JP2626008B2

JP2626008B2 - 細胞分析装置

Info

Publication number: JP2626008B2
Application number: JP63320915A
Authority: JP
Inventors: 晃史山本; 昌弘花房
Original assignee: Omron Corp
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1997-07-02
Anticipated expiration: 2012-07-02
Also published as: JPH02165050A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、フローサイトメトリーを適用した細胞分
析装置に関し、詳しく言えば、測定の自動化の促進及び
データを構成する細胞の数の統一化に関する。

（ロ）従来の技術フローサイトメトリーは、例えば蛍光色素で標識され
た細胞（又はこれに準ずる粒子）を、細い液流中に流
し、流体力学的焦点合わせ効果により１列になって流れ
る細胞の一つ一つにレーザ光を照射し、細胞より生じる
散乱光や蛍光の強度、すなわち細胞光情報を瞬時に測定
し、細胞を分析するものである。このフローサイトメト
リーは、大量の細胞を高速度かつ高精度に分析できる特
長を有している。

上記フローサイトメトリーを適用した細胞分析装置と
しては、細い液流を形成するためのフローセルと、この
フローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光源
（例えばレーザ）と、この光ビームが照射された細胞よ
り細胞光情報を検出し電気信号に変換する光検出器と、
この電気信号に変換された細胞光情報の解析処理等を行
うコンピュータを備えてなるものが知られている。

この従来の細胞分析装置は、蛍光色素等で染色した細
胞浮遊液（試料）をシース液と共にフローセル内に流
す。フローセル内には、シースフローが形成され、流体
力学的焦点合わせ効果により、細胞はフローセル中心軸
上を一列になって流れていく。

これら細胞に光ビームが照射されることにより生じる
散乱光及び蛍光の強度は、細胞光情報を構成するパラメ
ータとして、光電子増倍管等の光検出器により検出され
る。

さて、細胞浮遊液中に複数の細胞集団が含まれている
時に、これら細胞集団の１つについて分析を行いたい場
合がある。例えば、人体血液中のリンパ球サブセットの
分析の場合には、試料として血液を螢光色素で標識した
モノクローナル抗体と反応させ、溶血したものが使用さ
れるが、この試料中には、リンパ球の他に、単球、顆粒
球が含まれており、測定により得られた細胞光情報よ
り、リンパ球についてのものを識別する必要が生じる。

そこで、必要な細胞集団の細胞光情報を操作者の主観
にたよることなく、自動的に選別して収集する機能、い
わゆるオートトリガ機能を備えた細胞分析装置として
は、本願出願人の先願に係る特願昭62−22884号のもの
がある。この細胞分析装置は、１又は２以上のパラメー
タに基づいて細胞光情報を分画し、得られた画分の１又
は２以上のものを分析領域として、目的の細胞集団の細
胞光情報を収集する。

例えば、リンパ球分析の場合には、第７図（ａ）
（ｂ）に示すように、90゜散乱光強度I₉₀、前方散乱光
強度I₀のヒストグラムをそれぞれ作成する。I₉₀のヒス
トグラムよりは極小点p₁、p₂、p₃が、I₀のヒストグラム
よりは変曲点p₄、p₅が抽出される。

これら変曲点p₁〜p₅により、I₉₀−I₀サイトグラム
が、第５図中破線で示すように分画される。第５図にお
いて、ｂはリンパ球の分布、ｃは単球の分布、ｄは顆粒
球の分布をそれぞれ示している。また、ａはデブリスの
分布を示しているが、デブリスは赤血球の膜成分等より
構成されるもので、通常はノイズ処理の段階で取り除か
れることが多い。第５図中実線で示される画分Ｂには、
リンパ球の分布ｂが含まれるから、この画分Ｂを分析領
域とし、細胞光情報が収集される。こうして、収集され
た細胞光情報については、さらに蛍光特性が解析され陽
性率の判定等の処理が行われる。

