JP2572562B2

JP2572562B2 - 抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびβの産生菌

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Publication number: JP2572562B2
Application number: JP7288144A
Authority: JP
Inventors: ガイ・トマス・カーター; マイケル・グリーンスタイン; ジヨセフ・ジエイコブ・グツドマン; ドナルド・ブルース・ボーダーズ; ウイリアム・マイケル・メイエス; レイモンド・トマス・テスタ; アーウイン・ボイデン・ウツド; メアリイ・エーラーズ・ドツシヤー; シドニイ・カンター; ロバート・リー・ケネツト・ジユニア
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1986-06-30
Filing date: 1995-10-11
Publication date: 1997-01-16
Anticipated expiration: 2012-01-16
Also published as: JPH08205856A; DK170282B1; NZ220900A; IE871731L; DE3778225D1; KR880000457A; EP0252380A3; DK332287A; AU7490187A; DK332287D0; KR950000983B1; EP0252380B1; EP0252380A2; ES2051712T3; IL83025A; JP2535544B2; CA1338168C; JPS6366191A; IE60758B1; IL83025A0

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗生物質ＬＬ−Ｅ
１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９０２０βの産生菌に関
し、より具体的には、ストレプトマイセス・リジクス
エスエスピータンザニウス（Streptomyces lydicus s
sp. tanzanius）に関する。

【０００２】

【発明の構成】本発明の微生物が産生する抗生物質ＬＬ
−Ｅ１９０２０α、ＬＬ−Ｅ１９０２０βまたはその生
理学的に許容されうる塩を使用して、肉生成動物の成長
速度を増加し、飼料の利用効率を改良し、そして乳汁を
分泌する反すう動物の乳汁分泌を高めることができる。

【０００３】これらの抗生物質はまた、単胃動物および
反すう動物の両者の処置のために有用である。さらに、
前記抗生物質はウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ウマおよ
び家禽における飼料の利用効率を改良しかつ重量増加を
誘発するためにとくに有効である。

【０００４】本発明によれば、ＬＬ−Ｅ１９０２０α、
ＬＬ−Ｅ１９０２０βまたは前記抗生物質の製薬学的お
よび薬理学的に許容されうる塩を使用して、温血動物、
とくに家禽、ウシ、ブタおよびヤギ、およびコンパニオ
ン（companion）動物、例えば、イヌおよびウサギにお
ける原虫類（protozoa）の感染を予防、処置、抑制また
は軽減する方法および組成物も提供できる。

【０００５】上記の抗生物質は、また、ウシ、ヒツジ、
ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウお
よびイヌにおけるエイメリア（Eimeria）およびバベシ
ア（Babecia）により引き起こされる原虫類の感染を抑
制するために有効である。

【０００６】また、本発明により産生される抗生組成物
は、温血動物におけるマラリア、住肉胞子虫症およびト
キソプラズマを抑制するために有効であることが証明さ
れるであろうことが予測される。なぜなら、これらの病
気の病原因子はエイメリア（Eimeria）およびバベシア
（Babecia）に生物学的に関係する原虫類の感染である
からである。

【０００７】したがってまた、温血動物に、予防的、製
薬学的または治療的に有効量のＬＬ−Ｅ１９０２０α、
ＬＬ−Ｅ１９０２０βまたはその製薬学的および薬理学
的に許容されうる塩から選択される抗生物質を投与する
ことを含んでなる温血動物の寄生虫および線虫の感染を
抑制または予防するための組成物および方法を提供する
ことも可能になる。さらに詳しくは、本発明により、ヒ
トおよび広範な種類の動物、例えば、農場の動物、コン
パニオン動物、サーカスの動物または動物園の動物にお
ける寄生虫および線虫の感染を予防、抑制または処置す
る方法を提供し、そしてこの方法はウシ、ヒツジ、ブ
タ、ウサギ、ウマ、ヤギ、家禽、イヌ、ネコなどにおけ
る寄生虫および線虫の感染を抑制および予防することも
可能になる。

【０００８】ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９
０２０βの構造は、下記物理化学的特性から次の式で示
される。

【０００９】式

【００１０】

【化２】

【００１１】式中、ＬＬ−Ｅ１９０２０αは、Ｒ₁がベ
ンジルカルボニル基を表し、そしてＲ₂が水素原子を表
す：ＬＬ−Ｅ１９０２０βは、Ｒ₁が水素原子を表し、
そしてＲ₂がベンジルカルボニル基を表す。

【００１２】ＬＬ−Ｅ１９０２０αの物理化学的特性
は、次の通りである：ＬＬ−Ｅ１９０２０α （１）概算元素分析：Ｃ６２.７３；Ｈ７.６０；
Ｎ１.００；Ｏ２８.６７（差による）；（２）１２２５の分子量（ＦＡＢＭＳ）；（３）分子式：Ｃ₆₅Ｈ₉₅ＮＯ₂₁；（４）比旋光度：［α］_D ²⁶＝０；（Ｃ０.３８５、
メタノール）；（５）添付図面の第１図に示す特性紫外線吸収スペク
トル；

【００１３】

【数１】

【００１４】（６）添付図面の第２図に示す特性赤外
線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：３４２０、２９７０、２
９２５、１７１７、１６９５、１６４７、１６１７、１
５２５、１４４５、１３６５、１０９２、１０１８ｃｍ
^-1；（７）添付図面の第３図に示す特性プロトン核磁気共
鳴スペクトル（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）；（ｈ）添付図面の第４図に示す特性炭素−１３核磁気
共鳴スペクトル（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃、ＴＭＳから
のダウンフィールドｐｐｍ）：下に記載する有意のピー
ク：１７３.３、１７１.４、１７１.０、１４５.７、１
４０.３、１３７.０、１３４.４、１３３.９、１３２.
０、１３０.１、１２９.５（２×）、１２９.０、１２
８.６（２×）、１２８.４３、１２８.３８、１２８.１
（２×）、１２７.５、１２７.１、１２６.３、１２０.
８、１００.６、９９.０、９７.３、９７.０、８９.
２、８３.３、８１.６、７７.６、７７.０、７６.４、
７４.６、７４.５、７４.４、７４.２、７２.０、７１.
９、６９.１、６７.５、６６.４、６６.１、６３.５、
５６.５、５６.０、５５.６、５５.４、４９.８、４１.
８（２×）、３９.８、３９.１、３８.８、３２.９、３
１.０、２９.９、２３.８、１８.１、１７.２、１７.
０、１４.８、１３.５、１０.８、１０.０。

【００１５】２×＝２つの重複する信号。

【００１６】ＬＬ−Ｅ１９０２０β （１）概算元素分析：Ｃ６２.３３；Ｈ７.７２；
Ｎ１.１６；Ｏ２７.７９（差による）；（２）１２２５の分子量（ＦＡＢＭＳ）；（３）分子式：Ｃ₆₅Ｈ₉₅ＮＯ₂₁；（４）比旋光度：［α］_D ²⁶＝−１７±２；（Ｃ０.
４５５、メタノール）；（５）添付図面の第５図に示す特性紫外線吸収スペク
トル；

【００１７】

【数２】

【００１８】（６）添付図面の第６図に示す特性赤外
線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：３４３０、２９７０、２
９３０、１７１２、１６９５、１６４８、１６２０、１
５４３、１４５４、１３６７、１０９８、１０２０、９
８０ｃｍ^-1；（７）添付図面の第７図に示す特性プロトン核磁気共
鳴スペクトル（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）；（ｈ）添付図面の第８図に示す特性炭素−１３核磁気
共鳴スペクトル（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃、ＴＭＳから
のダウンフィールドｐｐｍ）：下に記載する有意のピー
ク：１７３.６、１７０.６、１７０.０、１４５.６、１
４０.２、１３６.７、１３４.４、１３３.９、１３２.
０、１３０.１、１２９.１（２×）、１２８.９、１２
８.６（２×）、１２８.５、１２８.４、１２８.３、１
２８.２、１２７.８、１２７.２、１２６.５、１２０.
９、１００.６、９９.０、９８.４、９７.２、８９.
２、８３.３、８１.６、７７.６、７７.５、７６.２、
７５.５、７４.６、７４.５、７４.２（２×）、６９.
１、６８.９、６７.５、６６.６、６６.１、６４.１、
５６.５、５６.０、５５.６、５５.４、４９.６、４１.
６（２×）、３９.８、３９.１、３８.０、３２.９、３
１.０、２９.９、２３.７、１８.１、１７.２、１７.
０、１６.２、１３.５、１０.８、１０.０。

