JP2652959B2 - 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 - Google Patents
水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は２種類のモノクローナル抗体を使用する水痘
・帯状疱疹ウイルス感染症の検出方法及び検出薬に関す
る。
・帯状疱疹ウイルス感染症の検出方法及び検出薬に関す
る。
水痘・帯状疱疹ウイルス疾患は、発熱と発疹を伴って
突然発病する急性ウイルス病の１つである。小児期に初
感染し、発病後３〜４日間は水痘性で最後は顆粒状の痂
皮を残して治癒するが、ウイルスは脊髄後根の神経節に
潜在し、長年月の後再発すると帯状疱疹としての症状を
示す。
突然発病する急性ウイルス病の１つである。小児期に初
感染し、発病後３〜４日間は水痘性で最後は顆粒状の痂
皮を残して治癒するが、ウイルスは脊髄後根の神経節に
潜在し、長年月の後再発すると帯状疱疹としての症状を
示す。
現在、水痘・帯状疱疹ウイルスと同じヘルペスウイル
スに属するヒト単純ヘルペスウイルスに対する抗体が検
出薬として知られている。しかしながら、この抗体はヒ
ト単純ヘルペスウイルスのみに反応し、水痘・帯状疱疹
ウイルスとは反応しない。従って、水痘・帯状疱疹ウイ
ルスを検出する検出薬が求められている。
スに属するヒト単純ヘルペスウイルスに対する抗体が検
出薬として知られている。しかしながら、この抗体はヒ
ト単純ヘルペスウイルスのみに反応し、水痘・帯状疱疹
ウイルスとは反応しない。従って、水痘・帯状疱疹ウイ
ルスを検出する検出薬が求められている。
水痘・帯状疱疹ウイルスの糖蛋白質GPに対するモノク
ローナル抗体が知られている。（Virology129,357−36
8,1983等）。また該ウイルスのヌクレオカプシドNPに対
するモノクローナル抗体も知られている。しかしながら
これらの抗体を単独で用いて該ウイルスが感染した細胞
を検出しようとする場合、必ずしも感度は十分でなく、
明瞭な結果を得られない。
ローナル抗体が知られている。（Virology129,357−36
8,1983等）。また該ウイルスのヌクレオカプシドNPに対
するモノクローナル抗体も知られている。しかしながら
これらの抗体を単独で用いて該ウイルスが感染した細胞
を検出しようとする場合、必ずしも感度は十分でなく、
明瞭な結果を得られない。
従って、本発明は、水痘・帯状疱疹ウイルスに対する
モノクローナル抗体を使用する、高感度で明瞭な、水痘
・帯状疱疹ウイルス感染症の新規な検出方法及び検出薬
を提供しようとするものである。
モノクローナル抗体を使用する、高感度で明瞭な、水痘
・帯状疱疹ウイルス感染症の新規な検出方法及び検出薬
を提供しようとするものである。
本発明者等は種々検討の結果、水痘・帯状疱疹ウイル
スの糖蛋白質に対するモノクローナル抗体及び該ウイル
スのヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体を混
合して使用することにより、該ウイルスが感染した細胞
を高感度で明瞭に検出することができるという全く新し
い地見を得、この発明を完成した。
スの糖蛋白質に対するモノクローナル抗体及び該ウイル
スのヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体を混
合して使用することにより、該ウイルスが感染した細胞
を高感度で明瞭に検出することができるという全く新し
い地見を得、この発明を完成した。
従って、本発明は、水痘・帯状疱疹ウイルス糖蛋白質
GPに対するモノクローナル抗体及び該ウイルスのヌクレ
オカプシドNPに対するモノクローナル抗体を、摘出され
た組織の細胞と接触せしめ、これら両抗体と前記ウイル
スが感染した細胞との特異的結合を検出することを特徴
とする水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出方法；及び
水痘・帯状疱疹ウイルス糖蛋白質GPに対するモノクロー
ナル抗体及び該ウイルスのヌクレオカプシドNPに対する
モノクローナル抗体を組み合わせて成る水痘・帯状疱疹
ウイルス感染症検出薬を提供しようとするものである。
GPに対するモノクローナル抗体及び該ウイルスのヌクレ
オカプシドNPに対するモノクローナル抗体を、摘出され
た組織の細胞と接触せしめ、これら両抗体と前記ウイル
スが感染した細胞との特異的結合を検出することを特徴
とする水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出方法；及び
水痘・帯状疱疹ウイルス糖蛋白質GPに対するモノクロー
ナル抗体及び該ウイルスのヌクレオカプシドNPに対する
モノクローナル抗体を組み合わせて成る水痘・帯状疱疹
ウイルス感染症検出薬を提供しようとするものである。
本発明に使用するモノクローナル抗体の調製方法及び
該モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの調製
方法は後で実施例において具体的に記載する。
該モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの調製
方法は後で実施例において具体的に記載する。
本発明において使用抗体は、水痘・帯状疱疹ウイルス
糖蛋白質GPに対するモノクローナル抗体、及び該ウイル
スのヌクレオカプシドNPに対するモノクローナル抗体で
あればいずれも使用することができるが、後に記載する
方法により種々のハイブリドーマを調製し、それらが生
産するモノクローナル抗体を調べた結果、糖蛋白質GPに
対するモノクローナル抗体としてはハイブリドーマNo.8
（微工研条寄第2123号）により生産されるモノクローナ
ル抗体が最も好ましく、またカプシドNPに対するモノク
ローナル抗体としてはハイブリドーマNo.17（微工研菌
寄第2124号）により生産されるモノクローナル抗体が最
も好ましいことを見出した。これら特定のモノクローナ
ル抗体の内、前者は水痘・帯状疱疹ウイルスが感染した
細胞（標的細胞と称する）の細胞質に強く結合し、そし
て後者は標的細胞の核に強く結合する。従って、上記特
定の２種類のモノクローナル抗体を組み合わせて使用す
るのが最も好ましい。
糖蛋白質GPに対するモノクローナル抗体、及び該ウイル
スのヌクレオカプシドNPに対するモノクローナル抗体で
あればいずれも使用することができるが、後に記載する
方法により種々のハイブリドーマを調製し、それらが生
産するモノクローナル抗体を調べた結果、糖蛋白質GPに
対するモノクローナル抗体としてはハイブリドーマNo.8
（微工研条寄第2123号）により生産されるモノクローナ
ル抗体が最も好ましく、またカプシドNPに対するモノク
ローナル抗体としてはハイブリドーマNo.17（微工研菌
寄第2124号）により生産されるモノクローナル抗体が最
も好ましいことを見出した。これら特定のモノクローナ
ル抗体の内、前者は水痘・帯状疱疹ウイルスが感染した
細胞（標的細胞と称する）の細胞質に強く結合し、そし
て後者は標的細胞の核に強く結合する。従って、上記特
定の２種類のモノクローナル抗体を組み合わせて使用す
るのが最も好ましい。
本発明の方法の実施に当たっては、前記２種類のモノ
クローナル抗体を混合して使用するが、その混合比には
特に制限はなく、およそ1:1程度で混合するのが好まし
い。
クローナル抗体を混合して使用するが、その混合比には
特に制限はなく、およそ1:1程度で混合するのが好まし
い。
検体は、例えば、患者の病巣基底部の感染細胞を綿棒
で採取し、そしてメタノール又はアセトン、好ましくは
アセトンで固定し、これを前記２種類のモノクローナル
抗体と接触せしめ、モノクローナル抗体をウイルス感染
細胞の特異的に結合せしめる。この場合、糖蛋白質に対
するモノクローナル抗体は主として感染細胞の細胞質に
結合し、ヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体
は主として核に結合する。
で採取し、そしてメタノール又はアセトン、好ましくは
アセトンで固定し、これを前記２種類のモノクローナル
抗体と接触せしめ、モノクローナル抗体をウイルス感染
細胞の特異的に結合せしめる。この場合、糖蛋白質に対
するモノクローナル抗体は主として感染細胞の細胞質に
結合し、ヌクレオカプシドに対するモノクローナル抗体
は主として核に結合する。
結合した抗体の検出方法としては、この抗体自体に標
識を付しておき直接検出する方法、この抗体に対する標
識を付した２次抗体を用いて間接的に検出する方法等が
あるが、本発明においては前記２種類の抗体に同じ標識
を付して用いるのが最も好ましい。この場合の標識とし
ては、免疫測定に常用される種々の標識を用いて例え
ば、酵素標識法（PAP法）、アビジンビオチン標識法、
蛍光アビジン法を使用することができるが、蛍光顕微鏡
下で直接観察することができるフルオレッセインイソチ
オシアネートを用いるのが最も好ましい。
識を付しておき直接検出する方法、この抗体に対する標
識を付した２次抗体を用いて間接的に検出する方法等が
あるが、本発明においては前記２種類の抗体に同じ標識
を付して用いるのが最も好ましい。この場合の標識とし
ては、免疫測定に常用される種々の標識を用いて例え
ば、酵素標識法（PAP法）、アビジンビオチン標識法、
蛍光アビジン法を使用することができるが、蛍光顕微鏡
下で直接観察することができるフルオレッセインイソチ
オシアネートを用いるのが最も好ましい。
両モノクローナル抗体をフルオレッセインイソチオシ
アネートにより標識する場合、標識された抗体中のフル
オレッセインイソチオシアネートと抗体蛋白質とのモル
比を約2.5〜3.5とするのが特に好ましく、フルオレッセ
インの比率が低過ぎる場合には標的細胞の染色が不十分
となり、それを明瞭に検出することが困難となる。他
