JP2024522183A - 非標準ｇ四重鎖構造に結合する化合物ならびにそれを作製および使用する方法 - Google Patents

非標準ｇ四重鎖構造に結合する化合物ならびにそれを作製および使用する方法 Download PDF

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モ ヤン，
シャオ リャン，
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Abstract

Figure 2024522183000001
本明細書に記載される様々なタイプの遺伝子において見出されるDNA中のg 4sなどの非正準位g-四重鎖(G 4)構造に選択的に結合する小分子化合物、およびタンパク質(例えば、タンパク質)を減少または阻害するために該化合物を使用する方法 癌細胞などの細胞におけるN-Mycタンパク質の発現。本発明の化合物は、本明細書に記載の式に従った構造、またはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に有効な塩またはエステルを有する。

Description

関連する用途へのクロスリファレンス
本出願は、米国仮特許出願第63/208、918号に出願されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国仮特許出願第63/208、918号の以前の出願日に対する利益及び優先順位を請求する
政府支援の確認
本発明は、国立機関(国家癌研究所-癌研究センター)によって付与されたプロジェクト番号Z 01ZIA BC 01158507の下で政府支援を用いて作製された。政府は、本発明において一定の権利を有する
フィールド
本開示は、特定の遺伝子に見出される非正準位G-四重鎖DNA構造に選択的に結合する化合物、ならびに癌細胞などの細胞におけるこのような遺伝子の発現を減少または阻害するために化合物を使用する方法に関する
背景
MYCファミリーの遺伝子は、遺伝子発現を広く支配し、遺伝子発現を増幅する転写因子をコードする。3つのmycタンパク質、c-myc、N-myc、およびl-mycは、DNAに結合し、転写を直接調節する塩基性ヘリックス-ループヘリックス(bHLH)領域を含む これらの遺伝子の中でも、MCNは胎児の発達に関与していることが示されており、神経組織において高度に発現されている。MYCNは、しばしば、癌において過剰発現または変異され、癌における癌遺伝子であると考えられる 神経芽腫や小細胞肺癌のような小細胞肺癌。MYCN遺伝子座内に埋め込まれるのは、アンチセンス転写によって生成され、元々ncymと呼ばれる第2の転写物である MYCN対向鎖(MYCNO)と呼ばれるより長い非コードRNA (lncRNA)内に埋め込まれていることが示された。MYCNOの発現は、MCNのプロモーター占有率を低下させ、かつ、MCN転写物安定性を配列によって制御することが示されている 相補性。より最近の研究では、NCYM、MYCNO転写産物の変異体2を翻訳して、小さなタンパク質を生成することもできることが示されている NCYMとして知られるこのポリペプチドは、N-Mycタンパク質の安定性を制御し、Gsk 3βを阻害し、Wnt/β-カテニンシグナル伝達に影響を及ぼすことを含む、多様な調節活性を有することを特徴としている
癌に関与するN-Mycタンパク質および他のタンパク質を制御または阻害する分子は抗癌剤として注目されているが、転写因子としては、 N-Mycタンパク質は、クラス学的に考慮されていないものであり、N-Myc自体を標的とするリガンドを開発しようとするものであり(特に、N-MycのようなN-MycがG-四極ラテックスまたは4S 4Sを含む)リガンドの開発を試みていなかった 小分子などの化合物は、疾患関連遺伝子のG 4sのような構造を結合し、タンパク質コード化および非コード化遺伝子産物を含むそのような遺伝子を標的とする選択性を達成することができる化合物の必要性が存在する
要約
MYCN遺伝子に見出されるヘアピン含有G 4sなどの非正準位G 4構造を標的とする新しいクラスの小分子化合物が本明細書に記載される 特定の実施態様では、化合物は、例えば、細胞(例えば、癌細胞)におけるN-Myc発現を低減または阻害する方法、ならびに対象における癌を治療または予防する方法において有用である ここで、癌は、少なくとも部分的に、N-Myc過剰発現によって特徴付けられる
本明細書に記載される化合物またはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルは、式IAに従って、化合物または立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルである
Figure 2024522183000002
 式IA
[選択図]図1
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである
R1は-(リンカー)t-Rbであり、ここでRbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
本明細書には、式Iによる化合物、または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルが記載されている
Figure 2024522183000003
 式I
[選択図]図1
環aはチオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアゾリル、1、3、4-オキサジアゾリル以外の5員ヘテロアリール環である
環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である
R1は-(リンカー)t-Rbであり、ここでRbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
各R4は、独立して、H、脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
nは0-10の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
いくつかの実施態様では、化合物、または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルは、式Iの構造を有する
Figure 2024522183000004
 式I
[選択図]図1
環aは5員ヘテロアリール環である
環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である
R1は-(CRa2)m-Rbであり、各Raは独立にH、アルキル又はハロであり、mは1、2、3、4又は5であり、Rbは窒素含有基である
R2はH又はアルキルである
各R3は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、脂肪族、又はハロである
各R4は、独立して、H、アルキル、又はハロである
nは0、1、2又は3である
xは0、1、2、3、4、又は5である
ただし、前記化合物は、MY-1、MY-2、MY-10、MY-11、MY-12のいずれかに記載された構造を含まない
いくつかの実施態様では、化合物、または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルは、式Iの構造を有する
Figure 2024522183000005
 式I
[選択図]図1
環aは5員ヘテロアリール環である
環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である
R1は-(CRa2)m-rb又は-[(CRa2)mO]r-(CH2)s-rbであり、各raは独立にH、脂肪族又はハロであり；tは1、2、3、4又は5であり；rは1、2、3、4又は5であり；sは0又は1である Rbはアクリジニル基である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
各R4は、独立して、H、脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
nは、0-10の整数である
さらに、本開示による化合物および少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物の実施が開示される
また、細胞を有効量の化合物、または立体異性体、互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステルと接触させることを含む、細胞における癌関連タンパク質の発現を減少させる方法も開示される 本開示によれば。そして、本開示による、細胞内のN-Myc発現を減少させるための本開示による、化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用 細胞を有効量の化合物と接触させることを含む、方法が開示される。いくつかの実装形態では、使用は、対象における癌を治療または予防するためのものである いくつかの実装形態では、使用は、対象における癌を治療または予防するための医薬の製造のためのものである
本開示の上記および他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進む以下の詳細な説明からより明らかになるであろう
[図面の簡単な説明]
特許又はアプリケーションファイルは、カラーで実行される少なくとも1つの描画を含む。この特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の要求および支払いの際にオフィスによって提供されるであろう
図1は、本明細書に議論されるような結合選択性プロファイリングに使用される5つのG-四重鎖配列を記載する表であり、ここで、全てのDNA/RNAオリゴは、5'末端でCy 5蛍光色素で標識され、G 4形成に関与したグアニンであった 下線で示されている 図2は、MYCN野生型/変異/切頭G 4配列を記載した表である 図3は、MYCN遺伝子におけるG 4形成配列の位置を示す 図4は、ゲノムワイドG 4配列解析により得られるMYCN G4生成確率を示すマップである 図5Aおよび5Bは、MCN/MYCNOにおけるG-四重鎖形成配列のG-Rich配列(またはQGRS)分析を形成する四重鎖の結果を示す 5AはG 4配列技術によって発見されたMYCNOにおけるG 4形成配列(目的の標的)を示し、図5Bはこの領域における電位G 4sのGスコアを示す 図6は、小分子マイクロアレイ(SMM)スクリーニングを使用して同定された4つのヒット化合物を示す。 図7は、SMM (5%DMSO中の100μM)およびネガティブコントロール(化合物15)から14ヒット化合物についての蛍光強度アッセイ結果を示す 化合物1、2、及び5と、化合物MY-1とを含む4つの特定の化合物の構造と共に、化合物MY-1を含む 図8は、図7の化合物の表面プラズモン共鳴結果を示す 図9は、化合物1、2、MY-1、および5の蛍光強度アッセイによる結合親和性測定値を示す 図10は、化合物1、2、MY-1、5の表面プラズモン共鳴による結合親和性測定を示す 図11A-11Dは、小分子によるMCN G4構造安定化および結合選択性評価を示し、図11Aは、異なる緩衝液中のMCN G4DNAの円二色性(CD)スペクトル(100mM KClまたは100mM LiClを含む10m MTris)およびinである 図11Bは、低KClバッファ(10m mM Tris、pH 7。0、5m MKCl)中の融解中に5μM MYCN G4を記録したCD曲線であり、図11Cは、化合物1又はMY-1で溶融しているMCN G4を示している 11Dは、化合物1又はMY-1とインキュベートしたdsDNAのCD融解試験を示す 図12は、10mM Tris、pH 7。0、及び100、20、又は5mM KClを含む緩衝液中でのアニーリング後のMCN G4のCDスペクトルを示す 図13Aおよび13Bは、tRNAを用いた化合物1(図13A)およびMY-1(図13B)の結合選択性プロファイルを示し、ここで、2-アミノプリン蛍光アッセイは、化合物を不在/存在下でMYCN G4DNAに滴定することによって実施された 10×tRNA 図14A-14Eは、6個の異なるG 4標的を有する化合物1の結合親和性を示すグラフであり、DNA/RNA G4オリゴマーの全てが5'でフルオロフォアで標識され、滴定曲線が蛍光強度アッセイによって得られた 図15A-15Eは、6つの異なるG 4標的を有する化合物MY-1の結合親和性を示すグラフであり、DNA/RNA G4オリゴマーの全てが5'でフルオロフォアで標識され、滴定曲線が蛍光強度アッセイによって得られた 図16A-16Eは、本明細書に記載の選択性評価で使用されるG 4sの品質制御グラフであり、全てのG 4sは、正の制御として、古典的なG 4結合剤、TMPyP 4(100μM)を用いた蛍光強度アッセイによって試験された 図17は、化合物1とMY-1との間の競合的結合研究のSPR曲線である 図18Aおよび18Bは、化合物1およびMY-1の競合アッセイの結果を示し、図18Aは、化合物1およびMY-1の連続注入のSPR曲線であり、図である 18Bは、異なる濃度の化合物1を注入した後の化合物MY-1の結合レベルを示す 図19Aおよび19Bは、50μM (図19A)および250μMの濃度の化合物MY-1および化合物MY-1のないTMPyP 4のSPR結合アッセイの結果を示す(図19B) 図20Aおよび図20Bは、個々の化合物(MY-1)または化合物混合物(1およびMY-1)によって安定化されたG 4のCD融解曲線(図20A)と、化合物の組み合わせによって安定化されたMCN G4の融解温度(図20B)とを含む 図21は、ジョブプロット解析によって決定されたMYCN G4と結合する化合物MY-1の化学量論を示すグラフである 図22は、3'-Cy 5標識MYCN G4DNAを用いた化合物MY-1の蛍光滴定を示すグラフである 図23Aおよび23Bは、3'Cy 5-MCN G4と結合する化合物MY-1に対するマイクロスケール熱泳動(MST)研究の結果を要約する 図24A-24Fは、蛍光消光ベースの方法及びジメチルサルフェート(DMS)フットプリントを用いた結合部位評価の結果を示し、図24Aは、MYCIN G4折り畳み構造の概略的な予測である 24Bは、MCN G4sで標識された5'/3'-Cy 5の溶液中に100μMのMY-1を添加することによる消光研究であり、図24Cは、それぞれa 11、a 18およびa 24の位置に標識された2-AP MYCN G4sの溶液に100μMのMY-1を添加することによる消光研究である 24Dは、滴定中の5'-Cy 5標識-蛍光強度を有する野生型/変異/切頭型MYCN G4DNA試料を用いた蛍光滴定を示し、曲線をフィッティングすることによってKD値を計算した 24Eは、小溝バインダー(Hoechst 33258およびネトロシン)を使用する蛍光置換アッセイであり、図24Fは、異なる濃度の化合物MY-1(四重鎖に関与するG管)とインキュベートされたMYCN G4-DNAのDMSフットプリント結果を示す 化合物MY-1の影響を受ける保護されたGsは、ドット(●)(高影響)または円(○)(わずかに影響)で標識された 同上。 同上。 図25A-25Cは、A 11(図25A)、A 18(図25B)、またはA 24で2-AP標識を有するDNAオリゴマー(図25B)を含む、2-AP修飾ベース滴定によるクエンチ画分決定を示す 25℃)位置を、化合物MY-1の一連の濃度で滴定した 図26A-26Nは、SPRを使用して本開示の14種類の異なる化合物で実施された結合アッセイの結果を示す 同上。 同上。 図27A-27Nは、A 11位置に2-AP標識DNAを使用して、本開示の14種類の異なる化合物で実施された結合アッセイの結果を示す 同上。 同上。 図28A-28Gは、NBEB細胞におけるMCN/MYCNOS発現に対する化合物MY-8の効果を示し、図28Aは、異なる濃度で化合物で処理した後の細胞合流性の画像である 28Bは、異なる濃度で時間依存性細胞合流曲線を示す 28 Cは細胞生存率のMTSアッセイ分析であり、図28D-28FはMYCN (図28D)のグラフであり、 MYCNOS 001(図28E)、およびMY-8処理後のMYCNOS 002(図28F)mRNA発現および図 28 Gは、MY-8処理後のMYCNレベルを示すウェスタンブロットである 同上。 図29は、癌関連遺伝子における代表的なヘアピンG 4配列をまとめた表である。 図30は、非正準位G 4結合成分とG 4スタッカとを含む2価化合物(化合物B 33)の結合活性を示す模式図である コンポーネント 図31Aおよび図31Bは、時間の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである(図1) 31 A)アクリジンICR 191に対するMYCNヘアピンG 4結合親和性を示す濃度(図31B) 図32Aおよび図32Bは、時間の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである(図1) 32 A)本開示による2価の化合物のMYCNヘアピンG 4結合親和性を示す濃度(図32B)(化合物B 33) 図33Aおよび図33Bは、アクリジンICR 191(図33A)および本開示による2価の化合物(化合物B 33)のdsDNA結合親和性を示す時間の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである(図33B) 図34Aおよび34Bは、アクリジンICR 191(図34A)のdsDNA結合親和性を示すDNA濃度の関数としての蛍光強度のグラフであり、FIAを用いた本開示(化合物B 33)(図34B)による2価の化合物である 図35A-35Fは、本開示による2価の化合物(化合物B 33)、チアゾールオレンジ、およびアミジンを含む、G 4マイクロアレイおよび3つの異なる化合物を用いた結合選択性プロファイリングの結果を示す 35A、35C、35Eは、それぞれ2価の化合物で観察される蛍光を示す光学像であり、チアゾール系オレンジ、アミジンであり、異なるターゲットである 35B、35D、35Fは、それぞれ、2価の化合物、チアゾール系オレンジ、及びアミジンの結合選択性の蛍光強度値と、異なるターゲットとを示す棒グラフである 同上。 図36は、円二色性分光法を用いて得られたスペクトルであり、これは、対照(DMSO)、アクリジンICR、および対照(DMSO)に曝露されたMYCN G4DNAの熱溶融アッセイの結果を示す 本開示の二価の化合物(化合物B 33) 図37A-37Gは、本開示の二価化合物(化合物B 33)とチアゾールオレンジとの高密度DNAオリゴマイクロアレイを用いた結合選択性プロファイル試験から得られた結果の画像である 37Aは、これら2つの異なる化合物で観察される蛍光を示す光学像であり、図37Bは、カーネル密度推定値(KDE)プロット及び図である 37Cは、マイクロアレイ全体にわたる結合信号の分布を表すバイオリンプロットであり、図37Dおよび37Eは、2つの化合物の結合挙動を要約するプロットを提供する 37F (チアゾールオレンジ)および37G (2価の化合物)は、2つの異なる化合物のGini係数を提供するグラフである 同上。 同上。 図38Aおよび38Bは、2価の化合物(化合物B 33)(図38A)およびヘアピン含有G 4の提案された折り畳み構造(図38A)および提案された折り畳み構造を有する、MCN G4DNAのDMSフットプリントを提供する(図38A) 38 B) 図39Aおよび39Bは、巻き出されたヘアピン(図39A)および切頭ヘアピン(図39B)を用いて2価の化合物(化合物B 33)をMYCN G4sに結合させる結果のFIAグラフである 図40は、2価の化合物(化合物B 33)とマンゴーII RNA G4との結合時間の関数としてSPR応答のグラフであり、弱い結合が観察された 図41Aおよび図41Bは、二価の化合物(化合物B 33)と、並列構造(BCL 2)を有するヘアピンG 4との結合モード評価の結果を示す 図42Aおよび図42Bは、(3+1)ハイブリッド構造(HIV)を有する二価化合物(化合物B 33)およびヘアピンG 4の結合モード評価の結果を示す 図43Aおよび図43Bは、(3+1)ハイブリッド構造を有する(3+1)ハイブリッド構造を有するヘアピンG 4(化合物B 33)と2価の化合物(化合物B 33)との結合モード評価の結果を示す 図44Aおよび図44Bは、2価の化合物(化合物B 33)と(2+2)椅子型構造を有するヘアピンG 4との結合モード評価の結果を示す(PIM 1-フォーム2) 図45は、異なるリンカー基を有する異なる2価の化合物(B 32、B 33、B 34、B 35、およびB 38)のMCN HP-G 4結合活性の結果(FIAおよびSPRを使用して評価される)の概要を示す 図46A-46Dは、異なるリンカー基を有する異なる2価の化合物(B 32、B 33、B 34、B 35、およびB 38)のFIA結果のグラフである 同上。 図47A-47Hは、異なるリンカー基を有する異なる2価の化合物(B 32、B 33、B 34、B 35、およびB 38)のSPR結果のグラフである 同上。 図48Aおよび48Bは、アサバのSPR結果のグラフである 図49Aおよび49Bは、2価の化合物(B 32)(図49A)およびdsDNAを有するアマチャリン(図49B)のSPR結果のグラフである
配列
付随配列表に列挙された核酸配列およびアミノ酸配列は、37CFR第1。822に規定されているように、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語およびアミノ酸のための3つの文字コードを使用して示されている 各核酸配列の1つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれていると理解される。配列表は、ASCIIテキストファイルとしてファイル名のファイルの形で提出される txt (28、672バイト)は、本明細書に参考として組み込まれる、6月3、2022上に生成される。付随する配列表では、以下のとおりである
配列番号1は、ヒトMYCをコードするゲノムDNA配列の一例である
配列番号2-6は、BCL 2、KRAS、mTOR、NRAS、およびテロマーDNAのためのG-四重鎖オリゴヌクレオチドの例示的な核酸配列である
配列番号7は、例示的なMYCN G4野生型オリゴヌクレオチドである
配列番号8は、例示的なMYCN G4変異オリゴヌクレオチドである
配列番号9は、例示的なMYCN G4切断オリゴヌクレオチドである
配列番号10は、MYCNO-01のセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号11は、MYCNO-01のアンチセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号12は、MYCNO-02のセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号13は、MYCNO-02のアンチセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号14は、MCNタンパク質アイソフォーム1のセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号15は、MCNタンパク質アイソフォーム1のアンチセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号16は、MCNタンパク質アイソフォーム2のセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号17は、MCNタンパク質アイソフォーム2のアンチセンス鎖のためのプライマーの例示的な核酸配列である
配列番号18は、MCN G4四重鎖形成配列の例示的な核酸配列である
配列番号19は、MYCNOにおけるG 4形成配列の例示的な核酸配列である
配列番号20-23は、MYCNOにおける電位G 4sの例示的な核酸配列である
配列番号24-30は、FOXA 3、KRAS、MYCL、BRD 4、BCL 2、LINC 01018、およびSOX 12におけるヘアピンG 4配列の例示的な核酸配列である
配列番号31は、例示のhTERT G4オリゴヌクレオチドである
配列番号32は、例示的なBCL 2G 4オリゴヌクレオチドである
配列番号33は、例示的なRB 1G 4オリゴヌクレオチドである
配列番号34は、例示的なVEGF G4オリゴヌクレオチドである
配列番号35は、例示的なc-MYC G4オリゴヌクレオチドである
配列番号36は、例示的なc-KIT G4オリゴヌクレオチドである
配列番号37は、例示的なdsDNAオリゴヌクレオチドである
配列番号38は、例示的なHIF 1-A 4オリゴヌクレオチドである
配列番号39は、例示的なssDNAオリゴヌクレオチドである
配列番号40は、ヒトMYCNOをコードする例示的なゲノムDNA配列である
詳細な説明
I定義および略称
以下の用語および略語の説明は、本開示をよりよく説明するために提供され、本開示の実施において当業者をガイドするために提供される 本明細書で使用されるように、特異的形態を含むことを含むことは、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の参考文献を含む 用語は、文脈がそうでない場合、文脈が明確に示されない限り、記載された代替要素の単一要素または2つ以上の要素の組み合わせを指す。用語は、手段を含む したがって、AAまたはBBを含むことは、Bを含むAを含むことを指す
AとBの両方を含む
説明しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する 本明細書に記載された方法及び材料と同様又は同等の方法及び材料は、本開示の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載される 材料、方法、および例は、例示であり、限定することを意図するものではない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである
数値範囲の開示は、特に断りのない限り、端点を含めた範囲内の各離散点を参照すると理解されるべきである 別段の指示がない限り、本明細書または特許請求の範囲で使用されるように、成分、分子量、パーセンテージ、温度、時間などの量を表すすべての数は、用語の項によって修飾されていると理解されるべきである したがって、特に明示的にまたは明示的に示されていない限り、または文脈が当業者によって適切に理解されなければ、より確定的な構成を有することは、当業者には適切に理解されない限り、 数値パラメータは、当業者に知られている標準的な試験条件/方法下で求められた所望の特性および/または検出の限界に依存し得る近似値である 上述した先行技術から直接的かつ明示的に実施態様を区別する場合には、実施番号は、単語が列挙されていなければ近似しない さらに、全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および核酸またはポリペプチドに与えられるすべての分子量または分子量値が近似であり、説明のために提供されることを理解されたい
本明細書に記載される様々な構成要素、パラメータ、動作条件などの代替物が存在するが、それらの代替物が必然的に同等である、および/または等しく良好に実行されることを意味しない Norは、そうでない限り好ましい順序で列挙されることを意味する
当業者は、以下に提供される定義が、許容される置換パターン(例えば、5個の異なる基で置換されたメチルなど)を含むことを意図していないことを認識するであろう このような不許容置換パターンは、当業者が容易に認識することができる。本明細書に開示される任意の官能基および/または上に定義される任意の官能基は、本明細書で別段の記載がない限り、置換または非置換とすることができる
化学的な共通用語の定義は、John Wiley&amp；Son、Inc、2016(ISBN 978-1-118-13515-0)によって公開されたRichard JLewis、Sr (ed)、Hawleyの縮合化学辞書に見出され得る 本開示の化合物はまた、化合物中に存在する原子の全ての同位体を含むが、これらに限定されないが、重水素、トリチウム、18F、14Cなどを含むことができる
当業者は、化合物が互変異性、コンフォメーション異性化、幾何異性化、及び/又は光異性化の現象を示し得ることを理解するであろう 例えば、特定の開示された化合物は、1つまたは複数のキラル中心および/または二重結合を含むことができ、結果として、二重結合異性体(すなわち、二重結合異性体)などの立体異性体として存在することができる ラセミ混合物のような、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、およびそれらの混合物。別の例として、ある開示された化合物は、エノール形態、ケト形態、および混合物を含むいくつかの互変異性形態で存在し得る
そのためのものである。本明細書及び特許請求の範囲内の様々な化合物名、式及び複合図面は、可能性のある互変異性体、立体構造異性体、光学異性体、又は幾何異性体形態のうちの1つのみを表すことができる 当業者は、開示された化合物が本明細書に記載の化合物の互変異性体、立体構造異性体、光学異性体、及び/又は幾何異性体形態を包含することを理解するであろう これらの様々な異なる異性体形態の混合物だけでなく、これらの様々な異性体形態の混合物も含む。エナンチオマーおよび/または立体異性体の混合物を含む、異なる異性体形態の混合物 当業者に知られている技術、特に本開示の利点を使用して、それぞれの別々の鏡像異性体および/または立体異性体を提供することができる。限定された回転の場合、例えば、 アミド結合の周囲、またはピリジニル環、ビフェニル基などの直接的に取り付けられた2つの環の間にも、アトロプ異性体も可能であり、本明細書に開示される化合物にも特に含まれる
任意の実施態様では、化合物中に存在する任意の又は全ての水素、又は化合物内の特定の基又は部分には、重水素又はトリチウムが置換されてもよい したがって、アルキルは、重水素化されたアルキルを含み、ここで、存在する水素の最大数は、重水素に置き換えられてもよい 例えば、メチルとは、CH 3またはCH 3の両方を指し、ここで、1-3個の水素は、CDxH 3-xなどの重水素に置換される
本明細書で使用される場合、用語"置換された"とは、例えば、用語"置換脂肪族-芳香族"の用語におけるすべての後続の修飾剤を指し、置換されてもよい 脂肪族-芳香族基の芳香族分又はその両方の部分
置換基は、特定の基または部分を修飾するために使用される場合、特定の基または部分の少なくとも1つ、およびおそらく2つ以上の水素原子が、独立して、同じまたは異なる置換基で置換されることを意味する 特定の実施態様では、基、部分、または置換基は、非置換または置換のいずれかとして明示的に定義されない限り、置換または非置換であってもよい したがって、本明細書で特定される官能基のうちのいずれかは、文脈がそうでないか、または特定の構造式が置換を阻害しない限り、非置換または置換されてもよい 特定の実施態様では、置換基は、置換されていてもよいし、明示的に定義されていなくてもよく、依然として置換されていてもよいことが企図されている 例えば、脂肪族または環状のものは、非置換であっても置換されていてもよいが、無置換の脂肪族または無置換の環状のものは置換されていない 一実施態様では、置換されている基は、1個の置換基、2個の置換基、3個の置換基、または4個の置換基などの特定の部分に可能な置換基の数まで少なくとも1つの置換基を有する
本明細書で定義される任意の基または部分は、価電子規則を考慮するなど、当業者に理解されるように、親またはコア構造などの開示された構造の任意の他の部分に接続することができる 構造の他の部分に対する基または部分の連結性が明示的に記載されていない限り、または文脈によって示唆されていない限り、例示的な種との比較、および/または機能性を考慮する
本開示の様々な実施態様の検討を容易にするために、以下の具体的な用語の説明が提供される
アシルハライド：-C (O)X (式中、Xは、Br、F、I、またはClなどのハロゲンである
投与：例えば、MCNの非正準位g 4(符号化N-Myc)などの非正準位g 4に選択的に結合する化合物(例えば、小化合物)を、任意の有効な経路によって、対象に提供または与える いくつかの実装形態では、投与は、例えば、c-MYCプロモーター中のG 4四重鎖DNAに選択的に結合する小分子化合物を、任意の有効な経路によって、対象に提供または与えることを含むことができる 投与の例示的な経路としては、経口、注射(皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内など)、舌下、直腸、経皮(例えば、局所)、鼻腔内、膣、および経皮などが挙げられるが、これらに限定されない 吸入経路及び吸入経路
Co投与または共投与とは、同じ一般時間内に少なくとも2つの治療化合物を投与することを指す 同じ正確な時点での投与を必要としない(同時投与は、同じ正確な時点で投与することを包含する) したがって、共投与は、同じ日または異なる日、または同じ週または異なる週であってもよい。本明細書に開示される治療用化合物は、同一の組成物に含まれていてもよいし、それぞれが別々に含まれていてもよい 組成物。特定の実施態様では、2つの化合物は、生物活性のそれぞれの期間が重複する時間フレーム中に投与されてもよい したがって、用語は、2つ以上の化合物の連続的な連続的な投与を含む
本発明の化合物の投与および投与は、本明細書に記載の化合物、化合物のプロドラッグ、または医薬組成物を提供することを意味するべきである 化合物または組成物は、被験体(例えば、静脈内)に他の人によって投与することができ、または被験体(例えば、錠剤)によって自己投与することができる
剤：任意の物質、または、末端または結果を達成するために有用な物質の任意の組み合わせ、例えば、対象における腫瘍成長を減少または減少させるのに有用な物質または物質の組み合わせ 薬剤は、エフェクター分子および検出可能なマーカーを含む。いくつかの実装形態では、薬剤は化学療法剤である。当業者は、特定の薬剤が、例えば、1つを超える結果を達成するのに有用であり得ることを理解するであろう 薬剤は、検出可能なマーカーおよび化学療法剤の両方として有用であり得る
アルデヒド：-C (O)H
脂肪族：1-25個の炭素原子(C 1-25)、又は1-10個の炭素原子(C 1-10)などの少なくとも1つの炭素原子-50個の炭素原子(C 1-50)を有する炭化水素基(例えば、実質的に炭化水素系化合物) 又は1-6個の炭素原子(C 1-6)、又は1-4個の炭素原子(C 1-4)を含み、アルカン(又はアルキル)、アルケン(又はアルケニル)、それらの環状バージョンを含むアルキン(又はアルキニル)を含む さらに、直鎖及び分岐鎖配列、並びに全てのステレオ及び位置異性体も含む。脂肪族基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族などの水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基。例示的な置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシル、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノアルキル、アリール、アリールアルキル、カルボキシル、 シアノ、シクロアルキル、ジアルキルアミノ、ハロ、ハロ脂肪族、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式、ヒドロキシル、オキソ、スルホンアミド、スルフヒドリル、チオアルコキシ、または他の官能性である
アルケニル：2-25個の炭素原子(C2～25)、または2-10個の炭素原子(C2～10)などの少なくとも2つの炭素原子-50個の炭素原子(C2～50)を有する不飽和1価炭化水素 少なくとも1つの炭素-炭素二重結合とを含み、前記不飽和1価炭化水素は、親アルケンの1つの炭素原子から1つの水素原子を除去することから誘導され得る。アルケニル基は、分岐し、直鎖状、環状(例えば、環状)とすることができる シクロアルケニル)、シス又はトランス(例えば、e又はZ)。アルケニル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されていてもよい
アルコキシ：-O-アルキル、-O-アルケニル、-O-アルキニルなどのアルコキシ：-O-脂肪族、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、i-ブトキシ、t-ブトキシ、sec-ブトキシ、n-ペンキ、シクロプロポキシ、シクロヘキシルオキシ、 そのような基の脂肪族成分のいずれかは、二重結合又は三重結合を含まないか、又は1つ以上の二重結合及び/又は三重結合を含むことができる アルコキシ基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい
アルキル：炭素原子数1-25の炭素原子数1-50の飽和1価炭化水素(C 1-25)、又は炭素数1-10の飽和1価炭化水素(C 1-10) 飽和1価炭化水素は、親化合物(例えば、アルカン)の1つの炭素原子から1つの水素原子を除去することから誘導され得る。アルキル基は、分岐、直鎖、または環状(例えば、シクロアルキル)であり得る アルキル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい いくつかの実施態様では、低級アルキルまたは(C 1-C 6)アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル、ペンチル、3-ペンチル、またはヘキシルであり得；(C 3-C 6)シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルであり得る (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキルは、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、2-シクロプロピルエチル、2-シクロブチリル、2-シクロペンチルチニル、または2-シクロヘキシルエチルであり得る (C1-C6)アルコキシはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、ペンキ基、3-ペンキ基、ヘキシルオキシ基、(C2-C6)アルケニル基はビニル基、アリル基、1-プロペニル基、2-プロペニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、 3-ブテニル、1、-ペンテニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、4-ペンテニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、又は5-ヘキセニル；(C 2-C 6)アルキニルはエチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、 4-ペンチニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、4-ヘキシニル、又は5-ヘキシニル；(C 1-C 6)アルカノイルはアセチル、プロパノイル又はブタノイルであり、ハロ(C 1-C 6)アルキルはヨードメチル、ブロモメチル、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、2-クロロエチル、2-フルオロエチル、 ヒドロキシ(C1-C6)アルキルは、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、2-ヒドロキシエチル、1-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、1-ヒドロキシブチル、4-ヒドロキシブチル、1-ヒドロキシペンチル、 5-ヒドロキシペンチル、1-ヒドロキシヘキシル又は6-ヒドロキシヘキシル；(C 1-C 6)アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペンチルカルボニル、又はヘキシルオキシカルボニル；(C 1-C 6)アルキルチオはメチルチオ、 エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、イソブチルチオ、ペンチルチオ、またはヘキシルチオ(C 2-C 6)アルカノイルオキシは、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、イソタロキシ、ペンタノイルオキシ、またはヘキサノイルオキシであり得る
アルキニル：2-25個の炭素原子(C2～25)、または2-10個の炭素原子(C2～10)などの少なくとも2つの炭素原子-50個の炭素原子(C2～50)を有する不飽和1価炭化水素 少なくとも1つの炭素-炭素三重結合とを含み、前記不飽和1価炭化水素は、親アルキンの1つの炭素原子から1つの水素原子を除去することから誘導され得る。アルキニル基は、分岐、直鎖、または環状であり得る(例えば、) シクロアルキニル)。アルケニル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい
アミド：-C (O)NReRf又は-NReC (O)Rf(式中、Re及びRfはそれぞれ独立に、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、 脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、有機官能基等の水素以外の1以上の基で置換されていてもよい
アミノ：-NReRf(式中、ReおよびRfは、それぞれ独立に、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される 脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい
アナログ：化学構造が親化合物とは異なる分子、例えばホモログ(化学構造または質量の増分によって異なる) 分子フラグメント、1つ以上の官能基によって異なる構造、またはイオン化の変化のような、アルキル鎖の長さの差、または1つの同位体の含有量の差など) アナログは、必ずしも親化合物から合成される必要はない。誘導体は、塩基構造に由来する分子である
芳香族：単環(例えば、フェニル)又は少なくとも1つの環が芳香族である複数の縮合環(例えば、フェニル)又は複数の縮合環を有する5-15個の環原子の環式共役基又は部分 ナフチル、インドリル、またはピラゾロピリジニル)；すなわち、少なくとも1つの環、および場合によっては複数の縮合環を有し、連続した非局在化π電子系を有する 典型的には、面π電子のアウト数は、Hunckel規則(4n+2)に対応する。親構造への取り付け点は、典型的には貫通している
縮合環系の芳香族部分。例えば、
Figure 2024522183000006
 しかしながら、特定の例では、コンテキストまたはエクスプレス開示は、付着点が非芳香族を介していることを示すことができる
縮合環系の一部。例えば、
Figure 2024522183000007
 芳香族基または部分は、アリール基または部分のような環内の炭素原子のみを含んでもよく、または、1つ以上の環炭素原子および1対の電子を含む1つ以上の環ヘテロ原子を含んでもよい(例えば、) S、O、N、P、又はSi)(例えば、ヘテロアリール基又は部分)。芳香族基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、脂肪族脂肪族、ハロゲン化脂肪族、ハロゲン化脂肪族、ハロゲン化脂肪族、ハロゲン化脂肪族、 有機官能基又は有機官能基
アリール：少なくとも5個の炭素原子を含む芳香族炭素環式基、および5-10個の炭素原子(C 5-C 10)などの少なくとも5個の炭素原子-15個の炭素原子(C5-C15)を有するいくつかの実施態様では、 縮合環は、本明細書に開示される化合物の残りの位置への付着点が芳香族炭素環基の原子を通っていることを示す、単一の環または複数の縮合環を有する、または芳香族でなくてもよい アリール基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい いくつかの実施態様では、アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアルコキシを含むがこれらに限定されない1つ以上の基で置換され得る
Arxy：-O-芳香族。アリールオキシ基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい
Azo：-N=NRd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である アゾ基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい
癌：分化損失、成長速度、周囲組織の侵入、転移可能な特性無形成を受けた悪性腫瘍 例えば、甲状腺癌は、甲状腺組織または甲状腺組織に生じる悪性腫瘍であり、乳癌は、乳房組織(例えば、管癌)に生じる悪性腫瘍である 残存癌は、癌を還元または根絶するために被験体に与えられた任意の形態の治療後に被験体に残存する癌である 転移性癌は、転移性癌が由来する原(一次)癌の起源部位以外の体内の1以上の部位の腫瘍である。癌は、限定されないが、固形腫瘍を含む
カルバメート：-OC (O)NReRf(式中、ReおよびRfは、それぞれ独立に、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される
カルバメート基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
カーボネート：-OC (O)ORd(式中、Rdは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される カーボネート基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る 独立した実施では、Rdは水素であり得る
カルボキシル基：-C (O)OH
カルボキシレート：-C(O)O-またはその塩であって、カルボキシレート基の負電荷は、M+対イオンと均衡してもよく、ここで、M+は、K+、Na+、Li+などのアルカリイオンであってもよい；+N(Re)4のようなアンモニウムイオン、例えば、[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5、または[Ba2+]0.5などのアルカリ土類イオンが挙げられる
化学療法剤：異常細胞増殖を特徴とする疾患の治療における治療的有用性を有する任意の薬剤。例えば、化学療法剤は、神経芽腫の治療に有用である 使用され得る追加の治療剤の特定の例としては、微小管結合剤、DNAインターカレーターまたは架橋剤、DNA合成阻害剤、DNAおよびRNA転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、 遺伝子調節剤および血管新生阻害剤。一実施態様では、化学療法剤は放射性化合物である。当業者は、使用する化学療法剤(例えば、SlapakおよびKufeを参照)を容易に識別することができる 癌治療の原理、第14版のHarrisonの原理における章86、14回目の編集；Perry et al、化学療法、CH。17：Abeloff、臨床癌2nd、C。2000Chury Livingstone、Inc；Baltzer、L、Berkery、R (eds)：化学療法に対する腫瘍学的ポケットガイド、第2のEd St Louis、Mosby-年Book、1995；Fischer、DS、Knobf、MF、Durimiss、HJ (eds)：癌化学療法ハンドブック、4番目のSt Louis、Mosby-年Book、1993；Chabner and Longo、癌化学療法および生物療法：原理および実践(4番目)。φladelphia：Lipincott Willians&Amps、2005；Skeel。癌化学療法のハンドブック(6番目) Lipincott Williams&Amps、2003)。併用化学療法は、がんを治療するための1つ以上の薬剤の投与である
対照：実験試料との比較に用いられる試料または標準。いくつかの実装形態では、制御は、健康な患者、または癌と診断された患者から得られた非腫瘍組織サンプルから得られたサンプルである 他の実施態様では、制御は、癌と診断された患者から得られた腫瘍組織サンプルである。いくつかの実装形態では、制御は、癌と診断された患者から得られた腫瘍組織サンプルである 本明細書に開示されるように、患者がG 4安定化剤で処理を受けていない場合、患者は、G 4安定化剤で処理を受けていない。さらに他の実装形態では、制御は、過去の制御または値の範囲(例えば、以前に試験された制御など)である 非腫瘍組織におけるMCNまたはMYC遺伝子の発現レベルなどのベースラインまたは正常値を表す、既知の予後または結果を有するがん患者のグループ、またはベースラインまたは正常値を表すサンプルのグループなどのサンプル
シアノ：-CN
減少または減少には、例えば腫瘍の負担を軽減するために、何かの品質、量、または強度を低下させる。一例では、治療は、腫瘍(腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移、腫瘍の転移など)を減少させる またはそれらの組み合わせ)、または治療の非存在下での応答と比較して、腫瘍に関連する1つ以上の症状を示す 特定の例では、治療は、治療後、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%の減少などの治療後に、腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移、またはそれらの組み合わせを減少させる 少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%である。このような減少は、本明細書に開示される方法を使用して測定することができる
遺伝子産物の発現レベルを決定または検出すること：例えば、核酸分子またはタンパク質を検出することによって、定性的または定量的に発現レベルの検出 例えば、当該技術分野で知られているルーチン法を使用する
診断：その兆候、症状、及び種々の試験の結果によって疾患を同定するプロセス。このプロセスを経て到達した結論は、診断とも呼ばれる 一般的に行われる検査の形態には、血液検査、医療用イメージング、尿検査、および生検が含まれる
ジスルフィド：-SSRd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される ジスルフィド基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
ジチオカルボン：-C (S)SRd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される ジチオカルボン酸基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
エステル：-C (O)ORd又は-OC (O)Rd(式中、Rdは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基から選択される いくつかの実施態様では、CO 2C 1-3アルキル基は、例えば、メチルスター(CO2Me)、エチニルエステル(CO 2Et)、およびプロピルエステル(CO 2Pr)などが好ましく、その逆エステル(例えば、-OC (O)Me、-OC (O)Etおよび-OC (O)Pr)を含む エステル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
エーテル：-脂肪族-O-脂肪族、-脂肪族-O-芳香族、-芳香族-O-脂肪族、または-芳香族-O-芳香族。エーテル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族などの水素以外の1つ以上の基で置換され得る 芳香族又は有機官能基
ヘアピン：ヘアピンという用語は、同じストランドの2つの領域が、通常は逆方向に読み取られたときに配列が相補的であるDNA構造を指す ベース対は、ヘアピンの遠位端に不対ループを有する二重螺旋を形成する：
Figure 2024522183000008
ハロ(またはハロゲン化物またはハロゲン)：フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード。いくつかの実装形態では、ハローはまた、アスタチンを含むことができる
ハロ脂肪族：1-10個の水素原子などの1つ以上の水素原子が、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードなどのハロゲン原子で置換されている脂肪族基 ハロ脂肪族基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
ハロアルキル：1-10個の水素原子等の1つ以上の水素原子が、フルオロ、ブロモ、クロロ又はヨード等のハロゲン原子で置換されているアルキル基 ハロアルキル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る。独立している
実施態様では、ハロアルキルは、CX3基であり得、ここで、各Xは独立して、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードから選択され得る
ハロヘテロ脂肪族：1-10個の水素原子などの1つ以上の水素原子が、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードなどのハロゲン原子で置換されているヘテロ脂肪族基 ハロヘテロ脂肪族基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
ヘテロ脂肪族：少なくとも1つのヘテロ原子を含む脂肪族基、例えば1-15個のヘテロ原子、又は1-5個のヘテロ原子を含むが、これらは酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、又はこれらに限定されない リン及びその酸化形態は、基内で行われる
アルコキシ、エーテル、アミノ、ジスルフィド、ペルオキシ、およびチオエーテル基は、ヘテロ脂肪族の例(ただし、非限定的)の例である。ヘテロ脂肪族基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂肪族などの水素以外の1つ以上の基で置換され得る ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基
ヘテロアリール：1つ-4つのヘテロ原子のような6個のヘテロ原子への少なくとも1つのヘテロ原子を含む芳香族基(例えば、アリール基)は、酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、およびこれらに限定されないが、これらに限定されない リンおよびその酸化形態は、環内である。このようなヘテロアリール基は、単環または複数の縮合環を有することができ、ここで、縮合環は、芳香族および/またはヘテロ原子を含有していてもよく、 前記アタッチメントの点は、前記芳香族ヘテロアリール基の原子を介していることを特徴とする。ヘテロアリール基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族などの水素以外の1つ以上の基で置換されてもよい 芳香族又は有機官能基
ヘテロ原子：(ただし、これらに限定されない)酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、またはリンなどの、炭素または水素以外の原子 特定の開示される実施形態では、原子価の制約が許容されない場合など、ヘテロ原子はハロゲン原子を含まない
複素環/ヘテロ環式：少なくとも1つの炭素原子と少なくとも1つのヘテロ原子、すなわち1つ以上の炭素原子を有する脂環式基は、典型的には窒素である少なくとも1つの電子対を有する原子で置換されている 酸素、リン、ケイ素、又は硫黄。複素環基は、単環式または二環式であってもよい
ヒドロキシ：式-OHで表される基
分離または精製された：生物学的成分は、成分が天然に生じる生物の細胞内の他の生物学的成分から実質的に分離または精製された成分である 他の染色体および染色体DNAおよびRNA、タンパク質、脂質、およびオルガネラ。単離物質は、絶対的な純度を必要としない 例えば、所望の単離された生物学的構成要素は、調製物の総含有量の少なくとも50%、特に少なくとも約75%、より具体的には少なくとも約90%、特に少なくとも約98%を表すことができる 本明細書に記載されるような単離された生物学的構成要素は、塩分別、フェノール抽出、有機溶媒(例えば、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド)による沈殿などの多くの方法によって単離することができる
エタノール)、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、iso-電気集束、物理的分離(例えば、遠心分離または撹拌)などが挙げられる
精製された用語は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質がその天然にあるペプチドまたはタンパク質よりも富化されたものである 細胞内の環境。例えば、所望の多糖タンパク質複合体が少なくとも50%、より具体的には少なくとも約90%、最も特に少なくとも約98%を表すように、化合物調製物が精製される )で表される化合物を含有することを特徴とする
ケトン：-C (O)Rd(式中、Rdは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される ケトン基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
窒素含有基：少なくとも1つの窒素原子を含む基。いくつかの実施態様では、窒素含有基は、アミド基またはアミノ基である いくつかの実施態様では、窒素含有基は、少なくとも1つの窒素原子を含む、モノまたは二環式環、または環系を含むことができる 環又は環系は、一般に、ヘテロ原子に加えて1-9個の炭素原子を含み、飽和、不飽和又は芳香族(擬芳香を含む)であってもよい "擬芳香族"という用語は、電子の脱局在化によって安定化され、芳香環と同様に挙動するリングシステムを指す。芳香族は、ピロリル環などの擬芳香環系を含む
窒素含有基の例としては、ピロリル、H-ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、(1、2、3-および1、2、4-オキサジアゾール)イソキサゾリル、フラジラニルなどのヘテロアリール基および/またはシクロヘテロ脂肪族基が挙げられる チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、トリアゾリル(1、2、3-および1、3、4-トリアゾリル)、テトラゾリル、チアジアゾリル(1、2、3-および1、3、4-チアジアゾールを含む)、ジチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、 ピリジルニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリン、ピペラジニル、トリアジニル、1Hチエノ[2、3-c]ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、イソキノリニル、ベンゾイソチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、イソキノリニル、 キノリニル、キノキサリニル、プリン、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾトリアジニルなど。このような窒素含有基は、フェニル、ナフチル、インデニル、アズレニル、フルオレニルなどの炭素環式環に融合することができる アントラセニル。特に断りのない限り、置換されていてもよい環状窒素含有基は、ピリジニウム塩および好適な環窒素原子のN-オキシド形態を含む いくつかの実施態様では、窒素含有基は、任意選択で、広範な置換基、好ましくはC 1-6アルキル、C 1-6アルコキシ、C 2-6アルケニル、C 2-6アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アミノ、 シアノ又はモノ又はジ(C 1-6アルキル)アミノ
N-Myc：N-Mycタンパク質は、MCN遺伝子によってコードされる。MYCNは胎児の発達に重要であることが示されており、神経組織において高度に発現されている MYCNは、しばしば、癌において過剰発現または変異され、癌遺伝子、特に神経芽腫および小細胞肺癌であると考えられる。MCNのための配列情報は、公開データベース、例えば、アンサンブルbl (uswestensebl)に記載されている 有機遺伝子ID no：ENSG 00000134323。MYCN対向鎖(MYCNO)は、MYCNのアンチセンス鎖上に配置される。MYCNOの発現は、MCNのプロモーター占有率を低下させ、配列を介したMCN転写安定性安定性を制御することが示されている 相補性。より最近の研究では、NCYM、MYCNO転写産物の変異体2を翻訳して、小さなタンパク質を生成することもできることが示されている NCYMとして知られるこのポリペプチドは、N-Mycタンパク質の安定性を制御し、Gsk 3βを阻害し、Wnt/β-カテニンシグナル伝達に影響を及ぼすことを含む、多様な調節活性を有することを特徴としている MYCNOのための配列情報は、公開データベース、例えば、アンサンブルbl (uswest。アンサンブル。log。org)遺伝子ID no：ENSG 00000233718に記載されている
有機官能基：脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、ハロ脂肪族、及び/又はハロヘテロ脂肪族基の任意の組み合わせによって提供されてもよい、又はこれらに限定されないが、アルデヒド、アラルキルオキシ、又はこれらに限定されない官能基 アシルハロゲン化物；ハロゲン；ニトロ；シアノ；アジド；カルボキシル(又はカルボキシレート)；アミド；ケトン；炭酸；イミン；アゾ；カルバメート；ヒドロキシル；チオール；スルホニル(又はスルホネート)；オキシム；エステル；チオシアン酸；チオケトン；チオカルボン酸；チオエステル；ジチオカルボン； ホスホン酸塩、リン酸塩、シリルエーテル、スルフィニル、スルホンアミド、雷、またはそれらの組み合わせ。有機官能基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族などの水素以外の1つ以上の基で置換され得る ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基
オキシム：-CRd=NOH (式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である オキシム基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
ペルオキシ：-O-ORd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である ペルオキシ基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
医薬組成物：開示された化合物のうちの1つ以上の量(例えば、単位用量)を含む組成物であって、1つ以上の非毒性の薬学的に許容される添加剤とともに、担体、希釈剤、および希釈剤を含む組成物 および/またはアジュバント、および任意選択的に他の生物学的に活性な成分。このような医薬組成物は、Remingtonの医薬科学に開示されているような標準的な医薬製剤技術によって調製することができる Mack Publishing Co、Easton、PA (19th Edition)
薬学的に許容される担体：その薬学的に許容される担体は、従来のものである。E。W。Martin、Mack Publishing Co Easton、PA、19th Edition、1995には、開示された免疫原の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は、通常、注射可能な流体を含む
水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容可能な流体は、ビヒクルとしてのものである。固体組成物(例えば、) 粉末、錠剤、錠剤、又はカプセル型)、従来の非毒性固体担体は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムの製薬グレードを含むことができる 投与される医薬組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤などの微量の非毒性の補助物質を含むことができる 例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート。特定の実施態様では、被検者への投与に適していてもよく、担体は滅菌されてもよい 所望の腫瘍応答を誘導するのに適した組成物の1つ以上の測定された用量を含む単位剤形に懸濁または他の方法で含有される。それはまた、治療目的のためのその使用のための薬剤を伴うことができる 単位剤形は、例えば、被検体内に注射するための滅菌内容物または注射器を含む密閉バイアルであってもよく、またはその後の可溶化および投与のために凍結乾燥されてもよいし、固体または制御された放出用量であってもよい
薬学的に許容される塩またはエステル：例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸を含むがこれらに限定されない、無機および有機酸などの塩を含む従来の手段によって調製された塩またはエステル メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸等
本開示の化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛、およびアンモニア、エチレンジアミン、N-メチル-グルタミンなどの塩基から形成されるものも含む リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、N、N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、N-ベンジルフェニルエチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド これらの塩は、例えば、遊離酸を適切な有機または無機塩基と反応させることによって、標準的な手順によって調製することができる 本明細書に記載の任意の化合物は、その薬学的に許容される塩として投与されてもよい。薬学的に許容される塩は、遊離酸、塩基、および双性イオン形態も包含する 適切な薬学的に許容される塩の説明は、医薬塩のハンドブック、特性、選択および使用、Wiley VCH (2002)に見出すことができる 本明細書に開示される化合物は、カルボキシ基のような酸性関数を含む場合、カルボキシ基のための適切な薬学的に許容されるカチオン対は当業者によく知られており、アルカリ、アルカリ土、 アンモニウム、第四級アンモニウムカチオン等。そのような塩は当業者に知られている。薬理学的に許容される塩の追加の例として、Bergeら、J。Pharmを参照されたい。S。66：1(1977)
薬学的に許容されるエステルは、カルボキシル基を含むように修飾された本明細書に記載の化合物由来のものを含む 生体内加水分解性エステルはエステルであり、これはヒトまたは動物の体内で加水分解され、親酸またはアルコールを生成する したがって、代表的なエステルは、エステル化のカルボン酸部分の非カルボニル部分が、直鎖または分枝鎖アルキル(例えば、メチル、n-プロピル、t-ブチル、またはn-ブチル)から選択されるカルボン酸エステルを含む シクロアルキル、
アルコキシアルキル(例えば、メトキシメチル)、アラルキル(例えばベンジル)、アリールオキシアルキル(例えばフェノキシメチル)、アリール(例えば、ハロゲン、C。sub。1-4アルキル、またはcsubによって置換されていてもよいフェニル)、アリール(例えば、フェニル) 1-4アルコキシ)またはアミノ)；アルキルまたはアラルキルスルフォイル(例えば、メタンスルホニル)などのスルホン酸エステル；またはアミノ酸エステル(例えば、L-バリルまたはL-イソロイシル) 薬学的に許容されるエステルはまた、モノ-、ジ-、またはトリ-リン酸エステルなどの無機エステルを含む。このようなエステルにおいて、特に断らない限り、任意のアルキル部分は、有利には1-18個の炭素原子を含有し、 特に1-6個の炭素原子、より具体的には1-4個の炭素原子を含む。このようなエステル中に存在する任意のシクロアルキル部分は、3-6個の炭素原子を有利に含む このようなエステル中に存在する任意のアリール部分は有利にはフェニル基を含み、置換されていてもよい したがって、薬学的に許容されるエステルは、アセチル、t-ブチル、または長鎖の直鎖または分枝不飽和またはω-6モノ不飽和脂肪酸などのC1-C22脂肪酸エステル、例えば、パモイル、ステアロイルなどを含む 代替のアリール又はヘテロアリールエステルは、上述のカルボシクリルに定義されるように、いずれも置換されていてもよいベンゾイル、ピリジルメチロール等を含む 追加の薬学的に許容されるエステルは、ロイシル、イソロイシル、特にバリルのような脂肪族L-アミノ酸エステルを含む
治療のために、化合物の塩は、対イオンが薬学的に許容可能であるものである。しかしながら、非薬学的に許容される酸及び塩基の塩は、例えば、使用を見出すこともできる 薬学的に許容される化合物の調製または精製において、
前述のような薬学的に許容される酸および塩基付加塩は、治療的に活性な非毒性の酸および化合物が形成することができる塩基付加塩を含むことを意味する 薬学的に許容される酸付加塩は、塩基形態をこのような適切な酸で処理することによって簡便に得ることができる。適切な酸は、例えば、ハロゲン化水素酸などの無機酸を含む 塩酸または臭化水素酸、硫酸、硝酸、リンなどの酸または有機酸、例えば、酢酸、プロパン、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン、シュウ酸、マロン、コハク酸などの有機酸 ブタン二酸)、マレイン、フマル酸、リンゴ(すなわち、ヒドロキシブタン二酸)、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクラミン、サリチル酸、p-アミノサリチル酸、パモ等の酸 逆に、塩形態は、適切な塩基を用いた処理によって遊離塩基形態に変換することができる
酸性プロトンを含む化合物はまた、適切な有機及び無機塩基で処理することによって、それらの非毒性金属又はアミン付加塩形態に変換されてもよい 適切な塩基塩形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等、有機塩基との塩を含む ベンジルアジン、N-メチル-D-グルカミン、ヒドロアビアミン塩、および、例えばアルギニン、リジンなどのアミノ酸との塩
上で使用される用語付加塩はまた、本明細書に記載の化合物が形成することができる溶媒和物を含む。このような溶媒和物は、例えば、水和物、アルコラートなどである
以上のような第4級アミンの用語は、化合物が化合物の塩基性窒素と適切な反応を形成することができる第4級アンモニウム塩を規定する
四級化剤、例えば、置換基を有していてもよいアルキルハライド、アリールハライド又はアリールアルキルハライド、例えば、メチルヨードド又はベンジリデンジde等が挙げられる 脱離基が良好な他の反応物もまた、アルキルトリフルオロメタンスルホネート、アルキルメタンスルホネート、及びアルキルp-トルエンスルホン酸塩のような使用することができる。第四級アミンは、正に帯電した窒素を有する 薬学的に許容される対イオンは、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロ酢酸塩およびアセテートを含む。選択の対イオンは、イオン交換樹脂を使用して導入することができる
開示された化合物のプロドラッグも本明細書で企図される。プロドラッグは、加水分解、代謝等の生体内の生理学的作用により化学的に修飾された活性又は不活性な化合物である 該プロドラッグを被験体に投与した後、活性化合物中に該プロドラッグを投与することを含む方法。このテキスト全体にわたって使用される用語"プロドラッグ"は、エステル、アミドおよびリン酸エステルなどの薬理学的に許容される誘導体を意味する その結果として得られる誘導体の生体内変換生成物は、本明細書に記載の化合物中に定義される活性薬物である プロドラッグは、好ましくは、優れた水溶性、高い生物学的利用能を有し、インビボで活性阻害剤に容易に代謝される 本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、修飾が、定常的な操作によって、またはインビボで、親化合物に切断されるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製され得る プロドラッグの作製および使用に関与する適性および技術は、当業者によってよく知られている。エステルを含むプロドラッグの一般的な議論では、SsvssonおよびTunekを含むプロドラッグの一般的な議論のために、薬物代謝レビュー165(1988)および結束バンド(Bundgaard)が示されている プロドラッグ、Elsevier (1985)の設計
用語"プロドラッグ"はまた、プロドラッグが対象に投与されたときに、インビボで本発明の活性親薬物を放出する任意の共有結合した担体を含むことを意図している プロドラッグは、しばしば、溶解性および生物学的利用能などの活性薬剤医薬に対する改善された特性を有するので、本明細書に開示される化合物は、プロドラッグの形態で送達され得る したがって、本明細書に開示される化合物のプロドラッグ、プロドラッグを送達する方法、およびそのようなプロドラッグを含む組成物も企図される 開示された化合物のプロドラッグは、典型的には、化合物中に存在する1つ以上の官能基を修飾することによって調製され、修飾は、ルーチン操作またはインビボで切断され、親化合物を生成する プロドラッグは、それぞれ対応するアミノ基および/またはホスホネート基を生成するためにインビボで切断される任意の基で官能化されたホスホネートおよび/またはアミノ基を有する化合物を含む プロドラッグの例としては、限定するものではないが、アシル化されたアミノ基および/またはホスホン酸エステルまたはホスホネートアミド基を有する化合物が挙げられる 特定の例では、プロドラッグは、ホスホネートエステルなどの低級アルキルホスホン酸エステルである
開示された化合物の保護された誘導体も企図される。開示された化合物と共に使用するための様々な適切な保護基は、GreeneおよびWuts、有機合成における保護基、3rd Edに開示されている 、John Wiley&ampand Sons、New York、1999
一般に、保護基は、分子の残りの部分に影響を及ぼさない条件下で除去される。これらの方法は、当技術分野で周知であり、酸加水分解、水素化分解などを含む 1つの好ましい方法は、遊離ホスホネートを生成するためにTMS-Br媒介エステル開裂などのルイス酸性条件を使用してホスホン酸エステルの開裂などのエステルを除去することを含む 第2の好ましい方法は、炭素中のパラジウムを利用した水素化分解によるベンジル基の除去などの保護基を、アルコール、酢酸などの適切な溶媒系またはそれらの混合物中で除去することを含む t-ブトキシカルボニル保護基を含むt-ブトキシ基は、水、ジオキサン、および/または塩化メチレンなどの好適な溶媒系において、HClまたはトリフルオロ酢酸などの無機または有機酸を利用して除去することができる アミノおよびヒドロキシ機能アミノを保護するのに適した別の例示的な保護基はトリチルである。他の従来の保護基が知られており、適切な保護基は、相談の当業者によって選択され得る Greene及びWuts、保護基：有機合成における保護基；第3Ed；John Wiley&amp；Son、New York、1999；アミンが脱保護された場合、得られた塩を容易に中和して遊離アミンを生成することができる 同様に、ホスホン酸部分のような酸部分が不揮発性である場合、化合物は、酸化合物として、またはその塩として単離されてもよい
リン酸塩：-O-P(O)(ORd)2(式中、各Rdは、それぞれ独立に、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である；1つ以上のRd基が存在せず、したがってリン酸基が対イオン、M+でバランスされ得る少なくとも1つの負電荷を有し、各M+は独立して、K+、Na+、Li+などのアルカリイオンであり得る；脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族等のアンモニウムイオン、又は[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5又は[Ba2+]0.5等のアルカリ土類イオンを含有し、前記リン酸エステルのRd基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族又は有機官能基等の水素以外の1以上の基で置換されていてもよい
ホスホネート：-P(O)(ORd)2(式中、各Rdは、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である；1つ以上のRd基が存在せず、したがってリン酸基が対イオン、M+でバランスされ得る少なくとも1つの負電荷を有し、各M+は独立して、K+、Na+、Li+などのアルカリイオンであり得る；脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族等のアンモニウムイオン、又は[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5又は[Ba2+]0.5等のアルカリ土類イオンを含有し、前記ホスホン酸基のRd基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族又は有機官能基等の水素以外の1以上の基で置換されていてもよい
シリルエーテル：-OSiReRf(式中、ReおよびRfは、それぞれ独立に、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される シリルエーテル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
本明細書で使用されるように、用語小分子は、分子量が1000ダルトン以下の分子(例えば、900ダルトン以下、800ダルトン以下、700ダルトン以下、600ダルトン以下、500ダルトン以下、 400ダルトン以下、300ダルトン以下、200ダルトン以下、又は100ダルトン以下)。いくつかの例では、小分子は、100-1000ダルトン、200-900ダルトン、200-700ダルトン、または200-500ダルトンの分子量を有する
対象：非ヒト霊長類、コンパニオンアニマル(イヌおよびネコなど)、家畜(ブタ、ヒツジ、牛など)、ならびに非ドーム化動物などの、鳥類および非ヒト哺乳動物を含む、ヒトおよび非ヒト対象の両方を含む このようなビッグネコ等の化合物は、例えば、一般式(I)で表される化合物。対象となる用語は、生物のライフサイクルにおけるステージに関係なく適用される。したがって、被験者は、生体(すなわち、生物が哺乳動物または鳥であるか否か)に応じて、子宮内または卵子中の生物に適用される 例えば、ドーム化された家禽または野生の家禽など)
スルフィニル：-S (O)Rd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される スルフィニル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
スルホニル：-SO 2Rd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される スルホニル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
スルホンアミド：-SO 2NReR又は-N (Re)SO 2Rf(式中、Re及びRfはそれぞれ独立に、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、芳香族、 有機官能基又は有機官能基。スルホンアミド基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
スルホン酸基の負電荷は、M+対イオンと均衡していてもよく、ここで、M+は、K+、Na+、Li+のようなアルカリイオンであってもよい。ここで、Reは、H、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、または芳香族である。または、[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5、または[Ba2+]0.5などのアルカリ土類イオンであってもよい
治療上有効な量：単独で、または1つ以上の追加の薬剤と共に、対象における腫瘍の治療などの所望の応答を誘導する 理想的には、治療上有効な量は、対象に実質的な細胞傷害効果を生じさせることなく治療効果を提供する
一例では、所望の応答は、対象における腫瘍のサイズ、体積、または数(転移など)を減少させることである。例えば、薬剤または薬剤は、所望の量だけ腫瘍のサイズ、体積、または数を減少させることができる 例えば少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、または少なくとも95%である
本明細書に開示されるいくつかの調製物は、治療的に有効な量で投与される。ヒトまたは獣医学的対象に投与される治療有効量の開示された化合物は、数に依存して変化する その対象に関連する因子、例えば、対象の総合的な健康。治療上有効な量は、投与量を変化させ、得られた治療応答、例えば腫瘍の回帰などの治療応答を測定することによって決定することができる 治療有効量はまた、in vitro、in vivoまたはin situ免疫アッセイにおいて種々のin vitroで決定することができる。開示されている
薬剤は、所望の応答を得るために必要に応じて、1回の用量で、またはいくつかの用量で投与することができる。しかしながら、治療的に有効な量は、処理されている供給源に依存することができる 処理されている状態の重症度およびタイプ、ならびに投与の様式
THC：-C (S)H
チオカルボン酸：-C (O)SH、又は-C (S)OH
チオシアン酸塩：-S-CN又は-N=C=S
チオエステル：-C (O)SRd又は-C (S)ORd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、又は有機官能基から選択される チオエステル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
チオエーテル：-S-脂肪族または-S-芳香族、例えば-S-アルキル、-S-アルケニル、-S-アルキニル、-S-アリール、または-S-ヘテロアリール；または-脂肪族-S-脂肪族、-脂肪族-S-芳香族、-芳香族-S-脂肪族、または-芳香族-S-芳香族である チオエーテル基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
チオケトン：-C (S)Rd(式中、Rdは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される チオケトン基は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基のような、水素以外の1つ以上の基で置換され得る
疾患を治療または阻害すること：疾患(腫瘍など)に関連する疾患または病態の標識または症状を減少させる治療介入。治療はまた、腫瘍などの状態の寛解または治癒を誘導することができる 特定の例では、治療は、例えば、腫瘍の完全な発達を阻害することによって、例えば、転移の発達または一次腫瘍の発達を防止することによって、腫瘍を予防することを含む 防止は、腫瘍の総不在を必要としない
疾患または疾患に関連する病態の兆候または症状を低減することは、処理の観察可能な有益な効果を意味する 腫瘍に関連する標識または症状を低減することは、例えば、感受性の対象における疾患の臨床症状の遅延発症(例えば、まだ転移していない腫瘍を有する対象)によって証明され得る 疾患の一部または全ての臨床症状の重症度の低下、疾患のより遅い進行(例えば、腫瘍を有する被験体の寿命を延長することによる)、疾患の再発数の減少、 特定の腫瘍に特異的な当技術分野でよく知られている他のパラメータによって、対象の総合的な健康またはウェルの改善の改善がある 予防治療は、疾患の兆候を示さない対象に投与される治療であり、病理を発症するリスクを低減する目的で、早期の標識のみを示す
腫瘍：良性または悪性であり得る細胞の異常増殖。癌は悪性腫瘍であり、これは、異常または制御されていない細胞増殖を特徴とする 悪性腫瘍にしばしば関連する他の特徴は、転移、隣接する細胞の正常な機能との干渉、 サイトカインまたは他の分泌物の異常レベルでの放出、および炎症または免疫応答の抑制または悪化、リンパ節などの周囲または遠方の組織または器官の侵入を抑制または悪化させる 転移性疾患は、元の腫瘍部位を残して、例えば血流またはリンパ系を介して身体の他の部分に移動する癌細胞を指す このように、転移性癌は、転移癌が由来する原(一次)癌の起源部位以外の体内の1箇所以上の癌である 個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積または重量として測定することができる腫瘍の負担である。転移しない腫瘍は、良性と呼ばれる
個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる腫瘍の負担である。転移しない腫瘍は、良性と呼ばれる 周囲組織に侵入し、および/または転移可能な腫瘍は、悪性と呼ばれる。血液学的腫瘍の例としては、急性白血病(11q 23陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病など)を含む白血病が挙げられる 急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤血球白血病)、慢性白血病(慢性骨髄球性(顆粒溶解性)白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、 慢性リンパ性白血病)、多血症Vera、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(インドール及び高品位の形態)、多発性骨髄腫、ワサビのマクログロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、 毛様細胞白血病および骨髄異形成
肉腫や癌などの固形腫瘍としては、線維肉腫、筋肉腫、リポソーム性、軟骨肉腫、骨形成肉腫、その他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、レジャー肉腫、横紋筋肉腫等が挙げられる 大腸癌、リンパ球悪性度、膵臓癌、乳癌(基底乳癌、管癌および小葉癌を含む)、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、 扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、唾液腺癌、骨髄甲状腺癌、乳頭甲状腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、 髄癌、気管支原癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、Wilms'腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミマ、膀胱癌、CNS腫瘍(グリオーマ、アストロサイト、 髄芽腫、脳腫瘍腫、ネペニア、パイナギ腫、血管芽腫、音響ニューoma、オリゴデンドログリオーマ、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫)
確立された、または存在する腫瘍は、診断テストによって識別され得る既存の腫瘍である。いくつかの実装形態では、確立された腫瘍を触診することができる 一部の実施では、確立された腫瘍は、少なくとも500mm3であり、例えば、少なくとも600mm3、少なくとも700mm3、又は少なくとも800mm3のサイズである。他の実施態様では、腫瘍は少なくとも1cmの長さである 固形腫瘍に関して、確立された腫瘍は、一般にロバストな血液供給を有し、誘導Tregおよび骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を有する。いくつかの例では、腫瘍は神経芽腫または小細胞肺癌である
II。導入
小分子を有するG-四重結合(G 4s)を標的とすることは、N-Mycおよび他のG 4含有タンパク質などのドルー可能なタンパク質の発現を制御するための魅力的な戦略であるが、選択的である
G 4sに対する結合剤は、多くのG 4sの構造類似性によって識別することが困難である。多くの正準位G 4構造は、比較的単純であり、中心カリウムイオンによって安定化されるグアニンのテトラッドを含み、 および小さな1-7ヌクレオチドループ。しかしながら、最近のより複雑なG 4s (または非正準位子G 4s)の例は、ヘアピンなどの追加の構造要素および他のタイプの構造(例えば、Onelらを参照)も含むことが示されている JACS 2016、138：2563；2570；Ngoc ngu円et al、Nucleic Acid Res。2020、48：10567-10575；Tan et al、Nucleic Acid Res。2020、48：11162-11171(ここでは、参照により本明細書に組み込まれるこのような非正準構造を開示する) MYCNにおける報告されたG 4sのうち、このような構造を有する非正準位G 4の一例が、MCNのイントロン1に見出される。ゲノムワイドプロービング研究も、MCN遺伝子におけるG 4の存在を実験的に確認した 他の多くの調節G 4sのようにMYCNのプロモーター領域には発生しないが、他の多くの調節G 4sと同様に、MCNのプロモーター領域には生じない
ヘアピン含有G 4sなどの非正準位G 4構造を標的とする新規な小分子化合物が本明細書に記載される。いくつかの実装形態では、MCNなどのMYC遺伝子ファミリーの非カノニカルG 4sを標的とする 該化合物を含む医薬組成物および該化合物を作製および使用する方法も開示される
また、癌のような疾患および/または障害を治療する方法などの治療処置のためのこのような化合物を使用する方法も開示される いくつかの実装形態では、開示された化合物による処置は、MCNおよびMYCNO転写物ならびにN-Mycタンパク質レベルの両方において減少する
III。化合物
本明細書に開示される化合物は、癌などの疾患および/または障害を治療するための新規な方法で使用するための化合物である。特定の実施態様では、化合物は、小分子化合物(立体異性体、互変異性体、 非正準位G 4sを標的および結合することができる、その薬学的に許容される塩またはエステル)。特定の実施態様では、化合物は、構造的に複雑な非正準位G 4sに選択的に結合する小分子である ヘアピン含有G 4sのようなヘアピン含有G 4s。特定の実施態様では、ヘアピン含有G 4はDNA中に存在する。独立した実施形態では、化合物は、G 4構造を含まないRNA (またはmRNA)に結合しない 本明細書に開示される2価の化合物のようないくつかの化合物は、RNA (例えば、mRNA)に存在するg 4sに結合することができるが、それらは、単純なRNA (またはmRNA)、例えば、ステムループ構造、バルジ構造、 g 4なしのヘアピン構造又はヘアピン構造。本明細書に開示される化合物を使用することができる例示的な遺伝子は、MYCファミリー(例えば、限定されない)を含むことができるが、これらに限定されない MFCN、MYCNO、MYCL、MYCなど)、FOXA 3、KRAS、BRD 4、ならびにBCL 2、SOX 2、および/またはLINC 01018などの任意の癌遺伝子および/または非コードRNA (例えば、長い非コードRNA (lncRNA)))、FOXA 3、KRAS、BRD 4、および/または非コードRNA (例えば、長い非コードRNA (lncRNA)) いくつかの実装形態では、化合物は、ヘリカーゼ中に存在するg 4s (例えば、DHX 15)に結合することができる。いくつかの実施態様では、化合物は、そのような遺伝子に見出されるg 4ヘアピンにおける接合付近に選択的に結合する
いくつかの実施態様では、化合物、または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルは、式Iの構造を有する
Figure 2024522183000009
 式I
式Iに関して、以下の可変再構成は、以下のように適用することができる
環aは5員ヘテロアリール環であり、特に独立した実施はチオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、またはチアジアゾリルではない
環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である
R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロ(例えば、Cl、F、Br、またはI)であり、独立した実施では、R3はフルオロではない
各R4は、独立して、H、脂肪族、又はハロである
xは、0-5、例えば、0、1、2、3、4、又は5から選択される整数である
nは、0-10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10から選択される整数である
式Iのいくつかの実施態様では、以下の可変再構成が適用可能である
環aはオキサジアゾリルであり、特に独立した実施は1、3、4-オキサジアゾリルではない；環Bは、ジアニル(例えば、ピリジルニル、ピリミジニルまたはピラジニル)から選択される
R1は、-(リンカー)t-Rbであり、ここで、Rbは、アリール、ヘテロアリール、シクロヘテロ脂肪族、アシクロヘテロ脂肪族、脂環式、アシルシクロ脂肪族である；tは0又は1である；リンカーは、-(CRa2)q-または-[(CRa2)qY]r-(CRa2)s-であり、各Raは、独立して、H、脂肪族、またはハロである；Yは酸素、硫黄又はNR'であり、r'はH又は脂肪族であり；qは1-10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10から選択される整数；rは1-10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10から選択される整数；sは0、1又は2から選択される整数；
R2はH又は低級アルキルである
各R3は、独立して、アルコキシ又はヒドロキシである
各R4は、独立して、H、アルキル、又はハロである
xは1-5の整数である
nは、0-3、例えば、0、1、2、又は3から選択される整数である
式Iの未追加の実施態様では、以下の可変列挙が適用可能である
Figure 2024522183000010
 R1は、-(リンカー)t-Rbであり、ここで、Rbは、フェニル、ピペラジニル、ピリジニル、アゼピニル、シクロペンチル、アミノ(例えば、NH 2、N (アルキル)2、およびNH (アルキル))、ピペリジニル、ピロリジニル、オキサジアゾリル、トリアジニル、アミドである
(例えば、-C(O)NH2)、モルホリニル、アクリジイル(例えば、9-アミノアクリジン、アクリジンCl、アクリジンNH2、アクリジンICR191)；tは0又は1である；リンカーが-(CH2)q-、-CH(Me)-、-(CH2)q-CH(Me)-、-[(CH2)qO]r-(CH2)s-；又は-(CH2)qNH-であり、qは1-4、例えば1、2、3又は4から選択される整数であり；rは1-4、例えば1、2、3又は4から選択される整数であり；sは0、1又は2であり；
R2はH又はMeである
各R3は、独立して、-OMe又はヒドロキシである
nは0である
いくつかの実施態様では、化合物は、式Iの構造を有し、ここで、環aは5員ヘテロアリール環である；環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である；r1は-(CRa2)m-Rb又は-[(CRa2)mO]r-(CH2)s-Rbであり、各Raは独立にH、アルキル又はハロであり、mは1、2、3、4又は5であり、rは1又は2であり、sは2であり、Rbはシクロアルキル基、アリール基、又は窒素原子を含む窒素又はシクロヘテロ脂肪族からなるヘテロアリール基等の窒素含有基である；r2はH又は脂肪族であり、r3はそれぞれ独立にアルコキシ又はヒドロキシであり、xは0、1、2、3、4又は5であり、r4はそれぞれ独立にH、アルキル又はハロであり、nは0、1、2又は3である
6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン；
6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン
N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン
N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン
6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン
6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
いくつかの実装形態では、化合物は、式IAによる構造を有することができる
Figure 2024522183000011
 式IA
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N、O、S、又はc (Rc)(式中、RcはH、アルキル、 X1、X2及びX3の少なくとも1つはc (Rc)以外である；R1は、-(リンカー)t-Rbであり、ここで、Rbは、芳香族、ヘテロ脂肪族、又は脂肪族である リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1であり；R2はHまたは脂肪族であり；各R3は独立してヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロである 独立した実施形態では、R3はフルオロではなく；各R4は独立して、H、脂肪族、またはハロであり；xは、0-5、例えば、0、1、2、3、4、または5から選択される整数である nは、0-10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10から選択される整数であり、特に独立した実施態様では、化合物は、チオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、又は1、3、4-オキサジアゾリル環を含まない 特定の実施態様では、化合物は、1、2、4-オキサジアゾリル環を含む
前記または以下の実施態様のいずれかにおいて、環Aは、であってもよい
Figure 2024522183000012
 X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N、O、S、又はc (Rc)であり、ここで、Rcは、H、アルキル、又はハロである X1、X2及びX3の少なくとも1つはc (Rc)以外である。式Iおよび/または式IAのいくつかの実施態様では、Rcは、Hまたはアルキルであり、例えば、c 1-c 3アルキル(メチル、エチル、プロピル、 イソプロピル)。式Iおよび/または式IAの特定の実施態様では、RcはHであり、式Iおよび/または式IAのいくつかの実施態様では、X1、X2およびX3の少なくとも1つはNである 式I及び/又は式IAの特定の実施態様では、X1、X2及びX3の少なくとも1つはNであり、X1、X2及びX3のうちの1つはO又はSである いくつかの実施態様では、式Iおよび/またはIAの5員環は、である
選択されたものから選択されるものである
Figure 2024522183000013
 あるいは、ある種のエクアンプ
Figure 2024522183000014
 式I及び/又はIAの5員環である
上記または以下の実施態様のいずれかにおいて、式Iの環Bは、であってもよい
Figure 2024522183000015
 Y1、Y2、Y3およびY4は、それぞれ独立に、Nまたはc (Rc)であり、ここで、Rcは、H、アルキル、またはハロであり、Y1、Y2、Y3、 Y1、Y2、Y3及びY4のうちの2つはNであり、Y1、Y2、Y3及びY4のうちの他方はc (Rc)である 各Rcは、独立して、H、-アルキル、またはハロであってもよい。In
特定の例では、RcはHである
Figure 2024522183000016
 式Iの特定の実施態様では、環Bは、である
Figure 2024522183000017
開示される化合物は、典型的には、多数のR3基(式I中、xは0、1、2、3、4、または5で表される)を含み、各R3は独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロアルキル、脂肪族、またはハロである 独立した実施形態では、R3はフルオロではない。いくつかの実施態様では、xは1、2または3であり、いくつかの実施態様では、xは1であり、少なくとも1つのR3基は環aに対してパラ位にある 前記または以下の実施態様のいずれかにおいて、R3は、C1-C3アルコキシまたはヒドロキシであってもよい。いくつかの実施態様では、R3はメトキシである。特定の実施態様では、xは1であり、R3は環Aにパラである
上記または以下の実施態様のいずれかにおいて、nは0以外の整数であり、各R4は独立して、H、アルキル(例えば、C 1-C 3アルキル)、またはハロである。いくつかの実施態様では、R4はHまたはメチルである 特定の実施態様では、r4はhであり、nは0または1であり、特定の実施態様では、nは0であり、-n (r1)(r2)は環bに直接取り付けられている
いくつかの実施態様では、化合物は、式IIの構造を有する
Figure 2024522183000018
 式II
式IIを参照すると、R1、R2及びR3の各々は、上記の実施態様のいずれかに従って定義される通りである。いくつかの実施態様では、R2はH又はC 1-C 3アルキルである 特定の実施態様では、R2はHである
いくつかの実施態様では、化合物は、式IIIの構造を有する
Figure 2024522183000019
 式III
式I、IA、II又はIIIのいずれかの特定の実施態様において、r1は-(CRa2)m-Rb又は-[(CRa2)mO]r-(CH2)2-Rbであり、各Raは独立にH、アルキル又はハロであり、mは1、2、3、4又は5であり、rは1、2、3、4又は5であり、Rbは窒素含有基である。いくつかの実施態様では、各Raは、独立して、HまたはC1-C3アルキルである。特定の実施態様では、各RaはHであり、r1は-(CH2)m-Rbである。特定の実施態様では、各RaはHであり、r1は-[(CRa2)mO]r-(CH2)2-Rbであり、ここで、rは1、2、又は3であり、mは1、2、3、4又は5であり、m+nは2、3又は4、特に2又は3であり、ある実施態様では、nは0であり、mは2又は3である
式I、IA、II、またはIIIのいずれか1つの特定の実施形態では、Rbは、窒素含有基である。いくつかの実施態様では、Rbは、N含有環状基であり、-N (Rc)2であり、 または-c (O)N (Rc)2であり、ここで、各Rcは、H、アルキル、またはハロである。N含有環式基は、飽和又は不飽和(芳香を含む)であってもよく、5-15原子、例えば5-14原子、又は5-10原子を含んでもよい 又は、原子数は5-8である。いくつかの実施態様では、N含有環状基は、ハロ、ヘテロ脂肪族、または脂肪族から選択される置換基などの1つ以上の置換基をさらに含む 特定の実施態様では、N含有環式基は、複素環中の窒素原子を介して-(CRa2)m-または-[(CRa2)mO]r-(CH2)2-を介して結合される
例示的なN含有環状基は、1又は2個の窒素原子を含み、別のヘテロ原子を含んでもよい
