JP2024521408A - Ｃｄ２０、ｎｋｐ４６、ｃｄ１６に結合し、かつｉｌ－２にコンジュゲートされた多特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１２２、および適宜ヒトＣＤ１６Ａに結合する多特異性タンパク質に関する。本発明によるタンパク質は、疾患、例えばがんの処置において有用性を有する。【選択図】図６
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月９日に出願された米国仮出願第６３／２０８，５１４号の利益を主張し、その開示は、任意の図面および配列表を含む、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年６月９日に出願された米国仮出願第６３／２０８，５１４号の利益を主張し、その開示は、任意の図面および配列表を含む、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子的な形式の配列表と共に出願されている。配列表は、１８５ＫＢのサイズの、２０２２年６月３日に作成された「ＮＫｐ４６－１４ ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。電子的な形式の配列表中の情報は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子的な形式の配列表と共に出願されている。配列表は、１８５ＫＢのサイズの、２０２２年６月３日に作成された「ＮＫｐ４６－１４ ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。電子的な形式の配列表中の情報は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本開示は、第１および第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、サイトカイン部分、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分を含む、多特異性結合性タンパク質であって、第１のＡＢＤがヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ第２のＡＢＤがヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ適宜、免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分がヒトＣＤ１６に結合する、多特異性結合性タンパク質に関する。本開示の多特異性結合性タンパク質は、有利には、エフェクター細胞を、複数の受容体を介して対象とするＣＤ２０発現細胞を溶解するように再方向付けすることができる。本開示はまた、前記結合性タンパク質、その組成物を作製する方法、ならびに、ＣＤ２０発現細胞が関与する疾患を含む、疾患の処置を含むそれらの使用に関する。
本開示は、第１および第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、サイトカイン部分、ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分を含む、多特異性結合性タンパク質であって、第１のＡＢＤがヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ第２のＡＢＤがヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ適宜、免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分がヒトＣＤ１６に結合する、多特異性結合性タンパク質に関する。本開示の多特異性結合性タンパク質は、有利には、エフェクター細胞を、複数の受容体を介して対象とするＣＤ２０発現細胞を溶解するように再方向付けすることができる。本開示はまた、前記結合性タンパク質、その組成物を作製する方法、ならびに、ＣＤ２０発現細胞が関与する疾患を含む、疾患の処置を含むそれらの使用に関する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、非従来的な免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、望ましくない細胞、例えば腫瘍またはウイルス感染細胞が排除され得る効率的な免疫サーベイランス機構を提供する。ＮＫ細胞の特徴および生物学的特性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７を含む表面抗原の発現、細胞表面上のα／βまたはγ／δ ＴＣＲ複合体の非存在、ＭＨＣ非制限的な方式において細胞、特に特異的細胞溶解酵素の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合し、それを殺傷する能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を殺傷する能力、ならびに免疫応答を刺激するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を含む。
潜在的な抗腫瘍特性に起因してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞にも関心は集中している。国際公開第２０１７１１４６９４号パンフレットは、ＮＫ細胞を、対象とする標的細胞を溶解するように特異的に再方向付けする能力を有する多特異性タンパク質の産生のための、ＮＫｐ４６結合性タンパク質のための可変領域を報告している。しかしながら、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２がＩＦＮ－ａと共に投与された場合にそれらの過剰活性化および複数の炎症性サイトカインの分泌を通じてマウスにおいて毒性を引き起こすことが示されている［Rothschilds et al, Oncoimmunology. 2019;8(5)］。追加的に、ＮＫ細胞はまた、これもまたＩＬ－２Ｒβｙを通じてシグナル伝達するサイトカインＩＬ－１５の毒性を引き起こすことが示された［Guo et al, J Immunol. 2015;195(5):2353-64を参照する国際公開第２０２０２４７８４３号パンフレットを参照］。
サイトカイン、例えばＩＬ－２により媒介される免疫毒性に対する１つの潜在的な解決策は、それを腫瘍特異的抗体と融合または会合させることであった。しかしながら、ＩＬ－２はインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で抗腫瘍効果において抗腫瘍抗体と実際に協同するが、同じ分子中にＩＬ－２および抗腫瘍抗原抗体を含めることは有効性も毒性の利点も示さないことが見出された。ＩＬ－２部分は体内分布を完全に支配し、無関連の抗原を認識する免疫サイトカインは、抗体と組み合わせられた場合に腫瘍特異的な免疫サイトカインと同等に機能するという観察を説明した［Tzeng et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2015 Mar 17; 112(11): 3320-332］。
ＮＫ細胞に対するサイトカインの効果に焦点を当てた研究は、単一のサイトカインまたは単純な組合せに一般に集中してきた。より最近において、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、およびＩＦＮ－αは、単独でおよび組合せで、ＩＬ－２と協同する潜在能力があり、また、非常に低濃度の、先天および適応の両方の共通γ鎖サイトカインは、等しく低い濃度のＩＬ－１８と協同して、迅速かつ強力なＮＫ細胞ＣＤ２５およびＩＦＮ－γ発現を駆動することが報告されている（Nielsen et al. Front Immunol. 2016; 7: 101）。しかしながら、ヒトへのサイトカインの投与は毒性を伴っており、これはサイトカインとの組合せ処置を困難なものとする。さらには、ＮＫ細胞におけるサイトカイン受容体シグナル伝達経路と他の活性化受容体との間の潜在的な相乗作用または相互作用に関しては依然としてほとんど分かっていない。したがって、疾患、特にはがんの処置においてＮＫ細胞を動員するための新たな仕方に対する必要性が存在する。
依然として、増殖性障害、例えばＣＤ２０陽性Ｂ非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を処置または予防するための活性剤に対する緊急の必要性が存在する。
治療効果を有する新規のＮＫエンゲージャーに対する必要性も存在する。
副作用がないかまたは減少している、生産および／または投与がより容易な新規の化合物に対する必要性も存在する。特に、患者におけるサイトカイン放出症候群のリスクがないかまたは減少している新規の化合物に対する必要性が存在する。
ＮＫ細胞は、抗腫瘍免疫を媒介する潜在能力を有する。
本発明は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６およびサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）に結合し、適宜、ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａにさらに結合し、かつ標的細胞上の腫瘍抗原ＣＤ２０にも結合する、機能的な多特異性結合性タンパク質であって、対象とする抗原を発現する標的細胞（例えば、疾患に寄与する細胞、がん細胞）に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させる能力を有する、多特異性結合性タンパク質の発見から生じたものである。
１つの実施形態において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。ポリペプチドは、１または２つのさらなるポリペプチドと会合（例えば二量体化または組合せ）して、ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ヒトＣＤ１６に特異的に結合する結合性タンパク質（例えば多量体結合性タンパク質）を形成することができる。提供されるのはまた、そのような１、２または３つのポリペプチドまたはポリペプチド鎖を含む多量体（例えば二量体、三量体）結合性タンパク質の他に、多量体（例えば二量体、三量体）結合性タンパク質を産生する方法である。
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ヒトＣＤ１６に特異的に結合する結合性タンパク質（例えば多量体タンパク質）であって、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１の（Ｉ）ポリペプチド、および配列番号７０のアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチドを含む、結合性タンパク質（例えば多量体タンパク質）に関する。
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ヒトＣＤ１６に特異的に結合する多量体結合性タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、配列番号９のアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖、および配列番号１７のアミノ酸配列を有する第３の（ＩＩＩ）ポリペプチド鎖を含む、多量体結合性タンパク質に関する。
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ヒトＣＤ１６に特異的に結合する多量体結合性タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、配列番号７３のアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖、および配列番号７４のアミノ酸配列を有する第３の（ＩＩＩ）ポリペプチド鎖を含む、多量体結合性タンパク質に関する。
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ヒトＣＤ１６に特異的に結合する多量体結合性タンパク質であって、配列番号６６のアミノ酸配列を有する第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖、および配列番号１７のアミノ酸配列を有する第３の（ＩＩＩ）ポリペプチド鎖を含む、多量体結合性タンパク質に関する。
１つの実施形態において、提供されるのは、配列番号１または６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の（Ｉ）ポリペプチド、配列番号６、６７、７０、または７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド、および適宜、配列番号１７または７４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第３の（ＩＩＩ）ポリペプチドを含む、結合性タンパク質（例えば本開示の多量体タンパク質）である。
１つの実施形態において、提供されるのは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第１および第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を含む、多量体結合性タンパク質（例えば本開示のタンパク質）であって、各々のＶＨおよびＶＬが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み；かつ
（ｉ）第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）が、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含み；
（ｉｉ）第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）が、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ２、ならびに
－ 配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ２
を含む、
多量体結合性タンパク質（例えば本開示のタンパク質）である。
（ｉ）第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）が、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含み；
（ｉｉ）第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）が、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ２、ならびに
－ 配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ２
を含む、
多量体結合性タンパク質（例えば本開示のタンパク質）である。
特定の実施形態において、本開示による多量体結合性タンパク質は変異型ＩＬ－２ポリペプチドを含み、前記変異型ＩＬ－２は配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、本開示の多量体結合性タンパク質は、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分を含み、免疫グロブリンＦｃ領域の前記全体または部分は、配列番号６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。
提供されるのはまた、第１および第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、サイトカイン部分ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分を含む、結合性タンパク質であって、第１のＡＢＤが、Ｆａｂ構造を有し、かつ免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、各々のＶＨおよびＶＬが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含み；かつ
（ｉ）第１のＡＢＤが、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ２、ならびに
－ 配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ２
を含み；
かつ免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分がヒトＦｃ－γ受容体に結合する、
結合性タンパク質である。
（ｉ）第１のＡＢＤが、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含み；
（ｉｉ）第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ２、ならびに
－ 配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ２
を含み；
かつ免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分がヒトＦｃ－γ受容体に結合する、
結合性タンパク質である。
１つの実施形態において、サイトカイン部分は変異型ＩＬ－２である。
１つの実施形態において、結合性タンパク質の第１および第２のＡＢＤはＦａｂ構造を有する。１つの実施形態において、結合性タンパク質の第１のＡＢＤはＦａｂ構造を有し、かつ結合性タンパク質の第２のＡＢＤはｓｃＦｖ構造を有する。
１つの実施形態において、本開示による結合性タンパク質は、上記に定義されている２つのＡＢＤを形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ （Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｃ２Ａ （ＩＩ）
Ｖ２Ｂ－Ｃ２Ｂ－ヒンジ３－Ｌ２－ＩＬ－２ （ＩＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは第１のＡＢＤの結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、かつＣ２ＡおよびＣ２ＢはペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１、ヒンジ２およびヒンジ３は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ （Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｃ２Ａ （ＩＩ）
Ｖ２Ｂ－Ｃ２Ｂ－ヒンジ３－Ｌ２－ＩＬ－２ （ＩＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは第１のＡＢＤの結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、かつＣ２ＡおよびＣ２ＢはペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１、ヒンジ２およびヒンジ３は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。
別の実施形態において、本開示による結合性タンパク質は、上記に定義されている２つのＡＢＤを形成する２つのポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）：
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ （Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２ （ＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは第１のＡＢＤの結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１およびヒンジ２は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ （Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２ （ＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは第１のＡＢＤの結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１およびヒンジ２は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＣＨ１ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＣＫドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＫ）である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質の（Ｆｃドメイン）Ａは、配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質の（Ｆｃドメイン）Ｂは、配列番号１４のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のヒンジ１ドメインは配列番号５のアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のヒンジ２ドメインは配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のヒンジ３ドメインは配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のリンカーＬ１は配列番号１５のアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のリンカーＬ２は配列番号２０～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化を含むＫａｂａｔ番号付けに従ってＦｃドメインまたはその変異型の残基Ｎ２９７を有する。好ましくは、本開示の結合性タンパク質のＦｃドメインまたはその変異型はヒトＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ）ポリペプチドに結合する。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、少なくとも１つのジスルフィドブリッジにより連結された少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。好ましくは、本開示の結合性タンパク質のポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）は、Ｃ１Ａとヒンジ２との間の１つのジスルフィドブリッジ、ヒンジ１とヒンジ２との間の２つのジスルフィドブリッジにより連結されており、かつポリペプチド鎖（ＩＩ）および（ＩＩＩ）はヒンジ３とＣ２Ｂとの間の１つのジスルフィドブリッジにより連結されている。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＶ１ＡドメインはＶＬ１であり、かつＶ１ＢドメインはＶＨ１である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＶ２ＡドメインはＶＨ２であり、かつＶ２ＢドメインはＶＬ２である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＣ１ＡドメインはＣＫであり、かつＣ１ＢドメインはＣＨ１である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＣ２ＡドメインはＣＫであり、かつＣ２ＢドメインはＣＨ１である。
代替的な実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＣ２ＡドメインはＣＨ１であり、かつＣ２ＢドメインはＣＫである。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
（ａ）それぞれ配列番号１１および３のアミノ酸配列に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）ＶＨ１およびＶＬ１、
ならびに／または
（ｂ）それぞれ配列番号９３および９５のアミノ酸配列に対応するＶＨ２およびＶＬ２
を含む。
（ａ）それぞれ配列番号１１および３のアミノ酸配列に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）ＶＨ１およびＶＬ１、
ならびに／または
（ｂ）それぞれ配列番号９３および９５のアミノ酸配列に対応するＶＨ２およびＶＬ２
を含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質の変異型ＩＬ－２は、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較してＣＤ２５に対する結合性の低減を示す。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質の結合性変異型ＩＬ－２は、配列番号２４～２８および６５から選択される配列、またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個の連続するアミノ酸残基の配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
代替的な実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７３のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７３のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＦｃドメインは、グリコシル化されるのを予防するように突然変異されたＮ２９７残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）を含む。好ましくは、前記突然変異はＮ２９７Ｓ置換である。好ましい実施形態において、そのような突然変異は、本開示の結合性タンパク質のＣＤ１６Ａ結合性を実質的に消失させる。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号６６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号６７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号６６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号６７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
代替的な実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号６６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号６６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
別の実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＦｃドメイン、ｋａｂａｔ番号付けに従ってＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ置換。
よって、本開示の１つの結合性タンパク質は、
－ 配列番号６８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号６９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号６８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号６９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
代替的な実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号６８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号６８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
代替的な実施形態において、ＣＤ２０に結合する本開示の結合性タンパク質の第１のＡＢＤはＦａｂであり、かつＮＫｐ４６に結合する第２のＡＢＤはｓｃＦｖである。
代替的な実施形態において、本開示の結合性タンパク質の第１のＡＢＤはＶＨ／ＶＬペアである。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号７７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号７７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
代替的な実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号７７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
－ 配列番号７７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）；および
－ 配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩＩ）
を含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質の第２のＡＢＤおよびサイトカイン部分は、配置；
－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２
を有し、
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。
－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２
を有し、
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＶ２ＡドメインはＶＨ２であり、かつＶ２ＢドメインはＶＬ２である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；および
－ 配列番号７０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）
を含む。
－ 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；および
－ 配列番号７０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）
を含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＦｃドメインは、グリコシル化されるのを予防するように突然変異されたＮ２９７残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）を含む。好ましくは、前記突然変異はＮ２９７Ｓ置換である。好ましい実施形態において、そのような突然変異は、本開示の結合性タンパク質のＣＤ１６Ａ結合性を実質的に消失させる。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、
－ 配列番号６６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）
を含む。
－ 配列番号６６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７１のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）
を含む。
別の実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＦｃドメインは、ｋａｂａｔ番号付けに従ってＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ置換を含む（ｔｈａｔ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）。
よって、本開示の１つの結合性タンパク質は、
－ 配列番号６８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）
を含む。
－ 配列番号６８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉ）；
－ 配列番号７２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＩＩ）
を含む。
提供されるのは、本開示の結合性タンパク質および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物である。
提供されるのはまた、本開示の結合性タンパク質またはそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸配列である。
提供されるのは、本開示の核酸を含む、発現ベクターであって、前記核酸配列が、本開示の結合性タンパク質またはそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターである。
提供されるのは、本開示の核酸を含む、単離された細胞であって、前記核酸配列が、本開示の結合性タンパク質またはそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された細胞である。
提供されるのは、本開示の発現ベクターを含む、単離された細胞であって、前記発現ベクターが本開示の核酸を含み、前記核酸配列が、本開示の結合性タンパク質またはそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された細胞である。
提供されるのは、医薬としての使用のための本開示の結合性タンパク質である。
提供されるのはまた、ＣＤ２０発現細胞が関与するかまたはそれにより特徴付けられる疾患の処置における使用のための本開示の結合性タンパク質；およびＣＤ２０発現細胞が関与するかまたはそれにより特徴付けられる対象における疾患を処置する方法であって、対象に本開示の結合性タンパク質を投与することを含む、方法である。
１つの実施形態において、本開示の使用のための結合性タンパク質または本開示の処置方法により処置される疾患は、血液がん、例えばＣＤ２０を発現する悪性細胞により特徴付けられる血液がんである。
別の実施形態において、本開示の使用のための結合性タンパク質または本開示の処置方法により処置される疾患は、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンまたは非ホジキンＢ細胞リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫および成熟Ｂ細胞新生物、例えばＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ型、結節型および脾臓型）、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群から選択される。
さらなる実施形態において、本開示の使用のための結合性タンパク質または本開示の処置方法により処置される疾患（例えばＮＨＬ、ＣＬＬ、ＳＬＬ）は、表面において低いレベルのＣＤ２０を発現する細胞（例えばがん細胞）、または少ない数のＣＤ２０発現細胞により特徴付けられる。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、月当たり１～４回、適宜２週毎に１回、適宜３週毎、適宜４週毎に１回投与され、適宜さらに、処置は、少なくとも３か月、６か月または１２か月の期間にわたりなされる。
提供されるのは、本開示の結合性タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）複数の組換えポリペプチドを発現させるために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、前記複数の組換えポリペプチドが、（ｉ）配列番号１、６６、６８、７７、９１または９２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、７８または７９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および適宜（ｉｉｉ）配列番号１７または７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、工程；
（ｂ）適宜、発現された組換えポリペプチドを回収する工程
を含む、方法である。
（ａ）複数の組換えポリペプチドを発現させるために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、前記複数の組換えポリペプチドが、（ｉ）配列番号１、６６、６８、７７、９１または９２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、７８または７９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および適宜（ｉｉｉ）配列番号１７または７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、工程；
（ｂ）適宜、発現された組換えポリペプチドを回収する工程
を含む、方法である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質を作製する方法は、
（ａ）複数の組換えポリペプチドを発現させるために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、前記複数の組換えポリペプチドが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸を含むポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、工程；
（ｂ）適宜、発現された組換えポリペプチドを回収する工程
を含む。
（ａ）複数の組換えポリペプチドを発現させるために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、前記複数の組換えポリペプチドが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸を含むポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、工程；
（ｂ）適宜、発現された組換えポリペプチドを回収する工程
を含む。
本発明のこれらのおよび追加の有利な態様および特色は、本明細書の他の箇所にさらに記載され得る。
定義
本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味することがある。請求項において使用される場合、語「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と組み合わせて使用される場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味することがある。
本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味することがある。請求項において使用される場合、語「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と組み合わせて使用される場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味することがある。
「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）が使用される場合、これは、適宜、「から本質的になる」、または適宜、「からなる」により置き換えられ得る。
本明細書において使用される場合、用語「抗原結合性ドメイン」または「ＡＢＤ」は、エピトープに免疫特異的に結合する能力を有する３次元構造を含むドメインを指す。そのため、１つの実施形態において、前記ドメインは、超可変領域、適宜抗体鎖のＶＨおよび／またはＶＬドメイン、適宜少なくともＶＨドメインを含むことができる。別の実施形態において、結合性ドメインは抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでもよい。別の実施形態において、結合性ドメインは、非免疫グロブリンスキャフォールドからのポリペプチドドメインを含んでもよい。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味において使用されており、全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ならびに、所望される生物学的活性を呈する限り、抗体断片および誘導体を特に含む。抗体の産生に関連する様々な技術は、例えば、Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)において提供されている。「抗体断片」は、全長抗体の部分、例えばその抗原結合性または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的にはＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、ならびにｄＡｂ（典型的にはＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、ならびにＶ－ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびにカッパボディ（例えば、Ill et al., Protein Eng 1997;10: 949-57を参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体断片、ならびに単離されたＣＤＲまたは抗原結合性残基もしくはポリペプチドが会合または連結して一緒になって機能的抗体断片を形成することができる１つまたは複数の単離されたＣＤＲまたは機能的なパラトープを含む。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23, 1126-1136；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書および同第２００２０１６１２０１号明細書において記載または総説されている。
