JP2563726B2 - 本質的に純粋なヒト副甲状腺ホルモン - Google Patents
本質的に純粋なヒト副甲状腺ホルモンInfo
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Description
係る。
々の生理的作用を有する副甲状腺のタンパク産物であ
る。特に重要な臨床作用は骨組織に対する同化作用であ
り、PTH療法は骨粗鬆症の進行を遅らせるか又は逆行
させることができ、関連骨疾患の治療に有益である。
立ち、多くの理由で本質的に純粋な形態でタンパク質を
提供することが必要である。例えば、本質的に純粋なP
THを臨床使用すると、PTHのみに起因し且つ構造的
に関連する汚染物質には起因しない効果を観察すること
ができる。更に、本質的に純粋形態のhPTHが得られ
るならば、より高い比活性即ちhPTH単位量当たり最
高の力価が得られ、所与の適応症を治療するために投与
する用量を最小限にすることができる。更に、汚染物質
を除去すると、骨粗鬆症のような慢性病を治療するため
にPHTを使用する際に特に重要である副作用の危険を
効果的に少なくすることができる。
分析するために現在使用されている1つの方法は、逆相
高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)であ
る。他のHPLC技術と同様に、逆相法は、特定のタン
パク質がシリカミクロスフェアのベッド中を移動する速
度の可変性を利用する。一方、逆相HPLC技術ではア
ルキル化シリカミクロスフェアを使用し、タンパク質電
荷を利用して分離を行う2相溶媒系を用いてタンパク質
を移動させる。最も典型的には溶媒系は、水相と、典型
的にはアセトニトリル及び(例えばトリフルオロ酢酸
(TFA)のような)イオン対生成剤(ion−pai
ring agent)(電荷改変剤としても知られ
る)を含む有機相とから構成され、水相と有機相との相
対割合はタンパク質サンプルがカラム中を移動するに従
って自動ブレンドにより勾配的に変化する。この方法に
より分析した場合、ただ1種の検出可能なタンパク質種
(214nm又は280nmでUV吸光度により測定)
が分析されるタンパク質調製物は1種のタンパク質種か
ら構成されるとみなされ、従って、本質的に純粋なタン
パク質として特徴付けられる。この純度を示すタンパク
質は場合により「HPLCグレード」のものとして特徴
付けられる。
たヒトPTHを精製し、その純度を決定するために使用
されている。ペプチド合成技術を適用することにより、
Biochem.Biophys.Res.Commu
n., 1983, 114(2):493に報告され
ているようにKimuraらにより合成ヒトPTHが製
造され、Bachem Inc.(1987−1988
カタログ#PCAL175)から市販されている。この
供給者によるとヒトPTH産物は、イオン対生成剤とし
てのTFAの存在下でアセトニトリル及び水を使用する
逆相HPLCにより分析した場合に99%以上の純度を
有する。
細菌宿主からHPLCグレードのヒトPTHが回収され
ている。例えば、Hogsetら(J.Biol.Ch
em., 1990, 265(13):7338)
は、大腸菌形質転換細胞からのヒトPTHの分泌につい
て記載している。こうして産生されたヒトPTHは培養
ブロス濾液中に回収され、イオン交換クロマトグラフィ
ーにかけられ、その後、イオン対生成剤としてTFAを
補充した従来の水/アセトニトリル溶媒系を使用する逆
相HPLCにより分画される。大腸菌から産生されるヒ
トPTHは、RabbaniらによりJ.Biol.C
hem., 1988, 263(3):1307に記
載されているように細胞内産物としても産生されてい
る。酸抽出したPTHを、慣用アセトニトリル/TFA
溶媒系を使用するRP−HPLCにかけ、その後、主ピ
ークをゲル濾過し、イオン対生成剤としてヘプタフルオ
ロ酪酸(HFBA)を補充した水/アセトニトリル溶媒
系を使用して再び別個に逆相HPLCにかけた。HFB
Aはトリフルオロ酢酸と同様に、アニオン性イオン対生
成剤の種類の別の構成員である。こうして分画した材料
を次にTFAを用いて再びRP−HPLC分画にかけ、
その後、ゲル濾過カラムに通した後、最終的に収集して
HPLCグレードPTHを得た。Sungらも同様にヒ
