JP2633459B2 - 電気生物化学的分析法及び電極 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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-
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Description
【０００１】
【産業上の利用の分野】本発明は液体媒体中の被検体の
存在及び濃度を決定する分析法に関する。本発明の方法
は電気生物化学的方法であり、被検体が生成物に変換さ
れる電気誘導酵素的酸化還元反応を用いて媒体中の被検
体の濃度を決定する。生成物の濃度の決定又は電荷の流
れの決定が被検体の濃度の尺度となる。
存在及び濃度を決定する分析法に関する。本発明の方法
は電気生物化学的方法であり、被検体が生成物に変換さ
れる電気誘導酵素的酸化還元反応を用いて媒体中の被検
体の濃度を決定する。生成物の濃度の決定又は電荷の流
れの決定が被検体の濃度の尺度となる。
【０００２】本発明の方法は新規種類の電極を用い、そ
れはその上に固定された酵素分子、電子を電極材料から
酵素の酸化還元中心に移動させる電子媒介物、あるいは
両方を有する。
れはその上に固定された酵素分子、電子を電極材料から
酵素の酸化還元中心に移動させる電子媒介物、あるいは
両方を有する。
【０００３】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】特定の
被検体に対する酵素の特異性は、それを液体媒体中の被
検体の存在の検のためのプローブとして有用なものにし
ている。分析生物化学法で用いるために提案された特定
の種類の酵素は酸化還元酵素であり、その場合媒体中の
被検体の存在及び濃度の検出は酵素的酸化還元反応から
生ずる電荷の流れの測定、又は酵素的酸化還元反応で得
られる生成物の蓄積に基づくことができる。そのような
方法では、例えば金又は白金で作られた電極材料を含
み、その上に酸化還元酵素が固定されている電極が用い
られる。酸化還元反応は酵素から被検体への電子の移動
（還元反応において）、あるいはその逆（酸化反応にお
いて）を含み、酵素分子の酸化還元中心と電極材料の間
に電気的交流（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｃｏｍｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎ）があると電荷の流れがあり、それは被検
体の存在の指標となり、電荷の流れの程度は被検体の濃
度の指標となる。代わりに反応生成物の測定に基づいて
決定を行うことができる。
被検体に対する酵素の特異性は、それを液体媒体中の被
検体の存在の検のためのプローブとして有用なものにし
ている。分析生物化学法で用いるために提案された特定
の種類の酵素は酸化還元酵素であり、その場合媒体中の
被検体の存在及び濃度の検出は酵素的酸化還元反応から
生ずる電荷の流れの測定、又は酵素的酸化還元反応で得
られる生成物の蓄積に基づくことができる。そのような
方法では、例えば金又は白金で作られた電極材料を含
み、その上に酸化還元酵素が固定されている電極が用い
られる。酸化還元反応は酵素から被検体への電子の移動
（還元反応において）、あるいはその逆（酸化反応にお
いて）を含み、酵素分子の酸化還元中心と電極材料の間
に電気的交流（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｃｏｍｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎ）があると電荷の流れがあり、それは被検
体の存在の指標となり、電荷の流れの程度は被検体の濃
度の指標となる。代わりに反応生成物の測定に基づいて
決定を行うことができる。
【０００４】そのような電気生物化学系において基本的
に必要なことは、酵素の酸化還元中心と電極材料の間の
電気的交流の開発である（Ｈｅｌｌｅｒ，１９９０；Ｗ
ｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。そのような電
気的交流は、官能基化された酸化還元ポリマー中の酸化
還元酵素の固定（Ｄｅｇａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８
９；Ｇｏｒｔｏｎ ｅｔ ａ．，１９９０；Ｆｏｕｌｄ
ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、又は電子移動媒介物を
用いたタンパク質の化学的修飾（Ｄｅｇａｎｉｅｔ ａ
ｌ．，１９８８；Ｈｅｌｌｅｒ，１９９２）により確立
することができる。現在開発されている電気生物化学電
極のほとんどは、酸化経路で用いられた。しかし最近、
ビピリジニウムポリマー中の酵素の固定（Ｗｉｌｌｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）又はビピリジニウム成分
によるタンパク質の官能基化（Ｗｉｌｌｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９１）が、光化学系において還元経路で用
いることができる電気的交流を与えることが示された。
に必要なことは、酵素の酸化還元中心と電極材料の間の
電気的交流の開発である（Ｈｅｌｌｅｒ，１９９０；Ｗ
ｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。そのような電
気的交流は、官能基化された酸化還元ポリマー中の酸化
還元酵素の固定（Ｄｅｇａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８
９；Ｇｏｒｔｏｎ ｅｔ ａ．，１９９０；Ｆｏｕｌｄ
ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、又は電子移動媒介物を
用いたタンパク質の化学的修飾（Ｄｅｇａｎｉｅｔ ａ
ｌ．，１９８８；Ｈｅｌｌｅｒ，１９９２）により確立
することができる。現在開発されている電気生物化学電
極のほとんどは、酸化経路で用いられた。しかし最近、
ビピリジニウムポリマー中の酵素の固定（Ｗｉｌｌｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）又はビピリジニウム成分
によるタンパク質の官能基化（Ｗｉｌｌｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９１）が、光化学系において還元経路で用
いることができる電気的交流を与えることが示された。
【０００５】還元及び酸化経路の両方において被検体の
存在を決定するための分析的電気生物化学的方法の提供
が本発明の目的である。
存在を決定するための分析的電気生物化学的方法の提供
が本発明の目的である。
【０００６】さらに、上記の方法で用いるための電極の
提供は本発明の目的である。
提供は本発明の目的である。
【０００７】そのような電極の製造法の提供は本発明の
さらに別の目的である。
さらに別の目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明に従い、酵素又は
電子媒介基のどちらか、あるいは両方を、電極材料の表
面上に化学吸着された硫黄含有部分を有する基を用いて
電極材料の表面上に固定すると、あるいは硫黄含有部分
を用いて電極材料に固定された酵素に電子媒介物を結合
することにより電極材料の表面上に固定すると、電極の
電極材料の表面と酸化還元酵素の間の電子媒介基を用い
た非常に有効な電子移動が達成できることが見いだされ
た。
電子媒介基のどちらか、あるいは両方を、電極材料の表
面上に化学吸着された硫黄含有部分を有する基を用いて
電極材料の表面上に固定すると、あるいは硫黄含有部分
を用いて電極材料に固定された酵素に電子媒介物を結合
することにより電極材料の表面上に固定すると、電極の
電極材料の表面と酸化還元酵素の間の電子媒介基を用い
た非常に有効な電子移動が達成できることが見いだされ
た。
【０００９】従って本発明はその特徴の１つに従い、液
体媒体中の被検体の存在又は濃度の決定のための電気生
物化学的酵素的酸化還元反応による分析法を提供し、こ
の方法において電子は分子状電子媒介物の媒介により電
極材料の表面と酸化還元酵素の間で移動し、それによっ
て酵素は被検体が生成物に変換される酸化還元反応を触
媒することができ、該方法は酸化還元反応で得られる生
成物の濃度の測定又は電荷の流れの測定を含み、方法
は、該電極材料が硫黄含有部分の化学吸着の可能な種類
の材料であり、成分の少なくとも１つ、酵素又は電子媒
介物が、それに共有結合し、該表面上に化学吸着した硫
黄含有部分を有する第１結合基により電極材料の表面上
に固定され、該成分の他方が（ｉ）電極材料の回りで液
体媒体中を混転している、（ｉｉ）該表面上に化学吸着
した硫黄含有部分を有する第２結合基を用いて該表面に
固定され、第２結合基は該第１結合基と同一又は異なる
ことができる、あるいは（ｉｉｉ）該第１結合基又は該
成分の１つに共有結合することにより該表面に固定され
ていることを特徴とする。
体媒体中の被検体の存在又は濃度の決定のための電気生
物化学的酵素的酸化還元反応による分析法を提供し、こ
の方法において電子は分子状電子媒介物の媒介により電
極材料の表面と酸化還元酵素の間で移動し、それによっ
て酵素は被検体が生成物に変換される酸化還元反応を触
媒することができ、該方法は酸化還元反応で得られる生
成物の濃度の測定又は電荷の流れの測定を含み、方法
は、該電極材料が硫黄含有部分の化学吸着の可能な種類
の材料であり、成分の少なくとも１つ、酵素又は電子媒
介物が、それに共有結合し、該表面上に化学吸着した硫
黄含有部分を有する第１結合基により電極材料の表面上
に固定され、該成分の他方が（ｉ）電極材料の回りで液
体媒体中を混転している、（ｉｉ）該表面上に化学吸着
した硫黄含有部分を有する第２結合基を用いて該表面に
固定され、第２結合基は該第１結合基と同一又は異なる
ことができる、あるいは（ｉｉｉ）該第１結合基又は該
成分の１つに共有結合することにより該表面に固定され
ていることを特徴とする。
【００１０】本発明はその別の特徴として、硫黄含有部
分の化学吸着の可能な種類の電極材料を含み、それぞれ
硫黄含有部分を有する結合基及び酸化還元酵素又は電子
媒介物の少なくとも１つを含む多数の複合体がその上に
固定されており、複合体のすべての成分が互いに共有結
合している、上記の方法で用いるための電極も提供す
る。
分の化学吸着の可能な種類の電極材料を含み、それぞれ
硫黄含有部分を有する結合基及び酸化還元酵素又は電子
媒介物の少なくとも１つを含む多数の複合体がその上に
固定されており、複合体のすべての成分が互いに共有結
合している、上記の方法で用いるための電極も提供す
る。
【００１１】本発明のさらに別の特徴により上記の方法
を行うための電気生物化学的系を提供する。
を行うための電気生物化学的系を提供する。
【００１２】本発明のさらに別の特徴により上記の電極
の製造法を提供し、その方法は下記にさらに概述する。
の製造法を提供し、その方法は下記にさらに概述する。
【００１３】電極材料は硫黄含有部分の化学吸着能力を
有する多数の導体及び半導体から選ばれることができ
る。そのような電極材料の例は金、銀、白金又は銅、及
びヒ化ガリウムなどの半導体であることができる。
有する多数の導体及び半導体から選ばれることができ
る。そのような電極材料の例は金、銀、白金又は銅、及
びヒ化ガリウムなどの半導体であることができる。
【００１４】結合基は以下の一般式（Ｉ）
【００１５】
【化１】Ｚ−Ｒ1−Ｑ （Ｉ） ［式中、Ｚは硫黄含有部分を示し；Ｑは基Ｘ1又はＰで
あり；Ｘ1は少なくとも１つの該成分、すなわち場合次
第で酵素又は電子媒介物の部分と共有結合を形成するこ
とができる官能基であり；Ｐは上記のＸ1の意味を有す
る官能基Ｘ2を多数有するタンパク質、ポリペプチド又
はポリマーであり、Ｒ1は結合基を示す］を有すること
ができる。
あり；Ｘ1は少なくとも１つの該成分、すなわち場合次
第で酵素又は電子媒介物の部分と共有結合を形成するこ
とができる官能基であり；Ｐは上記のＸ1の意味を有す
る官能基Ｘ2を多数有するタンパク質、ポリペプチド又
はポリマーであり、Ｒ1は結合基を示す］を有すること
ができる。
【００１６】Ｚは例えばチオール基又はジスルフィド基
から得られる硫黄原子、スルホネート基あるいはサルフ
ェート基であることができる。
から得られる硫黄原子、スルホネート基あるいはサルフ
ェート基であることができる。
【００１７】Ｘ1又はＸ2は例えばタンパク質のカルボキ
シル残基に結合できる官能基、例えばアミン基、タンパ
ク質のアミン残基に結合できるカルボキシル基、イソシ
アナート又はイソチオシアナートあるいはタンパク質の
アミン残基に結合できるアシル基、タンパク質又はポリ
ペプチドのヒドロキシ残基に結合できるハライド基、あ
るいは上記で定義したポリマーＰであることができる。
