JP2705126B2

JP2705126B2 - 細胞分析装置

Info

Publication number: JP2705126B2
Application number: JP63193033A
Authority: JP
Inventors: 晃史山本; 昌弘花房
Original assignee: Omron Corp
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1988-08-02
Filing date: 1988-08-02
Publication date: 1998-01-26
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: JPH0242357A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、フローサイトメトリーを適用した細胞分
析装置に関し、詳しく言えば、試料中の特定細胞集団に
ついての細胞光情報を選別収集する処理に関する。

（ロ）従来の技術フローサイトメトリーは、例えば蛍光色素で標識され
た細胞（又はこれに準ずる粒子）を、細い液流中に流
し、流体力学的焦点合わせ効果により１列になって流れ
る細胞の一つ一つにレーザ光を照射し、細胞より生じる
散乱光や蛍光の強度、すなわち細胞光情報を瞬時に測定
し、細胞を分析するものである。このフローサイトメト
リーは、大量の細胞を高速度かつ高精度に分析できる特
長を有している。

上記フローサイトメトリーを適用した細胞分析装置と
しては、細い液流を形成するためのフローセルと、この
フローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光源
（例えばレーザ）と、この光ビームが照射された細胞よ
り細胞光情報を検出し電気信号に変換する光検出器と、
この電気信号に変換された細胞光情報の解析処理等を行
うコンピュータを備えてなるものが知られている。

この従来の細胞分析装置は、蛍光色素で染色した細胞
浮遊液（試料）をシース液と共にフローセル内に流す。
フローセル内には、シースフローが形成され、流体力学
的焦点合わせ効果により、細胞は、フローセル中心軸上
を一列になって流れていく。

これら細胞に光ビームが照射されることにより生じる
散乱光及び蛍光の強度は、細胞光情報を構成するパラメ
ータとして、光電子増倍管等の光検出器により検出され
る。

さて、細胞浮遊液中に複数の細胞集団が含まれている
時に、これらの細胞集団の１つについて分析を行いたい
場合がある。例えば、ひと血液中のリンパ球サブセット
の分析の場合には、試料として血液を溶血したものが使
用されるが、この試料中には、リンパ球の他に、単球、
顆粒球が含まれており、測定により得られた細胞光情報
より、リンパ球についてのものを選別する必要が生じ
る。

そこで、必要な細胞集団の細胞光情報を選別して収集
する方法としては、いわゆるウインドゥ法が知られてい
る（例えば特開昭62−134559号公報参照）。このウイン
ドゥ法は、細胞光情報のうちの１又は２以上のパラメー
タを座標系とする空間に、ウインドゥと呼ばれる分析領
域を操作者が設定し、この領域に属する細胞の光情報を
目的の細胞集団の細胞光情報として収集していた。

例えば、上記リンパ球のサブセットの分析の場合に
は、細胞光情報のうち、90゜散乱光強度I₉₀及び前方散
乱光強度I₀の２つのパラメータを用いる。第６図は、I
₉₀を横軸に、I₀を縦軸にとったサイトグラムの模式図を
示している。ｂはリンパ球の分布、ｃは単球の分布、ｄ
は顆粒球の分布をそれぞれ示している。なお、ａはデブ
リスの分布を示しているが、このデブリスは、赤血球の
膜成分等より構成されるもので、通常ノイズ処理の段階
で取除かれることが多い。

リンパ球について分析を行うには、対照試料（健常者
の試料）を用いて、第６図に二点鎖線で示すように、ウ
インドゥｅを設定する。このウインドゥｅに属する細胞
光情報を、測定された全細胞光情報より収集し、蛍光特
性について解析処理を行い、結果をCRTに表示し、ま
た、プリンタより出力する。

