JP2024511019A - メラノサイト増殖促進剤および生存促進因子としての特異的炎症収束性メディエーター（ｓｐｍ）およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、メラノサイト増殖促進剤及び生存促進因子として使用するための、特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）の使用を提供する。より詳細には、ＳＰＭ組成物は、メラノサイトの色素脱失を防止するためにメラノサイトの増殖及び／又は生存を促進すること、及び／又はメラノサイトの非炎症性色素脱失において再色素化を促進することに適する。さらに、本組成物は、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、炎症療法に非反応の白斑症、又は白髪症を治療するために使用できる。
【選択図】図８

Description

関連出願の相互参照

本出願は、「メラノサイトの増殖促進および生存促進因子としての天然化合物の新規利用（novel uses of a natural compound as a growth promoter and pro-survival factor of melanocytes）」とのタイトルにおいて２０２１年３月１９日に出願された、米国仮特許出願第６３／１６３，２４１号の利益を主張するものである。
発明の分野
本発明は、メラノサイト増殖促進剤及び生存促進因子として用いるための、特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）の使用に関する。メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進することは、メラノサイトの色素脱失を防止し、及び／又はメラノサイトの非炎症性色素脱失における再色素化を促進し得る。さらに、本組成物は、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、炎症療法に非反応の白斑症、または白髪症を治療するために使用できる。

胚発生後の皮膚や毛髪の生理的なメラニン色素沈着は、毛包のバルジ領域に存在するメラノサイト幹細胞（ＭｃＳＣ）から分化・移動してきたメラノサイトによって維持されている。毛髪や皮膚の適切な色素沈着と生理学的分布は、紫外線の有害な影響からの保護だけでなく、個人の心理社会的幸福にとっても重要となる。メラニンの産生は、メラノサイトの枯渇のために失われる場合があり、こういった現象は、白斑症や白髪症を含む多くの疾患で起こる。

世界人口の０．５％～２％が罹患している白斑症^（１）では、皮膚又は毛髪、あるいはその両方に、非常に目立つ白い斑点が生じ、罹患者の外見を著しく損ない、生活の質を著しく低下させ得る^{（２－５）}。白斑症には複数の発症メカニズムが提唱されているが^{（６－１０）}、メラノサイト特異的自己免疫活性化が実験上では最も強く支持されている。具体的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞^{（１１－１３）}、ＮＫ細胞^（１４）などの免疫活性細胞傷害性細胞が皮膚病変において発見されている。再色素化は、狭帯域紫外線Ｂ光線療法（ＮＢＵＶＢ）、カルシニューリン阻害剤の外用、ステロイドの外用又は全身投与などの免疫抑制治療によって起こり得る^{（１５－２２）（２３）}。ＪＡＫ阻害剤^（２４）やＩＬ１５阻害剤^（２５）など、白斑症に対する新しい治療法や実験的治療法もまた、メラノサイトに対する免疫細胞傷害性の様々な側面を標的としている。これらの観察結果から、白斑症の発症における免疫介在性メラノサイト細胞傷害性の病原的役割は強く支持されている。

しかし、白斑症の臨床症状の多くの点は、自己免疫／自己炎症事象だけでは完全に説明できない。第一に、白斑症の皮膚病変の多くでは、Ｔｈ２介在性皮膚疾患である湿疹のような他の典型的な免疫介在性皮膚疾患とは異なり、紅斑、組織の硬化、体温上昇、鱗屑の発生といった急性免疫又は炎症反応の典型的な徴候が見られない。第二に、かなりの割合の患者、特にその手足に白斑がある患者では、最も強力な免疫抑制剤を用いても治療効果がほとんど見られない。また、たとえ免疫抑制治療の効果が見られた患者でも、再色素化は非常に遅く（しばしば３～６ヵ月かかる）、またほとんどが部分的である。対照的に、湿疹のような古典的な免疫介在性皮膚疾患においては、免疫抑制剤による治療効果はもっと迅速（多くの場合、数日又は数週間）かつ完全である。これらの結果は、メラノサイトの枯渇に寄与し白斑症皮膚病変でのメラノサイトの復活を妨げるさらなる要因が、皮膚微小環境に存在することを示唆している。しかし、その決定的な証拠は未だ得られていない。

白斑症における皮膚や毛髪の色素脱失がパッチ状に分布しているのとは対照的に、白髪症（加齢に伴う自然発生的な毛髪や皮膚の灰色化）の色素脱失はより広く拡散しており、色素脱失した毛髪は正常なメラニン色素を有する毛髪と混在し、分散している。高齢になると、ほとんどの人が白髪症を罹患する。通常、白髪症は主な身体症状を伴うことはないが、例えば特に若白髪（３０歳前に白髪が発生する）の場合などは、重大な心理社会的苦痛をもたらすこともある。白髪症においてメラノサイト枯渇が生じる正確なメカニズムは不明である。しかし最近、マウスモデルを用いて行われたＢｉｎｇ Ｚｈａｎｇらによる研究において、白髪症におけるメラノサイトの枯渇は、Ｔリンパ球やＢリンパ球が関与する免疫反応によるものではないことを示す確定的な結果が提示された。むしろ、加齢や交感神経系の過活性化^{（２６）（２７）}によって、免疫非依存的にメラノサイト幹細胞や前駆細胞が疲弊することによるものであることが示された。

白斑症と白髪症との関係は未だ議論の的となっている。新たな報告によると、この２つの疾患は病因的に関連している可能性がある。第一の研究として、Ｊ Ｓｍｉｔｈは、白斑症を罹患する子供が、典型的な白斑症のパッチ状分布とは異なる、早期拡散性白髪を発症したことを報告した^（２８）。第二の研究として、７１７人の白斑症患者を対象とした大規模な疫学的解析において、Ｋ Ｅｚｚｅｄｉｎｅらは、白斑症患者の３２．８％が若白髪であり、さらに思春期前に白斑症を発症した患者においては、その割合が４６％にもなることを示した^{（２９， ３０）}。さらに、思春期前に発症した白斑症は、白斑症には罹患していない家族における家族遺伝性の若白髪の増加と強く関連していた^（３０）。最後に、精神的ストレスが白髪症^{（２６）（２７）}と白斑症の両方の発症に強く関連していることも示されている。^{（２９， ３０） （３１）} しかしながら、白斑症と白髪症を結びつける統合的な発症機序は未だ明らかにされていない。

マクロファージは皮膚疾患の発症、特に炎症、創傷治癒、腫瘍形成において重要な役割を果たしている。Ｍ１マクロファージが炎症を促進する一方、交互に活性化されるＭ２マクロファージは、免疫反応や炎症反応の解消や組織の修復に関与する。さらに、メラノーマや皮膚Ｔ細胞リンパ腫などの悪性疾患では、Ｍ２様マクロファージが増加していることが、本発明者や他の研究者により発見されている^{（３２－３５）}。Ｍ２マクロファージは、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の酵素的修飾に由来する特異的炎症収束性メディエーター （ＳＰＭ）ファミリーの一つとしての機能的メディエーターであるマレシン１を分泌することによって機能する^{（３６， ３７）}。主にＭ２マクロファージから分泌される^{（３６， ３７）}マレシン１には、免疫消失の促進^{（３６， ３７）}、創傷治癒の促進^（３８）、マクロファージの分極のＭ２側へのシフト、神経因性疼痛の軽減^{（３６， ３９， ４０）}、炎症消失後の組織再生の促進^{（３６， ４１， ４２）}、外科的損傷後の褐色プラナリア線虫の頭部再生の促進^（３６）など、いくつかの重要な機能があることが示されている。

白斑のある皮膚ではマクロファージは増加するが^{（４３， ４４）}、白斑症と白髪症のいずれに関しても、マクロファージの分極化に関する研究は報告されていない。

本発明は、その一部が、本明細書に記載されている特異的炎症収束性メディエーター （ＳＰＭ）化合物がメラノサイト増殖促進剤および生存促進因子であるという発見に基づいている。また、発明者は、Ｍ２マクロファージやＭ２機能メディエーターであるマレシン１の欠乏が、白斑症や白髪症におけるメラノサイトの枯渇に寄与していることも見出した。さらに、発明者は、外因性ＳＰＭ化合物（例えばマレシン１）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでメラノサイトの生存を増加させることを見出した。また、本明細書では、マレシン１が白斑症及び白髪症のマウスモデルにおいてメラノサイトの枯渇を有意に減少させ、免疫非依存的な原因によるメラノサイトの枯渇からメラノサイトを保護することも偶発的に示された。本発明は、加齢に伴う白皮症及び白毛症の治療に適し得る化合物を提供する。本発明はまた、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、炎症療法に非反応の白斑症、又は白髪症の治療に好適であり得る化合物を提供する。

第一の態様では、メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象者に、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを投与することを含む。

更なる態様では、メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するための、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマー、又はその医薬組成物の使用を提供する。

更なる態様では、メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するための医薬の製造における、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマー、又はその医薬組成物の使用を提供する。

更なる態様では、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを有効成分として含む、白斑を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

更なる態様では、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを有効成分として含む、白斑症又は白髪症を予防又は治療するための化粧料組成物が提供される。

更なる態様では、（ａ）リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマー、及び（ｂ）メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するためのそれらの使用説明書を含む市販品パッケージが提供される。

更なる態様では、（ａ）リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを含む医薬組成物、及び（ｂ）メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するためのそれらの使用説明書を含む市販品パッケージが提供される。

更なる態様では、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを含むメラノサイト増殖培地が提供される。

ＳＰＭは、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、及びレゾルビンＥ１のうちの一つ又は複数から選択され得る。ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、マレシン１であってもよい。ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、マレシン２であってもよい。ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、リポキシンＢ４であってもよい。ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、プロテクチンＤ１であってもよい。ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、レゾルビンＤ２であってもよい。ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、レゾルビンＥ１であってもよい。ＳＰＭは、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、エピリポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、２２－ヒドロキシ－プロテクチンＤ１、プロテクチンＤＸ、１０－エピ－プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ１、レゾルビンＤ２、レゾルビンＤ３、レゾルビンＤ４、レゾルビンＤ５、レゾルビンＤ６、レゾルビンＥ１、レゾルビンＥ２、及びレゾルビンＥ３のうちの一つ又は複数から選択され得る。あるいは、ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、式１～１２のうちの一つ又は複数の中から選択され得る。メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進することは、メラノサイトの色素脱失を防止し、及び／又はメラノサイトの非炎症性色素脱失における再色素化を促進し得る。メラノサイトは、皮膚メラノサイト、毛髪メラノサイト、眼メラノサイト、耳メラノサイトのいずれかである。投与は、メラノサイトの非炎症性喪失を減少または逆転させるために行い得る。また、投与は、加齢に伴う白皮症及び白毛症の治療のために行い得る。メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進することは、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、炎症療法に非反応の白斑症、又は白髪症の治療となり得る。白斑症は、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、及び炎症療法に非反応の白斑症から選択され得る。