トPTHの大腸菌による産生を報告している(J.Bi
ol.Chem., 1991, 266(5):28
31参照)。これらの著者は、TFAを補充した従来の
アセトニトリル/水溶媒系を使用するRP−HPLCに
よりヒトPTH産物を精製した。
Cグレードの純度を示すPTH組成物は、実際に、より
高感度のキャピラリー電気泳動(CE)分析技術により
検出可能なタンパク質不純物を含有することがここに知
見された。従って本発明の目的は、キャピラリー電気泳
動により検出可能なタンパク質汚染物質を本質的に含ま
ない形態のヒトPTHを提供することである。本発明の
別の目的は、本質的に純粋形態でヒトPTHを得るため
の方法を提供することである。本発明の更に別の目的
は、本質的に純粋なヒトPTHを含有する医薬組成物を
提供することである。
泳動分析により決定した場合に本質的にタンパク質汚染
物質を含有しない形態のヒトPTHを提供する。キャピ
ラリー電気泳動技術は、従来適用されているHPLC分
析により純粋であると判断されるヒトPTH調製物中の
不純物を検出することができ、PTH純度のより高感度
な測定手段を提供する。
Hから構成され且つキャピラリー電気泳動により検出可
能なタンパク質汚染物質を本質的に含まない組成物が提
供される。本発明のこの態様の特定の実施態様による
と、本質的に純粋なヒトPTHは凍結乾燥形態で提供さ
れる。
THを医薬上許容可能なキャリヤーと配合する段階を含
む、医薬組成物の製造方法が提供される。本発明の関連
態様によると、純粋なPTHと医薬上許容可能なキャリ
ヤーとを含有する、骨粗鬆症の治療に有用な医薬組成物
が提供される。本発明のこの態様の特定の実施態様によ
ると、医薬組成物は該組成物中に含まれるPTHの酸化
安定性を強化するために有効な量の還元剤を更に含有す
る。組成物は更に必要に応じて第2の治療剤を含有し得
る。
製方法が提供され、該方法は、部分的に精製されたヒト
PTH調製物をカチオン性イオン対生成剤の存在下で逆
相HPLCにより分画し、調製物中に存在するタンパク
質汚染物質からヒトPTHを分離する段階と、その後、
本質的に純粋なヒトPTHを収集する段階とを含む。
面を参照しながら詳細に説明する。
能なタンパク質汚染物質(即ち夾雑物)を本質的に含有
しない形態のヒトPTHに係る。簡単にするために、本
明細書中ではこの純度を示すPTHを、場合により「C
Eグレード」のヒトPTH又は「本質的に純粋な」ヒト
PTHと呼称する。
TH」及び「ヒト副甲状腺ホルモン」なる用語は、下記
の配列で示されるアミド結合により配列される84個の
αアミノ酸残基から本質的に構成される非グリコシル化
タンパク質に関して交換可能に使用される。
類に大幅に依存してわずかな構造変化が存在し得ること
は予想されよう。細胞由来ヒトPTH、即ち副甲状腺組
織又は微生物供給源に由来するhPTHは、少量割合の
例えばC末端アミド化タンパク質又はC末端切断(tr
uncated)タンパク質を含有し得る。他方、合成
に由来するヒトPTHは、修飾されたα炭素側鎖を有す
るアミノ酸を含む少量割合のPTH分子を含み得る。C
EグレードのヒトPTHは、当然キャピラリー電気泳動
分析により検出不能であるほど少量存在するという条件
で、このような修飾を有するPTH分子を含み得る。
具体的には、キャピラリー電気泳動分析にかけた場合に
214nmでの単一の吸光度ピークとしての移動により
特徴付けられ得る。キャピラリー電気泳動技術は、Go
rdonらによりScience, 1988, 24
2:224により一般的に論じられているように、非常
に小さい孔径を有するキャピラリー内で質量/電荷比に
基づいてタンパク質を分離する。要約するならば、分析
すべきタンパク質調製物の水性サンプルを減圧によりキ
ャピラリー内に吸引し、電場にかけた後、望ましくは2
14nmでの吸光度を検出することによりキャピラリー
中のタンパク質種の移動を監視する。特にヒトPTHの
場合、タンパク質種はリン酸により約pH2に緩衝され
た水性ビヒクル中に約0.2mg/ml〜約1.0mg
/mlを含有する調製物を使用すると適切に分離され
る。サンプルを吸引する速度は均一であるが、汚染物質
が存在する場合は検出可能な量を充填するようにサンプ
ルの初期純度に依存して2〜10秒間サンプルの吸引を
維持することが望ましい。
本質的に純粋なヒトPTHは、例えばRabbaniら
