JP2564586B2 - 葉酸類縁体のアミン誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の分野 本発明は、部位選択的に付着した抗体−治療剤複合体
に関するものである。特に、本発明は、葉酸類縁体の反
応性アミンを介して抗体または抗体フラグメントに共有
結合した葉酸類縁体の誘導体を含むものである。抗体複
合体の製造方法ならびに生体内抗体複合体の使用方法が
記載されている。また、メトトレキセートおよびアミノ
プテリンのごとき葉酸類縁体の反応性アミン含有誘導体
の合成方法が含まれている。

2.発明の背景 2.1.メトトレキセートおよびアミノプテリンの誘導体 ロソウスキーら［Rosowsky et al.（1981,J.Med.Che
m.24:1450,以下「ロソウスキーらＩ」という）］は、ジ
エチルホスホロシアニデートのごときペプチド結合形成
剤によりカップリングされる適切に保護されたＬ−グル
タミン酸前駆体への４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−
メチルプテロイン酸（MAPA）のカップリング、つづいて
ヒドラジンとの反応および保護エステル部位の除去によ
るメトトレキセートのヒドラジド誘導体の製造方法を述
べている。このMAPAは、公知の化学合成方法［ロソウス
キーら（Rosowsky et al.），（1985 J.Med.Chem.（以
下、「ロソウスキーらII」という）；チャイコフスキー
ら（Chaykovsky et al.）,J.Med.Chem.17;1212;パイパ
ーら（Piper et al.,）1974,J.Org.Chem.42:208参照］
により、あるいはカルボキシペプチダーゼG₁によるメト
トレキセートの開裂［マーチネリら（Martinelli et a
l.）,1979,J.Med.Chem.22:869;マクローら（McCullough
et al.,）,1971,J.Biol.Chem.246:720参照］により調
製できる。前記ロソウスキーらＩの方法によれば、Ｌ−
グルタミン酸−γ−メチルエステルが70％の過塩素酸の
存在下にｔ−ブチルアセテートでエステル化されてα−
ｔ−ブチル−γ−メチルグルタミン酸が形成される。こ
のＣ−保護α−ｔ−ブチル−γ−メチルグルタミン酸エ
ステルは、トリエチルアミン含有ジメチルホルムアミド
（DMF）中でMAPAをジエチルホスホロシアニデートと約8
0℃で２分間加熱し、ついでグルタミン酸誘導体を添加
することによりMAPAと縮合される。加熱は約80℃でさら
に２時間続けられ、ついで減圧下に溶媒を蒸発させ、シ
リカゲル上でクロマトグラフィーを行うと、MTX−α−
ｔ−ブチル−γ−メチルエステルが形成される。MTXジ
エステルとメタノール溶液中のヒドラジンとの４℃での
60時間の反応は、α−ブチルエステルγ−ヒドラジドを
生じる。1NのHC1中のブチルエステルの50℃での１時間
の加酸分解、つづくDEAEセルロース上でのイオン交換ク
ロマトグラフィーは、所望のMTX−γ−ヒドラジドを形
成する。

ロソウスキーらの方法は、つぎのごとき数多くの欠点
を有している。

（１）使用される中間体、例えばα−メチルエステル−
ｔ−ブチルグルタミン酸は遊離の塩基として不安定であ
り、また （２）アミノプテリン−α−ヒドラジドの高い収率は、
４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロイン
酸からのホルミル保護基の不所望の早過ぎる除去が後続
する加ヒドラジン分解（相当するアミノプテリン類縁体
の形成に要する）の間に起こるので、容易に得られるMA
PA類縁体４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプ
テロイン酸を利用するこの方法を用いては得られない。

メトトレキセートおよび／またはアミノプテリンのア
ミノ酸およびペプチド誘導体の多くは、すでに記載され
ている［例えば、「メトトレキセートおよびアミノプテ
リンのシステイン酸およびホモシステイン酸類縁体」と
題したロソウスキーの米国特許第4,490,529号、ケムプ
トンら（Kempton et al.）,1982,J.Med.Chem.25:475:パ
イパーら（Piper et al.）,1982,J.Med Chem.25:182を
参照のこと］。

これらの文献には、付着したアミノ酸またはペプチド
の反応性アミン部位が、抗体の酸化された炭水化物部位
を介して抗体分子にメトトレキセートまたはアミノプリ
テン類縁体をカップリングさせるのに有用であることは
記載もされておらず、示唆もされていない。

2.2.抗体分子へのメトトレキセートの共有結合 数多くの異なる反応がメトトレキセート（またはメト
トレキセート類縁体）を抗体または抗体フラグメントに
共有結合させるのに利用されている。これは、リシン残
基のアミノ基、ゲルタミルまたはアスパラギン酸残基の
遊離のカルボン酸基、システニル残基のスルフヒドリル
基を含む抗体または抗体フラグメントのアミノ酸残基の
薬剤化合物のカルボキシ、アミノまたはスルフヒドリル
部位への反応により達成できた。抗体分子を通じて規則
的にあるいはランダムに分散しているアミノ酸を介して
の結合を含む方法は、ランダムまたは非部位特異的方法
と呼ぶことにする。

共有結合の最も普通に用いられるランダムな方法の一
つは、メトトレキセートまたはメトトレキセート類縁体
のカルボキシ（またはアミノ）部位を抗体のアミノ（ま
たはカルボキシ）部位へ結合させるカルボジイミド反応
である。例えば、シェンら（Shen et al.）は、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドを介してヒト血清アルブミンにメトトレキセート
（MTX）がカップリングし、水溶性MTX−HSA複合体を形
成することを記述している（1984,Proc.Nat′l Acad.Sc
i.U.S.A.81:1445）。

クルカルニら（Kulkarni et al.），（1981,Cancer R
es.41:1445）は、３つの非部位特異的方法による抗体分
子へのMTXの共有結合を記載している。すなわち、カル
ボジイミド法、混合酸無水物反応およびメトトレキセー
トのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応を
用いる活性型エステル法。もっと最近では、クルカルニ
ら（Kulkarni et al.），（1985,Cancer Immunol.Immun
other.19:211）は、メトトレキセートの活性型エステル
を用いる、抗体中のリシンのアミノ基を介する抗体また
はＦ（ab）_２フラグメントとMTXとの複合体化を記述し
ている。

マナベら（Manabe et al.），（1984,J.Clin.Med.10
4:445）は、多価担体として作用するデキストランＴ−4
0を介してモノクローナル抗体へのMTXの共有結合を記述
している。このデキストランＴ−40は、過ヨウ素酸ナト
リウムを用いて酸化されてポリアルデヒド−デキストラ
ンを形成する。酸化されたデキストランのアルデヒド部
位は、ついで抗体分子のアミノ基と反応してシッフ塩基
（イミン類）または還元されたシッフ塩基を形成する。
ついで、MTXは、酸化されたデキストラン−抗体中間体
と反応し、かつ共有結合した複合体がデキストランのア
ルデヒドとMTXの２−または４−位のアミノ基との間の
シッフ塩基形成およびこれに続く還元により形成される
ことが明らかにされている［前記マナベら（Manabe et
al.）等449頁］。しかしながら、本発明者らは、メトト
レキセートの２−および４−位のアミノ基は求核性が弱
く、恐らくは提案されるようなシッフ塩基または還元シ
ッフ塩基の形成を生じ得ないことを指摘する。

上記方法はすべて、抗体分子のポリペプチド骨格への
共有結合を伴う。従来法により薬剤成分に容易に複合し
得るリシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のごと
きアミノ酸は、比較的規則的に存在しかつ抗原結合領域
を含む免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖を通してラ
ンダムに分散する。この抗原結合領域の化学的修飾はど
れも、抗体の認識因子の変化を生じる。このような修飾
は、抗原に対する抗体の親和性および特異性を変える。
異なる抗体の集団において、抗原結合領域のこのような
変更は、抗原結合領域に対する変更の種類、強度および
／または接近の程度に応じて一部の抗体分子の完全な不
活性化および他の抗体分子ではより低い程度の不活性化
を生じる。この不活性化は、抗原結合領域の範囲内かあ
るいは極めて近い領域での変化によるものであって、非
反応的にするように結合部位の立体構造（コンフォーメ
ーション）を変えるか、あるいは抗原結合領域の域外で
の変化によるものであって、抗原結合領域への抗原の接
近を制限するかもしれない。

3.発明の概要 本発明の一般的方法によれば、治療用の葉酸類縁体
が、抗体または抗体フラグメントに共有結合される。こ
の共有結合は、得られる抗体複合体が生体内に投与され
たときに抗原と結合しかつ治療効果をもたらす能力を有
するように達成される。さらに詳しくは、この共有結合
は、抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水化物
部位と、アミンが第一級アミン、第二級アミン、ヒドラ
ジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、アルコキシア
ミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドよりな
る群から選ばれたものである葉酸類縁体の誘導体上の反
応性アミンとの間の共有結合を形成することにより達成
される。

特に、本発明は、 （ａ）抗体または抗体フラグメントを酸化剤と反応させ
て該抗体または抗体フラグメントの炭水化物部位中にア
ルデヒド基を形成させ；そして （ｂ）該抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水
化物部位のアルデヒド基を第一級アミン、第二級アミ
ン、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、フェ
ニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバ
ジド基よりなる群から選ばれた葉酸類縁体の反応性アミ
ン基と反応させて、複合体化されていない抗体または抗
体フラグメントと実質的に同一の免疫反応性および免疫
特異性を有する水溶性抗体−葉酸類縁体複合体を形成す
る； ことを特徴とする治療用抗体−葉酸類縁体複合体の製造
方法に関するものである。還元は、該複合体を安定化す
るのに使用される。

本発明はさらに、抗体または抗体フラグメントの酸化
された炭水化物部位に共有結合を介して結合した葉酸類
縁体誘導体よりなる抗体−葉酸複合体を含むものであ
り、該水溶性複合体は複合体化されていない抗体または
抗体フラグメントと実質的に同一の免疫反応性または免
疫特異性を有し、該共有結合はイミン、エナミン、ヒド
ラゾン、フェニルヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾ
ン、チオセミカルバゾンおよびその還元形態よりなる群
から選ばれたものである。

さらに本発明は、本発明の治療用抗体複合体の調製に
有用なアミノプテリン−γ−ヒドラジド、アミノプテリ
ン−α−ヒドラジド、メトトレキセート−α−ヒドラジ
ドおよびメトトレキセート−α−α−リシル−グリシル
−グリシル−チロシル−ヒドラジドのごとき新規な反応
性アミン含有葉酸類縁体を含むものである。

本発明はまた、 （ａ）保護されたカルボキシル基および遊離のカルボキ
シル基を有するＮ−保護−Ｌ−グルタミン酸の遊離カル
ボキシル基を、第一級アミン、第二級アミン、アルコキ
シアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジ
ン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドよりなる
群から選ばれた反応性アミンまたは保護反応性アミンを
含有する成分と反応させて反応性アミンまたは保護反応
性アミンを含有するＮ−保護−Ｌ−グルタミン酸誘導体
を形成し； （ｂ）工程（ａ）で生成したＮ−保護−Ｌ−グルタミン
酸誘導体からＮ−保護基を除去して遊離のα−アミノ基
を有する反応性アミンまたは保護された反応性アミンを
含むＬ−グルタミン酸誘導体を形成し； （ｃ）工程（ｂ）で生成したＬ−グルタミン酸誘導体の
α−アミノ基を、カルボキシル基が公知のカルボキシル
活性化剤により活性化されている４−アミノ−４−デオ
キシ−N¹⁰−メチルプテロイン酸または４−アミノ−４
−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロイン酸の活性型カル
ボキシル基と反応させ；そして （ｄ）すべての保護基を除去して第一級アミン、第二級
アミン、アルコキシアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、
フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカ
ルバジドよりなる群から選ばれた反応性アミンを含有す
るメトトレキセートまたはアミノプテリンの水溶性誘導
体を形成する； 工程よりなることを特徴とする治療的に有効な葉酸類縁
体のアミン誘導体の新規な合成方法を含むものである。