光線療法や免疫抑制療法との併用療法の一部としての投与も可能である。また、外科的メラノサイト移植療法との併用療法の一部としての投与も可能である。

医薬組成物は、経口投与、静脈内注射、皮下注射または腹腔内注射による全身投与用として製剤化することができる。また医薬組成物は局所投与用として製剤化してもよい。化粧料組成物は、ローション、クリーム、軟膏、懸濁液、スプレー、または粘着テープ上にコーティングされた製剤であってもよい。
図１Ａは、白斑症病変皮膚（ＬＳ、Ｎ＝３６）、非病変皮膚（ＮＬＳ、Ｎ＝３６）及び健常皮膚（ＨＮＳ、Ｎ＝９）から全層生検を採取してトータルＲＮＡ抽出に使用し、トランスクリプトームシークエンシングとそれに続くｘＣｅｌｌアルゴリズムを用いた細胞デコンボリューションを行い、各試料における６４の認識可能な細胞タイプのシグネチャーを、ＨＮＳの平均値に対する倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）として示した、健常皮膚に対する白斑症病変皮膚及び非病変皮膚の免疫細胞プロファイルを示す。 ＊ ｐ＜０．０５ （ｐ１： ＬＳ ｖｓ ＮＬＳ； ｐ２： ＬＳ ｖｓ ＨＮＳ；ｐ３： ＮＬＳ ｖｓ ＨＮＳ） 横破線は、ｘＣｅｌｌアルゴリズムによって定義された、メラノサイト、Ｍ２、及びその他のモノ・マクロファージを強調表示している。
図１Ｂは、白斑症ＬＳで濃縮された細胞のほとんどが、白斑症ＮＬＳでも濃縮されていることを示す。
図１Ｃは、白斑症ＬＳで枯渇した細胞が、白斑症ＮＬＳでは枯渇していないことを示す。
図２は、白斑症ＬＳと湿疹ＬＳの異なる細胞プロファイルのウォーターフォールプロットを示しており、健常皮膚（ＨＮＳ）に対する白斑症ＬＳ（左パネル）の倍率変化（ＦＣ）の降順に細胞がランク付けされ、ＦＣ値が示されている。右パネルは、ＨＮＳに対する、湿疹ＬＳにおけるこれらの細胞の濃縮または枯渇を示している（アスタリスクは、統計的に有意な変化を示す。ｐ＜０．０５）。
図３は、白斑症皮膚生検におけるＭ１（ＣＤ８０＋）及びＭ２（ＣＤ１６３＋）マクロファージを示す。（Ａ）には、白斑症患者の非病変皮膚（ＮＳ）及び病変皮膚（ＬＳ）から全層生検（５ ｍｍパンチ）を得て、細胞を単離し、１２時間インキュベーションした後、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８０ （Ｍ１マーカー）及びＣＤ１６３（Ｍ２マーカー）抗体で標識した細胞のセルソーターを用いた分析を示し、（Ｂ）では、代表的な白斑症患者のＬＳとＮＬＳにおけるＣＤ１１ｂ ＋ Ｍ１（Ｑ３）とＭ２（Ｑ１）である細胞のＦＡＣＳ分布を示し、（Ｃ）では、３人の白斑症患者のＮＬＳとＬＳにおけるＭ１とＭ２マクロファージの平均値を示す。
図４は、マレシン１による処置の有無における、Ｂ６白斑症マウスモデルの皮膚常在Ｍ２マクロファージを示す。ここで、Ｂ６マウスは、マレシン１（腹腔内注射（ＩＰ）により８００ ｎｇ／各マウス）、又は生理食塩水ＩＰで、３日間毎日３回前処置を行い、それに続く皮内注射（ＩＤ）によりＬＰＳおよびＣｐＧを含むアジュバント中のＴＲＰ２ペプチドで免疫した後、注射から４８時間経過後に安楽死させ、注射部位の皮膚を採取し、ＣＤ８０（Ｍ１マーカー）及びＣＤ１６３（Ｍ２マーカー）に対するモノクローナル抗体を用いて、ＣＤ１６３＋細胞／ＣＤ８０＋細胞に基づいて計算されたＭ２／Ｍ１比率で、細胞単離およびフローサイトメトリーを行った。
図５は、Ｂ６マウス白斑モデルにおけるメラノサイト枯渇に対するマレシン１の効果を示す。（Ａ）は、８週齢のＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスに、生理食塩水（Ｎ＝２０）またはマレシン１（８００ｎｇ／各マウス、Ｎ＝２０）のＩＰ注射を週３回、８週間投与し、各マウスに、１週目の終わりに左臀部への皮内注射（ＩＤ）によるＴＲＰ２免疫を行い、３週目の終わりにこれを繰り返し、マウスを観察し、免疫部位の色素脱失を評価するために毎週写真を撮った。（Ｂ）は、生理食塩水ＩＰまたはマレシンＩＰを受けたマウスの代表的な写真を示す。（Ｃ）は、毎週の評価で色素脱失の程度を測定するために色素脱失スコアテンプレートを使用し、生理食塩水ＩＰ又はマレシンＩＰ処置群の平均色素脱失スコアを（Ｄ）にプロットした。生理食塩水またはマレシン１処置群の免疫反応ピークスコア（０～６）を示す。（Ｅ）は、免疫後４８時間における紅斑（０－３）と浮腫（０－３）を組み合わせて測定した免疫反応ピークスコアを示す。（Ｆ）は、マレシン１処置によって達成された白斑症色素脱失の減少が、免疫スコアの減少の程度と強く相関していることを示す。（ｐ＜ ００００１、デミング回帰）。 ＊ ｐ＜ ０．０５（両側ｔ検定）。
図６は、Ｂ６白髪症マウスモデルにおけるメラノサイト枯渇に対するマレシン１の効果を示す。（Ａ）は、Ｂ６マウス（８週齢）を標準的な条件下で６週間飼育し、約４０％のマウスが白髪（白髪症）を発症したことを示す。（Ｂ）では、安楽死させた後静脈血を採取して血清調製に使用したマウスを示し、白髪症のあるマウスと白髪症のないマウスの血清中のマレシン１の濃度をＥＬＩＳＡを用いて測定した。（Ｃ）では、Ｂ６マウス（８週齢）を２群に分け（各群Ｎ＝２０）、一方の群ではさらに６週間、８００ ｎｇ ／各マウスで週３回マレシン１をＩＰ注射し、もう一方の群では通常の生理食塩水をＩＰ注射した。マウスは毎週目視とデジタル写真で観察した。（Ｄ）は体重測定を示し、（Ｅ）は各群で白髪症を発症したマウスの割合を経時的にプロットしたものを示し、（Ｆ）はＬｏｇ Ｒａｎｋ検定で測定した統計学的有意性を示す。
図７は、マレシン１が培養においてメラノサイトの生存を促進することを示す。（Ａ）では、ＡＴＣＣから入手した新生児包皮からの初代ヒト表皮メラノサイト（１Ｘ１０^６）を、完全メラノサイト増殖培地（ＭＧＭ）中で、０～３００ ｎｇ／ｍｌのマレシン１の存在下で３日間培養し、各ウェル中の細胞の総数をＣｌｅａｒ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（ＣＢＤ）アッセイを用いて推定し、結果を対照（０ ｎｇマレシン／ｍｌ）に対する％として表した。（Ｂ）では、増殖因子の補充を行わないこと以外は（Ａ）と同じ方法でアッセイを行ったが、マレシン１による処置を行わない場合はメラノサイトの枯渇を誘発し、マレシン１（１０～３００ ｎｇ ／ｍｌ）の存在下では、生存メラノサイトの有意な増加によって示されるように、メラノサイト枯渇の有意な減少が見られた。 （＊＊ ｐ＜ ０．０１）
図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養メラノサイトの枯渇に対する、様々な特異的炎症収束性メディエーターの効果を示しており、（Ａ）は完全メラノサイト増殖培地での初代表皮メラノサイトの増殖に対するＳＰＭ（０～３００ ｎｇ ／ｍｌ）の効果を示す。（Ｂ）はベースメラノサイト増殖培地で増殖因子の補充を行わない以外は、（Ａ）と同じである。 （＊ ｐ＜ ０．０５； ＊＊ ｐ＜ ０．０１ （ｔ検定、各濃度を無処置の対照（０ ｎｇ ／ｍｌ）と比較））
図９は、分節型白斑症と汎発型（非分節型）白斑症の間で有意な違いを示す白斑病変皮膚細胞を示す。
図１０は、最近発症した白斑症病変としばらく前に発症した白斑症病変との間で有意な違いを示す白斑症病変皮膚細胞を示す。
図１１は、白斑症ＬＳ、白斑症ＮＬＳ及びＨＮＳからの細胞を、ＲＮＡシークエンス解析からｘＣｅｌｌデコンボリューションを用いて解析した結果、ＮＬＳと比較して白斑症ＬＳにおいて枯渇または濃縮された細胞を示す。（Ａ）は、ＮＬＳと比較して白斑症ＬＳで枯渇した細胞を示し、一方（Ｂ）は、ＮＬＳと比較して白斑症ＬＳで濃縮された細胞を示す。 （＊ ｐ＜０．０５）
図１２は、Ｂ６マウスの、白髪症発生による精神的ストレスの影響を示す。Ｂ６マウスは、１ケージあたり４匹の密度で標準的な条件で飼育された。同腹仔は観察を通して変化しなかったが、約４０％のケージで、同じケージ内の他の同腹仔を噛んで毛を抜く行動（バーバリング）をとる同腹仔が存在した。この存在は検査時に斑点状の脱毛と噛み跡の目視で識別可能であった。バーバリング行動を行うマウスとケージを共有しているか否かによってマウスを層別化し、６週目までに白髪症を発症したマウスの割合を記録したところ、バーバリング行動を行うマウスとケージを共有しているマウスでは白髪症を発症したマウスの割合が有意に増加した。 （カイ二乗検定、 ｐ＜０．００７６）

発明の詳細な説明

以下の詳細な説明は、添付の図面を参照することで良好に理解される。本発明を説明するために、これらの図面に本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、図示されたそのままの配置、例、および手段に限定されるものではない。

