JP2943249B2

JP2943249B2 - 細胞分析装置

Info

Publication number: JP2943249B2
Application number: JP2152075A
Authority: JP
Inventors: 晃史山本; 昌弘花房
Original assignee: Omron Corp
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1990-06-11
Publication date: 1999-08-30
Anticipated expiration: 2014-08-30
Also published as: JPH0443942A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、フローサイトメトリーを適用した細胞分
析装置に関し、詳しく言えば、細胞光情報を処理する過
程での、細胞光情報の収集に関する。

（ロ）従来の技術フローサイトメトリーは、例えば蛍光色素で標識され
た細胞又は粒子を細い液流中に流し、流体力学的焦点合
わせ効果により１列になって流れる細胞の一つ一つにレ
ーザ光を照射し、細胞より生じる散乱光や蛍光の強度、
すなち細胞光情報を瞬時に測定し、細胞を分析するもの
である。このフローサイトメトリーは、大量の細胞を高
速度かつ高精度に分析できる特長を有し、臨床検査から
研究用まで広く利用されている。

上記フローサイトメトリーを適用した細胞分析装置と
しては、細い液流を形成するためのフローセルと、この
フローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光源
（例えばレーザ）と、この光ビームが照射された細胞よ
り細胞光情報を検出し電気信号に変換する光検出器と、
この電気信号に変換された細胞光情報の解析処理等を行
うコンピュータを備えてなるものが知られている。

この細胞分析装置は、赤血球、白血球、培養細胞等、
各種細胞の分析に適用できるものである。例えば、血液
中のリンパ球サブセット分析の場合には、蛍光色素で標
識されたモノクローナル抗体をヒト血液に反応させ、そ
の後、この血液を溶血処理したものが試料として用いら
れる。

フローセル内を流れる試料細胞には、レーザビームが
照射され、４つのパラメータ、すなわち前方散乱光強度
I₀、90゜散乱光強度I₉₀、緑色光強度I_g、赤色蛍光強度I
_rが、それぞれ検出器で検出され、細胞光情報（以下単
にデータという場合がある）が得られる。上記試料中に
は、リンパ球の他に、単球、顆粒球等が含まれており、
得られたデータ中には、リンパ球についてのデータの他
に、単球、顆粒球等についてのデータも含まれることに
なる。従って、リンパ球についてのデータを他の細胞の
データより選別して収集する必要が生じる。

そこで、細胞の大きさと内部構造を表すとされる前方
散乱光強度I₀、90゜散乱光強度I₉₀を直交座標軸とする
サイトグラムを作成する〔第４図（ａ）参照〕。このサ
イトグラムにおいて、ｂはリンパ球の分布、ｃは単球の
分布、ｄは顆粒球の分布をそれぞれ示している。なお、
三角形の領域ｆはノイズ処理で除かれた部分である。こ
のサイトグラム上で、例えばリンパ球の分布ｂを含む、
多角形又は楕円の分析領域（ウィンドゥと呼ばれること
が多い）Ｂを設定して、この分析領域に属する（斜線を
付した領域に属する）細胞のデータを、他の細胞のデー
タより選別して収集する。この分析領域は、操作者がマ
ウスやデジタイザを用いて手動設定したり、あるいは自
動的に設定される（いわゆるオートトリガ、例えば特願
昭63−193033号、特願昭63−193072号参照）。

こうして収集されたリンパ球のデータについて、さら
に緑色蛍光強度I_g、赤色蛍光強度I_rについて演算処理、
例えば、第４図（ｂ）に示すように、I_g−I_rのサイトグ
ラムを作成して、陽性率の算出が行われる。

（ハ）発明が解決しようとする課題上記細胞分析装置において、試料はヒト血液より調製
されることが多いが、血液はヒトの病態を多様に反映
し、I₉₀−I₀サイトグラム上の分布においても複雑なパ
ターンを呈し、帰属を異にする細胞の分布が多様に重畳
して、目的細胞集団をサイトグラム上で特定できないこ
とがある。

