JPH0534263A

JPH0534263A - 細胞分析装置

Info

Publication number: JPH0534263A
Application number: JP3187618A
Authority: JP
Inventors: Akishi Yamamoto; 晃史山本; Masahiro Hanabusa; 昌弘花房
Original assignee: Omron Corp; Omron Tateisi Electronics Co
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1993-02-09

Abstract

(57)【要約】【目的】検査の自動化・効率化の一層の向上を可能と
し、更にオペレータ、施設、機器、装置における分析領
域等の差によるデータのばらつきをソフトウエアで補う
ことを可能とする細胞分析装置を提供することである。【構成】細胞分析装置において、細胞光情報選別手段
が、予め入力・記憶される第１の細胞光情報選別手段
と、この第１の細胞光情報選別手段により選別される目
的細胞集団を更に選別する第２の細胞光情報選別手段と
を有し、細胞光情報処理手段が、第１の細胞光情報選別
手段により得られた細胞光情報をヒストグラム化する細
胞光情報ヒストグラム化手段と、予め入力・記憶される
閾値又は細胞光情報ヒストグラム化手段によるヒストグ
ラムの特徴点を選択して演算する演算手段と、この演算
手段による演算結果を用いて第２の細胞光情報選別手段
を導出する導出手段とを有する。【作用】細胞光情報の選別を行う際に、セルサイクルの
目的細胞集団の選別が自動的に行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フローサイトメトリー
を適用した細胞分析装置に関し、詳細には細胞の光情報
を処理する過程での細胞光情報の選別、特に細胞の分裂
・回転（セルサイクル）のモニターリング・解析を行う
際のデータ処理を効果的に行える細胞分析装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】フローサイトメトリーは、例えば蛍光色
素で標識された細胞（又はこれに準ずる粒子）を含む試
料をシース液と共に、細い液流中に流し、流体力学的焦
点合わせ効果により１列になって流れる細胞の一つ一つ
にレーザ等のビーム光を照射し、細胞より生じる散乱光
や蛍光の強度、即ち細胞光学的情報を瞬時に測定し、細
胞を分析するものである。このフローサイトメトリー
は、大量の細胞を高速度且つ高精度に分析できる特長を
有している。

【０００３】上記フローサイトメトリーを適用した細胞
分析装置としては、細い液流を形成するためのフローセ
ルと、このフローセル内を流れる細胞に光ビームを照射
する光源（例えばレーザ）と、この光ビームが照射され
た細胞よりの細胞光学的情報を検出して電気信号に変換
する光検出器と、この光検出器の信号を増幅・積分する
信号処理回路と、この信号処理回路より出力される細胞
光学的情報の信号の演算処理等を行うコンピュータとを
備えているものが知られている。

【０００４】例えば、細胞の分裂・回転（セルサイク
ル）の測定・解析の場合には、ヒト血液より分離した単
核球、ヒトより摘出した組織の一部を調製した細胞浮遊
液、培養細胞を調製して得られる細胞浮遊液等が試料と
して用いられ、それらの試料は常法によりプロピジウム
アイオダイド（Propidium Iodide ,略してＰＩと表記）
で染色される。

【０００５】染色された試料細胞はフローセル中を流さ
れ、レーザビームが照射されて、４つのパラメータ、即
ち前方散乱光強度Ｉ_O、緑色蛍光強度Ｉ_g、赤色蛍光強
度（エリア）Ｉ_ra、赤色蛍光強度（ピーク）Ｉ_rpが各々
検出され、細胞光情報（以下、単にデータという場合が
ある）が得られる。この試料のデータ中には、液流中で
試料細胞の様々な相互作用により、細胞が１個ずつ流れ
る場合に得られるデータと、複数個の細胞が連なって流
れる場合に得られるデータがある。しかしながら、セル
サイクル測定時には、蛍光強度測定が重要な要因である
ので、本来細胞を１個ずつ分析した情報中に、複数個の
細胞の情報が紛れ込むのは不具合である場合が多い。従
って、細胞１個のデータのみを選別する必要がある。