シル残基に結合できる官能基、例えばアミン基、タンパ
ク質のアミン残基に結合できるカルボキシル基、イソシ
アナート又はイソチオシアナートあるいはタンパク質の
アミン残基に結合できるアシル基、タンパク質又はポリ
ペプチドのヒドロキシ残基に結合できるハライド基、あ
るいは上記で定義したポリマーＰであることができる。
【００１８】Ｘ1の特定の例は、基−ＮＨ2；−ＣＯ
2Ｈ；−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ；Ｎ＝Ｃ＝Ｏであるか；又はＧがＯ
Ｈ、ハロゲン、ＯＲb又は
2Ｈ；−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ；Ｎ＝Ｃ＝Ｏであるか；又はＧがＯ
Ｈ、ハロゲン、ＯＲb又は
【００１９】
【化２】
【００２０】基であり、Ｒ2及びＲbが独立してＣ1−Ｃ
12アルキル、アルケニル、アルキニル又は場合により例
えばハロゲンで置換されたフェニル含有鎖である式−Ｒ
2−ＣＯ−Ｇを有するアシル基である。
12アルキル、アルケニル、アルキニル又は場合により例
えばハロゲンで置換されたフェニル含有鎖である式−Ｒ
2−ＣＯ−Ｇを有するアシル基である。
【００２１】Ｐにおける官能基はポリペプチド鎖上ある
いは側鎖上のアミン又はカルボキシル基であることがで
きる。Ｐは多数の官能基Ｘ2を有するポリマー又はポリ
ペプチドであるとができ、Ｘ2はすべて同一又は異なる
ことができ、Ｘ1に関する上記と同義である。
いは側鎖上のアミン又はカルボキシル基であることがで
きる。Ｐは多数の官能基Ｘ2を有するポリマー又はポリ
ペプチドであるとができ、Ｘ2はすべて同一又は異なる
ことができ、Ｘ1に関する上記と同義である。
【００２２】Ｐの例は酵素分子中のそれぞれアミン及び
カルボキシル基と結合できる遊離のカルボキシル又はア
ミン基を有するポリペプチドである。Ｐの特定の例はポ
リエチレンイミンなどのポリアミン及びグルタミン又は
リシンの豊富なポリペプチドである。Ｐは官能基化側鎖
を含むこともできる。
カルボキシル基と結合できる遊離のカルボキシル又はア
ミン基を有するポリペプチドである。Ｐの特定の例はポ
リエチレンイミンなどのポリアミン及びグルタミン又は
リシンの豊富なポリペプチドである。Ｐは官能基化側鎖
を含むこともできる。
【００２３】Ｒ1は共有結合であることができ、あるい
はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、フェニル
含有鎖及び他の多くの非常に多様な適した基から選択す
ることができる。
はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、フェニル
含有鎖及び他の多くの非常に多様な適した基から選択す
ることができる。
【００２４】Ｒ1の特定の例は化学結合又は次式（ＩＩ
ａ）、（ＩＩｂ）あるいは（ＩＩＩ）：
ａ）、（ＩＩｂ）あるいは（ＩＩＩ）：
【００２５】
【化３】
【００２６】［式中、Ｒ2又はＲ3は同一又は異なり炭素
数が１−１６の直鎖状もしくは分枝鎖状アルキレン、ア
ルケニレン、アルキニレンを示すか、又は共有結合を示
し、Ａ及びＢは同一又は異なりＯ又はＳを示し、Ｐｈは
場合により例えばＳＯ3 -又はアルキルから成る群より選
ばれる１個又はそれ以上の置換基により置換されたフェ
ニルである］を有する基である。
数が１−１６の直鎖状もしくは分枝鎖状アルキレン、ア
ルケニレン、アルキニレンを示すか、又は共有結合を示
し、Ａ及びＢは同一又は異なりＯ又はＳを示し、Ｐｈは
場合により例えばＳＯ3 -又はアルキルから成る群より選
ばれる１個又はそれ以上の置換基により置換されたフェ
ニルである］を有する基である。
【００２７】電子媒介物は、余分の電子を運び、それを
電極材料から酵素分子の酸化還元中心に移動させること
ができる電子媒介部分（後文では時々“Ｕ”の文字によ
り示す）を有する化合物である。Ｕはそのような電子移
動に適した酸化還元電位を持っていなければならない。
電極材料から酵素分子の酸化還元中心に移動させること
ができる電子媒介部分（後文では時々“Ｕ”の文字によ
り示す）を有する化合物である。Ｕはそのような電子移
動に適した酸化還元電位を持っていなければならない。
【００２８】電子媒介物は可溶性であるか、又は電極材
料の表面に固定することができ、あるいは酵素に共有結
合することができる。
料の表面に固定することができ、あるいは酵素に共有結
合することができる。
【００２９】酵素が還元酵素の場合、Ｕは場合により置
換されたビオロゲン、例えば次式（ＩＶ）：
換されたビオロゲン、例えば次式（ＩＶ）：
【００３０】
【化４】
【００３１】［式中ｎ＝１−１６］を有するカルボキシ
アルキルビピリジニウムを例とするアルキルビオロゲ
ン、場合により置換されたピリジニウム、例えば次式
（Ｖ）：
アルキルビピリジニウムを例とするアルキルビオロゲ
ン、場合により置換されたピリジニウム、例えば次式
（Ｖ）：
【００３２】
【化５】
【００３３】で示されるようなカルボキシ置換ピリジニ
ウム、場合により例えばカルボキシルなどの置換基によ
り置換されたアクリジン、例えば次式（ＶＩ）：
ウム、場合により例えばカルボキシルなどの置換基によ
り置換されたアクリジン、例えば次式（ＶＩ）：
【００３４】
【化６】
【００３５】を有する化合物であることができる。
【００３６】酵素が酸化酵素の場合、Ｕは例えば場合に
より置換されたフェロセンであることができ、置換基は
例えばアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニ
ル、アルキルアミド又はアルキルカルボキシフェロセン
であり、例えば次式（ＶＩＩ）：
より置換されたフェロセンであることができ、置換基は
例えばアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニ
ル、アルキルアミド又はアルキルカルボキシフェロセン
であり、例えば次式（ＶＩＩ）：
【００３７】
【化７】
【００３８】［式中ＹはＣＯ2Ｈ又はＮＨ2基である］に
示される化合物である。
示される化合物である。
【００３９】Ｕの他の例は場合により置換されたフェノ
チアジン、例えば次式（ＶＩＩＩ）：
チアジン、例えば次式（ＶＩＩＩ）：
【００４０】
【化８】
【００４１】で示される化合物である。
【００４２】電極材料上に固定することができる電子媒
介物は一般式（ＩＸ）：
介物は一般式（ＩＸ）：
【００４３】
【化９】Ｕ−Ｒ4−Ｘ3 （ＩＸ） ［式中Ｕは上記と同義であり、Ｒ4及びＸ3は式（Ｉ）に
おけるそれぞれＲ1及びＸ1と同義である］を有する。
おけるそれぞれＲ1及びＸ1と同義である］を有する。
【００４４】本発明の具体化の１つの場合、酵素分子は
結合基を用いて電極材料上に固定され、電子媒介物が回
りの溶液中で混転している。この具体化に従うと電極材
料は、それぞれ結合基及び１個又はそれ以上の酵素分子
を含む多数の複合体により被覆されている。
結合基を用いて電極材料上に固定され、電子媒介物が回
りの溶液中で混転している。この具体化に従うと電極材
料は、それぞれ結合基及び１個又はそれ以上の酵素分子
を含む多数の複合体により被覆されている。
【００４５】本発明の他の具体化の場合、電子媒介基が
電極材料上に固定され、酵素分子が回りの溶液中で混転
している。この具体化に従うと電極材料はそれぞれ結合
基及び１個又はそれ以上の電子媒介基を含む多数の複合
体により被覆されている。
電極材料上に固定され、酵素分子が回りの溶液中で混転
している。この具体化に従うと電極材料はそれぞれ結合
基及び１個又はそれ以上の電子媒介基を含む多数の複合
体により被覆されている。
【００４６】本発明の第３の具体化の場合、電子媒介基
及び酵素の両方が電極材料上に固定される。電子媒介基
及び酵素分子は、結合基、電子媒介基及び酵素分子の両
方を含む１個の分子複合体中にあることができ、あるい
は１つが第１結合基及び電子媒介基を含み、他方が第１
複合基と同一又は異なることができる第２結合基及び酵
素を含む別々の複合体中にあることもできる。
及び酵素の両方が電極材料上に固定される。電子媒介基
及び酵素分子は、結合基、電子媒介基及び酵素分子の両
方を含む１個の分子複合体中にあることができ、あるい
は１つが第１結合基及び電子媒介基を含み、他方が第１
複合基と同一又は異なることができる第２結合基及び酵
素を含む別々の複合体中にあることもできる。
【００４７】成分の１つ、すなわち酵素又は電子媒介物
が電極の回りの溶液中を自由にころび回り、他の成分が
固定されている場合電極は、調べられている被検体に対
して透過性であるが混転している成分に対して不透過性
であり、混転する成分を含む少量の溶液をそれと電極材
料の間に閉じ込める半透膜を含むことができる。
が電極の回りの溶液中を自由にころび回り、他の成分が
固定されている場合電極は、調べられている被検体に対
して透過性であるが混転している成分に対して不透過性
であり、混転する成分を含む少量の溶液をそれと電極材
料の間に閉じ込める半透膜を含むことができる。
【００４８】電極はすべてが結合基に直接結合した酵素
の単層を含むことができる。時には酵素分子の数層が含
まれ、１層の酵素分子が架橋基により前の層の酵素分子
に結合しているのが好ましい。そのような架橋基は例え
ば次式（Ｘ）：
の単層を含むことができる。時には酵素分子の数層が含
まれ、１層の酵素分子が架橋基により前の層の酵素分子
に結合しているのが好ましい。そのような架橋基は例え
ば次式（Ｘ）：
【００４９】
【化１０】Ｗ1−Ｒ6−Ｗ2 （Ｘ） ［式中Ｗ1及びＷ2は互いに同一又は異なり式（Ｉ）にお
けるＸ1と同義であり、Ｒ6は式（Ｉ）におけるＲ1と同
義である］を有する基である。
けるＸ1と同義であり、Ｒ6は式（Ｉ）におけるＲ1と同
義である］を有する基である。
【００５０】架橋基は式（Ｉ）におけるＰと同義のポリ
マー又はポリペプチドであることもできる。
マー又はポリペプチドであることもできる。
【００５１】電極が酵素分子の多層を含む場合、外層中
の酵素分子のいくらかは、電極材料に近付いた時に非特
異的に、すなわち酵素によらずに酸化又は還元される妨
害剤を分解する目的の第２酵素であることが適してい
る。そのような試薬は分解されないと結果に重大な影響
を及ぼし、結果を不正確なものとする。従って例えば酵
素がグルコースオキシダーゼの場合、そのような第２酵
素は例えばアスコルベートウレート又はアセトアミノフ
ェンなどの試薬により起こり得る還元反応を避けるため
のペルオキシダーゼであることができる。
の酵素分子のいくらかは、電極材料に近付いた時に非特
異的に、すなわち酵素によらずに酸化又は還元される妨
害剤を分解する目的の第２酵素であることが適してい
る。そのような試薬は分解されないと結果に重大な影響
を及ぼし、結果を不正確なものとする。従って例えば酵
素がグルコースオキシダーゼの場合、そのような第２酵
素は例えばアスコルベートウレート又はアセトアミノフ
ェンなどの試薬により起こり得る還元反応を避けるため
のペルオキシダーゼであることができる。
【００５２】本発明の電極を製造するために、結合基を
最初に化学吸着し、その後固定される成分、すなわち酵
素又は電子媒介基をその上に結合することができる。代
わりに結合基と該成分の結合を最初に行い、その後複合
体を電極材料上に化学吸着することができる。
最初に化学吸着し、その後固定される成分、すなわち酵
素又は電子媒介基をその上に結合することができる。代
わりに結合基と該成分の結合を最初に行い、その後複合
体を電極材料上に化学吸着することができる。
【００５３】電子媒介物を酵素上に固定する場合、電子
媒介基の少なくともいくらかを酵素の酸化還元部位の近
くに固定するのが好ましく、そのために酵素分子を最初
に、例えば高濃度のウレアを用いて変性させ、その後電
子媒介基を変性酵素分子に結合し、それをその後ウレア
の濃度を下げることにより再生する。酵素分子は多数、
例えば４−１２の電子媒介基に結合することにより修飾
するのが適している。
媒介基の少なくともいくらかを酵素の酸化還元部位の近
くに固定するのが好ましく、そのために酵素分子を最初
に、例えば高濃度のウレアを用いて変性させ、その後電
子媒介基を変性酵素分子に結合し、それをその後ウレア
の濃度を下げることにより再生する。酵素分子は多数、
例えば４−１２の電子媒介基に結合することにより修飾
するのが適している。
【００５４】
【具体的な態様】ここでいくつかの特定の具体化により
本発明を説明するが、本発明はそれに制限されないと理
解される。熟練者は、開示されている具体化の種々の修
正ならびに他の具体化によっても本発明を行うことがで
きることを必ず認識し、熟練者は本明細書中の開示に基
づいてそのような他の具体化を容易に行うことができる
であろう。
本発明を説明するが、本発明はそれに制限されないと理
解される。熟練者は、開示されている具体化の種々の修
正ならびに他の具体化によっても本発明を行うことがで
きることを必ず認識し、熟練者は本明細書中の開示に基
づいてそのような他の具体化を容易に行うことができる
であろう。
【００５５】まず、本発明の具体化の１つに従う電極表
