JP2620416B2 - 比活性の向上した合成アルカリホスファターゼ - Google Patents
比活性の向上した合成アルカリホスファターゼInfo
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物学的性質を改善す
るための酵素の修飾に関する。さらに詳しくは、遺伝子
操作した大腸菌を用いて産生したアルカリホスファター
ゼに関する。本発明のアルカリホスファターゼは比活性
が向上しており、かつ高い熱安定性を有しているため結
合アッセイの標識として有利に用いることができる。
るための酵素の修飾に関する。さらに詳しくは、遺伝子
操作した大腸菌を用いて産生したアルカリホスファター
ゼに関する。本発明のアルカリホスファターゼは比活性
が向上しており、かつ高い熱安定性を有しているため結
合アッセイの標識として有利に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】アル
カリホスファターゼは、容易に検出可能な標識酵素とし
て種々の診断結合アッセイに用いられる。アルカリホス
ファターゼは、たとえば、不均質酵素結合アッセイにし
ばしば用いられ、このアッセイにおいて該酵素は、分析
対象物の種類に依存して抗原、抗体、または目的の分析
対象物に結合する他の特異的結合成分に結合される。結
合後、新たに生成した結合複合体を反応混合物から分離
し、該複合体に付随するアルカリホスファターゼの存在
または量を観察することにより該複合体を検出すること
ができる。アルカリホスファターゼは、酵素基質を加
え、得られた酵素／基質反応の程度を観察することによ
り検出する。
カリホスファターゼは、容易に検出可能な標識酵素とし
て種々の診断結合アッセイに用いられる。アルカリホス
ファターゼは、たとえば、不均質酵素結合アッセイにし
ばしば用いられ、このアッセイにおいて該酵素は、分析
対象物の種類に依存して抗原、抗体、または目的の分析
対象物に結合する他の特異的結合成分に結合される。結
合後、新たに生成した結合複合体を反応混合物から分離
し、該複合体に付随するアルカリホスファターゼの存在
または量を観察することにより該複合体を検出すること
ができる。アルカリホスファターゼは、酵素基質を加
え、得られた酵素／基質反応の程度を観察することによ
り検出する。
【０００３】標識として使用するために特定の酵素を選
択する基準は、高い比活性(すなわち、高い触媒速度ま
たは高速の酵素反応)；高温(通常、５０〜６０℃を越え
る融解温度)での安定性；特異的結合成分に結合した後
の酵素の安定性；酵素検出反応に使用するため容易に定
量できる酵素基質を利用できること；反応生成物増幅法
を利用できること；およびアッセイが適切な性能を有す
ること(たとえば、バックグラウンド読み取りなど)など
が挙げられる。酵素の多くの工業的応用にとって主な関
心事となるのは温度安定性である。タンパク質は、その
温度安定性により種々のものがあり、種々の酵素の融解
温度(Ｔm)は４０℃未満から１００℃を越えるものまで
ある。
択する基準は、高い比活性(すなわち、高い触媒速度ま
たは高速の酵素反応)；高温(通常、５０〜６０℃を越え
る融解温度)での安定性；特異的結合成分に結合した後
の酵素の安定性；酵素検出反応に使用するため容易に定
量できる酵素基質を利用できること；反応生成物増幅法
を利用できること；およびアッセイが適切な性能を有す
ること(たとえば、バックグラウンド読み取りなど)など
が挙げられる。酵素の多くの工業的応用にとって主な関
心事となるのは温度安定性である。タンパク質は、その
温度安定性により種々のものがあり、種々の酵素の融解
温度(Ｔm)は４０℃未満から１００℃を越えるものまで
ある。
【０００４】ウシ腸管アルカリホスファターゼは酵素標
識としてしばしば用いられ、高い比活性および約５５℃
の融解温度の両方を示す。この酵素およびその結合体は
結合アッセイに都合よく用いることができ、検出反応の
生成物を増幅する幾つかの方法がある。しかしながら、
ウシ腸管アルカリホスファターゼの使用は依然として不
利な点が幾つかある。これら欠点としては、幾つかの酵
素調製物の純度が不適当であること、および共有結合的
に結合した炭水化物の存在が挙げられ、これらはアッセ
イ結果を決定する場合に高いバックグラウンド読み取り
を引き起こすと思われている。さらに、ウシ腸管アルカ
リホスファターゼは、結合アッセイに使用するために特
異的結合成分に結合させた後は温度安定性が不良であ
る。これらの欠点のため、多くの研究者が、結合アッセ
イ(とりわけ高い温度条件で行われるアッセイ)に一層適
した比活性および温度安定性の両方を備えた新しい形態
のアルカリホスファターゼの研究開発を行ってきた。
識としてしばしば用いられ、高い比活性および約５５℃
の融解温度の両方を示す。この酵素およびその結合体は
結合アッセイに都合よく用いることができ、検出反応の
生成物を増幅する幾つかの方法がある。しかしながら、
ウシ腸管アルカリホスファターゼの使用は依然として不
利な点が幾つかある。これら欠点としては、幾つかの酵
素調製物の純度が不適当であること、および共有結合的
に結合した炭水化物の存在が挙げられ、これらはアッセ
イ結果を決定する場合に高いバックグラウンド読み取り
を引き起こすと思われている。さらに、ウシ腸管アルカ
リホスファターゼは、結合アッセイに使用するために特
異的結合成分に結合させた後は温度安定性が不良であ
る。これらの欠点のため、多くの研究者が、結合アッセ
イ(とりわけ高い温度条件で行われるアッセイ)に一層適
した比活性および温度安定性の両方を備えた新しい形態
のアルカリホスファターゼの研究開発を行ってきた。
【０００５】哺乳動物酵素の上記欠点を克服するために
選択された一つの方法は、大腸菌のアルカリホスファタ
ーゼを使用することによるものであり、大腸菌のアルカ
リホスファターゼは哺乳動物のアルカリホスファターゼ
に比べれば極めて高い温度安定性を有する。大腸菌アル
カリホスファターゼは、約９５℃のＴmを有する。アル
カリホスファターゼはまた、対応遺伝子のコピーが細胞
当たりに多数存在しておれば大腸菌から大量に発現する
ことができる。さらに、この酵素は数工程で精製して均
質にすることができる。しかしながら、大腸菌アルカリ
ホスファターゼは、ウシ腸管アルカリホスファターゼに
比べると比活性が低い。大腸菌アルカリホスファターゼ
の触媒反応の最大速度(ｋcat)は、かなりの変化が認め
られはするが、６０ｓｅｃ-1である。これは、ウシ腸管
アルカリホスファターゼの約２,０００ｓｅｃ-1のｋcat
と比較される。天然の大腸菌アルカリホスファターゼは
ウシ腸管アルカリホスファターゼに比べると触媒速度が
低いので、好ましい温度安定性特性を保持したまま大腸
菌アルカリホスファターゼの酵素活性を向上させること
が有利である。
選択された一つの方法は、大腸菌のアルカリホスファタ
ーゼを使用することによるものであり、大腸菌のアルカ
リホスファターゼは哺乳動物のアルカリホスファターゼ
に比べれば極めて高い温度安定性を有する。大腸菌アル
カリホスファターゼは、約９５℃のＴmを有する。アル
カリホスファターゼはまた、対応遺伝子のコピーが細胞
当たりに多数存在しておれば大腸菌から大量に発現する
ことができる。さらに、この酵素は数工程で精製して均
質にすることができる。しかしながら、大腸菌アルカリ
ホスファターゼは、ウシ腸管アルカリホスファターゼに
比べると比活性が低い。大腸菌アルカリホスファターゼ
の触媒反応の最大速度(ｋcat)は、かなりの変化が認め
られはするが、６０ｓｅｃ-1である。これは、ウシ腸管
アルカリホスファターゼの約２,０００ｓｅｃ-1のｋcat
と比較される。天然の大腸菌アルカリホスファターゼは
ウシ腸管アルカリホスファターゼに比べると触媒速度が
低いので、好ましい温度安定性特性を保持したまま大腸
菌アルカリホスファターゼの酵素活性を向上させること
が有利である。
【０００６】プロテインエンジニアリングの分野におけ
る最近の進歩、たとえば、部位特異的(site−directed)
突然変異誘発、コンピューターによる分子設計、遺伝子
発現法、および結晶構造または核磁気共鳴構造の利用な
どにより、酵素の特定の性質を修飾することを目指した
プロジェクトを組むことが可能となった。修飾し得る酵
素の特性は、大きく２つのクラスに分けられる。すなわ
ち、(１)酵素活性部位の局所的な性質に依存する特性、
たとえば基質特異性、触媒反応の速度(ｋcat)、および
ミハエリス定数(Ｋm)など；および(２)酵素構造の全体
的な性質に依存する特性、たとえば温度安定性、タンパ
ク質分解に対する抵抗性、および活性部位のアロステリ
ック制御などである。酵素の活性部位は、一般に約１０
アミノ酸残基からなる。一般に、活性部位のアミノ酸
は、活性部位で起こる過程を確立する。それゆえ、活性
部位を構成するアミノ酸残基を変えることにより、酵素
の触媒活性を変えることができる。
る最近の進歩、たとえば、部位特異的(site−directed)
突然変異誘発、コンピューターによる分子設計、遺伝子
発現法、および結晶構造または核磁気共鳴構造の利用な
どにより、酵素の特定の性質を修飾することを目指した
プロジェクトを組むことが可能となった。修飾し得る酵
素の特性は、大きく２つのクラスに分けられる。すなわ
ち、(１)酵素活性部位の局所的な性質に依存する特性、
たとえば基質特異性、触媒反応の速度(ｋcat)、および
ミハエリス定数(Ｋm)など；および(２)酵素構造の全体
的な性質に依存する特性、たとえば温度安定性、タンパ
ク質分解に対する抵抗性、および活性部位のアロステリ
ック制御などである。酵素の活性部位は、一般に約１０
アミノ酸残基からなる。一般に、活性部位のアミノ酸
は、活性部位で起こる過程を確立する。それゆえ、活性
部位を構成するアミノ酸残基を変えることにより、酵素
の触媒活性を変えることができる。
【０００７】アルカリホスファターゼの性質を修飾する
初期の努力は、主として酵素の化学的修飾に基づくもの
であった。たとえば、酵素を光酸化に供したり、モノお
よびジクロロアセチル−β−グリセロリン酸；２,３−
ブタンジオール；フェニルグリオキサルや他の化合物で
処理した。一般に、これらの処理により酵素の触媒活性
は低減するかまたは消失されるので、その酵素の機能に
関する情報が得られた[コールマン(Ｃoleman)およびゲ
ッティングス(Ｇettings)、Ａdv.Ｅnzymol.５５：３５
１、１９８３]。この酵素をテトラニトロメタンで処理
し(チロシル残基をニトロ化する)、その後、該ニトロ化
残基をアミノチロシルに還元すると、酵素のホスホヒド
ロラーゼ活性は非修飾タンパク質の活性の１３０％まで
上昇し、一方、ホスホトランスフェラーゼ活性は標準値
の３５０％となった[クリステン(Ｃhristen)ら、Ｂioch
emistry１０：１３７７、１９７１]。そのような実験
は、アルカリホスファターゼのある種の酵素的性質が該
酵素の化学的修飾により改良され得ることを示してい
た。しかしながら、化学的修飾法は、酵素中のどのアミ
ノ酸を修飾するかに関して選択の余地が少なく、それゆ
え、広スペクトルのアミノ酸残基が影響を受け得る。
初期の努力は、主として酵素の化学的修飾に基づくもの
であった。たとえば、酵素を光酸化に供したり、モノお
よびジクロロアセチル−β−グリセロリン酸；２,３−
ブタンジオール；フェニルグリオキサルや他の化合物で
処理した。一般に、これらの処理により酵素の触媒活性
は低減するかまたは消失されるので、その酵素の機能に
関する情報が得られた[コールマン(Ｃoleman)およびゲ
ッティングス(Ｇettings)、Ａdv.Ｅnzymol.５５：３５
１、１９８３]。この酵素をテトラニトロメタンで処理
し(チロシル残基をニトロ化する)、その後、該ニトロ化
残基をアミノチロシルに還元すると、酵素のホスホヒド
ロラーゼ活性は非修飾タンパク質の活性の１３０％まで
上昇し、一方、ホスホトランスフェラーゼ活性は標準値
の３５０％となった[クリステン(Ｃhristen)ら、Ｂioch
emistry１０：１３７７、１９７１]。そのような実験
は、アルカリホスファターゼのある種の酵素的性質が該
酵素の化学的修飾により改良され得ることを示してい
た。しかしながら、化学的修飾法は、酵素中のどのアミ
ノ酸を修飾するかに関して選択の余地が少なく、それゆ
え、広スペクトルのアミノ酸残基が影響を受け得る。
【０００８】さらに、タンパク質の活性部位または結合
部位における変化は、単一アミノ酸の変化(すなわち、
点変異)よりも一層大きな変化をもたらす。たとえば、
遺伝子発現を抑制するタンパク質(リプレッサー)は、幾
つかの酸性残基を変えることによりアクチベーターに変
え得る[マ(Ｍa)およびプタシュネ(Ｐtashne)、Ｃell４
８：４８７〜８５３、１９８７]。トリプトファンシン
セターゼのαサブユニットにおける研究で示されるよう
に[ユタント(Ｙutant)ら、Ｎature２６７：２７４〜２
７５、１９７７]、たいていの突然変異はＴmを下げる。
にもかかわらず、バシラス・ステアロサーモフィルス
(Ｂacillus stearothermophilus)の中性プロテアーゼ
における研究結果に示されるように[イマナカ(Ｉmanak
a)ら、Ｎature３２４：６９５〜６９７、１９８６]、酵
素配列の幾つかのアミノ酸の置換により酵素のＴmを有
意に高め得る。
部位における変化は、単一アミノ酸の変化(すなわち、
点変異)よりも一層大きな変化をもたらす。たとえば、
遺伝子発現を抑制するタンパク質(リプレッサー)は、幾
つかの酸性残基を変えることによりアクチベーターに変
え得る[マ(Ｍa)およびプタシュネ(Ｐtashne)、Ｃell４
８：４８７〜８５３、１９８７]。トリプトファンシン
セターゼのαサブユニットにおける研究で示されるよう
に[ユタント(Ｙutant)ら、Ｎature２６７：２７４〜２
７５、１９７７]、たいていの突然変異はＴmを下げる。
にもかかわらず、バシラス・ステアロサーモフィルス
(Ｂacillus stearothermophilus)の中性プロテアーゼ
における研究結果に示されるように[イマナカ(Ｉmanak
a)ら、Ｎature３２４：６９５〜６９７、１９８６]、酵
素配列の幾つかのアミノ酸の置換により酵素のＴmを有
意に高め得る。
【０００９】組換えＤＮＡ法の出現により、アルカリホ
スファターゼの生成を指令する遺伝子(phoＡ遺伝子)の
修飾によって特定のアミノ酸残基を修飾または変える
(部位特異的突然変異誘発)ことが可能になった。大腸菌
では、phoＡ遺伝子は、リン酸基の結合、移動および代
謝に関与する少なくとも１８個の遺伝子からなる非連続
的な一群の一部をなしている。大腸菌phoＡ遺伝子のヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列は、当業者にはよく
知られている[チャング(Ｃhang)、Ｇene４４：１２１〜
１２５、１９８６参照]。
スファターゼの生成を指令する遺伝子(phoＡ遺伝子)の
修飾によって特定のアミノ酸残基を修飾または変える
(部位特異的突然変異誘発)ことが可能になった。大腸菌
では、phoＡ遺伝子は、リン酸基の結合、移動および代
謝に関与する少なくとも１８個の遺伝子からなる非連続
的な一群の一部をなしている。大腸菌phoＡ遺伝子のヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列は、当業者にはよく
知られている[チャング(Ｃhang)、Ｇene４４：１２１〜
１２５、１９８６参照]。
【００１０】遺伝子操作により、アルカリホスファター
ゼ酵素の活性部位にあるセリン102の変異は比活性の１
０００倍の低下となり、それゆえ、このアミノ酸残基が
アルカリホスファターゼ活性に重要であることが示され
た[バットラー−ランソホフ(Ｂatler−Ｒansohoff)ら、
１９８９年度アルカリホスファターゼシンポジウム、サ
ンジエゴ、ＣＡ、１９８９の要約]。これに対して、セ
リンのシステインによる置換(水酸基を保持している)
は、わずかに活性を低下させたにすぎなかった[ゴーシ
ュ(Ｇhosh)ら、Ｓcience２３１：１４５、１９８６]。
酵素活性部位の直ぐ近傍の残基であるアルギニン166の
役割についても突然変異誘発により調べられ、触媒効率
が天然の酵素に比べて約５０倍低下した[バットラー−
ランソホフら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８
５：４２７６、１９８８およびチャイダログロー(Ｃhai
daroglou)ら、Ｂiochemistry２７：８３３８、１９８
８]。アルカリホスファターゼのアミノ末端の１０〜４
０個のアミノ酸残基をタンパク質加水分解により除去す
ると、温度安定性は低下するが酵素の比活性は変化しな
いかまたは低下してもわずかであることも示された[ク
レボウスキー(Ｃhlebowski)ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６
４、４５２３；１９８９]。phoＡ遺伝子の幾つかのサイ
レント突然変異も野生型大腸菌の単離物から示されてい
る[デュボース(ＤuＢose)ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.
ＵＳＡ８５：７０３６、１９８８]。ごく最近では、大
腸菌アルカリホスファターゼの活性部位のアスパラギン
酸101の機能が部位特異的突然変異誘発によって調べら
れ、その際、該アミノ酸をアラニンで置換した(チャイ
ダログローら、ＰroteinＥngineering３(２)：１２７〜
１３２、１９８９)。この変異酵素は野生型の酵素に比
べて約３倍高い活性を示したが、熱安定性の実質的な低
下も示した。
ゼ酵素の活性部位にあるセリン102の変異は比活性の１
０００倍の低下となり、それゆえ、このアミノ酸残基が
アルカリホスファターゼ活性に重要であることが示され
た[バットラー−ランソホフ(Ｂatler−Ｒansohoff)ら、
１９８９年度アルカリホスファターゼシンポジウム、サ
ンジエゴ、ＣＡ、１９８９の要約]。これに対して、セ
リンのシステインによる置換(水酸基を保持している)
は、わずかに活性を低下させたにすぎなかった[ゴーシ
ュ(Ｇhosh)ら、Ｓcience２３１：１４５、１９８６]。
酵素活性部位の直ぐ近傍の残基であるアルギニン166の
役割についても突然変異誘発により調べられ、触媒効率
が天然の酵素に比べて約５０倍低下した[バットラー−
ランソホフら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８
５：４２７６、１９８８およびチャイダログロー(Ｃhai
daroglou)ら、Ｂiochemistry２７：８３３８、１９８
８]。アルカリホスファターゼのアミノ末端の１０〜４
０個のアミノ酸残基をタンパク質加水分解により除去す
ると、温度安定性は低下するが酵素の比活性は変化しな
いかまたは低下してもわずかであることも示された[ク
レボウスキー(Ｃhlebowski)ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６
４、４５２３；１９８９]。phoＡ遺伝子の幾つかのサイ
レント突然変異も野生型大腸菌の単離物から示されてい
る[デュボース(ＤuＢose)ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.
ＵＳＡ８５：７０３６、１９８８]。ごく最近では、大
腸菌アルカリホスファターゼの活性部位のアスパラギン
酸101の機能が部位特異的突然変異誘発によって調べら
れ、その際、該アミノ酸をアラニンで置換した(チャイ
ダログローら、ＰroteinＥngineering３(２)：１２７〜
１３２、１９８９)。この変異酵素は野生型の酵素に比
べて約３倍高い活性を示したが、熱安定性の実質的な低
下も示した。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、野生型酵素と
比べて高い比活性を有するアルカリホスファターゼの産
生を制御する合成遺伝子の構築を包含する。本発明の新
規酵素の酵素活性は、野生型の酵素と比べて３６倍も上
昇している。本発明の新規酵素は野生型酵素に比べて熱
安定性は低いとはいえ、該酵素を結合アッセイに使用す
るのに適した程度に、すなわち通常のアッセイ条件下で
熱不活化されない程度に熱安定性は保持されている。本
発明の新規酵素、該酵素を製造するための新規ＤＮＡ配
列、該遺伝子操作によるＤＮＡ配列を含有する新規プラ
スミド、および該酵素を指示試薬として利用したアッセ
イを記載する。
比べて高い比活性を有するアルカリホスファターゼの産
生を制御する合成遺伝子の構築を包含する。本発明の新
規酵素の酵素活性は、野生型の酵素と比べて３６倍も上
昇している。本発明の新規酵素は野生型酵素に比べて熱
安定性は低いとはいえ、該酵素を結合アッセイに使用す
るのに適した程度に、すなわち通常のアッセイ条件下で
熱不活化されない程度に熱安定性は保持されている。本
発明の新規酵素、該酵素を製造するための新規ＤＮＡ配
列、該遺伝子操作によるＤＮＡ配列を含有する新規プラ
スミド、および該酵素を指示試薬として利用したアッセ
イを記載する。
【００１２】たとえば、大腸菌によって産生される合成
アルカリホスファターゼであって、野生型の大腸菌アル
カリホスファターゼと比べて少なくとも１つのアミノ酸
変異を有し、野生型大腸菌アルカリホスファターゼと比
べて高い比活性を有する新規酵素を記載する。一般に、
アミノ酸変異は酵素の活性部位の約２０Å内に生じさせ
る。アミノ酸変化の例としては、Ｔｈｒ100の代わりの
Ｖａｌ、Ｔｈｒ100の代わりのＩｌｅ、Ｌｙｓ328の代わ
りのＡｒｇ、Ｖａｌ99の代わりのＡｌａ、Ａｌａ103の
代わりのＡｓｐ、Ａｌａ103の代わりのＣｙｓ、Ｔｈｒ
107の代わりのＶａｌおよびＡｓｐ101の代わりのＳｅｒ
が挙げられる。二重アミノ酸変化の例としては、Ｖａｌ
99の代わりのＡｌａおよびＬｙｓ328の代わりのＡｒ
ｇ、またはＶａｌ377の代わりのＡｌａおよびＳｅｒ415
の代わりのＧｌｙを含むアミノ酸変異が挙げられる。
アルカリホスファターゼであって、野生型の大腸菌アル
カリホスファターゼと比べて少なくとも１つのアミノ酸
変異を有し、野生型大腸菌アルカリホスファターゼと比
べて高い比活性を有する新規酵素を記載する。一般に、
アミノ酸変異は酵素の活性部位の約２０Å内に生じさせ
る。アミノ酸変化の例としては、Ｔｈｒ100の代わりの
Ｖａｌ、Ｔｈｒ100の代わりのＩｌｅ、Ｌｙｓ328の代わ
りのＡｒｇ、Ｖａｌ99の代わりのＡｌａ、Ａｌａ103の
代わりのＡｓｐ、Ａｌａ103の代わりのＣｙｓ、Ｔｈｒ
107の代わりのＶａｌおよびＡｓｐ101の代わりのＳｅｒ
が挙げられる。二重アミノ酸変化の例としては、Ｖａｌ
99の代わりのＡｌａおよびＬｙｓ328の代わりのＡｒ
ｇ、またはＶａｌ377の代わりのＡｌａおよびＳｅｒ415
の代わりのＧｌｙを含むアミノ酸変異が挙げられる。
【００１３】本発明は、アルカリホスファターゼ(野生
型の大腸菌アルカリホスファターゼと比べて少なくとも
１つのアミノ酸変異を有し、野生型大腸菌アルカリホス
ファターゼと比べて高い比活性を有する)をコードする
一連のコドンを含む、ベクター内に挿入するのに適した
新規なＤＮＡ配列を包含する。そのようなＤＮＡ配列を
含むプラスミド、およびそのようなプラスミドを含む宿
主細胞も記載する。単細胞宿主を用い、一般に細菌およ
び大腸菌、真菌株、たとえばバシラス属、ストレプトマ
イセス属、哺乳動物細胞、酵母および他の真菌などから
選択する。すべての宿主が等しく有効であるというわけ
ではないが、宿主の選択は本発明にとって重要ではな
い。
型の大腸菌アルカリホスファターゼと比べて少なくとも
１つのアミノ酸変異を有し、野生型大腸菌アルカリホス
ファターゼと比べて高い比活性を有する)をコードする
一連のコドンを含む、ベクター内に挿入するのに適した
新規なＤＮＡ配列を包含する。そのようなＤＮＡ配列を
含むプラスミド、およびそのようなプラスミドを含む宿
主細胞も記載する。単細胞宿主を用い、一般に細菌およ
び大腸菌、真菌株、たとえばバシラス属、ストレプトマ
イセス属、哺乳動物細胞、酵母および他の真菌などから
選択する。すべての宿主が等しく有効であるというわけ
ではないが、宿主の選択は本発明にとって重要ではな
い。
【００１４】さらに、本発明は、そのような合成酵素を
結合アッセイにおいて酵素標識として使用することを包
含する。試料中の分析対象物の存在または量を決定する
のに有用な指示試薬は、特異的結合成分を本発明の酵素
に直接または間接に結合することにより調製することが
できる。得られた指示試薬は、サンドイッチアッセイ、
競合アッセイおよび直接および間接アッセイ態様を含む
(しかし、これらに限られるものではない)種々のアッセ
イ態様に使用するのに適している。
結合アッセイにおいて酵素標識として使用することを包
含する。試料中の分析対象物の存在または量を決定する
のに有用な指示試薬は、特異的結合成分を本発明の酵素
に直接または間接に結合することにより調製することが
できる。得られた指示試薬は、サンドイッチアッセイ、
競合アッセイおよび直接および間接アッセイ態様を含む
(しかし、これらに限られるものではない)種々のアッセ
イ態様に使用するのに適している。
【００１５】塩基コードおよびアミノ酸を示すため、下
記記号および略語を用いる。 塩基コード：記号 ヌクレオチド Ａ アデノシン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン アミノ酸の３文字略語： 略語 アミノ酸名 略語 アミノ酸名 Ａｌａ アラニン Ｌｅｕ ロイシン Ａｒｇ アルギニン Ｌｙｓ リシン Ａｓｎ アスパラギン Ｍｅｔ メチオニン Ａｓｐ アスパラギン酸(アスパラギン酸塩) Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｃｙｓ システイン Ｐｒｏ プロリン Ｇｌｎ グルタミン Ｓｅｒ セリン Ｇｌｕ グルタミン酸(グルタミン酸塩) Ｔｈｒ トレオニン Ｇｌｙ グリシン Ｔｒｐ トリプトファン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｔｙｒ チロシン Ｉｌｅ イソロイシン Ｖａｌ バリン
記記号および略語を用いる。 塩基コード：記号 ヌクレオチド Ａ アデノシン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン アミノ酸の３文字略語： 略語 アミノ酸名 略語 アミノ酸名 Ａｌａ アラニン Ｌｅｕ ロイシン Ａｒｇ アルギニン Ｌｙｓ リシン Ａｓｎ アスパラギン Ｍｅｔ メチオニン Ａｓｐ アスパラギン酸(アスパラギン酸塩) Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｃｙｓ システイン Ｐｒｏ プロリン Ｇｌｎ グルタミン Ｓｅｒ セリン Ｇｌｕ グルタミン酸(グルタミン酸塩) Ｔｈｒ トレオニン Ｇｌｙ グリシン Ｔｒｐ トリプトファン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｔｙｒ チロシン Ｉｌｅ イソロイシン Ｖａｌ バリン
【００１６】本発明は、天然の酵素に備わる所望の熱安
定性特性は保持しながら、比活性を向上させた合成アル
カリホスファターゼを提供する。遺伝的に修飾した酵素
はウシ腸管アルカリホスファターゼよりも熱安定性が大
きく、７５℃(ｐＨ７.５)で５分間の最小半減期を示
す。さらに、アッセイ条件に依存して、本発明の新規酵
素の酵素活性は天然のものに比べて１.５〜３６倍上昇
している。酵素活性の最大の増加は、低濃度のトリス
(０.０５Ｍ)かまたはジエタノールアミン(０.０５Ｍ)の
存在下、約１０のｐＨで酵素活性を測定したときに観察
される。比活性の向上は、分子設計(molecular modeli
ng)、遺伝子工学および部位特異的突然変異誘発の組み
合わせにより達成した。
定性特性は保持しながら、比活性を向上させた合成アル
カリホスファターゼを提供する。遺伝的に修飾した酵素
はウシ腸管アルカリホスファターゼよりも熱安定性が大
きく、７５℃(ｐＨ７.５)で５分間の最小半減期を示
す。さらに、アッセイ条件に依存して、本発明の新規酵
素の酵素活性は天然のものに比べて１.５〜３６倍上昇
している。酵素活性の最大の増加は、低濃度のトリス
(０.０５Ｍ)かまたはジエタノールアミン(０.０５Ｍ)の
存在下、約１０のｐＨで酵素活性を測定したときに観察
される。比活性の向上は、分子設計(molecular modeli
ng)、遺伝子工学および部位特異的突然変異誘発の組み
合わせにより達成した。
【００１７】一般に、アルカリホスファターゼ中で変異
させる目的部位は、該酵素の結晶構造に基づいて前以て
決定した[ソワドスキー(Ｓowadski)ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.
