FI106802B - Olennaisesti puhdas ihmisen lisäkilpirauhashormoni - Google Patents
Olennaisesti puhdas ihmisen lisäkilpirauhashormoni Download PDFInfo
- Publication number
- FI106802B FI106802B FI922356A FI922356A FI106802B FI 106802 B FI106802 B FI 106802B FI 922356 A FI922356 A FI 922356A FI 922356 A FI922356 A FI 922356A FI 106802 B FI106802 B FI 106802B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- pth
- parathyroid hormone
- human parathyroid
- preparation
- substantially pure
- Prior art date
Links
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 90
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 32
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 26
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 13
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 claims description 4
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims 2
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 claims 1
- -1 cationic ion Chemical class 0.000 claims 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 1
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 88
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 31
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 23
- YPJUNDFVDDCYIH-UHFFFAOYSA-N perfluorobutyric acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F YPJUNDFVDDCYIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 5
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 229940086542 triethylamine Drugs 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N chembl252518 Chemical compound C([C@@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2O[C@H](O)[C@@H]4C BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JSMYHXFFKXKZRN-SBMIAAHKSA-N (2s,3s,4s)-3-(carboxymethyl)-4-(2-hydroxyphenyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)NC[C@@H]1C1=CC=CC=C1O JSMYHXFFKXKZRN-SBMIAAHKSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091005598 amidated proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- WEHWNAOGRSTTBQ-UHFFFAOYSA-N dipropylamine Chemical compound CCCNCCC WEHWNAOGRSTTBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
106802
Olennaisesti puhdas ihmisen lisäkilpirauhashormoni
Ihmisen lisäkilpirauhashormoni eli hPTH (human parathyroid hor-5 mone) on lisäkilpirauhasen proteiinituote, jolla on erilaisia fysiologisia vaikutuksia. Kliinisesti erityisen merkittävää on tämän hormonin anabolinen vaikutus luukudokseen sekä se mahdollisuus, että PTH-hoidolla voidaan hidastaa luukatoa (osteoporosis) tai kääntää sen eteneminen, ja että tästä hormonista on 10 hyötyä muiden samankaltaisten luuhäiriöiden hoidossa.
Ennen hPTH:n käyttöä farmaseuttisena tuotteena tämän proteiinin saattaminen olennaisesti puhtaaseen muotoon on välttämätöntä useista syistä. Esimerkiksi, olennaisesti puhtaan PTH:n käyttö 15 kliinisissä kokeissa tekee mahdolliseksi havainnot, joiden tiedetään aiheutuvan ainoastaan PTH:sta eikä jostakin rakenteellisesti samankaltaisesta kontaminantista. Samoin olennaisesti puhtaassa muodossa saadun hPTH:n saanti takaa suuremman omi-naisaktiivisuuden, eli suurimman tehokkuuden hPTH:n yksikkömää-20 rää kohden, jolloin mahdollisimman pieniä annoskokoja voidaan käyttää tiettyjen taudinsyiden hoitoon. Edelleen, kontaminant-tien poistaminen vähentää tehokkaasti sivuvaikutusten mahdollisuutta, mikä on erityisen tärkeätä·, kun PTH:ta käytetään kroonisten sairauksien kuten luukadon hoitoon.
25
Eräs tällä hetkellä käytössä oleva menetelmä proteiinien puhdistamiseksi ja proteiinien puhtauden analysoimiseksi on kään-teisfaasiin perustuva suuren suorituskyvyn nestekromatografia (RP-HPLC). Samoin kuin muutkin HPLC-tekniikat, tässä käänteis-30 faasiin perustuvassa menetelmässä käytetään hyväksi niissä nopeuksissa, joilla erityiset proteiinit kulkevat silikamikropal- - : · : loista muodostuvan petin läpi, esiintyviä eroja. Tässä kään- teisfaasiin perustuvassa HPLC-tekniikassa käytetään kuitenkin alkyloituja silikamikropalloja, ja petin läpi kulkevat proteii-35 nit joutuvat kosketukseen kaksi faasia käsittävän liuotinjär-jestelmän kanssa, joka järjestelmä käyttää hyväksi proteiinin varausta ja korostaa erottumista. Tyypillisimmillään liuotin- 2 106802 järjestelmä koostuu vesifaasista ja orgaanisesta faasista, joka sisältää tyypillisesti asetonitriiliä sekä ioniparin muodostavaa ainetta (joka tunnetaan myös varauksen muokkaajana) kuten trifluorietikkahappoa (TFA), joiden komponenttien suhteellisia 5 osuuksia muutetaan gradienttimaisesti automaattista sekoitusta hyväksikäyttäen, proteiininäytteen kulkiessa kolonnin läpi.
Tällä tekniikalla analysoitaessa proteiinivalmisteen, josta paljastuu vain yksi ilmaistava proteiinilaji (mitattuna UV-ab-sorbanssina joko aallonpituudella 214 nm tai 280 nm), katsotaan 10 koostuvan vain yhdestä proteiinilajista ja näin ollen se luonnehditaan olennaisesti puhtaaksi proteiiniksi. Tällä tavalla puhtaita proteiineja luonnehditaan joskus "HPLC-laatua oleviksi" proteiineiksi.
15 Käänteisfaasiin perustuvaa HPLC-tekniikkaa on käytetty eri lähteistä saadun ihmis-PTH:n puhdistamiseen ja puhtauden määrittämiseen. Kimura et ai. ovat tuottaneet peptidisynteesitekniik-kaa käyttäen synteettistä ihmis-PTH:ta, kuten julkaisussa Bio-chem. Biophvs. Res. Commun.. 1983, 114(2) : 493 on kuvattu, ja 20 sitä on myös saatavana kaupallisesti yhtiöstä Bachem Inc.
(1987-1988 luettelo, numero PCAL175). Tämän toimittajan mukaan ihmis-PTH-tuotteen puhtaus on enemmän kuin 99 % käänteisfaasiin perustuvalla HPLC-tekniikalla analysoituna, käyttäen analyysissä asetonitriiliä ja vettä sekä ionipareja muodostavana 25 aineena TFA:ta.
Viime aikoina HPLC-laatuista ihmis-PTH:ta on saatu geneettisesti muunnetuista bakteeri-isännistä. Esimerkiksi julkaisussa Hogset et ai., J. Biol. Chem.. 1990, 265 (13):7338) on kuvattu 30 ihmis-PTH:n erittyminen E. coli-transformanteista. Tällä tavalla tuotettu PTH saadaan talteen elatusalustan suodoksesta, » -joka käsitellään ensin ioninvaihtokromatografisesti ja fraktioidaan sitten käänteisfaasiin perustuvalla HPLC-menetelmällä, käyttäen tavanomaista vesi/asetonitriili-liuotinjärjestelmää, 35 jota on täydennetty ionipareja muodostavana aineena toimivalla TFA:11a. Ihmis-PTH:ta on myös saatu E. coli-bakteerien avulla solun sisäisenä tuotteena, kuten julkaisussa Rabbani et ai., J_s_ 106802
Biol. Chem.. 1988, 263 (3): 1307, on kuvattu. Happouutettu PTH käsiteltiin RP-HPLC-menetelmällä käyttäen tavanomaista aseto-nitriili/TFA-liuotinjärjestelmää, ja’sitten suuret piikit gee-lisuodatettiin ja käsiteltiin vielä erikseen käänteisfaasiin 5 perustuvalla HPLC-menetelmällä, jossa käytettiin vesi/asetonit-riili-liuotinjärjestelmää, jota oli täydennetty ionipareja muodostavana aineena toimivalla heptafluorivoihapolla (HFBA). Tri-fluorietikkahapon tavoin HFBA on toinen, anionisten, ionipareja muodostavien aineiden luokkaan kuuluva jäsen. Tällä tavalla 10 fraktioitu materiaali käsiteltiin sitten uudestaan TFA:han perustuvalla RP-HPLC-fraktioinnilla ja otettiin lopulta talteen geelisuodatuskolonnin läpi johtamisen jälkeen, jolloin saatiin HLPC-laatuista PTH:ta. Julkaisussa Sung et ai., J. Biol. Chem.. 1991, 266 (5): 2831, on myös kuvattu ihmis-PTH:n tuottaminen EL 15 coli-bakteereiden avulla. Nämä kirjoittajat puhdistivat ihmis-PTH-tuotteen RP-HPLC-tekniikalla käyttäen tavanomaista aseto-nitriili/vesi-liuotinjärjestelmää, jota oli täydennetty TFA:11a.