用語「超可変領域」は、本明細書において使用される場合、抗原結合性の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基［例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）；Kabat et al. 1991］ならびに／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基［例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917］を一般に含む。典型的には、この領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al.、上掲において記載される方法により行われる。本明細書における「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基番号付け」および「Ｋａｂａｔに従って」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有することがある。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に挿入された単一のアミノ酸（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）ならびに重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えばＫａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的」なＫａｂａｔ番号付けされた配列との抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより所与の抗体について決定されてもよい。
本明細書において使用されている「フレームワーク」または「ＦＲ」残基により、ＣＤＲとして定義される領域を除外した抗体可変ドメインの領域が意味される。各々の抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲにより分離された連続する領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）にさらに分けられ得る。
本明細書において定義されている「定常領域」により、軽鎖または重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによりコードされる抗体由来定常領域が意味される。
本明細書において使用されている「定常軽鎖」または「軽鎖定常領域」または「ＣＬ」により、カッパ（Ｃκ）またはラムダ（Ｃλ）軽鎖によりコードされる抗体の領域が意味される。定常軽鎖は、単一のドメインを典型的には含み、本明細書において定義されるように、Ｃκ、またはＣλの１０８～２１４位を指し、番号付けはＥＵインデックスによるものである（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda）。
本明細書において使用されている「定常重鎖」または「重鎖定常領域」により、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン遺伝子によりコードされて、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する抗体の領域が意味される。全長ＩｇＧ抗体について、本明細書において定義されている定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端を指し、そのため１１８～４４７位を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものである。
本明細書において使用される場合、用語「ＣＨ１ドメイン」、または「ＣＨ１ドメイン」、または「定常ドメイン１」は、交換可能に使用することができ、対応する重鎖免疫グロブリン定常ドメイン１を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」、または「ＣＨ２ドメイン」、または「定常ドメイン２」は、交換可能に使用することができ、対応する重鎖免疫グロブリン定常ドメイン２を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ＣＨ３ドメイン」、または「ＣＨ３ドメイン」、または「定常ドメイン３」は、交換可能に使用することができ、対応する重鎖免疫グロブリン定常ドメイン３を指す。
本明細書において使用される場合、（ＣＨ２－ＣＨ３）Ａおよび（ＣＨ２－ＣＨ３）Ｂにおけるような、用語「ＣＨ２－ＣＨ３」はそのため、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）を含むポリペプチド配列を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ペアＣ（ＣＨ１／ＣＬ）」、または「ペアとなったＣ（ＣＨ１／ＣＬ）」は、共有結合または非共有結合、好ましくは非共有結合により互いに結合し；そのためヘテロ二量体を形成している、１つの定常重鎖ドメイン１および１つの定常軽鎖ドメイン［例えばカッパ（κもしくはＫ）またはラムダ（λ）クラスの免疫グロブリン軽鎖］を指す。他に特定されなければ、ペアを形成する定常鎖ドメインが同じポリペプチド鎖上に存在しない場合、この用語はそのため、すべての可能な組合せを包含し得る。好ましくは、対応するＣＨ１およびＣＬドメインはそのため、互いに相補的であるとして選択され、その結果、それらは安定なペアＣ（ＣＨ１／ＣＬ）を形成する。
有利には、結合性タンパク質が、複数のペアとなったＣドメイン、例えば１つの「ペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）」および１つの「ペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）」を含む場合、ペアを形成する各々のＣＨ１およびＣＬドメインは、相補的なＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間でペアが形成されるように選択される。相補的なＣＨ１およびＣＬドメインの例は、国際特許出願国際公開第２００６／０６４１３６号パンフレットまたは国際公開第２０１２／０８９８１４号パンフレットまたは国際公開第２０１５１９７５９３Ａ１号パンフレットにおいて以前に記載されている。
他に指示されなければ、用語「ペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）」または「ペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）」は、同一のまたは別個の定常重鎖１ドメイン（ＣＨ１）および同一のまたは別個の定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）により形成される別個の定常ペアドメイン（Ｃ１およびＣ２）を指し得る。好ましくは、用語「ペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）」または「ペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）」は、同一の定常重鎖１ドメイン（ＣＨ１）および同一の定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）により形成される別個の定常ペアドメイン（Ｃ１およびＣ２）を指し得る。
本明細書において使用されている「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」により、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含む単位が意味される。用語Ｆａｂは、ＶＬ－ＣＬ部分と会合するＶＨ－ＣＨ１部分を含む単位の他に、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの間のクロスオーバーまたはインターチェンジがあるクロスオーバーＦａｂ構造を含む。例えば、Ｆａｂは、ＶＬ－ＣＨ１単位と会合するＶＨ－ＣＬ単位を有してもよい。Ｆａｂは、単離状態のこの領域、またはタンパク質、多特異性タンパク質もしくはＡＢＤ、もしくは本明細書において概説されている任意の他の実施形態の文脈におけるこの領域を指すことがある。
本明細書において使用されている「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」により、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片であって、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在するものが意味される。一般に、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のための所望される構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを産生する方法は当技術分野において周知である。ｓｃＦｖを産生する方法の総説には、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
本明細書において使用されている「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」により、単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドが意味される。
本明細書において使用されている「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」により、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を含むポリペプチドが意味される。そのため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端にある柔軟性ヒンジを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧについて、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）およびＣγ３（ＣＨ３）ならびに適宜Ｃγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、そのカルボキシル末端に対して残基Ｃ２２６、Ｐ２３０またはＡ２３１を含むように通常は定義され、番号付けはＥＵインデックスによるものである。Ｆｃは、単離状態のこの領域、または、以下に記載されるように、Ｆｃポリペプチドの文脈におけるこの領域を指すことがある。本明細書において使用されている「Ｆｃポリペプチド」または「Ｆｃ由来ポリペプチド」により、Ｆｃ領域の全体または部分を含むポリペプチドが意味される。本明細書におけるＦｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合物およびＦｃ断片を含むがそれに限定されない。また、本発明によるＦｃ領域は、Ｆｃ関連エフェクター機能を変更する（増強するかまたは減少させる）少なくとも１つの改変を含有する変異型を含む。また、本発明によるＦｃ領域は、例えば、異なるアイソタイプまたは種の抗体に由来する、異なるＦｃ領域の異なる部分またはドメインを含むキメラＦｃ領域を含む。
本明細書において使用されている「可変領域」により、軽鎖（κおよびλを含む）ならびに重鎖免疫グロブリン遺伝子座位をそれぞれ構成するＶＬ［Ｖκ（Ｖκ）およびＶλを含む］ならびに／またはＶＨ遺伝子のいずれかにより実質的にコードされる１つまたは複数のＩｇドメインを含む抗体の領域が意味される。軽鎖または重鎖可変領域（ＶＬまたはＶＨ）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として参照される３つの超可変領域を差し挟まれた「フレームワーク」または「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、例えばＫａｂａｔ［"Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)を参照］、およびＣｈｏｔｈｉａにおけるように、精密に定義されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成軽鎖および重鎖の組み合わせられたフレームワーク領域は、抗原に対する結合の主な原因となるＣＤＲを位置付けおよびアライメントするために役立つ。
本明細書において使用される場合、用語「ドメイン」は、特有の構造的または機能的な実体に関する、配列相同性または同一性に基づいて一般に定義される、タンパク質の任意の領域であり得る。よって、用語「領域」は、本開示の文脈において使用される場合、対応するドメインを越えて追加の領域を含み得るという点においてより広い。
本明細書において使用される場合、用語「リンカー領域」、「リンカーペプチド」もしくは「リンカーポリペプチド」または「アミノ酸リンカー」もしくは「リンカー」は、２つのポリペプチドドメイン、例えば２つの抗原結合性ドメインを一緒に、および／またはＦｃ領域を１つもしくは複数の可変領域、例えば１つもしくは複数の抗原結合性ドメインに共有結合的に連結するために好適な任意のアミノ酸配列を指す。該用語は特定のサイズまたはポリペプチドの長さに限定されないが、そのようなアミノ酸リンカーは、一般に、５０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは３０個未満のアミノ酸の長さ、例えば２０個または２０個未満のアミノ酸の長さ、例えば１５個または１５個未満のアミノ酸の長さである。そのようなアミノ酸リンカーは、適宜、免疫グロブリンポリペプチド鎖の全体または部分、例えば免疫グロブリンのヒンジ領域の全体または部分を含んでもよい。代替的に、アミノ酸リンカーは、免疫グロブリンのヒンジ領域に由来しない、またはさらには、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド鎖にも免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド鎖にも由来しないポリペプチド配列を含んでもよい。
本明細書において使用される場合、免疫グロブリンヒンジ領域、またはその断片はそのため、免疫グロブリンポリペプチド鎖に由来する、特定のタイプのリンカーとして考えられ得る。
本明細書において使用される場合、用語「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、一般に柔軟な領域であって、対応する重鎖ポリペプチドにより担持され、かつ免疫グロブリンのある特定のアイソタイプ、より特にはＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤアイソタイプのＦｃおよびＦａｂ部分を分離するものを指す。そのようなヒンジ領域は、考慮される免疫グロブリンのアイソタイプに依存することが当技術分野において公知である。ネイティブなＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプについて、ヒンジ領域はそのためＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインを分離し、パパイン消化で一般に切断される。他方、ＩｇＭおよびＩｇＥ重鎖中のヒンジに対応する領域は、より低い柔軟性を有する追加の定常ドメインにより一般に形成される。追加的に、ヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合に関与する１つまたは複数のシステインを含んでもよい。ヒンジ領域はまた、適用可能な場合、ＣＨ２ドメインにより担持されるＦｃγＲ結合性部位に加えて、Ｆｃγ受容体に対する１つまたは複数の結合性部位を含んでもよい。追加的に、ヒンジ領域は、１つまたは複数の翻訳後修飾、例えば考慮されるアイソタイプに依存する１つまたは複数のグリコシル化された残基を含んでもよい。そのため、本明細書の全体を通じた用語「ヒンジ」への言及は、ヒンジ配列の特定のセットにも構造上の特有の位置にも限定されないことが容易に理解される。他に指示されなければ、いっそう特に考慮されるヒンジ領域は、ＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプおよびＩｇＤアイソタイプから選択される１つのアイソタイプ；特にＩｇＧアイソタイプに属する免疫グロブリンからのヒンジの全体または部分を含む。
用語「～に特異的に結合する」は、抗体またはポリペプチドが、単離された標的細胞の表面上に存在する組換え形態のタンパク質、その中のエピトープ、またはネイティブなタンパク質のいずれかを使用して評価された場合に、結合パートナー、例えばＮＫｐ４６に、好ましくは競合結合アッセイにおいて、結合できることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するための他の方法は、以下にさらに記載されており、当技術分野において周知である。
抗体またはポリペプチドが特定の多特異性タンパク質または特定のモノクローナル抗体（例えば、抗ＮＫｐ４６一特異性抗体または多特異性タンパク質の文脈におけるＮＫｐ４６－１、－２、－４、－６または－９）と「競合する」と言われる場合、それは、抗体またはポリペプチドが、組換え標的（例えばＮＫｐ４６）分子または表面発現される標的（例えばＮＫｐ４６）分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいて特定の多特異性タンパク質またはモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいてＮＫｐ４６ポリペプチドまたはＮＫｐ４６発現細胞に対するＮＫｐ４６－１、－２、－４、－６または－９の結合性を低減させる場合、抗体は、それぞれＮＫｐ４６－１、－２、－４、－６または－９と「競合する」と言われる。
用語「親和性」は、本明細書において使用される場合、エピトープに対する抗体またはタンパク質の結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合の抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合の抗原のモル濃度である）として定義される解離定数ＫＤにより与えられる。親和性定数ＫＡは１／ＫＤにより定義される。タンパク質の親和性を決定する好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)（これらの参考文献は参照により本明細書に全体が組み込まれる）において見出され得る。タンパク質の親和性を決定するための当技術分野において周知の１つの好ましいおよび標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング［例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析デバイスを用いる分析によるもの］の使用である。
本発明の文脈内において、「決定因子」は、ポリペプチド上の相互作用または結合の部位を呼称する。
用語「エピトープ」は、抗原決定因子を指し、抗体またはタンパク質が結合する抗原上の区画または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基の他に、特有の抗原結合性抗体またはペプチドにより有効に遮断されるアミノ酸残基、すなわち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。それは、例えば、抗体または受容体と組み合わせられ得る複合体抗原分子上の最も単純な形態または最小の構造的区画である。エピトープは、リニアまたはコンフォメーショナル／構造的であり得る。用語「リニアエピトープ」は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で連続するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。用語「コンフォメーショナルまたは構造的エピトープ」は、すべてが連続しているわけではなく、そのため、分子のフォールディング（二次、三次および／または四次構造）により互いに近接状態とされるアミノ酸の直鎖状配列の分離された部分を表すアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。コンフォメーショナルエピトープは３次元構造に依存している。用語「コンフォメーショナル」は、したがって多くの場合に、「構造的」（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）と交換可能に使用される。エピトープは、数ある中でも、アラニンスキャニング、ファージディスプレイ、Ｘ線結晶学、アレイベースオリゴ－ペプチドスキャニングまたはｐｅｐｓｃａｎ分析、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット突然変異誘発マッピング、Ｈ／Ｄ－Ｅｘ質量分析、相同性モデリング、ドッキング、水素－重水素交換を含むがそれに限定されない当技術分野において公知の異なる方法により同定され得る。［例えば、Tong et al., Methods and Protocols for prediction of immunogenic epitopes", Briefings in Bioinformatics 8(2):96-108; Gershoni, Jonathan M; Roitburd-Berman, Anna; Siman-Tov, Dror D; Tarnovitski Freund, Natalia; Weiss, Yael (2007). "Epitope Mapping". BioDrugs 21 (3): 145-56;およびFlanagan, Nina (May 15, 2011); "Mapping Epitopes with H/D-Ex Mass Spec: ExSAR Expands Repertoire of Technology Platform Beyond Protein Characterization", Genetic Engineering & Biotechnology News 31 (10)を参照］。
「価」（ｖａｌｅｎｔ）または「価数」（ｖａｌｅｎｃｙ）は、抗原結合性タンパク質中の決定された数の抗原結合性部分の存在を表す。天然ＩｇＧは２つの抗原結合性部分を有し、二価である。特定の抗原のための１つの結合性部分を有する分子は、その抗原について一価である。
本明細書において「アミノ酸改変」により、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失が意味される。本明細書におけるアミノ酸改変の例は置換である。本明細書において「アミノ酸改変」により、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失が意味される。本明細書において「アミノ酸置換」または「置換」により、タンパク質配列中の所与の位置にけるアミノ酸の、別のアミノ酸での置き換えが意味される。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、５０位におけるチロシンがトリプトファンで置き換えられている、親ポリペプチドの変異型を指す。アミノ酸置換は、野生型タンパク質中に存在する残基／残基の位置／突然変異体タンパク質中に存在する残基を列記することにより指し示される。ポリペプチドの「変異型」は、参照ポリペプチド、典型的にはネイティブなまたは「親」ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異型は、ネイティブなアミノ酸配列内のある特定の位置において１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有してもよい。
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した物理化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
用語「同一性」または「同一の」は、２つまたはより多くのポリペプチドの配列の間の関係性において使用される場合、２つまたはより多くのアミノ酸残基のストリングの間のマッチの数により決定される場合の、ポリペプチドの間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアライメント（存在する場合）と共に２つまたはより多くの配列のうちのより小さいものの間の同一のマッチのパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に算出され得る。そのような方法は、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991;およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)において記載されているものを含むが、それに限定されない。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列の間の最大のマッチを与えるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムの方法は、ＧＡＰ［Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ［Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)］を含む、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al.、上掲）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
「単離された」分子は、それが属する分子のクラスに関して見出される組成物中の主な種である分子である（すなわち、分子は、組成物の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはより多くを構成する）。一般的に、ポリペプチドの組成物は、組成物中のすべての存在するペプチド種の文脈において、または少なくとも提案される使用の文脈における実質的に活性のペプチド種に関して、ポリペプチドについて９８％、９８％、または９９％の均質性を呈する。
本明細書における文脈において、「処置」または「処置する」は、文脈に矛盾しない限り、疾患または障害の１つまたは複数の症状または臨床的に関連する所見を予防するか、軽減するか、管理するか、治癒するか、または低減させることを指す。例えば、疾患または障害の症状または臨床的に関連する所見が同定されていない患者の「処置」は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅまたはｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）療法である一方、疾患または障害の症状または臨床的に関連する所見が同定されている患者の「処置」は予防的療法を一般に構成しない。
本明細書において使用される場合、語句「ＮＫ細胞」は、非従来的な免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、ある特定の特徴および生物学的特性、例えばヒトＮＫ細胞についてのＣＤ５６および／またはＮＫｐ４６を含む特異的な表面抗原の発現、細胞表面上のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の非存在、特異的細胞溶解機構の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合し、それを殺傷する能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を殺傷する能力、ならびに免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を理由として同定され得る。これらの特徴および活性のいずれも、当技術分野において周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するために使用され得る。ＮＫ細胞の任意の亜集団もまた用語ＮＫ細胞により包含される。本明細書の文脈において、「活性」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解するかまたは他の細胞の免疫機能を増強する能力を有するＮＫ細胞を含む、生物学的に活性のＮＫ細胞を呼称する。ＮＫ細胞は、当技術分野において公知の様々な技術、例えば血液試料からの単離、サイタフェレーシス、組織または細胞収集などにより得られ得る。ＮＫ細胞を伴うアッセイのための有用なプロトコールは、Natural Killer Cells Protocols (edited by Campbell KS and Colonna M). Humana Press. pp. 219-238 (2000)において見出され得る。
本明細書において使用される場合、ＮＫｐ４６において「アゴニスト」活性を有する剤は、「ＮＫｐ４６シグナル伝達」を引き起こすかまたは増加させることができる剤である。「ＮＫｐ４６シグナル伝達」は、細胞内シグナル伝達経路を活性化させるかまたは伝達するＮＫｐ４６ポリペプチドの能力を指す。ＮＫｐ４６シグナル伝達活性における変化は、例えば、例えばシグナル伝達成分のリン酸化をモニターすることにより、ＮＫｐ４６シグナル伝達経路における変化を測定するために設計されたアッセイ、ある特定のシグナル伝達成分の、他のタンパク質もしくは細胞内構造物との会合を測定するか、もしくは成分、例えばキナーゼの生化学的活性におけるアッセイ、もしくはＮＫｐ４６感受性プロモーターおよびエンハンサーの制御下のレポーター遺伝子の発現を測定するために設計されたアッセイにより、または間接的にＮＫｐ４６ポリペプチドにより媒介される下流の効果（例えばＮＫ細胞における特異的細胞溶解機構の活性化）により測定され得る。レポーター遺伝子は、天然に存在する遺伝子（例えばサイトカイン産生をモニターする）であり得るか、または細胞に人工的に導入された遺伝子であり得る。他の遺伝子をそのような調節エレメントの制御に置くことができ、該遺伝子はそのため、ＮＫｐ４６シグナル伝達のレベルをレポートするために役立つ。
「ＮＫｐ４６」は、Ｎｃｒ１遺伝子により、またはそのような遺伝子から調製されたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質またはポリペプチドを指す。任意の天然に存在するアイソフォーム、アレル、オルソログまたは変異型は用語ＮＫｐ４６ポリペプチドにより包含される（例えば、配列番号１、またはその少なくとも２０、３０、５０、１００もしくは２００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して９０％、９５％、９８％または９９％同一のＮＫｐ４６ポリペプチド）。ヒトＮＫｐ４６（アイソフォームａ）の３０４アミノ酸残基の配列を以下において示す：
配列番号８８はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４８２０に対応し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＮＫｐ４６ ｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９において記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、用語「対象」または「個体」または「患者」は、交換可能に使用され、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物、齧歯動物または非齧歯動物を包含し得る。該用語は、哺乳動物、例えば、男性、女性および小児を含むヒト、他の霊長動物（サル）、ブタ、齧歯動物、例えばマウスおよびラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを含むが、それに限定されない。
ポリペプチドの産生
本明細書において記載されるタンパク質は、好都合には、周知の免疫グロブリン由来ドメイン、特に重鎖および軽鎖可変ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメイン、ならびに野生型または変異型サイトカインポリペプチドを使用して構成および産生され得る。共通のポリペプチド鎖上に置かれたドメインは、関係する特定のドメインに依存して、直接的またはリンカーを介した接続のいずれかで互いに融合され得る。免疫グロブリン由来ドメインは、好ましくは、ヒト化されているか、またはヒト起源であり、それにより、ヒトに投与された場合の免疫原性のリスクの減少が提供される。本明細書において示されるように、最小の非免疫グロブリン連結アミノ酸配列（例えば４または５個以下のドメインリンカー、一部の場合には、１または２個もの少なさのドメインリンカー、および短い長さのドメインリンカーの使用）を使用し、それにより免疫原性のリスクをさらに低減する有利なタンパク質フォーマットが記載される。
本明細書において記載されるタンパク質は、好都合には、周知の免疫グロブリン由来ドメイン、特に重鎖および軽鎖可変ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメイン、ならびに野生型または変異型サイトカインポリペプチドを使用して構成および産生され得る。共通のポリペプチド鎖上に置かれたドメインは、関係する特定のドメインに依存して、直接的またはリンカーを介した接続のいずれかで互いに融合され得る。免疫グロブリン由来ドメインは、好ましくは、ヒト化されているか、またはヒト起源であり、それにより、ヒトに投与された場合の免疫原性のリスクの減少が提供される。本明細書において示されるように、最小の非免疫グロブリン連結アミノ酸配列（例えば４または５個以下のドメインリンカー、一部の場合には、１または２個もの少なさのドメインリンカー、および短い長さのドメインリンカーの使用）を使用し、それにより免疫原性のリスクをさらに低減する有利なタンパク質フォーマットが記載される。
免疫グロブリン可変ドメインは抗体（免疫グロブリン鎖）に一般的に由来し、例えば、２つのポリペプチド鎖上に見出される会合したＶＬおよびＶＨドメイン、または単鎖抗原結合性ドメイン、例えばｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ－ＮＡＲドメインもしくはＶＨＨドメインの形態である。対合および／またはフォールディングのための実質的なさらなる要求なしにＦａｂまたはｓｃＦｖからの広範囲の可変領域の使用を直接的に可能にする本明細書において開示されるある特定の有利なタンパク質フォーマットにおいて、抗原結合性ドメイン（例えば、ＡＢＤ１およびＡＢＤ２）はまた、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして抗体から容易に誘導され得る。
用語「抗原結合性タンパク質」は、抗原結合特性を有する免疫グロブリン誘導体を指すために使用され得る。結合性タンパク質は、標的抗原に結合する能力を有する免疫学的に機能的な免疫グロブリン部分を含む。免疫学的に機能的な免疫グロブリン部分は、免疫グロブリン、もしくはその部分、免疫グロブリン部分に由来する融合ペプチドまたは抗原結合性部位を形成する免疫グロブリン部分を組み合わせたコンジュゲートを含んでもよい。各々の抗原結合性部分は、抗原結合性部分の由来となる免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも必然的に１、２または３つのＣＤＲを含む。一部の態様において、抗原結合性タンパク質は単一のポリペプチド鎖（単量体）からなることができる。他の実施形態において、抗原結合性タンパク質は、少なくとも２つのポリペプチド鎖、例えば、二量体タンパク質 三量体タンパク質（ｄｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるとして適宜特定される、多量体タンパク質を含む。本明細書においてさらに例示されるように、抗原結合性ドメインは好都合にはＶＨおよびＶＬ（ＶＨ／ＶＬペア）を含むことができる。一部の実施形態において、ＶＨ／ＶＬペアは、ＣＨ１およびＣＬドメイン（ＣＨ１／ＣＬペア）をさらに含むＦａｂ構造中に組み込まれ得る。ＶＨ／ＶＬペアは、互いと会合して抗原結合性ドメインを形成している１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインを指す。ＣＨ１／ＣＬペアは、共有結合性または非共有結合、好ましくは非共有結合により互いに結合し、そのためヘテロ二量体（例えば、１つまたは複数のさらなるポリペプチド鎖を含むことができるタンパク質、例えばヘテロ三量体内のもの）を形成している１つのＣＨ１および１つのＣＬドメインを指す。
１つの実施形態において、結合性タンパク質は、
（ｉ）ヒトＣＤ２０ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体（ＣＤ１６）に結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分、およびサイトカイン部分
を含む。
（ｉ）ヒトＣＤ２０ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する可変領域を含む第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、（ｉｉｉ）ヒトＦｃ－γ受容体（ＣＤ１６）に結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分、およびサイトカイン部分
を含む。
タンパク質フォーマット
多量体の多特異性タンパク質、例えばヘテロ二量体およびヘテロ三量体は、様々なフォーマットに従って産生され得る。異なるポリペプチド鎖上の異なるドメインは会合して多量体タンパク質を形成する（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｔｈａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｔｏ ｆｏｒｍ ａ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．）。よって、広範囲のタンパク質フォーマットが、そのようなＣＤ１６結合性ＡＢＤの存在が所望されるか否かに依存して、ＣＤ１６またはＣＤ１６Ａに対する追加的な結合性を有するまたは有しない状態で、ヒトＦｃＲｎポリペプチド（新生児Ｆｃ受容体）に結合する能力を有するＦｃドメイン二量体と共に（ａｒｏｕｎｄ）構築され得る。本明細書において示されるように、ＮＫ細胞の細胞傷害性の最大の増強は、活性化ヒトＣＤ１６受容体（ＣＤ１６Ａ）［ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ１６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＣＤ１６Ａ） ｂｉｎｄｉｎｇ］に対する実質的な結合性を有するＦｃ部分の使用を通じて得ることができ；そのようなＣＤ１６結合性は、本明細書においてさらに記載されるように、好適なＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの使用を通じて得られ得る。１つの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１アイソタイプ定常領域に由来する。改変されたＣＨ３ドメインの使用もまた、広範囲のヘテロ多量体タンパク質構造の使用の可能性に寄与する。よって、タンパク質は、ヒトＦｃドメイン単量体（すなわちＣＨ２－ＣＨ３単位）、適宜、優先的なＣＨ３－ＣＨ３ヘテロ二量体化を起こす能力を有するＣＨ３ドメインを含むＦｃドメイン単量体に融合した可変ドメインを各々が含む第１および第２のポリペプチド鎖を含み、第１および第２の鎖はＣＨ３－ＣＨ３二量体化を介して会合し、タンパク質は結果的にＦｃドメイン二量体を含む。各々の鎖の可変ドメインは、同じまたは異なる抗原結合性ドメインの部分であり得る。
多量体の多特異性タンパク質、例えばヘテロ二量体およびヘテロ三量体は、様々なフォーマットに従って産生され得る。異なるポリペプチド鎖上の異なるドメインは会合して多量体タンパク質を形成する（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｔｈａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｔｏ ｆｏｒｍ ａ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．）。よって、広範囲のタンパク質フォーマットが、そのようなＣＤ１６結合性ＡＢＤの存在が所望されるか否かに依存して、ＣＤ１６またはＣＤ１６Ａに対する追加的な結合性を有するまたは有しない状態で、ヒトＦｃＲｎポリペプチド（新生児Ｆｃ受容体）に結合する能力を有するＦｃドメイン二量体と共に（ａｒｏｕｎｄ）構築され得る。本明細書において示されるように、ＮＫ細胞の細胞傷害性の最大の増強は、活性化ヒトＣＤ１６受容体（ＣＤ１６Ａ）［ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ１６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＣＤ１６Ａ） ｂｉｎｄｉｎｇ］に対する実質的な結合性を有するＦｃ部分の使用を通じて得ることができ；そのようなＣＤ１６結合性は、本明細書においてさらに記載されるように、好適なＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの使用を通じて得られ得る。１つの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１アイソタイプ定常領域に由来する。改変されたＣＨ３ドメインの使用もまた、広範囲のヘテロ多量体タンパク質構造の使用の可能性に寄与する。よって、タンパク質は、ヒトＦｃドメイン単量体（すなわちＣＨ２－ＣＨ３単位）、適宜、優先的なＣＨ３－ＣＨ３ヘテロ二量体化を起こす能力を有するＣＨ３ドメインを含むＦｃドメイン単量体に融合した可変ドメインを各々が含む第１および第２のポリペプチド鎖を含み、第１および第２の鎖はＣＨ３－ＣＨ３二量体化を介して会合し、タンパク質は結果的にＦｃドメイン二量体を含む。各々の鎖の可変ドメインは、同じまたは異なる抗原結合性ドメインの部分であり得る。