１８６、４１７〜４３３；１９８５]。目的部位として
所定のアミノ酸を選択する基準は、酵素分子の活性部位
に近いアミノ酸、とりわけ触媒残基のＳｅｒ102に近い
アミノ酸を選択することであった。
させる目的部位は、該酵素の結晶構造に基づいて前以て
決定した[ソワドスキー(Ｓowadski)ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.
１８６、４１７〜４３３；１９８５]。目的部位として
所定のアミノ酸を選択する基準は、酵素分子の活性部位
に近いアミノ酸、とりわけ触媒残基のＳｅｒ102に近い
アミノ酸を選択することであった。
【００１８】酵素中の所定部位に一定のアミノ酸変化を
生じさせるため、そのアミノ酸をコードする適当なコド
ンをphoＡ遺伝子中に挿入した。コドン配列ＮＮＮ(Ｎは
４種のヌクレオチドのいずれかを示す)をＤＮＡ配列中
に挿入することにより、ランダムなアミノ酸変化も生じ
させた。幸運なことに、構築した一つの変異体が２つの
点変異(すなわち、２つのアミノ酸変化)を含んでおり、
これは遺伝子合成に用いた合成オリゴヌクレオチドの化
学的修飾の結果であると思われた。
生じさせるため、そのアミノ酸をコードする適当なコド
ンをphoＡ遺伝子中に挿入した。コドン配列ＮＮＮ(Ｎは
４種のヌクレオチドのいずれかを示す)をＤＮＡ配列中
に挿入することにより、ランダムなアミノ酸変化も生じ
させた。幸運なことに、構築した一つの変異体が２つの
点変異(すなわち、２つのアミノ酸変化)を含んでおり、
これは遺伝子合成に用いた合成オリゴヌクレオチドの化
学的修飾の結果であると思われた。
【００１９】新規プラスミドの構築 適切に変異させたＤＮＡ分子の最初のセットが得られた
ら、２つのタンパク質設計法を用いて変異酵素を製造し
た。まず、種々の修飾ＤＮＡサブ配列を単一遺伝子中に
導入し、得られたクローンを比活性の高い変異酵素の産
生についてスクリーニングした。第二に、変異ＤＮＡ分
子を、２回目の突然変異誘発用に用いた。
ら、２つのタンパク質設計法を用いて変異酵素を製造し
た。まず、種々の修飾ＤＮＡサブ配列を単一遺伝子中に
導入し、得られたクローンを比活性の高い変異酵素の産
生についてスクリーニングした。第二に、変異ＤＮＡ分
子を、２回目の突然変異誘発用に用いた。
【００２０】第一の方法には、アルカリホスファターゼ
をコードする完全合成遺伝子を設計し構築することが含
まれていた。合成phoＡ遺伝子の合成は、本願出願人に
よる米国特許出願第１３１,９７３号(１９８７年１２月
１１日出願)明細書およびマンデッキ(Ｍandecki)および
ボリング(Ｂolling)のＧene６８、１０１〜１０７、１
９８８(これら文献を参照のため本明細書に引用する)に
記載されたＦokＩ法により行った。２１の合成オリゴヌ
クレオチド[第１(ａ)図〜第１(ｃ)図]を設計し、通例に
従って設計したプラスミドベクター(ｐＷＭ５００)中に
それぞれクローニングした。ついで、ＦokＩ制限酵素を
用い、各合成オリゴヌクレオチドをベクターから切断し
た。得られたＤＮＡ断片は、ベクターからの開裂後に、
２１のすべての断片が１回の反応でライゲートして約１
６００塩基対の合成phoＡ遺伝子を調製することを可能
にする独特の配列を各断片の突き出し末端が有している
ように設計した。
をコードする完全合成遺伝子を設計し構築することが含
まれていた。合成phoＡ遺伝子の合成は、本願出願人に
よる米国特許出願第１３１,９７３号(１９８７年１２月
１１日出願)明細書およびマンデッキ(Ｍandecki)および
ボリング(Ｂolling)のＧene６８、１０１〜１０７、１
９８８(これら文献を参照のため本明細書に引用する)に
記載されたＦokＩ法により行った。２１の合成オリゴヌ
クレオチド[第１(ａ)図〜第１(ｃ)図]を設計し、通例に
従って設計したプラスミドベクター(ｐＷＭ５００)中に
それぞれクローニングした。ついで、ＦokＩ制限酵素を
用い、各合成オリゴヌクレオチドをベクターから切断し
た。得られたＤＮＡ断片は、ベクターからの開裂後に、
２１のすべての断片が１回の反応でライゲートして約１
６００塩基対の合成phoＡ遺伝子を調製することを可能
にする独特の配列を各断片の突き出し末端が有している
ように設計した。
【００２１】上記合成遺伝子には、翻訳(遺伝子の塩基
配列がポリペプチド鎖のアミノ酸配列に翻訳される機
構)開始のためのphoＡリボソーム結合部位および転写タ
ーミネーター部位配列(ここで遺伝子に相補的なｍＲＮ
Ａの合成が終止する)が含まれていた。この合成遺伝子
を合成プラスミドベクター(ｐＷＭ５１８)(実施例１１
に構築を示す)中にクローニングした。このベクター
は、クローニング、発現および突然変異誘発などの手順
を容易にするため限られた数の制限部位を有するように
設計されていた。合成phoＡ遺伝子を有するプラスミド
(ｐＭＡ１００)からのアルカリホスファターゼの発現レ
ベルは、５５０ｎｍでの光学密度１.５まで増殖させた
細胞(１ｌ)からタンパク質１０ｍｇに達した。染色体ア
ルカリホスファターゼ遺伝子の欠失した大腸菌株を形質
転換に用い、引き続き発酵させて本発明の新規酵素を製
造した。そのような大腸菌株としては、イノウエ(Ｉnou
ye)らのＪ.Ｍol.Ｂiol.１１０、７５〜８７(１９７７)
(参照のため本明細書に引用する)に記載されているよう
に、ＭＺ１３ｂ(Ｆ-lacＸ７４、Δ(brnＱR、phoＡ-、ph
oＢ-、proＣ-)24tsxＲ、trpam、strR、Φ８０Ｄ(pro
Ｃ+、proＢ+)xpw3、Φ８０)大腸菌株が挙げられる。
配列がポリペプチド鎖のアミノ酸配列に翻訳される機
構)開始のためのphoＡリボソーム結合部位および転写タ
ーミネーター部位配列(ここで遺伝子に相補的なｍＲＮ
Ａの合成が終止する)が含まれていた。この合成遺伝子
を合成プラスミドベクター(ｐＷＭ５１８)(実施例１１
に構築を示す)中にクローニングした。このベクター
は、クローニング、発現および突然変異誘発などの手順
を容易にするため限られた数の制限部位を有するように
設計されていた。合成phoＡ遺伝子を有するプラスミド
(ｐＭＡ１００)からのアルカリホスファターゼの発現レ
ベルは、５５０ｎｍでの光学密度１.５まで増殖させた
細胞(１ｌ)からタンパク質１０ｍｇに達した。染色体ア
ルカリホスファターゼ遺伝子の欠失した大腸菌株を形質
転換に用い、引き続き発酵させて本発明の新規酵素を製
造した。そのような大腸菌株としては、イノウエ(Ｉnou
ye)らのＪ.Ｍol.Ｂiol.１１０、７５〜８７(１９７７)
(参照のため本明細書に引用する)に記載されているよう
に、ＭＺ１３ｂ(Ｆ-lacＸ７４、Δ(brnＱR、phoＡ-、ph
oＢ-、proＣ-)24tsxＲ、trpam、strR、Φ８０Ｄ(pro
Ｃ+、proＢ+)xpw3、Φ８０)大腸菌株が挙げられる。
【００２２】得られた変異大腸菌をスクリーニングして
どのクローンが比活性の高いアルカリホスファターゼを
産生するかを決定するため、生物学的アッセイを用い
た。これらのクローンを、基質である５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドールリン酸(ＢＣＩＰ)を含有する培
地で増殖させた。比活性の高いアルカリホスファターゼ
を産生するコロニーは、基質との酵素反応により青色を
呈したコロニーにより検出した。
どのクローンが比活性の高いアルカリホスファターゼを
産生するかを決定するため、生物学的アッセイを用い
た。これらのクローンを、基質である５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドールリン酸(ＢＣＩＰ)を含有する培
地で増殖させた。比活性の高いアルカリホスファターゼ
を産生するコロニーは、基質との酵素反応により青色を
呈したコロニーにより検出した。
【００２３】宿主細胞によるアルカリホスファターゼの
高発現レベルは、指示プレート上でコロニーをカラース
クリーニングするのに不利である(発現レベルの低上昇
は濃い青色の色変化として示されない)。それゆえ、変
異酵素を天然様酵素から識別するのを助けるため、天然
のphoＡリボソーム結合部位を、天然のリボソーム結合
部位と相同であるが翻訳開始が有効でない配列で置換す
ることによりプラスミドのアルカリホスファターゼ発現
レベルを減少させた。得られたプラスミドをｐＭＡ１０
１と称した。このphoＡ遺伝子は、イニシエーターＡＴ
Ｇコドンの上流に一群の５つのランダムヌクレオテドを
含んでいた。その結果、酵素の発現は実質的に減少し、
高い比活性を有する変異酵素のみがＢＣＩＰ基質との反
応で濃い青色を呈した。種々のアルカリホスファターゼ
活性レベルを発現する約１,０００クローンを含むクロ
ーンライブラリーが得られた。カラースクリーニングに
適したアルカリホスファターゼ活性を発現するクローン
(ｐＭＡ１０１)を、さらに突然変異誘発研究に用いるた
め選択した。
高発現レベルは、指示プレート上でコロニーをカラース
クリーニングするのに不利である(発現レベルの低上昇
は濃い青色の色変化として示されない)。それゆえ、変
異酵素を天然様酵素から識別するのを助けるため、天然
のphoＡリボソーム結合部位を、天然のリボソーム結合
部位と相同であるが翻訳開始が有効でない配列で置換す
ることによりプラスミドのアルカリホスファターゼ発現
レベルを減少させた。得られたプラスミドをｐＭＡ１０
１と称した。このphoＡ遺伝子は、イニシエーターＡＴ
Ｇコドンの上流に一群の５つのランダムヌクレオテドを
含んでいた。その結果、酵素の発現は実質的に減少し、
高い比活性を有する変異酵素のみがＢＣＩＰ基質との反
応で濃い青色を呈した。種々のアルカリホスファターゼ
活性レベルを発現する約１,０００クローンを含むクロ
ーンライブラリーが得られた。カラースクリーニングに
適したアルカリホスファターゼ活性を発現するクローン
(ｐＭＡ１０１)を、さらに突然変異誘発研究に用いるた
め選択した。
【００２４】部位特異的突然変異誘発 オリゴヌクレオチド特異的二本鎖切断修復法[マンデ
ッキらのＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.８３、７１７７〜７
１８１(１９８６)](該文献を参照のため本明細書に引用
する)を用い、合成プラスミドベクターを構築した。し
かしながら、この特定の方法を用いることは本発明には
重要ではない。この方法には、変性させた直線状プラス
ミド、および適当な変異をコードし該プラスミド切断の
近傍のプラスミドＤＮＡ配列に相同な２つの「アーム」を
有する合成オリゴヌクレオチド配列とで大腸菌細胞を同
時形質転換することにより変異を導入することが含まれ
ていた。一本鎖オリゴヌクレオチド配列のみを変異誘発
に用いるので、この方法は縮重配列をプラスミドＤＮＡ
中に導入するのに特に有利である。
ッキらのＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.８３、７１７７〜７
１８１(１９８６)](該文献を参照のため本明細書に引用
する)を用い、合成プラスミドベクターを構築した。し
かしながら、この特定の方法を用いることは本発明には
重要ではない。この方法には、変性させた直線状プラス
ミド、および適当な変異をコードし該プラスミド切断の
近傍のプラスミドＤＮＡ配列に相同な２つの「アーム」を
有する合成オリゴヌクレオチド配列とで大腸菌細胞を同
時形質転換することにより変異を導入することが含まれ
ていた。一本鎖オリゴヌクレオチド配列のみを変異誘発
に用いるので、この方法は縮重配列をプラスミドＤＮＡ
中に導入するのに特に有利である。
【００２５】この方法において、合成オリゴヌクレオチ
ドサブ配列(アルカリホスファターゼ遺伝子のサブ配列
中に変異をコードする)をプラスミドベクターのphoＡ遺
伝子中にクローニングしてphoＡ遺伝子を修飾(置換では
なく)した。合成オリゴヌクレオチドサブ配列は、目的
部位に一定のコドン配列かまたはランダムコドン配列
(一般に２０アミノ酸鎖に対応する)を運び込むように設
計した。サブ配列を導入するため、phoＡ遺伝子を含有
する大腸菌プラスミドを変異誘発の目的部位の隣で開裂
するか(すなわち、プラスミドを１カ所のみで開裂する
制限エンドヌクレアーゼで切断、phoＡ遺伝子内にはそ
のような部位が２５存在する)、またはプラスミドを２
つの酵素で開裂して変異誘発する部位とオーバーラップ
する制限断片を放出させた。宿主細胞を上記開裂プラス
ミド、合成オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼと
混合することにより、宿主細胞を形質転換した。１回の
形質転換から２００のコロニーが得られた。
ドサブ配列(アルカリホスファターゼ遺伝子のサブ配列
中に変異をコードする)をプラスミドベクターのphoＡ遺
伝子中にクローニングしてphoＡ遺伝子を修飾(置換では
なく)した。合成オリゴヌクレオチドサブ配列は、目的
部位に一定のコドン配列かまたはランダムコドン配列
(一般に２０アミノ酸鎖に対応する)を運び込むように設
計した。サブ配列を導入するため、phoＡ遺伝子を含有
する大腸菌プラスミドを変異誘発の目的部位の隣で開裂
するか(すなわち、プラスミドを１カ所のみで開裂する
制限エンドヌクレアーゼで切断、phoＡ遺伝子内にはそ
のような部位が２５存在する)、またはプラスミドを２
つの酵素で開裂して変異誘発する部位とオーバーラップ
する制限断片を放出させた。宿主細胞を上記開裂プラス
ミド、合成オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼと
混合することにより、宿主細胞を形質転換した。１回の
形質転換から２００のコロニーが得られた。
【００２６】カラースクリーニングの後、ＤＮＡシーク
エンシングおよび精製タンパク質の分析を行って、比活
性の増大したアルカリホスファターゼを発現する遺伝子
を含有する１０の変異大腸菌株が得られた。これら１０
の変異株は、Ｔｈｒ100＞Ｖａｌ(すなわち、１００位の
トレオニンがバリンで置換)；Ｔｈｒ100＞Ｉｌｅ；Ｌｙ
ｓ328＞Ａｒｇ；Ｖａｌ99＞Ａｌａ；Ａｓｐ101＞Ｓｅ
ｒ；Ａｌａ103＞Ａｓｐ；Ａｌａ103＞Ｃｙｓ；Ｔｈｒ
107＞Ｖａｌ；二重変異体Ｌｙｓ328＞ＡｒｇおよびＶａ
ｌ99＞Ａｌａ；および偶然の二重変異体Ｖａｌ377＞Ａ
ｌａおよびＳｅｒ415＞Ｇｌｙであった。
エンシングおよび精製タンパク質の分析を行って、比活
性の増大したアルカリホスファターゼを発現する遺伝子
を含有する１０の変異大腸菌株が得られた。これら１０
の変異株は、Ｔｈｒ100＞Ｖａｌ(すなわち、１００位の
トレオニンがバリンで置換)；Ｔｈｒ100＞Ｉｌｅ；Ｌｙ
ｓ328＞Ａｒｇ；Ｖａｌ99＞Ａｌａ；Ａｓｐ101＞Ｓｅ
ｒ；Ａｌａ103＞Ａｓｐ；Ａｌａ103＞Ｃｙｓ；Ｔｈｒ
107＞Ｖａｌ；二重変異体Ｌｙｓ328＞ＡｒｇおよびＶａ
ｌ99＞Ａｌａ；および偶然の二重変異体Ｖａｌ377＞Ａ
ｌａおよびＳｅｒ415＞Ｇｌｙであった。
【００２７】上記遺伝的変異を含むプラスミドクローニ
ングビヒクルを製造する別法もまた用いることができ、
たとえば、ポリスキー(Ｐolisky)らのＰroc.Ｎatl.Ａca
d.Ｓci.ＵＳＡ、７３(１１)、３９００〜３９０４(１９
７６)；シーワート(Ｓiewert)らの米国特許第４,３７
５,５１４号明細書；およびイタクラ(Ｉtakura)らの米
国特許第４,７０４,３６２号明細書等(これら文献を参
照のため本明細書に引用する)に記載された方法が挙げ
られる。
ングビヒクルを製造する別法もまた用いることができ、
たとえば、ポリスキー(Ｐolisky)らのＰroc.Ｎatl.Ａca
d.Ｓci.ＵＳＡ、７３(１１)、３９００〜３９０４(１９
７６)；シーワート(Ｓiewert)らの米国特許第４,３７
５,５１４号明細書；およびイタクラ(Ｉtakura)らの米
国特許第４,７０４,３６２号明細書等(これら文献を参
照のため本明細書に引用する)に記載された方法が挙げ
られる。
【００２８】アルカリホスファターゼ変異体の分析 比活性および温度安定性の分析を、高度に精製したタ
ンパク質物質について行った。簡単に説明すると、精製
法には、スフェロプラストの生成、硫酸アンモニウム沈
殿およびクロマトフォーカス(chromatofocusing)クロマ
トグラフィーによるペリプラスムタンパク質の放出が含
まれていた。比活性およびミハエリス定数の測定は、酵
素基質(たとえば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートな
ど)が変換して色原体生成物を生成する速度をモニター
することに基づいて行った。温度安定性の測定は、種々
の温度での酵素活性の失活をモニターすることにより行
った。
ンパク質物質について行った。簡単に説明すると、精製
法には、スフェロプラストの生成、硫酸アンモニウム沈
殿およびクロマトフォーカス(chromatofocusing)クロマ
トグラフィーによるペリプラスムタンパク質の放出が含
まれていた。比活性およびミハエリス定数の測定は、酵
素基質(たとえば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートな
ど)が変換して色原体生成物を生成する速度をモニター
することに基づいて行った。温度安定性の測定は、種々
の温度での酵素活性の失活をモニターすることにより行
った。
【００２９】得られた本発明の新規酵素およびそれらの
性質を第１表にまとめて示す。すべての変異大腸菌株
が、天然酵素(ｐＭＡ１００として示してある)よりも高
い比活性を有するアルカリホスファターゼを発現した。
各変異酵素の温度安定性は天然酵素に比べると低かった
が、すべての変異酵素において、哺乳動物細胞の酵素で
あるウシ腸管アルカリホスファターゼよりは温度安定性
が有意に高かった。
性質を第１表にまとめて示す。すべての変異大腸菌株
が、天然酵素(ｐＭＡ１００として示してある)よりも高
い比活性を有するアルカリホスファターゼを発現した。
各変異酵素の温度安定性は天然酵素に比べると低かった
が、すべての変異酵素において、哺乳動物細胞の酵素で
あるウシ腸管アルカリホスファターゼよりは温度安定性
が有意に高かった。
【００３０】第１表 (構築した変異株)プラスミド 変異 比活性 Ｋm 温度安定性 (μモル/mg/分) (μM) (半減期) ｐＭＡ１００ 野生型 ６０ ３０ ９５℃で６分間 ｐＭＡ１１０ Ｖａｌ377＞Ａｌａ ９０ ２３ ８０℃で７分間 Ｓｅｒ415＞Ｇｌｙ ｐＭＡ１１１ Ｔｈｒ100＞Ｖａｌ １２３ ２０ ８５℃で２１分間 ｐＭＡ１１２ Ｔｈｒ100＞Ｉｌｅ １２３ ２０ ８５℃で１０分間 ｐＭＡ１１３ Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ ２２０ ９４ ８５℃で１０分間 ｐＭＡ１１４ Ｖａｌ99＞Ａｌａ ２０５ ２２ ８０℃で１５分間 ８５℃で３分間 ｐＭＡ１１５ Ａｓｐ101＞Ｓｅｒ ２９０ ５６ ８０℃で１４分間 ８５℃で２分間 ｐＭＡ１１６ Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ １９０ ７４ ７５℃で５分間 Ｖａｌ99＞Ａｌａ ８５℃で＜１分間 ｐＭＡ１１７ Ａｌａ103＞Ａｓｐ １３３ １４４ ８５℃で２２分間 ｐＭＡ１１８ Ａｌａ103＞Ｃｙｓ １０５ ７５ ８５℃で２９分間 ｐＭＡ１１９ Ｔｈｒ107＞Ｖａｌ ２４０ １０２ ８５℃で７分間 ウシ腸管アルカリホスファターゼ １８００ １０ ６５℃で９分間
【００３１】アルカリホスファターゼ標識を用いた結合
アッセイ 結合アッセイの標識としてのアルカリホスファターゼ
の使用を記載する前に、幾つかの術語を定義する。本発
明の新規酵素標識を有利に用いることのできる種々のア
ッセイについても記載する。「特異的結合成分」とは、特
異的結合ペア(すなわち一方の分子が他方の分子に化学
的または物理的手段により特異的に結合する２つの異な
る分子)の成分をいう。抗原と抗体との特異的結合ペア
に加えて、他の特異的結合ペアとしては、ビオチンとア
ビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配
列、相補的ペプチド配列、エフェクター分子とレセプタ
ー分子、酵素コファクターと酵素、ペプチド配列と該配
列もしくは全タンパク質に特異的な抗体、ポリマー酸お
よび塩基、染料とタンパク質結合剤、ペプチドと特異的
タンパク質結合剤(たとえば、リボヌクレアーゼとＳ−
ペプチドおよびリボヌクレアーゼとＳ−タンパク質な
ど)などが挙げられる。さらに、特異的結合成分には、
もとの特異的結合成分の類似体、たとえば分析対象物類
似体なども含まれる。特異的結合成分が免疫反応物であ
るときは、たとえば、抗体、抗原、ハプテン、またはそ
れらの複合体であってよい。抗体を使用するときは、モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、組換えタ
ンパク質または抗体、それらの混合物または断片、並び
に抗体と他の特異的結合成分との混合物であってよい。
そのような抗体の調製法および特異的結合成分として使
用するのに適していることは、当業者にはよく知られて
いる。
アッセイ 結合アッセイの標識としてのアルカリホスファターゼ
の使用を記載する前に、幾つかの術語を定義する。本発
明の新規酵素標識を有利に用いることのできる種々のア
ッセイについても記載する。「特異的結合成分」とは、特
異的結合ペア(すなわち一方の分子が他方の分子に化学
的または物理的手段により特異的に結合する２つの異な
る分子)の成分をいう。抗原と抗体との特異的結合ペア
に加えて、他の特異的結合ペアとしては、ビオチンとア
ビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配
列、相補的ペプチド配列、エフェクター分子とレセプタ
ー分子、酵素コファクターと酵素、ペプチド配列と該配
列もしくは全タンパク質に特異的な抗体、ポリマー酸お
よび塩基、染料とタンパク質結合剤、ペプチドと特異的
タンパク質結合剤(たとえば、リボヌクレアーゼとＳ−
ペプチドおよびリボヌクレアーゼとＳ−タンパク質な
ど)などが挙げられる。さらに、特異的結合成分には、
もとの特異的結合成分の類似体、たとえば分析対象物類
似体なども含まれる。特異的結合成分が免疫反応物であ
るときは、たとえば、抗体、抗原、ハプテン、またはそ
れらの複合体であってよい。抗体を使用するときは、モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、組換えタ
ンパク質または抗体、それらの混合物または断片、並び
に抗体と他の特異的結合成分との混合物であってよい。
そのような抗体の調製法および特異的結合成分として使
用するのに適していることは、当業者にはよく知られて
いる。
【００３２】「分析対象物」とは、アッセイで検出すべき
化合物または組成物をいう。分析対象物は、分析対象物
特異的結合成分が天然に存在するかまたは分析対象物特
異的結合成分を調製することのできるあらゆる物質であ
ってよい。分析対象物の例としては、毒素、有機化合
物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ホルモ
ン、ステロイド、ビタミン、薬物(治療目的で投与され
るものおよび不法目的で投与されるものを含む)、これ
ら物質のいずれかの代謝物、またはこれら物質のいずれ
かに対する抗体などが挙げられるが、これらに限られる
ものではない。「分析対象物」にはまた、イムノアッセイ
の目的となる抗原性物質、ハプテン、抗体、またはそれ
らの組み合わせも含まれる。本発明の試薬および方法は
また、食品産物および環境分析物を測定するために設計
することもできる。
化合物または組成物をいう。分析対象物は、分析対象物
特異的結合成分が天然に存在するかまたは分析対象物特
異的結合成分を調製することのできるあらゆる物質であ
ってよい。分析対象物の例としては、毒素、有機化合
物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ホルモ
ン、ステロイド、ビタミン、薬物(治療目的で投与され
るものおよび不法目的で投与されるものを含む)、これ
ら物質のいずれかの代謝物、またはこれら物質のいずれ
かに対する抗体などが挙げられるが、これらに限られる
ものではない。「分析対象物」にはまた、イムノアッセイ
の目的となる抗原性物質、ハプテン、抗体、またはそれ
らの組み合わせも含まれる。本発明の試薬および方法は
また、食品産物および環境分析物を測定するために設計
することもできる。
【００３３】「指示試薬」とは、標識に結合した特異的結
合成分をいう。指示試薬は、試料中の分析対象物の量に
相関した検出可能なシグナルを生成する。一般に、指示
試薬は、指示試薬が固相物質上に固定化された後に検出
または測定するが、遊離または未結合の指示試薬も検出
または測定してアッセイ結果を決定することもできる。
指示試薬の特異的結合成分は、上記いずれかの特異的結
合ペアの成分であってよい。本発明では、指示試薬の標
識成分は比活性の向上した合成アルカリホスファターゼ
である。酵素標識は、酵素基質を検出可能な生成物に変
換するために用いる。この生成物は視覚手段または器具
により検出することができる。この酵素を１または２以
上の基質または別の酵素と反応させて検出可能な反応生
成物を生成させることにより、検出可能なシグナルを増
幅することもできる。
合成分をいう。指示試薬は、試料中の分析対象物の量に
相関した検出可能なシグナルを生成する。一般に、指示
試薬は、指示試薬が固相物質上に固定化された後に検出
または測定するが、遊離または未結合の指示試薬も検出
または測定してアッセイ結果を決定することもできる。
指示試薬の特異的結合成分は、上記いずれかの特異的結
合ペアの成分であってよい。本発明では、指示試薬の標
識成分は比活性の向上した合成アルカリホスファターゼ
である。酵素標識は、酵素基質を検出可能な生成物に変
換するために用いる。この生成物は視覚手段または器具
により検出することができる。この酵素を１または２以
上の基質または別の酵素と反応させて検出可能な反応生
成物を生成させることにより、検出可能なシグナルを増
幅することもできる。
【００３４】「捕捉結合成分」とは、分析対象物または指
示試薬に直接または間接に結合することができ、捕捉結
合成分を試料または他のアッセイ試薬から分離できるよ
うに、共有結合、非共有結合、吸着または非特異的結合
機構により固相に固定化されているかまたは固定化し得
るかまたは沈殿させ得る特異的結合成分をいう。
示試薬に直接または間接に結合することができ、捕捉結
合成分を試料または他のアッセイ試薬から分離できるよ
うに、共有結合、非共有結合、吸着または非特異的結合
機構により固相に固定化されているかまたは固定化し得
るかまたは沈殿させ得る特異的結合成分をいう。
【００３５】「捕捉試薬」とは、固相物質に直接または間
接に結合して、未結合の分析対象物およびアッセイ試薬
から捕捉結合成分および該捕捉結合成分に結合した分析
対象物または指示試薬を分離できる捕捉結合成分をい
う。一般に、捕捉結合成分の固相物質への結合は実質的
に可逆的なものであり、共有結合機構を含む。しかしな
がら、本発明の捕捉試薬は不溶性の固相物質に結合した
捕捉結合成分に限られるものではない。凝集アッセイ法
においては、捕捉試薬の捕捉結合成分はウシ血清アルブ
ミンなどの可溶性担体に結合している。
接に結合して、未結合の分析対象物およびアッセイ試薬
から捕捉結合成分および該捕捉結合成分に結合した分析
対象物または指示試薬を分離できる捕捉結合成分をい
う。一般に、捕捉結合成分の固相物質への結合は実質的
に可逆的なものであり、共有結合機構を含む。しかしな
がら、本発明の捕捉試薬は不溶性の固相物質に結合した
捕捉結合成分に限られるものではない。凝集アッセイ法
においては、捕捉試薬の捕捉結合成分はウシ血清アルブ
ミンなどの可溶性担体に結合している。
【００３６】「固相物質」とは、特異的結合成分を固定化
するのに使用する当業者によく知られた適当なクロマト
グラフィー物質、吸湿性物質、多孔質物質または毛管物