面の略図である図１に言及する。金電極１の表面は多数
の複合体２により覆われ、複合体のそれぞれは結合基
３、酸化還元酵素４及び電子媒介基５を含む。Ｒ1、
Ｘ1、Ｘ3、Ｒ4及びＵの意味は式（Ｉ）の関する上記と
同義である。
面の略図である図１に言及する。金電極１の表面は多数
の複合体２により覆われ、複合体のそれぞれは結合基
３、酸化還元酵素４及び電子媒介基５を含む。Ｒ1、
Ｘ1、Ｘ3、Ｒ4及びＵの意味は式（Ｉ）の関する上記と
同義である。
【００５６】電子媒介部分Ｕの性質は酸化還元酵素の性
質に依存して変わる。酵素が還元酵素の場合、適した電
子媒介部分は例えば上記の式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（Ｖ
Ｉ）を有する基であり、酵素が酸化酵素の場合、適した
電子媒介部分は例えば上記の式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩ
Ｉ）を有する基である。
質に依存して変わる。酵素が還元酵素の場合、適した電
子媒介部分は例えば上記の式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（Ｖ
Ｉ）を有する基であり、酵素が酸化酵素の場合、適した
電子媒介部分は例えば上記の式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩ
Ｉ）を有する基である。
【００５７】酵素の例は、ビリルビンオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、アラニンオキシダーゼ、キサン
テンオキシダーゼ及び乳酸オキシダーゼならびにコレス
テロールオキシダーゼなどの酸化酵素、グルタチオンレ
ダクターゼ、硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼ、
及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼなどの還元酵素であ
る。
ルコースオキシダーゼ、アラニンオキシダーゼ、キサン
テンオキシダーゼ及び乳酸オキシダーゼならびにコレス
テロールオキシダーゼなどの酸化酵素、グルタチオンレ
ダクターゼ、硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼ、
及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼなどの還元酵素であ
る。
【００５８】図１ａにおいて、結合基３のＸ1は酵素中
のアミノ基と結合できる種類のものである。適したその
ようなＸ1基は例えば−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は
Ｇが上記と同義である一般式Ｒ−ＣＯ−Ｇを有するアシ
ル基である。図１ｂ中のＸ1は酵素のカルボキシル基と
結合できる種類のもの、例えば−ＮＨ2である。
のアミノ基と結合できる種類のものである。適したその
ようなＸ1基は例えば−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は
Ｇが上記と同義である一般式Ｒ−ＣＯ−Ｇを有するアシ
ル基である。図１ｂ中のＸ1は酵素のカルボキシル基と
結合できる種類のもの、例えば−ＮＨ2である。
【００５９】電極材料１と酵素６の酸化還元中心の間の
電子移動経路は、図１ａの二方向矢印により模式的に示
され、電子移動の方向は酵素がレダクターゼであるか又
はオキシダーゼであるかに依存する。
電子移動経路は、図１ａの二方向矢印により模式的に示
され、電子移動の方向は酵素がレダクターゼであるか又
はオキシダーゼであるかに依存する。
【００６０】図２は本発明の他の具体化を示し、酵素１
０のみが結合基１１を用いて電極材料１２の表面上に固
定され、電子媒介物Ｕは回りの溶液中を自由に混転して
いる。酵素の酸化還元中心への電子の移動は電子媒介物
の拡散により保証されている。
０のみが結合基１１を用いて電極材料１２の表面上に固
定され、電子媒介物Ｕは回りの溶液中を自由に混転して
いる。酵素の酸化還元中心への電子の移動は電子媒介物
の拡散により保証されている。
【００６１】図３に示す具体化の場合、電子媒介基１３
のみが結合基１４を用いて電極材料１５の表面上に固定
され、酵素分子１６は溶液中を自由に混転している。必
要なら酵素分子も電子媒介基１３を持つことができる。
電子移動は酵素の拡散により保証され、酵素は拡散によ
り固定された電子媒介基に接触する。
のみが結合基１４を用いて電極材料１５の表面上に固定
され、酵素分子１６は溶液中を自由に混転している。必
要なら酵素分子も電子媒介基１３を持つことができる。
電子移動は酵素の拡散により保証され、酵素は拡散によ
り固定された電子媒介基に接触する。
【００６２】図４に示す具体化の場合、電子媒介基１７
及び酵素分子１８の両方が別の結合基１９により固定さ
れている。
及び酵素分子１８の両方が別の結合基１９により固定さ
れている。
【００６３】ここで本発明の他の具体化に従う電極表面
の略図である図５に言及する。電極材料２１の表面上に
ある本発明に従う各複合体２０は、多数の酸化還元酵素
分子を含み、その中の２２及び２３の２つを示してあ
る。複合体は酵素の１つである２２に結合した結合基２
４を用いて電極材料２１に結合している。酵素は電子媒
介基２５を有する（Ｚ、Ｒ1、Ｘ1、Ｘ3及びＲ４に関し
ては上記を参照）。
の略図である図５に言及する。電極材料２１の表面上に
ある本発明に従う各複合体２０は、多数の酸化還元酵素
分子を含み、その中の２２及び２３の２つを示してあ
る。複合体は酵素の１つである２２に結合した結合基２
４を用いて電極材料２１に結合している。酵素は電子媒
介基２５を有する（Ｚ、Ｒ1、Ｘ1、Ｘ3及びＲ４に関し
ては上記を参照）。
【００６４】酵素分子は層に配置され、第１層の酵素分
子は結合基２４を用いて電極材料に結合しており、その
後の各層の酵素分子は架橋基２６により前の層の酵素分
子に結合している。架橋基２６は一般式Ｗ−Ｒ6−Ｗを
有し、式中Ｗ及びＲ6は式（Ｉ）におけるＸ1及びＲ1と
同義である。
子は結合基２４を用いて電極材料に結合しており、その
後の各層の酵素分子は架橋基２６により前の層の酵素分
子に結合している。架橋基２６は一般式Ｗ−Ｒ6−Ｗを
有し、式中Ｗ及びＲ6は式（Ｉ）におけるＸ1及びＲ1と
同義である。
【００６５】電子移動経路のいくつかを二方向矢印によ
り示し、この場合も電子移動の方向は酵素の性質、すな
わち経路が還元的か又は酸化的かに依存する。
り示し、この場合も電子移動の方向は酵素の性質、すな
わち経路が還元的か又は酸化的かに依存する。
【００６６】ここで本発明のさらに別の具体化に従う電
極表面の略図を示す図６に言及する。この図において、
記号はすでに図１及び２で現れた記号と同義であり、そ
の説明に関して読者はこれらの図の記載を参照する。図
２に示されている具体化と同様にこの具体化の場合も各
複合体３０は多数の酸化還元酵素分子を含み、その中の
２つである３２及び３３を示す。複合体は酵素分子３２
に共有結合した結合基３４により電極基質３１に結合し
ている。酵素分子のそれぞれは、それに共有結合した電
子媒介基３５を伴っている。
極表面の略図を示す図６に言及する。この図において、
記号はすでに図１及び２で現れた記号と同義であり、そ
の説明に関して読者はこれらの図の記載を参照する。図
２に示されている具体化と同様にこの具体化の場合も各
複合体３０は多数の酸化還元酵素分子を含み、その中の
２つである３２及び３３を示す。複合体は酵素分子３２
に共有結合した結合基３４により電極基質３１に結合し
ている。酵素分子のそれぞれは、それに共有結合した電
子媒介基３５を伴っている。
【００６７】複合体中の酵素は、タンパク質中の基又は
電子媒介基に結合できる多数の官能基を有するポリマー
又はポリペプチドＰを含む架橋基３６により互いに結合
している。例えばＰが例えばポリリシンなどのリシンの
豊富なポリペプチドの場合、リシンのアミン基は酵素中
のカルボキシル基と容易に結合することができる。例え
ばＰがポリグルタメートなどのグルタメートの豊富なポ
リペプチドの場合、グルタメートのカルボキシル基が酵
素分子中のアミン基と容易に結合することができる。Ｐ
がポリペプチドの場合、それは図５に示す具体化の架橋
基２６と同様の性質を有する二官能基性基３７を含むこ
とができる。
電子媒介基に結合できる多数の官能基を有するポリマー
又はポリペプチドＰを含む架橋基３６により互いに結合
している。例えばＰが例えばポリリシンなどのリシンの
豊富なポリペプチドの場合、リシンのアミン基は酵素中
のカルボキシル基と容易に結合することができる。例え
ばＰがポリグルタメートなどのグルタメートの豊富なポ
リペプチドの場合、グルタメートのカルボキシル基が酵
素分子中のアミン基と容易に結合することができる。Ｐ
がポリペプチドの場合、それは図５に示す具体化の架橋
基２６と同様の性質を有する二官能基性基３７を含むこ
とができる。
【００６８】二方向矢印は電極材料３１と酵素分子の酸
化還元中心３８の間の複雑な電子移動経路のいくつかを
示す。この場合も電子移動の方向は触媒経路が酸化的で
あるか還元的であるかに依存する。
化還元中心３８の間の複雑な電子移動経路のいくつかを
示す。この場合も電子移動の方向は触媒経路が酸化的で
あるか還元的であるかに依存する。
【００６９】ここで、本発明のさらに別の具体化を示す
図７に言及する。この図において、類似の記号はすべて
前記の図の場合と同義である。この具体化の複合体４１
は結合基４３により電極材料４０に結合した多数の酵素
分子４２を含む。結合基４３は図６に示した具体化にお
けるＰと実質的に同様のポリマー又はポリペプチドＰを
有する。
図７に言及する。この図において、類似の記号はすべて
前記の図の場合と同義である。この具体化の複合体４１
は結合基４３により電極材料４０に結合した多数の酵素
分子４２を含む。結合基４３は図６に示した具体化にお
けるＰと実質的に同様のポリマー又はポリペプチドＰを
有する。
【００７０】この電極の場合の複雑な電子移動経路のい
くつかをここでも二方向矢印により示し、この場合も実
際の方向はその酸化還元経路の性質に依存する。
くつかをここでも二方向矢印により示し、この場合も実
際の方向はその酸化還元経路の性質に依存する。
【００７１】図７の具体化の場合も酵素の層を追加して
形成することができる。
形成することができる。
【００７２】すでに上記で指摘した通り、図５−７に示
した具体化のように電極が数層の酵素分子を含む本発明
の具体化の場合外層は、被検体以外の試薬が電極材料又
は電子媒介物と接触した場合の非特異的な、場合により
酸化又は還元を避けるためにこれらの試薬を分解する目
的の非酸化還元酵素を含むことができる。そのような試
薬が分解されないと非特異的電流を起こし、従って結果
の精度を減少させる。図５−７の具体化の修正に従い、
電子媒介基を複合体内に、又はそこへの付加物として含
む代わりに、電子媒介物を電極の回りの溶液に溶解する
ことにより電子媒介を与えることができる。そのような
場合電子移動は溶液中におけるこれらの化合物の自由な
拡散により保証される。
した具体化のように電極が数層の酵素分子を含む本発明
の具体化の場合外層は、被検体以外の試薬が電極材料又
は電子媒介物と接触した場合の非特異的な、場合により
酸化又は還元を避けるためにこれらの試薬を分解する目
的の非酸化還元酵素を含むことができる。そのような試
薬が分解されないと非特異的電流を起こし、従って結果
の精度を減少させる。図５−７の具体化の修正に従い、
電子媒介基を複合体内に、又はそこへの付加物として含
む代わりに、電子媒介物を電極の回りの溶液に溶解する
ことにより電子媒介を与えることができる。そのような
場合電子移動は溶液中におけるこれらの化合物の自由な
拡散により保証される。
【００７３】本発明の電極は試験試料中の特定の被検体
の存在及び濃度を調べるために有用である。電極の回り
の溶液中に被検体が存在する場合、（電子媒介基が電極
上の複合体の一部として含まれない場合その溶液は電子
媒介化合物も含まなければならない）、その被検体は酸
化還元酵素により場合によって還元又は酸化されること
ができ、電極に適した電圧がかけられると電荷がそれぞ
れ酵素に、又は酵素から移動し、それが溶液中の被検体
の存在の指標となる。電荷の流れの大きさは溶液中の被
検体の濃度と比例する。酵素がレダクターゼ酵素の場
合、電極に負の電圧をかけるべきであり、酵素がオキシ
ダーゼ酵素の場合、電圧は正でなければならない（前者
の場合電子の移動は電極基質から酸化還元中心であり、
後者の場合は逆である）。
の存在及び濃度を調べるために有用である。電極の回り
の溶液中に被検体が存在する場合、（電子媒介基が電極
上の複合体の一部として含まれない場合その溶液は電子
媒介化合物も含まなければならない）、その被検体は酸
化還元酵素により場合によって還元又は酸化されること
ができ、電極に適した電圧がかけられると電荷がそれぞ
れ酵素に、又は酵素から移動し、それが溶液中の被検体