上記細胞分析装置では、I₉₀−I₀サイトグラム上で、
長方形の領域Ｂを分析領域としているが、このような長
方形の分析領域では、収集された細胞光情報中になお不
必要のものが含まれる。そこで、目的細胞集団の分析に
より適合した分析領域を設定できる細胞分析装置とし
て、本願出願人により、特願昭63−193033号、特願昭63
−193072号が既に出願されている。

特願昭63−193033号の細胞分析装置は、第６図（ａ）
に示すように上記画分Ｂ内で、例えばI₉₀軸に平行なラ
インl_iを設定し、各ラインl_i上でヒストグラムを作成
し、このヒストグラムより極小点又は所定のしきい値と
なる点を抽出し、これら抽出された点を結んで得られる
領域を、分析領域Ｂ′として細胞光情報を抽出するもの
である。

一方、特願昭63−193072号の細胞分析装置は、第６図
（ｂ）に示すように、上記画分Ｂ内で最高度数値点ｑを
決定し、この点ｑより放射上にラインl_jを放射上に引
き、各ラインl_jでヒストグラムを作成し、各ヒストグラ
ムより極小点又は所定のしきい値となる点を抽出し、こ
れら抽出された点を結んで得られる領域を、分析領域
Ｂ″とする。これら２つの細胞分析装置では、より目的
細胞集団の分布形状に近い分析領域を設定できるから、
測定結果の信頼性を向上することができる。

（ハ）発明が解決しようとする課題上記オートトリガ機能を備えた細胞分析装置では、確
かに測定の自動化が図られ、客観的なデータ処理が行え
る等の利点を有している。しかしながら、分析領域の設
定は測定中又は測定終了後に行われるものであるから、
設定された分析領域に属する細胞数はまちまちとなる。
これは測定後再計算を行う際など、データを他と比較す
る時に細胞数が統一されていないから、比率のみで判断
を下さなければならない問題点が生じる。

例えば、リンパ球サブセットの分析においては、デー
タの信頼性上、5000個又は10000個のリンパ球中でその
亜群がどのようになっているかが分析されてきている。
それゆえに、上記従来の細胞分析装置で得られたデータ
を、既存のデータと直接比較することができず、データ
の客観性や互換性が損なわれてしまう。

そこで、分析領域に属する細胞数が所定の値に達する
まで測定を行う必要が生じるが、上述のように分析領域
は測定中または測定終了後に設定されるものであるか
ら、手動でウィンドウを設定しない限り、これを行うこ
とは困難であり、分析の自動化・効率化が制限されてし
まう。

この発明は上記に鑑みなされたもので、データの細胞
数を統一することができ、また、分析の自動化・効率化
を図ることのできる細胞分析装置の提供を目的としてい
る。

（ニ）課題を解決するための手段上記課題を解決するため、この発明の細胞分析装置
は、以下のｉ〜ｘ項に列記する構成を有している。

i:細胞浮遊液が流されるフローセルと、 ii:このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射す
る光源と、 iii:この光ビームが照射されたそれぞれの細胞につい
て、複数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細
胞光情報検出手段と、 iv:この細胞光情報検出手段で得られる、１又は２以上
のパラメータに基づいて分析領域を設定する分析領域設
定手段と、 v:この分析領域設定手段で設定された分析領域内で、目
的とする細胞集団の細胞光情報を収集する細胞光情報収
集手段と、 vi:前記細胞光情報検出手段で検出された細胞光情報及
び前記細胞光情報収集手段で収集された目的細胞集団の
細胞光情報を処理する細胞光情報処理手段と、 vii:この細胞光情報処理手段の処理結果を出力する出力
手段とを備えてなるものにおいて、 viii:前回測定時の分析領域を記憶する分析領域記憶手
段と、 ix:今回測定時にこの分析領域記憶手段に記憶される前
回測定時の分析領域を再び設定し、この分析領域内に属
する細胞を計数する細胞計数手段と、 x:この細胞計数手段で計数された細胞数が所定の値に達
した後、今回測定により前記分析領域設定手段で演算さ
れた新たな分析領域での細胞光情報の数を揃える細胞数
統一手段とを備えたことを特徴とするものである。

