JP6110306B2 - 組織傷害を診断するための新規な抗体 - Google Patents

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関連出願
この出願は、２０１０年１１月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／４１７，６８２号を基礎とする優先権を主張し、その主題の全てを本願明細書に取り込む。
この出願は、被験者における組織傷害を診断または識別するための組成物および方法に関し、より詳細には、被験者における補体媒介性の組織傷害を診断または識別するための組成物および方法に関する。
補体媒介性の組織傷害は、補体活性化が最終経路を完成し、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ、Ｃ５ｂ−９）が生じる際に発生する。これらの複合体により、組織傷害が引き起こされることが知られている。補体は、黄斑変性、関節リウマチ、心筋梗塞および臓器再かん流傷害を含めた、複数の疾病の兆候において、重要な病理学的役割を果たす。非侵襲的な手法を使用して、組織損傷の部位、強度および度合いを判定するのは困難である。ヒトの被験者において、他の非侵襲的な手法を使用して、眼に対する傷害を含めた内部組織の傷害を判定するのは、一般的に困難である。しかしながら、本願において提示される診断手段は、そのような情報を明らかにするために適用し得る。
この出願は、新規な抗体またはそのフラグメント、および、非侵襲的手法または最小限に侵襲的な手法において、被験者における組織傷害の診断または識別のための、新規な抗体またはそのフラグメントの使用に関する。一部の実施形態において、前記新規な抗体またはそのフラグメントを使用して、一般に高齢者に見られる眼の疾病等の疾病である黄斑変性を識別および／または診断し得る。前記新規な抗体またはそのフラグメントにより、補体媒介性の病変部位を明瞭に識別することが期待されている。沈着したＣ５ｂ−９および、補体活性化の結果として生じるタンパク質上の他の新規なエピトープの存在により、前記病変部位を判定し得る。
一部の実施形態において、前記疾病は、眼組織における病変部位となり得る、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）およびドルーセンであり得る。ドルーセンは、ＲＰＥとブルッフ膜との間の眼領域、視神経またはその抹消のいずれかの周辺に位置する、黄色または白色の細胞外沈着である。ドルーセンには２つのカテゴリーがあり、一つは病的な状態のもの、もう一つは、病的な状態にないものである。本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントは、病的な状態のドルーセンに関連する補体タンパク質活性化産物を検出することにより、病的な状態のドルーセンの存在を検出し得る。
本願の新規な抗体またはそのフラグメントは、補体活性化により生じ、補体活性化前の補体タンパク質上には存在しない、「新規なエピトープ」と呼ばれる特有のエピトープを標的とし得る。新規なエピトープは、補体タンパク質の切断の結果物である補体フラグメント上に生じ、親補体タンパク質上には存在しない特有のエピトープ、および、補体活性化による補体タンパク質またはフラグメントの凝集または複合体化の結果物である補体活性化産物に生じ、補体活性化前の補体タンパク質上には存在しない特有のエピトープを、含み得る。
例えば、補体活性化中に、Ｃ３は、Ｃ３ａとＣ３ｂとに変換される。Ｃ３ａおよびＣ３ｂは両方とも、Ｃ３ａとＣ３ｂとの両方に共通するエピトープを検出する抗Ｃ３抗体により検出され得る。Ｃ３ａとＣ３ｂとは、Ｃ３の切断の結果として表れ、前記親Ｃ３分子には存在しない、新規なエピトープも含んでいる。補体活性化産物の新規なエピトープの検出を、被験者における補体媒介性の組織傷害の検出に使用し得る。同様に、Ｃ５ａとＣ５ｂとは、Ｃ５の切断の結果として生じる新規なエピトープを含む。Ｃ５ａとＣ５ｂとを標的とする新規な抗体またはそのフラグメントは、Ｃ５由来の両者ほどは、Ｃ５タンパク質と交差反応しない。Ｂ因子は、Ｄ因子により、ＢａとＢｂとに切断される。ＢａおよびＢｂに対する新規な抗体またはそのフラグメントを、補体媒介性の組織傷害の検出に使用し得る。ＢａとＢｂと結合する抗体は、Ｂ因子にも結合するであろうが、新規な抗Ｂａ抗体および新規な抗Ｂｂ抗体は、Ｂ因子には結合しないであろう。
ＭＡＣ複合体としても公知のＣ５ｂ−９に特異的な、新規な抗体またはそのフラグメントも、同様である。前記ＭＡＣは、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９のタンパク質からなる。Ｃ６、Ｃ７およびＣ８に対する抗体は、Ｃ５ｂ−９の存在を検出するであろう。このような抗体は、血中に見られる各遊離タンパク質とＭＡＣ複合体とを区別しないであろう。ＭＡＣ複合体Ｃ５ｂ−９を特異的に検出できる、新規な抗体またはそのフラグメントは、抗重合体Ｃ９抗体または抗Ｃ５ｂ−９抗体を含み得る。非新規の抗体も、これらのタンパク質を認識し、検出するであろう。しかしながら、新規な抗重合体Ｃ９抗体および新規な抗Ｃ５ｂ−９抗体のみが、被験者におけるＭＡＣ複合体Ｃ５ｂ−９と、その構成補体タンパク質とを区別し得る。これらの新規な抗体またはそのフラグメントは、前記ＭＡＣを構成する可溶型の構成タンパク質を認識しないであろう。
患者から採取した血液検体を、各種の抗補体抗体を使用して、補体タンパク質の存在について分析し得る。しかしながら、可溶性の補体タンパク質は、組織損傷に関わらず、血中に構造的に存在する。補体活性化により生じる新規なエピトープに対して特異的でない抗体は、可溶型のこれらのタンパク質を検出してしまい、病変の検出には信頼性がないであろう。本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントを使用して、補体媒介性の組織損傷の特異的なプロファイルを取得し得る。
一部の実施形態において、本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントを使用して、適切な量の前記新規な抗体またはそのフラグメントを投与することにより、組織における病的な状態のドルーセンの存在を検出し得る。ＭＡＣ（Ｃ５ｂ−９）を含む補体タンパク質は、眼組織におけるドルーセン、ブルーフ膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の基底面および網膜下色素上皮に関連することが見出されている。Ｃ３、Ｃ５、Ｃ９因子および前記Ｃ５ｂ−９の終末複合体は、ドルーセンに関連することが見出されている。他の補体関連分子ＣＲ１、ＣＲ２、クラステリン（ｃｌｕｓｔｒｉｎ）およびビトロネクチンは、ドルーセンに関連することが見出されている。ブルーフ膜および／またはドルーセンに局在する、付加的な補体経路関連分子としては、Ｃ３ｄ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｄ因子、Ｈ因子、Ｌ因子、Ｂ因子、クラステリンおよびマンノース結合タンパク質が挙げられる。さらに、ＣＤ２１、ＣＤ３５、ＣＤ５５／分解促進因子およびＣＤ５９／プロテクチン等の一部の補体経路関連分子は、前記ＲＰＥの基底面に存在する。
ドルーセンを検出するための新規な抗体またはそのフラグメントは、Ｃ５ｂ−９複合体における重合体のＣ９により生じる新規なエピトープのみを認識する、新規な抗重合体Ｃ９抗体を含み得る。補体媒介性の病変において、組織損傷は、前記組織上へのＣ５ｂ−９の沈着の結果として生じる。したがって、この沈着および組織損傷の度合いを、抗重合体Ｃ９抗体を使用して可視化し得る。これらの抗体を試薬により標識し、検出感度を向上し得る。
本願明細書に記載の画像法により診断し得る眼関連疾患としては、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底変性症、化学作用によるシュタルガルト病、模様ジストロフィー、ベスト病、家族性ドルーセン、マラッティア・レベンティネース（ｍａｌａｔｔｈｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体の変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィーおよび錐体変性が挙げられる。