の存在の指標となる。電荷の流れの大きさは溶液中の被
検体の濃度と比例する。酵素がレダクターゼ酵素の場
合、電極に負の電圧をかけるべきであり、酵素がオキシ
ダーゼ酵素の場合、電圧は正でなければならない（前者
の場合電子の移動は電極基質から酸化還元中心であり、
後者の場合は逆である）。
【００７４】電荷の流れにより被検体の濃度を決定せず
に、ある時間の後に酸化還元反応の生成物の濃度を測定
することにより濃度を決定することもある。
に、ある時間の後に酸化還元反応の生成物の濃度を測定
することにより濃度を決定することもある。
【００７５】ここで以下の実施例により本発明をさらに
例示する。
例示する。
【００７６】
実施例１ 分子中に硫黄定着基（ａｎｃｈｏｒ ｇｒｏｕｐ）を含
む二官能基性試薬の使用により電極に共有結合した酵素
下記の方法は図８に模式的に示す。
む二官能基性試薬の使用により電極に共有結合した酵素
下記の方法は図８に模式的に示す。
【００７７】むきだしの金（Ａｕ）電極（箔、幾何学的
面積０．２ｃｍ2）を濃硝酸中に約１０分間浸し、その
後電極を水及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で十
分に濯いだ。そのような予備処理の後、電極を１ｘ１０
-2Ｍのジチオ−ビス−（コハク酸イミジルプロピオネー
ト（ＤＳＰ、Ｆｌｕｋａ）を含むＤＭＳＯ中に２時間浸
し、ＤＭＳＯで３回、及び水で１回濯いだ。
面積０．２ｃｍ2）を濃硝酸中に約１０分間浸し、その
後電極を水及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で十
分に濯いだ。そのような予備処理の後、電極を１ｘ１０
-2Ｍのジチオ−ビス−（コハク酸イミジルプロピオネー
ト（ＤＳＰ、Ｆｌｕｋａ）を含むＤＭＳＯ中に２時間浸
し、ＤＭＳＯで３回、及び水で１回濯いだ。
【００７８】結合したコハク酸イミジル活性エステル基
を有する電極を、１００Ｕ／ｍｌのグルタチオンレダク
ターゼ（パン酵母から、ＥＣ１．６．４．２，Ｓｉｇｍ
ａ）を含む０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２中で
４℃にて終夜インキュベートし、同緩衝液で３回濯いで
非−結合酵素を電極表面から除去した。
を有する電極を、１００Ｕ／ｍｌのグルタチオンレダク
ターゼ（パン酵母から、ＥＣ１．６．４．２，Ｓｉｇｍ
ａ）を含む０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２中で
４℃にて終夜インキュベートし、同緩衝液で３回濯いで
非−結合酵素を電極表面から除去した。
【００７９】別の二官能基性試薬：次式：
【００８０】
【化１１】
【００８１】を有するジメチル−３，３’−ジチオプロ
ピオンイミデート塩酸塩（ＤＴＢＰ、Ｆｌｕｋａ）を用
いるが、同一方法に従った。
ピオンイミデート塩酸塩（ＤＴＢＰ、Ｆｌｕｋａ）を用
いるが、同一方法に従った。
【００８２】次式：
【００８３】
【化１２】
【００８４】を有する３，３’−ジチオ−ビス−（スル
ホコハク酸イミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ、Ｐ
ｉｅｒｃｅ）などの水溶性スルホン化二官能基性試薬を
用い、ＤＭＳＯではなく水溶液中で電極修飾を行うこと
ができる。
ホコハク酸イミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ、Ｐ
ｉｅｒｃｅ）などの水溶性スルホン化二官能基性試薬を
用い、ＤＭＳＯではなく水溶液中で電極修飾を行うこと
ができる。
【００８５】グルタチオンレダクターゼ以外に以下の他
の酵素も同一方法で電極に結合させることができる：リ
ポアミドデヒドロゲナーゼ（ウシ腸粘膜から、ＥＣ１．
８．１．４）及びフェレドキシンＮＡＤＰ+レダクター
ゼ（ほうれんそうの葉から、ＥＣ１．１８．１．２．，
Ｓｉｇｍａ）及びグルコースオキシダーゼ。
の酵素も同一方法で電極に結合させることができる：リ
ポアミドデヒドロゲナーゼ（ウシ腸粘膜から、ＥＣ１．
８．１．４）及びフェレドキシンＮＡＤＰ+レダクター
ゼ（ほうれんそうの葉から、ＥＣ１．１８．１．２．，
Ｓｉｇｍａ）及びグルコースオキシダーゼ。
【００８６】上記の二官能基性試薬により修飾した電極
上にアミノ化合物を固定する能力を調べるために、酸化
還元活性アミノキノンである２−クロロ−３−（４−ア
ミノブチル）−１，４−ナフトキノンをコハク酸イミジ
ル活性エステル基に結合した。水バックグラウンド
（０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２）に対するサ
イクリックボルタモグラムを得、カチオン及びアニオン
ピークの積分により活性基の表面濃度を約８ｘ１０-11
モル／ｃｍ2と確認した（サイクリックボルタモグラム
は図９に示す）。
上にアミノ化合物を固定する能力を調べるために、酸化
還元活性アミノキノンである２−クロロ−３−（４−ア
ミノブチル）−１，４−ナフトキノンをコハク酸イミジ
ル活性エステル基に結合した。水バックグラウンド
（０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２）に対するサ
イクリックボルタモグラムを得、カチオン及びアニオン
ピークの積分により活性基の表面濃度を約８ｘ１０-11
モル／ｃｍ2と確認した（サイクリックボルタモグラム
は図９に示す）。
【００８７】電極表面上に固定された酵素の表面濃度の
決定のために、グルタチオンレダクターゼ分子をＨ3−
ヨード酢酸で標識し、その後それを電極上に固定した。
酵素修飾電極の放射活性の測定により、表面濃度を約２
ｘ１０-11モル／ｃｍ2と決定した。
決定のために、グルタチオンレダクターゼ分子をＨ3−
ヨード酢酸で標識し、その後それを電極上に固定した。
酵素修飾電極の放射活性の測定により、表面濃度を約２
ｘ１０-11モル／ｃｍ2と決定した。
【００８８】実施例２ 複合体の定着のためのシスタミン又はシステアミンの使
用による電極の製造下記の電極の製造法は図１０に示
す。
用による電極の製造下記の電極の製造法は図１０に示
す。
【００８９】実施例１に記載の硝酸を用いた予備処理の
後、Ａｕ電極を０．０２Ｍのシスタミン（２，２’−ジ
アミノジエチルジスルフィド、Ｆｌｕｋａ）を含む０．
１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２に２時間浸した。そ
の後電極を蒸留水で繰り返し濯ぎ、１ｘ１０-2Ｍの４，
４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスル
ホン酸（ＤＩＤＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）を含む同リン酸塩緩
衝液中に０℃にて１０分間浸した。
後、Ａｕ電極を０．０２Ｍのシスタミン（２，２’−ジ
アミノジエチルジスルフィド、Ｆｌｕｋａ）を含む０．
１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２に２時間浸した。そ
の後電極を蒸留水で繰り返し濯ぎ、１ｘ１０-2Ｍの４，
４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスル
ホン酸（ＤＩＤＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）を含む同リン酸塩緩
衝液中に０℃にて１０分間浸した。
【００９０】修飾電極を再度水で濯ぎ、１００Ｕ／ｍｌ
のグルタチオンレダクターゼを含むリン酸塩緩衝液中、
０℃にて１時間インキュベートした。その後酵素−修飾
電極をリン酸塩緩衝液で３回濯ぎ、非−固定酵素を除去
した。
のグルタチオンレダクターゼを含むリン酸塩緩衝液中、
０℃にて１時間インキュベートした。その後酵素−修飾
電極をリン酸塩緩衝液で３回濯ぎ、非−固定酵素を除去
した。
【００９１】シスタミンではなくチオール定着基［Ｈ2
Ｎ−（ＣＨ2）2−ＳＨ］を含むシステアミンを用い、類
似の方法により電極を製造したが、この場合Ａｕ電極の
浸漬は最高約１分間に減少させることができた。
Ｎ−（ＣＨ2）2−ＳＨ］を含むシステアミンを用い、類
似の方法により電極を製造したが、この場合Ａｕ電極の
浸漬は最高約１分間に減少させることができた。
【００９２】同一方法に従い、ＤＩＤＳの代わりにビス
（コハク酸イミジル）スベレート（ＢＳ、Ｐｉｅｒｃ
ｅ）などの他の二官能基性試薬を用いることができる。
ＢＳは次式を有する：
（コハク酸イミジル）スベレート（ＢＳ、Ｐｉｅｒｃ
ｅ）などの他の二官能基性試薬を用いることができる。
ＢＳは次式を有する：
【００９３】
【化１３】
【００９４】アミノ基の表面濃度の決定のために、シス
タミン（又はシステアミン）を用いた電極の修飾の直後
に２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノンをそこに結
合させた。ＤＩＤＳ修飾の前及びそのような修飾の後の
アミノ基の表面濃度の比較により、両方の場合のキノン
の結合を比較することができる。図１１はシスタミンで
修飾し、その後キノンで修飾した電極のサイクリックボ
ルタモグラムを示し、第２の修飾はシスタミン修飾の直
後（実線）又はＤＩＤＳを用いて１時間処理した後（破
線）である。図１２はＤＩＤＳ処理時間の関数としての
キノンの表面濃度を示す。わかる通り、ＤＩＤＳとの約
１０分の反応の後、表面アミノ基の約半分が二官能基性
試薬ＤＩＤＳにより遮蔽される。
タミン（又はシステアミン）を用いた電極の修飾の直後
に２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノンをそこに結
合させた。ＤＩＤＳ修飾の前及びそのような修飾の後の
アミノ基の表面濃度の比較により、両方の場合のキノン
の結合を比較することができる。図１１はシスタミンで
修飾し、その後キノンで修飾した電極のサイクリックボ
ルタモグラムを示し、第２の修飾はシスタミン修飾の直
後（実線）又はＤＩＤＳを用いて１時間処理した後（破
線）である。図１２はＤＩＤＳ処理時間の関数としての
キノンの表面濃度を示す。わかる通り、ＤＩＤＳとの約
１０分の反応の後、表面アミノ基の約半分が二官能基性
試薬ＤＩＤＳにより遮蔽される。
【００９５】電極表面上のＤＩＤＳの表面濃度を評価す
る他の方法は、側鎖の末端にアミノ基を有するキノンを
アミン基とＤＩＤＳの活性イソチオシアノ基の反応によ
り共有結合させて固定する方法である。図１３に示した
種類のサイクリックボルタモグラムの陰極（又は陽極）
ピーク積分は、キノンの表面濃度の尺度を与え、この値
は上記で得た値と一般的に一致するが少し低い濃度を示
し、それは電極修飾の間の加水分解によるイソチオシア
ナート基の一部の失活から生ずると思われる。 実施例３ 実施例１の電極の活性 固定された酵素を、可動性電子移動媒介物である次式
る他の方法は、側鎖の末端にアミノ基を有するキノンを
アミン基とＤＩＤＳの活性イソチオシアノ基の反応によ
り共有結合させて固定する方法である。図１３に示した
種類のサイクリックボルタモグラムの陰極（又は陽極）
ピーク積分は、キノンの表面濃度の尺度を与え、この値
は上記で得た値と一般的に一致するが少し低い濃度を示
し、それは電極修飾の間の加水分解によるイソチオシア
ナート基の一部の失活から生ずると思われる。 実施例３ 実施例１の電極の活性 固定された酵素を、可動性電子移動媒介物である次式
【００９６】
【化１４】
【００９７】を有するメチルビオロゲン（ＭＶ2+）を溶
解することにより電極材料と電気的にカップリングし
た。
解することにより電極材料と電気的にカップリングし
た。
【００９８】この系の電子移動経路を図１４に示す。図
１５は１ｘ１０-3ＭのＭＶ2+及び酵素の基質である０．
０１Ｍのグルタチオン（酸化型、ＧＳＳＧ）を含む溶液
中で得たサイクリックボルタモグラム（実線）及びＭＶ
2+を含まない溶液中で得たもの（破線）を示す。曲線は
ビオロゲンに関する可逆的電気化学的酸化還元過程を明
らかにし、電極本体の表面上に形成された複合体の単層
によりこの過程が遮蔽されないことを示す。−０．７Ｖ
（ＳＣＥに対して）の一定の電圧における酵素−修飾電
極を用いた溶液の電気分解により、還元型のグルタチオ
ン、ＧＳＨが形成される。スペクトル分析により決定さ
れたＧＳＨの蓄積を図１６に示す。
１５は１ｘ１０-3ＭのＭＶ2+及び酵素の基質である０．
０１Ｍのグルタチオン（酸化型、ＧＳＳＧ）を含む溶液
中で得たサイクリックボルタモグラム（実線）及びＭＶ
2+を含まない溶液中で得たもの（破線）を示す。曲線は
ビオロゲンに関する可逆的電気化学的酸化還元過程を明
らかにし、電極本体の表面上に形成された複合体の単層
によりこの過程が遮蔽されないことを示す。−０．７Ｖ
（ＳＣＥに対して）の一定の電圧における酵素−修飾電
極を用いた溶液の電気分解により、還元型のグルタチオ
ン、ＧＳＨが形成される。スペクトル分析により決定さ
れたＧＳＨの蓄積を図１６に示す。
【００９９】実施例４ 複合体に電子媒介基を共有結合させることによる電極の
