JP2024521372A - 塩分別沈殿を用いた細胞外小胞体分離方法 - Google Patents

塩分別沈殿を用いた細胞外小胞体分離方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2024521372000001
本発明は、分別沈殿（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を用いて生物学的試料から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法及びキットに関する。前記方法及びキットによれば、迅速な分離が可能であり、試料供給源に関係なく様々な種類の生物学的試料から効果的に細胞外小胞体を分離可能である。既存の沈殿法ベース細胞外小胞体分離方法と違い、洗浄によって塩を容易に除去でき、純度及び収率の高い細胞外小胞体を分離できるという長所があり、研究及び診断分野における少量細胞外小胞体分離及び産業的応用のための大量細胞外小胞体分離のいずれにも適用可能である。

Description

本発明は、生物学的試料から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法に関し、より詳細には、生物学的試料に塩（ｓａｌｔ）を添加する段階を含む細胞外小胞体分離方法及び分離用キットに関する。
細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）は、タンパク質、脂質及び核酸を含む分子物質の運搬が可能な脂質二重層で囲まれた微細粒子で、真核生物及び原核生物の両方においてほぼ全ての種類の細胞によって放出される。細胞間通信、信号伝達などを含む様々な生物物理学的過程に参加する。初期には、細胞死滅又はアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）中に放出される細胞副産物（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｕｓｔ）として知られたが、最近の研究によれば、細胞間信号伝達において重要な伝達者であり、癌細胞の転移、免疫機能、組織の再生などに関連しているものと報告されており、癌のような特定疾患の診断に関連したバイオマーカーとしての役割も知られている。細胞外小胞体は、数十ナノミリメートルサイズのエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と数百ナノミリメートルサイズの微細小嚢（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とに区別できる。複雑な生体試料からの細胞外小胞体の分離は、医療分野において疾病診断、治療モニタリング及び遺伝子又は薬物伝達による標的治療などに様々な利用可能性があり、よって、生物学的流体からそれらを効率的に分離する技術が要求されている。
細胞外小胞体を分離する様々な方法が存在する。最も広く用いられている方法は超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ；ＵＣ）であるが、高価の装備、長い処理時間及び低い収率の不具合から、細胞外小胞体の物理化学的特性に基づく他の分離方法及びキットが開発された。例えば、ポリマーを用いた様々な試薬（ポリエチレングリコール、体積排除ポリマー）が開発され、様々な生物学的サンプルにおいて細胞外小胞体分離用に商用化している（ＵＳ９，００５，８８８Ｂ、ＵＳ９，６７１，３２１Ｂ、ＵＳ２０２０／０１７９８２７Ａ）。しかし、分離後に細胞外小胞体サンプルに一緒に残っている高分子試薬は、次の段階に行われる様々な分析反応に邪魔になり得るという不具合があった。
また、細胞外小胞体の表面生化学的特性に基づく親和性ベース分離方法も開発されている（ｈｅｐａｒｉｎ：ＵＳ９，８２９，４８３Ｂ；Ｂａｌａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５；５：１０２６６；ＳｉＣ：ＵＳ２０１９／００７８０７８Ａ；Ｔｉｍ４：Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６；６：３３９３５；ｍａｇ ｃａｐｔｕｒｅ；Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｉｍ４，Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６；ｍａｇ ｃａｐｔｕｒｅ，Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４）。このような方法は、類似の表面親和的特性を有する分子が共に混合されて分離されるという点、細胞外小胞体特異的な特定抗体が要求されるという点、細胞外小胞体分離収率が再現されないという点といった限界がある。
塩を用いた細胞外小胞体分離方法としては、０．１Ｍ、ｐＨ ４．７５酢酸ナトリウム緩衝液（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４，４０７，１２０－６，ＵＳ９，８３５，６２６Ｂ）を用いて、ＥＶ表面においてホスホチジルセリンの電荷中和（ｃｈａｒｇｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）による細胞外小胞体の沈殿を試みたことがある。この研究では、低いｐＨにおいてより高い細胞外小胞体獲得収率を得たし、このようなｐＨ依存性は、実際には、中性である生体試料から細胞外小胞体を分離する過程には理想的でない。これは、血漿及び小便サンプルにおいて細胞外小胞体分離効率を比較した研究からも確認されたが（Ａｎａ Ｇａｍｅｚ－Ｖａｌｅｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５；６：６）、酢酸ナトリウムを用いた沈殿法は、他のテスト方法に比べて細胞外小胞体回収率が顕著に低かった。したがって、生体試料から細胞外小胞体を効率的に分離するためのより良い方法の開発が切に必要である。
そこで、本発明者らは、試料ボリューム、類型、試料供給源に関係なく生物学的試料からＥＶを分離するのに使用でき、拡張可能であり、高い収率のＥＶ分離が可能な、迅速、効率的且つ利用しやすい方法を開発しようと鋭意努力した結果、硫酸アンモニウム（ＡＳ）などの塩を用いた細胞外小胞体分離方法が血漿、血清、小便、培養液などのような様々な生物学的試料から、試料の体積、類型、供給源などに関係なく様々な生物学的試料から迅速ながら高収率で細胞外小胞体を分離できる利用しやすい細胞外小胞体分離方法であり、特に、次第に増加する濃度の塩添加による多段階塩沈殿法を用いると、様々なタンパク質不純物を沈殿させて高効率で不純物を除去できることを確認し、本発明を完成するに至った。
本背景技術の部分に記載された上記の情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって周知の先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
本発明の目的は、生物学的流体試料又は生物学的組織試料のような生物学的試料から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を効果的に分離する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）分離用キットを提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）生物学的流体試料に、濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように塩（ｓａｌｔ）を添加する段階；（ｂ）前記塩が添加された試料から、凝集又は沈殿した細胞外小胞体分画と上澄液を分離する段階；及び、（ｃ）前記（ｂ）段階で分離された細胞外小胞体分画を脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）して細胞外小胞体を分離する段階を含む、生物学的流体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅ）から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法を提供する。
本発明は、また、（ａ）生物学的組織試料を溶解（ｌｙｓｉｎｇ）又は粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）して精製（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）する段階；（ｂ）前記精製された試料に、濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように塩（ｓａｌｔ）を添加する段階；（ｃ）前記塩を添加した試料から、凝集又は沈殿した細胞外小胞体分画と上澄液を分離する段階；及び、（ｄ）前記（ｃ）段階で分離された細胞外小胞体分画を脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）して細胞外小胞体を分離する段階を含む、生物学的組織試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ）から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法を提供する。
本発明は、また、塩（ｓａｌｔ）及び緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）を含む細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）分離用キットを提供する。
生物学的流体から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離するための多段階塩分別沈殿（ｓａｌｔ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＳＰ）を示す模式図である。
６段階ＳＰによる血漿からのＥＶ分離を示す模式図である。
６段階ＳＰを用いた血漿から分離された分画の総タンパク質含有量及びＥＶ含有量の分析結果を示すグラフである。図３のＡは総タンパク質量比較（ＢＣＡ分析）；図３のＢはＥＶの回収率比較；図３のＣはＥＶマーカーであるＣＤ９－ＣＤ８１（膜表面）及びＡｌｉｘ（内部）に対するＥＬＩＳＡ結果であり、Ｆ３及びＦ４分画にＥＶ含有量が最も高いことが確認できる。
６段階ＳＰを用いた血漿から分離された分画内に存在するタンパク質不純物であるアルブミン及びリポタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。図４のＡはアルブミン；図４のＢはＡｐｏ－ＡＩ；図４のＣはＡｐｏ－Ｂ；図４のＤはＡｐｏ－Ｅを示すものであり、Ｆ５及びＦ６分画に不純物タンパク質が最も多く存在することが確認できる。
３段階ＳＰによって形成された分画のＥＶマーカー（ＣＤ９－ＣＤ８１（膜表面）及びＡｌｉｘ（内部））に対する比較ＥＬＩＳＡ結果を示すグラフであり、同じ最終濃度において固体ＡＳ（図５のＡ）及び液体ＡＳ（図５のＢ）を用いて比較した結果である。
０．４ｍＬ（図６のＡ）及び４ｍＬ（図６のＢ）血漿を使用して３段階ＳＰによって形成された分画のＥＶマーカーＣＤ９－ＣＤ８１及びＡｌｉｘに対するＥＬＩＳＡ結果を示すグラフであり、ＳＰは拡張可能であり、少量及び大量の試料のいずれにも利用可能であることが確認できる。
新鮮な又は冷凍保管してから解凍した血漿又は血清から２段階ＳＰによって分離されたＥＶの特性化を示す図である。図７のＡは総タンパク質定量（ＢＣＡ）；図７のＢはＥＶの回収率；図７のＣはＥＶマーカーに対するＥＬＩＳＡ結果；図７のＤはＮＴＡ分析結果である。