【００１９】２×＝２つの重複する信号。

【００２０】上記抗生物質のＬＬ−Ｅ１９０２０αおよ
びＬＬ−Ｅ１９０２０βは、本発明のステレプトマイセ
ス・リジクス（Streptomyces lydicus）ssp. タンザニ
ウス（tanzanius）の新規な菌株を制御された条件下に
培養する間に生産される。

【００２１】この微生物は、米国ニューヨーク州パール
リバー所在のメディカル・ディビジョン、アメリカン・
サイアナミド・カンパニーの培養物コレクションにおい
てＬＬ−Ｅ１９０２０として維持されている。この新規
な微生物の生存しうる培養物は、米国イリノイ州６１６
０４、ペオリア所在のパテント・カルチャー・コレクシ
ョン・ラボラトリー、ノーザーン・リージョナル・リサ
ーチ、センター、Ｕ.Ｓ.ディパートメント・オブ・アグ
リカルチャーに寄託されたおり、そしてその永久コレク
ションに加えられている。それは前記寄託所により受託
番号ＮＲＲＬ１８０３６を割当てられている。

【００２２】培養物ＬＬ−Ｅ１９０２０は、アフリカの
タンザニア・レイクマンヤラ（LakeMAnyara）付近の農
場で採取された土壌から分離された。培養物ＬＬ−Ｅ１
９０２０は、短いらせん胞子鎖、１０〜５０の胞子長
さ、場合によってこれより長い鎖を生成する。これらは
オートミールおよび無菌園−澱粉のようなＩＳＰ培地上
で合体して乾燥した黒味がかった塊を形成する傾向があ
る。胞子は電子顕微鏡で評価したとき平滑な表面を有す
る。この菌株はジアミノピメリン酸のＬ異性体を含有
し、こうしてストレプトマイセス（Streptomyces）属に
割当てられる。

【００２３】炭水化物の利用についてのＩＳＰ試験にお
いて、ＬＬ−Ｅ１９０２０は、アラビノース、フルクト
ース、イノシトール、マンニトール、ラフィノース、ラ
ムノース、スクロースおよびキシロースの上の生長を示
す。セルロースは利用されない。

【００２４】ゴードン（Gordon）生理学的シリーズにお
けるＬＬ−Ｅ１９０２０の反応を、次の表Ｉにおいて、
形態学的および生理学的に最も近く類似するストレプト
マイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）ＩＳＰ
５４６１の反応と比較する。ＬＬ−Ｅ１９０２０はＩＳ
Ｐ５４６１と５つの特性（キサンチン加水分解、オキ
サレートの脱カルボキシル化、エリスリトールから酸、
ラムノースから酸およびβ−メチル−Ｄ−キシロシドか
ら酸）において相違するので、それはストレプトマイセ
ス・リジクス（Streptomyces lydicus）の亜種として表
示される。

【００２５】表ＩＬＬ−Ｅ１９０２０およびストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）ＩＳＰ５４６１のゴードン試験の反応反応ＬＬ−Ｅ１９０２０ＩＳＰ５４６１次の劣化／転換＋＋カゼイン − ＋キサンチン＋＋ハイポキサンチン＋＋チロシン＋＋アデノシン＋＋次の生産アミラーゼ＋＋セラチナーゼ＋＋ホスファターゼ＋＋硝酸塩リダクターゼ − − ウレアーゼ＋＋エスクリナーゼ＋＋次の上／中の生長５％の塩化ナトリウム＋＋サリシレート − − リソチームのブロス微量微量次の利用アセテート＋＋ベンゾエート − − シトレート＋＋ラクテート＋＋マレート＋＋ムケート＋＋オキサレート＋ − プロピオネート＋＋ピブレート＋＋スクシネート＋＋タートレート − −次における生長１０℃ ＋＋４２℃ − − ５０℃ − −次から酸アドニトール＋＋アラビノース＋＋セルビオース＋＋デキストラン＋＋ズルシトール＋＋エリスリトール − − フルクトース＋ − ガカクトース＋＋グルコース＋＋グリセロール＋＋イノシトール＋＋ラクトース＋＋マルトース＋＋マンニトール＋＋マンノース＋＋メルビオース＋＋ α−メチル−Ｄ−グルコシド＋＋ラフィノース＋ − サリシン＋＋ソルビトール＋＋スクロース＋＋トレハロース＋＋キシロース＋＋ β−メチル−Ｄ−キシロシド＋ − これらの新規な抗菌剤の生産について、本発明はこの特
定の有機体に、あるいは例示の目的でのみ記載する上の
特定を完全に解答する有機体に限定されないことを理解
すべきである。事実、種々の手段、例えば、Ｘ線、紫外
線、Ｎ′−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン、アクチノファージへの暴露によって、この有機体
から生産される突然変異体の使用を包含することを望み
かつ意図する。

【００２６】ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９
０２０βの生体外抗生活性は、標準希釈法により、グラ
ム陽性およびグラム陰性の細菌のスペクトルに対して決
定した。５％のヒツジ血液およびＬＬ−Ｅ１９０２０α
またはＬＬ−Ｅ１９０２０βのいずれかの２倍減少濃度
を含有するミュラー−ヒントン寒天を、ペトリ皿の中に
注いだ。寒天表面に、スチーアズ（Steers）複製装置に
よって、５×１０⁴単位の細菌を接種した。１８時間の
インキュベーション後細菌の菌株の生長を阻害する抗生
物質の最低濃度を、その菌株についての最小阻止濃度と
して記録した。結果を表ＩＩに記載する。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【表２】

【００２９】抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ
−Ｅ１９０２０βの生体抗菌活性は、１.７×１０² Ｃ
ＦＵ／０.５ｍｌのストレプトコッカス・ピロゲネス（S
treptococcus pyogenes）Ｃ２０３または６.５×１０⁵
ＣＦＵ／０.５ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）スミス（Smith）のブロスを
使用して、チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Char
ler River Laboratories）からの各体重２０±２ｇの雌
のＣＤ−１マウスを腹腔内的に感染させることによって
確立した。感染前３０分に、０.５ｍｌの０.２％の水性
寒天中の試験化合物の示した投与量でマウスを処置し
た。この試験の結果を表ＩＩＩに記載する。

【００３０】

【表３】

【００３１】抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ
−Ｅ１９０２０βは、それらの抗菌活性からそれらの実
用性をもたらす。例えば、これらの抗生物質は、細菌の
感染の抑制において、局所用薬剤および実験室の汎用消
毒剤として使用できる。

【００３２】治療的使用において、本発明の化合物は意
図する用途に適した普通の製薬学的組成物の形態で投与
できる。このような組成物は、経口的、非経口的または
局所的投与に適するように配合することができる。活性
成分は、無毒の製薬学的に許容されうる担体と混合する
ことができ、そして担体は、投与、すなわち、経口的、
非経口的または局所的投与に望む調製物の形態に依存し
て広範な種類の形態を取ることができる。

【００３３】本発明によれば、抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０
２０αおよびＬＬ−Ｅ１９０２０βまたはそれらの塩類
は動物の経口的または非経口的に投与できる。それらは
動物飼料と混合して、したがってトップ・ドレッシング
として投与できる。それらは、また、動物に丸塊、ペレ
ット、錠剤、ピル、飲薬、経口ゲルなどの形態で与える
ことができ、あるいは動物の飲料水に供給することもで
きる。

【００３４】飼料中に含有させるか、あるいは飼料と一
緒に経口的に投与するとき、飼料の１トンにつき一般に
約０.１〜３００ｇのＬＬ−Ｅ１９０２０α、ＬＬ−Ｅ
１９０２０βまたはその生理学的に許容されうる塩から
選択される抗生物質が、成長速度を増大しかつ宿主動物
による飼料の利用効率を改良するために有効である。乳
汁を分泌する反すう動物、例えば、乳牛の飼料の利用の
要件は肉生産のために飼育した反すう動物の要件と測定
可能に異なるが、驚くべきことには、肉生産動物につい
て前述したように、飼料中の抗生物質の濃度は、また、
乳汁を分泌する反すう動物の乳汁分泌の増加において有
効である。

【００３５】反すう動物のＶＦＡの生産はとくに重要で
ある。なぜなら、それは動物の通常の飼育、ならびに動
物が生産する乳の品質および量に直接関係するからであ
る。しかしながら、乳汁を分泌する反すう動物において
は、乳汁分泌のエネルギーは乳の生産において最大の制
限因子である。アセテートは乳脂の合成のために要求さ
れるが、プロピオネートはグルコースの生産に利用さ
れ、次いでグルコースはラクトースの合成に要求され、
そしてまた油脂の生産において最小の役割を演ずる。ブ
チレートはより脂肪形成性であり、長鎖脂肪酸、すなわ
ち、乳脂の合成のために利用される前に、アセテート単
位にまず分解されなくてはならないので、脂肪形成の面
は間接的である。