S又はO原子等の化合物。好適なN含有環状基としては、アクリジイル基(または、ブレース-19などの他のG 4スタッキング化合物)、ヘキサヒドロアゼピニル基、ピペラジニル基、モルホリノ基、およびモルホリノ基が挙げられるが、これらに限定されない ピペリジニル基。いくつかの実施態様では、Rbは、-N (Rc)2または-c (O)N (Rc)2であり、ここで、Rcは、Hまたはc 1-c 3アルキルなどのHまたはアルキル、またはアクリジンICR 191、9-アミノアクリジン、アクリジンCl、アクリジンCl、 またはアクリジンNH 2。このようなアクリジイル基を含む実施では、化合物は、非正準位G 4結合成分およびG 4スタッカ成分を含む、2つのG 4応答性基を含む2価の化合物であり得る 非正準位G 4結合成分は、環A、Bおよび/またはR3を有するフェニル環を含む化合物の一部を含み、G 4スタッカ成分はアクリジイル基を含む
Figure 2024522183000020
 スキーム1
2価の化合物のいくつかの実装形態では、2価の化合物は、式IVの構造を有する
Figure 2024522183000021
 式IV
Rbは、芳香族基(例えば、アクリジイル基)などのg4スタッカ基であり、リンカー基は、-(CRa2)m-または-[(CRa2)mO]r-(CH2)s-であり、ここで、Ra、m、rおよびsは、式Iおよび/またはIIに提供されるようなものである
2価の化合物のいくつかの実装形態では、2価の化合物は、式Vの構造を有する
Figure 2024522183000022
 式V
ここで、rbはアクリジニル基であり、リンカー基は-(CH2)m-または-[CHa2)mO]r-(CH2)s-であり、ここで、m、rおよびsは、式Iおよび/またはIIに提供されるように本明細書に記載されている
式I、IA、II、またはIIIのいずれか1つの特定の実施形態では、R1は、以下のものから選択される
Figure 2024522183000023
式I、IA、IV、またはVのいずれか1つの特定の実施形態では、R1は、以下のものから選択される
Figure 2024522183000024
式IIの特定の実施態様では、R2はH又はC 1-C 3アルキルであり、R1は上記の実施態様のいずれかに従って定義される通りである。特定の実施態様では、R2はHである
式IIIの特定の実施態様では、R2はHであり、R3はメトキシであり、R1は上記の実施のいずれかによって定義される通りである
式Iによる特定の化合物を表1に示す
Figure 2024522183000025
Figure 2024522183000026
Inいくつかの実装形態では、化合物は、MY-5、MY-6、MY-7、MY-8、MY-13、MY-14、B 32、B 33、B 34、B 35、又はB 38である。特定の例では、化合物は、MY-8またはB 33である
独立した実施形態では、化合物は、以下のものを含まないか、または他のものではない
6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン；
6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン
N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン
N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン；6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン
6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
IV。製造方法
本明細書では、式I、IA、II、III、IV、またはVの化合物など、本開示による化合物を製造する方法の実装が開示される 化合物を製造するための代表的な方法は、スキーム2によって以下に提供され、ここで、Rは、本明細書に記載のR1を表すために使用される
Figure 2024522183000027
 スキーム2
本明細書に開示される化合物の実施形態を製造するための代表的な方法は、スキーム3の下に提供される
Figure 2024522183000028
 スキーム3
スキーム3を参照すると、以下の例示的な手順を使用することができる(ここで実施例セクションに記載された試薬量、反応時間、および温度は、いくつかの実装形態で使用することができる)
6 -ヒドロキシピリダジン-3-カルボン酸、EDC。HCl、オキシma純粋、DMFを組み合わせる。反応を室温で10分間撹拌し、続いて4-メトキシベンズアミドキシムを添加する。次いで、反応混合物を120℃に加熱し、撹拌する 3時間後、反応混合物を濾過し、DMFで洗浄する。濾液を回収し、乾燥させ、目的生成物P 1を得る。POCl3中のP 1の溶液を100℃に加熱し、4時間撹拌する 反応粗製物を氷冷水に注ぎ、10%NaOH溶液で中和する。次いで、混合物をEtOAcで抽出し、ブラインで洗浄する。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮する 得られた残渣をISCOフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。次いで、EtOH中のP 2、3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロパン-1-アミン及びNH 4Clの混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌する 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製してMY-5を得る
EtOH中のP 2、N、N'-ジメチルエチレンジアミンとNH 4Clの混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌する。反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製してMY-6を得た
EtOH中のP 2、3-アミノプロパンアミド塩酸塩及びK2CO3の混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌する 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製してMY-7を得る
EtOH中のP 2、3-(1-アゼパル)-1-プロパンアミンおよびNH4Clの混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌する。反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して得る 次いで、MY-8。MY-8をTFAで30分間攪拌して、対応するTFA塩を得た
EtOH中のP 2、2-モルホリノレイン-1-アミン及びNH 4Clの混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌する。反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製してMY-13を得る
EtOH中のP 2、2-(4-メチルピペラジン-1-イル)eea-1-アミン及びNH 4Clの混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌する。反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して得る MY-14
本明細書に開示される2価の化合物は、下記スキーム4によって提供される方法に従って製造することができ、ここで、Rは、本明細書に記載のR1を表すために使用される
Figure 2024522183000029
 スキーム4
本明細書に開示される二価化合物の実施形態を製造するための代表的な方法は、スキーム5の下に提供される
Figure 2024522183000030
 スキーム5
スキーム5を参照すると、以下の手順が使用され(試薬量、反応時間、本明細書の実施例に記載された温度を使用することができる)、Rはリンカー-G 4スタッカモチーフを指す 本明細書に開示される特定のR1置換基
DMSO中の7の溶液をDIPEAと結合させた後、2。反応を110℃で18時間加熱して維持する。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製して得られる B 33は黄色固体である
DMSO中の7の溶液をDIPEAと結合させた後、2。反応を110℃で18時間加熱して維持する。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製して得られる B 33は黄色固体である
DMSO中の7の溶液をDIPEAと結合させた後、3。反応を110℃で18時間加熱して維持する。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製する B 34を黄色固体として得た
DMSO中の7の溶液をDIPEAと結合させた後、4℃で18時間加熱して維持する。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製して得られる B 35は黄色固体である
DMSO中の7の溶液をDIPEAと組み合わせ、続いて、反応を加熱して110℃で18時間維持する。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製して得られる B 38は黄色固体である
代表的な化合物を製造するための方法に関するさらなる詳細は、実施例のセクション中に本明細書で提供される
V使用法
本明細書に開示されるのは、遺伝子および/または遺伝子発現を細胞内で制御するための方法の実施であって、遺伝子が、ヘアピンG 4を含む領域などの非正準位G 4を含む少なくとも1つの領域を含む いくつかの実装形態では、細胞は、対象または試料中に存在する細胞(例えば、癌性または非癌性細胞などの細胞を含む生物学的試料)であってもよい
遺伝子および/または遺伝子発現のレベルを制御することは、例えば、RNA (例えば、RNA)などの遺伝子産物の蓄積を減少させる遺伝子(例えば、MYCNまたはMYC)の発現を減少させることを含むことができる mRNAまたはlncRNA)、関連タンパク質、またはそれらの組み合わせ。方法のいくつかの実装形態では、遺伝子は、MYCファミリー(例えば、MYCN、MYCNO、MYCL、MYCなど)、FOXA 3、KRAS、BRD 4、および任意の関連する癌遺伝子から選択することができる
いくつかの実施態様では、本方法は、本開示による治療有効量の化合物(または立体異性体、互変異性体、 またはその薬学的に許容される塩またはそのエステル)を、癌(または腫瘍)を有する被験体に投与することにより、癌(または腫瘍)を処置する 他の実施態様では、本方法は、本開示に従って細胞を有効量の化合物(または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステル)と接触させることを含むことができる 細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることができる。いくつかの例では、本開示による化合物は、接触時に細胞に入る いくつかの実施態様では、本方法は、被験体またはサンプルを化合物に曝露した後に、遺伝子、タンパク質、および/またはlncRNA発現の減少を検出することをさらに含むことができる
特定の実施態様では、細胞内のN-Mycのタンパク質発現を減少させる方法が開示される。本方法は、細胞を、開示された化合物の有効量、または立体異性体、互変異性体、またはそれらに接触させることを含み得る またはその薬学的に許容される塩またはエステル。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることができる。化合物は、MCN遺伝子のG 4核酸領域に選択的に結合し、これは、特定の実施態様では、 非正準位g 4構造を含むg 4核酸領域である。特定の実施態様では、化合物は、そのような非カノニカルg 4sを遺伝子のDNAに結合させるが、g 4も含まない遺伝子のRNA (例えば、mRNA)には結合しない いくつかの実装形態では、化合物はG 4ヘアピンまたはG 4ヘアピンの近くで選択的に結合する。細胞は、MCN遺伝子の過剰発現によって少なくとも部分的に特徴付けられる細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞内のMCN遺伝子の発現は、である
少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、または化合物の非存在下での発現に対して少なくとも90%低減された、少なくとも25%減少した。化合物はまた、細胞の成長および/または増殖を減少させることができる いくつかの実施態様では、成長および/または増殖は、化合物の不在下での成長および/または増殖に対して、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%など、少なくとも25%低減される
特定の実施態様では、細胞内のc-Mycのタンパク質発現を減少させる方法が開示される。本方法は、細胞を、開示された化合物の有効量、または立体異性体、互変異性体、またはそれらに接触させることを含み得る またはその薬学的に許容される塩またはエステル。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることができる。化合物は、MYC遺伝子におけるG 4核酸領域に選択的に結合し、これは、特定の実施態様では、 非正準位g 4構造を含むg 4核酸領域である。特定の実施態様では、化合物は、そのような非カノニカルg 4sを遺伝子のDNAに結合させるが、g 4も含まない遺伝子のRNA (例えば、mRNA)には結合しない 細胞は、MYC遺伝子の過剰発現によって少なくとも部分的に特徴付けられる細胞であってもよい。いくつかの実施態様では、細胞内のMYC遺伝子の発現は、少なくとも25%、例えば少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、 または、化合物の非存在下での発現に対して少なくとも90%であってもよい。化合物はまた、細胞の成長および/または増殖を減少させることができる いくつかの実施態様では、成長および/または増殖は、化合物の不在下での成長および/または増殖に対して、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%など、少なくとも25%低減される
前記または以下の実施態様のいずれかにおいて、前記細胞は、対象における腫瘍および/または癌細胞であり得、前記方法は、それを必要とする対象に投与することによって、前記対象における癌を治療または予防することをさらに含むことができる 治療上有効な量の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはエステルを減少させてタンパク質(例えば、タンパク質)を減少させる 腫瘍及び/又は癌細胞におけるN-Myc、c-Myc等)発現により、対象の癌を治療又は予防する。開示された方法から利益を得ることができる対象は、ヒトおよび獣医学的対象を含む いくつかの実装形態では、癌細胞は、神経学的癌細胞または肺癌細胞である。特定の実施態様では、癌は神経芽腫または小細胞肺癌である いくつかの実施態様では、被験体における癌を治療することは、癌細胞または癌細胞を含む腫瘍の増殖および/または増殖を減少させる
癌の治療は、一般に、癌の診断の後、または前駆体条件の開始(異形成、良性腫瘍の発症など)の後に開始される 癌の初期段階で処置を開始することができ、例えば、被験者が、ステージIの診断中または異形成時などの状態の症状を発現する前に開始することができる しかしながら、ステージI、ステージII、ステージIIIおよびステージIVがんなどの疾患の任意の段階中に治療を開始することができる いくつかの例では、治療は、悪性または転移性腫瘍に変換することができる良性腫瘍を有するこれらの対象に投与される
悪性癌などの状態の発達の後に開始される治療は、症状の1つ以上の症状の重症度を低下させる、または症状を完全に除去する、または転移、腫瘍体積を減少させることをもたらし得る および/または腫瘍の数。一部の例では、腫瘍は、となる
不検知性以下の処理。本開示の一態様では、転移などの腫瘍の形成は、遅延され、防止または減少される。別の態様では、一次腫瘍のサイズが減少する さらなる態様では、腫瘍の症状が減少する。さらに別の態様では、腫瘍体積が減少する
被験体は、開示された治療を開始する前にスクリーニングすることができ、例えば、被験体が腫瘍および/または癌を有するかどうかを決定することができる 腫瘍の存在は、当該技術分野で公知の方法によって決定することができ、典型的には細胞学的および形態学的評価を含む。腫瘍は、確立された腫瘍であり得る。細胞は、生検から得られた細胞を含む、インビボまたはエクスビボであり得る 腫瘍の存在は、本明細書で提供される方法を使用して腫瘍を治療することができることを示す。いくつかの実装形態では、N-Myc陽性またはc-Myc陽性腫瘍を有する被験体が、例えば、治療のために選択される 被験体から得られる生体試料中のN-Myc又はc-Mycの発現及び/又は活性を検出することにより、上記課題を解決する
例えば、MCN遺伝子(例えば、MCN、N-Mycタンパク質のmRNAの増加により検出されるような)のUPREG発現、又は制御に比べてN-Mycによりアップ調整された遺伝子の発現を検出することができ、いくつかの例では定量化され得る 生物学的試料中のMCN遺伝子発現は、対照(例えば、正常、非腫瘍試料)と比較される。MCN遺伝子の発現の増加(MYCN、N-Mycタンパク質のmRNAの増加など) またはN-Mycで規定される遺伝子の発現は、N-Myc陽性腫瘍の存在を示し、N-Mycは、N-Myc陽性腫瘍の存在を示し、 本明細書に開示される化合物又は組成物のうちの1つ以上を用いて処理対象を選択するために使用することができる。例えば、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、 制御に対して少なくとも200%または500%を超えると、対象(例えば、ヒト被験体)は、本明細書に開示される1つ以上の薬剤による処理に有利に応答する可能性が高いことを示す 対象におけるN-Myc陽性腫瘍(例えば、N-Myc陽性神経芽腫)を検出および/またはモニタリングするための好適な方法は、治療医によって選択することができる 一実施態様では、被験体からサンプルを取得し、N-Mycを発現する細胞の存在をインビトロで評価する
さらなる実施態様では、MYC遺伝子(例えば、MYC、c-mycタンパク質のmRNAの増加によって検出されるような、または制御に比べてc-mycによってアップレギュレートされる遺伝子の発現によって検出されるような)のuプレギュレートされた発現を検出することができる いくつかの例では、定量化される。生物学的試料中のMYC遺伝子発現は、制御(通常、非腫瘍試料など)と比較される MYC遺伝子の発現の増加(MYC、c-mycタンパク質のmRNAの増加、またはc-mycによって規定される遺伝子の発現など)は、制御に対する生物学的試料中のc-myc陽性腫瘍の存在を示す 本明細書に開示される化合物又は組成物のうちの1つ以上を用いて処理対象を選択するために使用することができる。例えば、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、 制御に対して少なくとも200%または500%を超えると、対象(例えば、ヒト被験体)は、本明細書に開示される1つ以上の薬剤による処理に有利に応答する可能性が高いことを示す 被験体(例えばc-Myc陽性神経芽腫)中のc-Myc陽性腫瘍を検出および/またはモニタリングするための好適な方法は、治療医によって選択することができる。1つの実施例では、
実施態様では、被験体からサンプルを取得し、c-Mycを発現する細胞の存在をインビトロで評価する
式I、IA、II、III、IV、またはVのいずれか1つおよび任意の代表的な化合物種による、治療上有効な量の開示された化合物 MY-1、MY-2、MY-5、MY-6、MY-7、MY-8、MY-10、MY-11、MY-12、MY-13、MY-14、B 32、B 33、B 34、B 35、又はB 38)は、対象の腫瘍及び/又は癌を治療するために対象に投与することができる 被験体は、神経芽腫又は小細胞肺癌のような腫瘍又は腫瘍の発症リスク又は発症リスクが疑われる治療のために選択することができる
式I、IA、II、III、IV、またはVのいずれか1つによる化合物の投与、および任意の代表的な化合物種(例えば、)の投与 MY-1、MY-2、MY-5、MY-6、MY-7、MY-8、MY-10、MY-11、MY-12、MY-13、MY-14、B 32、B 33、B 34、B 35、又はB 38)が開示されている 予防的に提供される場合、化合物は、腫瘍および/または癌の初期発生の任意の症状、または以前に治療された腫瘍および/または癌の再発のいずれかの症状の前に提供される 化合物の予防的投与は、後続の疾患プロセスを予防または改善する役割を果たす。治療的に提供される場合、化合物は、疾患または感染の症状の発症後(または直後)に提供される
いくつかの例では、式I、IA、II、III、IV、又はVのいずれか1つに係る開示された化合物、及び任意の代表的な化合物種(例えば、)が開示されている MY-6、MY-7、MY-8、MY-10、MY-11、MY-7、MY-8、MY-10、MY-11、MY-12、MY-13、MY-14、B 32、B 33、B 34、B 35、又はB 38)は、被検体に投与して、その成長又は転移を遅く又は抑制することができる 腫瘍および/または癌。これらの用途では、治療上有効な量の化合物(またはその医薬組成物)を、非正準位G 4に結合するのに十分な量および条件下で被験体に投与することができる MCN遺伝子のDNA中に存在する非カノニカルG 4などのN-Myc発現を減少させ、それによって腫瘍の成長または転移を減速または阻害する、または腫瘍の標識または症状を抑制することができる 好適な被検者としては、例えば、神経芽腫または小細胞肺癌を有する被検者である癌(例えば、腫瘍を有する被検者)を診断または疑いのあるものが挙げられる
いくつかの例では、式I、IA、II、III、IV、又はVのいずれか1つに係る開示された化合物、及び任意の代表的な化合物種(例えば、)が開示されている MY-6、MY-7、MY-8、MY-10、MY-11、MY-7、MY-8、MY-10、MY-11、MY-12、MY-13、MY-14、B 32、B 33、B 34、B 35、又はB 38)は、被検体に投与して、その成長又は転移を遅く又は抑制することができる 腫瘍および/または癌。これらの用途では、治療上有効な量の化合物(またはその医薬組成物)を、非正準位G 4に結合するのに十分な量および条件下で被験体に投与することができる MYC遺伝子のDNA中に存在する非カノニカルG 4などのc-myc発現を減少させ、それによって腫瘍の成長または転移を減速または阻害する、または腫瘍の標識または症状を抑制することができる 好適な被検者としては、癌(例えば、腫瘍を有する被検者)を診断または疑いのあるものが挙げられ、いくつかの例では、被検者は癌を有する
MCNおよび/またはc-MYCを発現する。非限定的な例示的な癌としては、肉腫、癌、線維肉腫、筋肉腫、リポソーム肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、カポジ肉腫などが挙げられる 平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、リンパ球悪性度、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、 腺癌、副腎癌、汗腺癌、髄膜甲状腺癌、乳頭甲状腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄癌、 気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、Wilms'腫瘍、子宮頸癌、精巣性腫瘍、セミマ、膀胱癌、黒色腫、 神経膠腫(脳幹グリオーマ、混合グリオーマなど)、膠芽腫(グリオブラストーマ。マルチホルムとしても知られる)アストロサイト、CNSリンパ腫、発芽腫、髄芽腫、Schwanthoma cranophygiooma、ependimoma、パイナールマ、 血管芽腫、音響神経腫、オリゴデンド腫、髄膜腫、頭頸部癌、神経芽腫、網膜芽腫、及び脳転移 癌はまた、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(インドールまたは高品位の形態)、多発性骨髄腫、ワサビのマクログロブリン血症、重鎖疾患などの血液(または造血)癌を含む 骨髄異形成症候群、毛細胞白血病または骨髄異形成。非限定的な例では、癌は神経芽腫、横紋筋肉腫、前立腺癌、または小細胞肺癌である
治療上有効な量は、疾患の重症度および被験者の健康の一般的な状態に依存する 治療上有効な量は、臨床医または他の認定された観察者によって注目されるように、1つ以上の症状または客観的に識別可能な改善のいずれかを提供することである 一実施態様では、治療有効量は、腫瘍増殖を阻害するのに必要な量、または腫瘍の標識または症状を低減するのに有効な量である 投与される薬剤の治療有効量は、所望の効果および処理対象に依存して変化することができる いくつかの例では、治療量は、患者の腫瘍の負担を解消または低減する、または転移性細胞の増殖を防止または低減する量である
化合物の実際の投与量は、対象の疾患の指標および特定の状態(例えば、被験者の年齢、サイズ、適合度、症状の程度、磁化率因子など)などの因子に応じて変化することができる 投与の時間およびルート、他の薬物または治療が同時に投与される、ならびに対象における所望の活性または生物学的応答を誘発するための化合物の特定の薬理学 投与計画は、最適な予防または治療応答を提供するように調整することができる。治療上有効な量もまた、化合物および/または他の生物学的活性剤の毒性または有害な副作用があるものである 治療的に有益な効果によって臨床的な用語で上回る。本開示の方法および製剤中の治療有効量の化合物および/または他の生物学的活性剤の非限定的範囲は、約0である 01mg/kg体重-約20mg/kg体重、例えば約0。05mg/kg-約5mg/kg体重、または約0。2mg/kg-約2mg/kg体重である
投与量は、所望の濃度を標的部位(例えば、肺または全身循環)に維持するために、担当医によって変更され得る より高いまたはより低い濃度は、送達の態様、例えば、トランス表皮、直腸、経口、肺、骨内、または鼻腔内送達対静脈内または皮下または筋肉内送達に基づいて選択することができる 投薬はまた、投与された製剤の放出速度、例えば、肺内噴霧対粉末、持続放出経口対注入粒子または経皮送達製剤などの放出速度に基づいて調節することもできる
投与の任意の方法は、局所および全身投与を含む、開示された治療薬のために使用することができる。例えば、局所的、経口、血管内、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、 髄腔内投与および皮下投与を使用することができる。投与計画および投与計画の特定のモードは、ケースの詳細(例えば、対象、疾患、または疾患)を考慮して、担当医によって選択されるであろう 疾患状態、および治療が予防であるか否か、および治療が予防であるかどうか)。1つ以上の薬剤または組成物が投与されている場合には、1つ以上の投与経路を使用することができる 一部の実施では、投与は経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、または髄腔内などの血管内である
予防および治療目的のために、化合物は、長期間にわたる連続送達(例えば、連続静脈送達)を介して、経口経路または単一ボーラス送達によって被験体に投与することができる または反復投与プロトコル(例えば、毎時、毎日または週単位、反復投与プロトコルによって)である。治療的に有効な用量の化合物は、長期の予防または予防において繰り返し用量として提供することができる 臨床的に有意な結果をもたらす治療レジメンは、本明細書に記載されるような標的疾患または状態に関連する1つ以上の症状または検出可能条件を緩和する この文脈における有効な用量の決定は、典型的には、ヒト臨床試験に続く動物モデル研究に基づいており、標的疾患の発生または重症度を有意に低減する投与プロトコルによって誘導される 被験体における症状又は状態。この点に関して適切なモデルは、例えば、当技術分野で知られているマウス、ラット、鳥、イヌ、ヒツジ、ブタ、ネコ、非ヒト霊長類、および他の受け入れられた動物モデル対象を含む 代替的に、有効な用量は、in vitroモデルを使用して決定することができる。このようなモデルを使用して、治療有効量を投与するために適切な濃度および用量を決定するためには、通常の計算および調整のみが必要である 化合物(例えば、標的疾患の1つ以上の症状を緩和するのに有効な量)。代替の実施態様では、 化合物の有効量または有効量は、本明細書に記載されるように、疾患または状態に相関する1つ以上の選択された生物学的活性を、治療または診断目的のいずれかに簡単に阻害または増強することができる
いくつかの実装形態では、開示された化合物の局所投与は、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍の発生が起こりやすい領域に開示された化合物を適用することによって使用することができる いくつかの実装形態では、治療有効量の開示された化合物を含む、医薬製剤の持続的な腫瘍内(または、近接腫瘍)放出が有益であり得る
開示された化合物は、正確な用量の個々の投与に適した単位剤形で配合することができる。加えて、開示された化合物は、単一用量または複数用量スケジュールで投与され得る 複数の用量スケジュールは、一次コースの処理が、例えば1-10回の用量で、1回より多くの別々の用量であってもよい1つであり、 続いて、組成物の作用を維持または強化するために、必要に応じて次の時間間隔で与えられる他の用量を伴う。治療は、数日-月、または偶数の期間にわたって、1日または複数日の1日用量の化合物を含むことができる したがって、投与計画はまた、少なくとも部分的には、治療対象の特定の必要性に基づいて決定され、投与者の判断に依存するであろう
特定の実施例では、被験体は、少なくとも2つの連続した日数、連続した日数などの複数の毎日の投与スケジュール上に、開示された化合物のうちの1つ以上を含む治療用組成物を投与される 例えば、週、月、又は年の期間である。一例では、対象は、少なくとも30日間、少なくとも2ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも12ヶ月間、組成物を投与する 少なくとも24ヶ月、または少なくとも36ヶ月である
いくつかの実装形態では、開示された方法は、開示された化合物またはそれを含む組成物の投与と組み合わせて、対象に手術、放射線治療、および/または化学療法を提供することを含む そのような薬剤及び治療の方法及び治療薬は当業者に知られており、熟練した臨床医によって決定することができる 追加の薬剤の調製および投与スケジュールは、製造者の指示に従って、または当業者によって経験的に決定されるように使用され得る このような化学療法のための調製および投与スケジュールも、化学療法サービス、(1992)Ed、M CPerry、Williams&Amps、Baltire、Mdに記載されている
併用療法で使用することができる追加の治療剤の非限定的な例としては、微小管結合剤、DNAインターカレーターまたは架橋剤、DNA合成阻害剤、DNAおよびRNA転写阻害剤、抗体、 酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節剤、血管新生阻害剤、およびプロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブ、カーバゾミブなど) これらの薬剤(治療上有効な量で投与される)および処理は、単独でまたは組み合わせて使用することができる 例えば、任意の適切な抗がん剤又は抗血管新生剤を、本明細書に開示される化合物と組み合わせて投与することができる そのような薬剤の方法および治療用量は当業者に知られており、熟練した臨床医によって決定することができる
追加の化学療法剤としては、限定されないが、窒素ムスター(例えば、クロラムブニル、クロロメチン、シクロホスファミド、ifosfアミド、及びメリハリ)のようなアルキル化剤、ニトロソラバ(例えば、カラスチン、 フォテンシスチン、lomuスチン、及びストレプトゾシン)、白金化合物(例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、及びBBR 3464)、ブスルファン、ダカジン、メカロエタミン、プロカルアジン、テモゾロミド、チオテpa、及びウルトラスチン；抗代謝物、 プリン(例えば、クラドリビン、クロファルビン、フルダラビン、メルカプトプリン、及びチノグアニン)、ピリミジン(例えば、カプシタビン)、シタビン、フルオロウラシル、 ゲムシタビン；ポドフィラム等の植物アルカロイド(例えば、エトポシド、テニポシド)、タキサン(例えば、ドセタキシン及びパクリタキセル)、ビンカリン(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ボディシン、及びビレルビン)； 細胞傷害性/抗腫瘍性抗生物質、例えばアントラサイクリン系メンバー(例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピビシン、idarubicin、mitoxantron、及びバレルリシン)、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシ尿素、及びmitoマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、 トポテカンおよびイリノテカンなどのモノクローナル抗体；アルマツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パタムマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブなどのモノクローナル抗体；アミノレブリン酸、メチルアミノレブリン酸などの光増感剤； ポルフィプロナトリウム、および脊椎フィンなどの他の薬剤、および他の薬剤、例えば、アルテレチノイン、アルテタミン、アンサチン、アナグリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキシロテン、ベバシズマブ、ボロテゾミブ、セレコキシブ、象牙質ジチトックス、エルロチニブ、エストラムスチン、 ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラピチニブ、パゾウコブ、ペントスタチン、マノプロコール、マイトタン、ペガスパラナーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、サンシチニブ、バメダチニブ、バナデリア、及びトレチノイン そのような薬剤の選択および治療用量は当業者に知られており、熟練した臨床医によって決定することができる
併用療法は、相乗的に相乗的に、すなわち、一緒に使用される有効成分が、これらの化合物を別々に使用した結果の合計よりも大きい場合に達成される効果を提供することができる 有効成分が、(1)配合され、単位投与製剤中に同時に配合され、投与されるか、または同時に送達されるとき、相乗効果が達成され得る；(2)交互に、または別々の配合物として並列に送達される； または(3)いくつかの他のレジメンによって(3)。交互に送達されるとき、相乗効果は、化合物が、例えば別々の注射器における異なる注射によって順次投与または送達されるときに達成され得る 一般に、交互に、各有効成分の有効量は、連続的に、すなわち直列に投与され、併用療法では、2つ以上の有効成分の有効な用量が一緒に投与される
本開示の任意の方法実施態様では、本方法で使用される化合物は、本開示による任意の化合物であり、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、 4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン；6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、 4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン；N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、 4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン；6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
VI。医薬組成物
本開示の別の態様は、エクスビボ、インビボ、またはインビトロ細胞などの細胞への投与のために調製された医薬組成物を含む 本明細書に開示される化合物の1つ以上の治療上有効な量を含む。開示される化合物の治療有効量は、投与経路に依存する 被処理体の種類および被処理体の物理的特性は、被処理体の種類および被処理体の物理的特性である。考慮され得る特定の因子には、疾患の重症度が含まれる
段階、重量、ダイエット、及びコンカレント薬剤。治療上有効な量の開示された化合物を決定するためのこれらの因子の関係は、当業者によって理解される
対象への投与のための医薬組成物は、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤などの少なくとも1つのさらに薬学的に許容される添加剤を含むことができる 界面活性剤等は、選択の分子の他に、界面活性剤等を含む。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの1つ以上の追加の有効成分を含むことができる これらの配合物に有用な薬学的に許容される担体は、従来である。E。W。Martin、Mack Publishing Co Easton、PA、19th Edition (1995)には、本明細書に開示される化合物の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容可能な流体を含む注射可能な流体を含む ビヒクルとしては、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。固体組成物(例えば、粉末、錠剤、錠剤、またはカプセルの形態)のために、従来の無毒性固体担体は、 例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムの製薬等級。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の非毒性の補助物質を含むことができる 湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤などのような、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどが挙げられる
本明細書に開示される医薬組成物は、開示される化合物の薬学的に許容される塩および/または溶媒和物から形成されるものを含む 薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基および酸から誘導されるものを含む。特定の開示された化合物は、酸を用いて酸-塩基性塩を形成することができる少なくとも1つの塩基性基を有する 塩基性基としては、アミノ基、イミノ基等が挙げられるが、これらに限定されない。このような塩基性基と塩を形成し得る無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸等の鉱酸が挙げられるが、これらに限定されない 硫酸又はリン酸。塩基性基はまた、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸類、またはリン酸またはN-置換スルファミン酸と塩を形成することができ、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、 マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルタル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、 2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、メバロン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸、さらにアミノ酸、例えばα-アミノ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、 2-ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン-1、2-ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、2-または3-ホスホグリセリン酸、 グルコース-6-リン酸またはN-シクロヘキシルスルファミン酸(シクラメートの形成)、またはアスコルビン酸のような他の酸性有機化合物を用いることができる 特に、適切な塩は、医薬分野でよく知られている多数の他の酸の中で、カリウムおよびナトリウムなどのアルカリ金属から誘導されるもの、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属を含む
特定の化合物は、無機または有機塩基との酸-塩基塩を形成し得る少なくとも1つの酸性基を含む。無機塩基から形成される塩の例には、現在開示されている化合物の塩、例えば、アルカリ金属が含まれる カリウム及びナトリウム、カルシウム及びマグネシウムを含むアルカリ土類金属等。同様に、有機塩基を有する酸性化合物の塩 アミンのようなアミン(ここではアミンを指す用語は、遊離アミンが意図されていないことが明らかに示されない限り、それらの共役酸を含むと理解されるべきである)であり、塩基性アミノ酸で形成された塩を含むことが企図される 脂肪族アミン、複素環アミン、芳香族アミン、ピリジン、グアニンおよびアミジン類。脂肪族アミンのうち、非環式脂肪族アミンは、 環状および非環式のジ-およびトリ-アルキルアミンは、開示された化合物での使用に特に適している。また、第4級アンモニウム対イオンも使用することができる
本化合物で使用するための好適なアミン塩基(およびそれらの対応するアンモニウムイオン)の特定の例は、限定するものではないが、ピリジン、N、N-ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロノナン、ジアザビシクロウンデセン、N-メチル-N-エチルアミン、 ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、モノ、ビスまたはトリス-(2-ヒドロキシエチル)アミン、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミン、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン、N、N-ジメチル-N-(2-ヒドロキシエチル)アミン、トリ-(2-ヒドロキシエチル)アミンおよびN-メチル-D-グルカミン "薬理学的に許容される塩"の追加の例については、"Berge et al、J Pharm"を参照されたい。S。66：1(1977)
本明細書に開示される化合物は、結晶化することができ、単結晶形態で、または異なる結晶多形体の組み合わせとして提供することができる したがって、化合物は、異なる結晶形態、結晶性、液晶性、または非結晶性(非晶質)形態などの1つまたは複数の物理的形態で提供され得る このような異なる物理的形態の化合物は、例えば、再結晶のための溶媒または溶媒の異なる混合物を使用して調製することができる 代替的または追加的に、異なる多形体は、例えば、異なる温度で再結晶を実行することによって、および/または再結晶中に冷却速度を変更することによって調製することができる 多形体の存在は、X線結晶学によって、または場合によっては、固相NMR分光法、IR分光法、または示差走査熱量測定などの別の分光法によって決定することができる
医薬組成物は、経口、直腸、鼻腔内、肺内、または経皮送達、または他の表面への局所送達を含む様々な粘膜投与モードによって対象に投与することができる 随意に、組成物は、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、髄腔内、脳室内、または非経口経路を含む、非粘膜経路によって投与することができる 他の代替的な実施態様では、化合物は、被験体に由来する細胞、組織または器官に直接曝露することによって、エクスビボで投与することができる
医薬組成物を配合するために、化合物は、種々の薬学的に許容される添加剤、ならびに化合物の分散のための塩基またはビヒクルと組み合わせることができる 所望の添加剤としては、特に限定されないが、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸等のpH調整剤が挙げられる また、局所麻酔薬(例えば、ベンジルアルコール)、等張化剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール)、吸着阻害剤(例えば、Tween（登録商標） 80又はMiglyol 812)、溶解度向上剤(例えば、 シクロデキストリンおよびその誘導体)、安定剤(例えば、血清アルブミン)、および還元剤(例えば、グルタチオン)を含むことができる 水酸化アルミニウム(例えば、アンホゲル、Wyeth Laboratories、Madiscon、NJ)、フロールアジュバント、MPL^(3-O-脱アシル化モノホスホリル脂質A、コリxa、Hamilton、IN)およびIL-12(Gene Institute、Cambridge、MA)などのアジュバント 当技術分野でよく知られている多くの他の適切なアジュバントの中でも、当該技術分野でよく知られている多くの他の適切なアジュバントを組成物に含めることができる。組成物が液体である場合、組成物の張度は、0の張度を参照して測定される 9%(w/v)の生理食塩水溶液は、典型的には、実質的に不可逆的な組織損傷が投与部位に誘導される値に調整される
一般に、溶液の張度は、約0。3-約3。0、例えば約0。5-約2。0、又は約0。8-約1。7の値に調整される
化合物は、化合物を分散させる能力を有する親水性化合物、及び任意の所望の添加剤を含むことができる、塩基又はビヒクル中に分散させることができる 塩基は、これらに限定されないが、ポリカルボン酸又はその塩、カルボン酸無水物(例えば、無水マレイン酸)の他のモノマーとのコポリマーを含むがこれらに限定されない広範囲の適切な化合物から選択することができる (メタ)アクリル酸メチル、アクリル酸等)、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体等の親水性ビニル系重合体 また、キトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びこれらの非毒性の金属塩等の天然高分子である 多くの場合、生分解性ポリマーは、ベースまたは車両として、例えば、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-グリコール酸)コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ(ヒドロキシ酪酸-グリコール酸)コポリマー、およびそれらの混合物として選択される また、車両としては、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の合成脂肪酸エステルを採用することができる 親水性ポリマーおよび他のビヒクルは、単独でまたは組み合わせて使用することができ、部分結晶化、イオン結合、架橋などによって車両に向上した構造的完全性を付与することができる 車両は、粘膜表面に直接塗布するための、流体または粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、微小球およびフィルムを含む様々な形態で提供することができる
化合物は、様々な方法に従って、塩基または車両と組み合わせることができ、化合物の放出は、拡散、車両の崩壊、または水チャネルの関連形成によって行うことができる いくつかの状況では、化合物は、適切なポリマー、例えばイソブチル2-シアノアクリレートから調製されたマイクロカプセル(ミクロスフィア)またはナノカプセル(ナノスフェア)中に分散される(例えば、マイケルet al、J。薬局Pharmacolを参照されたい 43：1-5、1991)、および生体適合性分散媒中に分散され、長期にわたって持続的な送達および生物活性をもたらす
本開示の組成物は、代わりに、pH調整剤、緩衝剤、張度調整剤などの生理的状態を近似するために必要に応じて薬学的に許容される車両物質として含有することができる 湿潤剤等は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、及びトリエタノールアミンである 固体組成物のために、従来の無毒性の薬学的に許容される車両を使用することができる
例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬グレード
化合物を投与するための医薬組成物はまた、有効成分の高濃度に適した溶液、マイクロエマルション、または他の規則構造として処方することもできる 車両は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒とすることができる 溶液の適切な流動性は、例えば、分散可能な配合物の場合、及び界面活性剤の使用によって、レシチンなどのコーティングを使用することによって維持することができる 多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール及びソルビトール等の多価アルコール、又は組成物中の塩化ナトリウムを含むことが望ましいであろう 化合物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る
特定の実施態様では、化合物は、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物中で、時間放出配合物中で投与することができる これらの組成物は、迅速な放出を防止する車両、例えば、ポリマー、マイクロカプセル化された送達システム、または生体接着性ゲルのような制御放出車両を用いて調製することができる 本開示の様々な組成物における長期送達は、遅延吸収、例えば、アルミニウムモノステアリン酸ヒドロゲルおよびゼラチンを遅延吸収する組成物を含むことによってもたらされ得る 制御放出製剤が望まれる場合、本開示による使用に適した制御放出結合剤は、活性剤に対して不活性であり、かつ、それが可能な任意の生体適合性の制御放出材料を含む 化合物および/または他の生物学的活性剤を含有する。多くのそのような材料が当技術分野で知られている。有用な制御放出結合剤は、その送達に続いて生理学的条件下でゆっくりと代謝される物質である (例えば、粘膜表面で、または体液の存在下で)。適切な結合剤としては、これに限定されないが、徐放性製剤で使用するための当技術分野でよく知られている生体適合性ポリマーおよびコポリマーが挙げられる このような生体適合性化合物は、非毒性で周囲の組織に不活性であり、鼻刺激、免疫応答、炎症などの顕著な副作用を誘発しない それらは、生体適合性であり、本体から容易に除去される代謝産物に代謝される
本開示において使用するための例示的なポリマー材料は、限定されないが、加水分解性エステル結合を有する共重合体およびホモポリマーポリエステルから誘導されるポリマーマトリックスを含む これらの数は、当技術分野において生分解性であることが知られており、毒性のないまたは低い分解生成物につながる。典型的なポリマーとしては、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、ポリ(DL-乳酸-コ-グリコール酸)、 ポリ(D-乳酸-コ-グリコール酸)及びポリ(L-乳酸-コ-グリコール酸)。他の有用な生分解性またはバイオリン可能なポリマーは、限定されないが、ポリ(ε-カプロラクトン)などのこのようなポリマーを含むが、これらに限定されない ポリ(ε-アプロラクトン-CO-乳酸)、ポリ(ε。ポリ(β-ヒドロキシ酪酸)、ポリ(アルキル-2-シアノアクリラート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリアミド、ポリ(アミノ酸)(例えば、ポリアミノ酸)などのヒドロゲル、ポリ(β-ヒドロキシ酪酸)、ポリ(アルキル-2-シアノアクリラート)、ヒドロゲル、 L-ロイシン、グルタミン酸、L-アスパラギン酸など)、ポリ(エステルウレア)、ポリ(2-ヒドロキシエチルDL-アスパルアミド)、ポリアセタール重合体、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレイミド、多糖類、およびそれらのコポリマー そのような多くの方法を調製するための多くの方法
製剤は、当業者に周知である(例えば、徐放性薬物送達システム、J。R。Robinson、ed、Marcel Dekker、Inc、New York、1978参照) 他の有用な製剤としては、制御放出マイクロカプセル(米国特許第4、652441号および第4、917、893号)、マイクロカプセルを製造するのに有用な乳酸-グリコール酸共重合体および他の処方物(米国特許第4、917、893号)が含まれる 4、67、191、4、728、721)および水溶性ペプチドの徐放性組成物(米国特許第4、675189号)
本開示の医薬組成物は、典型的には無菌であり、製造、貯蔵および使用の条件下で安定である 滅菌溶液は、必要に応じて、必要に応じて、本明細書に列挙された成分の1つまたは組み合わせを用いて、必要量の化合物を必要な量で含有させ、その後、濾過された滅菌によって調製することができる 一般に、分散液は、化合物および/または他の生物学的活性剤を、塩基性分散媒と、本明細書で列挙したものから必要な他の成分とを含む無菌車両に組み込むことによって調製される 無菌粉末の場合、調製方法には、真空乾燥および凍結乾燥が含まれ、これは、化合物の粉末に、以前の滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分をもたらす 微生物の作用の防止は、種々の抗菌。抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、シン浸食等により達成することができる
本開示はまた、本明細書に記載される薬学的組成物、有効成分、および本明細書に記載の医薬組成物を含むキット、パッケージおよびマルチ容器ユニットも含む および/または哺乳動物被験体における疾患および他の状態の予防および治療に使用するためのそれらを投与するための手段。診断用キットも提供される 一実施態様では、これらのキットは、本明細書に記載される化合物のうちの1つ以上を含む容器または配合物を含む。一例では、この成分は、被験体への送達のための医薬製剤に配合される 化合物は、任意選択で、バルク分注容器またはユニットまたは多単位剤形で含有される。任意の分注手段は、例えば、肺または鼻腔内スプレーアプリケータで提供することができる 包装材料は、任意選択的に、どのような治療目的を示すか、および/またはどのように包装された薬剤を使用することができるかを示すラベルまたは指示を含む
本開示の任意の組成実施態様では、組成物で使用される化合物実装は、本開示による任意の化合物であり得、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、 4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン；6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、 4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン；N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、 4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン；6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン；6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
VII。代表的な実装形態
本明細書に開示される化合物またはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルは、式IAに従って、化合物または立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルである
Figure 2024522183000031
 式IA
[選択図]図1
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである
R1は-(リンカー)t-Rbであり、ここでRbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
本明細書には、式Iによる化合物、または立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容されるその塩またはエステルが開示される
Figure 2024522183000032
 式I
[選択図]図1
環aはチオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアゾリル、1、3、4-オキサジアゾリル以外の5員ヘテロアリール環である
環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である
R1は-(リンカー)t-Rbであり、ここでRbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
各R4は、独立して、H、脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
nは0-10の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
また、式Iの化合物、立体異性体、互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステル
Figure 2024522183000033
 式I
[選択図]図1
環aは5員ヘテロアリール環である
環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である
R1は-(CRa2)m-Rbであり、各Raは独立にH、アルキル又はハロであり、mは1、2、3、4又は5であり、Rbは窒素含有基である
R2はH又はアルキルである
各R3は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、脂肪族、又はハロである
各R4は、独立して、H、アルキル、又はハロである
nは0、1、2又は3である
xは0、1、2、3、4、又は5である
ただし、前記化合物は、MY-1、MY-2、MY-10、MY-11、MY-12のいずれかに記載された構造を含まない
本明細書には、式Iによる化合物、または立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容されるその塩またはエステルが開示される
Figure 2024522183000034
 式I
[選択図]図1
環aは5員ヘテロアリール環である
環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である
R1は-(CRa2)m-Rb又は-[(CRa2)mO]r-(CH2)s-Rbであり、各Raは独立にH、脂肪族又はハロであり；tは1、2、3、4又は5であり；rは1、2、3、4又は5であり；sは0又は1であり；Rbはアクリジニル基である；
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
各R4は、独立して、H、脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
nは、0-10の整数である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、環Aは、である
Figure 2024522183000035
 [解決手段]
各結合は、価数要件を満たすために必要に応じて単結合または二重結合である
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N、O、S又はC(Rc)であり、Rcは、H、アルキル又はハロであり、X1、X2及びX3の少なくとも1つは、C(Rc)以外である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、環Aは、である
Figure 2024522183000036
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、環Aは、である
Figure 2024522183000037
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、環
Figure 2024522183000038
 ここで、
Y1、Y2、Y3及びY4は、それぞれ独立に、N又はc (Rc)であり、Rcは、H、アルキル、又はハロであり、Y1、Y2、Y3、 Y4はNである
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、環Bは、である
Figure 2024522183000039
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、環Bは、である
Figure 2024522183000040
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、(i)xは、1、2、又は3であるか、又は(ii)1つのR3は、環aに対してパラ位にあるか、又は(iii)両方(i)及び(ii)の両方である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、nは0である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、各R3は、独立して、C 1-C 3アルコキシ又はヒドロキシである
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、xは1であり、R3はメトキシである
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、化合物は、式IIによる構造を有する
Figure 2024522183000041
 式II
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、R2はHである
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、化合物は、式IIIによる構造を有する
Figure 2024522183000042
 式III
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、R1は-(CH2)m-Rbである
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、mは2又は3である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、Rbは、N含有環状基-N(Rc)2又は-C(O)N(Rc)2であり、各RcはH又はアルキルである
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、R1は、以下の通りである
Figure 2024522183000043
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は以下の通りである
Figure 2024522183000044
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、化合物は、式IVによる構造を有する
Figure 2024522183000045
 式IV
前記リンカーは、-(CRa2)m-または-[(CRa2)mO]r-(CRa2)s-であり、各Raは、独立して、H、脂肪族またはハロであり；mは、1、2、3、4、または5であり；rは、1、2、3、4、または5であり；sは、0または1である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、化合物は、式Vによる構造を有する
Figure 2024522183000046
 式V
リンカーは-(CH2)m-または-[CH2)mO]r-(CH2)s-であり、mは1、2、3、4または5であり、rは1、2、3、4または5であり、sは0または1である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、R1は、以下の通りである
Figure 2024522183000047
Figure 2024522183000048
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は以下の通りである
Figure 2024522183000049
また、本明細書に開示されるのは、上述の代表的な実施形態のいずれか又は全てに係る化合物と、少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物である
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、医薬組成物は、化合物の治療量の単位剤形を含む
これらの代表的な実施態様のいずれか又は全てにおいて、医薬組成物は、抗癌剤をさらに含む
また、本発明は、細胞を有効量の化合物、または立体異性体、互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステルと接触させることを含む、細胞における癌関連タンパク質の発現を減少させる方法である 式IA
Figure 2024522183000050
 式IA
[選択図]図1
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである
R1は-(リンカー)t-Rbであり、ここでRbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
また、細胞を有効量の化合物、または立体異性体、互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステルと接触させることを含む、細胞における癌関連タンパク質の発現を減少させる方法も開示される 式、I、II、III、IV、およびVに関する上記の代表的な実施態様のいずれかまたはすべてにしたがって、上記の代表的な実施態様のいずれかまたはすべてにしたがって、上記の代表的な実施態様のいずれかまたはすべてにしたがって、上記の代表的な実施態様のいずれかまたはすべてにしたがって、上記の代表的な実施態様のいずれかまたは全てにしたがって、上記
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様では、
(
Figure 2024522183000051
 [選択図]なし
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N、O、S、又はc (Rc)であり、RcはH又はアルキルであり、 X1、X2及びX3の少なくとも1つはc (Rc)以外である
(ii)リングB
Figure 2024522183000052
 Y1、Y2、Y3及びY4は、それぞれ独立に、N又はc (Rc)であり、RcはH又はアルキルであり、Y1、Y2、Y3及びY4のうちの少なくとも2つはNである または、
(iii)(i)および(ii)の両方
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様では、
(i)リングA
Figure 2024522183000053
 、または、これに限定されるものではない
(ii)リングB
Figure 2024522183000054
 、または、これに限定されるものではない
(iii)(i)および(ii)の両方
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様では、
(i)R2はHである
(ii)R3は、C 1-C 3アルコキシ又はヒドロキシである
(iii)xは1、2又は3である
(iv)1つのR3は、環aを環化するパラ位にある
(v)nは0である
(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)及び(v)の任意の組み合わせ
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様では、化合物は、式II、III、IV、又はVのいずれかに従った構造を有する
Figure 2024522183000055
 式V
式VIおよびVについて、リンカーは、-(CRa2)m-または-[CRa2)mO]r-(CRa2)s-であり、各raは、独立して、H、脂肪族、またはハロであり；mは、1、2、3、4、または5であり；rは、1、2、3、4、または5であり；sは、0または1である
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様では、化合物は以下の通りである
Figure 2024522183000056
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様では、化合物は、である
Figure 2024522183000057
Figure 2024522183000058
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様では、化合物は、である
Figure 2024522183000059
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施態様において、細胞はインビトロである
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実装形態では、細胞はインビボである
これらの方法の任意のまたはすべての代表的な実施では、細胞内の癌関連タンパク質発現を減少させることは、細胞の増殖および/または増殖を減少させる
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実施では、細胞は、MCN遺伝子の過剰発現を伴う細胞である
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実施では、化合物は、MCN遺伝子の非正準位G 4四重鎖核酸領域に選択的に結合する
これらの方法のいずれか又は全ての代表的な実施形態では、非正準位G 4四重鎖核酸領域はヘアピン構造を含む
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実施形態では、細胞は、対象における癌細胞であり、対象における癌を治療または予防することをさらに含む方法 治療上有効な量の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはエステルを必要とする対象に投与して、癌細胞におけるN-Myc発現を減少させる工程を含む、方法 これにより、被検者の癌を治療または予防することができる
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実施態様において、癌細胞は、神経学的癌細胞または肺癌細胞である
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実施において、癌は神経芽腫、横紋筋肉腫、前立腺癌、または小細胞肺癌である
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実施態様では、癌を処置することは、腫瘍体積を減少させること、転移酵素の数またはサイズを減少させること、または癌の症状を軽減することを含む
これらの方法のいずれかまたはすべての代表的な実施形態では、方法は、治療有効量の追加の抗癌剤を対象に投与することをさらに含む
細胞内のN-Myc発現を減少させるために、式IAによる化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用も開示される 式IAの化合物の有効量を細胞に接触させることを含む、方法
Figure 2024522183000060
 式IA
[選択図]図1
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである
R1は-(リンカー)t-Rbであり、ここでRbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
さらに、式I、II、III、IVのために本明細書に記載される任意のまたはすべての代表的な実施態様による、化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用 細胞内のN-Myc発現を減少させるためのVであって、式I、II、III、IV、およびVについて本明細書に記載される任意のまたはすべての代表的な実施態様による、細胞を有効量の化合物と接触させることを含む、V
また、対象における癌を治療または予防するための、式IAによる、化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用も開示される 式IAの構造を有する化合物
Figure 2024522183000061
 式IA
[選択図]図1
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである
R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
また、式I、II、III、IVのために本明細書に記載される任意のまたはすべての代表的な実施態様による、化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用も開示される 対象における癌を治療または予防するためのVであって、式I、II、III、IVおよびVについて本明細書に記載される任意のまたはすべての代表的な実施態様による構造を有する化合物
また、対象における癌を治療または予防するための医薬の製造において、式IAによる化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用も開示される 式IAの構造を有する化合物
Figure 2024522183000062
 式IA
[選択図]図1
X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである
R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1である
R2はH又は脂肪族である
各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである
xは0-5の整数である
6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
さらに、式I、II、III、IVのために本明細書に記載される任意のまたはすべての代表的な実施態様による、化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用 対象における癌を治療または予防するための医薬の製造におけるVであって、式I、II、III、IV、およびVについて本明細書に記載される任意のまたはすべての代表的な実施態様による構造を有する化合物
VIII。[実施例]
以下の実施例は、特定の実施態様の特定の特徴を例示するために提供されるが、特許請求の範囲の範囲は、例示される特徴に限定されるべきではない
材料および方法
MYCN G4オリゴヌクレオチド(5'-AGG GGG TGG GGG GCA TGC AGA TGC AGG GGG GCA TGC AGA TGC AGG GGG T-3'、SEQ ID NO：7)を、または標識なしで、統合DNA技術から購入した 特異的研究に用いるDNA/RNA試料の他の配列を図1-2に要約する
有効化のためのヒット化合物をCheDivおよび化学ブリッジから購入した。化合物MY-1の類似体を家屋内で合成し又は購入した。RNA抽出キットRNa+Mini kit (#74134)をQiagen、CAから購入した cDNA合成キット高容量RNA-cDNATMキット(#4387406)をライフテクノロジーズ(Invitrogen)、ニューヨークから購入した。Fast SYBR (商標)Green Master Mixは、Life Technologies (Invitrogen)、NYから購入した。抗N-Myc (B 84) B)：sc-53993抗体(1：4000希釈；Santa Cruz Biotechnology (SCB)、USA)、抗GAPDH (0411)：sc-47724抗体(1：2000希釈；SCB、USA)、ヤギ抗マウスIgG-HRP：sc-2005抗体(1：1000希釈；SCB、 USA)を免疫バロットに使用した
一般的な化学的方法。全ての化学試薬を市販の供給業者から入手し、さらに精製することなく使用した これらの実施例では、SAR研究のための化合物は、CheDiv (MY-1、MY-2、MY-3、MY-4、MY-9、MY-10、MY-11、MY-12)から購入されるか、又はlab (MY-5、MY-6、MY-7、MY-8、MY-13、MY-14)で合成された 減圧下でBuchiロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Teledyne ISCO Combifish Rf自動クロマトグラフィーシステムを用いて実施した 1H及び13C NMRスペクトルをそれぞれ500MHz又は125MHzでBruker分光器に記録し、重水素化された溶媒信号に対して報告した データfor1H NMRスペクトルは、以下のように報告される：化学シフト(δppm)、多重度(s=一重項、d=ダブレット、t=トリプレット、q=カルテット、キン=キtet m=被乗数)、結合定数(Hz)、および積分 13C NMRスペクトルは、ケミカルシフトの観点から報告されている
高分解能質量分析データをAgilent 6520正確質量Q-TOF LC/MSシステム(Agilent Technologies、Inc)上で取得し、(Agilent Technologies、Inc)は、陽電子モードで動作する Zorbax 300SB-C 18ポロ殻カラム(2。1mm×150mm；粒子サイズ5μm)に対して分離を行った。0。1%ギ酸で水/アセトニトリル勾配を用いて分析物を溶出した。データを高分解能(1700m/z)、4GHzで取得した ランタイム中の質量精度を維持するために、LC/MSラン中に内部質量較正試料を連続的に注入した データ取得および分析は、MassHunterワークステーションデータソフトウェア、LCMSデータ取得(バージョンB 06。01)および定性分析(バージョンB 0。07。00)を使用して実行された
小分子マイクロアレイスクリーニング。2Dエポキシガラススライド(Schott)上に小分子マイクロアレイ(SM)を調製した。簡単に、約15、000の化合物(DMSO中の10m MのDMSO)、ならびに制御染料(Alexa Fluor 647および488)、ならびに制御染料(Alexa Fluor 647および488、 DMSO中の10μM)を384ウェルプレート(配列ジェットJetTM)で調製した。各化合物は、配列ジェットロボットマイクロアレイプリンタによって複製ブロックで印刷された 印刷後、ガラススライドを一晩中にインキュベートして固定化し、続いて24時間真空乾燥し、未反応のエポキシ基をクエンチし、スライドを1Mエタノールアミン水溶液(pH 8)でインキュベートした 5)2時間、DMFおよびddH 2Oで完全にリンスし、続いてN 2乾燥する
標的に対するスクリーニングを開始するために、5'Cy 5標識MYCN G4DNAサンプルを、まず、10μM濃度でアニーリングバッファー(10m mM Tris、pH 7。0、100mM KCl)中に調製した DNAサンプルを95℃で5分間加熱ブロック中でインキュベートし、次いで1時間以上室温まで徐冷した後、折り畳まれたDNAをスクリーニングバッファ(10m mM Tris、pH 7。0、100mM KCl、0)に希釈した 005%Tween 20)は、50nMの最終濃度を満たす。SMMスライドを4ウェルスライドホルダに入れ、3mLの10×tRNA (スクリーニングバッファで500nM)と2時間インキュベートした 次いで、スライドをスクリーニング緩衝液により慎重に洗浄し、3mLのMCN G4DNA溶液(10×tRNAを含む)と別の2hインキュベートした インキュベーション後、50mLの円錐管に移し、各緩衝液中でPBST、ddH 2Oで3回緩やかに洗浄した。次いで、1、700gで2分間遠心分離することにより、スライドを乾燥させた 最後に、SMMとの摺動を647nmの蛍光スキャナ(InnoScan 1100AL)によって5μmの分解能で撮像した。各スポットの蛍光強度をInnopsys Mapixソフトウェアにより定量し、それに基づいてヒットを特定した 事前に報告された基準(Conelly et al、ACS Chemical Biology 2017、12：435-443；Conelly et al、Nature Communications 2019、10：1501) ヒットを識別するために、スクリーニングバッファと共にインキュベートされた別のスライドについても、陰性対照と同様の方法を用いて検査および画像化された
蛍光強度測定。本開示において、蛍光強度アッセイ(FIA)は、単一用量でのヒット結合の有効化と結合親和性決定の両方のために使用された SMMスクリーニングからヒット化合物を有効にするために、各化合物100μM溶液を96で3重に調製した
ウェルプレート(Costar、黒側クリア底)を得、得られた5%DMSO濃度5'Cy 5'Cy 5標識MYCN G4DNAを上記のようにアニールした後、ウェルプレートに加えて最終濃度100nMにした プレートを30分間振盪培養し、続いて500rpmで2分間遠心分離した。次いで、蛍光強度を、Ex 649nm/Em 670nmで相乗的Mxマイクロプレートリーダー(BioTek)上で測定した TMPyP 4/DMSOをそれぞれ正および負の制御として使用した。特定の例では、化合物は、蛍光強度の10%を超える変化が陰性対照(DMSO溶液)と比較して観察されたときに結合剤と考えられた 結合親和性測定のために、小分子溶液をDMSO中の直列希釈液として調製した。次いで、5μLの小分子溶液および10μLのアニールされたDNA試料を85μL緩衝液に添加することによって、最終的な試験プレートを調製した 最終的な小分子濃度が0-250μM (5%最終DMSO濃度)になる。蛍光強度を正規化した 結合親和性は、GraphPadプリズム8。3。1ソフトウェアにおいて、1サイト全体モデルを使用して曲線をフィッティングすることによって計算された。3'標識オリゴヌクレオチドを用いた蛍光滴定も同様に行った
蛍光変位測定。蛍光変位アッセイは、2つの古典的な小溝結合剤(Hoechst 33258およびネトロシン)を使用して実施した フルオロフォアとしてHoechst 33258を、バッファー(10m mM Tris、pH 7。0、100mM KCl)中に5μM濃度で調製し、次いで、異なる濃度の非標識MYCN G4オリゴヌクレオチドで滴定した 置換のために、化合物MY-1またはネトロシンのいずれかを溶液中に加え、最終濃度5μMまたは50μMとした。励起波長352nm、発光波長500nmの蛍光信号を得た
表面プラズモン共鳴(SPR)分析。SPR結合アッセイをBIAコア3000(GEヘルスケア)器具で実施した。CM 5SPRバイオチップをシステムに装填し、ランニングバッファ(10m mM Tris、pH 7。0、100mM KCl、0)でプライミングした 005%Tween 20、5%DMSO)の流量を5μL/minとした後、両フローセル(Fc)1、2をEDC/NHS (0。4M/0。1M)水溶液で15分間活性化した後、ストレプトアビジン(SA)溶液(0)を注入した 2mg/mLの10m M酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4。5)を30分間行う。SAの固定化量が8000-10000RUに達した後、1Mエタノールアミン水溶液(pH 8)を流すことにより表面を失活させた 10m MNaOHで10分間再生し、10mM NaOHで2分間再生して未結合SAを除去し、アニーリングバッファー中の5μMにビオチン化MYCN G4DNAを調製し、95℃まで5分間加熱し、ゆっくりと冷却した アニーリング後、合計150μL溶液をSPRシステムのFc 2に30分間注入し、DNAをチップ表面上に固定した。ベースラインが安定であると、小分子溶液を試験した
結合信号および結合親和性を検出するために、Fc 1(参照)およびFc 2(DNA)の両方において、より高い流量(25μL/min)を使用した 各化合物溶液を20倍に調製し、DMSO中の濃度を設計した後、非DMSOランニングバッファに希釈し、最終濃度5%DMSOを得た 次いで、合計50μLの化合物溶液をFc 1-2流路に120秒間注入して会合させた後、200秒の解離用緩衝液を用いた 50μL再生バッファ(1M KCl)の注入は、必要に応じて2つのサンプル間で実施することができる。最終結合曲線は、基準減算によって得られた 結合親和性(KD)を決定するために、一連の希釈化合物溶液を注入し、ラングミュア1：1結合モデルを使用してBIA評価4。0ソフトウェア(GEヘルスケア)によってKDを計算した
円二色性(CD)特徴付けおよび熱溶融アッセイ。折り畳まれたG-四重鎖構造は、J-1500円二色性分光計(Jasco)を用いた円二色性によって特徴付けられた 未標識MYCNオリゴヌクレオチド(5'-AGG GGG TGG GGG GCA TGC AGA TGC AGG GGG GCA TGC AGA TGC AGG GGG T-3'、SEQ ID NO：7)を、5μM濃度でアニールバッファ(10m mM Tris、pH 7。0、100mM KCl)で調製した これに対して、Li+含有バッファー(10mM Tris、pH 7。0、100mM LiCl)及びH2Oで希釈したDNAサンプルを陰性コントロールとしても用いた。アニールの手順は、上記と同様であった CDスペクトルを25℃で320nmから200nmに1nmの工程で記録した。各スペクトルは、3つの複製サンプルの信号を平均化することによって得られた
熱溶融アッセイのために、MCNオリゴヌクレオチドを5μM濃度で低KCl緩衝液(10m mMトリス、pH 7。0、5m MKCl)で調製した 安定化効果を試験するために、G 4サンプルを20μM化合物(5%DMSOを含む最終溶液)と共にインキュベートした 次に、キュベットに合計300μLの溶液を加え、CD分光器で20℃から95℃まで1℃の間隔で加熱した 融解温度(Tm)を計算するために、263nmにおけるCDスペクトルのピークを追跡し、GraphPadプリズム8ソフトウェアにおいて可変勾配を有する非線形シグモイド用量応答モデルを用いてエリプソメトリ対温度をプロットし、フィッティングした 融解温度(ΔTm)のシフトは、Tm(化合物)-Tm(DMSO)を用いて計算した
2 アミノプリン(2-AP)蛍光滴定。2-アミノプリン標識に基づく蛍光滴定は、以前に報告されたプロトコルを使用して実施された 簡潔には、a 11またはa 18のいずれかの位置で2-AP置換を有するMYCN G4オリゴヌクレオチドを、試料を95℃に5分間加熱し、RTまで徐冷することによってアニールした 折り畳み構造を有するオリゴヌクレオチドをトリス緩衝液(10m mMトリス、pH 7。0、100m MKCl、0。005%Tween 20)中で10μMに希釈し、設計通り三連で黒色96ウェルプレート(Costar)に調製した 小分子をDMSOで希釈し、0。1-5mMの範囲の濃度を有する一連の溶液を得た後、プレート中に添加された20倍(5%DMSO最終濃度)で希釈した 2-AP DNAの最終濃度は、ウェルプレート中の1μMであった。バックグラウンド蛍光を得るために、DNAを含まない小分子溶液も同じプレート中に調製した RTで30分間インキュベートした後、プレートを簡単に遠心分離し、相乗的Mxマイクロプレートリーダー(BioTek)でEx 310nm/Em 365nmでスキャンした 蛍光信号は、基準を引いた後に3重ウェル内の強度を平均化することによって計算された。最後に、 結合信号は正規化され、KD値は、GraphPadプリズム8。3。1ソフトウェアにおいて可変勾配を有する非線形シグモイド用量応答モデルを使用して曲線をフィッティングすることによって決定された
ジョブプロット解析。結合の化学量論を決定するために、溶液中の化合物の嗅覚を変化させることによって、連続的な変動方法を使用した(Rennyら、Angewane Chemie 2013、52：11998-12013) 簡潔には、5μMアニールA 112-AP標識MYCN G4DNA試料および5μM化合物をそれぞれ含むストック溶液(5%DMSOを含む)を調製した 次いで、2つの一連の溶液を、実験のために96枚のブラックウェルプレートに調製した：DNAサンプルと化合物ストックとを混合して、総濃度定数(5μM)を維持することにより、小分子の画分を変化させたものを作製した 緩衝液で希釈されたDNAサンプルの濃度が変化することにより、サンプルのトラックが基準となる。走査後、蛍光強度における2つの一連の溶液の差を計算して、ジョブプロットを生成する 次いで、GraphPadプリズム8。3。1ソフトウェアを用いて線形回帰分析を行った
マイクロスケール熱泳動(MST)。MST実験をモノリスNT。115システム(NanoTemper Technologies)上で実施した。3'-Cy 5MCN G4DNA溶液を10mM Tris (pH 7。5)、100mM KCl、0に調製した 005%T 20、アニールされた(上記の方法によれば)、100nM (2×)に希釈される。小分子のDMSO溶液を、1：1希釈で緩衝液中に調製し、得られた2倍の設計濃度(10%DMSO)を得た 次いで、DNAサンプルを1：1(v/v)混合し、対応する小分子溶液と混合し、50nMのDNAおよび5%DMSOを得た。最後に、MST信号を3連キャピラリで検出した 単サイトモデルを用いて曲線をフィッティングすることにより解離定数を決定した(Mo。Affman分析v 2。3)
DMSフットプリント。5'Cy 5標識DNAのフットプリントは、文献(Zhang et al、JACS 2014、136：1381-1390；Li et al、PNAS 2015、112：14581-14586)に記載されているように実施された MCN G4DNAサンプルを適当な緩衝液(10m mMトリス、pH 7。0、5m MKCl、0。005%T 20)で5μM濃度で調製した後、上述の方法を用いてアニーリングした 次いで、DNA溶液を対応する緩衝液中で50nMに希釈し(各チューブ内の2mLの最終ボリューム)、化合物ストック溶液(DMSO)を添加して、設計された濃度の溶液(5%DMSOになる)を得た 30分間インキュベートした後、折り畳まれたDNAサンプルをRTで0。5%DMSで10分間処理し、200μLの停止バッファー(2。5M NH 4-、0。1Mβ-メルカプトエタノール、1mg/mLのふくらはぎ胸腺DNA)を加えて反応を停止した フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出及びエタノール沈殿後、DNAをヌクレアーゼ遊離水50μLに溶解した 10%ピペリジンを各チューブに等量添加し、混合溶液を90℃で30分間加熱した後、氷を急冷した 再度、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出、エタノール沈殿を行った。沈殿したDNAを10μLのヌクレアーゼ遊離水に溶解し、95℃で5分間変性した 17%変性ポリアクリルアミドゲル上で分解される。ゲルランニング後、Cy 5標識DNA断片を台風イメージャ(Amersham)上で可視化し、イメージJソフトウェアを用いてデジタル化した
細胞株及び細胞培養。神経芽腫細胞株NBEB (Single Copy MYCN)細胞を使用して、MYC/MYCNO G-四重鎖結合分子の有効性を評価した NBEBは、小児腫瘍学的ブランチ、国家がんインスティテインスティテュート(National Cancer Institute、National Institute of Health、Beシソーda、MD)のストックから得られたものであり、STSが検証されている 細胞をRPMI-1640で培養し、10%FBS (Atlanta Biologies、Atlanta)、2mMグルタミン(Life Technologies、New York)、および抗生物質(ペニシリン100μg/mL、ストレプトマイシン100μg/mL；Life Technologies、 5%CO2インキュベータ内の37℃でのニューヨーク
NBEB細胞上のG 4結合性化合物の効果を調べるために、生細胞イメージングは、以下に説明するIncyte界面を使用して実施した NBEB (5K/well)、細胞を三連で96ウェルプレートに播種し、様々な濃度(0-45μM)で化合物MY-8で処理し、制御ウェルが合流に到達するまで培養した RT-qPCRおよびウェスタンブロッティングのために、NBEB (300K)細胞を6ウェルディッシュ内のMY-8で48時間処理し、MYCNOの発現の時間依存性減少を調べ、細胞を22で処理した 5μMおよび45μM MY-8であり、様々な時間(0、4、24、48、72および96h)で分析される。細胞生存率を検証するために、トリパンブルー排除試験を、48hおよび96h後の処置に続いて実行し、生存対死細胞の割合を確認した 血球計算機を用いて算出した
細胞生存。生細胞画像解析に続いて、細胞生存を調べるために、3-(4、5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム内側塩アッセイを行った。(MTS；内部塩アッセイ；Promega、America) 吸光度は、波長490nmでマイクロプレートリーダー(BIO-RAD、アメリカ)で測定した。生存細胞の割合を計算するために、各グループからの制御サンプルによって、MY-8処理細胞を分割した
切開生細胞撮像システム。生きた細胞のイメージングは、センサーバイオシエンス(Annアーバ、MI、USA)からのIncyteズーム生細胞撮像システムを使用して実施された NBEB NB細胞のための予め定義された処理定義から、切開された細胞の合流点を測定する。C。C。ズーム。ライブ。セル。イメージング。システムは、処理の持続時間(0-120h)の間、6h毎に3つの位相コントラスト画像を走査する
定量的RT-PCR。総RNAを、製造者の指示に従って、NBEB細胞から抽出した(RNbプラスミニ抽出キット(#74134)(Qiagen、CA) cDNA合成高容量RNA-cDNA (商標)Kitを用いて、RNA (1μg)をcDNAに逆転写した。定量的PCRは、製造者のプロトコルに従って、Fast SYBR (商標)Green Master Mixを使用して実施した ハウスキーピング遺伝子として、β-アクチンを用いた。2(-ΔCt)法を用いて相対式を算出した。qPCRプライマー配列は補足材料中に見出され得る
タンパク質アッセイ。6ウェルプレート中の40-8時間後-MY-8処理、単一コピーMYCN細胞を、放射性免疫沈降アッセイバッファ(Beytime、China)を用いてプレートに直接溶解し、ペレット化し、-80℃で冷却した 細胞接着不良に起因して、NBEB細胞を1。5mLのマイクロ遠心チューブに集め、リン酸緩衝液(Sigma-Aldrich、USA)で2回洗浄し、ペレット化し、-80℃で冷却した 総タンパク質濃度は、Bradford試薬(Beyford試薬)を使用したBradfordアッセイを使用して決定した(Beytime、China)。各タンパク質試料(10μg)を12%のゲル(Bio-Rad、USA)上にロードした 90Vで90分間電気泳動し、Bio Rad Trans-ブロット。ターボ転送システム(Bio-Rad、USA)を使用してニトロセルロース膜(Impmoilon-P、Millipore、Bedford、MA、USA)に移送される ニトロセルロース膜を、室温で1時間、0。5%Tween 20を添加したトリス緩衝生理食塩水中で5%乳中でインキュベートし、抗N-Myc：sc-53993(1：4000)および抗GAPDH：sc-47724(1：2000)抗体と共に4℃で一晩インキュベートした インキュベーション後、膜を0。5%Tween 20を添加したトリス緩衝生理食塩水で洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウス(1：1000)抗体でプローブし、室温で1時間インキュベートした 化学発光シグナルは、クラリティ(商標)西洋ECL基質(Bio-Rad、USA)またはスーパーシグナル(商標)West Femto最大感度基質(ThermoFisher Scientific、USA)を用いて、CヘミDocゲルイメージングシステム(Bio-Rad、USA)を用いて検出された
バイオインフォマティクス研究。実験G 4データ(NA NA_K_PDs_minus_hits_hits_交差T。Z T。T。P。I。P。P。I。P ベッドファイルのゲノム配列を、就寝用具getfasta (寝具2。30。0)(2)を使用してGRCh37(hg 19)参照ゲノムから抽出した。Na_K_PDS_plus_hit_交差の場合には、Ana_K_PDS_plus_hit_hitは、Ana_K_PDS_plus_hit_交差する ベッド位置、相補鎖配列は、ゲノムアセンブリの負鎖上に存在するG 4配列によって抽出された (G 3-6(N 1-33)3G 3-6)一般式：(G 3-6(N 1-33)3G 3-6)
その後、G 4配列内のヘアピン形成ループの電位を計算した。UNAFold 4。0を使用して、G 4sの長さ3ntの2つのG管に挟まれた配列からヘアピン形成を計算した UNAFoldは、DNAエネルギー規則(3)の下で37℃で1本鎖を形成する各nt位置の確率を出力するために、ハイブリッドss-min--NA DNAを使用して実行された 50%を超えるヌクレオチド塩基対を有する配列をヘアピン形成配列として同定した。次いで、ヘアピン形成G 4sを同定し、それを抽出したOQsに遡った G 4-ヘアピン含有OQsの座標を、UCSC Liftゲノム注釈ツール(liftOver)(4)を使用してGRCh38(hg 38)座標に変換した
得られたhg 38座標をGENCODE、hg 38バージョン36の総合遺伝子アノテーションGFF 3ファイル(5)で注釈した。プロモーターはまた、GENCODE遺伝子のTSS部位の上流の領域1000ntとして定義された注釈に加えられた イントロンはまた、ゲノムツールパッケージ(genomツール1。6。1)-gt gff 3-addintron iコマンド(6)を使用してGENCODEアノテーションに添加された。GQ-ヘアピン含有OQsとの重複ゲノム特徴を、便器交差コマンドを使用して識別した Python 3。8は、前述のソフトウェアパッケージによって実行されない計算動作のために使用された
qPCR実験。qPCR実験のためのプライマー配列は、以下のように詳細に説明する
MYCNo-01(ENST 00000641263。1-1、313、bps)
センス5'-AGGCTCAGCTCCTCCTCRATA 3'、SEQ。ID NO 10
アンチセンス5'TTCTGGAGGAGAAGTCC 3'、SEQ ID NO：11
MYCNo-02(ENST 00000419083。5-770bps)
センス5'CTCACGAGCACGCAGACAC 3'、SEQ ID NO：12
アンチセンス5'-TCCCAGCTTTTGCAGCCTTCT 3'、配列番号13
MYCタンパク質アイソフォーム1(ENST 00000281043。4-464A A)
Sense 5'GATCTGCAAGAACCAGACC 3'、SEQ ID NO：14
アンチセンス5'CACAGCTCGTTCTCCAAGCAG 3'、SEQ ID NO：15
MYCタンパク質アイソフォーム2(ENST 00000638417。1-253A A)
センス5'TCCTGGGAACTGTGTTGGA 3'、SEQ ID NO：16
アンチセンス5'CACAGTGACGTCGATT 3'、SEQ ID NO：17
Figure 2024522183000063
 スキーム3
反応フラスコに6-ヒドロキシピリダジン-3-カルボン酸(392mg、2。80mmol)、EDC。HCl (589mg、3。08mmol)、オキシma純粋(438mg、3。08mmol)およびDMF (8mL)を添加した 反応を室温で10分間撹拌し、続いて4-メトキシベンズアミドキシム(605mg、3。64mmol)を添加した。次いで、反応混合物を120℃に加熱し、撹拌した 3時間後、反応混合物を濾過し、DMF (3mL×3)で洗浄した。濾液を回収し、乾燥して、目的生成物P 1(344mg、46%)を得た。1H NMR (500M Hz、DMSO-d6)：δ13。85(s、1H)、8。08(d、J=9) 9H z、1H)、8。04-8。01(m、2H)、7。17-7。14(m、1H)、7。12(d、J=9。9H z、1H)、3。85(s、3H)；13C NMR (125M Hz、DMSO-d 6)：δ171。2、167。9、162。0、160。3、132。4、131。9、130。4、128。9、118。0、114 8、5、5；HRMS：(ESI+)m/z：C13H11N4O3[m+H]+：271。0826、求められた271。0833
POCl 3(6m L)中のP 1(970mg、3。59mmol)の溶液を100℃に加熱し、4時間撹拌し、氷冷水に注ぎ、10%NaOH溶液で中和した 次いで、混合物をEtOAc (10mL×3)で抽出し、ブラインで洗浄した。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した 得られた残渣をISCOフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH 2Cl 2中の0-25%MeOH)で精製し、P 2(246mg、72%)をピンク色固体として得た。1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ8。57(d、J=8。9H z、1H)、8。26(d、J=8。9H z、1H)、8。09-8 06(m、2H)、7。19-7。16(m、2H)、3。87(s、3H)；13C NMR (125M Hz、DMSO-d 6)δ172。0、168。3、162。1、158。4、147。1、130。4、130。2、129。0、117。8、114。9、55。5；HRMS：(ESI+)m/zがC 13H 1035ClN 4O[m+H] +：289のために計算される 0487、見出された：289。0493
EtOH (3m L)中のP 2(20mg、0。07mmol)、3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロパン-1-アミン(22mg、0。14mmol)およびNH 4Cl (4mg、0。07mmol)の混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌した 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の0-25%MeOH)で精製し、白色固体としてMY-5(13mg、45%)を得た 1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ8。04-8。01(m、2H)、7。98(d、J=9。3H z、1H)、7。83(s、1H)、7。16-7。13(m、2H)、6。98(d、J=9。3H z、1H)、3。85(s、3H)、3。50-3。43(m、2H)、2。56-2。25(m、10H)、2。19(s、3H)、1。77(キン、J=7) 0H z、2H)；13C NMR (125M Hz、DMSO-d6)δ173。4、167。7、161。8、159。4、138。3、128。8、127。4、118。4、114。7、55。5、55。3、54。6、52。4、45。5、25。7；HRMS：(ESI+)m/zが、c 21h 28N 7O 2[m+H] +：410。2299について計算される
410.2305.
