JP2023184306A - Ｅ－カドヘリンの発現の制御による美容方法、及びｅ－カドヘリン発現に基づきシミを予測する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｅ－カドヘリンと皮膚色との関係を解明し、皮膚における新たな美容方法の確立を目的とする。
【解決手段】シミとＥ－カドヘリン発現との関連性を見出し、皮膚ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を制御することを含む美容方法、ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を指標としたメラノサイト鎮静化剤のスクリーニング方法、及びＥ－カドヘリン発現を指標とした将来のシミ形成の予測方法を確立した。さらに、エイジツエキス、トウキンセンカエキス、キイチゴエキスが、Ｅ－カドヘリン発現を促進することを見出し、これらの成分を含むＥ－カドヘリン発現促進剤及びシミ改善剤を発明した。
【選択図】図１

Description

本発明は、特にシミの制御に関わる美容の技術分野に関する。より具体的に皮膚におけるＥ－カドヘリン発現を促進することによるシミの改善方法、皮膚におけるＥ－カドヘリンの発現に基づきシミを予測する方法、さらには皮膚細胞におけるＥ－カドヘリンの発現に基づく、シミ改善剤のスクリーニング方法に関する。

表皮を構成する細胞であるケラチノサイトでは、アドヘレンスジャンクション、タイトジャンクション、及びデスモソームの３つの細胞間接着機構により、強固に細胞間が接着することで、細胞外液の漏出や、微生物や生体外物質の侵入から生体を守っている。これらの細胞間接着機構のうち、アドヘレンスジャンクションとデスモソームに関与するタンパク質としてカドヘリンが知られている。カドヘリンは、細胞接着に関わる膜タンパク質である。カドヘリンはカドヘリンスーパーファミリーを構成し、現在まで約１００種類以上が知られている。カドヘリンスーパーファミリーは、クラシカルカドヘリンと、非クラシカルカドヘリンに大別されており、クラシカルカドヘリンは、さらにタイプＩとタイプＩＩに分けられる。デスモソームを構成するデスモソーマルカドヘリンは非クラシカルカドヘリンに分類されている。細胞の種類によって発現するカドヘリンの種類は異なっており、ケラチノサイトにおいて発現するカドヘリンとしてはＥ－カドヘリン及びＰ－カドヘリンが知られている。細胞接着は、細胞の増殖、分化、移動等に関与し、細胞の生理機能にも影響することが知られており、カドヘリンの発現変化と、皮膚の生理機能との関係が研究されている（特許文献１：特開２００４－３５９６３２号公報）。一方で細胞接着と皮膚色との関連についての報告は限られている。表皮に存在するメラノサイトは、メラニンを産生し、皮膚の色に関与する。紫外線照射により、メラノサイトが活性化し、皮膚の色が黒くなるとともに、シミの形成にも寄与している。