【００３６】したがって、乳汁を分泌する反すう動物の
乳の生産を増加するためには、アセテートおよびプロピ
オネートの生産を大きく犠牲にしないで、プロピオネー
トの生産を増加することが必要である。この目的に対し
て、前述の抗生物質を反すう動物の経口的に投与する
と、こぶ胃内のプロピオネートの生産が増加すると同時
にアセテートの生産が抑制されることが、今回発見され
た。それ自体、この処理は動物のこぶ以内のプロピオネ
ート対アセテートの比を改良する。

【００３７】本発明の抗生物質は体重が数ｇから数千ｋ
ｇになることがある単胃動物および反すう動物の両者の
処置において有用であるので、前記動物を処置するため
に必要な抗生物質の有効レベルは動物の発育段階ととも
におよび種ごとに変化するであろう。したがって、各動
物種について有効レベルを下表ＩＶに記載する：

【００３８】

【表４】

【００３９】前述の動物において所望の成長速度を与え
るであろう動物飼料組成物は、前述の抗生物質またはそ
の塩、またはその化合物を含有する動物飼料補給物質
を、前記飼料中に所望レベルの活性化合物を供給するた
めに十分な量の適当な動物飼料と混合することによって
調製することができる。

【００４０】動物の飼料補給物質は、約１.０〜７５重
量％の抗生物質またはその塩と、約９９重量％〜２５重
量％の担体または希釈剤と混合することによって調製で
きる。飼料補給物質の調製における使用に適する担体ま
たは希釈剤は、次のものを包含する：アルファルファ粉
末、大豆粉末、綿実油粉末、塩化ナトリウム、トウモロ
コシ粉末、サトウモロコシシロップ、アマニ油粉末、尿
素、骨粉、魚粉、トウモロコシ穂軸粉末、塩化カルシウ
ムおよび他の同様な物質。飼料補給物質中の担体または
希釈剤の使用は、飼料補給物質を配合すべき最終飼料中
の活性成分の分布の均一性を促進する。こうして、それ
は飼料全体を通ずる活性成分の適切な分布を保証するこ
とによって重要な機能をはたす。

【００４１】飼料補給物質を飼料のためのトップ・ドレ
ッシングとして使用するとき、それはトップ・ドレッシ
ングされた飼料を横切る活性物質の分布の均一性を保証
する。

【００４２】非経口的投与のため、抗生物質または抗生
物質の塩は泥膏またはペレットの形態で調製し、そし
て、成長速度の増大および／または飼料の利用効率の改
良を望む場合、動物の頭または耳の皮膚の下に移植体と
して投与することができる。

【００４３】実際には、非経口的投与は、一般に、約
０.０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性成分を動物に
供給するために十分な量の前記抗生物質または抗生物質
の塩の注射を包含する。

【００４４】泥膏の配合物は、抗生物質または抗生物質
の塩を製薬学的に許容されうる油、例えば、落花生油、
ゴマ油およびトウモロコシ油中に分散させることによっ
て調製できる。

【００４５】有効レベルの抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０
αまたはＬＬ−Ｅ１９０２０βを含有するペレットは、
前述の抗生物質を希釈剤、例えば、カーボワックス、生
分解性ポリマー、カルナバ蝋などと混合することによっ
て調製できる。滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウ
ムまたはステアリン酸カルシウムを、必要に応じて、添
加してペレット化法を改良できる。

【００４６】もちろん、認識されるように、１種より多
いペレットを動物に投与して、成長速度を増加しおよび
／または前記動物による飼料の利用効率を改良するであ
ろう所望の投与レベルを達成することができる。その
上、追加の移植体を、また、処置期間の間周期的に導入
して、動物の体の中に適切な薬物の放出速度を維持する
ことができる。

【００４７】肉生産動物およびコンパニオン動物におけ
る原虫類の感染を抑制、処置または予防するための上に
同定した抗生物質の投与は、一般に動物飼料または飲料
水の中またはそれと一緒に実施されるのが最も普通であ
る。しかしながら、前記抗生物質は動物に個々の基準で
カプセル、錠剤、経口的ゲルなどの形態で与えることが
できる。それらは、また、非経口的に、一般に皮下注射
により、ゲル、泥膏、ペレット、溶液などとして、宿主
動物の皮下に与えることができる。

【００４８】本発明において、抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０
２０α、ＬＬ−Ｅ１９０２０βおよびその製薬学的およ
び薬理学的に許容されうる塩は、家禽および反すう動物
における原虫類の感染において予防的、製薬学的または
治療的に使用することができる。一般に、飼料または飲
料水中の約０.１ｐｐｍ〜３００ｐｐｍ、好ましくは約
１〜１００ｐｐｍの抗生物質または抗生物質の塩は、家
禽、反すう動物およびコンパニオン動物における原虫類
の感染、コクシジウム症およびバベシア（Babecia）の
抑制に有効である。

【００４９】本発明における薬物添加動物飼料は、０.
００００１〜０.０３重量％の抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０
２０αまたはＬＬ−Ｅ１９０２０βまたはその塩を栄養
的にバランスのとれた規定食と完全に混合することによ
って通常調製される。

【００５０】原虫類の感染の予防または抑制のために本
発明の化合物を使用するとき、活性抗原虫類剤は一般に
まず動物飼料のプレミックスとして調製される。このプ
レミックスは、通常、比較的高い百分率の抗原虫類剤を
含有し、そして一般に投与直前に動物飼料と配合され
る。必要に応じて、飼料プレミックスは、また、動物の
規定食のためのトップ・ドレッシングとして適用するこ
とができる。

【００５１】本発明の実施において有用な飼料プレミッ
クスまたは濃縮物は、約１.０〜１５.０重量％の上に同
定した抗生物質、またはその製薬学的および薬理学的に
許容されうる塩を、約９９.０〜８５重量％の適当な担
体または希釈剤と混合することによって調製できる。飼
料補給物質組成物を構成するために適する担体は、次の
ものを包含する：アルファルファ粉末、大豆粉末、綿実
油粉末、アマニユ粉末、魚粉、塩化ナトリウム、塩化カ
ルシウム、硫酸カルシウム、トウモロコシ粉末、サトウ
モロコシシロップ、尿素、骨粉、トウモロコシ穂軸粉
末、イネ穀粉末など。担体は飼料補給物質を配合する最
終飼料中の活性成分の本質的に均一な分布を促進する。
こうして、それは飼料全体を通ずる活性成分の適切な分
布を保証することによって重要な機能をはたす。

【００５２】実施において、通常４.５４ｋｇ（１ポン
ド）以上のプレミックスを飼料１トンに添加して、最終
飼料中に所望レベルの抗生物質を得る。

【００５３】本発明の化合物およびその製薬学的および
薬理学的に許容されうる塩は比較的水中に不活性である
ので、それは、一般に、化合物を動物の飲料水中に投与
するとき、活性化合物を有機溶媒、例えば、メタノー
ル、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド、オ
レイ酸、リノレイン酸、プロピレングリコールなどの中
に溶解し、そしてこの溶液を少量の界面活性剤および／
または分散剤と混合して、動物飲料水中の活性成分の溶
解および／または分散を確保することが望ましい。

【００５４】ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽またはコンパニ
オン動物にｍｇ／ｋｇ体重／日の基準で投与するとき、
前述の動物における原虫類の感染を予防または抑制する
ためには、一般に約０.０００１〜１５ｍｇ／ｋｇ動物
体重／日は有効である。動物の延長した処置のために
は、約０.０００１〜５ｍｇ／ｋｇ動物体重／日の割合
を通常用いる。

【００５５】抗生物質または抗生物質の塩の投与は、一
般に、飼料または飲料水の中で、あるいはそれと一緒に
実施されるのが最も普通である。しかしながら、必要に
応じて、活性化合物またはそれらの製薬学的または薬理
学的に許容されうる塩類は、個々の宿主動物に、丸塊、
ピル、錠剤、飲薬、経口的ゲル、カプセルなどの形態で
投与できる。有利には、活性化合物は、また、溶液、ペ
レット、泥膏、ゲルなどの形態で調製し、そして注射に
より一般に宿主動物の頭または耳の皮下に投与すること
ができる。動物の個々の処置は飼料または飲料水を介す
る群の処置よりも実際的ではないが、個々の処置は小さ
い規模で、例えば、コンパニオン動物、家畜、サーカス
の動物の処置におよび動物学的標本のために使用するた
めに非常に実際的である。