２段階ＳＰを用いて血漿から分離したＥＶ及びＥｘｏＱｕｉｃｋ及びｅｘｏＥａｓｙなどの他の分離キットで分離したＥＶの収率及び総タンパク質量を分析した結果を示す図である。総タンパク質定量化のためのＢＣＡ分析によるＥＶ分析（図８のＡ）及びＥＶの回収率（図８のＢ）を示すグラフであり、ＳＰによって分離されたＥＶが他の沈殿法に比べてＥＶ収率が高く、タンパク質不純物含有量が少ないことを示す。
２段階ＳＰを用いて血漿から分離したＥＶと、ＥｘｏＱｕｉｃｋ及びｅｘｏＥａｓｙなどの他の分離キットで分離したＥＶのＮＴＡ分析結果を示すグラフであり、各方法で分離されたＥＶの濃度（図９のＡ）及びサイズ分布（図９のＢ）結果である。
ＳＰ、Ｅｘｏｑｕｉｃｋ及びｅｘｏＥａｓｙキットで分離されたＥＶのＴＥＭ（透過電子顕微鏡）イメージである。
ＬＮＣａＰ由来ＥＶを添加したブタ血漿から２段階ＳＰによって分離されたＥＶに対する総タンパク質定量、ＥＬＩＳＡによるＥＶ分析結果を示すグラフであり、図１１のＡは総タンパク質定量；図１１のＢはＥＶマーカー用ＥＬＩＳＡ結果である。
ＳＰによる生物学的流体からＥＶの分離を示す模式図である。
様々なウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度を有するＬＮＣａＰ培養液からＥＶ分離のための最適硫酸アンモニウム（ＡＳ）の濃度評価のためのＣＤ９－ＣＤ８１サンドウィッチ酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）結果を示す図である。図１３のＡは無血清ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ培養液；図１３のＢは５％ ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培養液；図１３のＣは５％エクソソームフリー（Ｅｘｏ－Ｆｒｅｅ，ＥＦ）－ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培養液；図１３のＤは０．１％エクソソームフリー－ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ培養液を用いた結果である。
様々なＦＢＳ濃度を有するＬＮＣａＰ培養液から塩沈殿（ＳＰ）によって分離されたＥＶの分析結果を示すグラフであり、図１４（Ａ）は総タンパク質定量；図１４（Ｂ）はＥＶの回収率結果である。
ＬＮＣａＰ培養液から塩沈殿（ＳＰ）によって分離されたＥＶのＮＴＡ分析結果を示すグラフであり、無血清培養液（図１５のＢ）及び５％エクソソームフリー（ＥＦ）－ＦＢＳ（図１５のＣ）を含む培養液から得たＥＶの濃度（図１５のＡ）及びサイズ分布（図１５のＢ及び図１５のＣ）を示す図である。
ＬＮＣａＰ培養液からＳＰによって分離されたＥＶのＴＥＭイメージであり、図１６のＡは無血清培養液；図１６のＢは５％ ＥＦ－ＦＢＳ含有培養液を用いた結果である。
硫酸アンモニウムと酢酸ナトリウムを使用した沈殿方法で分離したＥＶの比較グラフであり、図１７のＡは総タンパク質定量化によるＥＶ分析；図１７のＢはＥＶの回収率；図１７のＣはＮＴＡ分析結果である。
小便からＳＰによって分離されたＥＶの特性化を示す図であり、図１８（Ａ）は総タンパク質定量化；図１８（Ｂ）はＥＶの回収率結果グラフである。
同じ供与者の血漿及び血清からＳＰによって分離されたＥＶの特性化を示す図であり、図１９（Ａ）は総タンパク質定量；図１９（Ｂ）はＥＶの回収率結果グラフである。
ＳＰ及びＵＣによってＭＤＡ－ＭＢ２３１培養液から分離されたＥＶを使用したスクラッチ傷治癒分析の結果を示す図であり、図２０Ａは、ＥＶと共に０時間及び２０時間の治療において撮った傷縫合の代表的なイメージ；図２０のＢは、（ｉ）５μｇ／ｍＬ、（ｉｉ）１０μｇ／ｍＬ、及び（ｉｉｉ）２０μｇ／ｍＬ ＥＶにおいてＥＶ線量に対する傷縫合百分率を示すグラフである。
標準（図２１のＡ）及び癌（図２１のＢ）ＥＶマーカーのＰＣＲ分析結果を示すグラフであり、プロテイナーゼの非処理（ｉ）及び処理（ｉｉ）時に、ＳＰと、他のＥＶ分離方法である超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ＵＣ）、Ｑｉａｇｅｎ及びＮｏｒｇｅｎを比較した結果である。
様々な段階のＳＰ方法を用いて血漿から分離したＥＶの回収率と純度を共に比較した結果である。
ホーフマイスター系列（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ）を示す図であり、系列の左側にあるイオンはタンパク質を安定化させ、赤色で表示された（ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｍｇ２ ＋、ＳＯ４ ２－、ＨＰＯ４ ２－、ＣＨ３ＣＯＯ－、Ｃｉｔｒａｔｅ－、Ｃｌ－）、系列左側の陽イオンと陰イオンが結合している塩がＥＶ沈殿に使用された。
様々な塩を用いて、前立腺（ＬＮＣａＰ、図２４のＡ）及び乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ２３１、図２４のＢ）細胞調整培地においてＥＶの回収率（％）を示すグラフである。
別に断りのない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明に属する技術の分野における熟練した専門家に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使われるものである。
本明細書において、塩沈殿（ｓａｌｔ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、分別塩沈殿（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓａｌｔ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及び塩分別沈殿（ｓａｌｔ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）はいずれも同じ意味で使われ、「ＳＰ」と略される。塩沈殿は、生物学的試料に塩を添加することによって、凝集又は沈殿した分画と上澄液を分離させる方法を意味する。
本明細書において、「細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）」は、核酸、タンパク質又はその他生体分子を含み得る小さな分泌小胞（一般的に約３０～８００ｎｍ）で、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）及び微細小嚢（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を含む。生命体又は生物学的システムの様々な位置に生体分子物質を移動させることによって細胞伝達者の役割を担うことができる。
本明細書において、用語「生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」は、生物学的流体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅ）及び生物学的組織試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ）を含む。
本発明の一実施例では、塩添加及び脱塩段階を含む細胞外小胞体分離方法が、従来の技術に比べて分離方式が簡単であり、非常に高い分離効率と純度を有し、超遠心分離段階を含まずにも短時間で細胞外小胞体を非常に効率よく分離できることを確認した。
特に、従来の沈殿法ベースの細胞外小胞体分離方法では、細胞外小胞体分離のために添加した添加剤が一緒に混ざっている短所があったのに対し、本発明に係る塩は、脱塩のための洗浄過程で添加剤が容易に除去され、より純度の高い細胞外小胞体を分離できるという長所がある他、血漿、血清、小便、唾液、組織、細胞培養液などの様々なバイオ試料に適用可能であり、産業的応用のための大容量細胞外小胞体試料の準備の他、診断及び治療分野に必要な少量の細胞外小胞体試料の準備にも適することを確認した。
したがって、本発明は、一観点において、（ａ）生物学的流体試料に、濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように塩（ｓａｌｔ）を添加する段階；（ｂ）前記塩が添加された試料から、凝集又は沈殿した細胞外小胞体分画と上澄液を分離する段階；及び、（ｃ）前記（ｂ）段階で分離された細胞外小胞体分画を脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）して細胞外小胞体を分離する段階を含む、生物学的流体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅ）から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法に関する。
本発明において、用語「飽和濃度（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」は、試料に塩が添加されて溶解平衡状態に到達する濃度を意味する。前記飽和濃度は、塩の種類、試料の種類、温度又は圧力によってそれぞれ異なり得ることは、通常の技術者に自明である。
本発明において、例えば、生物学的試料が水（ｗａｔｅｒ）のような状態を有するとき、これに対する硫酸アンモニウムの飽和濃度は２５℃で４．１Ｍ、リン酸アンモニウムの飽和濃度は２５℃で３．９Ｍ、リン酸カリウムの飽和濃度は２５℃で０．８Ｍ、硫酸ナトリウムの飽和濃度は２５℃で２．０Ｍ、クエン酸三ナトリウムの飽和濃度は２５℃で３．６Ｍであることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記塩が添加された生物学的流体試料の濃度は、０．１Ｍ～飽和濃度であることを特徴とし、好ましくは０．１Ｍ～４Ｍ、より好ましくは１Ｍ～３Ｍ、さらに好ましくは１．４Ｍ～２．２５Ｍであることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記（ａ）段階は、塩を１回～１５回添加して最終濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように行うことを特徴とし得る。
すなわち、本発明に係る細胞外小胞体分離方法は、塩を添加する段階が１回であれば、単一段階（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ）塩沈殿方法に該当し、１回を超えれば、多段階（ｍｕｌｔｉ－ｓｔｅｐ）塩沈殿方法に該当する。
本発明において、前記多段階塩沈殿方法では、塩を添加する段階を２回以上反復して行うことを特徴とし、好ましくは２回～１５回、より好ましくは２回～１０回、最も好ましくは２回～６回反復して行うことを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。前記塩を添加する段階の反復時に、追加される塩は、以前段階で添加された塩と比較して塩の種類は同一でも同一でなくてもよい。また、反復回数によって各塩添加段階の濃度は変わってよく、ただし、塩添加段階の反復につれて塩添加後の試料の濃度は増加することを特徴とし得る。多段階塩沈殿は一つ以上の別個の沈殿物を生成でき、各沈殿物は独立して処理され、同一の又は異なる細胞外小胞体を得ることができる。
本発明の一実施例において、ＥＶ分離の最適塩濃度は、単一段階塩沈殿方法において１．７５～２Ｍであったし、多段階塩沈殿方法において、２段階塩沈殿では１．８～２Ｍ、３段階塩沈殿では１．５～２．２５Ｍ、６段階塩沈殿では１．４～１．９Ｍであった。