20 Nyt ollaan kuitenkin todettu, että PTH-koostumukset, joiden puhtaus on HPLC-laatua, sisältävät itse asiassa sellaisia pro-teiiniepäpuhtauksia, jotka kyetään ilmaisemaan eräällä herkemmällä analyyttisillä tekniikalla eli kapillaarielektroforeesil-la (CE). Näin ollen oheisen keksinnön tavoitteena on saada ai-25 kaan ihmis-PTH:ta sellaisessa muodossa, joka ei sisällä olen-* · naisesti kapillaarielektroforeesilla ilmaistavia proteiinikon- taminantteja. Oheisen keksinnön toisena tavoitteena on saada aikaan menetelmä ihmis-PTH:n saamiseksi olennaisesti puhtaassa muodossa. Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada ai-30 kaan farmaseuttinen koostumus, joka sisältää olennaisesti puhdasta PTHcta.
" ·
Oheisessa keksinnössä saadaan aikaan ihmis-PTHrta olennaisesti puhtaassa muodossa, eli sellaisessa muodossa, joka ei sisällä 35 olennaisesti proteiinikontaminantteja kapillaarielektroforet-tisen analyysin perusteella. Kapillaarielektroforeesitekniikka on herkempi menetelmä PTH:n puhtauden mittaamiseksi, mikä näh- 106802 dään sen kyvystä ilmaista epäpuhtauksia ihmis-PTH-valmisteis-ta, jotka on todettu puhtaiksi perinteisellä HPLC-analyysillä.
Oheisen keksinnön erään piirteen mukaisesti aikaan saadaan 5 koostumus, joka koostuu puhtasta ihmis-PTH:sta, ja joka ei sisällä olennaisesti sellaisia proteiinikontaminantteja, jotka kyettäisiin ilmaisemaan kapillaarielektroforeettisesti. Keksinnön tämän piirteen eräässä erityisessä suoritusmuodossa tämä olennaisesti puhdas ihmis-PTH on lyofilisoidussa muodossa.
10
Oheisen keksinnön erään toisen piirteen mukaisesti aikaan saadaan menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheen, jossa puhdasta ihmis-PTH:ta yhdistetään farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Keksin-15 nön toisessa, samankaltaisessa suoritusmuodossa aikaan saadaan farmaseuttinen koostumus, joka käsittää puhdasta PTH:ta ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa. Oheisen keksinnön tämän piirteen erään erityisen suoritusmuodon mukaan tämä farmaseuttinen koostumus käsittää lisäksi pelkistävää ainetta määränä, 20 joka parantaa koostumuksen sisältämän PTH:n stabiilisuutta hapettumista vastaan. Koostumus voi myös sisältää toivottaessa toista hoitavaa ainetta.
Oheisen keksinnön erään muun piirteen mukaisesti aikaan saadaan 25 menetelmä ihmis-PTH:n puhdistamiseksi, joka menetelmän käsittä-: mässä vaiheessa osittain puhdistettu ihmis-PTH-valmiste frakti oidaan käänteisfaasiin perustuvalla HLPC-menetelmällä kationi-sen, ionipareja muodostavan aineen läsnäollessa ihmis-PTH:n erottamiseksi tämän valmisteen sisältämistä proteiinikontami-30 nanteista, minkä jälkeen olennaisesti puhdas ihmis-PTH otetaan talteen.
Keksinnön nämä ja muut piirteet kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisemmin liitteenä olevien piirustusten avulla, joissa:
Kuvio 1 esittää HPLC-laatua olevien PTH-näytteiden CE-profiile-ja, näiden näytteiden ollessa: erittynyt bakteeriperäinen PTH
35 106802 (IA), kaupallisesti saatava synteettinen PTH (IB) sekä solun sisäinen bakteeriperäinen PTH (1C);
Kuvio 2 esittää PTH-näytteen HPLC-profiilia, joka on saatu 5 HFBA:n (2A) ja TEAP:n (2B, 2C) läsnäollessa; sekä
Kuvio 3 esittää PTH-näytteen CE-profiilia, joka näyte on fraktioitu käänteisfaasiin perustuvalla HPLC-menetelmällä HFBAissa (3A) ja TEAP:ssa (3B).
10
Oheinen keksintö kohdistuu ihmis-PTH-proteiinin sellaiseen muotoon, joka ei sisällä olennaisesti kapillaarielektroforee-silla (CE) ilmaistavia proteiinikontaminantteja. Lyhyesti, puhtaudeltaan tällaista PTH:ta kutsutaan ohessa joskus "CE-15 laatua olevaksi" ihmis-PTH:ksi tai "olennaisesti puhtaaksi" ihmis-PTH:ksi.
Oheisessa kuvauksessa käsitteitä "hPTH", "ihmis-PTH" ja "ihmisen lisäkilpirauhashormoni" käytetään toistensa synonyymeinä 20 ja niillä viitataan glykosyloitumattomaan proteiiniin, joka koostuu olennaisesti 84 amidisidoksella sitoutuneesta alfa-aminohappo jäännöksestä seuraavassa järjestyksessä: H-Sel-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-2 5 Arg-Lys-Lys-Leu-Gin-Asp-Vai-His-Asn-Phe-Vai-AIa- • Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser-
Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Vai-Leu-'Vai-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Vai-Asn-Vai-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH 30
Proteiinikemiaa tunteville henkilöille on selvää, että raken-, teessä voi esiintyä pientä vaihtelua, riippuen suuresti ΡΊΉ- lähteen luonteesta. Esimerkiksi solusta peräisin oleva ihmis-PTH, eli hPTH, joka on saatu joko lisäkilpirauhasen kudoksesta 35 tai mikrobilähteistä, voi sisältää pienen osuuden C-päätteestä amidoitua proteiinia tai C-päätteestä katkennutta proteiinia. Toisaalta synteettisesti saatu ihmis-PTH voi sisältää pienen C v 6 106802 osuuden PTH-molekyylejä, joiden sisältämät aminohapot käsittävät alfa-hiilessä muokkautuneita sivuketjuja. CE-laatua oleva ihmis-PTH voi sisältää tällaisia muokkauksia käsittäviä PTH-molekyylejä, edellyttäen luonnollisestikin, että niitä on läsnä 5 niin pieninä määrinä, joita ei kyetä ilmaisemaan kapillaari-elektroforeesianalyysillä.