多特異性タンパク質は、そのため、好都合には、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、Ｆｃドメインおよびサイトカイン、およびドメインリンカーと共に、ｓｃＦｖまたはＦａｂ構造として配置されたＶＨおよびＶＬペアを使用して構築され得る。好ましくは、タンパク質は、最小の非天然配列、例えば非Ｉｇリンカーの最小の使用、適宜、抗体由来配列ではない５、４、３、２または１つ以下のドメインリンカーを使用し、適宜、ドメインリンカーは、１５、１０または５個以下のアミノ酸残基の長さである。１つの実施形態において、タンパク質は、Ｆｃドメイン二量体として具現化されたＣＤ１６ ＡＢＤを含む。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質（例えば二量体、三量体）は、以下：ドメインが、２または３つのポリペプチド鎖のいずれかに置くことができること、ＮＫｐ４６ ＡＢＤが、Ｆｃドメインとサイトカイン部分との間に差し挟まれていること［例えば、タンパク質は、Ｃ末端において末端または遠位サイトカイン受容体ＡＢＤを有し、かつトポロジカルなＮ末端において末端または遠位のＣＤ２０ ＡＢＤを有する］、ＮＫｐ４６ ＡＢＤが、Ｆｃドメイン二量体のポリペプチド鎖のうちの１つにヒンジポリペプチドまたは柔軟性リンカーを介して接続されていること、ならびにサイトカイン受容体に結合するＡＢＤが、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ（例えばＮＫｐ４６ ＡＢＤが２つの鎖上に含有される場合にそのポリペプチド鎖のうちの１つ）に柔軟性リンカー（例えばＧおよびＳ残基を含むリンカー）を介して接続されていることのいずれかのドメイン配置を含んでもよい：
（抗ＣＤ２０ ＡＢＤ）－（Ｆｃドメイン二量体）－（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）－（サイトカイン部分）。
（抗ＣＤ２０ ＡＢＤ）－（Ｆｃドメイン二量体）－（ＮＫｐ４６ ＡＢＤ）－（サイトカイン部分）。
サイトカイン部分は、ＩＬ２ポリペプチドまたはその変異型であり得る。Ｆｃドメイン二量体は、例えばヒトＦｃＲｎおよび／またはＦｃγ受容体に結合するＦｃドメイン二量体であるとして特定され得る。１つの実施形態において、ＣＤ２０ ＡＢＤおよびＮＫｐ４６ ＡＢＤのうちの１つまたは両方は、存在する２つの可変領域から形成され、会合して特定のＡＢＤを形成する可変領域は、同じポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上にあり得る。別の実施形態において、ＣＤ２０ ＡＢＤおよびＮＫｐ４６ ＡＢＤのうちの１つまたは両方はタンデム可変領域（ｓｃＦｖ）を含み、かつ他方はＦａｂ構造を含む。別の実施形態において、対象とする抗原およびＮＫｐ４６ ＡＢＤの両方はＦａｂ構造を含む。別の実施形態において、ＣＤ２０ ＡＢＤはＦａｂ構造を含み、かつＮＫｐ４６ ＡＢＤはｓｃＦｖ構造を含む。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、ヘテロ三量体であり、かつ、上記に定義されている、２つのＡＢＤを形成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ（Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｃ２Ａ（ＩＩ）
Ｖ２Ｂ－Ｃ２Ｂ－ヒンジ３－Ｌ２－ＩＬ－２（ＩＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、かつＣ２ＡおよびＣ２ＢはペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１、ヒンジ２およびヒンジ３は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。１つの実施形態において、結合ペアＶ１はＣＤ２０に結合し、かつ結合ペアＶ２はＮＫｐ４６に結合する。
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ（Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｃ２Ａ（ＩＩ）
Ｖ２Ｂ－Ｃ２Ｂ－ヒンジ３－Ｌ２－ＩＬ－２（ＩＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂは結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、かつＣ２ＡおよびＣ２ＢはペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１、ヒンジ２およびヒンジ３は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。１つの実施形態において、結合ペアＶ１はＣＤ２０に結合し、かつ結合ペアＶ２はＮＫｐ４６に結合する。
Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｂ、Ｖ２Ａ、Ｖ２Ｂの各々は免疫グロブリンＶＨまたはＶＬドメインであり、Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂのうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬであり、かつＶ２ＡおよびＶ２Ｂのうちの１つはＶＨであり、かつ他方はＶＬである。
一部の実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化を含むＫａｂａｔ番号付けに従ってＦｃドメインまたはその変異型の残基Ｎ２９７を有する。一部の実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに結合するＦｃドメインを含む。
一部の実施形態によれば、Ｖ１ＡはＶＬ１であり、かつＶ１ＢはＶＨ１である。
一部の実施形態によれば、Ｖ２ＡはＶＨ２であり、かつＶ２ＢはＶＬ２である。
一部の実施形態によれば、Ｃ１ＡはＣＫであり、かつＣ１ＢはＣＨ１である。
一部の実施形態によれば、Ｃ２ＡはＣＫであり、かつＣ２ＢはＣＨ１である。
一部の実施形態において、ＶＨ１は、配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ＶＬ１は、配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ＶＨ２は、配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、かつＶＬ２は、配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、以下に示されるように、結合性タンパク質は、（ａ）それぞれ配列番号１１および３のアミノ酸配列に対応するＶＨ１およびＶＬ１、ならびに／または（ｂ）それぞれ配列番号９３および９５のアミノ酸配列に対応するＶＨ２およびＶＬ２を含む。
ＶＨ１（配列番号１１）
EVQLVESGGG LVQPDRSLRL SCAASGFTFH DYAMHWVRQA PGKGLEWVST ISWNSGTIGY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV SS
ＶＬ１（配列番号３）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ GTRLEIK
ＶＨ２（配列番号９３）
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFS DYVINWVRQA PGQGLEWMGE IYPGSGTNYY NEKFKAKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG RYGLYAMDYW GQGTTVTVSS
ＶＬ２（配列番号９５）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GNTRPWTFGG GTKVEIK
ＶＨ１（配列番号１１）
EVQLVESGGG LVQPDRSLRL SCAASGFTFH DYAMHWVRQA PGKGLEWVST ISWNSGTIGY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV SS
ＶＬ１（配列番号３）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ GTRLEIK
ＶＨ２（配列番号９３）
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFS DYVINWVRQA PGQGLEWMGE IYPGSGTNYY NEKFKAKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG RYGLYAMDYW GQGTTVTVSS
ＶＬ２（配列番号９５）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GNTRPWTFGG GTKVEIK
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、（ａ）それぞれ配列番号１１および３のアミノ酸配列もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型に対応するＶＨ１およびＶＬ１、ならびに／または（ｂ）それぞれ配列番号９３および９５のアミノ酸配列もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型に対応するＶＨ２およびＶＬ２を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、（ａ）それぞれ配列番号１１および３のアミノ酸配列もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型に対応するＶＨ１およびＶＬ１、ならびに／または（ｂ）それぞれ配列番号９３および９５のアミノ酸配列もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型に対応するＶＨ２およびＶＬ２を含む。
一部の実施形態において、本開示のヘテロ三量体結合性タンパク質において、
ＣＨ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり；
ＣＫは、配列番号４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＫ）であり；
（Ｆｃドメイン）Ａは、配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
（Ｆｃドメイン）Ｂは、配列番号１４のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
ヒンジ１は配列番号５のアミノ酸配列に対応し；
ヒンジ２は配列番号１３のアミノ酸配列に対応し；
ヒンジ３は配列番号１９のアミノ酸配列に対応し；
Ｌ１は配列番号１５のアミノ酸配列に対応し；かつ／または
Ｌ２は配列番号２０～２３のアミノ酸配列のいずれか１つに対応する。
ＣＨ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり；
ＣＫは、配列番号４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＫ）であり；
（Ｆｃドメイン）Ａは、配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
（Ｆｃドメイン）Ｂは、配列番号１４のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
ヒンジ１は配列番号５のアミノ酸配列に対応し；
ヒンジ２は配列番号１３のアミノ酸配列に対応し；
ヒンジ３は配列番号１９のアミノ酸配列に対応し；
Ｌ１は配列番号１５のアミノ酸配列に対応し；かつ／または
Ｌ２は配列番号２０～２３のアミノ酸配列のいずれか１つに対応する。
一部の実施形態において、ＣＤ２０に結合するＡＢＤおよびＮＫｐ４６に結合するＡＢＤは各々、Ｆａｂ構造を有する。
一部の実施形態において、以下において本明細書に開示されるように、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
第１のポリペプチド鎖（Ｉ）（配列番号１）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGECDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）（配列番号９）
EVQLVESGGG LVQPDRSLRL SCAASGFTFH DYAMHWVRQA PGKGLEWVST ISWNSGTIGY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GSTGSQVQLV QSGAEVKKPG SSVKVSCKAS GYTFSDYVIN WVRQAPGQGL EWMGEIYPGS GTNYYNEKFK AKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARRGRYGLY AMDYWGQGTT VTVSSRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY
第３のポリペプチド鎖（ＩＩＩ）（配列番号１７）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GNTRPWTFGG GTKVEIKAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHSGSSSS GSSSSGSSSS TKKTQLQLEH LLLDLQMILN GINNYKNPKL TAMLTKKFYM PKKATELKHL QCLEEELKPL EEVLNLAQSK NFHLRPRDLI SNINVIVLEL KGSETTFMCE YADETATIVE FLNRWITFAQ SIISTLT
第１のポリペプチド鎖（Ｉ）（配列番号１）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGECDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）（配列番号９）
EVQLVESGGG LVQPDRSLRL SCAASGFTFH DYAMHWVRQA PGKGLEWVST ISWNSGTIGY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GSTGSQVQLV QSGAEVKKPG SSVKVSCKAS GYTFSDYVIN WVRQAPGQGL EWMGEIYPGS GTNYYNEKFK AKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARRGRYGLY AMDYWGQGTT VTVSSRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY
第３のポリペプチド鎖（ＩＩＩ）（配列番号１７）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GNTRPWTFGG GTKVEIKAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHSGSSSS GSSSSGSSSS TKKTQLQLEH LLLDLQMILN GINNYKNPKL TAMLTKKFYM PKKATELKHL QCLEEELKPL EEVLNLAQSK NFHLRPRDLI SNINVIVLEL KGSETTFMCE YADETATIVE FLNRWITFAQ SIISTLT
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９５％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも８０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
上記の第１、第２および第３のポリペプチド鎖を有する結合性タンパク質は、図１および図２Ａにおいて示されるタンパク質フォーマット（ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４）である。
別の実施形態において、Ｃ２ＡはＣＨ１であり、かつＣ２ＢはＣＫである。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９５％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも８０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
上記の第１、第２および第３のポリペプチド鎖を有する結合性タンパク質（Ｃ２ＡはＣＨ１であり、かつＣ２ＢはＣＫである）は、図２Ｇにおいて示されるフォーマット（ＣＤ２０－２－Ｔ２５－ＮＫＣＥ４）において配置される。
別の実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、グリコシル化されるのを予防するように突然変異されたＦｃドメインの残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）を有する。好ましい実施形態において、前記突然変異はＮ２９７Ｓ置換である。有利には、前記突然変異はＣＤ１６Ａ結合性を実質的に消失させる。
一部の実施形態によれば、Ｃ２ＡはＣＫであり、かつＣ２ＢはＣＨ１である。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９５％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも８０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は、図２Ｂにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ６－ＮＫＣＥ４）。
代替的な実施形態において、Ｃ２ＡはＣＨ１であり、かつＣ２ＢはＣＫである。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９５％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも８０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｈにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ２６－ＮＫＣＥ４）。
別の実施形態において、結合性タンパク質は、ｋａｂａｔ番号付けに従ってＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ置換を含むＦｃドメインを有する。
一部の実施形態によれば、Ｃ２ＡはＣＫであり、かつＣ２ＢはＣＨ１である。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９５％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも８０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｃにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ６Ｂ３－ＮＫＣＥ４）。
代替的な実施形態において、Ｃ２ＡはＣＨ１であり、かつＣ２ＢはＣＫである。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、または少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｉにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ２６Ｂ３－ＮＫＣＥ４）。
他の実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、ＶＨ／ＶＬペアであるＣＤ２０に結合するＡＢＤおよびＦａｂであるＮＫｐ４６に結合するＡＢＤを含む。
一部の実施形態によれば、Ｃ２ＡはＣＫであり、かつＣ２ＢはＣＨ１である。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）もしくは少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）もしくは少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖もしくは少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、または少なくとも８０％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｋにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ１９５－ＮＫＣＥ４）。
代替的な実施形態において、Ｃ２ＡはＣＨ１であり、かつＣ２ＢはＣＫである。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖、または少なくとも９５％の配列同一性を有するこれらの変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｊにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ１７５－ＮＫＣＥ４）。
別の実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、ヘテロ二量体であり、かつ、上記に定義されている、２つのＡＢＤを形成する２つのポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）：
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ（Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２（ＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２ＢはｓｃＦｖを形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、かつＣ２ＡおよびＣ２ＢはペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１、ヒンジ２およびヒンジ３は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。１つの実施形態において、結合ペアＶ１はＣＤ２０に結合し、かつ結合ペアＶ２はＮＫｐ４６に結合する。
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ（Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２（ＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂは結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２ＢはｓｃＦｖを形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢはペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、かつＣ２ＡおよびＣ２ＢはペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１、ヒンジ２およびヒンジ３は、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂは、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１およびＬ２はアミノ酸リンカーであり、Ｌ１およびＬ２は異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２は、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である。１つの実施形態において、結合ペアＶ１はＣＤ２０に結合し、かつ結合ペアＶ２はＮＫｐ４６に結合する。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）（以下において本明細書に開示される）、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）（以下において本明細書に開示される）を含む。
第１のポリペプチド鎖（Ｉ）（配列番号１）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGECDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）（配列番号７０）
EVQLVESGGG LVQPDRSLRL SCAASGFTFH DYAMHWVRQA PGKGLEWVST ISWNSGTIGY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GSTGSQVQLV QSGAEVKKPG SSVKVSCKAS GYTFSDYVIN WVRQAPGQGL EWMGEIYPGS GTNYYNEKFK AKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARRGRYGLY AMDYWGQGTT VTVSSVEGGS GGSGGSGGSG GVDDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCRASQ DISNYLNWYQ QKPGKAPKLL IYYTSRLHSG VPSRFSGSGS GTDFTFTISS LQPEDIATYF CQQGNTRPWT FGGGTKVEIK GSSSSGSSSS GSSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTAMLT KKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFAQSIIST LT
第１のポリペプチド鎖（Ｉ）（配列番号１）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGECDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）（配列番号７０）
EVQLVESGGG LVQPDRSLRL SCAASGFTFH DYAMHWVRQA PGKGLEWVST ISWNSGTIGY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GSTGSQVQLV QSGAEVKKPG SSVKVSCKAS GYTFSDYVIN WVRQAPGQGL EWMGEIYPGS GTNYYNEKFK AKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARRGRYGLY AMDYWGQGTT VTVSSVEGGS GGSGGSGGSG GVDDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCRASQ DISNYLNWYQ QKPGKAPKLL IYYTSRLHSG VPSRFSGSGS GTDFTFTISS LQPEDIATYF CQQGNTRPWT FGGGTKVEIK GSSSSGSSSS GSSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTAMLT KKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFAQSIIST LT
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｄにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４）。
別の実施形態において、本開示の結合性タンパク質は、グリコシル化されるのを予防するように突然変異されたＦｃドメインの残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）を有する。好ましい実施形態において、前記突然変異はＮ２９７Ｓ置換である。有利には、前記突然変異はＣＤ１６Ａ結合性を実質的に消失させる。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、および配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｅにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ１４－ＮＫＣＥ４）。
別の実施形態において、結合性タンパク質は、ｋａｂａｔ番号付けに従ってＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ置換を含むＦｃドメインを有する。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
一部の実施形態において、結合性タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖（Ｉ）または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＩＩ）、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含む。
そのようなタンパク質フォーマットの例は図２Ｆにおいて提示される（ＣＤ２０－２－Ｔ１４Ｂ３－ＮＫＣＥ４）。
ＣＤ２０ ＡＢＤ
ＣＤ２０は、ほとんどのＢ細胞新生物上に存在し、かつそれ以外は類似した外見のＴ細胞新生物上には存在しない細胞表面タンパク質である。ＣＤ２０陽性細胞はまた、ホジキン病、骨髄腫、および胸腺腫の症例において見出される場合がある。ＣＤ２０は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ジェンマブ（ｇｅｎｍａｂ）、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ＡＭＥ－１３３ｖ、ＩＭＭＵ－１０６、ＴＲＵ－０１５、およびトシツモマブの標的であり、これらはすべて、すべてのＢ細胞リンパ腫および白血病の処置における活性剤である。
ＣＤ２０は、ほとんどのＢ細胞新生物上に存在し、かつそれ以外は類似した外見のＴ細胞新生物上には存在しない細胞表面タンパク質である。ＣＤ２０陽性細胞はまた、ホジキン病、骨髄腫、および胸腺腫の症例において見出される場合がある。ＣＤ２０は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ジェンマブ（ｇｅｎｍａｂ）、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ＡＭＥ－１３３ｖ、ＩＭＭＵ－１０６、ＴＲＵ－０１５、およびトシツモマブの標的であり、これらはすべて、すべてのＢ細胞リンパ腫および白血病の処置における活性剤である。
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＣＤ２０ポリペプチドに結合するＡＢＤは、以下の表２において提示されるＶＨおよびＶＬペアを含む：
１つの実施形態において、本開示の結合性タンパク質のＣＤ２０ポリペプチドに結合するＡＢＤは、３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含むＶＨならびに３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含むＶＬを含む。
本明細書における任意の実施形態の別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれも、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列により、かつ／または、ＩＭＧＴ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義システムに従って、ＣＤＲの配列を要約する、以下の対応する配列番号もしくは表において列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するとして特徴付けられてもよい：
一部の実施形態において、結合性タンパク質の第１のＡＢＤは、ヒトＣＤ２０ポリペプチドに特異的に結合し、かつ
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含む。
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含む。
ＮＫｐ４６
本明細書において議論されるように、本開示の結合性タンパク質は、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤ（ａｎｄ ＡＢＤ）を含む。
本明細書において議論されるように、本開示の結合性タンパク質は、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＡＢＤ（ａｎｄ ＡＢＤ）を含む。
１つの実施形態において、結合性タンパク質の第２のＡＢＤは、配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列のＣＤＲ １、２および３を含むＶＨであって、適宜、ＣＤＲ中の１、２、３つまたはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、ＶＨ；ならびに配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列のＣＤＲ １、２および３を含むＶＬであって、適宜、ＣＤＲ中の１、２、３つまたはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されていてもよい、ＶＬを含む。
よって、本開示の結合性タンパク質の前記第２のＡＢＤは、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドの、Ｄ１およびＤ２ドメインにわたる領域（Ｄ１およびＤ２ドメインの境界、Ｄ１／Ｄ２ジャンクションにおいて）に結合することができる。一部の実施形態において、結合性タンパク質の第２のＡＢＤのＶＨ／ＶＬペアは、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、または１０－１０Ｍ未満のＫＤにより特徴付けられる、全長ＩｇＧ抗体としての、ヒトＮＫｐ４６に対する親和性を有する。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ＳＰＲにより決定された場合に、１～１００ｎＭ、適宜１～５０ｎＭ、適宜１～２０ｎＭ、適宜約１０または１５ｎＭの、ヒトＮＫｐ４６に対する親和性（ＫＤ）を有する。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質（または、例えば多特異性タンパク質中にもしくは従来の全長抗体として構成された場合のような、そのＮＫｐ４６結合性ＡＢＤもしくはＶＨ／ＶＬペア）は、抗体ＮＫｐ４６－１と実質的に同じＮＫｐ４６上の領域、部位またはエピトープにおいてＮＫｐ４６に結合する。１つの実施形態において、エピトープのすべての鍵となる残基は、ドメインＤ１またはＤ２に対応するセグメント中にある。１つの実施形態において、抗体または多特異性タンパク質は、Ｄ１ドメイン中に存在する残基の他に、Ｄ２ドメイン中に存在する残基に結合する。１つの実施形態において、抗体は、配列番号８８のＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１／Ｄ２ジャンクションに対応するセグメント中の１、２、３、４、５、６、７つまたはより多くの残基を含むエピトープに結合する。１つの実施形態において、抗体または多特異性タンパク質は、Ｄ１／Ｄ２ドメインジャンクションにおいてＮＫｐ４６に結合し、かつ残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１および／またはＹ１９４のうちの１、２、３、４または５つを含むかまたはからなるエピトープに結合する。
ＮＫｐ４６－１の重鎖可変領域のアミノ酸配列および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の表４において提示される。
ＮＫｐ４６結合性多特異性タンパク質は、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６－１と本質的に同じエピトープまたは決定因子に結合し（ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ）、適宜、抗体は抗体ＮＫｐ４６－１の超可変領域を含む。本明細書における任意の実施形態において、抗体ＮＫｐ４６－１は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴付けられ得る。１つの実施形態において、抗体はＮＫｐ４６－１のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、抗体ＮＫｐ４６－１のヒト化されたＶＨ／ＶＬを含む。３Ｄモデリング研究に基づいて、ヒトＩｇＧ１抗体として産生される、ＮＫｐ４６－１ ＣＤＲおよびヒトフレームワークを含む異なる重鎖および軽鎖可変領域を設計し、カニクイザルＮＫｐ４６に対する結合性について試験した。重鎖および軽鎖の２つの組合せは、各々の場合において軽鎖「Ｌ１」と組み合わせた、ヒトおよびカニクイザルの両方のＮＫｐ４６：重鎖可変領域「Ｈ１」および重鎖「Ｈ３」に結合することができた。これらの交差結合性可変領域は、重鎖可変領域についてＮＫｐ４６－１重鎖ＣＤＲ（以下において下線を引いて示す）、ヒトＩＧＨＶ１－６９＊０６遺伝子フレームワーク１、２および３領域ならびにヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子フレームワーク４領域；軽鎖可変領域について、ＮＫｐ４６－１軽鎖ＣＤＲ（以下において下線を引いて示す）、ヒトＩＧＫＶ１－３３＊０１遺伝子フレームワーク１、２および３領域ならびにヒトＩＧＫＪ４＊０１遺伝子フレームワーク４領域を含んでいた。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けに従って選択した。Ｈ１、Ｈ３およびＬ１鎖は、特有のアミノ酸置換を有した（以下において太字および下線で示される）。Ｌ１は、Ｋａｂａｔ軽鎖残基８７においてフェニルアラニンを有していた。Ｈ１は、Ｋａｂａｔ重鎖残基２７においてチロシン、ならびにＫａｂａｔ残基６６および６７においてそれぞれリジンおよびアラニンを有していた。Ｈ３は、Ｋａｂａｔ残基３７においてグリシン、Ｋａｂａｔ残基４８においてイソロイシン、およびＫａｂａｔ残基９１においてフェニルアラニンを追加的に有していた。
１つの実施形態によれば、抗体は、ＮＫｐ４６－１の重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、またはそのヒト化バージョン（ＮＫｐ４６－１Ｈ１もしくはＮＫｐ４６－１Ｈ３）を含む。提供されるのはまた、ＮＫｐ４６－１の軽鎖可変領域のＣＤＲのうちの１、２もしくは３つまたはそのヒト化バージョン（ＮＫｐ４６－１Ｌ１もしくはＮＫｐ４６－１Ｌ１）をさらに含むポリペプチドである。適宜、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つまたは複数は、１、２、３、４または５またはより多くのアミノ酸改変（例えば置換、挿入または欠失）を含有してもよい。
多特異性タンパク質またはＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、例えば、
（ａ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１の重鎖可変領域（配列番号１６）；
（ｂ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１の軽鎖可変領域（ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ＮＫｐ４６－１）（配列番号１８）；
または、
（ａ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｈ１の重鎖可変領域（配列番号９３）；
（ｂ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｌ１の軽鎖可変領域（配列番号９５）；
または、
（ａ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｈ３の重鎖可変領域（配列番号９４）；
（ｂ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｌ１の軽鎖可変領域（配列番号９５）
を含むことができる。
