JP2024501552A - ロンゴザ種子の発酵抽出物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ロンゴザ種子の発酵抽出物、その調製方法、およびそれを含有する化粧品組成物に関する。ロンゴザ種子の発酵抽出物は、特に、表皮再生、皮膚の落屑、皮膚細胞の生命力および/または皮膚細胞の凝集力を促進および/または刺激し、および/または皮膚老化の徴候、特に堅さの損失、弾力の損失、密度の損失、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、皮膚のバリア機能の改変、皮膚の柔軟さの改変および/または顔色の均一性もしくは輝きの改変を予防および/または軽減する活性成分として使用され得る。

Description

本発明は、化粧品の分野に関し、特に、ロンゴザ種子(Longoza seed)の発酵抽出物、ならびにそれを得ることができる発酵方法、ロンゴザ種子の発酵抽出物を含む化粧品組成物、およびケラチン物質をケアおよび/またはメークアップするのための化粧方法に関する。
老化は、内因性要因(例えばストレス、ホルモンなど)および外因性要因(例えば温度、気候、UV照射、大気汚染、タバコの煙など)によって引き起こされ、さまざまな細胞機能の鈍化および/または改変を引き起こすことが知られている。皮膚の場合、老化はさまざまな臨床的徴候、特に表皮再生の低下、皮膚のバリアの改変、皮膚の堅さおよび弾力の損失、皮膚の厚さの減少、しわまたは小じわの出現、顔色の均一性の低下および/または皮膚の乾燥の出現によって現れる。
したがって、皮膚老化の徴候を予防および/または軽減することができ、特にストレスに対抗することを可能にし、および/または皮膚再生ならびに皮膚細胞の生命力を刺激および/または促進することを可能にする物質を発見することが常に必要とされている。
予想外なことに、出願人は、皮膚モデルに対するインビトロでのロンゴザ種子の発酵抽出物の「抗老化」効果を発見した。実際、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、非常に明確な基底組織と構造化された真皮表皮接合部を備え、著しく厚くなる皮膚の構造を有利に改善することができる。さらに、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、皮膚の機械的堅牢性だけでなく、皮膚の再生と弾力、究極的には、例えば、皮膚細胞の細胞完全性と恒常性を促進するエラフィン、デスモグレイン1、ロリクリン、トランスグルタミナーゼおよびZO-1に関与するさまざまなタンパク質の発現を有利に増加させることができる。したがって、これらの効果により、皮膚老化の徴候を予防および/または軽減するために、このロンゴザ種子の発酵抽出物の使用を構想することが可能になる。ロンゴザ種子の発酵抽出物は、特に、本発明によれば、表皮再生、皮膚の落屑、皮膚細胞の生命力および/または皮膚細胞の凝集力を促進および/または刺激すること、および/または皮膚老化の徴候、特に堅さの損失、弾力の損失、密度の損失、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、皮膚のバリア機能の改変、皮膚の柔軟さおよび/または顔色の均一性もしくは輝きの改変を予防および/または軽減することを目的とする活性成分として使用される。
本発明の第一の目的は、ロンゴザ種子の発酵抽出物であって、該発酵抽出物の乾燥抽出物と比較して0.05重量％～2重量％の含有量のキナ酸および5重量％～15重量％の含有量の酢酸、を含む発酵抽出物に関する。
本発明の別の目的は、ロンゴザ種子を発酵させる方法であって、
a)微生物のコンソーシアムを17℃～38℃の温度で1～10日間炭水化物を含む溶液中でインキュベートすることで、微生物の培養物を得る工程であって、
該コンソーシアムは、ラクトバチルス(Lactobacillus)属またはペジオコックス(Pediococcus)属に属する少なくとも一つの乳酸菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、スキゾサッカロマイセス(Schyzosaccharomyces)属またはトルラスポラ(Torulaspora)属に属する少なくとも一つの酵母、およびアセトバクテル(Acetobacter)属、グルコノバクテル(Gluconobacter)属またはコマガタエイバクテル(Komagataeibacter)属に属する少なくとも一つの酢酸菌を含む、工程；
b)アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子を粉砕することで、100μm～1mmの平均サイズの粒子で構成されている粉末を得る工程；
c)前記微生物の培養物を含む発酵培地に前記粉末を添加することで、発酵混合物を得る工程であって、
該発酵培地は、スクロース、グルコース、フラクトース、糖蜜またはこれらの一つまたはそれ以上の混合物から選択される炭水化物を含む、工程；
d)前記発酵混合物を25℃～35℃の温度で7～13日間インキュベートする工程；
e)前記発酵混合物を濾過することで、ロンゴザ種子の発酵抽出物を得る工程。
また、本発明の別の目的は、本発明による方法によって得られるロンゴザ種子の発酵抽出物に関する。
本発明はまた、生理学的に許容できる媒体中にロンゴザ種子の発酵抽出物を含む化粧品組成物に関する。
本発明の別の目的は、ケラチン物質、特に皮膚および/または唇をケアおよび/またはメークアップする化粧方法であって、該ケラチン物質に、本発明に記載の化粧品組成物を少なくとも一層で適用することを含む方法に関する。
最後に、本発明は、本発明によるロンゴザ種子の発酵抽出物の化粧品的使用であって、表皮再生、皮膚の落屑、皮膚細胞の生命力および/または皮膚細胞の凝集力を促進および/または刺激し、および/または皮膚老化の徴候、特に堅さの損失、弾力の損失、密度の損失、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、皮膚のバリア機能の改変、皮膚の柔軟さの改変および/または顔色の均一性もしくは輝きの改変を予防および/または軽減する活性成分としての使用に関する。
ロリクリンの発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
フィラグリンの発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
エラフィンの発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
カリクレイン5の発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
デスモグレイン1の発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
トランスグルタミナーゼの発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
ZO-1の発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
皮膚のモデルに対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果の組織学的分析
皮膚の弾性率に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
本発明の詳細な説明
アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ
マダガスカル原産のロンゴザ(Longoza)は、ショウガ科の植物であるアフラモムム・アングスチホリウム(Aframomum angustifolium)の果実である。この植物は、切っても焼いても成長するため、根の再生力が非常に優れていることを特徴とする。マダガスカルの森林火災で焼けた地面で再び生育する先駆植物の一つである。
本発明の文脈において、アフラモムム・アングスチホリウム(Aframomum angustifolium)またはロンゴザの発酵抽出物は、アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザの植物の種子から得られる。
本明細書では簡略化のために「ロンゴザ種子」という表現が使用されているが、この表現は、アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザの種子と互換性をもって意味していることは、明らかである。
ロンゴザ種子の発酵抽出物
ロンゴザ種子は、本発明の対象であるロンゴザ種子の発酵抽出物を生成するための発酵方法に使用される。
本明細書において明示されている通り、「発酵抽出物」という表現は、濾過の有無にかかわらず、すなわち発酵培地の微生物バイオマスの有り無しの両方の、発酵を伴う発酵方法から得られる産物を意味し、、ならびに追加の工程、例えば配合工程(例えば、防腐剤を添加する工程)を受けた任意の産物を意味する。