Oheisen keksinnön mukaisen, CE-laatua olevan ihmis-PTH:n tunnusomaisena piirteenä on erityisemmin se, että siitä saadaan 10 vain yksi absorbanssipiikki aallonpituudella 214 nm kapillaari-elektroforeesianalyysissä. Tässä kapillaarielektroforeesitek-niikassa proteiinit erotetaan massa/varaus-suhteen perusteella kapillaarissa, jonka käsittämän kanavan halkaisija on hyvin pieni, kuten julkaisussa Gordon et ai., Science. 1988, 242:224, 15 yleisesti esitetään. Lyhyesti, analysoitavan proteiinivalmisteen vesipitoiset näytteet imetään vakuumin avulla kapillaariin, johon kohdistetun sähkökentän seurauksena proteiinilajit kulkevat kapillaarin läpi, ja jota kapillaaria seurataan määrittämällä absorbanssi edullisesti aallonpituudella 214 nm.
20 Ihmis-PTH:n erikoistapauksessa proteiinilajien erottumiseen päästään sopivalla tavalla käyttäen valmisteita, joiden pitoisuus on noin 0,2-1,0 mg/ml vesipitoisessa kuljettimessa, joka on puskuroitu fosfaatilla noin pH-arvoon 2. Nopeus, jolla näytettä imetään, on tasainen, vaikka onkin toivottavaa, että näy-25 teimua ylläpidetään 2-10 sekuntia näytteen alkuperäisestä puh-? taudesta riippuen siten, että mahdollisesti läsnäolevia kon-taminantteja saadaan kapillaariin ilmaistavina määrinä.
Sen lisäksi, että oheisen keksinnön mukainen, olennaisesti puh-20 das ihmis-PTH on puhtaudeltaan CE-laatua, sen tunnusomaisena piirteenä on huomattavat pieni EC50-arvo, joka on korkeintaan v * kaksi nanomoolia/litra, eli EC50 on noin 1,0 ± 0,2 nM, määritettynä UMR 106:een perustuvalla adenylaattisyklaasimäärityk-sellä, joka on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Rabbani et ai., 35 Endocrinology. 1988, 123:2709. Vertailun vuoksi esitettäköön, että edellä mainitun Rabbani:n et ai. julkaisun mukaisesti saadulla, HPLC-laatua olevalla PTH:lla sanotaan olevan tässä ko- 106802 keessa EC50-arvo, joka on vähintään 3 nM. Tämä in vitro-biomää-ritys mittaa kvantitatiivisesti sen voimakkuuden, jolla tietty PTH-valmiste stimuloi adenylaattisyklaasin tuotantoa rotan UMR-106-1injän osteosarkoomasoluissa. Ohessa käytetyllä käsitteellä 5 "EC50" tarkoitetaan tietyn hPTH-valmisteen sitä pitoisuutta (molaarisuutena mitattuna), jolla saavutetaan puolet suurimmasta vasteesta UMF-106:een perustuvassa adenylaattisyklaasimääri-tyksessä.
10 CE-laatua olevan ihmis-PTH:n tunnusomaisena piirteenä on myös sen molekyylipaino, joka on 9424 ± 1,4 daltonia määritettynä ionisuihkuun perustuvalla massaspektrometrisellä analyysillä, joka arvo on käytännöllisesti katsoen yhtäsuuri kuin sen teoreettinen molekyylipaino, 9424,7.
15
Ihmis-PTH:ta, jonka tunnusomaiset piirteet on kuvattu edellä, voidaan saada käsittelemällä osittain puhdistettua ihmis-PTH-valmistetta käänteisfaasiin perustuvalla korkean suorituskyvyn nestekromatografisella menetelmällä, kationisen, ionipareja 20 muodostavan aineen läsnäollessa. Alan asiantuntijalle on selvää, että ionipareja muodostavia aineita, joita käytetään tavanomaiseen tapaan proteiinien erottamiseksi RP-HPLC-menetel-mällä, ovat esimerkiksi sellaiset anioniset muokkaajat kuten heptafluorivoihappo (HFBA) ja tavallisempi trifluorietikkahappo 25 (TFA). Kuitenkin, kuten ohessa esitetään, näillä ionipareja * muodostavilla aineilla ja erityisesti HFBA:11a ei päästä sellaiseen erituskykyyn, joka olisi välttämätön ihmis-PTH:n erottamiseksi rakenteellisesti samanakaltaisista proteiinikontami-nanteista siten, että kromatografiakolonnista eluoituva ihmis-30 PTH saataisiin talteen proteiinikontaminanteista riippumatta.
Ollaan todettu, että kationisten, ionipareja muodostavien ai-w * neiden, erityisesti amiinipohjäisten ionipareja muodostavien aineiden (jotka tunnetaan myös "varauksen muokkaajina") varaus-ominaisuudet ovat edullisimmat tällaiseen erotuskykyyn pääsemi-35 seksi.
106802
Oheisen keksinnön eräänä piirteenä on näin ollen menetelmä olennaisesti puhtaan ihmis-PTH:n saamiseksi, jonka menetelmän käsittämässä vaiheessa osittain puhdistettu PTH-valmiste fraktioidaan käänteisfaasiin perustuvalla korkean suorituskyvyn 5 nestekromatografisella menetelmällä kationisen, ionipareja muodostavan aineen läsnäollessa. Sitten olennaisesti puhdas PTH otetaan talteen keräämällä selektiivisesti kolonnin läpi kulkenut pääasiallinen proteiinipiikki (ilmaistu aallonpituudella 280 nm tai edullisemmin 214 nm saadulla absorbanssilla), pää-10 asiallisen piikin vieressä olevien pienempien proteiinipiik-kien edustamat kontaminantit poissulkien.
Esimerkkeinä käyttökelpoisista kationisista, ionipareja muodostavista aineista voidaan mainita amiinipohjäiset aineet kuten 15 di- ja tri-(alempi alkyyli)-amiinit kuten trimetyyliamiini, trietyyliamiini, tributyyliamiini ja dipropyyliamiini. Tätä ionipareja muodostavaa ainetta voidaan käyttää erityisen edullisesti suolamuodossa, ja tässä suhteessa edullinen on trietyy-liamiinifosfaatti, joka on valmistettu sekoittamalla trietyyli-20 amiinia ja fosforihappoa. Edelleen, tämä valinnaisesti suola-muodossa oleva, ionipareja muodostava aine voidaan toivottaessa sekoittaa alkanoliliuottimeen, esimerkiksi metanoliin, propano-liin tai isopropanoliin tai orgaaniseen happoon, kuten muurahaishappoon.
25 -i Kun käytetään tämän amiinipohjäisen ionipareja muodostavan aineen suoloja, niin tällöin on toivottavaa, että PTH-tuotteen puhdistusprosessin viimeisenä vaiheena poistetaan tämä ionipareja muodostava aine poistamalla suola käänteisfaasia sisältä-30 västä HPLC-kolonnista saadusta materiaalista. Suolanpoisto voidaan toteuttaa käsittelemällä näyte millä tahansa monesta eri-laisesta suolanpoistomenetelmästä, joista voidaan mainita gee-lisuodatus, ultrasuodatus tai käänteisfaasiin perustuva HPLC, jossa käytetään haihtuvaa ionipareja muodostavaa ainetta kuten 35 esimerkiksi jotakin tavanomaista ionipareja muodostavaa ainetta kuten trifluorietikkahappoa (TFA) ja heptafluorivoihappoa (HFBA).