（ａ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１の重鎖可変領域（配列番号１６）；
（ｂ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１の軽鎖可変領域（ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ＮＫｐ４６－１）（配列番号１８）；
または、
（ａ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｈ１の重鎖可変領域（配列番号９３）；
（ｂ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｌ１の軽鎖可変領域（配列番号９５）；
または、
（ａ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｈ３の重鎖可変領域（配列番号９４）；
（ｂ）１、２、３つもしくはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよいＮＫｐ４６－１Ｌ１の軽鎖可変領域（配列番号９５）
を含むことができる。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質またはＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、
（ａ）ＣＤＲ中の１、２、３つまたはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよい、以下の表に示されている、ＮＫｐ４６－１の重鎖ＣＤＲ １、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ中の１、２、３つまたはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよい、以下の表に示されている、ＮＫｐ４６－１の軽鎖ＣＤＲ １、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含むことができる。
（ａ）ＣＤＲ中の１、２、３つまたはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよい、以下の表に示されている、ＮＫｐ４６－１の重鎖ＣＤＲ １、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ中の１、２、３つまたはより多くのアミノ酸が異なるアミノ酸により適宜置換されていてもよい、以下の表に示されている、ＮＫｐ４６－１の軽鎖ＣＤＲ １、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含むことができる。
１つの実施形態において、上述のＣＤＲは、例えば以下の表に示されている、Ｋａｂａｔによるものである。１つの実施形態において、上述のＣＤＲは、例えば以下の表に示されている、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによるものである。１つの実施形態において、上述のＣＤＲは、例えば以下の表に示されている、ＩＭＧＴ番号付けによるものである。
本明細書における任意の実施形態の別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれも、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸の配列により、かつ／または、以下の対応する配列番号もしくは表において列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するとして特徴付けられてもよい。
ＩＭＧＴ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義システムによる、ＣＤＲの配列は、以下の表６において要約される。
ＩＬ２部分
一部の実施形態において、本開示の結合性タンパク質のサイトカイン部分は変異型インターロイキン－２ポリペプチドである。
一部の実施形態において、本開示の結合性タンパク質のサイトカイン部分は変異型インターロイキン－２ポリペプチドである。
サイトカイン部分は、ヒトインターロイキン－２ポリペプチドの少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または１００個の連続するアミノ酸を含む断片であり得る。ある特定の実施形態において、ＩＬ－２ポリペプチドは、例えば、非ＮＫ細胞、例えばＴｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞上に存在する受容体に対する結合親和性を減少させるために、野生型ＩＬ－２と比較して１つまたは複数のアミノ酸改変（例えばアミノ酸置換）を含むヒトサイトカインの変異型である。
適宜、シグナル伝達は、ＩＬ－２（例えば組換えタンパク質ドメインとしてまたは本開示の多特異性タンパク質内）をＮＫ細胞と接触させ、シグナル伝達を測定すること、例えばＮＫ細胞におけるＳＴＡＴリン酸化を測定することにより評価される。
１つの実施形態において、ＩＬ－２またはＣＤ１２２特異的ＡＢＤは、ＳＰＲにより決定された場合に、約１ｎｍ～約２００ｎｍ、適宜約１ｎｍ～約１００ｎｍ、適宜約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、適宜約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、適宜約１５ｎＭ～約１００ｎＭの結合親和性（ＫＤ）と共に、その受容体に結合する。
ＣＤ１２２結合性ＡＢＤは、有利には、野生型ヒトインターロイキン－２と比較してＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に対する低減された結合性（例えば、例えばＳＰＲにより決定された場合に、低減または消失された結合親和性）を有する変異型または改変型ＩＬ－２ポリペプチドである。そのような変異型または改変型ＩＬ－２ポリペプチドはまた、本明細書において「ＩＬ２ｖ」または「非アルファＩＬ－２」として参照される。ＣＤ１２２結合性ＡＢＤは、適宜、野生型ヒトＩＬ－２の場合と実質的に同等であるヒトＣＤ１２２に対する結合親和性を有するとして特定され得る。ＣＤ１２２結合性ＡＢＤは、適宜、野生型ヒトＩＬ－２の場合と実質的に同等であるＣＤ１２２シグナル伝達を誘導する能力および／またはＣＤ１２２に対する結合親和性を有するとして特定され得る。１つの実施形態において、ＣＤ１２２結合性ＡＢＤは、ＣＤ１２２に対する結合親和性における低減よりも大きいＣＤ２５に対する結合親和性における低減、例えばＣＤ２５に対する結合親和性における少なくとも１－ｌｏｇ、２－ｌｏｇまたは３－ｌｏｇの低減および１－ｌｏｇ未満のＣＤ１２２に対する結合親和性における低減を有する。
ＩＬ－２は、単量体ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）としての形態においてＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）に結合し、続いてＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２；共通γ鎖とも称される）サブユニットを動員すると考えられている。表面においてＣＤ２５を発現しない細胞において、ＣＤ１２２に対する結合性（例えば低減された結合性）は、したがって、適宜、ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体におけるまたはそれに対する結合性であるとして特定され得る。ＣＤ１２２（またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体）は、適宜、ＮＫ細胞の表面に存在するとして特定され得る。表面においてＣＤ２５を発現する細胞において、ＩＬ－２は、単量体ＩＬ－２受容体としての形態においてＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に結合し、続いてサブユニットＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγと会合すると考えられている。ＣＤ２５に対する結合性（例えば低減された結合性、部分的に低減された結合性）は、したがって、適宜、ＣＤ２５：ＣＤ１２２複合体またはＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体におけるまたはそれに対する結合性であるとして特定され得る。
本明細書における多特異性タンパク質において、多特異性タンパク質は、適宜、多特異性タンパク質が細胞（例えばＮＫ細胞、ＣＤ１２２＋ＣＤ２５－細胞）の表面においてＮＫｐ４６（および適宜さらにＣＤ１６）に結合している場合に、ＣＤ１２２ ＡＢＤ（例えばＩＬ２ｖ）が前記細胞の表面においてＣＤ１２２に結合する能力を有するように構成されているかつ／またはコンフォメーションにある（もしくはコンフォメーションを取る能力を有する）として特定され得る。適宜、さらに、多特異性タンパク質：ＣＤ１２２複合体は、前記細胞の表面においてＣＤ１３２に結合する能力を有する。
ＣＤ１２２ ＡＢＤまたはＩＬ２ｖは、改変型ＩＬ－２ポリペプチド、例えば、ＣＤ２５に対する結合性を減少させる１つまたは複数の（ｏｎｅ ｍｏｒｅ）アミノ酸置換、挿入または欠失を導入することにより改変された単量体ＩＬ－２ポリペプチドであり得る。
一部の実施形態において、ＣＤ２５に対する結合性が選択的に減少されることが求められる場合、ＩＬ－２ポリペプチドは、それを、ＣＤ２５に対する結合性のさらなる減少または消失を結果としてもたらす１つまたは複数の他の追加の分子、例えばポリマーまたは（ポリ）ペプチドと結合または会合させることにより改変され得る。例えば、野生型または突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２のＣＤ２５結合性部位をシールドするか、マスクするか、それに結合するか、またはそれと相互作用し、それによりＣＤ２５に対する結合性を減少させる別の部分を該ＩＬ－２ポリペプチドに結合させることにより改変またはさらに改変され得る。一部の例において、分子、例えばポリマー（例えばＰＥＧポリマー）は、例えばＩＬ－２ポリペプチド上の特有の部位において専用の化学的フックを含有するアミノ酸を設置するための導入（例えば置換）により、ＣＤ２５により結合されるＩＬ－２上のエピトープをシールドまたはマスクするためにＩＬ－２ポリペプチドにコンジュゲートされる。他の例において、野生型または変異型ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２のＣＤ２５結合性部位に結合するかまたはそれと相互作用し、それによりＣＤ２５に対する結合性を減少させる抗ＩＬ－２モノクローナル抗体または抗体断片に結合される。
任意の実施形態において、ＩＬ２ポリペプチドは、全長ＩＬ－２ポリペプチドであり得るか、または、断片もしくはそれを含むＩＬ２ｖが特定される活性を保持する（例えば、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、少なくとも部分的なＣＤ１２２結合性を保持する）限り、ＩＬ－２ポリペプチド断片であり得る。
本明細書において示されるように、ＩＬ２ｖポリペプチドは、有利には、ヒトＣＤ１２２に結合する少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ ａｔ ｌｅａｓｔ）一部の、または適宜実質的に完全な、能力を保持しながら、ヒトＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に結合するその能力を低減させるように設計された１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むＩＬ－２ポリペプチドを含むことができる。
ＣＤ２５＋細胞上のＩＬ－２の活性化バイアスを低減させる様々なＩＬ２ｖまたは非アルファＩＬ－２部分が記載されている。そのようなＩＬ２ｖは、ＩＬ－２Ｒαに対する結合性を低減させ、かつＩＬ－２Ｒβに対する少なくとも部分的な結合性を維持する。いくつかのＩＬ２ｖポリペプチドが記載されており、多くは、ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基領域３５～７２および／または７９～９２中に突然変異を有する。例えば、ＩＬ－２Ｒαに対する親和性の減少は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの配列中の以下の残基：Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、およびＬ７２（アミノ酸残基番号付けは、配列番号２７において示される成熟ＩＬ－２ポリペプチドを参照している）の１つまたは複数を置換することにより得られてもよい。
野生型成熟ヒトＩＬ－２
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT（配列番号２７）
３つのＮ末端残基ＡＰＡの適宜の欠失を有する「ＩＬ－２ｐ」野生型成熟ＩＬ－２：
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
（配列番号２８）
野生型成熟ヒトＩＬ－２
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT（配列番号２７）
３つのＮ末端残基ＡＰＡの適宜の欠失を有する「ＩＬ－２ｐ」野生型成熟ＩＬ－２：
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
（配列番号２８）
例示的なＩＬ２ｖ（本明細書の実施例においてもＩＬ２ｖと称される）は、適宜さらに３つのＮ末端残基ＡＰＡの欠失と共に、以下に示されるように、５つのアミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２ＧおよびＣ１２５Ａを有する野生型ＩＬ－２のアミノ酸を有することができる：
APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT（配列番号２４）
APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT（配列番号２４）
１または２つもの少ない突然変異は、ＩＬ－２ＲαおよびＬ－２Ｒβに対する結合性を低減させることができる。例えば、本明細書における多特異性タンパク質において例示されるように、野生型ヒトＩＬ－２アミノ酸配列中に２つのアミノ酸置換Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを有するＩＬ２ｖポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対する結合性の保持と共に、ＩＬ－２Ｒαに対する結合性の好適な低減を示し、本明細書においてＩＬ２ｖ２と称される、高度に活性の多特異性タンパク質を結果としてもたらした。
ＩＬ２ｖ２（Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ置換）：
ＩＬ２ｖ２（Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ置換）：
１つの実施形態において、ＩＬ２ｖ２ポリペプチドは、置換Ｃ１２５Ａ（配列番号２７の野生型成熟ヒトＩＬ－２に関して）をさらに包含することができ、これは本明細書においてＩＬ２ｖ２Ａとして参照される。
ＩＬ２Ｖ２Ａ（Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ａ置換）：
ＩＬ２Ｖ２Ａ（Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ／Ｃ１２５Ａ置換）：
１つの実施形態において、ＩＬ２ｖポリペプチドは、以下に示されるように、３つのアミノ酸置換Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＴ４１Ａ（配列番号２７の野生型成熟ヒトＩＬ－２に関して）を有する野生型ＩＬ－２ｐアミノ酸配列を有し、これは本明細書においてＩＬ２ｖ３として参照される：
ＩＬ２ｖ３（Ｒ３８Ａ／Ｔ４１Ａ／Ｆ４２Ｋ置換）：
ＩＬ２ｖ３（Ｒ３８Ａ／Ｔ４１Ａ／Ｆ４２Ｋ置換）：
そのため、１つの実施形態において、ＩＬ２変異型は、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して少なくとも１つまたは少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば置換、挿入、欠失）を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２ｖは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｒ３８置換（例えばＲ３８Ａ）およびＦ４２置換（例えば、Ｆ４２Ｋ）を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２ｖは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｒ３８置換（例えばＲ３８Ａ）、Ｆ４２置換（例えば、Ｆ４２Ｋ）およびＴ４１置換（例えばＴ４１Ａ）を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２ｖは、ヒト野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｔ３置換（例えばＴ３Ａ）、Ｆ４２置換（例えば、Ｆ４２Ａ）、Ｙ４５置換（例えばＹ４５Ａ）、Ｌ７２置換（例えばＬ７２Ｇ）およびＣ１２５置換（例えばＣ１２５Ａ）を含む。適宜、ＩＬ２ｖは、配列番号２４～２６または６５のポリペプチドと同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。適宜、ＩＬ２ｖはヒトＩＬ－２ポリペプチドの断片を含み、断片は、配列番号２４～２６または６５のポリペプチドの４０、５０、６０、７０もしくは８０個のアミノ酸の連続する配列と同一であるか、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一のアミノ配列（ａｍｉｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する。
位置の任意の組合せが改変され得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２変異型は、２つまたはより多くの改変を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２変異型は、３つまたはより多くの改変を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２変異型は、４、５、または６つまたはより多くの改変を含む。
ＩＬ２変異型ポリペプチドは、例えば、２、３、４、５、６または７つのアミノ酸改変（例えば置換）を含むことができる。例えば、米国特許第５，２２９，１０９号明細書（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ置換を有するヒトＩＬ２ポリペプチドを提供する。米国特許第９，４４７，１５９号明細書（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ置換を有するヒトＩＬ２ポリペプチドを記載している。米国特許第９，２６６，９３８号明細書（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、例えばＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を低減または消失させるための三重突然変異Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを含む、残基Ｌ７２（例えばＬ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋ）、残基Ｆ４２（例えばＦ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、およびＦ４２Ｋ）；ならびに残基Ｙ４５（例えば、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５ＲおよびＹ４５Ｋ）において置換を有するヒトＩＬ２ポリペプチドを記載している。いっそうさらに国際公開第２０２０／０５７６４６号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、アミノ酸残基Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６１およびＥ６８の間の様々な組合せにおけるアミノ酸置換を含むＩＬ－２ｖポリペプチドのアミノ酸配列に関する。いっそうさらに、国際公開第２０２０２５２４１８号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、少なくとも１つのアミノ酸残基位置Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｙ１０７、またはＣ１２５が別のアミノ酸で置換されたＩＬ－２ｖポリペプチドのアミノ酸配列に関し、例えば、アミノ酸置換は、１９位におけるＬ１９Ｄ、Ｌ１９Ｈ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｐ、Ｌ１９Ｑ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｙの置換、３８位におけるＲ３８Ａ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｇの置換、４１位におけるＴ４１Ａ、Ｔ４１Ｇ、およびＴ４１Ｖの置換、４２位におけるＦ４２Ａの置換、４４位におけるＦ４４ＧおよびＦ４４Ｖの置換、６２位におけるＥ６２Ａ、Ｅ６２Ｆ、Ｅ６２Ｈ、およびＥ６２Ｌの置換、６５位におけるＰ６５Ａ、Ｐ６５Ｅ、Ｐ６５Ｇ、Ｐ６５Ｈ、Ｐ６５Ｋ、Ｐ６５Ｎ、Ｐ６５Ｑ、Ｐ６５Ｒの置換、６８位におけるＥ６８Ｅ、Ｅ６８Ｆ、Ｅ６８Ｈ、Ｅ６８Ｌ、およびＥ６８Ｐの置換、１０７位におけるＹ１０７Ｇ、Ｙ１０７Ｈ、Ｙ１０７ＬおよびＹ１０７Ｖの置換、ならびに１２５位におけるＣ１２５Ｉの置換、１２６位におけるＱ１２６Ｅの置換からなる群から選択される。位置の番号付けは野生型成熟ヒトＩＬ－２に関する。
改変型ＩＬ－２は、その受容体に対するより低い結合親和性を有することができ、適宜、改変型ＩＬ－２は、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチド（例えば配列番号２７のアミノ酸配列を含む）のＫＤの１－ｌｏｇ、適宜２－ｌｏｇ、適宜３－ｌｏｇ以内の、ＣＤ２５に対するまたはＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する結合性についてのＫＤを呈するとして特定され得る。改変型ＩＬ－２は、適宜、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ２５またはＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する２０％、３０％、４０％または５０％未満の結合親和性を呈するとして特定され得る。ＩＬ２は、適宜、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ１２２またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する少なくとも５０％、７０％、８０％または９０％の結合親和性を呈するとして特定され得る。一部の実施形態において、ＩＬ２は、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ１２２またはＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体に対する少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％であるが１００％未満の結合親和性を呈する。一部の実施形態において、ＩＬ２ｖは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＣＤ２５に対する５０％未満の結合親和性およびＣＤ１２２に対する少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％の結合親和性を呈する。
ＣＤ２５およびＣＤ１２２ならびにその複合体に対する野生型および開示される突然変異体ポリペプチドの結合親和性における差異は、例えば、当業者が精通しているタンパク質－タンパク質相互作用の親和性を測定する標準的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおいて測定され得る。
例示的なＩＬ２変異型ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を有する野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドと比べて１つもしくはより多くの、２つもしくはより多くの、または３つもしくはより多くのＣＤ２５親和性低減性アミノ酸置換を有する。１つの実施形態において、例示的なＩＬ２ｖポリペプチドは、以下の群：Ｑ１１、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｑ２２、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９、およびＳ１３０から選択される１つもしくはより多くの、２つもしくはより多くの、または３つもしくはより多くの置換された残基を含む。
１つの実施形態において、例示的なＩＬ２変異型ポリペプチドは、アミノ酸残基位置Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｙ１０７、またはＣ１２５のうちの１、２、３、４、５またはより多くが別のアミノ酸で置換されている。
１つの実施形態において、ＣＤ２５またはそれを含むタンパク質複合体（例えば、ＣＤ２５：ＣＤ１２２：ＣＤ１３２複合体）に対する親和性の減少は、野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドの配列中の以下の残基：Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、およびＬ７２のうちの１つまたは複数を置換することにより得られてもよい。
さらに他の例において、ＩＬ－２ポリペプチドは、それを、ＣＤ２５に対する結合性の減少を結果としてもたらす１つまたは複数の他の追加の化合物、化学的化合物、ポリマー（例えばＰＥＧ）、またはポリペプチドもしくはポリペプチド鎖と接続、融合、結合または会合させることにより改変される。例えば、野生型ＩＬ－２ポリペプチドまたはその断片は、ヒトＩＬ－２のＣＤ２５結合性部位に結合するかまたはそれと相互作用し、それによりＣＤ２５に対する結合性を減少させる抗ＩＬ－２モノクローナル抗体またはその抗体断片を含むがそれに限定されない、ＣＤ２５結合性ペプチドまたはポリペプチドをそれに結合させることにより改変され得る。
他の例において、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその断片は、選択された位置において導入された天然アミノ酸または非天然アミノ酸に共有結合された対象とする部分（例えば化合物、化学的化合物、ポリマー、直鎖状または分岐鎖状ＰＥＧポリマー）をそれに結合させることにより改変され得る。そのような改変型インターロイキン２（ＩＬ－２）ポリペプチドは、改変型ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ２５との間の結合性を低減させるがＣＤ１２２：ＣＤ１３２シグナル伝達複合体に対する意義のある結合性を保持するポリペプチド上の位置において少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むことができ、ＣＤ２５に対する低減された結合性は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ２５との間の結合性と比較したものである。非天然アミノ酸は、ＩＬ－２の残基Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｌ７２、Ｍ１０４、Ｃ１０５、およびＹ１０７のうちのいずれか１つまたは複数において位置付けられ得る。ＰＣＴ国際公開第２０１９／０２８４１９号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０１４２６７号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）において開示されるように、非天然アミノ酸は、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡペアにより改変型ＩＬ－２ポリペプチド中に組み込まれ得る。非天然アミノ酸は、例えば、リジンアナログ、芳香族側鎖、アジド基、アルキン基、またはアルデヒドもしくはケトン基を含むことができる。改変型ＩＬ－２ポリペプチドは次に、水溶性ポリマー、脂質、タンパク質、またはペプチドに非天然アミノ酸を通じて共有結合され得る。好適なポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（ａ－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはその組合せ、または多糖、例えばデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、もしくはヒドロキシエチル－デンプン（ＨＥＳ）を含む。
定常ドメイン
定常領域ドメインは、定常重鎖（ＣＨ１）および軽鎖（ＣＬ、ＣκまたはＣλ）ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ならびにＣＨ３ドメインを含む、任意の好適なヒト抗体、特にはガンマアイソタイプのヒト抗体に由来することができる。
定常領域ドメインは、定常重鎖（ＣＨ１）および軽鎖（ＣＬ、ＣκまたはＣλ）ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ならびにＣＨ３ドメインを含む、任意の好適なヒト抗体、特にはガンマアイソタイプのヒト抗体に由来することができる。
重鎖定常ドメインに関して、「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って１１８～２２０位を一般に指す。文脈に依存して、ＣＨ１ドメイン（例えばドメイン配置において示されている）は、適宜、ＣＨ１がヒンジ領域の少なくとも部分を含むようにヒンジ領域中に伸長した残基を含むことができる。例えば、ポリペプチド鎖上のＣ末端および／またはＦｃドメインのＣ末端、および／またはＦｃドメインであるかもしくはそのＣ末端にあるＦａｂ構造内に位置付けられた場合に、ＣＨ１ドメインは、適宜、ヒンジ領域の少なくとも部分を含むことができ、例えば、ＣＨ１ドメインは、少なくとも上ヒンジ領域、例えばヒトＩｇＧ１ヒンジの上ヒンジ領域を含むことができ、適宜さらに、上ヒンジの末端スレオニンはセリンにより置き換えられ得る。そのようなＣＨ２ドメインは、したがって、そのＣ末端においてアミノ酸配列：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＳを含むことができる。
例示的なヒトＣＨ１ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV（配列番号１２）
例示的なヒトＣκドメインアミノ酸配列は以下を含む：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４）
例示的なヒトＣＨ１ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV（配列番号１２）
例示的なヒトＣκドメインアミノ酸配列は以下を含む：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４）
一部の例示的な構成において、多特異性タンパク質は、可変領域、ＣＨ１および／またはＣＬドメインが、ＣＫドメインとのＣＨ１ドメインの所望される鎖対合を促進するためにノブ－イントゥー－ホールまたは静電ステアリングアプローチにおいてアミノ酸置換を導入することにより操作された１または２つのＦａｂ（例えば１つのＦａｂはＮＫｐ４６に結合し、他方はＣＤ２０に結合する）を含むヘテロ二量体またはヘテロ三量体であり得る。一部の例示的な構成において、多特異性タンパク質は、ＦａｂがＶＨ／ＶＬクロスオーバー（ＶＨおよびＶＬが互いに置き換わっている）またはＣＨ１／ＣＬクロスオーバー（ＣＨ１およびＣＬが互いに置き換わっている）を有し、かつＣＨ１および／またはＣＬドメインが、ノブ－イントゥー－ホールまたは静電ステアリングにより正確な鎖会合を促進するためのアミノ酸置換を含む、１または２つのＦａｂ（例えば１つのＦａｂはＮＫｐ４６に結合し、他方はＣＤ２０に結合する）を含むヘテロ二量体、またはヘテロ三量体であり得る。
「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って２３７～３４０位を一般に指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って３４１～４４７位を一般に指す。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、任意の好適な抗体に由来することができる。そのようなＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、野生型ドメインとして使用可能であるか、または改変されたＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインのための基礎として役立ち得る。適宜、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ヒト起源であるか、または別の種（例えば、齧歯動物、ウサギ、非ヒト霊長動物）のものを含んでもよいか、または改変されているかもしくはキメラのＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメイン、例えば、異なる抗体アイソタイプもしくは種の抗体からの、異なるＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインからの部分もしくは残基を含むものを含んでもよい。
例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK（配列番号７）
例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号８）
例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK（配列番号７）
例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号８）
ドメイン配置のいずれにおいても、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ２－ＣＨ３単位（全長ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその断片）を含んでもよい。Ｆｃドメイン単量体を有する２つの鎖を含むヘテロ二量体またはヘテロ三量体（すなわちヘテロ二量体またはヘテロ三量体はＦｃドメイン二量体を含む）において、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３－ＣＨ３二量体化の能力を有する（例えば、それは、野生型ＣＨ３ドメインまたは所望されるＣＨ３－ＣＨ３二量体化を促進するための改変を有するＣＨ３ドメインを含む）。Ｆｃドメインは、適宜、Ｃ末端リジン（Ｋ）をさらに含んでもよい（配列番号６を参照）。
例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３（Ｆｃ）ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号６）
または
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１４）
例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３（Ｆｃ）ドメインアミノ酸配列は以下を含む：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号６）
または
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１４）
一部の例示的な構成において、多特異性タンパク質は、ポリペプチド鎖が、所望されるタンパク質を生成するように互いの間でのヘテロ二量体化のために操作されている、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体であり得る。所望される鎖対合がＣＨ１－Ｃκ二量体化により駆動されないか、または対合の増強が所望される実施形態において、鎖は、２つの異なる鎖の優先的なヘテロ二量体化を２つの同一の鎖のホモ二量体化よりも助長する、アミノ酸改変（例えば、置換）を有する定常またはＦｃドメインを含んでもよい。
一部の実施形態において、「ノブ－イントゥー－ホール」アプローチが使用され、該アプローチにおいて、抗体が優先的にヘテロ二量体化するようにドメインインターフェース（例えば抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインインターフェース）は突然変異される。これらの突然変異はインターフェース（例えばＦｃ二量体インターフェース）間の電荷極性の変更を作出し、その結果、静電気的にマッチした鎖（例えばＦｃ含有鎖）の共発現は好都合な誘引性相互作用をサポートし、それにより、所望されるヘテロ二量体（例えばＦｃヘテロ二量体）形成が促進される一方、不都合な反発的電荷相互作用は、望ましくないヘテロ二量体（例えば、Ｆｃホモ二量体）形成を抑制する。例えば、Brinkmann and Kontermann, 2017 MAbs, 9(2): 182-212（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において総説されている突然変異およびアプローチを参照。例えば、１つの重鎖はＴ３６６Ｗ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含む。例えば、Ridgway et al (1996) Protein Eng., 9, pp. 617-621; Atwell (1997) J. Mol. Biol., 270, pp. 26-35；および国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖はＦ４０５Ｌ置換を含み、かつ第２の重鎖はＫ４０９Ｒ置換を含む。例えば、Labrijn et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110, pp. 5145-5150を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｓ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ置換を含む。例えば、Von Kreudenstein et al., (2013) mAbs 5:646-654を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｋ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄの両方の置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｄ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋの両方の置換を含む。例えば、Gunasekaran et al., (2010) J. Biol. Chem. 285:19637-19646を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒ置換を含む。例えば、Strop et al., (2012) J. Mol. Biol. 420: 204-219を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖は、Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ置換を含み、かつ第２の重鎖は、Ｙ３４９Ｔおよび、Ｔ３９４Ｆ置換を含む。例えば、Moore et al., (2011) mAbs 3: 546-557を参照。別のアプローチにおいて、１つの重鎖はＨ４３５Ｒ置換を含み、かつ第２の重鎖は、適宜、置換を含んでもよく、または含まなくてもよい。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号明細書を参照。そのようなヘテロ多量体抗体が、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を有する場合、これらの抗体のＦｃ領域は、ＣＤ１６結合性を可能にするアミノ酸改変を含有するように操作され得る。一部の実施形態において、抗体は、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）において哺乳動物抗体タイプＮ結合型グリコシル化を含んでもよい。