本明細書において直接定義されていない用語は、本発明の技術分野における理解に則り、一般的に想起される意味を有するものと理解される。

本明細書に記載の化合物は、遊離状態又は塩の形態であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物は、薬学的に許容し得る塩の形態であってもよく、これは当技術分野では公知である （Ｂｅｒｇｅ Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． （１９７７） ６６（１）：１－１９）。（１９７７） ６６（１）：１－１９）．本明細書で使用される薬学的に許容し得る塩には、例えば、親化合物の所望される生物学的有効性を持つ薬学的に許容し得る塩（親化合物の所望の生物学的有効性及び／又は特性を保持し、生物学的及び／又は他の点で望ましくない塩ではないもの）が含まれる。塩を形成し得る一つ又は複数の官能基を有する本明細書に記載の化合物は、例えば、薬学的に許容し得る塩として形成され得る。一つ又は複数の塩基性官能基を有する化合物は、例えば、薬学的に許容し得る有機酸又は無機酸を用いて薬学的に許容し得る塩を形成してもよい。薬学的に許容し得る塩としては、例えば、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、酪酸、桂皮酸、クエン酸、カンフル酸、カンファースルホン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジエチル酢酸、ジグルコン酸、ドデシルスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプタン酸、グルコン酸、グリセロリン酸、グリコール酸、ヘミスルホン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、イソニコチン酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ニコチン酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、３－フェニルプロピオン酸、リン酸、ピクリン酸、ピメリン酸、ピバリン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸、スルファミン酸、酒石酸、チオシアン酸又はウンデカン酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。一つ又は複数の酸性官能基を含む化合物は、薬学的に許容し得る塩基、例えば、限定されないが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属に基づく無機塩基、又は第１級アミン化合物、第２級アミン化合物、第３級アミン化合物、第４級アミン化合物、置換アミン、天然に存在する置換アミン、環状アミン又は塩基性イオン交換樹脂のような有機塩基と、薬学的に許容し得る塩を形成してもよい。薬学的に許容し得る塩は、例えば、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩、又は重炭酸塩、例えばアンモニウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、アンモニア、ベンザチン、メグルミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、グルカミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、プロカイン、Ｎ－エチルピペリジン、テオブロミン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、モルホリン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－エチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェナミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン又はポリアミン樹脂から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物は、酸性基および塩基性基の両方を含むことができ、例えば、限定されるものではないが、ベタインなどの分子内塩または双性イオンの形態であってもよい。本明細書に記載される塩は、限定されるものではないが、当業者に公知の従来の処理を用いて、例えば、遊離状態のものを有機酸若しくは無機酸又は塩基と反応させることによって、または他の塩からの陰イオン交換若しくは陽イオン交換によって調製することができる。当業者には、塩の調製は、化合物の単離および精製中にｉｎ ｓｉｔｕで行うか、又は単離され精製された化合物を別々に反応させることによって行えることは明らかである。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物及びそのすべての異なる形態（例えば、遊離形態、塩、多形体、異性体）は、溶媒を付加した形態、例えば溶媒和物であってもよい。溶媒和物は、化学量論的量又は非化学量論的量の溶媒を、化合物又はその塩と物理的に会合させたものを含んでいる。溶媒は、例えば、薬学的に許容し得る溶媒であってもよいが、これに限定されない。例えば、溶媒が水の場合は水和物が形成され、溶媒がアルコールの場合はアルコラートが形成される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物及びそのすべての異なる形態（例えば、遊離形態、塩、溶媒和物、異性体）は、結晶形態および非晶質形態、例えば、多形体、擬多形体、コンフォメーション多形体、非晶質体、またはそれらの組み合わせを含み得る。多形体は、ある化合物において、同じ元素組成の異なる結晶充填配置を含む。多形体は通常、Ｘ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的・電気的特性、安定性、及び／又は 溶解性などが異なる。当業者には、再結晶溶媒、結晶化速度、保存温度などの様々な要因によって、単結晶の形態が優勢になる可能性があることは明らかである。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物及びそのすべての異なる形態（例えば、遊離形態、塩、溶媒和物、多形体）は、異性体、例えば幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体、個々のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ラセミ体、ジアステレオマー混合物及びそれらの組み合わせなどを含み、便宜上図示される式の記載によって限定されるものではない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、そのような化合物の塩、好ましくは薬学的または生理学的に許容し得る塩を含んでいてもよい。医薬製剤は通常、製剤の投与様式（注射、吸入、局所投与、洗浄、または選択された治療に適した他の様式）として許容される一つ又は複数の担体、賦形剤、又は希釈剤を含む。適切な担体、賦形剤、又は希釈剤（本明細書では互換的に使用する）は、そのような投与様式で使用するものとして当該技術分野では公知である。

適切な医薬組成物は、当技術分野で公知の手段によって製剤化することができ、その投与様式および投与量は当業者によって決定される。非経口投与では、化合物は滅菌水もしくは生理食塩水、またはビタミンＫなどに使用される非水溶性化合物の投与に使用される薬学的に許容できる基剤に溶解する。経腸投与では、化合物を錠剤、カプセル剤、又は液体に溶解した形態で投与することができる。錠剤又はカプセルは、腸溶性コーティングされていてもよいし、徐放性製剤であってもよい。放出される化合物を封入した高分子又はタンパク質の微粒子、軟膏、ペースト、ゲル、ハイドロゲル、又は化合物を外用または局部的に投与するための溶液など、多くの適切な製剤が知られている。徐放パッチやインプラントは、長期間での放出を目的として使用される。当業者に公知の多くの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｂｙ Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， （２０００）に記載されている。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、又は水素化ナフタレンを含んでいてもよい。化合物の放出を制御するために、生体適合性かつ生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を使用してもよい。調節化合物のための、他の有用となり得る非経口送達システムとしては、エチレン酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、植込み型輸液系、リポソームなどがある。吸入用の製剤は、賦形剤、例えば乳糖を含んでいてもよいし、例えばポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、グリココール酸塩及びデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよいし、点鼻薬として投与するための油性溶液であってもよいし、またゲルであってもよい。

本明細書に記載の化合物又は医薬組成物、あるいは本明細書に記載の使用のための化合物又は医薬組成物は、インプラント、移植片、プロテーゼ、ステントなどの医療用デバイスまたは器具を用いて投与することができる。また、そのような化合物または組成物を含有および放出することを意図したインプラントを考案してもよい。一例として、一定期間にわたって化合物を放出するように適合させた高分子材料で作られたインプラントが挙げられる。

本明細書に記載の医薬組成物の「有効量」には、治療上有効な量又は予防上有効な量が含まれる。「治療上有効な量」とは、白斑症や白髪症の減少、メラノサイトの増殖及び／又は生存の増加、またはメラノサイトの色素脱失の予防及び／又は非炎症性色素脱失メラノサイトにおける再色素化の促進など、所望の治療結果を得るために必要な投与量及び期間における有効な量を指す。治療上有効な化合物の量は、被験者の病状、年齢、性別、体重、さらに被験者に所望の反応を惹起する化合物の性能などの因子によって変化し得る。投与量は、最適な治療効果が得られるように調節することができる。治療上有効な量とは、化合物の毒性又は有害作用を、治療上有益な作用が上回る量でもある。「予防上有効な量」とは、所望の予防効果を得るために必要な投与量及び期間において有効な量を指す。典型的には、予防的投与量は、疾病の前段階又は疾病の初期段階の被験者に使用されることで、その予防的有効量が治療的有効量より少なくなり得る。

なお、投与量は、その緩和を目的とする症状の重さによって変化する。任意の特定の対象者について、個々の必要性及び組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に応じて、特定の投与レジメンを経時的に調整することができる。本明細書で規定する用量範囲は例示的なものであり、医療従事者が選択可能な用量範囲を限定するものではない。組成物中の活性化合物の量は、対象者の病状、年齢、性別、体重などの因子によって変化し得る。投与量は、最適な治療効果が得られるように調節可能である。例えば、１回のボーラス投与や数回に分けての経時投与が可能であり、また治療状況の緊急性に応じて投与量を比例的に減量又は増量することができる。投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口組成物を投薬単位形態で製剤化することが有利となり得る。

マレシン１は、プロテクチン、レゾルビン（ＤシリーズとＥシリーズ）、リポキシンを含み、さらに種類が増えつつある脂肪酸由来の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）の一つである。マレシン、プロテクチン、Ｄシリーズのレゾルビンはオメガ３脂肪酸ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６（ｎ－３））の誘導体であり、Ｅシリーズのレゾルビンは別のオメガ３脂肪酸エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５（ｎ－３））の誘導体である。これに対し、リポキシンはオメガ６脂肪酸であるリノール酸（ＬＡ、１８：２（ｎ－６））から誘導される。ＬＡはまた、炎症性メディエーター（ロイコトリエンやプロスタグランジン）を生成する。なお、マレシン１に加えて、プロテクチンとレゾルビンもまた、培養ヒト表皮メラノサイトに対して強い生存促進作用を持つが、これはリポキシンＡ ４には共通していない機能であり、リポキシンＡ ４は、メラノサイトを生理的ストレスから保護しないだけでなく、メラノサイトの枯渇を促進した。したがって、すべてのＳＰＭがメラノサイトまたはメラノサイト前駆体を保護する能力において互換性があるわけではない。このことは、将来、色素脱失疾患または他の病状の治療のためにＳＰＭに基づく治療法を開発する際に考慮される可能性がある。しかし、本明細書で示したように、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、レゾルビンＥ１はすべて、メラノサイトを保護する能力を示している。

マレシン１ （ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １）は、１５リポキシゲナーゼ媒介酸素化によるドコサヘキサエン酸（ ＤＨＡ、オメガ３脂肪酸）の小分子誘導体（分子量＝ ３６３）である。現在までに、Ｇタンパク質共役型受容体ＬＧＲ６と核内受容体ＲＯＲαの２種類の細胞内受容体が見つかっている。ＲＯＲαはメラノサイトを含む複数の皮膚細胞型で発現しているが、ＬＧＲ６はメラノサイトでは発現していない。

そのような塩は、皮膚の外部製剤として使用される従来の酸付加塩など、医薬分野で使用することができ、その例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導される塩、酢酸などの有機酸から誘導される塩、グリコール酸、ステアリン酸、クエン酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、酒石酸、リンゴ酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸から誘導される塩が挙げられる。また塩は、アンモニウム、ジメチルアミン、モノメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミンなどの塩基付加塩であってもよい。さらに、塩は従来の金属塩、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウムなどの金属に由来する塩の形態であってもよい。酸付加塩、塩基付加塩又は金属塩は、従来の方法によって製造することができる。