しかし、上記ウインドゥ法では、試料によっては操作
者がウインドゥの変更をしなければ、目的の細胞集団の
細胞光情報を収集することができないことがある。例え
ば、リンパ球サブセットの分析において、第６図に示す
リンパ球の分布ｂの位置、大きさや形状が試料によって
変化し、ウインドゥｅをそれに応じて操作者が変更しな
ければならない。このようなウインドゥの変更は、多く
の試料を効率良く自動的に測定するのを妨げている。

そこで、細胞光情報の収集を、操作者がウインドゥを
設定することなく自動的に行える細胞分析装置が、本願
出願人によりすでに出願されている（特願昭62−22884
号）。この細胞分析装置は、細胞光情報の内、１又は２
以上のパラメータについてヒストグラムを作成し、これ
らヒストグラムの極小点を抽出し、極小点に基づいて細
胞集団を分画し、１又は２以上の画分を分析領域とし
て、これに属する細胞の光情報を、目的の細胞集団の細
胞光情報として収集する。

例えば、上記リンパ球サブセットの分析の場合には、
90゜散乱光強度I₉₀及び前方散乱光強度I₀のヒストグラ
ムを作成する〔第７図（ａ）及び第７図（ｂ）参照〕。
そして、I₉₀のヒストグラムより極小点p₁、p₂、p₃、I₀
のヒストグラムより極小点p₄、p₅を抽出する。これら極
小点p₁〜p₅をI₉₀、I₀サイトグラム上に表せば、第６図
に破線で示す画分に分画される。リンパ球の分布ｂは、
画分Ｂに含まれているので、この画分Ｂに属する細胞の
光情報、すなわち、I₉₀がp₁以上p₂以下、かつI₀がp₄以
上p₅以下となるような細胞の光情報を、測定された全細
胞の細胞光情報より検索し、リンパ球の細胞光情報を収
集する。

（ハ）発明が解決しようとする課題上記従来の細胞分析装置においては、細胞光情報収集
手段が目的細胞集団の細胞光情報を画分に基づいて収集
するが、この画分は第６図に示すように、サイトグラム
上で方形の領域である。従って、この画分は目的細胞集
団の分布の形状に完全には適合しておらず、不要な細胞
の光情報が、収集された目的細胞集団の光情報に含まれ
て、分析精度が低下する問題点があった。

より目的細胞集団の分布の形状に適合する分析領域を
求める方法としては、輪郭追跡法が知られているが、演
算処理に時間を要し、分析の効率化の面から好ましくな
い。

この発明は、上記に鑑みなされたものであり、より目
的細胞集団の分布に適合する画分を短い処理時間で決定
できる細胞分析装置の提供を目的としている。

（ニ）課題を解決するための手段上記課題を解決するため、この発明の細胞分析装置
は、細胞（これに準ずる粒子も含む）浮遊液が流されるフ
ローセルと、このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する
光源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細胞について、
複数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細胞光
情報検出手段と、この細胞光情報検出手段で得られる２種のパラメータ
について、それぞれのヒストグラムより極小点を抽出
し、この極小点の光強度を求め、前記細胞浮遊液中の細
胞群を前記求められた光強度により矩形の画像に分画す
る細胞集団分画手段と、この細胞集団分画手段で得られた目的とする細胞集団
の細胞光情報を収集する細胞光情報収集手段と、この細胞光情報収集手段で収集された細胞光情報につ
いて、１つのパラメータの所定度数ごとに、もう１つの
パラメータのヒストグラムをそれぞれ求めるヒストグラ
ム作成手段と、このヒストグラム作成手段で得られたそれぞれのヒス
トグラムより境界点を抽出する境界点抽出手段と、この境界点抽出手段で抽出された境界点を結んで形成
される領域を最終分画とし、この最終分画に基づき、目
的細胞集団の細胞光情報を収集する第２の細胞光情報収
集手段と、この第２の細胞光情報収集手段で収集された目的細胞
集団の細胞光情報を処理する細胞光情報処理手段と、この細胞光情報処理手段の処理結果を出力する出力手
段とを備えたことを特徴とするものである。