によりEndocrinology, 1988, 1
23:2709により記載されているUMR 106に
よるアデニル酸シクラーゼアッセイで決定した場合に2
nM以下の極めて低いEC50、即ち約1.0±0.2
nMのEC50を示すことを特徴とする。比較のため
に、Rabbaniらの前出の文献により記載されてい
るようにして得られたHPLCグレードのPTHは、こ
のアッセイで3nM以上のEC50を有すると述べられ
ている。このinvitroバイオアッセイは、所与の
PTH調製物がUMR−106系のラット骨粗鬆症細胞
内でのアデニル酸シクラーゼ産生を刺激する程度を定量
的に測定する。本明細書中において「EC50」なる用
語は、UMR〜106を用いるアデニル酸シクラーゼア
ッセイで半最大応答(half−maximal re
sponse)を誘導するために必要な所与のhPTH
調製物の濃度(モル濃度として測定)を意味する。
スプレー質量分析法により決定した場合に9424±
1.4ダルトンの分子量、即ち理論的分子量である94
24.7に実質的に等価の分子量を有することを特徴と
する。
精製されたヒトPTH調製物をカチオン性イオン対生成
剤の存在下で逆相高性能液体クロマトグラフィーにかけ
ることにより得られる。当業者であれば、RP−HPL
Cによりタンパク質分離を達成するために従来使用され
ているイオン対生成剤として、ヘプタフルオロ酪酸(H
FBA)、より一般的にはトリフルオロ酢酸(TFA)
のようなアニオン性改変剤を挙げることが予想されよ
う。しかしながら、本明細書中に示すように、これらの
イオン対生成剤、特にHFBAは、クロマトグラフィー
カラムから溶出するヒトPTHをタンパク質汚染物質か
ら別に収集できるように、構造的に関連するタンパク質
汚染物質からヒトPTHを分離するために必要な分離能
を提供しない。カチオン性イオン対生成剤、特にアミン
をベースとするイオン対生成剤(「電荷改変剤(cha
rge modifiers)」としても知られる)
は、この分離能を提供するのに最適な電荷特性を有する
ことが知見された。
されたPTHの調製物をカチオン性イオン対生成剤の存
在下で逆相高性能液体クロマトグラフィーにより分画す
る段階を含む、本質的に純粋なヒトPTHの製造方法に
ある。その後、隣接するより小さいタンパク質ピークと
して現れる汚染物質を排除して(280nm、又はより
好ましくは214nmでの吸光度により決定されるよう
に)カラム中を移動する主タンパク質ピークを選択的に
収集することにより、本質的に純粋なPTHを回収す
る。
ては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチ
ルアミン及びジプロピルアミンのようなジ−及びトリ−
低級アルキルアミンを含むアミンをベースとする物質を
挙げることができる。イオン対生成剤は塩形態で使用す
ると特に好適であり、トリエチルアミンとリン酸を混合
することにより製造されるリン酸トリエチルアミンがこ
の点で好適である。更に、メタノール、プロパノール又
はイソプロパノールのようなアルカノール溶媒中、必要
に応じてギ酸のような有機酸中で、場合により塩形態の
イオン対生成剤を調製してもよい。
を使用する場合、PTH精製工程の最終段階として、逆
相HPLCカラムから収集した物質を脱塩することによ
りイオン対生成剤を除去することが望ましい。脱塩は、
収集したサンプルをゲル濾過、限外濾過、又は逆相HP
LCのような種々の適切な脱塩方法のいずれか1種にか
けることにより実施することができ、逆相HPLCでは
従来のイオン対生成剤であるトリフルオロ酢酸(TF
A)及びヘプタフルオロ酢酸(HFBA)のような揮発
性イオン対生成剤を使用する。
合し、他のイオン対生成剤を使用する場合に一般的な方
法でRP−HPLC精製法を実施する。HPLC稼動中
に濃度勾配を形成するようにブレンドすべき2種の溶媒
溶液、即ち水及びアミンをベースとするイオン対生成剤
を含有する「溶媒A」溶液と、水、アミンをベースとす
るイオン対生成剤、及びアセトニトリル、メタノール又
は1−プロパノールのような有機成分約80%を含有す
る「溶媒B」溶液とをまず調製する。最良の結果はアセ
トニトリルを使用することにより得られる。各溶媒は従
来のプロトコルに従って、市販のHPLCグレードの試
薬を混合し、次いで例えば0.45μmフィルターで濾
過した後、脱ガスして酸素を除去することにより調製さ