EtOH (3m L)中のP 2(30mg、0。10mmol)、N、N'-ジメチルエチレンジアミン(18mg、0。20mmol)およびNH4Cl (5mg、0。10mmol)の混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌した 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中の0-25%MeOH)で精製し、白色固体としてMY-6(15mg、44%)を得た 1H NMR (500M Hz、DMSO-d6)δ8。17-8。14(m、1H)、8。05-8。03(m、2H)、7。35-7。32(m、1H)、7。17-7。14(m、2H)、4。08(t、J=6。4H z、2H)、3。86(s、3H)、3。24-3。20(m、5H)、2。59-2。58(m、3H)、13C NMR (125M Hz、DMSO-d 6)δ173 3、167。8、161。9、159。6、138。2、128。8、127。8、118。3、114。7、111。8、55。5、46。1、46。0、36。5、33。0；HRMS：(ESI+)m/zがC17H21N6O2[m+H]+：341。1721、見出された：341。1725
EtOH (3m L)中のP 2(20mg、0。07mmol)、3-アミノプロパンアミド塩酸塩(17mg、0。14mmol)及びK 2CO 3(37mg、0。28mmol)の混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌した 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH 2Cl 2で0-25%MeOH)で精製し、白色固体としてMY-7(12mg、50%)を得た。1H NMR (500M Hz、DMSO-d6)δ8。04-8 01(m、2H)、7。99(d、J=9。6H z、1H)、7。84(t、J=5。9H z、1H)、7。39(s、1H)、7。16-7。13(m、2H)、7。01(d、J=9。6H z、1H)、6。88(s、1H)、3。85(s、3H)、3。68-3。66(m、2H)、2。45(t、J=6) 7H z、2H)；13C NMR (125M Hz、DMSO-d6)δ173。4、172。5、167。7、161。8、159。2、138。4、128。8、127。4、118。4、114。7、55。4、37。3、34。3；HRMS：(ESI+)m/zがC 16h 17N 6O[m+H] +：341。1357、見出された：341。1359
2(32。91mg、0。11mmol)、3-(1-アゼパル)-1-プロパンアミン(36mg、0。23mmol)及びNH 4Cl (6mg、0。11mmol)のEtOH (3m L)中の混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌した 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH 2Cl 2で0-25%MeOH)で精製し、白色固体としてMY-8(31mg、66%)を得た。1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ8。04-7。99(m、4H)、7 16-7。14(m、2H)、7。04(d、J=9。5H z、1H)、3。85(s、3H)、3。55-3。54(m、2H)、3。15-3。07(m、6H)、2。08-2。00(m、2H)、1。83-1。77(m、4H)、1。67-1。57(m、4H)、13C NMR (125M Hz、DMSO-d 6)δ173。3、167。8、161。8、159。5、138。6、128。8、127。5、118 4、114。7、55。5、54。4、53。8、38。3、26。0、23。7、23。3；HRMS：(ESI+)m/zをC 22H 29N 6O 2[m+H] +：409。2347、求めた：409。2354、MY-8(5mg)をTFA (1mL)で30分間撹拌し、対応するTFA塩を得た
2(30mg、0。10mmol)、2-モルホリノレイン-1-アミン(14mg、0。20mmol)およびNH 4Cl (5mg、0。10mmol)のEtOH (3m L)中の混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌した 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィー(0-25%)で精製した
MY-13(22。5mg、59%)を白色固体として得られるように、CH 2Cl 2中のMeOHを用いて、MY-13(22。5mg、59%)を得る。1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ8。05-8。02(m、2H)、7。99(d、J=9。3H z、1H)、7。70(t、J=5。5H z、1H)、7。17-7。14(m、2H)、7。04(d、J=9。4H z、1H)、3。85(s、3H)、3。61-3 58(m、6H)、2。56(t、J=6。6H z、2H)、2。46-2。44(m、4H)；13C NMR (125M Hz、DMSO-d 6)δ173。4、167。7、161。8、138。4、128。8、127。4、118。4、114。7、66。2、56。9、55。4、53。4、38。0；HRMS：(ESI+)m/zがC 19H 23N 6O[m+H]+：383について計算される 1826、見出された：383。1831
2(20mg、0。07mmol)、2-(4-メチルピペラジン-1-イル)een-1-アミン(20mg、0。14mmol)およびNH4Cl (4mg、0。07mmol)のEtOH (3m L)中の混合物を80℃に加熱し、一晩撹拌した 反応混合物を真空下で濃縮し、得られた残渣をIscoフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH 2Cl 2で0-25%MeOH)で精製し、MY-14(16mg、58%)を白色固体として得た。1H NMR (500M Hz、DMSO-d6)δ8。04-8 02(m、2H)、7。99(d、J=9。5H z、1H)、7。68(t、J=5。3H z、1H)、7。16-7。14(m、2H)、7。03(d、J=9。5H z、1H)、3。85(s、3H)、3。62-3。56(m、2H)、2。56(t、J=6。7H z、2H)、2。46-2。26(m、8H)、2 17(s、3H)；13C NMR (125M Hz、DMSO-d6)δ173。4、167。7、161。8、138。4、128。8、127。4、118。4、114。7、56。4、55。4、54。6、52。6、38。3；HRMS：(ESI+)m/zがC 20H 26N 7O 2[m+H]+：396。2142、見出された：396。2141
化合物合成-2価の化合物
本明細書に開示される2価の化合物は、以下のスキーム5に従って作製された
Figure 2024522183000064
 スキーム5
2価の化合物のR1基(上記スキーム5)は、スキーム6で以下のように作製された後、下記の条件を使用してスキーム5中の化合物7と組み合わされた
Figure 2024522183000065
 N1-(6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-イル)エタン-1、2-ジアミン(1)：
暗所において、6、9-ジクロロ-2-メトキシクリジン(99.2mg、0.357mmol、1当量)、フェノール(33.6mg、0.357mmol、1当量)、1、2-ジアミノエタン(214mg、3.57mmol、10当量)、110℃で8時間加熱する。LCMSが終了すると、反応は室温まで冷却され、セライトに濃縮された。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/改質剤として0.1%TFAで0-100%アセトニトリル/水)で精製し、黄色固体として66.3mg(62%)を得た：1HNMR(500MHz、CD3OD)δ8.47(dd、J=9.5、2.6Hz、1H)、7.86(q、J=2.9、2.4Hz、1H)、7.81(dd、J=9.3、2.0Hz、1H)、7.74-7.67(m、1H)、7.54(dt、J=9.3、2.1Hz、1H)、4.52(t、J=6.2Hz、3H)、4.03(d、J=2.0Hz、3H)、3.58(t、J=6.1Hz、2H)；13CNMR(126MHz、CD3OD)δ158.72、158.55、142.20、141.78、136.27、129.37、129.19、125.48、121.60、118.79、116.08、111.61、103.92、56.75、47.44、39.78；C16H16ClN3O+[m+h]+m/z301.09、測定LC/MS(ESI)Rt1.18min、m/z302.20[m+h]+
Figure 2024522183000066
 N1-(6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-イル)プロパン-1、3-ジアミン(2)：
6、9-ジクロロ-2-メトキシクリジン(200mg、0.719mmol、1当量)、フェノール(67.7mg、0.719mmol、1当量)、1、3-ジアミノプロパン(533mg、7.19mmol。10当量)および1、3-ジアミノプロパン(533mg、7.19mmol。10当量)を密閉バイアルに入れ、暗所で110℃で8時間加熱する。LCMSが終了すると、反応は室温まで冷却され、セライトに濃縮された。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(0~100%のアセトニトリル/水で0.1%TFAを修飾剤として0~100%のアセトニトリル/水で精製し、125mg(57%)を黄色固体として得た：1HNMR(500MHz、CD3OD)δ8.47(dd、J=9.5、3.0Hz、1H)、7.77(dd、J=9.8、2.4Hz、1H)、7.77(dd、J=9.1、3.1Hz、1H)、7.50(dt、J=9.4、2.2Hz、1H)、4.27(t、J=7.0Hz、2H)、4.00(d、J=4.2Hz、2H)、3.13(t、J=7.6Hz、2H)、2.38-2.31(m、2H)；13CNMR(125MHz、CD3OD)δ158.47、158.33、142.05、141.73、136.08、129.34、128.99、125.29、121.59、118.67、115.88、111.59、103.86、56.71、47.30、38.11、28.66；C17H18ClN3O+[m+h]+m/z315.11、測定LC/MS(ESI)Rt1.17min、m/z316.20[m+h]+
Figure 2024522183000067
 N1-(6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-イル)ブタン-1、4-ジアミン(3)：
6、9-ジクロロ-2-メトキシクリジン(250mg、0.899mmol、1当量)、フェノール(84.6mg、0.889mmol、1当量)、1、4-ジアミノブタン(792mg、8.99mmol。10当量)、及び1、4-ジアミノブタン(792mg、8.99mmol。10当量)を密閉バイアルに入れ、暗所で110℃で8時間加熱する。LCMSが終了すると、反応は室温まで冷却され、セライトに濃縮された。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/水で0.1%TFAを改質剤として0-100%アセトニトリル/水)で精製し、黄橙色固体として424mg(85%)を得た：1HNMR(500MHz、CD3OD)δ8.20(dd、J=9.4、2.5Hz、1H)、7.80(t、J=2.0Hz、1H)、7.78~7.75(m、1H)、7.46(d、J=2.7Hz、1H)、7.39(dt、J=2.7Hz、2H)、3.83(t、J=7.1Hz、2H)、2.83(dd、J=8.9、6.0Hz、2H)、1.83(p、J=8.4、7.6Hz、2H)、1.70~1.62(m、2H)；C18H20ClN3O+[m+h]+m/z329.13、測定LC/MS(ESI)Rt1.56min、m/z330.25[m+h]+
Figure 2024522183000068
 N-(2-(2-アミノエトキシ)エチル)-6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-アミン(4)：
組み合わせ6、9-ジクロロ-2-メトキシクリジン(250mg、0.899mmol、1当量)、フェノール(84.6mg、0.889mmol、1当量)、2、2'-オキシビス(e-1-アミン)(936mg、8.99mmol。10当量)を密閉バイアルに入れ、暗所で110℃で8時間加熱する。LCMSが終了すると、反応は室温まで冷却され、セライトに濃縮された。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/水で0.1%TFAを改質剤として0-100%アセトニトリル/水)で精製し、黄色固体として441mg(86%)を得た：1HNMR(500MHz、CD3OD)δ8.15(d、J=9.4Hz、1H)、7.80(s、1H)、7.78(d、J=9.3Hz、1H)、7.38(s、2H)、7.33(d、J=9.3Hz、1H)、3.91(s、3H)、3.85(t、J=5.1Hz、2H)、3.63(m、2H)、3.43(m、2H)、2.70(m、2H)；13CNMR(126MHz、CD3OD)δ155.89、151.58、147.51、145.60、134.99、129.02、125.70、125.37、124.81、123.31、117.87、115.40、99.69、71.75、70.15、54.76、49.38、40.63、C18H20ClN3O2+[m+h]+m/z345.12、測定LC/MS(ESI)Rt1.74min、m/z346.25[m+h]+
Figure 2024522183000069
 N-(2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチル)-6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-アミン(5)：
組み合わせ6、9-ジクロロ-2-メトキシクリジン(250mg、0。899mmol、1当量)、フェノール(84。6mg、0。889mmol、1当量)2、2'-(エタン-1、2-ジニルビス(オキシ))ビス(1-アミン)(1。33g、8。99m mol。10当量)は、密閉されたバイアル内で(1。33g、8。99m mol。10当量)、暗所で110℃で8時間加熱する LCMSが終了すると、反応は室温まで冷却され、セライトに濃縮された。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/10m MNH 4OHを修飾剤として0-100%アセトニトリル/水)で精製した 黄色固体：1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ8。37(d、J=9。2H z、1H)、7。86(s、1H)、7。63(d、J=2。7H z、1H)、7。41(d、J=9。3H z、1H)、7。34(d、J=10。5H z、1H)、6。78-6。55(m、1H)、3。93(s、3H)、3。86(d、J=
7. 9H z、2H)、3。68(t、J=5。6H z、2H)、3。49(dd、J=5。7、3。9H z、2H)、3。40(t、J=5。9、3。9H z、2H)、3。25(t、J=5。8H z、2H)、13C NMR (126M Hz、DMSO-D 6)δ155。15、150。62、147。98、146。23、133。44、130。81、127 23, 126.34, 126.18, 117.69, 115.38, 100.54, 73.06, 69.79, 69.50, 55.59, 41.28.
Figure 2024522183000070
 6 -(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-オール(6)：
DMF (48m L)中の6-ヒドロキシピリダジン-3-カルボン酸(1。50g、11mmol、1当量)の溶液に、トリエチルアミン(3。0mL、21mmol、2当量)、HOBt (1。60g、11mmol、1当量)、EDC。HCl (2。40g、11mmol、1当量)を加えた N'-ヒドロキシ-4-メトキシベンズイミダゾールアミド(1。80g、11mmol、1当量)を添加する前に、溶液を室温で30分間撹拌した 反応を室温で1時間維持し、次いで加熱して150℃で1時間保持し、またはTLCにより完全に判断した。溶液を室温まで冷却し、その時点で溶液から析出した生成物を生成した 水(-300m L)を添加し、固体を室温で30分間攪拌した。生成物を真空濾過によって単離し、真空中で乾燥させ、1。84gの6(64%)を白色固体：1H NMR (500M Hz、DMSO-D 6)δ13として得た 85(s、1H、d2Oとの交換)、8。08(d、J=9。9H z、1H)、8。02(d、J=8。9H z、2H)、7。15(d、J=9。9H z、1H)、7。12(d、J=9。9H z、1H)、3。85(s、3H)、13C NMR (125M Hz、DMSO-d 6)δ171。2、167。9、162。0、160。3、132。3、131。8、130 4、128。9、117。9、114。8、55。4。NMRデータは文献値と一致する。[1]
Figure 2024522183000071
 5 -(6-クロロピリジン-3-イル)-3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール(7)：
1(500mg、1。85mmol、1当量)およびPOCl 3(3。14mL、0。59M)のバイアルを封止し、100℃に4時間加熱した。TLCにより完全に判定されると、反応混合物を室温まで冷却し、真空下で濃縮した 粗混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(0-100%EtOAc/ヘキサン)により精製して、tan固体：1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ8。56(d、J=8。9H z、1H)、8。26(d、J=9)として7の388mg (72%)を得た 0H z、1H)、8。07(d、J=8。8H z、2H)、7。17(d、J=8。8H z、2H)、3。86(s、3H)；13C NMR (125M Hz、DMSO-d 6)δ172。0、168。3、162。1、158。4、147。0、130。3、130。2、129。0、117。8、114。8、55。5
Figure 2024522183000072
 N 1-(6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-イル)-N 2-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)エタン-1、2-ジアミン(B 32)：
DMSO (1m L)中の7(21。3mg、0。07mmol、1当量)の溶液にDIPEA (64。3μL、0。370mmol、5当量)に続いて2(44。4mg、0。148mmol、2当量)を加えた。反応を加熱し、110℃で18時間維持した 粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/水で0。1%TFAを修飾剤として0-100%アセトニトリル/水)で精製して3を得た B 32の26mg (7%)は黄色固体として26mg (7%)である：1H NMR (500M Hz、DMSO-d 6)δ8。68(d、J=9。3H z、1H)、8。04(d、J=8。9H z、1H)、7。96(d、J=2。1H z、1H)、7。87(d、J=2。1H z、1H)、7。86-7。73(m、2H)、7。67(dd、J=9。2、2。5H z、1H)、7。50(dd、J=9) 2、2。2H z、1H)、7。16(d、J=8。9H z、2H)、6。91(d、J=9。4H z、1H)、4。42(d、J=5。9H z、2H)、4。00(s、3H)、3。86(s、3H)、3。75(m、2H)
Figure 2024522183000073
 N1-(6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-イル)-N3-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)プロパン-1、3-ジアミン(B 33)：
DMSO(1mL)中の7(30mg、0.1mmol、1当量)の溶液にDIPEA(91μL、0.52mmol、5当量)に続いて2(65mg、21μmol、2当量)を加えた。反応を加熱し、110℃で18時間維持した。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/改質剤として0.1%TFAで0-100%アセトニトリル/水)で精製し、B33を黄色固体として17mg(29%)を得た：1H)、8.11(d、J=9.4Hz、1H)、7.78(d、J=9.4Hz、1H)、7.78(d、J=9.4Hz、1H)、7.58(d、J=9.3、2.5Hz、1H)、7.10(d、J=8.8Hz、1H)、6.81(d、J=6.2Hz、1H)、4.02(t、J=6.2Hz、2H)、4.02(s、J=6.2Hz、2H)、3.75(t、J=6.4Hz、2H)、2.31(t、J=6.4Hz、2H)；C30H26ClN7O3+[m+H]+m/z567.18、測定LC/MS(ESI)Rt4.14min、m/z568.35[m+H]+
Figure 2024522183000074
 N1-(6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-イル)-N4-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)ブタン-1、4-ジアミン(B 34)：
DMSO(1.0mL)中の7(30mg、0.1mmol、1当量)の溶液にDIPEA(91μL、0.52mmol)に続いて3(51mg、0.16mmol、1.5当量)を加えた。反応物を110℃で18時間加熱保持し、粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/改質剤として0.1%TFAで0-100%アセトニトリル/水)で精製し、B34を19mg(31%)を黄色固体として得た：H)、8.09(d、J=9.4Hz、1H)、7.79(d、J=9.3Hz、1H)、7.79(d、J=9.3Hz、1H)、7.75(d、J=9.3Hz、1H)、7.47(d、J=9.3Hz、1H)、6.78(d、J=9.4Hz、1H)、3.96(s、J=7.0Hz、1H)、3.96(s、J=7.0Hz、2H)、3.55(t、J=6.9Hz、2H)、2.03-1.97(m、2H)、1.83(t、J=7.3Hz、2H)；C31H28ClN7O3+[m+h]+m/z581.19、測定LC/MS(ESI)Rt4.10min、m/z582.40[m+h]+で算出されるLRMS
Figure 2024522183000075
 6 -クロロ-2-メトキシ-N-(2-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)アミノ)エトキシ)エチル)アクリジン-9-アミン(B 35)：
DMSO(2mL)中の7(42mg、0.15mmol、1当量)の溶液にDIPEA(130μL、0.73mmol、5当量)に続いて4(75mg、0.22mmol、1.5当量)を加えた。反応を110℃で18時間加熱保持した。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/改質剤として0.1%TFAで0-100%アセトニトリル/水)で精製し、B35を黄色固体として48mg(55%)とした：1H)、8.03(d、J=8.8Hz、1H)、8.03(d、J=2.6Hz、1H)、7.89(d、J=2.6Hz、1H)、7.81~7.71(m、3H)、7.64(dd、J=9.3、2.5Hz、1H)、6.73(d、J=9.4Hz、1H)、6.73(d、J=9.4Hz、1H)、4.26(m、2H)、4.01(t、J=5.1Hz、2H)、3.93(s、3H)、3.87(s、3H)、3.75(t、J=5.3Hz、2H)、3.63(m、2H)；C31H28ClN7O4+[m+h]+m/z597.18、測定LC/MS(ESI)Rt3.89min、m/z598.35[m+h]+
Figure 2024522183000076
 6 -クロロ-2-メトキシ-N-(2-(2-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)エトキシ)エトキシ)エチル)アクリジン-9-アミン(B 38)：
DMSO(2mL)中の7(100mg、0.35mmol、1当量)の溶液にDIPEA(302μL、1.73mmol、5当量)に続いて5(168mg、0.43mmol、1.5当量)を加えた。反応を110℃で18時間加熱保持した。粗反応混合物を室温まで冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー(0-100%アセトニトリル/改質剤として0.1%TFAで0-100%アセトニトリル/水で精製して50mg(23%))を黄色固体として得た：1H)、8.01(d、J=8.8Hz、1H)、8.01(d、J=2.6Hz、1H)、7.88(d、J=2.6Hz、1H)、7.81(d、J=9.4Hz、1H)、7.51(d、J=9.4Hz、1H)、6.90(d、J=5.6Hz、1H)、4.24(q、J=5.6Hz、1H)、3.94(m、5H)、3.86(s、3H)、3.64(m、2H)、3.59-3.53(m、4H)、3.51(m、2H)；C33H32ClN7O5+[m+h]+m/z641.21、測定LC/MS(ESI)Rt3.87min、m/z642.50[m+h]+
[実施例1]
MCN遺伝子のG-四極ラテックスの分析
図3に示すように、本明細書で論じられるMYCN G4は、MYCNOの負鎖および転写開始部位(TSS)の近くに位置する。しかしながら、単純なG 4sとは異なり、MYCN G4は、テトラッド(Benablou et al、Biochim)に隣接するヘアピンを含む ET Biophys Acta 2014、1840(41-52)。この種のハイブリッドG 4構造は、最近、ゲノムデータマイニングおよび実験アプローチ(Onel et al、JACS 2016、138：2563-2570；Ngoc ngu円et al、核酸Res)の両方によって特徴付けられている 2020、48：10567-10575；Lim et al、Nucleic Acid Res。2015、43：5630-5646)、及びそれらの独自の構造Kangら、JACS 2016、138：13673-13692による小分子の非トリグリング標的を表す MYCN G4は、インビトロで構造的に特徴付けられているが、質問は、生物学的状況においてG 4sの存在について頻繁に生じる MYCN遺伝子がG 4sに折り畳まれる配列を含むことを確認するために、ベーラサランプ群(チャンバーet al、Nature Biotechnology 2015；33：877-881)によって報告されたゲノムワイドG 4配列データを分析した このアプローチは、G 4sを安定化させる前後の2回の配列からなっていた。対応する領域においてG 4構造を形成する可能性が高いとの実験間のより高い不整合率が得られる これらのデータ内で、この作業に対する関心のG 4配列は、K+およびPDS安定化データセットの両方においてはるかに高いミスマッチ率を有することが見出され、MCN遺伝子におけるG 4の存在を確認した(図4) さらに、QGRSマッパー(Kikin et al、Nucleic Acid Res。2006、34：W 676-682)を使用してこのシーケンス内のGスコアを計算することにより、関心対象が33の有望なGスコアを示すことが見出された(図5A-5B)
[実施例2]
小分子マイクロアレイのスクリーニングおよびHit同定
MYCN G4の小分子結合剤を同定するために、小分子マイクロアレイ(SMM)スクリーニングアプローチを使用した。この研究では、 エポキシ基で修飾されたガラスは、以前に報告された類似のプロトコルに従って調製された(Abulwerdiら、方法2016、103：188-195) 化合物は、ロボット配列(配列ジェットTM)によって印刷され、ガラス表面上に共有結合固定された。次いで、スライドを50nMのMYCN G4DNAとインキュベートし、Cy 5標識を5'および緩衝液に並行して行った
洗浄および乾燥の後、スライドをマイクロアレイスキャナによって撮像した。各化合物について、複合Zスコアを計算し、ヒットを同定した(Conelly et al、ACS Chemical Biology 2017、12：435-443) 他のSMMスクリーン中の他の核酸への約束性のある結合を欠失した化合物を優先した。合計14ヒットを同定した(表2)
Figure 2024522183000077
Figure 2024522183000078
真結合剤として14個のヒット化合物を有効にするために、蛍光強度アッセイ(FIA)および表面プラズモン共鳴(SPR)によって単濃度結合アッセイを行った。各アッセイにおいて、化合物を100μM濃度で評価した この例では、FIA研究における10%>消光の基準を用いて正の結合を定義し、比SNR>3をSPR実験におけるカットオフとして使用した
化合物1、2、MY-1、5、10、11、12、及び14はFIA研究にヒットし、化合物1-3、MY-1、5、9及び13はSPR研究にヒットした これらのアッセイから、4種の化合物(1、2、MY-1、5)を同定し、両結合アッセイにおける陽性反応を示した(図6-8)。平衡解離結合定数(KD)値をFIAおよびSPRによって測定した(図9および図10) MCN G4DNAサンプルを化合物の勾配濃度で滴定することにより、化合物MY-1は、4個の候補(KD=3。5±1。6μM、FIAによって、KD=3。6±2。4μM)の中で最も良い結合を示すことが見出された 化合物1は、2と同様の構造を共有しているが、より良好な結合親和性(FIAによって20。8±2。2μM、SPRによって11。7±2。6μM)であった
MYCN G4熱安定性に対するMY-1の効果は、円二色性(CD)によって評価された。まず、CD分光法によりG 4形成を確認した MCN G4DNAのサンプルを、3種類の異なる緩衝条件(10mM Tris、100mM KCl、10mM Tris、100mM LiCl、H2O)で調製した。図に示すように、 11A、MYCN G4DNAは263nmに正のピークを示し、240nmに負のピークを示し、KCl緩衝液中の適切に折り畳まれた平行G-四重鎖構造の特性を示している 対照的に、LiCl緩衝液およびH2O中のDNA試料のスペクトルは、240nmでのピークは無視できるが、263nmにおいてはるかに弱いピークを示した
次に、有効化された小分子バインダーなしでインキュベートされたMYCN G4DNAを使用して、CD器具上で融解アッセイを実証した。CDスペクトル中の263nmのピークは、加熱中に徐々に減少する(図1) 温度依存強度をフィッティングすることにより、Tmを決定した。MCN G4を最初に10m MTris緩衝液(pH 7。0)で100mM KClで溶解し、Tmを78。0±1と判定した 9℃は、以前に報告された値(Benablouら、Biochim)と一致した。Et Biophys Acta 2014；1840：41-52)。熱膨張に対する分子の影響を評価するために、低KCl濃度(Kuari et al)を使用してアッセイを行った G 4の折り曲げを確認した後、Nature Chemical Biology 2007、3：218-221)は、下部KClの影響を受けなかった(図12)。5m MKCl緩衝液中で、MCN G4の融解曲線をより良好にフィッティングさせ、Tmを54。6±0。4℃とした Tmは、バッファ。20μM 1またはMY-1への5%DMSOの添加の影響を受けず、MCN G4溶液に添加し、展開前15分間インキュベートした その結果、化合物の両方が融解曲線において有意なシフトを誘発し、4。7±0。7℃(1)および3。7±0。5℃(MY-1)によってTmを増加させる(図11C)。いずれの化合物もdsDNA融解に測定可能な効果を示していない(図1) 11D)、これらのヒット化合物がB-DNA結合剤ではなかったことを示す
また、化合物1およびMY-1の結合選択性についても評価した。別個の実験では、過剰tRNAの存在/非存在下で、化合物をG 4溶液に滴定することによって、蛍光ベースのアッセイを行った dsDNAと同様に、過剰tRNAは、1またはMY-1の結合親和性に影響を及ぼさず、再び特定の相互作用モードを示唆した(図13Aおよび13B)。加えて、癌関連遺伝子からの他の5つの5'Cy 5標識G 4s (図 1)も選択性プロファイリングに導入した。2つのヒットした化合物を滴定することによって、化合物1は、25。2-127。9μMの範囲の結合親和性を有する全てのG 4sへの結合を示すが、MCN G4よりも弱いことが観察された(図14A-14E) しかし、MY-1は、MYCN以外のG 4について有意な消光挙動およびKD値を測定できなかった(図15A-15E、16A-16E)。この結果、MYCN G4に特異的な構造を介して結合したMY-1が示された
[実施例3]
化合物MY-1を非正準位G 4結合剤として同定することにより、SPRセンサグラムを分析することにより、化合物1とMY-1との間の有意に異なる結合レベル(Rmax)が観察された 2つの化合物の結合モードが異なることが示唆される。この予期しない観察に基づいて、単一の理論に縛られることなく、 現在は、2つの化合物が異なる部位のMYCN G4に結合する可能性があると考えられている。調査するために、SPRでの競合アッセイは、指定された順序で化合物を段階的に注入するか、または混合物(Brooks et al)を注入することによって実施された 薬剤発見今日2014、19：1040-1044；スプリアスet al、PNAS 112：E 2543-2552)。100μMの1のMY-1注入に続いて100μMのMY-1注入を注入することによって、観察されたMY-1の結合レベルは大きく変化しなかった 個々の注入と比較して(図17)。1のより高い濃度(500μM)においても、MY-1結合のレベルが維持され(図18Aおよび18B)、1がMY-1と競合しないことを示唆した 次に、TMPyP 4、古典的な積層G 4-結合剤(SEE 2004、126：8702-8709)も、MY-1とともに試験され、TMPyP 4溶液中のMY-1(100μMおよび250μMの両方)の添加は、SPR結合シグナルの増加をもたらした(図 19Aおよび19B)は、別個のモードでG 4に結合したMY-1を示唆する。また、MY-1と2ヒット(1、MY-1)の混合物のいずれかを用いてCD融解アッセイを行った 20μM 1および20μM MY-1のTmを9。7±0。7℃含む溶液の混合物は、20μM MY-1のみ(図20Aおよび20B)よりも有意に高く、非重複モードの相互作用を示唆した 対照的に、40μMのMY-1添加を有するMCN G4のΔTM 4は、結合部位の飽和に起因して顕著に増加しなかった
MY-1とMYCN G4との結合化学量論を評価するために、ジョブプロット解析を行った。簡潔には、蛍光滴定中に成分画分を変化させることにより、蛍光強度の変化をプロットしてフィッティングした 0。47で最大になり、1：1結合化学量論を示す(図21)。MY-1とMYCN G4との結合をマイクロスケール熱泳動(MST)によって検討した。消光は認められないため、3'-Cy 5標識DNA試料を用いた(図22) マイクロスケール熱泳動(MST)曲線は、1：1結合モデルとよくフィッティングされ、結合親和性は、FIAおよびSPR実験の結果と合意した8。1±1。7μMとして計算された(図23Aおよび23B)
したがって、他の報告されたG 4スタッカの大部分とは異なり、1とは異なり、MY-1は非正準位G 4結合剤として同定された
[実施例4]
FIAとDMS-フットプリントを用いた結合部位同定
化合物MY-1とMYCN G4との間の結合詳細をさらに理解するために、一連のFIA研究を設計し、実施した 1：1化学量論でG 4に結合したヒット化合物は、独特の結合挙動がヘアピン構造に関連していると仮定した 環境感受性2-アミノプリン(2-AP)蛍光体をG 4(図24A)の異なる位置(A 11、A 18、A 24)に導入することによって、結合領域を最初に調査した(図24A) 標識DNA試料で100μM MY-1をインキュベートした後、蛍光強度を測定し、DMSO対照と比較した。A 112-AP DNA試料の蛍光を約100%クエンチした 焼き入れ率は、A 18およびA 242-AP DNAに対してそれぞれ80%および70%であった(図24B、図25A-25C)。5'と3'-Cy 5標識オリゴs (15%および0%クエンチとの間の異なるクエンチ挙動の以前の観察に基づいて、図 24C)は、MY-1がヘアピンの近くの領域に結合していると仮定した。次に、この結合イベントにおけるヘアピンの必要性は、突然変異した長いループを含む2つのDNA構築物を設計することによって探索された(塩基対形成を形成することができない)および切断された 配列(ヘアピンなし)(図2参照)。MY-1を2つのDNAに滴定することによって、結合親和性は、>100μMマイクロモル(野生型MYCN G4よりも弱い-30倍)に相当に減少した 対照的に、化合物1は、これらのG 4sに対して試験され、親和性は野生型(WT)構築物と同等であった(図24D) これらの結果は、MYCN G4におけるヘアピン構造が、MY-1との結合を維持することが重要であったが、1ではないことを示した
加えて、ヘアピンの小溝に結合した化合物が、蛍光変位アッセイ(Alniss、J)によって、他の2つの古典的な小溝結合剤(Hoechst 33258およびネトロシン)とともに試験されたかどうかを探索する 薬剤化学2019、62：385-402)。Hoechst 33258は、蛍光団として報告され、DNA染色試薬として広く使用されているので、最初に、異なる濃度の非標識MYCN G4DNAでインキュベートし滴定した 励起波長352nm、発光波長500nmを利用することにより、DNA濃度を高くして蛍光強度を向上させた(図24E) 次に、DNA滴定中に、MY-1またはネトロシンのいずれかを競合剤として溶液中に添加した。トロピシンは、周知の小溝バインダーとして、 蛍光強度の対応する減少によって測定されるHoechst 33258の有意な変位を示した。しかし、MY-1については、5μMでは測定可能な変化は認められず、50μMでは部分的な蛍光の減少が見られた したがって、ヘアピンはMY-1結合を促進していると考えられているが、これは古典的な小溝結合剤であるとは現れない
MCN G4への化合物の結合様式をより良く理解するために、硫酸ジメチル(DMS)フットプリントアッセイを開発した このアッセイは、DMSがグアニン(Gs)内の遊離N 7をメチル化する能力を利用し、次いでピペリジン(43、44)を用いて切断することができる。対照的に、四重鎖構造のHoogsteen結合Gsは、修飾から保護されたままである さらに、小分子とのインキュベーションの際の修飾の変化は、結合部位の近くで観察することができる。5'Cy 5標識MYCN G4を5m MKClの存在下でアニールした 図24Fに示すように、G 10-G 12に対応するバンドは、それらのGsが四重鎖中のテトラッド内に組み込まれていることを示す保護によって薄暗い しかしながら、G 13-G 16は、ワトソン-クニック塩基対合によるヘアピン形成に起因して、はるかに明るい帯域を示す保護されていないままである。化合物MY-1の存在下では、種々のGsの濃度依存性保護が観察された 化合物がG 4構造を安定化したことを示す。MY-1、G8、G9、G16、G17をかなり保護しながら、G13-G15をわずかに保護した この結果は、MY-1が、上述した複数の結果と一致して、四重鎖とヘアピンとの間の接合に結合したことを示唆した。(図24(b))
[実施例5]
化合物MY-1の構造活性関係(SAR)研究は、MCN G4ターゲットのためのより良い結合剤を得るために、MY-1の一連の類似体を使用して構造活性関係(SAR)研究を行った(表3参照) MY-1および13誘導体(MY-2-MY-14)を含む集束ライブラリーを購入または合成した。各化合物は、上述したようにSPRおよび2-AP滴定によって評価した 予備研究では、現在、MY-1中のピロリジン基はG 4との結合を維持するだけでなく、溶解性にも役立つと考えられている 一方、MY-1の複素環コア(表3に示す)は、MYCN G4認識を容易にすると考えられている。したがって、ほとんどの類似体は、改変された側鎖R基を含む
Figure 2024522183000079
Figure 2024522183000080
14類似体とMYCN G4との間の系統結合アッセイをSPRおよび2-AP (A 11)蛍光滴定により行った(図26A-26N、27A-27N)。概要として、観察された結合親和性は1。4-23。5μM (SPR)、及び0。2-7の範囲であった 0μM (2-AP滴定)。アナログの大部分は、MY-4およびMY-9を除く、MCN G4への良好な結合挙動を示し、いずれも適切な緩衝液に溶解性を有していた SPR実験では、4アナログ(MY-2、5、8、および10)は、それぞれ、1。4±0。2μMおよび1。5±0。3μMのタイテスト結合親和性で表示されるMY-5およびMY-8がそれぞれ、親化合物よりも強い結合剤として同定された 化合物MY-2は、それがアグリゲータであることを示唆するSPRセンサグラムにおいて高い応答を示した。2-AP蛍光滴定アッセイ(a 11置換コンストラクトを使用する)について、SPR実験で良好に整列したKD値を観察した 値は全体的にわずかに低いが、これらの値はわずかに低い。試験された類似体の中で、4つの化合物(MY-2、MY-8、MY-10、およびMY-14)を、MCN G4ターゲットに向かってサブマイクロモル結合剤として発見した。再び、アナログMY-2は、0と最も高い結合親和性を示した しかし、2±0。03μMであるが、凝集電位/溶解不良による更なる試験のために選択されなかった。全てのSARデータを考慮すると、MY-8は細胞ベースのアッセイのために選択された。結果を上記表3に示す
[実施例6]
MYCN遺伝子発現におけるMY-8の効果を評価するために、MY-8処理後のMYCN-MYCNOS発現に対する効果を評価するために、NBEB細胞を培養し、異なる濃度のMY-8で処理した 細胞生存率に対するMY-8の効果は、Incyte生細胞イメージング。システムを使用して評価した。MY-8の単独処理後の細胞合流の4日測定に基づいて、NBEB細胞増殖の有意な阻害が観察された(図1) 28A、28B)。化合物濃度が45μMまで増加すると、20。5μMのCC 50がMTSアッセイにより確認された(図
28 C)。次に、MCNを含む遺伝子のmRNAレベル、並びに、qRT-PCR (図28D-28F)を用いたMY-8処理後の異なる時点(24、36、48h)で2つのMCNOS転写物(MYCNOS 001及びMYCNOS 002)を測定した MY-8のより高い濃度では、MCNおよびMYCNOの両方の発現レベルを低下させたMY-8での処理を示すことを示す、mRNAレベルの明確な低下が3つの転写産物のすべてについて観察された 興味深いことに、MYCNOS 002レベルは、他の2つの転写物よりも早期に24時間減少した。N-Mycタンパク質のレベルもウエスタンブロッティング(図28G)を用いて測定した ここで、qPCR実験と整列した結果、およびN-Mycタンパク質のレベルは、MY-8で用量依存的に処理したときに減少した
本明細書に記載のデータによって示されるように、本明細書に記載される複数の直交技法を使用する生物物理的分析は、化合物MY-1およびMY-8などの化合物を確立する G-テトラッドおよびヘアピンによって形成される独特の折り目と相互作用することによって、筋状にMYCN G4に結合する。また、いくつかの例では、MY-8の生物学的評価は、MCN及びMYCNOのレベルが低下したことを明らかにした RNAおよびタンパク質レベルにおける両方の遺伝子産物のレベルを低下させる
本明細書に開示されるデータおよび情報は、DNA G4s内の高次構造を標的としたことを確立し、これは、ドルー可能な癌遺伝子の発現を制御する選択的阻害剤を開発するための新たな手段を提供する 実際、より高い複雑性RNA G4sは、高選択的な小分子結合のために成功したフレームワークであった。これらの例は、ほとんど進化した蛍光RNAアプタマーであるが、 G 4sを含む複雑な構造が、高選択性小分子認識のための独特のポケットを提供することができる、エレガントのデモンストレーションである
広義には、lncRNA促進剤の存在下におけるG 4元素の小分子認識は、lncRNA発現を制御する方法であり得る lncRNAは、複数の癌タイプの重要なドライバを表しているが、それらの発現または機能を制御することができる小分子の例が少ない 本明細書で提供されるデータは、これらの複雑な構造によって形成される独特の折り目が、小分子のための貴重な機能標的であり得ることを示す タンパク質コードを含む疾患関連遺伝子及び非コード遺伝子産物の標的化を促進することを容易にする
[実施例7]
ヘアピンを標的とするハイブリッドG 4sの電位を与えると、ヒトゲノムにおける同様の構造を有する他のG 4sの存在がさらに検討された ゲノムワイドG 4配列からのデータを使用して、約2百万個の一意のループ(>7nt)を、観察四重結合(OQs)の407、491個の領域に埋め込まれたG 4s間で同定した UNA折り目(46)(37℃のハイブリッド-ss-minパッケージ)を用いたヘアピン折り試験の後、OQsの33、912は、以前の計算予測と一致してヘアピン構造(合計OQsの-8。3%)を含むことが見出された ヘアピン-G 4領域のうち、58%は、13%が非コードRNAと関連付けられている間、タンパク質コード遺伝子と関連付けられた。ヘアピン含有G 4sのいくつかは、癌関連タンパク質(FOXA 3、KRAS、MYCL、BRD 4など)の遺伝子に配置された (代表ヘアピン-G 4sの図29参照)。この実施例は、埋め込まれたヘアピンを含有するより高い複雑性G 4sがゲノム全体を通して普及しており、しばしば癌遺伝子またはlncRNAと関連していることを示している
[実施例8]
この例では、SPR結合アッセイを実施して、本開示の代表的な二価化合物の結合活性を分析した。この例の化合物は、非正準位結合剤成分およびG 4スタッカー成分を含む BIAコア3000(GEヘルスケア)器具を使用した。CM 5SPRバイオチップを使用し、ランニングバッファ(10m mM Tris、pH 7。0、100mM KCl、0。005%Tween 20、5%DMSO)でプライミングした 化合物をチップ表面上に固定するために、流量を5μL/minとした後、チップ表面上のカルボキシル化デキストランをEDC/NHS (0。4M/0)によって活性化した 1M)水溶液を15分間、続いてストレプトアビジン(SA)溶液(10m mM酢酸ナトリウム緩衝液0。2mg/mL、pH 4。5)を30分間注入する SAの固定化量の後、1Mエタノールアミン(EA)水溶液(pH 8。5)を10分間注入し、10mM NaOHで2分間再生し、物理吸着を除去した さらに、ビオチン化MYCN G4DNAをアニーリングバッファー中5μMで調製し、95℃まで5分間加熱した後、1時間以内にゆっくりと室温まで冷却した アニーリング後、合計150μL溶液をSPRシステムのFc 2に30分間注入し、DNAをチップ表面上に固定した。次いで、ベースラインが安定であると、化合物溶液を試験した
結合信号および結合親和性を検出するために、Fc 1(ブランク)およびFc 2(ターゲット)の両方において、より高い流量(25μL/min)を使用した 各化合物溶液を20倍に調製し、DMSO中の濃度を設計し、次いで非DMSOランニングバッファに希釈し、最終濃度5%DMSOを得た 次いで、合計50μLの化合物溶液をFc 1-2流路に120秒間注入して会合させた後、200秒の解離用緩衝液を用いた 50μL再生バッファ(1M KCl)の注入は、必要に応じて2つのサンプル間で実施することができる。最終的な結合曲線は、ブランクチャネル(Fc 1)を参照することによって得られた 結合親和性(KD)を決定するために、一連の希釈化合物溶液を注入し、ラングミュア1：1結合モデルを使用してBIA評価4。0ソフトウェア(GEヘルスケア)によってKDを計算した
この例に対して実施される特定の実装の結果は、図30、31A、31B、32A、32Bに示されている。現在理解されるように、本実施例の二価化合物の結合を示す概略図は、図30によって提供される アクリジンICR 191は、滴定中に良好な結合信号(9-アミノアクリジン、アクリジンClおよびアクリジンNH 2を含む評価された他のアクリジイル化合物)を有し、821±184nMのKDを示す(図31Aおよび31B) 化合物B 33とMYCN G4との結合をSPR滴定により定量した。化合物B 33は、報告されたMY-8(SPRによって1。5±0。3μM)またはアクリジンICR 191(図では1。5±0。3μM)と比較して、結合親和性(KD=70±13nM)の大幅な改善を示した 32A、32B)。また、化合物B 33の結合曲線は、アクリジンICR 191とは異なる動態を示した(高速オン/オフ)。さらに、新規に開発された化合物は、5μMの化合物注入であっても、SPR上のdsDNAへの結合を示さなかった 対照的に、アクリジンICRは、溝結合およびインターカレーション(図33Aおよび33B)によって、dsDNAに用量依存性結合シグナルを示した これらの結果から、化合物B 33は、B-DNA構造上のG 4構造への優れた結合優先度を有し、これは、複雑な溶液中でより良好な特異性をもたらすであろう
[実施例9]
この研究では、FIAを使用して、ある2価とMYCN G4オリゴとの結合を確認した。結合親和性を測定するために、各化合物の溶液を96ウェルプレート(Costar、黒側クリア底)で3重に調製した 100nMの最終濃度(作動溶液中の5%最終DMSO)をもたらす。未標識MYCN G4DNAを上記のアニール方法に基づいて折り曲げた 次いでウェルプレートに添加して、血清希釈によって異なる濃度をもたらす。プレートを室温で30分間インキュベートし、続いて500rpmで2分間遠心分離した 次いで、蛍光強度を、Ex 340nm/Em 500nmにおける相乗的Mxマイクロプレートリーダー(BioTek)によって定量的に記録した。次いで、蛍光強度を正規化した 結合親和性は、GraphPadプリズム8。3。1ソフトウェアにおいて、1サイト全体モデルを使用して曲線をフィッティングすることによって計算された
また、アクリジン由来分子の蛍光特性を利用してFIA研究を行った。アクリジンICRおよび化合物B 33を340nmで励起し、約500nmに蛍光発光ピークを示す 折り畳まれたDNA G4を100nMの小分子溶液に滴定することにより、用量依存応答の曲線が得られ、フィッティングされた。その結果、アクリジンICR 191および化合物B 33は、それぞれ、1040±150nMおよび66±7nMを示した(図34Aおよび34B) この結果、化合物B 33とMYCNヘアピンG 4との間の緊密な結合が確認された
[実施例10]
この例では、12個の異なるG 4オリゴsおよび非G 4オリゴs (dsDNAおよびssDNA)を含む小規模DNA G4マイクロアレイを作製し、試験した(表4)。まず、SAコートされたガラス表面を作製した アミノ官能化ガラススライドを最初にN、N'-ジスクシンイミジルカーボネート(DSC、1。0M)およびN、N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、1。0M)の溶液で室温で一晩DMFに修飾した EtOH、Milli-Q水(各々5分)で順次洗浄し、N2ガスで乾燥した後、4℃fridgeで1mg/mLのSA溶液で12時間インキュベートした 次いで、表面をEAバッファーで30分間ブロッキングする。次いで、スライドをPBS緩衝液およびミリ-Q水でリンスし、遠心分離(1700g、2分)で乾燥した
Figure 2024522183000081
Figure 2024522183000082
並行して、ビオチン標識DNA/RNAオリゴsをアニーリングバッファー中に調製し、これにより5μMストック溶液を得、続いてアニーリング(上記方法による)を行った。次いで、全てのオリゴ溶液を384ウェルプレートに移した 次に、マイクロアレイ印刷を、湿度60%のロボット配列器(ナノプリント、配列、USA)によって行った。マイクロアレイを作製した後、 スライドをウェットキムワイプ組織片を有するスライドボックス内に配置し、4℃で2時間インキュベートした
蛍光性化合物(化合物B 33、チアゾールオレンジ(ROTO)、およびアンサチン)を用いてインキュベートするために、スライドをPBST、PBS、および水で完全にリンスし、非結合性オリゴを除去した 次いで、遠心分離(1700g、2分)によってスライドを乾燥させ、マイクロアレイガスケット(Agilent、USA)と迅速に組み立てた後、化合物溶液を装填した 1時間インキュベートした後、上記の方法で、スライドを洗浄し、乾燥させた。最後に、マイクロアレイスライドを緑色チャネルを使用して蛍光スキャナ(Maix)で撮像し、蛍光強度を定量した
2。5μMにおいて、化合物B 33は、他のインキュベート濃度(図示せず)と比較して、相対的に高い信号対雑音比(SNR)およびより低いバックグラウンドを示した その結果、化合物B 33で処理されたマイクロアレイで点灯されたMYCNスポットのみが、対応する標的に対して有望な結合選択性を示す(図35A-35F) 一方、G 4DNA (hTERTおよびBCL 2)を含む他の2つの報告されたヘアピンは蛍光を示さず、MYCN G4のヘアピンに依存する分子認識が高いことを示唆した 加えて、dsDNA/ssDNAへの結合は観察されず、化合物B 33のG 4結合挙動と一致した。対照的に、一般的なG 4結合剤として、dsDNA/ssDNA以外のオリゴsの大部分への結合を示した 広域スペクトルG 4結合能を示唆する。アクリジンコアを化合物B 33と共有しているが、より短いテール(ベンジルスルホンアミド)を有していたアサチンは、マイクロアレイ中のいくつかのG 4sに結合したことを示した 特にNRAS RNA G4および3つのヘアピン-G 4s (MYCN、hTERT、BCL 2)。これらの結果は、他のG 4構造上のMYCNヘアピン-G 4に対する化合物B 33の有望な結合選択性を実証した
[実施例11]
この例では、G-四重鎖構造の折り畳みは、J-1500円二色性分光計(Jasco)を用いた円二色性によって特徴付けられた 緩衝条件を最適化するために、非標識MYCNオリゴヌクレオチドを、5μM濃度で異なるアニーリングバッファー条件で調製した。アニールの手順は、上記と同様であった CDスペクトルを320-200nm、25℃で1nmの間隔で記録した。各スペクトルは、3つの複製走査の信号を平均化することによって得られた
CD融解アッセイのために、MCNオリゴヌクレオチドをKCl緩衝液(10m mMリン酸ナトリウム、pH 7。0、5m MKCl)で5μM濃度で調製した 化合物の安定化効果を試験するために、MYCN G4DNA試料を、設計された濃度で化合物(5%DMSOを含有する最終溶液)と混合/無しで混合した 次いで、キュベット中に合計300μLの溶液を加え、1℃の間隔でCD分光計で20-80℃に加熱した。融解温度(Tm)を算出するために、263nmのCDスペクトルのピークを追跡した エリプソメトリ対温度をプロットし、GraphPadプリズム8ソフトウェアにおいて可変勾配を有する非線形シグモイド用量応答モデルを用いてフィッティングした
CDを用いた熱溶融アッセイを実施して、MCN G4安定性に対する化合物の効果を調査した。アクリジンICR 191(ΔTm=4。6℃)と比較して、化合物B 33ははるかに高いΔTm(6)を示した 化合物B 33中の2つのフラグメントの相乗効果に起因する可能性がある(図36)。この結果は、2価の相互作用が結合親和性を向上させるだけでなく、熱を増加させることができるというという仮説に同意している 小分子とオリゴとの間のより多くの接触の導入による、MYCNヘアピン-G 4の安定性
化合物B 33の結合選択性をさらに特徴付けるために、19、000個の異なるG 4配列を含有する高密度で大規模なDNAマイクロアレイを作製し、使用した このマイクロアレイにおいて、340個の報告されたG 4s (Gリッチ配列)および280個の非G 4s (Cリッチ配列)は、陽性および陰性対照として設計された さらに、短いループ(1-7nt)を有する17000カノニカルG 4オリゴも、G 4構造の多様性に適合するようにループシーケンスを変化させることによって設計され、合成された 表面グラフト化DNAオリゴsを高濃度のKCl緩衝液に折り曲げた後、それぞれマイクロアレイと共に化合物B 33溶液(500nM)をインキュベートした 次いで、スライドを完全に洗浄し、乾燥させ、緑色チャネルを使用して蛍光スキャナにより撮像した。その結果、グローバル蛍光が提示されたマイクロアレイには、蛍光信号が均一に分配された(いくつかの負を除く) ほぼ全てのG 4sが折り畳まれたことを示す(図37A)。しかし、化合物B 33はスライドのみで輝点が少なく、他のスポットは背景として暗いままであった 化合物B 33が強い優先的結合挙動を有していたことを示唆する。各スポットの蛍光強度を定量することにより、さらにTOと化合物B 33の結合を調べた カーネル密度推定値(KDE)プロット及びバイオリンプロットは、マイクロアレイ全体にわたって結合信号の分布で表される。図37(b)に示すように、2つの小分子に対応する2つのバンドを良好に分離した 化合物B 33スペクトルは、TOよりはるかに広い範囲に及ぶ。バイオリンプロット(図0。3C)では、TO基の平均SNR値は、化合物B 33基の平均SNR値よりもはるかに高い さらに、TOグループは、マイクロアレイ内の均等に分配された結合信号を確認したより小さいエラーバーを有していた。化合物B 33群のバイオリンプロットは、頂部および底部において針状に提示された化合物B 33群のバイオリンプロットであり、 強くバイアスされた結合事象があったことを示す(図3C)。620G 4及び非G 4制御に着目して、G 4sと非G 4sの両方に結合したことを示した 前者の平均SNRは後者の平均SNRよりも有意に高い(図37D)。対照として、化合物B 33はG 4sに結合していたが、非G 4基には結合が見られなかった その結果、化合物B 33はG 4sを非G 4構造に比べて優先的に有し、これはマイクロアレイのグローバル解析と一致したことを示した TOと化合物B 33基との間のSNR値を比較することによって、散乱プロットは45度線からずれている(図1)
37 E)化合物B 33の結合挙動が非選択性バインダー(TO)と全く異なることを再び示す。また、Gini係数を用いて、2つの化合物の選択性を定量化した 最初に経済的な概念として使用されるGini係数は、キナーゼ阻害剤およびRNA結合剤の選択性/約束性をプロファイリングする際に適用されてきた。より高いGini値は、化合物(Gini係数>0)のより良い選択性を表す 75は優れた選択性)であると考えられる。Gini係数は、マイクロアレイ内のSNRに基づくGini係数である。その結果、化合物B 33は、0。236および0。628のGini係数値を示した(図37Fおよび37G) 高いGini値は、化合物B 33がG 4sの中で比較的有望な選択性を有することを定量的に確認した
[実施例12]
この例では、5'-Cy 5標識MYCNヘアピン-G 4DNA 5μMのオリゴを、最適化された緩衝条件(10m mMトリス、pH 7。0、10m mM LiCl、10m MNaCl)中で95℃まで加熱し、その後徐冷することによってアニールした 次いで、折り畳まれたDNAを化合物B 33と異なる濃度(0、10、25、50、100nM)で30分間インキュベートした。次いで、室温で1%DMS処理を10分間行った後、反応を2停止させた 5M NH4、0。1Mβ-メルカプトエタノール。処理したDNAをフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールおよびエタノールで精製した。次いで、DMS修飾DNAを10%ピペリジンを用いて90℃で30分間切断した 溶液を乾燥させ、SpeedVac真空濃縮器を用いて100μLの水で2回洗浄し、ヌクレアーゼを含まない水に溶解した 処理されたDNAサンプルを17%変性ポリアクリルアミドゲル上で分解し、台風イメージャ(Amersham)上で可視化した後、ImageJソフトウェアで処理した
緩衝最適化を行い、小分子誘導G 4形成を観察した。CDスペクトル研究により、10mM LiCl+10m MNaClをトリス-HClバッファー中の塩状態として選択した 5'-Cy 5標識MYCN G4をアニールし、異なる濃度の化合物B 33でインキュベートした後、DMS-フットプリントアッセイを実施した(図38A) 化合物がない場合、G 13-15のバンドはヘアピン領域に対応してより強く、一方、Gsの一部のバンドは四重鎖形成のために薄暗い(図38B) 化合物B 33の添加により、オリゴはG2-9、G 10-12、及びG 17-21の保護によりG 4構造を形成した また、G 13-15は部分的に保護されていることが観察され、四重鎖の形成中に、このヘアピン領域も分子に接触していた この結果は、巻き戻したMCN G4s (図39Aおよび39B)を使用した結合研究と一貫しており、ヘアピンが結合に関与したことを再び確認した
しかしながら、別の試験では、二重鎖含有RNA G4(マンゴーII)は、接合(PDB：6C 63)を形成する代わりに二重鎖および四重鎖構造が分離されているため、SPR (図40)によって化合物B 33に対する弱い結合を示した 単一の理論に縛られることなく、この結果は、分子認識がヘアピン-四重錯体によって形成される三次構造の存在によって促進されることを示し得ると考えられている
DMS-フットプリントの研究に加えて、化合物B 33のMYCNヘアピン-G 4への2価の結合様式も、HP-G 4sを異なる折り畳みタイプと比較することによって調査した 並列構造(BCL 2)、(3+1)ハイブリッド構造(HIV、PIM 1-形成1)、及び(2+2)椅子型構造(PIM 1-2)を有する4つの報告されたHP-G 4sを、化合物B 33を用いたFIA結合試験により調べた(図41A、41B、42A、42B、43A、43B、44A、44B) その結果、BCL 2HP-G 4は258±39nMのKDを示し、これはMYCN HP-G 4の約4倍であった。(3+1)ハイブリッドG 4s、HIVおよびPMIM 1HP-G 4sは、151±26nMおよび279±32nMの結合を小分子に示した アンチパラレル構造の場合、PIM 1-造形2HP-G 4は、化合物B 33に向かってはるかに弱い結合親和力(1。1±0。4μM)を示し、これは、2つのフラグメントの相乗効果を完全に喪失した この観察は、平面G-4adと溝とを分離した並列MYCN G4とのコンフォメーションの差に起因する可能性がある これらの結果は、開発された分子(化合物B 33)とHP-G 4との間の結合事象がヘアピン-四重鎖接合の構造に高度に関連していることを示し、これは結合部位の形状を決定するであろう
[実施例13]
この例では、2価の化合物のための異なるリンカー基が評価された。異なる長さおよび/または官能基を有するリンカーを評価し、結果を図45に要約した FIAおよびSPRを用いて測定される各化合物のKD値の具体的な結果は、それぞれ図46A-46Dおよび図47A-47Hによって提供される この例では、B 35は最低K D(FIAにより38±5nM、SPRにより14±6nM)を示し、B 32(FIAによる311±52nM、SPRによる303±32nM)と比較して>10倍向上を示す この解離定数は、平行g 4構造に結合した報告された抗体(scFV：KD-30nM)と同等であった。リンカーがさらに伸長した場合(例えば、) 化合物B 38のようなPEG2基を使用して)、より弱い結合が観察された(FIAによって69±21nM、SPRによって87±39nM)、B 33よりもタイターがない。加えて、短いリンカーを有していたアンサチンは、より弱い結合(2。9±0)を示した 5μM)-MCN HP-G 4(図48Aおよび48B参照)。および、低マイクロモル濃度でdsDNAに結合した化合物B 32およびアンサチン(図49Aおよび49B参照) 特定の例では、化合物B 35中のPEGリンカーは、適切な確認で2つの断片を結合部位に容易に嵌合させるだけでなく、水溶性に寄与するだけでなく、細胞アッセイ評価を容易にすることができる
IX。付加配列
ヒトMYCをコードする例示的なゲノムDNA配列の配列(配列番号：
Figure 2024522183000083
Figure 2024522183000084
Figure 2024522183000085
Figure 2024522183000086
 ヒトMYCNO (配列番号40)をコードする例示的なゲノムDNA配列の配列
Figure 2024522183000087
Figure 2024522183000088
Figure 2024522183000089
Figure 2024522183000090
本開示の原理を適用することができる多くの可能な実装を考慮すると、例示された実施態様は好ましい例であり、範囲を限定するものではないと認識されるべきである [発明を実施するための形態]。むしろ、範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神に入るものである
関連出願への相互参照
本願は、２０２１年６月９日に出願した米国特許仮出願第６３／２０８，９１８号の、より早い出願日に基づく利益および優先権を主張するものであり、前記仮特許出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援の確認
本発明は、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所－がん研究センターにより授与されたプロジェクト番号Ｚ０１ ＺＩＡ ＢＣ０１１５８５ ０７のもとで政府支援を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
分野
本開示は、ある特定の遺伝子に見られる非標準Ｇ四重鎖ＤＮＡ構造に選択的に結合する化合物、ならびにがん細胞などの細胞におけるそのような遺伝子の発現を低減または阻害するために化合物を使用する方法に関する。
背景
遺伝子のＭＹＣファミリーは、遺伝子発現を広く支配し増幅させる転写因子をコードする。ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、およびｌ－Ｍｙｃという３つのＭｙｃタンパク質は、塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）領域を含有し、この領域は、ＤＮＡに結合し、転写を直接制御する。これらの遺伝子の中で、ＭＹＣＮは、胎児発生に関与することおよび神経組織に高度に発現されることが示されている。ＭＹＣＮは、多くの場合、がんの際に過剰発現されるかまたは変異し、神経芽細胞腫および小細胞肺がんなどのがんにおける癌遺伝子と見なされている。ＭＹＣＮ遺伝子座内には第２の転写物が埋め込まれており、この第２の転写物は、アンチセンス転写によって産生され、元々、ｎｃｙｍと呼ばれていたものであり、ＭＹＣＮ逆鎖（ＭＹＣＮＯＳ）と呼ばれるより長鎖のノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）内に埋め込まれていることが示された。ＭＹＣＮＯＳの発現は、ＭＹＣＮのプロモーター占有率を減少させること、および配列相補性によってＭＹＣＮ転写物の安定性を調節することが示されている。つい最近の研究によって、ＭＹＣＮＯＳ転写物のバリアント２であるＮＣＹＭが翻訳されて低分子タンパク質を生成し得ることも示されている。ＮＣＹＭとして公知のこのポリペプチドは、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の安定性を調節すること、ＧＳＫ３βを阻害すること、およびＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に影響を及ぼすことをはじめとする、多様な制御活性を有することを特徴とする。
がんに関与するＮ－Ｍｙｃタンパク質および他のタンパク質を調節または阻害する分子は、抗がん剤として興味深いが、転写因子として、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質は、古典的に「創薬不可能」と見なされており、Ｎ－Ｍｙｃ自体および他の創薬不可能なタンパク質（特に、Ｎ－ＭｙｃのようにＧ四重鎖または「Ｇ４」を含むもの）を標的とするリガンドを開発する試みは、成功していない。タンパク質コードおよび非コード遺伝子産物を含む、疾患関連遺伝子におけるＧ４のような構造に結合してそのような遺伝子を標的にする選択性を実現することができる化合物、例えば小分子が、当技術分野において必要とされている。
要旨
ＭＹＣＮ遺伝子に見られるヘアピン含有Ｇ４などの非標準Ｇ４構造を標的とする小分子化合物の新たなクラスが、本明細書に記載される。特定の実施態様では、化合物は、例えば、細胞（例えば、がん細胞）におけるＮ－Ｍｙｃ発現を低減させるまたは阻害する方法において、ならびに対象におけるがんを処置または予防する方法であって、がんがＮ－Ｍｙｃ過剰発現を少なくとも一つには特徴とする方法において、有用である。
式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000221
 （式中、
Ｘ １ 、Ｘ ２ およびＸ ３ の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルが、本明細書に記載される。
式Ｉによる化合物
Figure 2024522183000222
 （式中、
環Ａは、チオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、および１，３，４－オキサジアゾリル以外の５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１
，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書に記載される。
一部の実施態様では、化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルは、式Ｉによる構造：
Figure 2024522183000223
 （式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ １ は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、Ｒ ｂ は、窒素含有基であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたはアルキルであり；
各Ｒ ３ は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり；
ｎは、０、１、２、または３であり；
ｘは、０、１、２、３、４、または５である）
を有し、ただし、化合物は、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、またはＭＹ－１２のいずれか１つとして示される構造を含まない。
一部の実施態様では、化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルは、式Ｉによる構造：
Figure 2024522183000224
 （式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ １ は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ｓ －Ｒ ｂ であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり、ｔは、１、２、３、４、または５であり、ｒは、１、２、３、４、または５であり、ｓは、０または１であり、Ｒ ｂ は、アクリジニル基であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）
を有する。
本開示による化合物と少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物の実施態様が、さらに開示される。
細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させる方法であって、細胞を、本開示による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含む方法も、開示される。また、細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させるための、本開示による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、細胞を化合物の有効量と接触させるステップを含む使用が、開示される。一部の実施態様では、使用は、対象におけるがんを処置または予防するための使用である。一部の実施態様では、使用は、対象におけるがんを処置または予防するための医薬の製造のための使用である。
本開示の上述のおよび他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかになる。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報のコピーは、請求して必要料金を支払うと、米国特許商標庁によって提供されることになる。
図１は、本明細書で論じる結合選択性プロファイリングに使用した５つのＧ四重鎖配列を記載する表であり、この表中、全てのＤＮＡ／ＲＮＡオリゴは５’末端がＣｙ５蛍光色素で標識されており、Ｇ４形成に関与するグアニンに下線が引かれている。 図２は、ＭＹＣＮ野生型／変異型／短縮型Ｇ４配列を記載する表である。 図３は、ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４形成配列の位置を示す。 図４は、ゲノムワイドなＧ４配列解析によって得たＭＹＣＮ Ｇ４形成確率を示すマップである。 図５Ａおよび５Ｂは、ＭＹＣＮ／ＭＹＣＮＯＳにおけるＧ四重鎖形成配列の四重鎖形成Ｇリッチ配列（またはＱＧＲＳ）解析の結果を示し、図５Ａは、Ｇ４－ｓｅｑ技術により発見されたＭＹＣＮＯＳにおけるＧ４形成配列（目的の標的）を示し、図５Ｂは、この領域内の可能性のあるＧ４のＧスコアを示す。 図６は、小分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）スクリーニングを使用して同定した４つのヒット化合物を示す。 図７は、化合物１、２および５ならびに化合物ＭＹ－１を含む４つの特定の化合物についての構造とともに、ＳＭＭ（５％ＤＭＳＯ中、１００μＭ）からの１４のヒット化合物および陰性対照（化合物１５）についての蛍光強度アッセイ結果を示す。 図８は、図７の化合物についての表面プラズモン共鳴結果を示す。 図９は、化合物１、２、ＭＹ－１、および５についての蛍光強度アッセイによる結合親和性測定結果を示す。 図１０は、化合物１、２、ＭＹ－１、および５についての表面プラズモン共鳴による結合親和性測定結果を示す。 図１１Ａ～１１Ｄは、小分子によるＭＹＣＮ Ｇ４構造安定化および結合選択性評価を示し、図１１Ａは、異なる緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌまたは１００ｍＭ ＬｉＣｌを含有する、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ）中および水中でのＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルであり；図１１Ｂは、低ＫＣｌ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ）中での融解中の５μＭ ＭＹＣＮ Ｇ４のＣＤ曲線記録であり；図１１Ｃは、化合物１またはＭＹ－１を伴う／伴わないＭＹＣＮ Ｇ４融解を示 し；図１１Ｄは、化合物１またはＭＹ－１とともにインキュベートしたｄｓＤＮＡのＣＤ融解試験を示す。 図１２は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０と、１００、２０または５ｍＭ ＫＣｌとを含有する緩衝液中でのアニーリング後のＭＹＣＮ Ｇ４のＣＤスペクトルを示す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、１０×ｔＲＮＡが非存在である／存在するＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡに化合物を徐々に加えることにより２－アミノプリン蛍光アッセイを行った、ｔＲＮＡを使用する化合物１（図１３Ａ）およびＭＹ－１（図１３Ｂ）の結合選択性プロファイルを示す。 図１４Ａ～１４Ｅは、ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｇ４オリゴマーの全てを５’においてフルオロフォアで標識し、蛍光強度アッセイにより滴定曲線を得た、化合物１と６つの異なるＧ４標的の結合親和性を示すグラフである。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｇ４オリゴマーの全てを５’においてフルオロフォアで標識し、蛍光強度アッセイにより滴定曲線を得た、化合物ＭＹ－１と６つの異なるＧ４標的の結合親和性を示すグラフである。 図１６Ａ～１６Ｅは、古典的Ｇ４結合剤であるＴＭＰｙＰ４（１００μＭ）を陽性対照として使用して蛍光強度アッセイにより全てのＧ４を試験した、本明細書に記載の選択性評価において使用したＧ４の品質管理グラフである。 図１７は、化合物１とＭＹ－１との競合結合研究のＳＰＲ曲線である。 図１８Ａおよび１８Ｂは、化合物１とＭＹ－１の競合アッセイの結果を示し、図１８Ａは、化合物１およびＭＹ－１の連続注入のＳＰＲ曲線であり、図１８Ｂは、異なる濃度の化合物１を注入した後の化合物ＭＹ－１の結合レベルを示す。 図１９Ａおよび１９Ｂは、５０μＭ（図１９Ａ）および２５０μＭ（図１９Ｂ）の濃度の化合物ＭＹ－１を伴うまたは伴わないＴＭＰｙＰ４のＳＰＲ結合アッセイの結果を示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、個々の化合物（ＭＹ－１）または化合物混合物（１とＭＹ－１）により安定化したＧ４のＣＤ融解曲線（図２０Ａ）、および化合物の組合せにより安定化したＭＹＣＮ Ｇ４の融解温度（図２０Ｂ）を含む。 図２１は、ジョブプロット解析により決定したＭＹＣＮ Ｇ４と結合する化合物ＭＹ－１の化学量論比を示すグラフである。 図２２は、３’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを使用する化合物ＭＹ－１の蛍光滴定を示すグラフである。 図２３Ａおよび２３Ｂは、３’Ｃｙ５－ＭＹＣＮ Ｇ４との化合物ＭＹ－１の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）研究の結果を要約する。 図２４Ａ～２４Ｆは、蛍光失活に基づく方法および硫酸ジメチル（ＤＭＳ）フットプリンティングを使用する結合部位評価からの結果を示し、図２４Ａは、ＭＹＣＩＮ Ｇ４折り畳み構造の模式的予測であり；図２４Ｂは、５’／３’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４の溶液に１００μＭ ＭＹ－１を添加することによる失活研究であり；図２４Ｃは、Ａ１１、Ａ１８およびＡ２４位をそれぞれ標識した２－ＡＰ ＭＹＣＮ Ｇ４の溶液に１００μＭ ＭＹ－１を添加することによる失活研究であり；図２４Ｄは、５’－Ｃｙ５標識されている野生型／変異型／短縮型ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を使用する蛍光滴定を示す－滴定中に蛍光強度を記録し、曲線に当てはめることによりＫ Ｄ 値を計算した；図２４Ｅは、副溝結合剤（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびネトロプシン）を使用する蛍光変位アッセイであり；図２４Ｆは、異なる濃度の化合物ＭＹ－１とともにインキュベートしたＭＹＣＮ Ｇ４－ＤＮＡのＤＭＳフットプリンティング結果を示し（四重鎖テトラドに関わるＧトラクトに下線が引かれている）、化合物ＭＹ－１による影響を受けた保護Ｇに点（●）（高度に影響を受けた）または丸（○）（わずかに影響を受けた）が記されている。 同上。 同上。 図２５Ａ～２５Ｃは、Ａ１１（図２５Ａ）、Ａ１８（図２５Ｂ）またはＡ２４（図２５Ｃ）位が２－ＡＰ標識されているＤＮＡオリゴマーを一連の濃度の化合物ＭＹ－１で滴定した、２－ＡＰ修飾に基づく滴定による失活分率決定を示す。 図２６Ａ～２６Ｎは、ＳＰＲを使用して本開示の１４の異なる化合物に関して行った結合アッセイの結果を示す。 同上。 同上。 図２７Ａ～２７Ｎは、Ａ１１位において２－ＡＰ標識されたＤＮＡを使用して本開示の１４の異なる化合物に関して行った結合アッセイの結果を示す。 同上。 同上。 図２８Ａ～２８Ｇは、ＮＢＥＢ細胞におけるＭＹＣＮ／ＭＹＣＮＯＳ発現に対する化合物ＭＹ－８の効果を示し、図２８Ａは、異なる濃度の化合物での処理後の細胞集密度の画像であり；図２８Ｂは、異なる濃度での時間依存的な細胞集密度曲線を示し；図２８Ｃは、細胞生存率のＭＴＳアッセイ解析であり；図２８Ｄ～２８Ｆは、ＭＹ－８処理後のＭＹＣＮ（図２８Ｄ）、ＭＹＣＮＯＳ００１（図２８Ｅ）、およびＭＹＣＮＯＳ００２（図２８Ｆ）ｍＲＮＡ発現のグラフであり；図２８Ｇは、ＭＹ－８処理後のＭＹＣＮレベルを示すウェスタンブロットである。 同上。 図２９は、がん関連遺伝子における代表的なヘアピンＧ４配列を要約する表である。 図３０は、非標準Ｇ４結合構成要素およびＧ４スタッカー構成要素を含む二価化合物（化合物Ｂ３３）の結合活性を示す模式図である。 図３１Ａおよび３１Ｂは、アクリジンＩＣＲ １９１に対するＭＹＣＮヘアピンＧ４結合親和性を示す、時間（図３１Ａ）および濃度（図３１Ｂ）の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである。 図３２Ａおよび３２Ｂは、本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）に対するＭＹＣＮヘアピンＧ４結合親和性を示す、時間（図３２Ａ）および濃度（図３２Ｂ）の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである。 図３３Ａおよび３３Ｂは、アクリジンＩＣＲ １９１（図３３Ａ）の、および本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）（図３３Ｂ）の、ｄｓＤＮＡ結合親和性を示す、時間の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである。 図３４Ａおよび３４Ｂは、ＦＩＡを使用する、アクリジンＩＣＲ １９１（図３４Ａ）の、および本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）（図３４Ｂ）の、ｄｓＤＮＡ結合親和性を示す、ＤＮＡ濃度の関数としての蛍光強度のグラフである。 図３５Ａ～３５Ｆは、Ｇ４マイクロアレイと、本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）、チアゾールオレンジ、およびアムサクリンを含む、３つの異なる化合物とを使用する、結合選択性プロファイリングの結果を示し、図３５Ａ、３５Ｃおよび３５Ｅは、二価化合物、チアゾールオレンジおよびアムサクリンそれぞれならびに異なる標的で観察された蛍光を示す光学画像であり；図３５Ｂ、３５Ｄおよび３５Ｆは、二価化合物、チアゾールオレンジおよびアムサクリンそれぞれならびに異なる標的の結合選択性についての蛍光強度値を示す棒グラフである。 図３６は、対照（ＤＭＳＯ）、アクリジンＩＣＲ、および本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）に曝露されたＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡの熱融解アッセイの結果を示す、円偏光二色性分光法を使用して得られたスペクトルである。 図３７Ａ～３７Ｇは、高密度ＤＮＡオリゴマイクロアレイを使用する、本開示の二価化合物（化合物Ｂ３３）およびチアゾールオレンジの結合選択性プロファイル試験から得られた結果の画像であり、図３７Ａは、これら２つの異なる化合物で観察された蛍光を示す光学画像であり；図３７Ｂは、カーネル密度推定（ＫＤＥ）プロットであり、図３７Ｃは、マイクロアレイ全体にわたっての結合シグナルの分布を表すバイオリンプ ロットであり；図３７Ｄおよび３７Ｅは、２つの化合物の結合挙動を要約するプロットを提供し；図３７Ｆ（チアゾールオレンジ）および３７Ｇ（二価化合物）は、２つの異なる化合物のジニ係数を提供するグラフである。 同上。 同上。 図３８Ａおよび３８Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）を伴うおよび伴わないＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡのＤＭＳフットプリント（図３８Ａ）、ならびにヘアピン含有Ｇ４の提案折り畳み構造（図３８Ｂ）を提供する。 図３９Ａおよび３９Ｂは、ほどけたヘアピン（図３９Ａ）および短縮型ヘアピン（図３９Ｂ）を有するＭＹＣＮ Ｇ４への二価化合物（化合物Ｂ３３）の結合についての結果のＦＩＡグラフである。 図４０は、弱い結合が観察された、ＭＡＮＧＯ ＩＩ ＲＮＡ Ｇ４への二価化合物（化合物Ｂ３３）の結合についての時間の関数としてのＳＰＲ応答のグラフである。 図４１Ａおよび４１Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および平行構造を有するヘアピンＧ４（ＢＣＬ２）の、結合様式評価の結果を示す。 図４２Ａおよび４２Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および（３＋１）ハイブリッド構造を有するヘアピンＧ４（ＨＩＶ）の、結合様式評価の結果を示す。 図４３Ａおよび４３Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および（３＋１）ハイブリッド構造を有するヘアピンＧ４（ＰＩＭ１－第１形態）の、結合様式評価の結果を示す。 図４４Ａおよび４４Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および（２＋２）いす型構造を有するヘアピンＧ４（ＰＩＭ１－第２形態）の、結合様式評価の結果を示す。 図４５は、異なるリンカー基を有する異なる二価化合物（Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、およびＢ３８）についてのＭＹＣＮ ＨＰ－Ｇ４結合活性結果（ＦＩＡおよびＳＰＲを使用して評価したときのもの）の要約を示す。 図４６Ａ～４６Ｄは、異なるリンカー基を有する異なる二価化合物（Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、およびＢ３８）についてのＦＩＡ結果のグラフである。 同上。 図４７Ａ～４７Ｈは、異なるリンカー基を有する異なる二価化合物（Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、およびＢ３８）についてのＳＰＲ結果のグラフである。 同上。 図４８Ａおよび４８Ｂは、アムサクリンについてのＳＰＲ結果のグラフである。 図４９Ａおよび４９Ｂは、二価化合物（Ｂ３２）（図４９Ａ）およびアムサクリン（図４９Ｂ）とｄｓＤＮＡについてのＳＰＲ結果のグラフである。
配列
添付の配列表に収載されている核酸およびアミノ酸配列は、アメリカ合衆国特許規則連邦規則法典第３７巻§１．８２２において規定のとおり、ヌクレオチド塩基については標準文字略号およびアミノ酸については３文字表記を使用して示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、表示されている鎖への一切の言及により相補鎖が含まれると解される。配列表は、２０２２年６月３日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」（２８，６７２バイト）という名のファイルの形式でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において、
配列番号１は、ヒトＭＹＣＮをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である。
配列番号２～６は、それぞれ、ＢＣＬ２、ＫＲＡＳ、ｍＴＯＲ、ＮＲＡＳ、およびテロメアＤＮＡについての、Ｇ四重鎖オリゴヌクレオチドの例示的な核酸配列である。
配列番号７は、例示的なＭＹＣＮ Ｇ４野生型オリゴヌクレオチドである。
配列番号８は、例示的なＭＹＣＮ Ｇ４変異型オリゴヌクレオチドである。
配列番号９は、例示的なＭＹＣＮ Ｇ４短縮型オリゴヌクレオチドである。
配列番号１０は、ＭＹＣＮＯｓ－０１のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１１は、ＭＹＣＮＯｓ－０１のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１２は、ＭＹＣＮＯｓ－０２のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１３は、ＭＹＣＮＯｓ－０２のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１４は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム１のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１５は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム１のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１６は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム２のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１７は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム２のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１８は、ＭＹＣＮ Ｇ４四重鎖形成配列の例示的な核酸配列である。
配列番号１９は、ＭＹＣＮＯＳにおけるＧ４形成配列の例示的な核酸配列である。
配列番号２０～２３は、ＭＹＣＮＯＳにおける可能性のあるＧ４の例示的な核酸配列である。
配列番号２４～３０は、それぞれ、ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＭＹＣＬ、ＢＲＤ４、ＢＣＬ２、ＬＩＮＣ０１０１８およびＳＯＸ１２における、ヘアピンＧ４配列の例示的な核酸配列である。
配列番号３１は、例示的なｈＴＥＲＴ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３２は、例示的なＢＣＬ２ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３３は、例示的なＲＢ１ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３４は、例示的なＶＥＧＦ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３５は、例示的なｃ－ＭＹＣ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３６は、例示的なｃ－ＫＩＴ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３７は、例示的なｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
配列番号３８は、例示的なＨＩＦ１－ａ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３９は、例示的なｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
配列番号４０は、ヒトＭＹＣＮＯＳをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である。
詳細な説明
Ｉ．定義および略語
用語および略語の以下の説明は、本開示をよりよく説明するためにおよび本開示を実施する際に当業者の指針となるように提供される。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の言及対象を含む。用語「または」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、述べられている代替要素のうちの単一の要素、または２つもしくはそれより多くの要素の組合せを指す。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「Ａ」または「Ｂ」を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、Ａを含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、Ｂを含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、またはＡとＢの両方を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を指す。
別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本開示が
属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験の際に使用することができるが、好適な方法および材料が下で説明される。材料、方法および例は、説明に役立つものに過ぎず、限定することを意図したものではない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
数値範囲の開示は、別段の注記がない限り、終点を含めて範囲内の各々の離散点に言及するものと理解されたい。別段の指示がない限り、本明細書または特許請求の範囲において使用される場合の構成要素、分子量、パーセンテージ、温度、時間などについての量を表す全ての数は、用語「約」により修飾されていると理解されたい。したがって、暗黙的であれ明示的であれ別段の指示がない限り、または文脈がより限定的な構成を有すると当業者によって適切に理解される場合を除き、示される数値パラメーターは、探究される所望の特性、および／または当業者に公知の標準的な試験条件／方法のもとでの検出限界に依存し得る、近似値である。実施態様と論じられる先行技術を直接かつ明示的に区別するときには、実施態様の数は、「約」という語の記述がない限り、近似値ではない。核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量値は、近似値であり、説明のために提供されることを、さらに理解されたい。
様々な構成要素、パラメーター、動作条件などの代替案が本明細書で示されるが、それは、それらの代替案が必然的に同等であるおよび／または同様に良好に機能することを意味しない。別段の記述がない限り、代替案が好ましい順序で列挙されていることも意味しない。
下で提供される定義が、許されない置換パターン（例えば、５つの異なる基で置換されたメチルなど）を含むことを意図したものでないことは、当業者には分かるであろう。そのような許されない置換パターンは、当業者には容易に分かる。本明細書で開示されるおよび／または上で定義されたいずれの官能基も、本明細書中で別段の指示がない限り、置換または非置換であり得る。
化学における一般用語の定義は、Richard J. Lewis, Sr. (ed.), Hawley's Condensed Chemical Dictionary, published by John Wiley & Sons, Inc., 2016
(ISBN 978-1-118-13515-0)において見つけることができる。本開示の化合物は、重水素、三重水素、 １８ Ｆ、 １４ Ｃなどをこれらに限定されないが含み得る、化合物中に存在する原子に全ての同位体も含む。
化合物が、互変異性、配座異性、幾何異性、および／または光学異性の現象を示し得ることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ある特定の開示化合物は、１つまたは複数のキラル中心および／または二重結合を含むことができ、結果として、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、エナンチオマー、ジアステレオマー、およびこれらの混合物、例えば、ラセミ混合物として存在し得る。別の例として、ある特定の開示化合物は、エノール形、ケト形、およびこれらの混合物を含む、いくつかの互変異性体形で存在し得る。本明細書および特許請求の範囲内の様々な化合物名、式および化合物図が、可能性のある互変異性体形、配座異性体形、光学異性体形または幾何異性体形の１つだけを表し得る場合、開示化合物が、本明細書に記載される化合物の任意の互変異性体形、配座異性体形、光学異性体形および／または幾何異性体形はもちろん、これらの様々な異なる異性体形の混合物も包含することは、当業者には理解されるであろう。エナンチオマーおよび／または立体異性体の混合物をはじめとする異なる異性体形の混合物を、特に本開示の恩恵を受ける当業者に公知の技術を使用して分離して、各々の別々のエナンチオマーおよび／または立体異性体を得ることができる。例えば、アミド結合の周り
の、またはピリジニル環、ビフェニル基などの２つの直接結合している環の間の、回転が制限されている場合、アトロプ異性体も可能性があり、アトロプ異性体も、本明細書で開示される化合物に特に含まれる。
いずれの実施態様においても、化合物中に存在する、または化合物中の特定の基もしくは部分の中に存在する、いずれかのまたは全ての水素が、重水素または三重水素によって置き換えられていることがある。したがって、アルキルの記述は、存在する１から最大数の水素が重水素によって置き換えられていることがある、重水素化アルキルを含む。例えば、メチルは、ＣＨ ３ 、または１～３個の水素が重水素で置き換えられている、例えばＣＤ ｘ Ｈ ３－ｘ での、ＣＨ ３ 、両方を指す。
本明細書で使用される場合、用語「置換されている」は、用語における全ての後続の修飾語句を指し、例えば、用語「置換されている脂肪族－芳香族」において、置換は、「脂肪族」部分に存在することもあり、「芳香族」部分に存在することもあり、または脂肪族－芳香族基の両方の部分に存在することもある。
「置換されている」は、明記されている基または部分を修飾するために使用される場合、明記されている基または部分の少なくとも１個の、恐らく２個またはそれより多くの、水素原子が、同じまたは異なる置換基で独立して置き換えられていることを意味する。特定の実施態様では、基、部分、または置換基は、「非置換の」または「置換されている」のどちらかとして明確に定義されている場合を除き、置換されていてもよく、または非置換であってもよい。したがって、本明細書に明記される官能基のいずれも、文脈による別段の指示がない限りまたは特定の構造式が置換を不可能にする場合を除き、非置換であってもよく、または置換されていてもよい。特定の実施態様では、置換基は、置換されていると明確に定義されていることもあり、されていないこともあるが、それでもやはり、必要に応じて置換されていることが企図される。例えば、「脂肪族」または「環式」部分は、非置換であってもよく、または置換されていてもよいが、「非置換脂肪族」または「非置換環式」は、置換されていない。１つの実施態様では、置換されている基は、少なくとも１つの置換基から特定の部分に可能な数までの置換基、例えば、１つの置換基、２つの置換基、３つの置換基、または４つの置換基を有する。
構造の他の部分への基または部分の接続が、明確に述べられているまたは文脈により暗示される場合を除き、原子価則の考慮、例示的な種の比較、および／または官能性の考慮などにより、当業者には理解されるように、本明細書で定義されるいずれの基または部分も、開示される構造の任意の他の部分、例えば、親またはコア構造に接続され得る。
本開示の様々な実施態様の再考を容易にするために、特定の用語についての以下の説明が提供される：
ハロゲン化アシル：－Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはＣｌである）。
投与：薬剤、例えば、ＭＹＣＮ（Ｎ－Ｍｙｃをコードする）の非標準Ｇ４などの、非標準Ｇ４に選択的に結合する化合物（例えば、小化合物）を、任意の有効な経路により対象に提供することまたは与えること。一部の実施態様では、投与は、薬剤、例えば、ｃ－ＭＹＣプロモーターにおけるＧ４四重鎖ＤＮＡに選択的に結合する小分子化合物を、任意の有効な経路により対象に提供することまたは与えることを含み得る。例示的投与経路としては、経口、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、局所的）、鼻腔内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。
同時投与または同時投与することは、同じ一般的な期間内の少なくとも２つの治療用化合物の投与を指し、正確に同じ時点での投与を必要としない（とはいえ、併用投与は、正確に同じ時点で投与することを含んでいる）。したがって、同時投与は、同じ日であってもよく、または異なる日であってもよく、または同じ週であってもよく、または異なる週であってもよい。本明細書で開示される治療用化合物を同じ組成物に含めてもよく、またはそれらを、各々個別に、別々の組成物に含めてもよい。ある特定の実施態様では、２つの化合物は、それらのそれぞれの生物活性期間がオーバーラップしている時間枠中に投与され得る。したがって、この用語は、２つまたはそれより多くの化合物の逐次的投与はもちろん同じ時間範囲内の投与も含む。
化合物「の投与」および「を投与すること」は、本明細書に記載の化合物、化合物のプロドラッグ、または医薬組成物を提供することを意味すると理解されたい。化合物または組成物は、別人により対象に（例えば、静脈内）投与されることもあり、または対象により自己投与されることもある（例えば、錠剤）。
薬剤：目標または結果を達成するのに有用である、任意の物質、または物質の任意の組合せ；例えば、対象における腫瘍成長を減少または低減させるのに有用な物質または物質の組合せ。薬剤は、エフェクター分子および検出可能なマーカーを含む。一部の実施態様では、薬剤は、化学療法剤である。特定の薬剤が、１つより多くの結果を達成するのに有用であり得ることは、当業者には理解されるであろう；例えば、薬剤は、検出可能なマーカーとしても、化学療法剤としても、有用であり得る。
アルデヒド：－Ｃ（Ｏ）Ｈ。
脂肪族：アルカン（またはアルキル）、アルケン（またはアルケニル）、アルキン（またはアルキニル）を、これらの環式バージョンを含めて、さらに直鎖および分岐鎖配置、ならびに全ての立体および位置異性体も含めて含む、少なくとも１個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ １～５０ ）、例えば、１個～２５個の炭素原子（Ｃ １～２５ ）、または１個～１０個の炭素原子（Ｃ １～１０ ）、または１個～６個の炭素原子（Ｃ １～６ ）、または１個～４個の炭素原子（Ｃ １～４ ）を有する、炭化水素基（例えば、実質的に炭化水素に基づく化合物）。脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。例示的な置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシル、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノアルキル、アリール、アリールアルキル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、ジアルキルアミノ、ハロ、ハロ脂肪族、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール、複素環式脂肪族、ヒドロキシル、オキソ、スルホンアミド、スルフヒドリル、チオアルコキシ、または他の官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
アルケニル：少なくとも２個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ ２～５０ ）、例えば、２個～２５個の炭素原子（Ｃ ２～２５ ）、または２個～１０個の炭素原子（Ｃ ２～１０ ）と、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合とを有する不飽和一価炭化水素であって、親アルケンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる不飽和一価炭化水素。アルケニル基は、分岐し得、直鎖であり得、環式（例えば、シクロアルケニル）であり得、シスまたはトランス（例えば、ＥまたはＺ）であり得る。アルケニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アルコキシ：－Ｏ－脂肪族、例えば、－Ｏ－アルキル、－Ｏ－アルケニル、－Ｏ－アル
キニル；これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、シクロプロポキシ、シクロへキシルオキシなど（このような基の脂肪族構成要素のいずれも、二重結合も三重結合も含まないことがあり、または１つもしくは複数の二重結合および／もしくは三重結合を含むことがある）を含む、例示的な実施態様がある。アルコキシ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アルキル：少なくとも１個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ １～５０ ）、例えば、１個～２５個の炭素原子（Ｃ １～２５ ）、または１個～１０個の炭素原子（Ｃ １～１０ ）を有する、飽和一価炭化水素であって、親化合物（例えば、アルカン）の１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる飽和一価炭化水素。アルキル基は、分岐し得、直鎖であり得、または環式（例えば、シクロアルキル）であり得る。アルキル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。一部の実施態様では、低級アルキルまたは（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ペンチル、３－ペンチル、またはヘキシルであり得；（Ｃ ３ ～Ｃ ６ ）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロへキシルであり得；（Ｃ ３ ～Ｃ ６ ）シクロアルキル（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルキルは、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、２－シクロプロピルエチル、２－シクロブチルエチル、２－シクロペンチルエチル、または２－シクロヘキシルエチルであり得；（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ペントキシ、３－ペントキシ、またはヘキシルオキシであり得；（Ｃ ２ ～Ｃ ６ ）アルケニルは、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、または５－ヘキセニルであり得；（Ｃ ２ ～Ｃ ６ ）アルキニルは、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、３－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－ペンチニル、４－ペンチニル、１－ヘキシニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、４－ヘキシニル、または５－ヘキシニルであり得；（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルカノールは、アセチル、プロパノイルまたはブタノイルであり得；ハロ（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルキルは、ヨードメチル、ブロモメチル、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、２－クロロエチル、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、またはペンタフルオロエチルであり得；ヒドロキシ（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルキルは、ヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル、１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル、１－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル、１－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル、１－ヒドロキシヘキシル、または６－ヒドロキシヘキシルであり得；（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル、またはヘキシルオキシカルボニルであり得；（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）アルキルチオは、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、イソブチルチオ、ペンチルチオ、またはヘキシルチオであり得；（Ｃ ２ ～Ｃ ６ ）アルカノイルオキシは、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、イソブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、またはヘキサノイルオキシであり得る。
アルキニル：少なくとも２個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ ２～５０ ）、例えば、２個～２５個の炭素原子（Ｃ ２～２５ ）、または２個～１０個の炭素原子（Ｃ ２～１０ ）と、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合とを有する不飽和一価炭化水素であって、親ア
ルキンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる不飽和一価炭化水素。アルキニル基は、分岐し得、直鎖であり得、または環式（例えば、シクロアルキニル）であり得る。アルケニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アミド：－Ｃ（Ｏ）ＮＲ ｅ Ｒ ｆ または－ＮＲ ｅ Ｃ（Ｏ）Ｒ ｆ （式中、Ｒ ｅ およびＲ ｆ の各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択され、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る）。
アミノ：－ＮＲ ｅ Ｒ ｆ （式中、Ｒ ｅ およびＲ ｆ の各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択され、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る）。
類似体：化学構造が親化合物と異なる分子、例えば、相同体（アルキル鎖の長さの違いまたは１つもしくは複数の同位体の組み入れの違いなど、化学構造または質量の増大の点で異なる）、分子断片、１つもしくは複数の官能基またはイオン化の変化の点で異なる構造。類似体は、必ずしも親化合物から合成されるとは限らない。誘導体は、基礎構造から誘導される分子である。
芳香族：別段の定めがない限り、単一の環（例えば、フェニル）、または少なくとも１つの環が芳香族である複数の縮合している環（例えば、ナフチル、インドリル、またはピラゾロピリジニル）を有する、すなわち、少なくとも１つの環、および必要に応じて複数の縮合している環が、連続、非局在化π電子系を有する、環原子数５～１５の環式の共役基または部分。典型的には、面外π電子の数は、ヒュッケル則（４ｎ＋２）に対応する。親構造への結合点は、典型的には、縮合環系の芳香族部分を介したものである。例えば、
Figure 2024522183000225
 。しかし、ある特定の例では、文脈または表される開示は、結合点が、縮合環系の非芳香族部分を介したものであることを示すことがある。例えば、
Figure 2024522183000226
 。芳香族基または部分は、環内に、例えば、アリール基もしくは部分に、炭素原子のみを含んでもよく、または１個もしくは複数の環炭素原子と、孤立電子対（例えば、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＰもしくはＳｉ）を含む１個もしくは複数の環ヘテロ原子とを、例えばヘテロアリール基もしくは部分に含んでもよい。芳香族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アリール：少なくとも５個の炭素原子を含む、一部の実施態様では、少なくとも５個の炭素原子～１５個の炭素原子（Ｃ ５ ～Ｃ １５ ）、例えば、５個～１０個の炭素原子（Ｃ ５ ～Ｃ １０ ）を有する、芳香族炭素環式基であって、単一の環または複数の縮合した環を有し、これらの縮合環が、芳香族であってもまたはなくてもよいが、ただし、本明細書で開
示される化合物の残りの位置への結合点が芳香族炭素環式基の原子を介したものであることを条件とする、芳香族炭素環式基。アリール基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。一部の実施態様では、アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸またはアルコキシを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の基で置換され得る。
アロキシ：－Ｏ－芳香族。アロキシ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アゾ：－Ｎ＝ＮＲ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である）。アゾ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
がん：分化の喪失を伴う特徴的な退形成を被った、成長速度の上昇、周囲組織への浸潤を有し、転移することができる、悪性腫瘍。例えば、甲状腺がんは、甲状腺組織にまたは甲状腺組織から発生する悪性腫瘍であり、乳がんは、乳房組織にまたは乳房組織から発生する悪性腫瘍（例えば、乳管癌）である。残存がんは、がんを低減または根絶させるために対象に施された任意の形態の処置の後に対象中に残存するがんである。転移がんは、転移がんが由来する元の（原発）がんの発生部位以外の１つまたは複数の体内部位における腫瘍である。がんは、固形腫瘍を含むが、これらに限定されない。
カルバメート：－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ ｅ Ｒ ｆ （式中、Ｒ ｅ およびＲ ｆ の各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。カルバメート基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
カーボネート：－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。カーボネート基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。独立した実施態様では、Ｒ ｄ は、水素であり得る。
カルボキシル：－Ｃ（Ｏ）ＯＨ。
カルボキシレート：－Ｃ（Ｏ）Ｏ － またはその塩。このカルボキシレート基の負電荷をＭ ＋ 対イオンで平衡させることができ、Ｍ ＋ は、アルカリイオン、例えば、Ｋ ＋ 、Ｎａ ＋ 、Ｌｉ ＋ ；アンモニウムイオン、例えば、 ＋ Ｎ（Ｒ ｅ ） ４ （式中、Ｒ ｅ は、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ ２＋ ］ ０．５ 、［Ｍｇ ２＋ ］ ０．５ 、もしくは［Ｂａ ２＋ ］ ０．５ であり得る。
化学療法剤：異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置に治療的有用性がある、任意の化学薬品。例えば、化学療法剤は、神経芽細胞腫の処置に有用である。使用することができる追加の治療剤の特定の例としては、微小管結合剤、ＤＮＡ挿入剤または架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子制御剤、
および血管新生阻害剤が挙げられる。１つの実施態様では、化学療法剤は、放射性化合物である。当業者は、有用である化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition；Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2 nd ed., (c) 2000 Churchill Livingstone, Inc；Baltzer, L., Berkery, R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995；Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook,
4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993；Chabner and Longo, Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice (4th ed.). Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins, 2005；Skeel,. Handbook of Cancer Chemotherapy (6th ed.). Lippincott Williams & Wilkins, 2003を参照されたい）。併用化学療法は、がんを処置するための１つより多くの薬剤の投与である。
対照：実験試料との比較に使用される試料または標準物質。一部の実施態様では、対照は、健常な患者から採取された試料、またはがんと診断された患者から採取された非腫瘍組織試料である。他の実施態様では、対照は、がんと診断された患者から採取された腫瘍組織試料である。一部の実施態様では、対照は、本明細書で開示のＧ４安定剤での処置を受けていない、がんと診断された患者から採取された腫瘍組織試料である。さらに他の実施態様では、対照は、歴史的対照または標準参照値または値域（例えば、以前に試験された対照試料、例えば、予後もしくは転帰が既知であるがん患者の群、またはベースラインもしくは正常値を示す試料の群、例えば、非腫瘍組織におけるＭＹＣＮもしくはＭＹＣ遺伝子の発現レベル）である。
シアノ：－ＣＮ。
減少させるまたは低下／低減させる／軽減する（ｒｅｄｕｃｅ）：何かの質、量または強度を低下させること；例えば、腫瘍負荷の低減。一例では、治療は、例えば治療の非存在下での応答と比較して、腫瘍（例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移、もしくはこれらの組合せ）を低減させる、または腫瘍に関連する１つもしくは複数の症状を軽減する。特定の例では、治療は、治療の後に腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移、またはこれらの組合せを減少させる、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の減少。そのような減少を、本明細書で開示される方法を使用して測定することができる。
遺伝子産物の発現のレベルを決定することまたは検出すること：例えば、当技術分野では公知の常套的な方法を使用して、例えば、核酸分子またはタンパク質を検出することによる、定性的方法または定量的方法どちらかでの発現レベルの検出。
診断：疾患を、その徴候、症状、および様々な検査の結果により同定するプロセス。そのプロセスによって達する結論もまた「診断」と呼ばれる。一般に行われる検査の形態としては、血液検査、医用イメージング、尿検査、および生検が挙げられる。
ジスルフィド：－ＳＳＲ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。ジスルフィド基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ジチオカルボン酸：－Ｃ（Ｓ）ＳＲ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、
ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。ジチオカルボン酸基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
エステル：－Ｃ（Ｏ）ＯＲ ｄ または－ＯＣ（Ｏ）Ｒ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。一部の実施態様では、ＣＯ ２ Ｃ １～３ アルキル基、例えば、メチルエステル（ＣＯ ２ Ｍｅ）、エチルエステル（ＣＯ ２ Ｅｔ）、およびプロピルエステル（ＣＯ ２ Ｐｒ）などが好ましく、これらの逆エステル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）Ｍｅ、－ＯＣ（Ｏ）Ｅｔおよび－ＯＣ（Ｏ）Ｐｒ）を含む。エステル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
エーテル：－脂肪族－Ｏ－脂肪族、－脂肪族－Ｏ－芳香族、－芳香族－Ｏ－脂肪族、または－芳香族－Ｏ－芳香族。エーテル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ヘアピン：用語「ヘアピン」は、反対方向に読んだときに配列が通常は相補的である同じ鎖の２つの領域が塩基対合して、ヘアピンの遠位末端に不対ループを有する二重ヘリックスを形成している、ＤＮＡ構造を指す：
Figure 2024522183000227
ハロ（またはハロゲン化物またはハロゲン）：フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード。一部の実施態様では、ハロは、アスタチンも含み得る。
ハロ脂肪族：１個または複数の水素原子、例えば、１個～１０個の水素原子が、独立して、ハロゲン原子、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードに置き換えられている、脂肪族基。ハロ脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ハロアルキル：１個または複数の水素原子、例えば、１個～１０個の水素原子が、独立して、ハロゲン原子、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードに置き換えられている、アルキル基。ハロアルキル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。独立した実施態様では、ハロアルキルは、ＣＸ ３ 基であり得、この式中の各Ｘは、独立して、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードから選択されることがある。
ハロヘテロ脂肪族：１個または複数の水素原子、例えば、１個～１０個の水素原子が、独立して、ハロゲン原子、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードに置き換えられている、ヘテロ脂肪族基。ハロヘテロ脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ヘテロ脂肪族：酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、リン、およびこれらの酸
化形態から、それらに限定されないが、選択され得る、少なくとも１個のヘテロ原子～２０個のヘテロ原子、例えば、１個～１５個のヘテロ原子、または１個～５個のヘテロ原子を基内に含む、脂肪族基。アルコキシ、エーテル、アミノ、ジスルフィド、ペルオキシ、およびチオエーテル基が、ヘテロ脂肪族の典型的（しかし、非限定的）な例である。ヘテロ脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ヘテロアリール：酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、リン、およびこれらの酸化形態から、それらに限定されないが、選択され得る、少なくとも１個のヘテロ原子～６個のヘテロ原子、例えば、１個～４個のヘテロ原子を環内に含む、芳香族基（例えば、アリール基）。そのようなヘテロアリール基は、単一の環または複数の縮合した環を有することがあり、縮合環は、芳香族であってもなくてもよく、および／またはヘテロ原子を含有してもしなくてもよいが、ただし、結合点が、芳香族ヘテロアリール基の原子を介したものであることを条件とする。ヘテロアリール基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