代替補体経路の異常活性化は、本来、急性および慢性の両方の各病理状態に関係している。代替経路活性化の副生成物レベルの向上は、下記に示す、体外循環傷害、心疾患、移植拒絶、眼疾患、溶血性疾患、呼吸器疾患、神経疾患、外傷誘因性傷害、全身性炎症および骨関連疾患、腎疾患、臓器の再かん流傷害、泌尿生殖器の疾病、皮膚病、消化器疾患、内分泌疾患または他の疾病の兆候等の、各種傷害の兆候において見出されている。本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントを、これらの傷害に関連する産物による補体活性化の検出に使用し得る。
体外循環傷害としては、例えば、心肺バイパス法後炎症、術後肺機能不全、心肺バイパス法、血液透析、白血球除去輸血、血漿交換、血小板フェレーシス、ヘパリン起因性体外ＬＤＬ沈降法（ＨＥＬＰ）、かん流後症候群、膜型人工肺（ＥＣＭＯ）、全身炎症反応および多臓器不全が挙げられる。
心疾患としては、例えば、川崎病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病腎炎、血管漏出症候群、経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）、急性心筋梗塞後の虚血再かん流、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、血管炎、免疫複合体性血管炎、敗血症、動脈炎、動脈瘤、心筋症、高安動脈炎、拡張型心筋症、静脈ガス塞栓症（ＶＧＥ）、ヴェーゲナー肉芽腫症およびベーチェット症候群が挙げられる。
移植傷害としては、例えば、移植拒絶、移植片対宿主拒絶反応、臓器または移植片の異種移植、臓器または移植片の異物移植および超急性拒絶が挙げられる。
眼疾患としては、例えば、加齢黄斑変性（ウエット型およびドライ型）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、角膜血管新生、網膜血管新生、網膜損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜細小血管症、糖尿病性黄斑浮腫、眼のヒストプラズマ症、ブドウ膜炎、病的近視、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）およびプルチャー網膜症（Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒ’ｓ ｒｅｔｉｎｐａｔｈｙｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）が挙げられる。
溶血性疾患としては、例えば、劇症型抗リン脂質抗体症候群（ＣＡＰＳ）、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、自己免疫血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、内毒素血症、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、敗血症、敗血性ショック、鎌状赤血球貧血、溶血性貧血、好酸球増加症候群、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＬＳ）が挙げられる。
呼吸器疾患としては、例えば、ぜんそく、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、反応性気道疾患症候群、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、パラインフルエンザウイルス感染、ライノウイルス感染、アデノウイルス感染、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、結核、肺寄生虫症、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管支炎、嚢胞性線維症、間質性肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、輸血関連急性肺障害、急性肺障害、線肺症およびアスベスト起因性炎症が挙げられる。
神経疾患としては、例えば、重症筋無力症、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、脳卒中、アルツハイマー病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、変性円板疾患（ＤＤＤ）、髄膜炎による脳神経損傷、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、特発性多発性神経障害および神経障害痛が挙げられる。
外傷誘因性傷害としては、例えば、出血性ショック、血液量減少性ショック、脊髄損傷、ニューロン損傷、脳外傷、脳虚血再かん流、圧挫損傷、創傷治癒、重度のやけどおよび凍傷が挙げられる。
全身性炎症、骨の炎症および骨関連疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、若年性全身関節リウマチ、変形性関節症、骨粗しょう症、サルコイドが挙げられる。
腎疾患としては、例えば、腎臓の再かん流傷害、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、グッドパスチャー病、膜性腎炎、ベルガー病／ＩｇＡ腎症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎および腎皮質壊死（ＲＣＮ）が挙げられる。
臓器の再かん流傷害としては、例えば、心臓、脳、腎臓および肝臓が挙げられるが、これに限定されるものではない。
泌尿生殖器の疾病としては、例えば、自然流産、胎児母性耐性、子癇前症、知覚性膀胱疾患および間質性膀胱炎が挙げられる。
皮膚病としては、例えば、類天疱瘡、後天性表皮水疱症、自己免疫水疱症、水疱性類天疱瘡、血管性浮腫、遺伝性血管神経性浮腫（ＨＡＥ）、多形性紅斑、妊娠性疱疹、シェーグレン症候群、乾癬、皮膚筋症、好酸球性海綿状態、アトピー性皮膚炎および疱疹状皮膚炎が挙げられる。
消化器疾患としては、例えば、クローン病、セリアック病／グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、腸虚血、炎症性大腸炎および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
内分泌疾患としては、例えば、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、ストレス性不安神経症、プロラクチン、成長因子、副腎皮質刺激ホルモンの放出に影響を与える疾病、膵炎、アジソン病ならびにインスリン耐性が挙げられる。
他の疾病としては、例えば、グッドパスチャー病、パーキンソン病、やけど、アルツハイマー病、じんましん、ハンチントン病、ベルガー病、心臓手術、血液量減少性ショック、クローン病、臓器移植における超急性拒絶、熱傷、重度のぜんそく、腸炎、経皮冠動脈インターベンション、ヘパリン起因性膜型人工肺およびアナフィラキシーショックが挙げられ得る。
本願の他の実施形態は、血流に注入された標識試薬に結合し、当該病的な状態の組織を検出可能な、新規な抗体またはそのフラグメントに関する。一部の実施形態において、新規な抗体は、完全なＩｇＧまたはそのフラグメントを含み得る。新規な抗体またはそのフラグメントを、インドシアニングリーン、９９ｍＴｃ、免疫陽電子放出トモグラフィー等の標識試薬、画像化試薬または造影剤に結合し、このような標識試薬、画像化試薬または造影剤に特異的な画像法により検出し得る。
本願のさらに他の実施形態は、組織における補体活性化のフラグメントを検出することにより、被験者における黄斑変性関連疾患を診断する方法に関する。任意の大きさのドルーセンの存在を、新規な抗体またはそのフラグメントにより検出可能である。このような抗体は、新規なエピトープの由来となる、遊離の親タンパク質と交差反応すべきでない。一部の実施形態において、前記新規な抗体は、眼組織内の補体経路関連分子に特異的に結合する。他の実施形態において、異常レベルの新規なエピトープのみを検出する。