本発明の抗体−葉酸類縁体は、生体内治療において理
想的に適している。特定の標的部位への該葉酸類縁体の
デリバリー（輸送）は、動物またはヒトに、有効量の水
溶性抗体−葉酸類縁体複合体を投与することを伴い、該
複合体は、該標的部位の抗原決定基と免疫反応性であり
かつ免疫特異性であり、また非標的部位と実質的に非免
疫反応性でありかつ非免疫特異性であり、また前記抗原
決定基は非標的部位で実質的な量が見出せないものであ
る。この標的部位は葉酸類縁体による治療を受けやすい
細胞性疾患と関連する生体内の特定細胞、組織、器官ま
たは他の部位を含むものである。

本発明は、動物またはヒトに、本発明により調製され
た治療的に有効な量の水溶性の部位選択的に結合された
抗体−葉酸類縁体複合体を投与することよりなる細胞性
疾患の治療方法を含むものである。治療されるべき細胞
性疾患は、つぎの子宮絨毛癌、絨毛腺腫、破壊性絨毛腺
腫、胞状奇胎、急性および亜急性白血病、白血病性髄膜
炎、リンパ肉腫、菌状息肉腫、肺癌、特に鱗状および小
細胞型、骨原性肉腫および頭部、首部および骨盤のある
腫瘍を含むがこれらに限定されるものではない。

図面の簡単な説明 本発明は、以下の発明の詳細な説明、発明の特定の態
様の実施例および添付図面を参照することによりさらに
完全に理解されるであろう。

第１図は、部位選択的に結合されたMTX−γ−Hy−抗
体複合体、すなわちMTX−Hy−CYT015の注射によるBN腫
瘍の異種移植片に対する影響を説明するグラフである。
未治療の対照動物における腫瘍増殖も比較のために含ま
れている。

第２図、ランダムに結合されたMTX−抗体複合体、す
なわちランダムMTX−CYT015の注射による確立されたBN
腫瘍の異種移植片に対する影響を説明するグラフであ
る。未治療の対照動物における腫瘍増殖も比較のために
含まれている。

5.定義 本願明細書を通して使用されている用語「葉酸類縁
体」は、少なくとも１個のカルボキシル基を含みかつ通
常の葉酸依存代謝過程を妨げることにより代謝拮抗物質
として作用し、葉酸欠乏症状を起こす葉酸のあらゆる類
縁体を含むものである。

用語「葉酸のアミン誘導体」は、反応性アミンを含む
かあるいは含むように修飾されたあらゆる葉酸類縁体を
含むものである。

用語「反応性アミン」は、単純な化学的縮合反応によ
りあるいは化学的な縮合反応を行なったのちに生成した
共有結合を安定化させるために還元することにより、窒
素原子を介してアルデヒド官能基と共有結合的に付着な
いし結合し得るあらゆる窒素含有官能基を含むものであ
る。このような反応性アミンの例としては、第一級アミ
ン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニル
ヒドラジン、アルコキシアミン、セミカルバジドおよび
チオセミカルバジドが含まれるが、これらに限定されも
のではない。

6.発明の詳細な説明 本発明は、抗体または抗体フラグメントに葉酸類縁体
のアミン誘導体を共有結合させることにより調製される
水溶性抗体複合体に関するものである。葉酸類縁体のア
ミン誘導体は、抗体分子の抗原性部位でもなければこれ
と直接関連もしてない抗体分子の炭水化物部位に反応性
アミン基を介して選択的に結合する。従って、部位選択
的に結合したのち、この抗体複合体は、複合体化されて
いない抗体または抗体フラグメントと実質的に同一の免
疫反応性および免疫特異性を有している。

本発明の一実施態様においては、この反応性アミン基
は、葉酸類縁体に直接結合する。代表例としては、ヒド
ラジン基がメトトレキセートまたはアミノプテリンのグ
ルタミル部位のαまたはγ−カルボキシル基に直接結合
できる。本発明の他の実施態様においては、この反応性
アミン基は、リシン、アルギニン等のようなアミノ酸、
およびペプチド末端遊離アミン基が反応性アミンとして
作用するチロシル−グリシル−グリシル−アルギニル−
ε−リシンのようなペプチドを含むがこれらに限定され
るものではないリンキング成分の一部であってもよい。

反応性アミン基は、葉酸類縁体に結合されるので、抗
体に複合化されて、生体内に投与されたときに、この抗
体−葉酸類縁体複合体が種々の腫瘍状態に対して治療的
に有効である。

本発明に使用する抗体は、従来の抗体またはモノクロ
ーナル抗体であり得る。モノクローナル抗体の使用は、
各モノクローナル抗体がある抗原決定基に特異的であり
また公知技術を使用して多量に容易に生産し得るために
いくつかの利益をもたらす。

本発明に利用できる抗体は、葉酸類縁体を使用して治
療し得る細胞性疾患に関連する任意の標的に対して向け
られたものである。本明細書を通して使用される用語
「細胞性疾患」は、良性であろうと悪性であろうと、葉
酸類縁体を使用する治療を受けやすい腫瘍および他の細
胞増殖性状態並びに葉酸類縁体を使用する治療を受けや
すいリウマチ性関節炎のような状態を含むことを意図す
るものである。このような細胞性疾患は、子宮絨毛癌、
絨毛腫、絨毛腺腫、破壊性絨毛腺腫、胞状奇胎、急性お
よび亜急性白血病、白血病性髄膜炎、リンパ肉腫、菌状
息肉腫（mycosis fungoides）、肺癌、特に鱗状および
小細胞型肺癌、骨原生肉腫、頭部、首部および骨盤のあ
る腫瘍、重症の障害性乾癬（disabling psoriasis）お
よびリウマチ性関節炎を含むがこれに限定されるもので
はない。

葉酸類縁体が代謝拮抗作用を発揮するためには細胞中
に内部移行されねばならないので、特定の腫瘍に対する
類縁体の治療効果に関する重要な考察事項は、腫瘍細胞
中への類縁体の侵入である。たいていは、葉酸類縁体
は、単純拡散経路というよりもむしろキャリヤー媒介葉
酸の輸送系を経て細胞中に内在化される。事実、一定の
腫瘍タイは、腫瘍細胞が葉酸輸送系を損なうことに特徴
があるため葉酸類縁体に耐性である［パイパーら（Pipe
r et al）,1982,J.Med.Chem.25 182参照］。本発明の
抗体・葉酸類縁体複合体は細胞上の異なるレセプター部
位に影響を及ぼし、従って、腫瘍細胞中への葉酸類縁体
の正常輸送を変更し得ることが考慮される。従って、対
応する遊離類縁体に耐性の腫瘍の抗原に対して特異的な
抗体への葉酸類縁体の付着により、抗体−葉酸類縁体に
よるこのような耐性腫瘍の治療ができるようになると予
想される。以下の体系は、特定腫瘍が本発明の特定の抗
体−葉酸類縁複合体を使用して生体内において効果的に
治療されるか否かを調べる便利な方法を提供する。

すなわち、治療すべき腫瘍の小サンプルを従来方法に
よって採取し、いくつかのアリコートに分割する。特定
腫瘍に免疫反応性でありかつ免疫特異性のモノクローナ
ルまたはポリクローナルのいずれかの抗体を同定しかつ
／または従来のまたはハイブリドーマ技術を用いて調製
する。抗体−葉酸類縁体複合体を本発明に従って調製す
る（後述の第6.3節参照）。腫瘍サンプルの１アリコー
トを実験動物の腎臓の被膜下に導入する。正常マウスま
たはヌードマウスのいずれかが便利な実験動物モデルで
ある。腫瘍フラグメントを例えば接眼マイクロメータを
使用して測定し、そして抗体−葉酸類縁体複合体を数日
間静脈内投与する。同様な移植腎臓下の被膜腫瘍フラグ
メントを有するが、治療されない動物は、陰性対照とし
ての役割を果す。定期的に移植腫瘍組織を測定し、腫瘍
成長の抑制または処置動物の腫瘍サイズの減少が、複合
体の治療効果を示す。上記の体系を使用して、いずれの
ヒト腫瘍組織も本発明の抗体・葉酸類縁体複合体への生
体内感受性についてスクリーニングされ得る。

従って、用語「細胞性疾患」は、さらに上記生体内試
験で調べられた抗体−葉酸類縁体複合体による治療を受
けやすい新生物腫瘍の増殖を含むものである。

本発明の抗体複合体を使用して効果的に処置し得る細
胞性疾患と関連した標的の例は、腫瘍抗原、組織適合性
抗原、分化抗原および他の細胞膜抗原、酵素、ホルモン
レセプター、腫瘍遺伝子産生物等を含むがこれに限定さ
れるものではない。加えて、異なる抗原決定基に反応性
の抗体の組合せを使用し得る。キャリヤーとして使用し
得る免疫グロブリンは、IgA,IgD,IgE,IgMのようなある
クラスの抗体、あるクラスのIgG、または例えば半抗体
分子（または単一H:L鎖対（single heavy:light chain
pair）、Fab、Fab′または（Fab′）_２フラグメントの
ような免疫グロブリンのある種のフラグメントを含む。
生体内投与したときの本発明の抗体−葉酸類縁体複合体
の治療効果の理由は未だ不明であるが、多くの機構が可
能であると思われる。本発明の複合体を生体内に投与す
る際の治療活性を説明するのにどのような特定の理論に
も限定されることを望まないが、本発明者等は、以下の
理論的説明を提示する。

本発明の一実施態様によると、抗体複合体は、葉酸類
縁体のグルタミル部位のγ−カルボキシル基に共有的に
結合される反応性アミン基を介する共有結合によって形
成される。葉酸類縁体が抗体−葉酸類縁体複合体から生
体内に放出されない場合、治療の有効性に重要であるこ
とが報告されているグルタミル部位のα−カルボキシル
基がこのような結合によってその活性を維持できる可能
性がある。

本発明の別の実施態様によると、反応性アミン基は、
該アミンを含むペプチドを介して葉酸類縁体に共有的に
結合されるが、ペプチドは細胞外へ活性な蛋白分解酵素
による開裂を受けやすい。高濃度のこれら蛋白分解酵素
が腫瘍部位に含まれていると報告されている。この場
合、ペプチドは、葉酸類縁体のグルタミル部位のα−ま
たはγ−カルボキシル基のいずれかに結合され得る。本
実施態様に従って調製される抗体−葉酸複合体の治療効
果は、生体内の意図された標的で遊離薬剤としての活性
葉酸類縁体が酵素触媒により放出されることによるとい
う可能性がある。例として、メトトレキセートが、グル
タミル部位のα−カルボキシル基を介して、酸化抗体の
アルデヒド基に結合されるリシル−グリシル−グリシル
−チロシルヒドラジドに共有結合されたメトトレキセー
ト−抗体複合体がプラスミンおよびカルボキシペプチダ
ーゼのような酵素によって標的部位で生体内において開
裂され得ると考えられる。従って治療上効果的なメトト
キセートは、生体内の意図された部位で酵素により放出
されることになる。事実、生体内において遊離メトトレ
キセートを形成するメトトレキセート−α−α−リシル
−グリシル−グリシル−チロシル−ヒドラジド抗体複合
体からの遊離メトトレキセートの酵素的に触媒された開
裂を示すデータは、後述の第９節に示してある。