例えば、上記リンパ球サブセット分布において、健常
者の場合には、第４図（ａ）に示すように細胞集団は３
つに大別され、その内ｂのリンパ球分布を含む分析領域
Ｂを設定し、この分析領域Ｂ内に属するリンパ球データ
を用いて蛍光解析を行うのは先に述べたとおりである。
しかしながら、白血病患者の場合には、第４図（ｃ）に
示すように、リンパ球と他の細胞とが重畳した分布ｅと
なることがあり、分析領域Ｂを正確に設定できなくな
る。このため、使用された蛍光色素標識モノクローナル
抗体の陽性率が大きく異なる問題点があった。

一方、試料中のある細胞集団を除いた、他の細胞集団
すべてについて分析を行いたい場合もある。例えば、上
記試料についてリンパ球を除いた部分について分析を行
いたい場合には、第４図（ｄ）に示すように、リンパ球
の分布ｂを除いて分析領域を設定しなければならない
が、ｋの領域がリンパ球の分布ｂに属さないにもかかわ
らず、分析領域より漏れてしまい、分析が正確に行えな
くなる問題点もあった。

この発明は、上記に鑑みなされたもので、必要な細胞
集団のデータを、的確に特定いて選別収集し、複雑なサ
イトグラムパターンの解析を精度よく行うことを目的と
している。

（ニ）課題を解決するための手段上記課題を解決するため、この発明の細胞分析装置
は、以下のｉ〜ixに列記する構成を有している。

i:細胞浮遊液が流されるフローセルと、 ii:このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射す
る光源と、 iii:この光ビームが照射されたそれぞれの細胞につい
て、複数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細
胞光情報検出手段と、 iv:この細胞光情報検出手段で得られるパラメータのう
ち、特定のパラメータに基づいて分析領域を設定する第
１の分析領域設定手段と、 v:前記細胞光情報検出手段で得られるパラメータのう
ち、前記特定のパラメータ以外の別のパラメータに基づ
いて分析領域を設定する第２の分析領域設定手段と、 vi:前記第１の分析領域設定手段で設定された分析領域
から、目的とする細胞集団の細胞光情報を収集する第１
の細胞光情報収集手段と、 vii:この第１の細胞光情報収集手段で収集された目的細
胞集団の細胞光情報から、前記第２の分析領域設定手段
で設定された分析外の細胞集団の細胞光情報を収集する
第２の細胞光情報収集手段と、 viii:前記第１の細胞光情報収集手段で収集された目的
細胞集団の細胞光情報と前記第２の細胞光情報収集手段
で収集された分析外細胞集団の細胞光情報とから、分析
対象の細胞集団の細胞光情報を収集して演算処理する細
胞光情報演算処理手段と、 ix:この細胞光情報演算処理手段の演算処理結果を出力
する出力手段とを備えることを特徴とするものである。

（ホ）作用この発明の細胞分析装置は、目的細胞集団の細胞光情
報と分析外細胞集団の細胞光情報とから、分析対象の細
胞集団の細胞光情報を収集する構成であるので、たとえ
目的細胞集団と分析外細胞集団が重畳する場合であって
も、分析対象の細胞集団の特定を正確に行うことがで
き、分析の精度、特に陽性率決定の精度を向上させるこ
とができる。

（ヘ）実施例この発明の一実施例を第１図乃至第３図に基づいて以
下に説明する。

第２図は、実施例細胞分析装置の構成を示す図であ
る。２は、オートサンプラーであり、その試料ラック2a
には複数の試料容器３、…、３が装填されている。この
試料ラック2aは、図示しない駆動機構により駆動され、
指定の試料を、試料吸引チューブ４直下に位置させる。
さらに、このオートサンプラー２は、図示しない振とう
機構、冷却機構を備えており、定時的に試料を振とうす
ると共に、装填された試料容器３、…、３内の試料を低
温（例えば４℃〜10℃）に保持する。