【０００６】そこで、細胞の大きさと染色性を表すとさ
れる前方散乱光強度Ｉ_Oと赤色蛍光強度（エリア）Ｉ_ra
を直交座標軸とするサイトグラム（図３参照）を作成す
る。但し図３において、ａは試料細胞の分布を、ｂは細
胞光情報選別手段として機能する分析領域を示す。この
サイトグラム上で、分析領域ｂ内の試料細胞が選別され
た後、第２のサイトグラム、即ち赤色蛍光強度（エリ
ア）Ｉ_raと赤色蛍光強度（ピーク）Ｉ_rpを直交座標軸と
する二次元分布図（図４参照）でもって、目的の細胞集
団が選別され、所定の演算が行われる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところで、セルサイク
ルの測定・解析には多くの経験とノウハウが必要とされ
る場合があり、それ故に大量の検体を自動的に測定して
データ処理を行う上では困難を伴い、効率の向上の支障
になることがある。特に近年、種々の検査を求められる
ことが多くなりつつあり、検査の自動化・効率化を図る
ことが要望されるようになっている。

【０００８】従って、本発明の目的は、上記に鑑み、検
査の自動化・効率化の一層の向上を可能とし、更にオペ
レータ、施設、機器、装置における分析領域等の差によ
るデータのばらつきをソフトウエアで補うことを可能と
する細胞分析装置を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の細胞分析装置は以下の構成（１）〜（８）
を備えることを特徴とする。即ち、（１）細胞浮遊液等
が流されるフローセルと、（２）このフローセル内を流
れる細胞等に光ビームを照射する光源と、（３）この光
ビームが照射された各々の細胞等について１又は２以上
のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細胞光情報
検出手段と、（４）この細胞光情報検出手段で検出され
た細胞光情報より目的細胞集団の細胞光情報を選別する
細胞光情報選別手段と、（５）前記細胞光情報検出手段
で検出された細胞光情報及び前記細胞光情報選別手段で
選別された細胞光情報を演算処理する細胞光情報処理手
段と、（６）この細胞光情報処理手段での処理結果を出
力する出力手段と、を備えてなる細胞分析装置におい
て、（７）前記細胞光情報選別手段は、予め入力・記憶
される第１の細胞光情報選別手段と、この第１の細胞光
情報選別手段により選別される目的細胞集団を更に選別
する第２の細胞光情報選別手段とを有し、（８）前記細
胞光情報処理手段は、前記第１の細胞光情報選別手段に
より得られた細胞光情報をヒストグラム化する細胞光情
報ヒストグラム化手段と、予め入力・記憶される閾値又
は前記細胞光情報ヒストグラム化手段によるヒストグラ
ムの特徴点を選択して演算する演算手段と、この演算手
段による演算結果を用いて前記第２の細胞光情報選別手
段を導出する導出手段とを有する。

【００１０】

【作用】本発明の細胞分析装置では、細胞光情報の選別
を行う際に、セルサイクルの目的細胞集団の選別が自動
的に行われるため、検査の自動化・効率化が図られると
共に、分析精度が向上する。

【００１１】

【実施例】以下、本発明の細胞分析装置を実施例に基づ
いて説明する。図１はその一実施例として細胞分析装置
の構成を示す図である。試料細胞１はオートサンプラ２
によって供給され、オートサンプラ２の試料ラック２ａ
には複数の試料容器３，・・・，３が装填されている。
この試料ラック２ａは駆動機構（図示せず）により駆動
され、指定の試料を試料吸引チューブ４の直下に位置さ
せる。更に、オートサンプラ２は振とう機構、冷却機構
（いずれも図示せず）を備えており、定時的に試料を振
とうすると共に、装填された試料容器３，・・・，３内
の試料を低温（例えば４〜１０℃）に保持する。