方、フルオレッセインイソチオシアネートの比率が高過
ぎるとモノクローナル抗体の変性が進み、モノクローナ
ル抗体の活性が低下し、やはり標的細胞の明瞭な検出が
困難となる。第１図は適切な比率で標識されたモノクロ
ーナル抗体により染色された感染細胞の写真であり、第
２図は過剰に標識されたモノクローナル抗体により染色
された感染細胞の写真である。
アネートにより標識する場合、標識された抗体中のフル
オレッセインイソチオシアネートと抗体蛋白質とのモル
比を約2.5〜3.5とするのが特に好ましく、フルオレッセ
インの比率が低過ぎる場合には標的細胞の染色が不十分
となり、それを明瞭に検出することが困難となる。他
方、フルオレッセインイソチオシアネートの比率が高過
ぎるとモノクローナル抗体の変性が進み、モノクローナ
ル抗体の活性が低下し、やはり標的細胞の明瞭な検出が
困難となる。第１図は適切な比率で標識されたモノクロ
ーナル抗体により染色された感染細胞の写真であり、第
２図は過剰に標識されたモノクローナル抗体により染色
された感染細胞の写真である。
前記の好ましい比率で標識されたモノクローナル抗体
を調製するには、抗体蛋白質とフルオレッセインイソチ
オシアネートとをおよそ160:1〜200:1の重量比で反応せ
しめるのが好ましい。最も好ましくは、約20〜25mg/ml
の濃度の抗体蛋白質溶液と約1mg/mlの濃度のフルオレッ
セインイソチオシアネート溶液とを調製し、該蛋白質溶
液とフルオレッセインイソチオシアネート溶液とをおよ
そ8:1の容量比て混合して反応せしめる。この反応媒体
としてはpH約9.5の炭酸緩衝液が好ましく、反応は低
温、例えば２℃〜８℃において攪拌しながら10〜20時間
行うのが好ましい。
を調製するには、抗体蛋白質とフルオレッセインイソチ
オシアネートとをおよそ160:1〜200:1の重量比で反応せ
しめるのが好ましい。最も好ましくは、約20〜25mg/ml
の濃度の抗体蛋白質溶液と約1mg/mlの濃度のフルオレッ
セインイソチオシアネート溶液とを調製し、該蛋白質溶
液とフルオレッセインイソチオシアネート溶液とをおよ
そ8:1の容量比て混合して反応せしめる。この反応媒体
としてはpH約9.5の炭酸緩衝液が好ましく、反応は低
温、例えば２℃〜８℃において攪拌しながら10〜20時間
行うのが好ましい。
この様にして得られた塩基性の炭酸緩衝液中の標識化
抗体を中性リン酸緩衝液で平衡化されたカラムにより精
製することにより中性リン酸緩衝液中標識化抗体溶液を
得る。好ましくは、この標識化抗体溶液に対比染色用色
素としてエバンスブルーを約0.001％添加する。こうす
ることにより、本発明の抗体が結合しなかった細胞又は
細胞の部分がエバンスブルーにより染色されて赤色を呈
し、これにより、本発明の抗体により染色された部分が
鮮明に検出される。
抗体を中性リン酸緩衝液で平衡化されたカラムにより精
製することにより中性リン酸緩衝液中標識化抗体溶液を
得る。好ましくは、この標識化抗体溶液に対比染色用色
素としてエバンスブルーを約0.001％添加する。こうす
ることにより、本発明の抗体が結合しなかった細胞又は
細胞の部分がエバンスブルーにより染色されて赤色を呈
し、これにより、本発明の抗体により染色された部分が
鮮明に検出される。
実施例1. ハイブリドーマの作製 ヒト胚繊維芽細胞（HEL）に水痘・帯状疱疹ウイルスK
awaguchi株を感染せしめ細胞変性効果の出現を確認した
後、細胞層をリン酸緩衝液で洗浄し、細胞を剥がした。
細胞を超音波破壊した後、細胞破砕液をそのまま−80℃
にて保存し、抗原として使用した。免疫はフロイント完
全アジュバントと共に１匹当たり0.5mlをマウスの腹腔
に注射することにより行った。１ヵ月後、同量の前記抗
原をアジュバントなしで腹腔内に投与することにより追
加免疫を行った。この追加免疫後３日目に脾臓を摘出し
細胞融合に伴した。
awaguchi株を感染せしめ細胞変性効果の出現を確認した
後、細胞層をリン酸緩衝液で洗浄し、細胞を剥がした。
細胞を超音波破壊した後、細胞破砕液をそのまま−80℃
にて保存し、抗原として使用した。免疫はフロイント完
全アジュバントと共に１匹当たり0.5mlをマウスの腹腔
に注射することにより行った。１ヵ月後、同量の前記抗
原をアジュバントなしで腹腔内に投与することにより追
加免疫を行った。この追加免疫後３日目に脾臓を摘出し
細胞融合に伴した。
すなわち、脾臓細胞を培地で洗浄した後、塩化エンモ
ニウム溶液により赤血球を破壊した。残ったリンパ球を
さらに２回培地で洗浄した後、骨髄腫細胞SP2/10−Ag14
と10:1の割合で混合し、遠心分離を行った。混合した細
胞にポリエチレングリコールNo.4000を加えて細胞融合
を行った。融合した細胞をHAT（ヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン）を含む培地で選択した。
ニウム溶液により赤血球を破壊した。残ったリンパ球を