特開２００４－３５９６３２号公報

Ｅ－カドヘリンと皮膚色との関係を解明し、皮膚における新たな美容方法の確立を目的とする。

本発明者らが、Ｅ－カドヘリンと皮膚色との関係に着目し、鋭意研究を行った結果、シミとＥ－カドヘリン発現との関連性を見出し、本発明に至った。
そこで、本発明は以下に関する：
［１］ 皮膚ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を制御することを含む、美容方法。
［２］ 前記美容方法が、シミの改善を含む、項目１に記載の美容方法。
［３］ シミ部位において、Ｅ－カドヘリン発現を促進することを含む、項目１又は２に記載の美容方法。
［４］ Ｅ－カドヘリン発現の促進により、メラノサイトの停滞抑制、メラニン取り込み正常化、及びメラノサイト鎮静化からなる群から選ばれる少なくとも１の作用を発揮する、項目１～３のいずれか一項に記載の美容方法。
［５］ Ｅ－カドヘリン発現の促進が、Ｅ－カドヘリン発現促進剤を皮膚に適用することを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の美容方法。
［６］ Ｅ－カドヘリン発現促進剤は、エイジツエキス、トウキンセンカエキス、キイチゴエキスからなる群から選ばれる少なくとも１のエキスを含む、項目５に記載の美容方法。
［７］ ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を指標としたメラノサイト鎮静化剤のスクリーニング方法。
［８］以下の：
候補成分を含む培地でケラチノサイトを培養する工程、
培養後のケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を測定する工程、及び
測定されたＥ－カドヘリン発現を、対照のＥ－カドヘリン発現と比較する工程
を含み、Ｅ－カドヘリン発現が促進した場合に、候補成分をメラノサイト鎮静化剤としてスクリーニングする、項目７に記載のスクリーニング方法。
［９］ メラノサイト鎮静化剤が、シミ改善剤である、項目７又は８に記載のスクリーニング方法。
［１０］ エイジツエキス、トウキンセンカエキス、キイチゴエキスからなる群から選ばれる少なくとも１のエキスを含む、Ｅ－カドヘリン発現促進剤。
［１１］ 前記Ｅ－カドヘリン発現促進剤が、メラノサイト停滞抑制剤、メラノサイト鎮静化剤、メラニン取り込み正常化からなる群から選ばれる、項目１０に記載のＥ－カドヘリン発現促進剤。
［１２］ Ｅ－カドヘリン発現促進剤が、シミ改善剤である、項目１０又は１１に記載のＥ－カドヘリン発現促進剤。
［１３］ Ｅ－カドヘリン発現を指標とした将来のシミ形成の予測方法。
［１４］ 採取されたケラチノサイトにおいて、Ｅ－カドヘリンの発現を測定する工程；及び
Ｅ－カドヘリンの発現を、閾値と比較することで、将来のシミ形成を予測する工程
を含む、項目１３に記載の予測方法。
［１５］ Ｅ－カドヘリン発現が、タンパク量又はｍＲＮＡ量である、項目１３又は１４に記載の予測方法。

シミとケラチノサイトにおいて発現されるＥ－カドヘリンとの関連が見出され、Ｅ－カドヘリンの発現を増大することにより、シミ改善効果を発揮する。

図１Ａは、正常皮膚及び色素沈着の認められる皮膚（色素沈着皮膚）におけるＥ－カドヘリンを免疫組織化学染色により示す。図１Ｂは、図１Ａの画像から測定された蛍光強度を比較したグラフである。 図２Ａは、ケラチノサイトの野生株とＥ－カドヘリンノックダウン株を用い、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養した場合におけるメラノサイトの移動を示す動画から得られた静止画像を示す。図２Ｂは、図２Ａの動画からメラノサイトの移動距離を測定して比較したグラフである。 図３は、ケラチノサイトの野生株（Ｃｏｎｔ）とＥ－カドヘリンノックダウン株（ΔＥ－Ｃａｄ）を培養して得た培養上清を、メラノサイト培養物に添加した場合におけるチロシナーゼ、ＴＲＰ１及びＭＩＴＦの発現量を示す（Ａ：チロシナーゼ、Ｂ：ＴＲＰ１、Ｃ：ＭＩＴＦ）。 図４は、ケラチノサイトの野生株（Ｃｏｎｔｏｌ）とＥ－カドヘリンノックダウン株（ΔＥ－Ｃａｄ）をそれぞれメラノサイトと共培養した場合におけるメラニンの生成を示す。 図５は、ケラチノサイトの野生株（Ｃｏｎｔｏｌ）とＥ－カドヘリンノックダウン株（ΔＥ－Ｃａｄ）を培養した場合におけるケラチノサイトによるメラニンの取り込みを示す。 図６は、（Ａ）エイジツエキス、（Ｂ）トウキンセンカエキス、及び（Ｃ）キイチゴエキスをケラチノサイト培養物に添加した場合の、Ｅ－カドヘリン発現量の変化を示す。

本発明は、一の態様において、皮膚ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を制御することを含む、美容方法に関する。より具体的に、Ｅ－カドヘリン発現を増大させることにより、メラノサイトの活性を抑制（以下、メラノサイトの鎮静化ともいう）し、美白作用、特にシミの改善、軽減、治療作用を発揮する。さらに本発明の美容方法により、シミ形成を未然に防ぐこともでき、シミ予防作用を発揮する。

本発明の美容方法において、美白作用、特にシミの改善、軽減、治療作用は、メラノサイトの活性を抑制することにより改善される。シミの改善とは、シミ部位の色味がシミ部位以外の皮膚色に近づくことをいい、シミ軽減、メラニン産生抑制、メラノサイト活性化抑制、メラノサイト鎮静化ともいうことができる。本発明の美容方法は、シミを有している対象、又はシミの発生を危惧する対象に適用することができる。