本発明のさらに別の実施態様によると、葉酸類縁体
は、標的部位において生体内に見い出される条件下、化
学的に開裂されやすい共有結合を形成する反応性アミン
を介して、直接またはリンキングペプチド成分によって
抗体に結合される。従って、遊離葉酸類縁体が腫瘍細胞
中への取り込みに先立って標的部位で、または多分、腫
瘍細胞への複合体の取り込みの後でさえも、その標的部
位で、生体内に放出され得る。例として、ヒドラゾン結
合が、メトトレキセート−γ−ヒドラジドと酸化抗体の
アルデヒド基の間に形成され得る。このようなヒドラゾ
ン結合は、生体内でゆっくりした加水分解を受けやす
く、特にヒドラゾンの生体内酸化が生じる場合はそうさ
れやすい。このような加水分解は複合体の結合後腫瘍細
胞表面にて、または複合体の取り込み後細胞内で起こる
と思われる。いずれの場合にも、遊離の治療的活性葉酸
類縁体は、生体内に放出されることになる。

生体内標的における複合体からの放出を伴わない治療
活性、酵素的に触媒される放出および化学的に誘導され
る放出を含む上記の可能性は、生体内における本発明の
葉酸類縁体の治療効果を説明するために提起されたもの
である。しかしながら、本発明は、このような治療効果
に対するいずれかの特定の理論ないし機構に限定される
べきでない。

6.1 葉酸類縁体のアミン誘導体 第５節に定義されるとおり、葉酸類縁体は、少なくと
も１個のカルボキシル基を含みかつ正常な葉酸依存代謝
過程を妨げることにより代謝拮抗物質として作用し、従
って葉酸欠乏症の症状をもたらす葉酸の類縁体である。
第Ｉ表は、このような葉酸類縁体の例の非包括的リスト
を示す。

これらおよび他の葉酸のアミン誘導体は、本発明に従
って有用である。このようなアミン誘導体は、反応性ア
ミンを含むかまたは含むように修飾されたいかなる葉酸
をも含むものである。用語「反応性アミン」は、単一の
化学的縮合あるいは化学的縮合を行った後に共有結合を
安定化させるために還元することによる、窒素原子を介
してアルデヒド官能基に共有的に付着ないし結合し得る
いかなる窒素含有官能基をも含むものである。従って本
発明に有用な葉酸類縁体のアミン誘導体は、メトトレキ
セート−γ−ヒドラジド、メトトレキセート−α−ヒド
ラジド、３′,5−ジクロロメトトレキセート−α−ヒド
ラジド、３′,5−ジクロロメトトレキセート−α−ヒド
ラジド、メトトレキセート−α−α−リシル−グリシル
−グリシル−チロシルヒドラジド、メトトレキセート−
γ−チロシルヒドラジド、メトトレキセート−α−α−
リシルヒドラジド、メトトレキセート−α−α−リシ
ン、メトトレキセート−α−α−リシル−ε−アルギニ
ン−グリシン−グリシン−チロシン、アミノプテリン−
γ−ヒドラジド、アミノプテリン−α−ヒドラジド、
３′,5′−ジクロロアミノプテリン−γ−ヒドラジド、
３′,5′−ジクロロアミノプテリン−α−ヒドラジド、
アミノプテリン−γ−チロシルヒドラジド、アミノプテ
リン−α−α−リシル−グリシル−チロシルヒドラジ
ド、アミノプテリン−α−α−リシルヒドラジド、アミ
ノプテリン−α−α−リシン、およびアミノプテリン−
α−α−リシル−ε−アルギニン−グリシン−グリシン
−チロシンを含むがこれに限定されるものではない。5,
8−ジデアザメトトレキセート、5,8−ジデアザ−5,6,7,
8−テトラヒドロメトトレキセート、5,8−ジデアザ−5,
6,7,8−テトラヒドロアミノプテリン、5,8,10−トリデ
アザテトラヒドロ葉酸および8,10−ジデアザアミノプテ
リン等のような葉酸類縁体の反応性アミン含有誘導体も
また本発明に有用である。

6.2. 葉酸類縁体のアミン誘導体の合成方法 本発明の抗体複合体を形成するのに使用される葉酸類
縁体のアミン誘導体は、種々の方法を使用して合成し得
る。

本発明の一方法によると、カルボキシル基含有葉酸類
縁体は、カルボジイミドのような活性化剤との反応で活
性化される。反応性アミンを介して酸化抗体のアルデヒ
ド部位に結合する能力を有する反応性アミン含有葉酸類
縁体を得るため、活性化中間体をヒドラジンまたはジア
ミンのような好適な求核性試薬と反応させる。これとは
別に、活性化中間体を、酸化抗体のアルデヒド部位に該
反応性アミンを介して結合する能力を有する反応性アミ
ン含有葉酸類縁体を得るために、カルボキシル基との反
応後に脱保護される、保護反応性アミンを含有するアミ
ノ酸ないしペプチドと反応させる。一部の葉酸類縁体
は、この方法で誘導体化され得る２つの異なるカルボキ
シル基を含むグルタミン部位を有するので、生成物の異
性体混合物が、求核試薬の性質に応じて得られる。所望
の異性体は、従来の技術を使用して不要の位置異性体か
ら分離可能なはずである（この方法を使用するメトトレ
キセート−γ−ヒドラジドの合成の実験例に関しては、
後述の第7,1,3節を参照のこと）。

本発明の他の新規な方法によると、メトトレキセート
およびアミノプテリンのような葉酸類縁体のアミン誘導
体は、次のとおり合成され得る。

保護反応性アミン含有グルタミン酸誘導体を最初に調
製する。好適な出発原料は、α−アミノ基が、例えばカ
ルボベンジルオキシ（CBZ）またはフルオレニルメトキ
シカルボニル（Fmoc）基で保護され、またカルボキシル
基の１つが例えばｔ−ブチルエステルのようなエステル
で保護されたグルタミン酸誘導体である。保護グルタミ
ン酸の他のカルボキシル基は、第一級アミン、第二級ア
ミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、
アルコキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカル
バジドおよびそれらの保護誘導体から成る群から選ばれ
た反応性アミンまたは保護反応性アミンを含む成分に結
合される。反応性アミン含有成分は、カルボジイミド
類、混合酸無水物または活性型エステル類によるカップ
リング等の公知カルボキシル活性化方法によって保護グ
ルタミン酸の遊離カルボキシルに結合し得る。反応性成
分がヒドラジンの場合、この成分を例えばブトキシカル
ボニル（Boc）ブロック基を使用してさらに保護するこ
とが好ましい。

反応性アミンまたは保護反応性アミン含有Ｎ−保護Ｌ
−グルタミン酸誘導体のα−アミノ基は、遊離α−アミ
ノ誘導体を得るために脱保護される。遊離α−アミノ基
は、カルボジイミド類、混合酸無水物または活性エステ
ル類によるカップリング等の公知カルボキシル活性化方
法により４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−メチルプテ
ロイン酸（MAPA）または４−アミノ−４−デオキシ−N
¹⁰−ホルミルプテロイン酸（FAPA）のいずれかのカルボ
キシル基にカップリングされる。すべての保護基の除去
後に形成された生成物は、葉酸類縁体メトトレキセート
またはアミノプテリンの反応性アミン含有、水溶性誘導
体である。

反応性アミン含有（または保護反応性アミン含有）グ
ルタミン酸誘導体をプテリジニルアミノ安息香酸にカッ
プリングさせるこの方法は、MAPAまたはFAPAの代わりに
適当に置換されたベンゾイル成分の利用によって種々の
反応性アミン含有葉酸類縁体を得るように一酸化され得
る。例えば、４−アミノ−４−デオキシ−8,10−ジデア
ザプテロイン酸のような置換安息香酸は、強力な葉酸類
縁体である、8,10−ジデアザアミノプテリンの反応性ア
ミン誘導体を得るため上記方法でMAPAの代わりになり得
る［デ グロウ等（De Graw et al.）,1984,J.Med.Che
m.27:376］。

説明するために、メトトレキセート−γ−ヒドラジド
を本発明の新規な方法に従って次のとおり調製できる。
市販のＬ−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステルを、一
晩室温にて１当量のNaHCO₃を含有する水：アセトン1:1
溶液中にて１当量のフルオレニルメチルスクシンイミジ
ルカーボネートとの反応によってそのＮ−Fmoc誘導体と
して保護する。酸性にして、エーテルで抽出し、有機溶
媒を蒸発させるとFmoc L−グルタミン酸α−ｔ−ブチル
エステルが得られる。Fmoc L−グルタミン酸α−ｔ−ブ
チルエステルを無水ジメチルホルムアミド（DMF）中に
１〜３当量の2,4−ジニトロフェノールとともに、ひき
続いて１〜３当量の３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−１−エチルカルボジイミドヒドロクロリドととも
に溶解する。得られた混合物を室温にて24時間撹拌す
る。反応の進行を薄層クロマトグラフィー（TLC）で検
査する。反応混合物を必要ならば反応を完結するために
約50℃まで加熱し得る。

2,4−ジニトロフェニル活性エステルの形成の完結
後、約１〜３当量のｔ−ブチルカルバゼートを加え、反
応混合物を撹拌下約24時間室温にてインキュベートす
る。溶媒の蒸発につづきエーテル：水で反応混合物を抽
出する。層分離および冷希NaHCO₃溶液でのエーテル層の
洗浄次いで乾燥、およびエーテル層の蒸発によりFmoc L
−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステル−γ−Ｎ′−Bo
c−ヒドラジドを得る。テトラヒドロフラン（THF）中約
10％ジエチルアミンでFmoc保護基を除去した後、ジエチ
ルアミンおよびTHFの蒸発を行って粗Ｌ−グルタミン酸
α−ｔ−ブチルエステル−γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジド
を得る。この粗Ｌ−グルタミン酸誘導体をさらに精製す
ることなしに使用する。

MAPAは約１〜４当量の2,4−ジニトロフェノールと共
に無水DMF中に懸濁し得る。３（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−１−エチルカルボジイミド（約１〜５当量）
を加え、反応混合物を約２時間室温にて撹拌する。反応
の進行をTLCで検査し、反応混合物を反応を完結するた
め必要ならば50℃以下で加熱する。ひき続いて溶媒を蒸
発させてイソプロパノールで粉砕すると、固形のMAPA−
2,4−ジニトロフェニルエステルが得られる。

MAPA−2,4−ジニトロフェニルエステルを約１〜３当
量のＬ−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステル−γ−
Ｎ′−Boc−ヒドラジドおよび約１〜３当量のジイソプ
ロピルエチルアミンとともに無水DMF中に溶解する。反
応混合物を室温にて約24時間撹拌する。反応進行をTLC
で検査し、必要ならば反応を完結するために50℃以下で
加熱する。混合物を蒸発させ、粗生成物をシリカゲルで
クロマトグラフにかけてメトトレキセート−γ−ｔ−ブ
チルエステル−γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジドを得る。次
いで室温にて約１時間メチレンクロリド中約30％トリフ
ルオロ酢酸で脱保護し、ひきつづき蒸発させて、粗メト
トレキセート−γ−ヒドラジドのトリフルオロ酢酸塩を
得、つづいて重炭酸アンモニウムで中和する。例えば、
重炭酸アンモニウムの濃度勾配を用いてQAEセファデッ
クス （QAE Sephadex ）によるイオン交換クロマトグ
ラフにかけ、ひきつづいて凍結乾燥するとメトトレキセ
ート−γ−ヒドラジドが得られる。