（ホ）作用この発明の細胞分析装置では、同一の目的細胞集団に
ついて、同一の測定条件で分析を行う場合には、前回の
分析領域を記憶させておいて、今回の測定ではこの記憶
された分析領域を用いて細胞数を計数する。この間細胞
光情報が検出されて、測定中あるいは測定後に今回の分
析領域が演算される。

前回測定時の分析領域と、今回測定時の分析領域とは
若干異なっているから、今回の測定において、前回測定
時の分析領域に属する細胞数と、今回測定時の分析領域
に属する細胞数とは異なっているが、近い数値であるこ
とは期待できる。そこで、前記所定の値をこれより大き
い慨ね所望の値としておき、細胞数統一手段により、今
回測定時の分析領域に属する細胞数を正確に所望の値に
揃える。この時、細胞数計数のために手動でウィンドウ
の設定を行う必要はないので、分析の自動化及び効率化
が妨げられない。

（ヘ）実施例この発明の一実施例を第１図乃至第４図に基づいて以
下に説明する。

この実施例細胞分析装置は、細胞光情報（以下単にデ
ータという場合がある）として、前方散乱光強度I₀、90
゜散乱光強度I₉₀、赤色蛍光強度I_r、緑色蛍光強度I_gの
計４つのパラメータを採用している。

第２図は、実施例細胞分析装置の構成を示す図であ
る。２は、オートサンプラーであり、その試料ラック2a
には複数の試料容器３、…、３が装填されている。この
試料ラック2aは、図示しない駆動機構により駆動され、
指定の試料を、試料吸引チューブ４直下に位置させる。
さらに、このオートサンプラー２は、図示しない振とう
機構、冷却機構を備えており、定時時に試料を振とうす
ると共に、装填された試料容器３、…、３内の試料を低
温（例えば４℃〜10℃）に保持する。

前記試料吸引チューブ４は、三方弁５の１つのポート
に接続されている。三方弁５の他の２つのポートには、
試料送液チュープ6a、6bがそれぞれ接続されており、試
料送液チュープ6aと試料吸引チューブ４、あるいは試料
送液チューブ6aと6bとを連通させることができる。試料
送液チューブ6aの他端には、試料ポンプ７が設けられて
いる。一方、試料送液チューブ6bの他端は、シース液送
液チューブ８内に開口している。

このシース液送液チューブ８は、一端が送液ポンプ９
に接続され、他端がフローセル10に接続されている。フ
ローセル10は、石英ガラス等により構成され、内部のフ
ローチャネル10a内にシースフローが形成され、流体力
学的焦点合わせ効果により、試料中の細胞又は粒子がフ
ローチャネル10a中心軸上を一列になって流される。

フローセル10より流出した液は、廃液チューブ11に導
かれて、廃液タンク12に収容される。なお、この細胞分
析装置は、図示しないシース液タンクを備えており、前
記試料ポンプ７、送液ポンプ９にシース液が補充され
る。また、オートサンプラー２、ポンプ７、９等を含む
送液系は密閉可能で、バイオハザードを防止できる。

フローセル10の周囲には、レーザ（光源）14、光検出
器（細胞光情報検出手段）15a、15b、、15c、15dが配設
される。レーザ14よりのレーザビームｌは、フローチャ
ネル10aを流れる細胞（又は粒子）１に照射される。こ
の細胞（又は粒子）１よりは、信号光が発生するが、そ
の内前方方向のものは、前方散乱光として、レンズ16a
に集光されて、光検出器15aに入射する。17は、レーザ
ビームｌが直接光検出器15aに入射するのを防止するビ
ームブロッカである。

一方、細胞１よりの90゜方向の信号光は、レンズ16b
で集光される。この信号光はその一部がダイクロイック
ミラー18aで反射されて、90゜散乱光検出用の光検出器1
5bに入射する。ダイクロイックミラー18aを透過した信
号光は、さらにその一部がもう一つのダイクロイックミ
ラー18bにより反射されて、フィルタ19aを透過して、緑
色蛍光用の光検出器15cに受光される。ダイクロイック
ミラー18bを透過した光は、フィルタ19bを透過して赤色
蛍光用の光検出器15dに受光される。なお、例えばレー
ザ14には、アルゴンレーザやヘリウムネオンレーザ、前
方散乱光用の光検出器15aにはフォトダイオード、その
他の検出器15b、15c、15dには光電子増倍管が適用され
る。