さらに２回培地で洗浄した後、骨髄腫細胞SP2/10−Ag14
と10:1の割合で混合し、遠心分離を行った。混合した細
胞にポリエチレングリコールNo.4000を加えて細胞融合
を行った。融合した細胞をHAT（ヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン）を含む培地で選択した。
HAT培地で生育したコロニーについて、培養上清を間
接蛍光抗体法により調べた。すなわち、水痘・帯状疱疹
ウイルスをヒト胚繊維芽細胞に感染せしめて細胞変性効
果を確認した後、培養上清を加えて37℃にて60分間イン
キュベートし、洗浄した。次に、２次抗体として抗マウ
スIgG−フルオレッセインイソチオシアネートを加え、3
7℃にて30分間インキュベートした後、リン酸緩衝液で
洗浄した。蛍光顕微鏡で観察し、上清が特異的染色を示
したコロニーについて水痘・帯状疱疹ウイルスモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマとした。こうして、該ウ
イルスの糖蛋白質GP3を認識する抗体を産生するハイブ
リドーマNo.8、及び該ウイルスのヌクレオカプシドを認
識する抗体を産生するハイブリドーマNo.17を得た。
接蛍光抗体法により調べた。すなわち、水痘・帯状疱疹
ウイルスをヒト胚繊維芽細胞に感染せしめて細胞変性効
果を確認した後、培養上清を加えて37℃にて60分間イン
キュベートし、洗浄した。次に、２次抗体として抗マウ
スIgG−フルオレッセインイソチオシアネートを加え、3
7℃にて30分間インキュベートした後、リン酸緩衝液で
洗浄した。蛍光顕微鏡で観察し、上清が特異的染色を示
したコロニーについて水痘・帯状疱疹ウイルスモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマとした。こうして、該ウ
イルスの糖蛋白質GP3を認識する抗体を産生するハイブ
リドーマNo.8、及び該ウイルスのヌクレオカプシドを認
識する抗体を産生するハイブリドーマNo.17を得た。
なお、この実施例に使用した出発材料細胞はいずれも
当業者が容易に入手できるものであり、この実施例に記
載した方法により、当業者は容易に同様の反応生を有す
る２つのタイプの抗体のいずれかを生産するハイブリド
ーマを得ることができる。
当業者が容易に入手できるものであり、この実施例に記
載した方法により、当業者は容易に同様の反応生を有す
る２つのタイプの抗体のいずれかを生産するハイブリド
ーマを得ることができる。
前記のハイブリドーマNo.8は、VZV−MAb−c18とし
て、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第
2123号（FERM BP−2123）としてブダペスト条約に基づ
き国際寄託されており、ハイブリドーマNo.17は、VZV−
MAb−cl17として、同様に微工研条寄第2124号（FERM BP
−2124）としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。
て、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第
2123号（FERM BP−2123）としてブダペスト条約に基づ
き国際寄託されており、ハイブリドーマNo.17は、VZV−
MAb−cl17として、同様に微工研条寄第2124号（FERM BP
−2124）としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。
実施例2. モノクローナル抗体の調製 前記ハイブリドーマの各々を次のDMEM−NCTC109培地
中で培養した。
中で培養した。
DMEM(1) 1000 ml NCTC 109 150 ml NEAA（＊100） 15 ml 100mMピルビン酸 ７ ml ３％グルタミン 15 ml 溶液I(2) 15 ml ゲルタマイシン（10mg/ml） 1.5ml （１）DMEM DMEM粉末 １パック NaHCO3 2.0 ｇ Ｌ−グルタミン 0.584g ビルピン酸ナトリウム 0.110g ペニシリンＧ １×105IU ストレプトマイシン 0.1g力価 蒸留水 全体が1000mlになる量 （２）溶液Ｉ オキサロ酸 100mM ウシ−インシュリン 20IU/ml 上記培地にウシ胎児血清を15％添加。
BALB/Cマウスに0.5ml/匹のプリスタンを腹腔中に注射
し、３週間後、上記の様にして培養したハイブリドーマ
細胞１×107を腹腔に注入した。その後、１〜２週間後
に腹腔を採取した。得られた腹水を遠心して細胞を除去
し、上清を硫酸アンモニウム沈澱法により精製した。20
％〜40％飽和の沈澱画分を得、これを0.05M炭酸緩衝液
（pH9.5）に溶解した。
し、３週間後、上記の様にして培養したハイブリドーマ
細胞１×107を腹腔に注入した。その後、１〜２週間後
に腹腔を採取した。得られた腹水を遠心して細胞を除去
