JP2024518174A - 高分子量ヘパリン化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【要約】
【解決手段】 高分子量ヘパリン（ＨＭＷＨ）化合物の製造方法が開示されている。この方法は、ヘパリン溶液を形成するためにヘパリンを溶解する工程と、約８ｋＤａ～約１２ｋＤａの間の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いた接線流濾過（ＴＦＦ）によってヘパリン溶液を分画する工程と、を含む。ＴＦＦにより、重量平均分子量約２０ｋＤａ以上の分画ヘパリン、すなわち高分子量ヘパリン化合物を含む保持液が得られる。分画ヘパリン中のヘパリン鎖のかなりの割合が高分子量を有し、例えば、ヘパリン鎖の５０％以上が２０ｋＤａ以上の分子量を有する。
【選択図】 図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年５月１２日に出願された"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ"と題する米国仮特許出願第６３／１８７、６２４号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本開示は概して、高分子量ヘパリン化合物の製造方法に関する。開示される対象は、様々な状態の画像化、診断、モニタリング、および／または治療のための化合物および／またはそれを有する組成物の製造に適用される。例えば、本明細書に開示される方法によって製造される化合物は、好酸球関連炎症および好酸球関連疾患、例えば好酸球性食道炎および好酸球関連眼疾患の画像化、診断、モニタリング、および／または治療に有用である。

歴史的に、医療分野では高分子量ヘパリンは避けられ、低分子量ヘパリンが好んで使用されてきた。ヘパリンは多糖類であり、様々な分子量のヘパリン鎖を含むように、ポリマー鎖の長さが本来不均一である。一般に、分子量を下げるためにヘパリンは解重合および分画化され、低分子量のヘパリンが患者に投与される。一般的な投与経路（すなわち、静脈内または皮下）で高分子量のヘパリン鎖を大量に投与すると、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）の発生率が増加することが疑われている。ＨＩＴは、ヘパリンに暴露された結果生じる合併症であり、四肢や生命を脅かす血栓性合併症を引き起こす可能性がある。ＨＩＴでは、ヘパリンが血小板第４因子（ＰＦ４）と結合すると、免疫システムがヘパリンに対する抗体を形成する。その後、抗体はヘパリン／ＰＦ４と複合体を形成し、血小板と結合して活性化するため、血栓が形成され、血小板数が減少する。ＨＩＴは静脈血栓塞栓症や、場合によっては動脈血栓症（ＨＩＴＴと呼ばれる）を引き起こす可能性がある。高分子量ヘパリン鎖との関連性が疑われているＨＩＴのリスクのため、医療分野の臨床応用においては、低分子量ヘパリンが好んで使用されている。

しかしながら、近年の進歩により、高分子量ヘパリンが特定の用途において有用であることが示唆されている。例えば、高分子量ヘパリンは、脊椎動物内で多細胞寄生虫や特定の感染症と闘う白血球の一種である好酸球に高確率で局在するため、この点で有用である。

通常、好酸球は血流、下部消化管、リンパ系に存在するが、病理学的にはさらに多くの臓器や部位に浸潤し、炎症ならびに様々な疾患および病態を引き起こす。好酸球の際立った特徴は、顕著なカチオン性タンパク質を含む顆粒である。この顆粒は、電子密度の高い中心核および電子放射線透過性のマトリックスから構成される。主に核は、主要塩基性タンパク質１（ＭＢＰ－１またはｅＭＢＰ－１）を含み、マトリックスは好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）、および好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）を含む。顆粒はまた、核および／またはマトリックスに主要塩基性タンパク質２（ＭＢＰ－２またはｅＭＢＰ－２）を含む。脱顆粒の際、好酸球はこれらのタンパク質を周囲の組織に放出し、ヒスタミンの放出を刺激し、炎症を引き起こす。研究では、ＭＢＰ－１が哺乳類の細胞、細菌、および特定の寄生虫に対して毒性があり、臓器機能障害（例えば、好酸球性食道炎）のような多くの好酸球関連疾患の炎症部位に沈着することが示されている。ヘパリンはＭＢＰ－１に結合し、ＭＢＰ－１の細胞毒性作用を用量関連的に中和するのに有効である。さらに、ＭＢＰ－１に対するヘパリンの結合力は分子量とともに増加する。したがって、高分子量ヘパリンは好酸球に関連した炎症および／または好酸球に関連した病態の画像化、診断、モニタリング、および／または治療に有用である。

こうした進歩にもかかわらず、いくつかの課題が高分子量ヘパリンの生産を妨げてきた。ヘパリン固有の鎖長の均一性欠如は、特定の分子量の鎖を単離する上で大きな困難をもたらす。医療分野において低分子量ヘパリンが注目されていることから、低分子量ヘパリン化合物を製造する方法は成功を収めてきた。しかし、高分子量ヘパリンを分画する方法の開発においては、同様の進歩がなかった。

さらに、目標平均分子量を有するヘパリン化合物（例えば、低分子量ヘパリン）の製造が成功したとしても、依然として分子量は大きくばらついており、目標分子量範囲内で化合物のヘパリン鎖の割合が高くないことがあった。

したがって、高平均分子量を有し、高分子量を有するヘパリン鎖の割合が高い高分子量ヘパリン化合物の製造方法があれば有用である。

本発明の実施形態は、分画ヘパリンの製造方法に関するものであり、前記方法は、ヘパリン溶液を形成するために、ヘパリンを溶媒に溶解する工程と、および分画分子量が約８ｋＤａ～約１２ｋＤａの間の分画分子量を有する分画膜を用いた接線流濾過によって前記ヘパリン溶液を分画する工程であって、それにより約２０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する分画ヘパリンを得られ、前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも５０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、前記分画する工程と、を含む方法である。

本発明の付加的な実施形態は、高分子量（ＨＭＷ）ヘパリンの製造方法に関連し、前記方法は、ヘパリン溶液を形成するために、ヘパリン塩を塩溶液に溶解する工程と、約０．２μｍの孔径を有する滅菌膜で濾過することにより、前記ヘパリン溶液を滅菌する工程であって、それにより滅菌ヘパリン溶液が得られる、前記滅菌する工程と、約５ｎｍの孔径を有する分画膜を用いた接線流濾過によって、前記滅菌ヘパリン溶液を分画する工程であって、それにより約２０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する分画ヘパリンを得られ、前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも５０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、前記分画する工程と、約３ｎｍの孔径を有する脱塩膜を用いた接線流濾過によって、前記分画ヘパリンを脱塩する工程であって、それにより脱塩ヘパリンを得られる、前記脱塩する工程と、および前記ＨＭＷヘパリンを得るために、凍結乾燥によって前記脱塩ヘパリンを乾燥させる工程と、を含む、方法である。

添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成するものであり、本発明の実施形態を示すものであり、本明細書とともに本発明の原理、特徴、および特徴を説明するのに役立つ。

実施形態に従った高分子量ヘパリン化合物の例示的製造方法のフロー図である。 図２Ａおよび２Ｂは、実施形態に従った、ｅＭＢＰ１（すなわち、リガンド）に結合する分画ヘパリン試料（すなわち、分析物）のシグナル応答のセンサグラムである。 実施形態に従った、１２００ＲＵの密度でｅＭＢＰ１に結合する１００ｎｇ／ｍＬの濃度における、分子量の異なる７種類のヘパリン試料についての複合体半減期対分子量のプロットグラフである。

本開示は、記載された特定のシステム、装置、および方法に限定されるものではない。本明細書で使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明するためだけのものであり、範囲を限定することを意図するものではない。本開示のような態様は、多くの異なる形態で具体化される。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、当業者にその範囲を十分に伝えるように提供される。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに指示がない限り、複数形の参照を含む。本明細書における実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者であれば、文脈および／または用途に応じて、複数形から単数形へ、および／または単数形から複数形へ解釈することができる。様々な単数／複数の順列は、明確化のために本明細書で明示的に規定される場合がある。

当業者には理解されるだろうが、書面による説明を提供するという観点など、あらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲は、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値を包含するものとして意図される。また、本明細書で開示されるすべての範囲は、あらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせを包含する。どのような記載範囲も、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解することを十分に説明し、可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じる各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、上位３分の１などに容易に分解できる。また、当業者には理解されるだろうが、「最大」、「少なくとも」などのすべての文言は、言及された数を含み、上述したように、その後サブ範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるだろうが、範囲は個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３細胞を有する群とは、１、２、または３細胞を有する群、および１細胞以上３細胞以下の値の範囲を指す。同様に、１～５細胞を有する群とは、１、２、３、４、５細胞を有する群、および１細胞以上５細胞以下の細胞を有する群などを指す。

さらに、特定の数が明示的に記載されている場合であっても、当業者であれば、そのような記載は、少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを認識するだろう（例えば、他の修飾語を伴わない「２回の反復」という単なる記載は、少なくとも２回の反復、または２回以上の反復を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ、など」に類似する慣用句が使用される場合、一般的に、そのような構文は、当業者がその慣用句を理解する意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、これに限定されるものではないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢを共に、ＡおよびＣを共に、ＢおよびＣを共に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを共に有するシステムなどを含む）。「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ、など」に類似する慣用句が使用される場合、一般的に、そのような構文は、当業者がその慣用句を理解する意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、これに限定されるものではないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢを共に、ＡおよびＣを共に、ＢおよびＣを共に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを共に有するシステムなどを含む）。当業者にはさらに、説明、サンプル実施形態、または図面のいずれにおいても、２つまたはそれ以上の代替的な用語を提示する実質的に任意の接続詞的な単語および／または語句は、用語の一方、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を意図するとされるべきであることが理解されるだろう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」、または「ＡおよびＢ」の可能性を含むものと理解される。

加えて、本開示の特徴がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本開示が、それによって、マーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーの下位群の観点からも記載されていることを認識するだろう。