本発明の上記方法はMAPA成分の代わりに適当に置換さ
れた安息香酸成分を使用することにより当業者によって
変更し得る。かくして本発明は、他の葉酸類縁体の反応
性アミン含有誘導体を得るためのこのような変更を含む
ものである。

葉酸類縁体のアミン誘導体の合成に関する本発明の新
規な方法は、従来の方法に比べて次のような利益をもた
らす。

（１）本方法は、アミノプテリンのヒドラジド誘導体を
形成するために容易に入手できるアミノプテリン前駆体
４−アミノ４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロイン酸
の使用を可能にし、従って本発明アミノプテリンヒドラ
ジドの新規化合物の高収率で異性体的に純粋な調製方法
を提供する。ホルムアミド保護基がヒドラジンまたはヒ
ドラジン誘導体との反応によってすぐにはずされるので
［ガイガーら（Geiger et al.）,1968,Chem.Ber.101:33
386参照］、アミノプテリンのヒドラジド誘導体を調製
するために加ヒドラジン分解を必要とする葉酸類縁体の
ヒドラジド類を合成するための従来法の使用は（前記ロ
ソウスキーらＩ参照）、保護N¹⁰−ホルミル基の望まし
くない時期早尚の除去をもたらすだろう。従って、アミ
ノプテリン−γ−ヒドラジドまたはアミノプテリン−α
−ヒドラジドの高収量は、従来の方法を使用したのでは
期待できない。

（２）目的の生成物がメトトレキセート−ヒドラジドで
ある場合、本方法は、メトトレキセート−ヒドラジドの
最後から２番目の前駆体として比較的無極性でかつ有機
溶媒に可溶な誘導体をもたらす。本方法では、有機溶媒
系を使用する標準クロマトグラフィー技術で該前駆体を
簡単に精製できる。これにより、合成の最終段階でより
純粋なメトトレキセート−ヒドラジドを形成する可能性
が高まる。

他に、ロソウスキーら（1981,J.Med.Chem.24:1450）
の方法もまた、本発明に有用な葉酸類縁体の反応性アミ
ン誘導体の合成に有用である。例えば、第2.1節に記載
したごとくメトトレキセート−γ−ヒドラジドは、ジエ
チルホスホロシアニデートのようなペプチド結合形成剤
によってカップリングされるMAPAおよび適当な保護Ｌ−
グルタミン酸エステル誘導体を使用して合成し得る。引
き続いて加ヒドラジン分解を行い、次いで保護基を除去
すると、酸化抗体のアルデヒド部位へ反応性アミンを介
して結合する能力を有する反応性アミン含有葉酸類縁体
が得られる。

6.3. 抗体複合体の調製方法 抗体が糖蛋白である故、化合物は、抗体分子のペプチ
ド骨格に共有結合している炭水化物部位に付着され得
る。いくつかの炭水化物部位は免疫グロブリンのFc領域
に存在しており、補体系の成分の結合を起こすのに必要
とされる。免疫グロブリンのFc領域の炭水化物部位は、
ここに記載される体系に利用され得る。また、炭水化物
部位を有するいかなる免疫グロブリンのFabないしFab′
フラグメントも、ここに記載される反応体系に利用され
得る。このような免疫グロブリンの一例は、プトナムら
（Putnam et al.），（1973,Science 182:287）によっ
て配列が定められたヒトIgMである。

以下に詳細に記載するごとく、抗体または抗体フラグ
メントの炭水化物側鎖はアルデヒドを生成するために選
択的に酸化され得る。得られるアルデヒドは、ついでイ
ミン、エナミン、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒド
ラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンまたはそ
れらの還元形態を形成するためにアミン基（例えば、第
一級アミン、第二級アミン、アルコキシアミン、ヒドラ
ジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、セミカルバジ
ドまたはチオセミカルバジドのようなアンモニア誘導
体）と反応させることができる。

また、抗体の炭水化物部位は、アミン基と付着または
反応できるように酵素的技術で修飾し得る。例えば、ノ
イラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼを使っ
て、アルデヒド基を形成させることができる。

6.3.1. 酸化の化学的方法 抗体分子の炭水化物部分ないし部位の酸化は、アルデ
ヒド基の形成を導く。過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸、メ
タ過ヨウ素酸ナトリウムおよびメタ過ヨウ素酸カリウム
等の種々の酸化剤を使用し得る。これらの中では、二次
的反応または好ましくない副反応がほとんど起こらない
ので、酸素酸およびその塩が好ましい。一般的議論に関
しては、ジャクソン（Jacson）、1944,in Organic Reac
tions 2,p.341;ブントン（Bunton）1965,Oxidation in
Organic Chemistry,Vol.1 Wiberg,ed.,Academic Press.
New York.p.367を参照のこと。

これらの酸化剤での抗体の酸化は、公知方法で実施で
きる。酸化において、抗体は、一般的に濃度が100mg/ml
未満、好ましくは１〜20mg/mlである水溶液の形態で使
用される。酸素酸またはその塩を酸化剤として使用する
際、一般的に水溶液の形態で使用され、また濃度は、一
般的に0.001〜10mM、好ましくは1.0〜10mMである。酸素
酸またはその塩の量は抗体の種類によるが、一般的に
は、例えば被酸化性炭水化物の量の10〜100倍過剰にて
使用される。しかしながら、最適量は、通常の実験によ
って決定され得る。

酸素酸またはその塩による抗体の酸化方法において最
善の範囲は、約４〜８のpH、０〜37℃の温度、および15
分〜12時間の反応時間を含む。

酸素酸およびその塩による糖蛋白の酸化の間、糖蛋白
の過剰酸化を防ぐため光を遮断することが好ましい。

6.3.2. 酸化の酵素的方法 抗体分子の炭水化物部分の酸化はまた、ノイラミニダ
ーゼの存在下または不存在下に酵素ガラクトースオキシ
ダーゼを使用しても達成し得る。［クーパー等（Cooper
et al.）,1959,J.Biol.Chem.234:445］。抗体は、水溶
液中にて使用され、濃度は、一般的に0.5〜20mg/mlであ
る。酵素は、一般的に約5.5〜8.0のpHで使用される。酵
素反応に対するpH、基質濃度、緩衝液および緩衝液濃度
の影響は、前記クーパーにより報告されている。

6.3.3. 酸化抗体と葉酸類縁体のアミン誘導体とのカッ
プリング 本発明の抗体複合体は、酸化抗体を第一級アミン、第
二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミ
ン、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセ
ミカルバジド基から成る群から選ばれた有効アミン基を
有する葉酸類縁体と反応させることによって製造され
る。すぐに得られる生成物は、初期の付加生成物から水
分子の除去による炭素−窒素二重結合を含む。

ヒドラジド類とアルデヒドとの反応の一般的議論に関
しては、マーチ（March）1978,Advanced Organic Chemi
stry:Reactions Mechanisms and structure,マグロウ
ヒル カンパニー，ニューヨーク（McGrow Hill Co.,Ne
w York）,pp824〜825を参照のこと。

約0.5〜20mg/mlの濃度の酸化抗体の溶液を葉酸のアミ
ン誘導体と混合し（反応性アミン基と抗体アルデヒドの
モル比は約１〜約10,000）、この溶液を約１〜18時間イ
ンキュベートする。好適な温度は０〜37℃であり、pHは
約６〜８であり得る。

6.3.4. 抗体複合体の安定化 抗体複合体が第5.3.3節で記載されたごとく抗体と葉
酸類縁体との間で形成された後、必要によりこれらをナ
トリウムシアノボロハイドライドまたはナトリウムボロ
ハイドライドのような好適な還元剤で安定化し得る。

還元剤は、一般に有効アルデヒド基に対して約10〜10
0倍モル過剰まで加えられる。一般的議論に関しては、
ジェントフトおよびディアーボーン（Jentoft and Dear
born）（1979,J.Biol.Chem.254:43549）を参照のこと。

6.3.5. 凝集物の除去 本発明の一実施態様によると、抗体または抗体フラグ
メントの炭水化物部位のアルデヒド基に共有的に付着さ
れる誘導体化葉酸類縁体の反応性アミン基は、第一級ア
ミンである。得られた抗体複合体は、アミノ酸の第一級
アミンと抗体分子のアルデヒド基との間の分子内シッフ
塩基形成による凝集物を含み得る。従って、これらの場
合には、形成された凝集物を、高性能ゲル透過液体クロ
マトグラフィー（これに限定されない）を含む好適なゲ
ル濾過方法で所望の抗体複合体から除く。不要の凝集物
の除去は、抗体複合体が治療用葉酸類縁体を希望の標的
部位に運ぶために生体内において使用されるので特に重
要である。このような抗体凝集物は除去のために網内細
胞系により取り込まれ、そして標的部位または特定組織
からのこのような移動は局在化の程度を減じ、従って投
与された葉酸類縁体の効果を減じ、また非標的部位への
毒性作用を導き出す可能性がある。

6.4. 葉酸類縁体のアミン誘導体および抗体複合体の使
用 本発明の葉酸類縁体のアミン誘導体は、治療用抗体複
合体の調製に使用するのに特によく適合する。従ってこ
れらの誘導体は、治療用抗体−葉酸類縁体の製造用中間
体にあたる。反応性アミンを介する葉酸類縁体の抗体ま
たは抗体フラグメントの酸化炭水化物部位への選択的付
着は、抗体特異性および免疫反応性を保持した複合体を
もたらす。

本発明の抗体複合体は、生体内における細胞性疾患の
治療処置方法に使用するのに理想的に適している。該方
法は、治療効果量の本発明の抗体−葉酸類縁体複合体を
投与することから成り、該複合体は該細胞性疾患に関連
する標的部位に対し免疫反応性かつ免疫特異的である
が、該細胞性疾患に関連しない組織に対して非免疫反応
性かつ非免疫特異性である。本発明の複合体は、その複
合体が誘導される非アミン含有葉酸類縁体前駆体による
治療を受けやすい細胞性疾患の処置に治療上有効であ
る。

本発明の抗体複合体が特に有効である細胞性疾患は、
以下のものを含むがこれに限定されるものではない。す
なわち子宮絨毛癌、絨毛腺腫、破壊性絨毛腺腫、胞状奇
胎、急性および亜急性白血病、白血病性髄膜炎、リンパ
肉腫、菌状息肉腫、肺癌、特に鱗状および小細胞型肺
癌、骨原性肉腫および頭部、首部および骨盤のある腫瘍
である。

また、葉酸類縁体は遊離の葉酸類縁体（これからアミ
ン誘導体が誘導される）に抵抗性のある腫瘍の治療に有
効であり得ると考えられる。特定の腫瘍を本発明の特定
の抗体−葉酸類縁体を使用して生体内にて治療処置し得
るかどうか決定するため、以下の生体内試験を使用し得
る。処置すべき腫瘍の小サンプルを従来方法によって採
取し、いくつかのアリコートに分割する。特定腫瘍に免
疫反応性でありかつ免疫特異性のモノクローナルまたは
ポリクローナルのいずれかの抗体を同定しかつ／または
従来のハイブリドーマ技術を用いて調製する。抗体−葉
酸類縁体複合体を本発明に従って調製する。腫瘍サンプ
ルの１アリコートを実験動物の腎臓の被膜下に挿入す
る。正常マウスまたはヌードマウスのいずれかが便利な
実験動物モデルである。腫瘍フラグメントを例えば接眼
マイクロメータを使用して測定し、そして抗体−葉酸複
合体を数日間静脈内投与する。同様に移植された腎臓下
被膜腫瘍フラグメントを有するが、処置されない動物を
陰性対照とする。定期的に移植腫瘍組織を測定し、処置
動物の腫瘍成長の抑制または腫瘍サイズの減少が、複合
体の治療効果を示す。上記の体系を使用して、いずれの
新しいヒト腫瘍組織も本発明の抗体−葉酸複合体への生
体内感受性についてスクリーニングされ得る。

