JPS63309848A - 酵素電極の製造方法 - Google Patents
酵素電極の製造方法Info
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- JPS63309848A JPS63309848A JP62146287A JP14628787A JPS63309848A JP S63309848 A JPS63309848 A JP S63309848A JP 62146287 A JP62146287 A JP 62146287A JP 14628787 A JP14628787 A JP 14628787A JP S63309848 A JPS63309848 A JP S63309848A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
酵素電極の簡易な製造方法に関する。
酵素と電子伝達物質を炭素等の電極上に固定化した酵素
電極が％ １．Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ等によってアナリテ
ィカルケミストリ−（Ａｎａ−６，０ｈｅｍ、ｉ ６６
７ （１９８４） ）に報告されている。この酵素電極
は浸漬法により製造されるもので電子伝達物質であるフ
ェロセンを含む有機溶液中に炭素電極を浸漬し、引揚げ
たのち風乾してフェロセンを電極上に不溶化してから酵
素を電極に共有結合させ続いて架橋物質の溶液に浸漬し
かつ反応させて電子伝達物質と酵素を炭素電極上に薄層
状態で固定化させる。酵素と電子伝達物質を固定化した
酵素電極は、酸素分圧の影響を受けにくい、低電圧で作
動するなどの特徴をもつ。
電極が％ １．Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ等によってアナリテ
ィカルケミストリ−（Ａｎａ−６，０ｈｅｍ、ｉ ６６
７ （１９８４） ）に報告されている。この酵素電極
は浸漬法により製造されるもので電子伝達物質であるフ
ェロセンを含む有機溶液中に炭素電極を浸漬し、引揚げ
たのち風乾してフェロセンを電極上に不溶化してから酵
素を電極に共有結合させ続いて架橋物質の溶液に浸漬し
かつ反応させて電子伝達物質と酵素を炭素電極上に薄層
状態で固定化させる。酵素と電子伝達物質を固定化した
酵素電極は、酸素分圧の影響を受けにくい、低電圧で作
動するなどの特徴をもつ。
一方酵素を高分子化合物とともに電極上に架橋固定する
方法が特公昭５８−４９８２１号公報に開示されている
。この方法は酵素電極を物理的に強固にし、さらに酵素
電極の活性を高める効果があるとされている。この方法
においては、高分子化合物としてのポリエチレンイミン
と酵素の水溶液を炭素電極上に塗布し、乾燥したのち架
橋試薬のグルタルアルデヒド水溶液中に浸漬し、架橋反
応を行なわせる。
方法が特公昭５８−４９８２１号公報に開示されている
。この方法は酵素電極を物理的に強固にし、さらに酵素
電極の活性を高める効果があるとされている。この方法
においては、高分子化合物としてのポリエチレンイミン
と酵素の水溶液を炭素電極上に塗布し、乾燥したのち架
橋試薬のグルタルアルデヒド水溶液中に浸漬し、架橋反
応を行なわせる。
しかしながらこのような従来の製造方法においては、酵
素膜の形成と、酵素等の架橋反応とを同時に行なわず互
いに異なる工程に分けて行っているために酵素電極の製
造が面倒であった。
素膜の形成と、酵素等の架橋反応とを同時に行なわず互
いに異なる工程に分けて行っているために酵素電極の製
造が面倒であった。
この発明は上記の点に鑑みてなされ、その目的は酵素膜
の形成と架橋による固定とを同時に行うことにより酵素
電極の製造を簡易化することにある。
の形成と架橋による固定とを同時に行うことにより酵素
電極の製造を簡易化することにある。
上記の目的はこの発明によれば分析目的物質と特異的に
反応する酵素と１反応後の酵素と電子授受を行う電子伝
達物質と、前記酵素および電子伝達物質の担体となるべ
き高分子化合物と、酵素および電子伝達物質を前記高分
子化合物に化学的に結合させるとともに、さらにこの高
分子化合物を電極に化学的に結合させる架橋試薬とを水
に溶解して混合水溶液を調製するとともに低温状態に維
持し、ついでこの混合水溶液をスピンキャスティング法
により前記電極上に展開することにより達成される。
反応する酵素と１反応後の酵素と電子授受を行う電子伝
達物質と、前記酵素および電子伝達物質の担体となるべ
き高分子化合物と、酵素および電子伝達物質を前記高分
子化合物に化学的に結合させるとともに、さらにこの高
分子化合物を電極に化学的に結合させる架橋試薬とを水
に溶解して混合水溶液を調製するとともに低温状態に維
持し、ついでこの混合水溶液をスピンキャスティング法
により前記電極上に展開することにより達成される。
電子伝達物質は反応後の酵素と反応してこれと電子授受
を行い、酵素と電極間の電子移動の仲文ちをする。電子
伝達物質は分析における酸素の妨害をなくすほか、高濃
度物質の測定を可能にするなどの機能を有する。架橋試