【００５６】抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０α、ＬＬ−Ｅ
１９０２０βまたはその塩類を肉生産動物の成長速度を
増加、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタまたは
家禽あるいはコンパニオン動物、例えば、イヌ、ネコな
どにおける寄生虫および線虫の感染の予防的または治療
的処置のために使用するとき、動物の食物または飲料水
の中にあるいはそれと一緒に投与するとき、一般に約
０.１〜１０００ｐｐｍ、好ましくは約０.１〜３００ｐ
ｐｍの抗生物質は、前記動物における寄生虫および線虫
の感染の予防、抑制または阻止のために有効である。

【００５７】動物飼料中に使用するため、本発明の抗生
物質は一般に担体または希釈剤と混合された比較的高い
百分率の抗生物質を含有する動物飼料の濃縮物、プレミ
ックスまたは補給物質として調製される。次いで、これ
らの濃縮物、プレミックスまたは補給物質は薬物添加飼
料を投与する直前に飼料と混合される。

【００５８】本発明において有用な飼料プレミックス、
濃縮物または補給物質は、約１.０〜２５.０重量％の上
に同定した抗生物質、またはその製薬学的および薬理学
的に許容されうる塩を、約９９.０〜７５重量％の前述
の適当な担体または希釈剤と混合することによって調製
できる。

【００５９】こうして、担体は飼料全体を通ずる活性成
分、すなわち、その０.１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、の
適切な分布を保証することによって重要な機能をはた
す。これは最終飼料中の約０.０００１〜０.１重量％の
活性成分に等しい。実際には、通常飼料の１トンにつき
４.５４ｋｇ（１ポンド）以上のプレミックスを添加し
て、最終飼料中に所望レベルの抗生物質を得る。

【００６０】有利には、より大きい肉生産動物の小さい
数を処置して、それらの中の寄生虫および線虫を抑制す
ることが必要であるとき、抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０
α、ＬＬ−Ｅ１９０２０βまたはその製薬学的および薬
理学的に許容されうる塩を、毎日の基準で、宿主動物
に、薬物添加した経口的ゲル、丸塊、錠剤、カプセル、
ピル、飲薬などの形態で経口的の投与できる。

【００６１】本発明の抗生化合物は、非寄生性の線虫ケ
ノルハブジチス・エレガンス（Caenorhabditis elegan
s）およびヒツジの寄生虫トリコストロンギルス・コル
ブリフォルミス（Trichostrongylus colubriformis）を
抑制するために有効であることが発見された。

【００６２】ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、家禽または
コンパニオン動物のｍｇ／ｋｇ体重／日基準で投与する
とき、前述の動物における原虫類の感染を予防または抑
制するためには、一般に約０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ動
物体重／日は有効である。動物の延長した処置のために
は、約０.０００１〜５ｍｇ／ｋｇ動物体重／日の割合
を通常用いる。

【００６３】実際には、非経口的投与は、一般に、約
０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ動物体重／日の活性成分を供
給するために十分な量の前述の抗生物質または抗生物質
の塩を注射することを包含する。

【００６４】一般的発酵条件ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicu
s）ｓｓｐ・タンザニウス（tanzanius）ＮＲＲＬ１８０
３６の培養は、広範な種類の液体培地中で実施すること
ができる。ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９０
２０βの生産に有用な培地は、炭素の同化源、例えば、
デキストリン、スクロース、糖蜜、グリセロールなど；
窒素の同化源、例えば、蛋白質、蛋白質加水分解物、ポ
リペプチド、アミノ酸、トウモロコシ浸漬液など；無機
のアニオンおよびカチオン、例えば、カリウム、ナトリ
ウム、アンモニウム、カルシウムの硫酸塩、炭酸塩、リ
ン酸塩、塩化物などを含む。微量要素、例えば、ホウ
素、モリブデン等などは、培地の他の構成成分の不純物
として供給される。タンクおよびびんの通気は、無菌の
空気を発酵培地の表面を通してかつその上に強制的に通
すことによって供給される。タンクにおけるそれ以上の
撹拌は、機械的インペラーによって提供される。消泡
剤、例えば、シリコーン油を、必要に応じて、添加でき
る。

【００６５】ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９
０２０βの分離の一般手順ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９０２０βは、
発酵ブロスをｐＨ４.４〜５.５に調節し、ケイ藻土を通
して濾過し、溶媒、例えば、酢酸エチル中に抽出し、濃
縮し、溶媒、例えば、ジクロロメタン中に溶解し、そし
てシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、連続的にジ
クロロメタンおよびメタノール：ジクロロメタン（１：
４）で溶離して粗生成物を得ることによって回収され
る。

【００６６】次いで、粗生成物をαおよびβの成分に分
割し、さらに逆相カラムの高性能液体クロマトグラフィ
ーにかけ、系アセトニトリル、０.１モルの酢酸アンモ
ニウム緩衝液、ｐＨ４.３（１：１）で溶離することに
よって精製する。

【００６７】

【実施例】さらに、本発明を次の非制限的実施例によっ
て説明する。

【００６８】実施例１接種物の調製一次接種物を生長させるために使用した典型的な培地
は、次の処方に従って調製した：デキストロース１.０％デキストリン２.０％酵母エキス０.５％ＮＺアミン（Amine）Ａ^R ０.５％［カゼインの脾臓消化物、米国ニューヨーク州、ノルウィッチ、シェフィールド・ケミカル（Sheffield Chemical）の登録商標］炭酸カルシウム０.１％水１００％とする量この培地をｐＨ７.０に調節し、次いで滅菌した。５０
０ｍｌのフラスコ内のこの滅菌した培地の１００ｍｌの
部分に、ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces
lydicus）ｓｓｐ．タンザニウス（tanzanius）ＮＲＲ
Ｌ１８０３６の寒天斜面からの菌糸体のけずり物で接種
した。次いで、この一次接種物を使用して、びん内の同
一の無菌培地の１０リットルを接種した。この培地を２
４時間生長させて、二次接種物を得た。次いで、この二
次接種物を使用して、タンク内の同一無菌培地の２５０
リットルに接種した。この培地を２８℃において４８時
間生長させ、その間２２０リットル／リットルのマッシ
ュ（mash）／分の無菌空気を流しかつ２２０ｒｐｍで駆
動されるインペラーにより撹拌して、三次接種物を得
た。

【００６９】実施例２発酵次の処方の発酵培地を調製した：デキストリン３.０％糖蜜２.０％大豆ペプトン０.７５％酵母エキス０.２５％炭酸カルシウム０.２％水１００％とする量この培地を滅菌し、次いで２７０リットルに実施例１か
らの三次接種物の３００リットルを接種した。発酵を２
８℃において１１３時間の間実施し、その間０.５５リ
ットル／リットルのマッシュ／分の無菌空気を流しかつ
１００ｒｐｍで駆動されるインペラーにより撹拌して、
マッシュを収穫した。

【００７０】実施例３ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９０２０βの分
離および精製実施例２に記載するように実施した２回の発酵から収穫
したマッシュを一緒にし、合計６０００リットルをつく
り、塩酸でｐＨ５に調節し、そしてケイ藻土で濾過し
た。濾液を酢酸エチルで抽出し、そして抽出液を濃縮し
てシロップを得た。

【００７１】このシロップをジクロロメタン中に溶解
し、そして焼結ガラスの漏斗上の１０００ｇのシリカゲ
ル（６０〜２００メッシュ）へ適用した。このシリカの
カラムをまずジクロロメタンで溶離し、２リットルの分
画を集め、次いでメタノール：ジクロロメタン（１：
４）で溶離して４リットルの分画を集めた。この４リッ
トルの分画を蒸発乾固して１２０ｇの残留物を得た。こ
の残留物を４リットルのジクロロメタン中に溶解し、そ
して焼結ガラスの漏斗上の５００ｇのシリカの上に適用
した。このシリカをメタノール：ジクロロメタン（１：
４）で溶離し、２リットルの分画を集めた。分画１およ
び２を一緒にし、そして蒸発乾固すると、９９ｇの粗製
ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９０２０βが得
られた。

【００７２】この粗生成物をメタノール中に溶解し、そ
して１２リットルの逆相カラム（Ｃ１８結合相４０ミク
ロン）へ適用した。このカラムをアセトニトリル、０.
１モルの酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ４.３（１：
１）で１.０リットル／分の流速において溶離した。１
３の２４リットルの分画を集めた。分画７はＬＬ−Ｅ１
９０２０αを含有し、そして分画１１〜１３はＬＬ−Ｅ
１９０２０βを含有した。抗生物質を移動相からジクロ
ロメタンを使用して抽出し、次いで蒸発しかつｔ−ブタ
ノールから凍結乾燥して、１０ｇのＬＬ−Ｅ１９０２０
αおよび１４ｇのＬＬ−Ｅ１９０２０βを、両者とも白
色固体として、得た。