したがって、本発明において、前記（ｃ）段階は、塩が添加された試料の濃度が１．４Ｍ～２．２５Ｍである試料から分離された細胞外小胞体分画から細胞外小胞体を分離することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施例において、生物学的試料に塩を添加して沈殿物と上澄液を含む溶液を得ることができる。この溶液は、本明細書においてｆｒａｃｔｉｏｎ－１（Ｆ１）と定義した第１分画と第１上澄液とに分離される。多段階塩沈殿において、２番目の沈殿のために第１上澄液に塩を添加し、生成された溶液から第２分画であるｆｒａｃｔｉｏｎ－２（Ｆ２）と第２上澄液が分離される。第１上澄液に塩を添加しているため、２番目の溶液の塩濃度は１番目の溶液の塩濃度よりも大きいだろう。全ての分画が分離されるまで塩添加と沈殿物及び上澄液の分離過程を反復する。塩沈殿は、再懸濁された沈殿物に対しても行われてよい。
本発明において、前記塩は、コスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ；ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｉｃ ｉｏｎ）又はカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ；ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｉｏｎ）を含むことを特徴とし得る。コスモトロープとは、タンパク質構造を安定化させる塩のことを指し、カオトロープとは、タンパク質構造を不安定にさせる塩を意味する（Ｗｉｇｇｉｎｓ，Ｐ．Ｍ．（２００１）。Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４７，７３５－７４４）。
本発明において、前記塩は、多価陰イオン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎ）及び１価陽イオン（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ）を含有することを特徴とし得る。
本明細書において、用語「多価陰イオン」とは、イオンの原子価が１以上である陰イオンを意味し、「１価陽イオン」とは、原子価が１である陽イオンを意味する。
具体的には、前記多価陰イオンは、硫酸塩（ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）であり、前記１価陽イオンは、アンモニウムイオン（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｏｎ）、カリウムイオン（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｉｏｎ）又はナトリウムイオン（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｎ）であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施例において、前記塩は、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）又はクエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記塩は固体又は液体の形態であることを特徴とし得る。本発明において、前記液体形態の塩は、用語「塩溶液」と同じ意味で使われてもよい。
本発明において、前記塩は水溶性塩又は非水溶性塩であってよく、好ましくは水溶性塩であってよいが、これに限定されるものではない。非水溶性塩の溶解度を向上させるキレート剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ；例えば、ＥＤＴＡ）と共に非水溶性塩（例えば、クエン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）及び／又は水に対する溶解度が低いその他塩）も使用することができる。高濃度の塩は、試料の細胞外小胞体濃度が低い時に有用である。
本発明の一実施例において、塩が添加された細胞外小胞体試料を処理するとき、生物学的試料に一般に使用される様々な緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）が使用されてよく、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩及びＴＲＩＳバッファを含む。緩衝液のｐＨは、試料に適するいかなるｐＨであってもよく、ｐＨ ４～ｐＨ １０であってよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記（ｂ）段階は、沈降、濾過又は遠心分離によって行われることを特徴とし得る。
本発明において、前記遠心分離は、２，０００ｘｇ～１５，０００ｘｇで５分～３０分行うことを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、生物学的流体試料は、－５～４０℃の温度で処理されてよいが、これに限定されず、細胞外小胞体が崩壊されない如何なる温度条件も適用可能である。
本発明の一実施例において、血漿は、室温（ＲＴ）を維持し、室温で塩溶液を添加して第１沈殿物と上澄液を得た。第１沈殿物と上澄液は室温で濾過したり室温又は４℃で＞１００００ｘｇで遠心分離して分離される。
本発明において、前記脱塩は、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、逆浸透（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｓｍｏｓｉｓ）又は脱塩カラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて行うことを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施例において、生物学的試料に塩を添加し、沈降、濾過又は遠心分離を行うと、凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）又は沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）された沈殿物分画と上澄液とに分離され、凝集又は沈殿した分画に含まれた細胞外小胞体が、本発明に係る方法の最終分離対象であるから、凝集又は沈殿した細胞外小胞体分画と記載されている。
沈殿した細胞外小胞体は、遠心分離、濾過又はその他の方法で分離できる。小規模の場合には遠心分離が好ましく、大規模の場合には濾過が好ましい。遠心分離を用いると、沈殿物がペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を形成し、ペレッティングで上澄液を除去することができる。濾過を用いると、沈殿物が濾過紙にケーキ（ｃａｋｅ）を形成し、濾過液が上澄液である。
沈殿物は緩衝液に溶解されてよく、分離された細胞外小胞体を精製するために脱塩、追加分別、クロマトグラフィーなど又はこれらの組合せを含む追加工程を行うことができる。前記方法は、１０～１００ｎｍの孔径サイズのフィルター又は１００ｋＤ～３００ｋＤのポリマーベースのＭＷＣＯフィルターが装着された限外濾過装置を用いて塩、小分子タンパク質及び脂質タンパク質を除去する遠心接線流動濾過（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は限外濾過段階をさらに含んでよい。
遠心濾過及び／又は限外濾過はいずれも、塩、低分子量種（ｓｐｅｃｉｅｓ）及び／又は加工剤（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を除去することができる。遠心濾過又は限外濾過は、塩沈殿段階同士の間及び／又はクロマトグラフィー段階同士の間及び／又は塩沈殿段階とクロマトグラフィー段階との間に行うことができる。
本発明において、前記細胞外小胞体分画に対して限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）段階、アフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）段階又は密度勾配超遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）段階をさらに行うことを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、必須のものではないか、試料において破片を除去するために、塩沈殿前に生物学的流体試料を精製すれば、高純度細胞外小胞体を得ることができる。精製方法には、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が含まれてよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、高純度の細胞外小胞体を得るために、塩沈殿法によって分離された細胞外小胞体の表面に露出されたサイズ、密度又はタンパク質に基づいてさらに精製することができる。
密度勾配、クロマトグラフィー、超遠心分離のような既存方法を用いて、細胞外小胞体をさらに分別できる。塩を用いて得た分画からの細胞外小胞体の精製は、クロマトグラフィーを含む精製段階、又はクロマトグラフィー以外の精製段階が必要であり得る。細胞外小胞体の下位集団は、表面マーカーの存在のような細胞外小胞体の他の特性を用いて分離されてもよい。細胞外小胞体の分類に使用可能な表面マーカーには腫瘍マーカー及びＭＨＣクラスＩＩマーカーが含まれるが、これに限定されるものではない。細胞外小胞体と関連した他の表面マーカーにはＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ６３及びＣＤ８２が含まれる（Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（２００２）５６９－５７９；Ｖａｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（２００７）６５４－６５９）。
純粋な細胞外小胞体を得るために、サイズ排除、陽イオン交換、陰イオン交換、疎水性相互作用又はアフィニティークロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを行うことができるが、これに限定されるものではない。単一クロマトグラフィー工程（例えば、アフィニティークロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー）を行うことができる。一連の互いに同一又は異なるクロマトグラフィーを順次に実行し（例えば、２回のイオン交換クロマトグラフィーを順に実行、或いは、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを順に実行）、一連のプロセスを行うことができる（例えば、塩沈殿後にアフィニティークロマトグラフィーを実行し、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行）。一連の互いに異なるクロマトグラフィー工程を順に行い（例えば、アフィニティークロマトグラフィー実行後にイオン交換クロマトグラフィーを実行）、中間工程と共に一連の互いに異なるクロマトグラフィー工程を行うことができる（例えば、アフィニティークロマトグラフィー実行に続いて塩沈殿後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行）。又は、このような過程の任意の組合せを行うことができる。