（ホ）作用この発明の細胞分析装置の作用を、実施例に対応する
第１図及び第２図を用いて説明すると、細胞集団分画手
段で得られた画分Ｂについて、細胞光情報収集手段が、
目的細胞集団の細胞光情報を収集した後、この収集され
た細胞光情報について、前記ヒストグラム作成手段が、
一つのパラメータI₀の所定度数ΔI₀ごとに、もう一つの
パラメータI₉₀のヒストグラムを作成する。前記境界点
抽出手段は、例えばこれらヒストグラムが所定のしきい
値n_thと交わる点あるいはヒストグラムの極小点X₁、X₂
等をを境界点r_a、r_bとして抽出する〔第２図（ａ）
（ｂ）参照〕。そして、各境界点を結んで得られる領域
Ｂ′は、第１図にも示すように、最初の画分Ｂよりも目
的細胞集団によく適合している。よって、この領域Ｂ′
を最終画分として細胞光情報を収集すれば、不要な細胞
光情報が解析処理に係る細胞光情報に含まれず、分析精
度の向上が可能となる。

（ヘ）実施例この発明の一実施例を、図面に基づいて以下に説明す
る。

この実施例細胞分析装置は、細胞光情報（以下単にデ
ータという場合がある）として、前方散乱光強度I₀、90
゜散乱光強度I₉₀、異なる二色の蛍光強度I_r、I_gの計４
つのパラメータを採用している。

第２図は、実施例細胞分析装置の構成を示す図であ
る。２は、オートサンプラーであり、その試料ラック2a
には複数の試料容器３、…、３が装填されている。この
試料ラック2aは、図示しない駆動機構により駆動され、
指定の試料を、試料吸引チューブ４直下に位置させる。
さらに、このオートサンプラー２は、図示しない振とう
機構、冷却機構を備えており、定時的に試料を振とうす
ると共に、装填された試料容器３、…、３内の試料を低
温（例えば４℃〜10℃）に保持する。

前記試料吸引チューブ４は、三方弁５の１つのポート
に接続されている。三方弁５の他の２つのポートには、
試料送液チューブ6a、6bがそれぞれ接続されており、試
料送液チューブ6aと試料吸引チューブ４、あるいは試料
送液チューブ6aと6bを連通させることができる。試料送
液チューブ6aの他端には、試料ポンプ７が設けられてい
る。一方、試料送液チューブ6bの他端は、シース液送液
チューブ８内に開口している。

このシース液送液チューブ８は、一端が送液ポンプ９
に接続され、他端がフローセル10に接続されている。フ
ローセル10は、石英ガラス等により構成され、内部のフ
ローチャネル10a内にシースフローが形成され、流体力
学的焦点合わせ効果により、試料中の細胞又は粒子１が
フローチャネル10a中心軸上を一列になって流される。

フローセル10より流出した液は、廃液チューブ11に導
かれて、廃液タンク12に収容される。なお、この細胞分
析装置は、図示しないシース液タンクを備えており、前
記試料ポンプ７、送液ポンプ９にシース液が充填され
る。また、オートサンプラー２、ポンプ７、９等を含む
送液系は密閉可能で、バイオハザードを防止できる。

フローセル10の周囲には、レーザ（光源）14、光検出
器（細胞光情報検出手段）15a、15b、15c、15dが配設さ
れる。レーザ14よりのレーザビームｌは、フローチャネ
ル10aを流れる細胞又は粒子１に照射される。この細胞
又は粒子１よりは、信号光が発生するが、その内前方向
のものは、前方散乱光として、レンズ16aに集光され
て、光検出器15aに入射する。17は、レーザビームｌが
直接光検出器15aに入射するのを防止するビームブロッ
カである。