本願の他の実施形態は、被験者における黄斑変性関連疾患の進展の傾向を診断または識別する方法に関する。これらの方法は、眼組織における、新規なエピトープを含む補体タンパク質および／またはフラグメントの存在を検出する。前記眼組織は、黄斑変性の患者由来であり得る。前記黄斑変性に関連する新規な抗原としては、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｃ、Ｃ５ｂ、Ｃ５ｂ−９、Ｃ３ａおよびＣ５ａからなる群から選択されるであろう分子が挙げられる。一部の実施形態において、疾病を患う被験者由来の組織試料を、診断の目的で使用し得る。前記組織試料は、体液および眼の液体を含んでもよい。
他の実施形態において、前記検出工程は、黄斑の眼の疾病を患う患者の眼組織における新規なエピトープを検出するための、標識された新規な抗体またはそのフラグメントの使用を伴う。この方法において、前記標識された新規な抗体フラグメントは、黄斑変性関連分子（または新規な抗原）に結合し、続いて、画像システムを使用して検出する。前記方法は、前記被験者における少なくとも１つの黄斑変性関連の新規なエピトープを検出する工程を含んでもよい。前記方法は、さらに、眼科的な撮像法により被験者を検査する工程を含んでもよい。
本願のさらに他の実施形態は、被験者における黄斑変性関連疾患の進展の傾向を診断または識別するキットに関する。前記標識抗体は、少なくとも１つの黄斑変性関連の新規な抗原、画像化試薬により標識された新規な抗体、および、前記新規な抗体と前記新規な抗原とを結合させる媒体試料を含むであろう。
図１は、新規な抗ｉＣ３ｂ抗体の結合特性を示す。新規な抗ｉＣ３ｂ抗体は、基板に結合したｉＣ３ｂを検出するが、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄを検出しない。 図２は、新規な抗Ｃ３ｄ抗体の結合特性を示す。新規な抗Ｃ３ｄ抗体は、Ｃ３ｄには結合するが、Ｃ３ｃには結合しない。 図３は、Ｂ因子に関連する抗Ｂｂ抗体および新規な抗Ｂｂ抗体の結合特性を示す。 図４は、新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体の結合特性を示す。新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体は、重合体のＣ９およびＳＣ５ｂ−９のみに結合する。 図５は、抗Ｃ５抗体、抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体、抗Ｃ８抗体および抗Ｃ９抗体に対する、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９の結合特性の関連性を示す。 図６は、抗Ｃ５抗体の結合特性を示す。抗Ｃ５抗体は、Ｃ５には結合するが、ＳＣ５ｂ−９には結合しない。 図７は、抗Ｃ６抗体の結合特性を示す。抗Ｃ６抗体は、Ｃ６およびＳＣ５ｂ−９に結合する。 図８は、抗Ｃ７抗体の結合特性を示す。抗Ｃ７抗体は、Ｃ７およびＳＣ５ｂ−９に結合する。 図９は、抗Ｃ８抗体の結合特性を示す。抗Ｃ８抗体は、Ｃ８およびＳＣ５ｂ−９に結合する。 図１０は、抗Ｃ９抗体の結合特性を示す。抗Ｃ９抗体は、Ｃ９には結合するが、ＳＣ５ｂ−９には結合しない。 図１１は、新規な抗重合体Ｃ９抗体の結合特性を示す。新規な抗重合体Ｃ９抗体は、重合体のＣ９およびＳＣ５ｂ−９に結合する。 図１２は、抗重合体Ｃ９抗体の結合特性を示す。抗重合体Ｃ９抗体による基板に結合したＳＣ５ｂ−９の検出は、ヒト血清中のタンパク質により阻害されない。 図１３は、新規な抗重合体Ｃ９抗体、抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体および抗Ｃ８抗体の結合特性を示す。これらの抗体は、ＭＡＣ複合体を検出した。 図１４は、新規な抗重合体Ｃ９抗体の結合特性を示す。新規な抗重合体Ｃ９抗体は、病的な状態のドルーセンを検出する。
本願明細書で使用される「抗体」という用語は、全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ナノボディおよび多重特異的抗体を含む。生物学的な抗体は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖とから構成される、１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。前記２本の重鎖は、ジスルフィド結合により互いに連結される。各重鎖は、ジスルフィド結合により１本の軽鎖に連結される。それぞれの全長ＩｇＧ分子は、少なくとも２つの、特異的な標的または抗原のための結合部位を含む。軽鎖は、κ鎖またはλ鎖のいずれかである。両軽鎖は、可変領域と呼ばれる（「ＶＬ領域」、「Ｖｋａｐｐａ領域」または「Ｖｌａｍｂｄａ領域」と、さまざまに呼ばれる）、可変のアミノ酸配列のドメインと、定常領域（「ＣＬ領域」）と呼ばれる、比較的保存されたアミノ酸配列のドメインとを含む。同様に、各重鎖は、１つの可変領域（「ＶＨ領域」）と、３つの定常領域（「ＣＨ１領域」、「ＣＨ２領域」および「ＣＨ３領域」）と、１つのヒンジ領域とを含む。
本願明細書で使用される、抗体の「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」または「そのフラグメント」という用語は、全長抗体の断片を意味し、一般的に、標的結合領域または可変領域と呼ばれる。例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識部位および結合部位を含む、最小の抗体フラグメントである。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２は、ＦＣ領域を欠いている。フラグメントは、全長抗体からプロテアーゼ消化により調製し得る。標準的な組換えＤＮＡ手法を使用して、当業者により、フラグメントを産生してもよい。
本願明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体またはそのフラグメントが結合し、その機能活性を果たす、タンパク質、ポリペプチド、補体因子、補体フラグメント上の部位を意味する。前記エピトープの用語は、「抗原部位」および「抗体結合部位」と同義である。
本願明細書で使用される「Ｆａｂフラグメント」は、前記軽鎖の定常ドメインおよび前記重鎖の第１の定常ドメインを意味する。Ｆａｂ’フラグメントは、前記抗体のヒンジ部から、１つ以上のシステインを含む前記重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の余分な残基により、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２のペプシン消化産物のヒンジ部のシステインにおけるジスルフィド結合の切断により産生される。
本願明細書で使用される、抗体の「機能性フラグメント」という用語は、全長抗体と同様に、質的な生物学的活性を有する抗体フラグメントを意味する。
本願明細書で使用される「ヒトコンセンサスフレームワーク」という用語は、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択における、最も共通して現れるアミノ酸残基を示す、フレームワークを意味する。一般的に、前記ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。
本願明細書で使用される「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を除く、大部分がヒトの配列からなる抗体を意味する。全てのフレームワーク領域も、ヒト化される。キメラ抗体は、マウスＣＤＲ、マウスフレームワーク領域およびヒト定常領域を含む。まとめると、キメラ抗体は、マウスの両可変領域と、ヒトの定常領域とを含む。
本願明細書で使用される、抗体鎖ポリペプチド配列に関する「同一」または「実質的に同一」という用語は、前記抗原結合フラグメントの可変領域に存在する基準ポリペプチド配列に対して、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列相同性を示す、抗体鎖と解釈されてもよい。核酸配列に関する前記用語は、基準核酸配列に対して、少なくとも約６５％、７５％、８５％、９０％、９５％または９７％の配列相同性を示す、ヌクレオチド配列と解釈されてもよい。