106802
Amiinipohjäinen ionipareja muodostava aine sisällytetään ja RP-HPLC-puhdistusprosessi toteutetaan tavalla, joka on tavanomainen muita ionipareja muodostavia aineita käytettäessä. Ensin valmistetaan ne kaksi liuotinliuosta, joista on tarkoitus muo-5 dostaa gradientti HPLC-ajon aikana, siten, että saadaan vettä ja amiinipohjäistä, ionipareja muodostavaa ainetta sisältävä "liuotin A"-liuos sekä vettä, amiinipohjaista, ionipareja muodostavaa ainetta ja noin 80 % orgaanista komponenttia kuten asetonitriiliä, metanolia tai 1-propanolia sisältävä "liuotin 10 B"-liuos. Parhaat tulokset saadaan käyttämällä asetonitriiliä. Kukin liuotin valmistetaan sekoittamalla kaupallisesti saatavia, HPLC-laatuisia reagensseja ja suodattamalla sitten esimerkiksi 0,45 mikronin suodattimen läpi, mitä seuraa kaasunpoisto hapen poistamiseksi, toteuttaen nämä kaikki toimenpiteet tavan-15 omaisella tavalla.
Kun trietyyliamiinifosfaattia (TEAP) käytetään ionipareja muodostavana aineena, niin tällöin TEAP:n pitoisuus liuottimessa voi olla noin alueella 0,05-1,0 til.-%, erottumisen ollessa 20 parhaimmillaan, kun TEAP-pitoisuus on noin 0,4 til.-%. Tästä syystä oheisen keksinnön eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa PTH-puhdistus toteutetaan käänteisfaasiin perustuvalla HPLC-menetelmällä käyttäen liuotinliuoksina liuotinta A, joka koostuu 100 %:sta vettä, johon on lisätty 0,4 % tri-25 etyyliamiinia ja 0,4 % fosforihappoa (85 %), sekä liuotinta B, : joka koostuu asetonitriilistä, johon on lisätty 0,4 % trietyy- liamiinia sekä jokin määrä fosforihappoa (85 %), yleensä noin 0,4 %, joka määrä riittää muuttamaan pH-arvon samaksi kuin liuottimen A pH.
30 , Lukuunottamatta amiinipohjaisen muokkaajan sisällyttämistä liuottimeen, olennaisesti puhdasta ihmis-PTH:ta sisältävien valmisteiden fraktiointi voidaan toteuttaa kaupallisesti saatavilla HPLC-laitteilla, käänteisfaasiin perustuville HPLC-tek-35 nilkoille tavanomaisella tavalla (katso esimerkiksi teos CRC Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins, voi. 1, 1984, CRC Prsee Inc.). Kolonnit, joilla 106802 10 fraktionti toteutetaan, on voitu pakata esimerkiksi silikahel-millä, joihin on liitetty yhtäpitkiä, alueella C4-C18 olevia alkyyliryhmiä, C18-ryhmien ollessa edullisia PTH-erotuksen kannalta. Ollaan havaittu, että C018-helmillä, jotka ovat kooltaan 5 yhtäsuuria, noin 5 mikronia, ja joiden huokoskoko on noin 300 ängströmiä, pakatut kolonnit sopivat' hyvin PTH-puhdistukseen. Tällaisia kolonneja on saatavana kaupallisesti käyttövalmiina "panoksina" HPLC-laitteeseen sijoittamista varten, yhtiöstä Painin Instrument Co., Inc., Woburn, MA, ja niitä markkinoidaan 10 tuotenimellä "Dynamax".
Tämän jälkeen olennaisesti puhdistunut PTH fraktioidaan injektoimalla tästä valmisteesta otettu näyte HPLC-laitteeseen ja asettamalla liuottimien A ja B suhteelliset osuudet toivotulla 15 tavalla. Vaikka onkin mahdollista toteuttaa lineaarinen gradi-entti 100 %:sta liuotinta A 100 %:iin liuotinta B, niin kuitenkin PTH-fraktioinnin kannalta toivottavamman gradientin on todettu olevan sellainen gradientti, joka muuttuu seuraavalla tavalla: 70 % A/30 % B —> 40 % A/60 % B, palaten takaisin pi-20 toisuuksiin 70 % A/30 % B. Tämä gradientti toteutetaan ihanteellisessa tapauksessa käyttäen injektoitaessa virtausnopeutena noin 1 ml liuotinta minuutissa. Näissä olosuhteissa olennaisesti puhdas PTH eluoituu noin 26 minuutissa, noin 35 % ase-tonitriilissä.
25 • Edut, jotka saavutetaan käyttämällä trietyyliamiinia ionipareja muodostavana aineena, ovat ilmeisiä kun proteiinin kulkeutumista HPLC-kolonnin läpi seurataan aallonpituudella 214 nm mitatulla absorbanssilla, mikä on tavanomaista. Kuten oheisista 30 kuvioista nähdään, injektoidussa PTH-näytteessä olevat kontami-nantit erottuvat PTH:sta, josta saadaan yksi suuri absorbanssi-piikki. Tämän ansiosta olennaisesti puhdas PTH voidaan kerätä eluentin etäisfraktiona, poissulkien muut materiaalit, jotka erottuvat PTHrsta kolonnin läpi kulkiessaan. Käänteisfaasia 35 sisältävästä HPLC-kolonnista eluoitunut, olennaisesti puhdas PTH voidaan lyofilisoida tavanomaisella tavalla, edullisesti 106802 välittömästi talteensaamisen jälkeen, jolloin vältetään PTH:n inaktivoituminen hapettumisen seurauksena.
Tällä tavalla saadusta, CE-laatuisesta ihmis-PTH:sta voidaan 5 tehdä hoitosovellutuksiin sopiva valmiste. Täten tällaista PTH:ta sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia voidaan tehdä sekoittamalla toivottu annos, esimerkiksi yksikköannos PTH:ta steriiliin ja pyrogeenittomaan vesipitoiseen kuljettimeen. Tähän vesipitoiseen PTH-koostumukseen voidaan lisätä toivottaessa 10 täydennökseksi pelkistävää ainetta kuten kysteiiniä hapettumisen vastustamiseksi ja säilyvyyden parantamiseksi. Samoin, koska PTH on stabiilimpaa happamassa ympäristössä, niin vesipitoinen kuljetin voidaan tehdä happamaksi esimerkiksi etikkahapol-la. Tätä farmaseuttista koostumusta voidaan myös täydentää toils vottaessa jollakin määrällä toista hoitavaa ainetta. Esimerkiksi tehokas määrä joko kalsiumsuolaa tai D-vitamiinianalogia voidaan sisällyttää luiden hoitoon tarkoitettuun valmisteeseen tavalla, joka on kuvattu patenttijulkaisussa US 4 698 328.
20 On selvää, että olennaisesti puhtaan PTH:n käyttöön farmaseuttisessa yhteydessä liittyy selvänä etuna näissä koostumuksissa, joiden puhtaus on tavallisesti huonompi, läsnäolevista komponenteista johtuvien sivuvaikutusten ja niiden immunogeenisyyden heikkeneminen sekä tietyn fysiologisen vasteen aikaansaamiseksi 25 tarvittavan PTH-määrän pieneneminen.