【００１２】前記試料吸引チューブ４は、三方弁５の１
つのポートに接続されている。三方弁５の他の２つのポ
ートには、試料送液チューブ６ａ、６ｂがそれぞれ接続
されており、試料送液チューブ６ａと試料吸引チューブ
４、或いは試料送液チューブ６ａと６ｂとを連通させる
ことができる。試料送液チューブ６ａの他端には、試料
ポンプ７が設けられている。一方、試料送液チューブ６
ｂの他端は、シース液送液チューブ８内に開口してい
る。

【００１３】このシース液送液チューブ８は、一端が送
液ポンプ９に接続され、他端がフローセル１０に接続さ
れている。フローセル１０は、石英ガラス等により構成
され、内部のフローチャネル１０ａ内にシースフローが
形成され、流体力学的焦点合わせ効果により、試料中の
細胞（又は粒子）１がフローチャネル１０ａの中心軸上
を一列になって流される。

【００１４】フローセル１０より流出した液は、廃液チ
ューブ１１に導かれて、廃液タンク１２に収容される。
なお、この細胞分析装置は、シース液タンク（図示せ
ず）を備えており、前記試料ポンプ７、送液ポンプ９に
シース液が補充される。又、オートサンプラ２、ポンプ
７、９等を含む送液系は密閉可能で、バイオハザードを
防止できる。

【００１５】フローセル１０の周囲には、レーザ（光
源）１４、光検出器（細胞光情報検出手段）１５ａ、１
５ｂ、１５ｃが配設される。レーザ１４よりのレーザビ
ームＬは、フローチャネル１０ａを流れる細胞（又は粒
子）１に照射される。この細胞（又は粒子）１よりは、
信号光が発生するが、そのうちの前方方向のものは、前
方散乱光として、レンズ１６ａに集光されて、光検出器
１５ａに入射する。なお、レーザビームＬが直接光検出
器１５ａに入射するのを防止するビームブロッカ１７が
設けられている。

【００１６】一方、細胞１よりの９０°方向の信号光
は、レンズ１６ｂで集光される。この信号光はその一部
がダイクロイックミラー１８で反射されて、緑色蛍光用
フィルタ１９ａを通過した後、緑色蛍光検出用の光検出
器１５ｂに入射する。ダイクロイックミラー１８を透過
した信号光は、更にフィルタ１９ｂを透過して、赤色蛍
光用の光検出器１５ｃに受光される。なお、例えばレー
ザ１４には、アルゴンレーザやヘリウムネオンレーザ、
前方散乱光用の光検出器１５ａにはホトダイオード、そ
の他の検出器１５ｂ、１５ｃには光電子増倍管が適用さ
れる。

【００１７】光検出器１５ａ、１５ｂ、１５ｃの受光信
号は、信号処理回路部２０ａ、２０ｂで増幅されノイズ
を取除かれた後、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器
２１によりデジタル信号に変換されて、ＭＰＵ２２に取
り込まれる。なお、信号処理回路部２０ｂでは、信号は
波高値として処理される。ＭＰＵ２２は、大別して、自
動的に分析領域を設定する機能、細胞数を統一する機能
及びその他の機能を有している。その他の機能として
は、目的細胞集団の光情報について統計計算を行う機
能、システム全体を制御する機能等である。

【００１８】更にＭＰＵ２２には、フロッピディスクド
ライブ２３、キーボード２４、ＣＲＴ２５及びプリンタ
２６が接続されている。フロッピディスクドライブ２３
は、測定条件（プロトコル）や測定データ等を、フロッ
ピディスクに保存させるためのものである。キーボード
２４は、プロトコルの選択・設定或いはその他の指令を
ＭＰＵ２２に入力するためのものである。ＣＲＴ２５
は、測定をモニタするためのものであり、プリンタ（出
力手段）２６は、ＭＰＵ２２の処理結果、例えば測定デ
ータのサイトグラムやヒストグラム等をプリントアウト
するためのものである。

