JP2652260B2 - ホエー蛋白質を含む出発原料からのラクトグロブリン除去法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明はホエー蛋白質を含む出発原料からのラクト
グロブリンの選択的かつ量的除去法に関する。

（従来の技術） 幼児用食物ミルク基材食品は牛乳から抽出した蛋白質
からしばしば製造される。人乳に類似させるため、牛乳
の異種成分の特殊配合が必要で、蛋白質だけの観点か
ら、アミノグラム（そして特に、たとえばトレオニン、
トリプトファンおよびリジンのような必須アミノ酸食
料）が人乳の蛋白質のアミノグラムに可能な限り接近し
ていることの保証が必要である。

この目的のために、詳述すれば、牛乳のホエー蛋白質
のカゼインに対する比率をホエー蛋白質の方がよくなる
ようにバランスを変える必要がある。このようにして調
製した食物ミルク基材食品には高比率のホエー蛋白質が
含まれることになる。そこで次掲の問題が提起される。
すなわち、人と牛のホエーの蛋白質留分の組成物が同一
でないこと、詳しくは、人のホエーにはベータラクトグ
ロブリンが含まれていないが、一方牛のホエーの蛋白質
留分の約半分がベータラクトグロブリンに相当する。組
成物のこの相違点は一部の幼児にとって牛血清蛋白質を
基材にした組成の乳汁を与えられた時、アレルギー現象
の原因となることである。このアレルギーは、特に消化
疾患（腹痛、下痢、嘔吐）とし出てくる。

この問題の解決に、たとえば、蛋白質の熱変性、蛋白
質の極く短いペプチドへの全加水分解もしくはラクトグ
ロブリンの量的除去を用いて解決する数提案が行われて
きた。

（発明が解決しようとする課題） しかし、蛋白質の熱変性はその消化生をかなりそこな
うものである。

蛋白質の全加水分解はペプチドだけが含まれかつ、残
留蛋白質のない配合物の生成に結びつく。この加水分解
は薬品（酸または塩基）を用いるか、あるいは酸素を用
いるかのいずれかで実施できる。酸素加水分解の場合
は、所望の程度まで加水分解を進めるために、相補的特
異性をもつ数種の蛋白質分解酵素（たとえば、トリプシ
ン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、細菌性蛋白
質分解酵素）を用いることがしばしば必要となるが、使
用する酵素の量はしばしば大量となる。加水分解に薬品
を用いるか、あるいは酵素を用いるかによって、加水分
解に特に耐性（特に血清アルブミンおよび免疫グロブリ
ン）であるため消化しない残留蛋白質が配合物中に残る
ことがしばしばである。ペプチドだけの回収が望ましい
場合は、これらの蛋白質を付加処理（沈澱・遠心分離・
限外過）により除去する必要がある。

ラクトグロブリンのホエーからの除去についてはすで
に数件の研究対象になってきた。たとえば、ラクトグロ
ブリンの除去は、ラクトグロブリンが他の主要ホエー蛋
白質のどれもがそうでない条件でなお可溶性である事実
を活用することで保証される。たとえば、クワタ（KUWA
TA）ほかによる（1985年刊、J.Food Sci.第50巻、第３
号、605〜609頁記載の論文、ベータラクトグロブリンの
ホエーからの除去による人乳蛋白質のシミュレーション
（Elimination of beta−lactoglobulin from whey to
simulate human milke protein））により塩化鉄をホエ
ーに添加してpHを３に調整し、蛋白質のどれもがラクト
グロブリンだけを残して沈澱し、その沈澱物を回収し、
その後、塩化鉄をイオン交換クロマトグラフィーにかけ
るか、あるいは限外過によるか、いずれかで除去する
方法が提案されている。得られた蛋白質濃縮にはラクト
グロブリンは含まれていない。この方法には、このよう
にして沈澱した蛋白質の消化性をそこなう欠点がある。

CHIANCONEとGATTONI（EP−Ａ−285,576号）の研究で
は、ラクトグロブリンをある支持体上に固定し、前記ラ
クトグロブリンの抽出が好ましいホエーをこの支持体に
通すと、ラクトグロブリンが支持体のラクトグロブリン
との関連で選択的に除去されるという一定の条件でラク
トグロブリンが二量体に結合する固有の特性を活用して
いる。

この発明の目的は、ラクトグロブリンを、ホエー蛋白
質が含まれる出発原料から前記ラクトグロブリンを適当
な作業条件で陰イオン交換器上に滞留させて選択的かつ
量的に抽出できる方法の提供にある。