れる。
オン対生成剤として使用する場合、0.05〜1.0容
量%のTEAPの溶媒濃度を使用することができ、最良
の分離は約0.4容量%のTEAPで達せられる。従っ
て本発明の特に好適な実施態様によると、PTH精製は
0.4%トリエチルアミン及び0.4%リン酸(85
%)を100%の水に加えることにより構成される溶媒
Aと、0.4%トリエチルアミン及びpHを溶媒Aと等
しくするために十分な量、一般に約0.4%のリン酸
(85%)を80%のアセトニトリルに加えることによ
り構成される溶媒Bとを溶媒溶液として使用する逆相H
PLCにより得られる。
加とは別に、実質的に純粋なヒトPTHを含有する調製
物の分画は、逆相HPLC技術(例えばCRC Han
dbook of HPLC for the Sep
aration of Amino Acids, P
eptides and Proteins, Vol
ume 1, 1984, CRC Press In
c.)に一般的な方法で市販のHPLC装置を使用して
実施され得る。分画に使用されるカラムには、例えばC
4〜C18の範囲の均一な長さのアルキル基を有するシ
リカビーズを充填してもよく、PTH分離にはC18が
好適である。約5μmの均一寸法及び約300Åの孔径
を有するC18ビーズを充填したカラムがPTH精製に
好適であることが知見された。このようなカラムはRa
inin InstrumentCo., Inc.
(Woburn, MA)からHPLC機械に組み込む
ためのカートリッジとして商品名Dynamaxで市販
されている。
その後、必要に応じて溶媒A及びBの相対ブレンド比を
調節することにより、実質的に精製されたPTHを分画
する。100%溶媒Aから100%溶媒Bまでの直線勾
配を形成することが可能であるが、PTH分画のために
より望ましい濃度勾配は、70%A/30%Bから40
%A/60%Bを経て70%A/30%Bに戻る勾配か
ら構成されることが判明した。この勾配は理想的には注
入時間1分につき約1mlの溶媒の流速を使用して達成
される。これらの条件下で、本質的に純粋なPTHは約
26分で約35%アセトニトリル中で溶出する。
使用する利点は、従来通りにHPLCカラム中のタンパ
ク質の移動を214nmでの吸光度により監視する場合
に得られる。図面に示すように、注入されるPTHサン
プル中の汚染物質は単一の大きい吸光度ピークとして移
動するPTHから分離される。こうして、カラム移動中
にPTHから分離する他の物質を排除し、本質的に純粋
なPTHを溶離液の別のフラクションとして収集するこ
とができる。好ましくはPTHの酸化的失活を避けるた
めに収集直後に逆相HPLカラムから溶出する本質的に
純粋なPTHを従来通りに凍結乾燥さてもよい。
ら、治療用に調合する。即ち、所望量、例えば単位用量
のPTHを発熱物質を含まない滅菌水性賦形剤と混合す
ることにより、このようなPTHを含有する医薬組成物
を調製することができる。酸化を防ぎ、貯蔵寿命を増加
するために必要に応じてシステインのような還元剤を水
性PTH組成物に補充してもよい。また、PTHは酸性
環境のほうが安定であるので、例えば酢酸を使用して水
性賦形剤を酸性化してもよい。更に、必要に応じて所定
量の第2の治療剤を医薬組成物に補充してもよい。例え
ば、骨治療用としては米国特許第4698328号に記
載されているように有効量のカルシウム塩又はビタミン
D類似物を配合することができる。
用すると、これとは別のより低レベルの純度を有する組
成物中に存在する汚染物質により誘導され得る副作用及
び免疫原性を低下させ、所与の生理学的応答を誘導する
ために必要なPTHの量を減少できるという顕著な利点
が得られると予想される。
織、PTHの微生物源及び合成源からの抽出を含む種々
の技術により得られるPTH組成物に適用できることも
理解されよう。一般に、このような供給源から単離され
るPTHは、部分的に精製された形態で得られ、即ち本
発明の逆相HPLC方法にかける前に少なくとも1回の
カラム分画段階にかけられる。例えば細菌のような微生
物源から得られる場合、微生物抽出物をまず最初に例え
ば酸抽出又は硫酸アンモニウム沈殿によりPTHを濃縮
するように処理し、処理したサンプルをその後、PTH
濃縮(enrichment)に有用な種々の分画技術
のいずれかにかけることが望ましい。例えば、S−Se
