JPS6143361B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、螢光ヘパリンおよびその製造法に関
するものであり、さらに詳しくは、フルオレセイ
ンチオカルバミルヘパリン
fluoresceinthiocarbamylheparinもしくはフルオ
レセインチオカルバミル脱Ｎ―硫酸ヘパリンもし
くはそれらの塩（以下、これらを総称してFTC
ヘパリンと略記する。）およびその製造法に関す
るものである。 ヘパリンは、強い抗凝血活性を有する酸性ムコ
多糖体であり、哺乳動物の脾臓、肺臓、肝臓、腸
粘膜などに存在するが、臨床に用いられるヘパリ
ンは主として豚の腸粘膜又は牛の肺臓から製造さ
れている。ヘパリンの物理化学的、生物学的性質
はかなり多様であるが、その化学構造上の特徴は
共通しており、次式（） で概ね正確に示されるように、その多糖類は、２
―アミノ―２―デオキシ―α―Ｄ―グルコピラノ
シル基、β―Ｄ―グルコピラノシルウロン酸基お
よびα―Ｌ―イドピラノシルウロン酸基から構成
されており、Ｎ―アセチル基、Ｏ―硫酸基および
Ｎ―硫酸基がこの多糖鎖に種々の割合に結合して
いる。分子量は市販のもので5000〜16000であ
り、抗凝血活性は市販のもので100〜170USP単
位／mgである〔エス・イー・ラスカー（S.E.
Lasker）、フエデレーシヨン・プロシーデイング
ス（Fed.Proc.）、第36巻、第92ページ（1977
年）〕。 ヘパリンは、その特異な生理作用の発見以来、
臨床医学において血栓性の諸疾病の治療薬とし
て、また外科手術、放射線治療および人工臓器使
用時の血液凝固の抑制などに広く使用されてお
り、近年のヘパリンに関する生化学的、医学的研
究の進歩は医療におけるヘパリンの重要性を著る
しく増加しつある。とくに人工臓器の開発にとも
ない、装置の血液輸送系、透析系など循環血液と
の接触部で起る血液凝固を抑止する目的で、従来
の患者体内のヘパリン大量投与に代り、ヘパリン
をこれら装置の材質（特殊なプラスチツクその
他）自体と結合させ、あるいは材質表面に不溶性
膜状にコーテイングする技術が研究され実用化さ
れている。 本発明はこれらのヘパリンに関する研究、ヘパ
リンの臨床応用に有用な螢光ヘパリンを提供する
ことを第１の目的とし、第２にその製造法を提供
することを目的とする。 螢光ヘパリンは、それ自体が新規なものである
が、本発明の螢光ヘパリンはフルオレセインチオ
カルバミルヘパリンもしくはフルオレセインチオ
カルバミル脱Ｎ―硫酸化ヘパリンであり、本発明
の製造法によれば該螢光ヘパリンはヘパリンもし
くは脱Ｎ―硫酸化ヘパリンとフルオレセインチイ
ソオシアネートを中性もしくはアルカリ性水性媒
体中で反応させることにより製造することができ
る。 本発明における脱Ｎ―硫酸化ヘパリンとは、い
わゆるヘパリンを例えば特開昭51―26987号公報
記載の方法に従つて部分的にあるいは完全に脱Ｎ
―硫酸化を行なつたものを言う。分子量は如何な
る範囲のものであつてもよいが5000〜16000のも
のが好ましい。本発明のFTCヘパリンは下記式
（）によつて模式的に示されるようにヘパリン
もしくは脱Ｎ―硫酸化ヘパリンの遊離アミノ基が
フルオレセインチオカルバミル化されたものであ
り、そのフルオレセインチオカルバミル化の程度
は、その螢光が通常の螢光測定手段によつて検知
できる程度であればいかなる程度であつてもよい
が、本発明の螢光ヘパリンを医療用に用いる場合
には、この条件が満たされる限り、天然のヘパリ
ンに近いという意味で置換度が少ないものが好ま
しい場合が多い。 本発明のFTCヘパリンの製造法は、ヘパリン
もしくは脱Ｎ―硫酸化ヘパリンと下記式（）に
よつて示されるフルオレセインイソチオシアナー
トをPH7.0〜12.0、好ましくは7.5〜9.5の中性もし
くはアルカリ性水性媒体中で温度10〜100℃好ま
しくは20〜50℃で反応させる方法である。ここで