ヘテロ原子：炭素または水素以外の原子、例えば（これらに限定されないが）、酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、またはリン。原子価による制約により許されない場合などの、特定の開示される実施態様では、ヘテロ原子は、ハロゲン原子を含まない。
複素環／複素環式脂肪族：少なくとも１個の炭素原子および少なくとも１個のヘテロ原子を有する、すなわち、１個または複数の炭素原子が、少なくとも１つの孤立電子対を有する原子、典型的には窒素、酸素、リン、ケイ素または硫黄、で置き換えられている、環式脂肪族基。複素環式基は、単環式であることもあり、または二環式であることもある。
ヒドロキシ：式－ＯＨにより表される基。
単離されたまたは精製された：生物学的構成要素は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞における他の生物学的構成要素、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、脂質ならびにオルガネラ、から実質的に分離されたまたは精製された構成要素である。「単離された」は、絶対純度を必要としない。例えば、所望される単離された生物学的構成要素は、調製物の全内容物の少なくとも５０％、特に少なくとも約７５％、より特に少なくとも約９０％、最も特に少なくとも約９８％に相当し得る。本明細書に記載の単離された生物学的構成要素は、多くの方法、例えば、塩分画、フェノール抽出、有機溶媒（例えば、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、またはエタノール）による沈殿、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点電気泳動、物理的分離（例えば、遠心分離または撹拌）などにより、単離することができる。
精製されたという用語は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的用語として意図されたものである。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、細胞内のその天然環境にあるペプチドまたはタンパク質より濃縮されているものである。例えば、化合物調製物は、所望の多糖タンパク質コンジュゲートが、調製物の全内容物の少なくとも５０％、より特に少なくとも約９０％、最も特に少なくとも約９８％に相当するように、精製される。
ケトン：－Ｃ（Ｏ）Ｒ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。ケトン基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香
族、または有機官能基で置換され得る。
窒素含有基：少なくとも１個の窒素原子を含む基。一部の実施態様では、窒素含有基は、アミド基またはアミノ基である。一部の実施態様では、窒素含有基は、少なくとも１個の窒素原子を含む、単または二環式環、または環系を含み得る。環または環系は、ヘテロ原子に加えて１個～９個の炭素原子を一般に含み、飽和していることもあり、不飽和であることもあり、または芳香族（シュード芳香族を含む）であることもある。用語「シュード芳香族」は、電子の非局在化によって安定化される環系であって、芳香族環と同様に挙動する環系を指す。芳香族は、シュード芳香族環系、例えば、ピロリル環を含む。
窒素含有基の例としては、ヘテロアリール基および／または環式ヘテロ脂肪族基、例えば、ピロリル、Ｈ－ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル（１，２，３－および１，２，４－オキサジアゾリルを含む）、イソオキサゾリル、フラザニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、トリアゾリル（１，２，３－および１，３，４－トリアゾリルを含む）、テトラゾリル、チアジアゾリル（１，２，３，－および１，３，４－チアジアゾリルを含む）、ジチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、トリアジニル、１Ｈチエノ［２，３－ｃ］ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、イソキノリニル、キノリニル、キノキサリニル、プリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾトリアジニルなどが、挙げられる。そのような窒素含有基は、炭素環式環、例えば、フェニル、ナフチル、インデニル、アズレニル、フルオレニルおよびアントラセニルと融合していることがある。別段の定義がない限り、必要に応じて置換されている環式窒素含有基には、好適な環窒素原子のピリジニウム塩およびＮ－酸化物形が含まれる。一部の実施態様では、窒素含有基は、広範な置換基で、好ましくは、Ｃ １～６ アルキル、Ｃ １～６ アルコキシ、Ｃ ２～６ アルケニル、Ｃ ２～６ アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アミノ、シアノまたはモノもしくはジ（Ｃ １～６ アルキル）アミノで必要に応じて置換され得る。
Ｎ－Ｍｙｃ：Ｎ－Ｍｙｃタンパク質は、ＭＹＣＮ遺伝子によりコードされる。ＭＹＣＮは、胎児発生に極めて重要であることおよび神経組織に高度に発現されることが示されている。ＭＹＣＮは、多くの場合、がんの際に過剰発現されるかまたは変異し、特に神経芽細胞腫および小細胞肺がんにおける、癌遺伝子と見なされている。ＭＹＣＮの配列情報は、公開データベース、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｕｓｗｅｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）遺伝子ＩＤ番号：ＥＮＳＧ０００００１３４３２３に記載されている。ＭＹＣＮ逆鎖（ＭＹＣＮＯＳ）は、ＭＹＣＮのアンチセンス鎖上に位置する。ＭＹＣＮＯＳの発現は、ＭＹＣＮのプロモーター占有率を減少させること、および配列相補性によってＭＹＣＮ転写物の安定性を調節することが示されている。つい最近の研究によって、ＭＹＣＮＯＳ転写物のバリアント２であるＮＣＹＭが翻訳されて低分子タンパク質を生成することもあることが示されている。ＮＣＹＭとして公知のこのポリペプチドは、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の安定性を調節すること、ＧＳＫ３βを阻害すること、およびＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に影響を及ぼすことをはじめとする、多様な制御活性を有することを特徴とする。ＭＹＣＮＯＳの配列情報は、公開データベース、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｕｓｗｅｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）遺伝子ＩＤ番号：ＥＮＳＧ０００００２３３７１８に記載されている。
有機官能基：脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、ハロ脂肪族および／もしくはハロヘテロ脂肪族基の任意の組合せにより提供され得る、またはアルデヒド、アロキシ、ハロゲン化
アシル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アジド、カルボキシル（またはカルボキシレート）、アミド、ケトン、カーボネート、イミン、アゾ、カルバメート、ヒドロキシル、チオール、スルホニル（またはスルホネート）、オキシム、エステル、チオシアネート、チオケトン、チオカルボン酸、チオエステル、ジチオカルボン酸、ホスホネート、ホスフェート、シリルエーテル、スルフィニル、スルホンアミド、チアールもしくはこれらの組合せからこれらに限定されないが選択され得る、官能基。有機官能基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
オキシム：－ＣＲ ｄ ＝ＮＯＨ（式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である）。オキシム基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ペルオキシ：－Ｏ－ＯＲ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である）。ペルオキシ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
医薬組成物：開示化合物の１つまたは複数についての量（例えば、単位投薬量）を、担体、希釈剤および／またはアジュバントをはじめとする非毒性の薬学的に許容される添加剤の１つまたは複数、ならびに必要に応じて他の生物活性成分と一緒に含む、組成物。そのような医薬組成物を、標準的な医薬製剤技術、例えば、Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (19th Edition)において開示されているものにより、調製することができる。
薬学的に許容される担体：有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995には、開示免疫原の薬学的送達に好適な組成物および製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、薬学的におよび生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどをビヒクルとして含む、注射可能な流体を通常は含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）のための従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されることになる医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存薬、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。対象への投与に好適な、特定の実施態様では、担体は、滅菌されたものであり得、および／または所望の腫瘍応答を誘導するのに好適な組成物の１もしくは複数の測定された用量を含有する単位剤形に懸濁もしくは別様に含有され得る。それは、処置を目的としたその使用のための薬物に付随することもある。単位剤形は、例えば、滅菌された内容物を収容している密封バイアル、もしくは対象への注射用の注射器の中にあり得、またはその後の可溶化および投与のために凍結乾燥され得、または固体もしくは調節放出投薬量であり得る。
薬学的に許容される塩またはエステル：例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデル
酸などを含むがこれらに限定されない無機および有機酸の、塩を含む、従来の手段により調製される塩またはエステル。
本開示の化合物の薬学的に許容される塩には、カチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛から、ならびに塩基、例えば、アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ－メチル－グルタミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、および水酸化テトラメチルアンモニウムから、形成されるものも含まれる。これらの塩は、標準手順により、例えば、遊離酸を好適な有機または無機塩基と反応させることにより、調製され得る。本明細書で述べられる化学物質を、代替的に、その薬学的に許容される塩として投与することができる。「薬学的に許容される塩」は、遊離酸、塩基、および双性イオン形も含む。好適な薬学的に許容される塩の説明は、Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection
and Use, Wiley VCH (2002)において見つけることができる。本明細書で開示される化合物が、カルボキシ基などの酸性官能基を含む場合には、カルボキシ基に好適な薬学的に許容されるカチオン対は当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、第四級アンモニウムカチオンなどを含む。そのような塩は、当業者に公知である。薬理学的に許容される塩のさらなる例については、Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977)を参照されたい。
薬学的に許容されるエステルは、カルボキシル基を含むように修飾されている本明細書に記載される化合物から誘導されたものを含む。ｉｎ ｖｉｖｏ加水分解性エステルは、ヒトまたは動物体内で加水分解されて親酸またはアルコールを生成するエステルである。したがって、代表的なエステルとしては、エステル基のカルボン酸部分の非カルボニル部分が、直鎖もしくは分岐鎖アルキル（例えば、メチル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、もしくはｎ－ブチル）、シクロアルキル、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）、アラルキル（例えば、ベンジル）、アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）、アリール（例えば、フェニル、例えば、ハロゲン、Ｃ １～４ アルキルもしくはＣ １～４ アルコキシまたはアミノによって必要に応じて置換されているフェニル）から選択される、カルボン酸エステル；スルホン酸エステル、例えば、アルキル－もしくはアラルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル）；またはアミノ酸エステル（例えば、Ｌ－バリルもしくはＬ－イソロイシル）が、挙げられる。「薬学的に許容されるエステル」は、無機エステル、例えば、一、二または三リン酸エステルも含む。そのようなエステルにおいて、別段の定めがない限り、存在するいずれのアルキル部分も、有利には、１個～１８個の炭素原子、特に１個～６個の炭素原子、より特に１個～４個の炭素原子を含有する。そのようなエステルに存在するいずれのシクロアルキル部分も、有利には、３個～６個の炭素原子を含有する。そのようなエステルに存在するいずれのアリール部分も、有利には、上記のカルボシクリル（carbocycylyl）の定義で示されたように必要に応じて置換されているフェニル基を含む。したがって、薬学的に許容されるエステルは、Ｃ １ ～Ｃ ２２ 脂肪酸エステル、例えば、アセチル、ｔ－ブチルまたは長鎖直鎖もしくは分岐不飽和もしくはオメガ－６一価不飽和脂肪酸、例えば、パルミトイル（palmoyl）、ステアロイルなどを含む。代替アリールまたはヘテロアリールエステルとしては、ベンゾイル、ピリジルメチロイルなどが挙げられ、これらのいずれも、上記カルボシクリルにおいて定義されたように置換されていてもよい。さらなる薬学的に許容されるエステルとしては、脂肪族Ｌ－アミノ酸エステル、例えば、ロイシル、イソロイシル、および特にバリルが挙げられる。
治療上の使用のための、化合物の塩は、対イオンが薬学的に許容されるものである。しかし、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において利用され得る。
本明細書における上述の薬学的に許容される酸および塩基付加塩は、化合物が形成し得る、治療効果のある非毒性の酸および塩基付加塩形を含むことを意図したものである。薬学的に許容される酸付加塩は、塩基形をそのような適切な酸で処理することにより適便に得ることができる。適切な酸は、例えば、無機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸およびこれらに類する酸；または有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわち、エタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸（すなわち、ヒドロキシブタン二酸）、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ－アミノサリチル酸、パモ酸およびこれらに類する酸などを含む。逆に、前記塩形を適切な塩基での処理によって遊離塩基形に変換することができる。
酸性プロトンを含有する化合物を、適切な有機および無機塩基での処理によってそれらの非毒性金属またはアミン付加塩形に変換することもできる。適切な塩基塩形は、例えば、アンモニウム塩、アルカリおよびアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など；有機塩基との塩、例えば、ベンザチン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ヒドラバミン塩；ならびに例えば、アルギニン、リシンなどのような、アミノ酸との塩を含む。
本明細書において上で使用した付加塩という用語は、本明細書に記載される化合物が形成し得る溶媒和物も含む。そのような溶媒和物は、例えば、水和物、アルコレートなどである。
本明細書において上で使用した用語「第四級アミン」は、第四級アンモニウム塩を定義し、この化合物は、化合物の塩基性窒素と、適切な四級化剤、例えば、必要に応じて置換されているハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリールまたはハロゲン化アルキルアリール、例えば、ヨウ化メチルまたはヨウ化ベンジルなどとの反応により形成され得る。トリフルオロメタンスルホン酸アルキル、メタンスルホン酸アルキル、およびｐ－トルエンスルホン酸アルキルなどの、良好な脱離基との他の反応物も、使用され得る。第四級アミンは、正荷電窒素を有する。薬学的に許容される対イオンは、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロアセテート、およびアセテートを含む。選ばれた対イオンを、イオン交換樹脂を使用して導入することができる。
開示化合物のプロドラッグも、本明細書において企図される。プロドラッグは、対象へのプロドラッグの投与後にｉｎ ｖｉｖｏ生理作用、例えば、加水分解、代謝などによって化学的に修飾されて活性化合物になる、活性または不活性化合物である。本文全体を通して使用される用語「プロドラッグ」は、薬理学的に許容される誘導体、例えば、エステル、アミドおよびホスフェートを意味し、したがって、誘導体の結果として生じるｉｎ ｖｉｖｏ生体内変換産物は、本明細書に記載される化合物に関して定義されるような活性薬物である。プロドラッグは、好ましくは、優れた水溶性を有し、バイオアベイラビリティが増大されたものであり、ｉｎ ｖｉｖｏで容易に代謝され活性阻害剤になる。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、修飾部が常套的操作によりまたはｉｎ ｖｉｖｏで切断されて親化合物になるように修飾することによって、調製され得る。プロドラッグの作製および使用に関わる適合性および技術は、当業者に周知である。エステルを含むプロドラッグの一般的考察については、Svensson and Tunek, Drug Metabolism Reviews 165 (1988)およびBundgaard, Design of Prodrugs, Elsevier (1985)を参照されたい。
用語「プロドラッグ」は、プロドラッグが対象に投与されたときにｉｎ ｖｉｖｏで本
発明の活性親薬物を放出する任意の共有結合した担体を含むことを意図したものでもある。プロドラッグは、多くの場合、活性薬剤医薬品と比べて向上した特性、例えば、可溶性およびバイオアベイラビリティを有するので、本明細書で開示される化合物は、プロドラッグ形態で送達され得る。したがって、本明細書で開示される化合物のプロドラッグ、プロドラッグを送達する方法、およびそのようなプロドラッグを含有する組成物も、企図される。開示化合物のプロドラッグは、典型的には、化合物中に存在する１つまたは複数の官能基を、修飾部が常套的操作でまたはｉｎ ｖｉｖｏで切断されて親化合物を生じさせるように修飾することにより調製される。プロドラッグは、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されて対応するアミノおよび／またはホスホネート基をそれぞれ生じさせる任意の基で官能化されたホスホネートおよび／またはアミノ基を有する化合物を含む。プロドラッグの例としは、アセチル化アミノ基および／またはホスホン酸エステルもしくはホスホン酸アミド基を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、プロドラッグは、ホスホン酸低級アルキルエステル、例えば、ホスホン酸イソプロピルエステルである。
開示化合物の保護された誘導体も企図される。開示化合物とともに使用するための様々な好適な保護基が、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999において開示されている。
一般に、保護基は、分子の残りの部分に影響を与えることにならない条件下で除去される。これらの方法は、当技術分野において周知であり、酸加水分解、水素化分解などを含む。１つの好ましい方法は、エステルの除去、例えば、遊離ホスホネートを生じさせるためのＴＭＳ－Ｂｒ媒介エステル切断の場合のものなどのルイス酸性条件を使用するホスホン酸エステルの切断を含む。第２の好ましい方法は、保護基の除去、例えば、好適な溶媒系、例えば、アルコール、酢酸などまたはこれらの混合物中での炭素に対するパラジウムを利用する水素化分解によるベンジル基の除去を含む。ｔ－ブトキシカルボニル保護基をはじめとする、ｔ－ブトキシに基づく基を、好適な溶媒系、例えば、水、ジオキサンおよび／または塩化メチレン中で、無機または有機酸、例えば、ＨＣｌまたはトリフルオロ酢酸を利用して、除去することができる。アミノおよびヒドロキシ官能基の保護に好適なもう１つの例示的な保護基は、トリチルである。他の従来の保護基は公知であり、当業者は、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999を参考にして好適な保護基を選択することができる。アミンが脱保護されると、得られた塩を容易に中和して遊離アミンを生じさせることができる。同様に、ホスホン酸部分などの酸部分が露出されると、化合物を、酸化合物としてまたはその塩として単離することができる。
ホスフェート：－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ ｄ ） ２ （式中、各Ｒ ｄ は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、もしくは有機官能基であり；または１つもしくは複数のＲ ｄ 基は、存在せず、したがって、ホスフェート基は、少なくとも１つの負電荷を有し、その負電荷をＭ ＋ 対イオンにより平衡させることができ、ここで、各Ｍ ＋ は、独立して、アルカリイオン、例えば、Ｋ ＋ 、Ｎａ ＋ 、Ｌｉ ＋ ；アンモニウムイオン、例えば、 ＋ Ｎ（Ｒ ｅ ） ４ （この式中、Ｒ ｅ は、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ ２＋ ］ ０．５ 、［Ｍｇ ２＋ ］ ０．５ 、もしくは［Ｂａ ２＋ ］ ０．５ であり得る）。ホスフェートのＲ ｄ 基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ホスホネート：－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ ｄ ） ２ （式中、各Ｒ ｄ は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、もしくは有機官能基であり；または１つもしくは複数のＲ ｄ 基は、存在せず、したがって、ホスフェート基は、少なくと
も１つの負電荷を有し、その負電荷をＭ ＋ 対イオンにより平衡させることができ、ここで、各Ｍ ＋ は、独立して、アルカリイオン、例えば、Ｋ ＋ 、Ｎａ ＋ 、Ｌｉ ＋ ；アンモニウムイオン、例えば、 ＋ Ｎ（Ｒ ｅ ） ４ （この式中、Ｒ ｅ は、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ ２＋ ］ ０．５ 、［Ｍｇ ２＋ ］ ０．５ 、もしくは［Ｂａ ２＋ ］ ０．５ であり得る）。ホスホネート基のＲ ｄ 基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
シリルエーテル：－ＯＳｉＲ ｅ Ｒ ｆ （式中、Ｒ ｅ およびＲ ｆ の各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。シリルエーテル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
小分子：本明細書で使用される場合、用語「小分子」は、１０００ダルトンまたはそれ未満（例えば、９００ダルトンもしくはそれ未満、８００ダルトンもしくはそれ未満、７００ダルトンもしくはそれ未満、６００ダルトンもしくはそれ未満、５００ダルトンもしくはそれ未満、４００ダルトンもしくはそれ未満、３００ダルトンもしくはそれ未満、２００ダルトンもしくはそれ未満、または１００ダルトンもしくはそれ未満）の分子量を有する分子を指す。一部の例では、小分子は、１００～１０００ダルトン、２００～９００ダルトン、２００～７００ダルトン、または２００～５００ダルトンの分子量を有する。
対象：ヒト対象と非ヒト対象の両方を含み、非ヒト対象には、鳥類および非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、伴侶動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ブタ、ヒツジ、雌ウシ）、ならびに飼い慣らされていない動物、例えば、大型のネコ科動物が含まれる。対象という用語は、生物の生活環の段階に関係なく適用される。したがって、対象という用語は、生物（すなわち、生物が、哺乳動物であるか、家禽または野鳥などの鳥類であるか）に依存してｉｎ ｕｔｅｒｏまたはｉｎ ｏｖｏの生物に適用される。
スルフィニル：－Ｓ（Ｏ）Ｒ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。スルフィニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
スルホニル：－ＳＯ ２ Ｒ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。スルホニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
スルホンアミド：－ＳＯ ２ ＮＲ ｅ Ｒまたは－Ｎ（Ｒ ｅ ）ＳＯ ２ Ｒ ｆ （式中、Ｒ ｅ およびＲ ｆ の各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。スルホンアミド基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
スルホネート：－ＳＯ ３ － 。このスルホネート基の負電荷をＭ ＋ 対イオンで平衡させることができ、Ｍ ＋ は、アルカリイオン、例えば、Ｋ ＋ 、Ｎａ ＋ 、Ｌｉ ＋ ；アンモニウムイオン、例えば、 ＋ Ｎ（Ｒ ｅ ） ４ （式中、Ｒ ｅ は、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ ２＋ ］ ０．５ 、［Ｍｇ ２＋ ］ ０．５ 、もしくは［Ｂａ ２＋ ］ ０．５ であり得る。
治療有効量：単独で、または１つもしくは複数の追加の薬剤と一緒に、例えば対象における腫瘍の処置などの、所望の応答を誘導する、薬剤の量。理想的には、治療有効量は、対象において実質的な細胞毒性効果を引き起こすことなく治療効果をもたらす。
一例では、所望の応答は、対象における腫瘍のサイズ、体積または数（例えば、転移）を減少させることである。例えば、薬剤（単数）または薬剤（複数）は、腫瘍のサイズ、体積または数を、所望の量、例えば、薬剤の非存在下での応答と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、減少させることができる。
本明細書で開示されるいくつかの調製物が治療有効量で投与される。ヒトまたは獣医学的対象に投与される開示される化合物の治療有効量は、対象に関連するいくつかの因子、例えば、対象の健康全般によって変わることになる。投薬量を変え、結果として生じる治療応答、例えば腫瘍の退縮、を測定することにより、治療有効量を決定することができる。治療有効量を、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイによって決定することもできる。開示薬剤を、所望される応答を得るために必要に応じて単一用量でまたは数用量で投与することができる。しかし、療有効量は、利用される供給源、処置される対象、処置される状態の重症度およびタイプ、ならびに投与方法に依存し得る。
チアール：－Ｃ（Ｓ）Ｈ。
チオカルボン酸：－Ｃ（Ｏ）ＳＨ、または－Ｃ（Ｓ）ＯＨ。
チオシアネート：－Ｓ－ＣＮまたは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ。
チオエステル：－Ｃ（Ｏ）ＳＲ ｄ または－Ｃ（Ｓ）ＯＲ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。チオエステル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
チオエーテル：－Ｓ－脂肪族または－Ｓ－芳香族、例えば、－Ｓ－アルキル、－Ｓ－アルケニル、－Ｓ－アルキニル、－Ｓ－アリール、もしくは－Ｓ－ヘテロアリール；または－脂肪族－Ｓ－脂肪族、－脂肪族－Ｓ－芳香族、－芳香族－Ｓ－脂肪族、もしくは－芳香族－Ｓ－芳香族。チオエーテル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
チオケトン：－Ｃ（Ｓ）Ｒ ｄ （式中、Ｒ ｄ は、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。チオケトン基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
疾患を処置することまたは抑制すること：疾患の徴候もしくは症状または疾患（例えば、腫瘍）に関係する病的状態を軽減する、治療介入。処置は、腫瘍などの状態の寛解または治癒も誘導し得る。特定の例では、処置は、腫瘍を、例えば腫瘍の完全な発生を抑制することにより、予防すること、例えば、転移の発生または原発腫瘍の発生を予防することを含む。予防は、腫瘍の完全非存在を必要としない。
疾患の徴候もしくは症状または疾患に関係する病的状態を軽減することは、処置の任意の観察可能な有益な効果を指す。腫瘍に関連する徴候または症状を軽減することは、例えば、感受性対象（例えば、まだ転移していない腫瘍を有する対象）における疾患の臨床症状の開始の遅延、疾患の一部もしくは全ての臨床症状の重症度の低下、疾患のより緩徐な進行（例えば、腫瘍を有する対象の寿命を延ばすことにより）、疾患の再発数の低減、対象の健康全般もしくは肉体的および精神的な健全性の改善により、または特定の腫瘍に特有である当技術分野において周知の他のパラメーターにより、証明され得る。「予防的」処置は、病態発症のリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示さないまたは初期徴候のみを示す対象に投与される処置である。
腫瘍：良性であることもあり、または悪性であることもある、細胞の異常な成長。がんは、異常なまたは調節されない細胞成長を特徴とする、悪性腫瘍である。悪性病変にしばしば関連する他の特徴としては、転移、隣接細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、および炎症性または免疫学的応答の抑止または増悪、周囲または遠位組織または器官、例えばリンパ節への浸潤などが挙げられる。「転移性疾患」は、原発腫瘍部位を離れ、身体の他の部分に、例えば血流またはリンパ系によって、移動する、がん細胞を指す。したがって、転移がんは、転移がんが由来する元の（原発）がんの元の発生部位以外の１つまたは複数の体内部位におけるがんである。個体における腫瘍の量が「腫瘍負荷」であり、これを腫瘍の数、体積または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。
個体における腫瘍の量が「腫瘍負荷」であり、これを腫瘍の数、体積または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲組織に浸潤する腫瘍および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。血液腫瘍の例としては、急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病）を含む白血病、真正赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常が挙げられる。
固形腫瘍、例えば肉腫および癌腫、の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性病変、膵臓がん、乳がん（基底乳癌、乳管癌および乳房小葉癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、唾液腺癌、甲状腺髄様癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が、挙げられる。
「定着」または「既存の」腫瘍は、診断検査により識別可能であり得る既存の腫瘍である。一部の実施態様では、定着腫瘍を触診することができる。一部の実施態様では、「定着腫瘍」は、サイズが少なくとも５００ｍｍ ３ 、例えば、少なくとも６００ｍｍ ３ 、少なくとも７００ｍｍ ３ 、または少なくとも８００ｍｍ ３ である。他の実施態様では、腫瘍は、少なくとも１ｃｍ長である。固形腫瘍に関しては、定着腫瘍は、一般に、確固たる血液供給を有し、Ｔｒｅｇおよび骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を誘導した。いくつかの例では、腫瘍は、神経芽細胞腫または小細胞肺がんである。
ＩＩ．序論
小分子によるＧ四重鎖（Ｇ４）の標的化は、創薬不可能なタンパク質、例えばＮ－Ｍｙｃおよび他のＧ４含有タンパク質、の発現を調節するために魅力的な戦略であるが、Ｇ４への選択的結合剤は、多くのＧ４の構造類似性のため同定するのが難しい。多くの標準Ｇ４構造は、比較的単純である：それらは、中心カリウムイオンおよび小さい１～７ヌクレオチドループによって安定化されている、グアニンテトラドを含有する。しかし、より複雑なＧ４（または「非標準」Ｇ４）の最近の例は、追加の構造エレメント、例えば、ヘアピンおよび他のタイプの構造を含有することも示されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、そのような非標準構造を開示している、Onel et al., JACS 2016, 138:2563;2570；Ngoc Nguyen et al., Nucleic Acids Res. 2020, 48:10567-10575；およびTan et al., Nucleic Acids Res. 2020, 48:11162-11171を参照されたい）。ＭＹＣＮにおける報告されているＧ４の中で、そのような構造を有する非標準Ｇ４の一例は、ＭＹＣＮの第１イントロンに見られる。ゲノムワイドな探索研究によっても、ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４の存在が実験的に確認されたが、それは、多くの他の制御性Ｇ４のようにＭＹＣＮのプロモーター領域には出現しない。
ヘアピン含有Ｇ４などの非標準Ｇ４構造を標的とする新たな小分子化合物が、本明細書に記載される。一部の実施態様では、化合物は、ＭＹＣＮなどの、ＭＹＣ遺伝子ファミリーにおける非標準Ｇ４を標的とする。化合物を含む医薬組成物、および化合物を作製および使用する方法も、開示される。
治療的処置のために、例えば、がんのような疾患および／または障害を処置する方法において、そのような化合物を使用する方法も開示される。一部の実施態様では、開示化合物での処置は、ＭＹＣＮ転写物とＭＹＣＮＯＳ転写物の両方のおよびＮ－Ｍｙｃタンパク質レベルの減少を生じさせる結果となる。
ＩＩＩ．化合物
がんなどの疾患および／または障害を処置するための新規方法における使用のための化合物が、本明細書で開示される。特定の実施態様では、化合物は、非標準Ｇ４を標的とすることおよびそれに結合することができる小分子化合物（その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルを含む）である。特定の実施態様では、化合物は、ヘアピン含有Ｇ４などの構造的に複雑な非標準Ｇ４に選択的に直接結合する小分子である。特定の実施態様では、ヘアピン含有Ｇ４は、ＤＮＡ中に存在する。独立した実施態様では、化合物は、Ｇ４構造を含まないＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）に結合しない。本明細書で開示される二価化合物などの、一部の化合物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）中に存在するＧ４に結合することができるが、単純ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）、例えば、ステム－ループ構造、バルジ構造、またはＧ４のないヘアピン構造を含む、単純ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）には結合しない。本明細書で開示される化合物を使用して標的とすることができる例示的な遺伝子としては、ＭＹＣファミリー（例えば、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＮＯＳ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣなど）、ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＢＲＤ４、ならびに任意のがん遺伝子ならびに／またはそのノンコーディングＲＮＡ（例えば、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ））、例えば、ＢＣＬ２、ＳＯＸ２および／もしくはＬＩＮＣ０１０１８を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施態様では、化合物は、ヘリカーゼ（例えば、ＤＨＸ１５）中に存在するＧ４に結合することができる。一部の実施態様では、化合物は、そのような遺伝子に見られるＧ４ヘアピンの接合部の付近に選択的に結合する。
一部の実施態様では、化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルは、式Ｉによる構造を有する。
Figure 2024522183000228
 式Ｉに関しては、以下の可変的記述が当てはまり得る：
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり、特定の独立した実施態様では、チオフェニルでも、チアゾリルでも、フラニルでも、トリアゾリルでも、チアジアゾリルでもない；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環である；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１である；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族である；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロ（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩ）であり、独立した実施態様では、Ｒ ３ は、フルオロではない；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロである；
ｘは、０～５、例えば、０、１、２、３、４または５から選択される整数である；および
ｎは、０～１０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数である。
式Ｉの一部の実施態様では、以下の可変的記述が当てはまり得る：
環Ａは、オキサジアゾリルであり、特定の独立した実施態様では、１，３，４－オキサジアゾリルではない；
環Ｂは、ジアジニル（例えば、ピリダジニル、ピリミジニル、またはピラジニル）から選択される；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、アリール、ヘテロアリール、環式ヘテロ脂肪族、非環式ヘテロ脂肪族、環式脂肪族、非環式脂肪族であり、ｔは、０または１であり、リンカーは、－（ＣＲ ａ ２ ） ｑ －または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｑ Ｙ］ ｒ －（ＣＲ ａ ２ ） ｓ －であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり、Ｙは、水素、硫黄、またはＮＲ’であり、ここでのＲ’は、Ｈまたは脂肪族であり、ｑは、１～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であり、ｒは、１～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であり、ｓは、０、１または２から選択される整数である；
Ｒ ２ は、Ｈまたは低級アルキルである；
各Ｒ ３ は、独立して、アルコキシまたはヒドロキシである；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロである；
ｘは、１～５から選択される整数である；および
ｎは、０～３、例えば、０、１、２または３から選択される整数である。
式Ｉのさらに追加の実施態様では、以下の可変的記述が当てはまり得る：
環Ａは、１，２，４－オキサジアゾリル（例えば、
Figure 2024522183000229
 ）である；
環Ｂは、ピリダジニル（例えば、
Figure 2024522183000230
 ）である；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、フェニル、ピペラジニル、ピリジニル、アゼピニル、シクロペンチル、アミノ（例えば、ＮＨ ２ 、Ｎ（アルキル） ２ 、およびＮＨ（アルキル））、ピペリジニル、ピロリジニル、オキサジアゾリル、トリアジニル、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ ２ ）、モルホリニル、アクリジニル（例えば、９－アミノアクリジン、アクリジンＣｌ、およびアクリジンＮＨ ２ 、アクリジンＩＣＲ １９１）であり；ｔは、０または１であり；リンカーは、－（ＣＨ ２ ） ｑ －、－ＣＨ（Ｍｅ）－、－（ＣＨ ２ ） ｑ －ＣＨ（Ｍｅ）－、－［（ＣＨ ２ ） ｑ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ｓ －、または－（ＣＨ ２ ） ｑ ＮＨ－であり、ここで、ｑは、１～４、例えば、１、２、３または４から選択される整数であり、ｒは、１～４、例えば、１、２、３または４から選択される整数であり；ｓは、０、１または２である；
Ｒ ２ は、ＨまたはＭｅである；
各Ｒ ３ は、独立して、－ＯＭｅまたはヒドロキシである；および
ｎは、０である。
一部の実施態様では、化合物は、式Ｉによる構造を有し、式中、環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；Ｒ １ は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ｓ－ Ｒ ｂ であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、ｒは、１または２であり、ｓは、２であり、Ｒ ｂ は、シクロアルキル基、アリール基、または窒素含有基（例えば、Ｎ含有環式基、例えば、窒素を含むヘテロアリール基、もしくは窒素原子を含む環式ヘテロ脂肪族基；アミド基；またはアミノ基）であり；Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；各Ｒ ３ は、独立して、アルコキシまたはヒドロキシであり；ｘは、０、１、２、３、４または５であり；各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり；ｎは、０、１、２または３である。式Ｉによる構造を有するそのような化合物の独立した実施態様では、化合物は、以下の化合物を含まないが、その任意の薬学的に許容される塩またはエステルを含み得る：
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；
Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；または
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミン。
一部の実施態様では、化合物は、式ＩＡによる構造
Figure 2024522183000231
 を有し得、ここで、
Figure 2024522183000232
 により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり；Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒ ｃ ）であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒ ｃ ）以外であり；Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロ（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩ）であり、独立した実施態様では、Ｒ ３ は、フルオロではなく；各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；ｘは、０～５、例えば、０、１、２、３、４または５から選択される整数であり；ｎは、０～１０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数である。特定の独立した実施態様では、化合物は、チオフェニル環も、チアゾリル環も、フラニル環も、トリアゾリル環も、チアジアゾリル環も、１，３，４－オキサジアゾリル環も含まない。特定の実施態様では、化合物は、１，２，４－オキサジアゾリル環を含む。
上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000233
 であり得、ここで、
Figure 2024522183000234
 により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり；Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒ ｃ ）であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒ ｃ ）以外である。式Ｉおよび／または式ＩＡの一部の実施態様では、Ｒ ｃ は、Ｈまたはアルキル、例えば、Ｃ １ ～Ｃ ３ アルキル（メチル、エチル、プロピル、もしくはイソプロピル）である。式Ｉおよび／または式ＩＡのある特定の実施態様では、Ｒ ｃ は、Ｈである。式Ｉおよび／または式ＩＡの一部の実施態様では、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ のうちの少なくとも１つは、Ｎである。式Ｉおよび／または式ＩＡのある特定の実施態様では、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ の１つは、ＯまたはＳである。一部の実施態様では、式Ｉおよび／または式ＩＡの５員環は、
Figure 2024522183000235
 から選択される。ある特定の例では、式Ｉおよび／または式ＩＡの５員環は、
Figure 2024522183000236
 である。
上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、式Ｉの環Ｂは、
Figure 2024522183000237
 であり得、ここで、Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ の各々は、独立して、ＮまたはＣ（Ｒ ｃ ）であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ のうちの少なくとも１つは、Ｎである。式Ｉの一部の実施態様では、Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ のうちの２つは、Ｎであり、Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ の他のものは、Ｃ（Ｒ ｃ ）である。各Ｒ Ｃ は、独立して、Ｈ、－アルキル、またはハロであり得る。特定の例では、Ｒ ｃ は、Ｈである。式Ｉの一部の実施態様では、環Ｂは、
Figure 2024522183000238
 である。式Ｉのある特定の実施態様では、環Ｂは、
Figure 2024522183000239
 である。
開示化合物は、典型的に、いくつかのＲ ３ 基（式Ｉ中で「ｘ」として表される）を含み、ｘは、０、１、２、３、４または５であり、各Ｒ ３ は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロアルキル、脂肪族、またはハロである。独立した実施態様では、Ｒ ３ は、フルオロではない。一部の実施態様では、ｘは、１、２または３である。ある特定の実施態様では、ｘは、１である。一部の実施態様では、少なくとも１つのＲ ３ 基は、環Ａに対してパラ位にある。上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、Ｒ ３ は、Ｃ １ ～Ｃ ３ アルコキシまたはヒドロキシであり得る。一部の実施態様では、Ｒ ３ は、メトキシである。ある特定の実施態様では、ｘは、１であり、Ｒ ３ は、環Ａに対してパラにある。
ｎが０以外の整数である、上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、アルキル（例えば、Ｃ １ ～Ｃ ３ アルキル）、またはハロである。一部の実施態様では、Ｒ ４ は、Ｈまたはメチルである。ある特定の実施態様では、Ｒ ４ は、Ｈである。一部の実施態様では、ｎは、０または１である。ある特定の実施態様では、ｎは、０であり、－Ｎ（Ｒ １ ）（Ｒ ２ ）は、環Ｂに直接結合している。
一部の実施態様では、化合物は、式ＩＩによる構造：
Figure 2024522183000240
 を有する。式ＩＩに関して、Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ の各々は、上記実施態様のいずれかに従って定義されたとおりである。一部の実施態様では、Ｒ ２ は、ＨまたはＣ １ ～Ｃ ３ アルキルである。ある特定の実施態様では、Ｒ ２ は、Ｈである。
一部の実施態様では、化合物は、式ＩＩＩによる構造：
Figure 2024522183000241
 を有する。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒ １ は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ２ －Ｒ ｂ であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、ｒは、１、２、３、４または５であり、Ｒ ｂ は、窒素含有基である。一部の実施態様では、各Ｒ ａ は、独立して、ＨまたはＣ １ ～Ｃ ３ アルキルである。ある特定の実施態様では、各Ｒ ａ は、Ｈであり、Ｒ １ は、－（ＣＨ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ である。ある特定の実施態様では、各Ｒ ａ は、Ｈであり、Ｒ １ は、－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ２ －Ｒ ｂ であり、ここでｒは、１、２または３である。一部の実施態様では、ｍは、１、２または３、特に、２または３である。上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、ｍ＋ｎは、１、２、３、４または５であり得る。一部の実施態様では、ｍ＋ｎは、２、３または４、特に、２または３である。ある特定の実施態様では、ｎは、０であり、ｍは、２または３である。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒ ｂ は、窒素含有基である。一部の実施態様では、Ｒ ｂ は、Ｎ含有環式基、－Ｎ（Ｒ ｃ ） ２ 、または－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ ｃ ） ２ であり、ここで、各Ｒ ｃ は、Ｈ、アルキル、またはハロである。Ｎ含有環式基は、飽和されているまたは不飽和である（芳香族を含む）ことがあり、５個～１５個の原子、例えば、５個～１４個の原子、または５個～１０個の原子、または５個～８個の原子を含み得る。一部の実施態様では、Ｎ含有環式基は、１つまたは複数の置換基、
例えば、ハロ、ヘテロ脂肪族、または脂肪族から選択される置換基を、さらに含む。特定の実施態様では、Ｎ含有環式基は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －、または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ２ －に複素環中の窒素原子を介して結合している。例示的なＮ含有環式基は、１または２個の窒素原子を含み、別のヘテロ原子、例えば、ＳまたはＯ原子を含み得る。好適なＮ含有環式基としては、アクリジニル基（または他のＧ４スタッキング化合物、例えば、ＢＲＡＣＯ－１９など）、ヘキサヒドロアゼピニル基、ピペラジニル基、モルホリノ基、およびピペリジニル基が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施態様では、Ｒ ｂ は、－Ｎ（Ｒ ｃ ） ２ または－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ ｃ ） ２ であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈもしくはアルキル、例えば、ＨもしくはＣ １ ～Ｃ ３ アルキル；またはアクリジニル基、例えば、アクリジンＩＣＲ １９１、９－アミノアクリジン、アクリジンＣｌ、もしくはアクリジンＮＨ ２ である。そのようなアクリジニル基を含む実施態様では、化合物は、非標準Ｇ４結合構成要素およびＧ４スタッカー構成要素を含む、２つのＧ４応答性基を含む、「二価」化合物であり得る。非標準Ｇ４結合構成要素は、環Ａ、環Ｂおよび／またはＲ ３ 保有フェニル環を含む、化合物の部分を含み、Ｇ４スタッカー構成要素は、アクリジニル基を含む。
Figure 2024522183000242
二価化合物の一部の実施態様では、二価化合物は、式ＩＶによる構造：
Figure 2024522183000243
 （式中、Ｒ ｂ は、Ｇ４スタッカー基、例えば、芳香族基（例えば、アクリジニル基）であり；リンカー基は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －、または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ｓ －であり、ここで、Ｒ ａ 、ｍ、ｒおよびｓの各々は、本明細書中で述べられる、例えば、式Ｉおよび／または式ＩＩについて与えられる、とおりである）
を有する。
二価化合物の一部の実施態様では、二価化合物は、式Ｖによる構造：
Figure 2024522183000244
 （式中、Ｒ ｂ は、アクリジニル基であり；リンカー基は、－（ＣＨ ２ ） ｍ －または－［（ＣＨ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ｓ －であり、ここで、ｍ、ｒおよびｓの各々は、本明細
書中で述べられる、例えば、式Ｉおよび／または式ＩＩについて与えられる、とおりである）
を有する。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒ １ は、以下のものから選択される：
Figure 2024522183000245
式Ｉ、ＩＡ、ＩＶまたはＶのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒ １ は、以下のものから選択される：
Figure 2024522183000246
式ＩＩのある特定の実施態様では、Ｒ ２ は、ＨまたはＣ １ ～Ｃ ３ アルキルであり、Ｒ １ は、上記実施態様のいずれかに従って定義されたとおりである。ある特定の実施態様では、Ｒ ２ は、Ｈである。
式ＩＩＩのある特定の実施態様では、Ｒ ２ は、Ｈであり、Ｒ ３ は、メトキシであり、Ｒ １ は、上記実施態様のいずれかに従って定義されたとおりである。
式Ｉによるある特定の化合物が表１に示される：
Figure 2024522183000247
Figure 2024522183000248
一部の実施態様では、化合物は、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、またはＢ３８である。ある特定の例
では、化合物は、ＭＹ－８またはＢ３３である。
独立した実施態様では、化合物は、以下：
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；
Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンも、
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンも
含まない、またはこれらではない、またはこれら以外である。
ＩＶ．作製方法
本開示による化合物、例えば、式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶの化合物を作製するための方法の実施態様が、本明細書で開示される。化合物を作製するための代表的な方法は、下記のスキーム２により提供され、このスキームでは、Ｒが、本明細書に記載のＲ １ を表すために使用される。
Figure 2024522183000249
本明細書で開示される化合物実施形態を作製するための代表的な方法が、下記のスキーム３で提供される。
Figure 2024522183000250
 スキーム３に関して、以下の例示的な手順を使用することができる（本明細書中の実施例セクションで説明される試薬量、反応時間、および温度を、一部の実施態様では使用することができる）：
６－ヒドロキシピリダジン－３－カルボン酸、ＥＤＣ・ＨＣｌ、Ｏｘｙｍａ ＰｕｒｅおよびＤＭＦを併せる。反応物を、室温で１０分間、撹拌し、続いて、４－メトキシベンズアミドオキシムを添加する。次いで、反応混合物を１２０℃に加熱し、撹拌する。３時間後、反応混合物を濾過し、ＤＭＦで洗浄する。濾液を収集し、乾燥させて、標的生成物Ｐ１を得る。次いで、ＰＯＣｌ ３ 中のＰ１の溶液を１００℃に加熱し、４時間、撹拌する。反応粗生成物を氷冷水上に注ぎ、１０％ＮａＯＨ溶液で中和する。次いで、混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄する。併せた有機層をＭｇＳＯ ４ で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物をＩＳＣＯフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。次いで、ＥｔＯＨ中のＰ２と３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロパン－１－アミンとＮＨ ４ Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－５を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２とＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンとＮＨ ４ Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－６を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２と３－アミノプロパンアミド塩酸塩とＫ ２ ＣＯ ３ の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－７を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２と３－（１－アゼパニル）－１－プロパンアミンとＮＨ ４ Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－８を得る。次いで、ＭＹ－８をＴＦＡ中で３０分間撹拌して、対応するＴＦＡ塩を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２と２－モルホリノエタン－１－アミンとＮＨ ４ Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフ
ラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－１３を得る；および
ＥｔＯＨ中のＰ２と２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エタン－１－アミンとＮＨ ４ Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－１４を得る。
本明細書で開示される二価化合物を、下記のスキーム４により提供される方法に従って作製することができ、このスキームでは、Ｒが、本明細書に記載のＲ １ を表すために使用される。
Figure 2024522183000251
本明細書で開示される二価化合物実施形態を作製するための代表的な方法が、下記のスキーム５で提供される。
Figure 2024522183000252
 スキーム５に関して、以下の手順が使用され（本明細書中の実施例セクションで説明される試薬量、反応時間、および温度を、一部の実施態様では使用することができる）、Ｒは、本明細書で開示されるある特定のＲ １ 置換基について述べられるようなリンカー－Ｇ４スタッカーモチーフを指す：
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて２と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３３を黄色固体として得る；
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて２と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３３を黄色固体として得る；
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて３と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３４を黄色固体として得る；
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて４と併せる。反応物を加熱し、１１
０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３５を黄色固体として得る；および
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて５と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３８を黄色固体として得る。
代表的な化合物を作製するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例セクションで提供される。
Ｖ．使用方法
細胞における遺伝子および／または遺伝子発現のレベルを調節するための方法の実施態様であって、遺伝子が、ヘアピンＧ４を含む領域などの、非標準Ｇ４を含む少なくとも１つの領域を含む、実施態様が、本明細書で開示される。一部の実施態様では、細胞は、対象にまたは試料（例えば、がん性もしくは非がん性細胞などの、細胞を含有する生体試料）に存在する細胞であり得る。遺伝子および／または遺伝子発現のレベルを調節することは、遺伝子（例えば、ＭＹＣＮまたはＭＹＣ）の発現を減少させること、例えば、遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくはｌｎｃＲＮＡ）、関連タンパク質、またはこれらの組合せ、の蓄積を減少させることを含み得る。方法の一部の実施態様では、遺伝子は、ＭＹＣファミリー（例えば、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＮＯＳ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣなど）、ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＢＲＤ４、および任意の関連癌遺伝子から選択され得る。
一部の実施態様では、方法は、がん（または腫瘍）を有する対象に、本開示による化合物（あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステル）の治療有効量を投与することによって、がん（または腫瘍）を処置するステップを含み得る。他の実施態様では、方法は、細胞を本開示による化合物（あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステル）の有効量と接触させるステップを含み得る。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができる。一部の例では、本開示による化合物は、接触時に細胞に侵入する。一部の実施態様では、方法は、対象または試料を化合物に曝露した後に遺伝子、タンパク質および／またはｌｎｃＲＮＡ発現の減少を検出するステップをさらに含み得る。
特定の実施態様では、細胞におけるＮ－Ｍｙｃのタンパク質発現を減少させるための方法が開示される。方法は、細胞を、開示される化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含み得る。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができる。化合物は、特定の実施態様では非標準Ｇ４構造を含むＧ４核酸領域である、ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４核酸領域に、選択的に結合する。特定の実施態様では、化合物は、遺伝子のＤＮＡにおけるそのような非標準Ｇ４に結合するが、同様にＧ４を含まない遺伝子のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）には結合しない。一部の実施態様では、化合物は、Ｇ４ヘアピンにまたはその付近に選択的に結合する。細胞は、ＭＹＣＮ遺伝子の過剰発現を少なくとも一つには特徴とする細胞であり得る。いくつかの実施態様では、細胞におけるＭＹＣＮ遺伝子の発現は、化合物の非存在下での発現と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、またはさらには少なくとも９０％、低減される。化合物は、細胞の成長および／または増殖も低減させ得る。一部の実施態様では、成長および／または増殖は、化合物の非存在下での成長および／または増殖と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％、低減される。
特定の実施態様では、細胞におけるｃ－Ｍｙｃのタンパク質発現を減少させるための方法が開示される。方法は、細胞を、開示化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含み得る。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができる。化合物は、特定の実施態様では非標準Ｇ４構造を含むＧ４核酸領域である、ＭＹＣ遺伝子におけるＧ４核酸領域に、選択的に結合する。特定の実施態様では、化合物は、遺伝子のＤＮＡにおけるそのような非標準Ｇ４に結合するが、同様にＧ４を含まない遺伝子のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）には結合しない。細胞は、ＭＹＣ遺伝子の過剰発現を少なくとも一つには特徴とする細胞であり得る。いくつかの実施態様では、細胞におけるＭＹＣ遺伝子の発現は、化合物の非存在下での発現と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、またはさらには少なくとも９０％、低減される。化合物は、細胞の成長および／または増殖も低減させ得る。一部の実施態様では、成長および／または増殖は、化合物の非存在下での成長および／または増殖と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％、低減される。
上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、細胞は、対象における腫瘍および／またはがん細胞であり得、方法は、それを必要とする対象に、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルの治療有効量を投与して、腫瘍および／またはがん細胞におけるタンパク質（例えば、Ｎ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｃなど）発現を減少させ、それによって対象におけるがんを処置または予防することによる、対象におけるがんを処置または予防するステップをさらに含み得る。開示される方法による恩恵を受けることができる対象は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。一部の実施態様では、がん細胞は、神経がん細胞または肺がん細胞である。ある特定の実施態様では、がんは、神経芽細胞腫または小細胞肺がんである。一部の実施態様では、対象におけるがんを処置することにより、がん細胞のまたはがん細胞を含む腫瘍の成長および／または増殖が減少される。
がんの処置は、一般に、がんの診断後に、または前駆状態（例えば、異形成、もしくは良性腫瘍発症）の開始後に、開始される。処置をがんの早期に開始することができ、例えば、対象が状態の症状を明示する前に、例えば、ステージＩ診断中に、または異形成が診断されたときに、開始することができる。しかし、処置を、疾患の任意のステージ、例えば、これらに限定されないが、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよびステージＩＶがん中に、開始することができる。一部の例では、処置は、悪性病変またはさらには転移性腫瘍に転換し得る良性腫瘍を有するこれらの対象に投与される。
悪性がんなどの状態の発症後に開始される処置は、状態の１つもしくは複数の症状の重症度を低下させる結果となることがあり、または症状を完全に除去する結果となることがあり、または転移、腫瘍体積および／もしくは腫瘍数を低減させる結果となることがある。一部の例では、腫瘍は、処置後に検出不能になる。本開示の一態様では、転移などの、腫瘍の形成が、遅延、予防または減少される。別の態様では、原発性腫瘍のサイズが、減少される。さらなる態様では、腫瘍の症状が、減少される。さらに別の態様では、腫瘍体積が、減少される。
開示される治療を開始する前に、例えば、対象が腫瘍および／またはがんを有するかどうかを判定するために、対象をスクリーニングすることができる。当技術分野において公知であり、典型的には細胞学的および形態学的評価を含む方法によって、腫瘍の存在を判定することができる。腫瘍は、定着腫瘍であり得る。細胞は、生検から得られる細胞を含めて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏであり得る。腫瘍の存在は、本明細書で提供される方法を使用して腫瘍を処置することができることを示す。一部の実施態様では、Ｎ
－Ｍｙｃ陽性またはｃ－Ｍｙｃ陽性腫瘍を有する対象が、例えば、対象から得られた生体試料中のＮ－Ｍｙｃまたはｃ－Ｍｙｃ発現および／または活性を検出することにより、処置に選択される。
例えば、ＭＹＣＮ遺伝子の上方制御された発現（例えば、対照と比較して、Ｎ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣＮのｍＲＮＡの、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加により検出されるような）を検出することができ、一部の例では定量化することができる。生体試料におけるＭＹＣＮ遺伝子の発現が対照（例えば、正常な非腫瘍試料）と比較される。対照と比べて、生体試料におけるＭＹＣＮ遺伝子の発現の増加（例えば、Ｎ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣＮのｍＲＮＡの、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加）は、Ｎ－Ｍｙｃ陽性腫瘍の存在を示し、その増加を使用して、本明細書で開示される化合物または組成物の１つまたは複数での処置のための対象を選択することができる。例えば、対照と比べて少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％の、またはさらには５００％を超える、被検試料における増加は、対象（例えば、ヒト対象）が、本明細書で開示される薬剤の１つまたは複数での処置に好ましく応答する可能性が高いことを示す。対象におけるＮ－Ｍｙｃ陽性腫瘍（例えば、Ｎ－Ｍｙｃ陽性神経芽細胞腫）を検出および／またはモニターするための好適な方法が主治医により選択され得る。１つの実施態様では、試料は、対象から採取され、Ｎ－Ｍｙｃを発現する細胞の存在がｉｎ ｖｉｔｒｏで評価される。
さらなる追加の実施態様では、ＭＹＣ遺伝子の上方制御された発現（例えば、対照と比較して、ｃ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣのｍＲＮＡの、ｃ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加により検出されるような）を検出することができ、一部の例では定量化することができる。生体試料におけるＭＹＣ遺伝子の発現が対照（例えば、正常な非腫瘍試料）と比較される。対照と比べて、生体試料におけるＭＹＣ遺伝子の発現の増加（例えば、ｃ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣのｍＲＮＡの、ｃ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加）は、ｃ－Ｍｙｃ陽性腫瘍の存在を示し、その増加を使用して、本明細書で開示される化合物または組成物の１つまたは複数での処置のための対象を選択することができる。例えば、対照と比べて少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％の、またはさらには５００％を超える、被検試料における増加は、対象（例えば、ヒト対象）が、本明細書で開示される薬剤の１つまたは複数での処置に好ましく応答する可能性が高いことを示す。対象におけるｃ－Ｍｙｃ陽性腫瘍（例えば、ｃ－Ｍｙｃ陽性神経芽細胞腫）を検出および／またはモニターするための好適な方法が主治医によって選択され得る。１つの実施態様では、試料は、対象から採取され、ｃ－Ｍｙｃを発現する細胞の存在がｉｎ ｖｉｔｒｏで評価される。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる開示化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）の治療有効量を対象に投与して、対象における腫瘍および／またはがんを処置することができる。神経芽細胞腫または小細胞肺がんなどの、腫瘍（単数）または腫瘍（複数）を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある対象を、処置に選択することができる。
本開示の式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－
１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）の投与は、予防または治療のどちらかを目的としたものであり得る。予防的に提供される場合、化合物は、腫瘍および／もしくはがんの最初の発生のまたは以前に処置された腫瘍および／もしくはがんの再発のいずれの症状よりも前に提供される。化合物の予防的投与は、任意の後続の疾患過程を予防または改善するのに役立つ。治療的に提供される場合、化合物は、疾患または感染症の症状の開始時（または直後）に提供される。
一部の例では、式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる開示化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）を対象に投与して、腫瘍および／またはがんの成長または転移を緩徐化または抑制することができる。これらの適用では、化合物（またはその医薬組成物）の治療有効量を、対象に、ＭＹＣＮ遺伝子のＤＮＡ中に存在する非標準Ｇ４などの非標準Ｇ４に結合し、Ｎ－Ｍｙｃ発現を低減させることによって、腫瘍の成長もしくは転移を緩徐化もしくは抑制するのに十分な、または腫瘍の徴候もしくは症状を抑制するのに十分な、量および条件下で、投与することができる。好適な対象の例としては、がんを有すると診断されたまたは有することが疑われる者（例えば、腫瘍を有する対象）、例えば、神経芽細胞腫または小細胞肺がんを有する対象が挙げられる。
一部の例では、式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる開示化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）を対象に投与して、腫瘍および／またはがんの成長または転移を緩徐化または抑制することができる。これらの適用では、化合物（またはその医薬組成物）の治療有効量を、対象に、ＭＹＣ遺伝子のＤＮＡ中に存在する非標準Ｇ４などの非標準Ｇ４に結合し、ｃ－Ｍｙｃ発現を低減させることによって、腫瘍の成長もしくは転移を緩徐化もしくは抑制するのに十分な、または腫瘍の徴候もしくは症状を抑制するのに十分な、量および条件下で、投与することができる。好適な対象の例としては、がんを有すると診断されたまたは有することが疑われる者（例えば、腫瘍を有する対象）が挙げられる。一部の例では、対象は、ＭＹＣＮおよび／またはｃ－ＭＹＣを発現するがんを有する。非限定的な例示的ながんとしては、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性病変、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、副腎癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合型神経膠腫）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽種としても公知）、星状細胞種、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、頭頸部がん、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫ならびに脳転移が挙げられる。がんには、血液（または血行性）がん、例えば、白血病、例えば、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度もしくは高悪性度）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病または脊髄形成異常も含まれる。非限定的な例では、がんは、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、前立腺がん、または小細胞肺がんである。
治療有効量は、疾患の重症度、および対象の全身の健康状態に依存することになる。治
療有効量は、１つもしくは複数の症状の主観的緩和、または臨床医もしくは他の適格な観察者により認められるような客観的に同定可能な改善、どちらかをもたらす量である。１つの実施態様では、治療有効量は、腫瘍成長を抑制するのに必要な量、または腫瘍の徴候もしくは症状を軽減するのに有効な量である。投与される薬剤の治療有効量は、所望の効果および処置される対象によって変わり得る。一部の例では、治療量は、患者の腫瘍負荷を消失もしくは低減させる量、または転移細胞の増殖を予防するもしくは低減させる量である。
化合物の実際の投薬量は、因子、例えば、対象の疾患兆候および特定のステータス（例えば、対象の年齢、サイズ、適応度、症状の程度、感受性因子など）、投与の時間および経路、同時に投与される他の薬物または処置、ならびに対象において所望の活性または生物学的応答を惹起するための化合物の具体的な薬効薬理によって、変わり得る。投薬量レジメンを、最適な予防または治療応答が得られるように調整することができる。治療有効量は、化合物および／または他の生物活性薬剤の任意の毒性または有害副作用より、治療有益効果のほうが臨床的観点で上回る量でもある。本開示の方法および製剤の中の化合物および／または他の生物活性薬剤の治療有効量についての非限定的な範囲は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ体重である。
担当臨床医は、標的部位（例えば、肺または体循環）において所望の濃度を維持するように投薬量を変えることができる。送達方式に基づいて、例えば、静脈内または皮下または筋肉内送達に対して経皮、直腸、経口、肺、骨内または鼻腔内送達に基づいて、より高いまたはより低い濃度を選択することができる。投与される製剤の放出速度、例えば、肺内投与用粉末に対する肺内投与用スプレー剤の放出速度、注射される微粒子製剤または経皮送達製剤に対する持続放出性経口製剤の放出速度などに基づいて、投薬量を調整することもできる。
局所および全身投与を含む任意の投与方法を、開示される治療剤に使用することができる。例えば、局所的、経口、血管内、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、髄腔内および皮下投与を使用することができる。特定の投与方式および投薬レジメンは、症例の詳細（例えば、対象、疾患、罹患している病状、および処置が予防的であるかどうか）を考慮に入れて、担当臨床医により選択されることになる。１つより多くの薬剤または組成物が投与されることになる場合、１つまたは複数の投与経路が使用され得る。一部の実施態様では、投与は、経口、血管内、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、または髄腔内投与である。
予防および治療を目的として、化合物を、対象に、経口経路によりまたは単回ボーラス送達で、長期間にわたって持続的送達（例えば、持続的静脈内送達）によって、または反復投与プロトコール（例えば、１時間に１回、１日１回もしくは週１回の反復投与プロトコール）で、投与することができる。本明細書で示される標的となる疾患または状態に関連する１つまたは複数の症状または検出可能な状態を和らげるために臨床的に有意な結果を生じさせることになる長期予防または処置レジメンの中で反復用量として化合物の治療有効投薬量を提供することができる。これに関連して有効な投薬量の決定は、典型的に、ヒト臨床試験により追跡調査される動物モデル研究に基づくものであり、対象における標的となる疾患症状または状態の出現率または重症度を有意に低下させる投与プロトコールによって導かれる。この点について好適なモデルとしては、例えば、マウス、ラット、トリ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ネコ科動物、非ヒト霊長類、および当技術分野において公知の他の許容される動物モデル対象が挙げられる。あるいは、有効投薬量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを使用して決定することができる。そのようなモデルを使用すると、化合物の治療有効量（例えば、標的となる疾患の１つまたは複数の症状を和らげるのに有効である量
）を投与するための適切な濃度および用量を決定するために、通常の計算および調整しか必要とされない。代替実施態様では、化合物の有効量または有効用量は、治療または診断のどちらかを目的として、本明細書で示される疾患または状態と相関関係がある１つまたは複数の選択された生物活性を簡単に阻害または増強することができる。
一部の実施態様では、開示化合物の局所投与を、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍を発症する傾向があることが疑われる領域に、開示化合物を適用することにより、使用することができる。一部の実施態様では、開示化合物の治療有効量を含む医薬調製物の腫瘍内（または腫瘍付近）持続放出は、有益であり得る。
開示化合物を、正確な投薬量の個別投与に好適な単位剤形で製剤化することができる。加えて、開示化合物を単回投与または複数回投与スケジュールで投与することができる。複数回投与スケジュールは、処置の主要コースが、１回より多くの別個の投与、例えば、１～１０回投与、続いて、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じた後続の時間間隔で施される他の投与によるものであり得る。処置は、数日から数ヶ月、またはさらには数年の期間にわたっての、化合物の１日１回または１日複数回の投与を含み得る。したがって、投薬量レジメンは、少なくとも一部は、処置されることになる対象の特定の要求に基づいて決定されることにもなり、投与実施者の判断に依存することになる。
特定の例では、対象は、開示化合物の１つまたは複数を含む治療用組成物の投与を、連続する少なくとも２日、連続する１０日などの複数連日投薬スケジュールで、例えば、数週間、数ヶ月または数年の期間にわたって受ける。一例では、対象は、組成物の投与を少なくとも３０日、例えば、少なくとも２ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも２４ヶ月、または少なくとも３６ヶ月の期間にわたって受ける。
一部の実施態様では、開示される方法は、開示化合物のまたはそれを含有する組成物の投与と組み合わせて、外科手術、放射線療法、および／または化学療法薬を対象に施すステップを含む。そのような薬剤および処置の方法および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医により決定され得る。追加の薬剤についての調製および投薬スケジュールを、当業者は、製造業者の使用説明書に従って、または実験により決定して、使用することができる。そのような化学療法のための調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service, (1992) Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore,
Mdにも記載されている。
併用療法で使用され得る追加の治療剤の非限定的な例としては、微小管結合剤、ＤＮＡ挿入剤または架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子制御剤、血管新生阻害剤、およびプロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブ）が、挙げられる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置を、単独でまたは組み合わせて使用することができる。例えば、任意の好適な抗がんまたは抗血管新生剤を、本明細書で開示される化合物と組み合わせて投与することができる。そのような薬剤についての方法および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医により決定され得る。
追加の化学療法剤としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチン；代謝拮抗薬、例えば、葉酸
（例えば、メトトレキセート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド、およびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）；細胞傷害／抗腫瘍抗体、例えば、アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレア、およびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、およびトラスツズマブ；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（vemurafinib）、バンデタニブ、およびトレチノインが挙げられるが、これらに限定されない。そのような薬剤についての選択および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医により決定され得る。
併用療法は、相乗作用をもたらし得、相乗的と判明し得る、つまり、活性成分を一緒に使用したときに達成される効果は、化合物を別々に使用した結果として生じる効果の合計より大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）同時に製剤化され、組み合わせられた単位投薬量製剤で同時に投与もしくは送達されたとき；（２）別個の製剤として交互にもしくは並行して送達されたとき；または（３）何らかの他のレジメンにより、達成され得る。交互に送達されるときの相乗効果は、化合物が、逐次的に、例えば、別々の注射器での異なる注射により、投与または送達されたときに達成され得る。一般に、交互の間に、各活性成分の有効投薬量が逐次的に、すなわち順次、投与されるが、併用療法では、２つまたはそれより多くの活性成分の有効投薬量が一緒に投与される。
本開示のいずれの方法の実施態様においても、方法において使用される化合物は、本開示による、ならびに６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；および６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンを含む、任意の化合物であり得る。
ＶＩ．医薬組成物
本開示の別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞
などの、細胞への投与用に調製された医薬組成物であって、本明細書で開示される化合物の１つまたは複数についての治療有効量を含む医薬組成物を含む。開示化合物の治療有効量は、投与経路、対象の種、および処置される対象の身体的特徴に依存することになる。考慮され得る具体的な因子としては、疾患重症度およびステージ、体重、食事、ならびに併用薬物が挙げられる。開示化合物の治療有効量を決定するためのこれらの因子の関連性は、当業者には理解される。
対象への投与のための医薬組成物は、選ばれた分子に加えて、少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される添加剤、例えば、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存薬、界面活性剤などを含み得る。医薬組成物は、１つまたは複数の追加の活性成分、例えば、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤なども含み得る。これらの製剤に有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)には、本明細書で開示される化合物の薬学的送達に好適な組成物および製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、薬学的におよび生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどをビヒクルとして含む、注射可能な流体を通常は含有する。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）のための従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されることになる医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存薬、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
本明細書で開示される医薬組成物は、開示化合物の薬学的に許容される塩および／または溶媒和物から形成されるものを含む。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基および酸から誘導されるものを含む。特定の開示化合物は、酸と酸－塩基塩を形成することができる少なくとも１つの塩基性基を保有する。塩基性基の例としては、アミノおよびイミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。そのような塩基性基と塩を形成することができる無機酸の例としては、鉱酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられるが、これらに限定されない。塩基性基もまた、有機カルボン酸、スルホン酸（ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、スルホン酸（ｓｕｌｆｏ ａｃｉｄ）またはリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏ ａｃｉｄ）またはＮ－置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、２－フェノキシ安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸と、ならびに加えて、アミノ酸、例えばα－アミノ酸と、およびまた、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、４－メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、２－もしくは３－ホスホグリセリン酸塩、グルコース－６－リン酸塩またはＮ－シクロへキシルスルファミン酸（シクラミン酸の形成を伴う）と、または他の酸性有機化合物、例えば、アスコルビン酸と、塩を形成することができる。特に、好適な塩としては、医薬品技術分野において周知の非常に多数の他の酸の中でも、アルカリ金属、例えば、カリウムおよびナトリウム、アルカリ土類金属、例えば、カルシウムおよびマグネシウムから誘導されるものが挙げられる。
ある特定の化合物は、無機または有機塩基と酸－塩基塩を形成することができる少なくとも１つの酸性基を含む。無機塩基から形成される塩の例としては、本開示化合物と、カ
リウムおよびナトリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムをはじめとするアルカリ土類金属などとの、塩が挙げられる。同様に、酸性化合物と有機塩基、例えば、アミン（本明細書で使用される場合、アミンを指す用語は、文脈が、遊離アミンが意図されていることを明確に示す場合を除き、それらの共役酸を含むと理解されたい）との塩が企図され、これらには、塩基性アミノ酸、脂肪族アミン、複素環式アミン、芳香族アミン、ピリジン、グアニジンおよびアミジンと形成される塩が含まれる。脂肪族アミンのうち、非環式脂肪族アミンならびに環式および非環式ジおよびトリアルキルアミンは、開示化合物における使用に特に好適である。加えて、第四級アンモニウム対イオンも使用することができる。
本化合物における使用に好適なアミン塩基（およびそれらの対応するアンモニアイオン）の特定の例としては、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロノナン、ジアザビシクロウンデセン、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、モノ－、ビス－またはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミン、トリ－（２－ヒドロキシエチル）アミンおよびＮ－メチル－Ｄ－グルカミンが挙げられるが、これらに限定されない。「薬理学的に許容される塩」の追加の例については、Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977)を参照されたい。
本明細書で開示される化合物を結晶化することができ、単結晶形態で、または異なる結晶多形の組合せとして、提供することができる。したがって、化合物を、１つまたは複数の物理的形態、例えば、異なる結晶形態、結晶質、液晶または非結晶質（非晶質）形態で、提供することができる。化合物のそのような異なる物理的形態を、例えば、再結晶用の異なる溶媒または異なる溶媒混合物を使用して、調製することができる。あるいはまたは加えて、異なる多形を、例えば、異なる温度で再結晶を行うことにより、および／または再結晶中の冷却速度を変えることにより、調製することができる。多形の存在を、Ｘ線結晶解析により、または一部の場合には別の分光技術、例えば、固相ＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法により、または示差走査熱量測定により、決定することができる。
医薬組成物を様々な粘膜投与方式により対象に投与することができ、これには、経口、直腸、鼻腔内、肺内もしくは経皮送達によりまたは他の表面への局所的送達により投与することが含まれる。必要に応じて、組成物を非粘膜経路により投与することができ、これには、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、髄腔内、脳室内または非経口経路により投与することが含まれる。他の代替実施態様では、化合物を、ｅｘ ｖｉｖｏで、対象が起源である細胞、組織または臓器への直接曝露により、投与することができる。
医薬組成物を製剤化するために、化合物を、様々な薬学的に許容される添加剤、ならびに化合物の分散のための塩基またはビヒクルと、組み合わせることができる。所望される添加剤としては、ｐＨ調節剤、例えば、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０またはＭｉｇｌｙｏｌ ８１２）、溶解増進剤（例えば、シクロデキストリン類およびそれらの誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、および還元剤（例えば、グルタチオン）を含めることができる。当技術分野において周知の多くの他の適するアジュバントの中でも特に、水酸化アルミニウム（例えば、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＩＮ）およびＩＬ－１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）などのアジュバントを、組
成物に含めることができる。組成物が液体である場合、製剤の等張性は、単一の状態と見なされる０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩溶液の等張性を基準にして測定して、通常は、実質的な不可逆的組織損傷を投与部位で誘導しないであろう値に調整される。一般に、溶液の等張性は、約０．３～約３．０、例えば、約０．５～約２．０、または約０．８～約１．７の値に調整される。
化合物を分散させる能力がある親水性化合物と任意の所望の添加剤とを含み得る塩基またはビヒクルに、化合物を分散させることができる。塩基は、ポリカルボン酸またはその塩、無水カルボン酸（例えば、無水マレイン酸）と他のモノマー（例えば、（メタ）アクリル酸メチル、アクリル酸など）とのコポリマー、親水性ビニルポリマー、例えば、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど、ならびに天然ポリマー、例えば、キトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、およびこれらの非毒性金属塩を含むがそれらに限定されない、広範な好適な化合物から選択することができる。多くの場合、生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸－グリコール酸）コポリマーおよびこれらの混合物が、塩基またはビヒクルとして選択される。あるいはまたは加えて、合成脂肪酸エステル、例えば、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステルなどを、ビヒクルとして利用することができる。親水性ポリマーおよび他のビヒクルを単独でまたは組み合わせて使用することができ、増強された構造一体性を、部分的結晶化、イオン結合、架橋などによりビヒクルに賦与することができる。粘膜表面への直接適用のために流体または粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、マイクロスフェアおよびフィルムをはじめとする様々な形態でビヒクルを提供することができる。
化合物を様々な方法に従って塩基またはビヒクルと併せることができ、化合物の放出は、分散、ビヒクルの崩壊、または付随する水チャネル形成により得る。一部の状況では、化合物は、好適なポリマー、例えば２－シアノアクリル酸イソブチル、から調製されたマイクロカプセル（マイクロスフェア）またはナノカプセル（ナノスフェア）（例えば、Michael et al., J. Pharmacy Pharmacol. 43:1-5, 1991を参照されたい）の中に分散され、生体適合性分散媒に分散され、それによって、長期間にわたっての持続送達および生物活性が生じる。
あるいは、本開示の組成物は、生理条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタンおよびオレイン酸トリエタノールアミンなどの物質を、薬学的に許容されるビヒクルとして含有し得る。固体組成物には、従来の非毒性の薬学的に許容されるビヒクルを使用することができ、それらには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
化合物を投与するための医薬組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、または高濃度の活性薬剤に好適な他の秩序構造として、製剤化することもできる。ビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。溶液の適切な流動性を、例えば、コーティング剤、例えばレシチン、の使用により、分散性製剤の場合は所望の粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトールおよびソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが望ましいであろう。化合物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩
およびゼラチンを組成物に含めることにより、もたらすことができる。
ある特定の実施態様では、化合物を、持続放出型製剤で、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物で、投与することができる。これらの組成物を、急速な放出を防ぐことになるビヒクル、例えば、調節放出ビヒクル、例えば、ポリマー、マイクロカプセル化送達系または生体接着性ゲルを用いて、調製することができる。本開示の様々な組成物での長期送達は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを組成物に含めることにより、もたらすことができる。調節放出製剤が望ましい場合、本開示に従って使用することに好適な調節放出結合剤としては、活性薬剤に挿入される、ならびに化合物および／または他の生物活性薬剤を組み込むことができる、任意の生体適合性調節放出材料が挙げられる。非常に多くのそのような材料が、当技術分野において公知である。有用な調節放出結合剤は、送達後に生理条件下で（例えば、粘膜表面で、または体液の存在下で）ゆっくりと代謝される材料である。適切な結合剤としては、持続放出製剤における使用のための当技術分野において周知の生体適合性ポリマーおよびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。このような生体適合性化合物は、周囲組織に対して非毒性かつ不活性であり、有意な有害副作用、例えば、鼻への刺激、免疫応答、炎症などを誘発しない。それらは、同じく生体適合性であり身体から容易に排除される代謝産物へと代謝される。
本開示における使用のための例示的なポリマー材料としては、加水分解性エステル連結を有するコポリマー状およびホモポリマー状ポリエステルから誘導されるポリマーマトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのこれらが、生分解性であること、および毒性のないまたは毒性の低い分解産物をもたらすことは、当技術分野において公知である。例示的なポリマーとしては、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、ポリ（ＤＬ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリ（Ｄ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ならびにポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）が挙げられる。他の有用な生分解性または生体内分解性（bioerodable）ポリマーとしては、ポリ（イプシロン－カプロラクトン）、ポリ（イプシロン－カプロラクトン（aprolactone）－ＣＯ－乳酸）、ポリ（イプシロン．－カプロラクトン－ＣＯ－グリコール酸）、ポリ（ベータ－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル－２－シアノアクリレート（cyanoacrilate））、ヒドロゲル、例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（例えば、Ｌ－ロイシン、グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸など）、ポリ（エステルウレア）、ポリ（２－ヒドロキシエチルＤＬ－アスパルタミド）、ポリアセタールポリマー、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、多糖、およびこれらのコポリマーといったポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。そのような製剤を調製するための多くの方法が、当業者に周知である（例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい）。他の有用な製剤としては、調節放出マイクロカプセル（米国特許第４，６５２，４４１号および同第４，９１７，８９３号）、マイクロカプセルおよび他の製剤の作製に有用な乳酸－グリコール酸コポリマー（米国特許第４，６７７，１９１号および同第４，７２８，７２１号）、ならびに水溶性ペプチドのための持続放出組成物（米国特許第４，６７５，１８９号）が挙げられる。
本開示の医薬組成物は、典型的に、滅菌されたものであり、製造、保管および使用条件下で安定している。滅菌溶液は、必要量の化合物を、必要に応じて、本明細に列挙される成分の１つまたは組合せとともに、適切な溶媒に添合し、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、化合物および／または他の生物活性薬剤を、塩基性分散媒と本明細書に列挙されるものからの他の必要成分とを含有する滅菌ビヒクルに添合することによって、調製される。滅菌粉末の場合、調製方法は、任意の追加の所望成分を加えた化合物の粉末を前以て滅菌濾過されたそれらの溶液から生じさせる、真
空乾燥および凍結乾燥を含む。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、果たすことができる。
本開示は、哺乳動物対象における疾患および他の状態の予防および処置における使用のための、本明細書に記載の医薬組成物、活性成分、および／またはそれらを投与する手段を収容している、キット、包装体および多容器ユニットも含む。診断上の使用のためのキットも提供される。１つの実施態様では、これらのキットは、本明細書に記載される化合物の１つもしくは複数を収容している容器、またはそれらを含有する製剤を含む。一例では、この構成要素は、対象への送達のための医薬の調製の際に製剤化される。化合物は、必要に応じて、大量投薬容器に収容されるか、または単位剤形もしくは多単位剤形に含有される。必要に応じた投薬手段、例えば、肺または鼻腔内スプレーアプリケーターを提供することができる。包装材は、処置の目的および／または包装されている医薬剤を使用することができる方法を示すラベルまたは使用説明書を、必要に応じて含む。
本開示のいずれの組成物の実施態様においても、組成物において使用される化合物の実施態様は、本開示による、ならびに６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；および６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンを含む、任意の化合物であり得る。
ＶＩＩ．代表的な実施態様
式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000253
 （式中、
Ｘ １ 、Ｘ ２ およびＸ ３ の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾー
ル－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルが、本明細書で開示される。
式Ｉによる化合物
Figure 2024522183000254
 （式中、
環Ａは、チオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、および１，３，４－オキサジアゾリル以外の５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書で開示される。
式Ｉによる化合物：
Figure 2024522183000255
 （式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ １ は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、Ｒ ｂ は、窒素含有基であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたはアルキルであり；
各Ｒ ３ は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり；
ｎは、０、１、２、または３であり；
ｘは、０、１、２、３、４、または５である）
であって、ただし、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、またはＭＹ－１２のいずれか１つとして示される構造を含まない
化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書で開示される。
式Ｉによる化合物
Figure 2024522183000256
 （式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ １ は、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ｓ －Ｒ ｂ であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり、ｔは、１、２、３、４、または５であり、ｒは、１、２、３、４、または５であり、ｓは、０または１であり、Ｒ ｂ は、アクリジニル基であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ ４ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）、
あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書で開示される。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000257
 であり、ここで、
Figure 2024522183000258
 により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり；
Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒ ｃ ）であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒ ｃ ）以外である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000259
 である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000260
 である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ｂは、
Figure 2024522183000261
 であり、ここで、
Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ の各々は、独立して、ＮまたはＣ（Ｒ ｃ ）であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ のうちの少なくとも２つは、Ｎである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ｂは、
Figure 2024522183000262
 である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ｂは、
Figure 2024522183000263
 である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、（ｉ）ｘは、１、２、もしくは３である；または（ｉｉ）１つのＲ ３ は、環Ａに対してパラ位にある；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、ｎは、０である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、各Ｒ ３ は、独立して、Ｃ １ ～Ｃ ３ アルコキシまたはヒドロキシである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、ｘは、１であり、Ｒ ３ は、メトキシである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式ＩＩによる構造：
Figure 2024522183000264
 を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ ２ は、Ｈである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式ＩＩＩによる構造：
Figure 2024522183000265
 を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ １ は、－（ＣＨ ２ ） ｍ －Ｒ ｂ である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、ｍは、２または３である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ ｂ は、Ｎ含有環式基－Ｎ（Ｒ ｃ ） ２ 、または－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ ｃ ） ２ であり、ここで、各Ｒ ｃ は、Ｈまたはアルキルである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ １ は、
Figure 2024522183000266
 である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、
Figure 2024522183000267
 である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式ＩＶによる構造：
Figure 2024522183000268
 （式中、リンカーは、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＲ ａ ２ ） ｓ －であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４、または５であり；ｓは、０または１である）
を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式Ｖによる構造：
Figure 2024522183000269
 （式中、リンカーは、－（ＣＨ ２ ） ｍ －または－［（ＣＨ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＨ ２ ） ｓ －であり、ここで、ｍは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４、または５であり；ｓは、０または１である）
を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ １ は、
Figure 2024522183000270
Figure 2024522183000271
 である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、
Figure 2024522183000272
 である。
上記の代表的な実施態様のいずれかまたは全てによる化合物と少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物も、本明細書で開示される。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、医薬組成物は、化合物の治療量の単位剤形を含む。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、医薬組成物は、抗がん剤をさらに含む。
細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させる方法であって、細胞を、式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000273
 （式中、
Ｘ １ 、Ｘ ２ およびＸ ３ の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップ
を含む方法も、本明細書で開示される。
細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させる方法であって、細胞を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに関する上に列挙された代表的な実施態様のいずれかまたは全てによる化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含む方法も、開示される。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、
（ｉ）環Ａは、
Figure 2024522183000274
 であり、ここで、
Figure 2024522183000275
 により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒ ｃ ）であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈまたはアルキルであり、ただし、Ｘ １ 、Ｘ ２ 、およびＸ ３ のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒ ｃ ）以外である；または
（ｉｉ）環Ｂは、
Figure 2024522183000276
 であり、ここで、Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ の各々は、独立して、ＮまたはＣ（Ｒ ｃ ）であり、ここで、Ｒ ｃ は、Ｈまたはアルキルであり、ただし、Ｙ １ 、Ｙ ２ 、Ｙ ３ 、およびＹ ４ のうちの少なくとも２つは、Ｎである；または
（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、
（ｉ）環Ａは、
Figure 2024522183000277
 である；または
（ｉｉ）環Ｂは、
Figure 2024522183000278
 である；または
（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、
（ｉ）Ｒ ２ は、Ｈである；または
（ｉｉ）Ｒ ３ は、Ｃ １ ～Ｃ ３ アルコキシもしくはヒドロキシである；または
（ｉｉｉ）ｘは、１、２、もしくは３である；または
（ｉｖ）１つのＲ ３ は、環Ａに対してパラ位にある；
（ｖ）ｎは、０である；または
（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）の任意の組合せである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶのいずれか１つによる構造：
Figure 2024522183000279
 （式中、式ＶＩおよびＶについて、リンカーは、－（ＣＲ ａ ２ ） ｍ －または－［（ＣＲ ａ ２ ） ｍ Ｏ］ ｒ －（ＣＲ ａ ２ ） ｓ －であり、ここで、各Ｒ ａ は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４、または５であり；ｓは、０または１である）
を有する。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、
Figure 2024522183000280
 である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、
Figure 2024522183000281
Figure 2024522183000282
 である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、
Figure 2024522183000283
 である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させることは、細胞の成長および／または増殖を減少させる。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、ＭＹＣＮ遺伝子の過剰発現を伴う細胞である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、ＭＹＣＮ遺伝子における非標準Ｇ４四重鎖核酸領域に選択的に結合する。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、非標準Ｇ４四重鎖核酸領域は、ヘアピン構造を含む。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、対象におけるがん細胞であり、方法は、それを必要とする対象に、化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルの治療有効量を投与してがん細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させ、それによって対象におけるがんを処置または予防するステップを含む、対象におけ