マレシン１（ＭａＲ１）は、オメガ３脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）から誘導されるリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の代謝産物であり、特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）である。マレシン１は、７Ｒ、１４Ｓ－ジヒドロキシ－４Ｚ、８Ｅ、１０Ｅ、１２Ｚ、１６Ｚ、１９Ｚ－ドコサヘキサエン酸（ＣＡＳ＃１２６８７２０－２８－０）であってもよく、下記式１の構造を有していてもよい。

式１

マレシン１はまた、その薬学的に許容し得る塩の形態であってもよい。例えば、塩基付加塩又は金属塩は、マレシン１のイオン体に適当な塩基又は金属イオン等を反応させることにより調製することができる。マレシン１の薬学的に許容し得る塩は、以下の式２の構造を有することができる。

式２

式２において、Ｘ^＋は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、またはカルシウムを表す。マレシン１の薬学的に許容し得る塩は、７Ｒ、１４Ｓ－ジヒドロキシ－４Ｚ、８Ｅ、１０Ｅ、１２Ｚ、１６Ｚ、１９Ｚ－ドコサヘキサエン酸ナトリウムであってもよいし、７Ｒ、１４Ｓ－ジヒドロキシ－、１０Ｅ、１２Ｚ、１６Ｚ、１９Ｚ－ドコサヘキサエン酸カリウムであってもよい。マレシン１はまた、その溶媒和物であってもよい。

下記式３で表される１３Ｒ，１４Ｓ－ジヒドロキシ－４Ｚ，７Ｚ，９Ｅ，１１Ｅ，１６Ｚ，１９Ｚ－ドコサヘキサエン酸であるマレシン２ （ＣＡＳ ＃ １６３９８０９－４６－３）もまた、検証済みＳＰＭである。

式３

あるいは、マレシン２の薬学的に許容し得る塩は、以下の式４の構造を有することができる。

式４

下記式５で表されるリポキシンＢ４（ＣＡＳ＃９８０４９－６９－５）、５Ｓ、１４Ｒ、１５Ｓ－トリヒドロキシ－６Ｅ、８Ｚ、１０Ｅ、１２Ｅ－エイコサテトラエン酸は、もう一つの検証済みＳＰＭである。

式５

あるいは、リポキシンＢ４の薬学的に許容し得る塩は、下記式６の構造を有していてもよい。

式６

下記式７で表されるプロテクチンＤ１（ＣＡＳ＃６６０４３０－０３－５）、１０Ｒ、１７Ｓ－ジヒドロキシ－４Ｚ、７Ｚ、１１Ｅ、１３Ｅ、１５Ｚ、１９Ｚ－ドコサヘキサエン酸は、さらに別の検証済みＳＰＭである。

式７

あるいは、プロテクチンＤ１の薬学的に許容し得る塩は、下記式８の構造を有することができる。

式８

下記式９で表されるレゾルビンＤ２（ＣＡＳ＃８１０６６８－３７－２）、７Ｓ、１６Ｒ、１７Ｓ－トリヒドロキシ－４Ｚ、８Ｅ、１０Ｚ、１２Ｅ、１４Ｅ、１９Ｚ－ドコサヘキサエン酸（４Ｚ、７Ｓ、８Ｅ、１０Ｚ、１２Ｅ、１４Ｅ、１６Ｒ、１７Ｓ、１９Ｚ）－７，１６，１７－トリヒドロキシドコサ－４、８、１０、１２、１４、１９－ヘキサエン酸は、さらに別の検証済みＳＰＭである。

式９

あるいは、レゾルビンＤ２の薬学的に許容し得る塩は、下記式１０の構造を有することができる。

式１０

下記式１１で表されるレゾルビンＥ１（ＣＡＳ＃５５２８３０－５１－０）、５Ｓ、１２Ｒ、１８Ｒ－トリヒドロキシ－６Ｚ、８Ｅ、１０Ｅ、１４Ｚ、１６Ｅ－エイコサペンタエン酸は、さらに別の検証済みＳＰＭである。

式１１

あるいは、レゾルビンＥ１の薬学的に許容し得る塩は、下記式１２の構造を有することができる。

式１２

本明細書で使用する「溶媒和物」とは、一つ又は複数の溶質分子、すなわち適切なＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩と、一つ又は複数の溶媒分子とによって形成される複合体又は凝集体を意味する。溶媒和物は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール又は酢酸と形成される、錯体または凝集体であってもよい。

本明細書に記載される適切なＳＰＭは、その立体異性体であってもよい。立体異性体には、エナンチオマーやジアステレオマーなどすべての立体異性体が含まれる。化合物は、立体異性的に純粋な形態であっても、一つ又は複数の立体異性体の混合物、例えばラセミ混合物であってもよい。特定の立体異性体の分離は、当分野で知られている従来の方法のいずれかによって行うことができる。

「有効成分」とは、組成物で言及されている機能を果たすためのものであり、不純物として微量に含まれるのみで機能を果たさないものは含まない。

本明細書に記載される適切なＳＰＭは、化学的に合成されたものであっても、市販されているものであっても、天然源から抽出されたものであってもよい。

本明細書に記載の好適なＳＰＭ組成物は、メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するものであることができる。

組成物は、「治療上有効な量」の適切なＳＰＭ、または薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、又はそれらの組み合わせを含み得る。本組成物において「治療上有効な量」とは、それを必要とする対象者又は細胞に投与した場合に、十分な治療効果を示す量を意味する。「治療」とは、ヒトを含む哺乳類（個体を含む）の疾病または病状の治療を意味し、（ａ）疾患又は病状の発生を予防することや治癒、（ｂ）疾患又は病状の緩和、すなわち、患者における疾患又は病状の除去又は改善、（ｃ）疾患又は病状の抑制、すなわち、個体における疾患又は病状の進行の遅延又は停止、又は（ｄ）対象者における疾患又は病状の緩和を含む。特に、メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するものを指す。

リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーは、本明細書に記載のＳＰＭとして、０．００１重量％～８０重量％、例えば０．０１重量％～６０重量％、０．０１重量％から４０重量％、０．０１重量％から３０重量％、０．０１重量％から２０重量％、０．０１重量％から１０重量％、０．０１重量％から５重量％、０．０５重量％から６０重量％、０．０５重量％から４０重量％、０．０５重量％から３０重量％、０．０５重量％から２０重量％、０．０５重量％から１０重量％、０．０５重量％から５重量％、０．１重量％から６０重量％、０．１重量％から４０重量％、０．１重量％から３０重量％、０．１重量％から２０重量％、０．１重量％から１０重量％、または０．１重量％から５重量％の量で存在することができる。特に、外用白斑症治療薬として、０．０１％のマレシン１を検証した。

薬物送達組成物は、特に治療部位にメラノサイトが含まれる様々な疾患や症状を治療又は予防するために調製し利用することができる。例えば、皮膚メラノサイト、毛髪メラノサイト、眼メラノサイト、又は耳メラノサイトに、本明細書に記載のＳＰＭを投与して、メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進する。ＳＰＭは、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、及びレゾルビンＥ１のうちの一つ又は複数から選択され得る。本明細書に記載の組成物は、メラノサイトの色素脱失の予防及び／又はメラノサイトの非炎症性色素脱失における再色素化の促進に使用することができる。治療対象となりうる疾患又は症状としては、例えば、加齢に伴う白皮症及び白毛症、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、炎症療法に非反応の白斑症、及び白髪症が挙げられる。
材料と方法

被験者と皮膚生検：
本研究はブリティッシュ・コロンビア大学の臨床倫理委員会の承認を得ている。３６名の白斑症患者（汎発型白斑症２９名、分節型白斑症７名）と１５名の慢性湿疹患者の病変皮膚と非病変皮膚、及び９名のボランティアの健常皮膚から、前述のように４ ｍｍのパンチ生検を採取し^（４５）、トランスクリプトームシークエンシングと細胞プロファイリング実験を行った。生検を二等分し、１／２を直ちにＲＮＡ Ｌａｔｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｌａｂｓ^ＴＭ）に投入し、さらに使用するまで－２０℃で保存した。残りの１／２は組織学的評価のためにホルマリンに入れた。白斑症患者の病変部、境界部、非病変部の皮膚から５ ｍｍのパンチ生検を採取し、直ちに生理食塩水に入れて細胞を単離し（下記参照）、白斑症患者のマクロファージをフローサイトメトリーで解析した。

ＲＮＡ抽出とトランスクリプトームシークエンシング：
バルクＲＮＡは、前述したように、ＲＮｅａｓｙ^ＴＭ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて皮膚生検から抽出し^{（１４， ４６）}、Ｎｏｖｏ Ｇｅｎｅ^ＴＭ（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｃｈｉｎａ）によるｉｌｌｕｍｉｎａ^ＴＭプラットフォーム（ＨｉＳｅｑ ＰＥ１５０）を用いた転写シークエンシングに使用した。これにより各試料について少なくとも３０００万のクリーンリードを生成した。各転写物の発現は、転写物の総数と転写物の長さに対して正規化し、ＦＰＫＭで表した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ^ＴＭ （ＩＰＡ）を用いて、病変皮膚と非病変皮膚の間で、また白斑症患者と慢性湿疹患者の皮膚生検と対照としての健常な皮膚生検との間で発現が異なる遺伝子を、Ｒプログラムを用いて２倍率変化（ｔｗｏ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）とｐ＜０．０５を統計的有意性のカットオフ値として解析した。

皮膚生検における細胞浸潤のｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロファイリング：
Ａｒｏｎらによって開発されたｘＣｅｌｌツール^{（４７， ４８）} を使用して、皮膚生検における認識可能な免疫細胞の相対的変化を評価した。炎症性疾患や悪性疾患における細胞浸潤のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析として頻繁に使用されつつある^{（４９－５２）}この方法は、炎症や免疫応答に関与する６４種類の細胞の検証済みの遺伝子発現シグネチャーに基づいており、組織生検に存在する免疫活性細胞の相対的な存在量を推定することができる。また、任意の組織における免疫反応の一般的な程度を推定するための複合スコア（ＩｍｍｕｎｅＳｃｏｒｅ^ＴＭ）が生成される。