し、上清を硫酸アンモニウム沈澱法により精製した。20
％〜40％飽和の沈澱画分を得、これを0.05M炭酸緩衝液
（pH9.5）に溶解した。
実施例3. 標識抗体の調製 前記硫酸アンモニウム沈殿に精製したモノクローナル
抗体の同炭酸緩衝液中溶液を35mg/ml以上の蛋白質濃度
に調整し、その2.5mlを同炭酸緩衝液で平衡化したPD−1
0カラム（Sephadex G−25）に適用し、次に同炭酸緩衝
液3.5mlを通して3.5mlの溶出液を回収した。次に、この
抗体液の蛋白質濃度が約20〜25mg/mlとなるように同炭
酸緩衝液により調整した。
抗体の同炭酸緩衝液中溶液を35mg/ml以上の蛋白質濃度
に調整し、その2.5mlを同炭酸緩衝液で平衡化したPD−1
0カラム（Sephadex G−25）に適用し、次に同炭酸緩衝
液3.5mlを通して3.5mlの溶出液を回収した。次に、この
抗体液の蛋白質濃度が約20〜25mg/mlとなるように同炭
酸緩衝液により調整した。
この場合、蛋白質濃度は吸光度により測定し、A280/
1.4＝蛋白質濃度とした。
1.4＝蛋白質濃度とした。
一方、フルオレッセインイソチオシアネート粉末1mg
を炭酸緩衝液（0.5M NaCO3−NaHCO3）（pH9.5）1mlに溶
解し、１μg/μのフルオレッセインイソチオシアネー
ト溶液を調製した。
を炭酸緩衝液（0.5M NaCO3−NaHCO3）（pH9.5）1mlに溶
解し、１μg/μのフルオレッセインイソチオシアネー
ト溶液を調製した。
次に、このフルオレッセインイソチオシアネート溶液
125μ（0.125mg）に対して前記の抗体液1000μ（25
〜30mg）の割合で両溶液を混合し、４℃、暗所で約15時
間攪拌することにより両者を反応せしめた。
125μ（0.125mg）に対して前記の抗体液1000μ（25
〜30mg）の割合で両溶液を混合し、４℃、暗所で約15時
間攪拌することにより両者を反応せしめた。
次に、0.01Mリン酸緩衝液（0.1M NaCl及び0.02％NaN3
を含有、pH7.2）で平衡化したPD−10のカラムに前記反
応混合物を加え、次に前記リン酸緩衝液により溶出を行
い、黄色の画分を採取することにより標識された抗体を
含む抗体画分を回収した。この場合、遊離のフルオレッ
セインイソチオシアネートはカラム中に残る。次に、前
記の回収した抗体画分をQAE Zetaprep（イオン交換体）
カラムに加え、このカラムに50mlの0.01Mリン酸緩衝液
（pH7.2）（0.1M NaCl含有）を通すことによってフルオ
レッセインイソチオシアネート及び未反応の抗体を溶出
して除去した。次に、このカラムに0.5M NaClを含有す
る0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）35〜40mlを通すことによ
り標識化抗体を溶出し回収した。これらの画分をリン酸
緩衝液（0.1M NaCl,0.02％NaN3,pH7.2）により10倍稀釈
し、波長520〜250nmの範囲で吸光スペクトルを測定し
た。この結果、フルオレッセインイソチオシアネート
（Ｆ）を示す495nm付近と、蛋白質（Ｐ）を示す280nm付
近にピークが認められた。このピーク値に基づいて、 蛋白質濃度＝A280×0.75−A495×0.227 F/P比＝A495×2.34/蛋白質濃度 により、F/P比（フルオレッセインイソチオシアネート
と蛋白質の比）を求め、これが2.5〜3.5にあることを確
認した。
を含有、pH7.2）で平衡化したPD−10のカラムに前記反
応混合物を加え、次に前記リン酸緩衝液により溶出を行
い、黄色の画分を採取することにより標識された抗体を
含む抗体画分を回収した。この場合、遊離のフルオレッ
セインイソチオシアネートはカラム中に残る。次に、前
記の回収した抗体画分をQAE Zetaprep（イオン交換体）
カラムに加え、このカラムに50mlの0.01Mリン酸緩衝液
（pH7.2）（0.1M NaCl含有）を通すことによってフルオ
レッセインイソチオシアネート及び未反応の抗体を溶出
して除去した。次に、このカラムに0.5M NaClを含有す
る0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）35〜40mlを通すことによ
り標識化抗体を溶出し回収した。これらの画分をリン酸
緩衝液（0.1M NaCl,0.02％NaN3,pH7.2）により10倍稀釈
し、波長520〜250nmの範囲で吸光スペクトルを測定し
た。この結果、フルオレッセインイソチオシアネート
（Ｆ）を示す495nm付近と、蛋白質（Ｐ）を示す280nm付
近にピークが認められた。このピーク値に基づいて、 蛋白質濃度＝A280×0.75−A495×0.227 F/P比＝A495×2.34/蛋白質濃度 により、F/P比（フルオレッセインイソチオシアネート
と蛋白質の比）を求め、これが2.5〜3.5にあることを確
認した。