一方、細胞又は粒子１よりの90゜方向の信号光は、レ
ンズ16bで集光される。この信号光はその一部がダイク
ロイックミラー18aで反射されて、90゜散乱光検出用の
光検出器15bに入射する。ダイクロイックミラー18aを透
過した信号光は、さらにその一部がもう一つのダイクロ
イックミラー18bにより反射されて、フィルタ19aを透過
して、緑色蛍光用の光検出器15cに受光される。ダイク
ロイックミラー18bは、フィルタ19bを透過して赤色蛍光
用の光検出器15dに受光される。なお、例えばレーザ14
には、アルゴンレーザやヘリウムネオンレーザ、前方散
乱光用の光検出器15aにはホトダイオード、その他の検
出器15b、15c、15dには光電子増倍管が適用される。

光検出器15a、15b、15c、15dの受光信号は、図示しな
いアナログ／デジタル変換器によりデジタル信号に変換
されて、MPU21に取込まれる。MPU21は、前方散乱光強度
I₀、90゜散乱光強度I₉₀についてのサイトグラム及びそ
れぞれのヒストグラムを作成する機能、このヒストグラ
ムより極小点を抽出し、細胞光情報を画分に分画する機
能、この画分に属する細胞光情報を収集する機能、さら
に、この収集された細胞光情報について最終の画分を決
定する機能、この最終画分に属する細胞光情報を収集
し、蛍光特性を解析する機能、前記試料ポンプ７、送液
ポンプ９及びオートサンプラー２を制御する機能等を有
している。

MPU21には、キーボード22、CRT23、プリンタ24が接続
されている。キーボード22は、プロトコル（測定条件）
の選択・設定あるいはその他の指令をMPU21に入力する
ためのものである。CRT23は、測定をモニタするもので
あり、プリンタ（出力手段）24は、MPU21の処理結果、
例えばサイトグラムやヒストグラム等をプリントアウト
するためのものである。

次に、実施例細胞分析装置の動作を説明する。

まず、分析目的に応じた処理が施された試料が、それ
ぞれ試料容器３に入れられて、試料ラック2aに装填され
る。例えば、リンパ球サブセットの解析のを行う試料
は、患者の血液にフルオレセインイソチオシアネート
（FITC）で標識したOKT4モノクローナル抗体及びファイ
コエリスリン（PE）で標識したOKT8モノクローナル抗体
を反応させた後、溶血処理して得られる。

細胞分析装置の電源がオンされると、図示しないROM
よりMPU21にプログラムが読込まれ、システム立上がる
〔ステップ（以下STという）１、第４図（ａ）参照〕。
次に、測定する試料に適合するプロトコルが選択・設定
される。このプロトコルには、光検出器15a、15b、15
c、15dの検出ゲインや補正演算等の測定条件を内容とす
るものである。これは、試料の処理方法が測定目的に応
じて異なるためであり、例えば各処理に用いられるモノ
クローナル抗体の細胞との反応性はそれぞれ異なるた
め、光検出器15a、15b、15c、15dの検出ゲインを変更す
る必要があり、また各モノクローナル抗体と蛍光色素の
結合様式がそれぞれ異なるため補正演算もそれに応じて
変更する必要がある。

ST2の処理が終了すると、試料ラック2aが駆動され、
最初に測定を行う試料が入れられた試料容器３を、試料
吸引チューブ４直下に位置させる。そして、三方弁５が
試料吸引チューブ４と試料送液チューブ6aとが連通する
ように切換えられ、試料吸引チューブ４が試料容器３内
に降下し、試料ポンプ７が吸引側に駆動されて、試料が
試料送液チューブ6aに吸引される（ST3）。

次に、三方弁５が、試料送液チューブ6aと6bを連通す
るように切換えられ、試料ポンプ７が送液側に駆動さ
れ、試料が送液チューブ８に送られる。一方、送液ポン
プ９が送液側に駆動され、シース液がフローセル10に送
られる。フローチャネル10a内では、シースフローが形
成され、流体力学的焦点合わせ効果により、細胞はフロ
ーチャネル10a中心軸上を一列になって流れていく。こ
の細胞の一つ一つについてレーザビームｌが照射され、
前方散乱光強度I₀、90゜散乱光強度I₉₀、緑色蛍光強度I
_g、赤色蛍光強度I_rがそれぞれ測定されていく（ST4）。