【００７３】参考例１パステレラのディスク試験無菌の紙のディスク［直径０.６３５ｃｍ（１／４イン
チ）］を試験化合物の２.５ｍｇ／ｍｌの溶液中でソー
キングし、そして３７℃のインキュベーター内で一夜乾
燥する。標準の抗生物質の対照ディスクを、試験化合物
のディスクと一緒に試験のために調製する。乾燥したデ
ィスクを使用するまで２〜４℃において貯蔵した。２種
類の有機体、パステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella m
ultocida）３１０８１Ｂおよびパステレラ・ヘモリチカ
（Pasteurrella haemolytica）３０６６０、を脳−心イ
ンヒュージョンブロス中で３７℃において５時間培養す
る。各培養物の１：１０希釈物をミュラー−ヒントンの
ブロス中で構成した。２００ｍｌのミュラー−ヒントン
寒天に前記希釈した培養の１ｍｌを接種し、そしてヌン
ク（Nunc）製の２２.８６ｃｍ×２２.８６ｃｍ（９イン
チ×９インチ）のバイオアッセイ用板の中に無菌的に注
ぐ。２２.８６ｃｍ×２２.８６ｃｍ（９インチ×９イン
チ）の板の使用は、３６ディスク／板の試験を可能とす
る。適当なディスクを接種した寒天板に適用し、そして
３７℃において１８〜２０時間インキュベーションす
る。阻害のゾーンを記録する。

【００７４】Ｔ．ヒオディセンテリアエのディスク試験無菌の紙のディスク［直径０.６３５ｃｍ（１／４イン
チ）］を試験化合物の２.５ｍｇ／ｍｌの溶液中でソー
キングし、そして３７℃のインキュベーター内で一夜乾
燥する。標準の抗生物質の対照ディスクを、試験化合物
のディスクと一緒に試験のために調製する。乾燥したデ
ィスクを使用するまで２〜４℃において貯蔵した。２種
類の有機体、Ｔ．ヒオディセンテリアエ（T. hyodysent
eriae）菌株ｂ７８（ＡＴＣＣ２７１６４）およびＢ
２０４（ＡＴＣＣ３１２１２）を、２％の胎児子牛血
清を補充した５ｍｌの脳−心インヒュージョンブロスを
含有するフンゲイト（Hungate）培養管（無菌的に調製
する）内で３７℃において２４時間培養する。５％の脱
フィブリル化したウシ血液を含有するトリプチカーゼ
（trypticase）大豆寒天の２００ｍｌに培養物の１ｍｌ
を接種し、そしてヌンク（Nunc）製の２２.８６ｃｍ×
２２.８６ｃｍ（９インチ×９インチ）のバイオアッセ
イ用板の中に無菌的に注ぐ。２２.８６ｃｍ×２２.８６
ｃｍ（９インチ×９インチ）の板の使用は３６ディスク
／板の試験を可能とする。適当なディスクを寒天板に適
用し、次いで８０％の窒素、１０％の二酸化炭素および
１０％の水素を含有する嫌気的室内で３７℃において２
４〜４８時間インキュベーションする。阻害された溶血
のゾーンを記録する。

【００７５】寒天希釈による最小阻止濃度の手順１．薬物の系列的２つの流れの希釈物を、ミュラー−ヒ
ントンのブロス中で２４６０〜０.１５μｇ／ｍｌの範
囲において、溶媒の対照と一緒に調製する。

【００７６】２．２ｍｌの薬物希釈物（１０×）を無菌
のねじぶた付きびんに添加し、これに５.６％の脱フィ
ブリル化したヒツジ血液を含有するミュラー−ヒントン
寒天の１８ｍｌを添加する。最終薬物濃度は、５％のヒ
ツジ血液を含有する寒天中において２５６〜０.０１５
μｇ／ｍｌの範囲である。

【００７７】３．各試験有機体のいくつかの分離したコ
ロニーを、５ｍｌのトリプチカーゼ大豆ブロスまたは脳
一心インヒュージョンブロス中に接種する。培養物を３
５℃において５時間振盪する。

【００７８】４．各培養物をミュラー−ヒントンのブロ
ス中で１：５０（１０^-1.5）に希釈し、そしてスチーア
ズ（Steers）複製器を使用して寒天板に適用する。対照
の板は最後に接種して、生存しうる有機体がこの手順全
体を通じて存在することを保証すべきである。接種した
寒天板を、接種のスポットが完全に吸収されるまで、放
置する。

【００７９】５．板を倒立させ、そしてＣＯ₂の不存在
下に３５℃において１８時間インキュベーションする。

【００８０】６．最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、完全な阻
害が起こる抗微生物剤の最低濃度として採用する。非常
に微細な肉眼で見えるくもりまたは単一のコロニーは無
視する。

【００８１】ＭＩＣ試験の有機体スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）ＡＴＣＣ２５９３２スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）５２“スミス（Smith）菌株” スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）１４ＡＴＣＣ６５３８Ｐスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）３３５マスチチス（Mastitis）分離物スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）３３６マスチチス（Mastitis）分離物スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）３４４マスチチス（Mastitis）分離物スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ピロゲネス（Streptococcus pyog
enes）ＡＴＣＣ１９６１５ストレプトコッカス・ピロゲネス（Streptococcus pyog
enes）４１ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus
agalactiae）３４１ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus
agalactiae）３４２ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus
agalactiae）３４３ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ（Streptococcu
s dysgalactiae）３４０ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus faec
alis）４２ジューク（Juke）博士の＃８０４３ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberi
s）コーネル・マニアチス・センター（Cornell Maniati
s Center）大腸菌（Escherichia coli）ＡＴＣＣ２５９９２大腸菌（Escherichia coli）８１大腸菌（Escherichia coli）８０−６５４テトラサイ
クリン耐性パステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella multocida）３
１０８１Ｂ（生体外ディスクの菌株）パステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella multocida）８
０−３５４８（生体内マウスのモデルの菌株）パステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella multocida）３
１４５１パステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella multocida）３
２３０１パステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella multocida）３
０１７０Ｂパステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella multocida）８
０−５９４５パステレラ・ヘモリチカ（Pasteurrella haemolytica）
３０６６０（生体外ディスクの菌株）パルテレラ・ヘモリチカ（Pasteurrella haemolytica）
Ｌ−１０１ナショナル・アニマル・ディジーズ・セン
ター（National Animal Desease Center）パステレラ・ムルトシダ（Pasteurrella multocida）８
０−６７４４サルモネラ・コレラエスイス（Salmonella choleraesui
s）バル・クンゼンドルフ（Var.Kunzendorf）Ｉ−３サルモネラ・コレラエスイス（Salmonella choleraesui
s）バル・クンゼンドルフ（var.Kunzendorf）４ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchise
ptica）“Ｂ”菌株ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchise
ptica）１１２６６ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchise
ptica）３１０６８Ｂボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchise
ptica）１１９４８Ａマイコプラズマ・ガリセプチクム（Mycoplasma gallise
pticum）による最小阻害濃度のアッセイ１．薬物原溶液の系統的２倍希釈物を、マイコプラズマ
のブロス中で２５６０〜０.０１５μｇ／ｍｌの濃度に
おいて、溶媒対照と一緒に調製する。これらの濃度は最
終試験濃度の１０倍である。

【００８２】２．マイコプラズマ・ガリセプチクム（My
coplasma gallisepticum）“Ｒ”菌株の凍結した（−８
０℃）の原培養を融解し、そして０.５ｍｌのアリコー
トを５ｍｌのマイコプラズマの培養ブロス中に接種し
た。同時に、０.１ｍｌを純粋な検査物としてマイコプ
ラズマ寒天板上へプレティングする。両者の培養物を３
７℃においてインキュベーションする。ブロス中の生長
は赤から黄色の色変化によって指示される。寒天上の生
長はステレオコープの助けによって観測する。

【００８３】３．ＭＩＣアッセイを９６ウェル（Well）
のマイクロタイタープレート（microtiter plate）にお
いて実施する。各試験ウェルに、２５μｌの１０×薬物
溶液のアリコートを入れる。適当な溶媒の対照を、ま
た、含める。

【００８４】４．マイコプラズマの接種物は、０.２ｍ
ｌの培養物：５.０ｍｌの培地の比を用いて陽性のブロ
スの培養を新鮮な培地に移すことによって調製する。よ
り大きい量の接種物は、上の処方を用いて必要に応じて
調製する。

