JPS63503144A - 葉酸類縁体のアミン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

５、　のアミンテ道　の　４ よ−光肌凶分責 本発明は、部位選択的に付着した抗体治療剤複合体に関するものである。特に、 本発明は、類縁体の反応性アミンを経由して抗体または抗体フラグメントに対し て共有結合した葉酸類縁体の誘導体を含むものである。抗体複合体の製造方法な らびに生体内抗体複合体の使用方法が記載されている。また、メトトリクセイト およびアミノプテリンのごとき葉酸類縁体の反応性アミン含有誘導体の合成方法 が含まれている。 ２、発明の背景 ２．１．メトトリクセイトおよびアミノプテリンのｊ導ロソウスキーら［Ｒｏｓ ｏｗｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１，Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　２４：１ ４５０．以下「ロソウスキーらＩ」という）コは、ジエチルホスフォシアニブイ トのごときペプチド形成剤によりカプリングされた適度に保護されたし一グルタ ミン酸前駆体に対する４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１Ｇ−メチルプテロイル酸 （ＭＡＰＡ）のカップリング、つづいてヒドラジンとの反応および保護エステル 部位の除去によるメトトリクセイトのヒドラジド誘導体の製造方法を述べている 。このＭＡＰＡは、公知の化学合成方法［ロソウスキーら（ＲＯ３ｏｗｓｋｙ　 ｅｔ　ａｌ、　）　、（１９８５Ｊ、　Ｒｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　（以下、「ロソ ウスキーらＩＩ　Ｊという）；チャイコフスキーら（Ｃｈａｙｋｏｖｓｋｙｅｔ 　ａｌ、）、Ｊ、　）ｌｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　１７１２１２；パイパーら（ｐｒ ｐｅｒ　ｅｔａｌ、、）１９７４．Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　４２：　２０ ８参照コにより、あるいはカルボキシペプチダーゼＧ、によるメトトリクセイト の開裂［マーチネリら（）ｌａｒｔｉｎｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、）、　１９７９ ．　Ｊ、　）ｌｅｄ、　ｃｈｅｍ、　２２：　８６９；　？クローら（）ＩｃＣ ｕｌｌｏｕｇｈ　ｅｔ　ａｌ、、）、　１９７１、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　２４蝕７２０参照］により調製される。 前記ロウソウスキーら■の方法によれば、Ｌ−グルタミン酸−ガンマ−メチルエ ステルが１０％の過塩素酸の存在下にｔ−ブチルアセテートでエステル化されて アルファー

【−ブチル−ガンマ−メチルグルタミン酸が形成れる。この炭素保護 アルファーｔ−ブチル−ガンマ−メチルグルタミン酸エステルは、トリエチルア ミン含有ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ＞とＭＡＰＡとを約８０℃で２分間加熱 し、ついでグルタミン酸誘導体を添加することにより縮合される。 加熱は約８０℃でさらに２時間続けられ、ついで減圧下に溶媒を蒸発させ、）Ｉ ＴＸ　−アルファーｔ　−ブチル−ガンマ−メチルエステルを形成するシリカゲ ル上でクロマトグラフィが行なわれる。）ＩＴＸジエステルとメタノール溶液中 のしドラジンとの４℃での６０時間の反応は、アルファーブチルエステルがガン マ−ヒドラジドを生じる。ＩＮのＨ（１中のブチルエステルの５０℃での１時間 の加酸分解、っづ＜ＤＥＡＥセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィーは 、所望の）ＩＴＸ　−ガンマ−ヒドラジドを形成する。 ロウソウスキーらの方法は、つぎのごとき数多くの欠点を有している。 （１）使用される中間体、例えばアルファーメチルエステル−１−ブチルグルタ ミン酸は遊離の塩基として不安定であり、また （２）アミノプテリン−アルファーヒドラジドの重大な収率は、ホルミル保護基 の４−アミノ−４デオキシ−Ｎ１０−ホルミルブチリル酸からの不所望の早過ぎ る除去が後続する加ヒドラジン分解が相当するアミノプテリン類縁体の形成に要 する間に起こるので、直ちに利用できるＨＡＰＡ類縁休４一体ミノ−デオキシ− ８１０−ホルミルブチリル酸を利用するこの方法を用いては得られない。 メトトリクセイトおよび／またはアミノプテリンのアミノ酸およびペプチド誘導 体の多くは、記載されている［例えば、「メトトリクセイトおよびアミノプテリ ンのシスティン酸およびヘモシスティン酸類縁体」の名称のロウソウスキーの米 国特許第４，４９０．５２９号、カムプトンらこれらの文献は、付着したアミノ 酸またはペプチドの反応性アミン部位が、抗体の酸化された炭水化物部位を経由 して抗体分子にメトトリクセイトまたはアミノプリテン類縁体がカップリングす るのに有用であることは記載もされておらずまたは示唆されていない。 ２．２．抗体分子に対するメトトリクセイトの共有結合数多くの異なる反応がメ トトリクセイト（またはメトトリクセイト類縁体）が抗体または抗体フラグメン トに共有結合するのに利用されている。これは、リシン残基のアミノ基、グルタ ミルまたはアスパラギン残基の遊離のカルボン酸基、システニル残基のスルフヒ ドリル基を含む抗体または抗体フラグメントのアミノ酸残基の薬剤化合物のカル ボキシ、アミノまたはスルフヒドリル部位に対する反応により達成される。抗体 分子を通じて規則的にあるいは不規則的に分散しているアミノ酸を経由しての結 合を含む方法は、不規則または非部位特異方法として参照される。 共有結合の最も普通に用いられる方法の一つは、メトトリクセイトまたはメトト リクセイト類縁体のカルボキシ（またはアミノ）部位が抗体のアミノ（またはカ ルボキシ）部位へ結合するカルボジイミド反応である。例えば、ジエンら（Ｓｈ ｅｎ　ｅｔ　ａｔ、）は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ ルボジイミドを経由してヒト血清アルブミンへメトクセイト（ＭＴＸ）がカップ リングし、水溶性ＭＴＸ−Ｈ８Ａ複合体を形成することを記述している（１９８ ４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１： 　１４４５）クルカルニら（Ｋｕｌｋａｒｎｉ　ｅｔ　ａｌ、）、（１９８１， Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。 旦：　１４４５）は、三つの非部位特異方法を経由して抗体分子に対するＭＴＸ の共有結合を記載している。すなわち、カルボジイミド法、混合無水物反応およ びメトトリクセイトのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルとの反応を用いる 活性エステル法。もっと最近では、クルカルニら（にｕｌｋａｒｎｉ　ｅｔ　ａ ｌ、）、（１９８５，Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ 、　旦２１１）は、メトトリクセイトの活性エステルを用いる抗体ににおけるリ シンのアミノ基を経由して抗体またはＦ　（ａｂ）２フラグメントとＭＴＸとの 複合化を記述している。 マナベら（Ｈａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、）、（１９８４，Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｈ ｅｄ、　虱４４５）は、多価担体として作用するデキストランＴ−４０を経由し てモノクローナル抗体に対するＭＴＸの共有結合を記述している。このデキスト ランＴ−４０は、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化されてポリアルデヒドデキ ストランを形成する。酸化されたデキストランのアルデヒド部位は、ついで抗体 分子のアミノ基と反応してシッフ塩基（イミン類）または還元されたシッフ塩基 を形成する。ついで、ＭＴＸは、酸化されたデキストラン抗体中間体と反応し、 かつ共有結合した複合体がシッフ塩基形成およびこれに続くデキストランのアル デヒドとＭＴＸの２または４個のアミノ基との間の還元により形成されることが 明らかにされている［前記マナベら（Ｈａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｔ、）等４４９頁 コ。しかしながら、本発明者らは、メトトリクセイトの２および４個のアミノ基 は核性が弱く、また予想されるような大部分はシッフ塩基または還元シッフ塩基 形成を生じない。 上記方法は、全て抗体分子のポリペプチド骨格に対して共有結合を生じている。 従来法により薬剤成分に直ちに複合し得るリジン、アスパラギン酸およびグルタ ミン酸のごときアミノ酸は、比較的規則的に生じかつ抗原結合領域を含む免疫グ ロブリンの軽および重鎖を通して不規則に分散する。この抗原結合領域のいかな る化学的変性も、抗体の認識因子における変化を生じる。このような変性は、抗 原に対する抗体の親和性および特異性を変える。異なる抗体の集団にいおて、抗 原結合領域のこのような変更は、若干の抗体分子の完全な不活性化および抗原結 合領域に対する変更の種類、激しさおよび／または接近により他の不活性化のよ り低い程度を生じる。この不活性化は、抗原結合領域の範囲内かあるいは極めて 近い領域での変化により、これは非反応的にするように結合部位の構造を変える か、あるいは抗原結合領域の域外での変化により、これは抗原結合領域に対する 抗原の接近を制限する。 １−元皿凶週丞 本発明の一般的方法によれば、治療用の葉酸類縁体は、抗体または抗体フラグメ ントに共有結合している。この共有結合は、得られる抗体複合体が抗原と結合し かつ生体内に投与されたときに治療効果をもたらす能力を有するように達成され る。さらに詳しくは、この共有結合は、抗体または抗体フラグメントの酸化され た炭水化物部位と、アミンが第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラ ジド、フェニルヒドラジン、アルコキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミ カルバジドよりなる群から選ばれたも有結合を形成することにより達成される。 特に、本発明は、 （ａ）抗体または抗体フラグメントを酸化剤と反応させて該抗体または抗体フラ グメント中にアルデヒド基を形成させ、かつ （ｂ）該抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水化物部位のアルデヒド基 を第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、 フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド基よりなる群か ら選ばれた葉酸類縁体の反応性アミン基と反応させて非複合化抗体または抗体フ ラグメントと実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を有する水溶性抗体葉 酸類縁体複合体を形成する ことを特徴とする治療性抗体−葉酸類縁体複合体の製造方法に関するものである 。還元は、該複合体を安定化するのに使用される。 本発明はさらに、抗体または抗体フラグメントの酸化された炭化水素部位に対す る共有結合を介して結合した葉酸類縁体誘導体よりなり、該水溶性複合体は非複 合化抗体または抗体フラグメントと実質的に同一の免疫反応性または免疫特異性 を有し、該共有結合はイミン、エナミン、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、オ キシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンおよびその還元形態よりなる群か ら選ばれたものである。 さらに本発明は、本発明の治療用抗体複合体の調製に有用なアミノプテリン−ガ ンマ−ヒドラジド、アミノプテリン−アルファーヒドラジド、メトトリキセイト ーアルファーヒドラジドおよびメトトリクセイトーアルファーアルファーリシル ーリシルーグリシルーグリシルーチロシルーヒドラジドのごとき新規な反応性ア ミン含有葉酸類縁体を含むものである。 本発明はまた、 （ａ）保護されたカルボキシル基および遊離のカルボキシル基を有するＮ−保護 ［−グルタミン酸を、第一級アミン、第二級アミン、アルコキシアミン、ヒドラ ジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバ ジドよりなる群から選ばれた反応性アミンまたは保護反応性アミンを含有する部 位と反応させて反応性アミンまたは保護反応性アミンを含有するＮ−保護し一グ ルタミン酸を形成し、 （ｂ）工程（ａ）で生成したＮ−保護［−グルタミン酸誘導体からＮ−保護基を 除去して遊離のアルファーアミノ基を有する反応性基または保護された反応性基 を有するし一グルタミン酸誘導体を形成し、 （Ｃ）工程（ｂ）生成したし一グルタミン酸誘導体のアルファーアミノ基を、カ ルボキシル基が公知のカルボキシル活性化剤により活性化されている４−アミノ −４−デオキシーＮ　メチルブチリル酸または４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１ ０−ホルミルブチリル酸のカルボキシル基と反応させ、かつ （ｄ）いかなる保護基をも除去して第一級アミン、第二級アミン、アルコキシア ミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチ オセミカルバジドよりなる群から選ばれた反応性アミンを含有するメトトリクセ イトまたはアミノプテリンの反応性アミン含有水溶性誘導体を形成する 工程よりなることを特徴とする葉酸類縁体の治療的に有効なアミン誘導体の新規 な合成方法を含むものである。 