表面分子を活用した純粋な細胞外小胞体を得るための方法の例示として、表面に、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ）マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１を有する細胞外小胞体を、抗体コートされた磁性粒子を用いて分離する方法を挙げることができる。例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（直径１～４．５μｍの超常磁性ビーズ）は、抗ヒトＣＤ９抗体、抗ヒトＣＤ６３抗体及び抗ヒトＣＤ８１抗体のカクテルとビーズ表面に直接接合されるか、２次リンカー（例えば、抗マウスＩｇＧ）で接合されてよい。抗体コートされたダイナビーズを、塩を用いて準備した細胞外小胞体試料に添加し、２～８℃又はＲＴで０分～一晩培養することができる。細胞外小胞体が結合したダイナビーズは磁石を用いて収集できる。分離されたビーズ結合細胞外小胞体は、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような適切な緩衝液に再懸濁され、ダウンストリーム分析（逆転写実時間重合酵素連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、シーケンシング、ウェスタン、流細胞分析など）に用いられてよい。これと類似のプロトコルは、抗体又は他の特定リガンドを利用可能な他の表面マーカーに対して利用されてよい。ビオチン－アビジンを使用するような間接結合方法も利用可能である。
試料から細胞外小胞体が分離されると、研究及び特性化のために細胞外小胞体の内容物を抽出することができる。細胞外小胞体から抽出可能な物質には、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質などがある。例えば、ａｌｌｐｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡキット（８０２０４，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞外小胞体からＤＮＡ及びＲＮＡを分離できる。また、細胞外小胞体から全（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを回収するためにｍｉＲＮｅａｓｙキット（２１７００４，Ｑｉａｇｅｎ）を用いることができる。同様に、ｍｉｒＶａｎａＴＭ ＰＡＲＩＳキット（ＡＭ１５５６，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞外小胞体においてｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡのような小分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）を含む天然（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質及びＲＮＡ種（ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ）を回収できる。
本明細書において、用語「生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｆｌｕｉｄ）」は、原核生物、真核生物、バクテリア、真菌、酵母、無脊椎動物、脊椎動物、爬虫類、魚類、昆虫、植物及び動物を含む有機体から分離又は由来した任意の流体を意味し、血清、血漿、全血、小便、唾液、母乳、涙、汗、関節液、脳脊髓液、精液、膣液、喀痰、胸水、リンパ液、腹水及び羊水を含んでよいが、これに限定されるものではない。気管支洗浄液及び培養された細胞から採取した培養液（例えば、細胞培養上澄液、条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培養液、細胞培養液又は細胞培養培地）も生物学的流体であってよい。
本発明において、前記塩沈殿方法によって生物学的試料から細胞外小胞体が直接分離されてよく、また、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、密度勾配超遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｇｕｇａｔｉｏｎ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）、接線流動濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）又は沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）のような他の方法で製造された細胞外小胞体を含む溶液から塩沈殿方法によって細胞外小胞体を分離又は濃縮することができる。
本発明は、他の観点において、（ａ）生物学的組織試料を溶解（ｌｙｓｉｎｇ）又は粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）して精製（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）する段階；（ｂ）前記精製された試料に、濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように塩（ｓａｌｔ）を添加する段階；（ｃ）前記塩を添加した試料から、凝集又は沈殿した細胞外小胞体分画と上澄液を分離する段階；及び、（ｄ）前記（ｃ）段階で分離された細胞外小胞体分画を脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）して細胞外小胞体を分離する段階を含む、生物学的組織試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ）から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法に関する。
本発明において、前記塩が添加された試料の濃度は、０．１Ｍ～飽和濃度であることを特徴とし、好ましくは０．１Ｍ～４Ｍ、より好ましくは１Ｍ～３Ｍ、さらに好ましくは１．４Ｍ～２．２５Ｍであることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記（ｂ）段階は、塩を１回～１５回添加し、最終濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように行うことを特徴とし得る。
本発明において、前記（ｄ）段階は、塩が添加された試料の濃度が１．４Ｍ～２．２５Ｍである試料から分離された細胞外小胞体分画から細胞外小胞体を分離することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記塩は、多価陰イオン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎ）及び１価陽イオン（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ）を含有することを特徴とし得る。
具体的には、前記多価陰イオンは、硫酸塩（ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）であり、前記１価陽イオンは、アンモニウムイオン（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｏｎ）、カリウムイオン（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｉｏｎ）又はナトリウムイオン（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｎ）であることを特徴とし、本発明の一実施例において、前記塩は、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）又はクエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
前記塩は固体又は液体の形態であることを特徴とし得る。
本発明において、前記（ｃ）段階は、沈降、濾過又は遠心分離によって行われることを特徴とし得る。
本発明において、前記脱塩は、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、逆浸透（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｓｍｏｓｉｓ）又は脱塩カラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて行うことを特徴とし得る。
本発明において、前記細胞外小胞体分画に対して限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）段階、アフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）段階又は密度勾配超遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｇｕｇａｔｉｏｎ）段階をさらに行うことを特徴とし得る。
本発明において、前記生物学的組織試料から細胞外小胞体を分離する方法は、前記生物学的流体試料から細胞外小胞体を分離する方法におけると同じ段階を含み、試料が生物学的流体ではなく生物学的組織であることから、生物学的組織試料を溶解又は粉砕して精製する段階及び試料を培養する段階をさらに含むだけであり、塩の種類、濃度、塩添加段階の反復など、前記生物学的流体試料から細胞外小胞体を分離する方法と重複する内容はその記載を省略する。
本明細書において、用語「生物学的組織（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ）」は、原核生物、真核生物、バクテリア、真菌、酵母、無脊椎動物、脊椎動物、爬虫類、魚類、昆虫、植物又は動物ら由来する細胞の集合を意味する。また、培養された細胞は、生物学的組織であってよい。生物学的組織試料の非制限的な例としては、手術試料、生検試料、組織、大便、植物組織、昆虫組織及び培養された細胞を含む。
組織ソースから細胞外小胞体を分離する時に、単一細胞懸濁液を得るために組織を均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、細胞外小胞体を放出するために細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）又は粉砕（ｇｒｉｎｄ）する段階をさらに含んでよい。このとき、細胞外小胞体を崩壊させない均質化及び溶解／粉砕手順を選択することが重要である。
本発明において、前記塩が添加された試料の培養は、任意の時間範囲で行われてよく、一般的には１秒～２４時間、より一般的には５分～１２時間であってよい。培養時間は、他の要因の中でも塩の濃度、培養温度、細胞外小胞体及び試料のその他構成要素に影響を受ける。
本発明は、さらに他の観点において、塩（ｓａｌｔ）及び緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）を含む細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）分離用キットに関する。
本発明において、前記塩は、多価陰イオン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎ）及び１価陽イオン（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ）を含有することを特徴とし、具体的には、前記多価陰イオンは、硫酸塩（ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）であり、前記１価陽イオンは、アンモニウムイオン（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｏｎ）、カリウムイオン（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｉｏｎ）又はナトリウムイオン（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｎ）であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。本発明の一実施例において、前記塩は、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）又はクエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