パーセンテージ、部数、比率はすべて化合物の総重量に基づいており、特に断りのない限り、測定はすべて約２５℃で行った。

本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、例えば、実世界における測定または取扱いの手順によって、これらの手順における不注意な誤りによって、組成物または試薬の製造、供給源、または純度の違いなどによって生じる数値量の変動を指す。一般的に、本明細書で使用される「約」という用語は、記載された値または値の範囲よりも、記載された値の１／１０、例えば±１０％だけ大きいまたは小さいことを意味する。また、「約」という用語は、先行技術によって実施されている既知の値を包含しない限り、当業者であれば同等であると認識できるような変動も意味する。「約」という用語が先行する各値または値の範囲は、記載された絶対値または値の範囲の実施形態を包含することも意図されている。用語「約」によって修正されるか否かにかかわらず、本開示において言及される定量的値は、言及される値に対する等価物、例えば、発生する可能性があるが、当業者によって等価物であると認識されるだろうそのような値の数値量の変動を含む。本開示の文脈がそうでないことを示す場合、またはそのような解釈と矛盾する場合、上記の解釈は、当業者にとって容易に明らかであるように修正することができる。例えば、「約４９、約５０、約５５」のような数値のリストにおいて、「約５０」は、先行する値と後続する値との間の間隔の半分未満、例えば、４９．５より大きく５２．５より小さい範囲を意味する。さらに、「約～より小さい」または「約～より大きい」という値の表現は、本明細書で提供される用語「約」の定義を考慮して理解されるべきである。

一般に、本明細書で使用される用語は、一般に「オープン（ｏｐｅｎ）」な用語として意図されることが当業者には理解されるだろう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含むが限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「含むが限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「により特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義である経過的用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、再現されない要素または方法工程を除外するものではない。様々な組成物、方法、および装置は、様々な成分または工程を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語で記載される（「含むが、これらに限定されない」という意味として解釈される）が、組成物、方法、および装置は、様々な成分および工程「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」こともでき、このような用語は、本質的にクローズドメンバー（ｃｌｏｓｅｄ－ｍｅｍｂｅｒ）群を定義するものとして解釈されるべきである。対照的に、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という経過的用語は、クレームで特定されていない要素、工程、または成分を除外する。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という経過的用語は、クレームの範囲を、クレームされた発明の「基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない」指定された材料または工程に限定する。

本明細書中で使用される場合、用語「治療上の（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」は、患者の望ましくない状態または疾患を治療、闘病、改良、または改善するために利用される薬剤を意味する。部分的には、本発明の実施形態は、好酸球関連炎症および／または他の好酸球関連疾患および状態の治療に向けられる。

「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、本明細書において、対象に投与した場合に、対象の組織の画像化、対象の障害の診断、および／または対象の症状もしくは障害のモニタリングを含む化合物の目的の遂行に適切な化合物の量を指す。「有効量」を構成する実際の量は、障害の重篤度、患者の体格および健康状態、撮像様式、診断の方法、モニタリングの方法、ならびに投与経路を含むがこれらに限定されない多くの条件によって変化する。熟練した医師であれば、医療技術分野で知られている方法を用いて、適切な量を容易に決定することができる。

本明細書において、「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、対象に投与した場合に、対象の障害の症状を軽減し、または意図する組織治療領域の質感、外観、色、感覚、または水分補給を増強することができる化合物の量を指すために使用される。「治療上有効量」を構成する実際の量は、障害の重篤度、患者の体格および健康状態、ならびに投与経路を含むがこれらに限定されない多くの条件によって変化する。熟練した医師であれば、医療技術分野で知られている方法を用いて、適切な量を容易に決定することができる。

「薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」という語句は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび／または他の哺乳動物の組織と接触して使用するのに適している、目的の薬剤／化合物、塩、組成物、剤形などを指すために使用される。いくつかの態様において、薬学的に許容されるとは、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されるか、または哺乳類（例えば、動物）、より詳細にはヒトにおいて使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されることを意味する。

用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」および「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は交換可能であり、本発明の組成物で治療される任意の生体を意味すると解釈される。このように、用語「患者」および「対象」は、これに限定されるものではないが、任意の非ヒト哺乳動物、霊長類またはヒトを含む。いくつかの実施形態において、「患者」または「対象」は、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類、またはヒトなどの哺乳動物である。いくつかの実施形態において、患者または対象は、成人、小児または幼児である。いくつかの実施形態において、患者または対象はヒトである。

本開示が、「医師（ｄｏｃｔｏｒ）」という用語、および特定の職種または役割による様々な医療専門家に対する追加的な用語に言及している場合、本開示のいかなる部分も、特定の職種または機能に限定することを意図していない。医師または医療専門家には、あらゆる医師、看護師、医療専門家、または技術者が含まれる。これらの用語または職種のいずれも、特に明示的に区分されない限り、本明細書に開示されるシステムの使用者と互換的に使用することができる。例えば、医師への言及は、いくつかの実施形態において、技術者、看護師、または他の医療提供者にも適用される。

「組織（ｔｉｓｓｕｅ）」とは、特定の機能を発揮するために一体化した、同様に特殊化した細胞の集合体を指す。

本開示において、「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、特に断りのない限り、疾患、状態、または疾病という用語を意味し、これと互換的に使用される。

本明細書で使用される用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、対象に化合物（関心の対象となる物質とも呼ばれる）、化合物（関心の対象となる物質）の薬学的に許容される塩、または組成物を、対象または医療提供者が直接投与することを指す。

本明細書で使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療された（ｔｒｅａｔｅｄ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療的処置の両方を指し、その目的は、医学的状態の症状の頻度を減少させるか、または発症を遅延させることであり、さもなければ有益または所望の臨床的結果を得ることである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、これに限定されるものではないが、病態症状の逆転、軽減または緩和；病態、障害または疾患の程度の減少；病態、状態、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化させないこと）；状態、障害または疾患の発症の遅延または進行の遅延；状態、障害または疾患の状態の改善；および、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず寛解（部分的であるか全体的であるかを問わない）、または状態、障害または疾患の増強もしくは改善を含む。治療には、過度の副作用を伴わずに臨床的に有意な反応を引き出すことが含まれる。治療には、治療を受けなかった場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも含まれる。

本明細書で使用される用語「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、または「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」は、対象における疾患、状態、または他の生理学的状態の存在および／または性質を、その特徴、徴候、および症状から特定する工程を指す。診断には、そのような工程に基づく、対象における疾患、状態、または他の生理学的状態に関連する陳述または結論が含まれる。

「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」という用語には、本発明の組成物を投与して、症状の発症を予防すること、症状を緩和すること、症状を軽減すること、疾患および／またはその症状の進行を遅延もしくは減少させること、または疾患、状態もしくは障害を除去することが含まれる。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物は、そのような検査、診断、モニタリング、および／または治療を必要とする対象と共に、またはその対象上で利用することができ、これは、「それらを必要とする（ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ）」とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、「それらを必要とする」という語句は、対象が特定の方法または治療の必要性を有すると同定されたこと、または状態を有すると同定されたこと、および方法（例えば、組織の画像化、状態の診断、状態のモニタリング）または治療が、その特定の目的のために、対象とともに、または対象上で利用されたことを意味する。

本発明の方法によって製造された組成物は、それらが活性を有する任意の経路によって、従来の方法で投与することができる。投与は、全身、局所、または経口であっても良い。例えば、投与は、これに限定されるものではないが、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、経頬、または眼経路、または膣内、吸入、デポー注射、またはインプラントであっても良い。このように、投与様式（単独または他の医薬との組み合わせのいずれか）は、これに限定されるものではないが、舌下、注射可能（皮下または筋肉内に注射される短時間作用型、デポー、インプラントおよびペレット形態を含む）、局所（点鼻薬、軟膏、または皮膚に適用するためのクリームを含む）、および／または膣クリーム、坐剤、ペッサリー、膣リング、直腸坐剤、子宮内器具、パッチやクリームなどの経皮吸収型であっても良い。

具体的な投与方法は、効能または目的によって異なる。特定の投与経路および投与量の選択は、最適な臨床反応を得るために、臨床医が公知の方法にしたがって調整または漸増する。投与する化合物の量は、有効な量である。投与量は、治療される対象の特性、例えば、治療される特定の動物、年齢、体重、健康状態、同時治療がある場合にはその種類、および治療の頻度に依存し、当業者（例えば、臨床医）によって容易に決定される。

経口投与のために、組成物は、本明細書の方法によって、高純度高分子量ヘパリンを当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に処方することができる。このような担体は、本発明の化合物を、画像化、診断、および／または治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口用医薬製剤は、固体賦形剤を添加し、任意に得られた混合物を粉砕し、所望により適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。好適な賦形剤としては、これに限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールを含む糖類の充填剤、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製剤を含む。所望により、崩壊剤、例えばこれに限定されないが、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（アルギン酸ナトリウム等）を添加することができる。

経口的に使用できる医薬組成物としては、これに限定されないが、ゼラチンで作られた押込型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）で作られた密封カプセルを含む。押込型カプセルは、例えば、ラクトースなどの充填剤、例えば、デンプンなどの結合剤、および／または例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意に安定剤と混合して活性成分を含有することができる。ソフトカプセルでは、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、もしくは流動ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定剤を添加することもできる。カプセルはまた、消化の１つまたは複数の段階を通して内容物を保護し、および／または内容物の放出を遅延させるために、付加的な層で被覆することができる。例えば、カプセルまたは他の担体は、胃環境での溶解または崩壊を防止するために、腸溶性コーティング（例えば、ポリマーによって形成される）を含むことができる。経口投与のためのすべての組成物は、そのような投与に適した用量であるべきである。

本明細書で使用される「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語は、担体、賦形剤、および希釈剤を包含し、これは、角質層または有棘層のような組織層を横切って医薬、化粧品、または他の薬剤を運搬または輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料などの材料、組成物、またはビヒクルを意味する。化合物の医薬組成物はまた、適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでも良い。このような担体または賦形剤の例としては、これに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、および例えばポリエチレングリコールのようなポリマーを含む。