この抗体液にエバンスブルー約0.001％（最後濃度）
を対比染色用色素として加えて標識抗体液とした。
を対比染色用色素として加えて標識抗体液とした。
この様にして前記２種類のモノクローナル抗体の標識
抗体液を得、これらを1:1の容量比で混合して試薬とし
た。
抗体液を得、これらを1:1の容量比で混合して試薬とし
た。
実施例4. 水痘・帯状疱疹ウイルスに感染している患者の病巣基
底部から綿棒により感染細胞を採取し、これを３枚のス
ライドグラスに２ヶ所ずつ塗布し、風乾した後、アセト
ンにより固定し、アセトンを蒸発せしめた。こられらの
３枚のスライドグラス上の固定細胞に、スライドグラス
Ａについては、ハイブリドーマNo.8（実施例１）により
生産されたモノクローナル抗体を実施例３により標識し
たものを、スライドグラスＢについてはハイブリドーマ
No.17（実施例１）により生産されたモノクローナル抗
体を実施例３により標識したものを、そしてスライドグ
ラスＣについては、両標識モノクローナル抗体の混合物
を滴加し、そして37℃にて30分間インキュベートした。
洗浄液PBS（−）（リン酸緩衝液）により過剰の試薬を
洗浄除去した後、乾燥し、封入液を滴下した後カバース
リップをかぶせ、蛍光顕微鏡で観察した。
底部から綿棒により感染細胞を採取し、これを３枚のス
ライドグラスに２ヶ所ずつ塗布し、風乾した後、アセト
ンにより固定し、アセトンを蒸発せしめた。こられらの
３枚のスライドグラス上の固定細胞に、スライドグラス
Ａについては、ハイブリドーマNo.8（実施例１）により
生産されたモノクローナル抗体を実施例３により標識し
たものを、スライドグラスＢについてはハイブリドーマ
No.17（実施例１）により生産されたモノクローナル抗
体を実施例３により標識したものを、そしてスライドグ
ラスＣについては、両標識モノクローナル抗体の混合物
を滴加し、そして37℃にて30分間インキュベートした。
洗浄液PBS（−）（リン酸緩衝液）により過剰の試薬を
洗浄除去した後、乾燥し、封入液を滴下した後カバース
リップをかぶせ、蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、ハイブリドーマNo.8由来の標識化抗体によ
り染色した細胞は細胞質がわずかに染色され、またハイ
ブリドーマNo.17由来の標識化抗体により染色した細胞
は核がわずかに染色され、いずれも染色はあまり明瞭で
なかったのに対して、両抗体により染色した細胞は細胞
質及び核の両者が染色され、全体として極めて明瞭に染
色された。
り染色した細胞は細胞質がわずかに染色され、またハイ
ブリドーマNo.17由来の標識化抗体により染色した細胞
は核がわずかに染色され、いずれも染色はあまり明瞭で
なかったのに対して、両抗体により染色した細胞は細胞
質及び核の両者が染色され、全体として極めて明瞭に染
色された。
なお、水痘・帯状疱疹ウイルスにより感染されていな
い細胞を用いて同様に処理した結果、いずれの抗体又は
抗体混合物によっても細胞は蛍光染色されなかった。
い細胞を用いて同様に処理した結果、いずれの抗体又は
抗体混合物によっても細胞は蛍光染色されなかった。
両抗体により染色された細胞の蛍光顕微鏡写真を第１
図に示す。
図に示す。
実施例5. 検出薬キット （１）実施例３により調製されたそれぞれの標識化抗体
2mlずつを別々のアンプルに充填して検出薬キットとし
た。このものは５℃にて貯蔵することができる。この試
薬は使用前に例えば同量ずつ混合する。
2mlずつを別々のアンプルに充填して検出薬キットとし
た。このものは５℃にて貯蔵することができる。この試
薬は使用前に例えば同量ずつ混合する。
（２）実施例３により調製したそれぞれの標識化抗体2m
lずつを別々のアンプルに充填した後凍結乾燥し、検出
薬キットとした。このものは常温で貯蔵することができ
る。使用直前に、例えば2mlの蒸留水により溶解し、そ
の溶液を例えば同量ずつ混合した後使用する。
lずつを別々のアンプルに充填した後凍結乾燥し、検出
薬キットとした。このものは常温で貯蔵することができ
る。使用直前に、例えば2mlの蒸留水により溶解し、そ
の溶液を例えば同量ずつ混合した後使用する。
（３）実施例３により調製した２種類の標識化抗体を同
量ずつ混合し、2mlずつアンプルに充填して検出用試薬
とした。このものは５℃にて貯蔵することができる。
量ずつ混合し、2mlずつアンプルに充填して検出用試薬
とした。このものは５℃にて貯蔵することができる。
（４）実施例３により調製した２種類の標識化抗体を同
量ずつ混合し、2mlずつアンプルに充填した後凍結乾燥
した。このものは常温で貯蔵することができる。これは
使用直前に、例えば2mlの蒸留水により溶解した後、そ
の溶液を使用する。
量ずつ混合し、2mlずつアンプルに充填した後凍結乾燥
した。このものは常温で貯蔵することができる。これは
使用直前に、例えば2mlの蒸留水により溶解した後、そ
の溶液を使用する。