本発明の抗体葉酸類縁体は、生体内治療において理想的に的している。特定の目 標部位に対する該葉酸類縁体のデリバリ−は、動物またはヒトに対して水溶性抗 体−葉酸類縁体複合体の有効量を投与することにあり、該複合体は、該目標部位 と免疫反応性でありかつ免疫特異性であり、また非目標部位と実質的に非免疫反 応性でありかつ非免疫特異性であり、また抗原決定基は非目標部位に実質的な量 が見出せない。この目標部位は葉酸類縁体で治療を受ける細胞性疾患と関連する 生体内の特定細胞、組織、器官またはいかなる部位をも含むものである。 本発明は、動物またはヒトに対して、本発明により調製された治療的に有効な量 の水溶性部位選択的に付着した抗体−葉酸類縁体複合体を投与することよりなる 細胞性疾患の治療方法を含むものである。治療されるべき細胞性疾患は、つぎの 子宮絨毛癌、破壊性繊毛腺腫、胞状奇胎、急性および亜急性白血病、白血病性髄 膜炎、リンパ肉腫、苗状息肉腫、肺癌、特に鱗状および小胞タイプ、背反性肉腫 および頭部、首部および骨盤のある腫瘍を含むがこれらに限定されるものではな い。 ４、【図面の簡単な説明】 本発明は、以下の発明の詳細な説明、発明の特定の具体例の実施例および添付図 面を参照することによりさらに完全に理解されるであろう。 第１図は、選択的に結合したＨＴＸ−ガンマ−ｔｌＶ抗体複合体、すなわちＨＴ Ｘ−Ｈｙ−ＣＹＴＯ１５の部位の注射の確立されたＢＮ腫瘍の異種移植片の影響 を説明するグラフである。未治療の対照動物における腫瘍増殖も比較のために含 まれている。 第２図、不規則に結合したＨＴＸ−ガンマ−Ｈ１／抗体複合体、すなわち不規則 ＨＴＸ　−ＣＹＴＯ１５の注射の確立されたＢＮｉｉ瘍の異種移植片の影響を説 明するグラフである。 ５、定　義 本願明細書を通して使用されているように、用語「葉酸類縁体」は、少なくとも １個のカルボキシル基を含みかつ代謝過程とは独立に正葉酸と緩衝することによ り代謝拮抗物質とて使用する葉酸のいかなるいる縁体をも含むものである。 用語「葉酸のアミン誘導体」は、反応性アミンを含むかあるいは含むように変性 されたいかなる葉酸類縁体をも含むものである。 用語「反応性アミン」は、単純な化学的縮合反応によりあるいは化学的な縮合反 応を行なったのちに生成した共有結合を安定化させるために還元することによる 窒素原子を介してアルデヒド官能基と共有的に付着ないし結合し得るいかなる窒 素含有官能基をも含むものである。このような反応性アミンの例としては、第一 級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、アル コキシアミン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドが含まれるが、これら に限定されものではない。 ６、発明の詳細な説明 本発明は、抗体または抗体フラグメントに対して葉酸類縁体のアミン誘導体を共 有的に結合させることにより調製される水溶性抗体複合体に関するものである。 葉酸類縁体のアミン誘導体は、分子の抗原性部位の部分でもなければこれを面接 合むこともない抗体分子の炭化水素部位に反応性アミン基を介して選択的に結合 している。しかして、部位に選択的に結合したのち、この抗体複合体は、未複合 化抗体または抗体フラグメントと実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を 有している。 本発明の一実施態様においては、この反応性アミン基は、葉酸類縁体に直接結合 している。説明例としては、ヒドラジン基がメトトリクセイトまたはアミノプテ リンのグルタミル部位のアルファまたはガンマ−カルボキシル基に直接結合でき る。本発明の他の実施態様においては、この反応性アミン基は、リシン、アルギ ニン等のようなアミノ酸およびペプチド末端遊離アミン基が反応性アミンととし て作用するチロシル−グリシル−グリシル−アルギニル−ε−リシンのようなペ プチドを含むがこれらに限定されるものではない結合部位の一部であってもよい 。 反応性アミン基は、抗体に複合化されたときあるいは生体内に投与されたときに 抗体−葉酸類縁体複合体が種々の腫瘍状態に対して治療的に有効であるように酸 類縁体に結合されている。 本発明の抗体は、従来の抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。モノク ローナル抗体の用途は、各モノクローナル抗体が一つの抗原決定基に対して特異 的であり、かつ多量が公知の技術で容易に製造できるもので数多くの利点を提供 する。 本発明に使用する抗体は、従来の抗体またはモノクローナル抗体であり得る。モ ノクローナル抗体の使用は、各モノクローナル抗体がある抗体決定因子に特異で ありまた公知技術を使用して多量に容易に生産し得るためにいくつかの利益をも たらす。 本発明に利用できる抗体は、葉酸類縁体を使用して処理し得る細胞性疾患に関連 するいずれの標的に対しても誘導される。本明細書を通して使用される用語「細 胞性疾患」は、良性であろうと悪性であろうと葉酸類縁体を使用する処理に修正 可能である腫瘍および他の細胞増殖性状態並びに葉酸類縁体を使用する処理に修 正可能であるリウマチ性関節炎のような状態を含むことを意図するものである。 このような細胞性疾患は、子宮絨毛癌、絨毛腫、破壊性絨毛腺腫、胞状奇胎、急 性および亜急性白血病、白血病性髄膜炎、リンパ肉種、蘭状息肉腫（ｍｙｃｏｓ ｉｓ　ｆｕｎｇｏｄｉｄｅｓ）　、肺癌、特に鱗状および小細胞型肺癌、背反生 肉腫、頭部、首部および骨盤のある腫瘍、重傷の作業不能乾瘤（ｄｉｓａｂｌｉ ｎｇ　ｐｏｒｉａｓｉｓ）およびリウマチ性関節炎を含むがこれに限定されるも のではない。 葉酸類縁体が代謝拮抗性効果を発揮するため細胞中に内部移行されるはずである ので、特定の腫瘍に対する類縁体の治療効果に対する重要な考察は、腫ｇ！！細 胞中への類縁体の進入である。はとんどの部分に関して、葉酸類縁体は、単純拡 散経路というよりむしろキャリヤー媒体葉酸エステル（塩）デリバリ−システム を経て細胞中に内部移送される。事実一定の腫瘍タイプは、腫瘍細胞が葉酸エス テル移送システムを損なうことを特徴とするため葉酸類縁体に抵抗する［パイパ ーら（Ｐｉｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、１９８２．Ｊ、Ｈｅｄ、Ｃｈｅｍ、２Ｌ１８ ２参照コ。本発明の抗体−葉酸類縁体複合体が細胞上に位置する異なるレセプタ ーに影響を及ぼし、従って、腫瘍細胞中への葉酸類縁体の正常の移送を変更し得 ることが考慮される。従ってさらに葉酸類縁体の相当する遊離類縁体性の耐腫瘍 の抗原に対して特異な抗体への付着が抗体−Ｓ酸類縁体による。このような耐腫 瘍性の治療を認め得ることが考察される。以下の体系は、特定腫瘍が本発明の特 別な抗体−葉酸類縁体を使用して生体内において効果的に処置されるか否かを決 定する便利な方法を提供する。 すなわち、処理される腫瘍の小サンプルを従来方法によって得、いくつかのアリ コートに分割する。特定腫瘍に免疫反応性でありかつ免疫特異性のモノクローナ ルまたはポリクローナルのいずれかの抗体を同定しかつ／または従来のまたはハ イブリドーマ技術を用いて調製する。抗体−葉酸類縁体を本発明に従って調製す る（後述の第６．３節参照）。腫瘍サンプルの１アリコートを実験動物の腎臓の 被膜下に導入する。正常または裸のマウスのいずれかが便利な実験動物モデルで ある。腫瘍フラグメントを例えば接眼マイクロメータを使用して測定し、そして 抗体−葉酸類縁体を数日間静脈内投与する。同様な移植腎臓下、嚢腫瘍フラグメ ントを有するが、処置されない動物は、陰性対照としての役割を果す。定期的に 移植腫瘍組成を測定し腫瘍成長の抑制または処置動物のＪ！！瘍サイズの減少は 、複合体の治療効果を示す。上記の体系を使用して、いずれのヒト腫瘍組織も本 発明の抗体−葉酸類縁体への生体内感受性に対してスクリーンされ得る。 従って、用語「細胞性疾患」は、さらに上記生体内試験で決定されるとおりの抗 体−葉酸類縁体複合体を使用する治療に順応するいずれかの新生物腫瘍を含むこ とを意図する。 本発明の抗体複合体を使用して効果的に処置し得る細胞性疾患の例は、腫瘍抗原 、組織適合性、分化および他の細胞膜抗原、酵素、ホルモンレセプター、腫瘍遺 伝子産生物等を含むがこれに限定されるものではない。加えて、異なる抗原決定 群に反応性の抗体の組合せを使用し得る。キャリヤーとして使用し得る免疫グロ ブリンは、ＩＣＩＡ、　ＩＣ１０，ＩｇＥ。 １（ＩＩ）Ｉのような一定のクラスの抗体、一定のクラスのＩｇＧまたは例えば 半抗体分子（または単−Ｈ：［鎖対（ｓｉｎｇｌｅ　ｈｅａｖｙ：Ｉｉｇｈｔ　 ｃｈａｉｎ　ｐａｉｒ　）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）　２フラグメ ントのような免疫グロブリンの一定のフラグメントを含む。生体内投与が不明瞭 を残す際、目下要求される抗体−葉Ｗｊｉ、類縁体複合体治療効果に対する根拠 および数多くの機構はもっともらしく思われる。本発明の複合体を生体内に投与 する際、治療活性を説明するいずれかの特定の理論に限定することを望まないが 、本発明者等は、以下の理論的説明を提供する。 本発明の一実施態様によると、抗体複合体は、葉酸類縁体のグルタミル部位のガ ンマ−カルボキシル基に共有的に結合された反応性アミン基を経由して共有的に 付着されるによって形成される。このような付着が葉酸類縁体が抗体−葉酸類縁 体複合体から生体内に放出されない場合その活性を保持するため、治療の有効性 に重要であることが報告されているグルタミル部位のアルファーカルボキシル基 を認めることは可能である。 本発明の別の実施態様によると、反応性アミン基は、ペプチドが細胞外に活性な 蛋白分解性酵素による分割に影響されやすい、該アミンを含むペプチドを経て葉 酸類縁体に共有的に付着される。高濃度のこれら蛋白分解性酵素は、Ｍ癌部位に おいて含まれている。この場合、ペプチドは、葉酸類縁体のグルタミル部位のア ルファマまたはガンマカルボキシル基のいずれかに付着され得る。本実施態様に 従って調製される抗体−葉酸複合体の治療効果が生体における意図された標的に 遊離薬剤として活性葉酸類縁体の酵素的に触媒された放出によることも可能であ る。説明するための例として、メトトリクセイトがグルタミル部位のアルファー カルボキシル基を経て酸化抗体のアルデヒド基に付着されたリシル−グリシル− グリシル−チロシル　ヒドラジドに共有的に付着されたメトトリクセイトー抗体 複合体がプラスミンおよびカルボキシルペプチターゼのような酵素によって標的 部位で生体内において分割し得ることが要求される。従って治療に効果的なメト キトリクセイトは、生体内における意図された部位に酵素的に放出されるべきで ある。事実、生体内において遊離メトトリクセイトを形成するメトトリクセイト ーアルファーアルファーリシルーグリシルーチロシルーヒドラジド抗体複合体の 酵素的に触媒された分割を示すデータは、後述の第９節にある。 本発明のさらに別の実施態様によると、葉酸類縁体は、標的部位において生体内 に見い出される条件下、化学的分割に影響されやすい抗体への共有結合を形成す る反応性アミンを経て、直接または結合ペプチド部位によって付着される。従っ て遊離葉酸類縁体が腫瘍細胞中への取り込みに先立つ標的部位または他分、腫瘍 部位中に複合体の取り込みの後さえもの標的部位のいずれかにおいて生体内に放 出され得る。説明するための例としてヒドラゾン結合は、メトトリクセイトーガ ンマーヒドラジドと酸化抗体のアルデヒド基の間に形成され得る。このようなヒ ドラゾン結合は、生体内における緩かな加水分解、特にヒドラゾンの生体内酸化 が生じる場合、影響を受けやすい。このような加水分解が複合体の結合後腫瘍細 胞表面にてまたは複合体の取り込み後細胞外に生じ得ることが必要とされる。い ずれかの場合においても、遊離治療的活性葉酸類縁体は、生体内に放出される。 生体内標的における複合体の放出、酵素的触媒放出および化学的に誘導された放 出なしで治療活性を含む上記交互の可能性は、生体内における本発明の葉酸類縁 体の治療効果を説明するために持ち出された。しかしながら、本発明は、このよ うな治療効果に対するいずれかの特定の理論ないし機構に限定すべきでない。 ６．１葉酸未縁体のアミン誘導 第５節に定義されるとおり、葉酸類縁体は、少なくとも１個のカルボキシル基を 含みかつ代謝過程とは独立に正葉酸と干渉することにより代謝拮抗物質として作 用する葉酸の類縁体であり、従って葉酸欠乏症の症状をもならす。第１表は、こ のような葉酸類縁体の例の非包活的リストを示す。 第１表 ｊ）ｉｊ　Ｕ」」 メトトリクセイト アミノプテリン ３°、５°−ジクロロメトトリクセイト３°、５°−ジクロロアミノプテリン ５．８−ジデアザメトトリクセイト ５．８−ジブアザ−５，６，フ、８−テトラヒドロメトトクレクセイト５．８− ジブアザ−５，６，フ、８−テトラヒドロアミノプテリンｓ、　ａ、　ｉｏ−ト リデアザアミノプテリン５．１０−ジブアザ　５，６，７．８−テトラヒドロ葉 酸８．１０−ジブアザアミノプテリン これらおよび他の葉酸のアミン誘導体は、本発明に従って有効である。このよう なアミン誘導体は、反応性アミンを含むかまたは含むように改質されたいがなる 葉酸をも含む。