pharoseもしくはMono−Sカラム等を使用す
るイオン交換クロマトグラフィー、又は例えばフェニル
−Sepharoseカラムを使用する疎水性相互作用
クロマトグラフィーに粗PTHサンプルをかける。逆相
HPLCによる精製以前に粗サンプルのPTH含有量を
どの程度まで増加させるかは、PTHが産生される環境
に大幅に依存する。この点で、本発明の好適実施態様に
よると、PTH源は分泌(細胞質)又は排出(細胞外)
産物としてPTHを産生するように遺伝子工学により製
造された大腸菌形質転換細胞であることが望ましい。本
発明の特に好適な実施態様によるとPTH源は、例えば
参考資料として本明細書の一部に加え、以下に要約する
Wontらのヨーロッパ特許第357391号に記載さ
れているような細胞外産物としてPTHを産生する大腸
菌形質転換細胞である。
べる種々の供給源から得たPTHサンプルについて分析
及び精製を行った。
PTH材料は、参考資料として本明細書の一部に加える
1990年3月7日付けで公開されたヨーロッパ特許出
願公開第357391号中にWongとSutherl
andにより記載されているPTH製造システムを使用
することにより得た。要約すると、この製造システム
は、ompAシグナルペプチドを有するPTH前駆物質
の発現を誘導するためにtacプロモーターを使用し、
且つ、株を培養する培地に成熟ヒトPTHを排出する大
腸菌JM101株を産生宿主として利用する。RP−H
PLC分画に先立ち、この「排出(excrete
d)」PTHの実質的に純粋な調製物を次のように得
た。全ブロスのpHを氷酢酸で4.0から8.0に調整
し、その後、遠心分離により清澄化した。次にサンプル
を1リットル容S−Sepharoseカラム上に充填
し、まず4カラム容量の40mM酢酸アンモニウム緩衝
液、次いで6カラム容量の400nM酢酸アンモニウム
緩衝液で洗浄した。カラムを8カラム容量以上0.4M
〜1.0M酢酸アンモニウム緩衝液の勾配で溶離させ、
PTHを含むフラクション(PAGE分析により決定)
をプールした。
ションを次に5N水酸化ナトリウムでpH8.0に調整
し、70mlフェニル−Sepharoseカラム上に
充填した。カラムを7カラム容量の0.06M酢酸アン
モニウム緩衝液で洗浄した。カラムを10カラム容量以
上の0.6〜0.4M酢酸アンモニウム勾配で溶離させ
た。フラクションを集め、C−18逆相HPLC(アセ
トニトリル/TFA)及びポリアクリルアミドゲル電気
泳動によるアリコート試験に基づいてプールした。
フラクションを次にイオン対生成剤としてHFBAを使
用してC−18シリカ中でRP−HPLCにより分析し
た処、単一のピークタンパク質移動が検出され、成熟ヒ
トPTHが精製されたことが判明した(図2A)。
このPTH材料はSungらによりJ. Biol.C
hem., 1991, 266(5):2831に記
載されているように製造した。要約すると、これらの著
者により報告されているように、この製造システムはア
ミノペプチダーゼにより成熟ヒトPTHに内在的に転化
されるN−メチオニルPTHを製造するためにlacプ
ロモーターを使用する大腸菌Y1090株を宿主として
利用する。PTHを抽出するために、細胞を音波処理に
より破砕し、遠心分離により細胞破片を除去後、酸抽出
により粗PTHを回収した。抽出したPTHを水酸化ナ
トリウムにより約pH4に調整し、カチオン交換体Mo
no−Sカラムで分画し、プールしたサンプルをその
後、TFAの存在下に逆相HPLCにより分画した。T
FAの存在下にHFBA中でRP−HPLCにより成熟
PTHの単一ピーク純度を分析決定した。
製造されるヒトPTHのサンプルはBachem In
c.(1987−1988カタログ#PCAL175)
から購入した。供給者により明示されているサンプル仕
様によると、PTHはイオン対生成剤として0.1%T
FAを使用するRP−HPLCにより分析した場合に9
9%以上の純度を有すると決定された。
TH純度の分析。
られたサンプルが純粋なヒトPTHを示すことが判明し
たので、より高感度の分析技術であるキャピラリー電気
泳動を使用してサンプルを分析した。この目的で、Ap
plied Biosystemsから市販されている
キャピラリー電気泳動装置Model#270を使用し
た。HFBAを用いるHPLC精製から回収した、0.