実施例6. 臨床診断により水痘・帯状疱疹ウイルス感染症に罹患
していることが確認された233人の患者について、前記
実施例５に記載したキットを用いて実施例４に記載した
方法に準じて本発明の方法による検出を行った。その結
果、215人の患者につき陽性と判断され、臨床診断結果
に対する陽性率は96％以上であった。
していることが確認された233人の患者について、前記
実施例５に記載したキットを用いて実施例４に記載した
方法に準じて本発明の方法による検出を行った。その結
果、215人の患者につき陽性と判断され、臨床診断結果
に対する陽性率は96％以上であった。
第１図は、本発明の方法により最適に標識されたモノク
ローナル抗体により染色された細胞を示す蛍光顕微鏡写
真であって、生物の形態を表す図面に代わる写真であ
る。 第２図は、過剰に標識されたモノクローナル抗体により
染色された細胞の蛍光顕微鏡写真であって、生物の形態
を表す図面に代わる写真である。
ローナル抗体により染色された細胞を示す蛍光顕微鏡写
真であって、生物の形態を表す図面に代わる写真であ
る。 第２図は、過剰に標識されたモノクローナル抗体により
染色された細胞の蛍光顕微鏡写真であって、生物の形態
を表す図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (13)
- 【請求項１】水痘・帯状疱疹ウイルス糖蛋白質GPに対す
るモノクローナル抗体及び該ウイルスのヌクレオカプシ
ドNPに対するモノクローナル抗体を、摘出された組織の
細胞と接触せしめ、これら両抗体と前記ウイルスが感染
した細胞との特異的結合を検出することを特徴とする水
痘・帯状疱疹ウイルス感染の検出方法。 - 【請求項２】前記糖蛋白質GPに対するモノクローナル抗
体がハイブリドーマNo.8（微工研条寄第2123号）により
生産されるモノクローナル抗体であり、そして前記ヌク
レオカプシドNPに対するモノクローナル抗体がハイブリ
ドーマNo.17（微工研条寄第2124号）により生産される
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】標識された両モノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記標識がフルオレッセインイソチオシア
ネートである請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】フルオレッセインイソチオシアネートとモ
ノクローナル抗体とのモル比が2.5〜3.5である、請求項
４に記載の方法。 - 【請求項６】標識されたモノクローナル抗体にエバンス
ブルーを添加して使用する、請求項２〜５のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項７】水痘・帯状疱疹ウイルス糖蛋白質GPに対す
るモノクローナル抗体及び該ウイルスのヌクレオカプシ
ドNPに対するモノクローナル抗体を組み合わせて成る水
痘・帯状疱疹ウイルス感染検出薬。 - 【請求項８】前記糖蛋白質GPに対するモノクローナル抗
体がハイブリドーマNo.8（微工研条寄第2123号）により
生産されるモノクローナル抗体であり、そして前記ヌク
レオカプシドNPに対するモノクローナル抗体がハイブリ
ドーマNo.17（微工研条寄第2124号）により生産される
モノクローナル抗体である、請求項７に記載の検出薬。 - 【請求項９】前記両モノクローナル抗体が混合されてい
る請求項７又は８に記載の検出薬。 - 【請求項１０】前記両モノクローナル抗体が標識されて
いる請求項７又は８に記載の検出薬。 - 【請求項１１】前記標識がフルオレッセインイソチオシ
アネートである請求項10に記載の検出薬。 - 【請求項１２】フルオレッセインイソチオシアネートと
モノクローナル抗体とのモル比が2.5〜3.5である、請求
項11に記載の検出薬。 - 【請求項１３】標識されたモノクローナル抗体にエバン
スブルーが添加されている、請求項第10〜12のいずれか
１項に記載の検出薬。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP63274602A JP2652959B2 (ja) | 1987-12-15 | 1988-11-01 | 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 |
| EP88311887A EP0321249B1 (en) | 1987-12-15 | 1988-12-15 | Agent for and method of diagnosis of varicella zoster virus infection |
| DE3852875T DE3852875T2 (de) | 1987-12-15 | 1988-12-15 | Mittel und Verfahren zur Diagnose von Varicella zoster-Virusinfektion. |