薬は酵素および電子伝達物質を担体としてへ分子化合物
に化学的に結合させ酵素の活性と安定性を増す。高分子
化合物はさらに架橋試薬によって電極と化学結合する。
を行い、酵素と電極間の電子移動の仲文ちをする。電子
伝達物質は分析における酸素の妨害をなくすほか、高濃
度物質の測定を可能にするなどの機能を有する。架橋試
薬は酵素および電子伝達物質を担体としてへ分子化合物
に化学的に結合させ酵素の活性と安定性を増す。高分子
化合物はさらに架橋試薬によって電極と化学結合する。
混合水溶液は反応のおこらない低温度に維持される。こ
の低温に維持された混合水溶液はスピンキャスティング
により電極上に展開され成膜される。
の低温に維持された混合水溶液はスピンキャスティング
により電極上に展開され成膜される。
混合水溶液の状態では架橋反応は開始しない。
この混合水溶液をスピンキャスティングにより電極上に
うずく展開し成膜して放置すると、膜の温度が室温まで
上昇し、やがて自動的に架橋反応を開始する。架橋反応
により酵素、電子伝達物質の固定が行われる。
うずく展開し成膜して放置すると、膜の温度が室温まで
上昇し、やがて自動的に架橋反応を開始する。架橋反応
により酵素、電子伝達物質の固定が行われる。
実施例１
次にこの発明の実施例を図面に基いて説明する。
電極はグラファイト製の薄膜で、温度９０〜１００℃で
７０時間加熱処理し１表面を酸化させたものを用いる。
７０時間加熱処理し１表面を酸化させたものを用いる。
酵素としてはグルコースオキシダーゼ、電子伝達物質と
してフェロセンカルボン酸、担体用の高分子化合物とし
てポリエチレンイミン、架橋試薬としてカルボジイミド
（１−ｅｙｅ−ｇｏｈｅｘｙ−６−３−（２−ｍｏｒｐ
ｈｏ６ｉｎｏｅｔｈｙ〕）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
ｐ−ｍｅｔｈｙ４−ｔｏｅｕｅｎｅｓｕ［ｆｏ −ｎａ
ｔｅ ）を用いる。
してフェロセンカルボン酸、担体用の高分子化合物とし
てポリエチレンイミン、架橋試薬としてカルボジイミド
（１−ｅｙｅ−ｇｏｈｅｘｙ−６−３−（２−ｍｏｒｐ
ｈｏ６ｉｎｏｅｔｈｙ〕）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
ｐ−ｍｅｔｈｙ４−ｔｏｅｕｅｎｅｓｕ［ｆｏ −ｎａ
ｔｅ ）を用いる。
フェロセンカルボン酸は１重量％、クルコースオキシダ
ーゼは１重量％、ポリエチレンイミンは５重量％、カル
ボジイミドは２．５重量％になるように温度４〜５°Ｃ
のリン酸塩緩衝水溶液（ｐＨ７）に溶解して混合水溶液
を調製する。（９）分間放置してから１２０〜１８０ｒ
ｐｍで回転している電極（直径１０６ｒ１）上に混合水
溶液を１ｄ滴加してスピンキャスティングを行う。回転
は加秒間行う。Ｉ分間放置し架橋反応を進行させてから
ＰＨ７のリン酸塩緩衝溶液を用いて１０分間洗浄し、風
乾する。このようにして膜厚１μｍの酵素固定化膜がグ
ラファイト電極上に形成される。
ーゼは１重量％、ポリエチレンイミンは５重量％、カル
ボジイミドは２．５重量％になるように温度４〜５°Ｃ
のリン酸塩緩衝水溶液（ｐＨ７）に溶解して混合水溶液
を調製する。（９）分間放置してから１２０〜１８０ｒ
ｐｍで回転している電極（直径１０６ｒ１）上に混合水
溶液を１ｄ滴加してスピンキャスティングを行う。回転
は加秒間行う。Ｉ分間放置し架橋反応を進行させてから
ＰＨ７のリン酸塩緩衝溶液を用いて１０分間洗浄し、風
乾する。このようにして膜厚１μｍの酵素固定化膜がグ
ラファイト電極上に形成される。
以上のようにして形成された酵素電極を５×加龍の大き
さに切り出してプラスチック板上にアラルダイトで固定
すると同時に被覆を行い、酵素電極の露出部分を２Ｘ５
１Ｒ１の大きさにする。
さに切り出してプラスチック板上にアラルダイトで固定
すると同時に被覆を行い、酵素電極の露出部分を２Ｘ５
１Ｒ１の大きさにする。
次にこの酵素電極を用いてグルコースの測定を行う。第
１図は測定系統図で、１は酵素電極、２は白金の対極、
３は飽和せ禾電極からなる参照電極、４はポテンショス
タット、５は記録計である。
１図は測定系統図で、１は酵素電極、２は白金の対極、
３は飽和せ禾電極からなる参照電極、４はポテンショス
タット、５は記録計である。
測定に際しては、酵素電極１に参照電極を基準として＋
０．２５Ｖの電圧を印加し、そのとき酵素電極１と対極
２の間に流れる電流を測定する。使用する緩衝液はｐＨ
７のリン酸塩緩衝液であり、温度５℃で測定が行われる
。
０．２５Ｖの電圧を印加し、そのとき酵素電極１と対極
２の間に流れる電流を測定する。使用する緩衝液はｐＨ
７のリン酸塩緩衝液であり、温度５℃で測定が行われる
。
測定結果を第２図曲線Ａに示す。グルコース濃度が３０
ｍＭまで直線性が良好であり、１００ｍＭ位までは計測
可能である。応答速度は（９）秒乃至１分で定常状態に
達する。酵素電極の電位が＋〇、２５Ｖにおいて流れる
電流は次のような機構によるものとされている。
ｍＭまで直線性が良好であり、１００ｍＭ位までは計測
可能である。応答速度は（９）秒乃至１分で定常状態に