ST5では、MPU21は、前方散乱光強度I₀、90゜散乱光強
度I₉₀を直交軸とするサイトグラム（第６図参照）、及
びそれぞれのヒストグラム〔第７図（ａ）（ｂ）参照〕
が作成される。そして、ST6では、I₉₀ヒストグラムより
極小点が抽出できるか否かを判定する。

試料が正常である場合には、I₉₀ヒストグラムより３
つの極小点p₁、p₂、p₃が抽出できる〔リンパ球サブセッ
ト分析の場合、第７図（ａ）参照〕。この場合には、ST
9へ分岐するが、試料が異常であり、極小点が抽出でき
ない場合には、ST7に分岐し、操作者に異常を検知す
る。この報知はCRT23への表示、あるいは音声等により
行われる。そして、操作者による画分の手動補正が行わ
れて（ST8）、ST9へ進む。

ST9では、I₉₀ヒストグラムより変曲点p₁、p₂、p₃を抽
出し、I₉₀がp₁とp₂との間であるデータを、当該試料に
ついての全測定データより選別収集する。第５図（ａ）
（ｂ）は、この選別収集されたデータについて、I₉₀及
びI₀のヒストグラムを示している。さらに、第５図
（ｂ）に示すI₀のヒストグラムより、極小点を抽出し、
これら極小点に基づいて最終的に画分Ｂが決定される
（ST10、第６図も参照）。

続くST11は、画分Ｂ内で前方散乱光強度I₀（ｉ）の線
上で、90゜散乱光強度I₉₀のヒストグラムを作成る〔第
１図及び第２図（ａ）（ｂ）参照〕。ST12では、このヒ
ストグラム上で境界点r_ai、r_biを決定する。この境界点
の決定は、第２図（ａ）に示すようにヒストグラムに極
小点がない場合には、ヒストグラムが所定のしきい値n
_thと交わる点を境界点r_ai、r_biと決定する。また、第２
図（ｂ）に示すように、ヒストグラムに極小点X₁、X₂が
ある場合には、これを境界点r_ai、r_biと決定する。もち
ろん、２つの境界点のうち、一方をしきい値n_thによ
り、他方を極小点により決定してもよい。ヒストグラム
全体がしきい値n_thより小さい場合、あるいはヒストグ
ラムより極小点が抽出できない場合には、境界点なしと
する。

ST13では、境界点r_ai、r_biがすべて決定されたか否か
を判定する、この判定がNOの場合には、ST11へ戻り、前
回のI₀（ｉ）よりΔI₀大きいI₀（ｉ＋１）について同様
にヒストグラムを作成し、境界点を決定する（ST12）。
すなわち、画分Ｂ内においてＤ、ΔI₀ごとに引かれるI₀
（１）、…、I₀（ｍ）の線上で、それぞれヒストグラム
を作成し、境界点を順次決定して行くわけである。

ST13の判定がYESの場合には、ST14へ分岐し、境界点r
_ai、r_biを結んで得られる領域を最終画分Ｂ′に決定す
る。この最終画分Ｂ′はST10で得られた画分Ｂよりも、
リンパ球の分布に適合する形となっている。また、ST1
1、12の処理は、輪郭追跡法を行う場合に比べて処理時
間を短くすることができる。

ST14で決定された最終画分に属するデータについて
は、さらに蛍光特性解析が行われる（ST15）。この蛍光
特性解析では、例えば緑色蛍光強度I_g、赤色蛍光強度I_r
についてそれぞれヒストグラムを作成し、陽性率の算出
等が行われる。この蛍光特性解析の結果は、CRT23に表
示され（ST16）、プリンタ24よりプリントアウトされる
（ST17）。