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| JP31525487 | 1987-12-15 | ||
| JP62-315254 | 1987-12-15 | ||
| JP63274602A JP2652959B2 (ja) | 1987-12-15 | 1988-11-01 | 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH021560A JPH021560A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2652959B2 true JP2652959B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=26551104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63274602A Expired - Lifetime JP2652959B2 (ja) | 1987-12-15 | 1988-11-01 | 水痘・帯状疱疹ウイルス感染症の検出薬及び検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0321249B1 (ja) |
| JP (1) | JP2652959B2 (ja) |
| DE (1) | DE3852875T2 (ja) |
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| WO2002018660A2 (en) | 2000-08-31 | 2002-03-07 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of varicella-zoster virus |
| WO2010017381A2 (en) * | 2008-08-07 | 2010-02-11 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods for the diagnosis of varicella zoster virus infection |
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| CN117106070A (zh) * | 2019-11-11 | 2023-11-24 | 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 | 抗水痘-带状疱疹病毒的抗体 |
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|---|---|---|---|---|
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| DE3581400D1 (de) * | 1984-09-28 | 1991-02-21 | Teijin Ltd | Maus/mensch-hybridoma mit erzeugung von antiviralen menschlichen antikoerpern, deren herstellung und antivirale menschliche monoklonale antikoerper. |
| GB8426467D0 (en) * | 1984-10-19 | 1984-11-28 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
-
1988
- 1988-11-01 JP JP63274602A patent/JP2652959B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-15 EP EP88311887A patent/EP0321249B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-15 DE DE3852875T patent/DE3852875T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0321249A2 (en) | 1989-06-21 |
| JPH021560A (ja) | 1990-01-05 |
| DE3852875D1 (de) | 1995-03-09 |
| DE3852875T2 (de) | 1995-09-21 |
| EP0321249A3 (en) | 1991-05-15 |
| EP0321249B1 (en) | 1995-01-25 |
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