一部の実施形態において、ジスルフィド結合の１つまたは複数のペア、例えばＡ２８７ＣおよびＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９ＣおよびＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃ、ならびにＶ３２３ＣおよびＩ３３２Ｃが、安定性を増加させるために、例えばさらに、他のＦｃ改変により引き起こされる安定性の喪失に対して（ｔｏ ａ ｌｏｓｓ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、Ｆｃ領域中に導入される。追加の例は、Ｆｃ安定性および凝集抵抗性を増強するためにＫ３３８Ｉ、Ａ３３９Ｋ、およびＫ３４０Ｓ突然変異を導入することを含む（Gao et al, 2019 Mol Pharm. 2019;16:3647）。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質（ｗｈｅｒｅ ａ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ヒトＦｃガンマ受容体に対する低減された結合性を有することが意図される。一部の実施形態において、多特異性タンパク質が、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する低減された結合性（ならびに適宜さらに、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４に対する低減された結合性）を有することが意図される場合、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、適宜さらに、Ｆｃドメインは、ヒンジジスルフィドを安定化させるためのＳ２２８Ｐ突然変異を含む。
実施形態において、多特異性タンパク質が、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する低減された結合性（ならびに適宜さらに、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４に対する低減された結合性）を有することが意図される場合、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメイン（またはそれを含むＦｃドメイン）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）に対する結合性を減少または消失させるための改変を含んでもよい。例えば、Ｆｃドメイン二量体タンパク質中の残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＣＨ２突然変異は、ＣＤ１６Ａ結合性を実質的に排除することができる。しかしながら、他の構成が実行され得ることを当業者は理解する。例えば、２３４～２３７位におけるヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２残基中へのならびに／または３２７、３３０および３３１位における残基中への置換は、Ｆｃγ受容体に対する結合性、ならびにそのためＡＤＣＣおよびＣＤＣを大きく低減させることが示された。さらには、Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164(8):4178-84は、Ｋ３２２を含む、異なる位置におけるアラニン置換は、補体活性化を有意に低減させることを実証した。
１つの実施形態において、Ｋａｂａｔ重鎖残基２９７におけるアスパラギン（Ｎ）は、アスパラギン以外の残基（例えばセリン）により置換され得る。
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を低減させるために改変されたＦｃドメインは、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０および３３１におけるＦｃドメイン中の置換を含む。１つの実施形態において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブタイプのものである。アミノ酸残基は、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けに従って指し示される。
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を低減させるために改変されたＦｃドメインは、Ｋａｂａｔ残基２３３～２３７のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸改変（例えば置換）、ならびにＫａｂａｔ残基３３０および／または３３１におけるアミノ酸改変（例えば置換）を含む。そのようなＦｃドメインの１つの例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０およびＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する低いまたは低減された結合性を有するＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、以下のアミノ酸配列（Ｎ２９７Ｓ置換を有するヒトＩｇＧ１）、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有する。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号８９）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号８９）
１つの実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する結合性を低減させるために改変されたＦｃドメインは、以下のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一であるが、Ｋａｂａｔ ２３４、２３５、２３７、３３０および３３１位（下線）におけるアミノ酸残基を保持するアミノ酸配列を有するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む：
上記のＦｃドメイン配列のいずれも、適宜、天然に存在する配列におけるように、Ｃ末端リジン（Ｋ）をさらに含むことができる。
ＣＤ１６（ＣＤ１６Ａ）に対する結合性が所望される本明細書におけるある特定の実施形態において、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメイン（またはそれを含むＦｃドメイン）は、野生型ドメインであってもよいか、またはヒトＣＤ１６および適宜別の受容体、例えばＦｃＲｎに対する結合性を増加させる１つもしくは複数のアミノ酸改変（例えばアミノ酸置換）を含んでもよい。適宜、改変は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、例えばヒトＦｃＲｎに結合するＦｃ由来ポリペプチドの能力を実質的に減少も消失もさせない。典型的な改変は、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば置換、欠失、挿入）、および／または変更されたタイプのグリコシル化、例えば、低フコシル化を含む改変されたヒトＩｇＧ１由来定常領域を含む。そのような改変は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響することができる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ １６）は活性化（すなわち、免疫系増強）受容体であり、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害（すなわち、免疫系減弱）受容体である。改変は、例えば、エフェクター（例えばＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａに対するＦｃドメインの結合を増加させ、かつ／またはＦｃγＲＩＩＢに対する結合性を減少させるものであってもよい。改変の例は、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０４４６８６号パンフレット（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において提供されている。ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃＲｎ結合性に影響する（それを増強する）特有の突然変異（ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン中）もまた以下に記載される。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｆｃ領域のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変を有する）変異型Ｆｃ領域を含み、改変はヒトＣＤ１６ポリペプチドに対する結合性を増強する。他の実施形態において、多特異性タンパク質は、アミノ酸２３７～３４１のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中に、または残基２３１～３４１を含む下ヒンジ－ＣＨ２領域内に少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含む。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含み、そのような改変のうちの少なくとも１つはＣＨ３領域内にあり、かつ少なくとも１つのそのような改変はＣＨ２領域内にある。包含されるのはまた、ヒンジ領域中のアミノ酸改変である。１つの実施形態において、包含されるのは、ＣＨ１ドメイン中、適宜、残基２１６～２３０（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）を含む上ヒンジ領域中のアミノ酸改変である。Ｆｃ改変の任意の好適な機能的な組合せ、例えば、米国特許第７，６３２，４９７号明細書；同第７，５２１，５４２号明細書；同第７，４２５，６１９号明細書；同第７，４１６，７２７号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書および同第６，７３７，０５６号明細書；ならびに／またはＰＣＴ国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；国際公開第２００８／１０５８８６号パンフレット；国際公開第２００８／００２９３３号パンフレット；国際公開第２００７／０２１８４１号パンフレット；国際公開第２００７／１０６７０７号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０５／１１５４５２号パンフレット；国際公開第０５／１１０４７４号パンフレット；国際公開第０４／１０３２２６９号パンフレット；国際公開第００／４２０７２号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０７／０２４２４９号パンフレット；国際公開第０５／０４７３２７号パンフレット；国際公開第０４／０９９２４９号パンフレットおよび国際公開第０４／０６３３５１号パンフレット；ならびに／またはLazar et al. (2006) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103(11): 405-410; Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740およびShields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604のいずれかにおいて開示されている異なるＦｃ改変の任意の組合せを行うことができる。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、その結果、分子は、野生型Ｆｃ領域を含む同じ分子と比べてヒトＣＤ１６に対する増強された結合親和性を有し、適宜、変異型Ｆｃ領域は、２２１、２３９、２４３、２４７、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１６、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７０、３７３、３７６、３７８、３９２、３９６、３９９、４０２、４０４、４１６、４１９、４２１、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および／または４３９（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）のうちのいずれか１つまたは複数の位置における置換を含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、その結果、分子は、野生型Ｆｃ領域を含む分子と比べてヒトＣＤ１６に対する増強された結合親和性を有し、適宜、変異型Ｆｃ領域は、２３９、２９８、３３０、３３２、３３３および／または３３４のうちのいずれか１つまたは複数の位置における置換（例えばＳ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａおよび／またはＫ３３４Ａ置換）を含み、適宜、変異型Ｆｃ領域は、残基Ｓ２３９およびＩ３３２における置換、例えばＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ置換（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）を含む。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７におけるＮ結合型グリコシル化を含むＦｃドメインを含む。一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ヒトＣＤ１６に対する結合親和性を増加させる変更されたグリコシル化パターンを含むＦｃドメインを含む。そのような炭水化物改変は、例えば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で多特異性タンパク質をコードする核酸を発現させることにより達成され得る。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野において公知であり、組換え抗体を発現し、それにより、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として使用され得る。例えば、Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1の他に、欧州特許第１１７６１９５号明細書；ＰＣＴ国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；国際公開第９９／５４３４２号パンフレット（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。１つの態様において、多特異性タンパク質は、１つまたは複数の低フコシル化された定常領域を含有する。そのような多特異性タンパク質は、アミノ酸変更を含んでもよいか、もしくはアミノ酸変更を含まなくてもよく、かつ／または低フコシル化を結果としてもたらす条件下で発現もしくは合成もしくは処理されてもよい。１つの態様において、多特異性タンパク質組成物は、組成物中の抗体種のうちの少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８５、９０、９５％または実質的にすべてが、フコースを欠いたコア炭水化物構造（例えば複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）を含む定常領域を有する、本明細書において記載される多特異性タンパク質を含む。１つの実施形態において、提供されるのは、フコースを有するコア炭水化物構造を含むＮ結合型グリカンを含まない多特異性タンパク質組成物である。コア炭水化物は好ましくはＡｓｎ２９７における糖鎖である。
適宜、Ｆｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、例えば、表面プラズモン共鳴により評価された場合に、従来的なヒトＩｇＧ１抗体の場合の１－ｌｏｇ以内のヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する結合親和性を有することにより特徴付けられ得る。
１つの実施形態において、Ｆｃ受容体結合性を増強するためにＦｃドメインが操作されているＦｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、例えば、表面プラズモン共鳴により評価された場合に、従来的なまたは野生型のヒトＩｇＧ１抗体の場合よりも少なくとも１－ｌｏｇ高いヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに対する結合親和性を有することにより特徴付けられ得る。
１つの実施形態において、Ｆｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、例えば、表面プラズモン共鳴により評価された場合に、従来的なヒトＩｇＧ１抗体の場合の１－ｌｏｇ以内のヒトＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）ポリペプチドに対する結合親和性を有することにより特徴付けられ得る。
適宜、Ｆｃドメイン二量体を含む多特異性タンパク質は、表面プラズモン共鳴［例えば、本明細書中の実施例におけるように、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上に固定化された二特異性抗体および固定化された二特異性抗体上に注入される可溶性ＣＤ１６ポリペプチドの段階希釈液を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行われるＳＰＲ測定により評価された場合に、１０－５Ｍ（１０μモル濃度）未満、適宜１０－６Ｍ（１μモル濃度）未満のヒトＦｃ受容体ポリペプチド（例えば、ＣＤ１６Ａ）に対する結合性（一価）についてのＫｄにより特徴付けられ得る。
接続およびリンカー
一般に、組換え技術により生成される、伝統的なペプチド結合を含む、多特異性タンパク質において使用され得る多数の好適なリンカーがある。一部の実施形態において、リンカーは「ドメインリンカー」であり、これは、本明細書において概説されている任意の２つのドメインを連結して一緒にするために使用される。隣接するタンパク質ドメインは、ドメインリンカーにより互いに接続または融合されているとして特定され得る。例示的なドメインリンカーは、（ポリ）ペプチドリンカー、適宜、柔軟性（ポリ）ペプチドリンカーである。本明細書において交換可能に使用されるペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、特定のドメイン、例えばヒンジ、ＣＨ１もしくはＣＬドメインに由来する部分配列を有してもよいか、または以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、もしくはＴｈｒを主に含んでもよい。リンカーペプチドは、２つの分子が所望される活性を保持するように互いに対して正確なコンフォメーションを取るような仕方で該２つの分子を連結するために十分な長さを有するべきである。１つの実施形態において、リンカーは、約１～５０アミノ酸の長さ、好ましくは約２～３０アミノ酸の長さである。１つの実施形態において、４～２０アミノ酸の長さのリンカーが使用されてもよく、約５～約１５個のアミノ酸は一部の実施形態において用途を有する。任意の好適なリンカーが使用され得るが、多くの実施形態において、リンカー（例えば柔軟性リンカー）は、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＳＳ）ｎ、（ＧＳＳＳＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎ［ｎは少なくとも１の整数である（適宜、ｎは、１、２、３または４である）］を含む、グリシン－セリンポリペプチドまたはポリマー、グリシン－アラニンポリペプチド、アラニン－セリンポリペプチド、および他の柔軟性リンカーを利用することができる。グリシンおよびセリン残基を含むリンカーは、プロテアーゼ耐性を一般に提供する。（ＧＳ）１リンカーの１つの例は、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するリンカーであり；そのようなリンカーは、ドメインをＦｃドメイン（またはそのＣＨ３ドメイン）のＣ末端に融合させるために有用であり得る。一部の実施形態において、例えば、ｎ＝１～２０である（Ｇ２Ｓ）ｎ、例えば、（Ｇ２Ｓ）、（Ｇ２Ｓ）２、（Ｇ２Ｓ）３、（Ｇ２Ｓ）４、（Ｇ２Ｓ）５、（Ｇ２Ｓ）６、（Ｇ２Ｓ）７もしくは（Ｇ２Ｓ）８、または、例えば、ｎが１～１５の整数である（Ｇ３Ｓ）ｎを含むペプチドリンカーが使用される。１つの実施形態において、ドメインリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドを含み、例えば、ｎは、１～１０、適宜１～６、適宜１～４の整数である。一部の実施形態において、（ＧＳ２）ｎ、（ＧＳ３）ｎまたは（ＧＳ４）ｎを含むペプチドリンカーが使用され、例えば、ｎ＝１～２０であり、例えば、（ＧＳ２）、（ＧＳ２）２、（ＧＳ２）３、（ＧＳ３）１、（ＧＳ３）２、（ＧＳ３）３、（ＧＳ４）１、（ＧＳ４）２、（ＧＳ４）３であり、例えば、ｎは１～１５の整数である。１つの実施形態において、ドメインリンカーは、（ＧＳ４）ｎペプチドを含み、例えば、ｎは、１～１０、適宜１～６、適宜１～４の整数である。１つの実施形態において、ドメインリンカーはＣ末端ＧＳジペプチドを含み、例えば、リンカーは、（ＧＳ４）を含み、かつアミノ酸配列ＧＳＳＳＳ（配列番号２０）、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳ（配列番号２１）、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号２２）またはＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳ（配列番号２３）を有する。
一般に、組換え技術により生成される、伝統的なペプチド結合を含む、多特異性タンパク質において使用され得る多数の好適なリンカーがある。一部の実施形態において、リンカーは「ドメインリンカー」であり、これは、本明細書において概説されている任意の２つのドメインを連結して一緒にするために使用される。隣接するタンパク質ドメインは、ドメインリンカーにより互いに接続または融合されているとして特定され得る。例示的なドメインリンカーは、（ポリ）ペプチドリンカー、適宜、柔軟性（ポリ）ペプチドリンカーである。本明細書において交換可能に使用されるペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、特定のドメイン、例えばヒンジ、ＣＨ１もしくはＣＬドメインに由来する部分配列を有してもよいか、または以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、もしくはＴｈｒを主に含んでもよい。リンカーペプチドは、２つの分子が所望される活性を保持するように互いに対して正確なコンフォメーションを取るような仕方で該２つの分子を連結するために十分な長さを有するべきである。１つの実施形態において、リンカーは、約１～５０アミノ酸の長さ、好ましくは約２～３０アミノ酸の長さである。１つの実施形態において、４～２０アミノ酸の長さのリンカーが使用されてもよく、約５～約１５個のアミノ酸は一部の実施形態において用途を有する。任意の好適なリンカーが使用され得るが、多くの実施形態において、リンカー（例えば柔軟性リンカー）は、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＳＳ）ｎ、（ＧＳＳＳＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎ［ｎは少なくとも１の整数である（適宜、ｎは、１、２、３または４である）］を含む、グリシン－セリンポリペプチドまたはポリマー、グリシン－アラニンポリペプチド、アラニン－セリンポリペプチド、および他の柔軟性リンカーを利用することができる。グリシンおよびセリン残基を含むリンカーは、プロテアーゼ耐性を一般に提供する。（ＧＳ）１リンカーの１つの例は、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するリンカーであり；そのようなリンカーは、ドメインをＦｃドメイン（またはそのＣＨ３ドメイン）のＣ末端に融合させるために有用であり得る。一部の実施形態において、例えば、ｎ＝１～２０である（Ｇ２Ｓ）ｎ、例えば、（Ｇ２Ｓ）、（Ｇ２Ｓ）２、（Ｇ２Ｓ）３、（Ｇ２Ｓ）４、（Ｇ２Ｓ）５、（Ｇ２Ｓ）６、（Ｇ２Ｓ）７もしくは（Ｇ２Ｓ）８、または、例えば、ｎが１～１５の整数である（Ｇ３Ｓ）ｎを含むペプチドリンカーが使用される。１つの実施形態において、ドメインリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドを含み、例えば、ｎは、１～１０、適宜１～６、適宜１～４の整数である。一部の実施形態において、（ＧＳ２）ｎ、（ＧＳ３）ｎまたは（ＧＳ４）ｎを含むペプチドリンカーが使用され、例えば、ｎ＝１～２０であり、例えば、（ＧＳ２）、（ＧＳ２）２、（ＧＳ２）３、（ＧＳ３）１、（ＧＳ３）２、（ＧＳ３）３、（ＧＳ４）１、（ＧＳ４）２、（ＧＳ４）３であり、例えば、ｎは１～１５の整数である。１つの実施形態において、ドメインリンカーは、（ＧＳ４）ｎペプチドを含み、例えば、ｎは、１～１０、適宜１～６、適宜１～４の整数である。１つの実施形態において、ドメインリンカーはＣ末端ＧＳジペプチドを含み、例えば、リンカーは、（ＧＳ４）を含み、かつアミノ酸配列ＧＳＳＳＳ（配列番号２０）、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳ（配列番号２１）、ＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号２２）またはＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳ（配列番号２３）を有する。
ペプチドまたはドメインリンカーのいずれも、少なくとも４残基、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、またはより多くの残基の長さを含むように特定されてもよい。他の実施形態において、リンカーは、２～４残基、２～４残基、２～６残基、２～８残基、２～１０残基、２～１２残基、２～１４残基、２～１６残基、２～１８残基、２～２０残基、２～２２残基、２～２４残基、２～２６残基、２～２８残基、２～３０残基、２～５０残基、または１０～５０残基の長さを含む。
ポリペプチドリンカーの例は、ＣＨ１またはＣＬドメインからの配列断片を含んでもよく；例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の４～１２または５～１２個のアミノ酸残基は、ｓｃＦｖ部分の連結における使用のために特に有用である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣＫまたはＣλに由来することができる。リンカーは、例えばＣｙ１、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４およびＣμを含む、任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来することができる。リンカー配列はまた、他のタンパク質、例えばＩｇ様タンパク質（例えばＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質からの他の天然配列に由来してもよい。ある特定のドメイン配置において、ＶＨおよびＶＬドメインは、リンカーペプチドにより分離されてタンデムに別のドメインに連結しており（例えばｓｃＦｖ）、次いでＦｃドメイン（またはそのＣＨ２ドメイン）のＮまたはＣ末端に融合している。そのようなタンデム可変領域またはｓｃＦｖは、Ｆｃドメインにヒンジ領域もしくはその部分、ＣＨ１もしくはＣＬドメインのＮ末端断片、またはグリシンおよびセリン含有柔軟性ポリペプチドリンカーを介して接続され得る。
Ｆｃドメインは、他のドメインに、任意の好適な連結性アミノ酸配列を含む、免疫グロブリン由来配列を介してまたは非免疫グロブリン配列を介して接続され得る。有利には、免疫グロブリン由来配列は、ＣＨ１またはＣＬドメインとＦｃドメインとの間で容易に使用可能であり、これは特に、ＣＨ１またはＣＬドメインがそのＣ末端においてＦｃドメイン（またはＣＨ２ドメイン）のＮ末端に融合される場合に該当する。免疫グロブリンヒンジ領域またはヒンジ領域の部分は、ポリペプチド鎖上でＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在することができ、そしてそれが一般的である。ヒンジまたはその部分はまた、ＣＬがポリペプチド鎖上でＦｃドメインに隣接している場合に、ポリペプチド鎖上でＣＬ（例えばＣκ）ドメインとＦｃドメインのＣＨ２ドメインとの間に置かれ得る。しかしながら、ヒンジ領域は、適宜、例えば、好適なリンカーペプチド、例えば柔軟性ポリペプチドリンカーにより置き換えられ得ることが理解される。
ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびＣ１２２ ＡＢＤ（例えば、サイトカイン）は、有利には、多特異性タンパク質の残部に（例えばまたはその定常ドメインもしくはＦｃドメインに）、従来的な（例えば野生型全長ヒトＩｇＧ）抗体と比較してより低い構造的剛性または堅さに繋がる柔軟性リンカー（例えばポリペプチドリンカー）（例えばＡＢＤとＦｃドメインとの間または中で）を介して連結される。例えば、多特異性タンパク質は、従来的な（例えば野生型全長ヒトＩｇＧ）抗体中の２つのＡＢＤと比較してドメイン運動の範囲の増加を可能にする構造または柔軟性リンカーをＮＫｐ４６ ＡＢＤと定常ドメインまたはＦｃドメインとの間に有してもよい。特に、構造または柔軟性リンカーは、従来的なヒトＩｇＧ１抗体中の抗原結合性部位と比較してより大きい鎖内ドメイン運動を抗原結合性部位に付与するように構成され得る。剛性またはドメイン運動／鎖間ドメイン運動は、例えば、コンピュータモデリング、電子顕微鏡法、分光法、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶学、またはリンカーもしくはヒンジを含むタンパク質の回転運動の半径を測定もしくは比較するための沈降速度分析超遠心分離（Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（ＡＵＣ）により決定され得る。試験タンパク質またはリンカーは、試験タンパク質が、比較用タンパク質、例えば、ＩｇＧ１抗体またはヒンジの値から、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％異なる、先行する一文において記載される試験のうちの１つから得られた値を有する場合に、比較用タンパク質と比べてより低い剛性を有し得る。サイトカインは、例えば、配列番号２０～２３のいずれかのリンカーによりＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤおよびＣＤ２０に結合するＡＢＤが、前記ＡＢＤの間に約８０オングストローム未満、約６０オングストローム未満または約４０～６０オングストロームの範囲を含む間隔を有することを可能にするＮＫｐ４６ ＡＢＤとＦｃドメインとの間の構造または柔軟性リンカーを有してもよい。
そのＣ末端において、Ｆｃドメイン（またはそのＣＨ３ドメイン）は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤまたはサイトカインポリペプチドのＮ末端にポリペプチドリンカー、例えばグリシン－セリン含有リンカー、適宜アミノ酸配列ＳＴＧＳ（配列番号１５）を有するリンカーを介して接続され得る。
ある特定の実施形態において、Ｆａｂ（例えばＮＫｐ４６ ＡＢＤ）のＣＨ１またはＣＬドメインは、そのＣ末端においてサイトカインのＮ末端に柔軟性ポリペプチドリンカー、例えばグリシン－セリン含有リンカーを介して融合される。好ましくは、リンカーは、少なくとも４個のアミノ酸残基の鎖長を有し、適宜、リンカーは、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基の長さを有する。
ある特定の実施形態において、ＮＫｐ４６ ＡＢＤは、ＦｃドメインのＣ末端に置かれており、かつＮＫｐ４６は、多特異性タンパク質中でＦｃドメインとサイトカインポリペプチドとの間に位置付けられている。ＮＫｐ４６ ＡＢＤは、そのＮ末端（ＶＨまたはＶＬドメインのＮ末端）においてＦｃドメインのＣ末端に十分な長さのリンカー（例えばグリシンおよびセリン含有リンカー、配列ＳＴＧＳを有するリンカー、柔軟性ポリペプチドリンカー）を介して接続または融合しており、それにより、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、ＮＫ細胞の表面においてＮｋｐ４６に結合することを可能にするような仕方でフォールディングおよび／または配向性を取ると同時に、隣接するＦｃドメイン（またはより一般には多特異性タンパク質の残部）に対して十分な距離および運動の範囲を有し、その結果、Ｆｃドメインが、同じＮＫ細胞の表面において発現されるＣＤ１６により同時に見出され得ることを可能にする。追加的に、ＮＫｐ４６ ＡＢＤが多特異性タンパク質中でＦｃドメインとサイトカインポリペプチドとの間に置かれている場合、ｓｃＦｖ ＮＫｐ４６ ＡＢＤのＶＨもしくはＶＬのＣ末端、またはＦａｂ ＮＫｐ４６ ＡＢＤのＣＨ１もしくはＣＬドメインは、サイトカインポリペプチドのＮ末端に十分な長さの柔軟性リンカー（例えば柔軟性ポリペプチドリンカー）を介して接続または融合しており、それにより、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤは、ＮＫ細胞の表面においてＮｋｐ４６に結合することを可能にするような仕方でフォールディングおよび／または配向性を取ると同時に、隣接するサイトカインポリペプチドに対して十分な距離および運動の範囲を提供し、その結果、サイトカインポリペプチドがまた、ＮＫ細胞の表面において発現されるそのサイトカイン受容体により同時に結合され得ることを可能にする。好ましくは、リンカーは、少なくとも４個のアミノ酸残基の鎖長を有し、適宜、リンカーは、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基の長さを有する。
タンデム可変領域（例えばｓｃＦｖ）中で、２つのＶドメイン（例えばＶＨドメインおよびＶＬドメイン）は、ＡＢＤが、ＡＢＤが結合することが意図される抗原に結合することを可能にするような仕方でフォールディングすることを可能にするために十分な長さのリンカーにより一般に連結して一緒にされる。リンカーの例は、グリシンおよびセリン残基を含むリンカー、例えば、アミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤ（配列番号９６）を含む。別の特有の実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３により連結して一緒にされる。
１つの実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬドメインをＦｃドメインのＣＨ２ドメインに連結するために使用される（ポリ）ペプチドリンカーは、ＣＨ１ドメインもしくはＣＬドメインおよび／またはヒンジ領域の断片を含む。例えば、ＣＨ１のＮ末端アミノ酸配列は、野生型抗体の天然の構造に可能な限り近い構造を模倣するために可変ドメインに融合され得る。１つの実施形態において、リンカーは、ヒンジドメインまたはＮ末端ＣＨ１アミノ酸からのアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、リンカーペプチドは、定型的なＶＫ－ＣＫエルボージャンクションを模倣し、例えば、リンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含むかまたはからなる。
１つの実施形態において、ＣＨ１またはＣＫドメイン（例えばＦａｂのＣＨ１またはＣＫドメイン）のＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端と接続するために使用されるヒンジ領域は、ヒンジ領域の断片（例えばシステイン残基を有しない切断されたヒンジ領域）であるか、またはシステイン残基、適宜、ヒンジ領域中の両方のシステイン残基を除去する（例えば別のアミノ酸により置換するか、もしくは欠失させる）１つもしくは複数のアミノ酸改変を含んでもよい。システインの除去は、望ましくないジスルフィド結合形成、例えば、単量体ポリペプチド中のジスルフィドブリッジの形成を予防するために有用であり得る。
本明細書における「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」は、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間の柔軟なポリペプチドまたはリンカーを指す。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ ２２０位において終了し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインはＥＵ ２３７位の残基において始まる。そのため、ＩｇＧのためにヒンジは２２１位（ＩｇＧ１中のＤ２２１）～２３６位（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を一般に含み、番号付けはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによるものである。ポリペプチド内に見出される定常領域ドメイン内の特有のアミノ酸残基に対する参照は、他に指し示されなければまたは他に文脈に矛盾しなければ、ＩｇＧ抗体の文脈において、Ｋａｂａｔに従って定義される。
例えば、ヒンジドメインは、アミノ酸配列：ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）、もしくはそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１３）、もしくはそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列；またはＥＰＫＳＣＤＫＴＨＳ（配列番号１９）、もしくはそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％もしくは９０％同一のアミノ酸配列を含んでもよい。
非共有結合を介して互いと二量体化および会合するポリペプチド鎖は、それぞれのＣＨ１およびＣκドメインの間、および／または鎖上のそれぞれのヒンジドメインの間に形成される鎖間ジスルフィド結合により追加的に結合していてもよく、またはそうでなくてもよい。ＣＨ１、Ｃκおよび／またはヒンジドメイン（または他の好適な連結性アミノ酸配列）は、適宜、鎖の所望される対合が助長され、かつ望ましくないまたは不正確なジスルフィド結合形成が回避されるように鎖間ジスルフィド結合が鎖の間に形成されるように構成され得る。例えば、対合すべき２つのポリペプチド鎖が各々、ヒンジドメインに隣接するＣＨ１またはＣκを有する場合、それぞれのＣＨ１／Ｃκ－ヒンジセグメントの間の鎖間ジスルフィド結合形成のために利用可能なシステインの数が低減される（または完全に排除される）ようにポリペプチド鎖は構成され得る。例えば、それぞれのＣＨ１、Ｃκおよび／またはヒンジドメインのアミノ酸配列は、ポリペプチドのＣＨ１／Ｃκおよびヒンジドメインの両方におけるシステイン残基を除去するために改変可能であり；それにより、二量体化する２つの鎖のＣＨ１およびＣκドメインは非共有結合性相互作用を介して会合する。
別の例において、ヒンジドメインに隣接する（例えば、Ｎ末端にある）ＣＨ１またはＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有するシステインを含み、かつＣＨ１またはＣκのＣ末端に置かれたヒンジドメインは、ヒンジの１つまたは両方のシステイン（例えばＫａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジについて番号付けされた場合にＣｙｓ ２３９およびＣｙｓ ２４２）の欠失または置換を含む。
別の例において、ヒンジドメインに隣接する（例えば、Ｎ末端にある）ＣＨ１またはＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有するシステイン残基において欠失または置換を含み、かつＣＨ１またはＣκのＣ末端に置かれたヒンジドメインは、ヒンジの１つまたは両方のシステイン（例えばＫａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジについて番号付けされた場合にＣｙｓ ２３９およびＣｙｓ ２４２）を含む。
別の例において、ヒンジ領域はＩｇＭ抗体に由来する。そのような実施形態において、ＣＨ１／ＣＫ対合は、ＩｇＭ抗体におけるＣμ２ドメインホモ二量体化を模倣する。例えば、ヒンジドメインに隣接する（例えば、Ｎ末端にある）ＣＨ１またはＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有するシステインにおいて欠失または置換を含み、かつＣＨ１またはＣκのＣ末端に置かれたＩｇＭヒンジドメインは、ヒンジの１つまたは両方のシステインを含む。
活性試験