特定の実施態様によれば、本発明によるロンゴザ種子の発酵抽出物は、発酵乾燥抽出物、水および防腐剤を含む発酵抽出物の水溶液の形態である。水溶液の形態の発酵抽出物は、「乾燥物質」または発酵乾燥抽出物とは対照的に、本明細書では「原料」とも称される。
特定の実施態様によれば、発酵抽出物の水溶液は、原料(発酵抽出物の水溶液)の総重量と比較して0.5重量％～3重量％、特に1重量％～2重量％、特に1.2重量％～1.7重量％の範囲の活性材料の活性含有量(乾燥物質)の発酵抽出物、水および防腐剤、好ましくはグリセリンを含む。水含有量は、一般に、原料(発酵抽出物の水溶液)の総重量と比較して20重量％～40重量％、特に25重量％～30重量％、特に27重量％～29重量％であり、防腐剤含有量(例えばグリセリン)は、一般に、原料(発酵抽出物の水溶液)の総重量と比較して60重量％～80重量％、特に65重量％～75重量％の範囲、特に70重量％である。
したがって、本発明は、溶液形態のロンゴザ種子の発酵抽出物であって、1重量％～2重量％のロンゴザ種子の活性材料の発酵抽出物、65重量％～75重量％のグリセリンおよび25重量％～30重量％の水を含む発酵抽出物に関する。
好ましくは、発酵抽出物の水溶液(以下に示す特徴付けでは「原料」とも称される)は、原料(発酵抽出物の水溶液)の総重量と比較して1.2％～1.65％の活性材料(乾燥物質)の発酵抽出物、70重量％のグリセリンおよび28.35％～28.8％の水を含む。特定の実施態様によれば、発酵抽出物の水溶液(以下に示す特徴付けでは「原料」とも称される)は、1.2％～1.35％の発酵抽出物の活性材料(乾燥物質)、70％のグリセリンおよび28.65％～28.8％の水を含む。別の特定の実施態様によれば、発酵抽出物の水溶液(以下に示す特徴付けでは「原料」とも称される)は、原料(発酵抽出物の水溶液)の総重量と比較して1.35％～1.65％の活性材料(乾燥物質)の発酵抽出物、70％のグリセリンおよび28.35％～28.65％の水を含む。
特定の実施態様によれば、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、発酵抽出物の乾燥抽出物(乾燥物質)の重量と比較して0.005重量％を超える、好ましくは0.005重量％～10重量％の含有量のキナ酸、および0.5重量％を超える、好ましくは0.5重量％～25重量％の含有量の酢酸を有する。好ましくは、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して0.01重量％～5重量％、より好ましくは0.05重量％～2重量％の含有量のキナ酸を有する。好ましくは、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して1重量％～20重量％、より好ましくは5重量％～15重量％の含有量の酢酸を有する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、他の有機酸、例えばクエン酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸およびコハク酸を含むことができる。また、ロンゴザ種子の発酵抽出物としては以下のものがある:
-クエン酸であって、発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して0.01重量％～5重量％、好ましくは0.05重量％～2重量％、好ましくは0.1重量％～1重量％、さらにより好ましくは0.2重量％～0.4重量％の含有量のクエン酸、
-グルコン酸であって、発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して0.5重量％を超える、好ましくは0.5重量％～25重量％、より好ましくは1重量％～20重量％、さらにより好ましくは1重量％～15重量％の含有量のグルコン酸、
-乳酸であって、発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して0.001重量％～10重量％、好ましくは0.005重量％～5重量％、より好ましくは0.01重量％～2重量％、より好ましくは0.01重量％～1.5重量％の含有量の乳酸、
-リンゴ酸であって、発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して0.001重量％～5重量％、好ましくは0.005重量％～1重量％、より好ましくは0.008重量％～0.5重量％の含有量のリンゴ酸、および/または
-コハク酸であって、発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して0.001重量％～5重量％、好ましくは0.005重量％～1重量％、より好ましくは0.01重量％～0.05重量％の含有量のコハク酸。
好ましくは、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、グルクロン酸またはプロピオン酸を含まない。
ロンゴザ種子の発酵抽出物はまた、一つまたはそれ以上の防腐剤を含む。用語「防腐剤」とは、抽出物の組成物またはそれを含む化粧品を物理的、化学的および/または微生物性改変から保護する目的を有する化合物を意味する。好ましくは、少なくとも一つの防腐剤は、ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、安息香酸ナトリウムおよびソルビン酸カリウムから選択され、より好ましくはグリセリンである。発酵抽出物は、特に、一つまたはそれ以上の防腐剤を総重量と比較して60重量％～80重量％、好ましくは65重量％～75重量％、より好ましくは70重量％の最終濃度で含み、好ましくは、ブチレングリコール、グリセリンおよびプロピレングリコールから選択される上記の少なくとも一つの防腐剤を含む。
発酵方法
このロンゴザ種子の発酵抽出物は、以下の工程を含む発酵方法によって得られる:
a)微生物のコンソーシアムを、17～38℃の温度で炭水化物および任意にまた茶葉の水性抽出物を含む溶液中でインキュベートすることで、微生物の培養物を得る工程；
b)アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザの種子を粉砕することで、微細な粉末を得る工程；
c)微生物の培養物および炭水化物を含む発酵培地に前記粉末を添加することで、発酵混合物を得る工程；
c)前記発酵混合物を12～42℃の温度で2～20日間インキュベートする工程；
d)前記発酵混合物を濾過することで、ロンゴザ種子の発酵抽出物を得る工程；および、任意に、
e)少なくとも一つの防腐剤を添加する工程。
用語「発酵方法」とは、本明細書で定義される微生物コンソーシアムを、炭水化物を含む培地中で培養し、それらの増殖を可能にすることによって、ロンゴザ種子の発酵抽出物を得ることができる方法を意味する。発酵は、不連続培養条件(「バッチ」)、連続培養条件、または連続/不連続条件(「フェドバッチ」)下で行うことができる。発酵は、好気的に、微好気的に、および/または嫌気的に行うことができる。
用語「微生物コンソーシアム」とは、安定かつ再現可能な方法で共存できる少なくとも3種の微生物の集合体を意味する。
有利には、微生物は相補的な活性を組み合わせることができる。非限定的な例として、第1の種による炭素源の使用または同化は、次に第2の種によって代謝され得る代謝産物を生成することができる。
本発明による微生物コンソーシアムは、
i)乳酸菌の群に属する少なくとも一つの微生物、
ii)酵母の群に属する少なくとも一つの微生物、および
iii)酢酸菌の群に属する少なくとも一つの微生物、
を含む。
好ましくは、乳酸菌の群に属する少なくとも一つの微生物は、ラクトバシラセアエ(Lactobacillaceae)科のラクトバシラス(Lactobacillales)目の微生物、特にラクトバチルス(Lactobacillus)属およびペジオコックス(Pediococcus)属に属する微生物、例えばラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)および/またはラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、より好ましくはL.プランタルム(L. plantarum)である。
好ましくは、酵母の群に属する少なくとも一つの微生物は、サッカロミセタセアエ(Saccharomycetaceae)科のサッカロミセタレス(Saccharomycetales)目の微生物、またはスキゾサッカロミセタセアエ(SchyzoSaccharomycetaceae)科のスキゾサッカロミセタレス(SchyzoSaccharomycetales)目の微生物、特に、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、スキゾサッカロマイセス(Schyzosaccharomyces)属またはトルラスポラ(Torulaspora)属に属する微生物である。