生体内投与は、ヒト血清アルブミンのような他の蛋白
質の存在下または不存在下で、血清または生理食塩水を
含む好適なキャリヤー中の抗体−葉酸類縁体複合体の医
薬組成物の使用を伴う。複合体の投与量は当業者が容易
に決定することができ、細胞性疾患の性質により、また
利用する特定の葉酸類縁体により異なる。投与の好まし
い形態は、一般的に筋肉内、静脈内、心房内、鞘内、腹
腔内、リンパ内経路を経る非経口投与である。

次の一連の実施例は、説明を目的としたもので、本発
明の範囲を限定するものではない。

7. 抗体−葉酸類縁体複合体の調製 7.1.葉酸類縁体のアミン誘導体の合成 7.1.1.メトトレキセート−γ−ヒドラジド（MTX−γ−H
Y）（１） 一般名「メトトレキセート−γ−ヒドラジド」である
Ｎ−４（（（2,4−ジアミノ−６−プテリジニル）メチ
ル）メチルアミノ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸−５
−ヒドラジド（CAS登録番号79640−75−８）を以下に説
明するいくつかの異なる方法に従って合成した。

Ｎ−CBZ−Ｌ−グルタミン酸−α−ｔ−ブチルエステル
γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジド（２） Ｎ−CBZ−Ｌ−グルタミン酸−α−ｔ−ブチルエステ
ル−γ−ジシクロヘキシルアミン塩［バーケム（Bache
m）］をスパンネンベルグら（Spannenherg et al.）,19
71,ホップ−セイラーズゼット（Hoppe−Seyler's Z）の
方法により遊離酸に変換した。又は、CBZ成分を市販の
Ｌ−グルタミン酸−α−ｔ−ブチルエステルに加えるこ
とによる従来の方法を使用しても遊離酸を調製できる。
遊離酸（0.93gm,3.0mモル）をN₂ガス雰囲気下、無水テ
トラヒドロフラン（50ml）中に溶解し、氷水浴中で０℃
まで冷却した。Ｎ−メチルモルホリン（0.3gm,0.33ml,
3.0mモル）を加えた。イソブチルクロロホルメート（0.
41gm,0.39ml,3.0mモル）を15分間にわたってシリンジで
滴下した。クロロホルメートの添加完了後、反応混合物
を０℃にてもう５分間撹拌したがその間わずかな濁りが
生じた。ｔ−ブチルカルバゼート（0.40gm,3.0mモル）
を一度に加え、反応混合物を室温にて一晩撹拌した。反
応混合物を水に注ぎ込み、エーテルで３度抽出した。エ
ーテル抽出物を集め、飽和NaCl溶液で洗浄し、Na₂SO₄で
乾燥し、ついで蒸発させ、薄層クロマトグラフィー（TL
C）および¹HNMRを使用して次の特性を有する1.13gm（83
％）のオイルを得た［（メルクシリカゲル，メチレンク
ロリド：メタノール，（CH₂Cl₂:MeOH;9:1）Rf＝0.58;¹H
NMR（CDCl₃,TMS）δ7.33（s,5H）,5.10（s,2H）,4.50〜
4.15（m,1H）,2.60〜1.80（m,4H）,1.46（S,18H）］。

Ｌ−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステルγ−Ｎ′−Bo
c−ヒドラジド（３） Ｎ−CBZ−Ｌ−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステル
γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジド（1.13gm,2.5mモル）を500m
lパー（Parr）圧力容器中で200mlの無水エタノールに溶
解し、2.0mlの酢酸、つづいて0.15gmの10％炭素担持Pd
を加えた。溶液をTLC（ニンヒドリン）で検査しながら
水素化した。反応終了時（約48時間）、溶液をセライト
で濾過し、蒸発し、ついで水に懸濁した。水溶液をメチ
レンクロリドで抽出し、層を分離し、ついで水層を凍結
乾燥し、0.52gm（52％）の遊離アミノエステルを得た。
¹HNMR（CDCl₃,TMS）δ6.8〜6.4（br d,2H）4.40〜4.0
（m,1H）2.8〜2.1（m,4H）1.64〜1.35（br d,18H）。

Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）−Ｌ−グ
ルタミン酸−α−ｔ−ブチルエステル（４） グルタミン酸−α−ｔ−ブチルエステル［ケミカルダ
イナミックス、サウスブラインフィールド、ニュージャ
ージー州（Chemical Dynamics,South Plainfield,N.
J.）,3.0gm,0.15mモル］をアセトン（60ml）に溶解し
た。重炭酸ナトリウム（1.24gm,15mモル）を水60mlに溶
解し、アセトン溶液に添加した。フルオレニル−スクシ
ンイミジル−カーボネート［フルカ、ヒューパーグ、ニ
ューヨーク州（Fluka Hauppauge,N.Y.）］（4.98gm,15m
モル）を溶液に加え、反応混合物を室温にて一晩撹拌し
た。薄層クロマトグラフィー（メルクシリカゲル、CH₂C
l₂:MeOH,9:1）は、原点でのニンヒドリン陽性スポット
の完全消失を示し、またRf＝0.57の新たな蛍光スポット
を示した。反応混合物を蒸発し、水（100ml）を反応容
器に加えた。水性懸濁液を３部のエチルエーテルで抽出
し、集めたエーテル層を水、飽和NaCl溶液で洗浄し、Na
₂SO₄で乾燥した。エーテルを蒸発させて次のスペクトル
を有する5.71gm（91％）の泡状固体を得た。¹HNMR（CDC
l₃,TMS）δ7.9〜7.20（m,8H）5.80〜5.40（m,1H）,4.55
〜4.05（m,4H）,2.66〜1.72（m,4H）,1.41（s,6H）。

Ｎ−Fmoc−Ｌ−グルタミン酸−α−ｔ−ブチルエステル
−γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジド（５） Ｎ−Fmoc−Ｌ−グルタミン酸−α−ｔ−ブチルエステ
ル（5.21gm,12.3mモル）をN₂ガス雰囲気下250mlの無水D
MFに溶解した。2,4−ジニトロフェノール（2.27gm,12.3
mモル）を加え、つづいて１−エチル−３（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドを加
えた。反応混合物を一晩室温にて撹拌した。TLC（メル
クシリカゲル,CH₂Cl₂:MeOH;9:1）を使用した分析は、出
発原料（Rf＝0.57）が完全に消失し、また（Rf＝0.9）
における新たな蛍光スポットの出現を示した。ｔ−ブチ
ルカルバゼート（1.63gm,12.3mモル）を一度に加え、反
応混合物を撹拌下室温にて一晩インキュベートした。溶
媒を蒸発させ、残留物をエチルエーテルで取り出し、冷
５％NaHCO₃で全ジニトロフェノールを除去するまで洗浄
した。エーテル層を飽和NaCl溶液で洗浄し、Na₂SO₄で乾
燥し、蒸発して泡状固体を回収し、そしてシリカゲルで
フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エ
チル1:1）にかけて、次の特性を示す4.19gm（63％）の
泡状白色固体を回収した。¹HNMR（CDCl₃,TMS）δ8.42
（br s,NH）5.90（br d,NH）7.90〜7.20（m,8H）6.88
（br d,NH）,5.90（br d,NH）,4.60〜4.05（m,4H）,2.6
0〜1.95（m,4H）,1.42（s,18H）。

４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−メチルプテロイン酸
−2,4−ジニトロフェニルエステル（６） ４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−メチルプテロイン
酸（MAPA）（0.98gm,3.0mモル）を0.83gm（4.5mモル）
の2,4−ジニトロフェノールとともに100mlの無水DMFに
懸濁した。３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−
エチルカルボジイミドヒドロクロリド（0.86gm,4.5mモ
ル）を加え、溶液を約72時間撹拌した。MAPA（Rf＝0.2
3）の消失および2,4−ジニトロフェニルエステル（Rf＝
0.49）の出現をTLC（メルクシリカゲル,CHCl₃:MeOH:HOA
c:9:1:0.5）を使用して検査した。さらにカルボジイミ
ドおよび2,4−ジニトロフェノールをMAPA出発原料の完
全な反応を得るため24時間ごとに1.5mモル部加えた。約
50℃以下にまで注意深く加熱して、反応を促進させた。
出発原料を消費した時、反応混合物を蒸発させ、残留物
をイソプロパノールで粉砕し、残留するカルボジイミ
ド、2,4−ジニトロフェノールおよび形成した尿素をす
べて除去した。黄色固体（収率90〜100％）をTLCで均質
化し、次のNMRスペクトル（d₆DMSO TMS）δ9.0〜8.5
（m,3H）,8.15〜7.80（m,5H）,7.2〜6.9（m,4H）,4.95
（br s,2H）,3.33（s,3H）を得た。

7.1.1.1. 混合酸無水物法によるメトトレキセート−γ
−ヒドラジド（１）：方法（１） MAPA（ロソウスキーら,1989,J.Med.Chem.28:660〜66
7）（0.52mg,1.6mモル）を無水ジメチルホルムアミド
（100ml,DMF）に懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン
（0.41gm,0.56ml,3.2mモル）を加えた。ジエチルホスホ
ロシアニデート（0.52gm,0.49ml,3.2mモル）を加え反応
混合物を１時間、室温にて撹拌した。ついでＬ−グルタ
ミン酸α−ｔ−ブチルエステル−γ−Ｎ′−Bocヒドラ
ジド（0.51gm,1.6mモル）を加え、反応混合物を室温に
て24時間撹拌した。ついで溶液を回転蒸発し、メチレン
クロリド：メタノール：酢酸（CH₂Cl₂:MeOH:HOAc;9:1:
0.5）を使用しシリカゲルでフラッシュクロマトグラフ
ィーにかけて生成物を分離した。Rf＝0.48（CH₂Cl₂:MeO
H;9:1）を有する主生成物を乾燥し、ついで10mlのCH₂Cl
₂および10mlのトリフルオロ酢酸に再溶解し２時間撹拌
した。この溶液を蒸発し、水に再溶解してpH12に調整
し、濾過した。酢酸でpH8に調整後、濾液を凍結乾燥し
た。得られた黄色残留物を無水DMFに懸濁し、３時間撹
拌し、次いで濾過した。濾液を蒸発し、逆相HPLCで主に
単一ピークをもつ水溶性黄色粉末を得た。保持時間は前
述のロソウスキーの方法に従って調製されたメトトレキ
セート−γ−ヒドラジド［エイ．ロソウスキー博士、ダ
ナ ファーバー キャンサー リサーチ インスティテ
ュートー、ボストン、マサチュセッツ州より寄贈（A.Ro
sowsky,Dana Farber Cancer Research Institute,Bosto
n,MA）］と同等であった。