本明細書において「粘膜組織（ｍｕｃｏｓａｌ ｔｉｓｓｕｅ）」とは、体内の様々な空洞を裏打ちする組織をいう。粘膜組織の例としては、これに限定されないが、鼻、副鼻腔、気管支、肺、結膜、口腔、舌、食道、胃、幽門、十二指腸、空腸、回腸、上行結腸、盲腸、虫垂、横行結腸、下行結腸、直腸、肛門、尿道、および膀胱を裏打ちする粘膜組織を含む。粘膜組織は、上皮表面、粘液を分泌する腺上皮、基底膜、結合組織を有する粘膜下層を含む。

本明細書で用いる「好酸球顆粒タンパク質（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、好酸球の顆粒を構成するタンパク質のことである。好酸球が活性化されると、顆粒タンパク質が細胞から周囲組織に放出される。放出された顆粒タンパク質は、周辺組織、例えば食道粘膜組織に病的な炎症反応を引き起こす。好酸球顆粒タンパク質の例としては、これに限定されないが、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、主要塩基性タンパク質１（ＭＢＰ－１）、主要塩基性タンパク質２（ＭＢＰ－２）、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）を含む。好酸球顆粒タンパク質の他の例は、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに記載されており、好酸球顆粒タンパク質の例の教示については、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用する「高分子量ヘパリン（ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎ）」とは、約２０ｋＤａ以上の分子量を有するヘパリンおよび／またはヘパリン塩（例えば、ヘパリンナトリウム）を指す。ヘパリンポリマーは通常、多分散線状ポリマー、すなわち様々な長さの分子鎖を持つポリマーの混合物からなり、ヘパリン鎖の分子量は様々であり、単一の数値で完全に説明することはできない。したがって、高分子量ヘパリンは、より詳細には、約２０ｋＤａ以上の平均分子量を有するものとして説明される。平均分子量は数平均（すなわち、試料の総重量を試料中の分子数で割ったもの）として計算することができる。さらに、高分子量ヘパリンは、本明細書でさらに記載されるように、未分画ヘパリンとは異なる多分散性を有することがある。多分散性は多分散性指数（ＰＤＩ）として定量することができる：

ここで、Ｍ_ｗは試料の重量平均分子量（すなわち、各分子の分子量の合計に試料の全重量に対する分子の重量分率を掛けたもの）であり、Ｍ_Ｎは化合物の数平均分子量である。ある実施態様において、高分子量ヘパリンは未分画ヘパリンより低い多分散性を有する。ある実施態様において、高分子量ヘパリンは未分画ヘパリンより高い多分散性を有する。他の例では、高分子量ヘパリンは未分画ヘパリンと実質的に同様の多分散性を有する。

本明細書で使用する「低分子量ヘパリン（ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎ）」とは、約８ｋＤａ以下の分子量を有するヘパリンおよび／またはヘパリン塩（例えば、ヘパリンナトリウム）を指す。例えば、エノキサパリン（Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）は低分子量ヘパリンファミリーの製品であり、分子量は約４．５ｋＤａである。ヘパリンポリマーは通常、多分散線状ポリマーの混合物、すなわち様々な長さの分子鎖を有するものからなり、ヘパリン鎖の分子量は様々であり、単一の数値で完全に説明することはできない。したがって、低分子量ヘパリンは、約８ｋＤａ未満の平均分子量を有するものとして、より詳細に説明される。平均分子量は数平均（すなわち、試料の総重量を試料中の分子数で割ったもの）として計算できる。さらに、低分子量ヘパリンの多分散性は、解重合の方法に基づいて変化する場合がある。ある実施態様において、低分子量ヘパリンは、本明細書でさらに記載されるように、未分画ヘパリンよりも低い多分散性を有する。他の実施態様において、低分子量ヘパリンは、未分画ヘパリンと実質的に等しいおよび／または未分画ヘパリンより高い多分散性を有する。

本明細書で使用される「未分画ヘパリン（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ）」または「ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）」は、様々な長さの分子鎖を持ち、分子量が３～３０ｋＤａのヘパリンポリマーを指す。「未分画ヘパリン」または「ヘパリン」は、高分子量ヘパリンまたは低分子量ヘパリンよりも大きな多分散性を有することがあり、特定の限られた範囲の分子量を有する分子の分画を隔離するために分画されていない。他の例では、未分画ヘパリンは、高分子量ヘパリンまたは低分子量ヘパリンより低いか、実質的に等しい多分散性を有する。

本明細書で使用される「放射性標識（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ）」とは、物質、例えばヘパリンに結合させることができる同位体組成物であり、物質がシステムまたは組織を通過する際に追跡することができる。放射性標識物質の非限定的な例は放射性標識ヘパリンであり、これに限定されないが、放射性標識高分子量ヘパリン、放射性標識低分子量ヘパリン、および放射性標識未分画ヘパリンを含む。本明細書で提供されるように、本明細書に記載される方法は、本明細書に開示される放射性標識ヘパリンのいずれかと共に使用され、これに限定されないが、放射性標識高分子量ヘパリン、放射性標識低分子量ヘパリン、ならびに放射性標識未分画ヘパリンを含む。いくつかの態様において、放射性標識ヘパリンは^９９ｍＴｃ－ヘパリンである。他の放射性標識の例としては、これに限定されないが、１１１Ｉｎ、１４Ｃ、３Ｈ、１３Ｎ、１８Ｆ、５１Ｃｒ、１２５Ｉ、１３３Ｘｅ、８１ｍＫｒ、１３１Ｉを含む。物質、例えばヘパリンに結合できる他の放射性標識を表１に示す。放射性標識、例えば^９９ｍＴｃは、当業者によく知られた市販の試薬を用いて物質、例えばヘパリンに結合させることができる。いくつかの態様において、^９９ｍＴｃ－ヘパリンは以下の実施例５に示すように調製することができる。

本明細書により、範囲または類似の方法にしたがって請求することができる、群内の任意のサブ範囲またはサブ範囲の組み合わせを含む、そのような群の任意の個々のメンバーを但し書きで除外または排除する権利を留保することにより、本開示の完全な尺度未満を、いかなる理由によっても請求することができる。さらに、個々の置換基、構造、またはその群、または請求された群の任意のメンバーを除外する権利をここに留保することにより、本開示の完全な尺度未満を任意の理由で請求することができる。本開示全体を通して、様々な特許、特許出願、および刊行物が参照されている。これらの特許、特許出願および刊行物の開示は、本開示の日付の時点で当業者に知られている技術の状態をより完全に説明するために、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。引用した特許、特許出願および刊行物と本開示との間に矛盾がある場合には、本開示が適用される。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本開示のいかなる内容も、本開示に記載された実施形態が、先行発明によりかかる開示に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるものではない。

本明細書で議論されているように、高分子量ヘパリンは好酸球に関連した炎症部位に局在するのに効果的である。さらに、高分子量ヘパリンは、ＭＢＰ－１、ならびに、ＭＢＰ－２、ＥＤＮ、ＥＣＰ、およびＥＰＯを含む他の好酸球顆粒タンパク質の毒性作用を中和するために有効である。いくつかの実施形態において、高分子量ヘパリンは、１つまたはそれ以上の好酸球関連炎症部位への適用または送達により、薬として機能する。さらに、高分子量ヘパリンは、好酸球関連炎症を標的とするために使用されるので、トレーサーおよび／または治療剤は、好酸球関連炎症への標的送達を提供するために高分子量ヘパリンに結合体化される。高分子量ヘパリンは低分子量ヘパリンよりも好酸球関連炎症部位に強く結合するので、高分子量ヘパリン化合物は有利である。その結果、好酸球関連炎症の局在化に使用されるヘパリン（例えば、高分子量ヘパリン）の量は、より多くの割合のヘパリンが１つまたはそれ以上の炎症部位に局在化することを期待して、減らすことができる。

このような利点があるにもかかわらず、いくつかの課題が高分子量ヘパリンの生産を妨げてきた。ヘパリン特有の鎖長の均一性の欠如は、特定の分子量の鎖を単離する上で大きな困難をもたらす。医療分野において低分子量ヘパリンが注目されていることから、低分子量ヘパリン化合物を製造する方法は成功を収めてきた。しかし、高分子量ヘパリンの分画法の開発においては、同様の進歩はなかった。さらに、目標とする平均分子量を有するヘパリン化合物（例えば、低分子量ヘパリン）の製造に成功した場合でも、分子量には大きなばらつきがあり、目標とする分子量範囲内のヘパリン鎖の割合が高くない場合がある。

高分子量ヘパリン化合物の製造方法
ここで図１を参照すると、実施形態に従った高分子量ヘパリン（ＨＭＷＨ）化合物の例示的製造方法のフロー図が描かれている。図１に示すように、方法１００は、ヘパリン溶液を形成するためにヘパリン（すなわち、出発材料）を溶解する工程１０５と、約８ｋＤａ～約１２ｋＤａの間、例えば、約１０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用する接線流濾過（ＴＦＦ）を介してヘパリン溶液を分画する工程１１５とを含む。方法１００によれば、ＴＦＦは、２０ｋＤａ以上の平均分子量を有する分画ヘパリン、すなわち高分子量ヘパリン化合物を含む回収物をもたらす。いくつかの実施形態において、分画ヘパリンは、本明細書においてさらに記載されるように、高純度、すなわち、分画ヘパリン中のヘパリン鎖の実質的な部分が高分子量を有する。

いくつかの実施形態において、ヘパリン出発物質は未分画ヘパリン（ＵＦＨ）を含む。いくつかの実施形態において、未分画ヘパリンはヘパリン塩である。いくつかの実施形態において、ヘパリン塩は、ヘパリンナトリウム、ヘパリンカルシウム、および／または当業者に公知である追加のヘパリン塩を含む。例えば、出発物質はＵＳＰヘパリンナトリウム、すなわち米国薬局方の品質基準を満たすヘパリンナトリウムであっても良い。市販されているヘパリン製剤の他のタイプも本明細書で意図される。

再び図１を参照すると、ヘパリン出発物質を溶解する工程１０５がここでさらに詳細に説明される。いくつかの実施形態において、ヘパリン出発物質を溶解する工程１０５は、ヘパリンを塩溶液に溶解する工程を含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液を含む。しかしながら、本明細書では、当業者に明らかなように、様々な塩溶液を利用することができる。