（課題を解決するための手段） さらに詳述すれば、この発明はラクトグロブリンをホ
エー蛋白質が含まれる出発原料から選択的かつ量的に除
去する方法で、さらに前記出発原料を強塩基型陰イオン
交換器と接触させることと、前記出発原料のpHが、前記
出発原料の灰分含量が重量比で０と最高１％の間である
時、４と６の間にあり、また前記灰分含量が重量比で１
％以上３％の間である時、６と８の間にあって、そのた
めラクトグロブリンを前記陰イオン交換器上に選択的か
つ量的に滞留することと、前記ラクトグロブリンが滞留
する陰イオン交換器を前記出発原料の残量から分離され
ることおよび、グロブリンのない前記残留が収集される
ことを特徴とする。

（作 用） ラクトグロブリンの除去は種々の出発原料たとえば様
々な起源のホエー、すなわち酸味ホエー（新鮮ペース
ト、カゼイン製品）、やわらかいホエー（押しペース
ト）から直接に行える。これらのホエーは先に脱脂化ま
たは（および）脱塩化されているので使用できる。この
ようなホエーを濃縮（約20％の乾燥抽出物）すると出発
原料として使用も可能である。

上述の異なるホエーから抽出した蛋白質も出発原料と
して使用可能である。これらの蛋白質は少くとも精製し
た状態で種々の方法により得られる。すなわち、イオン
交換またはゲル過クロマトグラフィー、沈澱、限外
過である。すべてのこれらの技術のうち、最も経済的で
また、最も広範に産業上利用されている理由で最も適当
なものは限外過である。約75乃至85％の蛋白質物質
（乾燥抽出物に対し）が含まれる非変性蛋白質配合物が
それによって得られる。これらの精製蛋白質配合物（乾
燥または水和）から、１当り約100乃至150gの蛋白質
が好ましく含まれる溶液ができる。

ホエーまたは再構成蛋白質配合物はそのまま、あるい
は好ましくは、遠心分離または極微過後使用できる。

出発原料の微生物学的品質に注目すべきである。事実
上、いくつかの作業条件（pHおよび温度）が最終製品の
品質について好ましくない微生物発生に好都合である。
それ故、このことは出発原料に加えられる事前の殺菌ま
たは滅菌に結びつく。

この発明の方法において、強塩基型陰イオン交換器を
用いる。「強塩基型」という呼称はイオン交換樹脂の使
用者には周知のことであり、その呼称は必要を満たして
いる。

この発明の必要条件として、どのような形式の強塩基
型陰イオン交換器も適する。これらの交換器は通例、1/
4アミン機能を帯びる。次掲の樹脂は限定されない実例
として挙げることができる。すなわち： ・PHARMACIA社が蛋白質分離用に販売する「Q Sepharos
e」のような架橋アガロースマトリックスを有するも
の、 ・PHARMACIA社が蛋白質分離用に販売する「QAE−Sephad
ex」のような架橋デキストランマトリックスを有するも
の、 ・ROHM AND HASS社が主として脱塩化用として販売する
樹脂のようなポリスチレンマトリックスを有するもの、 ・ROHM AND HASS社が主として脱塩化用に販売する樹脂
のようなポリアクリルマトリックスを有するもの、 注目できることは全種類のイオン交換樹脂はホエー蛋
白質分離に既に使用されてきたが、採用された手順の目
的が集合性蛋白質の分離または１形態の蛋白質に濃縮す
ることであり、またその手順はラクトグロブリンの選択
的抽出には結びつかなかった。

これについて次の研究が挙げられる。すなわち： ・フランス国追加特許願第77/24,162号（Rhne−Poule
nc）： 陰イオン交換樹脂とシリカを連続使用してホエーの集
合性蛋白質の単離に関する。

・フランス国特許第79/08,555号（BEL）： １種類以上の樹脂を使用してホエーの蛋白質の分離ま
たは、特定の蛋白質に濃縮した留分の生成に関する。用
いられた手順は出発原料の特殊前処理および後処理から
成る。

ラクトグロブリンをホエー蛋白質を含む物質から選択
的に除去するため、ある一定の作業条件の観察が必要で
ある。

イオン交換操作を満足できるよう行う決め手は、詳し
くは処理される配合物のイオン強度である。

蛋白質を陰イオン交換器上に滞留させるには、後者が
負の全電荷を帯びる必要がある。この目的のために、前
記配合物のpHを蛋白質の等電点以上にする必要がある。

しかし、この条件は蛋白質を滞留させるには不十分で
ある。事実上、蛋白質は配合物に存在するその他のイオ
ン種（詳しくは塩類）と競合し、また蛋白質が適当な全
電荷を帯びている場合でも、蛋白質の交換器への結合を
妨げることができる。

蛋白質の陰イオン交換器上での滞留が好ましくない場
合、他のイオン種とは関係なく、配合物のpHを蛋白質の
等電点以下またはそれに等しい値になるよう調整する必
要がある。