前記試料吸引チューブ４は、三方弁５の１つのポート
に接続されている。三方弁５の他の２つのポートには、
試料送液チューブ6a、6bがそれぞれ接続されており、試
料送液チューブ6aと試料吸引チューブ４、あるいは試料
送液チューブ6aと6bとを連通させることができる。試料
送液チューブ6aの他端には、試料ポンプ７が設けられて
いる。一方、試料送液チューブ6bの他端は、シース液送
液チューブ８内に開口している。

このシース液送液チューブ８は、一端が送液ポンプ９
に接続され、他端がフローセル10に接続されている。フ
ローセル10は、石英ガラス等により構成され、内部のフ
ローチャネル10a内にシースフローが形成され、流体力
学的焦点合わせ効果により、試料中の細胞又は粒子がフ
ローチャネル10a中心軸上を一列になって流される。

フローセル10より流出した液は、廃液チューブ11に導
かれて、廃液タンク12に収容される。なお、この細胞分
析装置は、図示しないシース液タンクを備えており、前
記試料ポンプ７、送液ポンプ９にシース液が補充され
る。また、オートサンプラー２、ポンプ７、９等を含む
送液系は密閉可能で、バイオハザードを防止できる。

フローセル10の周囲には、レーザ（光源）14、光検出
器（細胞光情報検出手段）15a、15b、15c、15dが配設さ
れる。レーザ14よりのレーザビームｌは、フローチャネ
ル10aを流れる細胞（又は粒子）に照射される。この細
胞よりは、信号光が発生するが、その内前方方向のもの
は、前方散乱光として、レンズ16aに集光されて、光検
出器15aに入射する。17は、レーザビームｌが直接光検
出器15aに入射するのを防止するビームブロッカであ
る。

一方、細胞よりの90゜方向の信号光は、レンズ16bで
集光される。この信号光はその一部がダイクロイックミ
ラー18aで反射されて、90゜散乱光検出用の光検出器15b
に入射する。ダイクロイックミラー18aを透過した信号
光は、さらにその一部がもう一つのダイクロイックミラ
ー18bにより反射されて、フィルタ19aを透過して、緑色
蛍光用の光検出器15cに受光される。ダイクロイックミ
ラー18bを透過した光は、フィルタ19bを透過して赤色蛍
光用の光検出器15dに受光される。なお、例えばレーザ1
4には、アルゴンレーザやヘリウムネオンレーザ、前方
散乱光用の光検出器15aにはホトダイオード、その他の
光検出器15b、15c、15dには光電子増倍管が適用され
る。

光検出器15a、15b、15c、15dの受光信号は、信号処理
回路部20で増幅されノイズを取除かれた後、アナログ／
デジタル（A/D）変換器21によりデジタル信号に変換さ
れて、MPU22に取り込まれる。

MPU22は、散乱光強度I₉₀−I₀サイトグラムを作成する
機能、このI₉₀−I₀サイトグラム上でウィンドゥを設定
する機能、ウィンドゥ内又はウィンドゥ外でデータを収
集する機能、収集されたデータについて蛍光特性解析を
行う機能、その他、試料ポンプ７、送液ポンプ９及びオ
ートサンプラー２を制御する機能等を有している。

MPU22には、フロッピディスクドライブ23、キーボー
ド24、CRT25及びプリンタ26が接続されている。フロッ
ピディスクドライブ23は、測定条件（プロトコル）や測
定データ等を、フロッピディスクに保存させるためのも
のである。キーボード24は、プロトコルの選択・設定あ
るいはその他の指令をMPU22に入力するためのものであ
る。CRT25は、測定をモニタするためのものであり、プ
リンタ26は、MPU22の処理結果、例えばサイトグラムや
ヒストグラム等をプリントアウトするためのものであ
る。なお、図示しないがマウス等の入力手段も接続され
る。

次に、実施例細胞分析装置の動作を説明する。

まず、分析目的に応じた処理が施された試料が、それ
ぞれ試料容器３に入れられて、試料ラック2aに装填され
る。例えば、リンパ球サブセットの解析を行う試料は、
患者の血液にフルオレセインイソチオシアネート（FIT
C）で標識したOKT4モノクローナル抗体及びファイコエ
リスリン（PE）で標識したOKT8モノクローナル抗体を反
応させた後、溶血処理して得られる。