理論に限定されることを意図するものではないが、ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリンの発現が減少すると、Ｅ－カドヘリンを足場とするメラノサイトの移動が滞る（図２）。メラノサイトが停滞すると、停滞している箇所において分泌されたメラニンがケラチノサイトに取り込まれて、シミを形成する。なお、色素沈着部位と正常部位とを比較すると、色素沈着部位においてＥ－カドヘリンの発現が低下しており（図１）、Ｅ－カドヘリンがシミ形成に関わることの証左となる。また、Ｅ－カドヘリンの発現が減少したケラチノサイトからは、メラノサイトを活性化する液性因子が分泌され、かかる液性因子（本明細書中で、メラノサイト活性化因子とも呼ぶ）の作用によりメラノサイトが活性化する（図３）。活性化したメラノサイトは、メラニンの生成量を増大し（図４）、分泌されたメラニンはケラチノサイトにより取り込まれて皮膚の着色、特にシミを形成する（図５）。ケラチノサイトへの取り込みが抑制されることで、メラニンの色素沈着が抑制され、シミの形成を予防し、又はシミを改善することができる。メラニン色素のケラチノサイトへの取り込みの増加抑制を、メラニン色素取り込み正常化ということができる。

Ｅ－カドヘリンの発現の制御は、特にＥ－カドヘリンの発現促進と発現抑制のいずれかであってもよいが、美白作用、特にシミ改善作用を発揮する観点からは、Ｅ－カドヘリンの発現促進が好ましい。Ｅ－カドヘリンの発現を促進することで、メラノサイト活性化因子の分泌が抑制され、メラノサイトが鎮静化するとともに、メラノサイトの移動を促す。メラノサイトの鎮静化とメラノサイトの移動の促進のうちの一方、又は両方の作用により、シミが改善する。しかしながら、メラノサイトから分泌され、ケラチノサイトに取り込まれたメラニンは消失するわけではない。メラノサイトの鎮静化及び移動の促進による効果が発揮され、その後表皮のターンオーバーにより、表皮が更新されることで、シミの改善効果が発揮される。

皮膚、特にシミ部位において、Ｅ－カドヘリン発現を促進するためには、Ｅ－カドヘリン発現促進剤が投与される。本実施例においてＥ－カドヘリン発現促進効果を発揮することが示されたエイジツエキス、トウキンセンカエキス、キイチゴエキスをＥ－カドヘリン発現促進剤として使用することができる（図６）。さらに本技術分野に周知のＥ－カドヘリン発現促進剤である、トルメンチラエキス、セイヨウバラエキス、ゼニアオイエキス、ハイアオイエキス、ハイビスカスエキスを使用することもできる（特許文献１）。ケラチノサイトにおけるＥ－カドヘリン発現を指標として、Ｅ－カドヘリン発現促進剤をスクリーニングすることができ、かかるスクリーニング方法によりスクリーニングされた成分を、Ｅ－カドヘリン発現促進剤として使用することもできる。Ｅ－カドヘリン発現促進剤は、経皮、経口、経粘膜、皮下、筋中、静脈内、動脈内等に任意の経路で投与されてもよいが、皮膚ケラチノサイトにおいて作用させる観点から、経皮的に適用することが好ましく、特にシミを含む領域に直接適用することがさらに好ましい。

本発明の更なる態様では、本発明は、ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を指標としたメラノサイト鎮静化剤のスクリーニング方法にも関する。本発明のスクリーニング方法は、より具体的に以下の：
候補成分を含む培地でケラチノサイトを培養する工程、
培養後のケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を測定する工程、及び
測定されたＥ－カドヘリン発現量を、対照のＥ－カドヘリン発現と比較する工程
を含み、Ｅ－カドヘリン発現が亢進した場合に、候補成分をメラノサイト鎮静化剤としてスクリーニングすることができる。スクリーニング方法は、Ｅ－カドヘリン発現が亢進した場合に、候補成分をメラノサイト鎮静化剤として選択する工程を含んでもよい。こうしてスクリーニングされたメラノサイト鎮静化剤は、Ｅ－カドヘリン発現を亢進することにより、メラノサイトを鎮静化することができる。メラノサイト鎮静化剤は、シミ改善剤ともいうことができる。