用語「反応性アミン」は、単純な化学的縮合あるいは化学的縮合 を行った後に共有結合を安定化させるために還元することによる窒素原子を介し てアルデヒド官能基共有的に付着ないし結合し得るいかなる窒素含有官能基をも 含むものである。従って本発明に有効な葉酸類縁体のアミン誘導体は、メトトリ クセイトーガンマーヒドラジン、３”、５−ジクロロメトトリクセイトーアルフ ァーヒドラジン、メトトリクセイトーアルファニアルファーリシル−グリシル− グリシルーチロシルヒドラジド、メトトリクセイトーガンマーチロシルヒドラジ ド、メトトリクセイトーアルファーアルファーリシルヒドラジド、メトトリクセ イトーアルファーアルファーリシン、メトトリクセイトーアルファーアルファ− ε−アルギニン−グリジン−グリシン−チロシン、アミノプテリン−アルファー ヒドラジド、３′、５−ジクロロアミノプテリン−ガンマ−ヒドラジド、３°、 ５−ジクロロアミノプテリン−アルファーヒドラジド、アミノプテリン−ガンマ −チロシルヒドラジド、アミノプテリン−アルファーアルファーリシル−グリシ ル−チロシルヒドラジド、アミノプテリン−アルファーアルファーリシルヒドラ ジド、アミノプテリン−アルファーアルファーリシン、およびアミノプテリン− アルファーアルファーリシル−ε−アルギニン−グリシン−グリシン−チロシン を含むがこれに限定されるものではない。５，８−ジデアザメトトリクセイト、 ５゜８−ジブアザ５．６．７．８−テトラヒドロアミノプテリン、５．８．１０ −トリデアザテトラヒドロ葉酸および８，１０−ジブアザアミノプテリン等のよ うな反応性アミン含有葉酸類縁体の誘導体もまた本発明に有効である。 ６．２１葉　４．　のアミン活ｊ　の／′２本発明の抗体複合体を形成するのに 使用される葉酸類縁体のアミン誘導体は、種々の方法を使用して合成し得る。 本発明の一方法によると、カルボキシル基含有葉酸類縁体は、カルボジイミドの ような活性化剤との反応で活性化される。活性化中間体を該反応性アミンを経由 して酸化抗体のアルデヒド部位に結合する能力を有する反応性アミン含有葉酸類 縁体を得るためヒドラジンまたはジアミンのような好適な核性試薬と反応する。 所望により、活性中間体を酸化抗体のアルデヒド部位に該反応性アミンを経由し て結合する能力を有する反応性アミン含有葉酸類縁体を得るため次のカルボキシ ル基との反応を脱保護される保護反応性アミンを含有するアミノ酸ないしペプチ ドと反応する。 いくつかの葉酸類縁体がこの方法で誘導され得る２つの異なるカルボキシル基含 有グルタミン部位を有するので生産物の異性体混合物は請求核試薬の性質によっ て生じる。所望の異性体は、従来の技術を使用して不要異性体から分離できるべ きである。（この方法を使用するメトトリクセイトーガンマーヒドラジドの合成 の実験例に関して、後述の第７．１．３節参照）。 本発明の他の新規な方法によると、メトキシトリクセイトおよびアミノプテリン のような葉酸類縁体のアミン誘導体は、次のとおり合成され得る。 保護反応性アミン含有グルタミン酸誘導体を最初に調製する。好適な出発原料は 、アルファーアミノ基が、例えばカルボベンゾイロキン（ＣＢＺ）またはフルオ ニニルメトキシカルボニル（ＦｍＯＣ）部位で保護され、またカルボキシル基の １つが例えばｔ−ブチルエステルのようなエステル部位で保護されたグルタミン 誘導体である。保護グルタミン酸の他のカルボキシル基は、第一級アミン、第二 級アミン、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、アルコキシアミン、セミカルバジ ドおよびチオセミカルバジドおよびそれらの保護誘導体から成る群から選ばれた 反応性アミンまたは保護反応性アミン部位に付着される。反応性アミン含有部位 は、カルボジイミド類、混合酸無水物または反応性エステル類でカップリングす る等の公知カルボキシル活性化方法によって保護グルタミン酸の遊離カルボキシ ルに付着し得る。 反応性部位がヒドラジンの場合、この部位を例えばブトキシカルボニル（ＢＯＣ ）ブロック基を使用してさらに保護することが好ましい。 反応性アミンまたは保護反応性アミン含有Ｎ−保護し一グルタミン酸のアルファ ーアミノ基は、遊離アルファーアミノ誘導体を得るためにデプロテクトされる。 遊離アルファーアミノ基は、カルボジイミド類、混合酸無水物または反応性エス テル類でカップリングする等の公知カルボキシル活性化方法により４−アミノ− ４デオキシ−ＮＩＯ−メチルプテロイル酸（ＨＡＰＡ）または４−アミノ−４デ オキシ−Ｎ１°−ホルミルプテロイル酸（ＦＡＰＡ）のいずれかのカルボキシル 基にカップリングされる。いずれかの保護基の除去後、形成される生産物は、葉 酸類縁体メトトリクセイトまたはアミノプテリンのいずれかの反応性アミン含有 、水溶性誘導体である。 反応性アミン含有（または保護反応性アミン含有）グルタミン酸誘導体をプテロ イジニル安息香酸にカップリングするこの方法は、ＨＡＰＡまなはＦＡＰＡのい ずれかの代わりに適当に置換されたベンゾイル部位の利用によって種々の反応性 アミン含有葉酸類縁体を得るため一般化し得る。例えば、４−アミノ−４−デオ キシ−８，１０−ジブアザプテロイルのようなＷ換安息香酸は、可能葉酸類縁体 、８．１０−ジブアザアミノプテリンの反応性誘導体を得るなめ上記方法で）Ｉ ＡＰＡの代わりになり得る［デ　グロウ等（Ｄｅ　Ｇｒａｗ　ｅｔ　ａｌ、）、 １９８４．Ｊ、Ｈｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　２７：３７６］。 説明するために、メトトリクセイトーガンマーヒドラジドを本発明の新規な方法 に従って次のとおり調製できる。 市販のし一グルタミン酸アルファｔ−ブチルエステルを一晩室温にて１当量のＮ ａＨＣＯ３含有水：アセトン１：１溶液中にて１当量のフルオロエニルメチルサ クシンイミジル（ＳＵｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　）カーボネートとの反応によって そのＮ−Ｆｍ０Ｃ誘導体として保護する。Ｆｍ０ＣＬ−グルタミン酸アルファー ℃−ブチルエステルをドライジメチルホルムアミド（ＤＨＦ）中１〜３当量の２ ，４−ジニトロフェノールとともに、ひき続いてカルボジイミドヒドロクロリド に溶解する。得られた混合物を室温にて２４時間攪拌する。反応の進行を薄層ク ロマトグラフィー（ＴＬＣ）で検査する。反応混合物を必要により反応を完結す るために約５０℃まで加熱し得る。 ２．４−ジニトロフェニル活性エステルの形成の完結後、約１〜３当量のｔ−ブ チルカーボネートを加え反応混合物を攪拌下、約２４時間室温にてインキュベー トする。溶媒の蒸発につづきエーテル：水で反応混合物を抽出する。層分離およ び冷希ＮａＨＣＯｓでのエーテル層の洗浄およびエーテル層の蒸発によりｒｍｏ ｃ　ｔ−グルタミン酸アルファーｔ　−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ’−ＢＯＣ −ヒドラジドを得る。テトラヒドロフラン（１旺）巾約１０％ジメチルアミンで Ｆｍ０Ｃ保護基の除去につづいてジエチルアミンおよび丁ＨＦの蒸発をし粗［− グルタミン酸アルファーｔ−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ。 −ＢＯＣ−ヒドラジドを得る。この粗［−グルタミン酸誘導体をさらに精製する ことなしに使用する。 ）ＩＡＰＡを約１〜４当量の２．４−ジニトロフェノールでドライＤＨＦ中懸濁 し得る。３（３−ジメチルアミノフェノール）−１−カルボジイミド（約１〜５ 当量〉を加え反応混合物を約２時間室温にて攪拌する。反応の進行を丁ＬＣで検 査し反応混合物を反応を完結するため必要により５０℃以下に加熱する。ひき続 いて溶媒の蒸発およびインプロパツールで粉砕し固形ＨＡＰＡ−２，４−ジニト ロフェノールエステルをもたらす。 ）ＩＡＰＡ−２，４−ジニトロフェノールエステルを約１〜３当量のＬ−グルタ ミン酸アルファー［−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ’−ＢＯＣヒドラジドおよび 約１〜３当量のジイソプロピルエチルアミンとともにドライＤＨＦ中に溶解する 。反応混合物を室温にて約２４時間撹拌する。反応進行を丁［Ｃで検査し必要に より反応を完結するなめに５０℃以下に加熱する。 混合物を蒸発し粗生産物をシリカゲルクロマトグラフしメトトリクセイトーガン マーｔ−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ゛−Ｂｏｃ−ヒドラジドを得る。続いて室 温にて約１時間メチレンクロリド中約３０％トリフルオロ酢酸で脱保護しひきつ づき蒸発して炭酸ニアンモニウム溶液を使用してつづいて中和される租メトトリ クセイトーガンマーヒドラジドのトリフルオロアセテートを得る。例えば、炭酸 ニアンモニウム傾斜でＱＡＥセファデックス■（ＱＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ■） を使用しイオン交換クロマトグラフし、ひきつづいて凍結乾燥しメトトリクセイ トーガンマーヒドラジドを得る。 本発明の上記方法を）ＩＡＰＡ部位の代りに適当に置換された安息香酸成分を使 用して当業者によって変更し得る。したがって本発明は、反応性アミン含有他の 葉酸類縁体のアミン誘導体を得るこのような変更を含むことを意図される。 葉酸類縁体のアミン誘導体の合成に関する本発明の新規な方法は、従来の方法に 比べて次のような利益をもたらす。 （１）本方法は、アミノプテリンのヒドラジド誘導体を形成するためにすぐに利 用できるアミノプテリン前駆体４−アめ従って高収率、本発明アミノプテリンヒ ドラジドの新規化合物の異性体的に純粋な調製方法を提供する。ホルムアミド保 護基がヒドラジンまたはヒドラジン誘導体との反応によってすぐにはずされるの で［ガイガーら（Ｇｅｉｇｅｒ　ｅｔａｌ、）、１９６８．Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、 　肚３３３８６参照コ、アミノプテリンのヒドラジド誘導体を調製するために加 ヒドラジン分解を必要とする葉酸類縁体のヒドラジド類の合成に関する従来の方 法の使用は（前記ロソウスキーら工参照）、保護Ｎ１０−ホルミル基の望ましく ない時期単向の除去を導く。従って、アミノプテリン−ガンマ−ヒドラジドまた はアミノプテリン−アルファーヒドラジドの匹敵する収址は、従来の方法を使用 しては期待され得ない。 （２）所望生産物がメトトリクセイトーヒドラジンの際、本方法は、ペナルティ メート前駆体としてより無極性かつ有機溶媒に可溶な誘導体をメトトリクセイト ーヒドラジンに与える。本方法は、有機溶媒系を使用する標準クロマトグラフィ ー技術でペナルティメート前駆体を簡単に精製する。これは、合成の根本的段階 におけるより純粋なメトトリクセイトーヒドラジトの形成の増強された可能性を もたＯ）の方法もまた、本発明に利用できる葉酸類縁体の反応性アミン誘導体の 合成に利用できる。例えば、第２．１節に記載されたごとくメトトリクセイトー ガンマーヒドラジドは、フォスフォロシアニデートのようなペプチド形成剤によ ってカップリングされた）ＩＡＰＡおよび適当な保ｉｔ−グルタミン酸エステル 誘導体を使用して合成し得る。引き続いて加ヒドラジン分解し次いで保護基の除 去をし反応性アミン含有葉酸類縁体を提供する。 ６．３抜代撲含体凶訓梨方抹 抗体が糖蛋白である故、化合物は、分子のペプチド骨格に共有的に付着される炭 水化物部位に付着され得る。いくつかの炭水化物部位は免疫グロブリンのＥＣ領 域に配置されまた生じるため補体システムの成分の結合が必要とされる。 免疫グロブリンのＥＣ領域の炭化水素部位は、ここに記載される体系に利用され 得る。場合により炭化水素部位を含有するいかなる免疫グロブリンのＦａｂない しＦａｂ“フラグメントは、ここに記載される反応体系に利用され得る。このよ うな免疫グロブリンの一例は、プトナムら（Ｐｕｔｎａｍ　ｅｔ　ａｌ。 ）、（１９７３，５ｃｉｅｎｃｅ　ｔ８２　：２８７）によって続けられたヒト ＩＣＩＨである。 以下に詳細に記載されるごとく、抗体または抗体フラグメントの炭化水素測鎖は アルデヒドを発生するために選択的に酸化され得る。得られるアルデヒドを、つ いでイミン、エナミン、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカル バゾン、チオセミカルバゾンまたはそれらの還元形態を形成するためアミン基（ 例えば、第一級アミン、第二級アミン、アルコキシアミン、ヒドラジン、ヒドラ ジド、フェルヒドラジン、セミカルバジドまたはチオセミカルバジドのようなア ンモニア誘導体）と反応し得る。 場合により、抗体の炭化水素部位は、アミン基と付着または反応できるように酵 素的技術で変成し得る。例えば、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダ ーゼは、アルデビト部位を形成するなめに使用し得る。 ６．３．１．醸化Ω化主煎方法 抗体分子の炭化水素部分ないし部位の酸化は、アルデヒド基の形成を導く。過ヨ ウ素酸、パラ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウムおよびメタ過ヨウ素酸カリ ウム等の種々の酸化剤を使用し得る。これらの中で二次的反応または好ましくな い副反応がほとんど影響しないので、酸素酸およびその塩が好ましい。一般的議 論に関しては、ジャクソン（Ｊａｃｓｏｎ）　、１９４４．ｉｎ叶ｇａｎｉｃ　 Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　２．　