前記塩は、固体又は液体の形態であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記キットは、生物学的流体又は生物学的組織から細胞外小胞体を分離するための用途に用いられることを特徴とし得る。したがって、前記細胞外小胞体分離方法に記載の内容と重複する内容はその記載を省略する。
本発明において、前記キットは、（ｉ）細胞外小胞体の表面に露出された表面マーカー又は細胞外小胞体の内部に存在するタンパク質に結合する抗体又はリガンドを含む容器；（ｉｉ）細胞外小胞体の表面に露出された表面マーカー又は細胞外小胞体の内部に存在するタンパク質に直接又は間接に結合する一つ以上の固体支持体；及び／又は、（ｉｉｉ）細胞外小胞体の密度勾配遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）が可能な一つ以上の塩及び緩衝液を含む容器；をさらに含むことを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記表面マーカーは、ＨＬＡ ＤＰハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）、ＨＬＡ ＤＱハプロタイプ、ＨＬＡ ＤＲハプロタイプ、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ６３及びＣＤ８２からなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記固体支持体は、レジン（ｒｅｓｉｎ）又はビーズ（ｂｅａｄｓ）であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ビーズは、シリカ（ｓｉｌｉｃａ）、磁性粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ）、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）又はアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）であることを特徴とし得る。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：材料及び方法
実施例１－１：塩貯蔵溶液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の準備
例えば、脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）に含まれた２Ｍ硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ；ＡＳ）貯蔵溶液１００ｍＬは、５０ｍＬの脱イオン水に３０．９ｇのＡＳを溶解させて準備することができる。ｐＨを所望の値に調整した後、追加の脱イオン水を使用して溶液の体積を最大１００ｍＬまでにすることができる。脱イオン水に含まれた４Ｍ ＡＳ貯蔵溶液１００ｍＬを準備するために、４０ｍＬ脱イオン水に７５ｇのＡＳを添加し、溶液のｐＨを調整した後、水を追加して最終体積を１００ｍＬにする。ＰＢＳ又はその他緩衝液又はＮａＣｌを含有又は非含有する１～４Ｍ ＡＳを含む溶液は、類似の方式で製造されてよい。ＡＳ貯蔵溶液は室温で長期間保管されてよい。
実施例１－２：生物学的流体試料の準備
試料を貯蔵庫から取り出して氷上に載せて置く。生物学的流体が凍結した場合に、試料が完全に液体になるまで室温又はぬるい水で徐々に解凍させることができる。試料は、必要時まで氷に保管できる。細胞破片を除去するために、試料を３０分間２，０００ｘｇで遠心分離させることができる。次に、細胞のない／破片のない（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ／ｄｅｂｒｉｓ－ｆｒｅｅ）試料を含む上澄液を新しい容器に移し、沈殿するまで氷に保管できる。細胞外小胞体の沈殿のために、１００μｌ～１ｍＬ（又は、その他適切な体積）の無細胞試料を新しいチューブに移し、所望の体積の塩沈殿試薬と結合させることができる。
例えば、最終濃度１Ｍの塩を得るために、３３μＬの４Ｍ貯蔵液を１００μＬの血清に添加することができる。その後、血清／試薬混合物が均質な溶液になるまで（溶液が濁ることがある。）上下にボルテクシング又はピペッティングしてよく混合することができる。続いて、試料を室温で０分～２時間培養できる。培養後、試料を室温又は４℃で、２，０００ｘｇ～１５，０００ｘｇで５～３０分間遠心分離できる。上澄液は吸引して廃棄する。細胞外小胞体はチューブ下段のペレットに含まれるであろう。前記ペレットは、使用しやすい体積のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）バッファ、例えば、１０００μＬ血清投入時に１００μＬで再懸濁されてよい。ペレットを再懸濁し難いことがあるが、この場合にはピペットチップを用いて溶液中で完全に再懸濁することができる。或いは、ペレットを３７℃で３０分間培養した後にボルテックスしてもよい。ペレットを再懸濁すると、短期間では４℃で又は長期間では－２０℃で保管できる。１～４Ｍの最終濃度のＡＳを含む溶液（血清試料と混合された場合）は、ＰＢＳバッファ又はＮａＣｌの有無に関係なく類似の方式で使用可能であり、通常、血清投入は、数マイクロリットルから数ミリリットルにまで至る。
実施例１－３：細胞培養及び培養上澄液の準備
ＡＴＣＣから入手したＬＮＣａＰ細胞を（１）１％抗生物質／抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）が補充されたＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ社製培地（ＲＰＭＩ，Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、（２）５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％抗生物質／抗真菌剤が補充されたＲＰＭＩ、（３）５％ Ｅｘｏ－Ｆｒｅｅ ＦＢＳ（ｅｆ－ＦＢＳ，Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び１％抗生物質／抗真菌剤が補充されたＲＰＭＩ、（４）０．１％ ｅｆ－ＦＢＳ及び１％抗生物質／抗真菌剤が補充されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において培養した。前記細胞を５％ ＣＯ２と共に３７℃で培養した。細胞培養液は、培養４８時間後に収集し、４℃、３００ｇで１０分間遠心分離し、死んだ細胞を除去した後、１５分間２，０００ｇで回転させ、死んだ細胞と細胞破片を完全に除去した。上澄液は、使用前には－８０℃で保管した。
実施例１－４：ＣＤ９－ＣＤ８１サンドウィッチＥＬＩＳＡ
全ての試料は全ての比較分析において同じ投入体積を維持するように準備した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ，ｃａｔ＃３５９０）を５０μＬのコーティング抗体（ＰＢＳバッファ中１０μｇ／ｍＬ抗ＣＤ９；ＭＥＭ６１；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）でコートし、４℃で一晩培養した。翌朝、プレートを３７℃で１時間１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－ＰＢＳバッファでブロックした。０．１％ ＢＳＡ－ＰＢＳバッファ（洗浄緩衝液）で洗浄した後、プレートをＰＢＳバッファ（５０μＬ）中細胞外小胞体溶液と共に室温で２時間さらに培養した。溶液を除去した後、プレートを洗浄緩衝液で２回洗浄した後、ＰＢＳバッファ（５０μＬ；５００ｎｇ／ｍＬ）中ビオチン－接合２次抗体（抗ＣＤ８１；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を添加し、室温で１時間培養した。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、プレートをＰＢＳバッファ（５０μＬ；１：５００）中ＨＲＰ－接合ストレプトアビジン溶液と共に室温で３０分間培養した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。続いて、ＴＭＢ溶液（５０μＬ）を添加し、プレートを室温で１５分間培養した後、５０μＬの停止液を各ウェルに添加した。溶液吸光度は、４５０ｎｍでプレートリーダー分光光度計（ＴＥＣＡＮ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて測定した。初期試料を用いてＣＤ９－ＣＤ８１ ＥＬＩＳＡに対する標準曲線を描き、ＥＶ回収率（％）を初期試料に対比して計算した。
実施例１－５：アルブミン及び脂質タンパク質マーカーに対するサンドウィッチＥＬＩＳＡ
Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手した商用ｄｕｏ ｓｅｔｓであるヒト血清アルブミンＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（ＤＹ１４５５）及びヒトアポリポタンパク質（Ｈｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ－Ｉ／ＡｐｏＡ１ ＤｕｏＳｅｔ（ＤＹ３６６４－０５）を、メーカーの指針に従ってそれぞれアルブミン及びａｐｏ ＡＩ分析に使用した。
実施例１－６：ＡＬＩＸ検出のための直接ＥＬＩＳＡ
細胞外小胞体（ＥＶ）は、１％タンパク質加水分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）抑制剤を含むＲＩＰＡバッファを用いて、１０分間隔で軟らかい渦流（ｖｏｒｔｅｘ）と共に氷で３０分間溶解された。ＰＢＳに１：５０で希釈された５０μＬ体積のＥＶ溶解物で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ，ｃａｔ＃３５９０）の各ウェルをコートし、４℃で一晩培養した。翌朝、プレートを室温で１時間１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－ＰＢＳバッファでブロックした。０．１％ ＢＳＡ－ＰＢＳバッファ（洗浄緩衝液）で洗浄した後、プレートをＰＢＳバッファ（５０μＬ；５００ｎｇ／ｍＬ）中抗ＡＬＩＸ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）でロードし、１時間室温で培養した。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、プレートをＰＢＳバッファ（５０μＬ）中ＨＲＰ－接合検出抗体の溶液と共に室温で２０分間培養した後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＴＭＢ溶液（５０μＬ）を添加し、プレートを再び室温で１５分間培養した。その後、５０μＬの停止液を各ウェルに添加した。溶液吸光度は、４５０ｎｍでプレートリーダー分光光度計を用いて測定した。