質または他の通常の固体物質などをいう。本発明におい
ては、固相物質は、１または２以上のアッセイ試薬を含
有する１または２以上の層を有するフロースルー(flow
−through)アッセイ装置で使用するための繊維ガラス、
セルロースまたはナイロンパッド；ディップアンドリー
ド(dip and read)アッセイのためのディップスティッ
ク(dipstick)；クロマトグラフィー法(たとえば、ペー
パークロマトグラフィーまたはガラス繊維クロマトグラ
フィーなど)または薄層クロマトグラフィー(たとえば、
ニトロセルロースクロマトグラフィーなど)に使用する
ための試験ストリップであって、固相物質の単一ストリ
ップの別々のゾーン中に１またはすべての試薬が含まれ
ているもの；または当業者によく知られた吸着物質など
が含まれる。固相物質にはまた、ポリアクリルアミドビ
ーズ、ポリスチレンビーズまたはチューブ、マグネチッ
クビーズ、マイクロタイタープレートまたはガラスまた
はプラスチック試験管なども含まれるが、これらに限ら
れるものではない。
するのに使用する当業者によく知られた適当なクロマト
グラフィー物質、吸湿性物質、多孔質物質または毛管物
質または他の通常の固体物質などをいう。本発明におい
ては、固相物質は、１または２以上のアッセイ試薬を含
有する１または２以上の層を有するフロースルー(flow
−through)アッセイ装置で使用するための繊維ガラス、
セルロースまたはナイロンパッド；ディップアンドリー
ド(dip and read)アッセイのためのディップスティッ
ク(dipstick)；クロマトグラフィー法(たとえば、ペー
パークロマトグラフィーまたはガラス繊維クロマトグラ
フィーなど)または薄層クロマトグラフィー(たとえば、
ニトロセルロースクロマトグラフィーなど)に使用する
ための試験ストリップであって、固相物質の単一ストリ
ップの別々のゾーン中に１またはすべての試薬が含まれ
ているもの；または当業者によく知られた吸着物質など
が含まれる。固相物質にはまた、ポリアクリルアミドビ
ーズ、ポリスチレンビーズまたはチューブ、マグネチッ
クビーズ、マイクロタイタープレートまたはガラスまた
はプラスチック試験管なども含まれるが、これらに限ら
れるものではない。
【００３７】天然物質、合成物質または合成的に修飾し
た天然物質を固相物質として用いることができ、たとえ
ば、多糖類(たとえば、紙、セルロースおよびセルロー
ス誘導体(ジアゾベンジルオキシメチルセルロース、ニ
トロセルロース、２−アミノフェニルチオエーテルセル
ロースおよび酢酸セルロースなど)を含むセルロース物
質など)；シリカ；ケイ素粒子；不活化アルミナなどの
無機物質、または他の無機の細砕し多孔質ポリマーマト
リックス中に均一に分散させた物質などの無機物質(ポ
リマーとしては、塩化ビニル、塩化ビニルとプロピレン
とのコポリマー、および塩化ビニルと酢酸ビニルとのコ
ポリマーなどが挙げられる)；天然の布(たとえば、綿な
ど)および合成の布(たとえば、ナイロンなど)；シリカ
ゲル、アガロース、デキストランおよびゼラチンなどの
多孔質ゲル；ポリアクリレートなどのポリマーフィル
ム；タンパク質結合膜；などが挙げられる。固相物質
は、それ自体で妥当な強度を有しているか、または支持
体により強度を付与し得るものでなければならず、また
検出可能なシグナルの生成を干渉してはならない。
た天然物質を固相物質として用いることができ、たとえ
ば、多糖類(たとえば、紙、セルロースおよびセルロー
ス誘導体(ジアゾベンジルオキシメチルセルロース、ニ
トロセルロース、２−アミノフェニルチオエーテルセル
ロースおよび酢酸セルロースなど)を含むセルロース物
質など)；シリカ；ケイ素粒子；不活化アルミナなどの
無機物質、または他の無機の細砕し多孔質ポリマーマト
リックス中に均一に分散させた物質などの無機物質(ポ
リマーとしては、塩化ビニル、塩化ビニルとプロピレン
とのコポリマー、および塩化ビニルと酢酸ビニルとのコ
ポリマーなどが挙げられる)；天然の布(たとえば、綿な
ど)および合成の布(たとえば、ナイロンなど)；シリカ
ゲル、アガロース、デキストランおよびゼラチンなどの
多孔質ゲル；ポリアクリレートなどのポリマーフィル
ム；タンパク質結合膜；などが挙げられる。固相物質
は、それ自体で妥当な強度を有しているか、または支持
体により強度を付与し得るものでなければならず、また
検出可能なシグナルの生成を干渉してはならない。
【００３８】捕捉試薬の特異的結合成分は、場合により
微粒子などの粒子に結合させることができる。これらの
微粒子は固相物質として働き、カラム中に保持される
か、可溶性試薬と試料との混合物中に懸濁されるか、ま
たは別の固相ベース物質に保持され固定化される。「保
持され固定化される」とは、微粒子が固相ベース物質に
関して該固相ベース物質内のどこの位置にも実質的に移
動できないことを意味する。微粒子は、ポリスチレン、
ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ポリテトラ
フルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボ
ネートまたは同様の物質からなるものを含む、あらゆる
適当なタイプの粒子から当業者により選択することがで
きる。微粒子のサイズは重要ではないが、固相ベース物
質を用いるような場合には該固相ベース物質の平均孔径
よりも小さい平均直径を有するのが好ましい。
微粒子などの粒子に結合させることができる。これらの
微粒子は固相物質として働き、カラム中に保持される
か、可溶性試薬と試料との混合物中に懸濁されるか、ま
たは別の固相ベース物質に保持され固定化される。「保
持され固定化される」とは、微粒子が固相ベース物質に
関して該固相ベース物質内のどこの位置にも実質的に移
動できないことを意味する。微粒子は、ポリスチレン、
ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ポリテトラ
フルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボ
ネートまたは同様の物質からなるものを含む、あらゆる
適当なタイプの粒子から当業者により選択することがで
きる。微粒子のサイズは重要ではないが、固相ベース物
質を用いるような場合には該固相ベース物質の平均孔径
よりも小さい平均直径を有するのが好ましい。
【００３９】本発明はまた、最初から固相に結合してい
なかった捕捉結合成分を含む捕捉試薬をも包含する。ア
ッセイ成分の間で複合体生成が生じたら、固相を分離機
構として用いることができる。たとえば、反応混合物を
固相物質と接触させると、新たに生成した反応複合体は
固相物質により保持される。この分離工程を行うために
別法を用いることもでき、たとえば、それ自体が捕捉結
合成分に結合する固相を用いること、捕捉結合成分に特
異的な結合成分を固相に結合させること、または捕捉結
合成分に結合した反対に荷電した物質を誘引し結合する
荷電物質などの反応試薬を固相に結合することなどが挙
げられる(本出願人による米国特許出願第１５０,２７８
号(１９８８年１月２９日出願)明細書、参照のため本明
細書に引用する)。
なかった捕捉結合成分を含む捕捉試薬をも包含する。ア
ッセイ成分の間で複合体生成が生じたら、固相を分離機
構として用いることができる。たとえば、反応混合物を
固相物質と接触させると、新たに生成した反応複合体は
固相物質により保持される。この分離工程を行うために
別法を用いることもでき、たとえば、それ自体が捕捉結
合成分に結合する固相を用いること、捕捉結合成分に特
異的な結合成分を固相に結合させること、または捕捉結
合成分に結合した反対に荷電した物質を誘引し結合する
荷電物質などの反応試薬を固相に結合することなどが挙
げられる(本出願人による米国特許出願第１５０,２７８
号(１９８８年１月２９日出願)明細書、参照のため本明
細書に引用する)。
【００４０】「補助特異的結合成分」とは、捕捉結合成分
および指示試薬の特異的結合成分の他に用いられる特異
的結合成分であって検出可能な結合複合体の一部となる
ものをいう。１または２以上の補助特異的結合成分をア
ッセイに用いることができる。たとえば、指示試薬が補
助特異的結合成分に結合することができ、該補助特異的
結合成分が今度は分析対象物と結合することができるア
ッセイにおいて補助特異的結合成分を用いることができ
る。
および指示試薬の特異的結合成分の他に用いられる特異
的結合成分であって検出可能な結合複合体の一部となる
ものをいう。１または２以上の補助特異的結合成分をア
ッセイに用いることができる。たとえば、指示試薬が補
助特異的結合成分に結合することができ、該補助特異的
結合成分が今度は分析対象物と結合することができるア
ッセイにおいて補助特異的結合成分を用いることができ
る。
【００４１】「試料」とは、一般に、分析対象物を含有し
ていると思われる、天然または人工的に調製した液体試
験媒体をいう。試料は、一般に生物学的流体またはその
希釈液である。分析対象物を測定する生物学的流体の例
としては、血清、全血、血漿、尿、唾液、羊水、脊髄
液、などが挙げられる。試料にはまた、液体試験媒体を
生成するように修飾した固体物質(たとえば、毛髪、組
織など)も含まれる。
ていると思われる、天然または人工的に調製した液体試
験媒体をいう。試料は、一般に生物学的流体またはその
希釈液である。分析対象物を測定する生物学的流体の例
としては、血清、全血、血漿、尿、唾液、羊水、脊髄
液、などが挙げられる。試料にはまた、液体試験媒体を
生成するように修飾した固体物質(たとえば、毛髪、組
織など)も含まれる。
【００４２】所定の結合成分、補助結合成分または固相
物質の選択は一般に本発明には重要ではないことが当業
者には理解されるであろう。これら物質は、所定の分析
対象物または試料に対して最適のアッセイ結果が得られ
るように選択する。
物質の選択は一般に本発明には重要ではないことが当業
者には理解されるであろう。これら物質は、所定の分析
対象物または試料に対して最適のアッセイ結果が得られ
るように選択する。
【００４３】本発明の新規酵素は、固相不均質結合アッ
セイ(サンドイッチアッセイ法および競合アッセイ法の
両方を含む)において有利に用いることができる。不均
質結合アッセイ法は、結合反応の成分を結合させる固相
の使用を含む。試料中の分析対象物の存在または量を示
す標識を検出する前に、固相を反応混合物から除去する
ことにより固定化反応成分を過剰の試料およびアッセイ
試薬から分離させる。
セイ(サンドイッチアッセイ法および競合アッセイ法の
両方を含む)において有利に用いることができる。不均
質結合アッセイ法は、結合反応の成分を結合させる固相
の使用を含む。試料中の分析対象物の存在または量を示
す標識を検出する前に、固相を反応混合物から除去する
ことにより固定化反応成分を過剰の試料およびアッセイ
試薬から分離させる。
【００４４】固相サンドイッチアッセイにおいては、捕
捉試薬は一般に固相物質に結合させた捕捉結合成分を含
む。たとえば、特異的結合成分は、固定化抗体(試料中
の抗原分析対象物に結合する)であってもよいし、また
は固定化抗原(試料中の抗体分析対象物に結合する)であ
ってもよい。この捕捉試薬を、分析対象物を含有してい
ると思われる試料、および標識した第二の特異的結合成
分からなる指示試薬(たとえば、標識抗分析対象物抗体)
と混合する。これら試薬は、同時に混合することもでき
るし、単独または組み合わせて連続的に加えることもで
きる。結合反応の結果、捕捉試薬／分析対象物／指示試
薬複合体が生成する。アッセイはまた、生成した複合体
を過剰の試薬および試料から分離する工程をも含んでい
てよい。指示試薬について固相を調べることにより、固
相物質上に保持された複合体を検出する。試料中に分析
対象物が存在しておれば、固相物質上に標識が存在する
であろう。固相に結合した標識の量は、試料中の分析対
象物の量に正比例する。
捉試薬は一般に固相物質に結合させた捕捉結合成分を含
む。たとえば、特異的結合成分は、固定化抗体(試料中
の抗原分析対象物に結合する)であってもよいし、また
は固定化抗原(試料中の抗体分析対象物に結合する)であ
ってもよい。この捕捉試薬を、分析対象物を含有してい
ると思われる試料、および標識した第二の特異的結合成
分からなる指示試薬(たとえば、標識抗分析対象物抗体)
と混合する。これら試薬は、同時に混合することもでき
るし、単独または組み合わせて連続的に加えることもで
きる。結合反応の結果、捕捉試薬／分析対象物／指示試
薬複合体が生成する。アッセイはまた、生成した複合体
を過剰の試薬および試料から分離する工程をも含んでい
てよい。指示試薬について固相を調べることにより、固
相物質上に保持された複合体を検出する。試料中に分析
対象物が存在しておれば、固相物質上に標識が存在する
であろう。固相に結合した標識の量は、試料中の分析対
象物の量に正比例する。
【００４５】本発明のアッセイは、順行(forward)法、
逆法および同時法を含む、いかなるサンドイッチアッセ
イ法を用いても行うことができる。一般に、順行アッセ
イ法は、試料を捕捉試薬に接触させた後、インキュベー
ション期間を置き、ついで指示試薬を加えることを含
む。逆アッセイ法では、試料に指示試薬を加え、ついで
インキュベーションの後で捕捉試薬を加える。同時アッ
セイ法は、捕捉試薬と指示試薬の両方ともを同時に試料
と接触させる単一のインキュベーション工程を含む。
逆法および同時法を含む、いかなるサンドイッチアッセ
イ法を用いても行うことができる。一般に、順行アッセ
イ法は、試料を捕捉試薬に接触させた後、インキュベー
ション期間を置き、ついで指示試薬を加えることを含
む。逆アッセイ法では、試料に指示試薬を加え、ついで
インキュベーションの後で捕捉試薬を加える。同時アッ
セイ法は、捕捉試薬と指示試薬の両方ともを同時に試料
と接触させる単一のインキュベーション工程を含む。
【００４６】さらに、本発明の新規酵素は、捕捉試薬／
分析対象物／分析対象物特異的結合成分／指示試薬から
なる複合体を生成させて間接サンドイッチアッセイに用
いることができる。この場合には、分析対象物特異的結
合成分は補助特異的結合成分である。
分析対象物／分析対象物特異的結合成分／指示試薬から
なる複合体を生成させて間接サンドイッチアッセイに用
いることができる。この場合には、分析対象物特異的結
合成分は補助特異的結合成分である。
【００４７】本発明の新規酵素を用いて競合アッセイを
行うこともできる。固相競合アッセイでは、捕捉試薬は
一般に、固相物質に結合させた捕捉結合成分を含み、こ
れを試料および指示試薬の両方に接触させる。しかしな
がら、指示試薬は、標識に結合させた分析対象物または
分析対象物類似体から調製する。結合反応が起こり、そ
の結果、(１)固定化捕捉試薬／分析対象物複合体、また
は(２)固定化捕捉試薬／指示試薬複合体が生成される。
別法としては、固定化特異的結合成分が分析対象物また
は分析対象物類似体であり、これと試料の分析対象物と
が指示試薬への結合について競合するようにすることも
できる。競合アッセイにおいては、固相に結合した標識
の量は試料中の分析対象物の量と逆の相関を有する。そ
れゆえ、陽性の試料はシグナルが減少するであろう。
行うこともできる。固相競合アッセイでは、捕捉試薬は
一般に、固相物質に結合させた捕捉結合成分を含み、こ
れを試料および指示試薬の両方に接触させる。しかしな
がら、指示試薬は、標識に結合させた分析対象物または
分析対象物類似体から調製する。結合反応が起こり、そ
の結果、(１)固定化捕捉試薬／分析対象物複合体、また
は(２)固定化捕捉試薬／指示試薬複合体が生成される。
別法としては、固定化特異的結合成分が分析対象物また
は分析対象物類似体であり、これと試料の分析対象物と
が指示試薬への結合について競合するようにすることも
できる。競合アッセイにおいては、固相に結合した標識
の量は試料中の分析対象物の量と逆の相関を有する。そ
れゆえ、陽性の試料はシグナルが減少するであろう。
【００４８】これらの結合アッセイにおいて、試料中の
分析対象物の存在または量は、通常は固相に結合した標
識の存在または量を検出することにより決定するが、遊
離または未結合の指示試薬を検出することもできる。競
合アッセイでは、試料中に存在する分析対象物の量が多
ければ多いほど、固相に結合する標識の量は減少する。
サンドイッチアッセイでは、試料中の分析対象物の量が
多ければ多いほど、固相に存在する標識の量は増大す
る。
分析対象物の存在または量は、通常は固相に結合した標
識の存在または量を検出することにより決定するが、遊
離または未結合の指示試薬を検出することもできる。競
合アッセイでは、試料中に存在する分析対象物の量が多
ければ多いほど、固相に結合する標識の量は減少する。
サンドイッチアッセイでは、試料中の分析対象物の量が
多ければ多いほど、固相に存在する標識の量は増大す
る。
【００４９】下記の特定の実施例でも記載するように、
本発明の幾つかの新規酵素を別の免疫グロブリンに化学
的に結合させ、酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)に使用する
ための結合体を生成させた。たとえば、プラスミドｐＭ
Ａ１１０、ｐＭＡ１１１、ｐＭＡ１１２、ｐＭＡ１１３
およびｐＭＡ１１５により発現された変異酵素を、種々
のヘテロ２官能性カップリング試薬により抗α−フェト
プロテインモノクローナル抗体(抗ＡＦＰ抗体)に結合さ
せた。これらの抗体／酵素結合体を引き続きＥＩＡにお
いて指示試薬として用いた。たとえば、変異プラスミド
ｐＭＡ１１３からのアルカリホスファターゼを結合させ
た抗ＡＦＰ抗体を用いたアッセイにおいてＡＦＰ標準曲
線を作成した。このｐＭＡ１１３酵素／抗体指示試薬か
らは、同様のアッセイ条件下で哺乳動物酵素／抗体指示
試薬を用いて得られた標準曲線に匹敵する標準曲線が作
成された。ヘテロ２官能性カップリング試薬の使用は当
業者にはよく知られており、特定のヘテロ２官能性カッ
プリング試薬が本発明の指示試薬に必須であるというこ
とはない。
本発明の幾つかの新規酵素を別の免疫グロブリンに化学
的に結合させ、酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)に使用する
ための結合体を生成させた。たとえば、プラスミドｐＭ
Ａ１１０、ｐＭＡ１１１、ｐＭＡ１１２、ｐＭＡ１１３
およびｐＭＡ１１５により発現された変異酵素を、種々
のヘテロ２官能性カップリング試薬により抗α−フェト
プロテインモノクローナル抗体(抗ＡＦＰ抗体)に結合さ
せた。これらの抗体／酵素結合体を引き続きＥＩＡにお
いて指示試薬として用いた。たとえば、変異プラスミド
ｐＭＡ１１３からのアルカリホスファターゼを結合させ
た抗ＡＦＰ抗体を用いたアッセイにおいてＡＦＰ標準曲
線を作成した。このｐＭＡ１１３酵素／抗体指示試薬か
らは、同様のアッセイ条件下で哺乳動物酵素／抗体指示
試薬を用いて得られた標準曲線に匹敵する標準曲線が作
成された。ヘテロ２官能性カップリング試薬の使用は当
業者にはよく知られており、特定のヘテロ２官能性カッ
プリング試薬が本発明の指示試薬に必須であるというこ
とはない。
【００５０】本発明の新規アルカリホスファターゼはま
た、幾つかの他のタンパク質、たとえば癌抗原−１２５
および抗−癌胎児性抗原抗体、癌抗原１９−９Ｆａｂ断
片およびヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン抗体にも化学的
にカップリングさせた。これらすべての場合において自
動ＥＩＡに使用することに成功した。この場合、アルカ
リホスファターゼの存在は、酵素基質を添加して検出可
能な生成物を生成させ、反応成分の存在または量を示す
ことにより検出することができる。アルカリホスファタ
ーゼ標識を利用する結合アッセイに使用するため、多く
のアルカリホスファターゼ基質を利用することができ
る。一般に用いられる基質は、ｐ−ニトロフェニルホス
フェート(ｐＮＰＰ)、５−クロロ−４−ブロモ−３−イ
ンドリルホスフェート(ＸＰ)、およびメチルウンベリフ
ェリルホスフェート(ＭＵＰ)などである。ＭＵＰおよび
ｐＮＰＰ基質がイムノアッセイにおいてしばしば用いら
れる。結合アッセイの別態様として、指示試薬が酵素基
質で標識した特異的結合成分からなり、アルカリホスフ
ァターゼ酵素を添加して検出可能なシグナルを生成させ
てもよい。
た、幾つかの他のタンパク質、たとえば癌抗原−１２５
および抗−癌胎児性抗原抗体、癌抗原１９−９Ｆａｂ断
片およびヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン抗体にも化学的
にカップリングさせた。これらすべての場合において自
動ＥＩＡに使用することに成功した。この場合、アルカ
リホスファターゼの存在は、酵素基質を添加して検出可
能な生成物を生成させ、反応成分の存在または量を示す
ことにより検出することができる。アルカリホスファタ
ーゼ標識を利用する結合アッセイに使用するため、多く
のアルカリホスファターゼ基質を利用することができ
る。一般に用いられる基質は、ｐ−ニトロフェニルホス
フェート(ｐＮＰＰ)、５−クロロ−４−ブロモ−３−イ
ンドリルホスフェート(ＸＰ)、およびメチルウンベリフ
ェリルホスフェート(ＭＵＰ)などである。ＭＵＰおよび
ｐＮＰＰ基質がイムノアッセイにおいてしばしば用いら
れる。結合アッセイの別態様として、指示試薬が酵素基
質で標識した特異的結合成分からなり、アルカリホスフ
ァターゼ酵素を添加して検出可能なシグナルを生成させ
てもよい。
【００５１】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものでは
ない。実施例１ 変異および野生型phoＡ遺伝子の調製： (ａ)オリゴヌクレオチドの合成：本発明にとって必須で
はないが、アルカリホスファターゼ遺伝子の突然変異誘
発および該遺伝子の発現を容易にするため、合成phoＡ
遺伝子を構築した。合成遺伝子の構造は、チャングらの
Ｇene４４、１２１〜１２５(１９８６)(参照のため本明
細書に引用する)に開示されている野生型の大腸菌アル
カリホスファターゼ遺伝子の配列に基づいた。この遺伝
子を、約５０〜１００塩基対の間隔にて大腸菌コドン選
択(preference)および独特制限部位で遺伝子操作した。
phoＡ遺伝子を合成するため、マンデッキらのＧene６
８、１０１〜１０７(１９８８)(参照のため本明細書に
引用する)に開示された遺伝子合成のＦokＩ法を用い
た。phoＡ遺伝子を、それぞれ長さが７３塩基の２１の
オリゴヌクレオチドサブ配列に分割した。ＦokＩアーム
に対応する付加３０塩基を各サブ配列に付加し、開裂部
位の各側で重複または切断プラスミドＤＮＡにアニール
するようにした。
詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものでは
ない。実施例１ 変異および野生型phoＡ遺伝子の調製： (ａ)オリゴヌクレオチドの合成：本発明にとって必須で
はないが、アルカリホスファターゼ遺伝子の突然変異誘
発および該遺伝子の発現を容易にするため、合成phoＡ
遺伝子を構築した。合成遺伝子の構造は、チャングらの
Ｇene４４、１２１〜１２５(１９８６)(参照のため本明
細書に引用する)に開示されている野生型の大腸菌アル
カリホスファターゼ遺伝子の配列に基づいた。この遺伝
子を、約５０〜１００塩基対の間隔にて大腸菌コドン選
択(preference)および独特制限部位で遺伝子操作した。
phoＡ遺伝子を合成するため、マンデッキらのＧene６
８、１０１〜１０７(１９８８)(参照のため本明細書に
引用する)に開示された遺伝子合成のＦokＩ法を用い
た。phoＡ遺伝子を、それぞれ長さが７３塩基の２１の
オリゴヌクレオチドサブ配列に分割した。ＦokＩアーム
に対応する付加３０塩基を各サブ配列に付加し、開裂部
位の各側で重複または切断プラスミドＤＮＡにアニール
するようにした。
【００５２】オリゴヌクレオチドの合成は、５'−ジメ
トキシトリチルヌクレオシドβ−シアノエチルホスホー
ルアミダイトを用い、アプライドバイオシステム(Ａppl
iedＢiosystem)３８０Ｂ合成機(アプライドバイオシス
テムズ、フォスターシティー、ＣＡ)で行った。得られ
たオリゴヌクレオチドを、１０％ポリアクリルアミドゲ
ル(１０％ポリアクリルアミド、７.０Ｍ尿素、および１
×ＴＢＥ[８９ｍＭトリス−ホウ酸塩、８９ｍＭホウ
酸、２.０ｍＭエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)])上
のゲル電気泳動(Ｇene６８、１０１〜１０７、１９８８
にも記載されている)により精製した。ＵＶ陰影(shadow
ing)によりＤＮＡを視覚化し、１０３塩基対サブ配列に
対応するバンドをゲルから切り出した。マキサムの溶離
緩衝液(０.５Ｍ酢酸アンモニウムおよび１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ)(１ｍｌ)を用い、３７℃にて１６時間、切り出した
ゲル部分からオリゴヌクレオチドを溶離した。残留する
ポリアクリルアミドを除去するため、溶離したオリゴヌ
クレオチドをフィルター[０.２μＭセントレックス(Ｃe
ntrex)フィルター;シュライヒャー＆シュエル(Ｓchleic
her＆Ｓchuell,Ｉnc.,キーン、ＮＨ)]に通した。精製し
たオリゴヌクレオチドを５容量のエタノールで沈殿さ
せ、水(５０μｌ)中に再懸濁し、ベックマンＤＵ−７分
光光度計[ベックマン・インスツルメンツ(Ｂeckman Ｉ
nstruments)パロアルト、ＣＡ]を用いて定量した。合成
オリゴヌクレオチドの配列を第１図〜第３図に示す。
トキシトリチルヌクレオシドβ−シアノエチルホスホー
ルアミダイトを用い、アプライドバイオシステム(Ａppl
iedＢiosystem)３８０Ｂ合成機(アプライドバイオシス
テムズ、フォスターシティー、ＣＡ)で行った。得られ
たオリゴヌクレオチドを、１０％ポリアクリルアミドゲ
ル(１０％ポリアクリルアミド、７.０Ｍ尿素、および１
×ＴＢＥ[８９ｍＭトリス−ホウ酸塩、８９ｍＭホウ
酸、２.０ｍＭエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)])上
のゲル電気泳動(Ｇene６８、１０１〜１０７、１９８８
にも記載されている)により精製した。ＵＶ陰影(shadow
ing)によりＤＮＡを視覚化し、１０３塩基対サブ配列に
対応するバンドをゲルから切り出した。マキサムの溶離
緩衝液(０.５Ｍ酢酸アンモニウムおよび１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ)(１ｍｌ)を用い、３７℃にて１６時間、切り出した
ゲル部分からオリゴヌクレオチドを溶離した。残留する
ポリアクリルアミドを除去するため、溶離したオリゴヌ
クレオチドをフィルター[０.２μＭセントレックス(Ｃe
ntrex)フィルター;シュライヒャー＆シュエル(Ｓchleic
her＆Ｓchuell,Ｉnc.,キーン、ＮＨ)]に通した。精製し
たオリゴヌクレオチドを５容量のエタノールで沈殿さ
せ、水(５０μｌ)中に再懸濁し、ベックマンＤＵ−７分
光光度計[ベックマン・インスツルメンツ(Ｂeckman Ｉ
nstruments)パロアルト、ＣＡ]を用いて定量した。合成
オリゴヌクレオチドの配列を第１図〜第３図に示す。
【００５３】(ｂ)ＤＮＡのクローニング：上記架橋突然
変異誘発プロトコールにより、合成オリゴヌクレオチド
のプラスミドベクター中へのクローニングを行った。ク
ローニング用に選択したプラスミドは、上記ｐＷＭ５０
０およびｐＷＭ５０１であった。
変異誘発プロトコールにより、合成オリゴヌクレオチド
のプラスミドベクター中へのクローニングを行った。ク
ローニング用に選択したプラスミドは、上記ｐＷＭ５０
０およびｐＷＭ５０１であった。
【００５４】クローニングベクターをＳmaＩ制限酵素で
開裂した。開裂したプラスミド(約５０ｎｇ)を変性緩衝
液(１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.