【００８５】５．前に接種したマイコプラズマのブロス
の２２５μｌのアリコートＰを各試験ウェルに添加し、
そして混合する。プラスチックのシール用テープを適用
し、そして小さい孔を無菌の２５ゲージの針で各試験ウ
ェルの中央に開ける。ウェルの交差汚染を回避するため
に、針は各薬物について交換する。さらに、テープの孔
開けは薬物の最低濃度から最高濃度へ進行させる。最終
の試験濃度は２５６〜０.０１５μｇ／ｍｌの範囲であ
り、合計の体積は２５０μｌである。２５０μｌの接種
した培地のみを含有するウェルおよび接種しない培地を
含有するウェルを、追加の対照として添加する。

【００８６】６．アッセイの板は３７℃において、赤か
ら黄色へのブロスの色変化が最初に試験板全体に均一に
起こるまで、インキュベーションする。ＭＩＣ値は、ブ
ロスの色（赤）が未変化にとどまる濃度として記録す
る。

【００８７】

【表５】

【００８８】

【表６】

【００８９】

【表７】

【００９０】参考例２ニワトリの生長速度を増加しかつ飼料の利用効率を改良
するための試験化合物の評価この試験において、生後１日のペターソンＸアーバー・
アクレス（Peterson XArbor Acres）ヒヨコを１つのか
ごにつき５匹の雄および５匹の雌の等しい体重の群に分
類する。かごを処置群についてランダム化し、各処置に
ついて６回の反復実験を実施する。各化合物は食物中に
おいて５０ｐｐｍおよび１００ｐｐｍで試験し、そして
薬物添加しない食物を与えたヒヨコに対して評価する。

【００９１】ヒヨコは試験の開始時およびその１週の間
隔で前記試験の終結まで秤量する。ヒヨコに飼料および
水を試験期間全体にわたって自由に与える。飼料は、ヒ
ヨコに与える時に秤量し、そしてかごを掃除する時に秤
量する。

【００９２】試験に使用した家禽の食物は、次の通りで
ある：ビタミン−アミノ酸予備混合物０.５％微量無機物質０.１％塩化ナトリウム０.３％リン酸二カルシウム１.２％石灰石粉砕物０.５％安定化油脂４.０％脱水したアルファルファ、１７％の蛋白質２.０％トウモロコシグルテン粉末、４１％の蛋白質５.０％メンハーデン魚粉、６０％の蛋白質５.０％大豆油粉末、４４％の蛋白質３０.０％粉砕した黄色トウモロコシ粉末、微細（fine to）１００％上の飼料組成物中のビタミン−アミノ酸予備混合物を、
次の処方から調製する。量の表現は、最終飼料組成物の
１ｋｇ当りの単位に関する。

【００９３】ブチル化ヒドロキシトルエン１２５.０ｍｇｄｌ−メチオニン５００.０ｍｇビタミンＡ３３００.０ＩＵビタミンＤ₃ １１００.０ＩＣＵリボフラビン４.４ｍｇビタミンＥ２.２ＩＵナイアシン２７.５ｍｇパントテン酸８.８ｍｇコリン塩化物５００.０ｍｇ葉酸１.４３ｍｇメナジオン重亜硫酸ナトリウム１.１ｍｇビタミンＢ₁₂ １１.０ｍｃｇ粉砕した黄色トウモロコシ粉末、微細５.０ｍｇ得られたデータを下表ＶＩＩＩに報告し、ここで理解さ
れるように、抗生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ
−Ｅ１９０２０βの両者はヒヨコの重量増加を改良し、
そしてこれにより薬物添加しない対照よりも飼料の利用
効率を増加した。

【００９４】

【表８】

【００９５】参考例３家禽の重量増加を増加しかつ飼料の利用効率を改良する
ための試験化合物の評価生後１日のペターソンＸアーバー・アクレス（Peterson
X Arbor Acres）ヒヨコの５匹の雄および５匹の雌を、
１組のかご割当てる。かごは処置の群に対してランダム
化し、処置につき７回の反復実験について実施する。各
化合物を食物中において１２.５、２５、５０、１００
および２００ｐｐｍにおいて試験する。陽性の標準は２
００ｐｐｍのペニシリンである。食物は毎週調製する。
この研究は異常に高い死亡率（６.２％）を有する。死
亡率は通常３％より低い。雄の死亡は３：１の比で雌の
死亡に数がまさるので、この高い死亡率は明らかに同定
のために雄の足指を切り取ったためである。さらに、雄
の重量増加の改良は雌の重量増加の改良よりも低かっ
た。これは最初に研究の場合に当てはまらない。データ
を表ＩＸおよびＩＸＡに要約する。

【００９６】この試験において使用した食物は、上の実
施例５に記載するのと同一である。

【００９７】

【表９】

【００９８】上の手順に従うが、投与の割合を変化さ
せ、そして試験期間を７週に延長し、飼料効率およびヒ
ヨコの体重増加を再び決定し、そして得られたデータを
下表ＩＸＡに報告する。

【００９９】

【表１０】

【０１００】

【表１１】

【０１０１】参考例４試験化合物の経口的投与によるプロピオネートの増強活
性の決定これらの試験において、フィステル形成した去勢牛（fi
stulated steer）から得たこしたこぶ胃の液体（２.５
ｍｌ）を、１２.５ｍｇ／ｍｌの基質（６０.５％のトウ
モロコシ澱粉、２５.９％の必須アミノ酸混合物および
１３.６％のα−セルロース）および適当な濃度の薬物
を含有するマクドガル（McDougall）の人工唾液緩衝液
の２.５ｍｌと一緒に、ガス解放弁を有する密閉したバ
イアルを使用して、振盪水浴中で２０〜２４時間インキ
ュベーションする。薬物を０.１％のツイーン２０−エ
タノール−水のビヒクル中に溶解または懸濁し（必要に
応じて超音波処理する）、そして２５〜５０μｇ／ｍｌ
をインキュベーションに添加する。この反応を６ＮＨ
Ｃｌで停止させ、そして２０,０００×ｇで遠心する。
上澄みのアリコートを気液クロマトグラフィーによって
発揮性脂肪酸（ＶＦＡ）について分析する。

【０１０２】この試験においてアセテート／プロピオネ
ート比を減少することによって決定したプロピオネート
の生成を増強させる化合物は、反すう動物における飼料
の利用効率を増加させることが一般に発見される。デー
タを表ＸおよびＸＩに要約する。

【０１０３】

【表１２】

【０１０４】

【表１３】

【０１０５】

【表１４】

【０１０６】

【表１５】

【０１０７】参考例５殺コクシジウム剤としての試験化合物の評価−エイメリ
ア・テネラ（Eimeria tenella）抗コクシジウム性細胞培養スクリーン（E. tenella）単層を生後７日のニワトリから得た一次賢細胞から開始
する。一般に、５０,０００の細胞を１ｍｌの容量の培
地中において２４ウェル群の板中に投与する。選択する
培地は０.１２５％のＮａＨＣＯ₃で緩衝化したＭ１９９
である。５％の胎児ウシ血清を添加して培地を完成す
る。

【０１０８】接種および薬物添加の前に、単層を５０％
の全面生長に生長させる。通常、これは５％のＣＯ₂−
９５％の空気の雰囲気中で４１℃に保持した湿潤化イン
キュベーター中で４８時間を要する。

【０１０９】６０,０００／１ｍｌの E. tenella の種
虫を含有する接種物（合計２ｍｌの容量）を、利用して
全面生長の単相を適切に感染させる。初期の培地をアス
ピレーションした後、１.９ｍｌの種虫含有維持培地を
投与する。

【０１１０】薬物は、種虫の導入直後に０.１ｍｌの容
量で、前もって決定した濃度で投与する。概して、合成
化合物は１ｐｐｍで試験し、そして組成の発酵生産物は
１：２００の希釈率で試験する。前者はジメチルスルホ
キシド中に溶解し、そして後者はリン酸塩緩衝化生理的
食塩水中に溶解する。ペニシリンおよびストレプトマイ
シンをすべての培地に添加して、起こりうる汚染を抑制
する。

【０１１１】処置は、接種後９６〜１２０時間に、倒立
相コントラスト顕微鏡によって細胞障害性および抗コク
シジウム活性について観察する。寄生虫の生活環の第２
世代の無性段階の発育を防止または著しく減少する薬剤
を活性と考える。全面的な細胞障害性のために抗コクシ
ジウムの読みを妨げる薬物は、終点が達成されるまで、
２倍に希釈する。活性剤は、一般に不活性まで希釈し
て、関連する効能を決定する。

【０１１２】モネンシン（monensin）およびロベニジン
（robenidine）を、すべての実験において、陽性の標準
として含める。得られたデータを下表ＸＩＩに報告す
る。