On selvää, että ohessa kuvattua tekniikkaa PTH:n puhdistamiseksi voidaan soveltaa erilaisilla menetelmillä saatuihin PTH-koostumuksiin, joista menetelmistä voidaan mainita PTH:n uutta-30 minen nisäkäskudoksesta, sen saaminen mikrobilähteistä sekä synteettisesti. Yleensä tällaisista lähteistä eristetty PTH
* saadaan osittain puhdistuneessa muodossa, eli se on käynyt läpi vähintään yhden kolonnifraktiointivaiheen ennen sen käsittelemistä oheisen keksinnön mukaisella, käänteisfaasiin perustuval-35 la HPLC-menetelmällä. Kun PTH on saatu mikrobilähteestä, esimerkiksi bakteerilähteestä, niin tällöin mikrobiuutteet käsitellään ensin toivottavalla tavalla PTH:n väkevöimiseksi, esi- 106802 merkiksi uuttamalla hapolla tai saostamalla ammoniumsulfaatilla, minkä jälkeen käsitellyt näytteet käsitellään millä tahansa erilaisella, PTH:n rikastamisen kannalta käyttökelpoisella fraktiointitekniikalla. Esimerkiksi raaka PTH-näyte voidaan 5 käsitellä ioninvaihtokromatografisesti, käyttäen esimerkiksi S-Sepharose- tai Mono-S-kolonnia, tai hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvaa kromatografista tekniikkaa, käyttäen esimerkiksi fenyyli-Sepharose-kolonnia. Se, miten voimakkaasti PTH rikastuu raakanäytteeseen ennen käänteisfaasiin perustuvaa 10 HPLC-puhdistusta, riippuu suuresti siitä ympäristöstä, jossa PTH:ta tuotetaan. Tässä suhteessa, ja keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti PTH-lähde on edullisesti E. coli-trans-formantti, jota on muokattu geneettisesti siten, että se tuottaa PTH:ta erittyvänä (periplasmisena) tuotteena tai poistuvana 15 (solun ulkopuolisena) tuotteena. Keksinnön eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa PTH-lähde on E. coli-transfor-mantti, joka tuottaa PTH:ta solun ulkopuolisena tuotteena tavalla, joka on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Wont et ai., EP 357 391, joka liitetään oheen tällä viittauksella, ja joka on 20 kuvattu lyhyesti jäljempänä.
Seuraavissa esimerkeissä analysoitiin ja puhdistettiin vertailun mahdollistamiseksi PTH-näytteitä, jotka oli saatu seuraa-vista lähteistä: 25 1. E. coli:sta solun ulkopuolelle erittynyt PTH: Tämä PTH-materiaali saatiin käyttäen PTH-tuotantojärjestelmää, jonka Wong ja Sutherland ovat kuvanneet eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 357 391, joka on julkaistu 7. maaliskuuta 30 1990, ja joka liitetään oheen tällä viittauksella. Lyhyesti, tässä tuotantojärjestelmässä käytetään tuotantoisäntänä E. coli JMlOl-kantaa, jossa käytetään tac-promoottoria ompA-signaali-peptidin käsittävän PTH-esiasteen ilmentymisen aikaansaamiseksi, ja joka erittää kypsää ihmis-PTH:ta kannan viljelyalustaan. 35 Ennen RP-HPLC-fraktiointia tämän solujen ulkopuolelle erittyneen PTH:n olennaisesti puhdas valmiste saatiin seuraavalla tavalla: koko elatusalustan pH asetettiin arvoon 4,0 arvosta 106802 8,0 jääetikalla, minkä jälkeen se kirkastettiin sentrifugoimal-la. Sitten näyte ladattiin 1 litran S-Sepharose-kolonniin ja pestiin 4 kolonnitilavuudella 40 mM ammoniumasetaatipuskuria, sitten 6 kolonnitilavuudella 400 nM ammoniumasetaattipuskuria.
5 Kolonnia eluoitiin gradientilla, joka koostui 0,4M - 1,0 M ammoniumasetaattipuskuria, ja jonka tilavuus oli 8 kolonnitila-vuutta, ja PTHsta sisältävät fraktiot (määritetty PAGE-analyy-sillä) yhdistettiin.
10 Sitten yhdistettyjen S-Sepharose-fraktioiden pH asetettiin arvoon 8,0 5 N natriumhydroksidilla ja ladattiin 70 ml:n fenyyli-Sepharose-kolonniin. Kolonni pestiin 7 kolonnitilavuudella 0,06 M ammoniumasetaattipuskuria. Kolonnia eluoitiin gradientilla, joka koostui 0,6-0,4 M ammoniumasetaatista, ja jonka kokonais-15 tilavuus oli 10 kolonnitilavuutta. Fraktiot kerättiin ja yhdistettiin sen jälkeen, kun niistä otetut näytteet oli analysoitu C18-käänteisaafiin perustuvalla HPLC-määrityksellä (asetoni-triili/TFA) ja elektroforesilla polyakryyliamidigeeliä käyttäen.
20
Sitten yhdistetyt fenyyli-Sepharose-fraktiot analysoitiin RP-HPLC-menetelmällä käyttäen C18-silikaa ja ionipareja muodostavana aineena HFBA:ta. Analyysistä saatiin vain yksi proteii-nipiikki, minkä perusteella todettiin, että kypsä ihmis-PTH oli 25 saatu puhdistetuksi (kuvio 2A).
2. E. coli:n tuottama solun sisäinen PTH: Tämä PTH-materiaali tuotettiin tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Sung et ai., J. Biol. Chem.. 1991, 266 (5): 2831. Lyhyes-30 ti, näiden kirjoittajien esittämällä tavalla, näissä tuotantojärjestelmissä käytetään isäntänä E. coli Y1090-kantaa, jossa « käytetään lac-promoottoria N-metionyyli-PTH:n tuottamiseksi, joka N-metionyyli-PTH muuttuu endogeenisesti aminopeptidaasin vaikutuksesta kypsäksi ihmis-PTH:ksi. PTH:n uuttamiseksi solut . 35 hajotettiin sonikoimalla ja raaka-PTH otettiin talteen happouu- tolla, minkä jälkeen solujätteet poistettiin sentrifugoimalla. Uutetun PTH:n pH asetettiin noin arvoon 4 natriumhydroksidilla, 106802 fraktioitiin Mono-S-kationinva ihtoko1onni11a, minkä jälkeen yhdistetyt näytteet fraktioitiin käänteisfaasiin perustuvalla HPLC-tekniikalla TFA:n läsnäollessa. Kypsän PTH:n tuottaman ainoan piikin puhtaus määritettiin analyyttisesti RP-HPLC-mene-5 telmällä, TFA:n läsnäollessa HFBA:ssa.
3. Synteettinen PTH:
Kiinteään faasiin perustuvalla peptidisynteesillä tuotettuja ihmis-PTH-näytteitä hankittiin yhtiöstä Bachem Inc. (1987-1988-10 luettelossa no. PCAL175). Toimittajalta saadun tuotekuvauksen mukaan PTH:n puhtaus oli määritetty suuremmaksi kuin 99 % RP-HPLC-analyysillä, käyttäen 0,1 % TFA:ta ionipareja muodostavana aineena.
15 Esimerkki 1 PTH:n puhtauden analyysi kapillaarielektroforeesilla Käänteisfaasiin perustuvan HPLC-analyysin perusteella todettiin, että edellä kuvatulla tavalla saadut näytteet olivat puh-20 dasta ihmis-PTH:ta, minkä jälkeen nämä näytteet analysoitiin herkemmällä analyysitekniikalla eli kapillaarielektroforesilla. Tähän tarkoitukseen käytettiin kapillaarielektroforeesilaitet-ta, joka saatiin yhtiöstä Applied Biosystems, malli 270. PTH-näytteet, jotka oli saatu HFBA:han perustuvasta HPLC-puhdistuk-25 sesta, ja jotka sisälsivät PTH:ta alueella 0,2-1,0 mg/ml olevi-na pitoisuuksina, laitettiin näyteputkiin ja imettiin kapillaa-rikolonniin, jota oli esikäsitelty 100 mM fosfaattipuskurilla. Kapillaariin erottumisen aikaansaamiseksi kohdistettuina olosuhteina oli +20 kV:n jännite. Näytettä ladattiin vakuumin 30 avulla imemällä 2-10 sekuntia.