０、５ｍＭ ＭｇＳＯ4および０.５ｍＭジチオトレイト
ール)(３０μｌ)中でオリゴヌクレオチドサブ配列(２０
ピコモル)と混合した。この試料を沸騰水浴中で１００
℃にて３分間加熱し、ついで室温に５分間冷却した。つ
いで、試料を冷却したコンピテントなＪＭ８３宿主細胞
(１００μｌ：ara、Δ[lac−proＡＢ]、strＡ、thi、Φ
８０d、lacＺΔＭ１５)と混合した[ビエイラ(Ｖieira)
らのＧene１９、２５９〜２６８(１９８２)に記載のよ
うにして](参照のため本明細書に引用する)。ＪＭ８３
細胞は、マンデル(Ｍandel)らのＪ.Ｍol.Ｂiol.,５３、
１５９〜１６２(１９７０)(参照のため本明細書に引用
する)に開示のＣａＣｌ2法により調製した。この混合物
を氷上で５分間冷却し、ついで３７℃で３分間熱ショッ
クを与えた。約２ｍｌのルリアブロス(ＬＢ)培地(１ｌ
当たりバクト−トリプトン１０ｇ；バクト−酵母エキス
５ｇ；およびＮａＣｌ１０ｇ；ｐＨ７.５を含有)を形質
転換混合物に加え、混合物を３７℃で１時間インキュベ
ートした。ついで、形質転換した細胞をＳorvall ＧＬ
Ｃ−２Ｂ卓上遠心管中で遠心分離にかけた(４,０００ｒ
ｐｍで５分間)。細胞をＬＢ培地(１００μｌ)中に再懸
濁し、アンピリシン耐性を有するコロニー(すなわち、
プラスミドを含有する細胞)を選択するため、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシド
(１.６ｍｇ)およびアンピリシンを含有するＬＢプレー
ト(ＬＢ培地／アンピリシン；２５ｍｇ／ｍｌで１００
μｌ)上にプレーティングした。プレートを３７℃で１
５時間インキュベートし、β−ガラクトシダーゼ発色ア
ッセイにより形質転換体を数えた。
開裂した。開裂したプラスミド(約５０ｎｇ)を変性緩衝
液(１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.
０、５ｍＭ ＭｇＳＯ4および０.５ｍＭジチオトレイト
ール)(３０μｌ)中でオリゴヌクレオチドサブ配列(２０
ピコモル)と混合した。この試料を沸騰水浴中で１００
℃にて３分間加熱し、ついで室温に５分間冷却した。つ
いで、試料を冷却したコンピテントなＪＭ８３宿主細胞
(１００μｌ：ara、Δ[lac−proＡＢ]、strＡ、thi、Φ
８０d、lacＺΔＭ１５)と混合した[ビエイラ(Ｖieira)
らのＧene１９、２５９〜２６８(１９８２)に記載のよ
うにして](参照のため本明細書に引用する)。ＪＭ８３
細胞は、マンデル(Ｍandel)らのＪ.Ｍol.Ｂiol.,５３、
１５９〜１６２(１９７０)(参照のため本明細書に引用
する)に開示のＣａＣｌ2法により調製した。この混合物
を氷上で５分間冷却し、ついで３７℃で３分間熱ショッ
クを与えた。約２ｍｌのルリアブロス(ＬＢ)培地(１ｌ
当たりバクト−トリプトン１０ｇ；バクト−酵母エキス
５ｇ；およびＮａＣｌ１０ｇ；ｐＨ７.５を含有)を形質
転換混合物に加え、混合物を３７℃で１時間インキュベ
ートした。ついで、形質転換した細胞をＳorvall ＧＬ
Ｃ−２Ｂ卓上遠心管中で遠心分離にかけた(４,０００ｒ
ｐｍで５分間)。細胞をＬＢ培地(１００μｌ)中に再懸
濁し、アンピリシン耐性を有するコロニー(すなわち、
プラスミドを含有する細胞)を選択するため、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシド
(１.６ｍｇ)およびアンピリシンを含有するＬＢプレー
ト(ＬＢ培地／アンピリシン；２５ｍｇ／ｍｌで１００
μｌ)上にプレーティングした。プレートを３７℃で１
５時間インキュベートし、β−ガラクトシダーゼ発色ア
ッセイにより形質転換体を数えた。
【００５５】２１のクローニングオリゴヌクレオチドの
それぞれについて、４つの個々の細胞コロニーを取り出
した。アンピリシン(１００μｇ／ｍｌ)を含有するＬＢ
培地(０.５ｍｌ)に単一コロニーを接種した。５時間常
に撹拌しながら３７℃で培養液を増殖させた。ついで、
２１の個々の細胞培養液(すなわち、一つの培養液が各
オリゴヌクレオチドサブ配列に対応する)をプールし、
アンピリシンを含有するＬＢ培地(１ｌ)に加え、６００
ｎｍでの光学密度が０.６５となるまで２.５時間増殖さ
せた。オリゴヌクレオチドサブ配列の合成の間に生じた
かもしれない別の変異を含むサブクローンを回避する目
的で、プールしたサブ配列について４つの別々の培養液
を調製した。培養液をクロラムフェニコール(最終濃度
２５ｍＭ)で増幅し、３７℃で１６時間インキュベート
した[フレンケル(Ｆrenkel)らのＤＮＡ、５：５３９〜
５４４(１９８６)に開示のように](参照のため本明細書
に引用する)。
それぞれについて、４つの個々の細胞コロニーを取り出
した。アンピリシン(１００μｇ／ｍｌ)を含有するＬＢ
培地(０.５ｍｌ)に単一コロニーを接種した。５時間常
に撹拌しながら３７℃で培養液を増殖させた。ついで、
２１の個々の細胞培養液(すなわち、一つの培養液が各
オリゴヌクレオチドサブ配列に対応する)をプールし、
アンピリシンを含有するＬＢ培地(１ｌ)に加え、６００
ｎｍでの光学密度が０.６５となるまで２.５時間増殖さ
せた。オリゴヌクレオチドサブ配列の合成の間に生じた
かもしれない別の変異を含むサブクローンを回避する目
的で、プールしたサブ配列について４つの別々の培養液
を調製した。培養液をクロラムフェニコール(最終濃度
２５ｍＭ)で増幅し、３７℃で１６時間インキュベート
した[フレンケル(Ｆrenkel)らのＤＮＡ、５：５３９〜
５４４(１９８６)に開示のように](参照のため本明細書
に引用する)。
【００５６】(ｃ)ＤＮＡ断片挿入物の構築：形質転換細
胞を遠心分離(１０,０００×ｇで５分間、４℃)により
回収した。細胞を溶解し、バーンボイム(Ｂirnboim)ら
のＮucleic Ａcids Ｒesearch、７；１５１３(１９７
９)(参照のため本明細書に引用する)に開示のように、
プラスミドＤＮＡをセシウムクロライド勾配上で精製し
た。
胞を遠心分離(１０,０００×ｇで５分間、４℃)により
回収した。細胞を溶解し、バーンボイム(Ｂirnboim)ら
のＮucleic Ａcids Ｒesearch、７；１５１３(１９７
９)(参照のため本明細書に引用する)に開示のように、
プラスミドＤＮＡをセシウムクロライド勾配上で精製し
た。
【００５７】４つのプール調製物の精製プラスミドＤＮ
ＡをＦokＩで消化してＤＮＡ断片挿入物を得た。約２５
０μｇのプールしたサブ配列プラスミドＤＮＡを、３７
℃で２.５時間、５００μｌの緩衝液(２０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、および１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2)中で２００単位のＦokＩで消化した。
消化物を６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にか
け、７３塩基対オリゴヌクレオチドサブ配列に対応する
断片を切り出した。上記実施例１(ａ)に記載したオリゴ
ヌクレオチドの精製に用いた方法に実質的に従い、断片
の溶離を行った。
ＡをＦokＩで消化してＤＮＡ断片挿入物を得た。約２５
０μｇのプールしたサブ配列プラスミドＤＮＡを、３７
℃で２.５時間、５００μｌの緩衝液(２０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、および１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2)中で２００単位のＦokＩで消化した。
消化物を６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にか
け、７３塩基対オリゴヌクレオチドサブ配列に対応する
断片を切り出した。上記実施例１(ａ)に記載したオリゴ
ヌクレオチドの精製に用いた方法に実質的に従い、断片
の溶離を行った。
【００５８】精製ＦokＩ断片を水(１５μｌ)中に再懸濁
した。４つの試料のそれぞれのアリコート(０.５μｌ)
を０.８％アガロースゲル上の電気泳動にかけて、生成
したＤＮＡの濃度をほぼ決定した。推定定量に基づき、
各試料から４.５μｇのプールＦokＩ断片が得られた。
した。４つの試料のそれぞれのアリコート(０.５μｌ)
を０.８％アガロースゲル上の電気泳動にかけて、生成
したＤＮＡの濃度をほぼ決定した。推定定量に基づき、
各試料から４.５μｇのプールＦokＩ断片が得られた。
【００５９】(ｄ)変異大腸菌株：高度に発現される機能
性のアルカリホスファターゼタンパク質を製造するた
め、２１の断片挿入物を合成プラスミドｐＷＭ５１８に
ライゲートした。この発現系では、合成phoＡ遺伝子は
天然phoＡ遺伝子のラクトースプロモーターおよびリボ
ソーム結合部位の制御下にあった。１５０ｎｇのＢamＨ
Ｉ／ＨindＩＩＩ開裂ベクターとライゲートするため５
０ｎｇの各断片を用いた。
性のアルカリホスファターゼタンパク質を製造するた
め、２１の断片挿入物を合成プラスミドｐＷＭ５１８に
ライゲートした。この発現系では、合成phoＡ遺伝子は
天然phoＡ遺伝子のラクトースプロモーターおよびリボ
ソーム結合部位の制御下にあった。１５０ｎｇのＢamＨ
Ｉ／ＨindＩＩＩ開裂ベクターとライゲートするため５
０ｎｇの各断片を用いた。
【００６０】変異のないphoＡ遺伝子(ｐＭＡ１００と称
する)を確実に得るため、４つのプラスミド調製物の等
アリコートを合わせた。ｐＭＡ１００の制限地図は第４
図に示してあり、合成野生型大腸菌アルカリホスファタ
ーゼ(独特制限部位を有する)のヌクレオチド配列および
アミノ酸配列を第５図〜第６図に示す。オリゴヌクレオ
チドサブ配列とベクターとのライゲーションは、ライゲ
ーション混合物(１０μｌ：６０ｍＭトリス[ｐＨ７.
５]；５ｍＭ ＭｇＣｌ2；０.４ｍＭアデノシン三リン
酸；および１０ｍＭジチオトレイトール)中で行った。
酵素リガーゼ(Ｔ４ＤＮＡリガーゼ)を添加する前に、試
料を４２℃で１５分間インキュベートし、ついで４℃で
１.５時間置いた。リガーゼ添加後、試料を０℃にて１
６時間インキュベートした。５％アクリルアミドゲル
(１／５０ビスアクリルアミド)上で分析することによ
り、ライゲーション反応の完了を試験した。ライゲート
物質の移動から、ｐＷＭ５１８中の完全長phoＡ遺伝子
に対応する３.５キロベース断片、およびはしご状につ
らなった部分的にライゲートした断片および非ライゲー
ト断片が明らかになった。ついで、ライゲート混合物を
ＳＣＳ−１宿主細胞(Ｆ-、recＡ１、gyrＡ９６、thi、h
sdＲ１７、(rk-mk+)、supＥ４４、relＡ１、λ-：スト
ラタジーン、サンジエゴ、ＣＡ)中に形質転換した。形
質転換法は、ハナハン(Ｈanahan)のＪ.Ｍol.Ｂiol.,１
６６、５５７〜５８０(１９８３)(参照のため本明細書
に引用する)に記載された方法に従って行った。ＳＣＳ
−１細胞(１００μｌ)を融解し、前もって冷却しておい
たポリプロピレンチューブ(１５ｍｌ；ファルコン２０
５９、フィッシャー・サイエンティフィック(Ｆisher
Ｓcientific)、ピッツバーグ、ＰＡ)中にアリコートし
た。β−メルカプトエタノール(１.４Ｍ、１.７μｌ)を
細胞に加え、０℃にて１０分間穏やかに回転撹拌した。
１ｎｇのプラスミドＤＮＡを細胞に添加して最高の形質
転換効率(すなわち複製プラスミドを含有する宿主細胞
数が最大)が得られた。混合物の種々の希釈(第２表に示
す)を研究した。試料を氷上で３０分間インキュベート
した。その間、試料を、周期的に４５℃の水浴中に４５
秒間熱処理したのち氷上に２分間置く方法をとった。Ｓ
ＯＣ培地(０.９ｍｌ)を加え、試料をインキュベートし
た(２２５ｒｐｍで震盪させながら３７℃で１時間)(Ｓ
ＯＣ培地は、１ｌ当たり、バクト−トリプトン２０ｇ、
バクト−酵母エキス５ｇ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、および
２.５ｍＭＫＣｌを含有し、２Ｍ濾過滅菌Ｍｇ溶液[１ｍ
ｌ／１００ｍｌ ＳＯＣ；１ＭＭｇＣｌ2および１Ｍ
ＭｇＳＯ4]および２Ｍ濾過滅菌グルコース溶液[１ｍｌ
／１００ｍｌ ＳＯＣ]と混合したものであった)。イン
キュベーション後、細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離にかけて濃縮した。得られたペレットをＳＯＣ
(２００μｌ)中に再懸濁し、アンピシリン(５０μｇ／
ｍｌ)を含有するＬＢ培地上にプレーティングした。
する)を確実に得るため、４つのプラスミド調製物の等
アリコートを合わせた。ｐＭＡ１００の制限地図は第４
図に示してあり、合成野生型大腸菌アルカリホスファタ
ーゼ(独特制限部位を有する)のヌクレオチド配列および
アミノ酸配列を第５図〜第６図に示す。オリゴヌクレオ
チドサブ配列とベクターとのライゲーションは、ライゲ
ーション混合物(１０μｌ：６０ｍＭトリス[ｐＨ７.