いくつかの実施形態において、塩溶液は所定の濃度、例えばモル濃度で提供される。塩溶液の濃度はヘパリン鎖に対する膜の透過性に影響を与える可能性がある。したがって、塩溶液の濃度はヘパリン生成物の所望のパラメータに基づいて精製することができる。例えば、塩濃度が低すぎると透過性が低下し、低分子量を含むヘパリン鎖がほとんど濾過されなくなる。したがって、塩濃度が低すぎるとヘパリン製品の純度が低下する。別の例において、塩濃度が高すぎると透過性が増大し、ヘパリンの全部または実質的に全部が膜を通過して濾過される。したがって、塩濃度が高すぎるとヘパリン生成物の収量が低下する。したがって、塩溶液のモル濃度は、ヘパリンに関連する膜の有効分画分子量を改良するために調整され、調節される。いくつかの実施形態において、塩溶液は約１００ｍＭ（すなわち、約０．１ｍｏｌ／Ｌ）のモル濃度で提供される。しかしながら、塩溶液の様々な濃度が本明細書において意図される。例えば、塩溶液は、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２００ｍＭより大きいモル濃度、またはその間の個々の値もしくは範囲を含む。

ヘパリンナトリウムおよび塩溶液は、ヘパリン出発物質を溶解する工程１０５の間に様々な比率で組み合わされても良い。いくつかの実施形態において、約２ｇのヘパリンナトリウムが約５０ｍＬの塩溶液と組み合わされ、これはすなわち、約０．０４ｇ／ｍＬである。しかしながら、この比率は単に例示的なものであり、当業者に明らかなように変更しても良いことを理解すべきである。いくつかの実施形態において、ヘパリンナトリウムおよび塩溶液は、約０．０１ｇ／ｍＬ、約０．０２ｇ／ｍＬ、約０．０３ｇ／ｍＬ、約０．０４ｇ／ｍＬ、約０．０５ｇ／ｍＬ、約０．１ｇ／ｍＬ、約０．２ｇ／ｍＬ、約０．２ｇ／ｍＬより大きい、および／またはその間の個々の値もしくは範囲の比率で組み合わされる。さらに、この工程は、ヘパリン生成物のより大きなバッチを製造するために有意にスケールアップできる。さらに議論されるように、本明細書に記載される方法は、工程にわずかな変更を加えるだけで、化合物の平均分子量および／または純度を損なうことなく、大幅にスケールアップできるので有利であり、それにより、従来の方法よりも高分子量ヘパリンの製造に商業的な利点をもたらす。

図１に示すように、いくつかの実施形態において、この方法は、そこから微生物および／または細菌を除去するために、サブミクロンの膜を通して濾過することによってヘパリン溶液を滅菌する工程１１０をさらに含む。例えば、ヘパリン溶液は、約０．２μｍまたは０．２２μｍの孔径を有する膜を通して濾過される。しかしながら、流体を滅菌するように構成された様々な孔径を有する膜を利用しても良い。

ここで、接線流濾過を介してヘパリン溶液を分画する工程１１５をさらに詳細に説明する。本明細書に記載された方法による改善を十分に伝えるために、まずＴＦＦをその従来の使用法の観点から一般的に説明する。ＴＦＦ（直交流濾過とも呼ばれる）は、生体分子の分離および精製のための迅速濾過法である。大きな生体分子と小さな生体分子を分画するなど、幅広い生物分野に応用できる。通常、ＴＦＦは一貫した構造を持つ球状タンパク質の処理または分離のために設計されている。

球状タンパク質を用いる典型的なＴＦＦ工程では、ＴＦＦは、供給液を、所定の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する細孔を有する膜の表面を接線方向に通過させることにより、供給液中の標的分子を濃縮する工程を含む。膜の供給側には、分子の循環と膜への通過を促進するための正圧（すなわち背圧）をかけることができる。ＭＷＣＯより小さい溶液中の分子の一部は膜を透過し、透過液または濾液と呼ばれる。ＭＷＣＯより大きい溶液中の分子は、一般的に膜の供給側に保持され、保持液と呼ばれる。比較的小さな分子が除去され、溶液量が全体的に減少するため、保持された標的分子は、保持液に濃縮される。

典型的なＴＦＦ工程はさらに、除去された透過液量を置き換えるために供給液に新鮮な溶媒を添加することによって、保持液を透析濾過する工程を含む。いくつかの実施形態において、透析濾過は、濃縮が連続的に行われる間、間隔をおいて行われ（すなわち、不連続透析濾過）、それにより、溶液が十分に分画されるまで、濃縮および希釈の段階を経て溶液を循環させる。いくつかの実施形態において、透析濾過は連続的に行われる。例えば、溶媒は、システム内の体積が実質的に一定のままであるように、透過液流速、すなわち濃縮速度と同じ速度で添加することができる。いくつかの実施形態において、濾過のためにシステムに添加される溶媒の総容量は、システムの体積（すなわち、１透析濾過体積またはＤＶ）とほぼ等しい。しかしながら、追加の体積が、例えば、約１ＤＶ、約２ＤＶ、約３ＤＶ、約４ＤＶ、約５ＤＶ、約１０ＤＶ、約２０ＤＶ、２０ＤＶより大きい、またはその間の個々の値もしくは範囲において、透析濾過のために利用されても良い。ＤＶを追加するごとに、ＭＷＣＯより小さい分子をより多く除去することが容易になり、その結果、より完全な分画（すなわち、本明細書で定義され、さらに記載される「純度」のレベル）が得られる。

再び本実施形態に目を向けると、市販のＴＦＦシステム（例えば、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＭｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、一貫した構造を有する球状タンパク質の処理に従来使用されていることが理解されるべきである。したがって、記載されたＭＷＣＯを含む期待される結果は、この文脈の中で決定される。膜の記載されたＭＷＣＯは、通常の当業者に知られ理解されるだろう細孔サイズおよび他の因子に基づいて、球状タンパク質を処理するために予想されるＭＷＣＯとして定義される。対照的に、ヘパリンは線状多糖であり、ヘパリン単位の分子量は一般的に分子の直径に対応しないため、球状タンパク質とは異なる方法で膜の孔と相互作用する可能性がある。その結果、市販の膜のＭＷＣＯは、ヘパリンと使用する場合には不正確となる。例えば、記載されたＭＷＣＯ以上の分子量を持つヘパリン鎖は、実効ＭＷＣＯが記載されたＭＷＣＯより大きくなるような実質的な速度で膜を通過することがある（例えば、本明細書の実施例１－３を参照）。この発見は、従来のＴＦＦ工程の範囲を超えており、膜の孔径が直鎖多糖類のＴＦＦのＭＷＣＯに影響を与える多くの要因の一つであることを示している。ヘパリン固有の不均一性と可変ポリマー鎖長のため、ＴＦＦを行う条件の多くが有効ＭＷＣＯを変化させる可能性がある。例えば、有効ＭＷＣＯは膜孔径、塩濃度、印加圧力などの因子の組み合わせによって変化する可能性がある。したがって、これらの因子は、有効ＭＷＣＯを制御するために、すなわち、記載された有効ＭＷＣＯに対して有効ＭＷＣＯを上下に調整するために、改良することができる。また、ＭＷＣＯより小さい分子はある程度の量で保持され、有効ＭＷＣＯより大きい分子はある程度の量で除去される可能性があること、すなわち、特定の条件下での有効ＭＷＣＯは絶対的なものではないことが理解されるべきである。むしろ、特定の条件下では、一般に、有効ＭＷＣＯより小さい分子は除去されやすく、有効ＭＷＣＯより大きい分子は保持されやすい。例えば、ＭＷＣＯおよび／または公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）は、一般に、溶質の９０％以上が膜によって保持される溶質の最低分子量として、膜または他の濾過成分について定義されることがある。したがって、ＭＷＣＯは、当業者によって一般的に定義され理解される方法で、膜の透過性を客観的に測定することができる。さらに、本明細書で議論されるように、ＭＷＣＯは、球状タンパク質の処理に基づくため、有効なＭＷＣＯは、非球状タンパク質に関して異なる可能性がある。

再び図１を参照すると、接線流濾過を介してヘパリン溶液を分画する工程１１５は、ヘパリン溶液を濃縮する工程１１５Ａと、所定のＭＷＣＯを有する膜を用いてヘパリン溶液を透析濾過する工程１１５Ｂとを含む。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、約１０ｋＤａの記載されたＭＷＣＯを有する膜を用いて実行される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、約８ｋＤａ～約１２ｋＤａの範囲の記載されたＭＷＣＯを有する膜を用いて実施される。しかしながら、他の記載されたＭＷＣＯは、所望の有効ＭＷＣＯを生成するために、本明細書に記載されるような適切な一連の条件下（すなわち、塩濃度、印加圧力、総運転時間、総濾過量などに変更を加えたもの）でＴＦＦに利用される。例えば、ＴＦＦは、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１８ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａより大きい、またはその間の個々の値もしくは範囲の記載されたＭＷＣＯを有する膜を用いて実施される。

いくつかの実施形態において、ＭＷＣＯは、膜材料を貫通する細孔および／または開口部のサイズおよび／または直径に関連する。したがって、いくつかの実施形態において、ＴＦＦを実施するために使用される膜は、膜の公称孔径または平均孔径に関して記載される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、約５ｎｍの平均細孔サイズ（すなわち、直径）を有する膜を使用して実施される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、約４ｎｍ～約６ｎｍの平均細孔径（すなわち、直径）を有する膜を使用して実施される。しかしながら、所望の有効ＭＷＣＯを生成するために、本明細書に記載されるような適切な一連の条件下（すなわち、塩濃度、印加圧力、総運転時間、総濾過量などに変更を加えたもの）で、他の孔径をＴＦＦに利用しても良い。例えば、ＴＦＦは、約３ｎｍ、約３．５ｎｍ、約４ｎｍ、約４．５ｎｍ、約５ｎｍ、約５．５ｎｍ、約６ｎｍ、約６．５ｎｍ、約７ｎｍ、約７．５ｎｍ、約８ｎｍ、約８．５ｎｍ、約９ｎｍ、約９．５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１０ｎｍより大きい、またはその間の個々の値もしくは範囲を有する平均孔径を有する膜を用いて実施される。また、孔径は膜材料内で一定ではなく、膜材料間で大きく異なる場合があることも理解されるべきである。したがって、本明細書に明示的に記載した範囲を超える孔径は、場合によっては、所望の有効ＭＷＣＯを生成する適切な条件下で実施することができる。