2mg/ml〜1.0mg/mlの濃度のPTHを含有
するPTHサンプルをサンプルチューブに入れ、100
mMリン酸緩衝液で予め平衡化しておいたキャピラリー
カラム中に吸引した。キャピラリー内で分離を行うため
に使用した条件は電圧+20Kvとし、サンプルを2〜
10秒間減圧吸引により充填した。
用いる逆相HPLCにより分析した場合に純粋であると
みなされるPTHサンプルは実際に、キャピラリー電気
泳動(CE)により分析した場合に検出可能な種々の種
類の汚染物質を含有する。図1Aは例えば、HFBA中
で単一HPLCピークとして移動する大腸菌排出PTH
サンプルのCEプロフィル(214nmでの吸光度)を
示す。CEプロフィルにはヒトPTH主ピークの前に溶
出する従来未検出の4つの小さいピークと、いくつかの
トレーリングピーク(trailing peaks)
が認められる。CE分析により推定されるサンプルの純
度は約90%(マーカーピークを含む)である。同様
に、RP−HPLC/TFAにより単一ピークとして移
動する大腸菌産生細胞内PTH(図1C)では、CEプ
ロフィルは、PTH主ピークより前に溶出する3つの小
さいピークと、小さいトレーリングピークを示し、全体
の純度計算値は97.8%である。更に、合成PTH
(図1B)は、大きい不均一の主ピークと、前縁部の視
覚化可能な小さいピークと示すCE移動パターンを形成
し、全体の純度は89%以下であった。大きいピークに
は非脱保護アミノ酸残基を有する複数のPTH種が存在
すると予想される。
生成剤を使用するRP−HPLCによるヒトPTHの精
製。
Sepharoseで分画後に大腸菌排出ヒトPTH
(Wongら,上掲)のサンプルを得た。フェニル−S
epharoseカラムから回収したサンプルをリン酸
添加によりpH8からpH4に調整し、pH調整したサ
ンプル200μlをHPLC装置(Waters HP
LCシステム: 721 Data Module,
730 Gradient Programmer、5
10 HPLCポンプ2個、U6Kマニュアルインジェ
クター、440可変波長デテクター)に注入した。Ra
ininから商品名Dynamaxで市販されている5
μm C−18シリカビーズ(4.1×25cm, 孔
径300Å)を充填したカラムを装置に組み込んだ。溶
媒A及びBは、100%水(A)及び80%アセトニト
リル(B)に各々0.4%トリエチルアミン及び0.4
%リン酸を補充した。自動調節される流速は1ml/m
inとし、溶媒は指示時間(分)の間以下のようにブレ
ンドされた。
で溶出し、イオン対生成剤としてHFBAを使用した場
合に従来では検出されなかった汚染物質から十分に分離
された。この主吸光度ピークをその後のキャピラリー電
気泳動分析のために集め、TEAPを用いて同様に操作
した。RP−HPLCは上記に従った。図2はこれらの
HPLC分析の結果を示し、HFBA(図2A)に対す
るTEAP(図2B)の分離能と、同様にCEにより単
一ピーク(図3)として特徴付けられるHPLCグレー
ド(単一ピーク)のヒトPTH(図2C)を得る能力を
示す。
条件下でTEAPを用いるHPLC精製にかけた。クロ
マトグラム(図示せず)によると、TFA中の分画によ
り分離されない汚染物質の2つのリーディングピークが
確認された。
生成剤を使用するRP−HPLC前後のヒトPTH純度
の分析。
施例2に記載したように得たTEAP精製PTHを実施
例1に記載した条件下でキャピラリー電気泳動により分
析した。図3は比較結果を示し、HFPA精製材料(図
3A)は複数の吸光度ピーク(214nm)を有してお
り、TEAP精製等価物(図3B)は単一の吸光度ピー
ク(214nm)を有している。
(1B)及び細胞内細菌PTH(1C)の各起源から得
られるHPLCグレードのPTHサンプルのCEプロフ
ィルを示す。
の存在下におけるPTHサンプルのHPLCプロフィル
を示す。