５]；５ｍＭ ＭｇＣｌ2；０.４ｍＭアデノシン三リン
酸；および１０ｍＭジチオトレイトール)中で行った。
酵素リガーゼ(Ｔ４ＤＮＡリガーゼ)を添加する前に、試
料を４２℃で１５分間インキュベートし、ついで４℃で
１.５時間置いた。リガーゼ添加後、試料を０℃にて１
６時間インキュベートした。５％アクリルアミドゲル
(１／５０ビスアクリルアミド)上で分析することによ
り、ライゲーション反応の完了を試験した。ライゲート
物質の移動から、ｐＷＭ５１８中の完全長phoＡ遺伝子
に対応する３.５キロベース断片、およびはしご状につ
らなった部分的にライゲートした断片および非ライゲー
ト断片が明らかになった。ついで、ライゲート混合物を
ＳＣＳ−１宿主細胞(Ｆ-、recＡ１、gyrＡ９６、thi、h
sdＲ１７、(rk-mk+)、supＥ４４、relＡ１、λ-：スト
ラタジーン、サンジエゴ、ＣＡ)中に形質転換した。形
質転換法は、ハナハン(Ｈanahan)のＪ.Ｍol.Ｂiol.,１
６６、５５７〜５８０(１９８３)(参照のため本明細書
に引用する)に記載された方法に従って行った。ＳＣＳ
−１細胞(１００μｌ)を融解し、前もって冷却しておい
たポリプロピレンチューブ(１５ｍｌ；ファルコン２０
５９、フィッシャー・サイエンティフィック(Ｆisher
Ｓcientific)、ピッツバーグ、ＰＡ)中にアリコートし
た。β−メルカプトエタノール(１.４Ｍ、１.７μｌ)を
細胞に加え、０℃にて１０分間穏やかに回転撹拌した。
１ｎｇのプラスミドＤＮＡを細胞に添加して最高の形質
転換効率(すなわち複製プラスミドを含有する宿主細胞
数が最大)が得られた。混合物の種々の希釈(第２表に示
す)を研究した。試料を氷上で３０分間インキュベート
した。その間、試料を、周期的に４５℃の水浴中に４５
秒間熱処理したのち氷上に２分間置く方法をとった。Ｓ
ＯＣ培地(０.９ｍｌ)を加え、試料をインキュベートし
た(２２５ｒｐｍで震盪させながら３７℃で１時間)(Ｓ
ＯＣ培地は、１ｌ当たり、バクト−トリプトン２０ｇ、
バクト−酵母エキス５ｇ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、および
２.５ｍＭＫＣｌを含有し、２Ｍ濾過滅菌Ｍｇ溶液[１ｍ
ｌ／１００ｍｌ ＳＯＣ；１ＭＭｇＣｌ2および１Ｍ
ＭｇＳＯ4]および２Ｍ濾過滅菌グルコース溶液[１ｍｌ
／１００ｍｌ ＳＯＣ]と混合したものであった)。イン
キュベーション後、細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離にかけて濃縮した。得られたペレットをＳＯＣ
(２００μｌ)中に再懸濁し、アンピシリン(５０μｇ／
ｍｌ)を含有するＬＢ培地上にプレーティングした。
【００６１】アルカリホスファターゼを合成したコロニ
ーは、水中に懸濁したＢＣＩＰ(１００μｌ；２０ｍｇ
／ｍｌ)を各プレートに加えて生じた青色の呈色により
同定した。形質転換効率を第２表にまとめて示す。形質
転換効率の比較定量決定のため、ＳＣＳ−１細胞をｐＵ
Ｃ９プラスミドＤＮＡ(通常、コントロールとして用い
られる；ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ガイセ
ルスバーグ、ＭＤ)でも形質転換した。ＳＣＳ−１宿主
細胞の全形質転換効率は、約２×１０7コロニー／μｇ
ｐＵＣ９ＤＮＡであった。ストラタジーンにより記載さ
れた効率は、１×１０9コロニー／μｇＤＮＡ以上であ
る。
ーは、水中に懸濁したＢＣＩＰ(１００μｌ；２０ｍｇ
／ｍｌ)を各プレートに加えて生じた青色の呈色により
同定した。形質転換効率を第２表にまとめて示す。形質
転換効率の比較定量決定のため、ＳＣＳ−１細胞をｐＵ
Ｃ９プラスミドＤＮＡ(通常、コントロールとして用い
られる；ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ガイセ
ルスバーグ、ＭＤ)でも形質転換した。ＳＣＳ−１宿主
細胞の全形質転換効率は、約２×１０7コロニー／μｇ
ｐＵＣ９ＤＮＡであった。ストラタジーンにより記載さ
れた効率は、１×１０9コロニー／μｇＤＮＡ以上であ
る。
【００６２】第２表 (形質転換効率) 試料 ライゲーション混合物 ＤＮＡ濃度 コロニー数 (１.０μｌ) (ｎｇ) 試料１ 希釈せず １２０.０ ３青、３６２白 試料２ １：１０希釈 １２.０ ３青、１２４白 試料３ １：２５希釈 ４.８ ０青、５３白 試料４ １：５０希釈 ２.４ ０青、１６白ライケ゛ -トした切断ヘ゛クタ- 希釈せず １５.０ ６８白 ｐＵＣ９ １.０ 〜２０,０００白
【００６３】わずかに６つの形質転換体(６つの青色コ
ロニー)のみが機能性の合成phoＡ遺伝子の存在を示した
にとどまったので、天然配列を分析するためのクローン
をもっと得るために形質転換プロトコールを繰り返し
た。全部で１６のコロニーを形質転換ＳＣＳ−１細胞か
ら取り出し、バーンボイムらのＮucleic Ａcids Ｒe
s.７、１５１３(１９７９)(参照のため本明細書に引用
する)に開示されたミニプレプ(miniprep)法によりプラ
スミドＤＮＡを単離した。各試料のアリコートをＥcoＲ
ＩおよびＨindＩＩＩで消化し、分子量マーカー(ＤＮＡ
／ＨindＩＩＩ断片、ΦＸ１７４ＲＦ ＤＮＡ／ＨindＩ
ＩＩ断片および１キロベースＤＮＡ；ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ、ガイセルスバーグ、ＭＤ)ととも
に０.８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。消化
した１６の試料のうち、すべての試料が、１.４キロベ
ース(全長アルカリホスファターゼ遺伝子の対応する長
さ)の断片挿入物を含有していた。
ロニー)のみが機能性の合成phoＡ遺伝子の存在を示した
にとどまったので、天然配列を分析するためのクローン
をもっと得るために形質転換プロトコールを繰り返し
た。全部で１６のコロニーを形質転換ＳＣＳ−１細胞か
ら取り出し、バーンボイムらのＮucleic Ａcids Ｒe
s.７、１５１３(１９７９)(参照のため本明細書に引用
する)に開示されたミニプレプ(miniprep)法によりプラ
スミドＤＮＡを単離した。各試料のアリコートをＥcoＲ
ＩおよびＨindＩＩＩで消化し、分子量マーカー(ＤＮＡ
／ＨindＩＩＩ断片、ΦＸ１７４ＲＦ ＤＮＡ／ＨindＩ
ＩＩ断片および１キロベースＤＮＡ；ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ、ガイセルスバーグ、ＭＤ)ととも
に０.８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。消化
した１６の試料のうち、すべての試料が、１.４キロベ
ース(全長アルカリホスファターゼ遺伝子の対応する長
さ)の断片挿入物を含有していた。
【００６４】１６の試料から４つのクローンを取り出
し、プラスミドＤＮＡをそれぞれ単離し、ＣｓＣｌ勾配
上で精製した[ラドロフ(Ｒadloff)らのＰroc.Ｎatl.Ａc
ad.Ｓci.５７、１５１４〜１５２１(１９６７)(参照の
ため本明細書に引用する)に開示のようにして]。複数の
重複配列プライマーを用いるサンガー(Ｓanger)のジデ
オキシ法[サンガーら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.７４、
５４６３〜５４６７(１９７７)(参照のため本明細書に
引用する)]により試料のシークエンシングを行った。４
つのすべての試料が同じ変異(１１９１位におけるＣ→
Ｔ、１２２０位におけるＴ→Ｃおよび１３３３位におけ
るＡ→Ｇ)を有していた。第一の変異はサイレントであ
ったが、残りの変化はＶａｌ377＞ＡｌａおよびＳｅｒ
415＞Ｇｌｙの変異となった。得られたクローンをｐＭ
Ａ１１０と称した。
し、プラスミドＤＮＡをそれぞれ単離し、ＣｓＣｌ勾配
上で精製した[ラドロフ(Ｒadloff)らのＰroc.Ｎatl.Ａc
ad.Ｓci.５７、１５１４〜１５２１(１９６７)(参照の
ため本明細書に引用する)に開示のようにして]。複数の
重複配列プライマーを用いるサンガー(Ｓanger)のジデ
オキシ法[サンガーら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.７４、
５４６３〜５４６７(１９７７)(参照のため本明細書に
引用する)]により試料のシークエンシングを行った。４
つのすべての試料が同じ変異(１１９１位におけるＣ→
Ｔ、１２２０位におけるＴ→Ｃおよび１３３３位におけ
るＡ→Ｇ)を有していた。第一の変異はサイレントであ
ったが、残りの変化はＶａｌ377＞ＡｌａおよびＳｅｒ
415＞Ｇｌｙの変異となった。得られたクローンをｐＭ
Ａ１１０と称した。
【００６５】(ｅ)合成野生型大腸菌株の調製：野生型ph
oＡ遺伝子(ｐＭＡ１００)を基礎として用い、その後の
比活性の向上したアルカリホスファターゼをコードする
ＤＮＡ修飾を調製した。加えて、合成野生型生物からの
アルカリホスファターゼも、市販の大腸菌アルカリホス
ファターゼとの比較と同様、変異酵素を評価するのに有
用であった。合成野生型phoＡ遺伝子を調製するため、
ｐＭＡ１１０プラスミド中に存在する遺伝的変異を修復
する必要があった。実質的に実施例１(ａ)に記載のプロ
トコールに従って調製した合成オリゴヌクレオチドを用
い、変異配列を野生型配列で置換した。変異の位置に基
づいて、２４６塩基対に対応するＢglＩＩ／ＳphＩ断片
を置換する必要があった。
oＡ遺伝子(ｐＭＡ１００)を基礎として用い、その後の
比活性の向上したアルカリホスファターゼをコードする
ＤＮＡ修飾を調製した。加えて、合成野生型生物からの
アルカリホスファターゼも、市販の大腸菌アルカリホス
ファターゼとの比較と同様、変異酵素を評価するのに有
用であった。合成野生型phoＡ遺伝子を調製するため、
ｐＭＡ１１０プラスミド中に存在する遺伝的変異を修復
する必要があった。実質的に実施例１(ａ)に記載のプロ
トコールに従って調製した合成オリゴヌクレオチドを用
い、変異配列を野生型配列で置換した。変異の位置に基
づいて、２４６塩基対に対応するＢglＩＩ／ＳphＩ断片
を置換する必要があった。
【００６６】ｐＭＡ１１０プラスミド(約１０μｇ)を１
×培地塩緩衝液(１００μｌ；１００ｍＭ ＮａＣｌ、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５および１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2)中、３７℃にて１６時間、ＢglＩＩ(７５単
位)で消化した。消化が完了したことを試験するため、
アリコートを０.８％アガロースゲル上の電気泳動にか
けた。塩濃度を１５０ｍＭ ＮａＣｌに増加させ、上記
ＤＮＡを３７℃で１６時間、ＳphＩ(６０単位)でさらに
消化した。得られた３.２キロベースのプラスミド断片
を５％ポリアクリルアミドゲル(１／５０ビス−アクリ
ルアミド)上で精製し、実質的に実施例１(ａ)に記載の
方法に従ってＤＮＡを抽出した。
×培地塩緩衝液(１００μｌ；１００ｍＭ ＮａＣｌ、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５および１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2)中、３７℃にて１６時間、ＢglＩＩ(７５単
位)で消化した。消化が完了したことを試験するため、
アリコートを０.８％アガロースゲル上の電気泳動にか
けた。塩濃度を１５０ｍＭ ＮａＣｌに増加させ、上記
ＤＮＡを３７℃で１６時間、ＳphＩ(６０単位)でさらに
消化した。得られた３.２キロベースのプラスミド断片
を５％ポリアクリルアミドゲル(１／５０ビス−アクリ
ルアミド)上で精製し、実質的に実施例１(ａ)に記載の
方法に従ってＤＮＡを抽出した。
【００６７】切り出した変異ＢglＩＩ／ＳphＩ断片を、
ＢglＩＩ／ＳphＩ断片(２４７塩基対からなる)の天然配
列に対応する３つの合成オリゴヌクレオチド(それぞ
れ、約８０塩基の長さ)で置換した。Ｔ４ＤＮＡキナー
ゼ(３.０単位；ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、
ガイセルスバーグ、ＭＤ)を用い、約４ピコモルの各合
成オリゴヌクレオチドを１×ライゲーション緩衝液(１
５μｌ；６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０.４ｍＭ ＡＴＰ)中、３７℃で３０分間
キナーゼ処理した[リチャードソン(Ｒichardson)ら、Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.２、８１５(１９７１)(参照のた
め本明細書に引用する)]。７０℃で５分間インキュベー
トし４℃で１.５時間かけてゆっくりと冷却することに
より、相補的オリゴヌクレオチドをアニールした。つい
で、アニールした合成オリゴヌクレオチドを３.２キロ
ベースの精製合成プラスミドにライゲートした。ライゲ
ーション、形質転換およびインキュベーションは実質的
に上記方法に従ったが、得られた合成プラスミドはＭＺ
１３ｂ宿主細胞中にクローニングした。
ＢglＩＩ／ＳphＩ断片(２４７塩基対からなる)の天然配
列に対応する３つの合成オリゴヌクレオチド(それぞ
れ、約８０塩基の長さ)で置換した。Ｔ４ＤＮＡキナー
ゼ(３.０単位；ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、
ガイセルスバーグ、ＭＤ)を用い、約４ピコモルの各合
成オリゴヌクレオチドを１×ライゲーション緩衝液(１
５μｌ；６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０.４ｍＭ ＡＴＰ)中、３７℃で３０分間
キナーゼ処理した[リチャードソン(Ｒichardson)ら、Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.２、８１５(１９７１)(参照のた
め本明細書に引用する)]。７０℃で５分間インキュベー
トし４℃で１.５時間かけてゆっくりと冷却することに
より、相補的オリゴヌクレオチドをアニールした。つい
で、アニールした合成オリゴヌクレオチドを３.２キロ
ベースの精製合成プラスミドにライゲートした。ライゲ
ーション、形質転換およびインキュベーションは実質的
に上記方法に従ったが、得られた合成プラスミドはＭＺ
１３ｂ宿主細胞中にクローニングした。
【００６８】約２００の青色コロニーと１２０の白色コ
ロニーが得られた。４つの青色コロニーを選び、実質的
に上記方法に従ってミニプレプＤＮＡを調製した。置換
または修復したオリゴヌクレオチドに対応する領域を実
質的に上記方法に従ってサンガーのジデオキシ法により
シークエンシングした。シークエンシングしたクローン
はすべて野生型のphoＡ配列を有していた。天然および
変異アルカリホスファターゼから得られたコロニーの色
強度を比較すると、変異コロニーは天然コロニーに比べ
ると濃い青色であった。
ロニーが得られた。４つの青色コロニーを選び、実質的
に上記方法に従ってミニプレプＤＮＡを調製した。置換
または修復したオリゴヌクレオチドに対応する領域を実
質的に上記方法に従ってサンガーのジデオキシ法により
シークエンシングした。シークエンシングしたクローン
はすべて野生型のphoＡ配列を有していた。天然および
変異アルカリホスファターゼから得られたコロニーの色
強度を比較すると、変異コロニーは天然コロニーに比べ
ると濃い青色であった。
【００６９】実施例２ 変異株のスクリーニングのための天然phoＡの修飾発
現：天然のアルカリホスファターゼにより示される強い
色のため、比活性の増大したアルカリホスファターゼ変
異株を高感度でカラースクリーニングすることは困難で
あった。天然のアルカリホスファターゼから変異株を識
別するため、天然phoＡの発現を減少させる必要があっ
た(すなわち、薄い青色の天然コロニーを得る必要があ
った)。アルカリホスファターゼの発現レベルを減少さ
せることは、phoＡのシャイン−ダルガルノ配列(ＧＧＡ
ＧＡ)を縮重配列で置換し、ＢＣＩＰ基質を用いて青色
の微弱なコロニーを選択することにより行った。
現：天然のアルカリホスファターゼにより示される強い
色のため、比活性の増大したアルカリホスファターゼ変
異株を高感度でカラースクリーニングすることは困難で
あった。天然のアルカリホスファターゼから変異株を識
別するため、天然phoＡの発現を減少させる必要があっ
た(すなわち、薄い青色の天然コロニーを得る必要があ
った)。アルカリホスファターゼの発現レベルを減少さ
せることは、phoＡのシャイン−ダルガルノ配列(ＧＧＡ
ＧＡ)を縮重配列で置換し、ＢＣＩＰ基質を用いて青色
の微弱なコロニーを選択することにより行った。
【００７０】天然リボソーム結合部位を除去するため、
ｐＭＡ１００(１５μｇ、実施例１(ｅ)から)を１×培地
塩緩衝液中、３７℃で１６時間、ＢamＨＩ(７５単位)で
消化した。塩濃度を１５０ｍＭ ＮａＣｌに増加させ、
このＤＮＡを３７℃で１６時間、ＳalＩ(７５単位)でさ
らに消化した。リボソーム結合部位は、実施例１に記載
したように、適当な位置に縮重配列を含むオリゴヌクレ
オチドを用いることにより架橋突然変異誘発により置換
された。種々のレベルのアルカリホスファターゼ比活性
を発現する約１,０００のクローンが得られた。
ｐＭＡ１００(１５μｇ、実施例１(ｅ)から)を１×培地
塩緩衝液中、３７℃で１６時間、ＢamＨＩ(７５単位)で
消化した。塩濃度を１５０ｍＭ ＮａＣｌに増加させ、
このＤＮＡを３７℃で１６時間、ＳalＩ(７５単位)でさ
らに消化した。リボソーム結合部位は、実施例１に記載
したように、適当な位置に縮重配列を含むオリゴヌクレ
オチドを用いることにより架橋突然変異誘発により置換
された。種々のレベルのアルカリホスファターゼ比活性
を発現する約１,０００のクローンが得られた。
【００７１】非常に薄い青色から中位の青色までの３つ
のコロニーを単離し、実質的に実施例１に記載のプロト
コールに従ってプラスミドＤＮＡを調製した。各試料で
得られた変異リボソーム結合部位の構造を決定するた
め、実質的に実施例１に記載のプロトコールに従ってサ
ンガーのジデオキシシークエンシング法を再び用いた。
このシークエンシングの結果は、シークエンシングした
形質転換体は(１)リボソーム結合部位が完全に欠失して
いるか、または(２)配列ＡＴＧＧＣまたはＣＡＡＴＡを
含むリボソーム結合部位を有しているか、いずれかであ
ることを示していた。ＡＴＧＧＣリボソーム結合部位に
対応する試料は最も薄い青色を示し、ｐＭＡ１０１と称
した。ついで、比活性を増大させるためさらにphoＡ遺
伝子の突然変異誘発を行い、リボソーム結合部位の変異
した天然phoＡを含むｐＭＡ１０１合成プラスミドを用
いてアッセイした。
のコロニーを単離し、実質的に実施例１に記載のプロト
コールに従ってプラスミドＤＮＡを調製した。各試料で
得られた変異リボソーム結合部位の構造を決定するた
め、実質的に実施例１に記載のプロトコールに従ってサ
ンガーのジデオキシシークエンシング法を再び用いた。
このシークエンシングの結果は、シークエンシングした
形質転換体は(１)リボソーム結合部位が完全に欠失して
いるか、または(２)配列ＡＴＧＧＣまたはＣＡＡＴＡを
含むリボソーム結合部位を有しているか、いずれかであ
ることを示していた。ＡＴＧＧＣリボソーム結合部位に
対応する試料は最も薄い青色を示し、ｐＭＡ１０１と称
した。ついで、比活性を増大させるためさらにphoＡ遺
伝子の突然変異誘発を行い、リボソーム結合部位の変異
した天然phoＡを含むｐＭＡ１０１合成プラスミドを用
いてアッセイした。
【００７２】実施例３ 天然アルカリホスファターゼの突然変異誘発：アルカリ
ホスファターゼの比活性を増大させるため、酵素の活性
部位、または触媒残基Ｓｅｒ102から約１０Å〜約２０
Å以内の領域に突然変異誘発を引き起こした。突然変異
誘発の目的とするアミノ酸は、Ｖａｌ99、Ｔｈｒ100、
Ａｓｐ101、Ａｌａ103、Ｔｈｒ107およびＬｙｓ328であ
った。アミノ酸Ｖａｌ99、Ｔｈｒ100、Ａｓｐ101、Ａｌ
ａ103およびＴｈｒ107は触媒残基のＳｅｒ102に近いた
め、とりわけ突然変異誘発の最重要目的であった。Ｌｙ
ｓ328も目的とされ、これは正に荷電していて、酵素の
活性部位の直ぐ近傍にある。
ホスファターゼの比活性を増大させるため、酵素の活性
部位、または触媒残基Ｓｅｒ102から約１０Å〜約２０
Å以内の領域に突然変異誘発を引き起こした。突然変異
誘発の目的とするアミノ酸は、Ｖａｌ99、Ｔｈｒ100、
Ａｓｐ101、Ａｌａ103、Ｔｈｒ107およびＬｙｓ328であ
った。アミノ酸Ｖａｌ99、Ｔｈｒ100、Ａｓｐ101、Ａｌ
ａ103およびＴｈｒ107は触媒残基のＳｅｒ102に近いた
め、とりわけ突然変異誘発の最重要目的であった。Ｌｙ
ｓ328も目的とされ、これは正に荷電していて、酵素の
活性部位の直ぐ近傍にある。
【００７３】Ｖａｌ99、Ｔｈｒ100およびＡｓｐ101アミ
ノ酸の突然変異誘発は、ｐＭＡ１０１のＳnaＢＩ制限部
位における架橋突然変異誘発により行い、Ｌｙｓ328の
突然変異誘発はＣlaＩ制限部位において行った。Ａｌａ
193およびＴｈｒ107については、ｐＭＡ１０１プラスミ
ドをＳnaＢＩおよびＥcoＲＶで消化した後に架橋突然変
異誘発を行った。合成オリゴヌクレオチドは実施例１に
記載のようにして調製したが、各合成オリゴヌクレオチ
ドは変異させようとするアミノ酸の縮重配列を含んでい
た。
ノ酸の突然変異誘発は、ｐＭＡ１０１のＳnaＢＩ制限部
位における架橋突然変異誘発により行い、Ｌｙｓ328の
突然変異誘発はＣlaＩ制限部位において行った。Ａｌａ
193およびＴｈｒ107については、ｐＭＡ１０１プラスミ
ドをＳnaＢＩおよびＥcoＲＶで消化した後に架橋突然変
異誘発を行った。合成オリゴヌクレオチドは実施例１に
記載のようにして調製したが、各合成オリゴヌクレオチ
ドは変異させようとするアミノ酸の縮重配列を含んでい
た。
【００７４】架橋突然変異誘発の標準法を５倍増大させ
たスケールで行い、変異させた各残基に対してすべての
可能なアミノ酸置換を含むクローンのライブラリーを得
た。ｐＭＡ１０１ベクター(２５０ｎｇ、実施例２から)
をＳnaＢＩか(９９位、１００位および１０１位の変異
のため)、ＣlaＩか(３２８位の変異のため)、またはＳn
aＢＩおよびＥcoＲＶ(１０３位および１０７位の変異の
ため)で完全に消化した。消化したベクターおよび合成
オリゴヌクレオチド(１００ピコモル)を混合し、１００
℃で３分間加熱した。試料を５分間冷却し、コンピテン
トなＪＭ８３細胞(５００μｌ)に加えた。形質転換混合
物を氷上で５分間インキュベートし、ついで３７℃で３
分間熱ショックを与えた。ＬＢ培地(２.０ｍｌ)を各試
料に加え、試料を３７℃で６０分間インキュベートし
た。細胞を遠心分離によりペレット化し、ＬＢ培地(１
００μｌ)中に再懸濁し、ＬＢプレート(１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンおよび１.０μｇ／ｍｌのＢＣＩＰを
含有)上に広げた。プレートを３７℃にて１６時間イン
キュベートした。リボソーム結合部位の変異によりpho
Ａ発現が減少しているため、プレートを室温にてさらに
６時間インキュベートした。バックグラウンドと比較し
て青色の濃いコロニーを、比活性の増大したphoＡ変異
株と評価した。
たスケールで行い、変異させた各残基に対してすべての
可能なアミノ酸置換を含むクローンのライブラリーを得
た。ｐＭＡ１０１ベクター(２５０ｎｇ、実施例２から)
をＳnaＢＩか(９９位、１００位および１０１位の変異
のため)、ＣlaＩか(３２８位の変異のため)、またはＳn
aＢＩおよびＥcoＲＶ(１０３位および１０７位の変異の
ため)で完全に消化した。消化したベクターおよび合成
オリゴヌクレオチド(１００ピコモル)を混合し、１００
℃で３分間加熱した。試料を５分間冷却し、コンピテン
トなＪＭ８３細胞(５００μｌ)に加えた。形質転換混合
物を氷上で５分間インキュベートし、ついで３７℃で３
分間熱ショックを与えた。ＬＢ培地(２.０ｍｌ)を各試
料に加え、試料を３７℃で６０分間インキュベートし
た。細胞を遠心分離によりペレット化し、ＬＢ培地(１
００μｌ)中に再懸濁し、ＬＢプレート(１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンおよび１.０μｇ／ｍｌのＢＣＩＰを
含有)上に広げた。プレートを３７℃にて１６時間イン
キュベートした。リボソーム結合部位の変異によりpho
Ａ発現が減少しているため、プレートを室温にてさらに
６時間インキュベートした。バックグラウンドと比較し
て青色の濃いコロニーを、比活性の増大したphoＡ変異
株と評価した。
【００７５】青色のコロニーを選択し、ミニプレプＤＮ
Ａを実質的に実施例１に記載した方法に従ってサンガー
のジデオキシシークエンシングのために調製した。変異
の結果を第３表に示す。天然アルカリホスファターゼと
比較して変異株の比活性に関する一層正確なデータを得
るため、各試料から精製タンパク質を得ることも必要で
あった。
Ａを実質的に実施例１に記載した方法に従ってサンガー
のジデオキシシークエンシングのために調製した。変異
の結果を第３表に示す。天然アルカリホスファターゼと
比較して変異株の比活性に関する一層正確なデータを得
るため、各試料から精製タンパク質を得ることも必要で
あった。
【００７６】第３表 (突然変異誘発結果)変異させたアミノ酸 コロニー数 コドン ｐＭＡ１１４ ２６０濃青色 ＧＣＡ：ＧＣＴ Ｖａｌ99＞Ａｌａ ３８０薄青色 ３６８０白色 ｐＭＡ１１１および１１２ ２３濃青色 ＧＴＡ／ＡＴＣ Ｔｈｒ100＞Ｖａｌ ３１６薄青色 Ｔｈｒ100＞Ｉｌｅ ７６白色 ｐＭＡ１１５ １３０濃青色 ＴＣＡ；ＴＣＣ Ａｓｐ101＞Ｓｅｒ ２６０薄青色 ４２００白色 ｐＭＡ１１３ １１濃青色 ＣＧＡ；ＡＧＡ； Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ ３２０薄青色 ＣＧＴ １６白色 ｐＭＡ１１６ ２７０濃青色 ＧＣＴ Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ ４９０薄青色 Ｖａｌ99＞Ａｌａ １３４０白色 ｐＭＡ１１７および１１８ ２３濃青色 ＧＡＴ；ＴＧＴ Ａｌａ103＞Ａｓｐ １４１薄青色 Ａｌａ103＞Ｃｙｓ １８０白色 ｐＭＡ１１９ １５濃青色 ＧＴＧ Ｔｈｒ107＞Ｖａｌ ８７薄青色 １６６白色
【００７７】第３表は、増大した比活性を有する変異ア
ルカリホスファターゼ酵素が得られたアミノ酸変異の形
質転換効率を示す。濃青色のコロニーは比活性の増大し
たアルカリホスファターゼ変異体を示し、薄青色のコロ
ニーは天然アルカリホスファターゼに匹敵する比活性を
有する変異体であり、白色のコロニーは比活性の減少し
た変異体であった。ｐＭＡ１１３(Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ)
が高い比活性を有していたので、引き続き突然変異誘発
に用いた。たとえば、ｐＭＡ１１６は、ｐＭＡ１１３プ
ラスミドにおいてさらにＶａｌ99をＡｌａに変えること
により調製した。各アミノ酸置換について得られたコド
ンを、サンガーのジデオキシシークエンシング法により
決定した。
ルカリホスファターゼ酵素が得られたアミノ酸変異の形
質転換効率を示す。濃青色のコロニーは比活性の増大し
たアルカリホスファターゼ変異体を示し、薄青色のコロ
ニーは天然アルカリホスファターゼに匹敵する比活性を
有する変異体であり、白色のコロニーは比活性の減少し
た変異体であった。ｐＭＡ１１３(Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ)
が高い比活性を有していたので、引き続き突然変異誘発
に用いた。たとえば、ｐＭＡ１１６は、ｐＭＡ１１３プ
ラスミドにおいてさらにＶａｌ99をＡｌａに変えること
により調製した。各アミノ酸置換について得られたコド
ンを、サンガーのジデオキシシークエンシング法により
決定した。
【００７８】実施例４ アルカリホスファターゼの精製：天然および変異アルカ
リホスファターゼの酵素速度論を決定するため、充分な
量の酵素を得なければならなかった。各試料について２
ｌシェーカーフラスコ発酵法を行った。スターター培養
液は、２０ｍＭグルコースを含有するＬＢ培地／アンピ
シリン(４０ｍｌ)中での単一コロニーの一夜培養液であ
った。グルコースを添加すると生物のアルカリホスファ