追加の修飾 実施例１又は２に従って製造した電極を、スペーサーの
長さが異なり次式：
追加の修飾 実施例１又は２に従って製造した電極を、スペーサーの
長さが異なり次式：
【０１００】
【化１５】
【０１０１】［式中ｎ＝１−１６］を有するビオロゲン
のカルボキシ誘導体によりさらに修飾した。修飾はその
カルボキシ基と酵素分子中のリシン残基のアミノ基との
カーボジイミドカップリングを用いた。そのようなカッ
プリングを行うために、実施例１又は２に従って製造し
た電極を、０．０１Ｍの構造ＩＶのビオロゲンのカルボ
ン酸誘導体、カップリング剤としての０．０１Ｍの１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カーボジ
イミド（ＥＤＣ）、及び内殻リシン残基を開くための
１．０Ｍのウレアを含む０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝溶
液、ｐＨ７．３中に４℃にて終夜浸した。インキュベー
ションの後電極をリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．３で濯ぎ、
非−結合成分すべてを電極表面から除去した。方法及び
最終的電子移動経路を図１７に模式的に示す。
のカルボキシ誘導体によりさらに修飾した。修飾はその
カルボキシ基と酵素分子中のリシン残基のアミノ基との
カーボジイミドカップリングを用いた。そのようなカッ
プリングを行うために、実施例１又は２に従って製造し
た電極を、０．０１Ｍの構造ＩＶのビオロゲンのカルボ
ン酸誘導体、カップリング剤としての０．０１Ｍの１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カーボジ
イミド（ＥＤＣ）、及び内殻リシン残基を開くための
１．０Ｍのウレアを含む０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝溶
液、ｐＨ７．３中に４℃にて終夜浸した。インキュベー
ションの後電極をリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．３で濯ぎ、
非−結合成分すべてを電極表面から除去した。方法及び
最終的電子移動経路を図１７に模式的に示す。
【０１０２】得られた電極をサイクリックボルタムメト
リーにより研究し、固定されたビオロゲンの酸化還元転
移に関して調べた。酸化還元電位Ｅ0＝−０．５８Ｖの
可逆的電気化学的還元が見られた。２メチレン基の短い
スペーサーを有する誘導体以外のすべてのビオロゲンの
カルボキシ誘導体の場合に類似の曲線が得られた。
リーにより研究し、固定されたビオロゲンの酸化還元転
移に関して調べた。酸化還元電位Ｅ0＝−０．５８Ｖの
可逆的電気化学的還元が見られた。２メチレン基の短い
スペーサーを有する誘導体以外のすべてのビオロゲンの
カルボキシ誘導体の場合に類似の曲線が得られた。
【０１０３】１電子還元をビオロゲン酸化還元過程の第
１段階の特徴と仮定し、陰極（又は陽極）ピークの積分
により、固定されたビオロゲンの表面濃度を算出し、約
１．６ｘ１０-10モル／ｃｍ2の値を得た。固定タンパク
質の表面濃度は約２ｘ１０-11モル／ｃｍ2と評価された
ので（実施例１を参照）、そのような基の平均数は約８
を意味し、すなわちグルタチオンレダクターゼ中の３９
リシン残基中８がこれらの酸化還元基により修飾され
る。
１段階の特徴と仮定し、陰極（又は陽極）ピークの積分
により、固定されたビオロゲンの表面濃度を算出し、約
１．６ｘ１０-10モル／ｃｍ2の値を得た。固定タンパク
質の表面濃度は約２ｘ１０-11モル／ｃｍ2と評価された
ので（実施例１を参照）、そのような基の平均数は約８
を意味し、すなわちグルタチオンレダクターゼ中の３９
リシン残基中８がこれらの酸化還元基により修飾され
る。
【０１０４】実施例５ 実施例１に従って製造され、実施例４に従って電子媒介
基により修飾された電極の機能 実施例１に従って製造され、実施例４に従って電子媒介
基により修飾された酵素−修飾電極はタンパク質球に直
接結合した酸化還元活性成分を含む。スペーサーの長さ
が異なる（Ｃ＝２、５、１１）媒介基を有する電極を用
いた。０．０１ＭのＧＳＳＧ及び０．１Ｍのリン酸塩緩
衝液、ｐＨ７．２を含む溶液に電極を浸し、−０．７Ｖ
（ＳＣＥに対して）の負の電圧をかけた。スペクトル分
析（実施例３と同様）によりＧＳＨ蓄積を観察した。タ
ンパク質に結合したアルキレン鎖の長さの異なるビピリ
ジニウムリレーを用いることによる時間の関数としての
ＧＳＨの蓄積を図１８に示す。わかる通り、スペーサー
の長さが増すと電気的交流が向上し、これは電子−ドナ
ー距離の短縮の結果タンパク質内電子移動速度が増した
ためと思われる。すなわち柔軟なアルキル“アーム”が
電子媒介部分と酵素の活性部位の間のより短いタンパク
質内電子移動距離を形成し、電気的交流が増した。
基により修飾された電極の機能 実施例１に従って製造され、実施例４に従って電子媒介
基により修飾された酵素−修飾電極はタンパク質球に直
接結合した酸化還元活性成分を含む。スペーサーの長さ
が異なる（Ｃ＝２、５、１１）媒介基を有する電極を用
いた。０．０１ＭのＧＳＳＧ及び０．１Ｍのリン酸塩緩
衝液、ｐＨ７．２を含む溶液に電極を浸し、−０．７Ｖ
（ＳＣＥに対して）の負の電圧をかけた。スペクトル分
析（実施例３と同様）によりＧＳＨ蓄積を観察した。タ
ンパク質に結合したアルキレン鎖の長さの異なるビピリ
ジニウムリレーを用いることによる時間の関数としての
ＧＳＨの蓄積を図１８に示す。わかる通り、スペーサー
の長さが増すと電気的交流が向上し、これは電子−ドナ
ー距離の短縮の結果タンパク質内電子移動速度が増した
ためと思われる。すなわち柔軟なアルキル“アーム”が
電子媒介部分と酵素の活性部位の間のより短いタンパク
質内電子移動距離を形成し、電気的交流が増した。
【０１０５】電極の電気的酵素活性は、電極製造の最終
段階のウレアの存在に強く依存することが見いだされ
た。ウレアが不在の場合、得られた電極は固定ビオロゲ
ンに関して同一の電気化学的性質を有したが、固定ビオ
ロゲンと酵素の活性中心の間の電気的交流が不足してい
た。そのような電極の場合、拡散により可動性の電子移
動媒介物の存在下のみに電気的酵素活性が得られた。
段階のウレアの存在に強く依存することが見いだされ
た。ウレアが不在の場合、得られた電極は固定ビオロゲ
ンに関して同一の電気化学的性質を有したが、固定ビオ
ロゲンと酵素の活性中心の間の電気的交流が不足してい
た。そのような電極の場合、拡散により可動性の電子移
動媒介物の存在下のみに電気的酵素活性が得られた。
【０１０６】実施例６ 実施例２に従って製造され、実施例４に従って電子移動
媒介物により修飾された電極の機能 実施例２に従って製造され、実施例４に従って電子移動
媒介物により修飾された電子−修飾電極はタンパク質球
のみでなく、その多くがＤＩＤＳにより遮蔽されていな
い電極表面上のアミノ基にも結合した酸化還元活性成分
を含む。実施例２で示した通り、シスタミンで修飾し、
その後ＤＩＤＳにより１０分間処理した電極は約５０％
の非−遮蔽アミノ基をその表面上に有した（図１２を参
照）。実施例４に従ってビオロゲンのカルボキシ誘導体
で修飾した後、この電極の媒介基は電極表面とタンパク
質球の両方に結合した。固定ビオロゲンの表面濃度は５
ｘ１０-10モル／ｃｍ2と算出され、これは実施例４で得
た値より少し高い。電極と固定ビオロゲンの間の電子移
動の速度定数を実施例４に記載の通りに算出し、非常に
類似した値である約１００ｓ-1が得られた。電極の電気
的酵素活性を実施例５に記載した通りに研究し、図１９
に示す通り非常に類似したＧＳＨ蓄積速度が観察され
た。
媒介物により修飾された電極の機能 実施例２に従って製造され、実施例４に従って電子移動
媒介物により修飾された電子−修飾電極はタンパク質球
のみでなく、その多くがＤＩＤＳにより遮蔽されていな
い電極表面上のアミノ基にも結合した酸化還元活性成分
を含む。実施例２で示した通り、シスタミンで修飾し、
その後ＤＩＤＳにより１０分間処理した電極は約５０％
の非−遮蔽アミノ基をその表面上に有した（図１２を参
照）。実施例４に従ってビオロゲンのカルボキシ誘導体
で修飾した後、この電極の媒介基は電極表面とタンパク
質球の両方に結合した。固定ビオロゲンの表面濃度は５
ｘ１０-10モル／ｃｍ2と算出され、これは実施例４で得
た値より少し高い。電極と固定ビオロゲンの間の電子移
動の速度定数を実施例４に記載の通りに算出し、非常に
類似した値である約１００ｓ-1が得られた。電極の電気
的酵素活性を実施例５に記載した通りに研究し、図１９
に示す通り非常に類似したＧＳＨ蓄積速度が観察され
た。
【０１０７】実施例７ 電極上へのグルコースオキシダーゼの固定 金電極を室温にてエタノール中の１−チオヘプタン酸
（０．０２Ｍ）中で終夜インキュベートした。その後電
極をエタノールで５回、その後７．３リン酸塩緩衝液
（０．１Ｍ）で再度濯ぎ、２ｍｇ／ｍｌのグルコースオ
キシダーゼを含む溶液及び０．０２ＭのＥＤＣと共にイ
ンキュベートした。得られた電極の表面を図２０に模式
的に示す（Ｅはグルコースオキシダーゼ酵素を示す）。
（０．０２Ｍ）中で終夜インキュベートした。その後電
極をエタノールで５回、その後７．３リン酸塩緩衝液
（０．１Ｍ）で再度濯ぎ、２ｍｇ／ｍｌのグルコースオ
キシダーゼを含む溶液及び０．０２ＭのＥＤＣと共にイ
ンキュベートした。得られた電極の表面を図２０に模式
的に示す（Ｅはグルコースオキシダーゼ酵素を示す）。
【０１０８】１０ｍＭのグルコースを含む、及び含まな
い溶液中の０．１ｍＭのフェロセンのカルボキシ誘導体
（ＸＩ）
い溶液中の０．１ｍＭのフェロセンのカルボキシ誘導体
（ＸＩ）
【０１０９】
【化１６】
【０１１０】の存在下のサイクリックボルタモグラム
（２ｍＶ／秒の走査速度）を図２１に示し、図中で
（ａ）はグルコースを含まない場合のサイクリックボル
タモグラムであり、（ｂ）は１０ｍＭのグルコースの存
在下のものである。
（２ｍＶ／秒の走査速度）を図２１に示し、図中で
（ａ）はグルコースを含まない場合のサイクリックボル
タモグラムであり、（ｂ）は１０ｍＭのグルコースの存
在下のものである。
【０１１１】わかる通り、グルコースの存在下ではグル
コースの触媒酸化から生ずる電荷の流れの劇的な増加が
ある。
コースの触媒酸化から生ずる電荷の流れの劇的な増加が
ある。
【０１１２】実施例８ 固定フェロセンを有する電極の利用 金電極を室温にて０．０２Ｍのシスタミン二塩酸塩溶液
中で２時間インキュベートした。電極を３回蒸留した水
で５回、及び０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２で
２回濯いだ。その後電極を室温にて、０．０２ＭのＥＤ
Ｃの存在下のＨＥＰＥＳ緩衝液中の０．０２Ｍのフェロ
センのカルボキシ誘導体（ＸＩ）と共に終夜インキュベ
ートした。得られた電極の表面を図２２に模式的に示す
（Ｆｃ：フェロセン）。
中で２時間インキュベートした。電極を３回蒸留した水
で５回、及び０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２で
２回濯いだ。その後電極を室温にて、０．０２ＭのＥＤ
Ｃの存在下のＨＥＰＥＳ緩衝液中の０．０２Ｍのフェロ
センのカルボキシ誘導体（ＸＩ）と共に終夜インキュベ
ートした。得られた電極の表面を図２２に模式的に示す
（Ｆｃ：フェロセン）。
【０１１３】この修飾の後、電極をＨＥＰＥＳ緩衝液で
５回濯ぎ、サイクリックボルタムメトリーにより固定フ
ェロセンの存在を調べた。その後２５０単位のグルコー
スオキシダーゼを電気化学槽に加え、異なるグルコース
濃度で２ｍＶ／秒の走査速度にてサイクリックボルタム
メトリーを行った。電極を＋０．５Ｖに固定し、異なる
グルコース濃度で得られた電流を図２３に示し、グルコ
ース濃度と測定電流の間に直線関係があることがわか
る。
５回濯ぎ、サイクリックボルタムメトリーにより固定フ
ェロセンの存在を調べた。その後２５０単位のグルコー
スオキシダーゼを電気化学槽に加え、異なるグルコース
濃度で２ｍＶ／秒の走査速度にてサイクリックボルタム
メトリーを行った。電極を＋０．５Ｖに固定し、異なる
グルコース濃度で得られた電流を図２３に示し、グルコ
ース濃度と測定電流の間に直線関係があることがわか
る。
【０１１４】実施例９ 数層の酵素で修飾した電極の製造 実施例１又は２に従って製造した酵素−修飾電極を二官
能基性試薬で再度処理することができる。そのような電
極の修飾の順序を図２４に模式的に示す。実施例１又は
２に従って電極を修飾し、実施例４に詳細に記載した通
りに電子媒介基を結合した後、０℃にてＤＩＤＳを用い
て１０分間、電極に２回目の処理を行った。この２回目
の修飾の後、酵素の第２層を実施例４と同一方法に従っ
て電極上に固定した。時々は、ビオロゲンのカルボキシ
誘導体を実施例４に記載の方法と同一方法で酵素分子に
結合させた。種々の実験においてこれらのビオロゲンの
カルボキシ誘導体は種々の鎖長を有し、アルキレン中の