Kuten kuviosta 1 nähdään, PTH-näytteet, jotka vaikuttivat puhtailta TFA:hän ja HFBA:hän perustuvalla käänteisfaasi-HPLC-me-netelmällä analysoituna, sisälsivät itse asiassa erilaisia kon-35 taminantteja, jotka saadaan ilmaistuiksi kapillaarielektroforeesilla (CE) analysoiden. Esimerkiksi kuvio IA esittää E. co- li-bakteerista solun ulkopuolelle erittyneestä PTH:sta otetun 106802 15 näytteen CE-profiilin (absorbanssi aallonpituudella 214 nm), tämän näytteen tuottaessa vain yhden HPLC-piikin HFBA:ssa. CE-profiilissa paljastuu neljä aikaisemmin ilmaisematta jäänyttä pientä piikkiä, jotka eluoituvat ennen ihmis-PTH-piikkiä, sekä 5 eräitä PTH-piikin jälkeen eluoituvia piikkejä. Näytteen puhtaus CE-analyysillä arvioiden on noin 90 % (sisältäen merkitsimen piikin). Samoin E. colirn tuottaman solun sisäisen PTH:n tapauksessa (kuvio IB), joka PTH etenee vain yhtenä piikkinä RP-HPLC/TFA-analyysissä, CE-profiili paljastaa kolme pientä piik-10 kiä, jotka eluoituvat ennen varsinaista PTH-piikkiä, sekä pieniä, varsinaisen piikin jälkeen eluoituvia piikkejä, lasketun kokonaispuhtauden ollessa 97,8 %. Samoin synteettisellä PTH:11a saatu CE-kulkeutumiskuvio (kuvio 1C) paljastaa suuren ja täten heterogeenisen varsinaisen piikin, pienten piikkien näkyessä 15 johtoreunassa, kokonaispuhtauden ollessa korkeintaan 89 %. Tämä suuri piikki edustaa todennäköisesti useita PTH-lajeja, jotka käsittävät suojaamattomia aminohappojäännöksiä.
Esimerkki 2 20 Ihmis-PTH:n puhdistus RP-HPLC-menetelmällä käyttäen amiinipoh-jaista, ionipareja muodostavaa ainetta E. coliista solun ulkopuolelle erittyneestä PTHista (Wong et ai., edellä) otettiin näyte fenyyli-Sepharose-kolonnilla edellä 25 olevisssa esimerkeissä kuvatulla tavalla toteutetun fraktioin-nin jälkeen. Fenyyli-Sepharose-kolonnista saadun näytteen pH asetettiin arvosta 8 arvoon 4 lisäämällä siihen fosforihappoa, ja 200 μΐ pH-säädettyä näytettä injektoitiin HPLC-laitteeseen (Waters HPLC-järjestelmä, seuraavasti: 721-tietojenkäsittely-30 yksikkö, 730-gradienttiohjelmoija, kaksi 510 HPLC-pumppua, kä- . sikäyttöinen U6K-injektori, 440-detektori, jossa aallonpituutta *· · voidaan muuttaa). Laitteessa oli kolonni, joka oli pakattu 5 /x:n C18-silikahelmillä, joita yhtiö Rainin markkinoi tuoteni-mellä Dynamax (4,1 x 25 cm, huokoskoko 300 Ä). Liuottimet A ja 35 B koostuivat 100 %:sta vettä (A) ja 80 %:sta asetonitriiliä (B), ja niitä kumpaakin oli täydennetty 0,4 %:lla trietyyli-amiinia ja 0,4 %:lla fosforihappoa. Automaattinen virtausnopeus 106802 oli 1 ml/min. ja liuottimia sekoitettiin seuraavalla tavalla mainitun ajanjakson (minuuttia) aikana:
Aika % A %B
5 0 70 30 5 70 30 40 40 60 45 40 60 50 70 30 10 55 70 30
Varsinainen PTH-piikki eluoitui ajanhetkellä 26,62 minuuttia, asetonitriilin pitoisuudella 35 %, ja se erottui hyvin kontami-nanteista, joita ei oltu todettu aikaisemmin, kun HFBA:ta oli 15 käytetty ionipareja muodostavana aineena. Tämä suurin absor-banssipiikki otettiin talteen sen analysoimiseksi edelleen ka-pillaarielektroforeesilla, ja se käsiteltiin myös vielä uudestaan TEAPrhen perustuvalla RP-HPLC-tekniikalla edellä kuvatulla tavalla. Tämän HPLC-analyysin tulokset on kuvattu kuviossa,2, 20 jossa on esitetty graafisesti TEAP:n erotuskyky (kuvio 2B) verrattuna HFBA:hän (kuvio 2A), sekä mahdollisuus saada HPLC-laa-tuista (vain yhden piikin tuottavaa) ihmis-PTH:ta (kuvio 2C), jonka tunnusomaisena piirteenä on vain yksi piikki myös CE-tek-niikalla (kuvio 3).
25 E. colitn tuottama solun sisäinen PTH puhdistettiin myös TEAPihen perustuvalla HPLC-tekniikalla näissä samoissa olosuhteissa. Kromatogrammissa (ei esitetty) nähdään kaksi ensin erottunutta kontaminanttipiikkiä, jotka eivät eronneet TFA:ssa 30 toteutetulla fraktioinnilla.
35 17 106802
Esimerkki 3
Ihmis-PTHin puhtauden analysointi ennen RP-HPLC-käsittelyä ja tämän käsittelyn jälkeen käyttäen amiinipohjäistä, ionipareja muodostavaa ainetta 5 HFBA-puhdistetun PTH:n kanssa vertaamiseksi TEAP-puhdistettu PTH, jota saatiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, analysoitiin kapillaarielektroforeesilla, esimerkissä 1 kuvatuissa olosuhteissa. Tästä vertailusta saadut tulokset on esitetty kuviossa 10 3, jossa nähdään moninkertaisia absorbanssipiikkejä (214 nm) HFPA-puhdistetun materiaalin tapauksessa (kuvio 2A) ja vain yksi absorbanssipiikki (214 nm) TEAP-puhdistetun vastineen tapauksessa (kuvio 2B).
15 20 25 • · 30 * · 35
Claims (12)
106802
1. Menetelmä ihmisen lisäkilpirauhashormonin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, jossa osit-5 tain puhdistettua ihmisen lisäkilpirauhashormoni- (PTH-) valmistetta fraktioidaan käänteisfaasiin perustuvalla korkean suorituskyvyn nestekromatografiällä kationisen, ionipareja muodostavan aineen läsnäollessa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kationinen, ionipareja muodostava aine on amiini-pohjainen, ionipareja muodostava aine.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että amiinipohjainen, ionipareja muodostava aine on tri-etyyliamiini tai sen suola.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amiinipohjainen, ionipareja muodostava aine on tri- 20 etyyliamiinifosfaatti.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osittain puhdistettu lisäkilpirauhashormonivalmiste on saatu ihmisen lisäkilpirauhashormonin mikrobilähteestä. 25 ·? 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen lisäkilpirauhashormonin mikrobilähde on ihmisen lisäkilpirauhashormonin bakteerilähde.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu - . siitä, että ihmisen lisäkilpirauhashormonin bakteerilähde on ihmisen lisäkilpirauhashormonin E. coli-lähde. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä olennaisesti puh-35 taan ihmisen lisäkilpirauhashormonin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa 106802 (i) saadaan E. coli:ssa tuotetun ihmisen lisäkilpirauhashormonin osittain puhdistettu valmiste, (ii) tämä osittain puhdistettu valmiste fraktioidaan kään-teisfaasiin perustuvalla korkean suorituskyvyn neste- 5 kromatografialla trietyyliamiinin tai sen suolan läs näollessa; ja (iii) kromatografiavaiheen jälkeen kerätään talteen olennaisesti puhdasta ihmisen lisäkilpirauhashormonia.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi vaiheen, jossa talteensaatu ihmisen lisäkilpirauhashormoni lyofilisoidaan.