7.1.1.2. 活性エステルによるメトトレキセート−γ−
ヒドラジド（１）：方法２ Ｎ−Fmoc−Ｌ−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステル
γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジド（1.0gm,1.86mモル）を30ml
の無水テトラヒドロフランに溶解した。ジエチルアミン
（5ml）を加え、反応混合物を２時間室温にて撹拌し
た。薄層クロマトグラフィー（メルクシリカゲル,CHC
l₃:MeOH:CH₃COOH;0:1:0.5）は、出発原料（Rf＝0.78）
の消失および新たなニンヒドリン陽性スポット（Rf＝0.
13）の出現を示した。溶液を蒸発し、２時間室温にて真
空状態に置いてジエチルアミンの最終痕跡を除去した。
形成された油状生成物すなわちＬ−グルタミン酸α−ｔ
−ブチルエステル−γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジドは単離
しなかった。

粗Ｌ−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステル−γ−
Ｎ′−Boc−ヒドラジドを100mlの無水DMFに溶解し、４
−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−メチルプテロイン酸2,4
−ジニトロフェニルエステル（６）（0.91gm,1.86mモ
ル）をジイソプロピルエチルアミン（0.23gm,0.32ml,1.
86mモル）とともに加えた。この反応混合物を24時間室
温にて撹拌し、次いで40℃まで加熱して完全な反応を行
った。この混合物を蒸発させ、黄色の粗油状生成物をシ
リカゲルでフラッシュクロマトグラフィー（CH₂Cl₂:MeO
H:HOAc,9:1:0.5）にかけ、シリカゲルTLC（CH₂Cl₂:MeO
H:HOAc,9:1:0.5）により均質化した後に次のNMR特性を
示す1.0gm（86％）の黄色固形分を得た。¹HNMR（CDCl₃
−d₆DMSO,TMS）δ9.43（br s1H）,8.72（s,2H,NH₂）,8.
40（br d,1H）,7.95（d,2H）,7.74（s,2H）,7.38（d,2
H）,6.03（s,2H）,5.22（s,2H）,4.43（m,1H）,2.20〜
2.03（m,4H）,1.45（s,9H）,1.43（s,9H）。

上記の黄色生成物（0.42gm）を10mlの無水CH₂Cl₂に溶
解し、5mlのトリフルオロ酢酸を加えた。この反応混合
物を１時間撹拌し、次いで蒸発乾固した。この黄色油状
生成物を100mlの0.025M NH₄HCO₃に懸濁し、0.5M NH₄HCO
₃（約20滴）を滴下してほぼ完全な溶液を得た。黄色溶
液は、１リットルの0.025M NH₄HCO₃を使用して15gmのQA
Eセファデックス ［シグマ ケミカル カンパニー，
セントルイス、ミズーリー州（Sigma Chemical Compan
y,St.Louis,MO）］でクロマトグラフィーを行った後、
1.5リットルの0.025M NH₄HCO₃および1.5リットルの0.50
M NH₄HCO₃にて勾配溶離した。勾配の中間で溶離した黄
色生成物を回収し、凍結乾燥してメトトレキセート−γ
−ヒドラジドを得、これは三水和物に対する正確な元素
分析（C,H,N）を与え、また前記ロソウスキーの方法に
よって調製されたメトトレキセート−γ−ヒドラジドの
サンプルにHPLC（C₁₈）上で一致した。

7.1.1.3.カルボジイミドによるメトトレキセートからの
メトトレキセート−γ−ヒドラジド（１）：方法３ メトトレキセート（0.5gm,1.1mモル）を無水DMF（50m
l）に溶解し、３（３−ジメチルアミノプロピル）−１
−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（0.42gm,2.1m
モル）を加えた。この反応混合物をさらに24時間室温に
て撹拌しながらインキュベートした。溶媒の蒸発により
黄色オイルが残り、それをQAEセファデックス（ジグマ
ケミカル カンパニー、セントルイス ミズーリー
州）上でクロマトグラフィーにかけ、おそらくMTX−α
−ヒドラシドなどを含むがこれらに限定されない他の生
成物（従来の調製用HPLCクロマトグラフ技術により目的
のMTX−γ−Hyから分離可能）と共に黄色の生成物メト
トレキセート−γ−ヒドラシドを得た。

7.1.2.メトトレキセート−α−ヒドラジド（７） Ｎ−α−Fmoc L−グルタミン酸Ｎ′−Boc−ヒドラジド
−γ−ｔ−ブチルエステル（８） Ｎ−α−Fmoc L−グルタミン酸γ−ｔ−ブチルエステ
ル（5.0gm.12mモル）（バーケム）をＮ−メチルモルホ
リン（1.19gm,1.29ml,12mモル）を含む100mlの無水THF
に溶解した。この溶液を窒素雰囲気下０℃まで冷却し、
ついで2,2,2−トリクロロ−1,1−ジエチルクロロホルメ
ート（3.39gm,1.4mモル）を溶解した10mlの無水THFを10
分間かけて滴下した。クロロホルメートの添加終了後、
反応混合物を15分間０℃にて撹拌し、ついでｔ−ブチル
カルバゼート（2.34gm,18mモル）を加え、反応物を０℃
でさらに10分以上撹拌し、次いで室温まで暖め、そして
一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、反応混合物を水（200m
l）に注ぎ、ジエチルエーテル（200ml）で抽出した。エ
ーテル層を10％酢酸で洗浄し、ひきつづき水、次いで飽
和NaClで洗浄しNa₂SO₄で乾燥した。エーテルを蒸発させ
ると、目的のＮ−α−Fmoc L−グルタミン酸Ｎ′−Boc
−ヒドラジド−γ−ｔ−ブチルエステル（８）である白
みがかった泡状物（6.25gm,98％）を得た。¹HNMR（CDCl
₃,TMS）δ8.92（br s,NH）7.91〜7.00（m,9H）,4.6〜4.
05（m,4H）,1.40（s,18H）。

Ｌ−グルタミン酸−Ｎ′−Boc−ヒドラジド−γ−ｔ−
ブチルエステル（９） Ｎ−α−Fmoc L−グルタミン酸−Ｎ′−Boc−ヒドラ
ジドγ−ｔ−ブチルエステル（0.7gm,1.3mモル）を窒素
雰囲気下、20ml無水THFに溶解した。ジエチルアミン（5
ml）を加え反応混合物を約２時間またはシリカゲルTLC
（CH₂Cl₂:MeOH;9:1）が出発原料（Rf＝0.45）の消失を
示すまで室温にて撹拌した。反応終了後、混合物を蒸発
させ、真空下に置いて最終痕跡量のアミンを除去した。
粗生成物Ｌ−グルタミン酸−Ｎ′−Boc−ヒドラジド−
γ−ｔ−ブチルエステルをさらに精製することなしに使
用した。

メトトレキセート−α−Ｎ′−Boc−ヒドラジドγ−ｔ
−ブチルエステル（10） 第7.1.1.2節に記載したとおりに調製した４−アミノ
−４−デオキシ−N¹⁰−メチルプテロイン酸2,4−ジニト
ロフェニルエステル（16）（0.64gm,1.3mモル）を30ml
の無水DMFに溶解し、5mlの無水DMF中のＬ−グルタミン
酸−Ｎ′−Boc−ヒドラジド−γ−ｔ−ブチルエステル
（0.41gm,1.3mモル）の溶液を加えた後、つづいてジイ
ソプロピルエチルアミン（0.24gm,0.32ml,1.86mモル）
の添加を行った。この反応混合物を室温にて24〜72時間
撹拌した。反応は出発原料の消失および生成物に相当す
る新たな黄色スポット（Rf＝0.21）の形成についてTLC
（シリカゲルCH₂Cl₂:MeOH:HOAc;9:1:0.5）で検査した。
反応終了後、混合物を蒸発し、CH₂Cl₂:MeOH:HOAc;（9:
1:0.5）を使用してシリカゲルでフラッシュクロマトグ
ラフィーにかけ、黄色粉末としてメトトレキセート−α
−Ｎ′−Boc−ヒドラジドγ−ｔ−ブチルエステルを得
た（0.60gm,74％収率）。

メトトレキセート−α−ヒドラジド（７） メトトレキセート−α−Ｎ′−Boc−ヒドラジドγ−
ｔ−ブチルエステル（0.60gm）を5mlのCH₂Cl₂に溶解
し、5mlのトリフルオロ酢酸を加え、反応混合物を２時
間撹拌し、蒸発し、重炭酸アンモニウム（0.025M,100m
l）の添加により中和し、そしてこの溶液を重炭酸アン
モニウム勾配を用いてQAEセファデックス カラム上で
精製し、凍結乾燥後、黄色粉末として100mgのメトトレ
キセート−α−ヒドラジドを得た。

7.1.3.メトトレキセート−α，α−リシル−グリシル−
グリシル−チロシル−ヒドラジド（11） チロシンＮ′−Boc−ヒドラジド（12） 100ml無水テトラヒドロフラン（THF）中のCBZ−Ｌ−
チロシン（3.00gm,9.11mモル）、Ｎ−メチルモルホリン
（0.92gm,1.00ml,9.11mモル）の溶液を窒素雰囲気下、
０℃に冷却した。2,2,2−トリクロロ−1,1−ジメチルエ
チルクロロホルメート（2.18gm,9.11mモル）を冷溶液に
加えた。５分撹拌後、20mlの無水THF中のｔ−ブチルカ
ルバゼート（1.20gm,9.11mモル）の溶液を０℃に冷却し
て反応混合物に添加した。徐々に室温まで温度を上昇さ
せ、約18時間撹拌した。溶媒を回転蒸発で除き、残留物
をクロロホルムと水とに分配し、層分離した。有機層を
飽和NaClで洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして溶
媒を蒸発させて粗保護生成物を得た。このCBZ−保護生
成物、すなわちCBZ−チロシンＮ′−Boc−ヒドラジドを
石油エーテルと酢酸エチルの混合物（1:1）を使用する
フラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲル上にて
精製した。

クロマトグラフィー精製後、CBZ成分を次のとおりに
保護生成物から除いた。すなわちCBZ−チロシンＮ′−B
oc−ヒドラジドを無水エタノール（250ml）および氷酢
酸（2ml）の混合物に溶解し、炭水化物に担持させた５
％Pd 0.5gmの存在下パー装置（３〜４気圧）内で１時間
水素化した。この触媒を濾別し、溶媒を回転蒸発で除
き、ニンヒドリン陽性生成物チロシンＮ′−Boc−ヒド
ラジド（12）を得た。¹HNMR（d₆,DMSO,TMS）δ7.13（d,
2H）,6.78（d,2H）,3.75〜2.70（m,3H）,1.55（s,9
H）。

グリシル−グリシル−チロシンＮ′−Boc−ヒドラジド
（13） 100mlの無水DMF中のCBZ−グリシル−グリシン（0.17g
m,0.68mモル）およびジイソプロピルエチルアミンの溶
液を０℃に冷却した。イソブチルクロロホルメート（0.
088gm,0.68mモル）を加えた。５分間の撹拌後、無水DMF
中のチロシンＮ′−Boc−ヒドラジド（12）（0.200gm,
0.68mモル）を０℃にて加えた。この混合物を室温まで
暖め一晩撹拌した。溶媒を回転蒸発により除去した。残
留物を水に懸濁し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル
層を飽和NaClで洗浄し、Na₂SO₄で乾燥、濾過そして蒸発
して0.274gm（74％）の生成物CBZ−グリシル−グリシル
−チロシンＮ′−Boc−ヒドラジドを得た。¹HNMR（d₆DM
SO,TMS）δ7.58（s,5H）,7.14（d,2H）,6.77（d,2H）,
5.11（s,2H）,3.72（m,5H）,2.90（m,2H）,1.50（M,9
H）。このCBZ−保護生成物（0.824gm）を無水エタノー
ル（200ml）および氷酢酸（2ml）の混合物に溶解した。
この混合物を１時間パー装置（３〜４気圧）上で炭素に
担持させた５％Pd 0.5gmの存在下に水素化した。この触
媒を濾別し、溶媒を回転蒸発により除去し、小量の酢酸
を含有する0.5gmの粗グリシル−グルシル−チロシン
Ｎ′−Boc−ヒドラジド生成物（13）を得た。¹HNMR（d₆
DMSO,TMS）δ7.30（d,2H）,6.90（d,2H）,3.80〜3.20
（m,5H）,3.90（m,2H）,2.00（CH₃COOH）,1.5（s,9
H）。