好ましくは、酵母の群に属する少なくとも一つの微生物は、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、トルラスポラ・デルブルエッキイ(Torulaspora delbrueckii)、サッカロマイセス・ボウラルジイ(Saccharomyces boulardii)および/またはスキゾサッカロマイセス・ポンブ(Schyzosaccharomyces pombe)である。
好ましくは、酢酸菌の群に属する少なくとも一つの微生物は、アセトバクテラセアエ(Acetobacteraceae)科のロドスピリラレス(Rhodospirillales)目に属する微生物、特に、アセトバクテル(Acetobacter)属、グルコノバクテル(Gluconobacter)属およびコマガタエイバクテル(Komagataeibacter)属(グルコンアセトバクテル(Gluconacetobacter)と称される)に属する微生物である。酢酸菌は、酸度レベル4％～5％のリンゴ酢または低温殺菌されていないワイン、好ましくは欧州連合の定義に従って「有機農業」と表示された市販のリンゴ酢に由来するものであってもよい。好ましくは、コンソーシアムへの酢酸細菌の添加は、他の種の微生物を含む組成物に一定分量の酢を直接添加することによって行われる。酢の中には、主要な酢酸菌と並んで、複雑な自然固有の細菌叢も存在し、その一部は添加された微生物と共生することができる。コンソーシアムを形成する微生物の集合体の共生成長が病原種を含む望ましくない種の成長を防ぐのと同じ方法で、コンソーシアムの設立中に別の部分も減少する。
好ましい実施態様によれば、前記コンソーシアムは、以下のものを含む：
-ラクトバチルス(Lactobacillus)属またはペジオコックス(Pediococcus)属に属する少なくとも一つの乳酸菌であって、より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)およびラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)から選択される少なくとも一つの乳酸菌、
-サッカロマイセス(Saccharomyces)属、スキゾサッカロマイセス(Schyzosaccharomyces)属またはトルラスポラ(Torulaspora)属に属する少なくとも一つの酵母であって、より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ボウラルジイ(Saccharomyces boulardii)、スキゾサッカロマイセス・ポンブ(Schyzosaccharomyces pombe)およびトルラスポラ・デルブルエッキイ(Torulaspora delbrueckii)から選択される少なくとも一つの酵母、および
-リンゴ酢またはワイン酢に由来する少なくとも一つの酢酸菌であって、好ましくは、アセトバクテル(Acetobacter)属、グルコノバクテル(Gluconobacter)属またはコマガタエイバクテル(Komagataeibacter)に属する少なくとも一つの酢酸菌。
工程a):微生物の培養物の調製
この方法の第1の工程ａ)において、微生物の培養物(上記の微生物を含むコンソーシアムとも称される)が調製される。この工程は、安定でバランスの取れたコンソーシアムを確立しながら、微生物を有利に活性化して増殖させることができる。この工程中、炭水化物を含む溶液(別名「栄養培地」とも称される)に、コンソーシアム中に存在する様々な微生物を、および任意に茶葉の水性抽出物も導入されることで、微生物懸濁液を生成する。次に、懸濁液を1～21日間インキュベートすることで、微生物の培養物(コンソーシアムとも称される)を調製する。
前記の溶液は、少なくとも一つの炭水化物、一般的には一つまたはそれ以上の単糖類または二糖類を含む。これは、純粋な糖、例えばスクロース、グルコースまたはフルクトースであってもよく、変換または同時生成された産物、例えば糖蜜などのであってもよい。また、好ましい実施態様によれば、溶液は、スクロース、グルコースもしくはフルクトース、糖蜜、またはこれらの一つまたはそれ以上の混合物から選択される炭水化物を含む。炭水化物は、好ましくは、スクロース、またはグルコースおよびフルクトースの混合物である。好ましくは、少なくとも一つの炭水化物は、溶液の20g/l～100g/l、好ましくは50～95g/lの濃度で存在する。好ましくは、栄養培地は、スクロース、またはグルコースおよびフルクトースの混合物を50g/lの濃度で含む。
特定の実施態様によれば、前記の溶液は、茶葉(Camellia sinensis)の水性抽出物をさらに含む。好ましくは、前記水性抽出物は、茶葉、好ましくは紅茶葉の浸出によって得られる。好ましくは、前記茶葉の水性抽出物は、2g/l～50g/lの茶葉、より好ましくは5g/l～10g/lの茶葉を用いて調製された紅茶の浸出液であり得る。
茶は、70℃～90℃の温度で10分～60分間水に浸した乾燥葉を加えることによって調製される。好ましくは、5g/l～10g/lの茶葉を使用し、80℃で15分間浸出する。浸出液は葉と一緒にそのまま使用することもできるが、水相を濾過するのがより便利である。
微生物は、乾燥形態および/または湿潤形態で栄養培地に導入することができ；接種レベルは、特に、溶液あたり103CFU/gおよび105CFU/gであり得る。次に、微生物懸濁液は、12℃～45℃、好ましくは25℃～35℃、より好ましくは25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃または35℃、さらにより好ましくは26℃でインキュベートすることができる。特に有利な実施態様によれば、インキュベーションは、無菌状態を確報する必要なしに、開放反応器内で行われる。
懸濁液は、1～21日間、好ましくは1～10日間、より好ましくは3～4日間、さらにより好ましくは3日間または4日間インキュベートすることができる。インキュベーション期間の終了時には、懸濁液中の総細菌叢は104および107CFU/gである。
このようにして得られたコンソーシアムは、水性培地中でロンゴザ種子などの天然基質と反応することができる。有利には、これは、ロンゴザ種子の抽出発酵を対象とすることで、それに含まれる多種多様な化合物の利用、場合によっては変換を行う
工程b):ロンゴザ種子の調製
工程b)において、ロンゴザ種子を微細な粉末が得られるまで粉砕する。この粉末の粒子は、有利には、0.01～1mm、好ましくは100μm～1mm、より好ましくは250～500μｍ、さらにより好ましくは500μｍの平均サイズを有する。種子は生であることが好ましい。種子は、粉砕する前に乾燥させることが好ましい。
工程b)は、工程a)の前、同時、または後に同様に行われ得る。
工程c):発酵混合物の調製
この方法の工程c)において、工程ａ)で得られた微生物の培養物および炭水化物を含む発酵培地に、工程b)で得られたロンゴザ種子の粉末を添加することで、発酵混合物を得る。
微生物の培養物は発酵培地に、好ましくは発酵培地当たり102CFU/g～104CFU/gの割合で添加される。好ましくは、微生物の培養物は発酵培地に、発酵培地の重量と比較して0.5重量％～15重量％、好ましくは0.75重量％～10重量％、より好ましくは5％の濃度で添加される。
粉末形態のロンゴザ種子は発酵培地に、発酵培地1リットル当たり種子1～75g(g/L)、好ましくは10～60g/L、より好ましくは12～50g/L、さらにより好ましくは12g/Lまたは50g/Lの濃度で添加されることが好ましい。換言すれば、粉末形態のロンゴザ種子は発酵培地に、発酵培地の総体積と比較して0.1重量％～7.5重量％、好ましくは1重量％～6重量％、より好ましくは1.2重量％～5重量％、さらにより好ましくは1.2重量％～5重量％の濃度で添加される。
発酵培地はまた、好ましくは、スクロース、グルコース、フルクトース、糖蜜またはこれらの一つまたはそれ以上の混合物から選択される炭水化物を含む。
特定の実施態様によれば、溶液は、上述したように、茶葉の水性抽出物を含むことができる。好ましくは、該水性抽出物は、茶葉、好ましくは紅茶葉の浸出によって得られる。
発酵培地への炭水化物の溶解を促進するために、発酵培地を炭水化物の添加前または後に、例えば25℃～90℃、好ましくは35℃の温度で加熱され得る。好ましくは、発酵培地を加熱する場合、微生物の培養物を添加する前に、または培養物の添加後の場合には45℃またはそれ以下、好ましくは35℃またはそれ以下の温度で行われる。
工程d):インキュベーション
この方法の次の工程d)において、工程c)で得られた発酵混合物をインキュベートすることで、ロンゴザ種子の発酵を確報する。
前記インキュベーションは、12℃～45℃、好ましくは25℃～35℃、より好ましくは25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃または35℃の温度で、さらにより好ましくは26℃で行われる。前記インキュベーションは、2～20日間、好ましくは7～13日間、より好ましくは7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間または13日間、さらにより好ましくは10日間の期間行われる。