実施例１－７：ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ５００機器を用いた細胞外小胞体の定量（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びサイズ測定（ｓｉｚｉｎｇ）
塩沈殿によって生物学的流体試料から精製された細胞外小胞体は、ＮＳ５００機器（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いてメーカーのプロトコルに従って定量及びサイズ測定された。イメージ分析ＮＴＡソフトウェアを用いると、使用者が個別にナノ粒子を自動で追跡し、サイズを測定することができる。分離された細胞外小胞体試料をボルテックスし、２００ｎｍフィルターで濾過されたＰＢＳで希釈し、ＮＴＡシステムで推奨される２５～１００ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｆｒａｍｅを得た。全ての測定は、一貫した結果を保障するために同一設定で行った。各試料を３回分析し、平均値をプロットした。
実施例１－８：透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＥＭ）
３００－ｍｅｓｈ ｆｏｒｍｖａｒ及び炭素コーティング銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＰＡ）を、０．１％ポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で３０分間コートした後、ＰＢＳバッファで適切に希釈された細胞外小胞体試料と共に室温で３０分間培養した。その後、グリッドの細胞外小胞体を４％パラホルムアルデヒド溶液で室温で１０分間固定した後、ＰＢＳ及び脱イオン水で順次に洗浄した。グリッドをＵｒａｎｙｌｅｓｓで染色し、ＪＥＭ－２１００透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，Ｊａｐａｎ）でイメージングした。
実施例１－９：ＲＮＡ抽出及び逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
遺伝子発現を分析するために、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＬＮＥＶ（ＬＮＣａＰ培養液から得るＥＶ）が混合された血漿から様々な方法で分離されたＥＶから全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて準備した。実時間重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は、遺伝子発現マスターミックスキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＴａｑｍａｎプローブとＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６実時間ＰＣＲ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った：５０℃で２分、９５℃１０分間反応させ、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒間４０サイクルを反復する。全試料は３回反復で分析されたし、データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で表示した。
実施例２：多段階塩分別沈殿法による細胞外小胞体（ＥＶ）の分離
生物学的流体試料から細胞外小胞体を分離する多段階塩分離沈殿方法の模式図を図１に示す。
本実施例では、１ｍＬの新鮮な冷凍血漿を生物学的流体試料として使用した。血漿試料を、増加する量の硫酸アンモニウム（ＡＳ）と共に培養し、図２に示すように、Ｆ１～Ｆ６分画を収集した。各分画は、ＥＶ及びタンパク質含有量を確認するために分析された。多段階塩分別沈殿法（ＳＰ）方法は、下記の段階を含む：
（１）生物学的流体に固体ＡＳを追加して１次沈殿物（Ｆｒａｃｔｉｏｎ－１，Ｆ１）を生成する段階、ここで、溶液中のＡＳ濃度は０．４５Ｍである；（２）室温で＞１００００ｘｇの遠心分離によって１次沈殿物を分離して１次上澄液を生成する段階；（３）ＡＳを１次上澄液に添加して２次沈殿物（Ｆｒａｃｔｉｏｎ－２，Ｆ２）を生成する段階、ここで、溶液中のＡＳの濃度は０．９５Ｍである；（４）２次沈殿物を分離して２次上澄液を生成し、ＡＳの濃度がＦ３、Ｆ４、Ｆ５及びＦ６においてそれぞれ１．４、１．９、２．３５及び２．８ＭとなるようにＡＳを添加する段階を反復し、沈殿物を全ての所望する分画が収集されるまで遠心分離する段階。このような段階の組合せを「ＳＰ」という。沈殿物Ｆ１～Ｆ６は、緩衝液に再懸濁させ、遠心濾過装置を用いて脱塩させる（図２）。
最終上層液と共にそれらの分画は、総タンパク質定量化のためにビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＢＣＡ）分析によって分析された；ＥＶ標準マーカーと非ＥＶマーカーの両方を用いてＥＶの定性分析のための酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）を行った（図３）。リポタンパク質、Ａｐｏ Ｂ、Ａｐｏ Ｅ及びＡｐｏ ＡＩに対するマーカーは、全ての分画において互いに異なるレベルで発現した（図４）。
分画の内容物をＥＶ及び非－ＥＶマーカーに対するＥＬＩＳＡで評価した結果、大部分のＣＤ９－ＣＤ８１陽性ＥＶはＦ３及びＦ４から発見されたし、大部分のＡＬＩＸ含有ＥＶはＦ３にあった（図３）。アルブミンに対するＥＬＩＳＡは、大部分のアルブミンが以降の分画であるＦ５及びＦ６において沈殿することを示す。脂質タンパク質に対するマーカー、Ａｐｏ Ｂ、Ａｐｏ Ｅ及びＡｐｏ ＡＩは、全ての分画において異なるレベルで発現したが、Ｆ５、Ｆ６において最も高かった（図４）。
実施例３：３段階塩分別沈殿法を用いた血漿からの細胞外小胞体（ＥＶ）の分離
実施例２に記載された６段階塩分別沈殿法において、Ｆ３、Ｆ４に回収されたＥＶを一つの分画として収集し、タンパク質不純物を極力多く除去するために、分画の数を３段階に減らして実験した。ＳＰはそれぞれ１ｍＬの生物学的流体試料（新鮮冷凍血漿）を使用し、固体及び液体ＡＳで行われた。血漿に固体ＡＳ又は液体ＡＳの飽和溶液を混合した後、結果溶液がＦ１、Ｆ２及びＦ３にそれぞれ０．７５、１．５及び２．２５ＭのＡＳを含むかを確認した。沈殿物と上澄液を遠心分離で分離した。ＡＳ添加段階及び遠心分離による上澄液からの沈殿物分離段階は、沈殿物の３個分画（Ｆ１～Ｆ３）及び上澄液が収集されるまで続いた。ＥＶマーカーを用いてＥＬＩＳＡでＥＶ含有量を分析した。ＣＤ９－ＣＤ８１及びＡＬＩＸ陽性ＥＶの大部分は、固体及び液体ＳＰ方法のＦ２及びＦ３から発見された（図５）。したがって、、固体又は液体形態のＡＳは性能差無しでＳＰに使用可能であることが確認できる。
実施例４：拡張性評価
他の体積の血漿、具体的には０．４ｍＬ及び４ｍＬの血漿からＥＶを分離するために３多段階塩分別沈殿を行った。液体塩を使用したし、実施例３に説明された方法を用いて３個沈殿物分画と上澄液を収集した。両試料から分離されたＥＶのＥＶマーカーＥＬＩＳＡの結果は類似であったし、大部分のＥＶは、両方の場合ともＦ２及びＦ３から確認された（図６）。これは、少量の体積試料にのみ適用可能な濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）方法やサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）方法と違い、多段階塩沈殿方法は、診断目的の小規模にも、産業的応用の大規模にも適用可能であることを意味する。
実施例５：２段階塩分別沈殿法で血漿試料からＥＶ分離
実施例３に示した３段階塩分別沈殿法において、Ｆ２とＦ３に集まったＥＶを一つの分画で集まり得るように２段階ＳＰによって（１）新鮮な血清（２）凍結－解凍された血清（３）新鮮な血漿、及び（４）凍結－解凍された血漿の各１ｍＬから一つの分画（Ｆ２）で濃縮した。血漿の主要成分には、フィブリノーゲン、グロブリン及びアルブミンが含まれる。フィブリノーゲンは０．８５Ｍ ＡＳにおいて、グロブリンは～１．５Ｍ ＡＳにおいて沈殿されることが知られており、アルブミンは≧２．５Ｍ ＡＳにおいて沈殿される。したがって、この２段階塩分別沈殿法ではフィブリノーゲンとアルブミンは選択的に除去されたし、大部分のＥＶはＦ２に収集された。１番目の段階において０．８５～１．０Ｍ ＡＳを追加してフィブリノーゲンを除去し、ＥＶは１．８～２Ｍ濃度のＡＳで収集したのに対し、アルブミンは上澄液に残っていた。血清と血漿試料において大差なかった。類似に、新鮮な試料及び凍結解凍された試料から分離されたＥＶにおいて差異が観察されなかった（図７）。沈殿物と上澄液はＢＣＡ、ＥＬＩＳＡ、ＮＴＡによってＥＶ含有量に対して分析された。ＥＶマーカーは、全ての試料のＦ２において高く見られた。
実施例６：２段階塩沈殿（ＳＰ）及びその他商用化した方法による細胞外小胞体（ＥＶ）回収比較
２段階ＳＰを用いて１ｍＬの血漿からＥＶを分離した。１ｍＬ血漿からＥｘｏＱｕｉｃｋ血漿キット（ＥＱ；Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、１ｍＬ血漿からｅｘｏＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて分離した。Ｆｒａｃｔｉｏｎ－２のＥＶを、ＢＣＡ、ＥＶマーカーに対するＥＬＩＳＡ及びＮＴＡによる粒子数で特徴化した。その結果、ＳＰ方法は、９．２５×１０１１±８．４６×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬで最も多い量のＥＶを分離したし、６．７×１０１１±１×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの回収を示したＥＱと比較して、相対的に少ない総タンパク質量及び類似のＥＶ回収率（％）を示した。ＥｘｏＥａｓｙは、相対的に少ない数の１．０５×１０１０±１．４４×１０９粒子であって、総タンパク質の量が最も少なく、低いＥＶ回収率（％）を示した（図８及び図９）。
透過電子顕微鏡イメージによれば、３つの方法とも形態学的に（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）類似な小胞体を示したが、ｅｘｏＥａｓｙキットの粒子サイズはＳＰ及びＥＱに比べて小さいことが見られた（図１０）。
実施例７：ブタ血漿から細胞外小胞体（ＥＶ）の分離
ＬＮＣａＰ細胞由来ＥＶを含む１ｍＬのブタ血漿からＥＶを分離した。２段階塩分別沈殿を使用したし、分画は、ＢＣＡ及びＬＮＣａＰ ＥＶマーカーに対するＥＬＩＳＡ分析を用いてＥＶ含有量に対して分析された（図１１）。ＥＶは、塩沈殿の第１及び第２分画から分離された。これは、塩沈殿方法がヒト血液又はブタ血液などの様々な生物学的流体試料からＥＶを分離するのに適用可能であることを意味する。
実施例８：硫酸アンモニウムを用いた１段階塩沈殿法によるＥＶ分離
図１２は、多段階塩分離の最も簡単な形態である、１段階で塩分離をする場合を例示する図である。
（１）無血清ＬＮＣａＰ培養液（ＬＮ－ＣＭ）（２）５％ ＦＢＳを含むＬＮ－ＣＭ（３）５％ ｅｆ－ＦＢＳを含むＬＮ－ＣＭ、及び（４）単一段階沈殿方法を用いて、ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩにおいて０．１％ ｅｆ－ＦＢＳを含むＬＮ－ＣＭからまずＥＶ分離のための最適ＡＳ濃度を見つける実験を行った。ＡＳの飽和溶液は、混合後に１．５、１．７５、２及び２．５Ｍの最終濃度となるように各ＬＮ－ＣＭ １ｍＬに添加された。内容物はチューブを５～６回ひっくり返して混合し、分離された沈殿物は１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離して収集した。収集されたＥＶは、ＣＤ９－ＣＤ８１サンドウィッチＥＬＩＳＡで評価した（図１３）。全ての試料から出た大部分のＥＶは、培地に存在するＦＢＳの量に関係なく１．７５～２Ｍの最終濃度において分離された。また、２Ｍ ＡＳ濃度において分離されたＥＶは、ＢＣＡ、ＥＬＩＳＡ、ＮＴＡ及びＴＥＭで分析した。ＦＢＳにおいて汚染するタンパク質や他の粒子が不足するため、無血清培地から得たＥＶのタンパク質の量と総粒子数が最も低かった。ＥＶの回収率は、テストされた４個試料とも９０％であった（図１４～図１６）。結果的に、１．７５～２ＭのＡＳ濃度を用いた１段階塩分離沈殿法では、使用した培地の種類にあまり関係なく大部分の（９０％以上）ＥＶが沈殿物に存在することが分かった。