達する。酵素電極の電位が＋〇、２５Ｖにおいて流れる
電流は次のような機構によるものとされている。
即ち、グルコースオキシダーゼ（酸化屋）をＧＯＤ（Ｏ
Ｘ）、グルコースオキシダーゼ（還元型）をＧＯＤ（Ｒ
ＥＤ） としフェリジニウムカルボン酸をＦｅｃｐ２
Ｒ”、 フェロセンカルボン酸をＦｅｃｐ２ Ｒで表
わすと。
Ｘ）、グルコースオキシダーゼ（還元型）をＧＯＤ（Ｒ
ＥＤ） としフェリジニウムカルボン酸をＦｅｃｐ２
Ｒ”、 フェロセンカルボン酸をＦｅｃｐ２ Ｒで表
わすと。
グルコース十ＧＯＤ（ＯＸ）→グルコン酸十ＧＯＤ（Ｒ
ＥＤ）・・・・・・・・・（１１ ＧＯＤ（ＲＥＤ）＋２Ｆｅｃｐ２Ｒ−＋ ＧＯＤ（ＯＸ
）＋２Ｆｅｃｐ２ Ｒ＋２Ｈ＋ ・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・（２１２Ｆｅｃｐ２Ｒｗ−−２Ｆｅｃｐ
２ Ｒ＋２ｅ ・−−−−−−・・−・−（３１＋
０．２５ Ｖ （輔孕浮）において酸化される。
ＥＤ）・・・・・・・・・（１１ ＧＯＤ（ＲＥＤ）＋２Ｆｅｃｐ２Ｒ−＋ ＧＯＤ（ＯＸ
）＋２Ｆｅｃｐ２ Ｒ＋２Ｈ＋ ・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・（２１２Ｆｅｃｐ２Ｒｗ−−２Ｆｅｃｐ
２ Ｒ＋２ｅ ・−−−−−−・・−・−（３１＋
０．２５ Ｖ （輔孕浮）において酸化される。
前述のように、グルコースの濃度が３０ ｍＭまで直線
性良く測定できるのは、上述のような反応機構によりグ
ルコースが検出されることと、このような機構を働かせ
る酵素と電子伝達物質を高い密度で酵素膜中に固定でき
るからである。
性良く測定できるのは、上述のような反応機構によりグ
ルコースが検出されることと、このような機構を働かせ
る酵素と電子伝達物質を高い密度で酵素膜中に固定でき
るからである。
また測定液中の酸素を窒素ガスで除去して測定すると１
曲線Ｂが得られ、これは曲線Ａと殆んど差がないことが
わかる。これはグルコースの定量が殆んど前述の機構で
行われていることを意味している。即ち酵素の存在でグ
ルコースは酸素と結合しグルコノラクトンとなり消費さ
れ、マイナスの誤差を与えると考えられるからである。
曲線Ｂが得られ、これは曲線Ａと殆んど差がないことが
わかる。これはグルコースの定量が殆んど前述の機構で
行われていることを意味している。即ち酵素の存在でグ
ルコースは酸素と結合しグルコノラクトンとなり消費さ
れ、マイナスの誤差を与えると考えられるからである。
一方この発明に係る方法で製造した酵素電極は。
高分子化合物に結合させ、この高分子化合物を介して電
極に固定化を行ったためであると考えられる。
極に固定化を行ったためであると考えられる。
上記方法で製作された酵素電極は特性の再現性も良好で
ある。ｌＯケの電極に関するバラツキはＣｖ値で１０％
程度である。
ある。ｌＯケの電極に関するバラツキはＣｖ値で１０％
程度である。
先に詳述したようにこの発明においては酵素電極の成膜
、および酵素の固定化は単一の工程で同時になされる。
、および酵素の固定化は単一の工程で同時になされる。
そのために電極の製造が容易でかつ簡単である。またこ
の作業性はスピンキャスティング法の採用により一層そ
の効果が高められる。
の作業性はスピンキャスティング法の採用により一層そ
の効果が高められる。
スピンキャスティング法は短時間に均一性に優れた酵素
膜を製造することを可能とするからである。
膜を製造することを可能とするからである。
この発明に係る酵素電極は水溶液系において製造がなさ
れるため有機溶剤を使う場合のような環境対策の必要が
ない。
れるため有機溶剤を使う場合のような環境対策の必要が
ない。
実施例２
エチルアルコールの定量を行うために酵素としてアルコ
ールオキシダーゼ、高分子化合物としてアルブミンを用
いる。酵素は０．５重量％、アルブミンは２．５重量％
とし、その他の条件は実施例１と同様である。測定の結
果０．１〜２０％の濃度範囲において良好な検量線が得
られる。
ールオキシダーゼ、高分子化合物としてアルブミンを用
いる。酵素は０．５重量％、アルブミンは２．５重量％
とし、その他の条件は実施例１と同様である。測定の結
果０．１〜２０％の濃度範囲において良好な検量線が得
られる。
この発明によれば分析目的物質と特異的に反応する酵素
と、反応後の酵素と電子授受を行う電子伝達物質と、前
記酵素および電子伝達物質の担体となるべき高分子化合
物と、酵素および電子伝達物質を前記高分子化合物に化
学的に結合させるとともに、さらにこの高分子化合物を
電極に化学的に結合させる架橋試薬とを水に溶解して混
合水溶液を調製するとともに低温状態に維持し、ついで
この混合水溶液をスピンキャスティング法により前記電
極上に展開するので酵素を含む膜の成膜と酵素の固定を
単一の工程で同時に行うことができ、酵素電極の製造が
極めて簡易となる効果が得られる。
と、反応後の酵素と電子授受を行う電子伝達物質と、前
記酵素および電子伝達物質の担体となるべき高分子化合
物と、酵素および電子伝達物質を前記高分子化合物に化
学的に結合させるとともに、さらにこの高分子化合物を