10. Patenttivaatimuksen 1 ja 8 mukainen menetelmä olennaisesti 15 puhtaan ihmisen lisäkilpirauhashormonin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kapillaarielektroforeesissa, aallonpituudella 214 nm analysoitaessa, saadaan vain yksi piikki, ja että EC50 on korkeintaan 2 nM UMR 106:n perustuvalla adeny-1aattisyklaas ianalyysil1ä määritettynä. 20
11. Patenttivaatimuksen 1 tai 8 mukainen menetelmä olennaisesti puhtaan ihmisen lisäkilpirauhashormonin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että läsnä ei ole proteiinikontaminant-teja, jotka voitaisiin ilmaista kapillaarielektroforeesilla. 25 ·? 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että olennaisesti puhdas ihmisen lisäkilpirauhashormoni on lyofilisoidussa muodossa. 30 25 106802
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/707,114 US5208041A (en) | 1991-05-23 | 1991-05-23 | Essentially pure human parathyroid hormone |
| US70711491 | 1991-05-23 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI922356A0 FI922356A0 (fi) | 1992-05-22 |
| FI922356A FI922356A (fi) | 1992-11-24 |
| FI106802B true FI106802B (fi) | 2001-04-12 |
Family
ID=24840399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI922356A FI106802B (fi) | 1991-05-23 | 1992-05-22 | Olennaisesti puhdas ihmisen lisäkilpirauhashormoni |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5208041A (fi) |
| EP (1) | EP0515228B1 (fi) |
| JP (1) | JP2563726B2 (fi) |
| KR (1) | KR970007755B1 (fi) |
| AT (1) | ATE164394T1 (fi) |
| CA (1) | CA2068438C (fi) |
| DE (1) | DE69224858T2 (fi) |
| DK (1) | DK0515228T3 (fi) |
| ES (1) | ES2115642T3 (fi) |
| FI (1) | FI106802B (fi) |
| HK (1) | HK1004340A1 (fi) |
| IE (1) | IE921672A1 (fi) |
| IL (3) | IL101829A (fi) |
| NO (2) | NO304190B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ242855A (fi) |
| ZA (1) | ZA923735B (fi) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5420242A (en) * | 1986-10-22 | 1995-05-30 | Kaare M. Gautvik | Production of human parathyroid hormone from microorganisms |
| USRE37919E1 (en) | 1989-05-12 | 2002-12-03 | The General Hospital Corporation | Recombinant DNA method for production of parathyroid hormone |
| WO1995011697A1 (fr) * | 1993-10-27 | 1995-05-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Accelerateur de guerison utilise en chondroplastie |
| US6074840A (en) | 1994-02-18 | 2000-06-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Recombinant production of latent TGF-beta binding protein-3 (LTBP-3) |
| US5962427A (en) | 1994-02-18 | 1999-10-05 | The Regent Of The University Of Michigan | In vivo gene transfer methods for wound healing |
| US5942496A (en) | 1994-02-18 | 1999-08-24 | The Regent Of The University Of Michigan | Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells |
| US20020193338A1 (en) * | 1994-02-18 | 2002-12-19 | Goldstein Steven A. | In vivo gene transfer methods for wound healing |
| US5763416A (en) | 1994-02-18 | 1998-06-09 | The Regent Of The University Of Michigan | Gene transfer into bone cells and tissues |
| US6551618B2 (en) | 1994-03-15 | 2003-04-22 | University Of Birmingham | Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival |
| US7923250B2 (en) | 1997-07-30 | 2011-04-12 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells |
| US6300127B1 (en) | 1997-07-30 | 2001-10-09 | Emory University | Bone mineralization proteins, DNA, vectors, expression systems |
| US6770623B1 (en) | 1997-12-09 | 2004-08-03 | Eli Lilly And Company | Stabilized teriparatide solutions |
| DZ2873A1 (fr) | 1998-08-19 | 2003-12-15 | Lilly Co Eli | Procédé pour augmenter la dureté et la rigidité osseuse. |
| US6495662B1 (en) * | 1998-10-22 | 2002-12-17 | The General Hospital Corporation | Bioactive peptides and peptide derivatives of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) |
| WO2000032771A1 (en) * | 1998-11-30 | 2000-06-08 | The General Hospital Corporation | Pth1r and pth3r receptors, methods and uses thereof |
| US7820393B2 (en) * | 1999-01-14 | 2010-10-26 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Methods, kits and antibodies for detecting parathyroid hormone |
| US6689566B1 (en) | 1999-01-14 | 2004-02-10 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone |
| WO2004028444A2 (en) * | 1999-06-02 | 2004-04-08 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Parathyroid hormone antagonists and uses thereof |
| US20080108086A1 (en) * | 1999-06-02 | 2008-05-08 | Cantor Thomas L | Parathyroid hormone antagonists and uses thereof |
| WO2001023521A2 (en) * | 1999-09-29 | 2001-04-05 | The General Hospital Corporation | Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth) |
| US7087248B2 (en) | 2000-06-30 | 2006-08-08 | Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. | Pharmaceutical component based on human parathyroid hormone and a pharmaceutical composition for intranasal administration comprising the component |
| US6905886B2 (en) * | 2000-08-11 | 2005-06-14 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Preservative solutions |
| US6387711B1 (en) * | 2000-08-11 | 2002-05-14 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Liquid intact parathyroid hormone (PTH) standards |
| US7572765B2 (en) * | 2001-07-23 | 2009-08-11 | The General Hospital Corporation | Conformationally constrained parathyroid hormone (PTH) analogs |
| US20040067526A1 (en) * | 2002-10-03 | 2004-04-08 | Cantor Thomas L. | Methods for diagnosing and guiding treatment of bone turnover disease |
| JP4334480B2 (ja) * | 2003-03-19 | 2009-09-30 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | α−ヘリックス安定化剤を用いる高次構造的に制約された副甲状腺ホルモン |
| KR100540659B1 (ko) * | 2003-07-02 | 2006-01-10 | 삼성전자주식회사 | 이미지 확대 인쇄 방법과 장치 및 컴퓨터 프로그램을저장하는 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록 매체 |
| WO2005009358A2 (en) | 2003-07-17 | 2005-02-03 | The General Hospital Corporation | Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs |
| AU2005244734A1 (en) | 2004-05-13 | 2005-12-01 | Alza Corporation | Apparatus and method for transdermal delivery of parathyroid hormone agents |
| US7541140B2 (en) * | 2004-06-03 | 2009-06-02 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Assessing risk for kidney stones using parathyroid hormone agonist and antagonist |
| CN101355959B (zh) * | 2005-11-10 | 2013-02-27 | 密歇根理工大学管理委员会 | 黑熊甲状旁腺素和使用黑熊甲状旁腺素的方法 |
| WO2008019062A2 (en) * | 2006-08-04 | 2008-02-14 | The General Hospital Corporation | Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth) |
| BRPI0814962B8 (pt) | 2007-08-01 | 2021-05-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | métodos in vitro para determinar se um composto candidato é um agonista de longa duração ou de curta duração de um receptor acoplado à proteína g, polipeptídeo, seu uso e composição farmacêutica |
| WO2009019715A1 (en) * | 2007-08-09 | 2009-02-12 | Usv Limited | Novel orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhpth) (1-34) |