本願明細書で使用される「個体」または「被験者」という用語は、脊椎動物を意味し、好ましくは哺乳動物を、より好ましくはヒトを意味する。治療可能な個体には、現時点で無症状の個体だけでなく、代替補体経路が役割を果たす、または、代替補体経路の活性化が役割を果たす、症候性疾患の進展の危険性がある個体も含まれる。
本願明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、高等霊長類、家畜、馬、豚、牛、犬、猫およびフェレット等を含む哺乳動物として分類される動物を意味する。本発明の一実施形態において、前記哺乳動物は、ヒトである。
本願明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、抗体の均質集団を意味する。このような抗体は、単一の標的抗原に対して、特異性が高い。これらのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの培養により均質的に産生され、他の免疫グロブリンが混入していない。モノクローナル抗体は、既知の方法によるファージディスプレイ等の他の手法によっても産生され得る。
本願明細書に記載の実施形態は、タンパク質分子上の新規な（新規な）エピトープに結合する新規な抗体またはそのフラグメントを含む組成物および方法を含む。補体活性化産物に結合する新規な抗体またはそのフラグメントは、親補体タンパク質または分子には存在しない、補体活性化産物内の新規なエピトープに結合する抗体を含む。例えば、本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントは、Ｃ３ｂには結合し得るがＣ３には結合し得ず、Ｃ３ａには結合し得るがＣ３には結合し得ず、Ｃ３ｄには結合し得るがＣ３には結合し得ず、Ｃ３ｃには結合し得るがＣ３には結合し得ず、ｉＣ３ｂには結合し得るがＣ３には結合し得ず、Ｃ５ｂには結合し得るがＣ５には結合し得ず、Ｃ５ａに結合し得るがＣ５には結合し得ず、Ｃ５ｂ−９に結合し得るがＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９には結合し得ない。
眼内部における補体活性化の進行を検出するために、遊離タンパク質に結合せず、活性化され、沈着したタンパク質を特異的に識別可能な、標的特異性が高いモノクローナル抗体が必要である。このように新規で特異的な部位起点のモノクローナル抗体は、本願明細書に記載の抗体が目的とするものの１つである。これらの抗体は、新規な抗体としても知られている。これらのモノクローナル抗体は、活性化後に生じるタンパク質上の新規なエピトープに結合する。Ｃ３を認識せず、新規な抗原を認識するモノクローナル抗体を、抗Ｃ３ｂ抗体、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｃ抗体および抗Ｃ３ｄ抗体、ならびにＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を認識せず、「重合性のＣ９」またはＣ５ｂ−９複合体の他の新規エピトープを認識するモノクローナル抗体からなる群から選択し得る。
本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントは、眼組織における新規な抗原を、画像システムを使用して検出し得る。画像化試薬により標識された新規な抗体を、前記眼に注入もしくは投与し、または任意の投与経路から投与し得る。ついで、前記新規な抗体は、補体が活性化される組織内に生じる、補体タンパク質上の新規な抗原エピトープに結合し得る。前記眼組織において、前記活性化された補体タンパク質（新規な抗原）は、病変の指標となる。このため、組織における新規なエピトープの識別は、病変部位の識別に言い換え得る。眼組織（例えば、ＲＰＥ、脈絡膜）について、高度な画像技術を使用して、新規な抗体の結合を検査し得る。
古典補体経路（ＣＰ）活性化の結果として生じる新規な抗原と、代替補体経路（ＡＰ）活性化の結果として生じる新規な抗原とを、区別可能である。古典補体経路が活性化される場合、ＣＰ活性化に特異的に生じる新規な抗原を識別することができる。代替経路が活性化される場合、ＡＰ活性化に特異的に生じる新規な抗原を識別することができる。
巨大タンパク質を標的とする、多くの異なる抗体を作製することができる。新規な抗体またはそのフラグメントを、新規なエピトープに基づくスクリーニングにより選択する。例えば、抗Ｃ３ｂ抗体、抗ｉＣ３ｂ抗体、抗Ｃ３ｃ抗体および抗Ｃ３ｄ抗体は、新規なエピトープのみを認識し検出すべきであり、親分子Ｃ３を認識し検出すべきでない。モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を、新規なエピトープに基づくスクリーニングに使用し得る。新規な抗原は、ａ）親分子には存在せず、ｂ）新たに生じた娘分子にのみ存在する、新規なエピトープを含む。新規な抗原としては、例えば、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇが挙げられる。これらの分子は前記Ｃ３分子に由来するが、個々のタンパク質フラグメントに特異的な、新規なエピトープを有する。
（ａ）Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ；（ｂ）Ｂａ、Ｂｂ；（ｃ）Ｃ５ｂ、Ｃ５ａ；（ｄ）Ｃ５ｂ−９および（ｅ）Ｃ４ｂ等の、種々の黄斑変性に関連する新規な抗原は、これらに対する新規な抗体またはそのフラグメントにより、前記抗原の親分子と区別され得る。前述の各分子に特異的な、それぞれの新規な抗体またはそのフラグメントにより、これらの分子を検出し得る。本願明細書に記載の新規な抗体は、Ｃ３、Ｂ因子、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を検出しないであろう。
例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄｇは、Ｃ３の切断産物である。このため、抗Ｃ３モノクローナル抗体および抗Ｃ３ポリクローナル抗体は、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄｇに交差反応する場合がある。前述の新規な抗体またはそのフラグメントは、それぞれ、Ｃ３には交差反応せず、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄｇにのみ結合する。Ｃ３フラグメントが生じると、新規なエピトープと呼ばれる、前記フラグメント内の新規なモチーフが露出する。このようなエピトープは、新規な抗体によってのみ検出され得る。
Ｃ５ｂ−９において、前記複合体は、Ｃ５の切断産物と、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８および多数の単量体のＣ９等のタンパク質とからなる。したがって、抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体、抗Ｃ８抗体は、前記Ｃ５ｂ−９複合体を検出するであろう。これらの抗体は、遊離タンパク質をも検出し得るため、遊離タンパク質の存在と前記Ｃ５ｂ−９複合体の一部であるタンパク質の存在とを区別し得ないであろう。本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントは、前記複合体内の新規なエピトープを認識する、新規な抗体またはそのフラグメントのみを含む、すなわち、抗Ｃ５ｂ抗体、抗重合体Ｃ９抗体および抗Ｃ５ｂ−９抗体を含む。
抗Ｃ５ｂ抗体は、遊離のＣ５およびＣ５ｂの両方を認識し得る。本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントは、Ｃ５ｂを認識し得るが、Ｃ５を認識し得ない。抗重合体Ｃ９抗体は、Ｃ５ｂ−９を認識し得るが、遊離のＣ９を認識し得ない。抗Ｃ５ｂ−９抗体は、ＭＡＣを認識し得るが、個々の構成タンパク質を認識し得ない。