CBZ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル−リシン
−（ε−Boc）（14） 無水DMF（35ml）中のCBZ−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ
−ブチルエステル−１−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（3.5gm,0.0081mモル）、ジイソプロピルエチルア
ミン（2.82ml,0.0162モル）およびε−ｔ−Boc−Ｌ−リ
シン（1.98gm,0.0081mモル）の混合物を一晩窒素雰囲気
下撹拌した。DMFを回転蒸発にて除去した。残留物をCH₂
Cl₂にとり、水で４度，飽和NaClで１度洗浄し、Na₂SO₄
で乾燥した。濾過および溶媒の蒸発によりろう状固形分
として4.0gmの（14）を得た。

グルタミン−γ−ｔ−ブチル−リシル−（−ε−Boc）
−グリシル−グリシル−チロシンＮ′−Boc−ヒドラジ
ド（15） 無水DMF（100ml）中の（14）（1.17mg,2.07mモル）お
よびＮ−メチルモルホリン（0.23ml,2.07mモル）の溶液
をN₂雰囲気下０℃まで冷却した。イソブチルクロロホル
メート（0.27ml,2.07mlモル）を加え、０℃にて５分間
撹拌した。無水DMF中の（13）（0.8465mg,2.07mモル）
の溶液を反応混合物に加えた。この反応物を室温まで暖
めた。DMFを回転蒸発にて除去した。この残留物を酢酸
エチルおよび水で抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、
濾過し、そして蒸発して1.1gm（64.7％）の（15）のCBZ
誘導体を得た。¹HNMR（d₆,DMSO,TMS）δ7.55（s,5H）,
7.21（d,2H）,6.80（d,2H）,6.80（d,2H）,5.13（s,2
H）,3.90〜1.80（m,21H）,1.40（br s 27H）。この物質
を炭素に担持させた0.5％Pd 0.5gの存在下エタノール
（200ml）および2mlの酢酸中で１時間水素化してCBZ成
分を除き、ニンヒドリン陽性生成物（15）を得た。¹HNM
R（d₆,DMSO,TMS）δ7.51（d,2H）,6.80（d,2H）,1.50
（br s,27H）。

メトトレキセート−α，α−リシル−グリシル−グリシ
ル−チロシル−ヒドラジド（11） 無水DMF（40ml）中のN,N−ジイソプロピルエチルアミ
ン（0.032ml,0.18mモル）、ジエチルホスホロシアニデ
ート（0.018ml,0.12mモル）および４−アミノ−４−デ
オキシ−N¹⁰−メチルプテロイン酸（ロソウスキーら198
5,J.Med.Chem.28:660の方法に従って調製）（0.34gm,0.
12mモル）の混合物を一晩N₂雰囲気下撹拌した。無水DMF
中の（15）（1.0gm,0.12mモル）およびN,N−ジイソプロ
ピルエチルアミン（0.021ml,0.12mモル）の溶液を反応
混合物に滴下した。この混合物を50℃で約２時間加熱し
た。DMFを回転蒸発により除き、残留物を水で粉砕し、
濾過および乾燥後に0.080gを得た。この生成物を２時間
メチレンクロリド（5ml）、アニソール（3ml）およびな
トリフルオロ酢酸（5ml）の混合物中で撹拌することに
よりｔ−ブチルエステルおよびBoc保護基を除去するこ
とによって脱保護した。溶媒を回転蒸発にて除き、そし
て残留物をエーテルで粉末化し、ついで濾過し、0.03gm
の生成物（11）を得た。

7.1.4. アミノプテリン−γ−ヒドラジド（AM−γ−H
Y）（16） Ｎ−４（（2,4−ジアミノ−６−プテリジニル）メチ
ルアミノ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸−５−ヒドラ
ジド、一般名「アミノプテリン−γ−ヒドラジド」を次
のごとく合成した。

４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロイン
酸2,4−ジニトロフェニルエステル（17） ４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロイ
ン酸をロソウスキーら、1985,J.Med Chem.28:660の方法
により調製した。

無水DMF中の４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミ
ルプテロイン酸の溶液（0.5gm,1.5mモル）を24時間25℃
で３−（３−ジメルアミノプロピル）−１−エチルカル
ボジイミドヒドロクロリド（0.43gm,2.25mモル）および
2,4−ジニトロフェノール（0.41gm,2.25mモル）ととも
に撹拌した。この反応混合物を濃縮し、イソプロパノー
ルで粉砕しそして濾過した。黄色固形分を回収し、40℃
で減圧下に乾燥し、４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−
ホルミルプテロイン酸2,4−ジニトロフェニルエステル
を得た（0.77gm,100％）。Rf＝0.31（メルクシリカゲ
ル、CH₃Cl₂:MeOH:HOAc;9:1:0.5）。

N¹⁰−ホルミルアミノプテリン−α−ｔ−ブチルエステ
ル−γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジド（18） ４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロイ
ン酸2,4−ジニトロフェニルエステル（17）（1.00gm,2m
モル）およびＬ−グルタミン酸α−ｔ−ブルチエステル
γ−Ｎ′−Boc−ヒドラジド（３）（0.70gm,2.2mモル）
の混合物を24時間25℃にて35mlの無水DMF中で攪拌し
た。回転蒸発によるDMFの除去後、残留物をCH₂Cl₂:MeO
H:HOAc（9:1:0.5）中に溶解し、シリカゲルカラムにか
けて同じ溶媒混合物で溶離した。生成物を含有するフラ
クションを貯め、蒸発して黄色固形分1.05gm,82％とし
て（18）を得た。Rf＝0.21、青色螢光スポット、（CH₂C
l₂:MeOH:HOAc,9:1:0.5）。

アミノプテリン−γ−ヒドラジド（16） トリフルオロ酢酸（5ml）を5mlのCH₂Cl₂の（18）（10
0mg,0.16mモル）の溶液に加えた。反応をTLC（シリカゲ
ル、CH₂Cl₂:MeOH:NH₄OH:5:4:1）で検査して（18）（Rf
＝0.95）の消失および新たな青色蛍光スポット（Rf＝0.
62）の形成を確認した。40分後反応を終了し、回転蒸発
により乾固した。化合物を次いで5mlの1N NaOHおよび10
mlのMeOHに溶解しホルミル基を除いた。つづいてTLC
（シリカゲル、CH₂Cl₂:MeOH:NH₄OH;5:4:1）で反応を追
跡し、青い螢光色の消失を観察した。青色螢光スポット
が消失した際（約2.5時間）反応は終了し、混合物を0.5
N HClでpH7に中和した。この反応混合物を濃縮、凍結
乾燥して黄色固体の粗アミノプテリン−γ−ヒドラジド
（16）を得た。重炭酸アンモニウム勾配（0.025M〜0.5
M）を用いるQAEセファデックス 上での精製および引き
続いて凍結乾燥を行い、純粋なアミノプテリン−γ−ヒ
ドラジド（16）（0.03gm,40％）を得た。

7.1.5. アミノプテリン−α−ヒドラジド（19） N¹⁰ホルミル−アミノプテリンα−Ｎ′−Boc−ヒドラジ
ドγ−ｔ−ブチルエステル（20） 第7.1.4節に記載したとおりに調製された４−アミノ
−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロイン酸2,4−ジニ
トロフェニルエステル（17）（0.50gm,1mモル）を50ml
の無水DMFに溶解し、Ｌ−グルタミン酸Ｎ′−Boc−ヒド
ラジド−γ−ｔ−ブチルエステル（９）（0.48gm,1.5m
モル）を加えた。この反応混合物を72時間室温にて攪拌
し、新しい黄色生成物の出現（Rf＝0.19）についてTLC
（シリカゲル,CH₂Cl₂:MeOH:HOAc;9:1:0.5）にて追跡し
た。反応完結後、この混合物を蒸発し、ついでフラッシ
ュクロマトグラフ（シリカゲル,CH₂Cl₂:MeOH:HOAc;9:1:
0.5）にかけてTLC上の単一螢光スポットとして（20）
（0.57gm,89％）を得た。

アミノプテリン−α−ヒドラジド（19） N¹⁰ホルミル−アミノプテリン−α−Ｎ′−Boc−ヒド
ラジド−γ−ｔ−ブチルエステル（0.57gm）をCH₂Cl
₂（20ml）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10ml）を加え
た。この反応混合物を２時間室温にて攪拌し、ついで回
転蒸発した。得られたオイルを10mlの1N NaOHに溶解
し、出発物質の青色螢光スポットがTLC（シリカゲル、C
H₂Cl₂:MeOH:NH₄OH;5:4:1）上から消失するまで室温にて
２時間攪拌した。ついでこの反応混合物を1N HClで中
和し、0.025M NH₄HCO₃溶液で100mlに希釈した。重炭酸
アンモニウム勾配（0.025M〜0.50M）を用いてQAEセファ
デックス でイオン交換クロマトグラフィーにかけ、つ
づいて凍結乾燥してアミノプテリン−α−ヒドラジド
（19）を得た。

7.1.6. メトトレキセート−α−α−リシン（21） Ｌ−グルタミル−γ−ｔ−ブチルエステル−α−リシン
（ε−CBZ）−ジフェニルメチルエステル（22） Ｎ−メチルモルホリン（0.26ml,2.35ミリモル）をFmo
c−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル（1.00gm,2.
35ミリモル）の無水DMF（10ml）溶液中に０℃において
加えた。イソブチルクロロホルメート（0.32gm,2.35ミ
リモル）を加え、その反応混合物を０℃において10分間
攪拌した。ε−CBZ−Ｌ−リシン−ジフェニルメチルエ
ステル（1.1gm,2.35ミリモル）を、室温まで暖めておい
た反応混合物に加え、１夜攪拌した。反応混合物を水30
0ml中に注入し、酢酸エチルで抽出した。層分離後、有
機層をNa₂SO₄で乾燥し、溶媒を除いて固形物を得た。固
形物をTHF（25ml）中に溶解し、Fmoc成分をジエチルア
ミン（0.84gm,1.2ml,12.0ミリモル）を用いて室温で２
時間かけて除いた。溶液を蒸発乾固して油状生成物（2
2）を得た。

メトトレキセート−α−α−リシン（21） ４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−メチルプテロイン
酸（0.76gm,2.35ミリモル）をジイソプロピルエチルア
ミン（1.23ml,7.05ミリモル）とジエチルホスホロシア
ニデート（1.07ml,7.05ミリモル）の無水DMF（100ml）
溶液中に少量ずつ攪拌しながら加えた。反応混合物のTL
Cは、１時間後に反応が完了したことを示した。

化合物（22）（1.52gm,2.35ミリモル）を加え、混合
物を室温で１夜攪拌してインキュベートした。反応混合
物を蒸発乾固した。残留油をCHCl₃に溶解し、冷飽和NaH
CO₃を用いて数回洗浄した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、
蒸発乾固し、生じた固形物をCH₂Cl₂:MeOH（95:5）を使
用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを通し
て精製した。