ｐ、３４１；ブントン（Ｂｕｎｔｏｎ）１９６５， ０ｘｉｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、Ｉ 　Ｗｉｂｅｒｇ、ｅｄ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ 、ｐ、３６７参照のこと。 これらの酸化剤での抗体の酸化は、公知方法で実行できる。酸化において、抗体 は、濃度が一般的に１００■／　ｍ１未満、好ましくは１〜２０■／　ｍｌであ る水溶液の形態で一般的に使用される。酸素酸またはその塩を酸化剤として使用 する際、一般的に水溶液の形態で使用され、また濃度は、一般的に０．００１〜 １０ｍ）ｌ、好ましくは１．０〜１０ｍＭである。酸素酸またはその塩の量は、 抗体の種類によるが一般的には、例えば被酸化炭化水素の量の１０〜１００倍の １に過剰にて使用される。しかしながら、最善の量は、通常の実験によって決定 され得る。 酸素酸またはその塩での抗体の酸化方法において最善の範囲は、約４〜６のｐＨ ，０〜３７℃の温度、および１５分〜１２時間の反応時間を含む。 酸素酸およびその塩での糖蛋白の酸化の間、糖蛋白の過剰酸化を防ぐため光を遮 断することが好ましい。 ６．３．２．脱化Ｏ鼓ム迫方払 抗体分子の炭水化物部分の酸化はまた、ノイラミニダーゼの存在下または不存在 下に＃素ガラクトースオキシダーセを使用しても達成し得る。［クーパー等（Ｃ ｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、１９５９．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２３４： ４４５］　、抗体は、水溶液中にて使用され、濃度は、一般的に０．５〜２０■ ／　０１１である。酵素は、一般的に約５．５〜８．０のｐＨで使用される。酵 素反応におけるｐＨの影響、基質濃度、緩衝液および緩衝液濃度は、前記クーパ ーに報告される。 ６．３．３．酸化抗体と葉酸類縁体のアミン誘導体のカップリング 本発明の抗体複合体は、酸化抗体を第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、 ヒドラジド、アルコキシアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチ オセミカルバジド基から成る群から３８ばれた有効アミン基を有する葉酸類縁体 と反応させることによって製造される。すぐに得られる生成物は、以下の添加物 から水分子の除去による炭素−窒素−二重結合を含む。 ヒドラジド類でのアルデヒドの反応の一般的議論に関しては、マーチ（Ｍａｒｃ ｈ）１９７８．　ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　Ｈｅｃｈａｍｉｓｍｓ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒ ｅ、マグロウ　ヒルカンパニー、二、：Ｌ−ヨーク（）ＩｃＧｒｏｗ　Ｈｉｌｌ 　Ｃｏ、、Ｎｅ＊　Ｙ。 ｒｋ）、ｐｐ８２４〜８２５を参照のこと。 約０．５〜２０■／ｍｌの濃度の酸化抗体の溶液を葉酸のアミン誘導体と混合し く反応性アミン基と抗体アルデヒドのモル比は約１〜約１０，０００）　、溶液 を約１〜１８時間培養する。 好適な温度は、０〜３０℃ではありｐＨは、約６〜８であり得る。 ６、３．４．抜体視金体ｍ女生北 抗体複合体が第５．３．３節で記載されたごとく抗体と葉酸類縁体との間で形成 された後、必要によりこれらをナトリウムシアノボロハイドライドまたはナトリ ウムボロハイドライドのような好適な還元剤で安定化し得る。 還元剤 抗体−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ→　抗体−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ還元剤は、一般に有効アルデヒ ド基を越えて約１０〜１００倍モル過剰のモル過剰まで加えられる。一般的議論 に関しては、ジエントフトおよびディアーボーン（Ｊｅｎｔｏｆｔ　ａｎｄ　Ｄ ｅａｒｂｏｒｎ）（１９７９，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４　：４３５４ ９）を参照のこと。 ６．３．５．役策惣立途法 本発明の一実施例態様によると、抗体または抗体フラグメント炭化水素部位のア ルデヒド基に共有的に付着した誘導葉酸類縁体の反応性アミン基は、第一級アミ ンである。 得られた抗体複合体は、第二級アミンと抗体分子のアルデヒド部位との間の分子 内シッフ塩基形成による凝集物を含み得る。従ってこれらの例において、必要に より形成された凝集物をこれに限定されないが高性能ゲルバーミュエーション液 体りロクトグラフィーを含む好適なゲル洪過方法で所望の抗体複合体から除く。 不要の凝集物の除去は、抗体が生体内において付着治療用葉酸類縁体を所望標的 部位に運ぶのに使用されるので特に重要である。このような抗体凝集物のいずれ も除去のため網内細胞系で吸収され、そして標的部位または特定組織からのこの ような移動は、局部化の程度を減じ従って投与葉酸類縁体の効果を減じまた非標 的部位への毒性効果を導き出す可能性がある。 ６．４１葉酸類縁体のアミン誘導体および抗体複合体の使用 本発明の葉酸類縁体のアミン誘導体は、治療用抗体複合体の調製に使用するのに 特によく適する。従ってこれらの誘導体は、治療用抗体−葉酸類縁体の調製にお ける中間体を表す。反応アミンを経由して葉酸類縁体の抗体または抗体フラグメ ントの酸化炭化水素部位への選択的付着は、抗体特異性および免疫反応性を残し た複合体をもたらす。 本発明の抗体複合体は、生体的における細胞性疾患の治療処置方法に使用するの に完全に適している。該方法は、治療効果量の本発明の抗体−葉酸複合体を投与 することがら成り、該複合体が該細胞性疾患に関連する標的に対し免疫反応性か つ免疫特異的でありまた該細胞性疾患に関連しない組織に対して非免疫反応性か つ非免疫特異性である。 本発明の複合体は、複合体が誘導される非アミン含有葉酸類縁体前駆体での処理 に適する細胞性疾患の処理に治療効果的である。 本発明の抗体複合体が特に有効である細胞性疾患は、以下のものを含むがこれに 限定されるものではない。すなわち子宮絨毛癌、絨毛腫、破壊性絨毛腺腫、胞状 奇胎、急性および亜急性白血病、白血病性髄膜炎、リンパ肉腫、菌状息肉腫、肺 癌、特に鱗状および小細胞型肺癌、背反性肉腫および頭部、首部および骨盤のあ る腫瘍である。 場合により葉酸類縁体がアミン誘導体が誘導される遊離葉酸類縁体に抵抗性のあ る腫瘍の治療に有効であり得ることが考察される。特定の腫瘍を本発明の特定の 抗体−葉酸類縁体を使用して生体内にて治療処理し得るかどうか決定するため、 以下の生体内試験を使用し得る。処理される腫瘍の小サンプルを従来方法によっ て得、いくつかのアリコートに分割する。特定腫瘍に免疫反応性でありかつ免疫 特異性のモノクローナルまたはポリクローナルのいずれかの抗体を同定しかつ／ または従来のハイブリドーマ技術を用いて調製する。抗体−葉酸類縁体複合体を 本発明に従って調製する。腫瘍サンプルの１アリコートを実験動物の腎臓の被膜 下に挿入する。正常または裸のマウスのいずれかが便利な実験動物モデルである 。腫瘍フラグメントを例えば接眼マイクロメータを使用して測定し、そして抗体 −葉酸類縁体を数日間静脈内投与する。同様な移植腎臓子嚢腫瘍フラグメントを 有するが、処置されない動物は、陰性対照としての役割を果す。定期的に移植Ｍ 瘍組成を測定し、腫瘍成長の抑制または処置動物の腫瘍サイズの減少は、複合体 の治療効果を示す。上記の体系を使用して、いずれの新しいヒト腫瘍組織も本発 明の抗体−葉酸類縁体への生体内感受性に対してスクリーンされ得る。 生体内投与は、ヒト血清アルブミンのような他の蛋白質とともにまたはなしで血 清または生理食塩水を含むいずれかの好適なキャリヤー中抗体−葉酸類縁体複合 体の医薬組成物を含む。複合体の服用は、当業者によってすぐに決定し得、また 細胞性疾患の性質によりまた利用する特定の葉酸類縁体により異なる。投与の好 ましい形態は、一般的に筋肉内、静脈内、心房内、鞘内、腹腔内、リンパ内経路 を経る非経口的である。 次の一連の実施例は、説明を目的として表され、また本発明の範囲を限定するも のではない。 １、　来　１人　の＝。１ ７、１．１．メトトリクセイト−ガンマ−ヒドラジド８丁Ｘ−ガンマ−Ｈｙｌ アミン）ベンゾイル−し−グルタミン＠−５−ｈドラシト（ＣＡＳ登録番号７９ ６４０−７５−８）を以下に説明するいくつかの異なる方法に従って合成した。 Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−グルタミン酸−アルファ−℃−プチルエステルンマーＮ−ＢＯ Ｃ−ヒドラジド　２） Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−グルタミン酸−アルファーｔ−ブチルエステル−ガンマ−ジシ クロヘキシルアミン塩［バーケム（Ｂａｃｈｅｍ）］をスパンネンベルグら（Ｓ ｐａｎｎｅｎｈｅｒｑ　ｅｔ　ａｌ、）、１９７１．ホ・ノフーセイラーズゼッ ト（Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ）の方法により遊離酸に変換した。場合 により遊離酸をＣＢＺ部位を市販の［−グルタミン酸−アルファーｔ−ブチルエ ステルに加えることによる従来の方法を使用して調製できた。遊離酸（０，９３ ｇｍ、３．０ｍモル）をＮ２ガス雰囲気下、ドライテトラヒドロフラン（５０ｍ ｌ）中に溶解し氷水浴中で０℃まで冷却した。トメチルモルホリン（０，３ｇｍ 、０．３９　ｍｌ、３．０ｍモル）を加えた。イソブチルクロロホルメート（０ ，４１ｚｍ、０．３９ｎ＋Ｉ、３．０ｍモル）を１５分間にわ、たってシリンジ で滴下した。 クロロホルメートの添加完了後、反応混合物をわずかな濁りを生じる間Ｏ℃にて もう５分間攪拌した。ｔ−プチルカーボゼート（０，４０ｇｍ、３．０ｍモル） を一度に加え、反応混合物を室温にて一晩攪拌した。反応混合物を水に注ぎ込み エーテルで３度抽出した。エーテル抽出物を一体にし飽和ＮａＣ１溶液で洗浄し 、Ｎａ２　Ｓ０４で乾燥し、ついで蒸発し薄層クロマトグラフィー（ｒｔｃ）お よびＩ　ＨＮ）ＩＲを使用し次の特性を有する１、　１３　ｇ　ｍ　（８３χ） のオイルを得た［（メルクシリカゲル、メチレンクロリド：メタノール、（ＣＨ ２ＣＩ２　：ＨｅＯＨ；９：１）Ｒｆ＝０．５８　；　’　ＨＮＨＲ（ＣＤＣｌ ２　、丁８３）δ　７．３３（Ｓ、５Ｎ）。 ５、１０（ｓ、　２Ｈ）、　４．５０〜４．１５（ｒｎ　、　ＩＨ）、　２．６ ０〜１．８０（ｍ　、　４Ｈ）、　１、４６（Ｓ、　１８８月。 Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−グルタミン酸−【−ブチルエステルガンマ−Ｎ　’　−Ｂ。 Ｃ−ヒドラジド（１，１３ｇ　ｍ　、２．５ｍモル）を５００ｎ＋Ｉパー（ｐａ ｒｒ）圧力容器中２００ｍ１無水エタノールに溶解し、２．０ｒｎＩの酢酸、つ づいて０．１５ｇｍの炭素上の１０％ｐｂを加えた。溶液を丁ｔｃにニンヒドリ ン）で検査しながら水素化した。反応修了時（約４８時間）、溶液をセライト（ Ｃｅｌｉｔ）で濾過し、蒸発し、ついで水に懸濁した。水溶液をメチレンクロリ ドで抽出し、層分離し、ついで水層を凍結乾燥し、０．５２ｇｍ（５２％）の遊 離アミノエステルを得た。１　Ｈ間旧ＣＤＣｌ３　、丁）（Ｓ）δ６．８−６． ４（ｂｒ　ｄ　、２Ｈ）４．４Ｃｈ−４，０（ｍ、ＩＨ）２．８〜２．１（ｍ、 ４Ｈ）１．６４〜１．３５（ｂｒ　ｄ、　１８Ｈ）。 Ｎ−フルオロエニルメトキシカルボニル（Ｆ）ＩＯｃ）−［−グルタミン　−ア ルファ−［−ブチルエステル（４グルタミン酸−アルファ−１−ブチルエステル ［ケミカルダイナミックス、サラスプラインフィールド、ニューシャーシー州（ Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ、５ｏｕｔｈ　Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、Ｎ 、Ｊ、）、３．０ｇｍ、０．１５　ｍモル］をアセトン（６０ｍｌ）に溶解した 。炭酸ナトリウム（１，２４ｇｍ、　１５ｍモル）を水６０ｒｎｌに溶解し、ア セトン溶液に添加した。フルオロエニルーサクシンイミジルーカーボネート［フ ル力、ヒユーバーブ、ニューヨーク州（Ｆｌｕｋａ　ＨａｔＪＤＤａＬＩＣ］ｅ 、Ｎ、Ｙ、）１　（４，９８ｇ　ｍ　、　１５ｍモル）を溶液に加え反応混合物 を室温にて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィー（メルクシリカゲル、ＣＨ２ ＣＩ２　：ＨｅＯＨ。 ９：１）は、器官におけるニンヒドリン陽性スポットの消失を示し、またＲｆ＝ ０．５７における新たな蛍光スポットを示した。反応混合物を蒸発し、水（ＩＱ Ｑｍｔ）を反応容器に加えた。水性懸濁液を３部のエチルエーテルで抽出し、一 体化したエーテル層を水、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ２３０４で乾燥した 。エーテルを蒸発し次のスペクトルを有する５、７１ｇｍ（９１％）の泡状固体 を得た。Ｉ　ＨＮＨＲ（ＣＤＣｌ２　、Ｔ）Ｉｓ）δ７、’Ｊ−７，２０（ｍ、 ８Ｈ）５．８Ｑ〜５．４０　（ｎｎ、１Ｎ）、４．５５〜４．０５（ｍ、４Ｈ） 、２．６６〜１．７２　（ｍ、４Ｈ）、１．４１（Ｓ、６Ｈ）。 Ｎ−ＦＨＯＣ−Ｌ−グルタミン酸−アルファ−ｔ−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ ’−Ｂｏｃ−ヒドラジド（５Ｎ−Ｆ）ＩＯｃ−Ｌ−グルタミン酸−アルファ−［ −ブチルエステル（５，２１１ｍ　、　１２．３ｍモル）をＮ２ガス雰囲気下２ ５０ｖｄのドライＤＨＦに溶解した。