電極に化学的に結合させる架橋試薬とを水に溶解して混
合水溶液を調製するとともに低温状態に維持し、ついで
この混合水溶液をスピンキャスティング法により前記電
極上に展開するので酵素を含む膜の成膜と酵素の固定を
単一の工程で同時に行うことができ、酵素電極の製造が
極めて簡易となる効果が得られる。
第１図は測定系統図、第２図はグルコースの検量線であ
る。 １：酵素電極、２：対極、３：参照電極、４：ボテンシ
ョスタット、５：記録計。 グルコ−ｚｌｍＭ）
る。 １：酵素電極、２：対極、３：参照電極、４：ボテンシ
ョスタット、５：記録計。 グルコ−ｚｌｍＭ）
Claims (1)
- １）分析目的物質と特異的に反応する酵素と、反応後の
酵素と電子授受を行う電子伝達物質と、前記酵素および
電子伝達物質の担体となるべき高分子化合物と、酵素お
よび電子伝達物質を前記高分子化合物に化学的に結合さ
せるとともに、さらにこの高分子化合物を電極に化学的
に結合させる架橋試薬とを水に溶解して混合水溶液を調
製するとともに該水溶液を低温度状態に維持し、ついで
この混合水溶液をスピンキャスティング法により前記電
極上に展開することを特徴とする酵素電極の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62146287A JPS63309848A (ja) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | 酵素電極の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62146287A JPS63309848A (ja) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | 酵素電極の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63309848A true JPS63309848A (ja) | 1988-12-16 |
Family
ID=15404286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62146287A Pending JPS63309848A (ja) | 1987-06-12 | 1987-06-12 | 酵素電極の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63309848A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262035A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-16 | E. Heller And Company | Enzyme electrodes |
| US5264105A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-23 | Gregg Brian A | Enzyme electrodes |
| US5264104A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-23 | Gregg Brian A | Enzyme electrodes |
| US5320725A (en) * | 1989-08-02 | 1994-06-14 | E. Heller & Company | Electrode and method for the detection of hydrogen peroxide |
-
1987
- 1987-06-12 JP JP62146287A patent/JPS63309848A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262035A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-16 | E. Heller And Company | Enzyme electrodes |
| US5264105A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-23 | Gregg Brian A | Enzyme electrodes |
| US5264104A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-23 | Gregg Brian A | Enzyme electrodes |
| US5320725A (en) * | 1989-08-02 | 1994-06-14 | E. Heller & Company | Electrode and method for the detection of hydrogen peroxide |
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