いくつかの実施形態において、膜はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜である。一具体例において、膜は、カセットまたは他の標準膜構造（例えば、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＴ－Ｓｅｒｉｅｓ ＴＦＦ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）の形態のポリオレフィン支持体を有するＰＥＳ膜である。追加の実施形態において、膜は中空糸膜である（例えば、ニューヨーク州Ｐｏｒｔ ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＭｉｃｒｏｚａ Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。例えば、中空糸膜は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）および／またはポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）を用いて形成される。いくつかの実施形態において、中空糸膜は、他の従来の膜材料と比較して、濾過工程の速度、効率、および／または全体的な収率が高い。例えば、中空糸膜は目詰まりを減少させることによって、濾過の速度と効率を向上させることができる。しかしながら、当該技術分野における通常の技術レベルを有する者に知られているように、様々な膜材料を利用することができ、濾過手順のスケール、収率、速度、効率、容量、コスト、および／または他のパラメータを改善するように選択できることを理解されたい。

いくつかの実施形態において、膜は多孔性支持体および／または不織布支持体を利用する。例えば、支持体はポリオレフィンから形成される。別の例では、支持体はアクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）から形成される。別の例では、支持体はポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）から形成される。しかし、当業者であれば知っているような様々な支持体が利用できることを理解されたい。

いくつかの実施形態において、ＴＦＦ中の印加圧力は約２９ｐｓｉである（実施例１～２を参照）。いくつかの実施形態において、ＴＦＦ中の印加圧力は、約３０ｐｓｉである（実施例３を参照）。しかしながら、印加圧力は、所望の有効ＭＷＣＯを生成するために適切な対応条件で変化させても良い。例えば、印加圧力は、約１ｐｓｉ、約５ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ、約１５ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ、約２５ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ、またはその間の個々の値もしくは範囲であって良い。

いくつかの実施形態において、透析濾過する工程１１５Ｂに使用される総濾過量は、約１８００ｍＬ、すなわち３６ＤＶである。いくつかの実施形態において、透析濾過に使用される総濾過量は、約２０５０ｍＬ、すなわち４１ＤＶである。総濾過量は、ＴＦＦを通して除去される低分子量粒子の量に影響するため、選択された総濾過量は、本明細書で定義され記載される分画ヘパリンの「純度」にも影響することが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、分画ヘパリンの純度は、総濾過量に直接関係する。したがって、総濾過量は、所望の有効ＭＷＣＯを生成するために、適切な対応する条件で変化させることができる。例えば、総濾過量は、約５ＤＶ、約１０ＤＶ、約２０ＤＶ、約３０ＤＶ、約４０ＤＶ、約５０ＤＶ、約１００ＤＶ、またはその間の個々の値もしくは範囲であっても良い。

いくつかの実施形態において、ＴＦＦを介したヘパリン溶液を分画する工程１１５は、ヘパリン出発物質の平均分子量よりも大きい平均分子量を有する分画ヘパリンからなる保持液をもたらす。いくつかの実施形態において、分画ヘパリンの平均分子量は少なくとも約２０ｋＤａ、すなわちＨＭＷＨ化合物である（平均分子量が２０ｋＤａ以上である実施例１～３を参照）。しかしながら、いくつかの実施形態において、分画ヘパリンは、約２０ｋＤａを超える平均分子量からなる。例えば、分画ヘパリンは、約２０ｋＤａ、約２１ｋＤａ、約２２ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２４ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４０ｋＤａより大きい、またはその間の個々の値もしくは範囲の平均分子量を含んで良い。

いくつかの実施形態において、分画ヘパリンは高純度を有する。分画ヘパリンの純度は、所定の閾値以上の分子量を有するヘパリン鎖の量として定義される。例えば、所定の閾値は約２０ｋＤａであっても良く、それに応じて、分画ヘパリンの純度は、約２０ｋＤａ未満の分子量を有するヘパリン鎖と比較した、２０ｋＤａ以上の分子量を有するヘパリン鎖の分画、割合、または比率（すなわち、高分子量ヘパリンである割合）に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、分画ヘパリンは、少なくとも約５０％の２０ｋＤａ以上のヘパリン鎖の純度、すなわち「高純度」を有する（平均分子量が２０ｋＤａ以上である実施例１～３を参照）。さらなる実施形態において、分画ヘパリンは、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９５％より大きい、またはその間の個々の値もしくは範囲の、２０ｋＤａ以上のヘパリン鎖の純度を有する。

いくつかの実施形態において、分画ヘパリンは、所定の閾値以下の分子量を有する分子鎖の最大量によって付加的に特徴付けられる。例えば、分画ヘパリンは、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約５％未満、またはその間の個々の値もしくは範囲の、分子量２０ｋＤａ未満のヘパリン鎖の割合を含む。付加的な実施形態において、分画ヘパリンは、その中の低分子量ヘパリン鎖の最大量、すなわち、低分子量ヘパリンを定義する分画値（例えば、約８ｋＤａ）未満の分子量を有するヘパリン鎖の量によって付加的に特徴付けられる。例えば、分画ヘパリンは、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約５％未満、またはその間の個々の値もしくは範囲の、約８ｋＤａ未満の分子量を有するヘパリン鎖の割合を含む。

さらに、いくつかの実施形態において、所定の閾値は約２０ｋＤａ以外の値である。例えば、所定の閾値は、分画ヘパリンの最小の所望の平均分子量に基づいて設定される。いくつかの実施形態において、分画ヘパリンの純度を評価するための所定の閾値は、約２０ｋＤａ、約２１ｋＤａ、約２２ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２４ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４０ｋＤａより大きい、またはその間の個々の値もしくは範囲である。同様に、低分子量鎖の分画値は、約８ｋＤａ以外の値であっても良い。例えば、分画は、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１２ｋＤａより大きい値、またはその間の個々の値もしくは範囲であっても良い。

本明細書に記載されるように、得られる分画ヘパリンの特性は、分画する工程１１５におけるＴＦＦ工程の条件によって制御される。例えば、分画ヘパリンの平均分子量および／または純度は、膜孔径（すなわち、記載されたＭＷＣＯ）、塩濃度、印加圧力、総運転時間、および総濾過量を含む因子の組み合わせに基づいて変化する。したがって、これらの因子は、所望の特性を有する分画ヘパリンを生成するように調節することができる。

ある特定の例において、分画ヘパリンの平均分子量は２０ｋＤａ以上として選択され、分画ヘパリンの純度は５０％以上として選択される。したがって、溶解する工程１０５は、約１００ｍＭのＮａＣｌ溶液を用いて実施することができる。さらに、ヘパリン溶液を濃縮する工程１１５Ａは、約１０ｋＤａの記載されたＭＷＣＯおよび約２９～３０ｐｓｉの印加圧力を有する膜を用いて実施される。さらに、ヘパリン溶液を透析濾過する工程１１５Ｂは、約１００ｍＭのＮａＣｌ溶液および約３６～４１ＤＶ、例えば約１８００～２０５０ｍＬの総濾過量を用いて実施することができる。実施例１～３に示すように、これらの条件により、平均分子量２０ｋＤａ以上、純度５０％以上の分画ヘパリンが得られる。

分画する工程１１５が完了すると、膜の供給側から保持液を回収することができる。さらに、膜を脱イオン水で洗浄して洗浄液を得ることができる。洗浄液には分画する工程１１５中に膜上に回収された高分子量のヘパリンが含まれている可能性があるため、分画ヘパリンの収率を向上させるために、洗浄液を逆流液と合わせても良い。

再び図１を参照すると、方法１００は、分画ヘパリンを脱塩する工程１２０をさらに含む。いくつかの実施形態において、脱塩する工程１２０は、適切な選択された条件でＴＦＦを介して実施される。

いくつかの実施形態において、脱塩する工程１２０は、通常、分画ヘパリンの通過を妨げ、塩溶液中の塩および／またはそのイオンの通過を可能にするように構成されたＭＷＣＯを有する膜を用いて、分画ヘパリンを濃縮する工程１２０Ａを含む。いくつかの実施形態において、約３ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜が使用される。しかしながら、約１ｋＤａ、約３ｋＤａ、約５ｋＤａ、約５ｋＤａより大きい、またはその間の個々の値もしくは範囲のＭＷＣＯを有する膜が、本明細書において利用される。いくつかの実施形態において、分画ヘパリンは、約２９～３０ｐｓｉの印加圧力下で濃縮１２０Ａされる。しかしながら、印加圧力は、当技術分野における通常の技術レベルを有する者に明らかなように変化させても良い。

いくつかの実施形態において、脱塩する工程１２０は、脱イオン水を用いて分画されたヘパリンを透析濾過する工程１２０Ｂをさらに含む。いくつかの実施形態において、透析濾過する工程１２０Ｂは、約１０ＤＶ、例えば、約５００ｍＬの総濾過量で実施される。しかしながら、総濾過量は、当技術分野における通常の技術レベルを有する者に明らかなように変化させても良い。

分画ヘパリンを脱塩する工程１２０の例示的な工程が本明細書に記載されているが、脱塩の様々な従来の方法が、当技術分野における通常の技術レベルを有する者に明らかなように、本明細書で利用されることが理解されるべきである。

再び図１を参照すると、方法１００はさらに、分画ヘパリンを乾燥する工程１２５と、それによって単離されたＨＭＷＨ化合物を製造する工程とを含む。いくつかの実施形態において、乾燥する工程１２５は凍結乾燥によって実施される。しかしながら、乾燥する工程１２５は、当該技術分野における通常の技術レベルを有する者に明らかなような任意の従来の手段によって実施されても良いことが理解されるべきである。