フローサイトメトリーによる、皮膚生検におけるＭ１及びＭ２マクロファージの分離と検出
ヒト白斑症皮膚からのマクロファージの分離：５ ｍｍのパンチ生検をハサミで細かく切り、ＲＰＭＩ培地中で、０．８ ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶと０．０３ ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ^ＴＭ）、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含む３ ｍｌのダイジェスションバッファーと混合した。試料は５％ＣＯ_２中、３７℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで回収し、１００－μｍのストレーナーで濾過し、遠心分離した。表面染色抗体パネルには、抗ヒトＣＤ１１ｂ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８^ＴＭ， ＣＤ１６３－ＢＶ４２１^ＴＭ ａｎｄ ＣＤ８０－Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７^ＴＭ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎ^ＴＭ）が含まれていた。細胞を抗体とともに４℃で３０分間インキュベートし、１％ ＦＣＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＬＳＲＩＩ^ＴＭセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ）を用いて解析した。

マウス皮膚からのマクロファージ分離：１ｃｍ×１ｃｍの大きさの皮膚試料を細かく裁断し、１ ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ^ＴＭ）を含むＰＢＳ溶液に入れ、３７℃で１時間インキュベートした。次いで試料を、１ ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶと０．１ ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ^ＴＭ）を含むＲＰＭＩに移し、３７℃で９０分間インキュベートした。１００ μｍのストレーナーに通し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞を洗浄し、１％非働化ＦＣＳを添加したＣａ^２＋とＭｇ^２＋を含まないＰＢＳで染色した。細胞表面染色パネルには、抗マウスＣＤ１６３－ＢＶ４２１^ＴＭ、ＣＤ８０－Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７^ＴＭ、ａｎｄ ＣＤ１１ｂ－Ｐｅｒｃｐ Ｃｙ５．５^ＴＭ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ^ＴＭ）が含まれ、４ ℃で３０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲＩＩ^ＴＭセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ）で分析した。

ＴＲＰ２免疫によるＢ６マウス白斑症モデル
８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ^ＴＭから取り寄せ、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｃｏａｓｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの標準飼料を与えた（４匹／ケージ）。メラノサイト特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を効率的に誘導するＳ． Ｙｏｕらの方法^（５３）を用いて、マウスを左臀部の皮内注射により免疫して（ＩＤ、０日目から開始）白斑症を誘発し、２週間で繰り返した。免疫原は、マウス１匹に対する各投与（注射）あたり、５０ μＬのＰＢＳ溶液にＴＲＰ２－１８０（５０ μｇ）ペプチドとＬＰＳ（５ μｇ）及びＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（５ μｇ）を混合したものを使用した。 免疫反応スコアは、初回免疫から４８時間後に、発赤と腫脹を評価することによって記録された（０＝なし、１＝軽度、２＝中等度、３＝重度）。ＴＲＰ免疫マウス及び非免疫マウスを免疫後４８時間後に麻酔し、上記のように免疫部位の皮膚を採取し細胞単離に用いて、マクロファージＭ１およびＭ２集団を評価した。

Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスを偽注射（２００ μｌ生理食塩水ＩＰ、ｎ＝２０）対照群とマレシン１（２００ μｌの生理食塩水中８００ｎｇを含むＩＰ、ｎ＝２０）注射群に無作為に割り付け、マレシン１処置の効果を評価した。すべてのマウスは初回免疫前に３回のＩＰ前処置を受け、試験終了まで週３回ＩＰ注射を続けた。マウスを週５回モニターし、Ｄｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｒｅａ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（０～５）を用いて評価した（図５Ｃ）。

試験終了時（３５日目）、写真撮影後、マウスを安楽死させ、左臀部免疫部位の全層皮膚生検（１ ｃｍ×１ ｃｍ）を外科用バサミで採取した。試料の半分はＲＮＡ抽出のためにＲＮＡｌａｔｅｒ^ＴＭに保存し、もう半分は病理組織学的解析のためにＯＣＴ包埋剤に固定した。免疫組織化学とＲＮＡ単離のため、脾臓と鼠径リンパ節の組織を採取した。

Ｂ６マウス白髪症モデルと血清マレシンの定量化
８週齢のＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスをＪＡＸ Ｌａｂｓ^ＴＭから購入し、標準的な環境で８週間飼育し、加齢に伴う自然白髪化（ｃａｎｉｔｉｅｓ）を観察した。毛色だけでなく、全体的な外見や行動も、目視と写真撮影によって毎日モニターした。６－８週までに、約２０－４０％のマウスに白髪が自然発生した。観察終了後、中心静脈血を採取し、メーカーの推奨プロトコルに従い、精製マレシン１を標準物質として、マレシン１ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ^ＴＭ）を用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。

Ｂ６マウスの白髪症発症に対するマレシン１の効果
８週齢のＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ^ＴＭ製Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスを２つのグループに分け、週に３回、マレシン１（１００ μｌの生理食塩水に８００ ｎｇ）又は生理食塩水のみの腹腔内注射を６週間行った。マウスは１週間ごとに目視で観察した。実験終了後、マウスの写真を撮り、体重を測定した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのメラノサイト増殖・生存アッセイ
ヒト新生児表皮メラノサイト（ＨＥＭｎ－ＤＰ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ^ＴＭ社から購入した（Ｃ－２０２－５Ｃ）。メラノサイトは、完全増殖培地（Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加したＭｅｄｉｕｍ ２５４：どちらもＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ^ＴＭ社から購入）で培養した。アッセイを実施する前に、細胞を増殖させ、３回継代させた。１ウェルあたり４ｘ１０^３個のメラノサイトを９６ウェルプレートに播種し、処置前に４時間回復させた後、各条件につき最終容量１００ μｌで添加した。細胞を処理し、３７℃、５％ＣＯ_２中で３日間保存した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ^ＴＭ （Ｐｒｏｍｅｇａ^ＴＭ， Ｇ８０８０） を用いて生存アッセイを行い、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間経過後、ＧｌｏｗＭａｘ^ＴＭプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ^ＴＭ）を用いてシグナルを測定した。マレシン１（Ｃａｙｍａｎ^ＴＭ）をＰＢＳで１ μｇ／ｍｌに希釈し、０～１ μｇ／ｍｌの範囲の濃度で培地に添加した。生存アッセイでは、メラノサイトをヒトメラノサイト増殖サプリメントを含まないＭ２５４培地で保持する以外は、基本的に増殖アッセイと同じ手順で行った。アッセイは３回実施した。

実施例１：免疫細胞ランドスケープのｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロファイリングでは、白斑症の病変部の皮膚微小環境においてＭ２マクロファージの欠損が認められたが、白斑症非病変部皮膚又は湿疹の患部の皮膚では認められなかった。

白斑症病変部皮膚の全トランスクリプトームシークエンシングとそれに次ぐ細胞デコンボリューション解析を、白斑症非病変部皮膚、および対照として健常ボランティアと湿疹患者の皮膚生検を用いて行い、白斑病変部皮膚の微小環境に優先的に存在する細胞の変化について洞察した。ｘＣｅｌｌ法で評価可能な６４種類の細胞のうち、１４種類の細胞が、健康な健常皮膚と比較して、白斑症皮膚生検で有意な濃縮を示した（図１Ａ）。その中には、自然免疫に関与する細胞（単球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ）や適応免疫に関与する細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞など）が含まれる。これらのうち、大部分（ＣＤ８＋ Ｔ ｃｍ、ＣＤ８＋ナイーブＴ、好中球、ＣＤ８＋ Ｔｅｍ、Ｔｈ２、軟骨細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ、ＧＭＰ、マスト細胞を含む）は、白斑症病変部および白斑症非病変部の両方の皮膚で濃縮されていた（図１Ｂ）。これに対し、メラノサイト、Ｍ２マクロファージ、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、中膜細胞、内皮細胞、ｌｙ内皮細胞、ｍｖ内皮細胞を含む７種類の細胞が、健常皮膚と比較して白斑症病変皮膚で特異的に有意な枯渇を示したが、白斑症非病変皮膚では認められなかった（図１Ｃ）。

白斑症病変皮膚で観察される細胞変化が、この免疫介在性皮膚疾患に特異的であるかどうかを理解するため、Ｔｈ２免疫介在性炎症性皮膚疾患の原型である慢性湿疹患者の皮膚生検でも同様の解析を行った。図２に示すように、白斑症病変部の皮膚で濃縮された細胞は、一般に湿疹病変部の生検でも濃縮されていた。しかし、白斑症病変皮膚で枯渇した細胞は湿疹病変皮膚では枯渇しなかったことから、メラノサイトや他の細胞（Ｍ２マクロファージなど）の枯渇は白斑症皮膚病変に特異的であることが示唆された。

病変部の細胞浸潤が白斑症のサブタイプや病期と相関しているかどうかを検証するため、白斑症患者を形態学的グループ（汎発型白斑症か分節型白斑症か）又は罹病期間グループ（１２ヵ月以内に発症した活動性白斑症か１２ヵ月を超える比較的安定した白斑症か）に層別化した。分析対象となった３６名の白斑症患者のうち、２９名は汎発型白斑症で、７名は分節型白斑症であった。 分節型白斑症と汎発型白斑症の間では、ｌｙ内皮細胞とｍｖ内皮細胞という２種類の細胞が有意な差異を示した（図９）。 これらの細胞は汎発型白斑症では減少していたが、分節型白斑症では減少していなかった。 １２ヵ月以上経過した白斑症と比較すると、罹病期間の短い白斑症病変（一般的に活動性又は進行性の白斑症）では免疫スコアが非常に高く、単球、顆粒球－単球前駆細胞、樹状細胞の濃縮が顕著であり（図１０）、白斑症の発生初期には高い免疫反応があることが示唆された。

実施例２：フローサイトメトリーによるヒト白斑症病変皮膚におけるＭ２マクロファージ分極化の欠損

白斑症病変皮膚が、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ細胞プロファイリング解析でＭ２マクロファージの特異的枯渇を示し（図１、２、１１）たことを受け、この発見の検証のためさらなる実験を行った。白斑症患者の病変部および非病変部の皮膚から新鮮な皮膚生検を採取し、Ｒ． Ｃｌａｒｋらのプロトコルを用いて細胞を単離した^{（５４， ５５）}。^{（５４， ５５）}．ＣＤ８０（Ｍ１マーカー）とＣＤ１６３（Ｍ２マーカー）に対するモノクローナル抗体を用いて、ＣＤ１１ｂ＋細胞のフローサイトメトリーを行った。図３Ａに示すように、白斑症の病変皮膚（ＬＳ）では、非病変皮膚（ＮＬＳ）と比較してＣＤ１６３＋細胞が有意に減少していた。Ｍ２マクロファージは非病変皮膚ではＣＤ１１ｂ＋細胞平均３７．３％を占めていたが、病変皮膚では１３％に減少した（ｐ＝０．０３７）。一方、Ｍ１マクロファージは逆の変化を示し、非病変皮膚と比較して白斑症の病変皮膚において濃縮されていた（ｐ＝０．００３５）（図３Ｂ）。このように、白斑症病変皮膚（０．５）では、非病変皮膚（４．７， ｐ＜０．０１６）と比較して、Ｍ２／Ｍ１比が有意に減少しており、白斑症病変皮膚ではＭ２分極化が欠損していることが確認された（図３Ｃ）。