光検出器15a、15b、15c、15dの受光信号は、信号処理
回路部20で増幅されノイズを取除かれた後、アナログ／
デジタル（A/D）変換器21によりデジタル信号に変換さ
れて、MPU22に取り込まれる。

MPU22は、大きく分けてオートトリガに関する機能、
細胞数カウント・統一に関する機能及びその他の機能を
有している。オートトリガに関する機能としては、例え
ば特願昭63−193033号の方式を適用するならば、前方散
乱光強度I₀、90゜散乱光強度I₉₀についてのサイトグラ
ム及びそれぞれのヒストグラムを作成する機能、これら
ヒストグラムより極小点を抽出し、細胞光情報を画分に
分画する機能、目的細胞集団を含む画分内で最終の画分
を決定する機能等を有している。

細胞数カウント・統一に関する機能としては、直前測
定の最終画分を記憶する機能、今回測定時に直前測定時
の最終画分を用いて細胞数をカウントする機能、今回測
定時に得られた最終画分内の細胞数を規定の数n_a0に揃
える機能等を備えている。

その他の機能としては、細胞数が揃えられた目的細胞
集団の光情報について蛍光解析を行う機能、前記試料ポ
ンプ７、送液ポンプ９及びオートサンプラー２を制御す
る機能等を有している。

PMU22には、フロッピーディスクドライブ23、キーボ
ード24、CRT25及びプリンタ26が接続されている。フロ
ッピーディスクドライブ23は、測定条件（プロトコル）
や測定データ等を、フロッピーディスクに保存させるた
めのものである。キーボード２は、プロトコルの選択・
設定あるいはその他の指令をMPU22に入力するためのも
のである。CRT25は、測定をモニタするためのものであ
り、プリンタ（出力手段）26は、MPU22の処理結果、例
えばサイトグラムやヒストグラム等をプリントアウトす
るためのものである。

次に、実施例細胞分析装置の動作を説明する。

まず、分析目的に応じた処理が施された試料が、それ
ぞれ試料容器３に入れられて、試料ラック2aに装填され
る。例えば、リンパ球サブセットの解析を行う試料は、
患者の血液にフルオレセインイソチオシアネート（FIT
C）で標識したOKT4モノクローナル抗体及びファイコエ
リスリン（PE）で標識したOKT8モノクローナル抗体を反
応させた後、溶血処理して得られる。

細胞分析装置の電源がオンされると、図示しないROM
よりMPU22にプログラムが読込まれ、システムが立上が
る〔ステップ（以下STという）１、第１図参照〕。次に
測定する試料に適合するプロトコルが選択・設定され
る。このプロトコルには、光検出器15a、15b、15c、15d
の検出ゲインや補正演算等の測定条件を内容とするもの
である。これは、試料の処理方法が測定目的に応じて異
なるためであり、例えば各処理に用いられるモノクロー
ナル抗体の細胞との反応性はそれぞれ異るため、光検出
器15a、15b、15c、15dの検出ゲインを変更する必要があ
り、また各クローナル抗体と蛍光色素の結合様式がそれ
ぞれ異なるため補正演算もそれに応じて変更する必要が
ある。

次にST2では、キーボード24よりオートトリガを行う
旨の指令が入力されているか否かが判定される。この判
定がYESの場合には、ST3へ分岐し、NOの場合にはST4へ
分岐する。また、ST3では、今回の測定が前回の測定と
は異なる新たなプロトコルに従ってなされる旨の指令が
入力されているか否かをMPU22が判定する。この判定がY
ESの場合にはST4へ分岐し、NOの場合にはST8へ分岐す
る。