フルオレセインイソチオシアナートとは５―イソ
チオシアナートフルオレセイン又は６―イソチオ
シアナートフルオレセインもしくはそれらの混合
物を言う。 反応系に添加するフルオレセインイソチオシア
ナートの量は目的とするFTCヘパリンによつて
も異なるが、一般に置換させようとする量の数倍
ないし数十倍であり、添加は一度に行なつてもよ
く、分割して行なつてもよい。水性媒体として
は、反応に悪影響を及ぼさず、出発物質を溶解さ
せるものならば如何なるものであつてもよいが、
好ましくはPH7.0〜12.0のリン酸緩衝液、炭酸緩
衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などの緩衝水溶
液であり、特に好ましいものはPH7.5〜9.5の炭酸
緩衝水溶液である。これらの緩衝水溶液に、例え
ばアセトン、DMSOなどの水と混合しかつ、フル
オレセインイソチオシアナートと反応しない極性
有機溶剤を加えて反応を有利に行なわせることも
出来る。 反応は、次式によつて模式的に示されるよう
に、ヘパリンもしくは 脱Ｎ―硫酸化ヘパリン中の遊離アミノ基とフルオ
レセインイソチオシアナートのイソチオシアナー
ト基の反応であり、本発明方法の条件に従えば副
反応はほとんど起らず、ヘパリンもしくは脱Ｎ―
硫酸化ヘパリンの多糖鎖の異性化、切断なども起
らない。 かくして得られる本発明のFTCヘパリンの一
例につきその性質を下記に示す。 １ 螢光性：図１参照、最大の吸収を示す波長は
491mmであり、491mmの光で励起した場合最大の
螢光強度を示す波長は516mmである。 ２ 核磁気共鳴吸収スペクトル：図２参照、ヘパ
リン分子に置換されたフルオレセインチオカル
バミル基の芳香環プロトンの吸収シグナルが
6.5〜8.1ppmに観察される。 ３ 電気泳動法：PH2.0、5.5および8.0において、
酸性ムコ多糖体に特徴的なアルシヤンブルー染
色バンドと一致する単一の螢光性バンドを示
し、その泳動度はもとのヘパリンのそれと同一
であつた。 ４ 分子量：図３参照、ゲルろ過法による溶出パ
ターンは、本発明の螢光ヘパリンともとのヘパ
リンについて同じである。 このようにFTCヘパリンは、FTC基の分子内
導入にもかかわらず物性の点で原料ヘパリンと殆
んど変らない事が判り、FTCヘパリンが生体内
においてヘパリンと同様に行動または作用するこ
とが期待される。事実、これらのFTCヘパリン
は抗凝血活性を完全に保持しており、その値はむ
しろ原料ヘパリンのそれらより高かつた。また兎
を用いた動物実験において、循環血液中のFTC
ヘパリン濃度の経時変化は、原料ヘパリンのそれ
と略々同様であることが示された。またヘパリン
の急性毒性との比較においても大差なかつた。 米国シグマ社製ヘパリンおよびこれより調製し
た部分および完全脱Ｎ―硫酸ヘパリンについて、
下記実施例１〜３および５で得られたFTCヘパ
リン類の分析データおよび抗凝血活性を表１およ
び２に示すが、表１に見るように、得られた螢光
ヘパリン類のFTC置換度（フルオレセインチオ
カルバミル基による置換度）は必ずしも高くな
い。螢光ヘパリンが強い生物活性を保持するため
には、むしろ適度のFTC置換度にとどまること
が望ましい。表１において、原料ヘパリンは単位
２糖当り0.04モルのグルコサミンNH₂基を有し、
部分脱Ｎ―硫酸化ヘパリンは0.17モル、完全脱Ｎ
―硫酸化ヘパリンは0.86モルのグルコサミンNH₂
基を有するが、FTC置換され得るNH₂基はその
１部のみであることが判る。FTC部分脱Ｎ―硫
酸化ヘパリンを再度、同じ条件でフルオレセイン
イソチオシアナート処理しても、そのFTC置換
度は上昇しない。しかし、完全脱Ｎ―硫酸化ヘパ
リンについてある一定の条件下でフルオレセイン
イソチオシアナート処理すると、表１記載の如く
置換度の高いFTC完全脱Ｎ―硫酸化ヘパリンが
得られるので、必要ならばこれを実施例15に示す
ごとく既知の方法（A.G.Lloyd et al.，Biochem.