多特異性タンパク質は、生物学的活性、例えば、抗原結合性、ＮＫ細胞の増殖を誘発する能力、ＮＫによる標的細胞溶解を誘発する、および／または、ＮＫ細胞により誘発される任意の特有のシグナル伝達活性、例えばサイトカイン産生もしくは活性化のマーカーの細胞表面発現を含む、ＮＫ細胞の活性化を誘発する能力について評価され得る。１つの実施形態において、提供されるのは、本開示の多特異性タンパク質の生物学的活性、例えば、抗原結合性、それにより誘発される標的細胞溶解および／または特有のシグナル伝達活性を誘発する能力を評価する方法である。多特異性タンパク質の構成要素のうちの１つ（例えばＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ、対象とする抗原に結合するＡＢＤ、Ｆｃドメイン、サイトカイン受容体ＡＢＤなど）の特有の寄与または活性が評価される場合、多特異性フォーマットは、対象とする構成要素（例えばドメイン）の評価を可能とする好適なフォーマットにおいて産生され得ることが理解される。本開示はまた、多特異性タンパク質の試験、評価、作製および／または産生における使用のためのそのような方法を提供する。例えば、サイトカインの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、サイトカインを有するタンパク質、および、サイトカインが、それを欠失させるか、または他にその活性をモジュレートするように改変されている別のタンパク質（例えば、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有する）として産生され、対象とするアッセイにおいて試験され得る。例えば、抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、ＡＢＤを有するタンパク質、および、ＡＢＤが存在しないか、またはＮＫｐ４６に結合しないＡＢＤ（例えば、アッセイシステム中に存在しない抗原に結合するＡＢＤ）により置き換えられている別のタンパク質として産生可能であり、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有し、かつ２つの多特異性タンパク質は対象とするアッセイにおいて試験される。別の例において、抗ＣＤ２０ ＡＢＤの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、ＡＢＤを有するタンパク質、および、ＡＢＤが存在しないか、またはＣＤ２０に結合しないＡＢＤ（例えば、アッセイシステム中に存在しない抗原に結合するＡＢＤ、異なる腫瘍抗原に結合するＡＢＤ）により置き換えられている別のタンパク質として産生可能であり、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有し、かつ２つの多特異性タンパク質は対象とするアッセイにおいて試験される。
多特異性タンパク質は、生物学的活性、例えば、抗原結合性、ＮＫ細胞の増殖を誘発する能力、ＮＫによる標的細胞溶解を誘発する、および／または、ＮＫ細胞により誘発される任意の特有のシグナル伝達活性、例えばサイトカイン産生もしくは活性化のマーカーの細胞表面発現を含む、ＮＫ細胞の活性化を誘発する能力について評価され得る。１つの実施形態において、提供されるのは、本開示の多特異性タンパク質の生物学的活性、例えば、抗原結合性、それにより誘発される標的細胞溶解および／または特有のシグナル伝達活性を誘発する能力を評価する方法である。多特異性タンパク質の構成要素のうちの１つ（例えばＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ、対象とする抗原に結合するＡＢＤ、Ｆｃドメイン、サイトカイン受容体ＡＢＤなど）の特有の寄与または活性が評価される場合、多特異性フォーマットは、対象とする構成要素（例えばドメイン）の評価を可能とする好適なフォーマットにおいて産生され得ることが理解される。本開示はまた、多特異性タンパク質の試験、評価、作製および／または産生における使用のためのそのような方法を提供する。例えば、サイトカインの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、サイトカインを有するタンパク質、および、サイトカインが、それを欠失させるか、または他にその活性をモジュレートするように改変されている別のタンパク質（例えば、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有する）として産生され、対象とするアッセイにおいて試験され得る。例えば、抗ＮＫｐ４６ ＡＢＤの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、ＡＢＤを有するタンパク質、および、ＡＢＤが存在しないか、またはＮＫｐ４６に結合しないＡＢＤ（例えば、アッセイシステム中に存在しない抗原に結合するＡＢＤ）により置き換えられている別のタンパク質として産生可能であり、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有し、かつ２つの多特異性タンパク質は対象とするアッセイにおいて試験される。別の例において、抗ＣＤ２０ ＡＢＤの寄与または活性が評価される場合、多特異性タンパク質は、ＡＢＤを有するタンパク質、および、ＡＢＤが存在しないか、またはＣＤ２０に結合しないＡＢＤ（例えば、アッセイシステム中に存在しない抗原に結合するＡＢＤ、異なる腫瘍抗原に結合するＡＢＤ）により置き換えられている別のタンパク質として産生可能であり、２つの多特異性タンパク質はそれ以外は同じまたは同等の構造を有し、かつ２つの多特異性タンパク質は対象とするアッセイにおいて試験される。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）およびＣＤ２０を発現する標的細胞（例えば腫瘍細胞）の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）の活性化を誘導する能力を有する。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）および対象とする抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）においてＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導する能力を有する。本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）ならびにＣＤ２０を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）においてＣＤ１６Ａシグナル伝達を誘導する能力を有する。
適宜、ＮＫ細胞活性化またはシグナル伝達は、活性化の細胞表面マーカー、例えばＣＤ１０７、ＣＤ６９、Ｓｃａ－１またはＬｙ－６Ａ／Ｅ、ＫＬＲＧ１などの発現の増加により特徴付けられる（ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６および／またはＣＤ１６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）の存在下で、適宜標的細胞の非存在下で、インキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６および／またはＣＤ１６発現細胞（例えばＮＫ細胞、レポーター細胞）の細胞表面上に存在するＣＤ１３７の増加を誘導する能力を有する。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）を欠いた同じ多特異性タンパク質と比較して少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、ＮＫ細胞を活性化させるかまたはその増殖を増強する能力を有する。適宜、多特異性タンパク質は、ＣＤ２５発現Ｔ細胞の活性化またはその増殖の増強についてのＥＣ５０よりも少なくとも１０倍、５０倍または１００倍低いＮＫ細胞の活性化またはその増殖の増強についてのＥＣ５０を示す。
本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍ＣＤ２５発現Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞を活性化させるかまたはその増殖を増強する能力を有する。適宜、ＣＤ２５発現Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞、適宜Ｔｒｅｇ細胞、またはＣＤ８ Ｔ細胞である。
サイトカイン受容体ＡＢＤ含有タンパク質による細胞（例えばＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞）におけるサイトカイン受容体を介する活性化または増殖の増強は、多特異性タンパク質を用いた処理後の前記細胞におけるｐＳＴＡＴまたは細胞増殖マーカー（例えばＫｉ６７）の発現を測定することにより決定され得る。ＣＤ１２２ ＡＢＤ含有タンパク質による細胞（例えばＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞）におけるＩＬ－２Ｒ経路を介する活性化または増殖の増強は、多特異性タンパク質を用いた処理後の前記細胞におけるｐＳＴＡＴ５または細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を測定することにより決定され得る。ＩＬ－２およびＩＬ－１５はＳＴＡＴ５タンパク質のリン酸化に繋がり、ＳＴＡＴ５タンパク質は細胞増殖、生存、分化およびアポトーシスに関与する。リン酸化されたＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）は核に移行して、ＣＤ２５を含む標的遺伝子の転写を調節する。ＳＴＡＴ５はまたＮＫ細胞生存のために要求され、ＮＫ細胞はＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路により緊密に調節される。本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞）においてＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する能力を有する。本明細書において記載される任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍ＣＤ２５発現Ｔ細胞を上回ってＮＫ細胞においてｐＳＴＡＴ５の発現の増加を引き起こす能力を有する。適宜、多特異性タンパク質は、ＣＤ２５発現Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の発現の誘導についてのそのＥＣ５０よりも少なくとも１０倍、５０倍または１００倍低いＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の発現の誘導についてのＥＣ５０を示す。
活性は、例えば、適宜さらに標的細胞（例えば腫瘍細胞）の存在下で、ＮＫｐ４６発現細胞（またはアッセイに依存してＣＤ２５発現細胞）を多特異性ポリペプチドと接触させることにより測定され得る。一部の実施形態において、活性は、例えば、標的細胞およびＮＫ細胞（すなわちＮＫｐ４６発現細胞）を、多特異性ポリペプチドの存在下で、互いと接触させることにより測定される。ＮＫｐ４６発現細胞は、精製されたＮＫ細胞もしくはＮＫｐ４６発現細胞として、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団内のＮＫｐ４６発現細胞として用いられてもよい。標的細胞は、対象とする抗原を発現する細胞、適宜腫瘍細胞であり得る。
１つの例において、多特異性タンパク質は、それぞれＮＫ細胞活性と関連付けられるとして当技術分野において公知の任意の特性または活性、例えば、細胞傷害性（ＣＤ１０７）またはサイトカイン産生（例えばＩＦＮ－γもしくはＴＮＦ－α）のマーカー、細胞内遊離カルシウムレベルにおける増加、例えば再方向付け殺傷アッセイにおいて、標的細胞を溶解する能力などにおける測定可能な増加を引き起こす能力について評価され得る。
標的細胞（対象とする抗原を発現する標的細胞）およびＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の存在下で、多特異性タンパク質は、インビトロでＮＫ細胞活性と関連付けられる特性または活性（例えば、ＮＫ細胞の細胞傷害性、ＣＤ１０７発現、ＩＦＮγ産生、標的細胞の殺傷の活性化）における増加を引き起こす能力を有する。例えば、本発明による多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞活性を検出するアッセイ、例えば、ＮＫ活性化マーカーの発現を検出するか、またはＮＫ細胞の細胞傷害性を検出するアッセイ、例えば、ＣＤ１０７もしくはＣＤ６９発現、ＩＦＮγ産生を検出するアッセイ、または細胞傷害性の古典的なインビトロクロム放出試験により測定された場合に、多特異性タンパク質と接触させられていない同じＮＫ細胞および標的細胞を用いて同じエフェクター：標的細胞比を用いて達成される場合と比較して約２０％より大きく、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、またはより大きくＮＫ細胞活性を増加させるその能力に基づいて選択され得る。ＮＫ細胞活性化を検出するためおよび細胞傷害性アッセイのためのプロトコールの例は、本明細書中の実施例の他に、例えば、Pessino et al, J. Exp. Med, 1998, 188 (5): 953-960; Sivori et al, Eur J Immunol, 1999. 29:1656-1666; Brando et al, (2005) J. Leukoc. Biol. 78:359-371; El-Sherbiny et al, (2007) Cancer Research 67(18):8444-9;およびNolte-'t Hoen et al, (2007) Blood 109:670-673)において記載されている。細胞傷害性の古典的なインビトロクロム放出試験において、標的細胞は、ＮＫ細胞の追加に先立って５１Ｃｒを用いて標識され、次に殺傷は、殺傷の結果としての、培地への細胞からの５１Ｃｒの放出に比例しているとして概算される。適宜、本発明による多特異性タンパク質は、ＮＫ細胞活性のアッセイ（例えば対象とする抗原を発現する標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を検出するアッセイ）により測定された場合に、同じ対象とする抗原に結合する従来的なヒトＩｇＧ１抗体と比較して標的細胞に向けたＮＫ細胞活性、すなわち、標的細胞の溶解を誘導するより大きい能力を有するその能力について選択され得るか、または該能力により特徴付けられ得る。
本明細書において示されるように、多特異性タンパク質の異なるＡＢＤは、インビボで強力な抗腫瘍活性を最終的に顕現する多特異性タンパク質の全体的な活性に寄与する。本明細書において例示される試験方法は、特定のＡＢＤを欠いた多特異性タンパク質の変異型を作製することおよび／または特定のＡＢＤのための受容体を欠いた細胞を使用することにより多特異性タンパク質の異なる個々のＡＢＤの活性のインビトロ評価を可能とする。本明細書において示されるように、本開示による多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）を含まない場合およびＣＤ１６に結合しないＦｃドメインを有する場合、タンパク質が標的細胞上の対象とする抗原に結合していない場合に（例えば対象とする抗原および／または標的細胞の非存在下で）ＮＫ細胞のＮＫｐ４６シグナル伝達（および／またはその結果としてもたらされるＮＫ活性化）を実質的に誘導しない。そのため、多特異性タンパク質の一価ＮＫｐ４６結合性構成要素はそれ自体はＮＫｐ４６シグナル伝達を引き起こさない。よって、ＣＤ１６に結合するＦｃドメインを有する多特異性タンパク質の場合、そのような多特異性タンパク質は、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）が不活性化されている（例えば、改変、マスクまたは欠失されており、それにより、ＩＬ－２Ｒに結合するその能力が排除されている）構成において産生可能であり、タンパク質は、ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞による、ＮＫｐ４６発現に対するこの多特異性タンパク質の効果を試験することによりＮＫｐ４６シグナル伝達またはＮＫｐ４６媒介性ＮＫ細胞活性化を誘発するその能力について評価され得る。多特異性タンパク質は、適宜、多特異性タンパク質が標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６発現ＣＤ１６陰性細胞（例えば、精製されたＮＫ細胞または精製されたレポーター細胞）とインキュベートされた場合にそのようなＮＫｐ４６発現ＣＤ１６陰性細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞、レポーター細胞）によるＮＫｐ４６シグナル伝達を実質的に引き起こさない（または増加させない）として特徴付けられ得る。
本明細書における任意の実施形態の１つの態様において、多特異性タンパク質は、例えば、以下により特徴付けられ得る：
（ａ）多特異性タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）の存在下でインキュベートされた場合にＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞）においてサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）シグナル伝達を誘導する能力を有すること（例えば、ＳＴＡＴシグナル伝達を評価すること、例えばＳＴＡＴリン酸化を評価することにより決定される）；
（ｂ）ＮＫｐ４６（および適宜さらにＣＤ１６）を発現するＮＫ細胞およびＣＤ２０発現細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞が標的細胞を溶解するのを誘導する能力を有すること；ならびに
（ｃ）多特異性タンパク質が、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）を欠くように改変されているかまたは不活性化されたサイトカイン受容体ＡＢＤを含む場合に、標的細胞の非存在下で、ＮＫ細胞（適宜ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞、ＣＤ１６を発現しないＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞）、適宜精製されたＮＫ細胞とインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞活性化もしくは細胞傷害性を欠如しているおよび／またはＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を欠如していること。
（ａ）多特異性タンパク質がＮＫｐ４６発現細胞（例えば精製されたＮＫ細胞）の存在下でインキュベートされた場合にＮＫｐ４６発現細胞（例えばＮＫ細胞）においてサイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）シグナル伝達を誘導する能力を有すること（例えば、ＳＴＡＴシグナル伝達を評価すること、例えばＳＴＡＴリン酸化を評価することにより決定される）；
（ｂ）ＮＫｐ４６（および適宜さらにＣＤ１６）を発現するＮＫ細胞およびＣＤ２０発現細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞が標的細胞を溶解するのを誘導する能力を有すること；ならびに
（ｃ）多特異性タンパク質が、サイトカイン受容体ＡＢＤ（例えばＣＤ１２２ ＡＢＤ）を欠くように改変されているかまたは不活性化されたサイトカイン受容体ＡＢＤを含む場合に、標的細胞の非存在下で、ＮＫ細胞（適宜ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞、ＣＤ１６を発現しないＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞）、適宜精製されたＮＫ細胞とインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞活性化もしくは細胞傷害性を欠如しているおよび／またはＮＫｐ４６におけるアゴニスト活性を欠如していること。
化合物の使用
１つの態様において、提供されるのは、それを必要とする哺乳動物における疾患の処置、予防または診断用の薬学的調製物を製造するための、多特異性タンパク質および／または該タンパク質（もしくはそのポリペプチド鎖）を発現する細胞のいずれかの使用である。提供されるのはまた、医薬または医薬中の活性成分もしくは活性物質としての上記に定義される化合物のいずれかの使用である。さらなる態様において、本発明は、投与（例えば、皮下または静脈内注射による）のための固体または液体製剤を提供するために本明細書において定義されている化合物を含有する医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような方法または製法は、該化合物を医薬的に許容される担体と混合する工程を少なくとも含む。
１つの態様において、提供されるのは、それを必要とする哺乳動物における疾患の処置、予防または診断用の薬学的調製物を製造するための、多特異性タンパク質および／または該タンパク質（もしくはそのポリペプチド鎖）を発現する細胞のいずれかの使用である。提供されるのはまた、医薬または医薬中の活性成分もしくは活性物質としての上記に定義される化合物のいずれかの使用である。さらなる態様において、本発明は、投与（例えば、皮下または静脈内注射による）のための固体または液体製剤を提供するために本明細書において定義されている化合物を含有する医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような方法または製法は、該化合物を医薬的に許容される担体と混合する工程を少なくとも含む。
本明細書における任意の態様において、本開示による多特異性タンパク質は、有利には、体重１ｋｇ当たり１μｇ～１ｍｇ、適宜体重１ｋｇ当たり０．０５～０．５ｍｇの用量で投与され得る。多特異性タンパク質は、有利には、月当たり１～４回、好ましくは月当たり１～２回、例えば週当たり１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与され得る。適宜、投与は、静脈内注入または皮下投与によりなされる。
１つの態様において、提供されるのは、本明細書において記載される多特異性タンパク質もしくは抗体、またはそれを含む（医薬）組成物を使用または投与することにより、個体において予め定義された状態を処置するか、予防するか、もしくはより一般にはそれに影響するか、またはある特定の状態を検出する方法である。
例えば、１つの態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えばがんを有する患者）においてＮＫｐ４６発現細胞、特にはＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性および／または増殖を回復させるかまたは増強する方法であって、本明細書において記載される多特異性タンパク質を前記患者に投与する工程を含む、方法を提供する。１つの態様において、本発明は、ＣＤ２５発現リンパ球、例えばＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞を上回るＮＫ細胞の活性および／または増殖を選択的に回復させるかまたは増強する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、増加したリンパ球（例えばＮＫ細胞）活性が有益であるか、または不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるかもしくは特徴付けられる疾患、例えばがんを有する患者においてＮＫｐ４６＋リンパ球（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性を増加させることに方向付けられている。
別の態様において、本発明は、それを必要とする患者（例えばがんを有する患者）においてＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞、ＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞）の活性および／または増殖を回復させるかまたは増強する方法であって、患者に由来する細胞、例えば、免疫細胞、および適宜、対象とする抗原を発現する標的細胞を、本発明による多特異性タンパク質と接触させる工程ならびに多特異性タンパク質で処理された細胞を患者中に再注入する工程を含む、方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、増加したリンパ球（例えばＮＫ細胞）活性が有益であるか、または不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるかもしくは特徴付けられる疾患、例えばがんを有する患者においてＮＫｐ４６＋リンパ球（例えばＮＫｐ４６＋ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞）の活性を増加させることに方向付けられている。
別の実施形態において、主題多特異性タンパク質は、処置される患者または異なるドナーに由来する免疫細胞、特にはＮＫ細胞と組み合わせて使用または投与されてもよく、これらのＮＫ細胞は、それを必要とする患者、例えば増加したリンパ球（例えばＮＫ細胞）活性が有益であるか、または不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるかもしくは特徴付けられる疾患、例えばがん、またはウイルスもしくは微小生物、例えば、細菌もしくは寄生生物感染症を有する患者に投与されてもよい。ＮＫ細胞は（ＣＡＲ－Ｔ細胞と異なり）ＴＣＲを発現しないので、これらのＮＫ細胞は、異なるドナーに由来するものであっても、ＧＶＨＤ反応を誘導しない［例えば、Glienke et al., "Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells", Front. Pharmacol. 6, Art. 21:1-6 (2015); Hermanson and Kaufman, Front. Immunol. 6, Art. 195:1-6 (2015)を参照］。
１つの実施形態において、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６およびＣＤ１２２を含む、エフェクター細胞の複数の活性化受容体を介してＮＫ細胞活性化、増殖、腫瘍浸潤および／または標的細胞溶解を媒介する本明細書において開示される多特異性タンパク質は、そのエフェクター細胞または腫瘍浸潤性エフェクター細胞（例えばＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞）が低機能であるか、疲弊しているかまたは抑制されている個体、例えば、１もしくは複数の阻害性受容体（例えばＴＩＭ－３、ＰＤ１、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴなど）の発現および／もしくは上方調節、またはＣＤ１６の発現の下方調節もしくは低いレベル（例えば、上昇した割合のＮＫｐ４６＋ＣＤ１６－ ＮＫ細胞の存在）により特徴付けられる意義のあるエフェクター細胞の集団を有する患者の処置のために有利に使用され得る。
本明細書において記載される多特異性ポリペプチドは、抗体を用いて処置され得る障害、例えばがん、血液学的悪性腫瘍、および炎症性または自己免疫障害を予防または処置するために使用され得る。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、リンパ腫［好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）］およびリンパ球性白血病からなる群から選択されるＣＤ２０発現細胞により特徴付けられるがんを予防または処置するために使用される。そのようなリンパ腫およびリンパ球性白血病は、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非分割細胞リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、孤発性バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫［節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫および脾辺縁帯リンパ腫を含む］、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞リンパ腫［Ｂ細胞びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫－肺Ｂ細胞リンパ腫を含む］、ｆ）有毛細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病を含む。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、ＣＤ２０発現細胞により特徴付けられるがんを予防または処置するために使用され、前記がんは、固形腫瘍、好ましくは固形の非血液学的（非リンパ系）腫瘍である。そのような固形腫瘍は、Ｂ細胞関与を有する、すなわち、Ｂ細胞が「腫瘍促進性」応答に関与する、非血液学的悪性腫瘍を含む。そのような固形腫瘍は、典型的には少なくとも０．５ｍｍの直径、より典型的には少なくとも１．０ｍｍの直径の、触知可能な腫瘍により特徴付けられる。その例は、結腸直腸がん、肝臓がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、胃がん、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮がんおよびその他を含む。これらのがんは、早期ステージ（前がん）、中期ステージ（ステージＩおよびＩＩ）、または、転移した固形腫瘍を含む、進行ステージにおけるものであってもよい。これらの固形腫瘍は、好ましくは、Ｂ細胞が腫瘍促進性応答を誘発する、すなわち、Ｂ細胞の存在が、腫瘍の発生、維持または転移に関与する、がんである。
１つの例において、腫瘍抗原は、リンパ腫細胞または白血病細胞の表面上に発現される抗原であり、かつ多特異性タンパク質は、リンパ腫または白血病を有する個体に投与され、かつ／または該個体の処置のために使用される。
１つの実施形態において、本明細書において記載される本発明の多特異性ポリペプチドは、本開示の多特異性タンパク質が特異的に結合するＣＤ２０を発現する腫瘍細胞により特徴付けられるがんを予防または処置するために使用され得る。
１つの態様において、処置の方法は、個体に本明細書において記載される多特異性タンパク質を、例えば、本明細書において開示されている疾患、例えば上記に同定されるがんのいずれかの処置のための、治療有効量において投与することを含む。治療有効量は、疾患または障害を有する患者において治療効果を有する（または疾患もしくは障害を有する患者および該患者と実質的に類似した特徴を有する患者の少なくとも実質的な割合においてそのような効果を促進、増強、および／もしくは誘導する）任意の量であってもよい。
多特異性タンパク質は、個体から得られた生物学的試料（例えばがん細胞、がん組織またはがん隣接組織を含む生物学的試料）中の標的細胞上の対象とする抗原（例えば腫瘍抗原）の発現を検出する先行する工程と共にまたは（ｗｉｔｈ ｏｕｒ）該工程なしで使用されてもよい。別の実施形態において、本開示は、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）対象とする抗原（例えば多特異性タンパク質がその対象とする抗原のＡＢＤを介して特異的に結合する対象とする抗原）を発現する個体からの試料中の細胞（例えば腫瘍細胞）を検出すること、ならびに
ｂ）対象とする抗原を発現する細胞が、適宜、少なくとも参照レベルに対応する（例えば多特異性タンパク質から実質的な利益を誘導する個体に対応する）レベルにおいて、または適宜、参照レベルと比較して増加した（例えば健常個体もしくは本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体に対応する）レベルにおいて、試料中に含まれると決定されたら、対象とする抗原、ＮＫｐ４６、サイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）、および適宜ＣＤ１６Ａに結合する（例えば、そのＦｃドメインを介して）本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む、方法を提供する。
ａ）対象とする抗原（例えば多特異性タンパク質がその対象とする抗原のＡＢＤを介して特異的に結合する対象とする抗原）を発現する個体からの試料中の細胞（例えば腫瘍細胞）を検出すること、ならびに
ｂ）対象とする抗原を発現する細胞が、適宜、少なくとも参照レベルに対応する（例えば多特異性タンパク質から実質的な利益を誘導する個体に対応する）レベルにおいて、または適宜、参照レベルと比較して増加した（例えば健常個体もしくは本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体に対応する）レベルにおいて、試料中に含まれると決定されたら、対象とする抗原、ＮＫｐ４６、サイトカイン受容体（例えばＣＤ１２２）、および適宜ＣＤ１６Ａに結合する（例えば、そのＦｃドメインを介して）本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、ＣＤ２０の細胞表面発現の低いレベルにより特徴付けられる腫瘍を処置するために使用される。よって、腫瘍またはがんは、低いレベルのＣＤ２０を発現する細胞により特徴付けられ得る。適宜、ＣＤ２０のレベルは、がん細胞１個当たり１００，０００個未満のＣＤ２０のコピーである。一部の態様において、腫瘍抗原のレベルは、がん細胞１個当たり９０，０００個未満、７５，０００個未満、５０，０００個未満、または４０，０００個未満のＣＤ２０のコピーである。使用は、適宜、対象の１つまたは複数のがん細胞のＣＤ２０のレベルを検出することをさらに含む。
１つの実施形態において、本開示は、それを必要とする個体における疾患（例えばがん）の処置または予防方法であって、
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）のがん細胞におけるＣＤ２０ポリペプチドの発現（例えば細胞表面発現）を検出すること、および
ｂ）がん細胞におけるＣＤ２０の発現が決定されたら、個体に本開示の多特異性タンパク質を投与すること
を含む、方法を提供する。
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）のがん細胞におけるＣＤ２０ポリペプチドの発現（例えば細胞表面発現）を検出すること、および
ｂ）がん細胞におけるＣＤ２０の発現が決定されたら、個体に本開示の多特異性タンパク質を投与すること
を含む、方法を提供する。
１つの実施形態において、本開示は、それを必要とする個体における疾患（例えばがん）の処置または予防方法であって、
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）のがん細胞におけるＣＤ２０ポリペプチドの発現を検出すること、および
ｂ）がん細胞上のＣＤ２０の低い発現、適宜、参照レベル［例えば、低い細胞表面発現のための参照レベルに対応するレベル；治療剤（例えば利用可能な抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ、または別の承認された抗ＣＤ２０剤）から実質的な利益を引き出さない個体に対応するレベル］と比較して減少したレベルの低い発現が決定されたら、個体に本開示の多特異性タンパク質を投与すること
を含む、方法を提供する。適宜、低い発現は、がん細胞１個当たり１００，０００個未満のＣＤ２０のコピーに対応する。一部の態様において、低い発現は、がん細胞１個当たり９０，０００個未満、７５，０００個未満、５０，０００個未満、または４０，０００個未満のＣＤ２０のコピーに対応する。
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）のがん細胞におけるＣＤ２０ポリペプチドの発現を検出すること、および
ｂ）がん細胞上のＣＤ２０の低い発現、適宜、参照レベル［例えば、低い細胞表面発現のための参照レベルに対応するレベル；治療剤（例えば利用可能な抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ、または別の承認された抗ＣＤ２０剤）から実質的な利益を引き出さない個体に対応するレベル］と比較して減少したレベルの低い発現が決定されたら、個体に本開示の多特異性タンパク質を投与すること
を含む、方法を提供する。適宜、低い発現は、がん細胞１個当たり１００，０００個未満のＣＤ２０のコピーに対応する。一部の態様において、低い発現は、がん細胞１個当たり９０，０００個未満、７５，０００個未満、５０，０００個未満、または４０，０００個未満のＣＤ２０のコピーに対応する。
多特異性タンパク質は、処置される個体からのＮＫ細胞を検出するかまたは特徴付ける先行する工程と共にまたは該工程なしで使用されてもよい。適宜、１つの実施形態において、本発明は、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの腫瘍試料中（または腫瘍内および／もしくは隣接組織内）のＮＫ細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料が、適宜、参照レベルと比較して減少したレベルまたは数において（例えば、従来的なＩｇＧ抗体療法、例えば同じがん抗原に結合する従来的なＩｇＧ１抗体から誘導される利益がないか、低いかまたは不十分である個体に対応するレベルにおいて）、ＮＫ細胞の少ない数または低い活性により特徴付けられると決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む、方法を提供する。
ａ）個体からの腫瘍試料中（または腫瘍内および／もしくは隣接組織内）のＮＫ細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料が、適宜、参照レベルと比較して減少したレベルまたは数において（例えば、従来的なＩｇＧ抗体療法、例えば同じがん抗原に結合する従来的なＩｇＧ１抗体から誘導される利益がないか、低いかまたは不十分である個体に対応するレベルにおいて）、ＮＫ細胞の少ない数または低い活性により特徴付けられると決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、個体は、ＣＤ１６（例えばＣＤ１６Ａ）欠損腫瘍微環境により特徴付けられる腫瘍を有する。適宜、多特異性タンパク質を使用する処置の方法は、個体からの試料（例えば腫瘍試料）中のＣＤ１６の発現レベルを検出する工程を含む。ＣＤ１６を検出することは、適宜、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂのレベルを検出することを含む。一部の態様において、ＣＤ１６欠損微環境は、造血幹細胞移植を受けた患者において評価される。適宜、ＣＤ１６欠損微環境は浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、かつ浸潤性ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して５０％未満のＣＤ１６の発現を有する。一部の態様において、浸潤性ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して３０％未満、２０％未満、または１０％未満のＣＤ１６の発現を有する。適宜、ＣＤ１６欠損微環境は浸潤性ＮＫ細胞の集団を含み、かつ浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも１０％は、対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。一部の態様において、浸潤性ＮＫ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％は、対照ＮＫ細胞と比較して低減されたＣＤ１６の発現を有する。
適宜、１つの実施形態において、提供されるのは、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの腫瘍または腫瘍試料（例えば、腫瘍および／または隣接組織内）からの細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）におけるＣＤ１６発現を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料がＣＤ１６欠損微環境により特徴付けられると決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法である。
ａ）個体からの腫瘍または腫瘍試料（例えば、腫瘍および／または隣接組織内）からの細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）におけるＣＤ１６発現を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料がＣＤ１６欠損微環境により特徴付けられると決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法である。
適宜、１つの実施形態において、提供されるのは、それを必要とする個体においてがんを処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの腫瘍試料中（または腫瘍内および／もしくは隣接組織内）のＮＫ細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）の表面におけるＣＤ１６発現を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料が、適宜、参照レベルと比較して増加したレベルまたは数において、ＣＤ１６－ ＮＫ細胞の上昇した割合により特徴付けられると決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法である。
ａ）個体からの腫瘍試料中（または腫瘍内および／もしくは隣接組織内）のＮＫ細胞（例えば腫瘍浸潤性ＮＫ細胞）の表面におけるＣＤ１６発現を検出すること、ならびに
ｂ）腫瘍または腫瘍試料が、適宜、参照レベルと比較して増加したレベルまたは数において、ＣＤ１６－ ＮＫ細胞の上昇した割合により特徴付けられると決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法である。
１つの実施形態において、本開示は、それを必要とする個体において疾患（例えばがん）を処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）の免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞）上の１または複数の阻害性受容体の細胞表面発現を検出すること、ならびに