生成物をHOAc中のHBr（30〜32％）30ml中に溶解し、
室温で４時間攪拌した。HPLC分析は開裂が完全であり、
単一生成物が生じたことを示した。エーテル（100ml）
を反応混合物中に加えて生成物を沈降させた。混合物を
遠心分離にかけ、ペレットをエーテルで数回洗浄した。
その後、ペレットを冷（０℃）プロピレンオキシド中に
懸濁させて臭化水素酸塩を中和し、その後濾過した。黄
色固体、メトトレキセート−α−α−リシン（21）は、
C18シリカゲルHPLC分析により単一ピークとして溶出し
た。

7.2. 抗体複合体の調製 7.2.1.MTX−γ−HY−抗体 一連の実験において、MTX−γ−HY−抗体複合体は、
本発明に従って次のように調製された。

ブラウンノルウェイ（BN）ラットのクラス１主要組織
適合性（MHC）抗原［スミレック等1980年ジャーナル・
オブ イクスペリメンタル メディシン 151巻 1139
頁（Smilek et al.,1980,J.Exp.Med.151:1139）］に特
異的なCTY015と指定されたラットモノクローナルIgG2c
抗体を使用した。モノクローナル抗体は、ヌードマウス
中に生じた腹水かまたは生体外で培養された抗体−産生
ハイブリドーマ細胞系の上澄液から収穫された。得られ
た抗体は、プロテインＡ−セファロース カラム［ファ
ーマシア・ファイン・ケミカルズ，ピスカタウェイ，ニ
ュージャージー州，（Pharmacia Fine Chemicals,Pisca
taway,N.J.）］を使用する勾配溶離で精製した。抗体調
製物の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により確認された。

CYT015抗体のオリゴ糖部位は、暗所でリン酸緩衝溶液
pH6.0（PBS;0.15M NaCl,0.01M PO₄ ^-2）中のNaIO₄ 10m
Mでもって、氷上で１時間インキュベートして酸化し
た。過剰NaIO₄は、その後、透析かまたはゲル濾過技術
かのいずれかを用いて酸化抗体から除かれた。修飾抗体
（７μｍ）は、室温において一夜暗所で1mM濃度のMTX−
γ−Hyと共にインキュベートした。未反応MTX−γ−Hy
を、PBSに対する透析により除去した。

7.2.2.MTX−α−α−リシン−ε−抗体 他の一連の実験において、MTX−抗体複合体は、次の
ように、MTX類縁体を反応性第一級アミン基を介して酸
化抗体のアルデヒド基にカップルリングさせる方法で調
製された。リシン部位に遊離の反応性ε−NH₂基を有す
るMTX−α−α−リシンは、前記第6.1.4節に記載のよう
に調製した。CYT015抗体は、前記第6.2.1節に記載のよ
うに酸化した。酸化抗体（1.0mg/ml）を、暗所において
室温で一夜、1mM MTX−α−α−リシンおよび10mMナト
リウムシアノボロハイドライド（NaCNBH₃）と反応させ
た。過剰NaCNBH₃と未反応MT−α−α−リシンをPBSに対
する透析で除去した。生体内使用前に、このMTX−α−
α−リシン−ε−抗体複合体は、ゲル濾過カラムを通し
て形成された可能性のある凝集物を除去することが好ま
しい。

8. 部位選択性抗体−MTX−γ−Hyの優れた治療効果 次の実験は、生体内投与された際に、本発明の部位選
択的に結合されたMTX−抗体複合体がランダムに結合さ
れた同様の複合体に比較して優れた治療効果を現すこと
を示す。

MTX−γ−Hy−抗体複合体は、第6.2.1節に記載のCYT0
15を使用して調製した（MTX−Hy−CTY015と呼ぶ）。ラ
ンダムに結合されたMTX−抗体複合体は、同一のCYT015
抗体を使用して調製した。メトトレキセート（MTX）
を、カネロス等の方法［カネロス等,1985年，ジャーナ
ル オブ ナショナル キャンサー インスティテュー
ト 75巻,319頁（kanellos et al.,1985 J.Nat′l Canc
er Inst.75:319）］に従って、CYT015抗体のリシン残基
に非選択的にカップリングさせた（ランダムMTX−CYT01
5と呼ぶ）。未反応MTXをPBSに対する透析で除去した。

複合体の生体内治療効果は、１×10⁶BNリンパ腫細胞
を左腹に皮下注射した雌ヌードマウス［NIH スイス−
ウェブスター、タコニック ファームス、ニューヨーク
州（NIH Swiss−Webster,Taconic Farms,NY）］で評価
した。注射後４日目に、手でさわれる腫瘍が大部分の動
物に生じた。４日目から８日目まで続けて、動物は、抗
体−複合体のいずれか一方、即ち、MTX−Hy−CYT015か
またはランダムMTX−CYT015かを腹腔内注射された。１
分子の抗体につきランダムに結合した薬剤の量は、選択
的結合と比べて約半量にすぎなかったので、同量の薬剤
同士を比較するために、約半量の部位選択的複合体を投
与した。BN腫瘍の異種移植片を有する一群の未処置動物
を対照として用いた。毎日、動物は計量され、腫瘍の大
きさが計測された。それらの結果が第１図および第２図
に示される。

第１図に示されるように、部位選択的MTX−Hy−CYT01
5は、未処置動物の同一グループと比較すると、腫瘍の
異種移植片を有する動物にすぐれた治療的効果を及ぼ
す。部位選択的複合体を受け取った動物は、腫瘍の退行
を示した。反対に、第２図に示すようにランダムに結合
されたMTX−CYT015複合体によって同量の薬剤を受け取
った動物は、ほんの僅かの治療効果を示したにすぎなか
った［例えばMTX−Hy−CYT015（0.5mg CYT015上の7.5μ
g MTX−Hy）とランダムMTX−CYT015（1.0mg CYT015上の
７μg MTX）とを比較のこと］。

9. メトトレキセート−α−α−リシル−グリシル−グ
リシル−チロシル−ヒドラジド抗体複合体の生体外開裂 次の実験は、本発明の抗体−ペプチド−MTX−複合体
が酵素的に開裂されて生体外で遊離MTXを放出するこを
示す、同様に、生体内でもプラスミンとカルボキシペプ
チダーゼのような酵素により触媒される開裂が腫瘍標的
部位において生じ、その結果治療活性を有する遊離のMT
Xが目的とした特定の標的部位において放出されること
が期待される。

メトトレキセート−α−α−リシル−グリシル−グリ
シル−チロシル−ヒドラジド（MTX−α−α−Ｋ−Ｇ−
Ｇ−Ｙ−NHNH₂）は前記第6.1.2節に記載のように調製し
た。CYT015抗体複合体は第6.2節に記載のように抗体を
酸化し、MTX−α−α−Ｋ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−NHNH₂のヒドラ
ジド成分を抗体のアルデヒド成分にカップリングするこ
とにより調製した。

抗体＝Ｎ−Ｎ−Ｈ−Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−MTX複合体（1mg
/ml）（pH7.4PBS中）は、３時間（37℃）トリプシン（5
00μgm/ml）と反応させた。薄層クロマトグラフィーに
よる消化物の分析は複合体からのMTX−α−α−リシン
の放出を示した。ジイソプロピルホスホロフルオリデー
トでトリプシンを阻害した後で、カルボキシペプチダー
ゼＢを加えた。遊離MTXが放出された。カルボキシペプ
チダーゼＢ単独では、複合体からMTXまたはMTX−α−α
−リシンを開裂できず、プラスミンとカルボキシペプチ
ダーゼＮの如き酵素により触媒される生体内で起こると
考えられる必須の２段階開裂が確認された。カルボキシ
ペプチダーゼＮは血液中に見い出され、カルボキシペブ
チダーゼＢは、消化管でのみで見い出される。しかしな
がら、カルボキシペプヘチダーゼＢは、両酵素が類似の
特異性を有するために、カルボキシペプチダーゼＮの良
い生体外モデルとして役立つ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 475/04 Ｃ０７Ｄ 475/04 (72)発明者 ロペス，アントニー ドワイト アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08525 ホープウェル シンダータウン ロード 341 (72)発明者 ロッドウェル，ジョン ディー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19067 ヤードレイ ラムセイ ロード 430

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】メトトレキセートまたはアミノプテリンの
   アミン誘導体の合成方法であって、 （ａ）遊離カルボキシル基と保護カルボキシル基を有す
   るＮ−保護Ｌ−グルタミン酸の遊離カルボキシル基を、
   第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジ
   ド、フェニルヒドラジン、アルコキシアミン、セミカル
   バジドおよびチオセミカルバジドより成る群から選ばれ
   る反応性アミンまたは保護反応性アミンを含む成分と反
   応させて、反応性アミンまたは保護反応性アミンを含む
   Ｎ−保護Ｌ−グルタミン酸誘導体を形成させること； （ｂ）工程（ａ）で形成されたＮ−保護Ｌ−グルタミン
   酸誘導体からＮ−保護基を除去して、反応性アミンまた
   は保護反応性アミンを含むＬ−グルタミン酸誘導体を形
   成させること； （ｃ）工程（ｂ）で形成されたＬ−グルタミン酸誘導体
   の遊離α−アミノ基を、４−アミノ−４−デオキシ−N
   ¹⁰−メチルプテロイン酸または４−アミノ−４−デオキ
   シ−N¹⁰−ホルミルプテロイン酸の活性化カルボキシル
   基と反応させること、その際該カルボキシル基が既知の
   カルボキシル活性化剤により活性化されること；および （ｄ）保護基をすべて除去して、反応性アミンを含む水
   溶性のメトトレキセートまたはアミノプテリン誘導体を
   形成させること、その際該誘導体が第一級アミン、第二
   級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジ
   ン、アルコキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミ
   カルバジドより成る群から選ばれる反応性アミンを含む
   こと； を特徴とする、上記方法。
2. 【請求項２】工程（ａ）で用いるＮ−保護Ｌ−グルタミ
   ン酸の保護カルボキシル基がα−カルボキシル基であ
   り、そして工程（ｂ）で形成されたＬ−グルタミン酸誘
   導体の遊離アミノ基が４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰
   −メチルプテロイン酸の活性化カルボキシル基と反応し
   てメトトレキセート−γ−ヒドラジドを形成する、請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】工程（ａ）で用いるＮ−保護Ｌ−グルタミ
   ン酸の保護カルボキシル基がγ−カルボキシル基であ
   り、そして工程（ｂ）で形成されたＬ−グルタミン酸誘
   導体の遊離α−アミノ基が４−アミノ−４−デオキシ−
   N¹⁰−メチルプテロイン酸の活性化カルボキシル基と反
   応してメトトレキセート−α−ヒドラジドを形成する、
   請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】工程（ａ）で用いるＮ−保護Ｌ−グルタミ
   ン酸の保護カルボキシル基がα−カルボキシル基であ
   り、そして工程（ｂ）で形成されたＬ−グルタミン酸誘
   導体の遊離α−アミノ基が４−アミノ−４−デオキシ−
   N¹⁰−ホルミルプテロイン酸の活性化カルボキシル基と
   反応してアミノプテリン−γ−ヒドラジドを形成する、
   請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】工程（ａ）で用いるＮ−保護Ｌ−グルタミ
   ン酸の保護カルボキシル基がγ−カルボキシル基であ
   り、そして工程（ｂ）で形成されたＬ−グルタミン酸誘
   導体の遊離α−アミノ基が４−アミノ−４−デオキシ−
   N¹⁰−ホルミルプテロイン酸の活性化カルボキシル基と
   反応してアミノプテリン−α−ヒドラジドを形成する、
   請求項１記載の方法。