２−４−ジニトロフェノール（２，２７ｇ ｍ、１２．３ｍモル）を加え、つづいて１−エチル−３〔３−ジメチルアミノプ ロピル）カルボジイミドヒドロクロリドを加えた。反応混合物を一晩室温にて攪 拌した。丁ｔｃｔメルクシリカゲル、　Ｃ）＋２　ＣＩ２　：ＨｅＯＨ；９：１ ）を使用した分析は、出発原料が完全に消失しくＲｆ＝０．５７＞また（Ｒｒ＝ ０．９）における新たな蛍光スポットの出現を示した。ｔ−プチルカーボゼート （１，６３ｇｍ、　１２．３ｍモル）を一度に加え反応混合物を攪拌上室温にて 一晩培養した。溶媒を蒸発し残留物をエチルエーテルで取り出し、５％ＮａＨＣ Ｏ３で全ジニトロフェノールを除去するまで洗浄した。エーテル層をＮａＣ１溶 液で洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥し、蒸発して泡状固体を回収し、そしてシリカゲ ル上フラッシュクロマトグラフィーをして、次の特性を示す４．１９　ｇ　ｍ　 （６３％）の泡状白色固体を回収した。ｌ　ＨＮＨＲ（ＣＤＣＩ　３　、■）Ｉ ｓ）　δ　８．４２（ｂｒ　ｓ　、ＮＨ）５．９０（ｂｒ　ｄ、ＮＨ）γ、９０ 〜７．２０　（ｍ、　８Ｈ）　６．８８　（ｂｒ　ｄ　、ＮＨ）　、５．９０（ ｂｒ　ｄ、ＮＨ）、　４．６０　〜４．０５　（ｍ、　４Ｈ）　、２．６０〜１ ．９５　（ｍ、　４Ｈ）　、１、４２　（ｓ、　１８Ｂ）。 ４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルブロイル酸−２，４−ジニトロフェ ノールエステル（６）４−アミノ＋デオキシーＮ１０−メチルブロイル酸（ＭＡ ＰＡ）（０，９８ｇｍ、３．０ｍモル）を０．８３　ｇ　ｍ　（４，５ｍモル） の２．４ジニトロフエノールとともに１００ｍ１のドライＤ肝に懸濁した。３− （３−ジメチルアミンプロピル）−１−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ ０，８６ｇｍ、４．５ｍモル）を加え溶液を約１２時間撹拌した。）ＩＡＰＡ（ Ｒｆ＝０．２３）の消失およＣ（メルクシリカゲル、　ＣＨＣｌ３　：）ｌｅＯ Ｈ：ＨＯＡｃ；９：１：０．５）を使用して検査しな。さらにカルボジイミドお よび２．４−ジニトロフェノールを）ＩＡＰＡ出発原料の完全な反応を得るため ２４時間ごとに１．５ｍモル部加えた。約５０℃未満まで注意深く加熱し、反応 を促進しな。出発原料を消費した時、反応混合物を蒸発し、残留物をイソプロパ ツールで粉砕しカルボジイミド、２，４−ジニトロフェノールおよびいずれかの 形成尿素を除去した。黄色固体（収率９０〜１００％）を丁ＬＣで均質化し次の Ｎ）ＩＲスペクトル（６，０８３０１Ｈ３）δ９．０−８．５（ｍ、３Ｈ）、８ ．１５〜７．８０　（ｍ、５Ｈ）、　７．２〜６．９（ｍ、４Ｈ）　、　４．９ ５（ｂｒ　ｓ、２旧、３．３３（Ｓ、３■）を得た。 ７、１．１．１．混合酸無水物方法によるメトトリクセイトーガンマーヒドラジ ド（１：　法（１））ＩＡＰＡ（０ソウスキーら、　１９８９．Ｊ、）ｌｅｄ、 ｃｈｅｍ、　２８　：６６０〜６６７）（０，５２ｇｍ、１．６ｍモル）をドラ イジメチルホルムアミド（１００ｍ１　、　ＤＨＦ）に懸濁しジイソプロピルエ チルアミン（０，４１ｇｍ、０．５６　ｍｌ　、　３．２ｍモル）を加えた。ジ エチルホスホロシアニデート（０，５２ｇｍ、０．４９　ｍｌ　、　３．２ｍモ ル）を加え反応混合物を１時間、室温にて撹拌した。ついで［−グルタミン酸ア ルファー【−ブチルエステル−ガンマ−Ｎｏ−８０Ｃヒドラジド（０，５１ｇｍ 、１．６ｍモル）を加え反応混合物を室温にて２４時間攪拌した。ついで溶液を 回転蒸発し、メチレンクロリド：メタノール：酢酸（ＣＨ２ＣＩ２　：）ｌｅＯ Ｈ：ｌｌ０Ａｃ；９：１：０．５）を使用しシリカゲル上にフラッシュクロマト グラフして生成物を分離した。Ｒｆ＝０．４８（ＣＨ２Ｃ１２：ＨｅＯＨ；９： １）を有する主生成物を乾燥し、ついで１０ｍ１Ｃ８２Ｃ１２および１０ｍ１の トリフルオロ酢酸に再溶解し２時間撹拌した。この溶液を蒸発し、水に再溶解し ｐＨ１２に調整し、沢過した。酢酸でｐＨ８に調整後、枦物を凍結乾燥しな。得 られた黄色残留物をドライＤＨＦに懸濁し、３時間攪拌し、次いで濾過した。 Ｐ物を蒸発し逆相ＨＰＬＣ上に単一ピークのするどい水溶性黄色粉末を形成した 。保持時間を前述のロスウスキの方法に従って調製されたメトトリクセイトーガ ンマーヒドラジド「エイ、ロスウスキー博士ダナ　ファーバー　キャンサーリサ ーチ　インスティテユート、ボストン、マサチュセッツ州よりｌ贈（Ａ、Ｒｏｓ ｏｗｓｋｙ、Ｄａｎａ　Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ｔ４Ａ）　］と比較した。 ７．１．１．２．活性エステルによるメトトリクセイトーガンマーヒドラジド（ １）：’２ Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸アルファー１−ブチルエステルガンマ−Ｎ　’ −ＢＯＣ−ヒドラジド（１，０ｇｍ、１．８６　ｍモル）を３０ｍ！のドライテ トラヒドロフランに溶解した。ジエチルアミン（５ｔｎｌ）を加え反応混合物を ２時間室温にて攪拌した。薄層クロマトグラフィー（メルクシリカゲル、　ＣＨ ３Ｃ１：）ＩｅＯＨ：ＣＨ３Ｃ０ＯＨ；Ｏ：１：０．５）は、出発原料（Ｒｆ＝ ０．７８）の消失および新たなニンヒドリン溶性スポット（Ｒｆ＝０．１３　＞ の出現を現わした。溶液を蒸発し２時間室温にて真空状態に置きジメチルアミン の最終痕跡を除去した。形成された油状生成物すなわち［−グルタミン酸アルフ ァーｔ−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ　’−Ｂｏｃ−ヒドラジドを単離しなかっ た。 租［−グルタミン酸アルファーｔ−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ　’−Ｂｏｃ− ヒドラジドを１００ｏ＋ＩのドライＤ）ＩＦに溶解し４−アミノ＋デオキシーＮ １０−メチルプテロイル酸２．４−ジニトロフェニルエステル（６）　（０，９ １ｇｍ、１．８６　ｍモル）をジイソプロピルエチルアミン（０，２３ｇｍ、０ ．３２　ｍｌ　、　１．８６　ｍモル）とともに加えた。この反応混合物を２４ 時間室温にて攪拌し次いで４０℃まで加熱して完全な反応を行った。この混合物 を蒸発し、黄色粗油状生成物をシリカゲル上でフラッシュクＤ？トゲラフをしく ＣＨ２ＣＩ２　：）ｌｅＯＨ：ＨＯＡＣ，９：１：０．５）、シリカケ１１丁Ｌ Ｃ（ＣＨ２Ｃ１２：）ｌｅＯＨ：ＨＯＡＣ，９：１：０．５）　、（ＣＨ２Ｃ１ ２：ＨｅＯＨ：ＨＯＡＣ，９：１：０．５）により均質化され、次のＮ）ＩＲ特 性を示す１．０ｇ　ｍ　（８６％）の黄色固形分を得た。Ｉ　ＨＮＨＲ（ＣＤＣ Ｉ４−ｄ、　Ｄ）１３０．丁）Ｉｓ）δ　９．４３（ｂｒ　５ＩＨ）、８．７２ （Ｓ、２Ｈ，ＮＨ２）。 ８．４０（ｂｒ　ｄ、ＩＨ）、７．９５（ｄ、２Ｈ）、７．７４（ｓ、　２Ｈ） 、　７．３８（ｄ、　２Ｈ）、　６．０３（Ｓ、　２Ｈ）、　５．２２　（Ｓ、 　２Ｈ）、　４．４３（ｍ　、　ＩＨ）、　２．２０〜２．０３（ｍ　、　４Ｈ ）、　１．４５（ｓ、９Ｎ）、１．４３（ｓ、９Ｈ）。 上記黄色生成物（０，４２ｇ　ｍ　）を１０ｔｎｌ乾燥ＣＨ２Ｃ１２に溶解し、 ５ｍｌの１〜リフルオロ酢酸を加えた。この反応混合物を１時間攪拌し、次いで 蒸発乾固した。この黄色油状生成物を１００ｍ１の０．０２５）Ｉ　ＮＨ４）１ ｃＯ２に懸濁し、０．５８　ＮＨ４８Ｃ０３を（約２０滴）滴下してほぼ完結溶 液をもたらした。黄色溶液は、１ｐの０．０２５８　Ｎ８４　ＨＣＯ３を使用し て１５ｉｒｍＯＡＥセファデックス■［シグマ　ケミカル　カンパニー、セント ルイス、ミズーリー州（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ 。 Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、　８０）］上でクロマトグラフィーを行った後、１．５９の０ ．０２５）Ｉ　Ｎ８４　ＨＣＯ３および１．５９の０．５０８　ＮＨ４ＨＣＯ３ にて傾斜溶離した。傾斜の中間に溶離した黄色生成物を回収し凍結乾燥してトリ ヒトレートに対する正確な元素分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）および前記ロソウスキーの方 法によって調製されたメトトリクセイトーガンマーヒドラジドとＨＰＬＣ（Ｃ１ ８）上で好意的に比較されたメトトリクセイトーガンマーヒドラジドを得た。 ７．１．１．３．カルボジイミドによるメトトリクセイトからのメトトリクセイ トーガンマーヒドラジド（１）：′　３ メトトリクセイト（０，５ｇｍ、１．１ｍモル）をドライＤ）ＩＦ（５０ｍｌ） に溶解し、３〔３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミドヒド ロクロリド（０，４２ｇｍ、２．１ｍモル）を加えた。この反応混合物をさらに ２４時間室温にて撹拌しながら培養した。溶媒の蒸発により黄色オイルが残り、 そしてそれをＱＡＥセファデックス（シグマ　ケミカル　カンパニー、セントル イス、ミズーリー州）上にクロマトグラフィーをし、おそらくこれら限定されな いがＨ丁Ｘ−アルファーヒドラジドを含み、そして従来の予備ＨＰＬＣクロマト グラフィー技術にて所望の）ＩＴＸ−ガンマ−ＨＹから分離し得る他の生成物と ともに黄色生成物メトトリクセイトーガンマーヒドラジドを得た。 ７．１．２．メトトリクセイトーアルファーヒドラジド（７）Ｎ−アルファーＦ ＨＯＣＯＬ−グルタミン酸Ｎ’−ＢＯＣ−ヒドラジド−ガンマ−ｔ−ブチルエス テル（８）Ｎ−アルファーＦｍ０ＣＬ−グルタミン酸ガンマ−ｔ−ブチルエステ ル（５，０ｇｍ　、１２ｍモル）（バークム）をトメチルモルホリン（１，１９ １ｍ、１．２９　ｍＩ　、１２ｍモル）とともにｉｏ。 ｍｌのドライ月ＩＦに溶解しな。この溶液を窒素雰囲気下Ｏ℃まで冷却し、つい で２，２．２−トリクロロ−１，１−ジエチルクロホルメート（３，３９ｇｍ　 、　１．４ｍモル）溶解１０ｎ＋Ｉのドライ丁１１Ｆを１０分間かけて滴下した 。クロロホルメートの添加修了後、反応混合物を１５分間Ｏ℃にて攪拌し、つい で、１−プチルカーバゼート（２，３４２ｍ　、１８ｍモル）を加え、そして、 反応物を０℃でさらに１０分間攪拌し、次いで室温まで暖めそして一晩攪拌した 。溶媒を蒸発し、反応混合物を水（２００ｍ１）に注ぎ、ジエチルエーテル（２ ００ｍＪ　）で抽出しノご。エーテル層を１０％酢酸で洗浄し、ひきつづき水、 次いで飽和ＮａＣｌで洗浄しＮａ２　ＳＯ４で乾燥した。エーテルを蒸発し、所 望のＮ−アルファーＦｍｏｃ　Ｌ−グルタミン酸Ｎ　’−ＢＯＣ−ヒドラジドー ガンマーｔ−ブチルエステル（８）である白みがかった泡状物（６，２５ｇｍ、 ９８％）を得た。’　ＨＮＨＲ（ＣＤＣｌ２　、ＴＨ３）δ　８．９２（ｂｒ　 ｓ、　ＮＨ）７．９１〜７．００（ｍ　、　９Ｈ）、　４．６〜４．０５（ｍ　 、　４Ｈ）、　１．４０（Ｓ、　１８Ｈ）。 し−グルタミン酸−Ｎ’−Ｂｐｃ−ヒドラジドルガンマ−ｔ−ブチルエステル（ ９） Ｎ−アルファーＦｍ０ＣＬ−グルタミン酸−Ｎ’−Ｂｏ叶ヒドラジド−ｔ−ブチ ルエステル（０，７ｇｍ、１．３ｍモル）を窒素雰囲気下、２０ｍ１ドライＴＨ Ｅに溶解した。ジエチルアミン（５＋ｍｌ）を加え反応混合物を約２時間または シリカゲル丁ＬＣ（ＣＨ２Ｃ１：ＨｅＯＨ；９：１）が出発原料（Ｒｆ＝０．４ ５）の消失を示すまで室温にて攪拌した。反応終了後、混合物を蒸発し真空下に 置いてアミンの最終痕跡を除去した。粗生成物Ｌ−グルタミン酸−Ｎ　’　−Ｂ 。 Ｃ−ヒドラジド−ｔ−ブチルエステルをさらに精製することなしに使用した。 メトトリクセイトーアルファーヒドラジドガンマーｔ−ブチルエステル（１０） 第７．１．１．２節に記載されたとおりに調製した４−アミノ−４−デオキシ− Ｎ１０−メチルプテロイル酸ジニトロフェニルエステル（１６）　（０，６４ｇ ｍ、１３ｍモル）を３０ｍ１のドライＯＨＦに溶解し、５０１１のドライＤＭＦ 中のＬ−グルタミン酸−Ｎ’−Ｂ。 Ｃ−ヒドラジド−ガンマ−１−ブチルエステル（０，４１ｇｍ　。 １．１．３ｍモル）の溶液を加えた後、つづいてジイソプロピルエチルアミン（ ０，２４ｇｍ、０．３２　ｍｌ　、　１．８６　ｍモル）の添加を行った。この 反応混合物を室温にて２４〜１２時間撹拌を行った。反応を出発原料の消失およ び生成物に相当する新たな黄色スポット（Ｒｆ＝０．２１）の形成のためにＴＬ Ｃ（シリカゲル　ＣＨ２ＣＩ２　：ＭｅＯＨ：ＨＯＡＣ；９：１：０．５）で検 査した。反応終了後、混合物を蒸発しくＣＨ２ＣＩ２　：ＭｅＯＨ：ＨＯＡＣ； ９：１：０．５）を使用しシリカゲル上にフラッシュクロマトグラフし黄色粉末 としてメトトリクセイトーアルファ−Ｎ’−Ｂｏｃヒドラジドガンマ−１−ブチ ルエステルを得な（０，６０ｇｍ、７４’Ｘ収Ｘ）。 メトトリクセイトーアルファーヒドラジド（７）メトトリクセイトーアルファー Ｈ−Ｂｏｃヒドラジドガンマ−１−ブチルエステル（０，６０ｇｍ＞を５ｎ＋Ｉ のＣＨ２Ｃ１２に溶解し、５ｍｌのトリフルオロ酢酸を加え反応混合物を２時間 攪拌し、蒸発し炭酸ニアンモニウム（０，０２５Ｍ、　１００　ｍｌ　）の添加 により中和しそしてこの溶液を炭酸ニアンモニウム傾斜を用いてＱＡＥセファデ ックス■カラム上で精製し凍結乾燥後、黄色粉末として１００ｍｇのメトトリク セイトアルファーヒドラジドを得た。 ７．１．３．メトトリクセイトーアルファ、アルファーリシル−グリシル−グリ シル−チロシル−ヒドラジド（１１）チロシンＮ’　−Ｂｏ叶ヒドラジド（１２ ）１００ｍｌドライテトラヒドロフラン（ＴＨＥ）１００　ｍｌ中のＣＢＺ−Ｌ −チロシン（３，００ｇｍ、９．１１　ｍモル）、Ｎ−メチルモルホリン（０， ９２ｇｍ、１．