実施例３：メラノサイト特異的抗原による免疫で白斑症を発症させたＢ６マウスの皮膚におけるＭ２マクロファージ分極化の減少

Ｍ２マクロファージの枯渇が白斑症の動物モデルでも観察されるかを検証するため、メラノサイト特異的細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介された、十分に確立されたＢ６白斑症マウスモデルを使用した^{（５３， ５６）}。このモデルでは、ＬＰＳとＣｐＧを含むアジュバントにおいてメラノサイト特異的抗原ＴＲＰ－２をＢ６（黒）マウスに皮内免疫し、免疫部位に強い急性免疫反応（発赤と腫脹）を惹起しており、その後約６週間で毛髪に白い斑点（白斑症）が発生した。この現象にＭ２マクロファージの枯渇が関与しているかどうかを検証するため、免疫後４８時間（免疫反応がピークに達する時期）に免疫部位から皮膚生検を採取し、フローサイトメトリーでＭ２／Ｍ１比を測定した。図４に示すように、ＴＲＰ２免疫により、Ｍ２／Ｍ１比が０．４４から０．２１に減少し、Ｍ２分極化が有意に減少した。

実施例４：Ｂ６マウスへのマレシン１による処置によって、白斑症誘発時に、皮膚のＭ２マクロファージの分極化が促進され、メラノサイトの枯渇が抑制された。

Ｍ２マクロファージは、強力な可溶性機能性メディエーターであるマレシン１を分泌することが知られており、このメディエーターはＭ２マクロファージの多様な機能を仲介するだけでなく、自己分泌フィードバックループでのＭ２マクロファージの分極を刺激する^（３７）。Ｂ６マウス白斑症モデルにおいて、Ｍ２マクロファージの枯渇がメラノサイトの枯渇に寄与しているかを検証するため、ＴＲＰ２免疫の前にマウスをマレシン１ＩＰで前処理した。図４に示すように、マレシン１の投与はＴＲＰ２免疫部位のＭ２マクロファージを劇的に濃縮させ、免疫後のＭ２／Ｍ１比を免疫前の状態以上のレベルにまで回復させた。

免疫後、マウスはマレシン１又は生理食塩水のＩＰ投与を週３回、８週間続けた（図５Ａ）。マウスの免疫部位に白斑が発生していないかどうか、目視と写真撮影によって毎週観察が行われた（図５Ｂ）。視覚スコアリング・テンプレート（図５Ｃ）を使用し、観察時間に応じて各群の色素脱失スコアの平均値をプロットし、白斑症の重症度を定量化した。マレシン１投与群では、偽薬投与マウスと比較して白斑症の発生が有意に抑制された（図５Ｄ）。

実施例５：メラノサイト枯渇に対するマレシン１の阻害効果は、免疫消失作用と相関していた。

マレシン１には炎症と免疫反応に対する強い収束作用があることから、マレシン１を投与したマウスの免疫反応のピークと色素脱失のレベルとの相関を評価した。図５Ｅに示すように、マレシン１投与は免疫応答を有意に低下させた。さらに、免疫反応スコアと白斑症色素脱失面積スコアとの間には有意な相関があった（図５Ｆ、ｐ＜０．０００１）。このことから、マレシン１には白斑症阻害作用があり、その作用の一部は、ＴＲＰ－２ペプチドによる免疫によって誘導されるメラノサイト特異的免疫反応を抑制し、消失させる能力に起因している可能性が示唆される。

実施例６：白髪症モデルとしてのＢ６マウス

マレシン１が免疫に依存しないメラノサイトの枯渇も抑制できるかどうかを評価するため、Ｂ６マウスの白髪症モデルを用いた追加研究を行った。白髪症は、人間や他の哺乳類が年齢を重ねるにつれて発症する自然現象である。最近の研究では、マウスにおける白髪症の発生は免疫活性化の結果ではなく、加齢に伴うメラノサイト幹細胞の疲弊によるメラノサイトの減少の結果であることが示された^{（５７， ５８）}。Ｂ６黒色マウスを用いた我々の白斑症研究では、非免疫化Ｂ６マウスは生後約３ヶ月から自然に白髪症を発症し、約３０％のマウスに、正常な色素を持つ黒色毛と混在した白色毛が、毛に覆われた皮膚全体に拡散している様子が散見された。また、白髪症の発症と、バーバリングを行う攻撃的なマウスとケージを共有することによる精神的ストレスの経験との間には有意な関連があり（図１２）、免疫の活性化よりもむしろ交感神経の過活動が早発白髪症を引き起こすという以前の観察と一致していた^{（５７， ５８）}。

実施例７：Ｂ６マウスにおける白髪症の発症とＭ２マクロファージの機能低下との相関

Ｂ６白斑症マウスでの免疫によって誘導されたメラノサイトの枯渇による白髪の発生は、Ｍ２マクロファージの分極化の抑制と相関していたことから、白髪症における免疫非介在性のメラノサイトの枯渇も、Ｍ２マクロファージの機能低下と相関している可能性が疑われた。これを検証するため、マレシン１が主にＭ２マクロファージによって産生されることから、血清マレシン１をＭ２マクロファージの代理マーカーとして測定した^{（３６， ３７）}。図６Ａおよび６Ｂに示すように、白髪症を発症したマウスでは、白髪症のない同年齢同性Ｂ６マウスと比較して、マレシン１の血清濃度が有意に低かった（ｐ＝０．０２６）。

実施例８：マレシン１によるＭ２マクロファージの機能増強による白髪症の発生の抑制とＢ６マウスの加齢に伴う体重増加の抑制

Ｂ６マウスを２群に分け（図６Ｃ）、一方には８００ ｎｇのマレシン１を週３回、８週間ＩＰ注射し、マレシン１の減少が白髪症の発症に寄与するかどうかを調べた。もう一方のグループは生理食塩水をＩＰ注射で投与した。マウスは毎週、目視と写真撮影によって毛色、一般的な外見、行動を記録し、体重測定によって加齢に伴う体重増加を評価した。図４Ｄに示すように、マレシン１投与はＢ６マウスの皮膚でＭ２マクロファージを有意に濃縮し、Ｍ２／Ｍ１比を０．４４から５．３４に増加させた。マレシン１を投与したマウスは、生理食塩水を投与した対照マウスと比較して、加齢に伴う体重増加が有意に低く（体重増加１４．２％対体重増加１７．７％、ｐ＝０．０４２３）、より健康的な体重を維持した（図６Ｅ）ことから、マレシン１はＢ６マウスにおいて、包括的な抗加齢効果を有する可能性が示唆された。さらに、図６Ｆに示すように、生理食塩水を投与した対照群では、１５週齢までに１５％のマウスが白髪症を発症した。マレシン１投与群では、白髪症の発症は完全に防止された（ｐ＜０．０１２５、Ｌｏｇ Ｒａｎｋ Ｔｅｓｔ）。

実施例９：マレシン１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、生理的ストレスによる培養表皮メラノサイトの枯渇を防ぐ。

マレシン１投与によって、なぜ白斑症や白髪症におけるメラノサイトの枯渇が防止できるのかは解明されていない。理論的には、この効果は、メラノサイトに対する免疫介在性細胞傷害性を抑制するなどの間接的な効果、あるいはメラノサイトまたはメラノサイト前駆体／幹細胞に対する直接的な保護効果によるものと考えられる。マレシン１による白斑症色素脱失効果の減少は、ＴＲＰ２免疫によって引き起こされる免疫反応を減少させるマレシン１の機能と密接な相関がある事が示されたため、白斑症におけるメラノサイトの枯渇を防ぐためにマレシン１が用いるメカニズムの少なくとも一部が免疫消失である可能性が示唆された。しかし、マレシン１は、白髪症における幹細胞の疲弊によって引き起こされる免疫非依存的なメラノサイトの枯渇も防ぐことができるため、マレシン１がメラノサイトまたはその前駆体に対して直接的な保護的役割も持っている可能性が示唆された。

この可能性を検証するために、新生児の包皮から単離した初代ヒト表皮メラノサイト（および前駆体）を培養した。通常の培養条件下では、増殖あるいは培養中の増殖前駆体からの分化の結果、メラノサイトの数は増加する。しかし、生理的ストレス（培養液中の増殖因子の除去）下では、培養３日後に生存メラノサイトが著しく減少する。図７に示すように、マレシン１投与はメラノサイトに対して有意な保護効果を示し、増殖因子の除去によるメラノサイトの枯渇を顕著に減少させた。アッセイでは免疫細胞は存在しなかったので、メラノサイトに対するマレシン１の抗枯渇作用は、免疫消失作用とは無関係であると思われる。その代わりに、マレシン１はメラノサイト又はその前駆体に直接作用して、増殖因子の除去によるメラノサイトの枯渇を防いでいる可能性が高い。

実施例１０：その他の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）によるメラノサイト保護作用

マレシン１は、さらに種類が増えつつあるＳＰＭの一つであり、免疫反応や炎症を収束することができる脂質由来のメディエーターである。ＳＰＭには、マレシン、プロテクチン、レゾルビン（ＥおよびＤシリーズ）、リポキシンの４つの主なグループがある。メラノサイトに対するマレシン１の保護作用が他のＳＰＭにも存在するかどうかを検証するため、様々なＳＰＭ群（すなわち、マレシン１、マレシン２、リポキシンＡ４、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、およびレゾルビンＥ１）を代表するメディエーターを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでメラノサイトの増殖および生存アッセイを行った。図８に示すように、リポキシンＡ４だけを除いて、ほとんどの種のＳＰＭは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、強力な濃度依存的生存促進作用をメラノサイトに対して直接的に示した。リポキシンＡ４はメラノサイトに対して生存促進作用を示さないだけでなく、濃度非依存的にメラノサイトの生存を有意に低下させた（図８）。