特定の態様によれば、前記インキュベーションは、無菌状態を確保する必要なしに、開放型反応器内で行われる。特定の態様によれば、前記インキュベーションは、20％～60％、好ましくは30％～50％、より好ましくは40％の湿度レベルで行われる。
工程e):濾過
次に、発酵混合物は、工程e)中に濾過される。ここで、用語「濾過」とは、固体画分と液体画分とを分離する工程を意味す。固体画分は、特に、残りのロンゴザ種子および/または微生物を含むことができる。有利には、濾過は、混合物中に存在するすべての微生物を除去することで、ロンゴザ種子の無菌発酵抽出物を得ることができる。濾過は、一つまたはそれ以上の篩および/またはフィルターを用いて行うことができる。また、一実施態様によれば、工程e)は、一つまたはそれ以上の濾過工程に相当し、好ましくは少なくとも一つの篩い分け工程および/または少なくとも一つの滅菌濾過工程を含む。好ましくは、工程e)は、篩い分け工程および滅菌濾過工程を含む。好ましくは、滅菌濾過は、0.1μｍ～0.2μｍ、好ましくは0.2μｍの平均孔径を有するフィルターで行われる。有利には、篩い分けは粉末状の破片を除去することができる。有利なことに、滅菌濾過により、細胞破片を迅速かつ安価に除去できる。好ましくは、フィルターの少なくとも一つはセルロースフィルターである。
工程f):濃縮および/または配合(任意に)
上記の方法により、ロンゴザ種子の清澄な発酵抽出物を得ることができる。しかしながら、場合によっては、例えば濃縮または配合のために、一つまたはそれ以上の追加の工程を行うことが有利な場合がある。したがって、本発明による方法は、工程e)の後に、濃縮または配合する少なくとも一つの追加の工程をさらに含むことができる。
特定の実施態様において、本発明による方法は、濾過工程f)の後に、特に組成物を特定の配合物に調整することを目的とする一つまたはそれ以上の以下の工程をさらに含む：
-濃縮工程；および/または
-配合工程。
上記で特定された各任意の工程は、方法の固有の追加工程として、または一つまたはそれ以上の他の任意の工程と組み合わせて存在することができる。発酵方法は、好ましくは、ロンゴザ種子の発酵抽出物に少なくとも一つの防腐剤を添加する工程f)を含む。前記防腐剤は、好ましくは、ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、安息香酸ナトリウムおよびソルビン酸カリウムから選択され、より好ましくは、グリセリンである。場合によっては、ロンゴザ種子の発酵抽出物に少なくとも二つの防腐剤が添加され得る。防腐剤は、好ましくは、工程f)のロンゴザ種子の発酵抽出物に、溶液形態の抽出物の総重量と比較して50重量％～80重量％、好ましくは65重量％～75重量％、より好ましくは70重量％の最終濃度で添加される。防腐剤が工程e)のロンゴザ種子の発酵抽出物に50～80％の最終濃度で添加される場合、前記防腐剤は、ブチレングリコール、グリセリンおよびプロピレングリコールから選択される。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、濾過工程e)の終了時、または工程e)の後に追加の工程が存在する場合には該他の工程の終了時に、好ましくは約4℃(4±2℃)および/または暗所に維持される。この方法が少なくとも一つの防腐剤の添加を含む場合、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、好ましくは、環境温度で維持される。
ロンゴザ種子の発酵抽出物には、国際命名法INCI：「水、グリセリン、アフラモムム・アングスチホリウム種子抽出物、ラクトバチルス(Lactobacillus)発酵溶解物、酵母発酵抽出物」で参照番号が与えられている。この製品は、特に、水/グリセリン混合物中に1.2重量％～1.65重量％のロンゴザ種子の発酵抽出物の乾燥抽出物を含有する。
化粧品組成物
驚くべきことに、本発明者らは、ロンゴザ種子の発酵抽出物が、インビトロで皮膚に有益な効果、特に線維芽細胞の数および/または密度の増加、ならびに皮膚の機械的堅牢性、皮膚の再生、皮膚の弾力に関与する様々なタンパク質、例えばエラフィン、デスモグレイン1およびロリクリンの発現を増加させることを確認した。したがって、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、年齢および/またはストレスに関連する皮膚老化の徴候、特に堅さおよび/または弾力の損失および皮膚のバリア機能の改変に対抗することができる。
本発明によれば、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、所望の効果を得るのに有効な量で使用される。それはそのまま使用されてもよく、あるいはケラチン物質への局所適用に適した化粧品組成物に有利に包含されてもよい。
特に、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、そのまま使用されるか、または化粧品組成物中に存在する。
また、本発明の別の目的は、生理学的に許容される媒体中に、本発明によるロンゴザ種子の発酵抽出物を含む化粧品組成物に関する。
用語「化粧品組成物」とは、人体の表面部分、より具体的にはケラチン物質、特にヒトの皮膚および/または唇に接触して配置され得る、化粧目的、すなわち美的目的のための任意の組成物を意味する。
用語「生理学的に許容できる媒体」とは、毒性、不適合性、不安定性および/またはアレルギー性反応の危険性がなく、ケラチン物質と接触させる局所使用に適した任意の賦形剤を意味する。
本発明による用語「ケラチン物質」とは、皮膚および/またはその付属器官、より具体的にはヒトの皮膚および/または唇を意味する。特に、顔および/または首および/または体の皮膚、および唇に関与するものである。
本発明によるケラチン物質は、特に健康なケラチン物質(「健康な」対象)、すなわち、病態(病理的に影響された「不健康」な対象)の一部である疾患または障害を示さないものである。説明の残りの部分では、健康な皮膚および/または唇、あるいは皮膚および/または唇を交互に参照する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は本発明の組成物中に、該組成物の総重量と比較して0.0001重量％～5重量％、好ましくは0.0005重量％～2重量％、より好ましくは0.001重量％～1重量％の範囲のレベルの原料(上記の方法によって得られた発酵抽出物溶液)で存在する。したがって、ロンゴザ種子の発酵抽出物は本発明の組成物中に、該組成物の総重量と比較して0.0000012重量％～0.0825重量％、好ましくは0.000006重量％～0.033重量％、より好ましくは0.000012重量％～0.0165重量％の範囲のレベルの活性材料(ロンゴザ種子発酵抽出物)で存在する。
本発明の組成物において有利に使用される追加成分は、該組成物の総重量と比較して0.0001重量％～10重量％、好ましくは0.001重量％～5重量％の範囲のレベルの(減少)で存在することができる。
生理学的に許容できる媒体は、一般に、前記組成物の総重量と比較して1～99重量％を示す。本発明による組成物の生理学的に許容できる媒体は、水および、必要に応じて、先に定義したような防腐剤を含む。
特定の実施態様において、本発明によるロンゴザ種子の発酵抽出物を含む前記化粧品組成物は、ケラチン物質、特に皮膚および/または唇、特に顔および/または首の皮膚をケアおよび/またはメークアップするための組成物である。
本発明の化粧品組成物は、一般に、局所適用のための組成物を得る目的で、ロンゴザ種子の発酵抽出物および生理学的に許容できる媒体、当業者に知られているものからの一つまたはそれ以上の化粧品的に許容できる賦形剤をさらに含み、例えば、乳剤、クリーム、ポマード、油中水型もしくは水中油型エマルジョン、軟膏、スティック(stick)、ゲル、ローション、セラム(serum)または粉末の形態である。
本発明の化粧品組成物はまた、パッチまたはマスクの形態、特に濃厚なクリームの形態のマスク、またはロンゴザ種子の発酵抽出物またはそれを含む組成物が含浸されたセルロースマスクの形態で存在することもできる。
好ましい実施態様において、前記組成物は、クリーム、エマルジョン、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、ローション、またはセラム(serum)の形態である。組成物がエマルジョンの形態である場合、該エマルジョンは、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョンまたは複合エマルジョンであり得る。
本発明の化粧品組成物は、ケラチン物質、特に皮膚および/または唇、特に、顔および/または首の皮膚への局所適用に適したガレヌス形態の組成物であって、ロンゴザ種子の発酵抽出物および、抗酸化剤、香料s、ビタミン、濃厚剤、皮膚軟化剤、保湿剤、抗老化剤、リフティング剤、緊張化剤(tensing agent)、膨化剤(plumping agent)、無痛化剤、抗汚染剤、光沢剤または脱色素剤、増量剤、真珠層顔料(nacres)およびこれらの混合物から選択される少なくとも一つの化粧品成分を含む。