実施例１～３に示されるように、開示された方法は、約１５～１８％の収率でＨＭＷＨ化合物を製造する。いくつかの実施形態において、この方法は、ＨＭＷＨ化合物の収率を改善するために様々な様式で変更される。いくつかの実施形態において、分画に使用される膜孔径、塩濃度、印加圧力、および／または全濾過体積は、収率を改善する方法で調整される。例えば、印加圧力を下げると、収率が改善され、分画が遅くなる（すなわち、所与の濾過量に対して総運転時間が長くなる）。別の例では、総濾過量を減少させることで、より速い分画（すなわち、所与の濾過量に対する総運転時間がより短い）が得られ、収率が改善される。別の例では、膜の孔径を小さくすることで、収率が向上した分画が得られる。塩濃度を調整することも同様に、本明細書に開示した方法の収率の改善につながる場合がある。

いくつかの実施形態において、より高い平均分子量を有するヘパリン出発物質を使用することは、同様に、より高い収率をもたらす。例えば、分子量によって予め濾過されたヘパリン出発物質の使用は、より高い収率をもたらすかもしれない。別の例では、分子量にほぼ相関する特性によって予め濾過されたヘパリン出発物質の使用も、より高い収率をもたらす可能性がある。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、さらなる有用な副生成物を生成する。例えば、濾過液または透過液（すなわち、ＴＦＦを介して保持液から除去された物質）は、実質的に平均分子量が低下したヘパリンを含む。いくつかの実施形態において、透過液はＬＭＷＨを含む。いくつかの実施形態において、透過液は、追加の分画工程を経てＬＭＷＨを製造するように処理される。このような分画工程は、当業者に公知である。したがって、本明細書に開示された方法は、ＨＭＷＨ化合物と一緒に副産物としてＬＭＷＨ化合物を製造するために、追加の工程の有無にかかわらず使用される。

本明細書に記載された例示的な方法は、未分画ヘパリン出発物質から分画されたヘパリンを製造するために接線流濾過を利用しているが、この工程を達成するために、追加のタイプの濾過が利用されても良いことが理解されるべきである。付加的な実施形態において、当業者に知られているような機械的濾過の代替タイプがヘパリンを分画するために利用される。したがって、最終的な高分子量ヘパリン化合物を製造するために、本明細書に記載されているような残りの工程の一部または全てを、そのような代替的な濾過の方法と組み合わせて使用しても良い。

分子量によって濾過する従来の方法で単離されたＨＭＷＨ化合物を製造しようとすると、様々な困難に遭遇するため、現在開示されている方法が有利であることを理解すべきである。一般に、ヘパリンの直鎖構造とポリマー鎖長（したがって分子量）の固有の不均一性は、従来の方法で実質的な純度でより高い分子量のヘパリンを分画する能力を妨げる。しかしながら、本明細書に開示された方法は、球状タンパク質用の膜を用いたＴＦＦによるヘパリンの分画が、ヘパリン鎖の５０％以上が２０ｋＤａ以上の分子量を有する、平均分子量２０ｋＤａ以上のヘパリン画分を生成するという予期せぬ発見を示している。さらに、得られるヘパリン画分のこれらの特性は、膜の孔径、塩濃度、印加圧力、濾過量などのＴＦＦの条件を調節することにより、注意深く調整することができる。

開示された方法は、その拡張性によりさらに有利である。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによってＨＭＷＨ化合物を製造することは可能かもしれないが、そのような工程は、比較的高コストであり、大容量を利用する場合にはさらなる困難が伴うため、スケールアップは困難だろう。他のタイプの膜濾過は、高度のファウリング（膜への蓄積）を伴うことがあり、目詰まりを引き起こし、濾過量および／または運転時間が多い場合には、さらに困難が伴う。対照的に、ＴＦＦは比較的低コストで、その性質上、ファウリングの程度が低い。したがって、ＴＦＦは非常に拡張性があり、数千リットルの溶液を分画するのにわずかな追加コストで使用できる。したがって、本明細書に開示された方法は、他の工程と比較して、製造目的のために非常に拡張性がある。

本明細書に記載される方法は、記載される特定の実施形態に関して限定されることを意図しておらず、これらは、種々の特徴の例示としてのみ意図される。当業者には明らかなように、その精神および範囲から逸脱することなく、方法の多くの修正、変形、および追加が可能である。

ＨＭＷＨ化合物は、様々な医療用途のためのＨＭＷＨ組成物を形成するのに有用である。いくつかの実施形態において、本方法は、ＨＭＷＨ化合物を薬学的に許容される賦形剤と組み合わせてＨＭＷＨ組成物を製造する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物は、医学的状態の画像化、診断、および／または治療に有用である。

いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物は、好酸球関連炎症または好酸球関連状態の発現への結合および／または局在化のために構成される。いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ化合物の平均分子量および／またはＨＭＷＨ化合物の純度は、好酸球関連炎症を発現する部位への結合を最適化するように選択される。ＨＭＷＨは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）または未分画ヘパリン（ＵＦＨ）よりもＭＢＰ－１に対して高い親和性を示すので、ＨＭＷＨはＬＭＷＨまたは未分画ヘパリンＵＦＨよりも好酸球関連炎症部位に強く結合する。

いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物の結合親和性は分子量に直接関係し、ＨＭＷＨ化合物の平均分子量とともに増加する。したがって、ＨＭＷＨの平均分子量が増加するにつれて、投与されたヘパリンのより大きな割合が炎症部位に局在することを期待して、好酸球関連炎症の局在化に必要なヘパリンの量を減少させることができる。

いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物の局在化率は分子量に直接関係するため、ＨＭＷＨ化合物の純度が高くなるにつれて増加する。したがって、ＨＭＷＨの純度が増加するにつれて、投与されたヘパリンのより大きな割合が炎症部位に局在することを期待して、好酸球関連炎症の適切な局在化に必要なヘパリンの量を減少させることができる。同様に、より高い分子量の閾値が本明細書に記載されているように純度を定義するために使用される場合、局在化率は同様に増加する可能性がある。

本明細書の方法によって製造されるＨＭＷＨ組成物は、それらが活性である任意の経路によって、従来の方法で投与するように構成することができる。投与は、全身投与、局所投与、または経口投与であっても良い。例えば、投与は、これに限定されるものではないが、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、経頬、または眼経路、または膣内、吸入、デポー注射、またはインプラントであっても良い。このように、投与様式（単独または他の医薬との組み合わせのいずれか）は、これに限定されるものではないが、舌下、注射可能（皮下または筋肉内に注射される短時間作用型、デポー、インプラントおよびペレット形態を含む）、局所（点鼻薬、軟膏、または皮膚に適用するためのクリームを含む）、および／または膣クリーム、坐剤、ペッサリー、膣リング、直腸坐剤、子宮内器具、パッチやクリームなどの経皮吸収型であっても良い。具体的な投与方法は、適応や目的によって異なる。高分子量ヘパリンとの関連が疑われるＨＩＴおよび／またはＨＩＴＴのリスクは、全身投与に限定されることにも留意すべきである。したがって、局所投与および／または経口投与は、ＨＩＴおよび／またはＨＩＴＴの重大なリスクをもたらさない点で有利である。

いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物は、好酸球関連状態および／またはＨＭＷＨが局在する他の標的状態を画像化するように構成される。したがって、本方法は、放射性標識造影剤などのトレーサーをＨＭＷＨ化合物に結合させることをさらに含む。例えば、放射性標識造影剤は^９９ｍＴｃである。好酸球関連炎症部位へのＨＭＷＨの結合を検出するために、陽電子放射断層撮影に使用されるトレーサーのような追加のトレーサーを採用することもできる。いくつかの実施形態において、トレーサーは表１の任意のトレーサーまたは標識である。したがって、ＨＭＷＨ組成物は、これに限定されないが、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放出（ＰＥＴ）スキャン、従来型またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、またはそれらの組み合わせを含む、従来の画像モダリティを用いて標的状態を可視化するために投与および使用される。トレーサーを有するＨＭＷＨ組成物はまた、記載されたように撮影された画像に基づいて、標的状態の診断および／またはモニタリングに利用することもできる。いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物は、標的状態（例えば、好酸球関連炎症）の部位の適切な画像化のために患者に投与されなければならないトレーサーの量の減少を可能にする。例えば、部位に対するＨＭＷＨの結合活性および局在化率により、未分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリンと比較して、ＨＭＷＨ組成物のより大きな割合が部位に局在化するため、投与されるトレーサーの量（または投与量）は減少する。したがって、トレーサーが放射性である場合、十分な画像化に必要な放射性物質の量が減少するため、組成物の安全性が向上し、放射性標識造影剤の投与に関連するあらゆる影響が制限される。

いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物は、好酸球関連状態および／またはＨＭＷＨが局在化する毒素を発現する他の標的状態の治療のために構成される。したがって、本方法は、ＨＭＷＨ組成物に治療剤を結合させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨ組成物は、患者に投与するための治療有効量の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、標的状態に対して治療効果を有するように構成される。標的状態（例えば、好酸球関連炎症）の部位に対するＨＭＷＨ化合物の結合活性および局在化率のために、適切なケアに必要な治療剤の量（または用量）を低減することができ、その結果、治療剤の投与に関連するあらゆる副作用が制限される。したがって、治療薬の治療上有効量は、ＨＭＷＨ化合物または別の標的化機構がない場合の治療薬の投与に典型的に関連する治療上有効量よりも少ない。いくつかの実施形態において、治療薬はグルココルチコイドである。いくつかの実施形態において、グルココルチコイドは、モメタゾン、フルチカゾン、ブデソニド、およびソルメドロールのうちの１つまたはそれ以上である。本明細書では、当業者に明らかなように、さらなる治療剤が意図される。

いくつかの実施形態において、ＨＭＷＨは、当該技術分野における通常の技術レベルを有する者に公知であるような様々な追加の成分または添加剤を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＨＭＷＨ組成物に安定化剤を添加することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＨＭＷＨ組成物に矯味矯臭剤を添加することをさらに含む。

本発明を、その特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に説明したが、他のバージョンも可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲は、本明細書内に含まれる説明および好ましいバージョンに限定されるべきではない。本発明の様々な態様を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。