これらがホエー蛋白質配合物のラクトグロブリンの選
択的滞留に活用される現象である。

主要ホエー蛋白質に関し、配合物のpHの効果を次の方
法で証明する。すなわち、 ・pHが４以下：蛋白質のどれもが正の帯電をして、従っ
て陰イオン上には滞留できない。

・pHが４乃至6:ラクトグロブリンだけが負の帯電をし、
その他の蛋白質は正の帯電をするが、イオン強度が強過
ぎる場合、ラクトグロブリンは交換器に結合できない。

・pHが６以上：主要ホエー蛋白質のどれもが負の帯電を
する。

ラクトグロブリンを陰イオン交換器上に滞留させるに
は、次掲の手順を用いる必要がある： ・イオン強度（塩分）の高い場合、ラクトグロブリンは
補正として高帯電の必要がある。この目的のため、比較
的高いpH（６以上）を選択する。

・イオン強度の低い場合、pHは６以下４以上を選択す
る。

ホエー蛋白質を含む出発原料の塩分はこれらの原料の
灰分と相関させることができ、次の手順が用いられる： ・処理される出発原料の灰分が０と１％の間（０と10g/
の間）である場合、全未変性ホエー、限外過で精製
されたホエー蛋白質配合物の溶液および、濃縮、脱塩ホ
エーでの場合と同様、処理される配合物のpHを４と６の
間に調整する。

・処理される出発原料の灰分が１と３％の間（10と30g/
の間）である場合、全脱塩濃縮ホエーでの場合と同
様、処理される配合物のpHを６と８の間に調整する。

交換器に接触させることが可能の出発原料の量は、そ
のラクトグロブリン濃度、出発原料の他の特性（乾燥抽
出物、灰分）、および用いる交換器に左右される。

交換器をラクトグロブリンで飽和させることが好まし
い。このことは、結合が可能な他の蛋白質の追い出し
と、それらを使用が好ましい生成物中への回収を可能に
する。

普通の強塩基陰イオン交換器を用いると、交換器の１
当り５と15gの間のラクトグロブリンを滞留させるこ
とが可能で、それは交換器１当り２乃至６の未変性
ホエーまたは0.5乃至1.5のホエー濃縮、もしくは15乃
至45gの乾燥抽出物ベースの精製ホエー蛋白質の配合物
にあたる。

処理される出発原料の交換器との接触は、この形式の
クロマトグラフィーで周知の手順により行うことが可能
である。それを以下に掲げる： ・攪拌床で混合し、 ・交換器の分離管で急速再循環し、 ・処理される配合物を交換器の分離管に進行させる。

どの場合もすべて、操作を室温（およそ20℃）または
冷気（細菌汚染問題を避けるため）で行う。昇温は無用
である。

ラクトグロブリンの交換器への結合は事実上瞬間的で
ある。数分間の接触時間（滞留時間）で十分である。

操作の終りに、処理生成物を単純過または遠心分
離、すなわち固定床遠心分離を用いる場合、分離管から
の流出量での遠心分離のいずれかで回収する。

処理生成物を直接、あるいは二者択一に、それを満足
に保存できるように事前に濃縮または（および）乾燥し
て使用できる。

再使用には、交換器がラクトグロブリンの数多い溶出
と再生とに耐える必要がある。

周期的の掃除を行う必要がある。

どの操作もすべて、イオン交換器の使用者に周知の報
告書が使用できる。たとえば： ・溶出：高イオン強度の溶液、たとえば、1Mの塩化ナト
リウム水溶液または高酸度（1M酢酸）の溶液を用いる。

・再生と掃除：サプライヤーの推奨する手順を採用す
る。

イオン交換作業を監視するため、ラクトグロブリンが
容易に分析できることが必要である。これは、たとえば
PHARMACIA社の販売するSuperose■６または12を詰めた
分離管を用いるゲル透過によるFPLC（ファーストプロテ
ィン液体クロマトグラフィー）により効果的に行うこと
ができる。

溶出留分を光学濃度280nmで測定して分析する。

異なる主要ホエー蛋白質を50mM燐酸緩衝液、pH7.0で
よく分離すると、ラクトグロブリンの存、不在が困難な
く観察できる。

主要ホエー蛋白質出現の順序は次の通り、すなわち
（最短滞留時間から最長滞留時間の順序）：リポ蛋白
質、免疫グロブリン、血清アルブミン、ラクトグロブリ
ン、ラクトアルブミンである。

ラクトグロブリンの存、不在の監視のもう１つの非常
に有効な方法は免疫定量法である。これを行うために
は、抗ラクトグロブリン抗体が必要である。ラクトグロ
ブリンとこれらの抗体との結合が、ラクトグロブリンの
存在の目視を可能にする沈澱が生成することになる。