また、本発明の好ましい目的によれば、化粧品組成物は、抗酸化剤、皮膚軟化剤、保湿剤、抗老化剤およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一つの化粧品補助剤(cosmetic adjuvant)をさらに含むことができる。
組成物の性質に従って、一つまたはそれ以上の化粧品的に許容できる賦形剤は、乳化剤、ポリマー、界面活性剤、レオロジー剤、電解質、pH調整剤、抗酸化剤、防腐剤、染料およびこれらの混合物から選択される。
特定の例として、前記化粧品組成物は、親水性ゲル化剤、抗酸化剤、防腐剤およびこれらの混合物を含み得る。
化粧方法
本発明の別の目的は、ケラチン物質、特に皮膚および/または唇、特に顔および/または首の皮膚をケアおよび/またはメークアップするのための化粧方法であって、前記ケラチン物質に、本発明に記載のロンゴザ種子の発酵抽出物、またはそれを含む化粧品組成物を少なくとも一層で局所適用することを含む方法である。
本発明の化粧方法は、特に、表皮再生、皮膚の落屑、皮膚細胞の生命力および/または皮膚細胞の凝集力を促進および/または刺激すること、および/または皮膚老化の徴候、特に堅さの損失、弾力の損失、密度の損失、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、皮膚のバリア機能の改変、皮膚の柔軟さの改変および/または顔色の均一性もしくは輝きの改変を予防および/または軽減することを目的とする。
用語「表皮再生を促進および/または刺激する」とは、ロンゴザ種子の発酵抽出物によりケラチン生成細胞の分化を促進することを目的とすることを意味する。
用語「皮膚の落屑を促進および/または刺激する」とは、特に、ロンゴザ種子の発酵抽出物により、皮膚の細胞および組織、特に皮膚および/または唇の再生および発達を促進することを目的とすることを意味する。
用語「皮膚細胞の生命力を促進および/または刺激する」とは、特に、ロンゴザ種子の発酵抽出物により、皮膚の一般的な状態、その輝きを促進することを目的とすることを意味する。
用語「皮膚老化の徴候を予防および/または軽減する」とは、特に、ロンゴザ種子の発酵抽出物により、皮膚のの損失、皮膚の弾力の損失、皮膚の密度の損失、皮膚の乾燥、柔軟さの損失および/またはしわおよび/または小じわの出現を軽減および/または遅延することを目的とすることを意味する。
用語「顔色の均一性または輝きの改変を予防および/または軽減する」とは、特に、ロンゴザ種子の発酵抽出物により、皮膚の欠陥または微細凹凸(microrelief)の出現、環状の曇ってくすんだおよび/または不均一な顔色を軽減および/または遅延することを目的とすることを意味する。
用語「皮膚のバリア機能の改変を予防および/または軽減する」とは、特に、ロンゴザ種子の発酵抽出物により、例えば、細胞間および/または細胞と細胞外マトリックス間の相互作用の変化に関連しており、皮膚のバリアのさまざまな機能(例えば、機械的、水分、抗酸化物剤、機能など)の改変を引き起こすことができる、皮膚の完全性の変化を軽減および/または遅延することを目的とすることを意味する。
特定の実施態様によれば、本発明による前記ロンゴザ種子の発酵抽出物、またはそれを含む前記化粧品組成物は、老化した皮膚、または老化の徴候を示している皮膚、および/またはストレスにさらされた皮膚、好ましくは老化した皮膚、または老化の徴候を示している皮膚に適用される。
用語「ストレスにさらされた皮膚」とは、皮膚が内因性または外因性のストレス、特に非病理学的で見苦しい皮膚反応を誘発する可能性のある物理的または化学的ストレスにさらされたこと、たとえば、皮膚が目に見えて疲れている、および/または刺激に対して敏感になっていることを意味する。
本発明の組成物が適用される皮膚および唇は健康であり、すなわち、病態(病理学的影響を受けた「不健康な」対象)の一部である疾患または障害を示さない。
有利には、本発明の化粧方法に関連して使用されるロンゴザ種子の発酵抽出物を含む組成物は、上記のものである。
ロンゴザ種子の発酵抽出物の使用
本発明の別の目的は、ケラチン物質、特に皮膚および/または唇、特に顔および/または首の皮膚への局所適用のための、本発明によるロンゴザ種子の発酵抽出物の化粧品的使用であって、表皮再生、皮膚の落屑、皮膚細胞の生命力および/または皮膚細胞の凝集力を促進および/または刺激すること、および/または皮膚老化の徴候、特に堅さの損失、弾力の損失、密度の損失、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、皮膚のバリア機能の改変、皮膚の柔軟さの改変および/または顔色の均一性もしくは輝きの改変を予防および/または軽減することを目的とする化粧品成分としての使用に関する。
本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。百分率は、特に断らない限り、組成物の総重量と比較した原料の重量によって表される。
実施例1:ロンゴザ種子を発酵させる方法
材料および方法
微生物コンソーシアム
コンソーシアムを構成する微生物は、
-ラクトバチルス(Lactobacillus)属またはペジオコックス(Pediococcus)属に属する少なくとも一つの乳酸菌、
-サッカロマイセス(Saccharomyces)属、スキゾサッカロマイセス(Schyzosaccharomyces)属またはトルラスポラ(Torulaspora)属に属する少なくとも一つの 酵母、および
-アセトバクテル(Acetobacter)属、グルコノバクテル(Gluconobacter)属またはコマガタエイバクテル(Komagataeibacter)属に属する少なくとも一つの酢酸菌、
を含む。
ロンゴザの種子の調製
ロンゴザの生の種子を粉砕することで、約250～500μmの平均サイズの粒子で構成される粉末を得る。
栄養培地の調製
茶を、5g/l～10g/lの茶葉を70～90℃で10～60分間浸出して調製する。次に、スクロースを20g/l～100g/l、一般に50g/lの濃度で水相に溶解する。スクロースは、特にグルコースおよびフルクトースの混合物で置き換えることができる。
発酵方法
ロンゴザ種子の発酵は、以下の工程を含む方法によって行った:
a)微生物コンソーシアムを、26℃で3～4日間炭水化物および紅茶葉の水性抽出物を含む溶液(別称で「栄養培地」と称さる)中でインキュベートすることで、培養物を得る工程；
b)ロンゴザ種子を粉砕することで、上記の微細な粉末を得る工程；
c)脱塩素水および炭水化物を含む発酵培地に、以下のものを添加することで、発酵混合物工程:
-前記発酵培地1リットルと比較して1.2重量％または5重量％の濃度のロンゴザ種子の粉末、および
-前記発酵培地の重量と比較して5重量％の濃度の、工程a)で得られた培養物
d)工程c)で得られた発酵混合物を、26℃で10日間発酵槽中でインキュベートする工程；
e)前記発酵混合物を、粗末な篩い分けし、次いで0.2μmの平均孔径を有するセルロースフィルターで濾過することで、ロンゴザ種子の発酵抽出物を得る工程、および
f)前記ロンゴザ種子の発酵抽出物にグリセリンを総重量と比較して70重量％の最終濃度で添加する工程。
結果
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、1.2重量％～1.35重量％の濃度の発酵ロンゴザ種子の活性材料、70％のグリセリンおよび28.65～28.8％の水、の溶液の形態で得られる。
あるいは、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、1.35重量％～1.65重量％の濃度の発酵ロンゴザ種子、70％のグリセリンおよび28.35～28.65％の水、の溶液の形態で得られる。
工程c)において、発酵培地1リットルと比較して1.2重量％(すなわち、12g/L)の濃度のロンゴザ種子から得られたロンゴザ種子の発酵抽出物を、以下、抽出物「L3」と称する。
工程c)において、発酵培地1リットルと比較して5重量％(すなわち、50g/L)の濃度のロンゴザ種子から得られたロンゴザ種子の発酵抽出物を、以下、抽出物「L2」と称する。
これらの抽出物の効果を以下の実施例で説明する。
実施例2:ロンゴザ種子の発酵抽出物の特徴づけ
材料および方法
HPLC分析による有機酸の定量化
アッセイは、Agilenet 1260 DAD MS HPLCで行った。
抽出物を0.02％で注入し、0.1％HCOOHで1/50に希釈する(1mLに20μLといった十分な量を秤量)
上記の取得方法におけるパラメータは次のとおりである：
注入用量：5μL
温度：30℃
カラム: Phenomenex Hydro-RP 150x4.6 mm 4μm(no.8)
溶媒:
定組成100％A: H2O＋0.1％ギ酸
流速: 0.400mL/min
分析時間：25分
NMR
遠心分配クロマトグラフィー(CPC)
ロンゴザ種子の発酵抽出物を凍結乾燥させることで、水の量を減少させるた。注入質量は約4gとした。