細胞分析装置の電源がオンされると、図示しないROM
よりMPU22にプログラムが読込まれ、システムが立上が
る〔ステップ（以下STという）１、第１図参照〕。次
に、測定する試料に適合するプロトコルが選択・設定さ
れる。このプロトコルには、光検出器15a、15b、15c、1
5dの検出ゲインや補正演算等の測定条件を内容とするも
のである。これは、試料の処理方法が測定目的に応じて
異なるためであり、例えば各処理に用いられるモノクロ
ーナル抗体の細胞との反応性はそれぞれ異なるため、光
検出器15a、15b、15c、15dの検出ゲインを変更する必要
があり、また各モノクローナル抗体と蛍光色素の結合様
式がそれぞれ異なるため補正演算もそれに応じて変更す
る必要がある。

ST2では、試料をフローセル10に流して測定が行われ
る。まず試料ラック2aが駆動され最初に測定を行う試料
が入れられた試料容器３を試料吸引チューブ４直下に位
置させる。そして、三方弁５が試料吸引チューブ４と試
料送液チューブ6aとを連通するように切り替えられ、試
料吸引チューブ４が試料容器３内に降下し、試料ポンプ
７が吸引側に駆動されて、試料が試料送液チューブ6aに
吸引される。

次に、三方弁５が試料送液チューブ6aと6bとを連通す
るように切り替えられ、試料ポンプ７が送液側に駆動さ
れ、試料が送液チューブ８に送られる。一方、送液ポン
プ９が送液側に駆動され、シース液がフローセル10に送
られる。フローチャネル10a内では、シースフローが形
成され流体力学的焦点合わせ効果により、細胞はフロー
チャネル10a中心軸上を一例になって流れていく。この
細胞の一つ一つについてレーザビームｌが照射され、前
方散乱光強度I₀、90゜散乱光強度I₉₀、緑色蛍光強度
I_g、赤色蛍光強度I_rがそれぞれ測定されていく。これら
細胞光情報は、フロッピディスク等に順次記憶されてい
く。

MPU22は、測定されたデータに基づき、散乱光強度I₉₀
−I₀サイトグラムを作成する（ST3）。このI₉₀−I₀サイ
トグラムは、CRT25に表示され、操作者はマウス等を用
いて、I₉₀−I₀サイトグラム上にウィンドゥを設定する
（ST4）。なお、ウィンドゥＢの設定は自動的に行う構
成としてもよい（オートトリガ）。

ST5では、ウィンドゥＢの再設定を行うか否かを判定
する。この判定は、操作者がCRT25の表示を見て行って
もよいし、また、ウィンドゥ内について、I₉₀、I₀ヒス
トグラムを作成し、そのピーク位置、平均値、標準偏
差、変動係数を算出し、これらを基準値と比較して再設
定を行うか否かを自動的に判定してもよい。この判定が
YESの場合にはST6へ、NOの場合にはST10へそれぞれ分岐
する。

ST6からST9は、いわゆるネスティゲーションによるウ
ィンドゥの再設定処理である。例えば、白血病患者の場
合には、I₉₀−I₀サイトグラムが第３図（ｂ）に示すよ
うに、リンパ球分布に他の細胞の分布が重畳する時があ
りこのような場合には一応重畳した分布ｅを囲むように
ウィンドゥＢを設定する（ST4）。このような場合に
は、ST5の判定がYESとなりST6へ分岐する。

ST6では、ウィンドゥＢ内に属する細胞のデータが収
集され、これらデータに基づいて蛍光強度I_g−I_rサイト
グラムが作成される〔第３図（ｃ）参照〕。このサイト
グラム上で、リンパ球でない細胞集団である分布ｉを囲
むようにウィンドゥＣが設定される（ST7）。さらに、
リンパ球である細胞集団を示すこのウィンドゥＣ外（斜
線を付した部分）に属するデータをMPU22が収集し、収
集されたデータについて再び散乱光強度I₉₀−I₀サイト
グラムを作成する〔第３図（ｄ）参照〕。このI₉₀−I₀
サイトグラム上では、重畳した部分がとり除かれ、リン
パ球の分布ｂが現れる。そこで、モノクローナル抗体と
の反応性のデータからリンパ球の分布ｂを正確に含むウ
ィンドゥＢ′を再設定することができる。