対照のＥ－カドヘリン発現は、候補成分を含まない点でのみ異なる培養ケラチノサイトにおけるＥ－カドヘリンの発現を使用することができる。対照群は、予め実験が行われて、対照群のＥ－カドヘリンの発現に基づいて閾値を設定してもよいし、並行して培養及び測定工程が行われてもよい。Ｅ－カドヘリンの発現は、培養ケラチノサイトにおけるＥ－カドヘリンのタンパク質量又はｍＲＮＡ量であってもよく、それぞれ免疫学的手法又は定量的ＰＣＲ等の本技術分野に周知の手法を用いて測定することができる。

本発明のスクリーニング方法に用いる候補成分は、化粧品素材、食品素材、医薬品素材などの任意のライブラリーを使用することができる。かかるライブラリーとしては、化合物ライブラリー、エキスライブラリーなどを使用してもよい。各ライブラリーに含まれる化合物及びエキスは、市販の化合物及びエキスを使用してもよいし、合成された化合物及び調製されたエキスを使用してもよい。

本明細書に記載される植物のエキスは常法により得ることができ、例えばその起源となる植物を抽出溶媒とともに常温又は加熱して浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、あるいは有機溶媒、例えばエタノール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、溶媒として水とアルコール、例えば１，３－ブチレングリコールの混合溶媒が使用される。上記溶媒で抽出して得られた抽出物をそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ－２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。

エイジツエキスとは、ノイバラ（Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ）果実から抽出されたエキスをいう。エイジツ（営実）とは、ノイバラの成熟果実を言う。ノイバラは日本の山地に自生し、朝鮮半島や中国にも分布する。エイジツエキスは、ノイバラの果実を乾燥させ、水、アルコール又はそれらの混合溶液で抽出することで調製することができる。アルコールとしては、エタノール、プロピレングリコール、又はブチレングリコールが用いられる。より好ましくは、水とエタノール又は水と１，３－ブチレングリコールの任意の割合の混合液、例えば１０：９０～９０：１０の混合液、好ましく３０：７０～７０：３０、さらに好ましくは５０：５０の混合液により抽出されうる。エイジツエキスは、０．００１％～０．０５％の濃度で配合され、０．００５％～０．０１％がより好ましい。

トウキンセンカ（学名Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌｉｎｎｅ）エキスは、キク科の一種であるトウキンセンカの花の抽出物である。トウキンセンカは、南ヨーロッパ原産のキク科の植物である。トウキンセンカの頭花を、水、エタノール、アルコール又はこれらの混合溶液で抽出することで調製することができる。アルコールとしては、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが用いられる。より好ましくは、水と１，３－ブチレングリコールの任意の割合の混合液、例えば１０：９０～９０：１０の混合液、好ましく３０：７０～７０：３０、さらに好ましくは５０：５０の混合液により抽出されうる。トウキンセンカエキスは、０．０５％～５％で配合され、０．１％～１％がより好ましい。

キイチゴエキスとは、バラ科のキイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）に属する植物の果実から抽出されたエキスをいう。キイチゴ属の植物体は北半球の寒帯から温帯にかけて広く分布している。キイチゴの果実を、水、エタノール、アルコール又はこれらの混合溶液で抽出することで調製することができる。アルコールとしては、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが用いられる。より好ましくは、水と１，３－ブチレングリコールの任意の割合の混合液、例えば１０：９０～９０：１０の混合液、好ましく３０：７０～７０：３０、さらに好ましくは５０：５０の混合液により抽出されうる。キイチゴエキスは、０．０１％～０．５％で配合され、０．０５～０．１％がより好ましい。