カラムの平衡化後、ロンゴザ種子の発酵抽出物を下相11ml＋上相6mlに溶解し、20mlのサンプルループを介してCPCカラム(303mLカラム、機器FCPE300(登録商標)(Rousselet Robatel Kromaton))に注入した。移動相を上昇モードで65分間ポンプした。モードセレクターバルブを10分間スイッチングすることによってカラムを押し出した。流速は20mL/分とし、カラムの回転速度は1300rpmとした。二相溶媒系は、酢酸エチル/アセトニトリル/水(3/3/4、v/v)に相当する。固定相は、二相溶媒系の下相(上昇モード)に相当し、移動相は二相溶媒系の上相に相当する。
20mlの画分を実験(溶出および押出し)を通して収集し、それらの薄層クロマトグラフィープロファイルに従って合わせた。このようにして、10個の画分が得られた。
主要な代謝産物の同定
各画分F1～F10の一定分量を700μLのDMSO-d6に溶解し、クライオプローブを備えたBruker Avance AVIII-600スペクトロメーター(Karlsruhe、Germany)で298Kで13C NMRによって分析した。スペクトルを処理した後、Natexploreが開発したコンピュータースクリプトを用いて、すべての113C NMRシグナルを自動的に収集し、一連の画分のスペクトルにグループ化した。得られたテーブルに階層群分析を適用した(PermutMatrix, 1.9.3, LIRMM, Montpellier, France)。得られた13C NMR化学シフトクラスターは、二次元マップ上の樹状図の形で表示した。代謝産物を同定するために、HCAによって得られた各13C NMR化学シフトクラスターを、構造と予測化学シフトを含む低分子量天然物用ACD/NMR Workbook Suite 2012(ACD/Labs、Ontario、Canada)データベース管理ソフトウェアの構造検索エンジンに手動で送信しました。脱複製プロセスの終了時にデータベースによって提案された分子構造を確認するために、同定されたと思われる化合物を含む画分に対して2D NMR実験(HSQC、HMBC、およびCOSY)を行った。
結果
この発酵方法により、ロンゴザの非発酵抽出物、例えば、100％水で抽出されたロンゴザの非発酵水性抽出物とは非常に異なる組成を有するロンゴザ種子の発酵抽出物が生成される。
特に、ロンゴザ種子の発酵抽出物は、以下の表1に示すように、様々な有機酸を含む。
表1:ロンゴザの(非発酵)水性抽出物と比較してアフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザの種子の発酵抽出物に存在する有機酸(乾燥抽出物1gに比較してmgで)
Figure 2024501552000001
実施例3:皮膚タンパク質の発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
皮膚のバリア機能、表皮の凝集力、皮膚の弾力および輝きのさまざまなタンパク質マーカーの発現に対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果を評価した。
材料および方法
NHKの培養物および処理
正常ヒトケラチン生成細胞(NHK)を、補足したEpilife培地中のTPP150フラスコに播種する。NHKをプレコンフルエンスでトリプシン処理し(0.05％トリプシン-EDTA、GIBCO-Invitrogen)、血清を含む培地で中和させる。次に、それらを96ウェルイメージングプレート(μ-プレート96ウェル、ibiTreat、Ibidi)にウェル当たり10,000個の細胞で播種する。
コンフルエンスで、NHKを、500μMのCaCl2を含む完全Epilife培地(0.2mL/ウェル)中のロンゴザ種子の発酵抽出物L2またはL3で処理する。L2および/またはL3抽出物は、0.02％および/または0.1％v/vの濃度で試験した。処理は3日間または5日間行ない、48時間後に培地を交換する。対照(未処理)条件では、培地を500μMのCaCl2を含む新しい培地に交換する。
細胞のマーキング
処理の終了時に、細胞をホルマリン(10％相互緩衝ホルマリン溶液、Sigma)で10分間固定し、次に、0.1％PBS-Triton溶液(Triton X-100、Sigma)で透過性にする。次に、それらを1％PBS/BSA(PBS：リン酸緩衝生理食塩水；BSA：ウシ血清アルブミン)で環境温度で30分間飽和させる。次に、1％PBS/BSA溶液を、1％PBS/BSAで希釈したマークした各タンパク質に対応する一次抗体溶液と置き換える(表2を参照)。プレートを4℃で一晩インキュベートした。
PBSで洗い流した後、細胞を、1/300での標的とする一次抗体と1/500でのDAPI(4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩、Invitrogen Molecular Probes)による、1％PBS/BSAで希釈した二次抗体溶液(抗ウサギまたは抗マウスヤギ抗体、InvitrogenのAlexa Fluor 568)で覆う。プレートを暗所、周囲温度で１時間インキュベートする。
PBS、続いて蒸留水で洗い流した後、PBSを各ウェルに1mLずつ添加する。画像を取得するまで、プレートを暗所で4℃に保持する。
表2:使用した一次抗体のサマリー
Figure 2024501552000002
HCSによる画像取得と分析
プレートを、Thermo Cellomicsの「ArrayScan XTi」でスキャンする。
取得条件：
検出：
DAPI:フィルターXF53_386_23
Alexa Fluor 568:フィルターXF53_572_15
解像度:1104 x 1104
レンズ:10x ドライ
画像数:ウェルあたり25枚
画像は、その発現に対応する標的タンパク質の赤いマーキングを検出するバイオの「スポット検出器」画像分析ソフトウェアを用いて分析した。測定ゾーンの表面は、画像の表面全体として定義される。細胞数は、青いマーキングを検出することによってコアをカウントすることによって測定する。
マーカーとその細胞発現に応じて、結果は次のように表現できる：
-検出されたマーキングの強度(閾値)/細胞数
-全領域におけるマーキングの強度/細胞数
スチューデント検定によって対照と処理試料の間で観察されたさまざまな比の有意性は、測定する(* p<0.05、** p<0.01)。
結果
3.1.ロリクリンの発現
ロリクリンは角質層で発現する構造タンパク質であり、皮膚のバリア機能に寄与する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、ロリクリンの発現を有意に増加させ、抽出物の濃度を増加させると用量効果が観察される(0.02％の濃度の抽出物L2では＋41％、0.1％の濃度の抽出物L2では＋57％)、p<0.01、図1を参照)。
3.2.フィラグリンの発現
ロリクリンと同様に、フィラグリンは皮膚のバリア機能に関与するタンパク質である。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、フィラグリンの発現を有意に増加させ、抽出物の濃度を増加させると用量効果が観察される(0.1％の濃度の抽出物L3では＋7.5％、0.1％の濃度の抽出物L2では＋17.8％、p<0.01、図2を参照)。
3.3.エラフィンの発現
エラフィンは、皮膚のバリア機能に関与するタンパク質である。また、エラスターゼの阻害作用もあることで、弾性繊維の劣化を予防する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、エラフィンの発現を有意に増加させ、抽出物の濃度が増加すると用量効果が観察される。実際、発現は、0.02％の濃度の抽出物L3では＋38.9％、0.1％の濃度の抽出物L3では＋52.6％増加した(p<0.05、図3を参照)。同様に、発現は、0.02％の濃度の抽出物L2では＋37％、0.1％の濃度の抽出物L2では＋45.8％増加した(p<0.05、図3を参照)。
3.4.カリクレイン5の発現
カリクレイン5は、皮膚の恒常性と落屑に関与するタンパク質である。皮膚の輝きにも貢献する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、カリクレイン5の発現を有意に増加させる(0.02％の濃度の抽出物L3では＋15.2％、0.1％の濃度の抽出物L3では＋11％、p<0.05、図4を参照)。
3.5.デスモグレイン1の発現
デスモグレイン1は、表皮の完全性にとって必須のタンパク質であり、細胞内接合部(デスモソーム)内の接着機能を通じて表皮の構造を与える。また、ケラチン生成細胞の分化も促進する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、デスモグレイン1の発現を有意に増加させる(0.02％の濃度の抽出物L3では＋30.4％、0.02％の濃度の抽出物L2では＋17％、p<0.01、図5を参照)。
3.6.トランスグルタミナーゼの発現