ターゼ発現が抑制された[アルカリホスファターゼの発
現は本発明の発現系ではlacプロモーターにより制御さ
れている[マガサニク(Ｍagasanik Ｂ)、ザ・ラクトー
ス・オペロン(Ｔhe Ｌactose Ｏperon)、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリ
ングハーバー、ＮＹ、１８９〜２１９、１９７０]]。激
しく震盪しながら、培養液をフラスコ(２５０ｍｌ)中、
３７℃で一夜増殖させた。培養液を１０分間遠心分離
(４,０００×ｇ)にかけ、上澄み液を捨て、ペレットを
ＬＢ培地／アンピシリン(４０ｍｌ)中に再懸濁した。Ｌ
Ｂ培地／アンピシリン(２ｌ)を入れた６ｌ容フラスコに
上記一夜培養液を接種し、激しく震盪しながら３７℃で
約６時間インキュベートした。
リホスファターゼの酵素速度論を決定するため、充分な
量の酵素を得なければならなかった。各試料について２
ｌシェーカーフラスコ発酵法を行った。スターター培養
液は、２０ｍＭグルコースを含有するＬＢ培地／アンピ
シリン(４０ｍｌ)中での単一コロニーの一夜培養液であ
った。グルコースを添加すると生物のアルカリホスファ
ターゼ発現が抑制された[アルカリホスファターゼの発
現は本発明の発現系ではlacプロモーターにより制御さ
れている[マガサニク(Ｍagasanik Ｂ)、ザ・ラクトー
ス・オペロン(Ｔhe Ｌactose Ｏperon)、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリ
ングハーバー、ＮＹ、１８９〜２１９、１９７０]]。激
しく震盪しながら、培養液をフラスコ(２５０ｍｌ)中、
３７℃で一夜増殖させた。培養液を１０分間遠心分離
(４,０００×ｇ)にかけ、上澄み液を捨て、ペレットを
ＬＢ培地／アンピシリン(４０ｍｌ)中に再懸濁した。Ｌ
Ｂ培地／アンピシリン(２ｌ)を入れた６ｌ容フラスコに
上記一夜培養液を接種し、激しく震盪しながら３７℃で
約６時間インキュベートした。
【００７９】アルカリホスファターゼの精製を下記方法
で行った。６００ｎｍで１.３〜１.４の光学密度に達し
てから、形質転換細胞を遠心分離(４８００ｒｐｍで２
０分間、４℃)により回収した。アルカリホスファター
ゼを抽出するため、２ｌの培養ブロスからの細胞を冷
０.１５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６.８(８０ｍ
ｌ；０.９％ＮａＣｌおよび６ｍｇ／ｍｌのポリミキシ
ンＢ含有)中に懸濁した[エバンス(Ｅvans)ら、the Ｊo
urnal of Ｉnfectious Ｄiseases、１３３、Ｓ９７
〜Ｓ１０２(１９７６)(参照のため本明細書に引用す
る)]。３７℃の水浴中で７〜１０分間インキュベートし
た後、細胞を遠心分離(８,０００×ｇで５分間、４℃)
により除去した。
で行った。６００ｎｍで１.３〜１.４の光学密度に達し
てから、形質転換細胞を遠心分離(４８００ｒｐｍで２
０分間、４℃)により回収した。アルカリホスファター
ゼを抽出するため、２ｌの培養ブロスからの細胞を冷
０.１５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６.８(８０ｍ
ｌ；０.９％ＮａＣｌおよび６ｍｇ／ｍｌのポリミキシ
ンＢ含有)中に懸濁した[エバンス(Ｅvans)ら、the Ｊo
urnal of Ｉnfectious Ｄiseases、１３３、Ｓ９７
〜Ｓ１０２(１９７６)(参照のため本明細書に引用す
る)]。３７℃の水浴中で７〜１０分間インキュベートし
た後、細胞を遠心分離(８,０００×ｇで５分間、４℃)
により除去した。
【００８０】上記ポリミキシンＢ抽出物に４℃にて固体
の硫酸アンモニウムをゆっくりと加えて８５％飽和にも
っていき、ついで４℃で２４時間ゆっくりと撹拌した。
得られた沈殿を遠心分離(８,０００×ｇで５分間、４
℃)により回収し、０.０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐ
Ｈ８.０、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)中に再懸濁した。こ
の試料の透析を０.０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ
８.０、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)(８〜１２ｌ)に対して
４℃で行った。ついで、限外濾過セル(アミコン、モデ
ル８０５０、デンバー、ＭＡ)を用いて試料を５〜１０
倍に濃縮した。
の硫酸アンモニウムをゆっくりと加えて８５％飽和にも
っていき、ついで４℃で２４時間ゆっくりと撹拌した。
得られた沈殿を遠心分離(８,０００×ｇで５分間、４
℃)により回収し、０.０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐ
Ｈ８.０、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)中に再懸濁した。こ
の試料の透析を０.０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ
８.０、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)(８〜１２ｌ)に対して
４℃で行った。ついで、限外濾過セル(アミコン、モデ
ル８０５０、デンバー、ＭＡ)を用いて試料を５〜１０
倍に濃縮した。
【００８１】モノＰ ＨＲ５／５カラムおよびポリバッ
ファー７４および９６(シグマ・ケミカル・カンパニ
ー、セントルイス、ＭＯ)を用い迅速タンパク液体クロ
マトグラフシステム(ファルマシア、ピスカタウエイ、
ＮＪ)上でアルカリホスファターゼのクロモフォーカス
クロマトグラフィーを行った。カラムを０.０２５Ｍビ
ス−ＣＨ3ＣＯＯＨ(ｐＨ６.９、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含
有)で平衡化した。ポリバッファー−ＣＨ3ＣＯＯＨ溶液
(ｐＨ５.５；６％[v/v]ポリバッファー９６、６％[v/v]
ポリバッファー７４および１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)でタ
ンパク質を溶離した。これらの条件によりｐＨ６.５〜
５.５の直線ｐＨ勾配が得られ、活性タンパク質はｐＨ
６.３〜６.１で溶離した。２０ｍＭトリス(ｐＨ８.０、
１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)中で平衡化したセファデックス
Ｇ−７５上でのゲル濾過クロマトグラフィーにより、ポ
リバッファーを試料から除去した。得られた酵素試料
を、アミコンセントリコン−３０マイクロコンセントレ
ーターを用いて３〜６倍に濃縮した。
ファー７４および９６(シグマ・ケミカル・カンパニ
ー、セントルイス、ＭＯ)を用い迅速タンパク液体クロ
マトグラフシステム(ファルマシア、ピスカタウエイ、
ＮＪ)上でアルカリホスファターゼのクロモフォーカス
クロマトグラフィーを行った。カラムを０.０２５Ｍビ
ス−ＣＨ3ＣＯＯＨ(ｐＨ６.９、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含
有)で平衡化した。ポリバッファー−ＣＨ3ＣＯＯＨ溶液
(ｐＨ５.５；６％[v/v]ポリバッファー９６、６％[v/v]
ポリバッファー７４および１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)でタ
ンパク質を溶離した。これらの条件によりｐＨ６.５〜
５.５の直線ｐＨ勾配が得られ、活性タンパク質はｐＨ
６.３〜６.１で溶離した。２０ｍＭトリス(ｐＨ８.０、
１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)中で平衡化したセファデックス
Ｇ−７５上でのゲル濾過クロマトグラフィーにより、ポ
リバッファーを試料から除去した。得られた酵素試料
を、アミコンセントリコン−３０マイクロコンセントレ
ーターを用いて３〜６倍に濃縮した。
【００８２】実施例５ 精製アルカリホスファターゼの分析：精製タンパク質の
特徴付けには、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動[ラムリ(Ｌaemmli,Ｕ.Ｋ.)、Ｎatur
e、２７７、６８０(１９７０)(参照のため本明細書に引
用する)]が含まれていた。電気泳動により単一の主要な
バンドが示され、これは全体の染色タンパク質の９８％
以上を占めるものであり、４６,０００ダルトン(アルカ
リホスファターゼのモノマーに予測されるサイズ)の分
子量に対応した。これらの条件下での各遺伝子操作した
アルカリホスファターゼの電気泳動移動度は、市販の大
腸菌アルカリホスファターゼ(シグマ)のものと同一であ
った。
特徴付けには、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動[ラムリ(Ｌaemmli,Ｕ.Ｋ.)、Ｎatur
e、２７７、６８０(１９７０)(参照のため本明細書に引
用する)]が含まれていた。電気泳動により単一の主要な
バンドが示され、これは全体の染色タンパク質の９８％
以上を占めるものであり、４６,０００ダルトン(アルカ
リホスファターゼのモノマーに予測されるサイズ)の分
子量に対応した。これらの条件下での各遺伝子操作した
アルカリホスファターゼの電気泳動移動度は、市販の大
腸菌アルカリホスファターゼ(シグマ)のものと同一であ
った。
【００８３】得られた変異酵素の速度定数(Ｖmaxおよび
Ｋm)の測定を、酵素基質ｐＮＰＰ(シグマ)および４−メ
チルウンベリフェリルホスフェート(４−ＭＵＰ；ベー
リンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ)を
用い、１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2含有)中、２５℃で行った。ヒューレット−パ
ッカード(Ｈewlett−Ｐackard)９１５３ＡＵＶ分光光度
計を用い、４１０ｎｍ(ε＝１.６２×１０4Ｍ-1ｃｍ-1)
での吸光度の変化を追跡することによりｐＮＰＰ基質の
ｐ−ニトロフェノールへの変換をモニターした。４−Ｍ
ＵＰ基質からのメチルウンベリフェロンの放出を蛍光計
でモニターした(λ励起＝３４０ｎｍ；λ放射＝４６５
ｎｍ；ε＝５.９×１０9Ｍ-1ｃｍ-1)。初期速度は、最
初の５〜１０％の反応(ｒ＞０.９９７)からグラフで決
定した。６〜８点のラインウイバー−バークプロットか
らｋcatおよびＫm値を得た。
Ｋm)の測定を、酵素基質ｐＮＰＰ(シグマ)および４−メ
チルウンベリフェリルホスフェート(４−ＭＵＰ；ベー
リンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ)を
用い、１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2含有)中、２５℃で行った。ヒューレット−パ
ッカード(Ｈewlett−Ｐackard)９１５３ＡＵＶ分光光度
計を用い、４１０ｎｍ(ε＝１.６２×１０4Ｍ-1ｃｍ-1)
での吸光度の変化を追跡することによりｐＮＰＰ基質の
ｐ−ニトロフェノールへの変換をモニターした。４−Ｍ
ＵＰ基質からのメチルウンベリフェロンの放出を蛍光計
でモニターした(λ励起＝３４０ｎｍ；λ放射＝４６５
ｎｍ；ε＝５.９×１０9Ｍ-1ｃｍ-1)。初期速度は、最
初の５〜１０％の反応(ｒ＞０.９９７)からグラフで決
定した。６〜８点のラインウイバー−バークプロットか
らｋcatおよびＫm値を得た。
【００８４】各酵素から得られた結果を第４表にまとめ
て示す。基質としてｐＮＰＰおよびＭＵＰを用い、すべ
ての変異酵素は天然のアルカリホスファターゼよりも高
い比活性を有していた。ｐＮＰＰを用いた決定では、酵
素比活性の増加は１.６〜３.９倍上昇の範囲であった。
Ｋm値は変異プラスミドｐＭＡ１１３により産生された
酵素で最も劇的に上昇したが、残りの酵素については相
対的に変化がないかまたはわずかに上昇したに止まっ
た。それゆえ、これら変異株は、Ｋmにおいて有益な変
化が認められないにしても、増大した比活性を有し、許
容し得るものである。
て示す。基質としてｐＮＰＰおよびＭＵＰを用い、すべ
ての変異酵素は天然のアルカリホスファターゼよりも高
い比活性を有していた。ｐＮＰＰを用いた決定では、酵
素比活性の増加は１.６〜３.９倍上昇の範囲であった。
Ｋm値は変異プラスミドｐＭＡ１１３により産生された
酵素で最も劇的に上昇したが、残りの酵素については相
対的に変化がないかまたはわずかに上昇したに止まっ
た。それゆえ、これら変異株は、Ｋmにおいて有益な変
化が認められないにしても、増大した比活性を有し、許
容し得るものである。
【００８５】第４表 (変異酵素の速度定数) ｄＮＰＰ基質 ４−ＭＵＰ基質 アルカリホスファターゼ Ｖmax(μモル Ｋm Ｖmax(μモル Ｋm ｍｇ-1分-1) (μＭ) ｍｇ-1分-1) (μＭ) ｐＭＡ１００ ５６ ３０.１ １０６ ９.３ 野生型 ｐＭＡ１１０ ９０ ２３ １８２ １４.４ Ｖａｌ377＞Ａｌａ Ｓｅｒ415＞Ｇｌｙ ｐＭＡ１１１ １２３ １９.８ １９０ １０.１ Ｔｈｒ100＞Ｖａｌ ｐＭＡ１１２ １３３ ２０.２ ２２９ １０.２ Ｔｈｒ100＞Ｉｌｅ ｐＭＡ１１３ ２２０ ９４.４ ２１７ ４７.７ Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ
【００８６】酵素の熱安定性を下記方法で測定した。各
アルカリホスファターゼの可逆的熱不活化の経時変化の
測定を、酵素溶液(２０μｇ／ｍｌ、加熱温度の０.０２
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５中で調製、１ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2を含有)を定温加熱ブロック中でインキュベート
し、試料を定期的に取り出して２５℃でアッセイするこ
とにより行った。一次速度定数および可逆的熱不活化の
半減期を半対数方眼中での直線回帰により測定し、すべ
ての細胞で少なくとも０.９７の相関係数が得られた。
８５℃およびｐＨ７.５での幾つかのアルカリホスファ
ターゼの可逆的熱不活化の経時変化の例を第５表に示
す。
アルカリホスファターゼの可逆的熱不活化の経時変化の
測定を、酵素溶液(２０μｇ／ｍｌ、加熱温度の０.０２
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５中で調製、１ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2を含有)を定温加熱ブロック中でインキュベート
し、試料を定期的に取り出して２５℃でアッセイするこ
とにより行った。一次速度定数および可逆的熱不活化の
半減期を半対数方眼中での直線回帰により測定し、すべ
ての細胞で少なくとも０.９７の相関係数が得られた。
８５℃およびｐＨ７.５での幾つかのアルカリホスファ
ターゼの可逆的熱不活化の経時変化の例を第５表に示
す。
【００８７】第５表 (可逆的熱不活化の経時変化) 時間(分) 残留活性(％) ｐＭＡ１００ ｐＭＡ１１１ ｐＭＡ１１２ ０ １００ １００ １００ ３ １０２ ９１ ７８ ６ １０２ ８２ ６０ ９ ９６ ７６ ５３ １２ ９７ ６９ ４４ １５ ９６ ６３ ３９
【００８８】各変異酵素の同様の研究結果を第６表に示
す。変異酵素はすべて、天然のアルカリホスファターゼ
に比べて速い速度で可逆的熱不活化を引き起こした。し
かしながら、変異酵素の熱安定性は、ウシ腸管アルカリ
ホスファターゼ(同様のアッセイ条件下で７０℃のみ６
分間の半減期を有する)の熱安定性よりも優れていた。
す。変異酵素はすべて、天然のアルカリホスファターゼ
に比べて速い速度で可逆的熱不活化を引き起こした。し
かしながら、変異酵素の熱安定性は、ウシ腸管アルカリ
ホスファターゼ(同様のアッセイ条件下で７０℃のみ６
分間の半減期を有する)の熱安定性よりも優れていた。
【００８９】第６表 (変異酵素の熱安定性)アルカリホスファターゼ 温度(℃) 速度(分-1) 半減期(分) ｐＭＡ１００ ９５ ０.１２６ ５.５ 野生型 ｐＭＡ１１０ ８０ ０.１００ ６.９ Ｖａｌ377＞Ａｌａ Ｓｅｒ415＞Ｇｌｙ ｐＭＡ１１１ ８５ ０.０３１ ２２.６ Ｔｈｒ100＞Ｖａｌ ｐＭＡ１１２ ８５ ０.０６２ １１.１ Ｔｈｒ100＞Ｉｌｅ ｐＭＡ１１３ ８５ ０.０６４ １０.８ Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ ｐＭＡ１１４ ８０ ０.０４０ １７.３ Ｖａｌ99＞Ａｌａ ｐＭＡ１１５ ８０ ０.０５１ １３.６ Ａｓｐ101＞Ｓｅｒ ｐＭＡ１１６ ７５ ０.１３８ ５.０ Ｌｙｓ328＞Ａｒｇ Ｖａｌ99＞Ａｌａ
【００９０】実施例６ アルカリホスファターゼの速度定数に及ぼすｐＨの影
響：変異酵素ｐＭＡ１１５(Ａｓｐ101＞Ｓｅｒ)および
ウシ腸管アルカリホスファターゼ(ベーリンガー・マン
ハイム、インディアナポリス、ＩＮ)の両方について、
速度定数(ＫmおよびＶmax)に及ぼすｐＨの影響を測定し
た。測定は４−ＭＵＰを基質として用い、２５℃で行っ
た。ヒューレット−パッカード９１５３Ａ ＵＶ分光光
度計を用い３６０ｎｍでの吸光度の増加(吸光係数はメ
チルウンベリフェロンを用いて実験的に決定し、第７表
に示した)を追跡することにより、基質からのメチルウ
ンベリフェロンの放出をモニターした。５０ｍＭトリス
(ｐＨ８〜９.５)または５０ｍＭジチオエタノールアミ
ン(シグマ)(ｐＨ９〜１１)およびＮａＣｌ(シグマ)を含
有する低イオン強度緩衝液(Ｉ＝２００)を用いた。Ｖ
maxおよびＫm値は、６〜７点のラインウイーバー−バー
クプロットから得た。Ｖmaxからｋcatへの変換は、ウシ
腸管アルカリホスファターゼについては１５０,０００
ダルトンの分子量、ｐＭＡ１１５アルカリホスファター
ゼについては９４,０００ダルトンの分子量をそれぞれ
用い、両酵素についてダイマー当たり２つの活性部位を
用いて行った。その結果を第７表に示す。
響：変異酵素ｐＭＡ１１５(Ａｓｐ101＞Ｓｅｒ)および
ウシ腸管アルカリホスファターゼ(ベーリンガー・マン
ハイム、インディアナポリス、ＩＮ)の両方について、
速度定数(ＫmおよびＶmax)に及ぼすｐＨの影響を測定し
た。測定は４−ＭＵＰを基質として用い、２５℃で行っ
た。ヒューレット−パッカード９１５３Ａ ＵＶ分光光
度計を用い３６０ｎｍでの吸光度の増加(吸光係数はメ
チルウンベリフェロンを用いて実験的に決定し、第７表
に示した)を追跡することにより、基質からのメチルウ
ンベリフェロンの放出をモニターした。５０ｍＭトリス
(ｐＨ８〜９.５)または５０ｍＭジチオエタノールアミ
ン(シグマ)(ｐＨ９〜１１)およびＮａＣｌ(シグマ)を含
有する低イオン強度緩衝液(Ｉ＝２００)を用いた。Ｖ
maxおよびＫm値は、６〜７点のラインウイーバー−バー
クプロットから得た。Ｖmaxからｋcatへの変換は、ウシ
腸管アルカリホスファターゼについては１５０,０００
ダルトンの分子量、ｐＭＡ１１５アルカリホスファター
ゼについては９４,０００ダルトンの分子量をそれぞれ
用い、両酵素についてダイマー当たり２つの活性部位を
用いて行った。その結果を第７表に示す。
【００９１】第７表(基質として４−ＭＵＰを用いたア
ルカリホスファターゼの速度定数に及ぼすｐＨの影響) アルカリホスファターゼ ｐＭＡ１１５ ウシ腸管 ｐＨ 吸光係数 Ｋm Ｖmax ｋcat Ｋm Ｖmax ｋcat (M-1cm-1) (μM) (μM/分) (秒-1) (μM) (μM/分) (秒-1) ８.０ 1.09×104 3.1 11.4 30 7.9 48.4 303 ８.５ 1.4×104 6.7 26.5 69 18.2 58.7 367 ９.０ 1.62×104 50.3 66.2 173 43.9 91.9 574 ９.５ 1.65×104 410 176 459 111 140 875 １０.０ 1.67×104 1660 262 684 348 181 1130 １０.５ 1.68×104 3520 284 741 4762 632 3950 １１.０ 1.69×104 3630 239 623 16600 1116 3980
ルカリホスファターゼの速度定数に及ぼすｐＨの影響) アルカリホスファターゼ ｐＭＡ１１５ ウシ腸管 ｐＨ 吸光係数 Ｋm Ｖmax ｋcat Ｋm Ｖmax ｋcat (M-1cm-1) (μM) (μM/分) (秒-1) (μM) (μM/分) (秒-1) ８.０ 1.09×104 3.1 11.4 30 7.9 48.4 303 ８.５ 1.4×104 6.7 26.5 69 18.2 58.7 367 ９.０ 1.62×104 50.3 66.2 173 43.9 91.9 574 ９.５ 1.65×104 410 176 459 111 140 875 １０.０ 1.67×104 1660 262 684 348 181 1130 １０.５ 1.68×104 3520 284 741 4762 632 3950 １１.０ 1.69×104 3630 239 623 16600 1116 3980
【００９２】両方の酵素においてＫm値およびｋcat値
は、調べたｐＨ範囲のほぼ全ｐＨ範囲でｐＨとともに増
加した。変異大腸菌アルカリホスファターゼとウシ腸管
アルカリホスファターゼの間でｋcatの差異が最も小さ
いのは、ｐＨ１０.０の場合である。このｐＨではウシ
腸管酵素は変異大腸菌酵素よりもわずかに１.６５倍速
いにすぎない。ｐＨ１０.０でＫm値が増大しても、本発
明の新規酵素はアッセイの標識として使用するのに適し
ている。ｐＮＰＰ基質を用いて同様の実験を本発明の酵
素および天然大腸菌アルカリホスファターゼ(ｐＭＡ１
００)について行った。ｐＮＰＰ基質のｐ−ニトロフェ
ノールへの変換を、ヒューレット−パッカード９１５３
Ａ ＵＶ分光光度計を用い４１０ｎｍでの吸光度の変化
(ε＝１.６２×１０4Ｍ-1ｃｍ-1)を追跡することにより
モニターした。これら酵素のｋcat値に及ぼすｐＨの影
響を第８表に示す。本発明の酵素ｐＭＡ１１５のｋcat
値は、ｐＨ１０.０において野生型大腸菌アルカリホス
ファターゼに比べておよそ３６倍高かった。
は、調べたｐＨ範囲のほぼ全ｐＨ範囲でｐＨとともに増
加した。変異大腸菌アルカリホスファターゼとウシ腸管
アルカリホスファターゼの間でｋcatの差異が最も小さ
いのは、ｐＨ１０.０の場合である。このｐＨではウシ
腸管酵素は変異大腸菌酵素よりもわずかに１.６５倍速
いにすぎない。ｐＨ１０.０でＫm値が増大しても、本発
明の新規酵素はアッセイの標識として使用するのに適し
ている。ｐＮＰＰ基質を用いて同様の実験を本発明の酵
素および天然大腸菌アルカリホスファターゼ(ｐＭＡ１
００)について行った。ｐＮＰＰ基質のｐ−ニトロフェ
ノールへの変換を、ヒューレット−パッカード９１５３
Ａ ＵＶ分光光度計を用い４１０ｎｍでの吸光度の変化
(ε＝１.６２×１０4Ｍ-1ｃｍ-1)を追跡することにより
モニターした。これら酵素のｋcat値に及ぼすｐＨの影
響を第８表に示す。本発明の酵素ｐＭＡ１１５のｋcat
値は、ｐＨ１０.０において野生型大腸菌アルカリホス
ファターゼに比べておよそ３６倍高かった。
【００９３】第８表(基質としてｐＮＰＰを用いたアル
カリホスファターゼのｋcat値に及ぼすｐＨの影響) アルカリホスファターゼのｋcat ｐＨ ｐＭＡ１００ ｐＭＡ１１５ ウシ腸管 ８.０ ８ ３５ ３４５ ８.５ １０ ７８ ４８０ ９.０ １２ １５４ ７６０ ９.５ １３ ２５５ １００４ １０.０ ３０ １０６８ ２１１３ １０.５ ３３ ９４７ ４６７５ １１.０ ２８ ９２７ ７１７５
カリホスファターゼのｋcat値に及ぼすｐＨの影響) アルカリホスファターゼのｋcat ｐＨ ｐＭＡ１００ ｐＭＡ１１５ ウシ腸管 ８.０ ８ ３５ ３４５ ８.５ １０ ７８ ４８０ ９.０ １２ １５４ ７６０ ９.５ １３ ２５５ １００４ １０.０ ３０ １０６８ ２１１３ １０.５ ３３ ９４７ ４６７５ １１.０ ２８ ９２７ ７１７５
【００９４】ｐＮＰＰにおいて観察された傾向は、４−
ＭＵＰで得られたものと類似していた。すなわち、ｋ
cat値はｐＨ８から１０につれて上昇し、ｐＭＡ１１５
とウシ腸管アルカリホスファターゼとの間のｋcat値の
差異が最小となるのはｐＨ１０.０においてであった(２
倍の差異がある)。ｋcat値は天然大腸菌(ｐＭＡ１００)
とウシ腸管アルカリホスファターゼとの間で全ｐＨ範囲
にわたって大きな差異が存在し、ｐＨ１０.０において
もｋcat値は７０倍の差異があった。ｐＭＡ１１５はウ
シ腸管酵素に比べてｐＨ１０.０でのｋcatの差異が７０
倍からわずか２倍に減少するので、野生型大腸菌アルカ
リホスファターゼよりも優れている。
ＭＵＰで得られたものと類似していた。すなわち、ｋ
cat値はｐＨ８から１０につれて上昇し、ｐＭＡ１１５
とウシ腸管アルカリホスファターゼとの間のｋcat値の
差異が最小となるのはｐＨ１０.０においてであった(２
倍の差異がある)。ｋcat値は天然大腸菌(ｐＭＡ１００)
とウシ腸管アルカリホスファターゼとの間で全ｐＨ範囲
にわたって大きな差異が存在し、ｐＨ１０.０において
もｋcat値は７０倍の差異があった。ｐＭＡ１１５はウ
シ腸管酵素に比べてｐＨ１０.０でのｋcatの差異が７０
倍からわずか２倍に減少するので、野生型大腸菌アルカ
リホスファターゼよりも優れている。
【００９５】実施例７ α−フェトプロテインのサンドイッチＥＩＡにおける変
異アルカリホスファターゼの使用：下記のように、まず
変異酵素(ｐＭＡ１１３からのアルカリホスファター
ゼ、実施例３に記載のようにして調製)およびモノクロ
ーナル抗ＡＦＰ抗体を別に処理することにより、酵素標
識抗ＡＦＰ抗体を調製した。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムア
ミド(ＤＭＦ)中の５０倍モル過剰のｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＳＭ
ＣＣ)を、１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２、１ｍＭＭｇＣ
ｌ2含有；最終ＤＭＦ濃度５％)中のアルカリホスファタ
ーゼの０.６ｍｇ／ｍｌ溶液に加えた。２５℃で３時間
反応を行い、その後、ＳＭＣＣ処理酵素を４℃で１８時
間、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２、１.０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2含有)に対して透析した。
異アルカリホスファターゼの使用：下記のように、まず
変異酵素(ｐＭＡ１１３からのアルカリホスファター
ゼ、実施例３に記載のようにして調製)およびモノクロ
ーナル抗ＡＦＰ抗体を別に処理することにより、酵素標
識抗ＡＦＰ抗体を調製した。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムア
ミド(ＤＭＦ)中の５０倍モル過剰のｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＳＭ
ＣＣ)を、１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２、１ｍＭＭｇＣ
ｌ2含有；最終ＤＭＦ濃度５％)中のアルカリホスファタ
ーゼの０.６ｍｇ／ｍｌ溶液に加えた。２５℃で３時間
反応を行い、その後、ＳＭＣＣ処理酵素を４℃で１８時
間、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２、１.０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2含有)に対して透析した。
【００９６】０.１Ｍリン酸塩(ｐＨ７.２、１.０Ｍ Ｍ
ｇＣｌ2含有)中の５.８ｍｇ／ｍｌ抗ＡＦＰ抗体溶液を
５００倍モル過剰の２−イミノチオランで２５℃にて１
時間処理した。ついで、このチオール化した試料を０.
１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)
に対して４℃で１８時間透析した。
ｇＣｌ2含有)中の５.８ｍｇ／ｍｌ抗ＡＦＰ抗体溶液を
５００倍モル過剰の２−イミノチオランで２５℃にて１
時間処理した。ついで、このチオール化した試料を０.