炭素の数は６−１１で変化した。
能基性試薬で再度処理することができる。そのような電
極の修飾の順序を図２４に模式的に示す。実施例１又は
２に従って電極を修飾し、実施例４に詳細に記載した通
りに電子媒介基を結合した後、０℃にてＤＩＤＳを用い
て１０分間、電極に２回目の処理を行った。この２回目
の修飾の後、酵素の第２層を実施例４と同一方法に従っ
て電極上に固定した。時々は、ビオロゲンのカルボキシ
誘導体を実施例４に記載の方法と同一方法で酵素分子に
結合させた。種々の実験においてこれらのビオロゲンの
カルボキシ誘導体は種々の鎖長を有し、アルキレン中の
炭素の数は６−１１で変化した。
【０１１５】上記の方法の後、得られた電極は酵素の２
層を有し、多層酵素電極を得るためにこの方法を所望の
サイクル数で繰り返した。
層を有し、多層酵素電極を得るためにこの方法を所望の
サイクル数で繰り返した。
【０１１６】図２５は固定されたビオロゲンのカルボキ
シ誘導体を含まない電極を用い、メチルビオロゲンを電
極の回りの溶液中に溶解した場合の、時間の関数として
のＧＳＨの蓄積を示す。２層の酵素（Ｅｌ２）又は９層
の酵素（Ｅｌ９）を含む電極を用い、溶液中のメチルビ
オロゲンの濃度は１０ｍＭであった。わかる通りＥｌ９
電極中のＧＳＨ蓄積速度はＥｌ２電極よりかなり速い。
シ誘導体を含まない電極を用い、メチルビオロゲンを電
極の回りの溶液中に溶解した場合の、時間の関数として
のＧＳＨの蓄積を示す。２層の酵素（Ｅｌ２）又は９層
の酵素（Ｅｌ９）を含む電極を用い、溶液中のメチルビ
オロゲンの濃度は１０ｍＭであった。わかる通りＥｌ９
電極中のＧＳＨ蓄積速度はＥｌ２電極よりかなり速い。
【０１１７】図２４に示した方法に従い、ビオロゲンの
カルボキシ誘導体（アルキレン鎖中の炭素数が１０）の
結合を含む数層の酵素グルタチオンレダクターゼを有す
る電極を製造した。サイクリックボルタムメトリー実験
を行い、図２６に示す結果は電極の電気応答が酵素の層
の数に明確に依存していることを示す。
カルボキシ誘導体（アルキレン鎖中の炭素数が１０）の
結合を含む数層の酵素グルタチオンレダクターゼを有す
る電極を製造した。サイクリックボルタムメトリー実験
を行い、図２６に示す結果は電極の電気応答が酵素の層
の数に明確に依存していることを示す。
【０１１８】別の組の実験において酵素を放射活性標識
し、層の数に対する標識を調べた。図２６でわかる通
り、層の数と放射活性の間の直線関係を見ることがで
き、層の数の増加に伴う酵素分子の数の直線的増加を示
している。
し、層の数に対する標識を調べた。図２６でわかる通
り、層の数と放射活性の間の直線関係を見ることがで
き、層の数の増加に伴う酵素分子の数の直線的増加を示
している。
【０１１９】実施例１０ 酵素及び末端酸化還元−活性基を含むポリマーの共−固
定 この実施例の電極の製造法を図２８に模式的に示す。
定 この実施例の電極の製造法を図２８に模式的に示す。
【０１２０】実施例２に記載の通りに電極をシスタミン
で修飾し、ＤＩＤＳで活性化し、その後実施例２に記載
の酵素の固定法と類似の方法に従ってポリリシン鎖（図
２８中のＰＬ）を電極上に固定した。ポリリシン鎖はビ
ピリジニウム基を有し、それはビピリジニウム誘導体の
カルボキシ基とポリマーのアミノ基のカーボジイミドカ
ップリングによりポリリシン鎖のアミノ基に共有結合し
た。ポリマー上に非−修飾基を残すためにビピリジニウ
ム基の負荷率はあまり高くしなかった。
で修飾し、ＤＩＤＳで活性化し、その後実施例２に記載
の酵素の固定法と類似の方法に従ってポリリシン鎖（図
２８中のＰＬ）を電極上に固定した。ポリリシン鎖はビ
ピリジニウム基を有し、それはビピリジニウム誘導体の
カルボキシ基とポリマーのアミノ基のカーボジイミドカ
ップリングによりポリリシン鎖のアミノ基に共有結合し
た。ポリマー上に非−修飾基を残すためにビピリジニウ
ム基の負荷率はあまり高くしなかった。
【０１２１】ポリマーの固定の後、電極を再度ＤＩＤＳ
で処理し、濯いだ後に酵素をＤＩＤＳ基への結合により
電極上に固定した。ＤＩＤＳとの反応及びその後ポリリ
シンの次の層の固定、ＤＩＤＳを用いた処理及び酵素の
次の層の固定という手順を多数回繰り返し、多数の酵素
層を有する電極を得ることができる。
で処理し、濯いだ後に酵素をＤＩＤＳ基への結合により
電極上に固定した。ＤＩＤＳとの反応及びその後ポリリ
シンの次の層の固定、ＤＩＤＳを用いた処理及び酵素の
次の層の固定という手順を多数回繰り返し、多数の酵素
層を有する電極を得ることができる。
【０１２２】実施例１１ ビリルビンオキシダーゼの電極上への固定及びビリルビ
ンの電流測定 この実施例の電極の製造法を図２９に模式的に示す。
ンの電流測定 この実施例の電極の製造法を図２９に模式的に示す。
【０１２３】むきだしの金電極を実施例１に記載の方法
で連続して濃ＨＮＯ3で処理し、蒸留水で濯ぎ、ＤＭＳ
Ｏで濯ぎ、その後ＤＭＳＯ中の２ｘ１０-2Ｍのジチオ−
ビス−（コハク酸イミジルプロピオネート）で修飾し
た。修飾電極を溶液から取り出し、ＤＭＳＯで２回及び
冷（０℃）リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．３）で
１回洗浄した。電極を２．５ｍｌのリン酸塩緩衝液中の
１００Ｕのビリルビンオキシダーゼの溶液に４℃で終夜
浸すことにより修飾電極にビリルビンオキシダーゼの第
１層を共有結合により固定し、その後それを冷リン酸塩
緩衝液で洗浄した。ビリルビンオキシダーゼの連続層を
ＤＩＤＳによりベース層に結合した。酵素電極をリン酸
塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．３）中０．０２ＭのＤＩ
ＤＳの冷（０℃）溶液２．５ｍｌに１０分間浸した。そ
の後電極をＤＩＤＳ溶液から取り出し、冷リン酸塩緩衝
液で２回洗浄し、その後酵素溶液に０℃で３０分間浸し
た。この方法を所望の数のビリルビンオキシダーゼの層
が電極に結合するまで繰り返した。
で連続して濃ＨＮＯ3で処理し、蒸留水で濯ぎ、ＤＭＳ
Ｏで濯ぎ、その後ＤＭＳＯ中の２ｘ１０-2Ｍのジチオ−
ビス−（コハク酸イミジルプロピオネート）で修飾し
た。修飾電極を溶液から取り出し、ＤＭＳＯで２回及び
冷（０℃）リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．３）で
１回洗浄した。電極を２．５ｍｌのリン酸塩緩衝液中の
１００Ｕのビリルビンオキシダーゼの溶液に４℃で終夜
浸すことにより修飾電極にビリルビンオキシダーゼの第
１層を共有結合により固定し、その後それを冷リン酸塩
緩衝液で洗浄した。ビリルビンオキシダーゼの連続層を
ＤＩＤＳによりベース層に結合した。酵素電極をリン酸
塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．３）中０．０２ＭのＤＩ
ＤＳの冷（０℃）溶液２．５ｍｌに１０分間浸した。そ
の後電極をＤＩＤＳ溶液から取り出し、冷リン酸塩緩衝
液で２回洗浄し、その後酵素溶液に０℃で３０分間浸し
た。この方法を所望の数のビリルビンオキシダーゼの層
が電極に結合するまで繰り返した。
【０１２４】溶液中で自由に混転する電子移動媒介物と
してのフェロセンカルボン酸（５ｘ１０-4Ｍ）を含むＴ
ＲＩＳ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ８．０）中のビリルビ
ンの溶液において、多層ビリルビンオキシダーゼ電極を
用いたサイクリックボルタムメトリーによりＥpとして
約０．４８（Ａｇ／ＡｇＮＯ3に対して）の接触波が得
られた。サイクリックボルタムメトリーは、ガラス槽中
で多層ビリルビンオキシダーゼ電極を作用電極として、
炭素棒を対電極として、Ａｇ／ＡｇＮＯ3を参照電極と
して用いて行った。電極は安定に保たれ、４℃で５週間
以上乾燥保存した後も同一の接触波を与えた。図３０に
示す通り陽極ピーク電流は、酵素の層がさらに加えられ
ると増加した。多層ビリルビンオキシダーゼ電極電流は
直線状のキャリブレーション曲線を有し、その陽極ピー
ク電流はビリルビン濃度に直線的に依存した（図３
１）。
してのフェロセンカルボン酸（５ｘ１０-4Ｍ）を含むＴ
ＲＩＳ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ８．０）中のビリルビ
ンの溶液において、多層ビリルビンオキシダーゼ電極を
用いたサイクリックボルタムメトリーによりＥpとして
約０．４８（Ａｇ／ＡｇＮＯ3に対して）の接触波が得
られた。サイクリックボルタムメトリーは、ガラス槽中
で多層ビリルビンオキシダーゼ電極を作用電極として、
炭素棒を対電極として、Ａｇ／ＡｇＮＯ3を参照電極と
して用いて行った。電極は安定に保たれ、４℃で５週間
以上乾燥保存した後も同一の接触波を与えた。図３０に
示す通り陽極ピーク電流は、酵素の層がさらに加えられ
ると増加した。多層ビリルビンオキシダーゼ電極電流は
直線状のキャリブレーション曲線を有し、その陽極ピー
ク電流はビリルビン濃度に直線的に依存した（図３
１）。
【０１２５】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【０１２６】１．電子が分子状電子媒介物の媒介により
電極材料の表面と酸化還元酵素の間で移動し、それによ
り酵素が被検体を生成物に変換する酸化還元反応を触媒
することができる、電気生化学的酵素酸化還元反応によ
り液体媒体中の被検体の存在又は濃度を決定するための
分析法において、該方法が酸化還元反応で得られる生成
物の濃度の測定又は電荷の流れの測定を含み、該電極材
料が硫黄含有部分の化学吸着が可能な種類であり、成分
である酵素又は電子媒介物の少なくとも１つが、それに
共有結合し、該表面に化学吸着した硫黄含有部分を有す
る第１結合基により電極材料の表面上に固定され、該成
分の他方が（ｉ）電極材料の回りで液体媒体中を混転し
ている、（ｉｉ）該表面上に化学吸着した硫黄含有部分
を有する第２結合基を用いて該表面に固定され、第２結
合基は該第１結合基と同一又は異なることができる、あ
るいは（ｉｉｉ）該第１結合基又は該成分の１つに共有
結合することにより該表面に固定されていることを特徴
とする方法。
電極材料の表面と酸化還元酵素の間で移動し、それによ
り酵素が被検体を生成物に変換する酸化還元反応を触媒
することができる、電気生化学的酵素酸化還元反応によ
り液体媒体中の被検体の存在又は濃度を決定するための
分析法において、該方法が酸化還元反応で得られる生成
物の濃度の測定又は電荷の流れの測定を含み、該電極材
料が硫黄含有部分の化学吸着が可能な種類であり、成分
である酵素又は電子媒介物の少なくとも１つが、それに
共有結合し、該表面に化学吸着した硫黄含有部分を有す
る第１結合基により電極材料の表面上に固定され、該成
分の他方が（ｉ）電極材料の回りで液体媒体中を混転し
ている、（ｉｉ）該表面上に化学吸着した硫黄含有部分
を有する第２結合基を用いて該表面に固定され、第２結
合基は該第１結合基と同一又は異なることができる、あ
るいは（ｉｉｉ）該第１結合基又は該成分の１つに共有
結合することにより該表面に固定されていることを特徴
とする方法。
【０１２７】２．酵素分子が結合基により電極材料上に
固定され、電子媒介物が回りの溶液中で混転しているこ
とを特徴とする上記１項に記載の方法。
固定され、電子媒介物が回りの溶液中で混転しているこ
とを特徴とする上記１項に記載の方法。
【０１２８】３．電子媒介基が電極材料上に固定され、
酵素分子が回りの溶液中で混転しており、電極材料がそ
れぞれ結合基及び１個又はそれ以上の電子媒介基を含む
多数の複合体により被覆されていることを特徴とする上
記１項に記載の方法。
酵素分子が回りの溶液中で混転しており、電極材料がそ
れぞれ結合基及び１個又はそれ以上の電子媒介基を含む
多数の複合体により被覆されていることを特徴とする上
記１項に記載の方法。
【０１２９】４．電子媒介基及び酵素の両方が電極材料
上に固定されていることを特徴とする上記１項に記載の
方法。
上に固定されていることを特徴とする上記１項に記載の
方法。
【０１３０】５．硫黄含有部分の化学吸着が可能な種類
の電極材料を含み、それぞれ硫黄含有部分を有する結合
基及び酸化還元酵素又は分子状電子媒介物の少なくとも
１つを含む多数の複合体をその上に固定し、複合体成分
のすべての成分が互いに共有結合しており、電子媒介物
が電極材料から酸化還元酵素の酸化還元中心に電子を移
動させてそれにより被検体の存在下で被検体を生成物に
変換する反応を酵素が触媒する電極。
の電極材料を含み、それぞれ硫黄含有部分を有する結合
基及び酸化還元酵素又は分子状電子媒介物の少なくとも
１つを含む多数の複合体をその上に固定し、複合体成分
のすべての成分が互いに共有結合しており、電子媒介物
が電極材料から酸化還元酵素の酸化還元中心に電子を移
動させてそれにより被検体の存在下で被検体を生成物に
変換する反応を酵素が触媒する電極。
【０１３１】６．一般式（Ｉ）
【０１３２】
【化１７】Ｚ−Ｒ1−Ｑ （Ｉ） ［式中、Ｚは硫黄含有部分を示し；Ｑは基Ｘ1又はＰで
あり；Ｘ1は少なくとも１つの該成分の部分と共有結合