トランスグルタミナーゼは、表皮の角質層を形成するように構造タンパク質の架橋に関与する酵素である。したがって、皮膚のバリア機能に貢献する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、トランスグルタミナーゼの発現を有意に増加させる(0.1％の濃度の抽出物L2では＋73.8％、0.1％の濃度の抽出物L3では＋97.6％、p<0.01、図6を参照)。
3.7.ZO-1の発現
ZO-1は、皮膚の細胞間の密着接合部の形成に関与する細胞内タンパク質である。したがって、それは皮膚のバリア機能と完全性に貢献する。
ロンゴザ種子の発酵抽出物は、ZO-1の発現を有意に増加させる(0.1％の濃度の抽出物L2では＋25.8％、0.1％の濃度の抽出物L3では＋49.7％、p<0.01、図7を参照)。
結果
2つのロンゴザ種子の発酵抽出物L2およびL3について、特に皮膚のバリアに対する活性を測定するために、培養物中の正常ヒトケラチン生成細胞のモデルで表皮分化マーカーの発現を試験した。
抽出物は、角質層の構成に関与するエラフィン、またはデスモソーム接合部の構成成分であるデスモグレイン1などの皮膚のバリアのマーカーの発現にプラスの効果をもたらす。さらに、抽出物L3は、皮膚の恒常性と落屑に関与するカリクレイン5の発現を増加させる。
実施例4:皮膚モデルに対するロンゴザ種子の発酵抽出物の効果
皮膚の弾力、堅さおよび細胞密度に対する本発明によるロンゴザ種子の発酵抽出物の効果を、幹細胞が枯渇した皮膚モデルで評価した。
材料および方法
再構成されたバイオプリンティングした表皮幹細胞枯渇(ESC)皮膚モデルの確立
押し出しによる乳頭状および網状の真皮のバイオプリンティング
バイオインクの組成物に入っている粉末を、カルシウムを含まないDMEMに溶解し、37℃で一晩撹拌した。
翌日、コンフルエンスにある若いまたは老化の乳頭状/網状線維芽細胞をトリプシン処理してカウントした。調製したインク1ミリリットルあたり250,000個の線維芽細胞となるように、必要な量の細胞をサンプリングし、次に、遠心分離した。細胞ペレットを適切な容量のバイオインクに直接懸濁した。次に、バイオインク/細胞混合物を、20ゲージのカニューレに取り付けた無菌シリンジに移した。
プリンティングしたオブジェクトを、Slic3r(GNU Affero General Public License)およびRepetier(Hot-World GmbH & Co. KG)ソフトウェアを用いてモデル化した。乳頭状真皮層と網状真皮層を2段階で重ねてプリンティングした。「老化した」真皮と「若い」真皮をプリンティングした。
第1段階では、乳頭状線維芽細胞を含むインクを使用して、寸法1.5cm x 1.5cm x 0.2cmの立方体をプリンティングした。これらの対象物の高さは、2つのレイヤーを重ね合わせた層に相当する。この最初のプリンティングに続いて、寸法1.5cm x 1.5cm x 0.1cm(1層に相当)の立方体を最初の2層立方体の上にプリンティングした。次に、これらの構造をカルシウムとトロンビンの溶液中に1時間置くことで、バイオインクの重合と固定化が可能になった。生理食塩水緩衝液で3回洗い流した後、同等の真皮をMCF(LabSkin Creationsの内部調製物、線維芽細胞の培養に適した培地)で培養し、インキュベーター(37℃、5％ CO2)に置き、次に7日間培養し、選別されたケラチン生成細胞をその表面に播種した。培養培地は2日ごとに交換した。
培養中の初代ケラチン生成細胞に対するCD71マーカーよる磁気選別
まず、成体初代ケラチン生成細胞を、培養培地MCK(LabSkin Creationsの内部調製物、ケラチン生成細の培養に適した培地)中の培養フラスコ内で継代１で解凍した。1週間の増幅後、コンフルエンスで細胞をトリプシン処理し、次に、カウントした。これらの細胞はすべて、製造元の指示に従って磁気ビーズキットCD71 130-046-201(Miltenyi)を用いて選別した。
簡単に説明すると、ケラチン生成細胞を、細胞/ビーズ体積の定義された比率の磁気ビーズとともに＋4℃で15分間インキュベートした。次に、この混合物を遠心分離し、上清を除去することで、目的の細胞に結合しなかった磁気ビーズを除去した。ケラチン生成細胞のペレットを培養培地中に懸濁し、この目的のために用意した磁石に取り付けられた磁気カラム上を通過させた。カラムに保持されない表皮幹細胞が豊富な集団に相当する、表面マーカーCD71を発現していない細胞を含む陰性画分を、まず無菌チューブに採取した。
次に、カラムを磁気支持体から外して洗い流すことで、磁気ビーズに結合した表面マーカーCD71を発現する細胞(幹細胞枯渇画分)を回収することができた。細胞内で濃縮された画分と枯渇した画分をカウントすることで、CD71-/CD71＋比を計算した。
この抽出と並行して、同じ日に真皮に播種するために、以前に培養した包皮ケラチン生成細胞もトリプシン処理してカウントした。これらは「若い対照」を形成した。
バイオプリンティングした真皮上へのケラチン生成細胞CD71＋の播種
磁気選別を行い、さまざまな画分をカウントし、「若い」および「老化した」バイオプリンティング真皮の培養培地を除去した。
500,000個のケラチン生成細胞CD71＋に相当する量を、老化した真皮の表面に沈着させた。同じことを、参照として機能する「若い対照」真皮の表面に播種した包皮ケラチン生成細胞の懸濁液を用いて行った。
＋37℃で30分間接着させた後、培地を用いて真皮表皮集合体を沈めた。
真皮表皮集合体をMCK培地中で3日間培養することで、ケラチン生成細胞の増殖を可能にした。次に、それらを空気/液体界面で持ち上げることで、表皮の分化を開始した。この最終培養工程を1週間続くことで、多層ではあるが完全には成熟していない表皮を得た。
抽出物L2またはL3を培養培地に添加した。次に、培地を濾過することで、汚染の危険性を避けた。次に、培養の最後の５日間、抽出物を毎日細胞培養物に適用した(培養は35日目に停止した)。
試料を4％緩衝ホルマリン溶液(Alphapath, France)で固定し、パラフィンに包埋した。
ヘマトキシリン・フロキシン・サフランでの組織学的染色
5μMのパラフィン切片を調製した。パラフィンを除去して再水和した後、試料をヘマトキシリン・フロキシン・サフラン(HPS)で染色した。
パラフィンに包埋させた切片の免疫蛍光
抗インテグリンアルファ6マーキングを、厚さ5および20マイクロメートルの切片上に作成した。熱でアンマスキングした後、4％PBS/BSAで非特異的抗原部位をブロックする飽和工程を行う。次に、細胞を、インテグリンアルファ6抗原の1/10000での特異的一次抗体(ウサギモノクローナル抗体、Abcam)とともに一晩インキュベートし、次に1/1000に希釈した二次抗体Alexa-Fluor 568抗ウサギ(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)とともにインキュベートし、ヘキスト核染色(Thermo Fisher Scientific)を行った。一次抗体を含まない陰性対照も並行して作製した。
画像の取得
組織学的染色および免疫組織学的マーキングは、光学顕微鏡システム、Axio Observer D1/高解像度カメラAxiocam(Zeiss, The Pecq, France)を用いて観察した。画像は、ZEN pro 2012ソフトウェアを用いて取得し、「tif」形式(高解像度)で保存した。
原子間力顕微鏡(AFM)データの取得
使用のAFMは、落射蛍光顕微鏡(Leica DMi8)が取り付けられたResolve bioscope (Bruker)であり、相関研究(AFM画像/蛍光)を実行することを可能にする。
PeakForce(登録商標)QNM/Fast-フォースボリュームモードを使用した。選択したAFMプローブは、理論上の剛性定数が0.4N/m、曲率半径が<10nmであった。各使用前に、サファイア上でプローブの偏向感度を測定し、その剛性定数も熱ノイズ法を用いて校正した。AFMのレバーを、凍結切片上で実行した抗インテグリンアルファ6免疫マーキングにより見える真皮表皮接合部(EDJ)上に配置した。
完全なAFM分析は、水性条件(PBS 1X)下で対象ゾーン(EDJ)のフォースボリューム(force volume)を取得することから構成される。
取得に使用したパラメータは次のとおりである：
-フォース/ボリュームマトリックス:20μm x 20μm-64px2
-フォース曲線:力=20nN-ランプのサイズ=10μM
真皮のAFMイメージングには、フォース-ボリュームモードも使用した。以前と同じパラメータを使用した、断片のさまざまな領域へのフォースボリュームが必要であった。
定量分析：弾性率(Ea)の抽出
生のフォースカーブからのEaの定量化は、BioMeca Analysis(BioMeca)処理ソフトウェアを用いて行った。
各断片で得られた生のアプローチ曲線を処理して、EDJのEa(剛性)の正確な定量化を抽出した。ここでは、Sneddonの理論モデルを0～1μMの圧痕に適用した。さまざまなフォースマトリックスを用いて、各断片の真皮表皮接合部の弾力の変化を抽出した。統計分析:若い対照対老化枯渇した未処理のCSE:t検定、$$$ p<0.001；老化枯渇した未処理のCSE対0.05％または0.1％のL3で処理した老化枯渇したCSE:t検定、*** p<0.001。