本願の一部の実施形態は、補体の新規な抗原の存在を検出することにより、黄斑変性関連疾患の進展の傾向を診断または判定する方法を含む。これらの方法により診断され得る適応症としては、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底変性症、シュタルガルト病、模様ジストロフィー、ベスト病、家族性ドルーセンおよびマラッティア・レベンティネース（ｍａｌａｔｔｈｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）が挙げられる。これらの方法により診断され得る、他の眼の病変としては、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体の変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィーおよび錐体変性が挙げられる。
本願明細書に記載の前記方法を、黄斑変性関連疾患の有無に関する、集団の大規模スクリーニングに使用し得る。前記方法は、診断、治療を受けている被験者についての、治療に対する反応のモニターにも使用し得る。複数の黄斑変性に関連する分子を対象とする、新規抗原の存在を検出する方法を、黄斑変性関連疾患またはドルーセン関連疾患と関連がある、他の表現型マーカーまたは遺伝子型マーカーを検出する方法と組み合わせて実行し得る。
他の実施形態において、本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントを、標識試薬、造影剤、画像化試薬により標識し得る。タンパク質を標識するのに化学物質を使用するのは、周知である。これらの標識された新規な抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのアッセイに使用し得る。同様の性質を使用して、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’および一本鎖の新規な抗体に、化学物質を部位特異的に結合し得る。Ｆａｂ’を使用してバイオコンジュゲートを産生することは、公知である。このようなバイオコンジュゲートを使用して、組織および／または体液中の新規な抗体の標的を検出し得る。これらのバイオコンジュゲートをヒトの身体に投与して、画像法により可視化し得る。新規な抗体またはそのフラグメントを、化学物質にも結合し得る。化学物質としては、種々の撮像法を使用して検出し得る、放射性同位体または画像化蛍光色素分子が挙げられる。
一部の実施例において、前記標識は、テクネチウム−９９ｍを含み得る。テクネチウム−９９ｍは、過テクネチウム酸ナトリウムとして一般的に入手できる。過テクネチウム酸を、塩化第一スズ等の還元剤に接触させ得る。これにより、タンパク質、キレート剤、または放射性標識された同様の物質の存在下において、テクネチウムを＋３、＋４または＋５の酸化状態に還元する。テクネチウムをこの還元状態に維持することで、テクネチウム分子と放射性標識された新規な抗体との間の化学結合を維持し得る。還元されたテクネチウムが、アッセイ中に、患者の血液または、利用可能な放射性標識された物質を含む他の媒体に存在する他の分子または他のタンパク質に移動しないように、テクネチウムを、新規な抗体に強固に結合し得る。複数の他の方法が、テクネチウム−９９ｍにより放射性標識されたモノクローナル抗体について記載されている。
一部の実施形態において、新規な抗体またはそのフラグメントを使用した補体媒介性の病変の検出は、ドライ型およびウエット型のＡＭＤの両方における、疾病の進展の部位および度合いの正確な描写を提供し得る。本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントを使用して、治療した個体における疾病の進展または退行の度合いも測定し得る。本願明細書に記載の新規な抗体またはそのフラグメントは、ＡＭＤの発病および進展も検出し得る。新規な抗体またはそのフラグメントを、眼に適した剤形で使用し得る。
例として、眼底検査画像により、個体における疾病の進展が速いものと遅いものとを区別し得る。具体的には、病的な状態の傷害部位と傷害の萎縮性斑点とを、容易に識別し得る。一方の眼に脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、もう一方の眼にソフトドルーセンを含む高齢女性の状況が、明確な例示となろう。本願明細書に記載の診断方法は、新規な抗体の沈着レベルに基づいて、ＣＮＶの眼とドルーセンの眼との疾病の進展の相対的な度合いを、区別し得る。画像化によって新規な抗体の相対的なレベルを比較することにより、臨床医は、ドルーセンのみを含む眼がＣＮＶに進展するのかを、判断し得る。本願明細書に記載の前記方法は、疾病の進展を示す情報と、病的な状態のドルーセン沈着がＣＮＶに変化する可能性とを明らかにし得る。
ブルーフ膜の破裂は、ドライ型の非滲出性ＡＭＤからウエット型の滲出性ＡＭＤへの変化を判定する、重要な病理学的なマーカーである。ブルーフ膜の破裂は、網膜および脈絡膜における体液または出血性滲出液の臨床所見に関連する。したがって、本願明細書に記載の前記方法は、新規な抗体の高レベルな沈着を示す膜領域を検出することにより、ブルーフ膜の破裂部位を識別し得る。新規な抗体またはそのフラグメントを使用する画像化研究による情報は、外科的または薬理的な臨床的介入が必要かどうかの見識を与え得る。
実施例１：新規な抗ｉＣ３ｂ抗体はｉＣ３ｂに結合し、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄに結合しない
新規な抗ｉＣ３ｂ抗体は、抗原ｉＣ３ｂ上の新規なエピトープに結合する。この抗体は、Ｃ３ｃまたはＣ３ｄには結合しなかった。前記Ｃ３分子は、活性化によりＣ３ｂとＣ３ａとに変換される。Ｃ３ｂは、Ｉ因子により不活性化されて、ｉＣ３ｂを生じる。新規な抗ｉＣ３ｂ抗体は、前記ｉＣ３ｂ分子上の新規なエピトープを認識した。この新規な抗体がＣ３ｃに結合しなかったことは、Ｃ３ｂ分子のα鎖およびβ鎖が、前記新規なエピトープを有していないことを、示唆している。抗ｉＣ３ｂ抗体がＣ３ｃおよびＣ３ｄに交差反応しないことは、前記Ｃ３ｃおよびＣ３ｄが生じる際、抗体が認識するエピトープが失われることを、示唆している。新規な抗ｉＣ３ｂ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても組織に対して同様の結合挙動を示すと期待される。
ヒトの因子であるｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄおよびＣ３ｃ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）により、ＰＢＳ中にそれぞれ（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、新規な抗ｉＣ３ｂ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
タンパク質に結合した新規な抗ｉＣ３ｂ抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。基板に結合した各種タンパク質に結合する新規な抗ｉＣ３ｂ抗体のＫｄを、最大結合の５０％における新規な抗ｉＣ３ｂ抗体の濃度に基づいて推定した（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）。
新規な抗ｉＣ３ｂ抗体は、２６２ｐＭの親和性でｉＣ３ｂに結合したが、Ｃ３ｄおよびＣ３ｃには結合しなかった。したがって、新規な抗ｉＣ３ｂ抗体は、特異性が高い。最大半量の結合に達するのに必要な、新規な抗ｉＣ３ｂ抗体の濃度として定義される、これらのデータからの見かけの結合定数は、およそ２００〜３００ｐＭである。図１にデータを示す。
実施例２：新規な抗Ｃ３ｄ抗体はＣ３ｄに結合し、Ｃ３ｃに結合しない
新規な抗Ｃ３ｄ抗体は、Ｃ３ｂ分子のα鎖およびβ鎖を含むＣ３ｃ分子には結合しなかった。Ｃ３ｂの切断により、Ｃ３ｃとＣ３ｄとが生じる。前記Ｃ３ｄ分子は、前記Ｃ３ｂ分子から放出され、Ｃ３ｃを生じる。新規な抗Ｃ３ｄ抗体は、前記Ｃ３ｄ分子に特異的に結合するが、Ｃ３ｃには結合しない。