今、ST2又はST3からST4へ分岐したものとして説明を
進める。ST4では、操作者がキーボード24より、ウィン
ドウB₀をI₉₀−I₀サイトグラム上に設定する〔第３図
（ａ）参照〕。ウィンドウB₀が設定されると、測定が開
始される（ST5）。ST5では、試料ラック2aが駆動され、
最初に測定を行う試料が入れられた試料容器３を試料吸
引チューブ４直下に位置させる。そして、三方弁５が試
料吸引チューブ４と試料送液チューブ４とが連通するよ
うに切換えられ、試料吸引チューブ４が試料容器３内に
降下し、試料ポンプ７が吸引側に駆動されて、試料が試
料送液チューブ6aに吸引される。

次に、三方弁５が、試料送液チューブ6aと6bを連通す
るように切換えられ、試料ポンプ７が送液側に駆動さ
れ、試料が送液チューブ８に送られる。一方、送液ポン
プ９が送液側に駆動され、シース液がフローセル10に送
られる。フローチャネル10a内では、シースフローが形
成され、流体力学的焦点合わせ効果により、細胞はフロ
ーチャネル10a中心軸上を一列になって流れていく。こ
の細胞の一つ一つについてレーザビームｌが照射され、
前方散乱光強度I₀、90゜散乱光強度I₉₀、緑色蛍光強度I
_g、赤色蛍光強度I_rがそれぞれ測定されていく。これら
細胞光情報は、必要に応じて、フロッピーディスク等に
順次記憶される。

測定中は、上記ウィンドウB₀に属する細胞の数がカウ
ントされる。ST6では、この細胞数ｎが所定のn_aに達し
たか否かを判定し、YESの場合にはST7へ、NOの場合に
は、ST6を繰り返す。所定の値n_aは、規制の細胞数n_a0に
対し大きめの、n₀＋αとされる。

ST7では、測定を終了し、ウィンドウB₀内の細胞光情
報について、先に述べた特願昭63−193033号の処理に従
い最終画分B₀′を決定する。この時、最終画分B₀′内の
細胞数ｎ′は、前記所定の細胞数n_aよりも少なくなる
が、初めからα分だけ余裕をもってカウントしているか
ら、n_a0を下回ることはないであろう。

ST12では、細胞数統一処理を行う。これは、最終画分
B₀′内の細胞光情報（細胞数ｎ′個）の内、n_a0を超え
る部分を切り捨てることにより行われる。切り捨てられ
る部分は、第４図の（ａ）に示すように後ろの部分を切
り捨てたり、（ｂ）のように最初の部分を切り捨てた
り、あるいは（ｃ）のように最初と最後の部分を切り捨
てる等の方法がある。

ST12で細胞数が統一されたデータについては、さらに
蛍光特性解析が行われる（ST13）。この蛍光特性解析で
は、例えば緑色蛍光強度I_g、赤色蛍光強度I_rについてそ
れぞれヒストグラムを作成し、陽性率の算出等が行われ
る。この蛍光特性解析の結果は、CRT25に表示され（ST1
4）、プリンタ26よりプリントアウトされる（ST15）。

ST16では、さらに測定すべき試料があるか否かが判定
される。この判定がYESの場合には、ST1へ戻り、NOの場
合には、分析を終了する。

さて、ST1へ戻り、前回の測定と同じプロトコルで、
かつオートトリガを行う場合には、ST2、ST3を経て、ST
8の処理へ進む。ST8では、直前の測定で得られた最終画
分B₀′を再び、I₉₀−I₀サイトグラム上にウィンドウと
して設定する〔第３図（ｂ）参照〕。そして、ST5と全
く同様に測定を開始し、最終画分B₀′に入る細胞をカウ
ントし、これが所定数n_aに達したか否かを判定する（ST
10）。

ST10の判定がYESになると、ST11へ進み測定を終了す
ると共に、オートトリガ演算を行う。このオートトリガ
演算は、先に述べたようにI₉₀、I₀のそれぞれについて
ヒストグラムを作成し、極小点p₁〜p₅を抽出して〔第７
図（ａ）（ｂ）参照〕、I₉₀−I₀サイトグラムを分画
し、画分B₁を設定する〔第３図（ｂ）参照〕。次に、こ
の画分B₁内に平行にラインl_iを引き、このラインl_i上で
ヒストグラムをそれぞれ作成し、極小点又はしきい値と
なる点を抽出し〔第６図（ａ）参照〕、これら点を結ん
で得られた領域を最終画分B₁′とする〔第３図（ｂ）参
照〕。