| EP2464655B1 (en) * | 2009-08-11 | 2017-02-15 | Biocon Limited | Chromatographic processes |
| CA2782640A1 (en) | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Michigan Technological University | Black bear parathyroid hormone and methods of using black bear parathyroid hormone |
| JP5941040B2 (ja) | 2010-05-13 | 2016-06-29 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 副甲状腺ホルモン類似体およびその使用 |
| CN108195965B (zh) | 2011-06-07 | 2021-02-23 | 旭化成制药株式会社 | 含pth肽冷冻干燥制剂的检査方法及包含该含pth肽冷冻干燥制剂的医药品的制造方法 |
| CN102993293B (zh) * | 2012-12-05 | 2014-05-07 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种特立帕肽醋酸盐的纯化方法 |
| LU100168B1 (en) | 2017-04-12 | 2018-10-15 | Michael Pazianas | Prevention of Bone and Mineral Disorders by Restoring Calcium and Phosphate Homeostasis in Patients Suffering from Chronic Kidney Disease |
| EP4110370A4 (en) | 2020-03-30 | 2023-06-07 | Sichuan Luzhou Buchang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. | FORMULATIONS OF HUMAN PARATHYROID HORMONE (PTH) AND METHODS OF MANUFACTURE THEREOF |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3886132A (en) * | 1972-12-21 | 1975-05-27 | Us Health | Human parathyroid hormone |
| US5223407A (en) * | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| WO1991005050A1 (en) * | 1989-09-29 | 1991-04-18 | Her Majesty In Right Of Canada As Represented By The National Research Council Of Canada | Synthesis of mature human parathyroid hormone |
-
1991
- 1991-05-23 US US07/707,114 patent/US5208041A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-11 IL IL10182992A patent/IL101829A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-05-11 IL IL11984092A patent/IL119840A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-05-12 CA CA002068438A patent/CA2068438C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-21 NO NO19922000A patent/NO304190B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-05-21 NZ NZ242855A patent/NZ242855A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-05-22 DE DE69224858T patent/DE69224858T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-22 FI FI922356A patent/FI106802B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-05-22 KR KR92008730A patent/KR970007755B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-05-22 JP JP4156100A patent/JP2563726B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-22 ZA ZA923735A patent/ZA923735B/xx unknown
- 1992-05-22 DK DK92304692T patent/DK0515228T3/da active
- 1992-05-22 AT AT92304692T patent/ATE164394T1/de active
- 1992-05-22 EP EP92304692A patent/EP0515228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-22 ES ES92304692T patent/ES2115642T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-01 IE IE167292A patent/IE921672A1/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-12-16 IL IL11984096A patent/IL119840A0/xx unknown
-
1998
- 1998-04-24 HK HK98103454A patent/HK1004340A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-24 NO NO2006013C patent/NO2006013I2/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI922356A (fi) | 1992-11-24 |
| AU639856B2 (en) | 1993-08-05 |
| ATE164394T1 (de) | 1998-04-15 |
| AU1604992A (en) | 1993-03-11 |
| IL119840A0 (en) | 1997-03-18 |
| DE69224858D1 (de) | 1998-04-30 |
| NO922000L (no) | 1992-11-24 |
| NO2006013I1 (no) | 2006-11-06 |
| IL101829A0 (en) | 1992-12-30 |
| ES2115642T3 (es) | 1998-07-01 |
| NO922000D0 (no) | 1992-05-21 |
| NZ242855A (en) | 1994-04-27 |
| ZA923735B (en) | 1993-01-27 |
| EP0515228B1 (en) | 1998-03-25 |
| JPH0687897A (ja) | 1994-03-29 |
| CA2068438C (en) | 1996-11-12 |
| NO2006013I2 (no) | 2009-12-07 |
| DE69224858T2 (de) | 1998-07-23 |
| NO304190B1 (no) | 1998-11-09 |
| US5208041A (en) | 1993-05-04 |
| EP0515228A3 (fi) | 1994-05-04 |
| DK0515228T3 (da) | 1998-09-28 |
| JP2563726B2 (ja) | 1996-12-18 |
| FI922356A0 (fi) | 1992-05-22 |
| KR970007755B1 (en) | 1997-05-16 |
| IL101829A (en) | 1999-12-31 |
| CA2068438A1 (en) | 1992-11-24 |
| IL119840A (en) | 2005-08-31 |
| IE921672A1 (en) | 1992-12-02 |
| EP0515228A2 (en) | 1992-11-25 |
| HK1004340A1 (en) | 1998-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI106802B (fi) | Olennaisesti puhdas ihmisen lisäkilpirauhashormoni | |
| Bennett et al. | Purification of the two major forms of rat pituitary corticotropin using only reversed-phase liquid chromatography | |
| Burtis et al. | Identification of a novel 17,000-dalton parathyroid hormone-like adenylate cyclase-stimulating protein from a tumor associated with humoral hypercalcemia of malignancy. | |
| Roberts et al. | Purification and properties of a type. beta. transforming growth factor from bovine kidney | |
| US5013720A (en) | SAP-6-Val proteins and methods | |
| DE69632224T2 (de) | Reduzierung von Gelation von Fettsäureacylierten Proteinen unter Nutzung von Zitratpuffer | |
| JP3285862B2 (ja) | 活性依存性神経栄養因子 | |
| CA1297635C (en) | Protein purification | |
| WO1987006943A1 (en) | Pulmonary hydrophobic surfactant-associated protein of 6,000 daltons molecular weight and multimers thereof | |
| US4389343A (en) | Immunopotentiating peptides from thymus | |
| US5290920A (en) | Method of purifying human epidermal growth factor | |
| Charlton et al. | Secretin immunoreactivity in rat and pig brain | |
| Tio et al. | Purification of gonadotropin surge-inhibiting factor from Sertoli cell-enriched culture medium | |
| CA2113868A1 (en) | Ultra-pure human interleukin-6 | |
| FRANCO-BOURLAND et al. | In vivo biosynthesis of L-[35S] Cys-arginine vasopressin,-oxytocin, and-somatostatin: rapid estimation using reversed phase high pressure liquid chromatography | |
| Perry et al. | ε-N-Methyl Lysine: an Additional Amino-acid in Human Plasma | |
| EP0146842B1 (en) | Novel calcitonin and collection thereof | |
| Nicola | [44] Granulocyte colony stimulating factor | |
| IE83494B1 (en) | Essentially pure human parathyroid hormone | |
| Jaffe et al. | HPLC isolation and purification of pheromone biosynthesis activating neuropeptide of Heliothis zea | |
| Rand-Weaver et al. | A rapid procedure for the isolation of bioactive growth hormone | |
| Yamamoto et al. | Identification and purification of apolipoprotein C-III from the serum of cows | |
| Welinder et al. | Binding affinity of monoiodinated insulin tracers isolated after reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| Paselk et al. | Preparation of several trifluoroacetyl insulin derivatives | |
| Olofsson et al. | Isolation and partial characterization of a glycine-and serine-rich polypeptide from human serum high-density lipoproteins (HDL) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: ALLELIX BIOPHARMACEUTICALS INC. |
|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: NPS PHARMACEUTICALS, INC. Free format text: NPS PHARMACEUTICALS, INC. |
|
| MA | Patent expired |