ヒトのＣ３ｄおよびＣ３ｃ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中にそれぞれ（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、新規な抗Ｃ３ｄ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
タンパク質に結合した新規な抗Ｃ３ｄ抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。２５℃で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。基板に結合した各種タンパク質に結合する新規な抗Ｃ３ｄ抗体のＫｄを、最大結合の５０％における新規な抗Ｃ３ｄ抗体の濃度に基づいて推定した（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ）。
新規な抗Ｃ３ｄ抗体は、４４７ｐＭの親和性でＣ３ｄに結合したが、Ｃ３ｃには結合しなかった。したがって、新規な抗Ｃ３ｄ抗体は、特異性が高い。最大半量の結合に達するのに必要な、新規な抗Ｃ３ｄ抗体の濃度として定義される、これらのデータからの見かけの結合定数は、およそ３５０〜５５０ｐＭである。図２にデータを示す。
実施例３：抗Ｂｂ抗体と新規な抗Ｂｂ抗体とでは、Ｂ因子への結合に差異がある
新規な抗Ｂｂ抗体は、Ｂ因子には結合しないが、非新規の抗Ｂｂ抗体は、Ｂ因子に結合する。Ｂｂは、代替経路に特有のタンパク質であり、前記新規な抗Ｂｂ抗体により検出され得る。
ヒトのＢ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、新規な抗Ｂｂ抗体および非新規の抗Ｂｂ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、Ｂ因子が被覆されたウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
Ｂ因子に結合した新規な抗Ｂｂ抗体および非新規の抗Ｂｂ抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。
新規な抗Ｂｂ抗体が、Ｂ因子が被覆された基板に結合しないことは、新規なエピトープが、Ｂ因子上に生じていないことを示唆している。最大半量の結合に達するための、非新規の抗Ｂｂ抗体の濃度として定義される、これらのデータからの見かけの結合定数は、およそ２１２ｐＭである。図３にデータを示す。新規な抗Ｂｂ抗体は、Ｂｂ上の新規なエピトープのみに特異的であるのが明らかである。
実施例４：新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体は、重合体のＣ９およびＳＣ５ｂ−９のみに結合する
新規な抗Ｃ５ｂ−９抗体は、１．１２ｎＭの親和性で、基板に結合したＣ９を認識する。基板に結合したＣ９の機能は、ＳＣ５ｂ−９複合体における重合体のＣ９と同様である。重合体のＣ９は、補体経路の活性化により生じる新規なエピトープを含む。前記新規な抗体は、ＳＣ５ｂ−９複合体における重合体のＣ９により生じるエピトープに結合する。新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体は、１．１２ｎＭの親和性で、基板に結合した（重合体の）Ｃ９に結合する。これと比較して、ＳＣ５ｂ−９に対するこの抗体の結合親和性は、５８５ｐＭである。この新規な抗体は、基板に結合したＣ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８のタンパク質に結合しなかった。
ヒトのＣ９またはＳＣ５ｂ−９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
タンパク質に結合した新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体は、Ｃ９およびＳＣ５ｂ−９の両方に高い親和性で結合した。前記親和性を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎを使用して算出した。
新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体は、５８５ｐＭの親和性でＳＣ５ｂ−９に結合し、１１２０ｐＭの親和性で重合体のＣ９に結合した。最大半量の結合に達するための、新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体の濃度として定義される、これらのデータからの見かけの結合定数は、親和性が高い。図４にデータを示す。
実施例５：各タンパク質に対する抗Ｃ５抗体、抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体、抗Ｃ８抗体および抗Ｃ９抗体の結合
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９のタンパク質が、実施例４におけるＥＬＩＳＡプレートに結合することを確認するために、これらのタンパク質を、各抗体を使用して検出した。抗Ｃ５抗体、抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体、抗Ｃ８抗体および抗Ｃ９抗体は、前記基板に結合したタンパク質に結合可能であった。図５に示すように、前記抗体は、同様の親和性で、各抗原に結合した。図５に単一濃度のプロットを示す。
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（１．０μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした各抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
抗原に結合した抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。飽和結合曲線を生成し、飽和に近い単一の濃度を、全ての抗体についてプロットし、比較した。図５にデータを示す。
図５に示すように、抗Ｃ５抗体、抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体、抗Ｃ８抗体および抗Ｃ９抗体の全ての抗体が、完全に活性を有し、各抗原に良好に結合することが説明される。
実施例６：基板に結合したＣ５およびＳＣ５ｂ−９に対する抗Ｃ５抗体の結合
図６に示すように、抗Ｃ５抗体がＣ５に結合するが、ＳＣ５ｂ−９複合体におけるＣ５ｂを検出しないことは、抗Ｃ５抗体はＣ５ｂ−９により引き起こされる組織損傷を検出し得ないことを、示唆している。本発明では、ＳＣ５ｂ−９またはＣ５ｂ−９上の新規なエピトープを認識する新規な抗体を選択する。
Ｃ５およびＳＣ５ｂ−９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、抗Ｃ５抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
Ｃ５およびＳＣ５ｂ−９に結合した抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。飽和結合曲線を生成し、飽和に近い単一の濃度を、全ての抗体についてプロットし、比較した。
図６に示すように、抗Ｃ５抗体は、基板に結合したＣ５を認識するが、ＳＣ５ｂ−９を認識しない。したがって、抗Ｃ５抗体は、補体媒介性の組織損傷を検出し得ない。
実施例７：基板に結合したＣ６およびＳＣ５ｂ−９に対する抗Ｃ６抗体の結合
図７に示すように、抗Ｃ６抗体がＣ６およびＳＣ５ｂ−９複合体に、およそ２００ｐＭの同様の親和性で結合することは、抗Ｃ６抗体がＣ６およびＳＣ５ｂ−９の両方を検出し、ＳＣ５ｂ−９と遊離のＣ６とを区別しないであろうことを、示唆している。
Ｃ６およびＳＣ５ｂ−９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、抗Ｃ６抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
Ｃ６およびＳＣ５ｂ−９に結合した抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。飽和結合曲線を生成し、飽和に近い単一の濃度を、全ての抗体についてプロットし、比較した。