るがんを処置または予防するステップをさらに含む。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、がん細胞は、神経がん細胞または肺がん細胞である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、がんは、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、前立腺がん、または小細胞肺がんである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、がんを処置するステップは、腫瘍体積を減少させること、転移の数もしくはサイズを減少させること、またはがんの症状を和らげることを含む。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、方法は、追加の抗がん剤の治療有効量を対象に投与するステップをさらに含む。
細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させるための、式ＩＡによる化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、細胞を、式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000284
 （式中、
Ｘ １ 、Ｘ ２ およびＸ ３ の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物の有効量と接触させることを含む使用も開示される。
細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させるための、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、細胞を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物の有効量と接触させることを含む使用が、さらに開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための、式ＩＡによる化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、化合物が、式ＩＡによる構造：
Figure 2024522183000285
 （式中、
Ｘ １ 、Ｘ ２ およびＸ ３ の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
を有し、ただし、化合物が、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない、
使用も開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、化合物が、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による構造を有する、使用も開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための医薬の製造における、式ＩＡによる化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステル
の使用であって、化合物が、式ＩＡによる構造
Figure 2024522183000286
 （式中、
Ｘ １ 、Ｘ ２ およびＸ ３ の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ １ は、－（リンカー） ｔ －Ｒ ｂ であり、ここで、Ｒ ｂ は、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ ２ は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ ３ は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
を有し、ただし、化合物が、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない、
使用も開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための医薬の製造における、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、化合物が、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による構造を有する、使用が、さらに開示される。
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、ある特定の実施態様の特定の特徴を説明するために提供されるものであり、請求項の範囲を、例示されるそれらの特徴に限定すべきでない。
材料および方法
標識されているまたはされていないＭＹＣＮ Ｇ４オリゴヌクレオチド（５’－ＡＧＧ
ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧＧ
Ｔ－３’、配列番号７）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。結合特異性研究に使用したＤＮＡ／ＲＮＡ試料の他の配列を図１～２に要約
する：
結合検証のためのヒット化合物をＣｈｅｍＤｉｖおよびＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅから購入した。化合物ＭＹ－１の類似体を社内で合成したか、または購入した。ＲＮＡ抽出キットＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（＃７４１３４）を、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡから購入した。ｃＤＮＡ合成キットＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ（商標）Ｋｉｔ（＃４３８７４０６）を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから購入した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＹから購入した。抗Ｎ－Ｍｙｃ（Ｂ８．４．Ｂ）：ｓｃ－５３９９３抗体（１：４０００希釈物；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＣＢ）、ＵＳＡ）、抗ＧＡＰＤＨ（０４１１）：ｓｃ－４７７２４抗体（１：２０００希釈物；ＳＣＢ、ＵＳＡ）、およびヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ：ｓｃ－２００５抗体（１：１０００希釈物；ＳＣＢ、ＵＳＡ）を、免疫ブロットに使用した。
一般的化学法。全ての化学試薬を商業供給業者から入手し、さらに精製せずに使用した。これらの実施例では、ＳＡＲ研究のための化合物は、ＣｈｅｍＤｉｖから購入した（ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－３、ＭＹ－４、ＭＹ－９、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２）か、研究室で合成した（ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４）。減圧下でＢｕｃｈｉロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標） Ｒｆ自動クロマトグラフィーシステムを使用して行った。 １ Ｈおよび １３ Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ分光計によってそれぞれ５００ＭＨｚまたは１２５ＭＨｚで記録した。それを、重水素化溶媒シグナルと比較して報告する。 １ Ｈ ＮＭＲスペクトルのデータは、次のように報告する：化学シフト（δｐｐｍ）、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｑｕｉｎ＝五重線 ｍ＝多重線）、結合定数（Ｈｚ）、および積分値。 １３ Ｃ ＮＭＲスペクトルのデータは、化学シフトに関して報告する。
高分解能質量分析データは、二重電子スプレー源を装備したＡｇｉｌｅｎｔ ６５２０
Ａｃｃｕｒａｔｅ－Ｍａｓｓ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって、陽イオンモードで動作させて、取得した。分離は、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ；粒径５μｍ）で行った。０．１％ギ酸を含有する、水／アセトニトリル勾配を使用して、被分析物を溶離させた。データを高分解能（１，７００ｍ／ｚ）、４ＧＨｚで取得した。実行時間中に質量精度を維持するために、内部質量較正試料をＬＣ／ＭＳ実行中に継続的に注入した。データの取得および解析は、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬＣＭＳ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（バージョンＢ．０６．０１）およびＱｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（バージョンＢ．０７．００）を使用して行った。
小分子マイクロアレイスクリーニング。小分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）を２Ｄエポキシスライドガラス（Ｓｃｈｏｔｔ）上に作成した。手短に述べると、ＣｈｅｍＤｉｖおよびＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅライブラリーからの約１５，０００の化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）、ならびに対照色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７および４８８、ＤＭＳＯ中１０μＭ）を、３８４ウェルプレート（Ａｒｒａｙｊｅｔ Ｊｅｔｓｔａｒ（商標））の中に用意した。化合物の各々を、二連ブロックに、Ａｒｒａｙｊｅｔロボットマイクロアレイプリンターによりプリントした。プリントした後、スライドガラスを固定化のためにアレイヤーにて一晩インキュベートし、その後、２４時間の真空乾燥を行った。未反応のエポキシ基を失活させるために、スライドを１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）中
で２時間インキュベートし、次いで、ＤＭＦおよびｄｄＨ ２ Ｏで入念にすすぎ、その後、Ｎ ２ 乾燥を行った。
目的の標的に対するスクリーニングを始めるために、５’Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を、先ず、アニーリング用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ）中、１０μＭ濃度で調製した。ＤＮＡ試料を、加熱ブロックにて９５℃で５分間インキュベートし、次いで、１時間より長い時間をかけてゆっくりと室温に冷却した。次いで、折り畳まれたＤＮＡをスクリーニング用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）に添加して５０ｎＭの最終濃度に対応するように希釈した。ＳＭＭスライドを４ウェルスライドホルダーに入れ、３ｍＬの１０×ｔＲＮＡ（スクリーニング用緩衝液中５００ｎＭ）とともに２時間インキュベートした。次いで、スライドをスクリーニング用緩衝液によって注意深く洗浄し、３ｍＬのＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ溶液（１０×ｔＲＮＡを含む）とともにさらに２時間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを５０ｍＬコニカルチューブに移し、ＰＢＳＴおよびｄｄＨ ２ Ｏによって３回、各緩衝溶液中で穏やかに洗浄した。次いで、スライドを１，７００ｇでの２分間の遠心分離によって乾燥させた。最後に、ＳＭＭを有するスライドを蛍光スキャナー（ＩｎｎｏＳｃａｎ １１００ ＡＬ）によって６４７ｎｍで、５μｍの分解能で画像化した。各スポットの蛍光強度をＩｎｎｏｐｓｙｓ Ｍａｐｉｘソフトウェアによって定量化し、以前に報告された基準（Connelly et al., ACS Chemical Biology 2017, 12:435-443；Connelly et al., Nature Communications
2019, 10:1501）に基づいてヒットを同定した。ヒットを同定するために、スクリーニング用緩衝液としかインキュベートしていない別のスライドも試験し、同じ方法を使用して陰性対照として画像化した。
蛍光強度アッセイ。本開示では、蛍光強度アッセイ（ＦＩＡ）を、単一用量でのヒット結合の検証と、結合親和性決定の両方に使用した。ＳＭＭスクリーニングからのヒット化合物を検証するために、各化合物の１００μＭ溶液を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、黒壁透明底）において三連で調製し、それによって５％ＤＭＳＯ濃度を得た。５’Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを上で説明したようにアニールし、次いで、ウェルプレートに添加し、それによって１００ｎＭの最終濃度を得た。プレートを３０分間、振盪しながらインキュベートし、その後、５００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。次いで、蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙ Ｍｘマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）によってＥｘ
６４９ｎｍ／Ｅｍ ６７０ｎｍで測定した。ＴＭＰｙＰ４／ＤＭＳＯをそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。ある特定の例では、陰性対照（ＤＭＳＯ溶液）と比較して蛍光強度の＞１０％変化である変化が観察された場合、化合物を結合剤と見なした。結合親和性測定のために、小分子溶液をＤＭＳＯ中の段階希釈物として調製した。次いで、最終試験プレートを、５μＬの小分子溶液および１０μＬのアニールされたＤＮＡ試料を８５μＬの緩衝溶液に添加することにより調製し、それによって０～２５０μＭの最終小分子濃度（５％最終ＤＭＳＯ濃度）を得た。蛍光強度を正規化し、結合親和性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアにおいてｏｎｅ－ｓｉｔｅ ｔｏｔａｌモデルを使用する曲線当てはめにより計算した。３’標識オリゴヌクレオチドを使用する蛍光滴定も同じように行った。
蛍光変位アッセイ。蛍光変位アッセイを、２つの古典的副溝結合剤（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびネトロプシン）を使用することにより行った。フルオロフォアとしてのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ）中５μＭ濃度で調製し、次いで、異なる濃度の非標識ＭＹＣＮ Ｇ４オリゴヌクレオチドで滴定した。変位のために、化合物ＭＹ－１またはネトロプシンのどちらかを溶液に添加し、それによって５μＭまたは５０μＭの最終濃度を得た。蛍光シグナルを３５２ｎｍの励起波長および５００ｎｍの発光波長で得た。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析。ＳＰＲ結合アッセイを、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器を用いて行った。ＣＭ５ ＳＰＲバイオチップをシステムにロードし、５μＬ／分の流速で泳動用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、５％ＤＭＳＯ）を用いてプライミングした。次いで、フローセル（Ｆｃ）１および２両方を１５分間、ＥＤＣ／ＮＨＳ（０．４Ｍ／０．１Ｍ）水溶液によって活性化し、その後、３０分にわたってストレプトアビジン（ＳＡ）溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中の０．２ｍｇ／ｍＬ）の注入を行った。ＳＡの固定化量が８，０００～１０，０００ＲＵに達した後、１０分間、１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）を流すことによって表面を不活性化し、２分間、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて再生して、未結合ＳＡを除去した。その一方で、ビオチン化ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡをアニーリング用緩衝液中５μＭで調製し、５分間、９５℃まで加熱し、ゆっくりと冷却した。アニーリング後、合計１５０μＬの溶液を３０分にわたってＳＰＲシステムのＦｃ ２に注入してＤＮＡをチップ表面に固定化した。ベースラインが安定したら、小分子溶液を試験した。
結合シグナルはもちろん結合親和性も検出するために、より速い流動速度（２５μＬ／分）をＦｃ １（リファレンス）とＦｃ ２（ＤＮＡ）の両方に使用した。化合物溶液の各々を、ＤＭＳＯ中の２０×設計濃度で調製し、次いで、非ＤＭＳＯ泳動用緩衝液に添加して希釈し、それによって５％ＤＭＳＯの最終濃度を得た。次いで、合計５０μＬの化合物溶液を会合のために１２０秒にわたってＦｃ １～２流路に注入し、続いて、解離のために緩衝液を２００秒流した。５０μＬの再生用緩衝液（１Ｍ ＫＣｌ）の注入を必要に応じて２つの試料間に行うことができた。リファレンスを引くことによって、最終結合曲線を得た。結合親和性（Ｋ Ｄ ）を決定するために、一連の希釈化合物溶液を注入し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりラングミュア１：１結合モデルを使用してＫ Ｄ を計算した。
円偏光二色性（ＣＤ）特徴付けおよび熱融解アッセイ。折り畳みＧ四重鎖構造を、Ｊ－１５００円偏光二色性分光計（Ｊａｓｃｏ）を使用して円偏光二色性により特徴付けた。非標識ＭＹＣＮオリゴヌクレオチド（５’－ＡＧＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧＧ Ｔ－３’、配列番号７）を、アニーリング用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ）中、５μＭ濃度で調製した。対比として、Ｌｉ ＋ 含有緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＬｉＣｌ）およびＨ ２ Ｏで希釈したＤＮＡ試料も、陰性対照として使用した。アニーリング手順は、上述の手順と同じであった。ＣＤスペクトルを３２０ｎｍ～２００ｎｍで、２５℃で、１ステップ１ｎｍで記録した。各スペクトルを、３つの反復測定試料のシグナルを平均することにより得た。
熱融解アッセイのために、ＭＹＣＮオリゴヌクレオチドを、低ＫＣｌ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ）中５μＭ濃度で調製した。安定化効果を試験するために、Ｇ４試料を２０μＭの化合物（５％ＤＭＳＯを含有する最終溶液）とともにおよびなしでインキュベートした。次いで、合計３００μＬの溶液をキュベットに添加し、ＣＤ分光計内で、１℃間隔で、２０℃から９５℃へ加熱した。融解温度（Ｔｍ）を計算するために、２６３ｎｍでＣＤスペクトルのピークを追跡し、温度に対して偏光解析をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアにて可変勾配を用いて非線形シグモイド用量応答モデルを使用して当てはめた。融解温度のシフト（ΔＴ ｍ ）を、Ｔ ｍ （化合物）－Ｔ ｍ （ＤＭＳＯ）を使用して計算した。
２－アミノプリン（２－ＡＰ）蛍光滴定。２－アミノプリン標識化に基づく蛍光滴定を、以前に報告されたプロトコールを使用して行った。手短に述べると、Ａ１１位またはＡ
１８位のどちらかに２－ＡＰ置換を有するＭＹＣＮ Ｇ４オリゴヌクレオチドを、９５℃への５分間の試料の加熱およびＲＴへの緩徐な冷却によりアニールした。折り畳み構造を有するオリゴヌクレオチドをＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中１０μＭに希釈し、黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において三連で設計どおりに調製した。小分子をＤＭＳＯで希釈して、０．１～５ｍＭの範囲にわたる濃度を有する一連の溶液を得、次いで、２０倍希釈し、プレートに添加した（５％ＤＭＳＯ最終濃度）。ウェルプレートにおける２－ＡＰ ＤＮＡの最終濃度は１μＭであった。バックグラウンド蛍光を得るために、ＤＮＡを含有しない小分子溶液も同じプレート内に調製した。３０分間のＲＴでのインキュベーション後、プレートを短時間、遠心分離し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｍｘマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）においてＥｘ ３１０ｎｍ／Ｅｍ ３６５ｎｍでスキャンした。リファレンスを引いた後に三連ウェルにおける強度を平均することにより、蛍光シグナルを計算した。最後に、結合シグナルを正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアにて可変勾配を用いて非線形シグモイド用量応答モデルを使用して曲線に当てはめることによりＫ Ｄ 値を決定した。
ジョブプロット解析。結合の化学量論比を決定するために、溶液中の化合物の分率を変化させることによる連続変化法を使用した（Renny et al., Angewandte Chemie 2013, 52:11998-12013）。手短に述べると、５μＭのアニールされたＡ１１ ２－ＡＰ標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料および５μＭの化合物のストック溶液（５％ＤＭＳＯ含有）をそれぞれ調製した。次いで、２系列の溶液を実験のために９６ウェル黒壁ウェルプレートにて調製した：一方は、総濃度を一定（５μＭ）に保ちながらＤＮＡ試料を化合物ストックと混合することにより小分子の分率を変え、他方は、緩衝液で希釈してＤＮＡ試料の濃度を変え、それによってリファレンスとしての試料の軌跡を得た。スキャン後、２系列の溶液間の蛍光強度の差を計算して、ジョブプロットを生成する。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアを使用して、線形回帰解析を行った。
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）。ＭＳＴ実験をＭｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５システム（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって行った。３’－Ｃｙ５ ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ
ＫＣｌ、０．００５％Ｔ２０中で調製し、アニールし（上述の方法に従って）、１００ｎＭに希釈した（２×）。小分子のＤＭＳＯ溶液を緩衝液中で段階１：１希釈によって調製し、それによって２×の設計濃度（１０％ＤＭＳＯ）を得た。次いで、ＤＮＡ試料を対応する小分子溶液と１：１（ｖ／ｖ）混合し、それによって５０ｎＭ ＤＮＡおよび５％ＤＭＳＯを得た。最後に、ＭＳＴシグナルを３連キャピラリーにて検出し、ｓｉｎｇｌｅ－ｓｉｔｅモデル（ＭＯ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．３）を使用して曲線に当てはめることにより解離定数を決定した。
ＤＭＳフットプリンティング。５’Ｃｙ５標識ＤＮＡのフットプリンティングを、文献（Zhang et al., JACS 2014, 136:1381-1390；Li et al., PNAS 2015, 112:14581-14586）に記載されているように行った。ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を、適切な緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔ２０）中で、５μＭ濃度で調製し、その後、上述の方法を使用してアニーリングを行った。次いで、ＤＮＡ溶液を対応する緩衝液中５０ｎＭに希釈し（各管における最終体積２ｍＬ）、化合物ストック溶液（ＤＭＳＯ中）を添加し、それによって設計濃度を有する溶液（結果として５％ＤＭＳＯとなる）を得た。３０分間のインキュベーション後、折り畳まれたＤＮＡの試料を０．５％ＤＭＳで１０分間、ＲＴで処理し、２００μＬの停止用緩衝液（２．５Ｍ
ＮＨ ４ ＯＡｃ、０．１Ｍ β－メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍＬのウシ胸腺ＤＮＡ）を添加することにより反応を停止させた。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿の後、ＤＮＡを５０μＬのヌクレアーゼフリー水に溶解
した。同体積の１０％ピペリジンを各管に添加し、混合溶液を９０℃で３０分間、加熱し、その後、氷での急冷を行った。ＤＮＡを再びフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿に付した。沈殿したＤＮＡを１０μＬのヌクレアーゼフリー水に溶解し、９５℃で５分間、変性させ、１７％変性ポリアクリルアミドゲルで分割した。ゲル泳動後、Ｃｙ５標識ＤＮＡ断片をＴｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用してデジタル化した。
細胞系および細胞培養。神経芽細胞腫細胞系ＮＢＥＢ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｐｙ ＭＹＣＮ）細胞を使用して、ＭＹＣＮ／ＭＹＣＮＯｓ Ｇ四重鎖結合分子の有効性を評価した。ＮＢＥＢは、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所、小児腫瘍科、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤにおけるストックからのものであり、ＳＴＳ検証済みであった。細胞を、５％ＣＯ ２ インキュベーターにて、３７℃で、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｔｌａｎｔａ）と、２ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）と、抗生物質（ペニシリン １００μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）とを補足したＲＰＭＩ－１６４０で培養した。
ＮＢＥＢ細胞に対するＧ４結合化合物の効果を調べるために、Ｉｎｃｕｃｙｔｅインターフェース（下で説明する）を使用して生細胞の画像化を行った。ＮＢＥＢ（５Ｋ／ウェル）、細胞を９６ウェルプレートに三連で播種し、様々な濃度（０～４５μＭ）の化合物ＭＹ－８で処理し、対照ウェルが集密に達するまで培養した。ＲＴ－ｑＰＣＲおよびウェスタンブロッティングのために、ＮＢＥＢ（３００Ｋ）細胞を６ウェル皿にて４８時間、ＭＹ－８で処理した。ＭＹＣＮＯｓ発現の時間依存的減少を調べるために、細胞を２２．５μＭおよび４５μＭのＭＹ－８で処理し、様々な時点（０、４、２４、４８、７２および９６時間）で解析した。細胞生存率を検証するために、処置の４８時間および９６時間後にトリパンブルー排除試験を行い、血球計数器を使用して生細胞の死細胞に対する割合を計算した。
細胞生存。生細胞の画像解析後、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム内塩アッセイを行って、細胞生存を調べた。（ＭＴＳ：内塩アッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａｍｅｒｉｃａ）。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ－ＲＡＤ、Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて４９０ｎｍの波長で測定した。生存細胞の割合を計算するために、ＭＹ－８処理細胞を各群からの対照試料で割った。
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞画像化システム。生細胞画像化を、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）からのＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。Ｉｎｃｕｃｙｔｅは、ＮＢＥＢ ＮＢ細胞についての予め定義されたプロセシング定義を基に細胞集密度を測定した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは、ウェルごとに３つの位相差画像を、処置継続期間（０～１２０時間）にわたって６時間ごとにスキャンした。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ。全ＲＮＡを、ＮＢＥＢ細胞から、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（＃７４１３４）（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）に従って抽出した。ｃＤＮＡ合成Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ（商標）Ｋｉｔを使用して、ＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者のプロトコールに従って使用して、定量的ＰＣＲを行った。ベータ－アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。２（－ΔＣ ｔ ）法を使用して、相対発現を計算した。ｑＰＣＲプライマ
ー配列は、補足資料において見つけることができる。
タンパク質アッセイ。６ウェルプレートにおけるＭＹ－８処理の４８時間後、放射性免疫沈降アッセイ用緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｃｈｉｎａ）が入っているプレートにて単一コピーＭＹＣＮ細胞を直接溶解し、ペレット化し、－８０℃で冷却した。細胞接着不良のため、ＮＢＥＢ細胞を１．５ｍＬ微量遠心管に収集し、リン酸緩衝溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で２回、洗浄し、ペレット化し、－８０℃で冷却した。ブラッドフォード試薬（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｃｈｉｎａ）を使用するブラッドフォードアッセイを使用して、総タンパク質濃度を決定した。各タンパク質試料（１０μｇ）を１２％ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）に負荷し、９０Ｖで９０分間、電気泳動し、Ｂｉｏ Ｒａｄ
Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用してニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に転写した。ニトロセルロース膜を、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０を補足したＴｒｉｓ緩衝食塩水中５％ミルク中で１時間、室温でインキュベートし、抗Ｎ－Ｍｙｃ：ｓｃ－５３９９３（１：４０００）および抗ＧＡＰＤＨ：ｓｃ－４７７２４（１：２０００）抗体とともに一晩、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０を補足したＴｒｉｓ緩衝食塩水で膜を洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウス（１：１０００）抗体でプローブし、１時間、室温でインキュベートした。ＣｈｅｍｉＤｏｃゲル画像化システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてＣｌａｒｉｔｙ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）またはＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、化学発光シグナルを検出した。
バイオインフォマティクス研究。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＳＥ６３８７４）から実験Ｇ４データに関する２つのファイル（ファイル名「Ｎａ＿Ｋ＿ＰＤＳ＿ｍｉｎｕｓ＿ｈｉｔｓ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ．ｂｅｄ．ｇｚ」および「Ｎａ＿Ｋ＿ＰＤＳ＿ｐｌｕｓ＿ｈｉｔｓ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ．ｂｅｄ．ｇｚ」）（１）をダウンロードした。ｂｅｄｔｏｏｌｓのｇｅｔｆａｓｔａ（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ２．３０．０）（２）を使用してＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）参照ゲノムからｂｅｄファイルのゲノム配列を抽出した。「Ｎａ＿Ｋ＿ＰＤＳ＿ｐｌｕｓ＿ｈｉｔｓ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ．ｂｅｄ」位置の場合、ゲノムアセンブリのマイナス鎖上に存在するＧ４配列のため、相補鎖配列を抽出した。抽出された固有のＯＱから正規表現式：（（Ｇ ３～６ （Ｎ １～３３ ） ３ Ｇ ３～６ ）を使用してＧ４形成配列を同定した。
次いで、Ｇ４配列内のヘアピン形成ループの可能性を計算した。ＵＮＡＦｏｌｄ ４．０を使用して、Ｇ４における長さ３ｎｔの２つのＧトラクトと隣接している配列からのヘアピン形成を計算した。ＵＮＡＦｏｌｄを、「ｈｙｂｒｉｄ－ｓｓ－ｍｉｎ －－ＮＡ ＤＮＡ」設定を使用して実行して、３７℃でＤＮＡエネルギー則に従って一本鎖を形成する各ｎｔ位置の確率を出力した（３）。それらのヌクレオチドの５０％より多くが塩基対合している配列を、ヘアピン形成配列として同定した。次いで、ヘアピン形成Ｇ４を同定し、それらを抽出したＯＱに遡った。次いで、Ｇ４ヘアピン含有ＯＱの座標を、ＵＣＳＣ
Ｌｉｆｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓツール（ｌｉｆｔＯｖｅｒ）（４）を使用してＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８）座標に変換した。
得られたｈｇ３８座標にＧＥＮＣＯＤＥ、ｈｇ３８バージョン３６包括的遺伝子アノテーションＧＦＦ３ファイル（５）でアノテーションを付けた。プロモーターも、ＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子のＴＳＳ部位の１０００ｎｔ上流の領域として定義してアノテーションに加えた。Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｏｏｌｓパッケージ（ｇｅｎｏｍｅｔｏｏｌｓ １．６．１）「
ｇｔ ｇｆｆ３－ａｄｄｉｎｔｒｏｎｓ」コマンド（６）を使用して、イントロンもＧＥＮＣＯＤＥアノテーションに加えた。ゲノム特徴量とＧＱ－ヘアピン含有ＯＱのオーバーラップを、ｂｅｄｔｏｏｌｓ交差コマンドを使用して同定した。述べたソフトウェアパッケージにより行わなかった演算操作にはＰｙｔｈｏｎ ３．８を使用した。
ｑＰＣＲ実験。ｑＰＣＲ実験のためのプライマー配列を次のとおり列挙する：
ＭＹＣＮＯｓ－０１（ＥＮＳＴ０００００６４１２６３．１－１，３１３，ｂｐｓ）
センス ５’－ＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＡ ３’、配列番号１０
アンチセンス ５’ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣ３’、配列番号１１
ＭＹＣＮＯｓ－０２（ＥＮＳＴ０００００４１９０８３．５－７７０ｂｐｓ）
センス ５’ＣＴＣＡＣＧＡＧＣＡＣＧＣＡＧＡＣＡＡＣ ３’、配列番号１２
アンチセンス ５’ＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＴ ３’、配列番号１３ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム１（ＥＮＳＴ０００００２８１０４３．４－４６４ＡＡ）
センス ５’ＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣ ３’、配列番号１４
アンチセンス ５’ＣＡＣＡＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧ ３’、配列番号１５ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム２（ＥＮＳＴ０００００６３８４１７．１－２５３ＡＡ）
センス ５’ＴＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡ ３’、配列番号１６
アンチセンス ５’ＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＴＴＴ ３’、配列番号１７
化合物合成－一価化合物
Figure 2024522183000287
反応フラスコに、６－ヒドロキシピリダジン－３－カルボン酸（３９２ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５８９ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ）、Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ（４３８ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（８ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で１０分間、撹拌し、続いて４－メトキシベンズアミドオキシム（６０５ｍｇ、３．６４ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を１２０℃に加熱し、撹拌した。３時間後、反応混合物を濾過し、ＤＭＦ（３ｍＬ×３）で洗浄した。濾液を収集し、乾燥させて、標的生成物Ｐ１（３４４ｍｇ、４６％）を得た。 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): δ 13.85 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 8.04-8.01 (m, 2H), 7.17-7.14
(m, 1H), 7.12 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H); 13 C NMR (125 M
Hz, DMSO-d 6 ): δ 171.2, 167.9, 162.0, 160.3, 132.4, 131.9, 130.4, 128.9, 118.0, 114.8, 55,5;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ １３ Ｈ １１ Ｎ ４ Ｏ ３ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：２７１．０８２６、実測値：２７１．０８３３。
ＰＯＣｌ ３ （６ｍＬ）中のＰ１（９７０ｍｇ、３．５９ｍｍｏｌ）の溶液を１００℃に加熱し、４時間撹拌した。反応粗生成物を氷冷水上に注ぎ、１０％ＮａＯＨ溶液で中和した。次いで、混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×３）で抽出し、ブラインで洗浄した。併せた有機層をＭｇＳＯ ４ で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。得られた残留物をＩＳＣＯフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、Ｐ２（２４６ｍｇ、７２％）を薄ピンク色の固体として得た。 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.57 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.09-8.06 (m, 2H), 7.19-7.16 (m, 2H), 3.87 (s, 3H); 13 C NMR (125
MHz, DMSO-d 6 ) δ 172.0, 168.3, 162.1, 158.4, 147.1, 130.4, 130.2, 129.0, 117.8, 114,9, 55.5;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ １３ Ｈ １０ ３５ ＣｌＮ ４ Ｏ ２ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：２８９．０４８７、実測値：２８９．０４９３。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中のＰ２（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）と３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロパン－１－アミン（２２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とＮＨ ４ Ｃｌ（４ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－５（１３ｍｇ、４５％）を白色固体として得た。 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.04-8.01 (m, 2H), 7.98
(d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.16-7.13 (m, 2H), 6.98 (d, J
= 9.3 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.50-3.43 (m, 2H), 2.56-2.25 (m, 10H), 2.19 (s, 3H), 1.77 (五重線, J = 7.0 Hz, 2H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 173.4, 167.7, 161.8, 159.4, 138.3, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 55.5, 55.3, 54.6, 52.4, 45.5, 25.7;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ ２１ Ｈ ２８ Ｎ ７ Ｏ ２ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：４１０．２２９９、実測値：４１０．２３０５。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中のＰ２（３０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミン（１８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）とＮＨ ４ Ｃｌ（５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－６（１５ｍｇ、４４％）を白色固体として得た。 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.17-8.14 (m, 1H), 8.05-8.03 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 1H), 7.17-7.14 (m, 2H), 4.08 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.86 (s,
3H), 3.24-3.20 (m, 5H), 2.59-2.58 (m, 3H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 173.3, 167.8, 161.9, 159.6, 138.2, 128.8, 127.8, 118.3, 114.7, 111.8, 55.5, 46.1, 46.0, 36.5, 33.0;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ １７ Ｈ ２１ Ｎ ６ Ｏ ２ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：３４１．１７２１、実測値：３４１．１７２５。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中のＰ２（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）と３－アミノプロパンアミド塩酸塩（１７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とＫ ２ ＣＯ ３ （３７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－７（１２ｍｇ、５０％）を白色固体として得た。 1 H NMR
(500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.04-8.01 (m, 2H), 7.99 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.16-7.13 (m, 2H), 7.01
(d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.88 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.68-3.66 (m, 2H), 2.45 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 173.4,
172.5, 167.7, 161.8, 159.2, 138.4, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 55.4,
37.3, 34.3;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ １６ Ｈ １７ Ｎ ６ Ｏ ３ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：３４１．１３５７、実測値：３４１．１３５９。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中の２（３２．９１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と３－（１－アゼパニル）－１－プロパンアミン（３６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）とＮＨ ４ Ｃｌ（６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－８（３１ｍｇ、６６％）を白色固体として得た。 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.04-7.99 (m, 4H), 7.16-7.14 (m, 2H), 7.04 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.55-3.54 (m, 2H), 3.15-3.07 (m, 6H), 2.08-2.00 (m, 2H), 1.83-1.77 (m, 4H), 1.67-1.57 (m, 4H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 173.3, 167.8, 161.8, 159.5, 138.6, 128.8, 127.5, 118.4, 114.7, 55.5, 54.4, 53.8, 38.3, 26.0, 23.7, 23.3;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ ２２ Ｈ ２９ Ｎ ６ Ｏ ２ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：４０９．２３４７、実測値：４０９．２３５４。次いで、ＭＹ－８（５ｍｇ）をＴＦＡ（１ｍＬ）中で３０分間撹拌して、対応するＴＦＡ塩を得た。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中の２（３０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と２－モルホリノエタン－１－アミン（１４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）とＮＨ ４ Ｃｌ（５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－１３（２２．５ｍｇ、５９％）を白色固体として得た。 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.05-8.02 (m, 2H), 7.99 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.70 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.17-7.14 (m, 2H), 7.04 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.61-3.58 (m, 6H), 2.56 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.46-2.44 (m, 4H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 173.4, 167.7, 161.8, 138.4, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 66.2, 56.9, 55.4, 53.4, 38.0;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ １９ Ｈ ２３ Ｎ ６ Ｏ ３ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：３８３．１８２６、実測値：３８３．１８３１。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中の２（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）と２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エタン－１－アミン（２０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とＮＨ ４ Ｃｌ（４ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－１４（１６ｍｇ、５８％）を白色固体として得た。 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.04-8.02 (m, 2H), 7.99 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.16-7.14 (m, 2H),
7.03 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.62-3.56 (m, 2H), 2.56 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.46-2.26 (m, 8H), 2.17 (s, 3H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 173.4, 167.7, 161.8, 138.4, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 56.4, 55.4, 54.6, 52.6, 38.3;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ ２０ Ｈ ２６ Ｎ ７ Ｏ ２ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋ のｍ／ｚ計算値：３９６．２１４２、実測値：３９６．２１４１。
化合物合成－二価化合物
本明細書で開示する二価化合物を下記のスキーム５に従って作製した。
Figure 2024522183000288
二価化合物のＲ １ 基（上記のスキーム５では「Ｒ」と呼ばれる）を、下記のスキーム６に示すように作製し、次いで、同じく下記の条件を使用してスキーム５における化合物７と併せた。
Figure 2024522183000289
Ｎ １ －（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）エタン－１，２－ジアミン（１）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（methoxycridine）（９９．２ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（３３．６ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ、１当量）および１，２－ジアミノエタン（２１４ｍｇ、３．５７ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して６６．３ｍｇ（６２％）の１を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 8.47 (dd, J = 9.5, 2.6 Hz, 1H), 7.86 (q, J
= 2.9, 2.4 Hz, 2H), 7.81 (dd, J = 9.3, 2.0 Hz, 1H), 7.74 - 7.67
(m, 1H), 7.54 (dt, J = 9.3, 2.1 Hz, 1H), 4.52 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.03 (d, J = 2.0 Hz, 3H), 3.58 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 13 C NMR
(126 MHz, CD 3 OD) δ 158.72, 158.55, 142.20, 141.78, 136.27, 129.37, 129.19, 125.48, 121.60, 118.79, 116.08, 111.61, 103.92, 56.75, 47.44, 39.78;ＬＲＭＳ：Ｃ １６ Ｈ １６ ＣｌＮ ３ Ｏ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３０１．０９、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ １．１８分、ｍ／ｚの測定値３０２．２０［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
Figure 2024522183000290
Ｎ １ －（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）プロパン－１，３－ジアミン（２）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２００ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（６７．７ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ、１当量）および１，３－ジアミノプロパン（５３３ｍｇ、７．１９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して１２５ｍｇ（５７％）の２を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 8.47 (dd, J = 9.5, 3.0 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 9.8, 2.4 Hz,
2H), 7.77 (dd, J = 9.1, 3.1 Hz, 1H), 7.66 (dd, J = 9.2, 2.6 Hz,
1H), 7.50 (dt, J = 9.4, 2.2 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 7.0 Hz, 2H),
4.00 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.38 - 2.31 (m, 2H); 13 C NMR (125 MHz, CD 3 OD) δ 158.47, 158.33, 142.05, 141.73, 136.08, 129.34, 128.99, 125.29, 121.59, 118.67, 115.88, 111.59, 103.86, 56.71, 47.30, 38.11, 28.66;ＬＲＭＳ：Ｃ １７ Ｈ １８ ＣｌＮ ３ Ｏ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３１５．１１、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ １．１７分、ｍ／ｚの測定値３１６．２０［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
Figure 2024522183000291
Ｎ １ －（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）ブタン－１，４－ジアミン（３）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２５０ｍｇ、０．８９９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（８４．６ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ、１当量）および１，４－ジアミノブタン（７９２ｍｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して４２４ｍｇ（８５％）の３を橙黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.20 (dd, J = 9.4, 2.5 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.78 - 7.75 (m, 1H), 7.46 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.39 (dt, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 7.25 (dt, J = 9.3, 2.1 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.83
(t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.83 (dd, J = 8.9, 6.0 Hz, 2H), 1.83 (p, J = 8.4, 7.6 Hz, 2H), 1.70 - 1.62 (m, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ １８ Ｈ ２０ ＣｌＮ ３ Ｏ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３２９．１３、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ １．５
６分、ｍ／ｚの測定値３３０．２５［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
Figure 2024522183000292
Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－アミン（４）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２５０ｍｇ、０．８９９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（８４．６ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ、１当量）および２，２’－オキシビス（エタン－１－アミン）（９３６ｍｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して４４１ｍｇ（８６％）の４を黄色固体として得た： 1 H NMR
(500 MHz, CD 3 OD) δ 8.15 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.78
(d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.38 (s, 2H), 7.33 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (t, J = 5.1 Hz, 2H),
3.63 (m, 2H), 3.43 (m, 2H), 2.70 (m, 2H); 13 C NMR (126 MHz, CD 3 OD) δ 155.89, 151.58, 147.51, 145.60, 134.99, 129.02, 125.70, 125.37, 124.81, 123.31, 117.87, 115.40, 99.69, 71.75, 70.15, 54.76, 49.38, 40.63;ＬＲＭＳ：Ｃ １８ Ｈ ２０ ＣｌＮ ３ Ｏ ２ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３４５．１２、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ １．７４分、ｍ／ｚの測定値３４６．２５［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
Figure 2024522183000293
Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－アミン（５）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２５０ｍｇ、０．８９９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（８４．６ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ、１当量） ２，２’－（エタン－１，２－ジイルビス（オキシ））ビス（エタン－１－アミン）（１．３３ｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として１０ｍＭ ＮＨ ４ ＯＨを含有する水））により精製して２００ｍｇ（５７％）の５を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 8.37 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.63 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.78 - 6.55 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.86 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 5.6 Hz, 2H),
3.49 (dd, J = 5.7, 3.9 Hz, 2H), 3.40 (dd, J = 5.9, 3.9 Hz, 2H),
3.25 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 5.8 Hz, 2H); 13 C NMR (126 MHz, DMSO-D6) δ 155.15, 150.62, 147.98, 146.23, 133.44, 130.81, 127.23, 126.34, 126.18, 117.69, 115.38, 100.54, 73.06, 69.79, 69.50, 55.59, 41.28.
Figure 2024522183000294
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－オール（６）：
ＤＭＦ（４８ｍＬ）中の６－ヒドロキシピリダジン－３－カルボン酸（１．５０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、トリエチルアミン（３．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ、２当量）、ＨＯＢｔ（１．６０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（２．４０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。溶液を室温で３０分間、撹拌しておいた後、Ｎ’－ヒドロキシ－４－メトキシベンズイミドアミド（１．８０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応物を室温で１時間維持し、次いで、加熱し、１５０℃で１時間、またはＴＬＣにより完了と判断されるまで、維持した。溶液を放置して室温に冷却し、この段階で生成物が溶液から沈殿した。水（約３００ｍＬ）を添加し、固体を室温で３０分間、研和した。生成物を真空濾過により単離し、真空中で乾燥させて１．８４ｇの６（６４％）を白色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 13.85 (s, 1H, D 2 Oにより交換), 8.08 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H);
13 C NMR (125 MHz, DMSO-D6) δ 171.2, 167.9, 162.0, 160.3, 132.3, 131.8, 130.4, 128.9, 117.9, 114.8, 55.4.ＮＭＲデータは、文献値と一致する。 ［１］
Figure 2024522183000295
５－（６－クロロピリダジン－３－イル）－３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール（７）：
１（５００ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１当量）およびＰＯＣｌ ３ （３．１４ｍＬ、０．５９Ｍ）のバイアルを密封し、４時間、１００℃に加熱した。ＴＬＣにより完了と判断されたら、反応混合物を放置して室温に冷却し、真空中で濃縮した。粗混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して３８８ｍｇ（７２％）の７を黄褐色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 1 H
NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 8.56 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-D6) δ 172.0, 168.3, 162.1,
158.4, 147.0, 130.3, 130.2, 129.0, 117.8, 114.8, 55.5.
Figure 2024522183000296
Ｎ１－（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）－Ｎ２－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）エタン－１，２－ジアミン（Ｂ３２）：
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の７（２１．３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（６４．３μＬ、０．３７０ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて２（４４．４ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して３．２６ｍｇ（７％）のＢ３２を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 8.68 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.86 - 7.73 (m, 2H), 7.67 (dd, J = 9.2, 2.5 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.42
(d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.75 (m, 2H).
Figure 2024522183000297
Ｎ １ －（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）－Ｎ ３ －（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）プロパン－１，３－ジアミン（Ｂ３３）：
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の７（３０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（９１μＬ、０．５２ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて２（６５ｍｇ、２１μｍｏｌ、２当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して１７ｍｇ（２９％）のＢ３３を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 8.49 (d, J =
9.2 Hz, 1H), 8.11 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H), 7.44 (dd,
J = 9.3, 2.3 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.75 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 6.4 Hz, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ ３０ Ｈ ２６ ＣｌＮ ７ Ｏ ３ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５６７．１８、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ ４．１４分、ｍ／ｚの測定値５６８．３５［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
Figure 2024522183000298
Ｎ １ －（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）－Ｎ ４ －（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）ブタン－１，４－ジアミン（Ｂ３４）：
ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）中の７（３０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（９１μＬ、０．５２ｍｍｏｌ）を添加し、続いて３（５１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して１９ｍｇ（３１％）のＢ３４を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, CD 3 OD) δ 8.36 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 9.4 Hz,
1H), 7.79 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H), 7.35 (dd, J
= 9.3, 2.2 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.08 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.89 (s, 3H),
3.55 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.03 - 1.97 (m, 2H), 1.83 (t, J = 7.3 Hz, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ３１Ｈ２８ＣｌＮ７Ｏ３ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５８１．１９、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ ４．１０分、ｍ／ｚの測定値５８２．４０［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
Figure 2024522183000299
６－クロロ－２－メトキシ－Ｎ－（２－（２－（（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）アミノ）エトキシ）エチル）アクリジン－９－アミン（Ｂ３５）：
ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中の７（４２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１３０μＬ、０．７３ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて４（７５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して４８ｍｇ（５５％）のＢ３５を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.58
(d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.81 - 7.71 (m, 3H), 7.64 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H),
7.45 (dd, J = 9.2, 2.1 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.73
(d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.26 (m, 2H), 4.01 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.75 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.63 (m, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ３１Ｈ２８ＣｌＮ７Ｏ４ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５９７．１８、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ ３．８９分、ｍ／ｚの測定値５９８．３５［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
Figure 2024522183000300
６－クロロ－２－メトキシ－Ｎ－（２－（２－（２－（（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）アクリジン－９－アミン（Ｂ３８）：
ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中の７（１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３０２μＬ、１．７３ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて５（１６８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して５０ｍｇ（２３％）のＢ３８を黄色固体として得た： 1 H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.81 - 7.75 (m, 2H), 7.68 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.24 (q, J =
5.6 Hz, 2H), 3.94 (m, 5H), 3.86 (s, 3H), 3.64 (m, 2H), 3.59 - 3.53 (m, 4H), 3.51 (m, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ３３Ｈ３２ＣｌＮ７Ｏ５ ＋ ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値６４１．２１、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒ ｔ ３．８７分、ｍ／ｚの測定値６４２．５０［Ｍ＋Ｈ］ ＋ 。
（実施例１）
ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ四重鎖の解析
図３に示されているように、本明細書で論じるＭＹＣＮ Ｇ４は、マイナス鎖に、およびＭＹＣＮＯＳの転写開始部位（ＴＳＳ）の付近に、位置する。しかし、単純Ｇ４とは異なり、ＭＹＣＮ Ｇ４は、テトラドに隣接するヘアピンを含有する（Benabou et al.,
Biochim. et Biophys. Acta 2014, 1840(41-52)。ハイブリッドＧ４構造のこのクラスは、ゲノムデータマイニングと実験アプローチの両方により最近特徴付けられており（Onel et al., JACS 2016, 138:2563-2570；Ngoc Nguyen et al., Nucleic Acids Res. 2020, 48:10567-10575；Lim et al., Nucleic Acids Res. 2015, 43:5630-5646）、それらの固有の構造に起因して小分子の興味深い標的となっている Kang et al., JACS 2016, 138:13673-13692）。ＭＹＣＮ Ｇ４はｉｎ ｖｉｔｒｏで構造的に特徴付けられているが、生物学的状況下ではＧ４の存在について疑問が生じることが多い。ＭＹＣＮ遺伝子が、Ｇ４に折り畳まれる配列を含有することを確認するために、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎグループにより報告されたゲノムワイドなＧ４－ｓｅｑデータ（Chambers et al., Nature Biotechnology 2015; 33:877-881）を解析した。このアプローチは、Ｇ４を安定化する前およびした後の２ラウンドのシークエンシングからなる。実験間のより高いミスマッチ率は、対応する領域においてＧ４構造を形成す
る可能性がより高いことを意味する。これらのデータの中で、この研究の目的のＧ４配列は、Ｋ ＋ 安定化データセットとＰＤＳ安定化データセットの両方において、よりいっそう高いミスマッチ率を有することが判明し、それによってＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４の存在が裏付けられる（図４）。さらに、ＱＧＲＳマッパー（Kikin et al., Nucleic Acids Res. 2006, 34:W676-682）を使用してこの配列内のＧスコアを計算したところ、目的の標的は、３３の有望なＧスコアを示すことが判明した（図５Ａ～５Ｂ）。
（実施例２）
小分子マイクロアレイスクリーニングおよびヒット同定
ＭＹＣＮ Ｇ４の小分子結合剤を同定するために、小分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）スクリーニングアプローチを使用した。この研究では、エポキシ基で修飾されたスライドガラスを、以前に報告された類似のプロトコール（Abulwerdi et al., Methods 2016,
103:188-195）に従って調製した。化合物をロボットアレイヤー（Ａｒｒａｙｊｅｔ（商標））によりガラス表面にプリントし、共有結合で固定化した。次いで、スライドを、５’をＣｙ５で標識した５０ｎＭ ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ、および緩衝液とともに、並行してインキュベートした。洗浄および乾燥後、スライドをマイクロアレイスキャナーにより画像化した。各化合物について、複合Ｚスコアを計算し、ヒットを同定した（Connelly et al., ACS Chemical Biology 2017, 12:435-443）。他のＳＭＭスクリーニングにおいて他の核酸への無差別な結合がなかった化合物を優先させた。合計で、１４のヒットを同定した（表２）。
Figure 2024522183000301
Figure 2024522183000302
本物の結合剤としての１４のヒット化合物を検証するために、単一濃度結合アッセイを蛍光強度アッセイ（ＦＩＡ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により行った。化合物を各アッセイにおいて１００μＭ濃度で評価した。この実施例では、陽性結合を、ＦＩＡ研究における＞１０％失活という基準によって定義し、その一方で、ＳＮＲ＞３をＳＰＲ実験におけるカットオフとして使用した。化合物１、２、ＭＹ－１、５、１０、１１、１２および１４は、ＦＩＡ研究におけるヒットであり、化合物１～３、ＭＹ－１、５、９および１３は、ＳＰＲ研究におけるヒットであった。これらのアッセイから、両方の結合アッセイにおいて陽性応答を示す４つの化合物（１、２、ＭＹ－１、および５）を特定した（図６～８）。平衡解離結合定数（Ｋ Ｄ ）値をＦＩＡおよびＳＰＲにより測定した（図９
および１０）。勾配濃度の化合物を用いてＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を滴定したところ、化合物ＭＹ－１は、４つの候補の中で最高の結合を示すことが判明した（ＦＩＡによりＫ Ｄ ＝３．５±１．６μＭ、およびＳＰＲによりＫ Ｄ ＝３．６±２．４μＭ）。化合物１は、２と同様の構造を共有していたが、より良好な結合親和性を有した（ＦＩＡにより２０．８±２．２μＭ、およびＳＰＲにより１１．７±２．６μＭ）。
ＭＹＣＮ Ｇ４の熱安定性に対するＭＹ－１の効果を円偏光二色性（ＣＤ）により評価した。先ず、Ｇ４形成をＣＤ分光法により確認した。ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡの試料を３つの異なる緩衝液条件（１００ｍＭ ＫＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ
ＬｉＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、およびＨ ２ Ｏ）で調製した。図１１Ａに示されているように、ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡは、ＫＣｌ緩衝液中で正しく折り畳まれた平行Ｇ四重鎖構造の特徴を示す２６３ｎｍにおける正のピークおよび２４０ｎｍにおける負のピークを示した。その一方で、ＬｉＣｌ緩衝液およびＨ ２ Ｏ中のＤＮＡ試料のスペクトルは、２６３ｎｍにおいてそれよりはるかに弱いピークを示し、その上、２４０ｎｍでのピークは、無視できるほどのものであった。
次に、融解アッセイを、検証された小分子結合剤なしで／とともにインキュベートしたＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを使用してＣＤ計器によって実際にやってみた。ＣＤスペクトルの２６３ｎｍピークは、加熱中に徐々に減少し（図１１Ｂ）、温度依存的強度を当てはめることによりＴ ｍ を決定した。ＭＹＣＮ Ｇ４を、先ず、１００ｍＭ ＫＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で融解し、Ｔ ｍ を７８．０±１．９℃と決定し、これは、以前に報告された値と一致した（Benabou et al., Biochim. et Biophys. Acta 2014; 1840:41-52）。熱アンフォールディングに対する分子の影響を評価するために、Ｇ４の折り畳みが、より少ないＫＣｌによる影響を受けないことを確認した（図１２）後、ＫＣｌ濃度低下を使用するアッセイ（Kumari et al., Nature Chemical
Biology 2007, 3:218-221）を行った。５ｍＭ ＫＣｌ緩衝液では、ＭＹＣＮ Ｇ４の融解曲線がよりよく当てはまり、Ｔ ｍ は５４．６±０．４℃であった。Ｔ ｍ は、緩衝液への５％ＤＭＳＯの添加の影響を受けなかった。２０μＭの１またはＭＹ－１をＭＹＣＮ
Ｇ４溶液に添加し、１５分間インキュベートした後、アンフォールディングした。結果として、両方の化合物が、融解曲線の有意なシフトを誘導し、Ｔ ｍ を、それぞれ、４．７±０．７℃（１について）および３．７±０．５℃（ＭＹ－１について）上昇させた（図１１Ｃ）。どちらの化合物も、ｄｓＤＮＡ融解に対して測定可能な効果を示さなかった（図１１Ｄ）。これは、これらのヒット化合物がＢ－ＤＮＡ結合剤でなかったことを示す。
化合物１およびＭＹ－１の結合選択性も評価した。別の実験で、蛍光に基づくアッセイを、過剰なｔＲＮＡが存在する／非存在であるＧ４溶液に化合物を徐々に加えることにより行った。ｄｓＤＮＡと同様に、過剰なｔＲＮＡは、１の結合親和性にもＭＹ－１の結合親和性にも影響を与えなかった。これは、さらに、特異的な相互作用様式を示唆する（図１３Ａおよび１３Ｂ）。加えて、がん関連遺伝子（図１）からの別の５つの５’Ｃｙ５標識Ｇ４も選択性プロファイリングに導入した。２つのヒット化合物を滴定したところ、化合物１は、２５．２～１２７．９μＭの範囲にわたる結合親和性で全てのＧ４へのある程度の結合を示したが、ＭＹＣＮ Ｇ４のものより弱かった（図１４Ａ～１４Ｅ）。しかし、ＭＹ－１は、有意な失活挙動を示さず、ＭＹＣＮを除くいずれのＧ４についてもＫ Ｄ 値を測定することができなかった（図１５Ａ～１５Ｅ、１６Ａ～１６Ｅ）。この結果は、ＭＹ－１がＭＹＣＮ Ｇ４にその固有の構造によって結合することを示していた。
（実施例３）
非標準Ｇ４結合剤としての化合物ＭＹ－１の同定
ＳＰＲセンサーグラムを解析したところ、化合物１とＭＹ－１との有意に異なる結合レベル（Ｒ ｍａｘ ）が観察され、これは、２つの化合物の結合様式が異なる可能性があるこ
とを示唆していた。この予想外の観察に基づいて、また、単一の理論に拘束されるものではないが、２つの化合物はＭＹＣＮ Ｇ４の異なる部位に結合する可能性があると今や考えられる。調査するために、化合物を指定された順序で段階的に注入することまたは混合物を注入することによりＳＰＲで競合アッセイを行った（Brooks et al., Drug Discovery Today 2014, 19:1040-1044；Spurny et al., PNAS 112:E2543-2552）。１００μＭの１を注入し、続いて１００μＭのＭＹ－１を注入したところ、ＭＹ－１の観察された結合レベルは、個々の注入のものと比較して有意に変化しなかった（図１７）。１のより高い濃度（５００μＭ）ででも、ＭＹ－１結合レベルは維持された（図１８Ａおよび１８Ｂ）。これは、１がＭＹ－１と競合しないことを示唆する。次に、古典的スタッキングＧ４結合剤であるＴＭＰｙＰ４（Seenisamy, JACS 2004, 126:8702-8709）も、ＭＹ－１と一緒に試験した。ＴＭＰｙＰ４溶液へのＭＹ－１（１００μＭと２５０μＭの両方）の添加は、ＳＰＲ結合シグナルの増加をもたらした（図１９Ａおよび１９Ｂ）。これは、ＭＹ－１が明確に異なる様式でＧ４に結合することを示唆する。加えて、ＭＹ－１か２つのヒット（１とＭＹ－１）の混合物かを使用してＣＤ融解アッセイも行った。２０μＭの１および２０μＭのＭＹ－１を含有する溶液の混合物は、ＭＹＣＮ Ｇ４のＴ ｍ を９．７±０．７℃上昇させ、この上昇は、２０μＭ ＭＹ－１のみのものより有意に高度であった（図２０Ａおよび２０Ｂ）。これは、オーバーラップしない相互作用様式を示唆する。その一方で、４０μＭ ＭＹ－１添加によるＭＹＣＮ Ｇ４のΔＴ ｍ は、恐らく結合部位の飽和に起因して、有意に増加しなかった。
ＭＹ－１とＭＹＣＮ Ｇ４の結合化学量論比を評価するために、ジョブプロット解析を行った。手短に述べると、蛍光滴定中に構成要素の分率を変えることにより、蛍光強度の変化をプロットし、当てはめ、その結果、１：１結合化学量論比を示す０．４７で最大となった（図２１）。ＭＹ－１とＭＹＣＮ Ｇ４との結合をマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）により研究した。３’－Ｃｙ５標識ＤＮＡ試料を、失活が観察されなかったので使用した（図２２）。マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）曲線は、１：１結合モデルによく当てはまり、結合親和性は、８．１±１．７μＭと算出され、これは、ＦＩＡおよびＳＰＲ実験の結果と一致した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。その結果として、他の報告されたＧ４スタッカーの大多数とは異なり、および１と明確に異なり、ＭＹ－１を非標準Ｇ４結合剤として同定した。
（実施例４）
ＦＩＡおよびＤＭＳ－フットプリンティングを使用する結合部位同定
化合物ＭＹ－１とＭＹＣＮ Ｇ４との結合の詳細をさらに理解するために、一連のＦＩＡ研究を設計し、行った。ヒット化合物が１：１化学量論比でＧ４と結合したことを考えて、固有の結合挙動はヘアピン構造に関係していると仮定した。先ず、環境感受性２－アミノプリン（２－ＡＰ）フルオロフォアをＧ４の別個の位置（Ａ１１、Ａ１８、およびＡ２４）に導入することにより、結合領域を調査した（図２４Ａ）。１００μＭ ＭＹ－１を標識ＤＮＡ試料とともにインキュベートした後、蛍光強度を測定し、ＤＭＳＯ対照と比較した。Ａ１１ ２－ＡＰ ＤＮＡ試料の蛍光は、ほぼ１００％失活したが、Ａ１８およびＡ２４ ２－ＡＰ ＤＮＡについての失活パーセンテージは、それぞれ８０％および７０％であった（図２４Ｂ、図２５Ａ～２５Ｃ）。５’－Ｃｙ５標識オリゴと３’－Ｃｙ５標識オリゴとの異なる失活挙動についての前の観察（１５％および０％失活、図２４Ｃ）に基づいて、ＭＹ－１は、ヘアピン付近の領域に結合していると仮定した。次に、この結合事象におけるヘアピンの必要性を、変異した長いループ（塩基対合を形成することができなかった）および短縮型配列（ヘアピンなし）を含む２つのＤＮＡ構築物を設計することにより探究した（図２を参照されたい）。２つのＤＮＡにＭＹ－１を徐々に加えると、結合親和性は、＞１００μＭのマイクロモル（野生型ＭＹＣＮ Ｇ４のものより約３０倍弱い）へと大幅に減少した。その一方で、化合物１もこれらのＧ４に対して試験し、親和性は、野生型（ＷＴ）構築物と同等であった（図２４Ｄ）。これらの結果は、ＭＹＣＮ
Ｇ４におけるヘアピン構造が、ＭＹ－１との結合を維持するために重要であるが、１との結合を維持するために重要でないことを示していた。
加えて、化合物がヘアピンの副溝に結合するかどうかを探究するために、ＭＹ－１を他の２つの古典的副溝結合剤（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびネトロプシン）と一緒に蛍光変位アッセイ（Alniss, J. Medicinal Chemistry 2019, 62:385-402）により試験した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８はフルオロフォアとして報告されており、ＤＮＡ染色試薬として広く使用されていたので、それを、先ず、異なる濃度の非標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡとともにインキュベートし、滴定した。３５２ｎｍの励起波長および５００ｎｍの発光波長を利用したところ、蛍光強度は、予想どおりＤＮＡ濃度の上昇に伴って増強された（図２４Ｅ）。次に、ＭＹ－１またはネトロプシンのどちらかをＤＮＡ滴定中に競合物質として溶液に添加した。周知の副溝結合剤としてのネトロプシンは、蛍光強度の対応する減少により測定されるＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８の有意な変位を示した。しかし、ＭＹ－１については、５０μＭでは部分的な蛍光減少が観察されたが、５μＭでは測定可能な変化は観察されなかった。したがって、ヘアピンはＭＹ－１結合を助長すると今や考えられるのだが、それは古典的副溝結合剤ではないようである。
ＭＹＣＮ Ｇ４への化合物の結合様式をさらによく理解するために、硫酸ジメチル（ＤＭＳ）フットプリンティングアッセイを開発した。このアッセイは、ピペリジンを使用して後で切断することができる、グアニン（Ｇ）内の遊離Ｎ７をメチル化するＤＭＳの能力を活用する（４３、４４）。その一方で、四重鎖構造におけるフーグスティーン結合Ｇは、修飾されないように保護されたままである。さらに、小分子とのインキュベーションによる修飾の変化を結合部位付近で観察することができる。５’Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４を５ｍＭ ＫＣｌの存在下でアニールし、その後、化合物を、観察されたＫ Ｄ に準拠した濃度で添加した。図２４Ｆに示されているように、Ｇ１０～Ｇ１２に対応するバンドは、保護に起因して暗く、これは、Ｇが四重鎖のテトラッド内に組み込まれたことを示す。しかし、Ｇ１３～Ｇ１６は、非保護のままであり、したがって、ワトソン・クリック塩基対合によるヘアピン形成に起因して、よりいっそう明るいバンドを示した。化合物ＭＹ－１の存在下で、様々なＧの濃度依存的保護が観察された。これは、化合物がＧ４構造を安定させることを示す。Ｍｙ－１を添加すると、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１６、Ｇ１７は、かなり保護され、その一方で、Ｇ１３～Ｇ１５は、わずかに保護された。この結果は、上記の複数の結果と一致して、ＭＹ－１が四重鎖とヘアピンとの接合部に結合していることを示唆していた。（図２４Ｂ）。
（実施例５）
化合物ＭＹ－１の構造－活性関係（ＳＡＲ）研究
ＭＹＣＮ Ｇ４標的に対するより良好な結合を達成するために、ＭＹ－１の一連の類似体（表３を参照されたい）を使用することにより構造－活性関係（ＳＡＲ）研究を行った。ＭＹ－１および１３の誘導体（ＭＹ－２～ＭＹ－１４）を含有する的を絞ったライブラリーを購入したか合成した。各化合物を上記のＳＰＲおよび２－ＡＰ滴定により評価した。予備的研究では、ＭＹ－１におけるピロリジン基がＧ４との結合を維持することによる役割ばかりでなく溶解性に役立つ役割も果たすと、今や考えられる。その一方で、ＭＹ－１の複素環コア（表３に示す）はＭＹＣＮ Ｇ４認識を助長するとも、今や考えられる。それ故、ほとんどの類似体が、変更された側鎖Ｒ基を含有した。
Figure 2024522183000303
Figure 2024522183000304
１４の類似体とＭＹＣＮ Ｇ４との系統的結合アッセイを、ＳＰＲおよび２－ＡＰ（Ａ１１）蛍光滴定により行った（図２６Ａ～２６Ｎ、２７Ａ～２７Ｎ）。概要として、観察された結合親和性は、１．４～２３．５μＭ（ＳＰＲ）、および０．２～７．０μＭ（２－ＡＰ滴定）の範囲にわたった。類似体の大部分は、ＭＹＣＮ Ｇ４への良好な結合挙動を示したが、ただし、ＭＹ－４およびＭＹ－９を除いてであり、これらの両方には好適な緩衝剤への溶解性があった。ＳＰＲ実験では、４つの類似体（ＭＹ－２、５、８、および１０）を親化合物より強い結合剤として同定し、これらの中で、ＭＹ－５およびＭＹ－８は、それぞれ、１．４±０．２μＭおよび１．５±０．３μＭという最も強力な結合親和性を示した。化合物ＭＹ－２は、ＳＰＲセンサーグラムで高い応答を示し、これは、それが凝集剤であることを示唆していた。２－ＡＰ蛍光滴定アッセイ（Ａ１１置換構築物を使用する）について、観察されたＫ Ｄ 値は、ＳＰＲ実験とよく合致したが、値は、全体的にそれよりわずかに低かった。試験した類似体の中で、４つの化合物（ＭＹ－２、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、およびＭＹ－１４）は、ＭＹＣＮ Ｇ４標的へのマイクロモル以下の結合剤と判明した。重ねて、類似体ＭＹ－２は、０．２±０．０３μＭでの最高結合親和性を示したが、凝集の可能性／不良な溶解度のため、それをさらなる試験に選ばなかった。全てのＳＡＲデータを勘案して、ＭＹ－８を細胞に基づくアッセイに選出した。結果を上の表３に示す。
（実施例６）
ＭＹ－８処理後のＭＹＣＮ－ＭＹＣＮＯＳ発現に対する効果
ＭＹＣＮ遺伝子発現に対するＭＹ－８の効果を評価するために、ＮＢＥＢ細胞を培養し、異なる濃度のＭＹ－８で処理した。細胞生存率に対するＭＹ－８の効果を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞画像化システムを使用して評価した。ＭＹ－８の単回処理後の細胞集密度の４日測定に基づいて、ＮＢＥＢ細胞成長の有意な阻害が観察された（図２８Ａおよび２８Ｂ）。４５μＭまでの化合物濃度の上昇に伴って、２０．５μＭのＣＣ ５０ がＭＴＳアッセイにより確認された（図２８Ｃ）。次に、ＭＹＣＮならびに２つのＭＹＣＮＯＳ転写物（ＭＹＣＮＯＳ００１およびＭＹＣＮＯＳ００２）を含む、遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＭＹ－８処理後の異なる時点（２４、３６および４８時間）で、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定した（図２８Ｄ～２８Ｆ）。より高いＭＹ－８濃度で、ｍＲＮＡレベルの明確な減少が３つ全ての転写物について観察され、これは、ＭＹ－８での処理がＭＹＣＮとＭＹＣＮＯＳの両方の発現レベルを低下させることを示していた。興味深いことに、ＭＹＣＮＯＳ００２レベルは、他の２つの転写物より早い、２４時間という早期に低下した。Ｎ－Ｍｙｃタンパク質のレベルもウェスタンブロッティングを使用して測定した（図２８Ｇ）。ここで、結果は、ｑＰＣＲ実験と一致し、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質のレベルは、ＭＹ－８での処理によって用量依存的に低下された。
本明細書におけるデータにより示されるように、本明細書に記載する複数の直交技術を使用する生物物理学的分析は、化合物、例えば、化合物ＭＹ－１およびＭＹ－８が、Ｇ－テトラドおよびヘアピンにより形成される固有の折り畳み構造と相互作用することにより非定型様式でＭＹＣＮ Ｇ４に結合することを確証する。また、一部の例では、ＭＹ－８の生物学的評価は、それが、ＭＹＣＮのレベルはもちろんＭＹＣＮＯＳのレベルも低下させること、したがって、両方の遺伝子産物のレベルをＲＮＡおよびタンパク質レベルで下方制御することを明示した。
本明細書で開示されるデータおよび情報は、ＤＮＡ Ｇ４内の高次構造の標的化が、創薬不可能ながん遺伝子の発現を調節する選択的阻害剤を開発するための新たな道をもたらすことを確証する。実際、複雑度のより高いＲＮＡ Ｇ４が、高選択的小分子結合に成功したフレームワークとなった。これらの例は、主に進化した蛍光ＲＮＡアプタマーであるが、それらは、Ｇ４を含有する複合体構造が高選択的小分子認識のための固有のポケットを提供することができることを見事に実証している。
より広い意味で、ｌｎｃＲＮＡプロモーターの存在下でのＧ４エレメントの小分子認識は、ｌｎｃＲＮＡ発現を調節する１つの方法であり得る。ｌｎｃＲＮＡは、複数のがん型における重要な駆動因子の代表であるが、それらの発現または機能を調節することができる小分子の少数の例が存在する。本明細書で提供するデータは、これらの複雑な構造により形成される固有の折り畳み構造が、タンパク質コード遺伝子産物はもちろんタンパク質非コード遺伝子産物も含む疾患関連遺伝子の標的化を助長する小分子の有益な機能的標的でもあり得ることを示す。
（実施例７）
標的としてのヘアピンを含有するハイブリッドＧ４の可能性を考えて、ヒトゲノムにおける同様の構造を有する他のＧ４の存在をさらに探究した。ゲノムワイドなＧ４－ｓｅｑからのデータを使用して、約２百万の固有のループ（＞７ｎｔ）を、観察四重鎖（ＯＱ）の４０７，４９１領域に埋め込まれたＧ４のＧトラクト間で特定した。ＵＮＡｆｏｌｄ（４６）（３７℃でｈｙｂｒｉｄ－ｓｓ－ｍｉｎパッケージ）を使用するヘアピン折り畳み試験をして、３３，９１２のＯＱは、以前のコンピュータによる予測と一致してヘアピン構造（全ＯＱの約８．３％）を含有することが判明した。ヘアピン－Ｇ４領域の中で、５８％は、タンパク質コード遺伝子に関連していたが、１３％は、ノンコーディングＲＮＡに関連していた。ヘアピン含有Ｇ４のうちのいくつかは、がん関連タンパク質の遺伝子（ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＭＹＣＬ、およびＢＲＤ４など）に位置した、（それぞれのヘアピン－Ｇ４については図２９を参照されたい）。この実施例は、埋め込まれたヘアピンを含有する複雑度のより高いＧ４が、ゲノム全体にわたって高度に見られ、多くの場合、癌遺伝子またはｌｎｃＲＮＡに関連していることを示す。
（実施例８）
この実施例では、ＳＰＲ結合アッセイを行って、本開示の代表的な二価化合物の結合活性を解析した。この実施例の化合物は、非標準結合剤構成要素およびＧ４スタッカー構成要素を含んだ。ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器を使用した。ＣＭ５ ＳＰＲバイオチップを使用し、泳動用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、５％ＤＭＳＯ）を用いてプライミングした。化合物をチップ表面に固定化するために、流速を５μＬ／分に設定した。次いで、チップ表面のカルボキシル化デキストランを１５分間、ＥＤＣ／ＮＨＳ（０．４Ｍ／０．１Ｍ）水溶液によって活性化し、続いて３０分間、ストレプトアビジン（ＳＡ）溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中の０．２ｍｇ／ｍＬ）を注入した。ＳＡの固定化量の後、１０分間、１Ｍエタノールアミン（ＥＡ）水溶液（ｐＨ８．５）を注入することによって表面を失活させ、２分間、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて再生して、物理的吸着を除去した。さらに、ビオチン化ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡをアニーリング用緩衝液中５μＭで調製し、５分間、９５℃まで加熱し、その後、１時間以内に室温にゆっくりと冷却した。アニーリング後、合計１５０μＬの溶液を３０分にわたってＳＰＲシステムのＦｃ ２に注入してＤＮＡをチップ表面に固定化した。次いで、ベースラインが安定したら、化合物溶液を試験した。
結合シグナルはもちろん結合親和性も検出するために、より速い流動速度（２５μＬ／分）をＦｃ １（ブランク）とＦｃ ２（標的）の両方に使用した。化合物溶液の各々を、ＤＭＳＯ中の２０×設計濃度で調製し、次いで、非ＤＭＳＯ泳動用緩衝液に入れて希釈し、それによって５％ＤＭＳＯの最終濃度を得た。次いで、合計５０μＬの化合物溶液を会合のために１２０秒にわたってＦｃ １～２流路に注入し、その後、解離のために緩衝液を２００秒流した。５０μＬの再生用緩衝液（１Ｍ ＫＣｌ）の注入を必要に応じて２つの試料間に行うことができた。ブランクチャネル（Ｆｃ １）を参照することにより最終結合曲線を得た。結合親和性（Ｋ Ｄ ）を決定するために、一連の希釈化合物溶液を注入
し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりラングミュア１：１結合モデルを使用してＫ Ｄ を計算した。
この実施例のために行った特定の実施態様についての結果を図３０、３１Ａ、３１Ｂ、３２Ａおよび３２Ｂに示す。現在分かっているような、本実施例の二価化合物の結合を示す概略図を、図３０によって提供する。アクリジンＩＣＲ １９１は、８２１±１８４ｎＭのＫ Ｄ を示す良好なシグナルを滴定中に有した（評価した他のアクリジニル化合物は、９－アミノアクリジン、アクリジンＣｌ、およびアクリジンＮＨ ２ を含んだ）（図３１Ａおよび３１Ｂ）。化合物Ｂ３３とＭＹＣＮ Ｇ４との結合をＳＰＲ滴定により定量化した。化合物Ｂ３３は、報告されたＭＹ－８（ＳＰＲにより１．５±０．３μＭ）またはアクリジンＩＣＲ １９１のどちらかと比較して、結合親和性の大きな改善（Ｋ Ｄ ＝７０±１３ｎＭ）を示した（図３２Ａおよび３２Ｂ）。それに加えて、化合物Ｂ３３の結合曲線は、アクリジンＩＣＲ １９１（高速オン／オフ）のものとは異なる動態を示した。さらに、新たに開発された化合物は、５μＭの化合物注入であっても、ＳＰＲではｄｓＤＮＡへのいずれの結合も示さなかった。その一方で、アクリジンＩＣＲは、溝結合および挿入に起因して、ｄｓＤＮＡへの用量依存的結合シグナルを示した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。これらの結果は、化合物Ｂ３３には、Ｂ－ＤＮＡ構造よりＧ４構造への優れた結合優先傾向があること、それが、複雑な溶液においてより良好な特異性をもたらすことになることを示した。
（実施例９）
この研究では、ある特定の二価オリゴとＭＹＣＮ Ｇ４オリゴとの結合を検証するためにＦＩＡを使用した。結合親和性を測定するために、各化合物の溶液を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、黒壁透明底）において三連で調製し、それによって１００ｎＭの最終濃度（作業溶液中５％最終ＤＭＳＯ）を得た。非標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを上述のアニーリング法に基づいて折り畳み、次いで、ウェルプレートに添加し、それによって段階希釈により異なる濃度を得た。プレートを室温で３０分間インキュベートし、その後、５００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。次いで、蛍光強度をＥｘ ３４０ｎｍ／Ｅｍ ５００ｎｍでＳｙｎｅｒｇｙ Ｍｘマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）により定量的に記録した。次いで、蛍光強度を正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアにおいてｏｎｅ－ｓｉｔｅ ｔｏｔａｌモデルを使用する曲線当てはめにより結合親和性を計算した。
アクリジンから誘導された分子の蛍光特性を利用することによりＦＩＡ研究も行った。アクリジンＩＣＲおよび化合物Ｂ３３は、３４０ｎｍで励起され、約５００ｎｍで蛍光発光ピークを示した。折り畳まれたＤＮＡ Ｇ４を１００ｎＭ小分子溶液に徐々に加えることにより、用量依存的応答の曲線を得、当てはめた。結果として、アクリジンＩＣＲ １９１および化合物Ｂ３３は、それぞれ、１０４０±１５０ｎＭおよび６６±７ｎＭを示した（図３４Ａおよび３４Ｂ）。この結果は、化合物Ｂ３３とＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４との強力な結合を裏付けた。
（実施例１０）
この実施例では、１２の異なるＧ４オリゴならびに非Ｇ４オリゴ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）を含有する小規模ＤＮＡ Ｇ４マイクロアレイを作製し、試験した（表４）。先ず第一に、ＳＡコートガラス表面を調製した。アミノ官能化スライドガラスを、先ず、ＤＭＦ中の炭酸Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジル（ＤＳＣ、１．０Ｍ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．０Ｍ）の溶液で一晩、室温で修飾した。ＥｔＯＨ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（各５分）で連続して洗浄し、Ｎ ２ ガスで乾燥させた後、スライドを４℃の冷蔵庫の中で１ｍｇ／ｍＬのＳＡ溶液とともに１２時間（一晩）インキュベートし、その後、３０分間、ＥＡ緩衝液で表面をブロックした。次いで、スライドをＰＢＳ
緩衝液およびＭｉｌｌｉ－Ｑ水ですすぎ、遠心分離（１，７００ｇ、２分）により乾燥させた。
Figure 2024522183000305
Figure 2024522183000306
並行して、ビオチン標識ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴをアニーリング用緩衝液中で調製し、それによって５μＭストック溶液を得、続いてアニールした（上記方法に従って）。次いで、全てのオリゴ溶液を３８４ウェルプレートに移した。次に、マイクロアレイプリンティングをロボットアレイヤー（Ｎａｎｏｐｒｉｎｔ、Ａｒｒａｙｉｔ、ＵＳＡ）によって６０％の湿度で行った。マイクロアレイを作製した後、１枚のウェットＫｉｍｗｉｐｅティッシュを用いてスライドをスライドボックスに入れ、４℃で２時間インキュベートした。
蛍光化合物（化合物Ｂ３３、チアゾールオレンジ（「ＴＯ」）、およびアムサクリン）とともにインキュベートするために、スライドをＰＢＳＴ、ＰＢＳ、および水で入念にすすいで、未結合オリゴを除去した。次いで、スライドを遠心分離（１，７００ｇ、２分）により乾燥させ、マイクロアレイガスケット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を用いて迅速に組み立て、その後、化合物溶液を負荷した。１時間のインキュベーション後、スライドを洗浄し、上述の方法を用いて乾燥させた。最後に、マイクロアレイスライドを、蛍光スキャナー（Ｍａｐｉｘ）により緑色チャネルを使用して画像化し、蛍光強度を定量化した。
２．５μＭで、化合物Ｂ３３は、他のインキュベーション濃度と比較して、比較的より高いシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）およびより低いバックグラウンドを示した（データ未記載）。結果として、ＭＹＣＮスポットのみが化合物Ｂ３３処理マイクロアレイにおいて光を発した。これは、対応する標的に対する有望な結合選択性を示す（図３５Ａ～３５Ｆ）。その一方で、Ｇ４ ＤＮＡを含有する別の２つの報告されたヘアピン（ｈＴＥＲＴおよびＢＣＬ２）は、蛍光を示さず、これは、分子認識がＭＹＣＮ Ｇ４におけるヘアピンに高度に依存することを示唆していた。加えて、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡへの結合は観察
されず、これは、化合物Ｂ３３のＧ４結合挙動と一致した。その一方で、一般的なＧ４結合剤としてのＴＯは、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡを除くほとんどのオリゴへの結合を示した。これは、広域Ｇ４結合能力を示唆する。化合物Ｂ３３とアクリジンコアを共有していたがより短いテール（ベンジル型スルホンアミド）を有したアムサクリンは、マイクロアレイにおいていくつかのＧ４、特に、ＮＲＡＳ ＲＮＡ Ｇ４および３つのヘアピン－Ｇ４（ＭＹＣＮ、ｈＴＥＲＴおよびＢＣＬ２）への結合を示した。これらの結果は、他のＧ４構造よりもＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４への化合物Ｂ３３の有望な結合選択性を実証した。
（実施例１１）
この実施例では、Ｇ四重鎖構造の折り畳みを、Ｊ－１５００円偏光二色性分光計（Ｊａｓｃｏ）を使用して円偏光二色性により特徴付けた。緩衝液条件を最適化するために、非標識ＭＹＣＮオリゴヌクレオチドを異なるアニーリング用緩衝液条件において５μＭ濃度で調製した。アニーリング手順は、上述の手順と同じであった。ＣＤスペクトルを３２０～２００ｎｍで、２５℃で、１ステップ１ｎｍで記録した。３回の反復スキャンのシグナルを平均することにより各スペクトルを得た。
ＣＤ融解アッセイのために、ＭＹＣＮオリゴヌクレオチドを、ＫＣｌ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ）中、５μＭ濃度で調製した。化合物の安定化効果を試験するために、ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を、設計濃度で化合物（５％ＤＭＳＯを含有する最終溶液）と／なしで混合した。次いで、合計３００μＬの溶液をキュベットに添加し、ＣＤ分光計内で、１℃間隔で、２０℃から８０℃へ加熱した。融解温度（Ｔ ｍ ）を計算するために、２６３ｎｍでのＣＤスペクトルのピークを追跡し、偏光解析を温度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアにおいて可変勾配を用いて非線形シグモイド用量応答モデルを使用して当てはめた。
ＣＤを使用する熱融解アッセイを行って、ＭＹＣＮ Ｇ４安定性に対する化合物の効果を調査した。アクリジンＩＣＲ １９１（ΔＴ ｍ ＝４．６℃）と比較して、化合物Ｂ３３は、よりいっそう高いΔＴ ｍ （６．４℃）を示し、これは、化合物Ｂ３３における２つの断片の相乗効果に起因すると考えられ得た（図３６）。この結果は、二価相互作用が、小分子とオリゴとのより多くの接点の導入に起因して、結合親和性を改善することのみならずＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４の熱安定性を増大させることもできるという本発明者らの仮説と一致した。
化合物Ｂ３３の結合選択性をさらに特徴付けるために、約１９，０００の異なるＧ４配列を含有する高密度の大規模ＤＮＡマイクロアレイを作製し、使用した。このマイクロアレイでは、３４０の報告されたＧ４（Ｇリッチ配列）ならびに２８０の非Ｇ４（Ｃリッチ配列）を、陽性および陰性対照として設計した。加えて、短いループ（１～７ｎｔ）を有する１７，０００を超える標準Ｇ４オリゴも、Ｇ４構造の多様性を満たすようにループ配列を変えることにより設計し、合成した。高濃度ＫＣｌ緩衝液中で表面グラフト化ＤＮＡオリゴを折り畳んだ後、ＴＯおよび化合物Ｂ３３溶液（５００ｎＭ）をマイクロアレイとともにそれぞれインキュベートした。次いで、スライドを入念に洗浄し、乾燥させ、蛍光スキャナーにより緑色チャネルを使用して画像化した。結果として、ＴＯ処理マイクロアレイは、広範囲の蛍光を提示し、蛍光シグナルは、均一に分布しており（一部の陰性対照スポットを除いて）、これは、ほぼ全てのＧ４が折り畳まれたことを示していた（図３７Ａ）。しかし、化合物Ｂ３３スライドは、少数の明るいスポットしか示さず、その一方で、他のスポットは、バックグラウンドのように暗いままであり、これは、化合物Ｂ３３が強い優先的結合挙動を有することを示唆していた。各スポットの蛍光強度を定量化するために、ＴＯおよび化合物Ｂ３３の結合をさらに調査した。カーネル密度推定（ＫＤＥ）プロットおよびバイオリンプロットは、マイクロアレイ全体の全域にわたっての結合シグナルの分布を示した。図３７Ｂに示されているように、２つの小分子に対応する２つのバン
ドは、十分に分離していた。化合物Ｂ３３スペクトルは、ＴＯのものよりはるかに広い範囲に広がっていた。バイオリンプロット（図３７Ｃ）では、ＴＯ群の平均ＳＮＲ値は１２であり、これは、化合物Ｂ３３群のものよりはるかに高かった。それに加えて、ＴＯ群は、マイクロアレイにおいて均一に分布していた結合シグナルを裏付ける、より小さいエラーバーを有した。化合物Ｂ３３群のバイオリンプロットは、頂部に針様形状および最下部に本体を提示した。これは、強く偏った結合事象があったことを示す（図３７Ｃ）。６２０のＧ４および非Ｇ４対照に焦点を合わせると、ＴＯは、Ｇ４と非Ｇ４の両方への結合を示したが、前者平均ＳＮＲは、後者のものより有意に高かった（図３７Ｄ）。それに対し、化合物Ｂ３３は、Ｇ４への多少の結合を示したが、非Ｇ４群では結合が観察されなかった。この結果は、化合物Ｂ３３には非Ｇ４構造よりＧ４への優先傾向があることを示しており、これは、マイクロアレイの大域解析と一致していた。ＴＯ群と化合物Ｂ３３群の間のＳＮＲ値を比較すると、散布図は４５度線から外れており（図３７Ｅ）、これは、重ねて、化合物Ｂ３３の結合挙動が非選択的結合剤（ＴＯ）のものとは全く異なることを示していた。さらに、２つの化合物の選択性を、ジニ係数を使用することにより、定量的にプロファイリングした。最初は経済学的概念として使用されたジニ係数は、キナーゼ阻害剤の選択性／無差別性のプロファイリングはもちろん、ＲＮＡ結合剤の選択性／無差別性のプロファイリングにも応用されている。より高いジニ値は、化合物のより高い選択性を意味する（ジニ係数＞０．７５は、優れた選択性と見なされる）。マイクロアレイにおけるＳＮＲに基づくジニ係数。結果として、ＴＯおよび化合物Ｂ３３は、０．２３６および０．６２８のジニ係数値を示した（それぞれ、図３７Ｆおよび３７Ｇ）。高いジニ値は、化合物Ｂ３３がＧ４の中で比較的有望な選択性を有することを定量的に裏付けた。
（実施例１２）
この実施例では、５’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４ ＤＮＡを使用することによりＤＭＳ－フットプリンティングを行った。９５℃まで加熱し、続いて緩徐な冷却を行うことにより、最適化緩衝液条件（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＬｉＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＣｌ）で、５μＭのオリゴをアニールした。その後、折り畳まれたＤＮＡを異なる濃度（０、１０、２５、５０、１００ｎＭ）の化合物Ｂ３３とともに３０分間インキュベートした。次いで、溶液を１０分間、室温での１％ＤＭＳ処理に付し、２．５Ｍ ＮＨ ４ ＯＡｃおよび０．１Ｍ β－メルカプトエタノールにより反応を停止させた。処理されたＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールにより精製し、エタノールにより沈殿させた。次いで、１０％ピペリジンを使用して９０℃で３０分間、ＤＭＳ修飾ＤＮＡを切断した。ＳｐｅｅｄＶａｃ減圧濃縮器を使用して溶液を乾燥させて１００μＬの水で２回洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に溶解した。処理したＤＮＡ試料を１７％変性ポリアクリルアミドゲルで分割し、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化し、続いてＩｍａｇｅＪソフトウェアで処理した。
緩衝液最適化を行って、小分子誘導Ｇ４形成を観察した。ＣＤスペクトル研究により、１０ｍＭ ＬｉＣｌ＋１０ｍＭ ＮａＣｌをＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液における塩条件として選択した。５’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４をアニールし、異なる濃度の化合物Ｂ３３とともにインキュベートした後、ＤＭＳ－フットプリンティングアッセイを行った（図３８Ａ）。化合物の非存在下で、Ｇ１３～１５のバンドは、ヘアピン領域に対応してより強かったが、Ｇの一部のバンドは、四重鎖形成のため暗かった（図３８Ｂ）。化合物Ｂ３３の添加に伴って、オリゴは、Ｇ２～９、Ｇ１０～１２およびＧ１７～２１については保護に起因してＧ４構造を形成するように誘導された。それに加えて、Ｇ１３～１５は、部分的に保護されたことが観察された。これは、四重鎖の形成中に、このヘアピン領域も分子に接触していたことを示す。この結果は、ほどけたおよび短縮型のＭＹＣＮ Ｇ４を使用する結合研究（それぞれ、図３９Ａおよび３９Ｂ）と一致しており、ヘアピンが結合に関与することを重ねて裏付けた。しかし、別の試験では、二重鎖含有ＲＮＡ Ｇ４（ＭＡＮＧＯ ＩＩ）は、二重鎖および四重鎖構造が接合部を形成するのではなく分離された（Ｐ
ＤＢ：６Ｃ６３）ため、化合物Ｂ３３への弱い結合をＳＰＲにより示した（図４０）。単一の理論により拘束されるものではないが、この結果は、分子認識が、ヘアピン－四重鎖により形成される三次構造の存在により助長されることを示し得ると、今や考えられる。
ＤＭＳ－フットプリンティング研究に加えて、ＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４への化合物Ｂ３３の二価結合様式も、ＨＰ－Ｇ４を異なる折り畳み型と比較することにより調査した。平行構造（ＢＣＬ２）、（３＋１）ハイブリッド構造（ＨＩＶおよびＰＩＭ１－第１形態）および（２＋２）いす型構造（ＰＩＭ１－第２形態）を有する４つの報告されたＨＰ－Ｇ４を、化合物Ｂ３３を使用するＦＩＡ結合試験により調べた（図４１Ａ、４１Ｂ、４２Ａ、４２Ｂ、４３Ａ、４３Ｂ、４４Ａおよび４４Ｂ）。結果として、ＢＣＬ２ ＨＰ－Ｇ４は、ＭＹＣＮ ＨＰ－Ｇ４よりほぼ４倍弱い、２５８±３９ｎＭのＫ Ｄ を示した。（３＋１）ハイブリッドＧ４について、ＨＩＶおよびＰＩＭ１－第１形態ＨＰ－Ｇ４は、小分子への１５１±２６ｎＭおよび２７９±３２ｎＭ結合を示した。逆平行構造について、ＰＩＭ１－第２形態ＨＰ－Ｇ４は、化合物Ｂ３３へのよりいっそう弱い結合親和性（１．１±０．４μＭ）を示し、２つの断片の相乗効果を完全に失っていた。この観察は、平面Ｇ－テトラドと溝を分離する平行ＭＹＣＮ Ｇ４との配座の相違に起因すると考えられ得た。これらの結果は、開発した分子（化合物Ｂ３３）とＨＰ－Ｇ４との結合事象が、結合部位の形を決めるであろうヘアピン－四重鎖接合部の配座と高度に関係していることを示した。
（実施例１３）
この実施例では、二価化合物の異なるリンカー基を評価した。異なる長さおよび／または官能基を有するリンカーを評価した。結果を図４５に要約する。ＦＩＡおよびＳＰＲを使用して測定したときの各化合物についてのＫ Ｄ 値の特定の結果を、図４６Ａ～４６Ｄおよび図４７Ａ～４７Ｈにそれぞれ提供する。この実施例では、Ｂ３５は、Ｂ３２（ＦＩＡにより３１１±５２ｎＭ、およびＳＰＲにより３０３±３２ｎＭ）と比較して＞１０倍の改善を示す、最低Ｋ Ｄ （ＦＩＡにより３８±５ｎＭ、ＳＰＲにより１４±６ｎＭ）を示した。この解離定数は、平行Ｇ４構造に結合する報告された抗体（ｓｃＦＶ：Ｋ Ｄ 約３０ｎＭ）と同等であった。リンカーをさらに延長した（例えば、化合物Ｂ３８におけるものなどの、ＰＥＧ２基を使用して）場合、より弱い結合が観察され（ＦＩＡにより６９±２１ｎＭ、ＳＰＲにより８７±３９ｎＭ）、Ｂ３３のものより強いものはなかった。加えて、短いリンカーを有するアムサクリンは、ＭＹＣＮ ＨＰ－Ｇ４へのよりいっそう弱い結合（２．９±０．５μＭ）を示した（図４８Ａおよび４８Ｂを参照されたい）。また、化合物Ｂ３２およびアムサクリンは、低マイクロモルレベルでｄｓＤＮＡに結合した（図４９Ａおよび４９Ｂを参照されたい）。特定の例では、化合物Ｂ３５におけるＰＥＧリンカーは、適切に確認して２つの断片の結合部位への適合を助長したばかりでなく、細胞アッセイ評価を助長し得る水溶性にも寄与した。
ＩＸ．追加の配列
ヒトＭＹＣＮをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）の配列
Figure 2024522183000307
Figure 2024522183000308
Figure 2024522183000309
Figure 2024522183000310
ヒトＭＹＣＮＯＳをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列（配列番号４０）の配列：
Figure 2024522183000311
Figure 2024522183000312
Figure 2024522183000313
Figure 2024522183000314
本開示の原理を応用することができる多くの可能な実施態様にかんがみて、説明した実施態様が好ましい例に過ぎず、本開示の範囲を限定するものと見なすべきでないことを認識されたい。むしろ、範囲は、以下の請求項により定義される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲および趣旨に入る全てを本発明であると主張する。
関連出願への相互参照
本願は、２０２１年６月９日に出願した米国特許仮出願第６３／２０８，９１８号の、より早い出願日に基づく利益および優先権を主張するものであり、前記仮特許出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援の確認
本発明は、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所－がん研究センターにより授与されたプロジェクト番号Ｚ０１ ＺＩＡ ＢＣ０１１５８５ ０７のもとで政府支援を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
分野
本開示は、ある特定の遺伝子に見られる非標準Ｇ四重鎖ＤＮＡ構造に選択的に結合する化合物、ならびにがん細胞などの細胞におけるそのような遺伝子の発現を低減または阻害するために化合物を使用する方法に関する。
背景
遺伝子のＭＹＣファミリーは、遺伝子発現を広く支配し増幅させる転写因子をコードする。ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、およびｌ－Ｍｙｃという３つのＭｙｃタンパク質は、塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）領域を含有し、この領域は、ＤＮＡに結合し、転写を直接制御する。これらの遺伝子の中で、ＭＹＣＮは、胎児発生に関与することおよび神経組織に高度に発現されることが示されている。ＭＹＣＮは、多くの場合、がんの際に過剰発現されるかまたは変異し、神経芽細胞腫および小細胞肺がんなどのがんにおける癌遺伝子と見なされている。ＭＹＣＮ遺伝子座内には第２の転写物が埋め込まれており、この第２の転写物は、アンチセンス転写によって産生され、元々、ｎｃｙｍと呼ばれていたものであり、ＭＹＣＮ逆鎖（ＭＹＣＮＯＳ）と呼ばれるより長鎖のノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）内に埋め込まれていることが示された。ＭＹＣＮＯＳの発現は、ＭＹＣＮのプロモーター占有率を減少させること、および配列相補性によってＭＹＣＮ転写物の安定性を調節することが示されている。つい最近の研究によって、ＭＹＣＮＯＳ転写物のバリアント２であるＮＣＹＭが翻訳されて低分子タンパク質を生成し得ることも示されている。ＮＣＹＭとして公知のこのポリペプチドは、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の安定性を調節すること、ＧＳＫ３βを阻害すること、およびＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に影響を及ぼすことをはじめとする、多様な制御活性を有することを特徴とする。
がんに関与するＮ－Ｍｙｃタンパク質および他のタンパク質を調節または阻害する分子は、抗がん剤として興味深いが、転写因子として、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質は、古典的に「創薬不可能」と見なされており、Ｎ－Ｍｙｃ自体および他の創薬不可能なタンパク質（特に、Ｎ－ＭｙｃのようにＧ四重鎖または「Ｇ４」を含むもの）を標的とするリガンドを開発する試みは、成功していない。タンパク質コードおよび非コード遺伝子産物を含む、疾患関連遺伝子におけるＧ４のような構造に結合してそのような遺伝子を標的にする選択性を実現することができる化合物、例えば小分子が、当技術分野において必要とされている。
要旨
ＭＹＣＮ遺伝子に見られるヘアピン含有Ｇ４などの非標準Ｇ４構造を標的とする小分子化合物の新たなクラスが、本明細書に記載される。特定の実施態様では、化合物は、例えば、細胞（例えば、がん細胞）におけるＮ－Ｍｙｃ発現を低減させるまたは阻害する方法において、ならびに対象におけるがんを処置または予防する方法であって、がんがＮ－Ｍｙｃ過剰発現を少なくとも一つには特徴とする方法において、有用である。
式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000372
（式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルが、本明細書に記載される。
式Ｉによる化合物
Figure 2024522183000373
（式中、
環Ａは、チオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、および１，３，４－オキサジアゾリル以外の５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書に記載される。
一部の実施態様では、化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルは、式Ｉによる構造：
Figure 2024522183000374
（式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ１は、－（ＣＲａ ２）ｍ－Ｒｂであり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、Ｒｂは、窒素含有基であり；
Ｒ２は、Ｈまたはアルキルであり；
各Ｒ３は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり；
ｎは、０、１、２、または３であり；
ｘは、０、１、２、３、４、または５である）
を有し、ただし、化合物は、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、またはＭＹ－１２のいずれか１つとして示される構造を含まない。
一部の実施態様では、化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルは、式Ｉによる構造：
Figure 2024522183000375
（式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ１は、－（ＣＲａ ２）ｍ－Ｒｂまたは－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）ｓ－Ｒｂであり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり、ｔは、１、２、３、４、または５であり、ｒは、１、２、３、４、または５であり、ｓは、０または１であり、Ｒｂは、アクリジニル基であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）
を有する。
本開示による化合物と少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物の実施態様が、さらに開示される。
細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させる方法であって、細胞を、本開示による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含む方法も、開示される。また、細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させるための、本開示による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、細胞を化合物の有効量と接触させるステップを含む使用が、開示される。一部の実施態様では、使用は、対象におけるがんを処置または予防するための使用である。一部の実施態様では、使用は、対象におけるがんを処置または予防するための医薬の製造のための使用である。
本開示の上述のおよび他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかになる。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報のコピーは、請求して必要料金を支払うと、米国特許商標庁によって提供されることになる。
図１は、本明細書で論じる結合選択性プロファイリングに使用した５つのＧ四重鎖配列を記載する表であり、この表中、全てのＤＮＡ／ＲＮＡオリゴは５’末端がＣｙ５蛍光色素で標識されており、Ｇ４形成に関与するグアニンに下線が引かれている。 図２は、ＭＹＣＮ野生型／変異型／短縮型Ｇ４配列を記載する表である。 図３は、ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４形成配列の位置を示す。 図４は、ゲノムワイドなＧ４配列解析によって得たＭＹＣＮ Ｇ４形成確率を示すマップである。 図５Ａおよび５Ｂは、ＭＹＣＮ／ＭＹＣＮＯＳにおけるＧ四重鎖形成配列の四重鎖形成Ｇリッチ配列（またはＱＧＲＳ）解析の結果を示し、図５Ａは、Ｇ４－ｓｅｑ技術により発見されたＭＹＣＮＯＳにおけるＧ４形成配列（目的の標的）を示し、図５Ｂは、この領域内の可能性のあるＧ４のＧスコアを示す。 図６は、小分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）スクリーニングを使用して同定した４つのヒット化合物を示す。 図７は、化合物１、２および５ならびに化合物ＭＹ－１を含む４つの特定の化合物についての構造とともに、ＳＭＭ（５％ＤＭＳＯ中、１００μＭ）からの１４のヒット化合物および陰性対照（化合物１５）についての蛍光強度アッセイ結果を示す。 図８は、図７の化合物についての表面プラズモン共鳴結果を示す。 図９は、化合物１、２、ＭＹ－１、および５についての蛍光強度アッセイによる結合親和性測定結果を示す。 図１０は、化合物１、２、ＭＹ－１、および５についての表面プラズモン共鳴による結合親和性測定結果を示す。 図１１Ａ～１１Ｄは、小分子によるＭＹＣＮ Ｇ４構造安定化および結合選択性評価を示し、図１１Ａは、異なる緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌまたは１００ｍＭ ＬｉＣｌを含有する、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ）中および水中でのＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルであり；図１１Ｂは、低ＫＣｌ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ）中での融解中の５μＭ ＭＹＣＮ Ｇ４のＣＤ曲線記録であり；図１１Ｃは、化合物１またはＭＹ－１を伴う／伴わないＭＹＣＮ Ｇ４融解を示し；図１１Ｄは、化合物１またはＭＹ－１とともにインキュベートしたｄｓＤＮＡのＣＤ融解試験を示す。 図１２は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０と、１００、２０または５ｍＭ ＫＣｌとを含有する緩衝液中でのアニーリング後のＭＹＣＮ Ｇ４のＣＤスペクトルを示す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、１０×ｔＲＮＡが非存在である／存在するＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡに化合物を徐々に加えることにより２－アミノプリン蛍光アッセイを行った、ｔＲＮＡを使用する化合物１（図１３Ａ）およびＭＹ－１（図１３Ｂ）の結合選択性プロファイルを示す。 図１４Ａ～１４Ｅは、ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｇ４オリゴマーの全てを５’においてフルオロフォアで標識し、蛍光強度アッセイにより滴定曲線を得た、化合物１と６つの異なるＧ４標的の結合親和性を示すグラフである。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｇ４オリゴマーの全てを５’においてフルオロフォアで標識し、蛍光強度アッセイにより滴定曲線を得た、化合物ＭＹ－１と６つの異なるＧ４標的の結合親和性を示すグラフである。 図１６Ａ～１６Ｅは、古典的Ｇ４結合剤であるＴＭＰｙＰ４（１００μＭ）を陽性対照として使用して蛍光強度アッセイにより全てのＧ４を試験した、本明細書に記載の選択性評価において使用したＧ４の品質管理グラフである。 図１７は、化合物１とＭＹ－１との競合結合研究のＳＰＲ曲線である。 図１８Ａおよび１８Ｂは、化合物１とＭＹ－１の競合アッセイの結果を示し、図１８Ａは、化合物１およびＭＹ－１の連続注入のＳＰＲ曲線であり、図１８Ｂは、異なる濃度の化合物１を注入した後の化合物ＭＹ－１の結合レベルを示す。 図１９Ａおよび１９Ｂは、５０μＭ（図１９Ａ）および２５０μＭ（図１９Ｂ）の濃度の化合物ＭＹ－１を伴うまたは伴わないＴＭＰｙＰ４のＳＰＲ結合アッセイの結果を示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、個々の化合物（ＭＹ－１）または化合物混合物（１とＭＹ－１）により安定化したＧ４のＣＤ融解曲線（図２０Ａ）、および化合物の組合せにより安定化したＭＹＣＮ Ｇ４の融解温度（図２０Ｂ）を含む。 図２１は、ジョブプロット解析により決定したＭＹＣＮ Ｇ４と結合する化合物ＭＹ－１の化学量論比を示すグラフである。 図２２は、３’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを使用する化合物ＭＹ－１の蛍光滴定を示すグラフである。 図２３Ａおよび２３Ｂは、３’Ｃｙ５－ＭＹＣＮ Ｇ４との化合物ＭＹ－１の結合に関するマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）研究の結果を要約する。 図２４Ａ～２４Ｆは、蛍光失活に基づく方法および硫酸ジメチル（ＤＭＳ）フットプリンティングを使用する結合部位評価からの結果を示し、図２４Ａは、ＭＹＣＩＮ Ｇ４折り畳み構造の模式的予測であり；図２４Ｂは、５’／３’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４の溶液に１００μＭ ＭＹ－１を添加することによる失活研究であり；図２４Ｃは、Ａ１１、Ａ１８およびＡ２４位をそれぞれ標識した２－ＡＰ ＭＹＣＮ Ｇ４の溶液に１００μＭ ＭＹ－１を添加することによる失活研究であり；図２４Ｄは、５’－Ｃｙ５標識されている野生型／変異型／短縮型ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を使用する蛍光滴定を示す－滴定中に蛍光強度を記録し、曲線に当てはめることによりＫＤ値を計算した；図２４Ｅは、副溝結合剤（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびネトロプシン）を使用する蛍光変位アッセイであり；図２４Ｆは、異なる濃度の化合物ＭＹ－１とともにインキュベートしたＭＹＣＮ Ｇ４－ＤＮＡのＤＭＳフットプリンティング結果を示し（四重鎖テトラドに関わるＧトラクトに下線が引かれている）、化合物ＭＹ－１による影響を受けた保護Ｇに点（●）（高度に影響を受けた）または丸（○）（わずかに影響を受けた）が記されている。 同上。 同上。 図２５Ａ～２５Ｃは、Ａ１１（図２５Ａ）、Ａ１８（図２５Ｂ）またはＡ２４（図２５Ｃ）位が２－ＡＰ標識されているＤＮＡオリゴマーを一連の濃度の化合物ＭＹ－１で滴定した、２－ＡＰ修飾に基づく滴定による失活分率決定を示す。 図２６Ａ～２６Ｎは、ＳＰＲを使用して本開示の１４の異なる化合物に関して行った結合アッセイの結果を示す。 同上。 同上。 図２７Ａ～２７Ｎは、Ａ１１位において２－ＡＰ標識されたＤＮＡを使用して本開示の１４の異なる化合物に関して行った結合アッセイの結果を示す。 同上。 同上。 図２８Ａ～２８Ｇは、ＮＢＥＢ細胞におけるＭＹＣＮ／ＭＹＣＮＯＳ発現に対する化合物ＭＹ－８の効果を示し、図２８Ａは、異なる濃度の化合物での処理後の細胞集密度の画像であり；図２８Ｂは、異なる濃度での時間依存的な細胞集密度曲線を示し；図２８Ｃは、細胞生存率のＭＴＳアッセイ解析であり；図２８Ｄ～２８Ｆは、ＭＹ－８処理後のＭＹＣＮ（図２８Ｄ）、ＭＹＣＮＯＳ００１（図２８Ｅ）、およびＭＹＣＮＯＳ００２（図２８Ｆ）ｍＲＮＡ発現のグラフであり；図２８Ｇは、ＭＹ－８処理後のＭＹＣＮレベルを示すウェスタンブロットである。 同上。 図２９は、がん関連遺伝子における代表的なヘアピンＧ４配列を要約する表である。 図３０は、非標準Ｇ４結合構成要素およびＧ４スタッカー構成要素を含む二価化合物（化合物Ｂ３３）の結合活性を示す模式図である。 図３１Ａおよび３１Ｂは、アクリジンＩＣＲ １９１に対するＭＹＣＮヘアピンＧ４結合親和性を示す、時間（図３１Ａ）および濃度（図３１Ｂ）の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである。 図３２Ａおよび３２Ｂは、本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）に対するＭＹＣＮヘアピンＧ４結合親和性を示す、時間（図３２Ａ）および濃度（図３２Ｂ）の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである。 図３３Ａおよび３３Ｂは、アクリジンＩＣＲ １９１（図３３Ａ）の、および本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）（図３３Ｂ）の、ｄｓＤＮＡ結合親和性を示す、時間の関数としての表面プラズモン共鳴応答のグラフである。 図３４Ａおよび３４Ｂは、ＦＩＡを使用する、アクリジンＩＣＲ １９１（図３４Ａ）の、および本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）（図３４Ｂ）の、ｄｓＤＮＡ結合親和性を示す、ＤＮＡ濃度の関数としての蛍光強度のグラフである。 図３５Ａ～３５Ｆは、Ｇ４マイクロアレイと、本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）、チアゾールオレンジ、およびアムサクリンを含む、３つの異なる化合物とを使用する、結合選択性プロファイリングの結果を示し、図３５Ａ、３５Ｃおよび３５Ｅは、二価化合物、チアゾールオレンジおよびアムサクリンそれぞれならびに異なる標的で観察された蛍光を示す光学画像であり；図３５Ｂ、３５Ｄおよび３５Ｆは、二価化合物、チアゾールオレンジおよびアムサクリンそれぞれならびに異なる標的の結合選択性についての蛍光強度値を示す棒グラフである。 同上。 図３６は、対照（ＤＭＳＯ）、アクリジンＩＣＲ、および本開示による二価化合物（化合物Ｂ３３）に曝露されたＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡの熱融解アッセイの結果を示す、円偏光二色性分光法を使用して得られたスペクトルである。 図３７Ａ～３７Ｇは、高密度ＤＮＡオリゴマイクロアレイを使用する、本開示の二価化合物（化合物Ｂ３３）およびチアゾールオレンジの結合選択性プロファイル試験から得られた結果の画像であり、図３７Ａは、これら２つの異なる化合物で観察された蛍光を示す光学画像であり；図３７Ｂは、カーネル密度推定（ＫＤＥ）プロットであり、図３７Ｃは、マイクロアレイ全体にわたっての結合シグナルの分布を表すバイオリンプロットであり；図３７Ｄおよび３７Ｅは、２つの化合物の結合挙動を要約するプロットを提供し；図３７Ｆ（チアゾールオレンジ）および３７Ｇ（二価化合物）は、２つの異なる化合物のジニ係数を提供するグラフである。 同上。 同上。 図３８Ａおよび３８Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）を伴うおよび伴わないＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡのＤＭＳフットプリント（図３８Ａ）、ならびにヘアピン含有Ｇ４の提案折り畳み構造（図３８Ｂ）を提供する。 図３９Ａおよび３９Ｂは、ほどけたヘアピン（図３９Ａ）および短縮型ヘアピン（図３９Ｂ）を有するＭＹＣＮ Ｇ４への二価化合物（化合物Ｂ３３）の結合についての結果のＦＩＡグラフである。 図４０は、弱い結合が観察された、ＭＡＮＧＯ ＩＩ ＲＮＡ Ｇ４への二価化合物（化合物Ｂ３３）の結合についての時間の関数としてのＳＰＲ応答のグラフである。 図４１Ａおよび４１Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および平行構造を有するヘアピンＧ４（ＢＣＬ２）の、結合様式評価の結果を示す。 図４２Ａおよび４２Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および（３＋１）ハイブリッド構造を有するヘアピンＧ４（ＨＩＶ）の、結合様式評価の結果を示す。 図４３Ａおよび４３Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および（３＋１）ハイブリッド構造を有するヘアピンＧ４（ＰＩＭ１－第１形態）の、結合様式評価の結果を示す。 図４４Ａおよび４４Ｂは、二価化合物（化合物Ｂ３３）、および（２＋２）いす型構造を有するヘアピンＧ４（ＰＩＭ１－第２形態）の、結合様式評価の結果を示す。 図４５は、異なるリンカー基を有する異なる二価化合物（Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、およびＢ３８）についてのＭＹＣＮ ＨＰ－Ｇ４結合活性結果（ＦＩＡおよびＳＰＲを使用して評価したときのもの）の要約を示す。 図４６Ａ～４６Ｄは、異なるリンカー基を有する異なる二価化合物（Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、およびＢ３８）についてのＦＩＡ結果のグラフである。 同上。 図４７Ａ～４７Ｈは、異なるリンカー基を有する異なる二価化合物（Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、およびＢ３８）についてのＳＰＲ結果のグラフである。 同上。 図４８Ａおよび４８Ｂは、アムサクリンについてのＳＰＲ結果のグラフである。 図４９Ａおよび４９Ｂは、二価化合物（Ｂ３２）（図４９Ａ）およびアムサクリン（図４９Ｂ）とｄｓＤＮＡについてのＳＰＲ結果のグラフである。
配列
添付の配列表に収載されている核酸およびアミノ酸配列は、アメリカ合衆国特許規則連邦規則法典第３７巻§１．８２２において規定のとおり、ヌクレオチド塩基については標準文字略号およびアミノ酸については３文字表記を使用して示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、表示されている鎖への一切の言及により相補鎖が含まれると解される。配列表は、２０２２年６月３日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」（２８，６７２バイト）という名のファイルの形式でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において、
配列番号１は、ヒトＭＹＣＮをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である。
配列番号２～６は、それぞれ、ＢＣＬ２、ＫＲＡＳ、ｍＴＯＲ、ＮＲＡＳ、およびテロメアＤＮＡについての、Ｇ四重鎖オリゴヌクレオチドの例示的な核酸配列である。
配列番号７は、例示的なＭＹＣＮ Ｇ４野生型オリゴヌクレオチドである。
配列番号８は、例示的なＭＹＣＮ Ｇ４変異型オリゴヌクレオチドである。
配列番号９は、例示的なＭＹＣＮ Ｇ４短縮型オリゴヌクレオチドである。
配列番号１０は、ＭＹＣＮＯｓ－０１のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１１は、ＭＹＣＮＯｓ－０１のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１２は、ＭＹＣＮＯｓ－０２のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１３は、ＭＹＣＮＯｓ－０２のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１４は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム１のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１５は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム１のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１６は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム２のセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１７は、ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム２のアンチセンス鎖についてのプライマーの例示的な核酸配列である。
配列番号１８は、ＭＹＣＮ Ｇ４四重鎖形成配列の例示的な核酸配列である。
配列番号１９は、ＭＹＣＮＯＳにおけるＧ４形成配列の例示的な核酸配列である。
配列番号２０～２３は、ＭＹＣＮＯＳにおける可能性のあるＧ４の例示的な核酸配列である。
配列番号２４～３０は、それぞれ、ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＭＹＣＬ、ＢＲＤ４、ＢＣＬ２、ＬＩＮＣ０１０１８およびＳＯＸ１２における、ヘアピンＧ４配列の例示的な核酸配列である。
配列番号３１は、例示的なｈＴＥＲＴ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３２は、例示的なＢＣＬ２ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３３は、例示的なＲＢ１ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３４は、例示的なＶＥＧＦ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３５は、例示的なｃ－ＭＹＣ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３６は、例示的なｃ－ＫＩＴ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３７は、例示的なｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
配列番号３８は、例示的なＨＩＦ１－ａ Ｇ４オリゴヌクレオチドである。
配列番号３９は、例示的なｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
配列番号４０は、ヒトＭＹＣＮＯＳをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である。
詳細な説明
Ｉ．定義および略語
用語および略語の以下の説明は、本開示をよりよく説明するためにおよび本開示を実施する際に当業者の指針となるように提供される。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の言及対象を含む。用語「または」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、述べられている代替要素のうちの単一の要素、または２つもしくはそれより多くの要素の組合せを指す。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「Ａ」または「Ｂ」を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、Ａを含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、Ｂを含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、またはＡとＢの両方を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を指す。
別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験の際に使用することができるが、好適な方法および材料が下で説明される。材料、方法および例は、説明に役立つものに過ぎず、限定することを意図したものではない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
数値範囲の開示は、別段の注記がない限り、終点を含めて範囲内の各々の離散点に言及するものと理解されたい。別段の指示がない限り、本明細書または特許請求の範囲において使用される場合の構成要素、分子量、パーセンテージ、温度、時間などについての量を表す全ての数は、用語「約」により修飾されていると理解されたい。したがって、暗黙的であれ明示的であれ別段の指示がない限り、または文脈がより限定的な構成を有すると当業者によって適切に理解される場合を除き、示される数値パラメーターは、探究される所望の特性、および／または当業者に公知の標準的な試験条件／方法のもとでの検出限界に依存し得る、近似値である。実施態様と論じられる先行技術を直接かつ明示的に区別するときには、実施態様の数は、「約」という語の記述がない限り、近似値ではない。核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量値は、近似値であり、説明のために提供されることを、さらに理解されたい。
様々な構成要素、パラメーター、動作条件などの代替案が本明細書で示されるが、それは、それらの代替案が必然的に同等であるおよび／または同様に良好に機能することを意味しない。別段の記述がない限り、代替案が好ましい順序で列挙されていることも意味しない。
下で提供される定義が、許されない置換パターン（例えば、５つの異なる基で置換されたメチルなど）を含むことを意図したものでないことは、当業者には分かるであろう。そのような許されない置換パターンは、当業者には容易に分かる。本明細書で開示されるおよび／または上で定義されたいずれの官能基も、本明細書中で別段の指示がない限り、置換または非置換であり得る。
化学における一般用語の定義は、Richard J. Lewis, Sr. (ed.), Hawley's Condensed Chemical Dictionary, published by John Wiley & Sons, Inc., 2016 (ISBN 978-1-118-13515-0)において見つけることができる。本開示の化合物は、重水素、三重水素、１８Ｆ、１４Ｃなどをこれらに限定されないが含み得る、化合物中に存在する原子に全ての同位体も含む。
化合物が、互変異性、配座異性、幾何異性、および／または光学異性の現象を示し得ることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ある特定の開示化合物は、１つまたは複数のキラル中心および／または二重結合を含むことができ、結果として、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、エナンチオマー、ジアステレオマー、およびこれらの混合物、例えば、ラセミ混合物として存在し得る。別の例として、ある特定の開示化合物は、エノール形、ケト形、およびこれらの混合物を含む、いくつかの互変異性体形で存在し得る。本明細書および特許請求の範囲内の様々な化合物名、式および化合物図が、可能性のある互変異性体形、配座異性体形、光学異性体形または幾何異性体形の１つだけを表し得る場合、開示化合物が、本明細書に記載される化合物の任意の互変異性体形、配座異性体形、光学異性体形および／または幾何異性体形はもちろん、これらの様々な異なる異性体形の混合物も包含することは、当業者には理解されるであろう。エナンチオマーおよび／または立体異性体の混合物をはじめとする異なる異性体形の混合物を、特に本開示の恩恵を受ける当業者に公知の技術を使用して分離して、各々の別々のエナンチオマーおよび／または立体異性体を得ることができる。例えば、アミド結合の周りの、またはピリジニル環、ビフェニル基などの２つの直接結合している環の間の、回転が制限されている場合、アトロプ異性体も可能性があり、アトロプ異性体も、本明細書で開示される化合物に特に含まれる。
いずれの実施態様においても、化合物中に存在する、または化合物中の特定の基もしくは部分の中に存在する、いずれかのまたは全ての水素が、重水素または三重水素によって置き換えられていることがある。したがって、アルキルの記述は、存在する１から最大数の水素が重水素によって置き換えられていることがある、重水素化アルキルを含む。例えば、メチルは、ＣＨ３、または１～３個の水素が重水素で置き換えられている、例えばＣＤｘＨ３－ｘでの、ＣＨ３、両方を指す。
本明細書で使用される場合、用語「置換されている」は、用語における全ての後続の修飾語句を指し、例えば、用語「置換されている脂肪族－芳香族」において、置換は、「脂肪族」部分に存在することもあり、「芳香族」部分に存在することもあり、または脂肪族－芳香族基の両方の部分に存在することもある。
「置換されている」は、明記されている基または部分を修飾するために使用される場合、明記されている基または部分の少なくとも１個の、恐らく２個またはそれより多くの、水素原子が、同じまたは異なる置換基で独立して置き換えられていることを意味する。特定の実施態様では、基、部分、または置換基は、「非置換の」または「置換されている」のどちらかとして明確に定義されている場合を除き、置換されていてもよく、または非置換であってもよい。したがって、本明細書に明記される官能基のいずれも、文脈による別段の指示がない限りまたは特定の構造式が置換を不可能にする場合を除き、非置換であってもよく、または置換されていてもよい。特定の実施態様では、置換基は、置換されていると明確に定義されていることもあり、されていないこともあるが、それでもやはり、必要に応じて置換されていることが企図される。例えば、「脂肪族」または「環式」部分は、非置換であってもよく、または置換されていてもよいが、「非置換脂肪族」または「非置換環式」は、置換されていない。１つの実施態様では、置換されている基は、少なくとも１つの置換基から特定の部分に可能な数までの置換基、例えば、１つの置換基、２つの置換基、３つの置換基、または４つの置換基を有する。
構造の他の部分への基または部分の接続が、明確に述べられているまたは文脈により暗示される場合を除き、原子価則の考慮、例示的な種の比較、および／または官能性の考慮などにより、当業者には理解されるように、本明細書で定義されるいずれの基または部分も、開示される構造の任意の他の部分、例えば、親またはコア構造に接続され得る。
本開示の様々な実施態様の再考を容易にするために、特定の用語についての以下の説明が提供される：
ハロゲン化アシル：－Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、ハロゲン、例えば、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、またはＣｌである）。
投与：薬剤、例えば、ＭＹＣＮ（Ｎ－Ｍｙｃをコードする）の非標準Ｇ４などの、非標準Ｇ４に選択的に結合する化合物（例えば、小化合物）を、任意の有効な経路により対象に提供することまたは与えること。一部の実施態様では、投与は、薬剤、例えば、ｃ－ＭＹＣプロモーターにおけるＧ４四重鎖ＤＮＡに選択的に結合する小分子化合物を、任意の有効な経路により対象に提供することまたは与えることを含み得る。例示的投与経路としては、経口、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、局所的）、鼻腔内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。
同時投与または同時投与することは、同じ一般的な期間内の少なくとも２つの治療用化合物の投与を指し、正確に同じ時点での投与を必要としない（とはいえ、併用投与は、正確に同じ時点で投与することを含んでいる）。したがって、同時投与は、同じ日であってもよく、または異なる日であってもよく、または同じ週であってもよく、または異なる週であってもよい。本明細書で開示される治療用化合物を同じ組成物に含めてもよく、またはそれらを、各々個別に、別々の組成物に含めてもよい。ある特定の実施態様では、２つの化合物は、それらのそれぞれの生物活性期間がオーバーラップしている時間枠中に投与され得る。したがって、この用語は、２つまたはそれより多くの化合物の逐次的投与はもちろん同じ時間範囲内の投与も含む。
化合物「の投与」および「を投与すること」は、本明細書に記載の化合物、化合物のプロドラッグ、または医薬組成物を提供することを意味すると理解されたい。化合物または組成物は、別人により対象に（例えば、静脈内）投与されることもあり、または対象により自己投与されることもある（例えば、錠剤）。
薬剤：目標または結果を達成するのに有用である、任意の物質、または物質の任意の組合せ；例えば、対象における腫瘍成長を減少または低減させるのに有用な物質または物質の組合せ。薬剤は、エフェクター分子および検出可能なマーカーを含む。一部の実施態様では、薬剤は、化学療法剤である。特定の薬剤が、１つより多くの結果を達成するのに有用であり得ることは、当業者には理解されるであろう；例えば、薬剤は、検出可能なマーカーとしても、化学療法剤としても、有用であり得る。
アルデヒド：－Ｃ（Ｏ）Ｈ。
脂肪族：アルカン（またはアルキル）、アルケン（またはアルケニル）、アルキン（またはアルキニル）を、これらの環式バージョンを含めて、さらに直鎖および分岐鎖配置、ならびに全ての立体および位置異性体も含めて含む、少なくとも１個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ１～５０）、例えば、１個～２５個の炭素原子（Ｃ１～２５）、または１個～１０個の炭素原子（Ｃ１～１０）、または１個～６個の炭素原子（Ｃ１～６）、または１個～４個の炭素原子（Ｃ１～４）を有する、炭化水素基（例えば、実質的に炭化水素に基づく化合物）。脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。例示的な置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシル、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノアルキル、アリール、アリールアルキル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、ジアルキルアミノ、ハロ、ハロ脂肪族、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール、複素環式脂肪族、ヒドロキシル、オキソ、スルホンアミド、スルフヒドリル、チオアルコキシ、または他の官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
アルケニル：少なくとも２個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ２～５０）、例えば、２個～２５個の炭素原子（Ｃ２～２５）、または２個～１０個の炭素原子（Ｃ２～１０）と、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合とを有する不飽和一価炭化水素であって、親アルケンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる不飽和一価炭化水素。アルケニル基は、分岐し得、直鎖であり得、環式（例えば、シクロアルケニル）であり得、シスまたはトランス（例えば、ＥまたはＺ）であり得る。アルケニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アルコキシ：－Ｏ－脂肪族、例えば、－Ｏ－アルキル、－Ｏ－アルケニル、－Ｏ－アルキニル；これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、シクロプロポキシ、シクロへキシルオキシなど（このような基の脂肪族構成要素のいずれも、二重結合も三重結合も含まないことがあり、または１つもしくは複数の二重結合および／もしくは三重結合を含むことがある）を含む、例示的な実施態様がある。アルコキシ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アルキル：少なくとも１個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ１～５０）、例えば、１個～２５個の炭素原子（Ｃ１～２５）、または１個～１０個の炭素原子（Ｃ１～１０）を有する、飽和一価炭化水素であって、親化合物（例えば、アルカン）の１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる飽和一価炭化水素。アルキル基は、分岐し得、直鎖であり得、または環式（例えば、シクロアルキル）であり得る。アルキル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。一部の実施態様では、低級アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ６）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ペンチル、３－ペンチル、またはヘキシルであり得；（Ｃ３～Ｃ６）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロへキシルであり得；（Ｃ３～Ｃ６）シクロアルキル（Ｃ１～Ｃ６）アルキルは、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、２－シクロプロピルエチル、２－シクロブチルエチル、２－シクロペンチルエチル、または２－シクロヘキシルエチルであり得；（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ペントキシ、３－ペントキシ、またはヘキシルオキシであり得；（Ｃ２～Ｃ６）アルケニルは、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、または５－ヘキセニルであり得；（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルは、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、３－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－ペンチニル、４－ペンチニル、１－ヘキシニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、４－ヘキシニル、または５－ヘキシニルであり得；（Ｃ１～Ｃ６）アルカノールは、アセチル、プロパノイルまたはブタノイルであり得；ハロ（Ｃ１～Ｃ６）アルキルは、ヨードメチル、ブロモメチル、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、２－クロロエチル、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、またはペンタフルオロエチルであり得；ヒドロキシ（Ｃ１～Ｃ６）アルキルは、ヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル、１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル、１－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル、１－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル、１－ヒドロキシヘキシル、または６－ヒドロキシヘキシルであり得；（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル、またはヘキシルオキシカルボニルであり得；（Ｃ１～Ｃ６）アルキルチオは、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、イソブチルチオ、ペンチルチオ、またはヘキシルチオであり得；（Ｃ２～Ｃ６）アルカノイルオキシは、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、イソブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、またはヘキサノイルオキシであり得る。
アルキニル：少なくとも２個の炭素原子～５０個の炭素原子（Ｃ２～５０）、例えば、２個～２５個の炭素原子（Ｃ２～２５）、または２個～１０個の炭素原子（Ｃ２～１０）と、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合とを有する不飽和一価炭化水素であって、親アルキンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる不飽和一価炭化水素。アルキニル基は、分岐し得、直鎖であり得、または環式（例えば、シクロアルキニル）であり得る。アルケニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アミド：－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆまたは－ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｆ（式中、ＲｅおよびＲｆの各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択され、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る）。
アミノ：－ＮＲｅＲｆ（式中、ＲｅおよびＲｆの各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択され、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る）。
類似体：化学構造が親化合物と異なる分子、例えば、相同体（アルキル鎖の長さの違いまたは１つもしくは複数の同位体の組み入れの違いなど、化学構造または質量の増大の点で異なる）、分子断片、１つもしくは複数の官能基またはイオン化の変化の点で異なる構造。類似体は、必ずしも親化合物から合成されるとは限らない。誘導体は、基礎構造から誘導される分子である。
芳香族：別段の定めがない限り、単一の環（例えば、フェニル）、または少なくとも１つの環が芳香族である複数の縮合している環（例えば、ナフチル、インドリル、またはピラゾロピリジニル）を有する、すなわち、少なくとも１つの環、および必要に応じて複数の縮合している環が、連続、非局在化π電子系を有する、環原子数５～１５の環式の共役基または部分。典型的には、面外π電子の数は、ヒュッケル則（４ｎ＋２）に対応する。親構造への結合点は、典型的には、縮合環系の芳香族部分を介したものである。例えば、
Figure 2024522183000376
。しかし、ある特定の例では、文脈または表される開示は、結合点が、縮合環系の非芳香族部分を介したものであることを示すことがある。例えば、
Figure 2024522183000377
。芳香族基または部分は、環内に、例えば、アリール基もしくは部分に、炭素原子のみを含んでもよく、または１個もしくは複数の環炭素原子と、孤立電子対（例えば、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＰもしくはＳｉ）を含む１個もしくは複数の環ヘテロ原子とを、例えばヘテロアリール基もしくは部分に含んでもよい。芳香族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アリール：少なくとも５個の炭素原子を含む、一部の実施態様では、少なくとも５個の炭素原子～１５個の炭素原子（Ｃ５～Ｃ１５）、例えば、５個～１０個の炭素原子（Ｃ５～Ｃ１０）を有する、芳香族炭素環式基であって、単一の環または複数の縮合した環を有し、これらの縮合環が、芳香族であってもまたはなくてもよいが、ただし、本明細書で開示される化合物の残りの位置への結合点が芳香族炭素環式基の原子を介したものであることを条件とする、芳香族炭素環式基。アリール基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。一部の実施態様では、アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸またはアルコキシを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の基で置換され得る。
アロキシ：－Ｏ－芳香族。アロキシ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
アゾ：－Ｎ＝ＮＲｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である）。アゾ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
がん：分化の喪失を伴う特徴的な退形成を被った、成長速度の上昇、周囲組織への浸潤を有し、転移することができる、悪性腫瘍。例えば、甲状腺がんは、甲状腺組織にまたは甲状腺組織から発生する悪性腫瘍であり、乳がんは、乳房組織にまたは乳房組織から発生する悪性腫瘍（例えば、乳管癌）である。残存がんは、がんを低減または根絶させるために対象に施された任意の形態の処置の後に対象中に残存するがんである。転移がんは、転移がんが由来する元の（原発）がんの発生部位以外の１つまたは複数の体内部位における腫瘍である。がんは、固形腫瘍を含むが、これらに限定されない。
カルバメート：－ＯＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ（式中、ＲｅおよびＲｆの各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。カルバメート基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
カーボネート：－ＯＣ（Ｏ）ＯＲｄ（式中、Ｒｄは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。カーボネート基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。独立した実施態様では、Ｒｄは、水素であり得る。
カルボキシル：－Ｃ（Ｏ）ＯＨ。
カルボキシレート：－Ｃ（Ｏ）Ｏ－またはその塩。このカルボキシレート基の負電荷をＭ＋対イオンで平衡させることができ、Ｍ＋は、アルカリイオン、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋；アンモニウムイオン、例えば、＋Ｎ（Ｒｅ）４（式中、Ｒｅは、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、もしくは［Ｂａ２＋］０．５であり得る。
化学療法剤：異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置に治療的有用性がある、任意の化学薬品。例えば、化学療法剤は、神経芽細胞腫の処置に有用である。使用することができる追加の治療剤の特定の例としては、微小管結合剤、ＤＮＡ挿入剤または架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子制御剤、および血管新生阻害剤が挙げられる。１つの実施態様では、化学療法剤は、放射性化合物である。当業者は、有用である化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition；Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., (c) 2000 Churchill Livingstone, Inc；Baltzer, L., Berkery, R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995；Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993；Chabner and Longo, Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice (4th ed.). Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins, 2005；Skeel,. Handbook of Cancer Chemotherapy (6th ed.). Lippincott Williams & Wilkins, 2003を参照されたい）。併用化学療法は、がんを処置するための１つより多くの薬剤の投与である。
対照：実験試料との比較に使用される試料または標準物質。一部の実施態様では、対照は、健常な患者から採取された試料、またはがんと診断された患者から採取された非腫瘍組織試料である。他の実施態様では、対照は、がんと診断された患者から採取された腫瘍組織試料である。一部の実施態様では、対照は、本明細書で開示のＧ４安定剤での処置を受けていない、がんと診断された患者から採取された腫瘍組織試料である。さらに他の実施態様では、対照は、歴史的対照または標準参照値または値域（例えば、以前に試験された対照試料、例えば、予後もしくは転帰が既知であるがん患者の群、またはベースラインもしくは正常値を示す試料の群、例えば、非腫瘍組織におけるＭＹＣＮもしくはＭＹＣ遺伝子の発現レベル）である。
シアノ：－ＣＮ。
減少させるまたは低下／低減させる／軽減する（ｒｅｄｕｃｅ）：何かの質、量または強度を低下させること；例えば、腫瘍負荷の低減。一例では、治療は、例えば治療の非存在下での応答と比較して、腫瘍（例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移、もしくはこれらの組合せ）を低減させる、または腫瘍に関連する１つもしくは複数の症状を軽減する。特定の例では、治療は、治療の後に腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移、またはこれらの組合せを減少させる、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の減少。そのような減少を、本明細書で開示される方法を使用して測定することができる。
遺伝子産物の発現のレベルを決定することまたは検出すること：例えば、当技術分野では公知の常套的な方法を使用して、例えば、核酸分子またはタンパク質を検出することによる、定性的方法または定量的方法どちらかでの発現レベルの検出。
診断：疾患を、その徴候、症状、および様々な検査の結果により同定するプロセス。そのプロセスによって達する結論もまた「診断」と呼ばれる。一般に行われる検査の形態としては、血液検査、医用イメージング、尿検査、および生検が挙げられる。
ジスルフィド：－ＳＳＲｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。ジスルフィド基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ジチオカルボン酸：－Ｃ（Ｓ）ＳＲｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。ジチオカルボン酸基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
エステル：－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒｄ（式中、Ｒｄは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。一部の実施態様では、ＣＯ２Ｃ１～３アルキル基、例えば、メチルエステル（ＣＯ２Ｍｅ）、エチルエステル（ＣＯ２Ｅｔ）、およびプロピルエステル（ＣＯ２Ｐｒ）などが好ましく、これらの逆エステル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）Ｍｅ、－ＯＣ（Ｏ）Ｅｔおよび－ＯＣ（Ｏ）Ｐｒ）を含む。エステル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
エーテル：－脂肪族－Ｏ－脂肪族、－脂肪族－Ｏ－芳香族、－芳香族－Ｏ－脂肪族、または－芳香族－Ｏ－芳香族。エーテル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ヘアピン：用語「ヘアピン」は、反対方向に読んだときに配列が通常は相補的である同じ鎖の２つの領域が塩基対合して、ヘアピンの遠位末端に不対ループを有する二重ヘリックスを形成している、ＤＮＡ構造を指す：
Figure 2024522183000378
ハロ（またはハロゲン化物またはハロゲン）：フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード。一部の実施態様では、ハロは、アスタチンも含み得る。
ハロ脂肪族：１個または複数の水素原子、例えば、１個～１０個の水素原子が、独立して、ハロゲン原子、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードに置き換えられている、脂肪族基。ハロ脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ハロアルキル：１個または複数の水素原子、例えば、１個～１０個の水素原子が、独立して、ハロゲン原子、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードに置き換えられている、アルキル基。ハロアルキル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。独立した実施態様では、ハロアルキルは、ＣＸ３基であり得、この式中の各Ｘは、独立して、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードから選択されることがある。
ハロヘテロ脂肪族：１個または複数の水素原子、例えば、１個～１０個の水素原子が、独立して、ハロゲン原子、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードに置き換えられている、ヘテロ脂肪族基。ハロヘテロ脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ヘテロ脂肪族：酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、リン、およびこれらの酸化形態から、それらに限定されないが、選択され得る、少なくとも１個のヘテロ原子～２０個のヘテロ原子、例えば、１個～１５個のヘテロ原子、または１個～５個のヘテロ原子を基内に含む、脂肪族基。アルコキシ、エーテル、アミノ、ジスルフィド、ペルオキシ、およびチオエーテル基が、ヘテロ脂肪族の典型的（しかし、非限定的）な例である。ヘテロ脂肪族基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ヘテロアリール：酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、リン、およびこれらの酸化形態から、それらに限定されないが、選択され得る、少なくとも１個のヘテロ原子～６個のヘテロ原子、例えば、１個～４個のヘテロ原子を環内に含む、芳香族基（例えば、アリール基）。そのようなヘテロアリール基は、単一の環または複数の縮合した環を有することがあり、縮合環は、芳香族であってもなくてもよく、および／またはヘテロ原子を含有してもしなくてもよいが、ただし、結合点が、芳香族ヘテロアリール基の原子を介したものであることを条件とする。ヘテロアリール基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換されていてもよい。
ヘテロ原子：炭素または水素以外の原子、例えば（これらに限定されないが）、酸素、窒素、硫黄、ケイ素、ホウ素、セレン、またはリン。原子価による制約により許されない場合などの、特定の開示される実施態様では、ヘテロ原子は、ハロゲン原子を含まない。
複素環／複素環式脂肪族：少なくとも１個の炭素原子および少なくとも１個のヘテロ原子を有する、すなわち、１個または複数の炭素原子が、少なくとも１つの孤立電子対を有する原子、典型的には窒素、酸素、リン、ケイ素または硫黄、で置き換えられている、環式脂肪族基。複素環式基は、単環式であることもあり、または二環式であることもある。
ヒドロキシ：式－ＯＨにより表される基。
単離されたまたは精製された：生物学的構成要素は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞における他の生物学的構成要素、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、脂質ならびにオルガネラ、から実質的に分離されたまたは精製された構成要素である。「単離された」は、絶対純度を必要としない。例えば、所望される単離された生物学的構成要素は、調製物の全内容物の少なくとも５０％、特に少なくとも約７５％、より特に少なくとも約９０％、最も特に少なくとも約９８％に相当し得る。本明細書に記載の単離された生物学的構成要素は、多くの方法、例えば、塩分画、フェノール抽出、有機溶媒（例えば、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、またはエタノール）による沈殿、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点電気泳動、物理的分離（例えば、遠心分離または撹拌）などにより、単離することができる。
精製されたという用語は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的用語として意図されたものである。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、細胞内のその天然環境にあるペプチドまたはタンパク質より濃縮されているものである。例えば、化合物調製物は、所望の多糖タンパク質コンジュゲートが、調製物の全内容物の少なくとも５０％、より特に少なくとも約９０％、最も特に少なくとも約９８％に相当するように、精製される。
ケトン：－Ｃ（Ｏ）Ｒｄ（式中、Ｒｄは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。ケトン基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
窒素含有基：少なくとも１個の窒素原子を含む基。一部の実施態様では、窒素含有基は、アミド基またはアミノ基である。一部の実施態様では、窒素含有基は、少なくとも１個の窒素原子を含む、単または二環式環、または環系を含み得る。環または環系は、ヘテロ原子に加えて１個～９個の炭素原子を一般に含み、飽和していることもあり、不飽和であることもあり、または芳香族（シュード芳香族を含む）であることもある。用語「シュード芳香族」は、電子の非局在化によって安定化される環系であって、芳香族環と同様に挙動する環系を指す。芳香族は、シュード芳香族環系、例えば、ピロリル環を含む。
窒素含有基の例としては、ヘテロアリール基および／または環式ヘテロ脂肪族基、例えば、ピロリル、Ｈ－ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル（１，２，３－および１，２，４－オキサジアゾリルを含む）、イソオキサゾリル、フラザニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、トリアゾリル（１，２，３－および１，３，４－トリアゾリルを含む）、テトラゾリル、チアジアゾリル（１，２，３，－および１，３，４－チアジアゾリルを含む）、ジチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、トリアジニル、１Ｈチエノ［２，３－ｃ］ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、イソキノリニル、キノリニル、キノキサリニル、プリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾトリアジニルなどが、挙げられる。そのような窒素含有基は、炭素環式環、例えば、フェニル、ナフチル、インデニル、アズレニル、フルオレニルおよびアントラセニルと融合していることがある。別段の定義がない限り、必要に応じて置換されている環式窒素含有基には、好適な環窒素原子のピリジニウム塩およびＮ－酸化物形が含まれる。一部の実施態様では、窒素含有基は、広範な置換基で、好ましくは、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アミノ、シアノまたはモノもしくはジ（Ｃ１～６アルキル）アミノで必要に応じて置換され得る。
Ｎ－Ｍｙｃ：Ｎ－Ｍｙｃタンパク質は、ＭＹＣＮ遺伝子によりコードされる。ＭＹＣＮは、胎児発生に極めて重要であることおよび神経組織に高度に発現されることが示されている。ＭＹＣＮは、多くの場合、がんの際に過剰発現されるかまたは変異し、特に神経芽細胞腫および小細胞肺がんにおける、癌遺伝子と見なされている。ＭＹＣＮの配列情報は、公開データベース、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｕｓｗｅｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）遺伝子ＩＤ番号：ＥＮＳＧ０００００１３４３２３に記載されている。ＭＹＣＮ逆鎖（ＭＹＣＮＯＳ）は、ＭＹＣＮのアンチセンス鎖上に位置する。ＭＹＣＮＯＳの発現は、ＭＹＣＮのプロモーター占有率を減少させること、および配列相補性によってＭＹＣＮ転写物の安定性を調節することが示されている。つい最近の研究によって、ＭＹＣＮＯＳ転写物のバリアント２であるＮＣＹＭが翻訳されて低分子タンパク質を生成することもあることが示されている。ＮＣＹＭとして公知のこのポリペプチドは、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の安定性を調節すること、ＧＳＫ３βを阻害すること、およびＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に影響を及ぼすことをはじめとする、多様な制御活性を有することを特徴とする。ＭＹＣＮＯＳの配列情報は、公開データベース、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｕｓｗｅｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）遺伝子ＩＤ番号：ＥＮＳＧ０００００２３３７１８に記載されている。
有機官能基：脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、ハロ脂肪族および／もしくはハロヘテロ脂肪族基の任意の組合せにより提供され得る、またはアルデヒド、アロキシ、ハロゲン化アシル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アジド、カルボキシル（またはカルボキシレート）、アミド、ケトン、カーボネート、イミン、アゾ、カルバメート、ヒドロキシル、チオール、スルホニル（またはスルホネート）、オキシム、エステル、チオシアネート、チオケトン、チオカルボン酸、チオエステル、ジチオカルボン酸、ホスホネート、ホスフェート、シリルエーテル、スルフィニル、スルホンアミド、チアールもしくはこれらの組合せからこれらに限定されないが選択され得る、官能基。有機官能基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
オキシム：－ＣＲｄ＝ＮＯＨ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である）。オキシム基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ペルオキシ：－Ｏ－ＯＲｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基である）。ペルオキシ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
医薬組成物：開示化合物の１つまたは複数についての量（例えば、単位投薬量）を、担体、希釈剤および／またはアジュバントをはじめとする非毒性の薬学的に許容される添加剤の１つまたは複数、ならびに必要に応じて他の生物活性成分と一緒に含む、組成物。そのような医薬組成物を、標準的な医薬製剤技術、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (19th Edition)において開示されているものにより、調製することができる。
薬学的に許容される担体：有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995には、開示免疫原の薬学的送達に好適な組成物および製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、薬学的におよび生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどをビヒクルとして含む、注射可能な流体を通常は含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）のための従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されることになる医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存薬、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。対象への投与に好適な、特定の実施態様では、担体は、滅菌されたものであり得、および／または所望の腫瘍応答を誘導するのに好適な組成物の１もしくは複数の測定された用量を含有する単位剤形に懸濁もしくは別様に含有され得る。それは、処置を目的としたその使用のための薬物に付随することもある。単位剤形は、例えば、滅菌された内容物を収容している密封バイアル、もしくは対象への注射用の注射器の中にあり得、またはその後の可溶化および投与のために凍結乾燥され得、または固体もしくは調節放出投薬量であり得る。
薬学的に許容される塩またはエステル：例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸などを含むがこれらに限定されない無機および有機酸の、塩を含む、従来の手段により調製される塩またはエステル。
本開示の化合物の薬学的に許容される塩には、カチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛から、ならびに塩基、例えば、アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ－メチル－グルタミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、および水酸化テトラメチルアンモニウムから、形成されるものも含まれる。これらの塩は、標準手順により、例えば、遊離酸を好適な有機または無機塩基と反応させることにより、調製され得る。本明細書で述べられる化学物質を、代替的に、その薬学的に許容される塩として投与することができる。「薬学的に許容される塩」は、遊離酸、塩基、および双性イオン形も含む。好適な薬学的に許容される塩の説明は、Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use, Wiley VCH (2002)において見つけることができる。本明細書で開示される化合物が、カルボキシ基などの酸性官能基を含む場合には、カルボキシ基に好適な薬学的に許容されるカチオン対は当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、第四級アンモニウムカチオンなどを含む。そのような塩は、当業者に公知である。薬理学的に許容される塩のさらなる例については、Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977)を参照されたい。
薬学的に許容されるエステルは、カルボキシル基を含むように修飾されている本明細書に記載される化合物から誘導されたものを含む。ｉｎ ｖｉｖｏ加水分解性エステルは、ヒトまたは動物体内で加水分解されて親酸またはアルコールを生成するエステルである。したがって、代表的なエステルとしては、エステル基のカルボン酸部分の非カルボニル部分が、直鎖もしくは分岐鎖アルキル（例えば、メチル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチル、もしくはｎ－ブチル）、シクロアルキル、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）、アラルキル（例えば、ベンジル）、アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）、アリール（例えば、フェニル、例えば、ハロゲン、Ｃ１～４アルキルもしくはＣ１～４アルコキシまたはアミノによって必要に応じて置換されているフェニル）から選択される、カルボン酸エステル；スルホン酸エステル、例えば、アルキル－もしくはアラルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル）；またはアミノ酸エステル（例えば、Ｌ－バリルもしくはＬ－イソロイシル）が、挙げられる。「薬学的に許容されるエステル」は、無機エステル、例えば、一、二または三リン酸エステルも含む。そのようなエステルにおいて、別段の定めがない限り、存在するいずれのアルキル部分も、有利には、１個～１８個の炭素原子、特に１個～６個の炭素原子、より特に１個～４個の炭素原子を含有する。そのようなエステルに存在するいずれのシクロアルキル部分も、有利には、３個～６個の炭素原子を含有する。そのようなエステルに存在するいずれのアリール部分も、有利には、上記のカルボシクリル（carbocycylyl）の定義で示されたように必要に応じて置換されているフェニル基を含む。したがって、薬学的に許容されるエステルは、Ｃ１～Ｃ２２脂肪酸エステル、例えば、アセチル、ｔ－ブチルまたは長鎖直鎖もしくは分岐不飽和もしくはオメガ－６一価不飽和脂肪酸、例えば、パルミトイル（palmoyl）、ステアロイルなどを含む。代替アリールまたはヘテロアリールエステルとしては、ベンゾイル、ピリジルメチロイルなどが挙げられ、これらのいずれも、上記カルボシクリルにおいて定義されたように置換されていてもよい。さらなる薬学的に許容されるエステルとしては、脂肪族Ｌ－アミノ酸エステル、例えば、ロイシル、イソロイシル、および特にバリルが挙げられる。
治療上の使用のための、化合物の塩は、対イオンが薬学的に許容されるものである。しかし、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において利用され得る。
本明細書における上述の薬学的に許容される酸および塩基付加塩は、化合物が形成し得る、治療効果のある非毒性の酸および塩基付加塩形を含むことを意図したものである。薬学的に許容される酸付加塩は、塩基形をそのような適切な酸で処理することにより適便に得ることができる。適切な酸は、例えば、無機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸およびこれらに類する酸；または有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわち、エタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸（すなわち、ヒドロキシブタン二酸）、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ－アミノサリチル酸、パモ酸およびこれらに類する酸などを含む。逆に、前記塩形を適切な塩基での処理によって遊離塩基形に変換することができる。
酸性プロトンを含有する化合物を、適切な有機および無機塩基での処理によってそれらの非毒性金属またはアミン付加塩形に変換することもできる。適切な塩基塩形は、例えば、アンモニウム塩、アルカリおよびアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など；有機塩基との塩、例えば、ベンザチン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ヒドラバミン塩；ならびに例えば、アルギニン、リシンなどのような、アミノ酸との塩を含む。
本明細書において上で使用した付加塩という用語は、本明細書に記載される化合物が形成し得る溶媒和物も含む。そのような溶媒和物は、例えば、水和物、アルコレートなどである。
本明細書において上で使用した用語「第四級アミン」は、第四級アンモニウム塩を定義し、この化合物は、化合物の塩基性窒素と、適切な四級化剤、例えば、必要に応じて置換されているハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリールまたはハロゲン化アルキルアリール、例えば、ヨウ化メチルまたはヨウ化ベンジルなどとの反応により形成され得る。トリフルオロメタンスルホン酸アルキル、メタンスルホン酸アルキル、およびｐ－トルエンスルホン酸アルキルなどの、良好な脱離基との他の反応物も、使用され得る。第四級アミンは、正荷電窒素を有する。薬学的に許容される対イオンは、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロアセテート、およびアセテートを含む。選ばれた対イオンを、イオン交換樹脂を使用して導入することができる。
開示化合物のプロドラッグも、本明細書において企図される。プロドラッグは、対象へのプロドラッグの投与後にｉｎ ｖｉｖｏ生理作用、例えば、加水分解、代謝などによって化学的に修飾されて活性化合物になる、活性または不活性化合物である。本文全体を通して使用される用語「プロドラッグ」は、薬理学的に許容される誘導体、例えば、エステル、アミドおよびホスフェートを意味し、したがって、誘導体の結果として生じるｉｎ ｖｉｖｏ生体内変換産物は、本明細書に記載される化合物に関して定義されるような活性薬物である。プロドラッグは、好ましくは、優れた水溶性を有し、バイオアベイラビリティが増大されたものであり、ｉｎ ｖｉｖｏで容易に代謝され活性阻害剤になる。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、修飾部が常套的操作によりまたはｉｎ ｖｉｖｏで切断されて親化合物になるように修飾することによって、調製され得る。プロドラッグの作製および使用に関わる適合性および技術は、当業者に周知である。エステルを含むプロドラッグの一般的考察については、Svensson and Tunek, Drug Metabolism Reviews 165 (1988)およびBundgaard, Design of Prodrugs, Elsevier (1985)を参照されたい。
用語「プロドラッグ」は、プロドラッグが対象に投与されたときにｉｎ ｖｉｖｏで本発明の活性親薬物を放出する任意の共有結合した担体を含むことを意図したものでもある。プロドラッグは、多くの場合、活性薬剤医薬品と比べて向上した特性、例えば、可溶性およびバイオアベイラビリティを有するので、本明細書で開示される化合物は、プロドラッグ形態で送達され得る。したがって、本明細書で開示される化合物のプロドラッグ、プロドラッグを送達する方法、およびそのようなプロドラッグを含有する組成物も、企図される。開示化合物のプロドラッグは、典型的には、化合物中に存在する１つまたは複数の官能基を、修飾部が常套的操作でまたはｉｎ ｖｉｖｏで切断されて親化合物を生じさせるように修飾することにより調製される。プロドラッグは、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されて対応するアミノおよび／またはホスホネート基をそれぞれ生じさせる任意の基で官能化されたホスホネートおよび／またはアミノ基を有する化合物を含む。プロドラッグの例としは、アセチル化アミノ基および／またはホスホン酸エステルもしくはホスホン酸アミド基を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、プロドラッグは、ホスホン酸低級アルキルエステル、例えば、ホスホン酸イソプロピルエステルである。
開示化合物の保護された誘導体も企図される。開示化合物とともに使用するための様々な好適な保護基が、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999において開示されている。
一般に、保護基は、分子の残りの部分に影響を与えることにならない条件下で除去される。これらの方法は、当技術分野において周知であり、酸加水分解、水素化分解などを含む。１つの好ましい方法は、エステルの除去、例えば、遊離ホスホネートを生じさせるためのＴＭＳ－Ｂｒ媒介エステル切断の場合のものなどのルイス酸性条件を使用するホスホン酸エステルの切断を含む。第２の好ましい方法は、保護基の除去、例えば、好適な溶媒系、例えば、アルコール、酢酸などまたはこれらの混合物中での炭素に対するパラジウムを利用する水素化分解によるベンジル基の除去を含む。ｔ－ブトキシカルボニル保護基をはじめとする、ｔ－ブトキシに基づく基を、好適な溶媒系、例えば、水、ジオキサンおよび／または塩化メチレン中で、無機または有機酸、例えば、ＨＣｌまたはトリフルオロ酢酸を利用して、除去することができる。アミノおよびヒドロキシ官能基の保護に好適なもう１つの例示的な保護基は、トリチルである。他の従来の保護基は公知であり、当業者は、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999を参考にして好適な保護基を選択することができる。アミンが脱保護されると、得られた塩を容易に中和して遊離アミンを生じさせることができる。同様に、ホスホン酸部分などの酸部分が露出されると、化合物を、酸化合物としてまたはその塩として単離することができる。
ホスフェート：－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｄ）２（式中、各Ｒｄは、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、もしくは有機官能基であり；または１つもしくは複数のＲｄ基は、存在せず、したがって、ホスフェート基は、少なくとも１つの負電荷を有し、その負電荷をＭ＋対イオンにより平衡させることができ、ここで、各Ｍ＋は、独立して、アルカリイオン、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋；アンモニウムイオン、例えば、＋Ｎ（Ｒｅ）４（この式中、Ｒｅは、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、もしくは［Ｂａ２＋］０．５であり得る）。ホスフェートのＲｄ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
ホスホネート：－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｄ）２（式中、各Ｒｄは、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、もしくは有機官能基であり；または１つもしくは複数のＲｄ基は、存在せず、したがって、ホスフェート基は、少なくとも１つの負電荷を有し、その負電荷をＭ＋対イオンにより平衡させることができ、ここで、各Ｍ＋は、独立して、アルカリイオン、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋；アンモニウムイオン、例えば、＋Ｎ（Ｒｅ）４（この式中、Ｒｅは、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、もしくは［Ｂａ２＋］０．５であり得る）。ホスホネート基のＲｄ基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
シリルエーテル：－ＯＳｉＲｅＲｆ（式中、ＲｅおよびＲｆの各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。シリルエーテル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
小分子：本明細書で使用される場合、用語「小分子」は、１０００ダルトンまたはそれ未満（例えば、９００ダルトンもしくはそれ未満、８００ダルトンもしくはそれ未満、７００ダルトンもしくはそれ未満、６００ダルトンもしくはそれ未満、５００ダルトンもしくはそれ未満、４００ダルトンもしくはそれ未満、３００ダルトンもしくはそれ未満、２００ダルトンもしくはそれ未満、または１００ダルトンもしくはそれ未満）の分子量を有する分子を指す。一部の例では、小分子は、１００～１０００ダルトン、２００～９００ダルトン、２００～７００ダルトン、または２００～５００ダルトンの分子量を有する。
対象：ヒト対象と非ヒト対象の両方を含み、非ヒト対象には、鳥類および非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、伴侶動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ブタ、ヒツジ、雌ウシ）、ならびに飼い慣らされていない動物、例えば、大型のネコ科動物が含まれる。対象という用語は、生物の生活環の段階に関係なく適用される。したがって、対象という用語は、生物（すなわち、生物が、哺乳動物であるか、家禽または野鳥などの鳥類であるか）に依存してｉｎ ｕｔｅｒｏまたはｉｎ ｏｖｏの生物に適用される。
スルフィニル：－Ｓ（Ｏ）Ｒｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。スルフィニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
スルホニル：－ＳＯ２Ｒｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。スルホニル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
スルホンアミド：－ＳＯ２ＮＲｅＲまたは－Ｎ（Ｒｅ）ＳＯ２Ｒｆ（式中、ＲｅおよびＲｆの各々は、独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。スルホンアミド基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
スルホネート：－ＳＯ３ －。このスルホネート基の負電荷をＭ＋対イオンで平衡させることができ、Ｍ＋は、アルカリイオン、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋；アンモニウムイオン、例えば、＋Ｎ（Ｒｅ）４（式中、Ｒｅは、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、もしくは芳香族である）；またはアルカリ土類イオン、例えば、［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、もしくは［Ｂａ２＋］０．５であり得る。
治療有効量：単独で、または１つもしくは複数の追加の薬剤と一緒に、例えば対象における腫瘍の処置などの、所望の応答を誘導する、薬剤の量。理想的には、治療有効量は、対象において実質的な細胞毒性効果を引き起こすことなく治療効果をもたらす。
一例では、所望の応答は、対象における腫瘍のサイズ、体積または数（例えば、転移）を減少させることである。例えば、薬剤（単数）または薬剤（複数）は、腫瘍のサイズ、体積または数を、所望の量、例えば、薬剤の非存在下での応答と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、減少させることができる。
本明細書で開示されるいくつかの調製物が治療有効量で投与される。ヒトまたは獣医学的対象に投与される開示される化合物の治療有効量は、対象に関連するいくつかの因子、例えば、対象の健康全般によって変わることになる。投薬量を変え、結果として生じる治療応答、例えば腫瘍の退縮、を測定することにより、治療有効量を決定することができる。治療有効量を、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイによって決定することもできる。開示薬剤を、所望される応答を得るために必要に応じて単一用量でまたは数用量で投与することができる。しかし、療有効量は、利用される供給源、処置される対象、処置される状態の重症度およびタイプ、ならびに投与方法に依存し得る。
チアール：－Ｃ（Ｓ）Ｈ。
チオカルボン酸：－Ｃ（Ｏ）ＳＨ、または－Ｃ（Ｓ）ＯＨ。
チオシアネート：－Ｓ－ＣＮまたは－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ。
チオエステル：－Ｃ（Ｏ）ＳＲｄまたは－Ｃ（Ｓ）ＯＲｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。チオエステル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
チオエーテル：－Ｓ－脂肪族または－Ｓ－芳香族、例えば、－Ｓ－アルキル、－Ｓ－アルケニル、－Ｓ－アルキニル、－Ｓ－アリール、もしくは－Ｓ－ヘテロアリール；または－脂肪族－Ｓ－脂肪族、－脂肪族－Ｓ－芳香族、－芳香族－Ｓ－脂肪族、もしくは－芳香族－Ｓ－芳香族。チオエーテル基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
チオケトン：－Ｃ（Ｓ）Ｒｄ（式中、Ｒｄは、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基から選択される）。チオケトン基は、水素以外の１つまたは複数の基、例えば、脂肪族、ヘテロ脂肪族、ハロ脂肪族、ハロヘテロ脂肪族、芳香族、または有機官能基で置換され得る。
疾患を処置することまたは抑制すること：疾患の徴候もしくは症状または疾患（例えば、腫瘍）に関係する病的状態を軽減する、治療介入。処置は、腫瘍などの状態の寛解または治癒も誘導し得る。特定の例では、処置は、腫瘍を、例えば腫瘍の完全な発生を抑制することにより、予防すること、例えば、転移の発生または原発腫瘍の発生を予防することを含む。予防は、腫瘍の完全非存在を必要としない。
疾患の徴候もしくは症状または疾患に関係する病的状態を軽減することは、処置の任意の観察可能な有益な効果を指す。腫瘍に関連する徴候または症状を軽減することは、例えば、感受性対象（例えば、まだ転移していない腫瘍を有する対象）における疾患の臨床症状の開始の遅延、疾患の一部もしくは全ての臨床症状の重症度の低下、疾患のより緩徐な進行（例えば、腫瘍を有する対象の寿命を延ばすことにより）、疾患の再発数の低減、対象の健康全般もしくは肉体的および精神的な健全性の改善により、または特定の腫瘍に特有である当技術分野において周知の他のパラメーターにより、証明され得る。「予防的」処置は、病態発症のリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示さないまたは初期徴候のみを示す対象に投与される処置である。
腫瘍：良性であることもあり、または悪性であることもある、細胞の異常な成長。がんは、異常なまたは調節されない細胞成長を特徴とする、悪性腫瘍である。悪性病変にしばしば関連する他の特徴としては、転移、隣接細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、および炎症性または免疫学的応答の抑止または増悪、周囲または遠位組織または器官、例えばリンパ節への浸潤などが挙げられる。「転移性疾患」は、原発腫瘍部位を離れ、身体の他の部分に、例えば血流またはリンパ系によって、移動する、がん細胞を指す。したがって、転移がんは、転移がんが由来する元の（原発）がんの元の発生部位以外の１つまたは複数の体内部位におけるがんである。個体における腫瘍の量が「腫瘍負荷」であり、これを腫瘍の数、体積または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。
個体における腫瘍の量が「腫瘍負荷」であり、これを腫瘍の数、体積または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲組織に浸潤する腫瘍および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。血液腫瘍の例としては、急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病）を含む白血病、真正赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常が挙げられる。
固形腫瘍、例えば肉腫および癌腫、の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性病変、膵臓がん、乳がん（基底乳癌、乳管癌および乳房小葉癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、唾液腺癌、甲状腺髄様癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が、挙げられる。
「定着」または「既存の」腫瘍は、診断検査により識別可能であり得る既存の腫瘍である。一部の実施態様では、定着腫瘍を触診することができる。一部の実施態様では、「定着腫瘍」は、サイズが少なくとも５００ｍｍ３、例えば、少なくとも６００ｍｍ３、少なくとも７００ｍｍ３、または少なくとも８００ｍｍ３である。他の実施態様では、腫瘍は、少なくとも１ｃｍ長である。固形腫瘍に関しては、定着腫瘍は、一般に、確固たる血液供給を有し、Ｔｒｅｇおよび骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を誘導した。いくつかの例では、腫瘍は、神経芽細胞腫または小細胞肺がんである。
ＩＩ．序論
小分子によるＧ四重鎖（Ｇ４）の標的化は、創薬不可能なタンパク質、例えばＮ－Ｍｙｃおよび他のＧ４含有タンパク質、の発現を調節するために魅力的な戦略であるが、Ｇ４への選択的結合剤は、多くのＧ４の構造類似性のため同定するのが難しい。多くの標準Ｇ４構造は、比較的単純である：それらは、中心カリウムイオンおよび小さい１～７ヌクレオチドループによって安定化されている、グアニンテトラドを含有する。しかし、より複雑なＧ４（または「非標準」Ｇ４）の最近の例は、追加の構造エレメント、例えば、ヘアピンおよび他のタイプの構造を含有することも示されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、そのような非標準構造を開示している、Onel et al., JACS 2016, 138:2563;2570；Ngoc Nguyen et al., Nucleic Acids Res. 2020, 48:10567-10575；およびTan et al., Nucleic Acids Res. 2020, 48:11162-11171を参照されたい）。ＭＹＣＮにおける報告されているＧ４の中で、そのような構造を有する非標準Ｇ４の一例は、ＭＹＣＮの第１イントロンに見られる。ゲノムワイドな探索研究によっても、ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４の存在が実験的に確認されたが、それは、多くの他の制御性Ｇ４のようにＭＹＣＮのプロモーター領域には出現しない。
ヘアピン含有Ｇ４などの非標準Ｇ４構造を標的とする新たな小分子化合物が、本明細書に記載される。一部の実施態様では、化合物は、ＭＹＣＮなどの、ＭＹＣ遺伝子ファミリーにおける非標準Ｇ４を標的とする。化合物を含む医薬組成物、および化合物を作製および使用する方法も、開示される。
治療的処置のために、例えば、がんのような疾患および／または障害を処置する方法において、そのような化合物を使用する方法も開示される。一部の実施態様では、開示化合物での処置は、ＭＹＣＮ転写物とＭＹＣＮＯＳ転写物の両方のおよびＮ－Ｍｙｃタンパク質レベルの減少を生じさせる結果となる。
ＩＩＩ．化合物
がんなどの疾患および／または障害を処置するための新規方法における使用のための化合物が、本明細書で開示される。特定の実施態様では、化合物は、非標準Ｇ４を標的とすることおよびそれに結合することができる小分子化合物（その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルを含む）である。特定の実施態様では、化合物は、ヘアピン含有Ｇ４などの構造的に複雑な非標準Ｇ４に選択的に直接結合する小分子である。特定の実施態様では、ヘアピン含有Ｇ４は、ＤＮＡ中に存在する。独立した実施態様では、化合物は、Ｇ４構造を含まないＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）に結合しない。本明細書で開示される二価化合物などの、一部の化合物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）中に存在するＧ４に結合することができるが、単純ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）、例えば、ステム－ループ構造、バルジ構造、またはＧ４のないヘアピン構造を含む、単純ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）には結合しない。本明細書で開示される化合物を使用して標的とすることができる例示的な遺伝子としては、ＭＹＣファミリー（例えば、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＮＯＳ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣなど）、ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＢＲＤ４、ならびに任意のがん遺伝子ならびに／またはそのノンコーディングＲＮＡ（例えば、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ））、例えば、ＢＣＬ２、ＳＯＸ２および／もしくはＬＩＮＣ０１０１８を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施態様では、化合物は、ヘリカーゼ（例えば、ＤＨＸ１５）中に存在するＧ４に結合することができる。一部の実施態様では、化合物は、そのような遺伝子に見られるＧ４ヘアピンの接合部の付近に選択的に結合する。
一部の実施態様では、化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルは、式Ｉによる構造を有する。
Figure 2024522183000379
式Ｉに関しては、以下の可変的記述が当てはまり得る：
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり、特定の独立した実施態様では、チオフェニルでも、チアゾリルでも、フラニルでも、トリアゾリルでも、チアジアゾリルでもない；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環である；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１である；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族である；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロ（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩ）であり、独立した実施態様では、Ｒ３は、フルオロではない；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロである；
ｘは、０～５、例えば、０、１、２、３、４または５から選択される整数である；および
ｎは、０～１０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数である。
式Ｉの一部の実施態様では、以下の可変的記述が当てはまり得る：
環Ａは、オキサジアゾリルであり、特定の独立した実施態様では、１，３，４－オキサジアゾリルではない；
環Ｂは、ジアジニル（例えば、ピリダジニル、ピリミジニル、またはピラジニル）から選択される；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、アリール、ヘテロアリール、環式ヘテロ脂肪族、非環式ヘテロ脂肪族、環式脂肪族、非環式脂肪族であり、ｔは、０または１であり、リンカーは、－（ＣＲａ ２）ｑ－または－［（ＣＲａ ２）ｑＹ］ｒ－（ＣＲａ ２）ｓ－であり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり、Ｙは、水素、硫黄、またはＮＲ’であり、ここでのＲ’は、Ｈまたは脂肪族であり、ｑは、１～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であり、ｒは、１～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であり、ｓは、０、１または２から選択される整数である；
Ｒ２は、Ｈまたは低級アルキルである；
各Ｒ３は、独立して、アルコキシまたはヒドロキシである；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロである；
ｘは、１～５から選択される整数である；および
ｎは、０～３、例えば、０、１、２または３から選択される整数である。
式Ｉのさらに追加の実施態様では、以下の可変的記述が当てはまり得る：
環Ａは、１，２，４－オキサジアゾリル（例えば、
Figure 2024522183000380
）である；
環Ｂは、ピリダジニル（例えば、
Figure 2024522183000381
）である；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、フェニル、ピペラジニル、ピリジニル、アゼピニル、シクロペンチル、アミノ（例えば、ＮＨ２、Ｎ（アルキル）２、およびＮＨ（アルキル））、ピペリジニル、ピロリジニル、オキサジアゾリル、トリアジニル、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）、モルホリニル、アクリジニル（例えば、９－アミノアクリジン、アクリジンＣｌ、およびアクリジンＮＨ２、アクリジンＩＣＲ １９１）であり；ｔは、０または１であり；リンカーは、－（ＣＨ２）ｑ－、－ＣＨ（Ｍｅ）－、－（ＣＨ２）ｑ－ＣＨ（Ｍｅ）－、－［（ＣＨ２）ｑＯ］ｒ－（ＣＨ２）ｓ－、または－（ＣＨ２）ｑＮＨ－であり、ここで、ｑは、１～４、例えば、１、２、３または４から選択される整数であり、ｒは、１～４、例えば、１、２、３または４から選択される整数であり；ｓは、０、１または２である；
Ｒ２は、ＨまたはＭｅである；
各Ｒ３は、独立して、－ＯＭｅまたはヒドロキシである；および
ｎは、０である。
一部の実施態様では、化合物は、式Ｉによる構造を有し、式中、環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；Ｒ１は、－（ＣＲａ ２）ｍ－Ｒｂまたは－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）ｓ－Ｒｂであり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、ｒは、１または２であり、ｓは、２であり、Ｒｂは、シクロアルキル基、アリール基、または窒素含有基（例えば、Ｎ含有環式基、例えば、窒素を含むヘテロアリール基、もしくは窒素原子を含む環式ヘテロ脂肪族基；アミド基；またはアミノ基）であり；Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；各Ｒ３は、独立して、アルコキシまたはヒドロキシであり；ｘは、０、１、２、３、４または５であり；各Ｒ４は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり；ｎは、０、１、２または３である。式Ｉによる構造を有するそのような化合物の独立した実施態様では、化合物は、以下の化合物を含まないが、その任意の薬学的に許容される塩またはエステルを含み得る：
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；
Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；または
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミン。
一部の実施態様では、化合物は、式ＩＡによる構造
Figure 2024522183000382
を有し得、ここで、
Figure 2024522183000383
により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり；Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒｃ）であり、ここで、Ｒｃは、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒｃ）以外であり；Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロ（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩ）であり、独立した実施態様では、Ｒ３は、フルオロではなく；各Ｒ４は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；ｘは、０～５、例えば、０、１、２、３、４または５から選択される整数であり；ｎは、０～１０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数である。特定の独立した実施態様では、化合物は、チオフェニル環も、チアゾリル環も、フラニル環も、トリアゾリル環も、チアジアゾリル環も、１，３，４－オキサジアゾリル環も含まない。特定の実施態様では、化合物は、１，２，４－オキサジアゾリル環を含む。
上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000384
であり得、ここで、
Figure 2024522183000385
により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり；Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒｃ）であり、ここで、Ｒｃは、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒｃ）以外である。式Ｉおよび／または式ＩＡの一部の実施態様では、Ｒｃは、Ｈまたはアルキル、例えば、Ｃ１～Ｃ３アルキル（メチル、エチル、プロピル、もしくはイソプロピル）である。式Ｉおよび／または式ＩＡのある特定の実施態様では、Ｒｃは、Ｈである。式Ｉおよび／または式ＩＡの一部の実施態様では、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、Ｎである。式Ｉおよび／または式ＩＡのある特定の実施態様では、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の１つは、ＯまたはＳである。一部の実施態様では、式Ｉおよび／または式ＩＡの５員環は、
Figure 2024522183000386
から選択される。ある特定の例では、式Ｉおよび／または式ＩＡの５員環は、
Figure 2024522183000387
である。
上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、式Ｉの環Ｂは、
Figure 2024522183000388
であり得、ここで、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４の各々は、独立して、ＮまたはＣ（Ｒｃ）であり、ここで、Ｒｃは、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４のうちの少なくとも１つは、Ｎである。式Ｉの一部の実施態様では、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４のうちの２つは、Ｎであり、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４の他のものは、Ｃ（Ｒｃ）である。各ＲＣは、独立して、Ｈ、－アルキル、またはハロであり得る。特定の例では、Ｒｃは、Ｈである。式Ｉの一部の実施態様では、環Ｂは、
Figure 2024522183000389
である。式Ｉのある特定の実施態様では、環Ｂは、
Figure 2024522183000390
である。
開示化合物は、典型的に、いくつかのＲ３基（式Ｉ中で「ｘ」として表される）を含み、ｘは、０、１、２、３、４または５であり、各Ｒ３は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロアルキル、脂肪族、またはハロである。独立した実施態様では、Ｒ３は、フルオロではない。一部の実施態様では、ｘは、１、２または３である。ある特定の実施態様では、ｘは、１である。一部の実施態様では、少なくとも１つのＲ３基は、環Ａに対してパラ位にある。上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ３アルコキシまたはヒドロキシであり得る。一部の実施態様では、Ｒ３は、メトキシである。ある特定の実施態様では、ｘは、１であり、Ｒ３は、環Ａに対してパラにある。
ｎが０以外の整数である、上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、各Ｒ４は、独立して、Ｈ、アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ３アルキル）、またはハロである。一部の実施態様では、Ｒ４は、Ｈまたはメチルである。ある特定の実施態様では、Ｒ４は、Ｈである。一部の実施態様では、ｎは、０または１である。ある特定の実施態様では、ｎは、０であり、－Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）は、環Ｂに直接結合している。
一部の実施態様では、化合物は、式ＩＩによる構造：
Figure 2024522183000391
を有する。式ＩＩに関して、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、上記実施態様のいずれかに従って定義されたとおりである。一部の実施態様では、Ｒ２は、ＨまたはＣ１～Ｃ３アルキルである。ある特定の実施態様では、Ｒ２は、Ｈである。
一部の実施態様では、化合物は、式ＩＩＩによる構造：
Figure 2024522183000392
を有する。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒ１は、－（ＣＲａ ２）ｍ－Ｒｂまたは－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）２－Ｒｂであり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、ｒは、１、２、３、４または５であり、Ｒｂは、窒素含有基である。一部の実施態様では、各Ｒａは、独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ３アルキルである。ある特定の実施態様では、各Ｒａは、Ｈであり、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｍ－Ｒｂである。ある特定の実施態様では、各Ｒａは、Ｈであり、Ｒ１は、－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）２－Ｒｂであり、ここでｒは、１、２または３である。一部の実施態様では、ｍは、１、２または３、特に、２または３である。上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、ｍ＋ｎは、１、２、３、４または５であり得る。一部の実施態様では、ｍ＋ｎは、２、３または４、特に、２または３である。ある特定の実施態様では、ｎは、０であり、ｍは、２または３である。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒｂは、窒素含有基である。一部の実施態様では、Ｒｂは、Ｎ含有環式基、－Ｎ（Ｒｃ）２、または－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、Ｈ、アルキル、またはハロである。Ｎ含有環式基は、飽和されているまたは不飽和である（芳香族を含む）ことがあり、５個～１５個の原子、例えば、５個～１４個の原子、または５個～１０個の原子、または５個～８個の原子を含み得る。一部の実施態様では、Ｎ含有環式基は、１つまたは複数の置換基、例えば、ハロ、ヘテロ脂肪族、または脂肪族から選択される置換基を、さらに含む。特定の実施態様では、Ｎ含有環式基は、－（ＣＲａ ２）ｍ－、または－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）２－に複素環中の窒素原子を介して結合している。例示的なＮ含有環式基は、１または２個の窒素原子を含み、別のヘテロ原子、例えば、ＳまたはＯ原子を含み得る。好適なＮ含有環式基としては、アクリジニル基（または他のＧ４スタッキング化合物、例えば、ＢＲＡＣＯ－１９など）、ヘキサヒドロアゼピニル基、ピペラジニル基、モルホリノ基、およびピペリジニル基が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施態様では、Ｒｂは、－Ｎ（Ｒｃ）２または－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、ここで、Ｒｃは、Ｈもしくはアルキル、例えば、ＨもしくはＣ１～Ｃ３アルキル；またはアクリジニル基、例えば、アクリジンＩＣＲ １９１、９－アミノアクリジン、アクリジンＣｌ、もしくはアクリジンＮＨ２である。そのようなアクリジニル基を含む実施態様では、化合物は、非標準Ｇ４結合構成要素およびＧ４スタッカー構成要素を含む、２つのＧ４応答性基を含む、「二価」化合物であり得る。非標準Ｇ４結合構成要素は、環Ａ、環Ｂおよび／またはＲ３保有フェニル環を含む、化合物の部分を含み、Ｇ４スタッカー構成要素は、アクリジニル基を含む。
Figure 2024522183000393
二価化合物の一部の実施態様では、二価化合物は、式ＩＶによる構造：
Figure 2024522183000394
（式中、Ｒｂは、Ｇ４スタッカー基、例えば、芳香族基（例えば、アクリジニル基）であり；リンカー基は、－（ＣＲａ ２）ｍ－、または－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、Ｒａ、ｍ、ｒおよびｓの各々は、本明細書中で述べられる、例えば、式Ｉおよび／または式ＩＩについて与えられる、とおりである）
を有する。
二価化合物の一部の実施態様では、二価化合物は、式Ｖによる構造：
Figure 2024522183000395
（式中、Ｒｂは、アクリジニル基であり；リンカー基は、－（ＣＨ２）ｍ－または－［（ＣＨａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、ｍ、ｒおよびｓの各々は、本明細書中で述べられる、例えば、式Ｉおよび／または式ＩＩについて与えられる、とおりである）
を有する。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒ１は、以下のものから選択される：
Figure 2024522183000396
式Ｉ、ＩＡ、ＩＶまたはＶのいずれか１つの特定の実施態様では、Ｒ１は、以下のものから選択される：
Figure 2024522183000397
式ＩＩのある特定の実施態様では、Ｒ２は、ＨまたはＣ１～Ｃ３アルキルであり、Ｒ１は、上記実施態様のいずれかに従って定義されたとおりである。ある特定の実施態様では、Ｒ２は、Ｈである。
式ＩＩＩのある特定の実施態様では、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、メトキシであり、Ｒ１は、上記実施態様のいずれかに従って定義されたとおりである。
式Ｉによるある特定の化合物が表１に示される：
Figure 2024522183000398
Figure 2024522183000399
一部の実施態様では、化合物は、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、またはＢ３８である。ある特定の例では、化合物は、ＭＹ－８またはＢ３３である。
独立した実施態様では、化合物は、以下：
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；
Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；
Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンも、
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンも
含まない、またはこれらではない、またはこれら以外である。
ＩＶ．作製方法
本開示による化合物、例えば、式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶの化合物を作製するための方法の実施態様が、本明細書で開示される。化合物を作製するための代表的な方法は、下記のスキーム２により提供され、このスキームでは、Ｒが、本明細書に記載のＲ１を表すために使用される。
Figure 2024522183000400
本明細書で開示される化合物実施形態を作製するための代表的な方法が、下記のスキーム３で提供される。
Figure 2024522183000401
スキーム３に関して、以下の例示的な手順を使用することができる（本明細書中の実施例セクションで説明される試薬量、反応時間、および温度を、一部の実施態様では使用することができる）：
６－ヒドロキシピリダジン－３－カルボン酸、ＥＤＣ・ＨＣｌ、Ｏｘｙｍａ ＰｕｒｅおよびＤＭＦを併せる。反応物を、室温で１０分間、撹拌し、続いて、４－メトキシベンズアミドオキシムを添加する。次いで、反応混合物を１２０℃に加熱し、撹拌する。３時間後、反応混合物を濾過し、ＤＭＦで洗浄する。濾液を収集し、乾燥させて、標的生成物Ｐ１を得る。次いで、ＰＯＣｌ３中のＰ１の溶液を１００℃に加熱し、４時間、撹拌する。反応粗生成物を氷冷水上に注ぎ、１０％ＮａＯＨ溶液で中和する。次いで、混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄する。併せた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物をＩＳＣＯフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。次いで、ＥｔＯＨ中のＰ２と３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロパン－１－アミンとＮＨ４Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－５を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２とＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンとＮＨ４Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－６を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２と３－アミノプロパンアミド塩酸塩とＫ２ＣＯ３の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－７を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２と３－（１－アゼパニル）－１－プロパンアミンとＮＨ４Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－８を得る。次いで、ＭＹ－８をＴＦＡ中で３０分間撹拌して、対応するＴＦＡ塩を得る；
ＥｔＯＨ中のＰ２と２－モルホリノエタン－１－アミンとＮＨ４Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－１３を得る；および
ＥｔＯＨ中のＰ２と２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エタン－１－アミンとＮＨ４Ｃｌの混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌する。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ＭＹ－１４を得る。
本明細書で開示される二価化合物を、下記のスキーム４により提供される方法に従って作製することができ、このスキームでは、Ｒが、本明細書に記載のＲ１を表すために使用される。
Figure 2024522183000402
本明細書で開示される二価化合物実施形態を作製するための代表的な方法が、下記のスキーム５で提供される。
Figure 2024522183000403
スキーム５に関して、以下の手順が使用され（本明細書中の実施例セクションで説明される試薬量、反応時間、および温度を、一部の実施態様では使用することができる）、Ｒは、本明細書で開示されるある特定のＲ１置換基について述べられるようなリンカー－Ｇ４スタッカーモチーフを指す：
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて２と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３３を黄色固体として得る；
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて２と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３３を黄色固体として得る；
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて３と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３４を黄色固体として得る；
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて４と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３５を黄色固体として得る；および
ＤＭＳＯ中の７の溶液をＤＩＰＥＡと併せ、続いて５と併せる。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持する。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製してＢ３８を黄色固体として得る。
代表的な化合物を作製するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例セクションで提供される。
Ｖ．使用方法
細胞における遺伝子および／または遺伝子発現のレベルを調節するための方法の実施態様であって、遺伝子が、ヘアピンＧ４を含む領域などの、非標準Ｇ４を含む少なくとも１つの領域を含む、実施態様が、本明細書で開示される。一部の実施態様では、細胞は、対象にまたは試料（例えば、がん性もしくは非がん性細胞などの、細胞を含有する生体試料）に存在する細胞であり得る。遺伝子および／または遺伝子発現のレベルを調節することは、遺伝子（例えば、ＭＹＣＮまたはＭＹＣ）の発現を減少させること、例えば、遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくはｌｎｃＲＮＡ）、関連タンパク質、またはこれらの組合せ、の蓄積を減少させることを含み得る。方法の一部の実施態様では、遺伝子は、ＭＹＣファミリー（例えば、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＮＯＳ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣなど）、ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＢＲＤ４、および任意の関連癌遺伝子から選択され得る。