実施例１－ＨＭＷＨ組成物の製造のための接線流濾過｜バッチ１
方法：２．０１３２ｇのＵＳＰヘパリンを５０ｍＬの１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に溶解し、０．２２ミクロンの膜で濾過した。このヘパリン溶液を接線流濾過（ＴＦＦ）システムで濾過した。分画分子量（ＭＷＣＯ）が１０ｋＤａの膜をＴＦＦシステムに取り付け、処理前に脱イオン水で洗浄した。その後、ヘパリン溶液をＴＦＦシステムに流送し、２９ｐｓｉの背圧で濾過を行った。１００ｍＭのＮａＣｌ置換溶液を濾過中に添加し、保持液量を一定に維持した（すなわち、透析濾過工程）。透過液の総容量が１８００ｍＬに達した時点で工程を停止した。次いで、実施例４に記載したように、保持液を脱塩および乾燥して、ＨＭＷＨ組成物を得た。

結果：この工程により、収率１５％で２９７ｍｇのヘパリンが得られた。この組成物の平均分子量は２３．９ｋＤａ（すなわち、全体的に高分子量）であった。さらに、ＨＭＷＨ組成物中のヘパリン鎖の５６％が２０ｋＤａより大きい分子量を有していた（すなわち、高純度）。抗凝固剤としてのヘパリンの治療上の有益性に関連する抗Ｘａ：抗ＩＩａ活性の比を決定するために、抗Ｘａ因子および抗ＩＩａ因子アッセイも組成物に対して行った。実施例１の結果を表２に要約する。

実施例２－ＨＭＷＨ組成物の製造のための接線流濾過｜バッチ２
方法：２．０８０１ｇのＵＳＰヘパリンを５２ｍＬの１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に溶解し、０．２２ミクロンの膜で濾過した。このヘパリン溶液をＴＦＦシステムで濾過した。１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜をＴＦＦシステムに取り付け、処理前に脱イオン水で洗浄した。その後、ヘパリン溶液をＴＦＦシステムに流送し、２９ｐｓｉの背圧で濾過を行った。１００ｍＭのＮａＣｌ置換溶液を濾過中に添加し、保持液量を一定に維持した（すなわち、透析濾過工程）。透過液の総量が２０５０ｍＬに達した時点で工程を停止した。次いで、実施例４に記載したように、保持液を脱塩および乾燥して、ＨＭＷＨ組成物を得た。

結果：この工程により、収率１６％で３２７ｍｇのヘパリンが得られた。この組成物の平均分子量は２３．５ｋＤａ（すなわち、全体的に高分子量）であった。さらに、ＨＭＷＨ組成物中のヘパリン鎖の５４％が２０ｋＤａより大きい分子量を有していた（すなわち、高純度）。治療上の有益性に関連する抗Ｘａ：抗ＩＩａ活性の比を決定するために、抗Ｘａ因子および抗ＩＩａ因子アッセイも組成物に対して行った。実施例２の結果を表２に要約する。

実施例３－ＨＭＷＨ組成物の製造のための接線流濾過｜バッチ３
方法：２．１４７６ｇのＵＳＰヘパリンを５４ｍＬの１００ｍＭのＮａＣｌ溶液に溶解し、０．２２ミクロンの膜で濾過した。このヘパリン溶液をＴＦＦシステムで濾過した。１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜をＴＦＦシステムに取り付け、処理前に脱イオン水で洗浄した。その後、ヘパリン溶液をＴＦＦシステムに流送し、３０ｐｓｉの背圧で濾過を行った。１００ｍＭのＮａＣｌ置換溶液を濾過中に添加し、保持液量を一定に維持した（すなわち、透析濾過工程）。透過液の総量が２０５０ｍＬに達した時点で工程を停止した。次いで、実施例４に記載したように、保持液を脱塩および乾燥して、ＨＭＷＨ組成物を得た。

結果：この工程により、収率１８％で３５８ｍｇのヘパリンが得られた。この組成物の平均分子量は２３．３ｋＤａ（すなわち、全体的に高分子量）であった。さらに、ＨＭＷＨ組成物中のヘパリン鎖の５３％が２０ｋＤａより大きい分子量を有していた（すなわち、高純度）。治療上の有益性に関連する抗Ｘａ：抗ＩＩａ活性の比を決定するために、抗Ｘａ因子および抗ＩＩａ因子アッセイも組成物に対して行った。実施例３の結果を表２に要約する。

実施例４－保持液の脱塩および乾燥
方法：１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いたＴＦＦの後、保持液をシステムから回収した。膜はＴＦＦシステムから取り出す前に脱イオン水で別途洗浄し、洗浄液を得た。この洗浄液を保持液と合わせて脱塩を行った。３ｋＤａのＭＷＣＯ膜をＴＦＦシステムに取り付け、純水で洗浄した。次いで、保持液／洗浄液の混合物を流送し、脱イオン水に対して透析濾過を行い、塩を除去した。透過液の総量が保持液量の１０倍に達した時点で、脱塩工程を停止した。

実施例５－ ^９９ｍ Ｔｃヘパリンの調製
塩化スズ溶液（４０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ２４３５２３）を脱イオン水中において窒素流下で調製した。０．５ｍＬの一定分量を濾過し、１．００ｍＬのＮａＣｌ（１．００Ｍ）と１５０ｍｇの防腐剤を含まないヘパリン（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）と混合した。約１００ｍＣｉの新鮮な溶出^９９ｍＴｃを加え、室温で３０分間混合した。約１０ｍＣｉの^９９ｍＴｃと２０ｍｇのヘパリンを含む一定分量を組織実験用に除去した。

結果：標識親和性はアセトンを用いたペーパークロマトグラフィーＷｈａｔｍａｎ３１番で測定し、ヘパリンと^９９ｍＴｃとの結合が９７％より大きいことを確認した。

ヘパリンはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ５ｍＬ脱塩カラム、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７１４０８０１）でも分析し、溶出緩衝液として０．１５ＭのＮａＣｌを使用し、約１ｍＬの分数を集めた。この試験により、^９９ｍＴｃがすべて空隙容量において溶出することが示され、放射性標識ヘパリン中に未結合の^９９ｍＴｃがないことを確認した。

酸性環境における^９９ｍＴｃヘパリンの安定性は、人工胃液（Ｃａｒｏｌｉｎａ、８６４６０３）で希釈して試験し、ペーパークロマトグラフィーとＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５の両方を用いて、その特性が変化しないことを確認した。

実施例６－ＳＰＲによるｅＭＢＰ－１へのヘパリン結合
この研究の目的は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いて、組み換えヒト（ｒｈｕ）ｅＭＢＰと結合する７種類のヘパリン試料の見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）を決定することである。その目的は、複合体の半減期とヘパリンの分子量との間に相関があるかどうかを決定することである。

方法：未分画および分画ヘパリン試料（すなわち分析物）を、組換えヒト（ｒｈｕ）ｅＭＢＰ１（すなわちリガンド）の表面への結合について評価した。

アッセイ条件：バイオセンサー分析は、ＣＭ４センサーチップ（ＧＥ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ；ＢＲ１００５３９）を搭載したＢｉａｃｏｒｅ３０００光学バイオセンサーを用い、ＨＢＳ緩衝系（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、および１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、２５℃で行った。オートサンプラーは室温で使用した。

表面処理：チオールカップリング化学を用いて、ｅＭＢＰ１をチップ表面に固定化した。チオールカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）のプロトコールに従い、まず０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳで２分間表面を活性化した後、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中の８０ｍＭのＰＤＥＡを４分間注入した。ｅＭＢＰ１を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２５）で０．６μＭまたは０．０６μＭに希釈し、目標とする固定化レベルに達するまで注入した。最後に、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、１．０Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ４．０）中の５０ｍＭのＬ－システインを１０μＬ／分で４分間注入し、残りの遊離システインをブロックした。リファレンスフローセルは、同じ固定化手順を用いて作製したが、ｅＭＢＰ１は添加しなかった。ｒｈｕ ｅＭＢＰ１は、センサーチップのフローセル２～４（すなわちＦＣ２、ＦＣ３、ＦＣ４）に、相対単位でいくつかの異なる密度（それぞれ低密度（１０００ＲＵ）、中密度（３０００ＲＵ）、高密度（４０００ＲＵ））になるように捕捉した。第二のチップも同様の方法で、それぞれ低密度（５００ＲＵ）、中密度（８００ＲＵ）、高密度（１２００ＲＵ）に調製した。

分析物の調製：１０μｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの分析物濃度系列を、ランニングバッファーで１０倍希釈して調製した。

相互作用パラメータ：分析物の注入は、試料番号順に二重または三重に行った。複数のブランク（緩衝液）注入を行い、システムのアーチファクトを評価し、差し引くために使用した。すべての分析物濃度について、会合段階は流速２５μＬ／分で６００秒間モニターし、解離段階は流速２５μＬ／分で１８００秒間収集した。

表面の再生：各結合サイクルの終わりに、１００μＬ／分の流速で６Ｍグアニジンを２、３（秒）パルス流して表面を再生した。

データ解析：ＳＰＲデータ処理および非線形最小二乗回帰フィッティングプログラムであるＳｃｒｕｂｂｅｒ ｖ２．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、オーストラリア）を用いて、データのアライメント、二重参照、およびフィッティングを行った。解離段階のデータは、各試料とアッセイ条件について、単純な指数関数的減衰モデルにグローバルにフィットさせた。この単純な減衰モデルは、ｅＭＢＰ１表面と複合化した多分散分析物から生じる複数の解離イベントの間で起こる複雑な解離を過度に簡略化したものであった。

結果：全体として、ｅＭＢＰ１表面密度とヘパリン濃度に依存する特定の条件下で、複合体半減期とヘパリン分子量の間に明らかな線形反応が観察された。複合体半減期とヘパリン分子量との相関の要約データを表３に示す。