【０１１３】表ＸＩＩ生体外抗コクシジウムスクリーンを使用する試験化合物の評価−Eimeria tenella 化合物５２.５１.２５０.６０.３０.１５ＬＬ−Ｅ１９０２０α ＴＴＡＡａ０ＬＬ−Ｅ１９０２０β ＴＴＴＡＡＡ性能の等級Ｔ＝毒性Ａ＝活性ａ＝限界の活性０＝不活性参考例６殺コクシジウム剤としての試験化合物の評価−エイメリ
ア・ミチス（Eimeria mitis）抗コクシジウム胚化（embryonated）卵アッセイ−E. mi
tis 年令１０日のヒヨコの胚を、生存能力について透かして
調べ、そして各々５個の卵の群に配置する。小さい孔
を、化学薬物の通路として、漿尿膜腔中に開ける。合成
化合物は１ｍｇ／胚でスクリーニングし、そして粗製天
然生産物は０.２ｍｌ／胚でスクリーニングする。ペニ
シリン／ストレプトマイシンを利用して汚染を抑制す
る。薬物を無菌のツベリクリン注射器で投与した後、ピ
ンホールをコロジオンでシールする。胚を３９.４℃
（１０９°Ｆ）設定した湿潤インキュベーターに戻し、
そして２４時間保持する。次いで、すべての胚を透かし
て調べて、薬物処置の毒性のため死んだものを除去す
る。次いで、生きているすべての胚をもとのピンホール
を通して、０.１ｍｌの容量の８０,０００の E. mitis
種虫で接種する。胚を再びシールし、そしてインキュベ
ーターに戻す。６日後、すべての胚を再び透かして調
べ、そして死んだものを除去し、そして記録する。各処
置からの繊毛尿（chorioallantonic）（ＣＡＭ）膜をプ
ールし、そして５０〜７０ｍｌの水道水中で均質化す
る。次いで、卵母細胞を血球計で計数する。薬物添加し
ない接種した対照の４回の反復実験において検出された
数に比較して、８０％以上の卵母細胞の減少が存在した
場合、処置は活性であると考える。有効な抗コクシジウ
ムの読みのためには２以上の胚が生きていなくてはなら
ない。１つまたは０の卵が６日後に残る群において、抗
コクシジウムの読みが実現できるまで、２倍の希釈を実
施する。ロベニジンを陽性の薬物として０.１ｍｇ／胚
で使用する。

【０１１４】利用した E. mitis は、胚中の反復継代培
養によって、このアッセイにおいて適合可能とした（P.
L. Long）。

【０１１５】得られたデータを下表ＸＩＩＩに報告す
る。

【０１１６】表ＸＩＩＩ殺コクシジウム剤としての試験化合物の評価−Eimeria mitis 化合物１０.５０.２５ＬＬ−Ｅ１９０２０α ＡＡ０ＬＬ−Ｅ１９０２０β ０性能の等級Ｔ＝毒性Ａ＝活性ａ＝臨界の活性０＝不活性参考例７ウシバベシア（Babecia bovis）およびバベシア・ビゲ
ミナ（Babecia bigemina）の抑制についての試験化合物
の評価これらの評価のため、ウシバベシア（Babecia bovis）
およびバベシア・ビゲミナ（Babecia bigemina）の実験
室の培養物を、連続的に維持する。正常の供与体の動物
を、正常の赤血球（ＲＢＣ）および血清の源として維持
する。

【０１１７】バベシアの培養を次のようにして維持す
る：１．各フラスコ内で生長するバベシアの百分率を決定す
る。百分率が１０％より下であるとき、培養物を供給す
る。

【０１１８】２．フラスコ内のバベシアの百分率が１０
〜２０％でありかつ細胞およびバベシアが健康に見える
とき、培養物を薬物のスクリーニングのための分割また
は使用すべきである。

【０１１９】Ａ．バベシアの培養のための培地３０ｍｌの１９９［アールス（Earls）培地２０ｍｌの血清１ｍｌのＴＥＳｐＨ（７.００）を検査し、必定に応じて調節する。

【０１２０】滅菌濾過する。

【０１２１】Ｂ．バベシアの培養物の供給培養において培地を除去し量と正確に同一の量を常に準
備する。

【０１２２】Ｃ．バベシア培養物の分割フラスコから培地を取り出すが、赤血球を取り出さな
い。取り出した正確な量の培地＋血清＋ＴＥＳを添加す
る。おだやかに混合する。

【０１２３】１０ｍｌの上のおだやかに混合したバベシ
ア培養物を、３０ｍｌの１９９培地／血清ＴＥＳおよび
３ｍｌの赤血球に添加する。バベシア培養物を１：４に
分割する。

【０１２４】フラスコの大きさに依存して、生存しうる
培養物を維持するために必要な量の分割したバベシア培
養物を使用する。

【０１２５】２００ｍｌ＝４５ｍｌの分割したバベシア
培養物３０ｍｌ＝１５ｍｌの分割したバベシア培養物薬物スクリーニングのためのバベシア培養物の調製１．５０ｍｌの培地１９９＋血清＋ＴＥＳを構成する
（ｐＨおよびフィルター）。

【０１２６】２．感染した培養物のスライドをつくり、
そして感染した細胞の％を決定する。

【０１２７】３．培地１９９中の５％の懸濁液および
６.７％の懸濁液または正常のウシ赤血球＋血清＋ＴＥ
Ｓを構成する。

【０１２８】４．感染した細胞を６.７％の懸濁液また
は正常の赤血球中で希釈して、４％の感染した細胞を含
有する最終の懸濁液を得る。

【０１２９】マイクロタイタープレートの調製１．プレートを次のように標識する：ａ．列Ａ＝２００μｇの５％の懸濁液正常の赤血球ｂ．列Ｂ＝１５０μｇの４％の懸濁液感染した細胞＋５
０μｌの培地ｃ．列Ｃ＝１５０μｇの４％の懸濁液感染した細胞＋５
０μｌの薬物濃度ｄ．列Ｄ＝１５０μｇの４％の懸濁液感染した細胞＋５
０μｌの薬物濃度ｅ．列Ｅ＝１５０μｇの４％の懸濁液感染した細胞＋５
０μｌの薬物濃度ｆ．列Ｆ＝１５０μｇの４％の懸濁液感染した細胞＋５
０μｌの薬物濃度ｇ．列Ｇ＝１５０μｇの４％の懸濁液感染した細胞＋５
０μｌの薬物濃度ｈ．列Ｈ＝１５０μｇの４％の懸濁液感染した細胞＋５
０μｌの薬物濃度２．プレートが完成した後、インキュベーター内に一夜
（１８時間）配置する。

【０１３０】３．２５μｌの³Ｈハイプキサンチンを各
ウェルに次の朝添加する。

【０１３１】４．プレートをその日の終りにフリーザー
に入れる。

【０１３２】５．２時間インキュベーションした後、プ
レートを収穫し、そしてシンチレーションカウンター内
の計数のために準備する。

【０１３３】薬物の調製１．１０ｍｇの薬物を秤量し、無菌の１５ｍｌの管に入
れる。１０ｍｌの培地１９９＋血清＋ＴＥＳを添加し
て、１ｍｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度をつく
る。

【０１３４】注：溶解しない場合、１０ｍｌの７０％の
エタノール（ＥＴＯＨ）＋３０％のＨ₂Ｏを添加する。

【０１３５】２．フィルター薬物濃度希釈倍数培養物中の最終濃度ａ．１０００μｇ／ｍｌなし１５０μｇ／ｍｌｂ．５００μｇ／ｍｌａの１：２１２５μｇ／ｍｌｃ．２００μｇ／ｍｌａの１：５５０μｇ／ｍｌｄ．１００μｇ／ｍｌａの１：１０２５μｇ／ｍｌｅ．５０μｇ／ｍｌｂの１：１０１２.５μｇ／ｍｌｆ．２０μｇ／ｍｌｃの１：１０５μｇ／ｍｌ次いで１０００ｇ／ｍｌを１：５０＝２０μｇ／ｍｌに
希釈する。

【０１３６】ａ．２０ａμｇ／ｍｌなし５μｇ／ｍｌｂ．１０ μｇ／ｍｌａの２：２２.５μｇ／ｍｌｃ．５ μｇ／ｍｌｂの１：２１.２５μｇ／ｍｌｄ．２.５μｇ／ｍｌｃの２：２０.６２５μｇ／ｍｌｅ．１.２５μｇ／ｍｌｄの２：２０.３１μｇ／ｎｆ．０.６２５μｇ／ｍｌｅの２：２０.１５５μｇ／ｍｌ抗ウシバベシア（Babecia bovis）活性手順：ウシバベシア（Babecia bovis）を生体外培養に
おいて維持する。培養物を希釈して４％の寄生虫血症に
し、そして種々の薬物希釈物を使用して培養した。１８
時間のインキュベーション後、３Ｈハイポキサンチンを
添加し、そして培養物をさらに１８時間インキュベーシ
ョンした。板を収穫し、そして試料を計数した。生長の
阻害は３Ｈハイポキサンチンの組込みの減少を生ずる。
薬物を２回の反復実験および２種類の異なる時間間隔に
おいて評価する。この手順を使用して、ＬＬ−Ｅ１９０
２０αの５０％の阻害濃度は０.６２５μｇ／ｍｌであ
ることがわかった。