００　ｍモル）の溶液を窒素雰囲気下、０℃に冷却した。２，２ ．２−トリクロロ−１，１−ジメチルエチルクロロホルメート（２，１８ｇｍ　 、　９．１１　ｍモル）を冷溶液に加えた。５分攪拌後、２０ｍ１ドライＴＨＦ 中の［−ブチルカバーセード（１，２０ｇｍ　、　９．１１　ｍモル）の溶液を ０℃に冷却し反応混合物に添加した。この混合物を回転蒸発で除き残留物をクロ ロホルムと水とで分割し層分離した。有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄しＮａ２３０ ４で乾燥し、涙過し、そして溶媒を蒸発し粗保護生成物を得た。このＣＢＺ−保 護生成物、すなわちＣＢＺ−チロシンＮ　’−Ｂｏｃ−ヒドラジドを石油エーテ ルと酢酸エチルの混合物（１：１）を使用しフラッシュクロマトグラフィーを経 てシリカゲル上にて精製した。 クロマトグラフィー精製後、ＣＢＺ部位を次のとおりに保護生成物から除いた。 すなわちＣＢＺ−チロシンＮ　’−ＢＯＣ−ヒドラジドを無水エタノール（２５ ０ｍ１）および氷酢酸（２ｍｌ）の混合物に溶解し、炭素上の５％Ｐｂの存在下 パー装置（３〜４気圧）中１時間水素化した。この触媒を炉別し溶媒を回転蒸発 で除きニンヒドリン陽性生成物Ｎ’−Ｂｏａ−ヒドラジド（１２）を得た。ｌ　 ＨＮＭＲ（ｄｅ　、ＤＭＳＯ）δ７．１３（ｄ、　２Ｈ）、　６．７８（ｄ、２ Ｈ）、３．７５〜２．７０（ｍ、３Ｈ）、１．５５（Ｓ、９Ｈ）。 グリシル−グリシル−チロシンＮ’−Ｂｏｃ−ヒドラジド（１３）１００ｍｌド ライＤＨＦ中のＣＢＺ−グリシルグリシン（０，１７ｇｍ　、　０．６８　ｍモ ル）およびジイソプロピルエチルアミンの溶液を０℃に冷却した。インブチルク ロロホルメート（０ライＤ）ＩＦ中のチロシンＮ’−ＢＯＣ−ヒドラジド（１２ ）　（０，２００ｇｍ、　０．６８　ｍモル）を０℃にて加えた。この混合物を 室温まで暖め一晩攪拌した。溶媒を回転蒸発により除去した。 残留物を水に懸濁し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和ＮａＣｌで洗 浄し、Ｎａ２　ｓｏ４で乾燥、沢過そして蒸発して０．２７４ｇ　ｍ　（７４％ ）の生成物ＣＢＺ−グリシルーグリシル−チロシンＮ　’−Ｂｏｃ−ヒドラジド を得た。’　ＨＮＨＲ（ｄａ　０８３０．丁Ｈ３）δ７．５８（Ｓ、５Ｈ）　、 ７．１４（ｄ、２Ｈ）、６．７７　（ｄ、２Ｈ）、５．１１（Ｓ、２Ｍ）、　３ ．７２　（ｍ、　５Ｈ）、　２．９０　（ｍ、　２Ｈ）、　１．５０（Ｈ，９Ｈ ）　、このＣＢＺ−保護生成物（０，８２４ｇｍ）を無水エタノール（２００ｍ １）および氷酢酸（２ｍｌ）の混合物に溶解した。この混合物を１時間パー装置 （３〜４気圧）上で炭素上の５％Ｐｂの存在下に水素化した。この触媒を炉別し 溶媒を回転蒸発により除去し、小量の酢酸含有０．５ｇｍは租グリシルーグルシ ルーチロシンＮ’−Ｂｏ叶ヒドラジド生成物を得た。Ｉ　ＨＮＨＫＲ（ｄｅ　Ｄ ）１３０．丁１４ｓ）δ　７．３０　（ｄ、２Ｈ）、６．９０（ｄ、２Ｈ）、３ ．８０〜３．２０（ｒｎ、　５Ｈ）、　３．９０（ｍ　、　２Ｈ）、　２．００ （ＣＨ３Ｃ００Ｈ）、　１．５　（Ｓ、　９Ｈ）。 ＣＢＺ−グルタミン酸−ガンマ−ｔ−ブチル　エステル−リシン−（ε−ＢＯＣ ）（１４ ドライＤＨＦ（３５ｍｌ　）中ＣＢＺ−Ｌ−グルタミン酸−ガンマーｔ−ブチル エステル−１−ヒドロキシサクシンイミドエステル（３，５ｇｍ　、　０．００ ８１　ｍモル）ジイソプロピルエチルアミン（２，８２ｍｌ　、　０．０１６２ モル）およびｅ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−リシン（１，９８ｇｍ　、　０．００８１　 ｍモル）の混合物を一晩Ｎ２雰囲気下攪拌した。ＤＨＦを回転蒸発にて除去した 。残留物をＣＭ２Ｃ１２にとり、水で４度、飽和ＮａＣ１で１度洗浄しＮａ２３ ０４で乾燥した。濾過および溶媒の蒸発によりろう状固形分として４．０ｇｍの （１４）を得た。 グルタミン酸−ガンマーＶ−ブチルーリシル〔−ε−Ｂｏｃ）−グリシル−グリ ル−チロシンＮ’−Ｂｏｃ−ヒドラジド　１５）ドライ０ｆ（Ｆ（１００ｍｌ） 中（１４）　（、１，１７ｍｇ　、　２．０７　ｍモル）およびＮ−メチルモル ホリン（０，２３ｍｌ　、　２．０７　ｍモル）の溶液をＮ２雰囲気下Ｏ′Ｃま で冷却した。インブチルクロロホルメート（０，２７ｔｎｌ　、　２．０７　ｍ モル）を加え０°Ｃにて５分間攪拌した。ドライＤＨＦ中（１３）　（０，８４ ６５■、２．０７ｍモル）の溶液を反応混合物に加えた。この反応物を室温まで 暖めた。ＤＭＦを回転蒸発にて除去した。この残留物を酢酸エチルおよび水で抽 出した。有機装置をＮａ２　ｓｏ、、で乾燥し、濾過し、そして蒸発し１．１ｇ ｍ　（６４，７％）の（１５）のＣＢＺ誘導体を得た。’　ＨＮＭＲ（ｄｅ　、 ＤＭＳＯ，ＴＨ３）δ７．５５（ｓ、５Ｈ）、　７．２１（ｄ、２Ｈ）、６．８ ０（ｄ、２旧、６．８０（ｄ、２旧、５．１３（ｓ、２Ｈ）、３．９０〜１．８ ０（ｍ、　２１Ｈ）、１．４０（ｂｒ　ｓ　２７旧。この原料を１時間炭素上の ０．５％ｐｂの存在下エタノール（２００ｍ１）および２ｍｌ酢酸中水素化して ニンヒドリン陽性生成物（１５）をもたらす部位を除いた。Ｉ　ＨＮ）ＩＲ（ｄ ｅ、ＤＭＳＯ，Ｔ）Ｉｓ）δ７．５１　（ｄ、２Ｈ）。 ６．８０（ｄ、　２旧、１．５０（ｂｒ　ｓ、２７旧。 メトトリクセイトーアルファ　、アルファーリシル−グリシル−グリシル−チロ シルヒドラジドドライＤＨＦ　（４０ｍｌ　）中Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチル アミン（０，３２ｍｌ、０．１８　ｍモル）、ジエチルホスホロシアニデート（ ０，０１８ｍ１，０．１２　ｍモル）および４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０ −メチルブチリル酸（ロソウスキーら１９８５．　Ｊ、　Ｒｅｄ。 ｃｈｅｍ、２８：　６６０の方法に従って調製＞　（０，３４ｇｍ、０．１２ｍ モル）の混合物を一晩Ｎ２雰囲気下攪拌した。ドライＤＨＦ中の（１５）　（１ ，０ｇｍ、０．１２　ｍモル）およびＮ−Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０ ，０２１ｍ１．０．１２　ｍモル）を反応混合物に滴下した。この生成物を２時 間メチレンクロリド（５ｍ１）　、アニソール（３ｍｌ）およびなトリフルオロ 酢酸（５ｍｌ）の混合物中これを攪拌することによりｔ−ブチルエステルおよび Ｂｏｃ保護基を除去することによって脱保護した。溶媒を回転蒸発にて除き、そ して残留物をエーテルで粉末し、ついで濾過し、０．０３ｇｍの生成物（１１） を得た。 ７．１．４．アミノプテリン−ガンマ−ヒドラジド（ＡＭ−ガンマ−ＨＹ）　（ １６） Ｎ−４（（２，４−ジアミノ−６−プテリンニル）メチルアミノ）ベンゾイル− ［−グルタミン酸−５−ヒドラジド、一般名「アミノプテリン−ガンマ−ヒドラ ジド」を次のごとく合成しな。 ４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−ホルミルプテロイル酸２．４−ジニトロフ ェノールエステル（１７）４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−ホルミルプテロ イル酸をロソウスキーら、１９８５．Ｊ、）ｌｅｄ　Ｃｈｅｍ、２８：６６０の 方法により調製した。 ドライＤ肝中の４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−ホルミルプテロル酸の溶液 （０，５ｇｍ、１．５ｍモル）を２４時間２５℃で３−（３−ジチルアミノプロ ピル）−１−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（０，４３ｇｍ　、　２．２ ５　ｍモル）および２，４−ジニトロフェノール（０，４１ｇｍ　、　２．２５ 　ｍモル）とともに攪拌した。この反応混合物を濃縮し、イソプロパツールで粉 砕しそして濾過した。黄色固形分が回収され４０℃で真空中（Ｖａｃｕｏ）乾燥 し、４−アミノ＋デオキシーＮｉｏ−ホルミルプテロイル酸２，４−ジニトロフ ェノールエステルを得た（０．７７　ｇｍ、１００％）。Ｒｆ＝０．３１（メル クシリカゲル、ＣＨ２ＣＩ２　：）ｌｅＯＨ：ＨＯＡｃ；９：１：０．５）。 −１−ブチルエステル−ガンマ−Ｎ′ −Ｂｏｃ−ヒドラジド（１８） ４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１°−ホルミルプテロイル酸２，４−ジニトロフ ェニルエステル（１７）　（１，００ｇｍ、２ｍモル）および［−グルタミン酸 アルファー【　−プルチェスチルガン？−Ｎ’−ＢＯＣ−ヒドラジド（３）　（ ０，７０ｇｍ、　２．２ｍモル）の混合物を２４時間２５℃にて３５ｍ１のドラ イＤ肝中で撹拌した。 回転蒸発によるＤ）４Ｆの除去後、残留物をＣＨ２ＣＮ　２　：　）ｌｅＯＨ： ＨＯＡｃ（９：１：０．５）中に取り出し、同じ溶媒混合物に溶離されるシリカ ゲルカラムに適用した。生成物を含有するフラクションを貯め、蒸発して黄色固 形分１．０５ｇｍ、　８２％として（１８）を得た。Ｒｆ＝０．２１．黄色螢光 スポット、（ＣＨ２ＣＤ　：ＨｅＯＨ：ＨＯＡｃ、　９：１　：０．５）。 アミノプテリン−ガンマ−ヒドラジド　１６）トリフルオロ酢酸（５ｎ＋Ｉ）を ５　ｍｌのＣＨ２ＣＣ２の（１８）（１００ｇｍ、　０．１６ｍモル）の溶液に 加えた。反応を丁ＬＣ（シリカゲル、ＣＨ２ＣＤ　２　：　ＨｅＯＨ：ＮＨ４０ Ｈ：５：４：１）で検査して（１８）　（Ｒｆ＝０．９５）の消失および新たな 青色スポット（Ｒｆ＝０．６２）の形成を確認した。４０分後反応を終了し回転 蒸発乾固した。 化合物を次いで５■のｌＮＮａＯＨおよび１０ｎ＋ＩのＨｅＯＨに溶解しホルミ ル基を除いた。つづいて丁Ｌｃ　（シリカゲル、ＣＨ２ＣＮ２　：　）ｌｅＯＨ ：ＮＨ４０Ｈ；　５：４：１）にて反応を行い青い螢光色の消失を観察した。青 色螢光スポットが消失した際（約２．５時間）反応を終了し混合物を０．５８　 ＨＣ！ＱでｐＨ７に中和した。 この反応混合物を濃縮、凍結乾燥し租黄色固形状アミノプテリンーガンマ−ヒド ラジド（１６）を得た。炭酸ニアンニウム傾斜（０，０２５）１〜０．５）１） を用いてＱＡＥセファデックス■上での精製および引き続いて凍結乾燥を行い純 粋アミノプテリン−ガンマ−ヒドラジド（１６）　（０，０３ｇｍ、４０％）を 得た。 ７．１．５．アミノプテリン−アルファーヒドラジド（１９） ＮＩＯホルレミルーアミノプテリン アルファーＮ−Ｂｏｃ　−ヒドラジド ガンマ−℃−ブチルエステル　２０） 第７．１．４節に記載されたとおりに調製された４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ ”−ホルミルプテロイル酸、２，４−ジニトロフェニルエステル（１７）　（０ ，５０ａｍ、１ｍモル）を５０＋ｎｌドライＤＨＦに溶解し、［−グルタミン酸 Ｎ’−Ｂｏｃ　−ヒドラジド−ガンマ−［−ブチルエステル（９）　（０，４８ ９ｍ、１．５ｍモル）を加えた。この反応混合物を１２時間室温にて撹拌し、新 しい黄色生産物の出現（Ｒｆ＝０．１９）に関して丁ＬＣ（シリカゲル、　ＣＨ ２ＣＤ２：　）ｌｅＯＨ：ＨＯＡｃ；９：１：０．５）にて検査した。 反応完結後、この混合物を蒸発しついでフラッシュクロマスゲラフ（シリカゲル 、　ＣＨ２Ｃｆ）２　：　ＨｅＯＨ：ＨＯＡｃ；９：１：０．５）して丁［Ｃ止 車−螢光スポットとして（２０）　（０，５７ｇｍ、８９％）を得カニ。 アミノプテリン−アルファーヒドラジド（１９）Ｎ１０ホルミル−アミノプテリ ン−Ｎ’−Ｂｏｃ　−ヒドラジド−ガンマ−１−ブチルエステル（０，５７ｇｍ ）をＣＨ２（１１２（２０ｍｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（１０ｃｎｌ）を 加えた。 この反応混合物を２時間室温にて撹拌し、ついで回転蒸発しな。得られたオイル を１０ｍ１の１８　ＮａＯＨに溶解し黄色螢光スポットが丁ＬＣ（シリカゲル、 ＣＨ２ＣＣ２：　ＨｅＯＨ：ＮＨ４ＤＨ：５：４：１　）上から消失するまで室 温にて２時間撹拌した。ついでこの反応混合物をＩＮ　ＨＣＮで中和し０．０２ ５　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３溶液で炭酸ニアンモニウム傾斜（０，０２５）１〜０． ５０）１　）を用いてＱＡＥセファデックス■上イオン交換クロマスグラフィー 、つづいて凍結乾燥しアミノプテリンアルファーヒドラジド（１９）を得た。 ７．１．６．メトＩヘレクセイトーアルファーアルファーリシン（２１ ［−グルタミン−ガンマ−１−ブチルエステル−アルファーリシン（ε−ＣＢＺ 　）−ジフェニルメチルエステル（２２） Ｎ−メチルモルフォリン（０，２６ｍ１　、２．３５ミリモル）をＦＨＯＣ−グ ルタミン酸−ガンマ−ｔ−ブチルエステル（１，００ｇｍ２．３５ミリモル）の ドライＤＨＦ　（１０ｍ１　＞溶液中に０℃において加えた。インブチルクロロ ホルメート（０，３２ｇｍ、　２．３５ミリモル）を加え、その反応混合物を０ ℃において１０分間撹拌した。ε−ＣＢＺ−Ｌ　−リシン−ジフェニルメチルエ ステル（１，１ａｍ　、　２．３５ミリモル）を、室温まで暖めた反応混合物に 加えた後、１夜撹拌しな。反応混合物を水３００　ｎ＋１中に投入し、エチルア セテートで抽出した。層分離後、有機層をＮａ２３０４で乾燥し、溶媒を除いて 固形物を得た。固形物をＴＨＦ（２５ｏ＋Ｉ　）中に入れ、ＦＨＯＣ成分をジエ チルアミン（０゜８４Ｑｍ、　１２ｒｎｌ　、　１２．０ミリモル）を用いて室 温で２時間かけて除いた。溶液を蒸発し、乾燥して油状生産物（２２）を得た。 