【００１９】次に、実施例の細胞分析装置の動作を図２
に示すフローチャートを参照しながら説明する。まず、
分析目的に応じた処理が施された試料が、それぞれ試料
容器３に入れられて、試料ラック２ａに装填される。例
えば、セルサイクル解析を行う試料は、トリプシン処
理、ＰＩ染色、固定等のプロセスを経て処理される。

【００２０】細胞分析装置の電源がオンされると、ＲＯ
Ｍ（図示せず）よりＭＰＵ２２にプログラムが読込ま
れ、システムが立上がる〔ステップ( 以下ＳＴという）
１、図２参照〕。次に、測定する試料に適合するプロト
コルが選択・設定される。このプロトコルには、光検出
器１５ａ、１５ｂ、１５ｃの検出ゲインや補正演算等の
測定条件を内容とするものである。これは、試料とする
細胞の出所により上記処理プロセスが微妙に異なり、試
料細胞のコンディションによって微妙に対応を変えるた
めである。

【００２１】次にＳＴ２では、キーボード２４よりオー
トトリガを行う旨の指令が入力されているか否かが判定
される。この判定がＹＥＳの場合にはＳＴ３へ分岐し、
ＮＯの場合にはＳＴ４へ分岐する。又、ＳＴ３では、今
回の測定が前回の測定とは異なる新たなプロトコルに従
ってなされる旨の指令が入力されているか否かをＭＰＵ
２２が判定する。この判定がＹＥＳの場合にはＳＴ８へ
分岐し、ＮＯの場合にはＳＴ４へ分岐する。

【００２２】今、ＳＴ２又はＳＴ３からＳＴ４へ分岐し
たものとして説明を進める。ＳＴ４では、オペレータが
キーボード２４より、図３に示すような分析領域ｂと、
図４に示すような仮の分析領域Ｂ₀を各々のサイトグラ
ム上に設定する。これらの分析領域が設定されると、測
定が開始される（ＳＴ５）。ＳＴ５では、試料ラック２
ａが駆動され、最初に測定を行う試料が入れられた試料
容器３を試料吸引チューブ４の直下に位置させる。そし
て、三方弁５が試料吸引チューブ４と試料送液チューブ
６ａとを連通するように切換えられ、試料吸引チューブ
４が試料容器３内に降下し、試料ポンプ７が吸引側に駆
動されて、試料が試料送液チューブ６ａに吸引される。

【００２３】次に、三方弁５が試料送液チューブ６ａと
６ｂを連通するように切換えられ、試料ポンプ７が送液
側に駆動され、試料が送液チューブ８に送られる。一
方、送液ポンプ９が送液側に駆動され、シース液がフロ
ーセル１０に送られる。フローチャネル１０ａ内では、
シースフローが形成され、流体力学的焦点合わせ効果に
より、細胞１はフローチャネル１０ａの中心軸上を一列
になって流れていく。この細胞１の一つ一つについてレ
ーザビームＬが照射され、前方散乱光強度Ｉ₀、緑色蛍
光強度Ｉ_g、赤色蛍光強度（エリア）Ｉ_ra、赤色蛍光強
度（ピーク）Ｉ_rpがそれぞれ測定されていく。これら細
胞光情報は、必要に応じてフロッピディスク等に順次記
憶される。

【００２４】測定中は、上記仮の分析領域Ｂ₀に属する
細胞が計数される。ＳＴ６では、この細胞数ｎが所定数
Ｎ’に達したか否かを判定し、ＹＥＳの場合にはＳＴ７
へ、ＮＯの場合にはＳＴ６を繰り返す。所定値Ｎ’は、
演算結果で導出される最終の分析領域Ｂ（図９の斜線領
域参照、後述）に属する細胞数Ｎより大である必要があ
り、予めＮ’≫Ｎ＋αとなるように計数しておけば十分
である。