図７に示すように、抗Ｃ６抗体は、基板に結合したＣ６およびＳＣ５ｂ−９の両方を認識する。したがって、抗Ｃ６抗体は、組織損傷を特異的には検出し得ない。
実施例８：基板に結合したＣ７およびＳＣ５ｂ−９に対する抗Ｃ７抗体の結合
図８に示すように、抗Ｃ７抗体がＣ７およびＳＣ５ｂ−９複合体に、２００〜４００ｐＭの範囲で結合することは、抗Ｃ７抗体がＣ７およびＳＣ５ｂ−９の両方を検出し、ＳＣ５ｂ−９と遊離のＣ７とを区別しないであろうことを、示唆している。
Ｃ７およびＳＣ５ｂ−９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、抗Ｃ７抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
Ｃ７およびＳＣ５ｂ−９に結合した抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。飽和結合曲線を生成し、飽和に近い単一の濃度を、全ての抗体についてプロットし、比較した。
図８に示すように、抗Ｃ７抗体は、基板に結合したＣ７およびＳＣ５ｂ−９の両方を認識する。したがって、抗Ｃ７抗体は、組織損傷を特異的には検出し得ない。
実施例９：基板に結合したＣ８およびＳＣ５ｂ−９に対する抗Ｃ８抗体の結合
図９に示すように、抗Ｃ８抗体がＣ８およびＳＣ５ｂ−９複合体に、６００〜１０００ｐＭの範囲の親和性で結合することは、抗Ｃ８抗体がＣ８およびＳＣ５ｂ−９の両方を検出し、ＳＣ５ｂ−９と遊離のＣ８とを区別しないであろうことを、示唆している。
Ｃ８およびＳＣ５ｂ−９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、抗Ｃ８抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
Ｃ８およびＳＣ５ｂ−９に結合した抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。飽和結合曲線を生成し、飽和に近い単一の濃度を、全ての抗体についてプロットし、比較した。
図９に示すように、抗Ｃ８抗体は、基板に結合したＣ８およびＳＣ５ｂ−９の両方を認識する。したがって、抗Ｃ８抗体は、組織損傷を特異的には検出し得ない。
実施例１０：基板に結合したＣ９およびＳＣ５ｂ−９に対する抗Ｃ９抗体の結合
図１０に示すように、抗Ｃ９抗体がＣ９に結合し、ＳＣ５ｂ−９複合体に結合しないことは、抗Ｃ９抗体がＳＣ５ｂ−９を認識しないために、組織損傷を検出しないであろうことを、示唆している。
Ｃ９およびＳＣ５ｂ−９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（１μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、抗Ｃ９抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
Ｃ９およびＳＣ５ｂ−９に結合した抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。飽和結合曲線を生成し、飽和に近い単一の濃度を、全ての抗体についてプロットし、比較した。
図１０に示すように、抗Ｃ９抗体は、基板に結合したＣ９を認識するが、ＳＣ５ｂ−９を認識しない。したがって、抗Ｃ９抗体は、ＳＣ５ｂ−９により引き起こされる組織損傷を検出し得ない。
実施例１１：新規な抗重合体Ｃ９抗体は、重合体のＣ９およびＳＣ５ｂ−９に結合する
新規な抗重合体Ｃ９抗体は、基板に結合したＣ９を、１．１２ｎＭの親和性で認識する。基板に結合したＣ９は、重合体のＣ９と同様の特性を示し得る。重合体のＣ９を人工的に作り出しているため、Ｃ９は、単量体を含む重合体として存在する場合がある。前記基板に結合したＣ９は、重合体のＣ９と共通点があり得る。重合体のＣ９は、活性化により生じる新規なエピトープを含む。前記新規な抗重合体Ｃ９抗体は、重合体のＣ９および前記ＳＣ５ｂ−９複合体における重合体のＣ９に結合する。前記新規な抗重合体Ｃ９抗体は、１．１２ｎＭの親和性で、基板に結合した（重合体の）Ｃ９に結合する。これと比較して、ＳＣ５ｂ−９に対するこの抗体の結合親和性は、５８５ｎＭである。この抗体には、基板に結合したＣ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８のタンパク質への結合が見られなかった。
ヒトのＣ９またはＳＣ５ｂ−９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。ブロッキング液中で種々の濃度にした、新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の一定分量を、前記ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。
基板に被覆したＣ５ｂ−９およびＣ９に結合した新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体は、Ｃ９およびＳＣ５ｂ−９の両方に高い親和性で結合した。前記親和性を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎを使用して算出した。
新規な抗重合体Ｃ９抗体は、５８５ｐＭの親和性でＳＣ５ｂ−９に結合し、１１２０ｐＭの親和性で重合体のＣ９に結合する。最大半量の結合に達するための、新規な抗重合体Ｃ９抗体の濃度として定義される、これらのデータからの見かけの結合定数は、親和性が高い。図１１にデータを示す。
実施例１２：正常なヒト血清の存在下で、抗重合体Ｃ９抗体は、基板に結合したＳＣ５ｂ−９を検出する
図１〜１１の結果は、新規な抗体が、重合体のＣ９の発生により生じる組織損傷を検出することを説明している。例えば、新規な抗ｉＣ３ｂ抗体、新規な抗Ｃ３ｄ抗体、新規な抗Ｂｂ抗体および新規な抗重合体Ｃ９抗体は、補体活性化の種々の工程において、ＡＰ活性化を検出する。新規な抗重合体Ｃ９抗体は、ＡＰ活性化の最終工程を検出する。Ｃ５ｂ−９複合体が細胞溶解に重要であるため、重合体のＣ９が存在することは、組織損傷を示す。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、新規な抗重合体Ｃ９抗体が重合体のＣ９に特異的に結合するのを確認するために、競合アッセイを行った。このアッセイでは、過剰量の正常なヒト血清を使用して、新規な抗重合体Ｃ９抗体への結合について、基板に結合したＳＣ５ｂ−９と競合させた。正常なヒト血清は、新規な抗重合体Ｃ９抗体の基板に結合したＳＣ５ｂ−９に対する結合を、生理的な血清濃度の５０％の高さまで阻害しなかった。したがって、新規な抗重合体Ｃ９抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｃ５ｂ−９に対して特異的であり、血清に存在する遊離の補体タンパク質には結合しない。血清中に存在するＣ９量は、通常、６０μｇ／ｍｌである。今回の研究で使用した最も高い濃度の血清は、５０％であり、Ｃ９は３０μｇ／ｍｌに換算される。ｎＭの条件において、それぞれに希釈して使用した血清中のＣ９の濃度は、４２２ｎＭ、２５３ｎＭ、１２６ｎＭ、４２ｎＭ、２５ｎＭ、１２ｎＭ、４．２ｎＭ、２．５ｎＭ、１．３ｎＭ、０．４２ｎＭおよび０ｎＭである。
新規な抗重合体Ｃ９抗体は、新規な抗原であるＳＣ５ｂ−９を検出するが、抗単量体Ｃ９抗体は、ＳＣ５ｂ−９を検出しない。このことは、前記抗重合体Ｃ９抗体が、基板に結合したＳＣ５ｂ−９を特異的に検出することを、示唆している。この抗重合体Ｃ９抗体は、遊離のＣ９または単量体のＣ９を認識しないため、Ｃ５ｂ−９により生じる新規なエピトープを特異的な標的とする。抗単量体Ｃ９抗体は、遊離のＣ９にのみに結合し、ＳＣ５ｂ−９を認識しない。
このモデルにおいて、Ｃ５ｂ−９複合体を含む組織を示すＳＣ５ｂ−９により、ＥＬＩＳＡのウェルを被覆する。ついで、種々の濃度の正常なヒト血清と、固定濃度の新規な抗重合体Ｃ９抗体とにより、この被覆されたプレートをインキュベートする。前記新規な抗体は、ＳＣ５ｂ−９に結合するであろう。したがって、前記新規な抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｃ５ｂ−９に特異的であろう。