メトトリクセイトーアルファーアルファーリシン（２１）４−アミノ−４−デオ キシＮ　１０−メチルプテロイル酸（０，７６ｇｍ、　２．３５ミリモル）の少 量をジイソプロピルエチルアミン（１，２３ｍ１　、７．０５ミリモル）とジエ チルホスホロシアニデート（１，０７ｍ１　、７．０５ミリモル）のドライＤ） ＩＦ　（１００ｍｌ　＞溶液中に撹拌しながら加えた。反応混合物の且Ｃは、１ 時間接に反応が完了したことを示した。 化合物（２２）　（１，５２ｐｍ、　２．３５ミリモル）を加え、混合物を室温 で１夜撹拌して培養した。反応混合物を蒸発して乾燥した。残留油をＣＨＣΩ３ に溶解し、冷飽和ｈａ２８ＣＯ３を用いて数回洗浄した。有機層をＮａ２３０３ で乾燥し、蒸発して乾燥し生じた固形物をＣＨ２Ｃ’；Ｉ　２　：Ｈｅ０Ｈ（９ ５：　５）を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを通して精製し た。 生産物をＨＯＡＣ（３０〜３２％）中の３０　ｍ１ＨＢｒ中に溶解し、室温で４ 時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析の分割が完全であり、単一生産物が生じたことを示 した。エーテル（１００ｔｎｌ）に反応混合物中に加えて生産物を沈降させた。 混合物を遠心分離にかけ、ペレットをエーテルで数回洗浄した。その後、ペレッ トを冷（０℃）プロピレンオキシド中に懸濁させて臭化水素を中和し、その後濾 過した。黄色固体、メトトレクセイトーアルファーアルファーリジン（２１）は 、Ｃ１８シリ力ゲルＨＰＬＣ分析により単一ピークとして溶出した。 ７．２．抗体複合体調製 ７．２．１．　）ＩＴＸ−ガンマ−ＨＹ−一連の実験において、ＨＴＸ−ガンマ −ＨＹ−抗体複合体は、本発明に従って次のように調製された。 ブラウンノルウェイ（ＢＮ）ラットのクラス１メジヤーヒストコンパテイビリテ イ−（）ＩＨＣ）抗原［スミレツク等１９８０年ジャーナル・オブ　イクスペリ メンタル　タデ４９フ１５１巻　１１３９頁（Ｓｍｉｌｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８０．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｒｅｄ、　１５１：１１３９月に特異なＣ丁ＹＯ １５と指定されたラットモノクローナルＩｇＧ２ｃ抗体を使用した。モノクロー ナル抗体は、ヌードマウス中に生じた腹水かまたは生体外で培養された抗体−産 生ハイブリドーマ細胞系上澄液から収穫された。得られた抗体は、°プロティン 　Ａ−セファロース　カラム［ファーマシア・ファイン・ケミカルズ、ビス力タ ウエイ、ニューシャーシー州、（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）］を使用する勾配溶液で精製し た。抗体調製純度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法により確認された。 ＣＹＴＯ１５抗体寡糖類を、暗所でリン酸緩衝溶液ｐＨ６，０（ＰＢＳ；０．１ ５Ｈ’ＮａＣ１１、０，０１８ＰＯ４−２＞中のＮａＩＯ４１０ｍｔ（でもって 、氷上で１時間培養して酸化した。過剰ＮａＩＯ４は、その後、透析かまたはゲ ル濾過技術かのいずれかを用いて酸化抗体から除かれた。修飾抗体（７μｍ）は 、室温において一夜暗所で１ｍｔ４濃度ＭＴＸ−ガンマーＨＶで培養された。 未反応）ＩＴＸ−ガンマ−ＨＶを、ＰＢＳに対する透析により除去化の一連の実 験において、）ＩＴＸ　−抗体複合体は、次のように、）ＩＴＸ類縁体が反応性 第一級アミン部位を介して酸化抗体のアルデヒド部位にカップルする方法で調製 される。 （リシン部位に遊離反応性ε−ＮＨ２基を有する）ＨＴＸ−アルファーアルファ ーリシンは、前記第６．１．４節の記載のように調製した。ＣＹ丁０１５抗体は 、前記第６．２．１節の記載のように酸化した。酸化抗体（１，０ｍｇ／　ｍｌ 　＞を、暗所において室温で一夜、１ｍ）Ｉ　）ＩＴＸ−アルファーアルファー リシンと１０ｍ）ｌナトリウム　ジアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３）と を反応させた。過剰ＮａＣＮＢＨ３と未反応ＨＴＸ　−アルファーアルファーリ シンをＰＢＳに対する透析で除去した。生体内使用前に、この）ＩＴＸ　−アル ファーアルファーリシン−ε−抗体複合体は、ゲルフィルトレージョンカラムを 通して形成されたであろう凝縮物を除去されることが好ましい。 ８、部位選択性抗体−ＨＴＸ　〜ガンマーＨＶの・れな治療・果 次の実験は、生体内投与された際に、本発明のＨＴＸ　−抗体複合体に選択的に 付着した部位が複合体にランダムに付着した類縁体に比較して優れた治療効果を 現わことを示す。 ）ＩＴＸ−ガンマ−ＨＶ−抗体複合体は、第６．２．１節に記載のＣＹＴＯ１５ を使用して調製した（）ＩＴＸ　−Ｈｙ−ＣＴＹＯ１５を参照のこと）。ランダ ムに付着な）ＩＴＸ　−抗体複合体は、同−ＣＹＴＯ１５抗体を使用して調製し たメトトレクセイト（）ＩＴＸ　）を、カネロス等の方法［カネロス等、　１９ ８５年、ジャーナル　オブナショナル　キャンサー　インステイテユート　７５ 巻。 ３１９頁（ｋａｎｅｌｌｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５　Ｊ、　Ｎａｔ’ｌ　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、〕紅３１９）］に従って、ＣＹＴＯ１５抗体のりシン 残基に非選択的にカップルしたくランダム）ＩＴＸ　−ＣＹＴＯ１５参照のこと ）。未反応）ＩＴＸをＰＢＳに対する透析で除去した。 複合体の生体内治療効果は、ｉ　Ｘ１０Ｂ　ＢＮリンパ腫細胞を左腹に皮下注射 した雌ヌードマウス［ＮＩＨスイス−ウェブスター、タコニック　ファームス、 ニューヨーク州（ＮＩＨ５ｖｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ、　Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａ ｒｍｓ、　ＨＹ月で評価した。注射後４日に、手でされれる腫瘍が大部分の動物 に生じた。４日から８日まで続けて、動物は、抗体−複合体のどちらか、即ち、 ＨＴＸ−ＨＶ−ＣＹ丁０１５かまたはランダムＨ丁ｘ−ｃｙ丁０１５がで腹腔的 注射された。約１／２だけについて、薬剤量が抗体分子あたりランダムに付着し 得たために（選択付着に比較して）、約１７２について、部位選択性複合体が薬 剤の等価服用量を比較するために投与された。ＢＮＮ腫瘍ソノグラフッＸｅｎ（ ＸｌｒａｆｔＳ）を生ずる一群の非処理動物は、対照とて役立った。毎日、動物 は計算され、腫瘍の多きさが計測された。それらの結果が第１図および第２図に 示される。 第１図に示されるように、部位選択性）ＩＴＸ　−Ｈｙ−ＣＹ丁０１５は、非処 置動物の同一グループと比較すると腫瘍ゼノグラフツを生ずる動物に極めて治療 的効果を及ぼす。部位選択性複合体を受ける動物は、腫瘍抗体を示した。反対に 、第２図に示すようにランダムに）ＩＴＸ　−ＣＹ丁０１５複合体に付着した等 価薬剤服用量を受ける動物は、若干の治療効果を示した［例えばＨＴＸ　−ＣＹ 丁０１５　（０，５ｍｇｃＹ丁０１５上（７）？、５　μＱ　ＨＴＸ−ＨＶ）対 ランダムＨＴＸ−ＣＹ丁０１５　（１，０■　ｃｙ丁０１５上の７０Ｈｇ）ＩＴ Ｘ）を比較のことコ。 ９、メトトレクセイトーアルファーアルファ−リシル−グリシル−グリシル−チ ロシル−ヒドラジド　人　の生　夕 次の実験は、本発明の抗体−ペプチド−）ＩＴＸ−複合体が酵素的に分割されて 生体外で遊ｚｌ＋ｒｘを放出するこを示す。 分割は、同様に生体外でプラスミンとカルボキシペプチダーゼのような酵素によ り触媒的に腫瘍標的部位において生じ、遊離治療的活性ＨＴＸが計画的に特異標 的部位において放出されることが期待される。 メトトレクセイトーアルファーアルファーリシルーグリシルーグリシルーチロシ ルーヒドラジド（ＭＴＸ−アルファーアルファーに−Ｇ　−Ｇ　−Ｙ−’ＮＨＮ Ｈ２は、前記第６．１．２節の記載のように調製した。ＣＹＴＯ１５抗体複合体 は、第６．２節の記載のように抗体の酸化により調製し、ＨＴＸ　−アルファー アルファーＫ　−Ｇ　−Ｇ　−Ｙ　−ＮＨＮＨ２のヒドラジド成分を抗体のアル デヒド成分にカップルした。　抗体＝Ｎ　−Ｎ　−Ｈ−Ｙ　−Ｇ　−Ｇ　−Ｋ　 −）ＩＴＸ複合体（１ｍｇ／　ｍ！　）　（ｐＨ７，４ＰＢｓ）は、３時間（３ ７℃）トリプシン（５００μｇｍ／　ｔｎｌ　＞と反応させた。薄層クロマトグ ラフィーによる消化分析は複合体からのＨＴＸ　−アルファーアルファーリシン 放出を示した。 ジイソプロピルホスホロフルオリデートでのトリプシンの抑制後、カルボキシペ プチダーゼ８を加えた。遊離ＨＴＸが放出された。カルボキシペプチダーゼ８単 独では、複合体からＨＴＸまたは）ＩＴＸ　−アルファーアルファーリシンを分 割できず、プラスミンとカルボキシペプチダーゼＨの如き酵素により触媒的に生 体内で生ずるであろう分割の必須の２段階系列が確認された。カルボキシペプチ ダーゼＮは、血液中に見い出され、カルボキシペプチダーゼ８は、消化経路での みで見い出される。しかしながら、カルボキシペプチダーゼＢは、両酵素が類似 特異性を有するために、カルボキシペプチダーゼＨの良いインビボモデルとして 役立つ。 ＦＩＧ、１ △ＩＩ　ＭＴＸ−Ｈｙ−ＣＹＴＣ１５０，２５ｍｇＣＹＴＯＩ５１？Ｊ＋’１７ ａ　３．８”９ＭＴＸ−ＨｙＦＩＧ、２ Ｘ　４　’ｌン９−１−　ＭＴＸ−ＣＹＴＯＩ５　１　ｍｇｃＹＴＯＩ５＋（＃ Ｌｔ６　７．−ｇｏ　５　’）＞５”　ＭＴＸ−ＣＹＴＯ１５’　０．５ｍｇＣ ＹＴＯＩ５ＭＭ６３．５＃ｇΔ　６−７　シフ゛ｂ　ＭＴＸ−ＣＹＴ○１５　０ ２５ｒｎｇ　ＣＹＴＯ１５＋？ｈＩ７！１．８　ｊ１ｇ国際調査報告 １ｒ！電ｅ＋ｎｄｋりｎＮ＾””””””ｏｒｒｔｎｃ＊７ｚｎｎｏｏｔ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）抗体または抗体フラグメントを酸化剤と反応させて該抗体または抗体 フラグメント中にアルデヒド基を形成させ、かつ （ｂ）該抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水化物部位のアルデヒド基 を第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、 フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオカルバジド基よりなる群から選 ばれた葉酸類縁体の反応性アミン基と反応させて非複合化抗体または抗体フラグ メントと実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を有する水溶性抗体葉酸類 縁体を形成する ことを特徴とする治療性抗体葉酸類縁体複合体の製造方法。 ２．（ａ）抗体または抗体フラグメントを酸化剤と反応させて該抗体または抗体 フラグメント中にアルデヒド基を形成させ、かつ （ｂ）該抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水化物部位のアルデヒド基 を第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン、 フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオカルバジド基よりなる群から選 ばれた葉酸類縁体の反応性アミン基と反応させて非複合化抗体または抗体フラグ メントと実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を有する水溶性抗体葉酸類 縁体を形成し、前記葉酸類縁体がメトトレクセイト、アミノプテリン、３′−５ ′−ジクロロメトトレクセイト、３′−５′−ジクロロアミノプテリン、５，８ −ジデアザメトトレクセイト、５，８−ジデアザ−５，６，７，８−テトラヒド ロアミノプテリン、５，８，１０−トリデアザアミノプテリン、５，１０−ジデ アザテトラヒドロ葉酸および８，１０−ジデアザアミノプテリンよりなる群から 選ばれた葉酸類縁体のアミン含有誘導体である ことを特徴とする治療性抗体葉酸類縁体複合体の製造方法。 ３．葉酸類縁体がメトトレクセイトーガンマーヒドラジド、メトトレクセイトー アルファーヒドラジド、３′，５′−ジクロロメトトレクセイトーガンマーヒド ラジド、３′，５′−ジクロロメトトレクセイトーアルファーヒドラジド、メト トレクセイトーアルファーアルファーリシルーグリシルーグリシルーチロシルー ヒドラジド，メトトレクセイトーガンマーチロシルヒドラジド、メトトレクセイ トーアルファーアルファーリシルヒドラジド、メトトレクセイトーアルファーア ルファーリシン、メトトレクセイトーアルファーアルファーリシル−ε−アルギ ニン−グリシン−グリシン−チロシン、アミノプテリン−ガンマーヒドラジド、 アミノブテリン−アルファーヒドラジド、３′，５′−ジクロロアミノプテリン −ガンマーヒドラジド、３′，５′−ジクロロアミノブテリン−アルファーヒド ラジド、アミノプテリン−アルファーアルファーグリシルーグリシルーチロシル ーヒドラジド、アミノプテリン−ガンマーチロシルヒドラジド、アミノプテリン −アルファーアルファーリシルヒドラジド、アミノプテリン−アルファーアルフ ァーリシンおよびアミノプテリン−アルファーアルファーリシル−ε−アルギニ ン−グリシン−グリシン−チロシルよりなる群がら選ばれたものである請求の範 囲第２項に記載の方法。 ４．抗体フラグメントがＦａｂフラグメント（Ｆａｂ′）２フラグメントおよび 半抗体フラグメントよりなる群から選ばれたものである請求の範囲第２項に記載 の方法。 ５．