【０１３７】抗バベシア・ビゲミナ（Babecia bigemin
a）活性手順：バベシア・ビゲミナ（Babecia bigemina）を生体
外培養において維持する。培養物を希釈して４％の寄生
虫血症にし、そして種々の薬物希釈物を使用して培養し
た。１８時間のインキュベーション後、３Ｈハイポキサ
ンチンを添加し、そして培養物をさらに１８時間インキ
ュベーションした。板を収穫し、そして試料を計数し
た。生長の阻害は３Ｈハイポキサンチンの組込みの減少
を生じ、そしてこれを第９図に示す。薬物を２回の反復
実験および２種類の異なる時間間隔において評価する。

【０１３８】参考例８自由に生きている線虫ケノルハブジチス・エレガンス
（Caenorhabditis elegans）の抑制についての試験化合
物の評価培養物の維持：ケノルハブジチス・エレガンス（C. ele
gans）［Ｊ．レウィス（Lewis）からのブリストール（B
ristol）菌株］を、２０℃においてＮＧ寒天板上の大腸
菌（E. coli）の菌叢上で維持する。新しい培養物を毎
週確立する。

【０１３９】試験のための線虫は、４〜５日古い培養物
から、新鮮なかい虫リンゲル溶液（ＦＡＲＳ）を使用し
て洗浄する。かい虫をゲンタマイシンを含有するさらに
ＦＡＲＳでさらに洗浄して、最近の汚染を減少し、そし
て遠心して洗浄溶液からかい虫を分離する。次いで、洗
浄したかい虫をＣ．ブリガサエ（briggasae）維持培地
（ＣｂＭＭ）［ギブコ・ラボラトリーズ（GIBCO Labora
tories）、米国ニューヨーク州１４０７２、グランド・
アイランド、ステイレイ・ロード３１７５から入手可
能］に添加し、これにゲンタマイシン（６００単位／ｍ
ｌ）およびファギシジン（mycostatin）（０.５ｍｇ／
ｍｌ）を添加する。

【０１４０】化合物をアセトン中に溶解し、そして等部
の水で容量を構成する。混合物中の各化合物の最終試験
濃度は１５０ｐｐｍである。試験物質はマイクロピペッ
ト（２５μｌ）で９６ウェルの無菌組織培養板［コスタ
ー（ＣＯＳＴＡＲ）、米国マサチュセッツ州０２１３
９、ケンブリッジ、ブロードウェイ２０５］の単一のウ
ェルに入れ、そして直ちに使用するか、あるいはフリー
ザー内に貯蔵する（化合物への見掛けの悪い作用は存在
しない）。

【０１４１】ＣｂＭＭ中の C. elegans の新しく調製し
た容量（５０μｇ）を、各処理したウェルおよび板につ
き数個の対照ウェルにマイクロピペットで入れる。

【０１４２】効能についての観察は、浸漬後４、２４お
よび４８時間に解剖用顕微鏡で実施する。プレートを読
む直前に、それをあだやかに軽くたたいて、かい虫の動
きを刺激する。活性は、成虫および幼虫の動きへの薬物
の作用に基づいて、主観的であるが、半定量的に判断す
る。基準は次の通りである：９＝マイクロフィルター試
験溶液中に浸漬後４時間以内における虫の不動または
死、８＝不動、７＝虫のほぼ９５％の動きの著しい減
少、６＝動きの減少、５＝動きのわずかの減少、０＝正
常の動き、対照と同じ。活性を示す他の因子は、容易に
認められ、例えば、死、リガー・モーチス（riger mort
is）、収縮、コイル状、麻痺、異常なよじれ、４８時間
以内の虫の集団の異常な減少および正常な挙動からの他
の逸脱である。

【０１４３】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを使用する試験結果化合物割合ｐｐｍ評価ＬＬ−Ｅ１９０２０α １５０９（不動または死）ＬＬ−Ｅ１９０２０β １５０９（不動または死）参考例９トリコストロンギルス・コルブリフォルミス（Tichostr
ongylus colubriformis）／アレチネズミ（Gerbil）抗寄
生虫評価アレチネズミに、ヒツジの寄生虫トリコストロンギルス
・コルブリフォルミス（T. colubriformis）の４００匹
の幼虫を第０日に感染させる。第７日に、アレチネズミ
を２〜３匹の動物の試験群および処置しない対照群に分
割する。薬物を飼料中に投与し、そして第７〜１１日に
与えた。薬物は、また、ガバージュ（単一の経口的投
与）で投与するか、あるいは皮下注射することができ
る。単一の投与は通常第７日に実施される。

【０１４４】アレチネズミを第１１日に殺し、そして小
腸を切除する。処置した動物の腸内に残る T. colubrif
ormis の数を計数し、そして処置しない対照中に残る数
と比較する。試験の結果を下に報告する。

【０１４５】化合物投与量除去された虫、％ＬＬ−Ｅ１９０２０α ２５０ｐｐｍ食物５６ＬＬ−Ｅ１９０２０β ２５０ｐｐｍ食物１００１５０ｐｐｍ食物８６６２.５ｐｐｍ食物３２ＬＬ−Ｅ１９０２０α １０ｍ／ｋｇ単一経口的投与２３ＬＬ−Ｅ１９０２０β ５ｍ／ｋｇ単一経口的除１９

【図面の簡単な説明】

【図１】ＬＬ−Ｅ１９０２０αの紫外線吸収スペクトル
を示す。

【図２】ＬＬ−Ｅ１９０２０αの赤外線吸収スペクトル
を示す。

【図３】ＬＬ−Ｅ１９０２０αのプロトン核磁気共鳴ス
ペクトルを示す。

【図４】ＬＬ−Ｅ１９０２０αの炭素−１３核磁気共鳴
スペクトルを示す。

【図５】ＬＬ−Ｅ１９０２０βの紫外線吸収スペクトル
を示す。

【図６】ＬＬ−Ｅ１９０２０βの赤外線吸収スペクトル
を示す。

【図７】ＬＬ−Ｅ１９０２０βのプロトン核磁気共鳴ス
ペクトルを示す。

【図８】ＬＬ−Ｅ１９０２０βの炭素−１３核磁気共鳴
スペクトルを示す。

【図９】Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａの成長についてのＬ
Ｌ−Ｅ１９０２０αの作用を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｈ 15/26 Ｃ０７Ｈ 15/26 Ｃ１２Ｐ 19/58 Ｃ１２Ｐ 19/58 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 19/58 Ｃ１２Ｒ 1:465）微生物の受託番号ＮＲＲＬ１８０３６ (72)発明者ジヨセフ・ジエイコブ・グツドマンアメリカ合衆国ニユーヨーク州10977スプリングバレイ・グロトクロード134 (72)発明者ドナルド・ブルース・ボーダーズアメリカ合衆国ニユーヨーク州10901サフアーン・ヘザーヒルレイン13 (72)発明者ウイリアム・マイケル・メイエスアメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08807ブリツジウオーター・シヤーウツドロード891 (72)発明者レイモンド・トマス・テスタアメリカ合衆国ニユージヤージイ州 07009シーダーグローブ・ロツクレツジプレイス55 (72)発明者アーウイン・ボイデン・ウツドアメリカ合衆国ペンシルベニア州19067 モリスビル・エルムアベニユー211 (72)発明者メアリイ・エーラーズ・ドツシヤーアメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08690トレントン・ゲイリイドライブ147 (72)発明者シドニイ・カンターアメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08513クランベリイ・マーチンバンビユーレンドライブ４エイ (72)発明者ロバート・リー・ケネツト・ジユニアアメリカ合衆国ニユージヤージイ州ランバートビル・アールデイ１・ボツクス 203

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】栄養培地において、下記式で示される抗
生物質ＬＬ−Ｅ１９０２０αおよびＬＬ−Ｅ１９０２０
βを産生しうるストレプトマイセス・リジクス（Strept
omyces lydicus）。式【化１】式中、ＬＬ−Ｅ１９０２０αは、Ｒ₁がベンジルカルボ
ニル基を表し、そしてＲ₂が水素原子を表す：ＬＬ−Ｅ
１９０２０βは、Ｒ₁が水素原子を表し、そしてＲ₂がベ
ンジルカルボニル基を表す。