ここで図２Ａ～２Ｂを参照すると、実施形態にしたがって、ｒｈｕ ｅＭＢＰ１（すなわち、リガンド）に結合する分画ヘパリン試料（すなわち、分析物）のシグナル応答のセンサグラムが描かれている。図２Ａは、実施形態にしたがって、１２００ＲＵの密度でｅＭＢＰ１に結合する１００ｎｇ／ｍＬの濃度の分子量が異なる７つのヘパリン試料の経時的なシグナル応答曲線を描いている。図２Ｂは、１２００ＲＵの密度でｅＭＢＰ１に結合する１００ｎｇ／ｍＬの濃度の分子量が異なる７つのヘパリン試料の経時的な正規化シグナル応答曲線を描いている。次に図３を参照すると、実施形態にしたがって、１２００ＲＵの密度でｅＭＢＰ１に結合する１００ｎｇ／ｍＬの濃度の分子量が異なる７つのヘパリン試料について、複合体半減期対分子量のプロットグラフが描かれている。図２Ａ～２Ｂおよび３は、本明細書で議論されているように、複合体半減期とヘパリンの分子量との間の相関を示している。

さらに、いくつかのアッセイ条件はこの相関から乖離しており、これはｅＭＢＰ１表面に結合する多量体および多分散のヘパリン試料の複雑さを強調している。ヘパリンの分子量が高いほど結合反応が高いという一般的な相関は観察されたが、この反応は最も結合活性の高い条件を含む全ての条件下で見られたわけではない。最も結合活性が高い条件（すなわち、ｅＭＢＰ１の密度が高く、ヘパリンの濃度が低い）では、明らかな相関は認められなかった。この現象は、各ヘパリン分子に対して結合するサブユニットの数が多いほど、様々な分子量種間の複合体の半減期がより類似し、それによってアッセイのダイナミックレンジが減少するという事実によって説明できる。

さらに、各結合サイクルの後、シグナル応答の明らかな減衰が観察された。したがって、複合体半減期は、応答シグナルとは対照的に、このアッセイのより良い評価ツールである。

上記の詳細な説明において、添付図面を参照し、これらの図面は本明細書の一部を構成する。図面において、文脈上別段の指示がない限り、同様の符号は、通常、同様の構成要素を識別する。本開示において説明される例示的な実施形態は、限定を意図するものではない。本明細書に提示された対象の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、他の変更を加えることができる。本明細書において一般的に記載され、図に例示されるような本開示の様々な特徴は、多種多様な異なる構成において配置、置換、組み合わせ、分離、および設計され得、その全てが本明細書において明示的に意図されることが容易に理解されるだろう。

本開示は、本出願に記載された特定の実施形態の点で限定されるものではなく、これらは様々な特徴の例示として意図されている。その代わりに、本出願は、本教示の任意の変形、使用、または適応をカバーし、その一般原理を使用することを意図する。さらに、本出願は、これらの教示が関連する技術分野において公知または慣例の範囲内にあるような、本開示からの逸脱を対象とすることを意図している。当業者には明らかなように、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、記載された特定の実施形態に対して多くの修正および変形を行うことができる。本明細書に列挙したものに加えて、本開示の範囲内にある機能的に等価な方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかだろう。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物学的システムに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。

上記に開示された様々な特徴および機能、またはそれらの代替物は、他の多くの異なるシステムまたは用途に組み合わされても良い。当業者によって、現在予見されていない、または予期されていない様々な代替、修正、変形、または改良がその後なされる可能性があり、それらの各々もまた、開示された実施形態によって包含されることが意図される。

Claims (33)

1. 分画ヘパリンの製造方法であって、前記方法は、
   ヘパリン溶液を形成するために、ヘパリンを溶媒に溶解する工程と、および
   約８ｋＤａ～約１２ｋＤａの間の分画分子量を有する分画膜を用いた接線流濾過によって前記ヘパリン溶液を分画する工程であって、それにより約２０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する分画ヘパリンを得られ、
   前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも５０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、前記分画する工程と、
   を含む、方法。
2. 請求項１記載の方法において、前記ヘパリンはＵＳＰヘパリンである、方法。
3. 請求項１～２のいずれか一つに記載の方法において、前記溶媒は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液である、方法。
4. 請求項３記載の方法において、前記ＮａＣｌ溶液は約１００ｍＭの濃度を有する、方法。
5. 請求項１～４のいずれか一つに記載の方法において、前記分画膜の分画分子量は約１０ｋＤａである、方法。
6. 請求項１～５のいずれか一つに記載の方法において、接線流濾過によって前記ヘパリン溶液を分画する工程は、前記分画ヘパリンを含む保持液を得るために、前記ヘパリン溶液の少なくとも一部を印加圧力下で前記分画膜に透過させる工程を含む、方法。
7. 請求項６記載の方法において、前記印加圧力は約２９ｐｓｉ～約３０ｐｓｉである、方法。
8. 請求項６～７のいずれか一つに記載の方法において、接線流濾過によって前記ヘパリン溶液を分画する工程は、前記保持液の体積を維持するために追加量の前記溶媒を添加する工程をさらに含む、方法。
9. 請求項１～８のいずれか一つに記載の方法において、前記ヘパリン溶液を滅菌するためにサブミクロン膜を通して前記ヘパリン溶液を濾過する工程をさらに含む、方法。
10. 請求項１～９のいずれか一つに記載の方法において、前記分画ヘパリンを脱塩する工程をさらに含む、方法。
11. 請求項１０記載の方法において、前記分画ヘパリンを脱塩する工程は、約１ｋＤａ～約５ｋＤａの間の分画分子量を有する脱塩膜を用いて接線流濾過を実施する工程を含む、方法。
12. 請求項１１記載の方法において、前記脱塩膜の分画分子量は約３ｋＤａである、方法。
13. 請求項１～１２のいずれか一つに記載の方法において、前記分画ヘパリンを乾燥する工程をさらに含む、方法。
14. 請求項１３記載の方法において、前記分画ヘパリンを乾燥する工程は、前記分画ヘパリンを凍結乾燥する工程を含む、方法。
15. 請求項１～１４のいずれか一つに記載の方法において、前記分画ヘパリンの重量平均分子量は約３０ｋＤａ以上である、方法。
16. 請求項１５記載の方法において、前記分画ヘパリンの重量平均分子量は約４０ｋＤａ以上である、方法。
17. 請求項１～１６のいずれか一つに記載の方法において、前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも６０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、方法。
18. 請求項１７記載の方法において、前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも７０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、方法。
19. 高分子量（ＨＭＷ）ヘパリンの製造方法であって、前記方法は、
    ヘパリン溶液を形成するために、ヘパリン塩を塩溶液に溶解する工程と、
    約０．２μｍの孔径を有する滅菌膜で濾過することにより、前記ヘパリン溶液を滅菌する工程であって、それにより滅菌ヘパリン溶液が得られる、前記滅菌する工程と、
    約５ｎｍの孔径を有する分画膜を用いた接線流濾過によって、前記滅菌ヘパリン溶液を分画する工程であって、それにより約２０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する分画ヘパリンを得られ、前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも５０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、前記分画する工程と、
    約３ｎｍの孔径を有する脱塩膜を用いた接線流濾過によって、前記分画ヘパリンを脱塩する工程であって、それにより脱塩ヘパリンを得られる、前記脱塩する工程と、および
    前記ＨＭＷヘパリンを得るために、凍結乾燥によって前記脱塩ヘパリンを乾燥させる工程と、
    を含む、方法。
20. 請求項１９記載の方法において、前記ヘパリン塩は、ヘパリンナトリウムおよびヘパリンカルシウムからなる群から選択される、方法。
21. 請求項１９～２０のいずれか一つに記載の方法において、前記ヘパリン塩はＵＳＰヘパリン塩である、方法。
22. 請求項１９～２１のいずれか一つに記載の方法において、前記塩溶液は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液である、方法。
23. 請求項２２記載の方法において、前記ＮａＣｌ溶液は約１００ｍＭの濃度を有する、方法。
24. 請求項１９～２３のいずれか一つに記載の方法において、前記分画膜の分画分子量は約１０ｋＤａである、方法。
25. 請求項１９～２４のいずれか一つに記載の方法において、接線流濾過によって前記滅菌ヘパリン溶液を分画する工程は、前記分画ヘパリンを含む保持液を得るために、前記滅菌ヘパリン溶液の少なくとも一部を印加圧力下で前記分画膜に透過させる工程を含む、方法。
26. 請求項２５記載の方法において、前記印加圧力は約２９ｐｓｉ～約３０ｐｓｉである、方法。
27. 請求項２５～２６のいずれか一つに記載の方法において、接線流濾過によって前記滅菌ヘパリン溶液を分画する工程は、前記保持液の体積を維持するために追加量の前記塩溶液を添加する工程をさらに含む、方法。
28. 請求項１９～２７のいずれか一つに記載の方法において、前記脱塩膜の分画分子量は約３ｋＤａである、方法。
29. 請求項１９～２８のいずれか一つに記載の方法において、前記分画ヘパリンの重量平均分子量は約３０ｋＤａ以上である、方法。
30. 請求項２９記載の方法において、前記分画ヘパリンの重量平均分子量は約４０ｋＤａ以上である、方法。
31. 請求項１９～３０のいずれか一つに記載の方法において、前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも６０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、方法。
32. 請求項３１記載の方法において、前記分画ヘパリン中のヘパリン鎖の少なくとも７０％は２０ｋＤａ以上の分子量を有する、方法。
33. 請求項１９～３２のいずれか一つに記載の方法において、接線流濾過によって前記滅菌ヘパリン溶液を分画する工程は、前記滅菌ヘパリン溶液の少なくとも一部を約３０ｐｓｉの膜貫通圧下で前記分画膜に透過させる工程を含み、（１）２０ｋＤａ未満の分子量を有する前記滅菌ヘパリン中のヘパリン鎖は、濾液として濾過膜を透過し、および（２）２０ｋＤａ以上の分子量を有する前記滅菌ヘパリン中のヘパリン鎖は、濾過膜を透過せず、それにより前記分画ヘパリンを含む保持液が得られ、
    前記ヘパリン塩はヘパリンナトリウムを含み、前記塩溶液は約１００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液を含む、方法。

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