を形成することができる官能基であり；Ｐは少なくとも
１つの該成分の部分と共有結合を形成することができる
官能基Ｘ2を多数有するタンパク質、ポリペプチド又は
ポリマーであり、Ｒ1は結合基を示す］の結合基を含む
ことを特徴とする上記５項に記載の電極。
あり；Ｘ1は少なくとも１つの該成分の部分と共有結合
を形成することができる官能基であり；Ｐは少なくとも
１つの該成分の部分と共有結合を形成することができる
官能基Ｘ2を多数有するタンパク質、ポリペプチド又は
ポリマーであり、Ｒ1は結合基を示す］の結合基を含む
ことを特徴とする上記５項に記載の電極。
【０１３３】７．Ｘ1又はＸ2がアミン基、カルボキシル
基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、アシル基又は
基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、アシル基又は
【０１３４】
【化１８】
【０１３５】である一般式（Ｉ）の結合基を含むことを
特徴とする上記５項に記載の電極。
特徴とする上記５項に記載の電極。
【０１３６】８．該アシル基が式−Ｒ2−ＣＯ−Ｇを有
し、式中ＧがＯＨ、ハロゲン又はＯＲbであり、Ｒ2又は
Ｒbは独立して場合により置換されたＣ1−Ｃ12アルキ
ル、アルケニル、アルキニル又はフェニル含有鎖である
ことを特徴とする上記７項に記載の電極。
し、式中ＧがＯＨ、ハロゲン又はＯＲbであり、Ｒ2又は
Ｒbは独立して場合により置換されたＣ1−Ｃ12アルキ
ル、アルケニル、アルキニル又はフェニル含有鎖である
ことを特徴とする上記７項に記載の電極。
【０１３７】９．Ｐが遊離のアミン又はカルボキシル基
を有するポリアミン又はポリペプチドである一般式
（Ｉ）の結合基を含むことを特徴とする上記５−８項の
いずれか１つに記載の電極。
を有するポリアミン又はポリペプチドである一般式
（Ｉ）の結合基を含むことを特徴とする上記５−８項の
いずれか１つに記載の電極。
【０１３８】１０．Ｐがポリリシン、ポリグルタメート
又はポリエチレンイミンであることを特徴とする上記９
項に記載の電極。
又はポリエチレンイミンであることを特徴とする上記９
項に記載の電極。
【０１３９】１１．Ｐが上記６項で定義された多数の官
能基Ｘ1を有することを特徴とする上記９又は１０項に
記載の電極。
能基Ｘ1を有することを特徴とする上記９又は１０項に
記載の電極。
【０１４０】１２．Ｒ1が共有結合を示すか又はアルキ
レン、アルケニレン、アルキニレン及びフェニル含有鎖
を示すことを特徴とする上記６項に記載の電極。
レン、アルケニレン、アルキニレン及びフェニル含有鎖
を示すことを特徴とする上記６項に記載の電極。
【０１４１】１３．Ｒ2が化学結合又は次式（ＩＩ
ａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）
ａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）
【０１４２】
【化１９】
【０１４３】［式中、Ｒ2又はＲ3は同一又は異なり炭素
数が１−１２の直鎖状もしくは分枝鎖状アルキレン、ア
ルケニレン、アルキニレンを示すか又は共有結合を示
し、Ａ及びＢは同一又は異なりＯあるいはＳを示し、Ｐ
ｈは場合により例えば１個又はそれ以上のＳＯ3 -又はア
ルキル基により置換されたフェニルである］を有する基
を示すことを特徴とする、上記１２項に記載の電極。
数が１−１２の直鎖状もしくは分枝鎖状アルキレン、ア
ルケニレン、アルキニレンを示すか又は共有結合を示
し、Ａ及びＢは同一又は異なりＯあるいはＳを示し、Ｐ
ｈは場合により例えば１個又はそれ以上のＳＯ3 -又はア
ルキル基により置換されたフェニルである］を有する基
を示すことを特徴とする、上記１２項に記載の電極。
【０１４４】１４．電子媒介物が、すべて場合により置
換されたビオロゲン、ピリジニウム、アクリジン、フェ
ロセン及びフェノチアジンから成る群より選ばれる１つ
である媒介部分Ｕを有することを特徴とする上記５−１
３項のいずれか１つに記載の電極。
換されたビオロゲン、ピリジニウム、アクリジン、フェ
ロセン及びフェノチアジンから成る群より選ばれる１つ
である媒介部分Ｕを有することを特徴とする上記５−１
３項のいずれか１つに記載の電極。
【０１４５】１５．Ｕが次式（ＩＶ）−（ＩＸ）：
【０１４６】
【化２０】
【０１４７】［式中ｎは１−１６の整数である］
【０１４８】
【化２１】
【０１４９】［式中ＹはＣＯ2Ｈ又はＮＨ2である］
【０１５０】
【化２２】
【０１５１】を有する化合物から成る群より選ばれる１
つであることを特徴とする上記１４項に記載の電極。
つであることを特徴とする上記１４項に記載の電極。
【０１５２】１６．電子媒介基が該複合体の一部を形成
し、一般式（ＩＸ）：
し、一般式（ＩＸ）：
【０１５３】
【化２３】Ｕ−Ｒ4−Ｘ3 （ＩＸ） ［式中Ｕはすべて場合により置換されたビオロゲン、ピ
リジニウム、アクリジン、フェロセン及びフェノチアジ
ンから成る群より選ばれる１つであり、Ｒ4は結合基で
あり、Ｘ3は該成分の少なくとも１つの共有結合を形成
することができる官能基である］を有することを特徴と
する上記５−１４項のいずれか１つに記載の電極。
リジニウム、アクリジン、フェロセン及びフェノチアジ
ンから成る群より選ばれる１つであり、Ｒ4は結合基で
あり、Ｘ3は該成分の少なくとも１つの共有結合を形成
することができる官能基である］を有することを特徴と
する上記５−１４項のいずれか１つに記載の電極。
【０１５４】１７．数層の酵素を含み、１つの層の酵素
が架橋基により隣接層の酵素に結合していることを特徴
とする上記５項に記載の電極。
が架橋基により隣接層の酵素に結合していることを特徴
とする上記５項に記載の電極。
【０１５５】１８．架橋基が次式（Ｘ）：
【０１５６】
【化２４】 Ｗ1−Ｒ6−Ｗ2 （Ｘ） ［式中Ｗ1及びＷ2は互いに同一又は異なり上記６項のＸ
1と同義であり、Ｒ6は上記６項のＲ1と同義である］を
有することを特徴とする上記１７項に記載の電極。
1と同義であり、Ｒ6は上記６項のＲ1と同義である］を
有することを特徴とする上記１７項に記載の電極。
【０１５７】１９．架橋基が上記６項に記載のＰと同義
であることを特徴とする上記１７項に記載の電極。
であることを特徴とする上記１７項に記載の電極。
【０１５８】２０．外部酵素層中の酵素分子が被検体以
外の試薬を分解することができる非−酸化還元酵素であ
ることを特徴とする上記１７−１９項のいずれか１つに
記載の電極。
外の試薬を分解することができる非−酸化還元酵素であ
ることを特徴とする上記１７−１９項のいずれか１つに
記載の電極。
【０１５９】２１．（ａ）硫黄含有部分の化学吸着によ
り結合基を電極材料中に固定し、（ｂ）複合体の他の成
分を化学吸着された結合基に結合する段階を含む、硫黄
含有部分の化学吸着の可能な種類の電極材料を含み、そ
れぞれ硫黄含有部分を有する結合基及び酸化還元酵素又
は電子媒介物の少なくとも１つを含む多数の複合体をそ
の上に固定し、複合体成分のすべての成分が互いに共有
結合している電極の製造法。
り結合基を電極材料中に固定し、（ｂ）複合体の他の成
分を化学吸着された結合基に結合する段階を含む、硫黄
含有部分の化学吸着の可能な種類の電極材料を含み、そ
れぞれ硫黄含有部分を有する結合基及び酸化還元酵素又
は電子媒介物の少なくとも１つを含む多数の複合体をそ
の上に固定し、複合体成分のすべての成分が互いに共有
結合している電極の製造法。
【０１６０】２２．（ａ）結合基を複合体の他の成分と
結合し、（ｂ）結合基の硫黄含有部分の化学吸着により
複合体を電極材料に固定する段階を含む、硫黄含有部分
の化学吸着の可能な種類の電極材料を含み、それぞれ硫
黄含有部分を有する結合基及び酸化還元酵素又は電子媒
介物の少なくとも１つを含む多数の複合体をその上に固
定し、複合体成分のすべての成分が互いに共有結合して
いる電極の製造法。
結合し、（ｂ）結合基の硫黄含有部分の化学吸着により
複合体を電極材料に固定する段階を含む、硫黄含有部分
の化学吸着の可能な種類の電極材料を含み、それぞれ硫
黄含有部分を有する結合基及び酸化還元酵素又は電子媒
介物の少なくとも１つを含む多数の複合体をその上に固
定し、複合体成分のすべての成分が互いに共有結合して
いる電極の製造法。
【０１６１】２３．さらに（ａ）酵素分子を変性させ、
（ｂ）電子媒介基を変性酵素分子に結合し、（ｃ）酵素
を再生させる段階を含むことを特徴とする上記２１又は
２２項に記載の方法。
（ｂ）電子媒介基を変性酵素分子に結合し、（ｃ）酵素
を再生させる段階を含むことを特徴とする上記２１又は
２２項に記載の方法。
【０１６２】２４．該電極が上記第５−２３項のいずれ
か１つに記載の電極であることを特徴とする上記１項に
記載の方法。
か１つに記載の電極であることを特徴とする上記１項に
記載の方法。
【０１６３】２５．上記１−４項及び２４項のいずれか
１つの方法を行うための電気生物化学系。
１つの方法を行うための電気生物化学系。
【０１６４】２６．上記５−２３項のいずれか１つに記
載の電極を含む、上記２４項に記載の系。
載の電極を含む、上記２４項に記載の系。
【図１】それぞれ１個の酸化還元酵素分子、電子媒介基
及び結合基を含む複合体を有する電極表面の略図であ
る。（ａ）の場合Ｘ1及びＸ3は酵素分子のアミン基に結
合したものであり、（ｂ）の場合Ｘ1及びＸ3は酵素分子
のカルボキシル基に結合したものである。
及び結合基を含む複合体を有する電極表面の略図であ
る。（ａ）の場合Ｘ1及びＸ3は酵素分子のアミン基に結
合したものであり、（ｂ）の場合Ｘ1及びＸ3は酵素分子
のカルボキシル基に結合したものである。
【図２】別の具体化に従う電極表面の略図を示し、この
場合電極表面上の各複合体が酵素分子と結合基を含み、
電子媒介物が回りの液体媒体中で混転している。
場合電極表面上の各複合体が酵素分子と結合基を含み、
電子媒介物が回りの液体媒体中で混転している。
【図３】本発明の他の具体化に従う電極の表面の略図で
あり、この場合電極材料の表面上に化学吸着された各複
合体は結合基及び電子媒介基を含み、酵素分子は溶液中
を自由に混転し、場合によりそれに結合した多数の電子
媒介基を有する。
あり、この場合電極材料の表面上に化学吸着された各複
合体は結合基及び電子媒介基を含み、酵素分子は溶液中
を自由に混転し、場合によりそれに結合した多数の電子
媒介基を有する。
【図４】本発明の他の具体化に従う電極表面の略図であ
り、この場合電極は２種類の複合体を有し、１つは結合
基と電子媒介基を含み、他は結合基と酵素分子を含み、
酵素分子は場合によりそこに結合した電子媒介基を有す
る。
り、この場合電極は２種類の複合体を有し、１つは結合
基と電子媒介基を含み、他は結合基と酵素分子を含み、
酵素分子は場合によりそこに結合した電子媒介基を有す
る。
【図５】それぞれ酸化還元酵素分子の多層を含む複合体
を有する本発明の別の具体化に従う電極表面の略図であ
り、多数の電子媒介基が酵素に共有結合し、結合基が電
極材料の表面上に化学吸着し、第１層の酸化還元酵素分
子の１つと共有結合し、多数の架橋基が１つの層の酸化
還元酵素分子を他の層の分子と結合している。
を有する本発明の別の具体化に従う電極表面の略図であ
り、多数の電子媒介基が酵素に共有結合し、結合基が電
極材料の表面上に化学吸着し、第１層の酸化還元酵素分
子の１つと共有結合し、多数の架橋基が１つの層の酸化
還元酵素分子を他の層の分子と結合している。
【図６】それぞれ異なる層中に多数の酸化還元酵素分子
を含む複合体を有する本発明の他の具体化に従う電極表
面の略図であり、１つの層の酵素分子はポリマー又はポ
リペプチド鎖を含む架橋基により他の層の分子と結合し
ている。
を含む複合体を有する本発明の他の具体化に従う電極表
面の略図であり、１つの層の酵素分子はポリマー又はポ
リペプチド鎖を含む架橋基により他の層の分子と結合し
ている。
【図７】それぞれポリマー又はポリペプチド鎖を含む架
橋基にすべて結合した多数の酸化還元酵素分子を含む複
合体を有する本発明の他の具体化に従う電極表面の略図
である。
橋基にすべて結合した多数の酸化還元酵素分子を含む複
合体を有する本発明の他の具体化に従う電極表面の略図
である。
【図８】酵素がグルタチオンレダクターゼの場合の図１
（ａ）に示す種類の電極製造の１つの方法及び得られる
複合体の電子移動経路の略図である。
（ａ）に示す種類の電極製造の１つの方法及び得られる
複合体の電子移動経路の略図である。
【図９】ＤＳＰで修飾され、続いてナフトキノンのアミ
ノ誘導体の固定に用いられた金電極のサイクリックボル
タモグラムを示す［電圧走査速度：２００ｍＶ／秒；バ
ックグラウンド：０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ７．
５］。
ノ誘導体の固定に用いられた金電極のサイクリックボル
タモグラムを示す［電圧走査速度：２００ｍＶ／秒；バ
ックグラウンド：０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ７．
５］。
【図１０】金電極の表面上への酵素の固定の他の方法を