【００２５】ＳＴ１２では、細胞数統一処理を行う。こ
の統一処理は、図５に示す（ａ）〜（ｃ）の仕方のう
ち、いずれかの仕方により行われる。この統一されたデ
ータについては、更に蛍光特性解析により統計計算が施
される（ＳＴ１３）。この統計計算では、各々のピーク
の標準偏差、変動係数の他、Ｄｅａｎ法やその他の方法
によるセルサイクル特有の演算結果が求められる。この
結果は、ＣＲＴ２５に表示され（ＳＴ１４）、続いてプ
リンタ２６よりプリントアウトされる（ＳＴ１５）。

【００２６】ＳＴ１６では、更に測定すべき試料がある
か否かが判定される。この判定がＹＥＳの場合にはＳＴ
１へ戻り、ＮＯの場合には分析を終了する。さて、ＳＴ
１へ戻り、前回の測定と同じプロトコルで、且つ第２の
分析領域でオートトリガを行う場合には、ＳＴ２、ＳＴ
３を経て、ＳＴ８の処理へ進む。ＳＴ８では、予め入力
・記憶されている仮の分析領域Ｂ₀又は前回の測定結果
のいずれかが設定される。そして、ＳＴ５と全く同様に
測定を開始し、仮の分析領域Ｂ₀に入る細胞を計数し、
これが所定数Ｎ’に達したか否かを判定する（ＳＴ１
０）。

【００２７】ＳＴ１０の判定が、ＮＯの場合にはＳＴ１
０を繰り返し、ＹＥＳになるとＳＴ１１へ進み測定を終
了すると共に、オートトリガ演算を行う。このオートト
リガ演算は、まず図６に示すように、ｙ＝ａｘ＋ｂで表
される直線を、所定の座標（０，ｂ）を中心に反時計回
りに一定角度ずつ放射状に描画し、得られるヒストグラ
ムにおいて最初に所定値を越えるピークが生じたヒスト
グラムの１つ手前のヒストグラムを表す直線を最終分析
領域の境界線の１つとして用いる。即ち、ｙ＝ａｘ＋ｂ
を反時計回りにθだけ回転させると、新しく表される方
程式は、

【００２８】

【数２】

【００２９】となる。この直線上に在る点をヒストグラ
ムで表したものを図７に示す。図７には、図６に示す直
線Ｌ_a上のデータが表されており、そのピークＰ_aが閾
値Ｔ₀を越えているので、最終分析領域の境界線として
用いる直線は、時計回りにθだけ戻した直線Ｌ_a-1とな
る。或いは、この直線Ｌ_a-1で示される境界線の他の実
施例としては、直線Ｌ_aが求められた後、この直線Ｌ_a
をｙ軸の負の方向に所定量ｂ’だけ平行移動した直線Ｌ
_a’、即ち

【００３０】

【数３】

【００３１】で表される直線を最終分析領域の境界線と
してもよい。次に、図８に示すように、直線Ｌ_a-1又は
Ｌ_a’を最終分析領域の境界線とした時、この境界線に
対して垂直方向から投影して得られるヒストグラムにお
いて、最小値の方向から始めて最初の所定値又は極小
点、及び最大値の方向から始めて最初の所定値又は極小
点を用いて、直線Ｌ_a-1又はＬ_a’に直交する線分
Ｌ_v1、Ｌ_v2を引く。

【００３２】更に、図９において、直線Ｌ_a-1又は
Ｌ_a’に平行に、所定間隔で線分Ｌ_m1、Ｌ_m2、Ｌ_m3、・
・・、Ｌ_mn、・・・を引き、その線分上の点（細胞数）
の分布をヒストグラムで表す。このヒストグラムのデー
タを図１０に示す。図９に示す直線Ｌ_maのヒストグラム
では、一連の操作の中で始めて所定値より小さくなるの
で、直線Ｌ_maを最終分析領域の境界線として用いる。