ST10では、MPU22はこの再設定されたウィンドゥＢ′
内（斜線を付して示す）についてデータを収集し、再び
蛍光強度I_g−I_rサイトグラム（あるいはI_gヒストグラ
ム、I_rヒストグラム）を作成し、陽性率の算出等を行
う。ST5の判定がNOで、直接ST10に分岐してきた場合に
は、ST4で設定されたウィンドゥＢ内についてデータを
収集し、同様の処理を行う。

また、リンパ球以外の細胞について蛍光特性解析を行
いたい場合には、第３図（ａ）に示すように、ウィンド
ゥＢ外（斜線を付して示す）についてデータを収集し、
蛍光特性解析を行う。

ST11では、ST10での蛍光特性解析の結果がCRT25に表
示され、ST12ではさらに、この結果がプリンタ26よりプ
リントアウトされる。

ST13では、さらに測定すべき試料があるか否かが判定
される。この判定がYESの場合には、ST1へ戻り、NOの場
合には分析を修了する。

なお、この実施例では、リンパ球の分布を例に上げて
説明しているが、単球等白血球全般、赤血球、培養細胞
等の広範囲の試料の分析について本発明は適用可能であ
る。

（ト）発明の効果以上説明したように、この発明の細胞分析装置は、目
的細胞集団の細胞光情報と分析外細胞集団の細胞光情報
とから、分析対象の細胞集団の細胞光情報を収集して演
算処理するものであるから、たとえ目的細胞集団と分析
外細胞集団が重畳する場合であっても、必要な細胞手段
のデータを的確に特定して収集し、複雑なサイトグラム
パターンの解析をより精度よく行うことができる利点を
有している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例に係る細胞分析装置の動
作を説明するフロー図、第２図は、同細胞分析装置の構
成を説明するブロック図、第３図（ａ）、第３図
（ｂ）、第３図（ｃ）及び第３図（ｄ）は、ぞれぞれ同
細胞分析装置におけるウィンドゥとデータを収集する領
域との関係を説明するサイトグラム、第４図（ａ）、第
４図（ｂ）、第４図（ｃ）及び第４図（ｄ）は、それぞ
れ従来の細胞分析装置におけるウィンドゥとデータを収
集する領域との関係を説明するサイトグラムである。 10:フローセル、14:レーザ、 15a・15b・15c・15d:光検出器、 22:MPU、25:CRT、 26:プリンタ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 15/14 G01N 33/49

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞浮遊液が流されるフローセルと、このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光
源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細胞について、複
数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細胞光情
報検出手段と、この細胞光情報検出手段で得られるパラメータのうち、
特定のパラメータに基づいて分析領域を設定する第１の
分析領域設定手段と、前記細胞光情報検出手段で得られるパラメータのうち、
前記特定のパラメータ以外の別のパラメータに基づいて
分析領域を設定する第２の分析領域設定手段と、前記第１の分析領域設定手段で設定された分析領域か
ら、目的とする細胞集団の細胞光情報を収集する第１の
細胞光情報収集手段と、この第１の細胞光情報収集手段で収集された目的細胞集
団の細胞光情報から、前記第２の分析領域設定手段で設
定された分析外の細胞集団の細胞光情報を収集する第２
の細胞光情報収集手段と、前記第１の細胞光情報収集手段で収集された目的細胞集
団の細胞光情報と前記第２の細胞光情報収集手段で収集
された分析外細胞集団の細胞光情報とから、分析対象の
細胞集団の細胞光情報を収集して演算処理する細胞光情
報演算処理手段と、この細胞光情報演算処理手段の演算処理結果を出力する
出力手段とを備えることを特徴とする細胞分析装置。