本発明のＥ－カドヘリン発現促進剤、メラノサイト鎮静化剤、シミ改善剤、メラノサイト停滞抑制剤、及びメラニン取り込み正常化剤は互換的に用いることができ、それぞれ化粧料、医薬品又は医薬部外品に配合されてもよく、また、食品、例えばサプリメントなどの栄養補助食品に配合されてもよい。これらの薬剤は、経口、又は非経口、例えば経皮投与されてもよい。経皮投与される場合、皮膚外用剤に剤形することができる。皮膚外用剤は、皮膚に適用可能であれば特に限定されず、例えば、溶液状、乳化状、固形状、半固形状、粉末状、粉末分散状、水－油二層分離状、水－油－粉末三層分離状、軟膏状、ゲル状、エアゾール状、ムース状、スティック状等、任意の剤型が適用できる。皮膚外用剤に剤形される場合には、皮膚外用剤に通常用いられる基剤、及び賦形剤、例えば保存剤、乳化剤、ｐＨ調整剤などが用いられてもよい。化粧料に配合する場合、化粧水、乳液、美容液、クリーム、ローション、パック、エッセンス、ジェル等の顔用又は体用の化粧料や、ファンデーション、化粧下地、コンシーラー等のメーキャップ化粧料、さらには浴用剤などに配合することができる。本発明の成分を含む化粧品、医薬品及び医薬部外品を用いることにより、Ｅ－カドヘリンの発現促進を介して、メラノサイトを鎮静化し、美白作用を発揮するとともに、シミを改善、軽減、予防、又は治療することができる。

本発明のＥ－カドヘリン発現促進剤、メラノサイト鎮静化剤、シミ改善剤、メラノサイト停滞抑制剤、及びメラニン取り込み正常化剤は、所望の効果、例えば美白効果及び／又はシミ改善効果を発揮させる観点で任意に濃度を選択することができる。皮膚外用剤として配合する観点からは、本発明に係るエキスは、０．０００５％～０．５％で配合することができる。効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．００１％以上で配合でき、さらに好ましくは０．００５％以上で配合することができる。強いにおいを避ける観点から、好ましくは０．１％以下で配合することができ、さらに好ましくは０．０５％以下で配合することができる。

本発明のさらに別の態様では、本発明はＥ－カドヘリン発現を指標とした将来のシミ形成を予測する方法にも関する。より具体的に、シミ形成の予測方法は、以下の：
生体から採取されたケラチノサイトにおいて、Ｅ－カドヘリンの発現量を測定する工程、及び
Ｅ－カドヘリン発現量を閾値と比較することで、将来のシミ形成を予測する工程を含む。ケラチノサイトにおけるＥ－カドヘリン発現量が、所定の閾値よりも低い場合に、現在のシミが形成していない場合であっても、シミが形成する蓋然性が高い。閾値は、生体におけるＥ－カドヘリン発現量の大規模調査により適宜決定することができる。ＶＩＳＩＡなどの本技術分野に周知のシミ判定手法を用いてシミと皮膚のＥ－カドヘリン量との関係に基づいて、閾値を設定することができる。さらに所定の期間を空けて追跡調査を行うことで、より正確に閾値を設定することが可能になる。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

実施例１：Ｅ－カドヘリンの染色
色素沈着部位あるいはシミを含む顔の皮膚試料（入手先会社；Ｏｂｉｏ， ＬＬＣ． およびＫＡＣ）を入手した。皮膚試料において正常部位と色素沈着部位をそれぞれ細胞組織学的にＨ＆Ｅ染色にてシミに特徴的なｒａｔｅ ｒｉｄｇｅ様の基底層の凹凸構造、表皮肥厚、基底ケラチノサイトにおける著しいメラニン沈着の３つの基準で鑑別し、正常皮膚試料と色素沈着皮膚試料として選別した。各皮膚試料を４％パラホルムアルデヒドを含む固定溶液で固定し、その後ＰＢＳで洗浄した。次いでパラフィン包埋を行い、７ｕｍの厚さの皮膚切片を取得した。通常の脱パラフィン処理の後、賦活化処理液中（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｂｕｆｆｅｒ， ａｂｃａｍ， ａｂ９３６８４）にパラフィン切片を浸し、９０℃の湯浴にて熱による賦活化処理を２０分間おこなった。その後室温になるまでパラフィン切片を自然冷却した。皮膚切片をブロッキング溶液（２．５％ヤギ血清及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００を含むＰＢＳ）で１時間インキュベートした後に、１次抗体として２００倍希釈の抗Ｅ－カドヘリン抗体（Ｄａｋｏ）で４℃、Ｏ／Ｎでインキュベートした。その後洗浄液ＰＢＳ－Ｔ（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００を含むＰＢＳ）で抗体を洗浄した。次いで二次抗体として２００倍希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ抗体コンジュゲート（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で１時間、室温でインキュベートを行った。ＰＢＳ－Ｔにて二次抗体を洗浄した。最後に、ＤＡＰＩ入りの封入剤Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加しカバーガラスでスライドサンプルを封入後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察を行った（図１）。Ｅ－カドヘリンの発現量はＩｍａｇｅＪを用いて定量した。基底層、有棘層、および顆粒層においてＥ－カドヘリンが発現していることが示された。また、色素沈着部位の皮膚と比較して、正常皮膚においてカドヘリンの発現が高いことが示された。