【００３３】ここまでにより、最終分析領域Ｂは、直線
Ｌ_a-1又はＬ_a’、線分Ｌ_v1、Ｌ_v2、及び直線Ｌ_maの４
つの線で囲まれた領域（図９の斜線領域）に設定され
る。そこで、ＳＴ１２で所定の細胞数Ｎに統一するため
の演算がなされ、続いてＳＴ１３〜１５の処理が行わ
れ、最後にＳＴ１６の処理に移行する。

【００３４】

【発明の効果】本発明の細胞分析装置は、以上説明した
ように、分析領域の設定を測定データの演算により自動
的に行うものである。従って、セルサイクル測定時の分
析領域の設定を手動で行うのに比して、人為的な誤差を
抑えることができる上に、検査・解析の効率向上を大い
に図れる等、特有の効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例に係る細胞分析装置の構成模
式図である。

【図２】本発明による細胞分析装置の全体動作を説明す
るフローチャートである。

【図３】サイトグラムＩ_o−Ｉ_ra及びその上に表示され
る試料細胞の二次元分布図である。

【図４】サイトグラムＩ_ra−Ｉ_rp及びその上に表示され
る試料細胞の二次元分布図である。

【図５】最終分析領域内の細胞数の統一方法の説明図で
ある。

【図６】サイトグラムＩ_ra−Ｉ_rpにおける試料細胞の分
析領域の設定方法の説明図である。

【図７】分析領域の境界線として用いられる直線上に分
布するヒストグラム説明図である。

【図８】分析領域の境界線の設定説明図である。

【図９】分析領域の境界線を最終的に演算して求める過
程の説明図である。

【図１０】分析領域内の線分上に分布する試料細胞のヒ
ストグラム説明図である。

【符号の説明】

１０フローセル１４レーザ１５ａ、１５ｂ、１５ｃ光検出器２０ａ、２０ｂ信号処理回路部２２ＭＰＵ２５ＣＲＴ２６プリンタ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞浮遊液等が流されるフローセルと、こ
のフローセル内を流れる細胞等に光ビームを照射する光
源と、この光ビームが照射された各々の細胞等について
１又は２以上のパラメータよりなる細胞光情報を検出す
る細胞光情報検出手段と、この細胞光情報検出手段で検
出された細胞光情報より目的細胞集団の細胞光情報を選
別する細胞光情報選別手段と、前記細胞光情報検出手段
で検出された細胞光情報及び前記細胞光情報選別手段で
選別された細胞光情報を演算処理する細胞光情報処理手
段と、この細胞光情報処理手段での処理結果を出力する
出力手段とを備えてなる細胞分析装置において、前記細胞光情報選別手段は、予め入力・記憶される第１
の細胞光情報選別手段と、この第１の細胞光情報選別手
段により選別される目的細胞集団を更に選別する第２の
細胞光情報選別手段とを有し、前記細胞光情報処理手段は、前記第１の細胞光情報選別
手段により得られた細胞光情報をヒストグラム化する細
胞光情報ヒストグラム化手段と、予め入力・記憶される
閾値又は前記細胞光情報ヒストグラム化手段によるヒス
トグラムの特徴点を選択して演算する演算手段と、この
演算手段による演算結果を用いて前記第２の細胞光情報
選別手段を導出する導出手段とを有する、ことを特徴と
する細胞分析装置。
【請求項２】前記細胞光情報処理手段は、複数の細胞光
情報ヒストグラム化手段を有し、そのうちの第１の細胞
光情報ヒストグラム化手段は、所定の座標を中心とし、
反時計回りで回転する次の方程式（数１）で表される直
線上のヒストグラムを作成することを特徴とする請求項
１記載の細胞分析装置。【数１】
【請求項３】前記第２の細胞光情報選別手段は、目的細
胞集団の細胞数を所定数に揃える細胞数統一手段を有す
ることを特徴とする請求項１記載の細胞分析装置。