実施例１１：外用マレシン１の局所的抗炎症療法に抵抗性のある白斑に対する再色素化誘導

３８歳のアジア人男性において右手背側に２つの白い斑点と右中腹部に１つの白い斑がある５年３ヵ月の既往歴を持つ症例に、外用マレシン１を投与した。白い斑点は５年前の初夏に初めて見られたが、今までその大きさに大きな変化はなかった。発赤や鱗屑などの炎症徴候は見られなかった。かゆみや痛みなどの症状もなかった。この患者は、過去１２ヵ月間、腹部の斑にはモメタゾンフマル酸塩０．１％クリームＢＩＤを、右手の２つの斑点にはクロベタゾール０．０５％クリームＯＤを外用していたが、白い部分の大きさに変化はなかった。

患者は、甲状腺疾患、皮膚狼瘡、その他の慢性炎症性疾患の既往歴や診断はなく、健康であった。また、ベンゼンやフェノールなどの化学物質への暴露や、ハイドロキノンやハイドロキノンのモノベンゾエーテルなどの既知の皮膚色素脱失薬の使用も報告されていない。

診察において、被験者は健常であるとみなされた。包括的な皮膚検査を行った。色素脱失のある３つの病変を除けば、皮膚全体は正常であった。（１）右中腹部に１．５Ｘ１．２ｃｍの白色斑点、（２）右第３中手骨頭背部に１．３Ｘ１．０ｃｍの白色斑点、（３）右第４中手骨頭背部に１．０Ｘ０．８ｃｍの白色斑。

標準的な抗炎症薬を１２ヵ月間使用したが効果が見られなかったため、被験者は他の治療法を探しており、０．０１％マレシン１を含むエタノール溶液の１日２回の使用を試みた。被験者に刺激、かゆみ、発赤などの有害事象は見られなかった。３ヵ月後までには、著しい再色素化が末梢縁から始まり、次第に中心の方までにも認められた。色素脱失した３病変の面積は１１．７％減少した（３病変それぞれで、１３．６％、１０．５％、１１．１％）。

考察

入手可能な文献によると、白斑症と白髪症は、メラニン色素の消失が共通しているにもかかわらず、発症メカニズムにおいて大きく異なっている。白斑症におけるメラノサイトの枯渇は、主に毛包と表皮の分化したメラノサイトの免疫破壊によって媒介されるが、白髪症におけるメラノサイトの枯渇は、免疫反応とは無関係にメラノサイト幹細胞の疲弊の結果である。これらの結果は、これまで知られていなかった共通のメカニズムが、白斑症と同様に白髪症でも（Ｍ２マクロファージ又はその機能的メディエーターであるマレシン１、あるいは他の適切なＳＰＭの欠乏によって）メラノサイトの枯渇に寄与していることを示唆している。

上記の結果は、機能的メディエーターであるマレシン１または他の適切なＳＰＭの産生を通して、メラノサイトに対する免疫介在性攻撃を抑制し、またメラノサイト又はその前駆体の生存を直接促進することにより、Ｍ２マクロファージがメラノサイトの恒常性ニッチを維持することが必要であることを示した。Ｍ２マクロファージの機能は、２つの相補的なメカニズムによってメラノサイトの恒常性を維持し得る。その一つは、マレシン１あるいは他の適切なＳＰＭの炎症収束機能が、メラノサイトとその前駆体にとって正常な微小環境において免疫細胞傷害性を低く保つことである。二つ目は、メラノサイト又はその前駆体に対してマレシン１又は他の適切なＳＰＭが生存促進機能を与えることで、自然老化、又は交感神経の過活性化や増殖因子の除去によって引き起こされるストレスによるメラノサイトの死を減らすことである。これに対して、Ｍ２機能の欠損により、恒常性ニッチはメラノサイトにとって不利なものとなり、免疫細胞傷害性が抑制されず、メラノサイトの保護が不十分となるため、メラノサイトが枯渇する。恒常的な環境は、外因性のＭ２マクロファージ機能メディエーターであるマレシン１を補充することによって調節できるという点が重要である。マレシン１がＴＲＰ２によって誘導されるメラノサイトに対する免疫細胞傷害性を減弱させ（図５Ａ）、免疫活性化下で皮膚常在性のＭ２分極化を増加させ（図４）、白斑症マウスモデルにおける免疫介在性のメラノサイト破壊を減少させ（図５）、白髪症マウスモデルにおける免疫非介在性のメラノサイト枯渇を防ぎ（図６）、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖因子飢餓による死からメラノサイトを保護する（図７）ことが実験により示された。

Ｍ２マクロファージが成人の幹細胞ニッチの組織恒常性に関与しているという実験的証拠が増えつつあり^（５９）、脂肪組織では、Ｍ２様マクロファージが脂肪細胞前駆体に必要なニッチを形成しているという報告もある^{（６０、６１）}。メラノサイト幹細胞の疲弊が白髪症発症の主なメカニズムであることを考えると^{（２６）（２７）}、白髪症マウスにおけるＭ２マクロファージ機能の低下（マレシン１血清濃度の低下）（図６Ｂ）、及びマレシン１投与による白髪症発症予防（図６ＤおよびＦ）の観察結果は、Ｍ２マクロファージもメラノサイトの恒常性維持に必要であることを強く示唆している。

以前の研究では、メラノサイトの恒常性は幹細胞プールの維持に依存しており、幹細胞の喪失は毛包の老化につながることが示されていた^（６２）。毛包内の幹細胞が必要とするニッチの維持には、Ｃｏｌ１７ａ１^（６２）、ｗｎｔ／ｂ－カテニンシグナリング^（６３）、ＳＣＦ／ｋｉｔシグナリング^{（６４， ６５）}、酸化ストレスの抑制^（６６）、ＣＸＣＬ１２^（６７）などの分子シグナル伝達のネットワークが関与している。結果として、メラノサイトの恒常性ニッチ維持に必要なシグナル伝達ネットワークのパズルに、Ｍ２マクロファージがもう一つの重要なピースとして加えられた。

Ｂ Ｚｈａｎｇらによるマウスモデルでの研究では、精神的ストレスによって誘発される交感神経シグナル伝達の亢進がメラノサイト幹細胞の疲弊を招き、その結果、免疫反応とは無関係に毛包内のメラノサイトが枯渇することが示された^（２６）。実験結果から、攻撃的な同居マウスと同じケージに収容されたマウスは、白髪症の発生率が非常に高かったことから、精神的ストレスと白髪症の発生との間に強い関連があることが確認された（図１２）。さらに精神的ストレスによって誘発されるメラノサイト幹細胞の疲弊が、マレシン１投与によって予防できることも示された（図６）。したがって、Ｍ２マクロファージの生理的機能の範囲が、心理的あるいは精神的ストレスに対する防御にまで拡張された。

マレシン１や他のＳＰＭがどのようにメラノサイトの恒常性を維持し、免疫依存的あるいは免疫非依存的な原因によるメラノサイトの枯渇を防いでいるのかは、現時点では解明されていない。これまでの研究では、マレシン１が、メラノサイト幹細胞ニッチの障害と同様に白斑症の病因に重要なかかわりを持つとされる酸化ストレスを阻害することが示されている。マレシン１あるいは他の適切なＳＰＭは、酸化ストレスを防止することによってメラノサイトの枯渇を阻害している可能性がある。単離されたヒト表皮メラノサイトのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において、マレシン１が、増殖補助剤の除去による生理的ストレスによって誘発されたメラノサイトの枯渇に対する抵抗性を有意に増加させており、マレシン１または他の適切なＳＰＭが、メラノサイト又はその前駆体に直接作用して、その生存を促進できることが示唆されている。この効果のメカニズムは現時点では解明されていない。

マレシン１ （ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １）は、１５リポキシゲナーゼ媒介酸素化によるドコサヘキサエン酸（ ＤＨＡ、オメガ３脂肪酸）の小分子誘導体（分子量＝ ３６３）である。特異的炎症収束性メディエーター （ＳＰＭ）^{（６８，６９）}のひとつであるマレシン１は、炎症の解消、創傷治癒、組織再生におけるＭ２マクロファージの機能を仲介する^（３６）。現在までに、Ｇタンパク質共役型受容体ＬＧＲ６と核内受容体ＲＯＲαの２種類の細胞内受容体が見つかっている。ＲＯＲαはメラノサイトを含む複数の皮膚細胞型で発現しているが、ＬＧＲ６はメラノサイトでは発現していない。マレシン１や他の適切なＳＰＭの、メラノサイトの刺激や保護におけるメカニズムを調べるためには、さらなる研究が必要である。

上記結果では、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞^{（１１－１３）}、常在メモリーＴ細胞^（２５）、ＮＫ細胞^（４６）によるメラノサイト破壊では充分説明しきれなかった白斑症の臨床的特徴についての説明を示した。これらデータは、シクロスポリン、メトトレキサート、皮質ステロイドなどの免疫抑制剤が、特に手、足、生殖器などの確立した白斑症病変部でのメラノサイト復活に一般的に効果がない理由が、白斑症病変部微小環境におけるメラノサイトの恒常性に対する増殖補助の欠如である可能性を示唆している。

マレシン１は免疫反応を抑制するだけでなく、メラノサイト又はその前駆体を直接刺激することができ、そのためマレシン１（または他のＭ２アゴニスト）に基づく治療法は、白斑症の治療において、特に免疫抑制療法に反応しない病変に対して、従来の免疫抑制に基づく治療法に対して優位性を持つ可能性がある。白斑症のほかにも、白髪症、化学的白皮症、加齢に伴う白皮症など、メラノサイトの消失を伴ういくつかの疾患がある。上記の結果は、マレシン１や他の適切なＳＰＭ分子が、これらの症状も治療できる可能性を示唆している。

白斑症や白髪症におけるＭ２欠乏のメカニズムについては、さらなる研究が必要である。加齢に伴う、骨格筋でのマレシン１産生の減少が発見されている^（７０）。したがって、白髪症におけるマレシン１の減少という観察結果は、マレシン１の産生低下（およびＭ２機能全般の低下）と生理的老化との関連性をより強く示し、マレシン１およびその関連分子が、白髪症やその他の生理的老化症状の治療法となる可能性を提起するものである。実際、マレシン１を投与したＢ６マウスでは、白髪症形成減少だけでなく、加齢に伴う体重増加の減少も観察されたことから、マレシン１がマウスにとってより包括的な抗老化効果を持つ可能性が示唆された。心血管系、神経系や認知の機能など、老化の他の側面に対するマレシン１の効果可能性を評価するためには、さらなる実験が必要である。