相HPLCにより分画したPTHサンプルのCEプロフ
ィルを示す。
Claims (19)
- 【請求項1】 部分的に精製されたヒト副甲状腺ホルモ
ン調製物をカチオン性イオン対生成剤の存在下で逆相高
性能液体クロマトグラフィーにより分画する段階を含む
ことを特徴とする、ヒト副甲状腺ホルモンの精製方法。 - 【請求項2】 カチオン性イオン対生成剤がアミンをベ
ースとするイオン対生成剤であることを特徴とする請求
項1に記載の方法。 - 【請求項3】 アミンをベースとするイオン対生成剤が
トリエチルアミン又はその塩であることを特徴とする請
求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 アミンをベースとするイオン対生成剤が
リン酸トリエチルアミンであることを特徴とする請求項
3に記載の方法。 - 【請求項5】 部分的に精製された副甲状腺ホルモン調
製物がヒト副甲状腺ホルモンの微生物供給源から得られ
ることを特徴とする請求項3に記載の方法 - 【請求項6】 ヒト副甲状腺ホルモンの微生物供給源が
ヒト副甲状腺ホルモンの細菌供給源であることを特徴と
する請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 ヒト副甲状腺ホルモンの細菌供給源がヒ
ト副甲状腺ホルモンの大腸菌供給源であることを特徴と
する請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】 (i)大腸菌から産生されたヒト副甲状
腺ホルモンの部分的に精製された調製物を得る段階と、
(ii)部分的に精製された調製物をトリエチルアミン
又はその塩の存在下で逆相高性能液体クロマトグラフィ
ーにより分画する段階と、(iii)クロマトグラフィ
ー段階後に本質的に純粋なヒト副甲状腺ホルモンを収集
する段階とを含むことを特徴とする本質的に純粋なヒト
副甲状腺ホルモンの製造方法。 - 【請求項9】 収集したヒト副甲状腺ホルモンを凍結乾
燥する段階を更に含むことを特徴とする請求項8に記載
の方法。 - 【請求項10】 214nmでキャピラリー電気泳動に
より分析した場合に単一ピーク移動を示し、UMR 1
06によるアデニル酸シクラーゼアッセイで決定したE
C50が2nM以下であることを特徴とする本質的に純
粋なヒト副甲状腺ホルモン。 - 【請求項11】 キャピラリー電気泳動による分析を、
ヒト副甲状腺ホルモ ン濃度が0.2−1.0mg/m
l,電圧+20kVで、100mMリン酸緩衝液中で行
なうことを特徴とする請求項10に記載の本質的に純粋
なヒト副甲状腺ホルモン。 - 【請求項12】 EC50値が約1.0±0.2nMで
ある請求項10に記載の本質的に純粋なヒト副甲状腺ホ
ルモン。 - 【請求項13】 請求項1ないし7のいずれかに記載の
方法により得られる、請求項10に記載の本質的に純粋
なヒト副甲状腺ホルモン。 - 【請求項14】 請求項8または9に記載の方法により
得られる、請求項10に記載の本質的に純粋なヒト副甲
状腺ホルモン。 - 【請求項15】 請求項10に記載の本質的に純粋なヒ
ト副甲状腺ホルモンを医薬上許容可能なキャリヤーと配
合する段階を含むことを特徴とする骨形成のために有用
な医薬組成物の製造方法。 - 【請求項16】 治療上有効量の請求項10に記載の本
質的に純粋なヒト副甲状腺ホルモンと、医薬上許容可能
なキャリヤーとを含有する、骨形成のために有用な医薬
組成物。 - 【請求項17】 前記キャリヤーが水性賦形剤であるこ
とを特徴とする請求項16に記載の医薬組成物。 - 【請求項18】 安定性を増進する量の還元剤を更に含
有することを特徴とする請求項17に記載の医薬組成
物。 - 【請求項19】 第2の治療剤をさらに含有することを
特徴とする請求項16に記載の医薬組成物。
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