１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２、１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)
に対して４℃で１８時間透析した。
【００９７】上記ＳＭＣＣ処理酵素を上記チオール化抗
ＡＦＰ酵素に２：１のモル比および１ｍｇ／ｍｌ全タン
パク質濃度にて加えた。４℃にて４時間反応させた後、
Ｎ−エチルマレイミド(最終濃度０.３ｍＭ)を４℃にて
３０分間加え、ついで２−メルカプトエタノール(最終
濃度１.０ｍＭ)を４℃にて３０分間加えることにより反
応を停止させた。ついで、この溶液を２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０、１.０ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)
に対して４℃にて１８時間透析した。
ＡＦＰ酵素に２：１のモル比および１ｍｇ／ｍｌ全タン
パク質濃度にて加えた。４℃にて４時間反応させた後、
Ｎ−エチルマレイミド(最終濃度０.３ｍＭ)を４℃にて
３０分間加え、ついで２−メルカプトエタノール(最終
濃度１.０ｍＭ)を４℃にて３０分間加えることにより反
応を停止させた。ついで、この溶液を２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０、１.０ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)
に対して４℃にて１８時間透析した。
【００９８】アボットＩＭｘ−ＡＦＰアッセイプロトコ
ールおよび試薬(アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、ＩＬ)を用い、上記酵素／抗体指示試薬の性能
を評価した。大腸菌変異株アルカリホスファターゼ指示
試薬の基質は、１.５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
０、１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有)中の１.２ｍＭの４−Ｍ
ＵＰを含んでいた。上記アッセイキットからの指示試薬
希釈緩衝液で酵素／抗体指示試薬を最終濃度１.３μｇ
／ｍｌに希釈し、ついで濾過した(０.２μＭ膜)。この
指示試薬を用いて第７図に示す標準曲線を作成した。第
７図にはまた、ウシ腸管アルカリホスファターゼ標識抗
ＡＦＰ抗体指示試薬を用いて得た標準曲線も示してあ
る。これら曲線間の相関から、哺乳動物酵素／抗体指示
試薬が約０.８μｇ／ｍｌで用いられるのと比較して、
変異酵素／抗体指示試薬はアッセイにおいて１.３μｇ
／ｍｌもの低い濃度で用いることができることが示され
た。
ールおよび試薬(アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、ＩＬ)を用い、上記酵素／抗体指示試薬の性能
を評価した。大腸菌変異株アルカリホスファターゼ指示
試薬の基質は、１.５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
０、１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有)中の１.２ｍＭの４−Ｍ
ＵＰを含んでいた。上記アッセイキットからの指示試薬
希釈緩衝液で酵素／抗体指示試薬を最終濃度１.３μｇ
／ｍｌに希釈し、ついで濾過した(０.２μＭ膜)。この
指示試薬を用いて第７図に示す標準曲線を作成した。第
７図にはまた、ウシ腸管アルカリホスファターゼ標識抗
ＡＦＰ抗体指示試薬を用いて得た標準曲線も示してあ
る。これら曲線間の相関から、哺乳動物酵素／抗体指示
試薬が約０.８μｇ／ｍｌで用いられるのと比較して、
変異酵素／抗体指示試薬はアッセイにおいて１.３μｇ
／ｍｌもの低い濃度で用いることができることが示され
た。
【００９９】実施例８ 癌抗原のサンドイッチＥＩＡにおける変異アルカリホス
ファターゼの使用：下記手順に従い、抗−癌抗原抗体断
片を変異アルカリホスファターゼで標識した。ｐＭＡ１
１５からの変異アルカリホスファターゼの溶液(０.６μ
ｇ／ｍｌ、０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.２中、１.０
ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)を、穏やかに回転しながら４５０
倍モル過剰の２−イミノチオランで２５℃にて３０分間
処理した。このチオール化した試料を、０.１Ｍリン酸
緩衝液(ｐＨ７.０、０.１ＭＮａＣｌ、１.０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2および０.１ｍＭ ＺｎＣｌ2含有)で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラム(１×４５ｃｍ)上で脱塩
し、同緩衝液で溶離した。
ファターゼの使用：下記手順に従い、抗−癌抗原抗体断
片を変異アルカリホスファターゼで標識した。ｐＭＡ１
１５からの変異アルカリホスファターゼの溶液(０.６μ
ｇ／ｍｌ、０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.２中、１.０
ｍＭ ＭｇＣｌ2含有)を、穏やかに回転しながら４５０
倍モル過剰の２−イミノチオランで２５℃にて３０分間
処理した。このチオール化した試料を、０.１Ｍリン酸
緩衝液(ｐＨ７.０、０.１ＭＮａＣｌ、１.０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2および０.１ｍＭ ＺｎＣｌ2含有)で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラム(１×４５ｃｍ)上で脱塩
し、同緩衝液で溶離した。
【０１００】抗体断片を、穏やかに回転しながら、５０
倍モル過剰のスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメ
チル−１−トリカプラミド)シクロヘキサンカルボキシ
レート(３０原子リンカー)(ＤＭＦ(最終濃度１５％)中
で調製)と２５℃で３０分間反応させた。ついで、この
試料を、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０、０.１Ｍ Ｎ
ａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ含有)で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５カラム(１×４５ｃｍ)上で脱塩し、
同緩衝液で溶離した。
倍モル過剰のスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメ
チル−１−トリカプラミド)シクロヘキサンカルボキシ
レート(３０原子リンカー)(ＤＭＦ(最終濃度１５％)中
で調製)と２５℃で３０分間反応させた。ついで、この
試料を、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０、０.１Ｍ Ｎ
ａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ含有)で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５カラム(１×４５ｃｍ)上で脱塩し、
同緩衝液で溶離した。
【０１０１】上記チオール化変異アルカリホスファター
ゼを上記活性化抗体断片と１.５：１のモル比で混合し
た。この反応混合物を２〜８℃で１５時間穏やかに回転
し、Ｎ−エチルマレイミド(最終濃度０.１ｍＭ)を加え
て反応を停止させた。２５℃で１時間後、試料をトリス
−ＨＣｌ緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ８.０、１.０ｍＭＭｇ
Ｃｌ2含有)に対して４℃にて１８時間透析した。
ゼを上記活性化抗体断片と１.５：１のモル比で混合し
た。この反応混合物を２〜８℃で１５時間穏やかに回転
し、Ｎ−エチルマレイミド(最終濃度０.１ｍＭ)を加え
て反応を停止させた。２５℃で１時間後、試料をトリス
−ＨＣｌ緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ８.０、１.０ｍＭＭｇ
Ｃｌ2含有)に対して４℃にて１８時間透析した。
【０１０２】実質的に実施例７に記載の方法に従い、得
られた酵素／抗体断片指示試薬を指示試薬緩衝液で最終
濃度３.７μｇ／ｍｌに希釈し、濾過した。実質的に実
施例７に記載の方法に従い、この指示試薬をサンドイッ
チアッセイに用いて癌抗原を検出し第８図に示す標準曲
線を作成した。第８図にはまた、同様にして調製したウ
シ腸管アルカリホスファターゼ／抗体断片指示試薬をア
ッセイ濃度１.６４μｇ／ｍｌで用いて得られた標準曲
線も示してある。指示試薬濃度の差異を考慮した上で、
変異酵素／抗体断片指示試薬の性能は哺乳動物酵素／抗
体断片指示試薬に匹敵するものである。このアッセイの
結果は、ＥＩＡにおける標識として変異酵素を用いた指
示試薬を首尾よく用いることができることを示してい
た。
られた酵素／抗体断片指示試薬を指示試薬緩衝液で最終
濃度３.７μｇ／ｍｌに希釈し、濾過した。実質的に実
施例７に記載の方法に従い、この指示試薬をサンドイッ
チアッセイに用いて癌抗原を検出し第８図に示す標準曲
線を作成した。第８図にはまた、同様にして調製したウ
シ腸管アルカリホスファターゼ／抗体断片指示試薬をア
ッセイ濃度１.６４μｇ／ｍｌで用いて得られた標準曲
線も示してある。指示試薬濃度の差異を考慮した上で、
変異酵素／抗体断片指示試薬の性能は哺乳動物酵素／抗
体断片指示試薬に匹敵するものである。このアッセイの
結果は、ＥＩＡにおける標識として変異酵素を用いた指
示試薬を首尾よく用いることができることを示してい
た。
【０１０３】実施例９ 変異アルカリホスファターゼ／結合成分指示試薬の安定
性：下記例外を除いて、実質的に実施例７に記載の方法
に従って酵素標識抗ＡＦＰ抗体を調製した。(１)ｐＭＡ
１１０からの変異アルカリホスファターゼの０.６μｇ
／ｍｌ溶液(０.１Ｍリン酸緩衝液中)を、ＤＭＦ中に溶
解した５０倍モル過剰の３０−原子リンカー(ＤＭＦの
最終濃度１５％)で２５℃にて２時間処理し、(２)活性
化酵素とチオール化抗体(実質的に実施例７に記載の方
法に従って調製)とを１：１のモル比で４℃にて８時間
反応させた。得られた指示試薬を指示試薬希釈緩衝液で
１５μｇ／ｍｌに希釈し(実施例６に記載のようにし
て)、４５℃で熱的に刺激した。
性：下記例外を除いて、実質的に実施例７に記載の方法
に従って酵素標識抗ＡＦＰ抗体を調製した。(１)ｐＭＡ
１１０からの変異アルカリホスファターゼの０.６μｇ
／ｍｌ溶液(０.１Ｍリン酸緩衝液中)を、ＤＭＦ中に溶
解した５０倍モル過剰の３０−原子リンカー(ＤＭＦの
最終濃度１５％)で２５℃にて２時間処理し、(２)活性
化酵素とチオール化抗体(実質的に実施例７に記載の方
法に従って調製)とを１：１のモル比で４℃にて８時間
反応させた。得られた指示試薬を指示試薬希釈緩衝液で
１５μｇ／ｍｌに希釈し(実施例６に記載のようにし
て)、４５℃で熱的に刺激した。
【０１０４】指示試薬の熱不活化の経時変化を追跡する
ため、試料を６０日間加熱条件下におき、実施例６に記
載のプロトコールに従って指示試薬の性能を測定した。
このアッセイの結果を第９図に示す。第９図にはまた、
ウシ腸管アルカリホスファターゼ／抗ＡＦＰ抗体指示試
薬の熱不活化の経時変化をも示す。大腸菌変異アルカリ
ホスファターゼを含む指示試薬は４５℃で６０日後に最
初のシグナルの３０％未満が失われたが、一方、哺乳動
物酵素／抗体指示試薬では４５℃でわずかに２０日後に
最初のシグナルの６０％以上が失われた。大腸菌変異酵
素／抗体指示試薬の熱安定性は、哺乳動物酵素指示試薬
よりもはるかに優れていた。
ため、試料を６０日間加熱条件下におき、実施例６に記
載のプロトコールに従って指示試薬の性能を測定した。
このアッセイの結果を第９図に示す。第９図にはまた、
ウシ腸管アルカリホスファターゼ／抗ＡＦＰ抗体指示試
薬の熱不活化の経時変化をも示す。大腸菌変異アルカリ
ホスファターゼを含む指示試薬は４５℃で６０日後に最
初のシグナルの３０％未満が失われたが、一方、哺乳動
物酵素／抗体指示試薬では４５℃でわずかに２０日後に
最初のシグナルの６０％以上が失われた。大腸菌変異酵
素／抗体指示試薬の熱安定性は、哺乳動物酵素指示試薬
よりもはるかに優れていた。
【０１０５】実施例１０ 変異アルカリホスファターゼと特異的結合成分の部位特
異的結合：この実験には、高い比活性を示しモノマー当
たり１つの表面システイン残基を有する変異大腸菌アル
カリホスファターゼを調製することが含まれていた。こ
の反応性システイン残基の存在により、ヘテロ２官能性
架橋試薬を用いて変異酵素を特異的結合成分に部位特異
的に共有結合することが可能になった。この結合反応
は、実施例７および８に記載してあるような２−イミノ
チオランを用いた非特異的化学修飾によりチオール基を
酵素に導入する必要をなくした。得られた特異的結合成
分／酵素結合体は安定性が高く、ＥＩＡで非特異的結合
が起こることが少ない。
異的結合：この実験には、高い比活性を示しモノマー当
たり１つの表面システイン残基を有する変異大腸菌アル
カリホスファターゼを調製することが含まれていた。こ
の反応性システイン残基の存在により、ヘテロ２官能性
架橋試薬を用いて変異酵素を特異的結合成分に部位特異
的に共有結合することが可能になった。この結合反応
は、実施例７および８に記載してあるような２−イミノ
チオランを用いた非特異的化学修飾によりチオール基を
酵素に導入する必要をなくした。得られた特異的結合成
分／酵素結合体は安定性が高く、ＥＩＡで非特異的結合
が起こることが少ない。
【０１０６】実質的に実施例３に記載の方法に従って酵
素を調製し、酵素の活性部位およびモノマー界面のいず
れをも妨害しない位置に実質的に実施例３に記載した方
法に従ってシステイン残基を酵素分子中に導入した。つ
いで、この修飾酵素を、実質的に実施例７および８に記
載の方法に従い、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルまたは４−(マレイミド
メチル−１−トリカルパミドシクロヘキサンカルボキシ
レート)などのヘテロ２官能性架橋剤により特異的結合
成分に結合させた。
素を調製し、酵素の活性部位およびモノマー界面のいず
れをも妨害しない位置に実質的に実施例３に記載した方
法に従ってシステイン残基を酵素分子中に導入した。つ
いで、この修飾酵素を、実質的に実施例７および８に記
載の方法に従い、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルまたは４−(マレイミド
メチル−１−トリカルパミドシクロヘキサンカルボキシ
レート)などのヘテロ２官能性架橋剤により特異的結合
成分に結合させた。
【０１０７】実施例１１ 独特の制限部位を有する合成大腸菌プラスミドの構築： (ａ)総論 合成大腸菌プラスミドを設計し、構築し、機能性のクロ
ーニングベクターであることが示された。遺伝子合成の
ＦokＩ法(マンデッキおよびボリング、Ｇene、６８、１
０１；１９８８)を用いて３０オリゴヌクレオチドから
プラスミドを組み立てた。このプラスミドは、β−ラク
タマーゼ遺伝子の合成モデュール(modules)、複製開始
点、lacＺ遺伝子断片およびマルチクローニング部位を
含んでおり、ｐＵＣタイプのプラスミドにならってパタ
ーン化される。違いは、ｐＵＣプラスミドに存在する制
限部位のほぼ５０％が除かれてあること、プラスミドの
サイズが２０５０塩基対に小さくなっていること、およ
びβ−ラクタマーゼ遺伝子およびlacＺ断片の両方の下
流に転写ターミネーターを導入してあることなどであ
る。これらの変化により、クローニング、突然変異誘
発、発現および制限分析などの多くの方法が容易にな
る。
ーニングベクターであることが示された。遺伝子合成の
ＦokＩ法(マンデッキおよびボリング、Ｇene、６８、１
０１；１９８８)を用いて３０オリゴヌクレオチドから
プラスミドを組み立てた。このプラスミドは、β−ラク
タマーゼ遺伝子の合成モデュール(modules)、複製開始
点、lacＺ遺伝子断片およびマルチクローニング部位を
含んでおり、ｐＵＣタイプのプラスミドにならってパタ
ーン化される。違いは、ｐＵＣプラスミドに存在する制
限部位のほぼ５０％が除かれてあること、プラスミドの
サイズが２０５０塩基対に小さくなっていること、およ
びβ−ラクタマーゼ遺伝子およびlacＺ断片の両方の下
流に転写ターミネーターを導入してあることなどであ
る。これらの変化により、クローニング、突然変異誘
発、発現および制限分析などの多くの方法が容易にな
る。
【０１０８】(ｂ)プラスミドの設計：大腸菌の合成プラ
スミドの全設計は、クローニング／発現ベクターに必要
または望ましい特性に基づいた。１つの条件は、ベクタ
ーから得られた制限断片の操作および精製を容易にする
ため低分子量であることであった。他の望ましい特性
は、重要な位置には独特の制限部位を導入しながら、可
能な限り多くの制限部位を排除することであった。過去
の経験では、多くの種々の制限部位を有するベクター中
にクローニングする場合に、その後のＤＮＡ断片のサブ
クローニングには明らかな欠点を伴うことが示されてい
る。
スミドの全設計は、クローニング／発現ベクターに必要
または望ましい特性に基づいた。１つの条件は、ベクタ
ーから得られた制限断片の操作および精製を容易にする
ため低分子量であることであった。他の望ましい特性
は、重要な位置には独特の制限部位を導入しながら、可
能な限り多くの制限部位を排除することであった。過去
の経験では、多くの種々の制限部位を有するベクター中
にクローニングする場合に、その後のＤＮＡ断片のサブ
クローニングには明らかな欠点を伴うことが示されてい
る。
【０１０９】合成プラスミドを３つの別のカセットに分
けた。第一に、ｐＵＣ９(ビエイラおよびメッシング、
Ｇene、１９、２５９〜２６８；１９８２)からの複製開
始点を合成プラスミド中のori領域を構成するＤＮＡ配
列として選択した。この配列には、ＲＮＡＩおよびＲＮ
ＡＩＩの両方の複製プライマー領域、およびそれぞれの
プロモーターが含まれている(ポリスキー、Ｍaximizing
Ｇene Ｅxpression、レズニコフ編、バターワース、
ボストン、１９８６)。
けた。第一に、ｐＵＣ９(ビエイラおよびメッシング、
Ｇene、１９、２５９〜２６８；１９８２)からの複製開
始点を合成プラスミド中のori領域を構成するＤＮＡ配
列として選択した。この配列には、ＲＮＡＩおよびＲＮ
ＡＩＩの両方の複製プライマー領域、およびそれぞれの
プロモーターが含まれている(ポリスキー、Ｍaximizing
Ｇene Ｅxpression、レズニコフ編、バターワース、
ボストン、１９８６)。
【０１１０】第二に、ｐＵＣプラスミドのβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子を選択マーカーとして選んだ。この遺伝子
は、ｐＵＣ９中に認められる天然Ｐ３プロモーター[ブ
ロシウス(Ｂrosius)ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,２５７、９２
０５〜９２１０、１９８２]および強力なファージfd遺
伝子ＶＩＩＩ転写ターミネーター[ベック(Ｂeck)ら、Ｎ
ucleic Ａcids Ｒes.５、４４９４〜４５１０、１９
７８]を含んでいた。ori領域とは対照的に、幾つかの制
限部位を除去することによりβ−ラクタマーゼのヌクレ
オチド配列を変えた。たいていの場合(Ｉｌｅ82＞Ｖａ
ｌおよびＶａｌ182＞Ａｌａの場合を除いて)、アミノ酸
配列は同じである。bla遺伝子中に天然に存在する制限
部位の約６０％を除去した。
ーゼ遺伝子を選択マーカーとして選んだ。この遺伝子
は、ｐＵＣ９中に認められる天然Ｐ３プロモーター[ブ
ロシウス(Ｂrosius)ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,２５７、９２
０５〜９２１０、１９８２]および強力なファージfd遺
伝子ＶＩＩＩ転写ターミネーター[ベック(Ｂeck)ら、Ｎ
ucleic Ａcids Ｒes.５、４４９４〜４５１０、１９
７８]を含んでいた。ori領域とは対照的に、幾つかの制
限部位を除去することによりβ−ラクタマーゼのヌクレ
オチド配列を変えた。たいていの場合(Ｉｌｅ82＞Ｖａ
ｌおよびＶａｌ182＞Ａｌａの場合を除いて)、アミノ酸
配列は同じである。bla遺伝子中に天然に存在する制限
部位の約６０％を除去した。
【０１１１】第三に、ｐＵＣのα−相補的(complementi
ng)lacＺ遺伝子断片もまた、ori領域およびアンピシリ
ン耐性遺伝子を有することに加えて、クローニングマー
カーとしての有用性および不均質融合タンパク質として
発現されることのために望ましかった。ｐＵＣ９からの
lacＺ配列は、β−ラクタマーゼ遺伝子における変化と
同様にして制限部位の数を減少させた。ＳmaＩ部位は、
他のあらゆる所望の部位の挿入のため独特の制限部位と
して保持した。
ng)lacＺ遺伝子断片もまた、ori領域およびアンピシリ
ン耐性遺伝子を有することに加えて、クローニングマー
カーとしての有用性および不均質融合タンパク質として
発現されることのために望ましかった。ｐＵＣ９からの
lacＺ配列は、β−ラクタマーゼ遺伝子における変化と
同様にして制限部位の数を減少させた。ＳmaＩ部位は、
他のあらゆる所望の部位の挿入のため独特の制限部位と
して保持した。
【０１１２】(ｃ)遺伝子構築：遺伝子合成のＦokＩ法を
用いてｐＷＭ５１０を構築するため全部で２５のオリゴ
ヌクレオチドを合成し、これらオリゴヌクレオチドを上
記のようにしてｐＷＭ５００群のプラスミド中にクロー
ニングした(マンデッキおよびボリング、Ｇene６８、１
０１〜１０７、１９８８)。プラスミドを精製し、Ｆok
Ｉで切断して個々の断片に切り出す前に配列を確かめ
た。２５のすべての断片(４０塩基対〜８２塩基対)が独
特の相補的な４つの塩基対突出を含んでおり、これら突
出はアニールしライゲートしたときに完全な閉環ベクタ
ーを生成した。これら断片をライゲートし、ＳＣＳ−１
コンピテント細胞[Ｆ-、recＡＩ、endＡＩ、gryＡ９
６、thi、hsdＲ１７、(rk-，mk+)、supＥ４４、relＡＩ
λ-]中に形質転換した。形質転換した細胞をアンピシリ
ンを含有するＬＢプレート上にプレーティングした。う
まく形質転換できた細胞は、機能性の複製開始点および
β−ラクタマーゼ遺伝子を有する完全プラスミドを含ん
でいる場合にのみ生存しコロニーを形成することができ
た。
用いてｐＷＭ５１０を構築するため全部で２５のオリゴ
ヌクレオチドを合成し、これらオリゴヌクレオチドを上
記のようにしてｐＷＭ５００群のプラスミド中にクロー
ニングした(マンデッキおよびボリング、Ｇene６８、１
０１〜１０７、１９８８)。プラスミドを精製し、Ｆok
Ｉで切断して個々の断片に切り出す前に配列を確かめ
た。２５のすべての断片(４０塩基対〜８２塩基対)が独
特の相補的な４つの塩基対突出を含んでおり、これら突
出はアニールしライゲートしたときに完全な閉環ベクタ
ーを生成した。これら断片をライゲートし、ＳＣＳ−１
コンピテント細胞[Ｆ-、recＡＩ、endＡＩ、gryＡ９
６、thi、hsdＲ１７、(rk-，mk+)、supＥ４４、relＡＩ
λ-]中に形質転換した。形質転換した細胞をアンピシリ
ンを含有するＬＢプレート上にプレーティングした。う
まく形質転換できた細胞は、機能性の複製開始点および
β−ラクタマーゼ遺伝子を有する完全プラスミドを含ん
でいる場合にのみ生存しコロニーを形成することができ
た。
【０１１３】ライゲーションは、２５のすべてのＦokＩ
断片のショットガンライゲーションによって行った。１
０ｍｇのライゲーション混合物当たり約３８の形質転換
体が得られた(ＳＣＳ−１細胞の全体の形質転換効率
は、５×１０7細胞／ｍｇ高次コイルｐＢＲ３２２より
も大きかった[ボリバー(Ｂolivar)ら、Ｇene２：９５〜
１１３、１９７７に記載])。
断片のショットガンライゲーションによって行った。１
０ｍｇのライゲーション混合物当たり約３８の形質転換
体が得られた(ＳＣＳ−１細胞の全体の形質転換効率
は、５×１０7細胞／ｍｇ高次コイルｐＢＲ３２２より
も大きかった[ボリバー(Ｂolivar)ら、Ｇene２：９５〜
１１３、１９７７に記載])。
【０１１４】全部で３つのコロニーをプレートから取り
出した。これら３つのクローンのうち、２つは正しいＡ
vaＩＩ制限パターンを有していた。クローンを取り出
し、シークエンシングのためのＣｓＣｌ勾配上で単離し
た。複数のシークエンシングプライマーを用いて二本鎖
ＤＮＡ配列確認を行った。全部で１６５９の塩基対のう
ち、個々のＦokＩクローン中、または組み立てたプラス
ミド中に配列の間違いは検出されなかった。ori領域お
よび機能性のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する合成プ
ラスミドをｐＷＭ５１０と称した。
出した。これら３つのクローンのうち、２つは正しいＡ
vaＩＩ制限パターンを有していた。クローンを取り出
し、シークエンシングのためのＣｓＣｌ勾配上で単離し
た。複数のシークエンシングプライマーを用いて二本鎖
ＤＮＡ配列確認を行った。全部で１６５９の塩基対のう
ち、個々のＦokＩクローン中、または組み立てたプラス
ミド中に配列の間違いは検出されなかった。ori領域お
よび機能性のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する合成プ
ラスミドをｐＷＭ５１０と称した。
【０１１５】プラスミド操作の第二段階では、第４図に
示すＦokＩ断片を用い、合成lacＺカセット[ヤニッシュ
−ペロン(Ｙanish−Ｐerron)ら、Ｇene３３：１０３〜
１１９、１９８５]をｐＷＭ５１０のＥcoＲＩ部位にク
ローニングした。このカセットには、lacプロモータ
ー、β−ガラクトシダーゼの６０アミノ酸をコードする
lacＺ遺伝子断片、trpＡ転写ターミネーター[クリスチ
ー(Ｃhristie)ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ７
８：４１８０〜４１８４、１９８１]および架橋突然変
異誘発によるマルチプルクローニング部位を導入するた
めのＳmaＩ部位を含んでいた。このクローニングにより
プラスミドｐＷＭ５１１が得られた。lacＺカセットは
ＥcoＲＩ開裂ｐＷＭ５１０中に２つの方向のうちのいず
れでもライゲートすることができたが、β−ラクタマー
ゼｍＲＮＡまたはＲＮＡＩＩと同じ方向にlacＺ転写単
位を発現するクローンのみを回収した(試験した２０ク
ローンから)。それゆえ、ｐＷＭ５１１中のlacＺ遺伝子
断片の方向はｐＵＣタイプのプラスミドと同じである。
遺伝子合成のＦokＩ法のクローニングベクターとして合
成プラスミドを用いることができるように、β−ラクタ
マーゼ遺伝子中の独特のＦokＩ部位もまた除去した。こ
の特別の方法は、プラスミドから小さな遺伝子断片をＦ
okＩで切断するという原理に基づいているので、プラス
ミド中のどの場所にもＦokＩ部位が存在しないことが小
さなＦokＩ断片の精製を非常に容易にする。ＦokＩ部位