この実験において、ＳＣ５ｂ−９またはＣ９（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、ＰＢＳ中に（０．５μｇ／５０μｌ／ウェル）として、４℃にて一晩、ポリスチレンマイクロタイタープレートを被覆した。前記タンパク質溶液を吸引した後、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにより、１時間、室温で、ウェルをブロッキングした。タンパク質で被覆していないウェルを同様にブロッキングし、バックグランド対照とした。固定濃度の新規な抗ＳＣ５ｂ−９抗体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、種々の濃度の正常なヒト血清と、ブロッキング液中で混合した。室温で１時間インキュベートした後、前記ウェルをＰＢＳで洗浄した。ＳＣ５ｂ−９に結合した新規な抗重合体Ｃ９抗体を、１：２０００で希釈した、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、前記プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌの１Ｍリン酸を添加して、ＴＭＢ反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍにおいて前記プレートを読み取った。血清またはそれ以外に存在する遊離のＣ９は、Ｃ５ｂ−９複合体に結合する新規な抗重合体Ｃ９抗体の特異的な結合性に、影響を与えなかったであろう。
図１２に示すように、ＳＣ５ｂ−９に対する新規な抗重合体Ｃ９抗体の結合は、正常なヒト血清により阻害されなかった。このことは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、新規な抗重合体Ｃ９抗体を使用して、組織損傷を検出し得ることを、示唆している。
実施例１３：新規な抗重合体Ｃ９抗体は、正常なヒト血清由来の、沈着したＣ５ｂ−９を検出する
新規な抗重合体抗体が、正常なヒト血清から生じる、沈着したＣ５ｂ−９に結合するかを判定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用した。このアッセイにおいて、リポ多糖（ＬＰＳ）で被覆したウェルを、バッファー中に５０％、３０％、２０％、１０％、８％、６％、４％および０％とした正常なヒト血清でインキュベートし、代替経路（ＡＰ）を活性化させた。ＬＰＳは、代替経路を活性化することで知られている。結果として、ＬＰＳの表面にＣ５ｂ−９が生じる。抗Ｃ５抗体、抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体、抗Ｃ８抗体および抗Ｃ９抗体ならびに新規な抗重合体Ｃ９抗体を使用して、新たに沈着したＣ５ｂ−９を検出した。抗Ｃ６抗体、抗Ｃ７抗体および抗Ｃ８抗体は、沈着したＣ５ｂ−９を検出可能であった。さらに、新規な抗重合体Ｃ９抗体は沈着したＣ５ｂ−９を検出したが、抗単量体Ｃ９抗体は沈着したＣ５ｂ−９を検出しなかった。新規な抗重合体Ｃ９抗体が高い親和性でＣ５ｂ−９に結合したことは、この抗体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じるＣ５ｂ−９を検出するのに、効果的であろうことを示した。
図１３に示すように、新規な抗重合体Ｃ９抗体は、正常なヒト血清の存在下であっても、特異的にＣ５ｂ−９を検出した。
実施例１４：新規な抗重合体Ｃ９抗体は、病的な状態のドルーセンにおける、沈着したＣ５ｂ−９を検出する
ＩＲＢの承認のもと、アイ・バンクを通じて、ＡＭＤ患者から眼球を取得した。パラフィンブロックを調製し、黄斑が表示されるように、切片を切り出した。新規な抗重合体Ｃ９抗体を使用して、前記切片を染色した。図１４に示すように、ＡＭＤ患者由来の組織において、新規な抗重合体Ｃ９抗体は、重合体のＣ９の沈着によるドルーセンを検出した。したがって、正常と分類される個体には、ＡＭＤのリスクがある場合がある。
本発明は、参照としてその好ましい実施形態を具体的に示し、記載しているが、添付のクレームに含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細において、さまざまに変更し得ることが、当業者により理解されるであろう。先の明細書において引用した、全ての特許、公報および参考文献を、参照としてその全体が本願明細書に取り込まれる。本発明を説明してきたが、以下の対象が特許請求される。

Claims (9)

  1. 被験者の組織上に沈着した新規なエピトープを有する補体タンパク質またはフラグメントの新規なエピトープに結合する新規な抗体またはそのフラグメントの試料を被験者の組織に対して投与することと、
    前記被験者の組織上に沈着した前記新規なエピトープを有する補体タンパク質またはフラグメントの新規なエピトープに結合した新規な抗体の量を検出することと、
    前記被験者の組織上に沈着した前記新規なエピトープを有する補体タンパク質またはフラグメントに結合した新規な抗体の量が、沈着した補体活性化産物の指標であり、組織傷害を有さない被験者の対照群における基準値レベルと比較して組織傷害を有する被験者において著しく増加していることとを含む被験者における組織傷害の進展の診断に用いられる、新規なエピトープを有する補体タンパク質またはフラグメントの新規なエピトープに結合する新規な抗体またはそのフラグメントであって、前記新規な抗体またはそのフラグメントが新規な抗Ｃ５ｂ−９抗体であり、かつ前記新規な抗Ｃ５ｂ−９抗体が、重合体のＣ９に結合できるが、単量体のＣ９に結合できない、新規な抗体またはそのフラグメント。
  2. 前記組織傷害が、組織に対する疾病の結果である、請求項１記載の新規な抗体またはそのフラグメント。
  3. 前記組織傷害が、眼疾患の結果である、請求項１記載の新規な抗体またはそのフラグメント。
  4. 前記眼疾患が、黄斑変性関連疾患である、請求項３記載の新規な抗体またはそのフラグメント。
  5. 前記眼疾患が、加齢黄斑変性である、請求項４記載の新規な抗体またはそのフラグメント。
  6. 前記新規な抗体またはそのフラグメントが、標識試薬、造影剤、又は画像化試薬で標識されており、前記組織に投与された前記標識された新規な抗体またはそのフラグメントを定量するために前記標識試薬、造影剤、又は画像化試薬による前記標識が検出される、請求項１に記載の新規な抗体またはそのフラグメント。
  7. 前記標識が、放射性又は非放射性のトレース、 ９９ｍ Ｔｃ、免疫陽電子放出トモグラフィー、及び二光子画像化剤よりなる群から選択され得る標識である、請求項６に記載の新規な抗体またはそのフラグメント。
  8. 被験者の組織上に沈着した新規なエピトープを有する補体タンパク質またはフラグメントの新規なエピトープに結合する新規な抗体またはそのフラグメントの試料を被験者の組織に対して投与を行い、
    前記被験者の組織上に沈着した前記新規なエピトープを有する補体タンパク質またはフラグメントの新規なエピトープに結合した新規な抗体の量の検出であって、
    前記被験者の組織上に沈着した前記新規なエピトープを有する補体タンパク質またはフラグメントに結合した新規な抗体の量が、沈着した補体活性化産物の指標であり、組織傷害を有さない被験者の対照群における基準値レベルと比較して組織傷害を有する被験者において著しく増加していることの検出を行うための、被験者における組織傷害の進展を診断するキットであって、
    前記組織に投与された標識された新規な抗体またはそのフラグメントを定量するために検出される、標識試薬、造影剤、又は画像化試薬で標識された新規な抗体またはそのフラグメントの試料を含み、
    前記新規な抗体またはそのフラグメントが新規な抗Ｃ５ｂ−９抗体であり、かつ前記新規な抗Ｃ５ｂ−９抗体が、重合体のＣ９に結合できるが、単量体のＣ９に結合できない、被験者における組織傷害の進展を診断するキット。
  9. 前記標識が、放射性又は非放射性のトレース、９９ｍＴｃ、免疫陽電子放出トモグラフィー、及び二光子画像化剤よりなる群から選択され得る標識である、請求項８に記載のキット。
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