ｂ）適宜、参照レベルと比較して増加したレベルにおける（例えば、健常個体、免疫疲弊も抑制も患っていない個体、または本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体と比較して増加したレベルにおける）、免疫エフェクター細胞上の１または複数の阻害性受容体の細胞表面発現が決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）の免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞）上の１または複数の阻害性受容体の細胞表面発現を検出すること、ならびに
ｂ）適宜、参照レベルと比較して増加したレベルにおける（例えば、健常個体、免疫疲弊も抑制も患っていない個体、または本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体と比較して増加したレベルにおける）、免疫エフェクター細胞上の１または複数の阻害性受容体の細胞表面発現が決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
１つの実施形態において、本開示は、それを必要とする個体において疾患（例えばがん）を処置または予防する方法であって、
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）の免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞）上のＮＫＧ２Ｄポリペプチドの細胞表面発現を検出すること、ならびに
ｂ）適宜、参照レベルと比較して減少したレベルにおける（例えば、健常個体、免疫疲弊も抑制も患っていない個体、または本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体と比較して増加したレベルにおける）、免疫エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄポリペプチドの細胞表面発現の減少が決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
ａ）個体からの試料中（例えば循環中または腫瘍環境中）の免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞）上のＮＫＧ２Ｄポリペプチドの細胞表面発現を検出すること、ならびに
ｂ）適宜、参照レベルと比較して減少したレベルにおける（例えば、健常個体、免疫疲弊も抑制も患っていない個体、または本明細書において記載されるタンパク質から実質的な利益を誘導しない個体と比較して増加したレベルにおける）、免疫エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄポリペプチドの細胞表面発現の減少が決定されたら、本開示の多特異性タンパク質を個体に投与すること
を含む方法を提供する。
１つの実施形態において、多特異性タンパク質は、単剤療法（他の治療剤を伴わない）として、または１つもしくは複数の他の治療剤との併用処置において使用されてもよい。
多特異性タンパク質はまた、キット、例えば、
（ｉ）多特異性タンパク質を含有する医薬組成物、
（ｉｉ）多特異性タンパク質、およびさらなる治療剤、および適宜、前記さらなる治療剤と共に前記多特異性タンパク質を投与するための指示書を含有する、医薬組成物
を含むキット中に含まれ得る。
（ｉ）多特異性タンパク質を含有する医薬組成物、
（ｉｉ）多特異性タンパク質、およびさらなる治療剤、および適宜、前記さらなる治療剤と共に前記多特異性タンパク質を投与するための指示書を含有する、医薬組成物
を含むキット中に含まれ得る。
医薬組成物は、適宜、医薬的に許容される担体を含むとして特定されてもよい。多特異性タンパク質は、適宜、本明細書における方法のいずれかにおける使用のために適合された治療有効量において存在するとして特定されてもよい。キットはまた、適宜、例えば、プラクティショナー（例えば、医師、看護師、または患者）が、がんを有する患者にその中に含有される組成物を投与することを可能とするための、投与スケジュールを含む、指示書を含むことができる。任意の実施形態において、キットは、適宜、前記多特異性タンパク質、適宜他の治療剤を投与するための指示書を含むことができる。キットはまたシリンジを含むことができる。
適宜、キットは、単回投与のための、有効量の多特異性タンパク質および適宜別の治療剤を各々が含有する単回用量医薬組成物の複数のパッケージを含む。医薬組成物を投与するために必要な機器またはデバイスもまたキット中に含まれ得る。例えば、キットは、ある量の多特異性タンパク質を含有する１つまたは複数の事前充填シリンジを提供してもよい。
１つの実施形態において、本発明は、子宮頸がんに罹患したヒト患者においてがんまたは腫瘍を処置するためのキットであって、
（ａ）ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ＣＤ１６Ａに特異的に結合する多特異性タンパク質の用量であって、前記タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖を含む、用量；ならびに／または
（ｂ）適宜、別の治療剤の用量、ならびに／または
（ｃ）適宜、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて前記多特異性タンパク質、ならびに適宜、前記抗ＨＥＲ抗体および／もしくは前記化学療法剤を使用するための指示書
を含む、キットを提供する。
（ａ）ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ＣＤ１６Ａに特異的に結合する多特異性タンパク質の用量であって、前記タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖を含む、用量；ならびに／または
（ｂ）適宜、別の治療剤の用量、ならびに／または
（ｃ）適宜、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて前記多特異性タンパク質、ならびに適宜、前記抗ＨＥＲ抗体および／もしくは前記化学療法剤を使用するための指示書
を含む、キットを提供する。
一部の実施形態において、多特異性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態において、多量体タンパク質は、体重１ｋｇ当たり１μｇから体重１ｋｇ当たり１ｍｇまでで含まれる用量において１、２、３または４週毎に投与される。
キットは、適宜、任意の数のポリペプチドおよび／または他の化合物、例えば、１、２、３、４、または任意の他の数の多特異性タンパク質および／または他の化合物をさらに含有してもよい。キットの内容物のこの記載は、いかなるようにも限定的でないことが理解される。例えば、キットは、他のタイプの治療用化合物を含有してもよい。適宜、キットはまた、例えば、本明細書において記載される方法、例えば特有の疾患状態の検出または処置における方法を詳述する、ポリペプチドを使用するための指示書を含む。
提供されるのはまた、主題多特異性タンパク質および適宜、上記に定義されている他の化合物を含む、医薬組成物である。多特異性タンパク質および適宜別の化合物は、薬学的担体と共に精製された形態において医薬組成物として投与されてもよい。形態は、意図される投与のモードおよび治療的なまたは診断的な応用に依存する。薬学的担体は、化合物を患者にデリバリーするために好適な任意の適合性の非毒性物質であり得る。医薬的に許容される担体は当技術分野において周知であり、例えば、水性溶液、例えば（無菌）水または生理緩衝食塩水または他の溶媒もしくは媒体、例えばグリコール、グリセロール、油、例えばオリーブ油もしくは注射用有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体を含む。医薬的に許容される担体は、例えば化合物を安定化させるかまたはその吸収を増加させるために作用する生理学的に許容される化合物をさらに含有してもよい。そのような生理学的に許容される化合物は、例えば、炭水化物、例えばグルコース、スクロースもしくはデキストラン、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸もしくはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤を含む。生理学的に許容される化合物を含む、医薬的に許容される担体の選択は、例えば、組成物の投与の経路に依存することは当業者に公知である。医薬的に許容されるアジュバント、緩衝化剤、および分散剤などもまた医薬組成物中に組み込まれ得る。
本発明による多特異性タンパク質は非経口的に投与され得る。非経口投与用の化合物の調製物は無菌でなければならない。滅菌は、適宜凍結乾燥および再構成に先立つかまたはその後になされる、無菌濾過膜を通じた濾過により容易に達成される。化合物の投与のための非経口経路は、公知の方法、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、または病巣内経路による注射または注入に従う。化合物は、注入により連続的にまたはボーラス注射により投与されてもよい。静脈内注入用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物およびその要求される投薬レジメンに依存して、２０％のアルブミン溶液および１ｍｇ～１０ｇの化合物を適宜補充された、１００～５００ｍｌの無菌０．９％ ＮａＣｌまたは５％のグルコースを含有するように構成され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は当技術分野において周知である。
多特異性タンパク質の調製
実施例において使用された例示的な「Ｔ５」フォーマット多特異性タンパク質のドメイン構造を図１および図２Ａにおいて示す。図１は、ドメインリンカー、例えばヒンジおよびグリシン－セリンリンカー、ならびに鎖間ジスルフィドブリッジを示す。ＣＤ１６Ａ結合性を実質的に消失させるためのＮ２９７Ｓ突然変異を有するがそれ以外はフォーマットＴ５と同等である例示的な「Ｔ６」フォーマットのドメイン構造を図２Ｂにおいて示す。Ｔ５鎖Ｌ（鎖３としても参照される）を構築するために、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ中でＮＫｐ４６－１ ＶＫドメインと通常は会合されるＣＫドメインをＣＨ１ドメインにより置き換えた（ｃｒｏｓｓ－ｍａｂバージョン）。Ｔ２５（図２Ｇ）フォーマットは、ＮＫｐ４６－１ ＶＫドメインと通常は会合しているＣＫドメインおよびＶＨと通常は会合しているＣＨ１がそれらと会合したままであるようなＮＫｐ４６結合性ＡＢＤのＣＨ１およびＣＫの置き換えによりＴ５フォーマットから異なる。鎖Ｌ（鎖３）と鎖Ｈ（鎖１）との間の正確な対合およびＨ鎖とＬ鎖との間の適正なジスルフィド結合の形成を確実にするために、ヒトＩｇＧ１の上ヒンジ残基を、鎖ＬをＩＬ－２変異型に接続するリンカーの上流において鎖ＬのＣＨ１ドメインのＣ末端において加えた。他のタンパク質フォーマットを図２Ａ～２Ｋにおいて示す。
実施例において使用された例示的な「Ｔ５」フォーマット多特異性タンパク質のドメイン構造を図１および図２Ａにおいて示す。図１は、ドメインリンカー、例えばヒンジおよびグリシン－セリンリンカー、ならびに鎖間ジスルフィドブリッジを示す。ＣＤ１６Ａ結合性を実質的に消失させるためのＮ２９７Ｓ突然変異を有するがそれ以外はフォーマットＴ５と同等である例示的な「Ｔ６」フォーマットのドメイン構造を図２Ｂにおいて示す。Ｔ５鎖Ｌ（鎖３としても参照される）を構築するために、ＮＫｐ４６結合性ＡＢＤ中でＮＫｐ４６－１ ＶＫドメインと通常は会合されるＣＫドメインをＣＨ１ドメインにより置き換えた（ｃｒｏｓｓ－ｍａｂバージョン）。Ｔ２５（図２Ｇ）フォーマットは、ＮＫｐ４６－１ ＶＫドメインと通常は会合しているＣＫドメインおよびＶＨと通常は会合しているＣＨ１がそれらと会合したままであるようなＮＫｐ４６結合性ＡＢＤのＣＨ１およびＣＫの置き換えによりＴ５フォーマットから異なる。鎖Ｌ（鎖３）と鎖Ｈ（鎖１）との間の正確な対合およびＨ鎖とＬ鎖との間の適正なジスルフィド結合の形成を確実にするために、ヒトＩｇＧ１の上ヒンジ残基を、鎖ＬをＩＬ－２変異型に接続するリンカーの上流において鎖ＬのＣＨ１ドメインのＣ末端において加えた。他のタンパク質フォーマットを図２Ａ～２Ｋにおいて示す。
各々の多特異性抗原結合性タンパク質のための各々のポリペプチド鎖をコードする配列をｐＴＴ－５ベクター中のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間に挿入した。３つのベクター（エンドトキシンフリーミディプレップまたはマキシプレップとして調製された）を使用して、ＰＥＩの存在下（３７℃、５％ ＣＯ２、１５０ｒｐｍ）でＥＸＰＩ－２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への共トランスフェクトを行った。該細胞を使用して１×１０６細胞／ｍｌ（ＥＸＰＩ２９３培地、Ｇｉｂｃｏ）の密度において培養フラスコへの播種を行った。参照として、「Ｔ５」コンストラクトのために、０．１μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖Ｉ）、０．４μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖ＩＩ）、または０．８μｇ／ｍｌ（ポリペプチド鎖ＩＩＩ）のＤＮＡ比を使用した。バルプロ酸（最終濃度０．５ｍＭ）、グルコース（４ｇ／Ｌ）およびトリプトンＮ１（０．５％）を加えた。上清を６日後に採取し、０．２２μｍのポアを有するＳｔｅｒｉｃｕｐフィルターに通過させた。
ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、参照番号１７－１２７９－０３）を使用して採取後の上清から多特異性抗原結合性タンパク質を精製した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を次に行い、予想されるサイズにおいて溶出されたタンパク質を最後に０．２２μｍデバイスにおいて濾過した。
［実施例１］
［実施例１］
ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、選択的にＮＫ細胞においてＩＬ２Ｒ活性化を促進するために強力である
突然変異型ＩＬ－２の１つのＣ末端部分を含有するヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４を調製し、ＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞においてＩＬ－２ Ｒ活性化を促進するそれらの能力について評価した。前記ヘテロ三量体タンパク質は、野生型ヒトＩＬ－２と比較してＣＤ２５に対する減少した結合親和性を付与する、３つの最初の残基の欠失および置換Ｒ３８Ａ、Ｔ４１Ａ、Ｆ４２Ｋを含む、配列番号２６のアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン－２の変異型であるサイトカイン部分を組み込んでいる。前記ヘテロ三量体タンパク質は、ＣＤ１６Ａに結合するために好適なさらに１つのＦｃドメイン、ＮＫｐ４６のＤ１／Ｄ２ドメイン上の部位に結合するＡＢＤ、およびＣＤ２０に結合する１つのＡＢＤを形成する配列番号１６および１８のＶＨ／ＶＬペアを組み込んでいる。ＣＤ２０に結合する以下の異なるＡＢＤを評価した：
－ 配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号８６のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３。
突然変異型ＩＬ－２の１つのＣ末端部分を含有するヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４を調製し、ＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞においてＩＬ－２ Ｒ活性化を促進するそれらの能力について評価した。前記ヘテロ三量体タンパク質は、野生型ヒトＩＬ－２と比較してＣＤ２５に対する減少した結合親和性を付与する、３つの最初の残基の欠失および置換Ｒ３８Ａ、Ｔ４１Ａ、Ｆ４２Ｋを含む、配列番号２６のアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン－２の変異型であるサイトカイン部分を組み込んでいる。前記ヘテロ三量体タンパク質は、ＣＤ１６Ａに結合するために好適なさらに１つのＦｃドメイン、ＮＫｐ４６のＤ１／Ｄ２ドメイン上の部位に結合するＡＢＤ、およびＣＤ２０に結合する１つのＡＢＤを形成する配列番号１６および１８のＶＨ／ＶＬペアを組み込んでいる。ＣＤ２０に結合する以下の異なるＡＢＤを評価した：
－ 配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号８６のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３。
これらの実施例において使用されたＶＨ／ＶＬドメインの配列を以下の表８に示す。
図１および図２Ａに示されるように、Ｔ５タンパク質フォーマットに従ってヘテロ三量体タンパク質を構築した。
簡潔に述べれば、１Ｍ／ウェルの精製されたＰＢＭＣを９６ウェルプレート中に播種し、増加性用量のＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４または組換えＩＬ－２（１．３３×１０－５Ｍ～１３３ｎＭの用量）を用いて３７℃、５．５％ＣＯ２のインキュベーター中で２０分間処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化を次に、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ８＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－）およびＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋に関してゲーティングされた）に関するフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図３において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５細胞の％ならびにｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。組換えヒトＩＬ－２は、各々の試験された細胞においてＩＬ－２受容体の活性化を促進するが、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞の有意なより低い活性化を示した。ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４によるＣＤ８ Ｔ細胞におけるＩＬ－２Ｒ活性化は組換えＩＬ－２と同等のレベルであった。しかしながら、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、ＮＫ細胞における組換えＩＬ－２と比較して、ＮＫ細胞の中でのｐＳＴＡＴ５＋細胞のパーセントにおける約１－ｌｏｇの増加を結果としてもたらした。したがって、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４タンパク質は、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を上回るＮＫ細胞の選択的な活性化を可能とする。
［実施例２］
［実施例２］
ＲＡＪＩ腫瘍細胞に結合するＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４
実施例１に記載されている、ヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３をフローサイトメトリーによりＲＡＪＩ細胞に結合するそれらの能力について評価した。異なるタンパク質をＲＡＪＩ細胞（ＣＤ２０発現細胞）に対する結合について試験した。
実施例１に記載されている、ヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３をフローサイトメトリーによりＲＡＪＩ細胞に結合するそれらの能力について評価した。異なるタンパク質をＲＡＪＩ細胞（ＣＤ２０発現細胞）に対する結合について試験した。
簡潔に述べれば、１０５個のＲＡＪＩ細胞を飽和用の正常マウス血清と４℃で１０分インキュベートした。ＲＡＪＩ細胞を次に増加性用量のＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４と４℃で３０分間インキュベートした。２回の洗浄後に、ＲＡＪＩ細胞に結合したＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４を、二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＰＣ抗体およびフローサイトメトリー分析を用いて明らかにした。
結果を図４において示しており、該図は、測定されたメジアン蛍光強度をｙ軸上に示しており、試験タンパク質の濃度をｘ軸上に示している。腫瘍細胞に対する異なるヘテロ三量体タンパク質の結合親和性は同等であったが、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４の例外を伴い、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、他のタンパク質と比較してＲＡＪＩ腫瘍細胞に対する有意により強い結合性を呈した。
ＣＤ２０－２ ＡＢＤは、ＮＫＣＥ４タンパク質に対する特に強い結合性を付与した。
［実施例３］
［実施例３］
ＣＤ２０－２－Ｔ５ ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡはＣＤ１２２に選択的に結合する
配列番号９１の第１のポリペプチド鎖、配列番号９の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１７の第３のポリペプチド鎖を含む、ヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａを、ＩＬ－２受容体ＣＤ２５、ＣＤ１２２およびＣＤ１３２に結合するその能力についてＳＰＲ－Ｂｉａｃｏｒｅ機器を通じて評価した。
配列番号９１の第１のポリペプチド鎖、配列番号９の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１７の第３のポリペプチド鎖を含む、ヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａを、ＩＬ－２受容体ＣＤ２５、ＣＤ１２２およびＣＤ１３２に結合するその能力についてＳＰＲ－Ｂｉａｃｏｒｅ機器を通じて評価した。
簡潔に述べれば、ｂｉａｃｏｒｅ機器を、固定化された抗Ｈｉｓ抗体を含むＣＭ５チップと共に使用した。各々のサイクルの始めに、リガンドＨｕＣＤ１２２－Ｈｉｓ（サイクル１）、ＨｕＣＤ２５－Ｈｉｓ（サイクル２）またはＨｕＣＤ１３２－Ｈｉｓ（サイクル４）を１５ｍｇ／ｍｌの希釈において注入してチップ上に捕捉させた。タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ（１μＭ）を次に、１２０ｓ間１０μＬ／分の流量を用いて注入した。ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡとＨｕＣＤ２５－Ｈｉｓ、ＨｕＣＤ１２２－ＨｉｓまたはＨｕＣＤ１３２－Ｈｉｓとの間の相互作用を、６００ｓの解離時間を用いて研究した。チップを次に、４０μＬ／分の流量においてＮａＯＨ １０ｍＭを用いて１０秒間再生させた。
この実験のセンサーグラムの部分を図５において示している。このセンサーグラムにより、ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａタンパク質の注入の間に測定された応答を明らかにした。詳細には、サイクル１（リガンド＝ＨｕＣＤ１２２－Ｈｉｓ）の間に、１０μＬ／分における１２０ｓ間の１５μｇ／ｍＬのＣＤ１２２－Ｈｉｓの注入は＋１５４，０ＲＵの応答を誘導した。次に１０μＬ／分における１２０ｓ間の１μＭのＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａの注入は＋３４，４ＲＵの応答を誘導した。最後に、１ＲＵよりも低い残留応答が、４０μＬ／分における１０ｓ間のＮａＯＨ １０ｍＭを用いた再生後に観察された。サイクル２（リガンド＝ＨｕＣＤ２５－Ｈｉｓ）の間に１０μＬ／分における１２０ｓ間の１５μｇ／ｍＬのＣＤ２５－Ｈｉｓの注入は＋８０ＲＵの応答を生成した。次に、１０μＬ／分における１２０ｓ間の１μＭのＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａの注入は－７ＲＵの応答を誘導した。最後に、５ＲＵよりも低い残留応答が、４０μＬ／分における１０ｓ間のＮａＯＨ １０ｍＭを用いた再生後に観察された。サイクル４（リガンド＝ＨｕＣＤ１３２－Ｈｉｓ）の間に、１０μＬ／分における１２０ｓ間の１５μｇ／ｍＬのＣＤ１３２－Ｈｉｓの注入は＋４１ＲＵの応答を誘導した。次に、１０μＬ／分における１２０ｓ間の１μＭのＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａの注入は－６ＲＵの応答を誘導した。５ＲＵよりも低い残留応答が、４０μＬ／分における１０ｓ間のＮａＯＨ １０ｍＭを用いた再生後に観察された。
図５において示されるように、ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａと受容体ＣＤ２５（インターロイキン２受容体アルファ）およびＣＤ１３２（インターロイキン２受容体ガンマ）との間の結合は観察されなかった。センサーグラムはしかしながら、ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡはＣＤ１２２（インターロイキン２受容体ベータ）に結合できることを示す。
［実施例４］
［実施例４］
ＣＤ１２２に対するＣＤ２０－２－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａの親和性
ヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２、ＣＤ２０－２－Ｔ６ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ、および二量体タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａを産生し、ＣＤ１２２に対するそれらの親和性をＳＰＲ－Ｂｉａｃｏｒｅを通じて研究した。
ヘテロ三量体タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２、ＣＤ２０－２－Ｔ６ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ、および二量体タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａを産生し、ＣＤ１２２に対するそれらの親和性をＳＰＲ－Ｂｉａｃｏｒｅを通じて研究した。
ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号９１の第１のポリペプチド鎖、配列番号９の第２のポリペプチド鎖、配列番号１７の第３のポリペプチド鎖を含む。ＣＤ２０－２－Ｔ６ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、配列番号９２の第１のポリペプチド鎖、配列番号６９の第２のポリペプチド鎖、配列番号１７の第３のポリペプチド鎖を含む。ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、配列番号９１の第１のポリペプチド鎖および配列番号７０の第２のポリペプチド鎖を含む。
簡潔に述べれば、ｂｉａｃｏｒｅ機器を、固定化された抗Ｈｉｓ抗体を含むＣＭ５チップと共に使用した。リガンドＨｕＣＤ１２２－Ｈｉｓを１５ｍｇ／ｍｌの希釈において注入してチップ上に捕捉させた。タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２、ＣＤ２０－２－Ｔ６ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ、ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａを次に、１０μＬ／分の流量を用いて１２０ｓ間、３１．２５ｎＭ～１μＭの濃度範囲において注入した。これらのタンパク質とＨｕＣＤ１２２－Ｈｉｓとの間の相互作用を、６００ｓの解離時間を用いて研究した。チップを次に、４０μＬ／分の流量においてＮａＯＨ １０ｍＭを用いて１０秒間再生させた。
データは、センサーグラムの見た目に関して最も正確であると思われた定常状態モデルの下で分析された。そのように算出された異なるＫＤを以下の表９において示している。
定常状態反応フィットに従って、それらのサイトカイン部分（配列番号２５のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ｖ２および配列番号６５のアミノ酸配列を有するＩＬ２ｖ２Ａ）において追加的に異なるＮＫＣＥのフォーマットはＣＤ１２２（ＩＬ２Ｒβ）に対する同等の親和性を示すと結論付けることができる。
［実施例５］
［実施例５］
ＣＤ２０－２ ＮＫＣＥ４はＲＡＪＩ腫瘍細胞における細胞傷害性の最良の誘導因子である
この実験において、カルセイン放出をリードアウトとして使用する標準的な４時間の細胞傷害性アッセイにおいて１０：１のエフェクター：標的比においてヒトドナーからのＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞（ＣＤ２０＋）の殺傷を誘導する能力についてＮＫＣＥタンパク質を評価した。
この実験において、カルセイン放出をリードアウトとして使用する標準的な４時間の細胞傷害性アッセイにおいて１０：１のエフェクター：標的比においてヒトドナーからのＮＫ細胞によるＲＡＪＩ腫瘍細胞（ＣＤ２０＋）の殺傷を誘導する能力についてＮＫＣＥタンパク質を評価した。
実施例１におけるように、ＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３タンパク質はいくつかのＣＤ２０ ＡＢＤを呈していた：
－ 配列番号９１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３。
－ ＣＤ２０ ＡＢＤが、この実験において存在するタンパク質に結合しないＶＨ／ＶＬペアにより置換されていることを除いて、他のタンパク質と同じ構造を有する、ＩＣ－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３。
－ 配列番号９１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－３－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３；
－ 配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＣＤ２０－４－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３。
－ ＣＤ２０ ＡＢＤが、この実験において存在するタンパク質に結合しないＶＨ／ＶＬペアにより置換されていることを除いて、他のタンパク質と同じ構造を有する、ＩＣ－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３。
図１および図２Ａに示されるように、Ｔ５タンパク質フォーマットに従ってヘテロ三量体タンパク質を構築した。
簡潔に述べれば、健常ドナーからの新たに精製されたＮＫ細胞を、カルセインを用いて以前にロードされたＲａｊｉ腫瘍細胞と１０対１の比において共培養した。細胞を上記の試験タンパク質（６．６×１０－＿６～６６ｎＭの用量）と３７℃、５．５％ ＣＯ２のインキュベーター中で４ｈインキュベートした。細胞傷害性は、カルセイン放出を評価することによりモニターされる。
結果を図６において示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞により誘導された細胞傷害性の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。すべてのＣＤ２０－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３タンパク質は、それらのＣＤ２０ ＡＢＤが何であれ、腫瘍標的細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介する能力において非常に強力であった。しかしながら、ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３は、ＲＡＪＩ腫瘍細胞におけるＮＫ細胞の細胞傷害性の有意により良好な誘導を誘導した。
各々の分子についての細胞傷害性の異なるＥＣ５０を、４人の異なるドナーの血液から単離されたＮＫ細胞について算出し、以下の表１０において示している。
ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ３はインビボで強い抗腫瘍活性を示す
この実験において、０．４μｇ、２μｇまたは１０μｇのＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡまたはＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４の単回注射を、ヒトがんのマウスモデルにおけるそのインビボ抗腫瘍活性について評価した。ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ａは、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖および配列番号７０のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質であり、かつＮＫｐ４６、ＣＤ１２２、ＣＤ２０およびＣＤ１６Ａに結合する。ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、配列番号１０１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１０３のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質であり、かつＮＫｐ４６、ＣＤ１２２、ＣＤ２０およびＣＤ１６Ａに結合する。
この実験において、０．４μｇ、２μｇまたは１０μｇのＮＫ細胞エンゲージャータンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡまたはＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４の単回注射を、ヒトがんのマウスモデルにおけるそのインビボ抗腫瘍活性について評価した。ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ａは、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖および配列番号７０のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質であり、かつＮＫｐ４６、ＣＤ１２２、ＣＤ２０およびＣＤ１６Ａに結合する。ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、配列番号１０１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１０３のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質であり、かつＮＫｐ４６、ＣＤ１２２、ＣＤ２０およびＣＤ１６Ａに結合する。
簡潔に述べれば、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの皮下にマトリゲル中の５×１０６個のＲＡＪＩ細胞を移植した。移植の９日後に、０．４、２または１０μｇのＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡまたはＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４および媒体としてのＰＢＳの単回静脈内注射を用いてマウスを処置した。腫瘍容量を移植後２６日目に測定した。
結果を図７において示している。各々のドットは個々の動物における腫瘍容量を表す。１０μｇのＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡまたはＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４の用量は、媒体単独と比較して、単回の注射として強い有効性を示した。
［実施例７］
［実施例７］
ＮＫＣＥ４の異なるフォーマットはＲＡＪＩ腫瘍細胞において細胞傷害性を誘導することができる。
この実験において、配列番号１６および１８のＶＨ／ＶＬペアのＣＤ２０－２結合性ドメインおよびＮＫｐ４６結合性ドメインをいずれも組み込んでいるＮＫＣＥ４のいくつかの追加のフォーマットを、ＲＡＪＩ腫瘍細胞において細胞傷害性を誘導するそれらの能力について評価した。この実験において含まれる試験タンパク質は以下の通りであった：
－ ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号９１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号９１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号９９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ６ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号９２のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号６９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１３ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異されたＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１４Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、配列番号９２のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号７１のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１４Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異されたＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１７５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号７７のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号７８のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１００のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１７５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１９５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号７７のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号７９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１９５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
この実験において、配列番号１６および１８のＶＨ／ＶＬペアのＣＤ２０－２結合性ドメインおよびＮＫｐ４６結合性ドメインをいずれも組み込んでいるＮＫＣＥ４のいくつかの追加のフォーマットを、ＲＡＪＩ腫瘍細胞において細胞傷害性を誘導するそれらの能力について評価した。この実験において含まれる試験タンパク質は以下の通りであった：
－ ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号９１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ５Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号９１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号９９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１３Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ６ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号９２のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号６９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１３ＡＢ３－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異されたＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１４Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、配列番号９２のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号７１のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１４Ａ－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異されたＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１７５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号７７のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号７８のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１００のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１７５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１９５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、配列番号７７のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号７９のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号９８のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１９５－ＮＫＣＥ４－ｖ２は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６（Ｆａｂ）、ＩＬ２ｖ２を含有する。
簡潔に述べれば、ドナーからの新たに精製されたＮＫ細胞を完全培地中で終夜静置した。静置したＮＫ細胞を次に、カルセイン放出を用いて以前にロードされたＲａｊｉ腫瘍細胞と、１０対１の比において共培養した。細胞を上記の試験タンパク質［６．１×１０－６～６１ｎＭの用量、１０－５～１０２Ｍの用量（ｄｏｓｅｓ ｆｒｏｍ ６．１×１０－６ ｔｏ ６１ｎＭｄｏｓｅｓ ｆｒｏｍ １０－５ ｔｏ １０２ Ｍ）］と３７℃、５．５％のＣＯ２のインキュベーター中で４ｈインキュベートした。細胞傷害性は、カルセイン放出を評価することによりモニターされる。
結果を図８Ａおよび図８Ｂにおいて示しており、該図は、ｙ軸上にＮＫ細胞により誘導された細胞傷害性の％およびｘ軸上に試験タンパク質の濃度を示している。すべてのＮＫＣＥ４タンパク質は、それらのフォーマットが何であれ、腫瘍標的細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介する能力において非常に強力であった。
［実施例８］
［実施例８］
ＮＫ細胞におけるＩＬ２Ｒシグナル伝達の誘導の比較
この実験において、バイオアッセイシステムにおいてＮＫ細胞株の増殖を誘導する２つの多特異性タンパク質の効力を評価した。
この実験において、バイオアッセイシステムにおいてＮＫ細胞株の増殖を誘導する２つの多特異性タンパク質の効力を評価した。
試験タンパク質は以下の通りであった：
－ 配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質、ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ。ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する；
－ Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号８２および８３による抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖを含有するヘテロ三量体タンパク質、ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ＩＬ２ｖ。
－ 配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質、ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ。ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する；
－ Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号８２および８３による抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖを含有するヘテロ三量体タンパク質、ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ＩＬ２ｖ。
簡潔に述べれば、ＮＫｐ４６を発現し、かつ高いレベルのＣＤ１６を発現するように改変された１００００個のＫＨＹＧ－１細胞を、７．５ｕｇ／ｍＬ～０．０１ｎｇ／ｍＬの連続希釈の試験分子と５０ｈインキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて細胞増殖を評価した（ｙ軸上にＲＬＵ）。結果を図９において示している。データは、ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４ｖ２Ａは、ＮＫ細胞増殖を誘導するためにＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４－ＩＬ２ｖ多特異性タンパク質よりも強力であることを示した。
［実施例９］
［実施例９］
非ヒト霊長動物へのＣＤ２０－ＮＫＣＥ４の投与
この実験において、配列番号８２および８３のＶＨ／ＶＬペアのＣＤ２０－１結合性ドメインおよびＮＫｐ４６結合性ドメインをいずれも組み込んだＮＫＣＥ４のいくつかのフォーマットを試験した。
この実験において、配列番号８２および８３のＶＨ／ＶＬペアのＣＤ２０－１結合性ドメインおよびＮＫｐ４６結合性ドメインをいずれも組み込んだＮＫＣＥ４のいくつかのフォーマットを試験した。
この実験において含まれる試験タンパク質は以下の通りであった：
－ ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、配列番号１０１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１０３のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖを含有する；
－ ＣＤ２０－１－Ｔ６－ＮＫＣＥ４は、配列番号１０４のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号１０５のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１０６のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－１－Ｔ６－ＮＫＣＥ４は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異されたＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖを含有する。
－ ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、配列番号１０１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１０３のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖを含有する；
－ ＣＤ２０－１－Ｔ６－ＮＫＣＥ４は、配列番号１０４のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、配列番号１０５のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖、および配列番号１０６のアミノ酸配列の第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ＣＤ２０－１－Ｔ６－ＮＫＣＥ４は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６結合性を消失させるために突然変異されたＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖを含有する。
第１の多特異性タンパク質ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４はＦｃコンピテントであり、ＣＤ１６Ａに結合することができるＣＨ２－ＣＨ３ドメインを有していた一方、第２の多特異性タンパク質ＣＤ２０－１－Ｔ６－ＮＫＣＥ４はＦｃ非コンピテントであり、ＣＤ１６Ａに対する結合を予防する突然変異を有するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを有していた。これらの多特異性タンパク質を次に非ヒト霊長動物の静脈内に、ＦｃコンピテントＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４について体重１ｋｇ当たり０．０５ｍｇおよび体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇの用量において、ならびにＦｃ非コンピテントＣＤ２０－１－Ｔ６－ＮＫＣＥ４について０．５ｍｇ／ｋｇの用量において投与した。これらの３つの設定の各々を、４匹の非ヒト霊長動物を含むコホートに投与した（対照としての媒体との比較）。
これらの多特異性タンパク質の薬物動態を、それらの血清濃度を経時的に測定することにより追跡した。結果を図１０Ａにおいて示している。
１匹は０．０５ｍｇ／ｋｇおよび他の２匹は０．５ｍｇ／ｋｇにおいて、ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４（Ｆｃコンピテント）を用いて処置された３匹の抗薬物抗体フリーの動物について、評価可能な終末半減期を算出した。０．０５ｍｇ／ｋｇの用量についての終末半減期は１４６時間（６日）であった。０．５ｍｇ／ｋｇの用量についての終末半減期は３１１時間（１３日）および１７５時間（７日）であった。インビボ安定性の結果は、多特異性タンパク質は、例えば２、３または４週毎であり得る、ヒトへの投与と適合性であることを示す。
ＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４タンパク質が、ＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の発現、ＮＫ細胞に対する細胞傷害性およびＮＫ細胞の増殖を誘導する濃度をヒトＰＢＭＣにおいてインビトロで決定し、体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇにおいて投与された注射後２２日目におけるＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４の最大血清濃度およびＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４の血清濃度と比較した。結果を図１０Ｂにおいて示している。結果は、体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇにおいて投与されたＣＤ２０－１－Ｔ５－ＮＫＣＥ４の２２日目における血清濃度は、ｐＳＴＡＴ５誘導、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性およびＮＫ細胞増殖の各々についてのＥＣ５０値またはそれより高い値のままであったことを示す。
いくつかのサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＩＬ－１β）の放出もまた多特異性タンパク質の注射後にモニターした。結果を図１４において示している。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１の放出の一時的な増加が、注射後の最初の５日間に観察され、その後にベースラインまで減少した。多特異性タンパク質は、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１β放出に対して影響力を有しなかった。結論として、ＣＤ２０特異的ＮＫＣＥ４分子は、非ヒト霊長動物において低い全身性サイトカイン放出を誘導したが、図１５に示されるように、ＣＤ２０発現Ｂ細胞の強い枯渇を提供した。
［実施例１０］
［実施例１０］
非ヒト霊長動物へのＣＤ２０－ＮＫＣＥ４の投与における免疫細胞集団の研究
多特異性タンパク質を非ヒト霊長動物の静脈内または皮下に、週毎（すなわち実験の０、７および１４日目）に投与された体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇの用量において投与した。２匹の非ヒト霊長動物（２２５８および２２６１）は、ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａの用量を静脈内に与えられた一方、１匹（２２６２）は皮下注射により用量を与えられた。
多特異性タンパク質を非ヒト霊長動物の静脈内または皮下に、週毎（すなわち実験の０、７および１４日目）に投与された体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇの用量において投与した。２匹の非ヒト霊長動物（２２５８および２２６１）は、ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａの用量を静脈内に与えられた一方、１匹（２２６２）は皮下注射により用量を与えられた。
循環Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞の数をフローサイトメトリーにより経時的に追跡した。結果を図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃにおいて示している。多特異性タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａの投与は、Ｂ細胞の強いかつ持続的な枯渇（約１００％）を誘導した。追加的に、特に多特異性タンパク質の第１の投与（０日目）後に、ＴおよびＮＫ細胞集団の中等度の拡大／収縮が観察されたが、枯渇はこれらの細胞集団について観察されなかった。
ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａにより誘導されるＢ、ＴおよびＮＫ細胞サブセットの枯渇をヒトＰＢＭＣにおいてインビトロでさらにモニターし、ＣＤ１６ＡおよびＮＫｐ４６に結合するアイソタイプ対照多特異性タンパク質（ＩＣ－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ）、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６に結合するがＩＬ－２部分を含まない多特異性タンパク質（ＣＤ２０－２－Ｆ１３－ＮＫＣＥ３）、ならびに対照ＩＬ－２タンパク質（ＨｉｓおよびＢｉｒＡタンパク質タグに連結されたＩＬ－２）と比較した。
試験されたタンパク質は以下を含んでいた：
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する；
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａと同じ構造を有し、ＣＤ２０ ＡＢＤがアイソタイプ対照により置換されている（ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬが、実験において存在するいかなるタンパク質にも結合しないＶＨ／ＶＬペアにより置き換えられている）、ＩＣ－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ。
－ ＣＤ２０－２－Ｆ１３－ＮＫＣＥ３は、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号９７のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｆ１３－ＮＫＣＥ３は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖを含有する。
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ、ＩＬ２ｖ２Ａを含有する；
－ ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａと同じ構造を有し、ＣＤ２０ ＡＢＤがアイソタイプ対照により置換されている（ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬが、実験において存在するいかなるタンパク質にも結合しないＶＨ／ＶＬペアにより置き換えられている）、ＩＣ－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａ。
－ ＣＤ２０－２－Ｆ１３－ＮＫＣＥ３は、配列番号１のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、および配列番号９７のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ＣＤ２０－２－Ｆ１３－ＮＫＣＥ３は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２０ ＶＨ／ＶＬペア（Ｆａｂ）、ＣＤ１６に結合するＦｃドメイン二量体、ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖを含有する。
結果を、Ｂ細胞について図１１Ａおよび図１１Ｂにおいて、Ｔ細胞について図１２Ａおよび図１２Ｂにおいて、ならびにＮＫ細胞について図１３Ａおよび図１３Ｂにおいて示している。図１１Ａおよび図１１Ｂにおいて示されるように、１０－１ｎＭの範囲の多特異性タンパク質ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡおよびＣＤ２０－２－Ｆ１３－ＮＫＣＥ３は、ほぼ１００％のＢ細胞を枯渇させることができた。ＩＬ２もＩＣ－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２ＡもＢ細胞枯渇を誘導することはできなかった。図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３Ａおよび図１３Ｂにおいて示されるように、試験されたタンパク質のいずれも、有意なＴ細胞またはＮＫ細胞枯渇を誘導することはできなかった。
結果は、ＣＤ２０－２－Ｔ１３－ＮＫＣＥ４－ｖ２Ａは、ＮＫ細胞の同胞殺傷を引き起こすことなく、Ｂ細胞を枯渇させる能力において非常に強力であることを示す。
すべての見出しおよび副見出しは、簡便性のためにのみ本明細書において使用されており、いかなるようにも本発明を限定するとして解釈されるべきではない。すべての可能なバリエーションにおける上記される要素の任意の組合せは、本明細書において他に指し示されないか、または他に明確に文脈に矛盾しなければ、本発明により包含される。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において他に指し示されなければ、範囲内に入る各々の別々の値に個々に言及する簡略化された方法として役立つことが単に意図され、各々の別々の値は、それが本明細書において個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。他に記載されなければ、本明細書において提供されるすべての正確な値は、対応するおおよその値の代表的なものである（例えば、特定の因子または測定に関して提供されるすべての正確な例示的な値は、適切な場合に、「約」により改変された、対応するおおよその測定値も提供すると考えられ得る）。本明細書において記載されるすべての方法は、本明細書において他に指し示されないか、または他に明確に文脈に矛盾しなければ、任意の好適な順序において行われ得る。
本明細書において提供される任意のおよびすべての例、または例示的な表現（例えば、「例えば」）の使用は、本発明をより良好に説明することが単に意図され、他に指し示されなければ、本発明の範囲に対する限定を課さない。本明細書中のいかなる記載も、明示的に記載されなければ、任意の要素が本発明の実施にとって必須であることを指し示すとして解釈されるべきではない。
１つまたは複数の要素への言及などの用語を使用する本発明の任意の態様または実施形態の本明細書における記載は、他に記載されないか、または明確に文脈に矛盾しなければ、その１つまたは複数の特定の要素「からなる」か、「から本質的になる」か、またはそれを「実質的に含む」本発明の類似した態様または実施形態のためのサポートを提供することが意図される（例えば、特定の要素を含むとして本明細書において記載される組成物は、他に記載されないか、または明確に文脈に矛盾しなければ、その要素からなる組成物もまた記載するとして理解されるべきである）。
本発明は、適用法により許容される最大の程度まで本出願において提示される態様または請求項において記載される主題のすべての改変および均等物を含む。
本明細書において参照されるすべての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが特におよび個々に指し示されたかのようにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以上の発明が、理解を明確にする目的のために実例および例によってある程度詳細に記載されたが、ある特定の変更および改変が、添付の請求項の精神または範囲から離れることなくそれに対してなされてもよいことは本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかとなる。
Claims (43)
- ヒトＣＤ２０、ヒトＮＫｐ４６、ヒトＣＤ１２２、および適宜ＣＤ１６Ａに特異的に結合する、多量体結合性タンパク質であって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、配列番号９のアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３の（ＩＩＩ）ポリペプチド鎖；
または、
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、配列番号７３のアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖、および配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３の（ＩＩＩ）ポリペプチド鎖
または、
ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、配列番号６７のアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む第３の（ＩＩＩ）ポリペプチド鎖
を含む、前記多量体結合性タンパク質。 - 前記第１、第２および／または第３のポリペプチド鎖が１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、前記タンパク質が、配列番号１、６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の（Ｉ）ポリペプチド鎖、配列番号６、６７、７０、または７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第２の（ＩＩ）ポリペプチド鎖、および適宜、配列番号１７または７４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第３の（ＩＩＩ）ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載の多量体結合性タンパク質。
- 前記タンパク質が、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第１および第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）を含み、各々のＶＨおよびＶＬが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み；かつ
（ｉ）前記第１の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）が、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含み；
（ｉｉ）前記第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）が、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ２、ならびに
－ 配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ２
を含む、請求項２に記載の多量体結合性タンパク質。 - 前記タンパク質が変異型ＩＬ－２ポリペプチドを含み、前記変異型ＩＬ－２が配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多量体結合性タンパク質。
- 前記タンパク質が、ヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに結合する免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分を含み、免疫グロブリンＦｃ領域の前記全体または部分が、配列番号６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の多量体結合性タンパク質。
- 第１および第２の抗原結合性ドメイン（ＡＢＤ）、サイトカイン部分ならびに免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分を含む、結合性タンパク質であって、前記ＡＢＤの各々が免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、各々のＶＨおよびＶＬが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含み；かつ
（ｉ）前記第１のＡＢＤが、ヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号２９（ＨＣＤＲ１）、配列番号３２（ＨＣＤＲ２）、配列番号３５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ１、ならびに
－ 配列番号３８（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１（ＬＣＤＲ２）、配列番号４４（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ１
を含み；
（ｉｉ）前記第２のＡＢＤが、ヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、かつ
－ 配列番号４７（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０（ＨＣＤＲ２）、配列番号５３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨ２、ならびに
－ 配列番号５６（ＬＣＤＲ１）、配列番号５９（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ２
を含み；
前記サイトカイン部分が変異型ＩＬ－２であり；
かつ前記免疫グロブリンＦｃ領域またはその変異型の全体または部分がヒトＦｃＲｎポリペプチドに結合する、前記結合性タンパク質。 - 前記第１のＡＢＤがＦａｂ構造を有する、請求項６に記載の結合性タンパク質。
- 一緒になって前記第１のＡＢＤおよび前記第２のＡＢＤを構成する３つのポリペプチド鎖（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ （Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｃ２Ａ（ＩＩ）
Ｖ２Ｂ－Ｃ２Ｂ－ヒンジ３－Ｌ２－ＩＬ－２ （ＩＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂが前記第１のＡＢＤの結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂが前記第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢがペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、かつＣ２ＡおよびＣ２ＢがペアＣ２（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、
ＣＨ１が免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬが免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１、ヒンジ２およびヒンジ３が、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し、ヒンジ３が適宜であり；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂが、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１およびＬ２がアミノ酸リンカーであり、Ｌ１およびＬ２が異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２が、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である、請求項６または７に記載の結合性タンパク質。 - ＣＨ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり；
ＣＫが、配列番号４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＫ）であり；
（Ｆｃドメイン）Ａが、配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
（Ｆｃドメイン）Ｂが、配列番号１４のアミノ酸配列に対応するＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
ヒンジ１が配列番号５のアミノ酸配列に対応し；
ヒンジ２が配列番号１３のアミノ酸配列に対応し；
ヒンジ３が配列番号１９のアミノ酸配列に対応し；
Ｌ１が配列番号１５のアミノ酸配列に対応し；
Ｌ２が配列番号２０～２３のアミノ酸配列のいずれか１つに対応する、請求項８に記載の結合性タンパク質。 - 少なくとも１つのジスルフィドブリッジにより連結された少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- 前記ポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）が、Ｃ１Ａとヒンジ２との間の１つのジスルフィドブリッジ、ヒンジ１とヒンジ２との間の２つのジスルフィドブリッジにより連結されており、かつ前記ポリペプチド鎖（ＩＩ）および（ＩＩＩ）が、ヒンジ３とＣ２Ｂとの間の１つのジスルフィドブリッジにより連結されている、請求項８～１０に記載の結合性タンパク質。
- Ｖ１ＡがＶＬ１であり、かつＶ１ＢがＶＨ１である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- Ｖ２ＡがＶＨ２であり、かつＶ２ＢがＶＬ２である、請求項６～１２のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- Ｃ１ＡがＣＫであり、かつＣ１ＢがＣＨ１である、請求項６～１３のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- Ｃ２ＡがＣＫであり、かつＣ２ＢがＣＨ１である、請求項６～１４のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- Ｃ２ＡがＣＨ１であり、かつＣ２ＢがＣＫである、請求項６～１４のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- （ａ）ＶＨ１およびＶＬ１がそれぞれ配列番号１１および３のアミノ酸配列に対応し、
かつ／または
（ｂ）ＶＨ２およびＶＬ２がそれぞれ配列番号９３および９５のアミノ酸配列に対応する、請求項６～１６のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。 - 前記変異型ＩＬ－２が、配列番号２４～２８および６５から選択される配列またはその少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは１００個のアミノ酸残基の連続する配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６～１７のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- － ポリペプチド（Ｉ）が配列番号１のアミノ酸配列からなり；
－ ポリペプチド（ＩＩ）が配列番号９のアミノ酸配列からなり；かつ
－ ポリペプチド（ＩＩＩ）が配列番号１７のアミノ酸配列からなる、請求項６～１８のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。 - ＣＤ２０に結合する前記第１のＡＢＤがＦａｂであり、かつＮＫｐ４６に結合する前記第２のＡＢＤがｓｃＦｖである、請求項６に記載の結合性タンパク質。
- 前記第２のＡＢＤおよびサイトカイン部分が配置：
－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２
を有し、
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂが前記第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３がアミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２が、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である、請求項６または２０に記載の結合性タンパク質。 - 前記結合性タンパク質が、２つのポリペプチド鎖（Ｉ）および（ＩＩ）：
Ｖ１Ａ－Ｃ１Ａ－ヒンジ１－（Ｆｃドメイン）Ａ （Ｉ）
Ｖ１Ｂ－Ｃ１Ｂ－ヒンジ２－（Ｆｃドメイン）Ｂ－Ｌ１－Ｖ２Ａ－Ｌ２－Ｖ２Ｂ－Ｌ３－ＩＬ－２ （ＩＩ）
を含み、
Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂが前記第１のＡＢＤの結合ペアＶ１（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成し；
Ｖ２ＡおよびＶ２Ｂが前記第２のＡＢＤの結合ペアＶ２（ＶＨ２／ＶＬ２）を形成し；
Ｃ１ＡおよびＣ１ＢがペアＣ１（ＣＨ１／ＣＬ）を形成し、ＣＨ１が免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１であり、かつＣＬが免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ヒンジ１およびヒンジ２が、同一であるかまたは異なり、かつ免疫グロブリンヒンジ領域の全体または部分に対応し；
（Ｆｃドメイン）Ａおよび（Ｆｃドメイン）Ｂが、同一であるかまたは異なり、かつＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３がアミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が異なるかまたは同じであり得；
ＩＬ－２が、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１２２に結合する変異型ヒトインターロイキン－２ポリペプチドまたはその部分である、請求項６または２０～２１に記載の結合性タンパク質。 - Ｖ１ＡがＶＬ１であり、かつＶ１ＢがＶＨ１であり、かつＶ２ＡがＶＨ２であり、かつＶ２ＢがＶＬ２である、２１～２２のいずれか一項（ａｎｙ ｏｎｅ ｏｆ ２１－２２）に記載の結合性タンパク質。
- （ａ）ＶＨ１およびＶＬ１がそれぞれ配列番号１１および３のアミノ酸配列に対応し、
かつ／または
（ｂ）ＶＨ２およびＶＬ２がそれぞれ配列番号９３および９５のアミノ酸配列に対応する、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。 - 少なくとも１つのジスルフィドブリッジにより連結された２つのポリペプチド鎖を含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- 野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較してＣＤ２５に対する結合性の低減を示す変異型ＩＬ－２を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- 前記Ｆｃ領域がヒトＣＤ１６Ａポリペプチドに結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- 配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項６および２０～２７のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- － ポリペプチド（Ｉ）が配列番号１のアミノ酸配列からなり；かつ
－ ポリペプチド（ＩＩ）が配列番号７０のアミノ酸配列からなる、請求項６および２０～２７のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。 - 前記Ｆｃ領域が、ｋａｂａｔ番号付けに従ってＨ４３５Ｒおよび／またはＹ４３６Ｆ置換を含む、請求項６～２７のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- 請求項１～３０のいずれか一項に記載の結合性タンパク質および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 請求項１～３０のいずれか一項に記載の結合性タンパク質またはそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項３２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項３２に記載の核酸分子を含む、単離された細胞。
- 請求項３３に記載の発現ベクターを含む、単離された細胞。
- 前記宿主細胞（ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）が哺乳動物細胞である、請求項３４または３５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
- 医薬としての使用のための、請求項１～３０のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- ＣＤ２０発現細胞が関与する疾患の処置における使用のための、請求項１～３０のいずれか一項に記載の結合性タンパク質。
- 対象において疾患を処置しかつ／またはＣＤ２０発現細胞を排除する方法であって、適宜、前記疾患がＣＤ２０発現細胞により特徴付けられ、前記方法が、前記対象に請求項１～３０のいずれか一項に記載の結合性タンパク質を投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患が、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンまたは非ホジキンＢ細胞リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫および成熟Ｂ細胞新生物、例えばＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ型、結節型および脾臓型）、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群から選択される、請求項３７もしくは３８に記載の使用のための結合性タンパク質または請求項３９に記載の疾患を処置する方法。
- 前記疾患が、低いレベルのＣＤ２０を発現する細胞により特徴付けられる、請求項３７～４０に記載の使用のための結合性タンパク質または疾患を処置する方法。
- 前記多特異性タンパク質が、月当たり１～４回、または３もしくは４週毎に１回投与され、適宜、処置が、少なくとも３か月、６か月または１２か月の期間にわたりなされる、請求項３７～４１に記載の使用のための結合性タンパク質または疾患を処置する方法。
- 請求項１～３０のいずれか一項に記載の結合性タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）複数の組換えポリペプチドを発現させるために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、前記複数の組換えポリペプチドが、（ｉ）配列番号１、６６、６８または７７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、７８または７９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および適宜（ｉｉｉ）配列番号１７または７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、工程；
（ｂ）適宜、前記発現された組換えポリペプチドを回収する工程
を含む、前記方法。
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