結果
4.1.組織学的分析
ロンゴザ種子の発酵抽出物(0.05％または0.1％の濃度のL2またはL3)で処理すると、未処理の試料で観察されたものよりも多くの新たに合成された線維芽細胞の層を有する細胞化真皮を得ることができた。表皮の構造も改善された：非常に明確な基底組織と構造化されたEDJを備え、より厚く見えた。この区画の分化は抽出物の投与によって妨げられなかったが、それどころか、角質層は全ての条件下で存在していた。最後に、ロンゴザ種子の発酵抽出物L3は、0.1％の用量で真皮表皮接合部の下の線維芽細胞のより厚い層による用量効果を示すようである。
4.2.免疫マーキング
インテグリンアルファ-6の発現プロファイルの分析により、表皮幹細胞の集団を含む表皮の基底部分をより正確に研究することが可能にあった。ロンゴザ種子の発酵抽出物L3(0.05％または0.1％の濃度)で処理した再構成ESC枯渇皮膚では、インテグリンアルファ6の発現が大幅に増加し、真皮表皮接合部にしっかりと固定された表皮幹細胞のより大きな集団が明らかになった。このマーカーの発現レベルは、再構成「若い」皮膚の試料で観察されたレベルと同等、またはそれ以上に達する。
4.3.AFM
AFMによる各処理条件下で得られたEDJの弾力の分析により、上記の結果を確認することができた(図9を参照)。0.05％または0.1％の抽出物L3で処理すると、表皮幹細胞の集団が増加し、したがってEDJでは弾力の増加が測定され(0.05％のL3:＋48％、p<0.001；0.1％のL3:＋96％、p<0.001)、これは、これらの接合部がより剛性であることを示している。さらに、ロンゴザ種子の発酵抽出物は用量効果を示し、培養培地に適用される活性成分の濃度とともに弾力モジュールを増加させる。
また、ロンゴザ種子の発酵抽出物L3は、表皮の基底レベルの増殖性区画の増加を導入することにより、より硬く、より強力に固定されたEDJを得ることができるとともに、より厚く、より増殖性であるが満足な分化の表皮を得ることができる。
実施例5:化粧品配合物
実施例1で調製したようなロンゴザ種子の発酵抽出物を、化粧品における従来の配合方法に従って調製した、以下の例示的かつ非限定的な組成物に配合する。
5.1.ローションの形態の組成物
Figure 2024501552000003
この組成物は、皮膚、特に顔に適用すると、皮膚の堅さおよび/または弾力に対する有益な効果を伴う抗老化作用を提供する。
5.2.セラムの形態の組成物
Figure 2024501552000004
セラムを顔全体、特に老化の徴候が見られる部分に適用する。本発明によるロンゴザ種子の発酵抽出物を含むセラムにより、表皮の再生を促進し、より引き締まり、より均一な顔色の弾力性のあるゴム様皮膚を実現する。

Claims (13)

  1. アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物であって、
    -該発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して0.05重量％～2重量％の含有量のキナ酸；および
    -該発酵抽出物の乾燥抽出物の重量と比較して5重量％～15重量％の含有量の酢酸、
    を含む発酵抽出物。
  2. 液体形態であること、および少なくとも一つの防腐剤、好ましくはブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、安息香酸ナトリウムおよびソルビン酸カリウムから選択される少なくとも一つの防腐剤を含むこと、を特徴とする、請求項1に記載のアフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物。
  3. アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子を発酵させる方法であって、以下の工程を含む方法:
    a)微生物コンソーシアムを、17℃～38℃の温度で1～10日間炭水化物を含む溶液中でインキュベートすることで、微生物の培養物を得る工程であって、
    該コンソーシアムは、ラクトバチルス属またはペジオコックス属に属する少なくとも一つの乳酸菌、サッカロマイセス属、スキゾサッカロマイセス属またはトルラスポラ属に属する少なくとも一つの酵母、およびアセトバクテル属、グルコノバクテル属またはコマガタエイバクテル属に属する少なくとも一つの酢酸菌を含む、工程；
    b)アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子を粉砕することで、100μm～1mmの平均サイズの粒子で構成されている粉末を得る工程；
    c)前記微生物の培養物を含む発酵培地に前記粉末を添加することで、発酵混合物を得る工程であって、
    該発酵培地は、スクロース、グルコース、フラクトース、糖蜜またはこれらの一つまたはそれ以上の混合物から選択される炭水化物を含む、工程；
    d)前記発酵混合物を25℃～35℃の温度で7～13日間インキュベートする工程；
    e)前記発酵混合物を濾過することで、アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物を得る工程。
  4. 工程a)において、発酵培地1リットルあたりに、約60gまたはそれ以下の粉末、より好ましくは約50gまたはそれ以下の粉末を添加し、さらにより好ましくは約12g/Lまたは50g/Lの粉末を添加する、請求項3に記載の方法。
  5. 前記発酵培地が、茶葉の水性抽出物をさらに含む、請求項3または4に記載の方法。
  6. 請求項3～5のいずれか一項に記載の方法によって得あれる、アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物。
  7. 請求項1、2または6に記載のアフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物を生理学的に許容できる媒体中に含む化粧品組成物。
  8. アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物が、該組成物の総重量と比較して0.0000012重量％～0.0825重量％、好ましくは0.000006重量％～0.033重量％、より好ましくは0.000012重量％～0.0165重量％の百分率の活性材料(アフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物の乾燥物質)で存在することを特徴とする、請求項7に記載の化粧品組成物。
  9. 抗酸化剤、皮膚軟化剤、保湿剤、抗老化剤、香料およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一つの化粧品補助剤をさらに含むことを特徴とする、請求項7または8のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
  10. クリーム、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョンまたは複合エマルジョン、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、ローションまたはセラムの形態であることを特徴とする、請求項7～9のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
  11. ケラチン物質、特に皮膚および/または唇をケアおよび/またはメークアップするための化粧方法であって、前記ケラチン物質に、請求項7～10のいずれか一項に記載の化粧品組成物を少なくとも一層で局所適用することを含む、方法。
  12. 表皮再生、皮膚の落屑、皮膚細胞の生命力および/または皮膚細胞の凝集力を促進および/または刺激すること、および/または皮膚老化の徴候、特に堅さの損失、弾力の損失、密度の損失、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、皮膚のバリア機能の改変、皮膚の柔軟さの改変および/または顔色の均一性もしくは輝きの改変を予防および/または軽減するること、を目的とすることを特徴とする、請求項11に記載の化粧方法。
  13. 請求項1、2または6に記載のアフラモムム・アングスチホリウムまたはロンゴザ種子の発酵抽出物の化粧品的使用であって、表皮再生、皮膚の落屑、皮膚細胞の生命力および/または皮膚細胞の凝集力を促進および/または刺激し、および/または皮膚老化の徴候、特に堅さの損失、弾力の損失、密度の損失、しわおよび/または小じわの出現、皮膚の乾燥、皮膚のバリア機能の改変、皮膚の柔軟さの改変および/または顔色の均一性もしくは輝きの改変を予防および/または軽減する活性成分としての使用。
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