マレシン１は、プロテクチン、レゾルビン（ＤシリーズとＥシリーズ）、リポキシンを含み、さらに種類が増えつつある脂肪酸由来の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）の一つである。マレシン、プロテクチン、Ｄシリーズのレゾルビンはオメガ３脂肪酸ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６（ｎ－３））の誘導体であり、Ｅシリーズのレゾルビンは別のオメガ３脂肪酸エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５（ｎ－３））の誘導体である。これに対し、リポキシンはオメガ６脂肪酸であるリノール酸（ＬＡ、１８：２（ｎ－６））から誘導される。ＬＡはまた、炎症促進性メディエーター（ロイコトリエンやプロスタグランジン）を生成する。なお、マレシン１に加えて、プロテクチンとレゾルビンもまた、培養ヒト表皮メラノサイトに対して強い生存促進作用を持つが、これはリポキシンＡ ４には共通していない機能であり、リポキシンＡ ４は、メラノサイトを生理的ストレスから保護しないだけでなく、メラノサイトの枯渇を促進した。したがって、すべてのＳＰＭがメラノサイトまたはメラノサイト前駆体を保護する能力において互換性があるわけではない。このことは、将来、色素脱失疾患または他の病状の治療のためにＳＰＭに基づく治療法を開発する際に考慮される可能性がある。しかし、本明細書で示したように、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、レゾルビンＥ１はすべて、メラノサイトを保護する能力を示している。

本研究はまた、これまで報告されていなかった、白斑症病変皮膚における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と複数種類の内皮細胞の減少を明らかにした（図１および２）。皮膚ＭＳＣは、組織の恒常性に関与する特殊な線維芽細胞様細胞である。これらは、マクロファージの分極化を制御することによって中枢神経系の微小環境を維持し^（７１）、ニューロレグリン^（７２）のような生存促進メディエーターを分泌し、白斑症の皮膚へのＴ細胞のホーミングを阻害することができる^（７３）。さらに、これらは、メラノサイトを含む他の種類の皮膚細胞を生み出す前駆細胞としても機能する^（７４）。分節型白斑症病変では血管新生が亢進しているという以前の報告を鑑みれば、汎発型白斑症病変ではそのような増加は観察されていなかったとしても、汎発型白斑症病変で内皮細胞が減少しているという発見は驚くべきものである^（７５）。 ＭＳＣと内皮細胞で観察された変化の病原性意義を理解するためには、さらなる研究が必要である。

本明細書には、本発明の様々な実施形態が開示されているが、当業者の一般的な知識に従って、本発明の範囲内で多くの適応や変形を行うことができる。このような変形例は、発明の任意の態様に対する既知の等価の置換によって、実質的に同じ方法において同じ結果を達成することを含む。数値範囲には、その範囲を定義する数値も含まれる。本明細書において、”ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ”という用語は、”ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ ”というフレーズと実質的に等価な、オープンエンドな用語として使用され、”ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ”も、これに倣った意味を有する。本明細書において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の参照語を含む。従って、例えば、「あるもの」への言及は、そのものの複数を含む。本明細書における参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の実施形態に対する先行技術であることを認めるものではない。本発明は、本明細書において実施例及び図面を参照して説明したすべての実施形態及び変形例を実質的に含む。

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69. Spite M, Claria J, Serhan CN.Resolvins, specialized proresolving lipid mediators, and their potential roles in metabolic diseases.（仮訳「レゾルビン、特殊な分解促進脂質メディエーター、および代謝性疾患におけるその潜在的役割」）Cell Metab. 2014; 19(1): 21-36.
70. Markworth JF, Brown LA, Lim E, Castor-Macias JA, Larouche J, Macpherson PCD, et al.Metabolipidomic profiling reveals an age-related deficiency of skeletal muscle pro-resolving mediators that contributes to maladaptive tissue remodeling.（仮訳「メタボリピドミクスのプロファイリングにより、明らかとなる、不適応な組織リモデリングの一因としての加齢に伴う骨格筋の解離促進メディエーターの欠乏」）Aging Cell. 2021; 20(6): e13393.
71. Xu C, Fu F, Li X, Zhang S.Mesenchymal stem cells maintain the microenvironment of central nervous system by regulating the polarization of macrophages/microglia after traumatic brain injury.（仮訳「外傷性脳損傷後のマクロファージ／ミクログリアの分極化を制御することにより、中枢神経系の微小環境を維持する間葉系幹細胞」）Int J Neurosci. 2017; 127(12): 1124-35.
72. Bara JJ, Turner S, Roberts S, Griffiths G, Benson R, Trivedi JM, et al.High content and high throughput screening to assess the angiogenic and neurogenic actions of mesenchymal stem cells in vitro.（仮訳「間葉系幹細胞の血管新生・神経新生作用をin vitroで評価するための高含量・高スループットスクリーニング」）Exp Cell Res. 2015; 333(1): 93-104.
73. Zhou MN, Zhang ZQ, Wu JL, Lin FQ, Fu LF, Wang SQ, et al.Dermal mesenchymal stem cells (DMSCs) inhibit skin-homing CD8+ T cell activity, a determining factor of vitiligo patients' autologous melanocytes transplantation efficiency.（仮訳「白斑症患者の自家メラノサイト移植効率を決定する因子である皮膚ホーミングＣＤ８＋ Ｔ細胞活性を阻害する真皮間葉系幹細胞（ＤＭＳＣｓ）」）PLoS One. 2013; 8(4): e60254.
74. Crigler L, Kazhanie A, Yoon TJ, Zakhari J, Anders J, Taylor B, et al.Isolation of a mesenchymal cell population from murine dermis that contains progenitors of multiple cell lineages.（仮訳「複数の細胞系列の前駆細胞を含む、マウス真皮からの間葉系細胞集団の単離」）FASEB J. 2007; 21(9): 2050-63.
75. Aroni K, Voudouris S, Ioannidis E, Grapsa A, Kavantzas N, Patsouris E.Increased angiogenesis and mast cells in the centre compared to the periphery of vitiligo lesions.（仮訳「白斑症病変部の末梢と比較して、増加した中心部の血管新生および肥満細胞」）Arch Dermatol Res. 2010; 302(8): 601-7.

Claims (31)

1. メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進する方法であって、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを、それを必要とする対象者に投与することを含む方法。
2. 前記ＳＰＭが、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、及びレゾルビンＥ１のうちの一つ又は複数から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進することが、メラノサイトの色素脱失を防止、及び／又はメラノサイトの非炎症性色素脱失において再色素化を促進する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記メラノサイトが皮膚メラノサイト、毛髪メラノサイト、眼メラノサイト又は耳メラノサイトである、請求項１、２又は３に記載の方法。
5. 前記投与が、メラノサイトの非炎症性喪失を減少又は逆転させるためのものである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記投与が加齢に伴う白皮症及び白毛症の治療のためである、請求項１又は２に記載の方法。
7. 前記メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進することが、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、炎症療法に非反応の白斑症、又は白髪症の治療のためのものである、請求項１または２に記載の方法。
8. 前記投与が、光線療法又は免疫抑制療法との併用療法の一部として行われる、請求項７に記載の方法。
9. 前記投与が外科的メラノサイト移植療法との併用療法の一部として行われる、請求項７に記載の方法。
10. 前記ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーが、マレシン１である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するための、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマー、又はそれらの医薬組成物の使用。
12. メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するための医薬品の製造における、リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数の特異的炎症収束性メディエーター（ＳＰＭ）、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマー、又はそれらの医薬組成物の使用。
13. 前記ＳＰＭが、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、及びレゾルビンＥ１のうちの一つ又は複数から選択される、請求項１１又は１２に記載の使用。
14. 前記メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進することが、メラノサイトの色素脱失を防止、及び／又はメラノサイトの非炎症性色素脱失において再色素化を促進する、請求項１１、１２又は１３に記載の使用。
15. 前記メラノサイトが皮膚メラノサイト、毛髪メラノサイト、眼メラノサイト又は耳メラノサイトである、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の使用。
16. 前記ＳＰＭが、メラノサイトの非炎症性喪失を減少又は逆転させるためのものである、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の使用。
17. 前記ＳＰＭが加齢に伴う白皮症及び白毛症の治療のために使用される、請求項１１、１２又は１３に記載の使用。
18. 前記メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進することが、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、炎症療法に非反応の白斑症、又は白髪症の治療のためのものである、請求項１１、１２又は１３に記載の使用。
19. 前記ＳＰＭが、光線療法又は免疫抑制療法との併用療法の一部として、又は外科的メラノサイト移植療法との併用療法の一部として使用される、請求項１８に記載の使用。
20. 前記ＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーが、マレシン１である、請求項１１から１９のいずれか１項に記載の使用。
21. リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを有効成分として含む、白斑症を予防又は治療するための医薬組成物。
22. 前記白斑症が、休眠白斑症病変、化学誘因性白斑症、及び炎症療法に非反応の白斑症から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 前記ＳＰＭがマレシン１である、請求項２１又は２２に記載の医薬組成物。
24. 前記ＳＰＭがメラノサイトの増殖及び／又は生存を促進、又はメラノサイトの色素脱失を防止、及び／又はメラノサイトの非炎症性色素脱失において再色素化を促進する、請求項２１に記載の医薬組成物。
25. 前記医薬組成物が、経口投与、静脈内注射、皮下注射又は腹腔内注射による全身投与用として製剤化される、請求項２１に記載の医薬組成物。
26. ａ）リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマー、及び（ｂ）メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するためのそれらの使用説明書、を含む市販品パッケージ。
27. （ａ）リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを含む医薬組成物、及び（ｂ）メラノサイトの増殖及び／又は生存を促進するためのそれらの使用説明書、を含む市販品パッケージ。
28. 前記ＳＰＭが、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、及びレゾルビンＥ１のうちの一つ又は複数から選択される、請求項２６又は２７に記載の市販品パッケージ。
29. リポキシンＡ４を除く、一つ又は複数のＳＰＭ又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、若しくは水和塩、若しくはその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオ異性体、若しくはエナンチオマーを含む、メラノサイト増殖培地。
30. 前記ＳＰＭが、マレシン１、マレシン２、リポキシンＢ４、プロテクチンＤ１、レゾルビンＤ２、及びレゾルビンＥ１のうちの一つ又は複数から選択される、請求項２９に記載のメラノサイト増殖培地。
31. 前記ＳＰＭがマレシン１である、請求項２９又は３０に記載のメラノサイト増殖培地。
    
    

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