この場合、細胞数は、直前の最終画分B₀′によりカウ
ントされるので、最終画分B₀′内の細胞数n₁′は、n_aと
は異なるが、n_a0を下回ることはない。よって、この場
合も先と同様に細胞数統一処理を行う（ST12）。そし
て、ST13〜15の処理が行われる。

この実施例では、最終画分内の細胞数がn_a0個に統一
されているから、既存のデータと直接比較することがで
き、また、再計算の際にも便利である。一方、細胞数カ
ウントのための領域を初回以外は手動で設定する必要が
ないので、分析の自動化及び効率化が促進される。

なお、オートトリガの方式としては、特願昭63−1930
33号のものに限定されずに、特願昭63−193072号のもの
や、特願昭62−22884号のものや、その他輪郭追跡法な
ど適宜変更可能である。

（ト）発明の効果以上説明したように、この発明の細胞分析装置は、直
前測定時の分析領域を記憶する分析領域記憶手段と、今
回測定時にこの分析領域記憶手段に記憶される前回測定
時の分析領域を再び設定し、この分析領域内に属する細
胞を計数する細胞計数手段と、この細胞計数手段で計数
された細胞数が所定の値に達した時、前記分析領域設定
手段で今回測定について演算された新たな分析領域での
細胞光情報の数を揃える細胞数統一手段とを備えたこと
を特徴とするものである。従って、データが統一された
細胞数について得られ、データの客観性及び互換性が保
証される。また、計数のためのウィンドウの手動設定等
が不要で、分析の自動化、効率化を図ることが可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例に係る細胞分析装置の動
作を説明するフロー図、第２図は、同細胞分析装置の構
成を説明するブロック図、第３図（ａ）及び第３図
（ｂ）は、それぞれ同細胞分析装置の細胞数カウントを
説明するための90゜散乱光強度−前方散乱光強度のサイ
トグラム、第４図は、同細胞分析装置の細胞数統一を説
明するための図、第５図、第６図（ａ）及び第６図
（ｂ）は、それぞれ従来の細胞分析装置のオートトリガ
を説明するための90゜散乱光強度−前方散乱光強度のサ
イトグラム、第７図（ａ）及び第７図（ｂ）は、それぞ
れ従来の細胞分析装置のオートトリガを説明するための
90゜散乱光強度及び前方散乱光強度のヒストグラムであ
る。 10:フローセル、14:レーザ、 15a・15b・15c・15d:光検出器、 22:MPU、25:CRT、 26:プリンタ。

フロントページの続き (56)参考文献特開昭63−191043（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−225481（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−53968（ＪＰ，Ａ) 実開昭63−124663（ＪＰ，Ｕ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞浮遊液が流されるフローセルと、このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光
源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細胞について、複
数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細胞光情
報検出手段と、この細胞光情報検出手段で得られる、１又は２以上のパ
ラメータに基づいて分析領域を設定する分析領域設定手
段と、この分析領域設定手段で設定された分析領域内で、目的
とする細胞集団の細胞光情報を収集する細胞光情報収集
手段と、前記細胞光情報検出手段で検出された細胞光情報及び前
記細胞光情報収集手段で収集された目的細胞集団の細胞
光情報を処理する細胞光情報処理手段と、この細胞光情報処理手段の処理結果を出力する出力手段
とを備えてなる細胞分析装置において、前回測定時の分析領域を記憶する分析領域記憶手段と、今回測定時にこの分析領域記憶手段に記憶される前回測
定時の分析領域を再び設定し、この分析領域内に属する
細胞を計数する細胞計数手段と、この細胞計数手段で計数された細胞数が所定の値に達し
た時、前記分析領域設定手段で今回測定について演算さ
れた新たな分析領域での細胞光情報の数を揃える細胞数
統一手段とを備えたことを特徴とする細胞分析装置。