Pharmac.，20（1971）637；Y.Inoue＆K.
Nagasawa，Carbohydr.Res.，46（1976）87）で
Ｎ―再硫酸化して、高度にFTC置換された活性
の高い螢光ヘパリンを得ることが出来る（表
２）。FTC部分脱Ｎ―硫酸化ヘパリンについても
同様に処理して、目的に応じたFTC置換度をも
ち、かつ活性な螢光ヘパリンが得られる。 かくして得られたフルオレセインチオカルバミ
ルヘパリン又は脱Ｎ―硫酸化ヘパリンはアルカリ
性水溶液又は有機塩基で処理することにより、例
えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、又は有機塩基の塩などに変化することができ
る。 以上に説明したように、本発明の方法および必
要に応じて既知の方法を併せ用いることにより、
種々のFTC置換を有し、かつ高い抗凝血活性を
保持した螢光ヘパリンを製造し得るのであるが、
螢光ヘパリン分子にはなお反応に関与し得る遊離
NH₂基が充分存在しているので、すでに開発され
た固定化（不溶化）方法（A.S.Hoffman and G.
Schmer，“New Approaches to Non―
Thrombogenic Materials”，Acad.Press，
1973）により、遊離NH₂基を介して種々の不溶性
担体（アガロースゲル、セルロース、セロフア
ン、ナイロン、その他各種のプラスチツクス）に
螢光ヘパリンを結合させることが出来る。例え
ば、ブロムシアン（BrCN）で活性化したアガロ
ースゲルをFTC部分脱Ｎ―硫酸化ヘパリンと反
応させることにより、螢光ヘパリンを固定化した
アガロースゲル・カラムを簡単に作ることが出来
る。また人工腎臓装置の透析用セロフアン膜や、
血液の体外循環装置のプラスチツクス製器材、輸
血・採血用器具などの材質表面に螢光ヘパリンを
結合させることにより、これらに抗凝血性を賦与
すると共に、その活性保持の状態を簡単に紫外線
下の螢光観察により識別することが出来る。 すでに説明したように、FTCヘパリンの物理
化学的性質およびin vitroにおける抗凝血活性の
力価、兎の循環血中におけるFTCヘパリンの動
態などの生物学的性状は、無標識のヘパリンと変
らない。図４および５のグラフは、ヘパリンまた
はFTCヘパリン（実施例１により製造されたも
の）のそれぞれ３mg／Kg（体重）をウサギ（雄）
耳静脉より注射し、頚動脉に挿入したカニユーレ
を経て経時的に採血し、それぞれ血液凝固時間
（Clotting time）を測定することにより得られた
ものである。図４，５に見るように、血中濃度の
時間変化のパターンと半減期は、ヘパリンと
FTCヘパリンとで殆んど大差なく、動物実験に
おける誤差を考慮するとき、両者は全く同じよう
に挙動しているものと見做し得る。 このように、本発明の方法で製造された螢光ヘ
パリンは血液と接触する医療器材に用いて、これ
に抗凝血性を賦与する目的に使用されるのみでは
なく、ヘパリンと同様にヒトに安全に使用し得る
可能性を示している。 螢光測定により得られたFTCヘパリンの血中
濃度の経時変化を図６に示した。図５は生物学的
方法により測定されたFTCヘパリンの血中濃度
の経時変化を示すグラフであるが、血中のFTC
ヘパリン濃度は螢光測定により、はるかに簡便、
速やかに、かつ最少の血液量で測定される。図５
のグラフは投与されたFTCヘパリンが血液凝固