抗体フラグメントがモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメ ントである請求の範囲第２項に記載の方法。 ６．抗体−葉酸類縁体複合体が有効量の還元剤にさらされることにより安定化さ れてなる請求の範囲第２項に記載の方法。 ７．抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水化物部位に共有結合を介して 結合したアミン含有葉酸類縁体誘導体よりなり、該水溶性複合体が非複合化抗体 または抗体フラグメントと実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を有し、 かつ該共有結合がイミン、エナミン、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、オキシ ム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンおよびそれらの還元形態よりなる群か ら選ばれたものである抗体−葉酸類縁体複合体＞８．メトトレクセイト、３′− ５′ジクロロメトトレクセイト、アミノプテリン、３′−５′−ジクロロアミノ プテリン、５，８−ジデアザメトトレクセイト、５，８−デアザ−５，６，７， ８−テトラヒドロメトトレクセイト、５，８−ジアザ−５，６，７，８−テトラ ヒドロアミノプテリン、５，８，１０−トリデアザアミノプテリン、５，１０− ジデアザテトラヒドロ葉酸および８，１０−ジデアザアミノプテリンよりなる群 から選ばれた葉酸類縁体のアミン含有誘導体よりなり、該アミンが抗体または抗 体フラグメントの酸化された炭水化物部位に共有結合を介して結合した第一級ア ミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、アルコキ シアミン、セミカルバジド、チオセミカルバジドおよびそれらの還元形態よりな る群から選ばれたものであり、該水溶性複合体が非複合化抗体または抗体フラグ メントと実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を有し、かつ該共有結合が イミン、エナミン、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾ ン、チオセミカルバゾンおよびそれらの還元形態よりなる群から選ばれたもので ある抗体−葉酸類縁体複合体。 ９．アミン含有葉酸類縁体誘導体が、メトトレクセイトーガンマーヒドラジド、 メトトレクセイトーアルファーヒドラジド、３′，５′−ジクロロメトトレクセ イトーガンマーヒドラジド、３′，５′ジクロロメトトレクセイトーアルファー ヒドラジド、メトトレクセイトーアルファーアルファーリシリルーグリシルーグ リシルーチロシルーヒドラジド、メトトレクセイトーガンマーチロシルヒドラジ ド、メトトレクセイトーアルファーアルファーリシルヒドラジド、メトトレクセ イトーアルファーリシン、メトトレクセイトーアルファーアルファーリシル−ε −アルギニン−グリシン−チロシン、アミノプテリン−ガンマーヒドラジド、ア ミノプテリン−アルファーヒドラジド、３′，５′−ジクロロアミノプテリン− ガンマーヒドラジド、３′，５′−ジクロロアミノプテリン−アルフアーヒドラ ジド、アミノプテリン−アルファーアルファーリシルーグリシルーグリシルーチ ロシルーヒドラジド、アミノプテリン−ガンマーチロシルヒドラジド、アミノプ テリン−アルファーアルファーリシルーヒドラジド、アミノプテリン−アルファ ーアルファーリシンおよびアミノプテリン−アルファーアルファーリシン−ε− アルギニン−グリシン−グリシン−チロシンよりなる群から選ばれたものである 請求の範囲第８項に記載の抗体−葉酸複合体。 １０．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーガンマーヒドラジドである請 求の範囲第９項に記載の複合体。 １１．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーアルファーヒドラジドである 請求の範囲第９項に記載の複合体。 １２．アミン含有葉酸類縁体がアミノプテリン−ガンマーヒドラジドである請求 の範囲第９項に記載の複合体。 １３．アミン含有葉酸類縁体がアミノプテリン−アルファーヒドジドである請求 の範囲第９項に記載の複合体。 １４．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーアルフアーアルファーリシル ーグリシルーグリシルーチロシルーヒドラジドである請求の範囲第９項に記載の 複合体。 １５．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーアルファーアルファーリシン である請求の範囲第９項に記載の複合体。 １６．抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水化物部位に共有結合を介し て結合したアミン含有葉酸類縁体誘導体よりなり、該水溶性複合体が非複合化抗 体または抗体フラグメントと実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を有し 、かつ該共有結合がイミン、エナミン、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、オキ シム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンおよびそれらの還元形態よりなる群 から選ばれたものであり、該抗体−葉酸類縁体複合体が細胞性疾患に関連した目 標部位と免疫反応的かつ免疫特異的でありかつ該細胞性疾患に関連しない組織に 対しては非免疫反応的かつ非免疫特異的である医薬的有効量の水溶性の部位選択 的結合抗体−葉酸類縁体複合体を動物またはヒトに投与することを特徴とする細 胞性疾患の治療方法。 １７．抗体または抗体フラグメントの酸化された炭水化物部位に共有結合を介し て結合したメトトレクセイト、３′，５′−ジクロロメトトレクセイト、アミノ プテリン、３′，５′−ジクロロアミノプテリン、５，８−ジデアザメトトレク セイト、５，８−ジデアザ−５，６，７，８−テトラヒドロメトトレクセイト、 ５，８−ジデアザ−５，６，７，８，−テトラヒドロアミノプテリン、５，８， １０−トリデアザアミノプテリン、５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸および ８，１０−ジデアザアミノプテリンよりなる群から選ばれた葉酸類縁体のアミン 含有誘導体よりなり、該水溶性複合体が非複合化抗体または抗体フラグメントと 実質的に同一の免疫反応性および免疫特異性を有し、かつ該共有結合がイミン、 エナミン、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオ セミカルバゾンおよびそれらの還元形態よりなる群から選ばれたものであり、該 抗体−葉酸類縁体複合体が細胞性疾患に関連した部位と免疫反応的かつ免疫特異 的でありかつ該細胞性疾患に関連しない組織に対しては非免疫反応的かつ非免疫 特異的である医薬的有効量の水溶性の部位選択的結合抗体−葉酸類縁体複合体を 動物またはヒトに投与することとを特徴とする細胞性疾患の治療方法。 １８．アミン含有葉酸類縁体誘導体は、メトトレクセイトーガンマーヒドラジド 、メトトレクセイトーアルファーヒドラジド、３′，５′−ジクロロメトトレク セイトーガンマーヒドラジド、３′，５′−ジクロロメトトレクセイトーアルフ アーヒドラツド、メトトレクセイトーアルファーアルファーリシルーグリシルー グリシルーチロシルーヒドラシド、メトトレクセイトーガンマーチロシルヒドラ ジド、メトトレクセイトーアルファーアルファーリシルーヒドラジド、メトトレ クセイトーアルファーアルファーリシン、メトトレクセイトーアルファーアルフ ァーリシル−ε−アルギニン−グリシン−グリシン−チロシン、アミノプテリン −ガンマーヒドラジド、アミノプテリン−アルファーヒドラジド、３′，５′− ジクロロアミノプテリン−ガンマーヒドラジド、３′，５′−ジクロロアミノプ テリン−アルフアーヒドラツド、アミノプテリン−アルファーアルファーリシル ーグリシルーグリシルーチロシルーヒドラジド、アミノプテリン−ガンマーチロ シルヒドラジド、アミノプテリン−アルファーアルファーリシルヒドラジド、ア ミノプテリン−アルファーアルファーリシンおよびアミノプテリン−アルファー アルファーリシル−ε−アルギニン−グリシン−グリシン−チロシンよりなる群 から選ばれたものである請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーガンマーヒドラジドである請 求の範囲第１７項に記載の方法。 ２０．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーアルファーヒドラジドである 請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２１．アミン含有葉酸類縁体がアミノプテリン−ガンマーヒドラジドである請求 の範囲第１７項に記載の方法。 ２２．アミン含有葉酸類縁体がアミノプテリン−アルファーヒドラジドである請 求の範囲第１７項に記載の方法。 ２３．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーアルファーアルファーリシル ーグリシルーグリシルーチロシルーヒドラジドである請求の範囲第１７項に記載 の方法。 ２４．アミン含有葉酸類縁体がメトトレクセイトーアルフアーアルファーリシン である請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２５．（ａ）保護されたカルボキシル基および遊離のカルボキシル基を有するＮ −保護Ｌ−グルタミン酸を、第一級アミン、第二級アミン、アルコキシアミン、 ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミ カルバジドよりなる群から選ばれた反応性アミンまたは保護反応性アミンを含有 する部位と反応させて反応性アミンまたは保護反応性アミンを含有するＮ−保護 Ｌ−グルタミン酸を形成し、 （ｂ）工程（ａ）で生成したＮ−保護Ｌ−グルタミン酸誘導体からＮ−保護基を 除去して遊離のアルファーアミノ基を有する反応性基または保護された反応性基 を有するＬ−グルタミン酸誘導体を形成し、 （ｃ）工程（ｂ）で生成したＬ−グルタミン酸誘導体のアルファーアミノ基を、 カルボキシル基が公知のカルボキシル活性化剤により活性化されている４−アミ ノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテリル酸または４−アミノ−４−デオキシ −Ｎ１０−ホルミルプテリル酸のカルボキシル基と反応させ、かつ （ｄ）いかなる保護基をも除去して第一級アミン、第二級アミン、アルコキシア ミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルしドラジン、セミカルバジドおびチオ セミカルバジドよりなる群から選ばれた反応性アミンを含有するメトトレクセイ トまたはアミノプテリンの反応性アミン含有水溶性誘導体を形成する ことを特徴とする葉酸類縁体の治療的に有効なアミン誘導体の合成方法。 ２６．工程（ａ）で使用されるＮ−保護Ｌ−グルタミン酸の保護カルボキシル基 がアルファーカルボキシル基であり、また工程（ｂ）で生成するＬ−グルタミン 酸誘導体の遊離のアルファーアミノ基が４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メ チルプテリル酸の活性化カルボキシル基と反応してメトトレクセイトーガンマー ヒドラジドを形成してなる請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７．工程（ａ）使用されるＮ−保護Ｌ−グルタミン酸の保護カルボキシル基が ガンマーカルボキシル基であり、また工程（ｂ）で生成するＬ−グルタミン酸誘 導体の遊離のアルファーアミノ基が４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチル プテリル酸の活性化カルボキシル基と反応してメトトレクセイトーアルファーヒ ドラジドを形成してなる請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２８．工程（ａ）で使用されるＮ−保護Ｌ−グルタミン酸の保護カルボキシル基 がアルファーカルボキシル基であり、また工程（ｂ）で生成するＬ−グルタミン 酸誘導体の遊離のアルファーアミノ基が４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−ホ ルミルプテリル酸の活性化カルボキシル基と反応してアミノプテリン−ガンマー ヒドラジドを形成してなる請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２９．工程（ａ）で使用されるＮ−保護Ｌ−グルタミン酸の保護カルボキシル基 がガンマーカルボキシル基であり、また工程（ｂ）で生成するＬ−グルタミン酸 誘導体の遊離のアルフアーアミノ基が４−ノ−４−デオキシ−Ｎ１０−ホルミル プテリル酸と反応してアミノプテリン−アルファーヒドラジドを形成してなる請 求の範囲第２５項に記載の方法。 ３０．アミノプテリン−ガンマーヒドラジド。 ３１．アミノプテリン−アルファーヒドラジド。 ３２．メトトレクセイトーアルファーアルファーリシルーグリシルーグリシルー チロシルヒドラジド。 ３３．メトトレクセイトーアルファーヒドラジド。