実施例９：硫酸アンモニウムと酢酸ナトリウムによるＥＶ回収率比較
既存報告されたプロトコル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．，２０１４，４０７，１２０）に従って硫酸アンモニウム及び酢酸ナトリウムを用いて、５％ ｅｆ－ＦＢＳを含むＬＮ－ＣＭの各１ｍＬからＥＶを分離した。硫酸アンモニウムを用いたＥＶ分離では、ＬＮ－ＣＭを最終濃度１．８ＭのＡＳ飽和溶液と混合した。両方法で得たＥＶは、ＢＣＡ、ＥＶマーカーではＥＬＩＳＡ及びＮＴＡの粒子数で特性化された。その結果、４．８５×１０９±５．７×１０８ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ及び４％ ＥＶ回収率を算出した酢酸ナトリウム方法に比べて、硫酸アンモニウム方法は２．８×１０１０±３．０６×１０８ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの回収率及び＞９５％ ＥＶ回収率であって、遥かに多い量のＥＶを分離した（図１７）。
実施例１０：硫酸アンモニウムによる小便からのＥＶ分離
ＡＳの飽和溶液を最終濃度２Ｍとなるように小便１ｍＬに添加し、単一段階塩分離沈殿法でＥＶを分離した。チューブの内容物をひっくり返して混合し、直ちに１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離して沈殿物を分離した。沈殿物及び上澄液は、総タンパク質定量のためのＢＣＡ分析及びＥＶマーカーに対するＥＬＩＳＡで特性化された。図１８に示すように、２Ｍ ＡＳ濃度において８０％以上の大部分のＥＶが回収された。
実施例１１：硫酸アンモニウムによる血漿及び血清からのＥＶ分離
ＡＳの飽和溶液は、２Ｍの最終濃度においてそれぞれの血漿及び血清１ｍＬに添加された。チューブを数回ひっくり返して内容物を混合し、沈殿物は１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離して収集した。沈殿物と上澄液は、ＥＶマーカーに対する総タンパク質定量及びＥＬＩＳＡで特性化された。その結果、２Ｍ ＡＳ濃度において大部分のＥＶが多いタンパク質と共に回収された（図１９）。血漿及び血清のタンパク質は、タンパク質の電荷、サイズ及び形状によって選択的に分類されてよい。
血漿、血清などの試料の種類に関係なく１段階塩沈殿によっても９０％以上のＥＶ回収率を示した。多量の不純物タンパク質が共に分離されるが、最終に検出しようとする物質がＥＶから出る核酸である場合には核酸分離過程をさらに有するので、ＥＶ回収率が顕著に増加した本方法を用いて効率的に目的物質を検出することができる。
実施例１２：塩沈殿方法で分離されたＭＤＡ－ＭＢ２３１ ＥＶの傷治癒（ｓｃｒａｔｃｈ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ）促進効果確認
ＥＶは、各方法、ＳＰ及びＵＣごとに５０ｍＬのＭＤＡ－ＭＢ２３１培養液から分離された。スクラッチ傷治癒分析のために、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を、９６ウェルプレート当たりに１００，０００個細胞の密度で入れた。細胞を単層に成長させ、ウェルの中央にスクラッチ傷を作った。ウェルを数回洗浄して浮遊細胞を除去し、細胞を、ウェル当たりに０、５、１０及び２０μｇ／ｍＬ（ＢＣＡ総タンパク質分析で測定）濃度においてＳＰ及びＵＣで分離されたＥＶで処理した。傷は、ＪｕＬＩ Ｓｔａｇｅリアルタイム生細胞イメージングシステムによって４ｘ倍率で４時間間隔で最大２０時間まで撮影した。
培養液の処理時に傷縫合の代表的なイメージ、ＵＣで分離されたＥＶ、及びＳＰで分離されたＥＶは、図２０のＡに示されている。傷縫合率はＥＶ量によって変わっており、２０μｇ／ｍＬ濃度においてより高かった（図２０のＢ）。塩沈殿によって準備したＥＶは、超遠心分離によって準備したＥＶに比べてスクラッチ傷縫合を大きく促進した。これは、塩沈殿方法で準備したＥＶが機能的活動を維持することを示唆する。
実施例１３：硫酸アンモニウム及びその他方法で分離されたＥＶからのＲＮＡ回収率比較
生物学的流体試料からのＥＶの効率的分離に対する硫酸アンモニウム方法とその他方法を比較するために、超遠心分離（ＵＣ）、ｅｘｏＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）及びＮｏｒｇｅｎ小胞体精製キットのような他の方法と共に評価された。ＬＮ－ＣＭにおいてＥＶでスパイキングされた１ｍＬの血漿を各方法別に使用した。ＥＶ分離前に試料をＰ－Ｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－Ｋ）で処理又は非処理した。
ＵＣ（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｇｕｇａｔｉｏｎ）によるＥＶの分離のために標準超遠心分離工程が用いられた。血漿は、ＴＬＡ １２０．２ Ｔｉ固定角ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）及び１．２ｍＬポリカーボネート超遠心分離チューブを用いて４℃で９０分間１２０，０００ｘｇのベックマンコールター遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で遠心分離してＥＶをペレット化した。タンパク質汚染物質を除去するために、上澄液を注意して除去し、ＥＶペレットをＰＢＳに再懸濁し、４℃で９０分間１２０，０００ｘｇで再び遠心分離した。上澄液を除去し、生成されたＥＶペレットを所望の体積のＰＢＳに再懸濁し、追加分析を容易にした。商業用キット（Ｑｉａｇｅｎ及びＮｏｒｇｅｎ）を用いたＥＶ分離は、メーカーの指針に従って行われた。ＡＳによるＥＶ分離では単一段階沈殿（ＳＰ）を用い、脱塩後に得たＥＶをＲＮＡ抽出に使用した。
ＥＶマーカー（ＣＤ９及びＡＬＩＸ）と癌マーカー（ＰＳＡ及びＰＳＭＡ）の相対的発現をプロットした（図２１）。ＳＰ方法は、上のテスト方法と比較して、Ｐ－Ｋ処理及び未処理試料の両方において全てのマーカーに対して最も高い発現を示した。
図２２には、前記実施例に示した様々な段階のＳＰ方法を用いて血漿から分離したＥＶの回収率と純度を共に比較した。段階数を増加させる場合に、類似の回収率を確保する上にも、分離されたＥＶの純度を向上させ得ることが見られる。前記実施例に示すように、様々な試料種類と所望の収率と純度、使い勝手の良さなど、必要によって様々な段階のＳＰ方法をＥＶ分離に用いることができる。例えば、図９、図２１、図２２に示すように、様々な段階のＳＰ方法はいずれも、他のＥＶ分離方法に比べて８０％以上の非常に優れた回収率を確保しており、ＳＰ法の段階を増加させると、より純度の高いＥＶを分離濃縮することができる。
実施例１３：種々の塩によるＥＶ分離
タンパク質塩析（ｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ）は、様々な類型の中性塩において発生し得る。塩は、水と相互作用してタンパク質（又は、ＥＶ）溶媒化に使用可能な水分子の数を減らす。その結果、タンパク質（又は、ＥＶ）相互作用が増加してタンパク質（又は、ＥＶ）凝集及び沈殿が発生する。
様々な塩の塩析能力をテストした（表１）。ホーフマイスター系列（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ）において高いイオンを生成する塩が用いられた（図２３）。それぞれの塩に対して４Ｍ溶液又は飽和溶液を製造したし、４Ｍ溶液が飽和溶液でない塩に対して４Ｍ及び飽和溶液の両方とも準備した（表１）。
［表１］
Figure 2024521372000002
ＥＶは、室温で同一体積の細胞調整培地及び塩溶液を３０分間培養した後、１０，０００ｇで１５分遠心分離して分離された。その後、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁されたペレットを濾過によって脱塩した。
ＣＤ８１－ＣＤ９サンドウィッチＥＬＩＳＡを用いてＥＶ回収率を計算した（図２４）。硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、クエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）のような多価陰イオン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎ）及び１価陽イオン（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ）を含有する塩は、沈殿を選好し、テストされた塩のうち最も高い回収率を示した。しかし、硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）及びリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のような塩は、水に対する溶解度が低いため、タンパク質を沈殿させなかった。また、１価陰イオンを有する塩（例えば、塩化物及びアセテート）及び多価陽イオンを有する塩（例えば、硫酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ））は飽和状態でも全てのＥＶを沈殿させなかった。
本発明によれば、従来の細胞外小胞体分離方法に比べて分離方式が簡単であり、短時間で細胞外小胞体を高純度及び高効率で分離することが可能である。
本発明に係る細胞外小胞体分離方法は、ヒト、ブタ、マウス、ネズミなどから採取可能な試料（血漿、血清、小便、唾液、組織、細胞培養液、腹水、気管支洗浄など）を含む種々の生物学的試料に適用可能であり、既存の析出ベース細胞外小胞体分離に基づく方法と違い、洗浄によって塩を容易に除去でき、純度及び収率の高い細胞外小胞体を得ることができるという長所がある。また、研究及び診断などの分野に適用される小規模細胞外小胞体分離及び大規模産業的応用のいずれにも適用可能である。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims (30)

  1. 以下の段階を含む生物学的流体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅ）から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法：
    （ａ）生物学的流体試料に、濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように塩（ｓａｌｔ）を添加する段階；
    （ｂ）前記塩が添加された試料から凝集又は沈殿した細胞外小胞体分画と上澄液を分離する段階；及び
    （ｃ）前記（ｂ）段階で分離された細胞外小胞体分画を脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）して細胞外小胞体を分離する段階。