一部の実施態様では、方法は、がん（または腫瘍）を有する対象に、本開示による化合物（あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステル）の治療有効量を投与することによって、がん（または腫瘍）を処置するステップを含み得る。他の実施態様では、方法は、細胞を本開示による化合物（あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステル）の有効量と接触させるステップを含み得る。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができる。一部の例では、本開示による化合物は、接触時に細胞に侵入する。一部の実施態様では、方法は、対象または試料を化合物に曝露した後に遺伝子、タンパク質および／またはｌｎｃＲＮＡ発現の減少を検出するステップをさらに含み得る。
特定の実施態様では、細胞におけるＮ－Ｍｙｃのタンパク質発現を減少させるための方法が開示される。方法は、細胞を、開示される化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含み得る。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができる。化合物は、特定の実施態様では非標準Ｇ４構造を含むＧ４核酸領域である、ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４核酸領域に、選択的に結合する。特定の実施態様では、化合物は、遺伝子のＤＮＡにおけるそのような非標準Ｇ４に結合するが、同様にＧ４を含まない遺伝子のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）には結合しない。一部の実施態様では、化合物は、Ｇ４ヘアピンにまたはその付近に選択的に結合する。細胞は、ＭＹＣＮ遺伝子の過剰発現を少なくとも一つには特徴とする細胞であり得る。いくつかの実施態様では、細胞におけるＭＹＣＮ遺伝子の発現は、化合物の非存在下での発現と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、またはさらには少なくとも９０％、低減される。化合物は、細胞の成長および／または増殖も低減させ得る。一部の実施態様では、成長および／または増殖は、化合物の非存在下での成長および／または増殖と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％、低減される。
特定の実施態様では、細胞におけるｃ－Ｍｙｃのタンパク質発現を減少させるための方法が開示される。方法は、細胞を、開示化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含み得る。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができる。化合物は、特定の実施態様では非標準Ｇ４構造を含むＧ４核酸領域である、ＭＹＣ遺伝子におけるＧ４核酸領域に、選択的に結合する。特定の実施態様では、化合物は、遺伝子のＤＮＡにおけるそのような非標準Ｇ４に結合するが、同様にＧ４を含まない遺伝子のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）には結合しない。細胞は、ＭＹＣ遺伝子の過剰発現を少なくとも一つには特徴とする細胞であり得る。いくつかの実施態様では、細胞におけるＭＹＣ遺伝子の発現は、化合物の非存在下での発現と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、またはさらには少なくとも９０％、低減される。化合物は、細胞の成長および／または増殖も低減させ得る。一部の実施態様では、成長および／または増殖は、化合物の非存在下での成長および／または増殖と比べて、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％、低減される。
上述のまたは以下の実施態様のいずれかにおいて、細胞は、対象における腫瘍および／またはがん細胞であり得、方法は、それを必要とする対象に、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルの治療有効量を投与して、腫瘍および／またはがん細胞におけるタンパク質（例えば、Ｎ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｃなど）発現を減少させ、それによって対象におけるがんを処置または予防することによる、対象におけるがんを処置または予防するステップをさらに含み得る。開示される方法による恩恵を受けることができる対象は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。一部の実施態様では、がん細胞は、神経がん細胞または肺がん細胞である。ある特定の実施態様では、がんは、神経芽細胞腫または小細胞肺がんである。一部の実施態様では、対象におけるがんを処置することにより、がん細胞のまたはがん細胞を含む腫瘍の成長および／または増殖が減少される。
がんの処置は、一般に、がんの診断後に、または前駆状態（例えば、異形成、もしくは良性腫瘍発症）の開始後に、開始される。処置をがんの早期に開始することができ、例えば、対象が状態の症状を明示する前に、例えば、ステージＩ診断中に、または異形成が診断されたときに、開始することができる。しかし、処置を、疾患の任意のステージ、例えば、これらに限定されないが、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよびステージＩＶがん中に、開始することができる。一部の例では、処置は、悪性病変またはさらには転移性腫瘍に転換し得る良性腫瘍を有するこれらの対象に投与される。
悪性がんなどの状態の発症後に開始される処置は、状態の１つもしくは複数の症状の重症度を低下させる結果となることがあり、または症状を完全に除去する結果となることがあり、または転移、腫瘍体積および／もしくは腫瘍数を低減させる結果となることがある。一部の例では、腫瘍は、処置後に検出不能になる。本開示の一態様では、転移などの、腫瘍の形成が、遅延、予防または減少される。別の態様では、原発性腫瘍のサイズが、減少される。さらなる態様では、腫瘍の症状が、減少される。さらに別の態様では、腫瘍体積が、減少される。
開示される治療を開始する前に、例えば、対象が腫瘍および／またはがんを有するかどうかを判定するために、対象をスクリーニングすることができる。当技術分野において公知であり、典型的には細胞学的および形態学的評価を含む方法によって、腫瘍の存在を判定することができる。腫瘍は、定着腫瘍であり得る。細胞は、生検から得られる細胞を含めて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏであり得る。腫瘍の存在は、本明細書で提供される方法を使用して腫瘍を処置することができることを示す。一部の実施態様では、Ｎ－Ｍｙｃ陽性またはｃ－Ｍｙｃ陽性腫瘍を有する対象が、例えば、対象から得られた生体試料中のＮ－Ｍｙｃまたはｃ－Ｍｙｃ発現および／または活性を検出することにより、処置に選択される。
例えば、ＭＹＣＮ遺伝子の上方制御された発現（例えば、対照と比較して、Ｎ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣＮのｍＲＮＡの、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加により検出されるような）を検出することができ、一部の例では定量化することができる。生体試料におけるＭＹＣＮ遺伝子の発現が対照（例えば、正常な非腫瘍試料）と比較される。対照と比べて、生体試料におけるＭＹＣＮ遺伝子の発現の増加（例えば、Ｎ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣＮのｍＲＮＡの、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加）は、Ｎ－Ｍｙｃ陽性腫瘍の存在を示し、その増加を使用して、本明細書で開示される化合物または組成物の１つまたは複数での処置のための対象を選択することができる。例えば、対照と比べて少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％の、またはさらには５００％を超える、被検試料における増加は、対象（例えば、ヒト対象）が、本明細書で開示される薬剤の１つまたは複数での処置に好ましく応答する可能性が高いことを示す。対象におけるＮ－Ｍｙｃ陽性腫瘍（例えば、Ｎ－Ｍｙｃ陽性神経芽細胞腫）を検出および／またはモニターするための好適な方法が主治医により選択され得る。１つの実施態様では、試料は、対象から採取され、Ｎ－Ｍｙｃを発現する細胞の存在がｉｎ ｖｉｔｒｏで評価される。
さらなる追加の実施態様では、ＭＹＣ遺伝子の上方制御された発現（例えば、対照と比較して、ｃ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣのｍＲＮＡの、ｃ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加により検出されるような）を検出することができ、一部の例では定量化することができる。生体試料におけるＭＹＣ遺伝子の発現が対照（例えば、正常な非腫瘍試料）と比較される。対照と比べて、生体試料におけるＭＹＣ遺伝子の発現の増加（例えば、ｃ－Ｍｙｃにより上方制御された、ＭＹＣのｍＲＮＡの、ｃ－Ｍｙｃタンパク質の、または遺伝子発現の、増加）は、ｃ－Ｍｙｃ陽性腫瘍の存在を示し、その増加を使用して、本明細書で開示される化合物または組成物の１つまたは複数での処置のための対象を選択することができる。例えば、対照と比べて少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％の、またはさらには５００％を超える、被検試料における増加は、対象（例えば、ヒト対象）が、本明細書で開示される薬剤の１つまたは複数での処置に好ましく応答する可能性が高いことを示す。対象におけるｃ－Ｍｙｃ陽性腫瘍（例えば、ｃ－Ｍｙｃ陽性神経芽細胞腫）を検出および／またはモニターするための好適な方法が主治医によって選択され得る。１つの実施態様では、試料は、対象から採取され、ｃ－Ｍｙｃを発現する細胞の存在がｉｎ ｖｉｔｒｏで評価される。
式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる開示化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）の治療有効量を対象に投与して、対象における腫瘍および／またはがんを処置することができる。神経芽細胞腫または小細胞肺がんなどの、腫瘍（単数）または腫瘍（複数）を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある対象を、処置に選択することができる。
本開示の式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）の投与は、予防または治療のどちらかを目的としたものであり得る。予防的に提供される場合、化合物は、腫瘍および／もしくはがんの最初の発生のまたは以前に処置された腫瘍および／もしくはがんの再発のいずれの症状よりも前に提供される。化合物の予防的投与は、任意の後続の疾患過程を予防または改善するのに役立つ。治療的に提供される場合、化合物は、疾患または感染症の症状の開始時（または直後）に提供される。
一部の例では、式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる開示化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）を対象に投与して、腫瘍および／またはがんの成長または転移を緩徐化または抑制することができる。これらの適用では、化合物（またはその医薬組成物）の治療有効量を、対象に、ＭＹＣＮ遺伝子のＤＮＡ中に存在する非標準Ｇ４などの非標準Ｇ４に結合し、Ｎ－Ｍｙｃ発現を低減させることによって、腫瘍の成長もしくは転移を緩徐化もしくは抑制するのに十分な、または腫瘍の徴候もしくは症状を抑制するのに十分な、量および条件下で、投与することができる。好適な対象の例としては、がんを有すると診断されたまたは有することが疑われる者（例えば、腫瘍を有する対象）、例えば、神経芽細胞腫または小細胞肺がんを有する対象が挙げられる。
一部の例では、式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのいずれか１つによる開示化合物、ならびに本明細書で開示される任意の代表的な化合物種（例えば、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、もしくはＢ３８）（またはそれを含有する医薬組成物）を対象に投与して、腫瘍および／またはがんの成長または転移を緩徐化または抑制することができる。これらの適用では、化合物（またはその医薬組成物）の治療有効量を、対象に、ＭＹＣ遺伝子のＤＮＡ中に存在する非標準Ｇ４などの非標準Ｇ４に結合し、ｃ－Ｍｙｃ発現を低減させることによって、腫瘍の成長もしくは転移を緩徐化もしくは抑制するのに十分な、または腫瘍の徴候もしくは症状を抑制するのに十分な、量および条件下で、投与することができる。好適な対象の例としては、がんを有すると診断されたまたは有することが疑われる者（例えば、腫瘍を有する対象）が挙げられる。一部の例では、対象は、ＭＹＣＮおよび／またはｃ－ＭＹＣを発現するがんを有する。非限定的な例示的ながんとしては、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性病変、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、副腎癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合型神経膠腫）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽種としても公知）、星状細胞種、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、頭頸部がん、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫ならびに脳転移が挙げられる。がんには、血液（または血行性）がん、例えば、白血病、例えば、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度もしくは高悪性度）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病または脊髄形成異常も含まれる。非限定的な例では、がんは、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、前立腺がん、または小細胞肺がんである。
治療有効量は、疾患の重症度、および対象の全身の健康状態に依存することになる。治療有効量は、１つもしくは複数の症状の主観的緩和、または臨床医もしくは他の適格な観察者により認められるような客観的に同定可能な改善、どちらかをもたらす量である。１つの実施態様では、治療有効量は、腫瘍成長を抑制するのに必要な量、または腫瘍の徴候もしくは症状を軽減するのに有効な量である。投与される薬剤の治療有効量は、所望の効果および処置される対象によって変わり得る。一部の例では、治療量は、患者の腫瘍負荷を消失もしくは低減させる量、または転移細胞の増殖を予防するもしくは低減させる量である。
化合物の実際の投薬量は、因子、例えば、対象の疾患兆候および特定のステータス（例えば、対象の年齢、サイズ、適応度、症状の程度、感受性因子など）、投与の時間および経路、同時に投与される他の薬物または処置、ならびに対象において所望の活性または生物学的応答を惹起するための化合物の具体的な薬効薬理によって、変わり得る。投薬量レジメンを、最適な予防または治療応答が得られるように調整することができる。治療有効量は、化合物および／または他の生物活性薬剤の任意の毒性または有害副作用より、治療有益効果のほうが臨床的観点で上回る量でもある。本開示の方法および製剤の中の化合物および／または他の生物活性薬剤の治療有効量についての非限定的な範囲は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ体重である。
担当臨床医は、標的部位（例えば、肺または体循環）において所望の濃度を維持するように投薬量を変えることができる。送達方式に基づいて、例えば、静脈内または皮下または筋肉内送達に対して経皮、直腸、経口、肺、骨内または鼻腔内送達に基づいて、より高いまたはより低い濃度を選択することができる。投与される製剤の放出速度、例えば、肺内投与用粉末に対する肺内投与用スプレー剤の放出速度、注射される微粒子製剤または経皮送達製剤に対する持続放出性経口製剤の放出速度などに基づいて、投薬量を調整することもできる。
局所および全身投与を含む任意の投与方法を、開示される治療剤に使用することができる。例えば、局所的、経口、血管内、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、髄腔内および皮下投与を使用することができる。特定の投与方式および投薬レジメンは、症例の詳細（例えば、対象、疾患、罹患している病状、および処置が予防的であるかどうか）を考慮に入れて、担当臨床医により選択されることになる。１つより多くの薬剤または組成物が投与されることになる場合、１つまたは複数の投与経路が使用され得る。一部の実施態様では、投与は、経口、血管内、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、または髄腔内投与である。
予防および治療を目的として、化合物を、対象に、経口経路によりまたは単回ボーラス送達で、長期間にわたって持続的送達（例えば、持続的静脈内送達）によって、または反復投与プロトコール（例えば、１時間に１回、１日１回もしくは週１回の反復投与プロトコール）で、投与することができる。本明細書で示される標的となる疾患または状態に関連する１つまたは複数の症状または検出可能な状態を和らげるために臨床的に有意な結果を生じさせることになる長期予防または処置レジメンの中で反復用量として化合物の治療有効投薬量を提供することができる。これに関連して有効な投薬量の決定は、典型的に、ヒト臨床試験により追跡調査される動物モデル研究に基づくものであり、対象における標的となる疾患症状または状態の出現率または重症度を有意に低下させる投与プロトコールによって導かれる。この点について好適なモデルとしては、例えば、マウス、ラット、トリ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ネコ科動物、非ヒト霊長類、および当技術分野において公知の他の許容される動物モデル対象が挙げられる。あるいは、有効投薬量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを使用して決定することができる。そのようなモデルを使用すると、化合物の治療有効量（例えば、標的となる疾患の１つまたは複数の症状を和らげるのに有効である量）を投与するための適切な濃度および用量を決定するために、通常の計算および調整しか必要とされない。代替実施態様では、化合物の有効量または有効用量は、治療または診断のどちらかを目的として、本明細書で示される疾患または状態と相関関係がある１つまたは複数の選択された生物活性を簡単に阻害または増強することができる。
一部の実施態様では、開示化合物の局所投与を、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍を発症する傾向があることが疑われる領域に、開示化合物を適用することにより、使用することができる。一部の実施態様では、開示化合物の治療有効量を含む医薬調製物の腫瘍内（または腫瘍付近）持続放出は、有益であり得る。
開示化合物を、正確な投薬量の個別投与に好適な単位剤形で製剤化することができる。加えて、開示化合物を単回投与または複数回投与スケジュールで投与することができる。複数回投与スケジュールは、処置の主要コースが、１回より多くの別個の投与、例えば、１～１０回投与、続いて、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じた後続の時間間隔で施される他の投与によるものであり得る。処置は、数日から数ヶ月、またはさらには数年の期間にわたっての、化合物の１日１回または１日複数回の投与を含み得る。したがって、投薬量レジメンは、少なくとも一部は、処置されることになる対象の特定の要求に基づいて決定されることにもなり、投与実施者の判断に依存することになる。
特定の例では、対象は、開示化合物の１つまたは複数を含む治療用組成物の投与を、連続する少なくとも２日、連続する１０日などの複数連日投薬スケジュールで、例えば、数週間、数ヶ月または数年の期間にわたって受ける。一例では、対象は、組成物の投与を少なくとも３０日、例えば、少なくとも２ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも２４ヶ月、または少なくとも３６ヶ月の期間にわたって受ける。
一部の実施態様では、開示される方法は、開示化合物のまたはそれを含有する組成物の投与と組み合わせて、外科手術、放射線療法、および／または化学療法薬を対象に施すステップを含む。そのような薬剤および処置の方法および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医により決定され得る。追加の薬剤についての調製および投薬スケジュールを、当業者は、製造業者の使用説明書に従って、または実験により決定して、使用することができる。そのような化学療法のための調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service, (1992) Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Mdにも記載されている。
併用療法で使用され得る追加の治療剤の非限定的な例としては、微小管結合剤、ＤＮＡ挿入剤または架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子制御剤、血管新生阻害剤、およびプロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブ）が、挙げられる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置を、単独でまたは組み合わせて使用することができる。例えば、任意の好適な抗がんまたは抗血管新生剤を、本明細書で開示される化合物と組み合わせて投与することができる。そのような薬剤についての方法および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医により決定され得る。
追加の化学療法剤としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチン；代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキセート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド、およびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）；細胞傷害／抗腫瘍抗体、例えば、アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレア、およびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、およびトラスツズマブ；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（vemurafinib）、バンデタニブ、およびトレチノインが挙げられるが、これらに限定されない。そのような薬剤についての選択および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した臨床医により決定され得る。
併用療法は、相乗作用をもたらし得、相乗的と判明し得る、つまり、活性成分を一緒に使用したときに達成される効果は、化合物を別々に使用した結果として生じる効果の合計より大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）同時に製剤化され、組み合わせられた単位投薬量製剤で同時に投与もしくは送達されたとき；（２）別個の製剤として交互にもしくは並行して送達されたとき；または（３）何らかの他のレジメンにより、達成され得る。交互に送達されるときの相乗効果は、化合物が、逐次的に、例えば、別々の注射器での異なる注射により、投与または送達されたときに達成され得る。一般に、交互の間に、各活性成分の有効投薬量が逐次的に、すなわち順次、投与されるが、併用療法では、２つまたはそれより多くの活性成分の有効投薬量が一緒に投与される。
本開示のいずれの方法の実施態様においても、方法において使用される化合物は、本開示による、ならびに６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；および６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンを含む、任意の化合物であり得る。
ＶＩ．医薬組成物
本開示の別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞などの、細胞への投与用に調製された医薬組成物であって、本明細書で開示される化合物の１つまたは複数についての治療有効量を含む医薬組成物を含む。開示化合物の治療有効量は、投与経路、対象の種、および処置される対象の身体的特徴に依存することになる。考慮され得る具体的な因子としては、疾患重症度およびステージ、体重、食事、ならびに併用薬物が挙げられる。開示化合物の治療有効量を決定するためのこれらの因子の関連性は、当業者には理解される。
対象への投与のための医薬組成物は、選ばれた分子に加えて、少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される添加剤、例えば、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存薬、界面活性剤などを含み得る。医薬組成物は、１つまたは複数の追加の活性成分、例えば、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤なども含み得る。これらの製剤に有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)には、本明細書で開示される化合物の薬学的送達に好適な組成物および製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、薬学的におよび生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどをビヒクルとして含む、注射可能な流体を通常は含有する。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）のための従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されることになる医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存薬、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
本明細書で開示される医薬組成物は、開示化合物の薬学的に許容される塩および／または溶媒和物から形成されるものを含む。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基および酸から誘導されるものを含む。特定の開示化合物は、酸と酸－塩基塩を形成することができる少なくとも１つの塩基性基を保有する。塩基性基の例としては、アミノおよびイミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。そのような塩基性基と塩を形成することができる無機酸の例としては、鉱酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられるが、これらに限定されない。塩基性基もまた、有機カルボン酸、スルホン酸（ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、スルホン酸（ｓｕｌｆｏ ａｃｉｄ）またはリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏ ａｃｉｄ）またはＮ－置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、２－フェノキシ安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸と、ならびに加えて、アミノ酸、例えばα－アミノ酸と、およびまた、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、４－メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、２－もしくは３－ホスホグリセリン酸塩、グルコース－６－リン酸塩またはＮ－シクロへキシルスルファミン酸（シクラミン酸の形成を伴う）と、または他の酸性有機化合物、例えば、アスコルビン酸と、塩を形成することができる。特に、好適な塩としては、医薬品技術分野において周知の非常に多数の他の酸の中でも、アルカリ金属、例えば、カリウムおよびナトリウム、アルカリ土類金属、例えば、カルシウムおよびマグネシウムから誘導されるものが挙げられる。
ある特定の化合物は、無機または有機塩基と酸－塩基塩を形成することができる少なくとも１つの酸性基を含む。無機塩基から形成される塩の例としては、本開示化合物と、カリウムおよびナトリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムをはじめとするアルカリ土類金属などとの、塩が挙げられる。同様に、酸性化合物と有機塩基、例えば、アミン（本明細書で使用される場合、アミンを指す用語は、文脈が、遊離アミンが意図されていることを明確に示す場合を除き、それらの共役酸を含むと理解されたい）との塩が企図され、これらには、塩基性アミノ酸、脂肪族アミン、複素環式アミン、芳香族アミン、ピリジン、グアニジンおよびアミジンと形成される塩が含まれる。脂肪族アミンのうち、非環式脂肪族アミンならびに環式および非環式ジおよびトリアルキルアミンは、開示化合物における使用に特に好適である。加えて、第四級アンモニウム対イオンも使用することができる。
本化合物における使用に好適なアミン塩基（およびそれらの対応するアンモニアイオン）の特定の例としては、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロノナン、ジアザビシクロウンデセン、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、モノ－、ビス－またはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミン、トリ－（２－ヒドロキシエチル）アミンおよびＮ－メチル－Ｄ－グルカミンが挙げられるが、これらに限定されない。「薬理学的に許容される塩」の追加の例については、Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977)を参照されたい。
本明細書で開示される化合物を結晶化することができ、単結晶形態で、または異なる結晶多形の組合せとして、提供することができる。したがって、化合物を、１つまたは複数の物理的形態、例えば、異なる結晶形態、結晶質、液晶または非結晶質（非晶質）形態で、提供することができる。化合物のそのような異なる物理的形態を、例えば、再結晶用の異なる溶媒または異なる溶媒混合物を使用して、調製することができる。あるいはまたは加えて、異なる多形を、例えば、異なる温度で再結晶を行うことにより、および／または再結晶中の冷却速度を変えることにより、調製することができる。多形の存在を、Ｘ線結晶解析により、または一部の場合には別の分光技術、例えば、固相ＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法により、または示差走査熱量測定により、決定することができる。
医薬組成物を様々な粘膜投与方式により対象に投与することができ、これには、経口、直腸、鼻腔内、肺内もしくは経皮送達によりまたは他の表面への局所的送達により投与することが含まれる。必要に応じて、組成物を非粘膜経路により投与することができ、これには、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、髄腔内、脳室内または非経口経路により投与することが含まれる。他の代替実施態様では、化合物を、ｅｘ ｖｉｖｏで、対象が起源である細胞、組織または臓器への直接曝露により、投与することができる。
医薬組成物を製剤化するために、化合物を、様々な薬学的に許容される添加剤、ならびに化合物の分散のための塩基またはビヒクルと、組み合わせることができる。所望される添加剤としては、ｐＨ調節剤、例えば、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０またはＭｉｇｌｙｏｌ ８１２）、溶解増進剤（例えば、シクロデキストリン類およびそれらの誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、および還元剤（例えば、グルタチオン）を含めることができる。当技術分野において周知の多くの他の適するアジュバントの中でも特に、水酸化アルミニウム（例えば、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＩＮ）およびＩＬ－１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）などのアジュバントを、組成物に含めることができる。組成物が液体である場合、製剤の等張性は、単一の状態と見なされる０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩溶液の等張性を基準にして測定して、通常は、実質的な不可逆的組織損傷を投与部位で誘導しないであろう値に調整される。一般に、溶液の等張性は、約０．３～約３．０、例えば、約０．５～約２．０、または約０．８～約１．７の値に調整される。
化合物を分散させる能力がある親水性化合物と任意の所望の添加剤とを含み得る塩基またはビヒクルに、化合物を分散させることができる。塩基は、ポリカルボン酸またはその塩、無水カルボン酸（例えば、無水マレイン酸）と他のモノマー（例えば、（メタ）アクリル酸メチル、アクリル酸など）とのコポリマー、親水性ビニルポリマー、例えば、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど、ならびに天然ポリマー、例えば、キトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、およびこれらの非毒性金属塩を含むがそれらに限定されない、広範な好適な化合物から選択することができる。多くの場合、生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸－グリコール酸）コポリマーおよびこれらの混合物が、塩基またはビヒクルとして選択される。あるいはまたは加えて、合成脂肪酸エステル、例えば、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステルなどを、ビヒクルとして利用することができる。親水性ポリマーおよび他のビヒクルを単独でまたは組み合わせて使用することができ、増強された構造一体性を、部分的結晶化、イオン結合、架橋などによりビヒクルに賦与することができる。粘膜表面への直接適用のために流体または粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、マイクロスフェアおよびフィルムをはじめとする様々な形態でビヒクルを提供することができる。
化合物を様々な方法に従って塩基またはビヒクルと併せることができ、化合物の放出は、分散、ビヒクルの崩壊、または付随する水チャネル形成により得る。一部の状況では、化合物は、好適なポリマー、例えば２－シアノアクリル酸イソブチル、から調製されたマイクロカプセル（マイクロスフェア）またはナノカプセル（ナノスフェア）（例えば、Michael et al., J. Pharmacy Pharmacol. 43:1-5, 1991を参照されたい）の中に分散され、生体適合性分散媒に分散され、それによって、長期間にわたっての持続送達および生物活性が生じる。
あるいは、本開示の組成物は、生理条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタンおよびオレイン酸トリエタノールアミンなどの物質を、薬学的に許容されるビヒクルとして含有し得る。固体組成物には、従来の非毒性の薬学的に許容されるビヒクルを使用することができ、それらには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
化合物を投与するための医薬組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、または高濃度の活性薬剤に好適な他の秩序構造として、製剤化することもできる。ビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。溶液の適切な流動性を、例えば、コーティング剤、例えばレシチン、の使用により、分散性製剤の場合は所望の粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトールおよびソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが望ましいであろう。化合物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることにより、もたらすことができる。
ある特定の実施態様では、化合物を、持続放出型製剤で、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物で、投与することができる。これらの組成物を、急速な放出を防ぐことになるビヒクル、例えば、調節放出ビヒクル、例えば、ポリマー、マイクロカプセル化送達系または生体接着性ゲルを用いて、調製することができる。本開示の様々な組成物での長期送達は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを組成物に含めることにより、もたらすことができる。調節放出製剤が望ましい場合、本開示に従って使用することに好適な調節放出結合剤としては、活性薬剤に挿入される、ならびに化合物および／または他の生物活性薬剤を組み込むことができる、任意の生体適合性調節放出材料が挙げられる。非常に多くのそのような材料が、当技術分野において公知である。有用な調節放出結合剤は、送達後に生理条件下で（例えば、粘膜表面で、または体液の存在下で）ゆっくりと代謝される材料である。適切な結合剤としては、持続放出製剤における使用のための当技術分野において周知の生体適合性ポリマーおよびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。このような生体適合性化合物は、周囲組織に対して非毒性かつ不活性であり、有意な有害副作用、例えば、鼻への刺激、免疫応答、炎症などを誘発しない。それらは、同じく生体適合性であり身体から容易に排除される代謝産物へと代謝される。
本開示における使用のための例示的なポリマー材料としては、加水分解性エステル連結を有するコポリマー状およびホモポリマー状ポリエステルから誘導されるポリマーマトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのこれらが、生分解性であること、および毒性のないまたは毒性の低い分解産物をもたらすことは、当技術分野において公知である。例示的なポリマーとしては、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、ポリ（ＤＬ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリ（Ｄ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ならびにポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）が挙げられる。他の有用な生分解性または生体内分解性（bioerodable）ポリマーとしては、ポリ（イプシロン－カプロラクトン）、ポリ（イプシロン－カプロラクトン（aprolactone）－ＣＯ－乳酸）、ポリ（イプシロン．－カプロラクトン－ＣＯ－グリコール酸）、ポリ（ベータ－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル－２－シアノアクリレート（cyanoacrilate））、ヒドロゲル、例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（例えば、Ｌ－ロイシン、グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸など）、ポリ（エステルウレア）、ポリ（２－ヒドロキシエチルＤＬ－アスパルタミド）、ポリアセタールポリマー、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、多糖、およびこれらのコポリマーといったポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。そのような製剤を調製するための多くの方法が、当業者に周知である（例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい）。他の有用な製剤としては、調節放出マイクロカプセル（米国特許第４，６５２，４４１号および同第４，９１７，８９３号）、マイクロカプセルおよび他の製剤の作製に有用な乳酸－グリコール酸コポリマー（米国特許第４，６７７，１９１号および同第４，７２８，７２１号）、ならびに水溶性ペプチドのための持続放出組成物（米国特許第４，６７５，１８９号）が挙げられる。
本開示の医薬組成物は、典型的に、滅菌されたものであり、製造、保管および使用条件下で安定している。滅菌溶液は、必要量の化合物を、必要に応じて、本明細に列挙される成分の１つまたは組合せとともに、適切な溶媒に添合し、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、化合物および／または他の生物活性薬剤を、塩基性分散媒と本明細書に列挙されるものからの他の必要成分とを含有する滅菌ビヒクルに添合することによって、調製される。滅菌粉末の場合、調製方法は、任意の追加の所望成分を加えた化合物の粉末を前以て滅菌濾過されたそれらの溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥を含む。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、果たすことができる。
本開示は、哺乳動物対象における疾患および他の状態の予防および処置における使用のための、本明細書に記載の医薬組成物、活性成分、および／またはそれらを投与する手段を収容している、キット、包装体および多容器ユニットも含む。診断上の使用のためのキットも提供される。１つの実施態様では、これらのキットは、本明細書に記載される化合物の１つもしくは複数を収容している容器、またはそれらを含有する製剤を含む。一例では、この構成要素は、対象への送達のための医薬の調製の際に製剤化される。化合物は、必要に応じて、大量投薬容器に収容されるか、または単位剤形もしくは多単位剤形に含有される。必要に応じた投薬手段、例えば、肺または鼻腔内スプレーアプリケーターを提供することができる。包装材は、処置の目的および／または包装されている医薬剤を使用することができる方法を示すラベルまたは使用説明書を、必要に応じて含む。
本開示のいずれの組成物の実施態様においても、組成物において使用される化合物の実施態様は、本開示による、ならびに６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン；Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン；６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン；および６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンを含む、任意の化合物であり得る。
ＶＩＩ．代表的な実施態様
式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000404
（式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルが、本明細書で開示される。
式Ｉによる化合物
Figure 2024522183000405
（式中、
環Ａは、チオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、および１，３，４－オキサジアゾリル以外の５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書で開示される。
式Ｉによる化合物：
Figure 2024522183000406
（式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ１は、－（ＣＲａ ２）ｍ－Ｒｂであり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ｍは、１、２、３、４または５であり、Ｒｂは、窒素含有基であり；
Ｒ２は、Ｈまたはアルキルであり；
各Ｒ３は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、アルキル、またはハロであり；
ｎは、０、１、２、または３であり；
ｘは、０、１、２、３、４、または５である）
であって、ただし、ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、またはＭＹ－１２のいずれか１つとして示される構造を含まない
化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書で開示される。
式Ｉによる化合物
Figure 2024522183000407
（式中、
環Ａは、５員ヘテロアリール環であり；
環Ｂは、少なくとも２個の窒素原子を含有する６員ヘテロアリール環であり；
Ｒ１は、－（ＣＲａ ２）ｍ－Ｒｂまたは－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）ｓ－Ｒｂであり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり、ｔは、１、２、３、４、または５であり、ｒは、１、２、３、４、または５であり、ｓは、０または１であり、Ｒｂは、アクリジニル基であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数であり；
ｎは、０～１０から選択される整数である）、
あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルも、本明細書で開示される。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000408
であり、ここで、
Figure 2024522183000409
により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり；
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒｃ）であり、ここで、Ｒｃは、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒｃ）以外である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000410
である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ａは、
Figure 2024522183000411
である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ｂは、
Figure 2024522183000412
であり、ここで、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４の各々は、独立して、ＮまたはＣ（Ｒｃ）であり、ここで、Ｒｃは、Ｈ、アルキル、またはハロであり、ただし、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４のうちの少なくとも２つは、Ｎである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ｂは、
Figure 2024522183000413
である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、環Ｂは、
Figure 2024522183000414
である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、（ｉ）ｘは、１、２、もしくは３である；または（ｉｉ）１つのＲ３は、環Ａに対してパラ位にある；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、ｎは、０である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、各Ｒ３は、独立して、Ｃ１～Ｃ３アルコキシまたはヒドロキシである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、ｘは、１であり、Ｒ３は、メトキシである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式ＩＩによる構造：
Figure 2024522183000415
を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ２は、Ｈである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式ＩＩＩによる構造：
Figure 2024522183000416
を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｍ－Ｒｂである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、ｍは、２または３である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒｂは、Ｎ含有環式基－Ｎ（Ｒｃ）２、または－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、Ｈまたはアルキルである。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ１は、
Figure 2024522183000417
である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、
Figure 2024522183000418
である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式ＩＶによる構造：
Figure 2024522183000419
（式中、リンカーは、－（ＣＲａ ２）ｍ－または－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＲａ ２）ｓ－であり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４、または５であり；ｓは、０または１である）
を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、式Ｖによる構造：
Figure 2024522183000420
（式中、リンカーは、－（ＣＨ２）ｍ－または－［（ＣＨ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、ｍは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４、または５であり；ｓは、０または１である）
を有する。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、Ｒ１は、
Figure 2024522183000421
Figure 2024522183000422
である。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、化合物は、
Figure 2024522183000423
である。
上記の代表的な実施態様のいずれかまたは全てによる化合物と少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物も、本明細書で開示される。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、医薬組成物は、化合物の治療量の単位剤形を含む。
これらの代表的な実施態様のいずれかまたは全てにおいて、医薬組成物は、抗がん剤をさらに含む。
細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させる方法であって、細胞を、式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000424
（式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップ
を含む方法も、本明細書で開示される。
細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させる方法であって、細胞を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに関する上に列挙された代表的な実施態様のいずれかまたは全てによる化合物、あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの有効量と接触させるステップを含む方法も、開示される。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、
（ｉ）環Ａは、
Figure 2024522183000425
であり、ここで、

により表される各結合は、原子価要件を満たすために必要に応じて単または二重結合であり、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の各々は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒｃ）であり、ここで、Ｒｃは、Ｈまたはアルキルであり、ただし、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つは、Ｃ（Ｒｃ）以外である；または
（ｉｉ）環Ｂは、
Figure 2024522183000427
であり、ここで、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４の各々は、独立して、ＮまたはＣ（Ｒｃ）であり、ここで、Ｒｃは、Ｈまたはアルキルであり、ただし、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４のうちの少なくとも２つは、Ｎである；または
（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、
（ｉ）環Ａは、
Figure 2024522183000428
である；または
（ｉｉ）環Ｂは、
Figure 2024522183000429
である；または
（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、
（ｉ）Ｒ２は、Ｈである；または
（ｉｉ）Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ３アルコキシもしくはヒドロキシである；または
（ｉｉｉ）ｘは、１、２、もしくは３である；または
（ｉｖ）１つのＲ３は、環Ａに対してパラ位にある；
（ｖ）ｎは、０である；または
（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）の任意の組合せである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶのいずれか１つによる構造：
Figure 2024522183000430
（式中、式ＶＩおよびＶについて、リンカーは、－（ＣＲａ ２）ｍ－または－［（ＣＲａ ２）ｍＯ］ｒ－（ＣＲａ ２）ｓ－であり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、脂肪族、またはハロであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４、または５であり；ｓは、０または１である）
を有する。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、
Figure 2024522183000431
である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、
Figure 2024522183000432
Figure 2024522183000433
である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、
Figure 2024522183000434
である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞におけるがん関連タンパク質発現を減少させることは、細胞の成長および／または増殖を減少させる。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、ＭＹＣＮ遺伝子の過剰発現を伴う細胞である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、化合物は、ＭＹＣＮ遺伝子における非標準Ｇ４四重鎖核酸領域に選択的に結合する。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、非標準Ｇ４四重鎖核酸領域は、ヘアピン構造を含む。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、細胞は、対象におけるがん細胞であり、方法は、それを必要とする対象に、化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルの治療有効量を投与してがん細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させ、それによって対象におけるがんを処置または予防するステップを含む、対象におけるがんを処置または予防するステップをさらに含む。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、がん細胞は、神経がん細胞または肺がん細胞である。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、がんは、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、前立腺がん、または小細胞肺がんである。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、がんを処置するステップは、腫瘍体積を減少させること、転移の数もしくはサイズを減少させること、またはがんの症状を和らげることを含む。
これらの方法のいずれかのまたは全ての代表的な実施態様では、方法は、追加の抗がん剤の治療有効量を対象に投与するステップをさらに含む。
細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させるための、式ＩＡによる化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、細胞を、式ＩＡによる化合物
Figure 2024522183000435
（式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
であって、ただし、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない
化合物の有効量と接触させることを含む使用も開示される。
細胞におけるＮ－Ｍｙｃ発現を減少させるための、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、細胞を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物の有効量と接触させることを含む使用が、さらに開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための、式ＩＡによる化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、化合物が、式ＩＡによる構造：
Figure 2024522183000436
（式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
を有し、ただし、化合物が、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない、
使用も開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、化合物が、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による構造を有する、使用も開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための医薬の製造における、式ＩＡによる化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、化合物が、式ＩＡによる構造
Figure 2024522183000437
（式中、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は、独立して、ＮまたはＯであり；
Ｒ１は、－（リンカー）ｔ－Ｒｂであり、ここで、Ｒｂは、芳香族、ヘテロ脂肪族、または脂肪族であり、リンカーは、脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり、ｔは、０または１であり；
Ｒ２は、Ｈまたは脂肪族であり；
各Ｒ３は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、またはハロであり；
ｘは、０～５から選択される整数である）
を有し、ただし、化合物が、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ－（３－（［１，４’－ビピペリジン］－１’－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミン、Ｎ１－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）－Ｎ２，Ｎ２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ－（３－（アゼパン－１－イル）プロピル）－６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－アミン、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（３－（４－メチルピペリジン－１－イル）プロピル）ピリダジン－３－アミンでも、６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）－Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピリダジン－３－アミンでもない、
使用も開示される。
対象におけるがんを処置または予防するための医薬の製造における、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による化合物あるいはその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩もしくはエステルの使用であって、化合物が、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについて本明細書に記載されるいずれかのまたは全ての代表的な実施態様による構造を有する、使用が、さらに開示される。
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、ある特定の実施態様の特定の特徴を説明するために提供されるものであり、請求項の範囲を、例示されるそれらの特徴に限定すべきでない。
材料および方法
標識されているまたはされていないＭＹＣＮ Ｇ４オリゴヌクレオチド（５’－ＡＧＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧＧ Ｔ－３’、配列番号７）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。結合特異性研究に使用したＤＮＡ／ＲＮＡ試料の他の配列を図１～２に要約する：
結合検証のためのヒット化合物をＣｈｅｍＤｉｖおよびＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅから購入した。化合物ＭＹ－１の類似体を社内で合成したか、または購入した。ＲＮＡ抽出キットＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（＃７４１３４）を、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡから購入した。ｃＤＮＡ合成キットＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ（商標）Ｋｉｔ（＃４３８７４０６）を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから購入した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＹから購入した。抗Ｎ－Ｍｙｃ（Ｂ８．４．Ｂ）：ｓｃ－５３９９３抗体（１：４０００希釈物；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＣＢ）、ＵＳＡ）、抗ＧＡＰＤＨ（０４１１）：ｓｃ－４７７２４抗体（１：２０００希釈物；ＳＣＢ、ＵＳＡ）、およびヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ：ｓｃ－２００５抗体（１：１０００希釈物；ＳＣＢ、ＵＳＡ）を、免疫ブロットに使用した。
一般的化学法。全ての化学試薬を商業供給業者から入手し、さらに精製せずに使用した。これらの実施例では、ＳＡＲ研究のための化合物は、ＣｈｅｍＤｉｖから購入した（ＭＹ－１、ＭＹ－２、ＭＹ－３、ＭＹ－４、ＭＹ－９、ＭＹ－１０、ＭＹ－１１、ＭＹ－１２）か、研究室で合成した（ＭＹ－５、ＭＹ－６、ＭＹ－７、ＭＹ－８、ＭＹ－１３、ＭＹ－１４）。減圧下でＢｕｃｈｉロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標） Ｒｆ自動クロマトグラフィーシステムを使用して行った。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ分光計によってそれぞれ５００ＭＨｚまたは１２５ＭＨｚで記録した。それを、重水素化溶媒シグナルと比較して報告する。１Ｈ ＮＭＲスペクトルのデータは、次のように報告する：化学シフト（δｐｐｍ）、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｑｕｉｎ＝五重線 ｍ＝多重線）、結合定数（Ｈｚ）、および積分値。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのデータは、化学シフトに関して報告する。
高分解能質量分析データは、二重電子スプレー源を装備したＡｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ－Ｍａｓｓ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって、陽イオンモードで動作させて、取得した。分離は、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ；粒径５μｍ）で行った。０．１％ギ酸を含有する、水／アセトニトリル勾配を使用して、被分析物を溶離させた。データを高分解能（１，７００ｍ／ｚ）、４ＧＨｚで取得した。実行時間中に質量精度を維持するために、内部質量較正試料をＬＣ／ＭＳ実行中に継続的に注入した。データの取得および解析は、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬＣＭＳ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（バージョンＢ．０６．０１）およびＱｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（バージョンＢ．０７．００）を使用して行った。
小分子マイクロアレイスクリーニング。小分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）を２Ｄエポキシスライドガラス（Ｓｃｈｏｔｔ）上に作成した。手短に述べると、ＣｈｅｍＤｉｖおよびＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅライブラリーからの約１５，０００の化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）、ならびに対照色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７および４８８、ＤＭＳＯ中１０μＭ）を、３８４ウェルプレート（Ａｒｒａｙｊｅｔ Ｊｅｔｓｔａｒ（商標））の中に用意した。化合物の各々を、二連ブロックに、Ａｒｒａｙｊｅｔロボットマイクロアレイプリンターによりプリントした。プリントした後、スライドガラスを固定化のためにアレイヤーにて一晩インキュベートし、その後、２４時間の真空乾燥を行った。未反応のエポキシ基を失活させるために、スライドを１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）中で２時間インキュベートし、次いで、ＤＭＦおよびｄｄＨ２Ｏで入念にすすぎ、その後、Ｎ２乾燥を行った。
目的の標的に対するスクリーニングを始めるために、５’Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を、先ず、アニーリング用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ）中、１０μＭ濃度で調製した。ＤＮＡ試料を、加熱ブロックにて９５℃で５分間インキュベートし、次いで、１時間より長い時間をかけてゆっくりと室温に冷却した。次いで、折り畳まれたＤＮＡをスクリーニング用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）に添加して５０ｎＭの最終濃度に対応するように希釈した。ＳＭＭスライドを４ウェルスライドホルダーに入れ、３ｍＬの１０×ｔＲＮＡ（スクリーニング用緩衝液中５００ｎＭ）とともに２時間インキュベートした。次いで、スライドをスクリーニング用緩衝液によって注意深く洗浄し、３ｍＬのＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ溶液（１０×ｔＲＮＡを含む）とともにさらに２時間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを５０ｍＬコニカルチューブに移し、ＰＢＳＴおよびｄｄＨ２Ｏによって３回、各緩衝溶液中で穏やかに洗浄した。次いで、スライドを１，７００ｇでの２分間の遠心分離によって乾燥させた。最後に、ＳＭＭを有するスライドを蛍光スキャナー（ＩｎｎｏＳｃａｎ １１００ ＡＬ）によって６４７ｎｍで、５μｍの分解能で画像化した。各スポットの蛍光強度をＩｎｎｏｐｓｙｓ Ｍａｐｉｘソフトウェアによって定量化し、以前に報告された基準（Connelly et al., ACS Chemical Biology 2017, 12:435-443；Connelly et al., Nature Communications 2019, 10:1501）に基づいてヒットを同定した。ヒットを同定するために、スクリーニング用緩衝液としかインキュベートしていない別のスライドも試験し、同じ方法を使用して陰性対照として画像化した。
蛍光強度アッセイ。本開示では、蛍光強度アッセイ（ＦＩＡ）を、単一用量でのヒット結合の検証と、結合親和性決定の両方に使用した。ＳＭＭスクリーニングからのヒット化合物を検証するために、各化合物の１００μＭ溶液を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、黒壁透明底）において三連で調製し、それによって５％ＤＭＳＯ濃度を得た。５’Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを上で説明したようにアニールし、次いで、ウェルプレートに添加し、それによって１００ｎＭの最終濃度を得た。プレートを３０分間、振盪しながらインキュベートし、その後、５００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。次いで、蛍光強度をＳｙｎｅｒｇｙ Ｍｘマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）によってＥｘ ６４９ｎｍ／Ｅｍ ６７０ｎｍで測定した。ＴＭＰｙＰ４／ＤＭＳＯをそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。ある特定の例では、陰性対照（ＤＭＳＯ溶液）と比較して蛍光強度の＞１０％変化である変化が観察された場合、化合物を結合剤と見なした。結合親和性測定のために、小分子溶液をＤＭＳＯ中の段階希釈物として調製した。次いで、最終試験プレートを、５μＬの小分子溶液および１０μＬのアニールされたＤＮＡ試料を８５μＬの緩衝溶液に添加することにより調製し、それによって０～２５０μＭの最終小分子濃度（５％最終ＤＭＳＯ濃度）を得た。蛍光強度を正規化し、結合親和性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアにおいてｏｎｅ－ｓｉｔｅ ｔｏｔａｌモデルを使用する曲線当てはめにより計算した。３’標識オリゴヌクレオチドを使用する蛍光滴定も同じように行った。
蛍光変位アッセイ。蛍光変位アッセイを、２つの古典的副溝結合剤（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびネトロプシン）を使用することにより行った。フルオロフォアとしてのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ）中５μＭ濃度で調製し、次いで、異なる濃度の非標識ＭＹＣＮ Ｇ４オリゴヌクレオチドで滴定した。変位のために、化合物ＭＹ－１またはネトロプシンのどちらかを溶液に添加し、それによって５μＭまたは５０μＭの最終濃度を得た。蛍光シグナルを３５２ｎｍの励起波長および５００ｎｍの発光波長で得た。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析。ＳＰＲ結合アッセイを、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器を用いて行った。ＣＭ５ ＳＰＲバイオチップをシステムにロードし、５μＬ／分の流速で泳動用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、５％ＤＭＳＯ）を用いてプライミングした。次いで、フローセル（Ｆｃ）１および２両方を１５分間、ＥＤＣ／ＮＨＳ（０．４Ｍ／０．１Ｍ）水溶液によって活性化し、その後、３０分にわたってストレプトアビジン（ＳＡ）溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中の０．２ｍｇ／ｍＬ）の注入を行った。ＳＡの固定化量が８，０００～１０，０００ＲＵに達した後、１０分間、１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）を流すことによって表面を不活性化し、２分間、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて再生して、未結合ＳＡを除去した。その一方で、ビオチン化ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡをアニーリング用緩衝液中５μＭで調製し、５分間、９５℃まで加熱し、ゆっくりと冷却した。アニーリング後、合計１５０μＬの溶液を３０分にわたってＳＰＲシステムのＦｃ ２に注入してＤＮＡをチップ表面に固定化した。ベースラインが安定したら、小分子溶液を試験した。
結合シグナルはもちろん結合親和性も検出するために、より速い流動速度（２５μＬ／分）をＦｃ １（リファレンス）とＦｃ ２（ＤＮＡ）の両方に使用した。化合物溶液の各々を、ＤＭＳＯ中の２０×設計濃度で調製し、次いで、非ＤＭＳＯ泳動用緩衝液に添加して希釈し、それによって５％ＤＭＳＯの最終濃度を得た。次いで、合計５０μＬの化合物溶液を会合のために１２０秒にわたってＦｃ １～２流路に注入し、続いて、解離のために緩衝液を２００秒流した。５０μＬの再生用緩衝液（１Ｍ ＫＣｌ）の注入を必要に応じて２つの試料間に行うことができた。リファレンスを引くことによって、最終結合曲線を得た。結合親和性（ＫＤ）を決定するために、一連の希釈化合物溶液を注入し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりラングミュア１：１結合モデルを使用してＫＤを計算した。
円偏光二色性（ＣＤ）特徴付けおよび熱融解アッセイ。折り畳みＧ四重鎖構造を、Ｊ－１５００円偏光二色性分光計（Ｊａｓｃｏ）を使用して円偏光二色性により特徴付けた。非標識ＭＹＣＮオリゴヌクレオチド（５’－ＡＧＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧＧ Ｔ－３’、配列番号７）を、アニーリング用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ）中、５μＭ濃度で調製した。対比として、Ｌｉ＋含有緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＬｉＣｌ）およびＨ２Ｏで希釈したＤＮＡ試料も、陰性対照として使用した。アニーリング手順は、上述の手順と同じであった。ＣＤスペクトルを３２０ｎｍ～２００ｎｍで、２５℃で、１ステップ１ｎｍで記録した。各スペクトルを、３つの反復測定試料のシグナルを平均することにより得た。
熱融解アッセイのために、ＭＹＣＮオリゴヌクレオチドを、低ＫＣｌ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ）中５μＭ濃度で調製した。安定化効果を試験するために、Ｇ４試料を２０μＭの化合物（５％ＤＭＳＯを含有する最終溶液）とともにおよびなしでインキュベートした。次いで、合計３００μＬの溶液をキュベットに添加し、ＣＤ分光計内で、１℃間隔で、２０℃から９５℃へ加熱した。融解温度（Ｔｍ）を計算するために、２６３ｎｍでＣＤスペクトルのピークを追跡し、温度に対して偏光解析をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアにて可変勾配を用いて非線形シグモイド用量応答モデルを使用して当てはめた。融解温度のシフト（ΔＴｍ）を、Ｔｍ（化合物）－Ｔｍ（ＤＭＳＯ）を使用して計算した。
２－アミノプリン（２－ＡＰ）蛍光滴定。２－アミノプリン標識化に基づく蛍光滴定を、以前に報告されたプロトコールを使用して行った。手短に述べると、Ａ１１位またはＡ１８位のどちらかに２－ＡＰ置換を有するＭＹＣＮ Ｇ４オリゴヌクレオチドを、９５℃への５分間の試料の加熱およびＲＴへの緩徐な冷却によりアニールした。折り畳み構造を有するオリゴヌクレオチドをＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中１０μＭに希釈し、黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において三連で設計どおりに調製した。小分子をＤＭＳＯで希釈して、０．１～５ｍＭの範囲にわたる濃度を有する一連の溶液を得、次いで、２０倍希釈し、プレートに添加した（５％ＤＭＳＯ最終濃度）。ウェルプレートにおける２－ＡＰ ＤＮＡの最終濃度は１μＭであった。バックグラウンド蛍光を得るために、ＤＮＡを含有しない小分子溶液も同じプレート内に調製した。３０分間のＲＴでのインキュベーション後、プレートを短時間、遠心分離し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｍｘマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）においてＥｘ ３１０ｎｍ／Ｅｍ ３６５ｎｍでスキャンした。リファレンスを引いた後に三連ウェルにおける強度を平均することにより、蛍光シグナルを計算した。最後に、結合シグナルを正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアにて可変勾配を用いて非線形シグモイド用量応答モデルを使用して曲線に当てはめることによりＫＤ値を決定した。
ジョブプロット解析。結合の化学量論比を決定するために、溶液中の化合物の分率を変化させることによる連続変化法を使用した（Renny et al., Angewandte Chemie 2013, 52:11998-12013）。手短に述べると、５μＭのアニールされたＡ１１ ２－ＡＰ標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料および５μＭの化合物のストック溶液（５％ＤＭＳＯ含有）をそれぞれ調製した。次いで、２系列の溶液を実験のために９６ウェル黒壁ウェルプレートにて調製した：一方は、総濃度を一定（５μＭ）に保ちながらＤＮＡ試料を化合物ストックと混合することにより小分子の分率を変え、他方は、緩衝液で希釈してＤＮＡ試料の濃度を変え、それによってリファレンスとしての試料の軌跡を得た。スキャン後、２系列の溶液間の蛍光強度の差を計算して、ジョブプロットを生成する。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアを使用して、線形回帰解析を行った。
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）。ＭＳＴ実験をＭｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５システム（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって行った。３’－Ｃｙ５ ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔ２０中で調製し、アニールし（上述の方法に従って）、１００ｎＭに希釈した（２×）。小分子のＤＭＳＯ溶液を緩衝液中で段階１：１希釈によって調製し、それによって２×の設計濃度（１０％ＤＭＳＯ）を得た。次いで、ＤＮＡ試料を対応する小分子溶液と１：１（ｖ／ｖ）混合し、それによって５０ｎＭ ＤＮＡおよび５％ＤＭＳＯを得た。最後に、ＭＳＴシグナルを３連キャピラリーにて検出し、ｓｉｎｇｌｅ－ｓｉｔｅモデル（ＭＯ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．３）を使用して曲線に当てはめることにより解離定数を決定した。
ＤＭＳフットプリンティング。５’Ｃｙ５標識ＤＮＡのフットプリンティングを、文献（Zhang et al., JACS 2014, 136:1381-1390；Li et al., PNAS 2015, 112:14581-14586）に記載されているように行った。ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を、適切な緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔ２０）中で、５μＭ濃度で調製し、その後、上述の方法を使用してアニーリングを行った。次いで、ＤＮＡ溶液を対応する緩衝液中５０ｎＭに希釈し（各管における最終体積２ｍＬ）、化合物ストック溶液（ＤＭＳＯ中）を添加し、それによって設計濃度を有する溶液（結果として５％ＤＭＳＯとなる）を得た。３０分間のインキュベーション後、折り畳まれたＤＮＡの試料を０．５％ＤＭＳで１０分間、ＲＴで処理し、２００μＬの停止用緩衝液（２．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、０．１Ｍ β－メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍＬのウシ胸腺ＤＮＡ）を添加することにより反応を停止させた。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿の後、ＤＮＡを５０μＬのヌクレアーゼフリー水に溶解した。同体積の１０％ピペリジンを各管に添加し、混合溶液を９０℃で３０分間、加熱し、その後、氷での急冷を行った。ＤＮＡを再びフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿に付した。沈殿したＤＮＡを１０μＬのヌクレアーゼフリー水に溶解し、９５℃で５分間、変性させ、１７％変性ポリアクリルアミドゲルで分割した。ゲル泳動後、Ｃｙ５標識ＤＮＡ断片をＴｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用してデジタル化した。
細胞系および細胞培養。神経芽細胞腫細胞系ＮＢＥＢ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｐｙ ＭＹＣＮ）細胞を使用して、ＭＹＣＮ／ＭＹＣＮＯｓ Ｇ四重鎖結合分子の有効性を評価した。ＮＢＥＢは、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所、小児腫瘍科、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤにおけるストックからのものであり、ＳＴＳ検証済みであった。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｔｌａｎｔａ）と、２ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）と、抗生物質（ペニシリン １００μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）とを補足したＲＰＭＩ－１６４０で培養した。
ＮＢＥＢ細胞に対するＧ４結合化合物の効果を調べるために、Ｉｎｃｕｃｙｔｅインターフェース（下で説明する）を使用して生細胞の画像化を行った。ＮＢＥＢ（５Ｋ／ウェル）、細胞を９６ウェルプレートに三連で播種し、様々な濃度（０～４５μＭ）の化合物ＭＹ－８で処理し、対照ウェルが集密に達するまで培養した。ＲＴ－ｑＰＣＲおよびウェスタンブロッティングのために、ＮＢＥＢ（３００Ｋ）細胞を６ウェル皿にて４８時間、ＭＹ－８で処理した。ＭＹＣＮＯｓ発現の時間依存的減少を調べるために、細胞を２２．５μＭおよび４５μＭのＭＹ－８で処理し、様々な時点（０、４、２４、４８、７２および９６時間）で解析した。細胞生存率を検証するために、処置の４８時間および９６時間後にトリパンブルー排除試験を行い、血球計数器を使用して生細胞の死細胞に対する割合を計算した。
細胞生存。生細胞の画像解析後、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム内塩アッセイを行って、細胞生存を調べた。（ＭＴＳ：内塩アッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａｍｅｒｉｃａ）。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ－ＲＡＤ、Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて４９０ｎｍの波長で測定した。生存細胞の割合を計算するために、ＭＹ－８処理細胞を各群からの対照試料で割った。
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞画像化システム。生細胞画像化を、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）からのＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。Ｉｎｃｕｃｙｔｅは、ＮＢＥＢ ＮＢ細胞についての予め定義されたプロセシング定義を基に細胞集密度を測定した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは、ウェルごとに３つの位相差画像を、処置継続期間（０～１２０時間）にわたって６時間ごとにスキャンした。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ。全ＲＮＡを、ＮＢＥＢ細胞から、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（＃７４１３４）（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）に従って抽出した。ｃＤＮＡ合成Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ（商標）Ｋｉｔを使用して、ＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者のプロトコールに従って使用して、定量的ＰＣＲを行った。ベータ－アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。２（－ΔＣｔ）法を使用して、相対発現を計算した。ｑＰＣＲプライマー配列は、補足資料において見つけることができる。
タンパク質アッセイ。６ウェルプレートにおけるＭＹ－８処理の４８時間後、放射性免疫沈降アッセイ用緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｃｈｉｎａ）が入っているプレートにて単一コピーＭＹＣＮ細胞を直接溶解し、ペレット化し、－８０℃で冷却した。細胞接着不良のため、ＮＢＥＢ細胞を１．５ｍＬ微量遠心管に収集し、リン酸緩衝溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で２回、洗浄し、ペレット化し、－８０℃で冷却した。ブラッドフォード試薬（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｃｈｉｎａ）を使用するブラッドフォードアッセイを使用して、総タンパク質濃度を決定した。各タンパク質試料（１０μｇ）を１２％ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）に負荷し、９０Ｖで９０分間、電気泳動し、Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用してニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に転写した。ニトロセルロース膜を、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０を補足したＴｒｉｓ緩衝食塩水中５％ミルク中で１時間、室温でインキュベートし、抗Ｎ－Ｍｙｃ：ｓｃ－５３９９３（１：４０００）および抗ＧＡＰＤＨ：ｓｃ－４７７２４（１：２０００）抗体とともに一晩、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０を補足したＴｒｉｓ緩衝食塩水で膜を洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウス（１：１０００）抗体でプローブし、１時間、室温でインキュベートした。ＣｈｅｍｉＤｏｃゲル画像化システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてＣｌａｒｉｔｙ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）またはＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、化学発光シグナルを検出した。
バイオインフォマティクス研究。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＳＥ６３８７４）から実験Ｇ４データに関する２つのファイル（ファイル名「Ｎａ＿Ｋ＿ＰＤＳ＿ｍｉｎｕｓ＿ｈｉｔｓ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ．ｂｅｄ．ｇｚ」および「Ｎａ＿Ｋ＿ＰＤＳ＿ｐｌｕｓ＿ｈｉｔｓ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ．ｂｅｄ．ｇｚ」）（１）をダウンロードした。ｂｅｄｔｏｏｌｓのｇｅｔｆａｓｔａ（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ２．３０．０）（２）を使用してＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）参照ゲノムからｂｅｄファイルのゲノム配列を抽出した。「Ｎａ＿Ｋ＿ＰＤＳ＿ｐｌｕｓ＿ｈｉｔｓ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ．ｂｅｄ」位置の場合、ゲノムアセンブリのマイナス鎖上に存在するＧ４配列のため、相補鎖配列を抽出した。抽出された固有のＯＱから正規表現式：（（Ｇ３～６（Ｎ１～３３）３Ｇ３～６）を使用してＧ４形成配列を同定した。
次いで、Ｇ４配列内のヘアピン形成ループの可能性を計算した。ＵＮＡＦｏｌｄ ４．０を使用して、Ｇ４における長さ３ｎｔの２つのＧトラクトと隣接している配列からのヘアピン形成を計算した。ＵＮＡＦｏｌｄを、「ｈｙｂｒｉｄ－ｓｓ－ｍｉｎ －－ＮＡ ＤＮＡ」設定を使用して実行して、３７℃でＤＮＡエネルギー則に従って一本鎖を形成する各ｎｔ位置の確率を出力した（３）。それらのヌクレオチドの５０％より多くが塩基対合している配列を、ヘアピン形成配列として同定した。次いで、ヘアピン形成Ｇ４を同定し、それらを抽出したＯＱに遡った。次いで、Ｇ４ヘアピン含有ＯＱの座標を、ＵＣＳＣ
Ｌｉｆｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓツール（ｌｉｆｔＯｖｅｒ）（４）を使用してＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８）座標に変換した。
得られたｈｇ３８座標にＧＥＮＣＯＤＥ、ｈｇ３８バージョン３６包括的遺伝子アノテーションＧＦＦ３ファイル（５）でアノテーションを付けた。プロモーターも、ＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子のＴＳＳ部位の１０００ｎｔ上流の領域として定義してアノテーションに加えた。Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｏｏｌｓパッケージ（ｇｅｎｏｍｅｔｏｏｌｓ １．６．１）「ｇｔ ｇｆｆ３－ａｄｄｉｎｔｒｏｎｓ」コマンド（６）を使用して、イントロンもＧＥＮＣＯＤＥアノテーションに加えた。ゲノム特徴量とＧＱ－ヘアピン含有ＯＱのオーバーラップを、ｂｅｄｔｏｏｌｓ交差コマンドを使用して同定した。述べたソフトウェアパッケージにより行わなかった演算操作にはＰｙｔｈｏｎ ３．８を使用した。
ｑＰＣＲ実験。ｑＰＣＲ実験のためのプライマー配列を次のとおり列挙する：
ＭＹＣＮＯｓ－０１（ＥＮＳＴ０００００６４１２６３．１－１，３１３，ｂｐｓ）
センス ５’－ＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＡ ３’、配列番号１０
アンチセンス ５’ＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣ３’、配列番号１１
ＭＹＣＮＯｓ－０２（ＥＮＳＴ０００００４１９０８３．５－７７０ｂｐｓ）
センス ５’ＣＴＣＡＣＧＡＧＣＡＣＧＣＡＧＡＣＡＡＣ ３’、配列番号１２
アンチセンス ５’ＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＴ ３’、配列番号１３ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム１（ＥＮＳＴ０００００２８１０４３．４－４６４ＡＡ）
センス ５’ＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣ ３’、配列番号１４
アンチセンス ５’ＣＡＣＡＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧ ３’、配列番号１５ＭＹＣＮタンパク質アイソフォーム２（ＥＮＳＴ０００００６３８４１７．１－２５３ＡＡ）
センス ５’ＴＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡ ３’、配列番号１６
アンチセンス ５’ＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＴＴＴ ３’、配列番号１７
化合物合成－一価化合物
Figure 2024522183000438
反応フラスコに、６－ヒドロキシピリダジン－３－カルボン酸（３９２ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５８９ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ）、Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ（４３８ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（８ｍＬ）を添加した。反応物を、室温で１０分間、撹拌し、続いて４－メトキシベンズアミドオキシム（６０５ｍｇ、３．６４ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を１２０℃に加熱し、撹拌した。３時間後、反応混合物を濾過し、ＤＭＦ（３ｍＬ×３）で洗浄した。濾液を収集し、乾燥させて、標的生成物Ｐ１（３４４ｍｇ、４６％）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 13.85 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 8.04-8.01 (m, 2H), 7.17-7.14 (m, 1H), 7.12 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 171.2, 167.9, 162.0, 160.3, 132.4, 131.9, 130.4, 128.9, 118.0, 114.8, 55,5;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ１３Ｈ１１Ｎ４Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：２７１．０８２６、実測値：２７１．０８３３。
ＰＯＣｌ３（６ｍＬ）中のＰ１（９７０ｍｇ、３．５９ｍｍｏｌ）の溶液を１００℃に加熱し、４時間撹拌した。反応粗生成物を氷冷水上に注ぎ、１０％ＮａＯＨ溶液で中和した。次いで、混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×３）で抽出し、ブラインで洗浄した。併せた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。得られた残留物をＩＳＣＯフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、Ｐ２（２４６ｍｇ、７２％）を薄ピンク色の固体として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.09-8.06 (m, 2H), 7.19-7.16 (m, 2H), 3.87 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 172.0, 168.3, 162.1, 158.4, 147.1, 130.4, 130.2, 129.0, 117.8, 114,9, 55.5;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ１３Ｈ１０ ３５ＣｌＮ４Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：２８９．０４８７、実測値：２８９．０４９３。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中のＰ２（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）と３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロパン－１－アミン（２２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とＮＨ４Ｃｌ（４ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－５（１３ｍｇ、４５％）を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.04-8.01 (m, 2H), 7.98 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.16-7.13 (m, 2H), 6.98 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.50-3.43 (m, 2H), 2.56-2.25 (m, 10H), 2.19 (s, 3H), 1.77 (五重線, J = 7.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 173.4, 167.7, 161.8, 159.4, 138.3, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 55.5, 55.3, 54.6, 52.4, 45.5, 25.7;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ２１Ｈ２８Ｎ７Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：４１０．２２９９、実測値：４１０．２３０５。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中のＰ２（３０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミン（１８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）とＮＨ４Ｃｌ（５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－６（１５ｍｇ、４４％）を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.17-8.14 (m, 1H), 8.05-8.03 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 1H), 7.17-7.14 (m, 2H), 4.08 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.24-3.20 (m, 5H), 2.59-2.58 (m, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 173.3, 167.8, 161.9, 159.6, 138.2, 128.8, 127.8, 118.3, 114.7, 111.8, 55.5, 46.1, 46.0, 36.5, 33.0;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ１７Ｈ２１Ｎ６Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３４１．１７２１、実測値：３４１．１７２５。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中のＰ２（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）と３－アミノプロパンアミド塩酸塩（１７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とＫ２ＣＯ３（３７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－７（１２ｍｇ、５０％）を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.04-8.01 (m, 2H), 7.99 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.16-7.13 (m, 2H), 7.01 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.88 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.68-3.66 (m, 2H), 2.45 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 173.4, 172.5, 167.7, 161.8, 159.2, 138.4, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 55.4, 37.3, 34.3;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ１６Ｈ１７Ｎ６Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３４１．１３５７、実測値：３４１．１３５９。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中の２（３２．９１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と３－（１－アゼパニル）－１－プロパンアミン（３６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）とＮＨ４Ｃｌ（６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－８（３１ｍｇ、６６％）を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.04-7.99 (m, 4H), 7.16-7.14 (m, 2H), 7.04 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.55-3.54 (m, 2H), 3.15-3.07 (m, 6H), 2.08-2.00 (m, 2H), 1.83-1.77 (m, 4H), 1.67-1.57 (m, 4H);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 173.3, 167.8, 161.8, 159.5, 138.6, 128.8, 127.5, 118.4, 114.7, 55.5, 54.4, 53.8, 38.3, 26.0, 23.7, 23.3;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ２２Ｈ２９Ｎ６Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：４０９．２３４７、実測値：４０９．２３５４。次いで、ＭＹ－８（５ｍｇ）をＴＦＡ（１ｍＬ）中で３０分間撹拌して、対応するＴＦＡ塩を得た。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中の２（３０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と２－モルホリノエタン－１－アミン（１４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）とＮＨ４Ｃｌ（５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－１３（２２．５ｍｇ、５９％）を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.05-8.02 (m, 2H), 7.99 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.70 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.17-7.14 (m, 2H), 7.04 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.61-3.58 (m, 6H), 2.56 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.46-2.44 (m, 4H);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 173.4, 167.7, 161.8, 138.4, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 66.2, 56.9, 55.4, 53.4, 38.0;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ１９Ｈ２３Ｎ６Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３８３．１８２６、実測値：３８３．１８３１。
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中の２（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）と２－（４－メチルピペラジン－１－イル）エタン－１－アミン（２０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とＮＨ４Ｃｌ（４ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱し、一晩、撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた残留物をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０～２５％ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＹ－１４（１６ｍｇ、５８％）を白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.04-8.02 (m, 2H), 7.99 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.16-7.14 (m, 2H),
7.03 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.62-3.56 (m, 2H), 2.56 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.46-2.26 (m, 8H), 2.17 (s, 3H);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 173.4, 167.7, 161.8, 138.4, 128.8, 127.4, 118.4, 114.7, 56.4, 55.4, 54.6, 52.6, 38.3;ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ＋）Ｃ２０Ｈ２６Ｎ７Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３９６．２１４２、実測値：３９６．２１４１。
化合物合成－二価化合物
本明細書で開示する二価化合物を下記のスキーム５に従って作製した。
Figure 2024522183000439
二価化合物のＲ１基（上記のスキーム５では「Ｒ」と呼ばれる）を、下記のスキーム６に示すように作製し、次いで、同じく下記の条件を使用してスキーム５における化合物７と併せた。
Figure 2024522183000440
Ｎ１－（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）エタン－１，２－ジアミン（１）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（methoxycridine）（９９．２ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（３３．６ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ、１当量）および１，２－ジアミノエタン（２１４ｍｇ、３．５７ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して６６．３ｍｇ（６２％）の１を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.47 (dd, J = 9.5, 2.6 Hz, 1H), 7.86 (q, J = 2.9, 2.4 Hz, 2H), 7.81 (dd, J = 9.3, 2.0 Hz, 1H), 7.74 - 7.67 (m, 1H), 7.54 (dt, J = 9.3, 2.1 Hz, 1H), 4.52 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.03 (d, J = 2.0 Hz, 3H), 3.58 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 158.72, 158.55, 142.20, 141.78, 136.27, 129.37, 129.19, 125.48, 121.60, 118.79, 116.08, 111.61, 103.92, 56.75, 47.44, 39.78;ＬＲＭＳ：Ｃ１６Ｈ１６ＣｌＮ３Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３０１．０９、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ １．１８分、ｍ／ｚの測定値３０２．２０［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2024522183000441
Ｎ１－（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）プロパン－１，３－ジアミン（２）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２００ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（６７．７ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ、１当量）および１，３－ジアミノプロパン（５３３ｍｇ、７．１９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して１２５ｍｇ（５７％）の２を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.47 (dd, J = 9.5, 3.0 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 9.8, 2.4 Hz, 2H), 7.77 (dd, J = 9.1, 3.1 Hz, 1H), 7.66 (dd, J = 9.2, 2.6 Hz, 1H), 7.50 (dt, J = 9.4, 2.2 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.00 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.38 - 2.31 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 158.47, 158.33, 142.05, 141.73, 136.08, 129.34, 128.99, 125.29, 121.59, 118.67, 115.88, 111.59, 103.86, 56.71, 47.30, 38.11, 28.66;ＬＲＭＳ：Ｃ１７Ｈ１８ＣｌＮ３Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３１５．１１、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ １．１７分、ｍ／ｚの測定値３１６．２０［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2024522183000442
Ｎ１－（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）ブタン－１，４－ジアミン（３）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２５０ｍｇ、０．８９９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（８４．６ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ、１当量）および１，４－ジアミノブタン（７９２ｍｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して４２４ｍｇ（８５％）の３を橙黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.20 (dd, J = 9.4, 2.5 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.78 - 7.75 (m, 1H), 7.46 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.39 (dt, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 7.25 (dt, J = 9.3, 2.1 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.83 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.83 (dd, J = 8.9, 6.0 Hz, 2H), 1.83 (p, J = 8.4, 7.6 Hz, 2H), 1.70 - 1.62 (m, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ１８Ｈ２０ＣｌＮ３Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３２９．１３、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ １．５６分、ｍ／ｚの測定値３３０．２５［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2024522183000443
Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－アミン（４）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２５０ｍｇ、０．８９９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（８４．６ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ、１当量）および２，２’－オキシビス（エタン－１－アミン）（９３６ｍｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して４４１ｍｇ（８６％）の４を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.15 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.78 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.38 (s, 2H), 7.33 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.63 (m, 2H), 3.43 (m, 2H), 2.70 (m, 2H); 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 155.89, 151.58, 147.51, 145.60, 134.99, 129.02, 125.70, 125.37, 124.81, 123.31, 117.87, 115.40, 99.69, 71.75, 70.15, 54.76, 49.38, 40.63;ＬＲＭＳ：Ｃ１８Ｈ２０ＣｌＮ３Ｏ２ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値３４５．１２、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ １．７４分、ｍ／ｚの測定値３４６．２５［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2024522183000444
Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－アミン（５）：
密封バイアルの中で６，９－ジクロロ－２－メトキシアクリジン（２５０ｍｇ、０．８９９ｍｍｏｌ、１当量）、フェノール（８４．６ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ、１当量） ２，２’－（エタン－１，２－ジイルビス（オキシ））ビス（エタン－１－アミン）（１．３３ｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１０当量）を併せ、１１０℃で８時間、暗所で加熱した。ＬＣＭＳにより完了したら、反応物を放置して室温に冷却し、セライト上に注いで濃縮した。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨを含有する水））により精製して２００ｍｇ（５７％）の５を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 8.37 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.63 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.78 - 6.55 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.86 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.49 (dd, J = 5.7, 3.9 Hz, 2H), 3.40 (dd, J = 5.9, 3.9 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 5.8 Hz, 2H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-D6) δ 155.15, 150.62, 147.98, 146.23, 133.44, 130.81, 127.23, 126.34, 126.18, 117.69, 115.38, 100.54, 73.06, 69.79, 69.50, 55.59, 41.28.