の除去は縮重オリゴヌクレオチドを用いた架橋突然変異
誘発により行い、Ｔｒｐ−Ｍｅｔアミノ酸配列を変え
た。その後のシークエンシングにより、この配列はＴｒ
ｐ−Ｌｅｕアミノ酸配列に変わったことが示された。こ
のＴｒｐ−Ｍｅｔ配列は、１０６０〜１０６４残基にあ
るＤＮＡ領域に対応する(第１０図)。突然変異誘発に用
いたオリゴヌクレオチドの配列は下記の通りであった。
ＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＮＮＮＧＡ
ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＡ
ＣＴｐＷＭ５１１プラスミドをＦokＩで直線状にし、架
橋突然変異誘発法を用いて上記配列変化を導入した。こ
の保存的アミノ酸変異からはアンピシリン耐性の変化が
観察されなかった。
示すＦokＩ断片を用い、合成lacＺカセット[ヤニッシュ
−ペロン(Ｙanish−Ｐerron)ら、Ｇene３３：１０３〜
１１９、１９８５]をｐＷＭ５１０のＥcoＲＩ部位にク
ローニングした。このカセットには、lacプロモータ
ー、β−ガラクトシダーゼの６０アミノ酸をコードする
lacＺ遺伝子断片、trpＡ転写ターミネーター[クリスチ
ー(Ｃhristie)ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ７
８：４１８０〜４１８４、１９８１]および架橋突然変
異誘発によるマルチプルクローニング部位を導入するた
めのＳmaＩ部位を含んでいた。このクローニングにより
プラスミドｐＷＭ５１１が得られた。lacＺカセットは
ＥcoＲＩ開裂ｐＷＭ５１０中に２つの方向のうちのいず
れでもライゲートすることができたが、β−ラクタマー
ゼｍＲＮＡまたはＲＮＡＩＩと同じ方向にlacＺ転写単
位を発現するクローンのみを回収した(試験した２０ク
ローンから)。それゆえ、ｐＷＭ５１１中のlacＺ遺伝子
断片の方向はｐＵＣタイプのプラスミドと同じである。
遺伝子合成のＦokＩ法のクローニングベクターとして合
成プラスミドを用いることができるように、β−ラクタ
マーゼ遺伝子中の独特のＦokＩ部位もまた除去した。こ
の特別の方法は、プラスミドから小さな遺伝子断片をＦ
okＩで切断するという原理に基づいているので、プラス
ミド中のどの場所にもＦokＩ部位が存在しないことが小
さなＦokＩ断片の精製を非常に容易にする。ＦokＩ部位
の除去は縮重オリゴヌクレオチドを用いた架橋突然変異
誘発により行い、Ｔｒｐ−Ｍｅｔアミノ酸配列を変え
た。その後のシークエンシングにより、この配列はＴｒ
ｐ−Ｌｅｕアミノ酸配列に変わったことが示された。こ
のＴｒｐ−Ｍｅｔ配列は、１０６０〜１０６４残基にあ
るＤＮＡ領域に対応する(第１０図)。突然変異誘発に用
いたオリゴヌクレオチドの配列は下記の通りであった。
ＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＮＮＮＧＡ
ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＡ
ＣＴｐＷＭ５１１プラスミドをＦokＩで直線状にし、架
橋突然変異誘発法を用いて上記配列変化を導入した。こ
の保存的アミノ酸変異からはアンピシリン耐性の変化が
観察されなかった。
【０１１６】ｐＷＭ５１５をＥcoＲＩ／ＳmaＩで切断
し、必要な塩基変化を含む合成二本鎖オリゴヌクレオチ
ドを導入することによりＥcoＲＩ領域を欠失させた。こ
うして構築された合成プラスミドをｐＷＭ５２０と称し
た。架橋突然変異誘発を用いて、ファージＭ１３ｍｐ１
８からのマルチプルクローニング部位(ヤニッシュ−ペ
ロンら、Ｇene３３：１０３〜１１９、１９８５)をlac
Ｚ遺伝子内のＳmaＩ部位にクローニングした。このこと
は、ｐＵＣ１８のために確立した標準クローニングプロ
トコールに適応させるために行った。このマルチプルク
ローニング部位ｍｐ１８を有する構築物をｐＷＭ５１８
と称した。ｐＷＭ５１８中のマルチプルクローニング部
位は、下記の通りであった。ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣ
ＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧ
ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴ
し、必要な塩基変化を含む合成二本鎖オリゴヌクレオチ
ドを導入することによりＥcoＲＩ領域を欠失させた。こ
うして構築された合成プラスミドをｐＷＭ５２０と称し
た。架橋突然変異誘発を用いて、ファージＭ１３ｍｐ１
８からのマルチプルクローニング部位(ヤニッシュ−ペ
ロンら、Ｇene３３：１０３〜１１９、１９８５)をlac
Ｚ遺伝子内のＳmaＩ部位にクローニングした。このこと
は、ｐＵＣ１８のために確立した標準クローニングプロ
トコールに適応させるために行った。このマルチプルク
ローニング部位ｍｐ１８を有する構築物をｐＷＭ５１８
と称した。ｐＷＭ５１８中のマルチプルクローニング部
位は、下記の通りであった。ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣ
ＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧ
ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴ
【０１１７】(ｄ)プラスミドの特徴付け：合成プラスミ
ドの特徴付けは、この合成プラスミドが最初に完全に合
成したレプリコンを構成していたため重要であった。こ
の合成プラスミドは、その原型であるｐＵＣタイプのプ
ラスミドとは有意に異なっていた。この合成プラスミド
は、ｐＵＣタイプのプラスミドと比較したときに、３つ
の欠失を含んでおり、その全長は６３６塩基対であり、
７０の点変異を有していた。ｐＵＣプラスミド中に存在
する制限部位のほぼ５０％が除去されていたが、このこ
とはＤＮＡの制限分析または精製に有利である。特に、
ｐＷＭ５１９プラスミドは、６塩基対非縮重配列を認識
する制限酵素のための部位を７つしか(操作を容易にす
るための設計により導入した３つの部位を含む)含んで
いない。ｐＵＣプラスミドでは、マルチプルクローニン
グ部位を含まなくても、そのような部位が２４存在す
る。そのような部位の数が少ないことにより、６塩基対
特異性を有する実質的にあらゆる制限酵素をクローニン
グ、および合成ＤＮＡでの制限断片置換または架橋突然
変異誘発によりクローニング遺伝子の突然変異誘発に用
いることができる。プラスミドｐＷＭ５２０は、７５の
制限酵素のための開裂部位を有していない。この合成プ
ラスミドは、β−ラクタマーゼ遺伝子のＰ１プロモータ
ーが欠失している。この合成プラスミドは、最小の長さ
の複製開始点、２つの新たに導入した転写ターミネータ
ーおよび最小の長さの操作lacプロモーターを含んでい
る。
ドの特徴付けは、この合成プラスミドが最初に完全に合
成したレプリコンを構成していたため重要であった。こ
の合成プラスミドは、その原型であるｐＵＣタイプのプ
ラスミドとは有意に異なっていた。この合成プラスミド
は、ｐＵＣタイプのプラスミドと比較したときに、３つ
の欠失を含んでおり、その全長は６３６塩基対であり、
７０の点変異を有していた。ｐＵＣプラスミド中に存在
する制限部位のほぼ５０％が除去されていたが、このこ
とはＤＮＡの制限分析または精製に有利である。特に、
ｐＷＭ５１９プラスミドは、６塩基対非縮重配列を認識
する制限酵素のための部位を７つしか(操作を容易にす
るための設計により導入した３つの部位を含む)含んで
いない。ｐＵＣプラスミドでは、マルチプルクローニン
グ部位を含まなくても、そのような部位が２４存在す
る。そのような部位の数が少ないことにより、６塩基対
特異性を有する実質的にあらゆる制限酵素をクローニン
グ、および合成ＤＮＡでの制限断片置換または架橋突然
変異誘発によりクローニング遺伝子の突然変異誘発に用
いることができる。プラスミドｐＷＭ５２０は、７５の
制限酵素のための開裂部位を有していない。この合成プ
ラスミドは、β−ラクタマーゼ遺伝子のＰ１プロモータ
ーが欠失している。この合成プラスミドは、最小の長さ
の複製開始点、２つの新たに導入した転写ターミネータ
ーおよび最小の長さの操作lacプロモーターを含んでい
る。
【０１１８】このプラスミドは、少なくとも１２０世代
(プレート上で４継代)まで安定に増殖し得ることが示さ
れた。それゆえ、複製開始点を含む構築断片(第１０図
中の１３４９〜１９３３)は、安定な複製を充分に維持
することができた。プラスミドのコピー数は、プラスミ
ドＤＮＡバンドの密度をアガロースゲル上で調べ、大き
なＤＮＡ調製物からＤＮＡの収量を測定し、β−ラクタ
マーゼレベルをアッセイすることにより評価した[ジョ
ーンズ(Ｊones)ら、Ｊ.Ｃlinic.Ｍicrobiol.１５：６７
７〜６８３、１９８２]。コピー数はｐＵＣ９よりも３
〜４倍低く、ｐＢＲ３２２のコピー数と等価であること
がわかった。この観察結果は、ｐＢＲ３２２と比較して
最近決定されたｐＵＣタイプのプラスミドの複製開始点
の配列変化(ｐＢＲ３２２中の２９９０位のＧがｐＵＣ
プラスミドの対応領域ではＡに変わっている；ミルトン
(Ｍilton)ら、Ｆocus,ＢＲＬ−Ｇibco１０、５６、１９
８８)と一致するものであったが、これはｐＵＣプラス
ミドの方に高いコピー数を与えているように思われる。
(プレート上で４継代)まで安定に増殖し得ることが示さ
れた。それゆえ、複製開始点を含む構築断片(第１０図
中の１３４９〜１９３３)は、安定な複製を充分に維持
することができた。プラスミドのコピー数は、プラスミ
ドＤＮＡバンドの密度をアガロースゲル上で調べ、大き
なＤＮＡ調製物からＤＮＡの収量を測定し、β−ラクタ
マーゼレベルをアッセイすることにより評価した[ジョ
ーンズ(Ｊones)ら、Ｊ.Ｃlinic.Ｍicrobiol.１５：６７
７〜６８３、１９８２]。コピー数はｐＵＣ９よりも３
〜４倍低く、ｐＢＲ３２２のコピー数と等価であること
がわかった。この観察結果は、ｐＢＲ３２２と比較して
最近決定されたｐＵＣタイプのプラスミドの複製開始点
の配列変化(ｐＢＲ３２２中の２９９０位のＧがｐＵＣ
プラスミドの対応領域ではＡに変わっている；ミルトン
(Ｍilton)ら、Ｆocus,ＢＲＬ−Ｇibco１０、５６、１９
８８)と一致するものであったが、これはｐＵＣプラス
ミドの方に高いコピー数を与えているように思われる。
【０１１９】合成プラスミドの配列を第１０図に示す。
第１０図中、転写ターミネーター、−３５および−１０
プロモーター領域、およびｆＭｅｔコードＡＴＧトリプ
レットには下線を引いてある。水平の矢印は転写開始部
位を示す。垂直の矢印はＲＮaseＨ開裂部位を示す。ア
ポストロフィは分割点を示し、ＦokＩ断片を与える。合
成オリゴヌクレオチドの配列は、アーム１＋分割点の間
の配列＋４つの３'末端残基の重複＋アーム２であっ
た。ＦokＩ断片およびオリゴヌクレオチドは配列の上に
示すように番号を付してある。断片１の配列は、２つの
不連続な配列からなる。楔形はlacＺカセットを定め
る。
第１０図中、転写ターミネーター、−３５および−１０
プロモーター領域、およびｆＭｅｔコードＡＴＧトリプ
レットには下線を引いてある。水平の矢印は転写開始部
位を示す。垂直の矢印はＲＮaseＨ開裂部位を示す。ア
ポストロフィは分割点を示し、ＦokＩ断片を与える。合
成オリゴヌクレオチドの配列は、アーム１＋分割点の間
の配列＋４つの３'末端残基の重複＋アーム２であっ
た。ＦokＩ断片およびオリゴヌクレオチドは配列の上に
示すように番号を付してある。断片１の配列は、２つの
不連続な配列からなる。楔形はlacＺカセットを定め
る。
【０１２０】ｐＷＭ５１０の構築に用いるすべてのオリ
ゴヌクレオチドの合成を、５'−ジメエトキシトリチル
ヌクレオシドβ−シアノエチルホスホルアミダイトを用
いアプライドバイオシステムズ３８０Ａ合成機上で行っ
た。合成は、平均孔径が１０００Åの０.２μモルスケ
ール制御孔ガラス固相上で行った。オリゴヌクレオチド
の精製はゲル電気泳動により行った。
ゴヌクレオチドの合成を、５'−ジメエトキシトリチル
ヌクレオシドβ−シアノエチルホスホルアミダイトを用
いアプライドバイオシステムズ３８０Ａ合成機上で行っ
た。合成は、平均孔径が１０００Åの０.２μモルスケ
ール制御孔ガラス固相上で行った。オリゴヌクレオチド
の精製はゲル電気泳動により行った。
【０１２１】合成オリゴヌクレオチドのクローニング
は、架橋突然変異誘発プロトコールにより行った。遺伝
子合成のＦokＩ法に用いた４つのすべてのクローニング
ベクター(ｐＷＭ５００、ｐＷＭ５０１、ｐＷＭ５０２
およびｐＷＭ５０７)をＳmaＩで切断した。約５０ｎｇ
の直線状ベクターを３０μｌの変性緩衝液(１０ｍＭ
ＫＣｌ、５.０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５.０
ｍＭ ＭｇＳＯ4、０.５ｍＭジチオトレイトール)中で
２０ピコモルのオリゴヌクレオチドと混合し、混合物を
沸騰水浴中、１００℃で３分間加熱した。試料を室温に
５分間冷却し、２００ｍｌの冷却したコンピテントなＪ
Ｍ８３細胞(ara、Ｄ(lac−proＡＢ)、strＡ、thi、Φ８
０laczＤＭ１５)に移した。このＤＮＡ／細胞混合物を
氷上で５分間冷却し、ついで３７℃で３分間熱ショック
を与えた。この形質転換混合物に約２μｌのＬＢ培地を
加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、ついで
細胞をプレーティングした。
は、架橋突然変異誘発プロトコールにより行った。遺伝
子合成のＦokＩ法に用いた４つのすべてのクローニング
ベクター(ｐＷＭ５００、ｐＷＭ５０１、ｐＷＭ５０２
およびｐＷＭ５０７)をＳmaＩで切断した。約５０ｎｇ
の直線状ベクターを３０μｌの変性緩衝液(１０ｍＭ
ＫＣｌ、５.０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５.０
ｍＭ ＭｇＳＯ4、０.５ｍＭジチオトレイトール)中で
２０ピコモルのオリゴヌクレオチドと混合し、混合物を
沸騰水浴中、１００℃で３分間加熱した。試料を室温に
５分間冷却し、２００ｍｌの冷却したコンピテントなＪ
Ｍ８３細胞(ara、Ｄ(lac−proＡＢ)、strＡ、thi、Φ８
０laczＤＭ１５)に移した。このＤＮＡ／細胞混合物を
氷上で５分間冷却し、ついで３７℃で３分間熱ショック
を与えた。この形質転換混合物に約２μｌのＬＢ培地を
加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、ついで
細胞をプレーティングした。
【０１２２】合成プラスミドのためのＦokＩ断片を含む
プラスミド構築物を以下のようにして設計した。約２０
０ｎｇの各プラスミドを９０単位のＦokＩ(ニュー・イ
ングランド・バイオラブズ、ビバーリー、ＭＡ)で切断
した。反応は、１×ＦokＩ緩衝液(２０ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2および１０ｍＭ２−メルカプトエタノール)を含有
する５００μｌ容量中、３７℃で２.５時間行った。つ
いで、挿入物を含有するＦokＩ断片をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により精製した。
プラスミド構築物を以下のようにして設計した。約２０
０ｎｇの各プラスミドを９０単位のＦokＩ(ニュー・イ
ングランド・バイオラブズ、ビバーリー、ＭＡ)で切断
した。反応は、１×ＦokＩ緩衝液(２０ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2および１０ｍＭ２−メルカプトエタノール)を含有
する５００μｌ容量中、３７℃で２.５時間行った。つ
いで、挿入物を含有するＦokＩ断片をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により精製した。
【０１２３】ライゲーション手順において、２５のすべ
てのＦokＩ断片(各１００ｎｇ)を１回の反応で一緒にし
た(上記)。使用したクローニングベクターのタイプは、
ｐＷＭ５００(断片２〜１４のため)、ｐＷＭ５０１(断
片１５〜１８、２４および２５のため)、ｐＷＭ５０２
(断片１９〜２３のため)、およびｐＷＭ５０７(断片３
０のため)であった。
てのＦokＩ断片(各１００ｎｇ)を１回の反応で一緒にし
た(上記)。使用したクローニングベクターのタイプは、
ｐＷＭ５００(断片２〜１４のため)、ｐＷＭ５０１(断
片１５〜１８、２４および２５のため)、ｐＷＭ５０２
(断片１９〜２３のため)、およびｐＷＭ５０７(断片３
０のため)であった。
【０１２４】本発明の概念を他の酵素に同様に適用でき
ることは当業者には評価されるであろう。その際、該酵
素をコードするＤＮＡは、野生型酵素の温度安定性は保
持しながら比活性を増大させた酵素を産生するように、
または野生型酵素の比活性は保持しながら温度安定性を
増大させた酵素を産生するように修飾してある。本発明
はまた、大腸菌以外の宿主にも適用することができる。
すべての宿主が等しく有効であるわけではないが、その
ような宿主の例として、バシラス属、ストレプトマイセ
ス属、哺乳動物細胞および酵母および他の真菌類が挙げ
られる(これらに限られるものではない)。本明細書に記
載した態様は限定を意図したものではなく単に例示を示
したものにすぎず、上記および添付の特許請求の範囲に
記載した発明の範囲内のすべての等価物を包含するもの
である。
ることは当業者には評価されるであろう。その際、該酵
素をコードするＤＮＡは、野生型酵素の温度安定性は保
持しながら比活性を増大させた酵素を産生するように、
または野生型酵素の比活性は保持しながら温度安定性を
増大させた酵素を産生するように修飾してある。本発明
はまた、大腸菌以外の宿主にも適用することができる。
すべての宿主が等しく有効であるわけではないが、その
ような宿主の例として、バシラス属、ストレプトマイセ
ス属、哺乳動物細胞および酵母および他の真菌類が挙げ
られる(これらに限られるものではない)。本明細書に記
載した態様は限定を意図したものではなく単に例示を示
したものにすぎず、上記および添付の特許請求の範囲に
記載した発明の範囲内のすべての等価物を包含するもの
である。
【０１２５】
【図１】 アルカリホスファターゼ遺伝子を構築するの
に使用する新規合成オリゴヌクレオチドの配列を示す
図。
に使用する新規合成オリゴヌクレオチドの配列を示す
図。
【図２】 アルカリホスファターゼ遺伝子を構築するの
に使用する新規合成オリゴヌクレオチドの配列を示す
図。
に使用する新規合成オリゴヌクレオチドの配列を示す
図。
【図３】 アルカリホスファターゼ遺伝子を構築するの
に使用する新規合成オリゴヌクレオチドの配列を示す
図。
に使用する新規合成オリゴヌクレオチドの配列を示す
図。
【図４】 プラスミドｐＭＡ１００の制限地図を示す模
式図。
式図。
【図５】 合成野生型大腸菌アルカリホスファターゼの
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。
【図６】 合成野生型大腸菌アルカリホスファターゼの
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。
【図７】 本発明の新規指示試薬を用いてα−フェトプ
ロテインの検出のための結合アッセイを行った結果を示
すグラフ。
ロテインの検出のための結合アッセイを行った結果を示
すグラフ。
【図８】 本発明の新規指示試薬を用いて癌抗原の検出
のための結合アッセイを行った結果を示すグラフ。
のための結合アッセイを行った結果を示すグラフ。
【図９】 ウシ腸管アルカリホスファターゼ結合体およ
び大腸菌アルカリホスファターゼ結合体の可逆的熱不活
化の経時変化を示すグラフ。
び大腸菌アルカリホスファターゼ結合体の可逆的熱不活
化の経時変化を示すグラフ。
【図１０】 合成プラスミドｐＷＭ５２０のヌクレオチ
ド配列を示す図。
ド配列を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/42 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スーザン・ジェイ・トマジック−アレン アメリカ合衆国60045イリノイ州レイ ク・フォレスト、サミット・アベニュー 775番 (56)参考文献 ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩ ＮＧ，ＶＯＬ．３，ＮＯ．２（1989）, ＰＰ．127〜132
Claims (9)
- 【請求項１】 大腸菌により産生されたアルカリホスフ
ァターゼであって、野生型の大腸菌アルカリホスファタ
ーゼと比べて１または２以上のアミノ酸変異を有し、該
アミノ酸変異が、Ｔｈｒ100の代わりのＶａｌ、Ｔｈｒ
100の代わりのＩｌｅ、Ｌｙｓ328の代わりのＡｒｇ、Ｖ
ａｌ99の代わりのＡｌａ、Ａｌａ103の代わりのＡｓ
ｐ、Ｔｈｒ107の代わりのＶａｌおよびＡｓｐ101の代わ
りのＳｅｒよりなる群から選ばれたものであることを特
徴とする、合成酵素。 - 【請求項２】 大腸菌により産生されたアルカリホスフ
ァターゼであって、野生型の大腸菌アルカリホスファタ
ーゼと比べて１または２以上のアミノ酸変異を有し、該
アミノ酸変異が、Ｖａｌ99の代わりのＡｌａおよびＬｙ
ｓ328の代わりのＡｒｇ、またはＶａｌ377の代わりのＡ
ｌａおよびＳｅｒ415の代わりのＧｌｙよりなる群から
選ばれたものであることを特徴とする、合成酵素。 - 【請求項３】 単細胞宿主中で発現するためのアルカリ
ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を有する
遺伝子操作したＤＮＡ配列であって、該アルカリホスフ
ァターゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと比
べて１または２以上のアミノ酸変異を有し、その際、該
アミノ酸変異が、Ｔｈｒ100の代わりのＶａｌ、Ｌｙｓ
328の代わりのＡｒｇ、Ｖａｌ99の代わりのＡｌａ、Ａ
ｌａ103の代わりのＡｓｐ、Ａｌａ103の代わりのＣｙ
ｓ、Ｔｈｒ107の代わりのＶａｌおよびＡｓｐ101の代わ
りのＳｅｒよりなる群から選ばれたものであり、野生型
の大腸菌アルカリホスファターゼよりも大きな比活性を
有することを特徴とする、ＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 単細胞宿主中で発現するためのアルカリ
ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を有する
遺伝子操作したＤＮＡ配列であって、該アルカリホスフ
ァターゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと比
べて１または２以上のアミノ酸変異を有し、その際、該
アミノ酸変異が、Ｖａｌ99の代わりのＡｌａおよびＬｙ
ｓ328の代わりのＡｒｇ、またはＶａｌ377の代わりのＡ
ｌａおよびＳｅｒ415の代わりのＧｌｙよりなる群から
選ばれたものであり、野生型の大腸菌アルカリホスファ
ターゼよりも大きな比活性を有することを特徴とする、
ＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 単細胞宿主中で発現するためのアルカリ
ホスファターゼをコードする遺伝子操作によるＤＮＡ配
列を含むプラスミドであって、該アルカリホスファター
ゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと比べて１
または２以上のアミノ酸変異を有し、その際、該アミノ
酸変異が、Ｔｈｒ100の代わりのＶａｌ、Ｔｈｒ100の代
わりのＩｌｅ、Ｌｙｓ328の代わりのＡｒｇ、Ｖａｌ99
の代わりのＡｌａ、Ａｌａ103の代わりのＡｓｐ、Ａｌ
ａ103の代わりのＣｙｓ、Ｔｈｒ107の代わりのＶａｌお
よびＡｓｐ101の代わりのＳｅｒよりなる群から選ばれ
たものであり、野生型の大腸菌アルカリホスファターゼ
よりも大きな比活性を有することを特徴とする、プラス
ミド。 - 【請求項６】 単細胞宿主中で発現するためのアルカリ
ホスファターゼをコードする遺伝子操作によるＤＮＡ配
列を含むプラスミドであって、該アルカリホスファター
ゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと比べて１
または２以上のアミノ酸変異を有し、その際、該アミノ
酸変異が、Ｖａｌ99の代わりのＡｌａおよびＬｙｓ328
の代わりのＡｒｇ、またはＶａｌ377の代わりのＡｌａ
およびＳｅｒ415の代わりのＧｌｙよりなる群から選ば
れたものであり、野生型の大腸菌アルカリホスファター
ゼよりも大きな比活性を有することを特徴とする、プラ
スミド。 - 【請求項７】 単細胞宿主中で発現するためのアルカリ
ホスファターゼをコードする遺伝子操作によるＤＮＡ配
列を含むプラスミドで形質転換した単細胞宿主であっ
て、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌アルカ
リホスファターゼと比べて１または２以上のアミノ酸変
異を有し、その際、該アミノ酸変異が、Ｔｈｒ100の代
わりのＶａｌ、Ｔｈｒ100の代わりのＩｌｅ、Ｌｙｓ328
の代わりのＡｒｇ、Ｖａｌ99の代わりのＡｌａ、Ａｌａ
103の代わりのＡｓｐ、Ａｌａ103の代わりのＣｙｓ、Ｔ
ｈｒ107の代わりのＶａｌおよびＡｓｐ101の代わりのＳ
ｅｒよりなる群から選ばれたものであり、野生型の大腸
菌アルカリホスファターゼよりも大きな比活性を有する
ことを特徴とする、宿主細胞。 - 【請求項８】 単細胞宿主中で発現するためのアルカリ
ホスファターゼをコードする遺伝子操作によるＤＮＡ配
列を含むプラスミドで形質転換した単細胞宿主であっ
て、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌アルカ
リホスファターゼと比べて１または２以上のアミノ酸変
異を有し、その際、該アミノ酸変異が、Ｖａｌ99の代わ
りのＡｌａおよびＬｙｓ328の代わりのＡｒｇ、または
Ｖａｌ377の代わりのＡｌａおよびＳｅｒ415の代わりの
Ｇｌｙよりなる群から選ばれたものであり、野生型の大
腸菌アルカリホスファターゼよりも大きな比活性を有す
ることを特徴とする、宿主細胞。 - 【請求項９】 試料中の分析対象物の存在または量を決
定する方法であって、 （ａ）試料を、特異的結合成分に直接または間接に結合
した請求項１または２に記載のアルカリホスファターゼ
からなり、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌
アルカリホスファターゼよりも大きな比活性を有するこ
とを特徴とする指示試薬、および捕捉結合成分と連続的
または同時に混合し、 （ｂ）該指示試薬を分析対象物、該捕捉試薬および補助
特異的結合成分よりなる群から選ばれたものに結合させ
て指示試薬複合体を生成させ、ついで （ｃ）該指示試薬複合体または遊離の指示試薬を酵素基
質と反応させて検出可能なシグナルを生成させることに
より試料中の分析対象物の存在または量を決定すること
を特徴とする方法。
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