の抑制にはたらくまでの時間的“遅れ”を明らか
に示しており、そのグラフおよび半減期はFTC
ヘパリンによつて発動された抗凝血活性の変化に
より得られたものである。それにたいして、図６
のグラフおよび半減期は、血における投与FTC
ヘパリンの濃度変化そのものをあらわしている。 ヘパリンに代る螢光ヘパリンの投与により、あ
るいはヘパリンとともに少量の螢光ヘパリンを同
時投与することにより、ヒト血流中のヘパリン濃
度の追跡は極めて容易となり、適確なヘパリン投
与による治療がより完全に行なえるであろう。 以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説
明する。 実施例 １ ヘパリン・ナトリウム塩1.2gを蒸留水50mlに溶
解した。フルオレセインイソチオシアナート
0.18gを0.5M炭酸緩衝液（PH8.5）50mlに溶解し
た。両液を混合したのち、35℃で６時間反応させ
た。反応液をゲルろ過剤（0.1Mりんん酸緩衝液
（PH6.8）で飽和したセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ―25）を充填したカラム（90×
2.8cm内径）に加え、0.1Mりん酸緩衝液（PH6.8）
で溶出した。赤外線（UV）検出器で検出しなが
ら、最初に溶出する螢光性画分を分取する。これ
を透析膜（Visking tube―60）に入れ、蒸留水
中で24時間透析したのち、凍結乾燥した。得られ
た黄色粉末を室温でP₂O₅デシケータ内で減圧乾
燥し、FTCヘパリン・ナトリウム塩1.06gを得
た。 実施例 ２ 特開昭51―26987号公報記載の方法により、部
分的に脱Ｎ―硫酸化したヘパリン・ナトリウム塩
1.2gを蒸留水50mlに溶解し、フルオレセインイソ
チオシアナート0.18gを0.5M炭酸緩衝液（PH8.5）
50mlに溶解した溶液に加え、よく混和したのち、
35℃で６時間反応させた。以下、実施例１と同様
に操作することにより、目的物と過剰のフルオレ
セインイソチオシアナートおよび低分子副生成物
とを分離し、透析、凍結乾燥後、P₂O₅デシケー
タ内で室温、減圧乾燥してFTC部分脱Ｎ―硫酸
ヘパリン・ナトリウム塩0.93gを得た。 実施例 ３ 完全に脱Ｎ―硫酸化したヘパリン・ナトリウム
塩1.8gを蒸留水100mlに溶解した。フルオレセイ
ンイソチオシアナート0.9gを0.5M炭酸緩衝液
（PH8.5）100mlに溶解した。両液を混合したの
ち、35℃で24時間反応させた。以下、実施例１と
同様に操作してFTC完全脱Ｎ―硫酸化ヘパリ
ン・ナトリウム塩1.94gを得た。 実施例１〜３に用いたヘパリン類およびFTC
ヘパリン類の分析データおよび抗凝血活性を一括
して表１に示す。

【表】 実施例 ４ ヘパリン・ナトリウム塩0.8gを蒸留水40mlに溶
解した。フルオレセインイソチオシアナート（５
―および６―異性体の混合物。その混合比は約
２：１である。）0.12gを0.5M炭酸緩衝液（PH
8.5）40mlに溶解した。両液を混合したのち、35
℃で６時間反応させた。以下、実施例１と同様に
操作することにより、FTCヘパリン・ナトリウ
ム塩0.69gを得た。こゝに得られた製品のフルオ
レセインチオカルバミル基による置換度および抗
凝血活性は、表１記載のFTCヘパリン（実施例
１の製品）の値と殆んど変らなかつた。また螢光