（実施例） この発明の具体的説明のため次の非限定実施例を示
す。

実施例１乃至４はこの発明を種々の出発原料の適用を
示し、実施例５および６は異なる形式のイオン交換器を
示す。

実施例１乃至４ これらの実施例で、用いられたイオン交換器はQ Seph
rose■（Pharmacia社）である。処理された出発原料と
作業条件は表１に要約されている。

交換器と処理される配合物との接触は室温で15分間中
程度の攪拌による混合で実施できる。操作の終りに、処
理配合物を焼結ガラスで過して交換器から分離させ
る。交換器を水ですすぎ、ラクトグロブリンをその後、
塩化ナトリウムモル溶液を用いるすすぎで溶出する。

交換器をその後、水ですすいだ後、50mM燐酸緩衝液を
用いて平衡化して後続使用する。

FPLC分析は、得られた蛋白質配合物にはラクトグロブ
リンが無く、またすべての他の主要ホエー蛋白質が量的
に回収されることを示す。

この観察は高純度のラクトグロブリン留分が回収され
たことで確認される。

実施例５ カゼイン製造から得られる未変性ホエーのpHを5.0に
調整し、遠心分離により透明化を行う。

このようにして調製されたホエー２を１のポリス
チレン型イオン交換樹脂（Rohm and Hass社が販売する
「Duolite A 101」）に室温で30分間樹脂の固定床の上
で急速再循環させて接触させ、その後、樹脂から分離す
る。

得られたホエーはラクトグロブリンが無く、それの他
の主要蛋白質すべてを滞留させた。

ラクトグロブリンの溶出と樹脂の再生を２の標準塩
酸溶液を用い交換器をすすいで行う。

樹脂をその後、大量の水で洗浄し、後続の使用に供す
る。

実施例６ カゼイン製造からでる未変性ホエーのpHを5.0に調整
し、その後、遠心分離で透明化を行う。このようにして
調製されたホエー６を20℃の温度で15分間中程度の攪
拌して１のQAE−Sephadex■交換器（Pharmacia）と接
触させる。

処理配合物をその後、交換器から焼結ガラスで過し
て分離する。

得られたホエーはラクトグロブリンが無く、それの他
の主要蛋白質全部を滞留させた。

ラクトグロブリンを塩化ナトリウムモル溶液を用いて
溶出して、交換器ゲルをその後、50mM燐酸緩衝液を用い
て平衡化して後続使用に供する。

（発明の効果） この発明の方法は、すべてのラクトグロブリンを選択
的に滞留させ、またラクトグロブリンのないホエー蛋白
質配合物を単一操作でまた単一形式のイオン交換器を用
いて回収させるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−225197（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−113470（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−230600（ＪＰ，Ａ) 英国公開2188526（ＧＢ，Ａ) 仏国公開2487642（ＦＲ，Ａ) 仏国公開2452881（ＦＲ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｉｎｄ ｕｓｔｒｙ，Ｎｏ．21（1983）Ｐ．810 −814 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．59，Ｎｏ. １（1985）Ｐ．167−181 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．51，Ｎｏ．４ （1986）Ｐ．919−923

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ホエー蛋白質を含む出発原料からのラクト
   グロブリン除去の方法であって、前記出発原料を強塩基
   型陰イオン交換器と接触させる方法において、陰イオン
   交換器の１当り次掲の量の出発原料、すなわち： ２乃至６の未変成ホエー、または 0.5乃至1.5のホエー濃縮、または 15乃至45gの乾燥抽出物ベースの精製ホエー蛋白質の配
   合物を接触させる工程と、前記出発原料のpHは、前記出
   発原料の灰分が重量比で０と最高１％の間の時、４と６
   の間、そして前記灰分が重量比で１％以上３％の間の
   時、６と８の間であって、ラクトグロブリンを前記陰イ
   オン交換器上で選択的かつ量的に滞留させる工程と、前
   記ラクトグロブリンを滞留させる前記イオン交換器を前
   記出発原料の残量から分離する工程と、およびラクトグ
   ロブリンの無い前記残量を収集する工程とからなること
   を特徴とするラクトグロブリンの除去法。
2. 【請求項２】前記出発原料を未変成ホエー、濃縮かつ脱
   塩したホエー、およびホエー蛋白質配合物の溶液から選
   択し、かつ前記原料のpHが４と６の間であることを特徴
   とする請求項１によるラクトグロブリンの除去法。
3. 【請求項３】前記出発原料が非脱塩化濃縮ホエーであ
   り、かつ前記原料のpHが６と８の間であることを特徴と
   する請求項１によるラクトグロブリンの除去法。
4. 【請求項４】前記出発原料を遠心分離または極微過に
   より透明化してから前記陰イオン交換器と接触させるこ
   とを特徴とする請求項２または３によるラクトグロブリ
   ンの除去法。