ST18では、測定すべき試料があるか否かが判定され
る。この判定がYESの場合は、ST2へ戻り、次の試料の測
定を行い、NOの場合には、測定を終了する。

なお、上記説明では、リンパ球サブセットの分析を例
にとっているが、この発明はこれに限定されるものでは
なく、各種細胞（あるいはこれに準ずる粒子）集団、例
えば赤血球、網赤血球、血小板等の分析に広く適用可能
なものである。また、用いるパラメータも、前方散乱光
強度、90゜散乱光強度、緑色蛍光強度、赤色蛍光強度の
４種類に限られるものではない。さらに、この発明はウ
インドゥ法を用いる細胞分析装置にも適用可能であり、
この場合にはウインドゥ内で最終画分を決定する。

（ト）発明の効果以上発明したように、この発明の細胞分析装置は、２
つのパラメータのヒストグラムの極小点から目的細胞集
団を含む矩形の分画を得るので、目的細胞を外すことな
く確実、短時間にウインドゥを設定できる。また、細胞
光情報収集手段で収集された細胞光情報について、１つ
のパラメータの所定度数ごとに、もう一つのパラメータ
のヒストグラムをそれぞれ求めるヒストグラム作成手段
と、このヒストグラム作成手段で得られたそれぞれのヒ
ストグラムより境界点を抽出する境界点抽出手段と、こ
の境界点抽出手段で抽出された境界点を結んで形成され
る領域を最終画分とし、この最終画分に基づき、目的細
胞集団の細胞光情報を収集する第２の細胞光情報収集手
段とを備えてなるものであるから、目的細胞集団に適用
する画分を短い処理時間で決定でき、分析精度の向上を
図ることができる利点を有している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例に係る細胞分析装置の最
終画分決定を説明する三次元表示サイトグラムの要部を
示す図、第２図（ａ）及び第２図（ｂ）は、同細胞分析
装置の最終画分決定をそれぞれ説明するヒストグラムの
模式図、第３図は、同細胞分析装置の構成を説明するブ
ロック図、第４図は、同細胞分析装置の動作を説明する
フロー図、第５図（ａ）及び第５図（ｂ）は、同細胞分
析装置の画分抽出演算を説明するためのそれぞれ90゜散
乱光強度、前方散乱光強度のヒストグラム、第６図は、
前方散乱光強度、90゜散乱光強度のサイトグラムの一例
を示す模式図、第７図（ａ）及び第７図（ｂ）は、それ
ぞれ90゜散乱光強度と前方散乱光強度のヒストグラムの
一例をそれぞれ示す図である。 10:フローセル、14:レーザ、 15a・15b・15c・15d:光検出器、 21:MPU、23:CRT、 24:プリンタ。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞浮遊液が流されるフローセルと、このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光
源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細胞について、複
数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細胞光情
報検出手段と、この細胞光情報検出手段で得られる２種のパラメータに
ついて、それぞれのヒストグラムより極小点を抽出し、
この極小点の光強度を求め、前記細胞浮遊液中の細胞群
を前記求められた光強度により矩形の画像に分画する細
胞集団分画手段と、この細胞集団分画手段で得られた目的とする細胞集団の
細胞光情報を収集する細胞光情報収集手段と、この細胞光情報収集手段で収集された細胞光情報につい
て、１つのパラメータの所定度数ごとに、もう１つのパ
ラメータのヒストグラムをそれぞれ求めるヒストグラム
作成手段と、このヒストグラム作成手段で得られたそれぞれのヒスト
グラムより境界点を抽出する境界点抽出手段と、この境界点抽出手段で抽出された境界点を結んで形成さ
れる領域を最終分画とし、この最終分画に基づき、目的
細胞集団の細胞光情報を収集する第２の細胞光情報収集
手段と、この第２の細胞光情報収集手段で収集された目的細胞集
団の細胞光情報を処理する細胞光情報処理手段と、この細胞光情報処理手段の処理結果を出力する出力手段
とを備えてなる細胞分析装置。