  2. 前記（ａ）段階は、塩を１回～１５回添加して最終濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記（ｃ）段階は、塩が添加された試料の濃度が１．４Ｍ～２．２５Ｍである試料から分離された細胞外小胞体分画から細胞外小胞体を分離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記塩は、多価陰イオン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎ）及び１価陽イオン（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ）を含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記多価陰イオンは、硫酸塩（ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）であり、前記１価陽イオンは、アンモニウムイオン（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｏｎ）、カリウムイオン（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｉｏｎ）又はナトリウムイオン（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｎ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記塩は、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）又はクエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  7. 前記塩は、固体又は液体の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 前記（ｂ）段階は、沈降、濾過又は遠心分離によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  9. 前記脱塩は、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、逆浸透（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｓｍｏｓｉｓ）又は脱塩カラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 前記細胞外小胞体分画に対して限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）段階、アフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）段階又は密度勾配超遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｇｕｇａｔｉｏｎ）段階をさらに行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  11. 前記生物学的流体は、血清、血漿、全血、尿、唾液、母乳、涙、汗、関節液、脳脊髓液、精液、膣液、喀痰、胸水、リンパ液、腹水、羊水、気管支洗浄液及び培養された細胞から採取した培養液からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  12. 以下の段階を含む生物学的組織試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ）から細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）を分離する方法：
    （ａ）生物学的組織試料を溶解（ｌｙｓｉｎｇ）又は粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）して精製（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）する段階；
    （ｂ）前記精製された試料に、濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように塩（ｓａｌｔ）を添加する段階；
    （ｃ）前記塩を添加した試料から、凝集又は沈殿した細胞外小胞体分画と上澄液を分離する段階；及び
    （ｄ）前記（ｃ）段階で分離された細胞外小胞体分画を脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）して細胞外小胞体を分離する段階。
  13. 前記（ｂ）段階は、塩を１回～１５回添加して最終濃度が０．１Ｍ～飽和濃度となるように行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記（ｄ）段階は、塩が添加された試料の濃度が１．４Ｍ～２．２５Ｍである試料から分離された細胞外小胞体分画から細胞外小胞体を分離することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記塩は、多価陰イオン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎ）及び１価陽イオン（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ）を含有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記多価陰イオンは、硫酸塩（ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）であり、前記１価陽イオンは、アンモニウムイオン（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｏｎ）、カリウムイオン（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｉｏｎ）又はナトリウムイオン（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｎ）であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記塩は、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）又はクエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記塩は、固体又は液体の形態であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  19. 前記（ｃ）段階は、沈降、濾過又は遠心分離によって行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  20. 前記脱塩は、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、逆浸透（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｓｍｏｓｉｓ）又は脱塩カラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  21. 前記細胞外小胞体分画に対して限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）段階、アフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）段階又は密度勾配超遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｇｕｇａｔｉｏｎ）段階をさらに行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  22. 前記生物学的組織は、原核生物、真核生物、バクテリア、真菌、酵母、無脊椎動物、脊椎動物、爬虫類、魚類、昆虫、植物又は動物に由来する細胞の集合及び培養された細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  23. 塩（ｓａｌｔ）及び緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）を含む細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）分離用キット。
  24. 前記塩は、多価陰イオン（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ａｎｉｏｎ）及び１価陽イオン（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ）を含有することを特徴とする、請求項２３に記載のキット。
  25. 前記多価陰イオンは、硫酸塩（ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）であり、前記１価陽イオンは、アンモニウムイオン（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｏｎ）、カリウムイオン（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｉｏｎ）又はナトリウムイオン（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｎ）であるインことを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
  26. 前記塩は、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）又はクエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）であることを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
  27. （ｉ）細胞外小胞体の表面に露出された表面マーカー又は細胞外小胞体の内部に存在するタンパク質に結合する抗体又はリガンドを含む容器；
    （ｉｉ）細胞外小胞体の表面に露出された表面マーカー又は細胞外小胞体の内部に存在するタンパク質に直接又は間接に結合する一つ以上の固体支持体；及び／又は
    （ｉｉｉ）細胞外小胞体の密度勾配遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行うための一つ以上の塩及び緩衝液を含む容器；をさらに含むことを特徴とする、請求項２３に記載のキット。
  28. 前記表面マーカーは、ＨＬＡ ＤＰハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）、ＨＬＡ ＤＱハプロタイプ、ＨＬＡ ＤＲハプロタイプ、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ６３及びＣＤ８２からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
  29. 前記固体支持体は、レジン（ｒｅｓｉｎ）又はビーズ（ｂｅａｄｓ）であることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
  30. 前記ビーズは、シリカ（ｓｉｌｉｃａ）、磁性粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ）、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）又はアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）であることを特徴とする、請求項２９に記載のキット。
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