スペクトル、セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―
75によるゲル過クロマトグラムも実施例１の製
品と変らなかつた。 実施例 ５ 実施例３において得られたFTC完全脱Ｎ―硫
酸化ヘパリン0.6gを蒸留水20mlに溶解し、５％炭
酸ナトリウム溶液を用いてPH９―10に調整した。
この溶液にトリメチルアミン・サルフアートリオ
キシド（（CH₃）₃N：SO₂））0.8g加え、55℃で２
時間撹拌し、さらにトリメチルアミンサルフアー
トリオキシド0.8gを追加して６時間撹拌した。そ
の間、PHを９―10に保つた。反応液を透析膜
（Visking tube―60）に入れ、蒸留水に対して48
時間透析したのち、凍結乾燥し、さらに室温で減
圧下にP₂O₅デシケータ内で乾燥することによ
り、FTC完全脱Ｎ―硫酸化ヘパリンの再Ｎ―硫
酸化成績体（ナトリウム塩）0.52gを得た。 実施例５に用いたFTC完全脱Ｎ―硫酸化ヘパ
リンおよびその再Ｎ―硫酸化成体の分析データお
よび抗凝血活性を表２に示す。

【表】 【図面の簡単な説明】

図１：FTCヘパリンの励起および螢光スペク
トル。実線は螢光スペクトル（励起波長：491nm
を、破線は励起（吸収）スペクトルを示す。図
２：FTCヘパリンの核磁気共鳴吸収スペクトル
（内部標準物質：テトラメチルシラン）、図３：
FTCヘパリンのセフアデツクスＧ―75ゲルクロ
マトグラム、Voはボイド・ボリユームを示す。
破線は、もとのヘパリンの溶出曲線を示す。図
４：無標識ヘパリンの血中濃度の経時変化（血液
凝固時間測定による追跡）。―〇―は体重3.5Kgの
ウサギ（〓）による実験結果を示す（半減期ｔ〓
＝35分）。―●―は体重3.0Kgのウサギ（〓）によ
る実験結果を示す（半減期ｔ〓＝３分）。投与量
はいずれも３mg／Kg。図５：FTCヘパリンの血
中濃度の経時変化（血液凝固時間測定による追
跡）。―〇―は体重3.0Kgのウサギ（〓）による実
験結果を示す（半減期ｔ〓＝36分）。―●―は体
重3.0Kgの別のウサギ（〓）による実験結果を示
す（半減期ｔ〓＝40分）。投与量はいずれも３
mg／Kg。図６：FTCヘパリンの血中濃度の経時
変化（螢光強度による追跡）。―〇―は体重3.0Kg
のウサギ（〓）による実験結果を示す（半減期ｔ
〓＝26分）。―●―は体重3.7Kgのウサギ（〓）に
よる実験結果を示す（半減期ｔ〓＝22分）。投与
量はいずれも３mg／Kg。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコサミン残基が、 次式： 〔式中、R₁はその0.1〜20モル％が 次式： （式中、残基―HNCS―のフルオレセイン残基
   との結合位置は５位又は６位である。） で示されるフルオレセインチオカルバミル基であ
   り、残りが硫酸基、アセチル基又はアミノ基であ
   り：R₂は硫酸基又は水素原子を表わす。〕 で示されることを特徴とするＮ―フルオレセイン
   チオカルバミルヘパリン又はＮ―フルオレセイン
   チオカルバミル脱Ｎ―硫酸化ヘパリンもしくはそ
   れらの塩。 ２ ヘパリンもしくは脱Ｎ―硫酸化ヘパリンとフ
   ルオレセインイソチオシアナートを中性ないしア
   ルカリ性水性媒体中で反応させることを特徴とす
   るＮ―フルオレセインチオカルバミルヘパリン又
   はＮ―フルオレセインチオカルバミル脱Ｎ―硫酸
   化ヘパリンもしくはそれらの塩の製造法。