示す。
示す。
【図１１】シスタミン及び２，３−ジクロロ−１，４−
ナフトキノンで修飾した金電極のサイクリックボルタモ
グラムを示し、キノン固定は電極をＤＩＤＳで１時間処
理する前（実線）及び処理後（破線）に行った［電圧走
査速度：２００ｍＶ／秒；バックグラウンド：０．１Ｍ
リン酸塩緩衝液，ｐＨ７．５］。
ナフトキノンで修飾した金電極のサイクリックボルタモ
グラムを示し、キノン固定は電極をＤＩＤＳで１時間処
理する前（実線）及び処理後（破線）に行った［電圧走
査速度：２００ｍＶ／秒；バックグラウンド：０．１Ｍ
リン酸塩緩衝液，ｐＨ７．５］。
【図１２】ＤＩＤＳを用いた電極予備処理の時間に対す
るシスタミンのアミノ基を介して固定されたキノンの表
面濃度を示す。濃度は図１１に示したものと類似のサイ
クリックボルタモグラム上のピークの積分により算出し
た。
るシスタミンのアミノ基を介して固定されたキノンの表
面濃度を示す。濃度は図１１に示したものと類似のサイ
クリックボルタモグラム上のピークの積分により算出し
た。
【図１３】シスタミンその後ＤＩＤＳ、続いてアミノキ
ノンで処理した金電極（実線）、及びアミノキノンとの
反応の前にＤＩＤＳ−修飾電極をｎ−ブチルアミンで処
理して電極表面上のイソチオシアノ基を失活させた標準
実験（破線）のサイクリックボルタモグラムを示す。
ノンで処理した金電極（実線）、及びアミノキノンとの
反応の前にＤＩＤＳ−修飾電極をｎ−ブチルアミンで処
理して電極表面上のイソチオシアノ基を失活させた標準
実験（破線）のサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１４】ＤＳＰ及びグルタチオンレダクターゼで修飾
した電極表面、及び拡散により可動性の電子移動媒介物
（ＭＶ2+）を介し、基質の還元を招く電極から酵素の活
性中心への電子移動の略図である。
した電極表面、及び拡散により可動性の電子移動媒介物
（ＭＶ2+）を介し、基質の還元を招く電極から酵素の活
性中心への電子移動の略図である。
【図１５】模式図的に図１４で示した、ＤＳＰを介して
電極表面に結合したグルタチオンレダクターゼにより修
飾された金電極を用いた、１ｘ１０-3Ｍのメチルビオロ
ゲンの存在下の溶液中におけるサイクリックボルタモグ
ラム（実線）を示す［電圧走査速度：２００ｍＶ／秒；
バックグラウンド：０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ７．
５（破線）］。
電極表面に結合したグルタチオンレダクターゼにより修
飾された金電極を用いた、１ｘ１０-3Ｍのメチルビオロ
ゲンの存在下の溶液中におけるサイクリックボルタモグ
ラム（実線）を示す［電圧走査速度：２００ｍＶ／秒；
バックグラウンド：０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ７．
５（破線）］。
【図１６】拡散により可動性の電子移動媒介物として１
ｘ１０-3Ｍのメチルビオロゲン及び初期基質として１ｘ
１０-2ＭのＧＳＳＧの存在下の溶液中における、ＤＳＰ
及びグルタチオンレダクターゼで修飾した電極上の電気
分解の間のグルタチオン還元型（ＧＳＨ）の蓄積を示す
［電極電圧：−０．７Ｖ（ＳＣＥに対して）］。
ｘ１０-3Ｍのメチルビオロゲン及び初期基質として１ｘ
１０-2ＭのＧＳＳＧの存在下の溶液中における、ＤＳＰ
及びグルタチオンレダクターゼで修飾した電極上の電気
分解の間のグルタチオン還元型（ＧＳＨ）の蓄積を示す
［電極電圧：−０．７Ｖ（ＳＣＥに対して）］。
【図１７】ＤＳＰ、グルタチオンレダクターゼ及び鎖長
の異なる基を介して酵素に結合した電子媒介基を含む複
合体の電極表面上における製造の略図である。
の異なる基を介して酵素に結合した電子媒介基を含む複
合体の電極表面上における製造の略図である。
【図１８】図１７に模式的に示した種類の電極上におけ
る、長さの異なるアルキレン基を介して酵素に結合した
ビオロゲンを用いた電気分解の間のＧＳＨ蓄積を示す：
（ａ）−Ｃ2、（ｂ）−Ｃ5及び（ｃ）−Ｃ11［電極電
圧：−０．７Ｖ（ＳＣＥに対して）；ＧＳＳＧ濃度：１
ｘ１０-2Ｍ、ｐＨ７．３（リン酸塩緩衝液）］。
る、長さの異なるアルキレン基を介して酵素に結合した
ビオロゲンを用いた電気分解の間のＧＳＨ蓄積を示す：
（ａ）−Ｃ2、（ｂ）−Ｃ5及び（ｃ）−Ｃ11［電極電
圧：−０．７Ｖ（ＳＣＥに対して）；ＧＳＳＧ濃度：１
ｘ１０-2Ｍ、ｐＨ７．３（リン酸塩緩衝液）］。
【図１９】図１０に示す電極を用い、Ｃ5−スペーサー
を介して酵素に結合したビオロゲンを用いたＧＳＳＧの
電気分解の間のグルタチオン還元型（ＧＳＨ）蓄積を示
す［電極電圧：−０．７Ｖ（ＳＣＥに対して）；ＧＳＳ
Ｇ初期濃度：１ｘ１０-2Ｍ］。
を介して酵素に結合したビオロゲンを用いたＧＳＳＧの
電気分解の間のグルタチオン還元型（ＧＳＨ）蓄積を示
す［電極電圧：−０．７Ｖ（ＳＣＥに対して）；ＧＳＳ
Ｇ初期濃度：１ｘ１０-2Ｍ］。
【図２０】１−チオヘプタン酸結合基を用いて電極表面
上に固定されたグルコースオキシダーゼ酵素（Ｅ）を有
する電極の略図である。
上に固定されたグルコースオキシダーゼ酵素（Ｅ）を有
する電極の略図である。
【図２１】溶液中に１０ｍＭのグルコースを含まないで
（ａ）又は含み（ｂ）、溶液中の１ｘ１０-4Ｍのフェロ
センを用いた、図２０の電極のサイクリックボルタモグ
ラムを示す［電極電圧：＋０．５Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに
対して）］。
（ａ）又は含み（ｂ）、溶液中の１ｘ１０-4Ｍのフェロ
センを用いた、図２０の電極のサイクリックボルタモグ
ラムを示す［電極電圧：＋０．５Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに
対して）］。
【図２２】上にフェロセン含有複合体を固定した電極を
示す。
示す。
【図２３】溶液中のグルコースオキシダーゼ酵素（２ｍ
ｇ／ｍｌ）を用い、異なるグルコース濃度で得た電流を
示す［電極電圧：＋０．５Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに対し
て）］。
ｇ／ｍｌ）を用い、異なるグルコース濃度で得た電流を
示す［電極電圧：＋０．５Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに対し
て）］。
【図２４】図５に示した種類の複合体を結合した電極の
製造法の略図である。
製造法の略図である。
【図２５】酵素の層数の異なる（２又は９）図２４に模
式的に示した種類の電極（固定ビオロゲン基ではなく溶
解性メチルビオロゲン）を用いた電気分解の間のＧＳＨ
蓄積を示す［電極電圧：＋０．５Ｖ（ＳＣＥに対し
て）；ＧＳＳＧの初期濃度：１ｘ１０-2Ｍ；溶解メチル
ビオロゲン（電子媒介物）の濃度：１ｘ１０-2Ｍ］。
式的に示した種類の電極（固定ビオロゲン基ではなく溶
解性メチルビオロゲン）を用いた電気分解の間のＧＳＨ
蓄積を示す［電極電圧：＋０．５Ｖ（ＳＣＥに対し
て）；ＧＳＳＧの初期濃度：１ｘ１０-2Ｍ；溶解メチル
ビオロゲン（電子媒介物）の濃度：１ｘ１０-2Ｍ］。
【図２６】図２４に模式的に示した方法に従いｎ＝１０
にて製造された種類の電極のサイクリックボルタモグラ
ムを示す。１層、４層及び８層の酵素を有する電極を調
べた［電圧走査速度：２００ｍＶ／秒；バックグラウン
ド：０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ７．３］。
にて製造された種類の電極のサイクリックボルタモグラ
ムを示す。１層、４層及び８層の酵素を有する電極を調
べた［電圧走査速度：２００ｍＶ／秒；バックグラウン
ド：０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ７．３］。
【図２７】電極表面上の放射活性標識酵素の層数に対す
る電極の放射活性標識を示す。
る電極の放射活性標識を示す。
【図２８】図７の電極の製造法の略図である。
【図２９】ビリルビンオキシダーゼ電極の構成を示す。
【図３０】３、６又は１２層を含む電極の、１．７ｘ１
０-4Ｍに対応するビリルビンの濃度に対する電流応答を
示す。この実験では５ｘ１０-4Ｍのフェロセンカルボン
酸を電子移動媒介物として用いる。
０-4Ｍに対応するビリルビンの濃度に対する電流応答を
示す。この実験では５ｘ１０-4Ｍのフェロセンカルボン
酸を電子移動媒介物として用いる。
【図３１】ビリルビン濃度に対する電極の電流応答を示
す。この実験では８層を含む電極を検出電極（ｓｅｎｓ
ｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）として用いる。
す。この実験では８層を含む電極を検出電極（ｓｅｎｓ
ｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）として用いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イタマル・ウイルナー イスラエル・メバセレツトジオン 90805・ハシヤロムストリート12・メバ セレツトジオン（番地なし) (72)発明者 イブジエニー・カツツ イスラエル・エルサレム93262・ハノト リムストリート14／２ (72)発明者 アザリア・リクリン イスラエル・エルサレム・ハボツセムス トリート440／35 (72)発明者 ロン・カシヤー イスラエル・エルサレム96268・ギバツ トベイトハケレム１／28 (72)発明者 ベンジヤミン・シヨハム イスラエル・エルサレム96103・ガトス トリート８／シー (56)参考文献 Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．, 1992，114，Ｐ．10965−10966
Claims (4)
- 【請求項１】 電子が分子状電子媒介物の媒介により電
極材料の表面と酸化還元酵素の間を移動し、それにより
酵素が被検体を生成物に変換する酸化還元反応を触媒す
ることができる、電気生化学的酵素酸化還元反応により
液体媒体中の被検体の存在又は濃度を決定するための分
析法において、該方法が酸化還元反応で得られる生成物
の濃度の測定又は電荷の流れの測定を含み、該電極材料
が硫黄含有部分の化学吸着が可能な種類であり、成分で
ある酵素又は電子媒介物の少なくとも１つが、それに共
有結合し、該表面に化学吸着した硫黄含有部分を有する
第１結合基により電極材料の表面上に固定され、該成分
の他方が（ｉ）電極材料の回りで液体媒体中を混転して
いるか、（ｉｉ）該表面上に化学吸着した硫黄含有部分
を有する第２結合基を用いて該表面に固定されており、
第２結合基は該第１結合基と同一又は異なることができ
るか、あるいは（ｉｉｉ）該第１結合基又は該成分の１
つに共有結合することにより該表面に固定されているこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項２】 硫黄含有部分の化学吸着が可能な種類の
電極材料を含み、それぞれ硫黄含有部分を有する結合基
及び酸化還元酵素又は分子状電子媒介物の少なくとも１
つを含む多数の複合体をその上に固定し、複合体成分の
すべての成分が互いに共有結合しており、電子媒介物が
電極材料から酸化還元酵素の酸化還元中心に電子を移動
させてそれにより被検体の存在下で被検体を生成物に変
換する反応を酵素が触媒する電極。 - 【請求項３】 （ａ）硫黄含有部分の化学吸着により結
合基を電極材料中に固定し、 （ｂ）複合体の他の成分を化学吸着された結合基に結合
する段階を含む、硫黄含有部分の化学吸着の可能な種類
の電極材料を含み、それぞれ硫黄含有部分を有する結合
基及び酸化還元酵素又は電子媒介物の少なくとも１つを
含む多数の複合体をその上に固定し、複合体成分のすべ
ての成分が互いに共有結合している電極の製造法。 - 【請求項４】 （ａ）結合基を複合体の他の成分と結合
し、 （ｂ）結合基の硫黄含有部分の化学吸着により複合体を
電極材料に固定する段階を含む、硫黄含有部分の化学吸
着の可能な種類の電極材料を含み、それぞれ硫黄含有部
分を有する結合基及び酸化還元酵素又は電子媒介物の少
なくとも１つを含む多数の複合体をその上に固定し、複
合体成分のすべての成分が互いに共有結合している電極
の製造法。
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|---|---|---|---|
| IL102930 | 1992-08-25 | ||
| IL102930A IL102930A (en) | 1992-08-25 | 1992-08-25 | Electrobiochemical analytical method and electrodes |
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|---|---|---|---|
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