Figure 2024522183000445
６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－オール（６）：
ＤＭＦ（４８ｍＬ）中の６－ヒドロキシピリダジン－３－カルボン酸（１．５０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、トリエチルアミン（３．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ、２当量）、ＨＯＢｔ（１．６０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（２．４０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。溶液を室温で３０分間、撹拌しておいた後、Ｎ’－ヒドロキシ－４－メトキシベンズイミドアミド（１．８０ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応物を室温で１時間維持し、次いで、加熱し、１５０℃で１時間、またはＴＬＣにより完了と判断されるまで、維持した。溶液を放置して室温に冷却し、この段階で生成物が溶液から沈殿した。水（約３００ｍＬ）を添加し、固体を室温で３０分間、研和した。生成物を真空濾過により単離し、真空中で乾燥させて１．８４ｇの６（６４％）を白色固体として得た：1H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 13.85 (s, 1H, D2Oにより交換), 8.08 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-D6) δ 171.2, 167.9, 162.0, 160.3, 132.3, 131.8, 130.4, 128.9, 117.9, 114.8, 55.4.ＮＭＲデータは、文献値と一致する。［１］
Figure 2024522183000446
５－（６－クロロピリダジン－３－イル）－３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール（７）：
１（５００ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１当量）およびＰＯＣｌ３（３．１４ｍＬ、０．５９Ｍ）のバイアルを密封し、４時間、１００℃に加熱した。ＴＬＣにより完了と判断されたら、反応混合物を放置して室温に冷却し、真空中で濃縮した。粗混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して３８８ｍｇ（７２％）の７を黄褐色固体として得た：1H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 8.56 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-D6) δ 172.0, 168.3, 162.1, 158.4, 147.0, 130.3, 130.2, 129.0, 117.8, 114.8, 55.5.
Figure 2024522183000447
Ｎ１－（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）－Ｎ２－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）エタン－１，２－ジアミン（Ｂ３２）：
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の７（２１．３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（６４．３μＬ、０．３７０ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて２（４４．４ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して３．２６ｍｇ（７％）のＢ３２を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, DMSO-D6) δ 8.68 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.86 - 7.73 (m, 2H), 7.67 (dd, J = 9.2, 2.5 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.75 (m, 2H).
Figure 2024522183000448
Ｎ１－（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）－Ｎ３－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）プロパン－１，３－ジアミン（Ｂ３３）：
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の７（３０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（９１μＬ、０．５２ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて２（６５ｍｇ、２１μｍｏｌ、２当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して１７ｍｇ（２９％）のＢ３３を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.49 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.11 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 9.3, 2.3 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.75 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 6.4 Hz, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ３０Ｈ２６ＣｌＮ７Ｏ３ ＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５６７．１８、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ ４．１４分、ｍ／ｚの測定値５６８．３５［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2024522183000449
Ｎ１－（６－クロロ－２－メトキシアクリジン－９－イル）－Ｎ４－（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）ブタン－１，４－ジアミン（Ｂ３４）：
ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）中の７（３０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（９１μＬ、０．５２ｍｍｏｌ）を添加し、続いて３（５１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して１９ｍｇ（３１％）のＢ３４を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.36 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.08 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.55 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.03 - 1.97 (m, 2H), 1.83 (t, J = 7.3 Hz, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ３１Ｈ２８ＣｌＮ７Ｏ３＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５８１．１９、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ ４．１０分、ｍ／ｚの測定値５８２．４０［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2024522183000450
６－クロロ－２－メトキシ－Ｎ－（２－（２－（（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）アミノ）エトキシ）エチル）アクリジン－９－アミン（Ｂ３５）：
ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中の７（４２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１３０μＬ、０．７３ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて４（７５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して４８ｍｇ（５５％）のＢ３５を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.58 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.81 - 7.71 (m, 3H), 7.64 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H), 7.45 (dd, J = 9.2, 2.1 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.26 (m, 2H), 4.01 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.75 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.63 (m, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ３１Ｈ２８ＣｌＮ７Ｏ４＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５９７．１８、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ ３．８９分、ｍ／ｚの測定値５９８．３５［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2024522183000451
６－クロロ－２－メトキシ－Ｎ－（２－（２－（２－（（６－（３－（４－メトキシフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル）ピリダジン－３－イル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）アクリジン－９－アミン（Ｂ３８）：
ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中の７（１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３０２μＬ、１．７３ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて５（１６８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応物を加熱し、１１０℃で１８時間維持した。粗反応混合物を放置して室温に冷却し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０～１００％アセトニトリル／（修飾剤として０．１％ＴＦＡを含有する水））により精製して５０ｍｇ（２３％）のＢ３８を黄色固体として得た：1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.81 - 7.75 (m, 2H), 7.68 (dd, J = 9.3, 2.5 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.94 (m, 5H), 3.86 (s, 3H), 3.64 (m, 2H), 3.59 - 3.53 (m, 4H), 3.51 (m, 2H);ＬＲＭＳ：Ｃ３３Ｈ３２ＣｌＮ７Ｏ５＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値６４１．２１、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ ３．８７分、ｍ／ｚの測定値６４２．５０［Ｍ＋Ｈ］＋。
（実施例１）
ＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ四重鎖の解析
図３に示されているように、本明細書で論じるＭＹＣＮ Ｇ４は、マイナス鎖に、およびＭＹＣＮＯＳの転写開始部位（ＴＳＳ）の付近に、位置する。しかし、単純Ｇ４とは異なり、ＭＹＣＮ Ｇ４は、テトラドに隣接するヘアピンを含有する（Benabou et al., Biochim. et Biophys. Acta 2014, 1840(41-52)。ハイブリッドＧ４構造のこのクラスは、ゲノムデータマイニングと実験アプローチの両方により最近特徴付けられており（Onel et al., JACS 2016, 138:2563-2570；Ngoc Nguyen et al., Nucleic Acids Res. 2020, 48:10567-10575；Lim et al., Nucleic Acids Res. 2015, 43:5630-5646）、それらの固有の構造に起因して小分子の興味深い標的となっている Kang et al., JACS 2016, 138:13673-13692）。ＭＹＣＮ Ｇ４はｉｎ ｖｉｔｒｏで構造的に特徴付けられているが、生物学的状況下ではＧ４の存在について疑問が生じることが多い。ＭＹＣＮ遺伝子が、Ｇ４に折り畳まれる配列を含有することを確認するために、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎグループにより報告されたゲノムワイドなＧ４－ｓｅｑデータ（Chambers et al., Nature Biotechnology 2015; 33:877-881）を解析した。このアプローチは、Ｇ４を安定化する前およびした後の２ラウンドのシークエンシングからなる。実験間のより高いミスマッチ率は、対応する領域においてＧ４構造を形成する可能性がより高いことを意味する。これらのデータの中で、この研究の目的のＧ４配列は、Ｋ＋安定化データセットとＰＤＳ安定化データセットの両方において、よりいっそう高いミスマッチ率を有することが判明し、それによってＭＹＣＮ遺伝子におけるＧ４の存在が裏付けられる（図４）。さらに、ＱＧＲＳマッパー（Kikin et al., Nucleic Acids Res. 2006, 34:W676-682）を使用してこの配列内のＧスコアを計算したところ、目的の標的は、３３の有望なＧスコアを示すことが判明した（図５Ａ～５Ｂ）。
（実施例２）
小分子マイクロアレイスクリーニングおよびヒット同定
ＭＹＣＮ Ｇ４の小分子結合剤を同定するために、小分子マイクロアレイ（ＳＭＭ）スクリーニングアプローチを使用した。この研究では、エポキシ基で修飾されたスライドガラスを、以前に報告された類似のプロトコール（Abulwerdi et al., Methods 2016, 103:188-195）に従って調製した。化合物をロボットアレイヤー（Ａｒｒａｙｊｅｔ（商標））によりガラス表面にプリントし、共有結合で固定化した。次いで、スライドを、５’をＣｙ５で標識した５０ｎＭ ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ、および緩衝液とともに、並行してインキュベートした。洗浄および乾燥後、スライドをマイクロアレイスキャナーにより画像化した。各化合物について、複合Ｚスコアを計算し、ヒットを同定した（Connelly et al., ACS Chemical Biology 2017, 12:435-443）。他のＳＭＭスクリーニングにおいて他の核酸への無差別な結合がなかった化合物を優先させた。合計で、１４のヒットを同定した（表２）。
Figure 2024522183000452
Figure 2024522183000453
本物の結合剤としての１４のヒット化合物を検証するために、単一濃度結合アッセイを蛍光強度アッセイ（ＦＩＡ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により行った。化合物を各アッセイにおいて１００μＭ濃度で評価した。この実施例では、陽性結合を、ＦＩＡ研究における＞１０％失活という基準によって定義し、その一方で、ＳＮＲ＞３をＳＰＲ実験におけるカットオフとして使用した。化合物１、２、ＭＹ－１、５、１０、１１、１２および１４は、ＦＩＡ研究におけるヒットであり、化合物１～３、ＭＹ－１、５、９および１３は、ＳＰＲ研究におけるヒットであった。これらのアッセイから、両方の結合アッセイにおいて陽性応答を示す４つの化合物（１、２、ＭＹ－１、および５）を特定した（図６～８）。平衡解離結合定数（ＫＤ）値をＦＩＡおよびＳＰＲにより測定した（図９および１０）。勾配濃度の化合物を用いてＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を滴定したところ、化合物ＭＹ－１は、４つの候補の中で最高の結合を示すことが判明した（ＦＩＡによりＫＤ＝３．５±１．６μＭ、およびＳＰＲによりＫＤ＝３．６±２．４μＭ）。化合物１は、２と同様の構造を共有していたが、より良好な結合親和性を有した（ＦＩＡにより２０．８±２．２μＭ、およびＳＰＲにより１１．７±２．６μＭ）。
ＭＹＣＮ Ｇ４の熱安定性に対するＭＹ－１の効果を円偏光二色性（ＣＤ）により評価した。先ず、Ｇ４形成をＣＤ分光法により確認した。ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡの試料を３つの異なる緩衝液条件（１００ｍＭ ＫＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＬｉＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、およびＨ２Ｏ）で調製した。図１１Ａに示されているように、ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡは、ＫＣｌ緩衝液中で正しく折り畳まれた平行Ｇ四重鎖構造の特徴を示す２６３ｎｍにおける正のピークおよび２４０ｎｍにおける負のピークを示した。その一方で、ＬｉＣｌ緩衝液およびＨ２Ｏ中のＤＮＡ試料のスペクトルは、２６３ｎｍにおいてそれよりはるかに弱いピークを示し、その上、２４０ｎｍでのピークは、無視できるほどのものであった。
次に、融解アッセイを、検証された小分子結合剤なしで／とともにインキュベートしたＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを使用してＣＤ計器によって実際にやってみた。ＣＤスペクトルの２６３ｎｍピークは、加熱中に徐々に減少し（図１１Ｂ）、温度依存的強度を当てはめることによりＴｍを決定した。ＭＹＣＮ Ｇ４を、先ず、１００ｍＭ ＫＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で融解し、Ｔｍを７８．０±１．９℃と決定し、これは、以前に報告された値と一致した（Benabou et al., Biochim. et Biophys. Acta 2014; 1840:41-52）。熱アンフォールディングに対する分子の影響を評価するために、Ｇ４の折り畳みが、より少ないＫＣｌによる影響を受けないことを確認した（図１２）後、ＫＣｌ濃度低下を使用するアッセイ（Kumari et al., Nature Chemical Biology 2007, 3:218-221）を行った。５ｍＭ ＫＣｌ緩衝液では、ＭＹＣＮ Ｇ４の融解曲線がよりよく当てはまり、Ｔｍは５４．６±０．４℃であった。Ｔｍは、緩衝液への５％ＤＭＳＯの添加の影響を受けなかった。２０μＭの１またはＭＹ－１をＭＹＣＮ Ｇ４溶液に添加し、１５分間インキュベートした後、アンフォールディングした。結果として、両方の化合物が、融解曲線の有意なシフトを誘導し、Ｔｍを、それぞれ、４．７±０．７℃（１について）および３．７±０．５℃（ＭＹ－１について）上昇させた（図１１Ｃ）。どちらの化合物も、ｄｓＤＮＡ融解に対して測定可能な効果を示さなかった（図１１Ｄ）。これは、これらのヒット化合物がＢ－ＤＮＡ結合剤でなかったことを示す。
化合物１およびＭＹ－１の結合選択性も評価した。別の実験で、蛍光に基づくアッセイを、過剰なｔＲＮＡが存在する／非存在であるＧ４溶液に化合物を徐々に加えることにより行った。ｄｓＤＮＡと同様に、過剰なｔＲＮＡは、１の結合親和性にもＭＹ－１の結合親和性にも影響を与えなかった。これは、さらに、特異的な相互作用様式を示唆する（図１３Ａおよび１３Ｂ）。加えて、がん関連遺伝子（図１）からの別の５つの５’Ｃｙ５標識Ｇ４も選択性プロファイリングに導入した。２つのヒット化合物を滴定したところ、化合物１は、２５．２～１２７．９μＭの範囲にわたる結合親和性で全てのＧ４へのある程度の結合を示したが、ＭＹＣＮ Ｇ４のものより弱かった（図１４Ａ～１４Ｅ）。しかし、ＭＹ－１は、有意な失活挙動を示さず、ＭＹＣＮを除くいずれのＧ４についてもＫＤ値を測定することができなかった（図１５Ａ～１５Ｅ、１６Ａ～１６Ｅ）。この結果は、ＭＹ－１がＭＹＣＮ Ｇ４にその固有の構造によって結合することを示していた。
（実施例３）
非標準Ｇ４結合剤としての化合物ＭＹ－１の同定
ＳＰＲセンサーグラムを解析したところ、化合物１とＭＹ－１との有意に異なる結合レベル（Ｒｍａｘ）が観察され、これは、２つの化合物の結合様式が異なる可能性があることを示唆していた。この予想外の観察に基づいて、また、単一の理論に拘束されるものではないが、２つの化合物はＭＹＣＮ Ｇ４の異なる部位に結合する可能性があると今や考えられる。調査するために、化合物を指定された順序で段階的に注入することまたは混合物を注入することによりＳＰＲで競合アッセイを行った（Brooks et al., Drug Discovery Today 2014, 19:1040-1044；Spurny et al., PNAS 112:E2543-2552）。１００μＭの１を注入し、続いて１００μＭのＭＹ－１を注入したところ、ＭＹ－１の観察された結合レベルは、個々の注入のものと比較して有意に変化しなかった（図１７）。１のより高い濃度（５００μＭ）ででも、ＭＹ－１結合レベルは維持された（図１８Ａおよび１８Ｂ）。これは、１がＭＹ－１と競合しないことを示唆する。次に、古典的スタッキングＧ４結合剤であるＴＭＰｙＰ４（Seenisamy, JACS 2004, 126:8702-8709）も、ＭＹ－１と一緒に試験した。ＴＭＰｙＰ４溶液へのＭＹ－１（１００μＭと２５０μＭの両方）の添加は、ＳＰＲ結合シグナルの増加をもたらした（図１９Ａおよび１９Ｂ）。これは、ＭＹ－１が明確に異なる様式でＧ４に結合することを示唆する。加えて、ＭＹ－１か２つのヒット（１とＭＹ－１）の混合物かを使用してＣＤ融解アッセイも行った。２０μＭの１および２０μＭのＭＹ－１を含有する溶液の混合物は、ＭＹＣＮ Ｇ４のＴｍを９．７±０．７℃上昇させ、この上昇は、２０μＭ ＭＹ－１のみのものより有意に高度であった（図２０Ａおよび２０Ｂ）。これは、オーバーラップしない相互作用様式を示唆する。その一方で、４０μＭ ＭＹ－１添加によるＭＹＣＮ Ｇ４のΔＴｍは、恐らく結合部位の飽和に起因して、有意に増加しなかった。
ＭＹ－１とＭＹＣＮ Ｇ４の結合化学量論比を評価するために、ジョブプロット解析を行った。手短に述べると、蛍光滴定中に構成要素の分率を変えることにより、蛍光強度の変化をプロットし、当てはめ、その結果、１：１結合化学量論比を示す０．４７で最大となった（図２１）。ＭＹ－１とＭＹＣＮ Ｇ４との結合をマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）により研究した。３’－Ｃｙ５標識ＤＮＡ試料を、失活が観察されなかったので使用した（図２２）。マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）曲線は、１：１結合モデルによく当てはまり、結合親和性は、８．１±１．７μＭと算出され、これは、ＦＩＡおよびＳＰＲ実験の結果と一致した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。その結果として、他の報告されたＧ４スタッカーの大多数とは異なり、および１と明確に異なり、ＭＹ－１を非標準Ｇ４結合剤として同定した。
（実施例４）
ＦＩＡおよびＤＭＳ－フットプリンティングを使用する結合部位同定
化合物ＭＹ－１とＭＹＣＮ Ｇ４との結合の詳細をさらに理解するために、一連のＦＩＡ研究を設計し、行った。ヒット化合物が１：１化学量論比でＧ４と結合したことを考えて、固有の結合挙動はヘアピン構造に関係していると仮定した。先ず、環境感受性２－アミノプリン（２－ＡＰ）フルオロフォアをＧ４の別個の位置（Ａ１１、Ａ１８、およびＡ２４）に導入することにより、結合領域を調査した（図２４Ａ）。１００μＭ ＭＹ－１を標識ＤＮＡ試料とともにインキュベートした後、蛍光強度を測定し、ＤＭＳＯ対照と比較した。Ａ１１ ２－ＡＰ ＤＮＡ試料の蛍光は、ほぼ１００％失活したが、Ａ１８およびＡ２４ ２－ＡＰ ＤＮＡについての失活パーセンテージは、それぞれ８０％および７０％であった（図２４Ｂ、図２５Ａ～２５Ｃ）。５’－Ｃｙ５標識オリゴと３’－Ｃｙ５標識オリゴとの異なる失活挙動についての前の観察（１５％および０％失活、図２４Ｃ）に基づいて、ＭＹ－１は、ヘアピン付近の領域に結合していると仮定した。次に、この結合事象におけるヘアピンの必要性を、変異した長いループ（塩基対合を形成することができなかった）および短縮型配列（ヘアピンなし）を含む２つのＤＮＡ構築物を設計することにより探究した（図２を参照されたい）。２つのＤＮＡにＭＹ－１を徐々に加えると、結合親和性は、＞１００μＭのマイクロモル（野生型ＭＹＣＮ Ｇ４のものより約３０倍弱い）へと大幅に減少した。その一方で、化合物１もこれらのＧ４に対して試験し、親和性は、野生型（ＷＴ）構築物と同等であった（図２４Ｄ）。これらの結果は、ＭＹＣＮ Ｇ４におけるヘアピン構造が、ＭＹ－１との結合を維持するために重要であるが、１との結合を維持するために重要でないことを示していた。
加えて、化合物がヘアピンの副溝に結合するかどうかを探究するために、ＭＹ－１を他の２つの古典的副溝結合剤（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびネトロプシン）と一緒に蛍光変位アッセイ（Alniss, J. Medicinal Chemistry 2019, 62:385-402）により試験した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８はフルオロフォアとして報告されており、ＤＮＡ染色試薬として広く使用されていたので、それを、先ず、異なる濃度の非標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡとともにインキュベートし、滴定した。３５２ｎｍの励起波長および５００ｎｍの発光波長を利用したところ、蛍光強度は、予想どおりＤＮＡ濃度の上昇に伴って増強された（図２４Ｅ）。次に、ＭＹ－１またはネトロプシンのどちらかをＤＮＡ滴定中に競合物質として溶液に添加した。周知の副溝結合剤としてのネトロプシンは、蛍光強度の対応する減少により測定されるＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８の有意な変位を示した。しかし、ＭＹ－１については、５０μＭでは部分的な蛍光減少が観察されたが、５μＭでは測定可能な変化は観察されなかった。したがって、ヘアピンはＭＹ－１結合を助長すると今や考えられるのだが、それは古典的副溝結合剤ではないようである。
ＭＹＣＮ Ｇ４への化合物の結合様式をさらによく理解するために、硫酸ジメチル（ＤＭＳ）フットプリンティングアッセイを開発した。このアッセイは、ピペリジンを使用して後で切断することができる、グアニン（Ｇ）内の遊離Ｎ７をメチル化するＤＭＳの能力を活用する（４３、４４）。その一方で、四重鎖構造におけるフーグスティーン結合Ｇは、修飾されないように保護されたままである。さらに、小分子とのインキュベーションによる修飾の変化を結合部位付近で観察することができる。５’Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４を５ｍＭ ＫＣｌの存在下でアニールし、その後、化合物を、観察されたＫＤに準拠した濃度で添加した。図２４Ｆに示されているように、Ｇ１０～Ｇ１２に対応するバンドは、保護に起因して暗く、これは、Ｇが四重鎖のテトラッド内に組み込まれたことを示す。しかし、Ｇ１３～Ｇ１６は、非保護のままであり、したがって、ワトソン・クリック塩基対合によるヘアピン形成に起因して、よりいっそう明るいバンドを示した。化合物ＭＹ－１の存在下で、様々なＧの濃度依存的保護が観察された。これは、化合物がＧ４構造を安定させることを示す。Ｍｙ－１を添加すると、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１６、Ｇ１７は、かなり保護され、その一方で、Ｇ１３～Ｇ１５は、わずかに保護された。この結果は、上記の複数の結果と一致して、ＭＹ－１が四重鎖とヘアピンとの接合部に結合していることを示唆していた。（図２４Ｂ）。
（実施例５）
化合物ＭＹ－１の構造－活性関係（ＳＡＲ）研究
ＭＹＣＮ Ｇ４標的に対するより良好な結合を達成するために、ＭＹ－１の一連の類似体（表３を参照されたい）を使用することにより構造－活性関係（ＳＡＲ）研究を行った。ＭＹ－１および１３の誘導体（ＭＹ－２～ＭＹ－１４）を含有する的を絞ったライブラリーを購入したか合成した。各化合物を上記のＳＰＲおよび２－ＡＰ滴定により評価した。予備的研究では、ＭＹ－１におけるピロリジン基がＧ４との結合を維持することによる役割ばかりでなく溶解性に役立つ役割も果たすと、今や考えられる。その一方で、ＭＹ－１の複素環コア（表３に示す）はＭＹＣＮ Ｇ４認識を助長するとも、今や考えられる。それ故、ほとんどの類似体が、変更された側鎖Ｒ基を含有した。
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１４の類似体とＭＹＣＮ Ｇ４との系統的結合アッセイを、ＳＰＲおよび２－ＡＰ（Ａ１１）蛍光滴定により行った（図２６Ａ～２６Ｎ、２７Ａ～２７Ｎ）。概要として、観察された結合親和性は、１．４～２３．５μＭ（ＳＰＲ）、および０．２～７．０μＭ（２－ＡＰ滴定）の範囲にわたった。類似体の大部分は、ＭＹＣＮ Ｇ４への良好な結合挙動を示したが、ただし、ＭＹ－４およびＭＹ－９を除いてであり、これらの両方には好適な緩衝剤への溶解性があった。ＳＰＲ実験では、４つの類似体（ＭＹ－２、５、８、および１０）を親化合物より強い結合剤として同定し、これらの中で、ＭＹ－５およびＭＹ－８は、それぞれ、１．４±０．２μＭおよび１．５±０．３μＭという最も強力な結合親和性を示した。化合物ＭＹ－２は、ＳＰＲセンサーグラムで高い応答を示し、これは、それが凝集剤であることを示唆していた。２－ＡＰ蛍光滴定アッセイ（Ａ１１置換構築物を使用する）について、観察されたＫＤ値は、ＳＰＲ実験とよく合致したが、値は、全体的にそれよりわずかに低かった。試験した類似体の中で、４つの化合物（ＭＹ－２、ＭＹ－８、ＭＹ－１０、およびＭＹ－１４）は、ＭＹＣＮ Ｇ４標的へのマイクロモル以下の結合剤と判明した。重ねて、類似体ＭＹ－２は、０．２±０．０３μＭでの最高結合親和性を示したが、凝集の可能性／不良な溶解度のため、それをさらなる試験に選ばなかった。全てのＳＡＲデータを勘案して、ＭＹ－８を細胞に基づくアッセイに選出した。結果を上の表３に示す。
（実施例６）
ＭＹ－８処理後のＭＹＣＮ－ＭＹＣＮＯＳ発現に対する効果
ＭＹＣＮ遺伝子発現に対するＭＹ－８の効果を評価するために、ＮＢＥＢ細胞を培養し、異なる濃度のＭＹ－８で処理した。細胞生存率に対するＭＹ－８の効果を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞画像化システムを使用して評価した。ＭＹ－８の単回処理後の細胞集密度の４日測定に基づいて、ＮＢＥＢ細胞成長の有意な阻害が観察された（図２８Ａおよび２８Ｂ）。４５μＭまでの化合物濃度の上昇に伴って、２０．５μＭのＣＣ５０がＭＴＳアッセイにより確認された（図２８Ｃ）。次に、ＭＹＣＮならびに２つのＭＹＣＮＯＳ転写物（ＭＹＣＮＯＳ００１およびＭＹＣＮＯＳ００２）を含む、遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＭＹ－８処理後の異なる時点（２４、３６および４８時間）で、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定した（図２８Ｄ～２８Ｆ）。より高いＭＹ－８濃度で、ｍＲＮＡレベルの明確な減少が３つ全ての転写物について観察され、これは、ＭＹ－８での処理がＭＹＣＮとＭＹＣＮＯＳの両方の発現レベルを低下させることを示していた。興味深いことに、ＭＹＣＮＯＳ００２レベルは、他の２つの転写物より早い、２４時間という早期に低下した。Ｎ－Ｍｙｃタンパク質のレベルもウェスタンブロッティングを使用して測定した（図２８Ｇ）。ここで、結果は、ｑＰＣＲ実験と一致し、Ｎ－Ｍｙｃタンパク質のレベルは、ＭＹ－８での処理によって用量依存的に低下された。
本明細書におけるデータにより示されるように、本明細書に記載する複数の直交技術を使用する生物物理学的分析は、化合物、例えば、化合物ＭＹ－１およびＭＹ－８が、Ｇ－テトラドおよびヘアピンにより形成される固有の折り畳み構造と相互作用することにより非定型様式でＭＹＣＮ Ｇ４に結合することを確証する。また、一部の例では、ＭＹ－８の生物学的評価は、それが、ＭＹＣＮのレベルはもちろんＭＹＣＮＯＳのレベルも低下させること、したがって、両方の遺伝子産物のレベルをＲＮＡおよびタンパク質レベルで下方制御することを明示した。
本明細書で開示されるデータおよび情報は、ＤＮＡ Ｇ４内の高次構造の標的化が、創薬不可能ながん遺伝子の発現を調節する選択的阻害剤を開発するための新たな道をもたらすことを確証する。実際、複雑度のより高いＲＮＡ Ｇ４が、高選択的小分子結合に成功したフレームワークとなった。これらの例は、主に進化した蛍光ＲＮＡアプタマーであるが、それらは、Ｇ４を含有する複合体構造が高選択的小分子認識のための固有のポケットを提供することができることを見事に実証している。
より広い意味で、ｌｎｃＲＮＡプロモーターの存在下でのＧ４エレメントの小分子認識は、ｌｎｃＲＮＡ発現を調節する１つの方法であり得る。ｌｎｃＲＮＡは、複数のがん型における重要な駆動因子の代表であるが、それらの発現または機能を調節することができる小分子の少数の例が存在する。本明細書で提供するデータは、これらの複雑な構造により形成される固有の折り畳み構造が、タンパク質コード遺伝子産物はもちろんタンパク質非コード遺伝子産物も含む疾患関連遺伝子の標的化を助長する小分子の有益な機能的標的でもあり得ることを示す。
（実施例７）
標的としてのヘアピンを含有するハイブリッドＧ４の可能性を考えて、ヒトゲノムにおける同様の構造を有する他のＧ４の存在をさらに探究した。ゲノムワイドなＧ４－ｓｅｑからのデータを使用して、約２百万の固有のループ（＞７ｎｔ）を、観察四重鎖（ＯＱ）の４０７，４９１領域に埋め込まれたＧ４のＧトラクト間で特定した。ＵＮＡｆｏｌｄ（４６）（３７℃でｈｙｂｒｉｄ－ｓｓ－ｍｉｎパッケージ）を使用するヘアピン折り畳み試験をして、３３，９１２のＯＱは、以前のコンピュータによる予測と一致してヘアピン構造（全ＯＱの約８．３％）を含有することが判明した。ヘアピン－Ｇ４領域の中で、５８％は、タンパク質コード遺伝子に関連していたが、１３％は、ノンコーディングＲＮＡに関連していた。ヘアピン含有Ｇ４のうちのいくつかは、がん関連タンパク質の遺伝子（ＦＯＸＡ３、ＫＲＡＳ、ＭＹＣＬ、およびＢＲＤ４など）に位置した、（それぞれのヘアピン－Ｇ４については図２９を参照されたい）。この実施例は、埋め込まれたヘアピンを含有する複雑度のより高いＧ４が、ゲノム全体にわたって高度に見られ、多くの場合、癌遺伝子またはｌｎｃＲＮＡに関連していることを示す。
（実施例８）
この実施例では、ＳＰＲ結合アッセイを行って、本開示の代表的な二価化合物の結合活性を解析した。この実施例の化合物は、非標準結合剤構成要素およびＧ４スタッカー構成要素を含んだ。ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器を使用した。ＣＭ５ ＳＰＲバイオチップを使用し、泳動用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、５％ＤＭＳＯ）を用いてプライミングした。化合物をチップ表面に固定化するために、流速を５μＬ／分に設定した。次いで、チップ表面のカルボキシル化デキストランを１５分間、ＥＤＣ／ＮＨＳ（０．４Ｍ／０．１Ｍ）水溶液によって活性化し、続いて３０分間、ストレプトアビジン（ＳＡ）溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中の０．２ｍｇ／ｍＬ）を注入した。ＳＡの固定化量の後、１０分間、１Ｍエタノールアミン（ＥＡ）水溶液（ｐＨ８．５）を注入することによって表面を失活させ、２分間、１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて再生して、物理的吸着を除去した。さらに、ビオチン化ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡをアニーリング用緩衝液中５μＭで調製し、５分間、９５℃まで加熱し、その後、１時間以内に室温にゆっくりと冷却した。アニーリング後、合計１５０μＬの溶液を３０分にわたってＳＰＲシステムのＦｃ ２に注入してＤＮＡをチップ表面に固定化した。次いで、ベースラインが安定したら、化合物溶液を試験した。
結合シグナルはもちろん結合親和性も検出するために、より速い流動速度（２５μＬ／分）をＦｃ １（ブランク）とＦｃ ２（標的）の両方に使用した。化合物溶液の各々を、ＤＭＳＯ中の２０×設計濃度で調製し、次いで、非ＤＭＳＯ泳動用緩衝液に入れて希釈し、それによって５％ＤＭＳＯの最終濃度を得た。次いで、合計５０μＬの化合物溶液を会合のために１２０秒にわたってＦｃ １～２流路に注入し、その後、解離のために緩衝液を２００秒流した。５０μＬの再生用緩衝液（１Ｍ ＫＣｌ）の注入を必要に応じて２つの試料間に行うことができた。ブランクチャネル（Ｆｃ １）を参照することにより最終結合曲線を得た。結合親和性（ＫＤ）を決定するために、一連の希釈化合物溶液を注入し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりラングミュア１：１結合モデルを使用してＫＤを計算した。
この実施例のために行った特定の実施態様についての結果を図３０、３１Ａ、３１Ｂ、３２Ａおよび３２Ｂに示す。現在分かっているような、本実施例の二価化合物の結合を示す概略図を、図３０によって提供する。アクリジンＩＣＲ １９１は、８２１±１８４ｎＭのＫＤを示す良好なシグナルを滴定中に有した（評価した他のアクリジニル化合物は、９－アミノアクリジン、アクリジンＣｌ、およびアクリジンＮＨ２を含んだ）（図３１Ａおよび３１Ｂ）。化合物Ｂ３３とＭＹＣＮ Ｇ４との結合をＳＰＲ滴定により定量化した。化合物Ｂ３３は、報告されたＭＹ－８（ＳＰＲにより１．５±０．３μＭ）またはアクリジンＩＣＲ １９１のどちらかと比較して、結合親和性の大きな改善（ＫＤ＝７０±１３ｎＭ）を示した（図３２Ａおよび３２Ｂ）。それに加えて、化合物Ｂ３３の結合曲線は、アクリジンＩＣＲ １９１（高速オン／オフ）のものとは異なる動態を示した。さらに、新たに開発された化合物は、５μＭの化合物注入であっても、ＳＰＲではｄｓＤＮＡへのいずれの結合も示さなかった。その一方で、アクリジンＩＣＲは、溝結合および挿入に起因して、ｄｓＤＮＡへの用量依存的結合シグナルを示した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。これらの結果は、化合物Ｂ３３には、Ｂ－ＤＮＡ構造よりＧ４構造への優れた結合優先傾向があること、それが、複雑な溶液においてより良好な特異性をもたらすことになることを示した。
（実施例９）
この研究では、ある特定の二価オリゴとＭＹＣＮ Ｇ４オリゴとの結合を検証するためにＦＩＡを使用した。結合親和性を測定するために、各化合物の溶液を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、黒壁透明底）において三連で調製し、それによって１００ｎＭの最終濃度（作業溶液中５％最終ＤＭＳＯ）を得た。非標識ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡを上述のアニーリング法に基づいて折り畳み、次いで、ウェルプレートに添加し、それによって段階希釈により異なる濃度を得た。プレートを室温で３０分間インキュベートし、その後、５００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。次いで、蛍光強度をＥｘ ３４０ｎｍ／Ｅｍ ５００ｎｍでＳｙｎｅｒｇｙ Ｍｘマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）により定量的に記録した。次いで、蛍光強度を正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェアにおいてｏｎｅ－ｓｉｔｅ ｔｏｔａｌモデルを使用する曲線当てはめにより結合親和性を計算した。
アクリジンから誘導された分子の蛍光特性を利用することによりＦＩＡ研究も行った。アクリジンＩＣＲおよび化合物Ｂ３３は、３４０ｎｍで励起され、約５００ｎｍで蛍光発光ピークを示した。折り畳まれたＤＮＡ Ｇ４を１００ｎＭ小分子溶液に徐々に加えることにより、用量依存的応答の曲線を得、当てはめた。結果として、アクリジンＩＣＲ １９１および化合物Ｂ３３は、それぞれ、１０４０±１５０ｎＭおよび６６±７ｎＭを示した（図３４Ａおよび３４Ｂ）。この結果は、化合物Ｂ３３とＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４との強力な結合を裏付けた。
（実施例１０）
この実施例では、１２の異なるＧ４オリゴならびに非Ｇ４オリゴ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）を含有する小規模ＤＮＡ Ｇ４マイクロアレイを作製し、試験した（表４）。先ず第一に、ＳＡコートガラス表面を調製した。アミノ官能化スライドガラスを、先ず、ＤＭＦ中の炭酸Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジル（ＤＳＣ、１．０Ｍ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．０Ｍ）の溶液で一晩、室温で修飾した。ＥｔＯＨ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（各５分）で連続して洗浄し、Ｎ２ガスで乾燥させた後、スライドを４℃の冷蔵庫の中で１ｍｇ／ｍＬのＳＡ溶液とともに１２時間（一晩）インキュベートし、その後、３０分間、ＥＡ緩衝液で表面をブロックした。次いで、スライドをＰＢＳ緩衝液およびＭｉｌｌｉ－Ｑ水ですすぎ、遠心分離（１，７００ｇ、２分）により乾燥させた。
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並行して、ビオチン標識ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴをアニーリング用緩衝液中で調製し、それによって５μＭストック溶液を得、続いてアニールした（上記方法に従って）。次いで、全てのオリゴ溶液を３８４ウェルプレートに移した。次に、マイクロアレイプリンティングをロボットアレイヤー（Ｎａｎｏｐｒｉｎｔ、Ａｒｒａｙｉｔ、ＵＳＡ）によって６０％の湿度で行った。マイクロアレイを作製した後、１枚のウェットＫｉｍｗｉｐｅティッシュを用いてスライドをスライドボックスに入れ、４℃で２時間インキュベートした。
蛍光化合物（化合物Ｂ３３、チアゾールオレンジ（「ＴＯ」）、およびアムサクリン）とともにインキュベートするために、スライドをＰＢＳＴ、ＰＢＳ、および水で入念にすすいで、未結合オリゴを除去した。次いで、スライドを遠心分離（１，７００ｇ、２分）により乾燥させ、マイクロアレイガスケット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を用いて迅速に組み立て、その後、化合物溶液を負荷した。１時間のインキュベーション後、スライドを洗浄し、上述の方法を用いて乾燥させた。最後に、マイクロアレイスライドを、蛍光スキャナー（Ｍａｐｉｘ）により緑色チャネルを使用して画像化し、蛍光強度を定量化した。
２．５μＭで、化合物Ｂ３３は、他のインキュベーション濃度と比較して、比較的より高いシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）およびより低いバックグラウンドを示した（データ未記載）。結果として、ＭＹＣＮスポットのみが化合物Ｂ３３処理マイクロアレイにおいて光を発した。これは、対応する標的に対する有望な結合選択性を示す（図３５Ａ～３５Ｆ）。その一方で、Ｇ４ ＤＮＡを含有する別の２つの報告されたヘアピン（ｈＴＥＲＴおよびＢＣＬ２）は、蛍光を示さず、これは、分子認識がＭＹＣＮ Ｇ４におけるヘアピンに高度に依存することを示唆していた。加えて、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡへの結合は観察されず、これは、化合物Ｂ３３のＧ４結合挙動と一致した。その一方で、一般的なＧ４結合剤としてのＴＯは、ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡを除くほとんどのオリゴへの結合を示した。これは、広域Ｇ４結合能力を示唆する。化合物Ｂ３３とアクリジンコアを共有していたがより短いテール（ベンジル型スルホンアミド）を有したアムサクリンは、マイクロアレイにおいていくつかのＧ４、特に、ＮＲＡＳ ＲＮＡ Ｇ４および３つのヘアピン－Ｇ４（ＭＹＣＮ、ｈＴＥＲＴおよびＢＣＬ２）への結合を示した。これらの結果は、他のＧ４構造よりもＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４への化合物Ｂ３３の有望な結合選択性を実証した。
（実施例１１）
この実施例では、Ｇ四重鎖構造の折り畳みを、Ｊ－１５００円偏光二色性分光計（Ｊａｓｃｏ）を使用して円偏光二色性により特徴付けた。緩衝液条件を最適化するために、非標識ＭＹＣＮオリゴヌクレオチドを異なるアニーリング用緩衝液条件において５μＭ濃度で調製した。アニーリング手順は、上述の手順と同じであった。ＣＤスペクトルを３２０～２００ｎｍで、２５℃で、１ステップ１ｎｍで記録した。３回の反復スキャンのシグナルを平均することにより各スペクトルを得た。
ＣＤ融解アッセイのために、ＭＹＣＮオリゴヌクレオチドを、ＫＣｌ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＫＣｌ）中、５μＭ濃度で調製した。化合物の安定化効果を試験するために、ＭＹＣＮ Ｇ４ ＤＮＡ試料を、設計濃度で化合物（５％ＤＭＳＯを含有する最終溶液）と／なしで混合した。次いで、合計３００μＬの溶液をキュベットに添加し、ＣＤ分光計内で、１℃間隔で、２０℃から８０℃へ加熱した。融解温度（Ｔｍ）を計算するために、２６３ｎｍでのＣＤスペクトルのピークを追跡し、偏光解析を温度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアにおいて可変勾配を用いて非線形シグモイド用量応答モデルを使用して当てはめた。
ＣＤを使用する熱融解アッセイを行って、ＭＹＣＮ Ｇ４安定性に対する化合物の効果を調査した。アクリジンＩＣＲ １９１（ΔＴｍ＝４．６℃）と比較して、化合物Ｂ３３は、よりいっそう高いΔＴｍ（６．４℃）を示し、これは、化合物Ｂ３３における２つの断片の相乗効果に起因すると考えられ得た（図３６）。この結果は、二価相互作用が、小分子とオリゴとのより多くの接点の導入に起因して、結合親和性を改善することのみならずＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４の熱安定性を増大させることもできるという本発明者らの仮説と一致した。
化合物Ｂ３３の結合選択性をさらに特徴付けるために、約１９，０００の異なるＧ４配列を含有する高密度の大規模ＤＮＡマイクロアレイを作製し、使用した。このマイクロアレイでは、３４０の報告されたＧ４（Ｇリッチ配列）ならびに２８０の非Ｇ４（Ｃリッチ配列）を、陽性および陰性対照として設計した。加えて、短いループ（１～７ｎｔ）を有する１７，０００を超える標準Ｇ４オリゴも、Ｇ４構造の多様性を満たすようにループ配列を変えることにより設計し、合成した。高濃度ＫＣｌ緩衝液中で表面グラフト化ＤＮＡオリゴを折り畳んだ後、ＴＯおよび化合物Ｂ３３溶液（５００ｎＭ）をマイクロアレイとともにそれぞれインキュベートした。次いで、スライドを入念に洗浄し、乾燥させ、蛍光スキャナーにより緑色チャネルを使用して画像化した。結果として、ＴＯ処理マイクロアレイは、広範囲の蛍光を提示し、蛍光シグナルは、均一に分布しており（一部の陰性対照スポットを除いて）、これは、ほぼ全てのＧ４が折り畳まれたことを示していた（図３７Ａ）。しかし、化合物Ｂ３３スライドは、少数の明るいスポットしか示さず、その一方で、他のスポットは、バックグラウンドのように暗いままであり、これは、化合物Ｂ３３が強い優先的結合挙動を有することを示唆していた。各スポットの蛍光強度を定量化するために、ＴＯおよび化合物Ｂ３３の結合をさらに調査した。カーネル密度推定（ＫＤＥ）プロットおよびバイオリンプロットは、マイクロアレイ全体の全域にわたっての結合シグナルの分布を示した。図３７Ｂに示されているように、２つの小分子に対応する２つのバンドは、十分に分離していた。化合物Ｂ３３スペクトルは、ＴＯのものよりはるかに広い範囲に広がっていた。バイオリンプロット（図３７Ｃ）では、ＴＯ群の平均ＳＮＲ値は１２であり、これは、化合物Ｂ３３群のものよりはるかに高かった。それに加えて、ＴＯ群は、マイクロアレイにおいて均一に分布していた結合シグナルを裏付ける、より小さいエラーバーを有した。化合物Ｂ３３群のバイオリンプロットは、頂部に針様形状および最下部に本体を提示した。これは、強く偏った結合事象があったことを示す（図３７Ｃ）。６２０のＧ４および非Ｇ４対照に焦点を合わせると、ＴＯは、Ｇ４と非Ｇ４の両方への結合を示したが、前者平均ＳＮＲは、後者のものより有意に高かった（図３７Ｄ）。それに対し、化合物Ｂ３３は、Ｇ４への多少の結合を示したが、非Ｇ４群では結合が観察されなかった。この結果は、化合物Ｂ３３には非Ｇ４構造よりＧ４への優先傾向があることを示しており、これは、マイクロアレイの大域解析と一致していた。ＴＯ群と化合物Ｂ３３群の間のＳＮＲ値を比較すると、散布図は４５度線から外れており（図３７Ｅ）、これは、重ねて、化合物Ｂ３３の結合挙動が非選択的結合剤（ＴＯ）のものとは全く異なることを示していた。さらに、２つの化合物の選択性を、ジニ係数を使用することにより、定量的にプロファイリングした。最初は経済学的概念として使用されたジニ係数は、キナーゼ阻害剤の選択性／無差別性のプロファイリングはもちろん、ＲＮＡ結合剤の選択性／無差別性のプロファイリングにも応用されている。より高いジニ値は、化合物のより高い選択性を意味する（ジニ係数＞０．７５は、優れた選択性と見なされる）。マイクロアレイにおけるＳＮＲに基づくジニ係数。結果として、ＴＯおよび化合物Ｂ３３は、０．２３６および０．６２８のジニ係数値を示した（それぞれ、図３７Ｆおよび３７Ｇ）。高いジニ値は、化合物Ｂ３３がＧ４の中で比較的有望な選択性を有することを定量的に裏付けた。
（実施例１２）
この実施例では、５’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４ ＤＮＡを使用することによりＤＭＳ－フットプリンティングを行った。９５℃まで加熱し、続いて緩徐な冷却を行うことにより、最適化緩衝液条件（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＬｉＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＣｌ）で、５μＭのオリゴをアニールした。その後、折り畳まれたＤＮＡを異なる濃度（０、１０、２５、５０、１００ｎＭ）の化合物Ｂ３３とともに３０分間インキュベートした。次いで、溶液を１０分間、室温での１％ＤＭＳ処理に付し、２．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃおよび０．１Ｍ β－メルカプトエタノールにより反応を停止させた。処理されたＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールにより精製し、エタノールにより沈殿させた。次いで、１０％ピペリジンを使用して９０℃で３０分間、ＤＭＳ修飾ＤＮＡを切断した。ＳｐｅｅｄＶａｃ減圧濃縮器を使用して溶液を乾燥させて１００μＬの水で２回洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に溶解した。処理したＤＮＡ試料を１７％変性ポリアクリルアミドゲルで分割し、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化し、続いてＩｍａｇｅＪソフトウェアで処理した。
緩衝液最適化を行って、小分子誘導Ｇ４形成を観察した。ＣＤスペクトル研究により、１０ｍＭ ＬｉＣｌ＋１０ｍＭ ＮａＣｌをＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液における塩条件として選択した。５’－Ｃｙ５標識ＭＹＣＮ Ｇ４をアニールし、異なる濃度の化合物Ｂ３３とともにインキュベートした後、ＤＭＳ－フットプリンティングアッセイを行った（図３８Ａ）。化合物の非存在下で、Ｇ１３～１５のバンドは、ヘアピン領域に対応してより強かったが、Ｇの一部のバンドは、四重鎖形成のため暗かった（図３８Ｂ）。化合物Ｂ３３の添加に伴って、オリゴは、Ｇ２～９、Ｇ１０～１２およびＧ１７～２１については保護に起因してＧ４構造を形成するように誘導された。それに加えて、Ｇ１３～１５は、部分的に保護されたことが観察された。これは、四重鎖の形成中に、このヘアピン領域も分子に接触していたことを示す。この結果は、ほどけたおよび短縮型のＭＹＣＮ Ｇ４を使用する結合研究（それぞれ、図３９Ａおよび３９Ｂ）と一致しており、ヘアピンが結合に関与することを重ねて裏付けた。しかし、別の試験では、二重鎖含有ＲＮＡ Ｇ４（ＭＡＮＧＯ ＩＩ）は、二重鎖および四重鎖構造が接合部を形成するのではなく分離された（ＰＤＢ：６Ｃ６３）ため、化合物Ｂ３３への弱い結合をＳＰＲにより示した（図４０）。単一の理論により拘束されるものではないが、この結果は、分子認識が、ヘアピン－四重鎖により形成される三次構造の存在により助長されることを示し得ると、今や考えられる。
ＤＭＳ－フットプリンティング研究に加えて、ＭＹＣＮヘアピン－Ｇ４への化合物Ｂ３３の二価結合様式も、ＨＰ－Ｇ４を異なる折り畳み型と比較することにより調査した。平行構造（ＢＣＬ２）、（３＋１）ハイブリッド構造（ＨＩＶおよびＰＩＭ１－第１形態）および（２＋２）いす型構造（ＰＩＭ１－第２形態）を有する４つの報告されたＨＰ－Ｇ４を、化合物Ｂ３３を使用するＦＩＡ結合試験により調べた（図４１Ａ、４１Ｂ、４２Ａ、４２Ｂ、４３Ａ、４３Ｂ、４４Ａおよび４４Ｂ）。結果として、ＢＣＬ２ ＨＰ－Ｇ４は、ＭＹＣＮ ＨＰ－Ｇ４よりほぼ４倍弱い、２５８±３９ｎＭのＫＤを示した。（３＋１）ハイブリッドＧ４について、ＨＩＶおよびＰＩＭ１－第１形態ＨＰ－Ｇ４は、小分子への１５１±２６ｎＭおよび２７９±３２ｎＭ結合を示した。逆平行構造について、ＰＩＭ１－第２形態ＨＰ－Ｇ４は、化合物Ｂ３３へのよりいっそう弱い結合親和性（１．１±０．４μＭ）を示し、２つの断片の相乗効果を完全に失っていた。この観察は、平面Ｇ－テトラドと溝を分離する平行ＭＹＣＮ Ｇ４との配座の相違に起因すると考えられ得た。これらの結果は、開発した分子（化合物Ｂ３３）とＨＰ－Ｇ４との結合事象が、結合部位の形を決めるであろうヘアピン－四重鎖接合部の配座と高度に関係していることを示した。
（実施例１３）
この実施例では、二価化合物の異なるリンカー基を評価した。異なる長さおよび／または官能基を有するリンカーを評価した。結果を図４５に要約する。ＦＩＡおよびＳＰＲを使用して測定したときの各化合物についてのＫＤ値の特定の結果を、図４６Ａ～４６Ｄおよび図４７Ａ～４７Ｈにそれぞれ提供する。この実施例では、Ｂ３５は、Ｂ３２（ＦＩＡにより３１１±５２ｎＭ、およびＳＰＲにより３０３±３２ｎＭ）と比較して＞１０倍の改善を示す、最低ＫＤ（ＦＩＡにより３８±５ｎＭ、ＳＰＲにより１４±６ｎＭ）を示した。この解離定数は、平行Ｇ４構造に結合する報告された抗体（ｓｃＦＶ：ＫＤ 約３０ｎＭ）と同等であった。リンカーをさらに延長した（例えば、化合物Ｂ３８におけるものなどの、ＰＥＧ２基を使用して）場合、より弱い結合が観察され（ＦＩＡにより６９±２１ｎＭ、ＳＰＲにより８７±３９ｎＭ）、Ｂ３３のものより強いものはなかった。加えて、短いリンカーを有するアムサクリンは、ＭＹＣＮ ＨＰ－Ｇ４へのよりいっそう弱い結合（２．９±０．５μＭ）を示した（図４８Ａおよび４８Ｂを参照されたい）。また、化合物Ｂ３２およびアムサクリンは、低マイクロモルレベルでｄｓＤＮＡに結合した（図４９Ａおよび４９Ｂを参照されたい）。特定の例では、化合物Ｂ３５におけるＰＥＧリンカーは、適切に確認して２つの断片の結合部位への適合を助長したばかりでなく、細胞アッセイ評価を助長し得る水溶性にも寄与した。
ＩＸ．追加の配列
ヒトＭＹＣＮをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）の配列
Figure 2024522183000458
Figure 2024522183000459
Figure 2024522183000460
Figure 2024522183000461
ヒトＭＹＣＮＯＳをコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列（配列番号４０）の配列：
Figure 2024522183000462
Figure 2024522183000463
Figure 2024522183000464
Figure 2024522183000465
本開示の原理を応用することができる多くの可能な実施態様にかんがみて、説明した実施態様が好ましい例に過ぎず、本開示の範囲を限定するものと見なすべきでないことを認識されたい。むしろ、範囲は、以下の請求項により定義される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲および趣旨に入る全てを本発明であると主張する。

Claims (55)

  1. 式IAの化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステル
    Figure 2024522183000091
     式IA
    [選択図]図1
    X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである；
    R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1であり；
    R2はH又は脂肪族；
    各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである；
    xは0-5の整数である
    6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
  2. 式Iによる化合物、または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステル
    Figure 2024522183000092
     式I
    [選択図]図1
    環aはチオフェニル、チアゾリル、フラニル、トリアゾリル、チアジアゾリルおよび1、3、4-オキサジアゾリル以外の5員ヘテロアリール環である；
    環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である；
    R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1であり；
    R2はH又は脂肪族；
    各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである；
    各R4は、独立して、H、脂肪族、またはハロである；
    xは0-5の整数である
    nは0-10の整数である；
    6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
  3. 式Iの化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステル
    Figure 2024522183000093
     式I
    [選択図]図1
    環aは5員ヘテロアリール環である；
    環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である；
    R1は-(CRa2)m-Rbであり、ここで各Raは独立にH、アルキル、又はハロであり、mは1、2、3、4、又は5であり、Rbは窒素含有基である
    R2はH又はアルキル；
    各R3は、独立して、アルコキシ、ヒドロキシ、脂肪族、またはハロである；
    各R4は、独立して、H、アルキル、またはハロである；
    nは0、1、2又は3である
    xは0、1、2、3、4、又は5である
    ただし、前記化合物は、MY-1、MY-2、MY-10、MY-11、MY-12のいずれかに記載された構造を含まないことを特徴とする請求項1に記載の方法
  4. 式Iによる化合物、または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステル
    Figure 2024522183000094
     式I
    [選択図]図1
    環aは5員ヘテロアリール環である；
    環Bは、少なくとも2つの窒素原子を含む6員ヘテロアリール環である；
    R1は、-(CRa2)m-rbまたは-[(CRa2)mO]r-(CH2)s-rbであり、ここで、各raは、独立して、H、脂肪族、またはハロであり；tは、1、2、3、4、または5であり；rは、1、2、3、4、または5であり；sは、0または1であり； Rbはアクリジニル基である；
    R2はH又は脂肪族；
    各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである；
    各R4は、独立して、H、脂肪族、またはハロである；
    xは0-5の整数である
    nは0-10の整数である
  5. 環Aが、請求項2-4のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000095
     式(I)で表される結合
    Figure 2024522183000096
     価数要件を満たすために必要に応じて、単一または二重結合である、請求項1に記載の方法
    X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N、O、S又はC(Rc)であり、Rcは、H、アルキル又はハロであり、X1、X2及びX3の少なくとも1つは、C(Rc)以外である
  6. 環Aが、請求項1-5のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000097
  7. 環Aが、請求項1-6のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000098
  8. 環Bが、請求項2-7のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000099
     ここで、
    Y1、Y2、Y3およびY4は、それぞれ独立に、Nまたはc (Rc)であり、ここで、Rcは、H、アルキル、またはハロであり、Y1、Y2、Y3、 Y4はN
  9. 環Bが、または、である、請求項2-8のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000100
  10. 環Bが、請求項2-9のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000101
  11. 請求項1-10のいずれか1項に記載の化合物
    (i)xは1、2又は3である
    (ii)1つのR3は、環aを環化するパラ位である
    (iii)(i)および(ii)の両方
  12. nが0である、請求項2-10のいずれか1項に記載の化合物
  13. 各R3が独立にC1-C3アルコキシ又はヒドロキシである、請求項1-12のいずれか1項に記載の化合物
  14. xが1であり、R3がメトキシである、請求項1-13のいずれか1項に記載の化合物
  15. 式IIの構造を有する、請求項1-3、6、7、9、10又は12-14のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000102
  16. R2がHである、請求項1-15のいずれか1項に記載の化合物
  17. 前記化合物が、式IIIの構造を有する、請求項1-3のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000103
  18. R1が-(CH2)m-Rbである、請求項1-17のいずれか1項に記載の化合物
  19. mが2または3である、請求項1-18のいずれか1項に記載の化合物
  20. Rbは、N含有環式基-N(Rc)2又は-C(O)N(Rc)2であり、各RcがH又はアルキルである、請求項1、2、3又は5-19のいずれか1項に記載の化合物
  21. R1が以下である、請求項1、2、3又は5-19のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000104
  22. 化合物が：である、請求項1-3のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000105
  23. 前記化合物が、式IVの構造を有する、請求項1、2又は5-15のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000106
     前記リンカーは、-(CRa2)m-または-[(CRa2)mO]r-(CRa2)s-であり、各Raは、独立して、H、脂肪族またはハロであり；mは、1、2、3、4、または5であり；rは、1、2、3、4、または5であり；sは、0または1である
  24. 前記化合物が、式Vの構造を有する、請求項1、2又は4-14のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000107
     前記リンカーが-(CH2)m-又は-[CH2)mO]r-(CH2)s-であり、mが1、2、3、4又は5であり、rが1、2、3、4又は5であり、sが0又は1である
  25. R1が以下である、請求項1、2又は4のいずれか1項に記載の化合物
    Figure 2024522183000108
  26. 化合物が以下である、請求項1、2又は4のいずれか一項に記載の化合物
    Figure 2024522183000109
    Figure 2024522183000110
  27. 請求項1-26のいずれか1項に記載の化合物および少なくとも1種の薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物
  28. 前記化合物の治療量の単位剤形を含む、請求項27に記載の医薬組成物
  29. 抗癌剤をさらに含む、請求項26または請求項27に記載の医薬組成物
  30. 式IAによる、細胞を有効量の化合物、または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルと接触させることを含む、細胞における癌関連タンパク質発現を減少させる方法
    Figure 2024522183000111
     式IA
    [選択図]図1
    X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである；
    R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1であり；
    R2はH又は脂肪族；
    各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである；
    xは0-5の整数である
    6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
  31. 細胞を有効量の化合物、または立体異性体、互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩またはエステルと接触させることを含む、細胞における癌関連タンパク質発現を減少させる方法であって、 請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の方法
  32. 請求項31に記載の方法であって、ここで：
    (i)リングA
    Figure 2024522183000112
     X1、X2およびX3は、それぞれ独立に、N、O、S、またはc (Rc)であり、ここで、Rcは、Hまたはアルキルであり、Rcは、 X1、X2及びX3のうちの少なくとも1つがc (Rc)以外であることを特徴とする化合物
    (ii)リングB
    Figure 2024522183000113
     Y1、Y2、Y3及びY4は、それぞれ独立に、N又はc (Rc)(式中、RcはH又はアルキルであり；Y1、Y2、Y3及びY4のうちの少なくとも2つはNであり； または、
    (iii)(i)および(ii)の両方
  33. 請求項31-32のいずれか1項に記載の方法であって、以下：
    (i)リングA
    Figure 2024522183000114
     、または、これに限定されるものではない
    (ii)リングB
    Figure 2024522183000115
     または、
    (iii)(i)および(ii)の両方
  34. 請求項30-33のいずれか1項に記載の方法であって、以下：
    (i)R2はHである
    (ii)R3は、C 1-C 3アルコキシ又はヒドロキシである
    (iii)xは1、2又は3である
    (iv)1つのR3は、環aを環化するパラ位にある；
    (v)nは0である
    (vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)及び(v)の任意の組み合わせ
  35. 前記化合物が、式II、III、IV、またはVのいずれかに従った構造を有する、請求項30または請求項31に記載の方法
    Figure 2024522183000116
     リンカーは、-(CRa2)m-または-[(CRa2)mO]r-(CRa2)s-であり、各Raは、独立して、H、脂肪族またはハロであり；mは、1、2、3、4、または5であり；rは、1、2、3、4、または5であり；sは、0または1である
  36. 前記化合物が：である、請求項30又は31に記載の方法
    Figure 2024522183000117
    Figure 2024522183000118
  37. 前記化合物が、請求項30又は31に記載の方法
    Figure 2024522183000119
    Figure 2024522183000120
  38. 前記化合物が、請求項30または請求項31に記載の方法
    Figure 2024522183000121
  39. 前記細胞がインビトロである、請求項29-37のいずれか1項に記載の方法
  40. 前記細胞がインビボである、請求項29-37のいずれか1項に記載の方法
  41. 細胞における癌関連タンパク質発現を減少させることが、細胞の増殖および/または増殖を減少させる、請求項29-39のいずれか1項に記載の方法
  42. 細胞がMCN遺伝子の過剰発現を有する細胞である、請求項29-40のいずれか1項に記載の方法
  43. 化合物がMCN遺伝子の非正準位G 4四重鎖核酸領域に選択的に結合する、請求項29-41のいずれか1項に記載の方法
  44. 非正準位G 4四重鎖核酸領域がヘアピン構造を含む、請求項43に記載の方法
  45. 請求項30-38または40-44のいずれか1項に記載の方法であって、前記細胞は、対象における癌細胞であり、前記方法は、前記対象における癌を治療または予防することをさらに含み、 治療上有効な量の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはエステルを必要とする対象に投与して、癌細胞におけるN-Myc発現を減少させる工程を含み、 被検者の癌を治療または予防することを特徴とする癌の治療または予防方法
  46. 前記癌細胞が、神経癌細胞または肺癌細胞である、請求項45に記載の方法
  47. 癌が神経芽腫、横紋筋肉腫、前立腺癌、または小細胞肺癌である、請求項45または請求項46に記載の方法
  48. 癌を処置することが、腫瘍体積を減少させること、転移酵素の数またはサイズを減少させること、または癌の症状を軽減することを含む、請求項45-47のいずれか1項に記載の方法
  49. 治療有効量の追加の抗癌剤を対象に投与することをさらに含む、請求項45-48のいずれか1項に記載の方法
  50. 細胞におけるN-Myc発現を減少させるための、式IAによる化合物または立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルの使用、 式IAの化合物の有効量を前記細胞に接触させることを含む、方法
    Figure 2024522183000122
     式IA
    [選択図]図1
    X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである；
    R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1であり；
    R2はH又は脂肪族；
    各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである；
    xは0-5の整数である
    6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
  51. 細胞におけるN-Myc発現を減少させるために、請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の化合物又は立体異性体、互変異性体又はその薬学的に許容される塩又はエステルの使用、 請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の化合物の有効量を前記細胞に接触させることを含む、請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の化合物
  52. 式IAの化合物または立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩またはエステルの使用であって、対象における癌を治療または予防するための、式IAの構造を有する化合物
    Figure 2024522183000123
     式IA
    [選択図]図1
    X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである；
    R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1であり；
    R2はH又は脂肪族；
    各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである；
    xは0-5の整数である
    6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
  53. 被験体における癌を治療または予防するための、請求項2、3または4のいずれか1項に記載の化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用、 前記化合物が、請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の構造を有する、請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の構造を有する化合物
  54. 式IAによる化合物または立体異性体、互変異性体、またはその薬学的に許容される塩またはエステルの使用において、対象における癌を治療または予防するための医薬の製造において、 式IAの構造を有する化合物
    Figure 2024522183000124
     [選択図]図1
    X1、X2及びX3は、それぞれ独立に、N又はOである；
    R1は-(リンカー)t-Rb(式中、Rbは芳香族、ヘテロ脂肪族または脂肪族であり；リンカーは脂肪族またはヘテロ脂肪族基であり；tは0または1であり；
    R2はH又は脂肪族；
    各R3は、独立して、ヘテロ脂肪族、ヒドロキシ、脂肪族、ハロ脂肪族、又はハロである；
    xは0-5の整数である
    6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(ピロリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N-(3-([1、4'-ビピペリジン]-1'-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、 6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、N 1-(6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-イル)-N 2、N 2-ジメチルエタン-1、2-ジアミン、N-(3-(アゼピン-1-イル)プロピル)-6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、 2、4-オキサジアゾール-5-イル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(3-(4-メチルピペリジン-1-イル)プロピル)ピリダジン-3-アミン、6-(3-(4-メトキシフェニル)-1、2、4-オキサジアゾール-5-イル)-N-(2-モルホリノエチル)ピリダジン-3-アミン
  55. 請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の化合物又は立体異性体、互変異性体又はその薬学的に許容される塩又はエステルの使用において、被験体の癌を治療又は予防するための医薬の製造において、 前記化合物が、請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の構造を有する、請求項2、3又は4のいずれか1項に記載の構造を有する化合物
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