実施例２：培養ケラチノサイトにおけるＥ－カドヘリンのノックダウン
培養ヒトケラチノサイト（クラボウ）の培養培地には、ＥｐｉＬｉｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０ｕＭのカルシウムとＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ増殖添加剤セット（クラボウ）を添加して用いた。ケラチノサイトを４ｘ１０⁴Ｃｅｌｌｓ／１ｍＬで１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で４８時間培養した。Ｅ－カドヘリンに対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ―ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＣＤＨ１ ＳｉＲＮＡ， Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）およびネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｏｏｌ， Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を終濃度１０ｎＭで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて培養ケラチノサイトに導入し、２４時間培養をして、ノックダウン株を取得した。

培養ヒトメラノサイト（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の培養培地には、ｍｅｄｉｕｍ２５４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＨＭＧＳ特注増殖添加剤セット（クラボウ）を添加して用いた。メラノサイトを、終濃度０．５ｕＭになるようＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を添加した培地に懸濁し、３７℃２５分間インキュベートした後、観察用のガラスベースディッシュ（２７φ、ＩＷＡＫＩ）に播種した。メラノサイトの定着を確認後、ケラチノサイトとメラノサイトの比率が５：１となるよう、ケラチノサイトを上から播種し、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で共培養をした。ケラチノサイトの定着を確認後、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で６時間、５分間隔で共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮影を行った。ＩｍａｇｅＪを用いてメラノサイトの細胞中心をトラッキングし、移動距離の合計を比較した。Ｅ－カドヘリンノックダウン株のケラチノサイトとメラノサイトを培養した場合に、メラノサイトの移動が抑制され、動きが停滞した（図２）。

実施例３：ケラチノサイトにより分泌される液性因子の作用
ケラチノサイトを４ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／１ｍＬで１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で２４時間培養した。ＰＢＳでケラチノサイトを洗浄後、培地をＣｎＴ－ＰＲＩＭＥ ＫＭ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ）１ｍＬに置換し、さらに２４時間培養した。実施例２に記載の方法でノックダウン試薬を添加した後、４８時間後に培養上清を回収した。メラノサイトは５ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／１ｍＬで１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で７２時間培養した。メラノサイトをＰＢＳで洗浄後、回収したケラチノサイトの上清をメラノサイトに添加し、４８時間培養した。メラノサイトをＰＢＳで洗浄後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて逆転写反応を行った。逆転写後の核酸は、以下のプライマーセットとＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （２ｘ） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）、およびＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）ｐｌｕｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量ＰＣＲを行った。結果を図３に示す。Ｅ－カドヘリンノックダウン株が分泌する液性因子の作用により、メラノサイトが活性化し、メラニン生成に関与するチロシナーゼ、ＴＲＰ１の発現量、並びにこれらの発現量を調整するＭＩＴＦの発現量が増大した。

実施例４：メラニン産生への影響
メラノサイトを２ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／１ｍＬでガラスベースディッシュ（２７φ、ＩＷＡＫＩ）に播種し、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で２４時間培養した。実施例２に記載の方法で調製されたＥ－カドヘリンノックダウン（ΔＥ－Ｃａｄ）株および野生（Ｃｏｎｔｒｏｌ）株をそれぞれ回収してメラノサイトに添加し、ＣｎＴ－ＰＲ ＫＭ培地で７日間、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で共培養した。ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒドを含む固定溶液で固定し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてメラニンの観察を行った。Ｅ－カドヘリンノックダウン（ΔＥ－Ｃａｄ）株との共培養時にメラノサイトにおけるメラニン産生量が増大した（図４）。実施例３と併せて、Ｅ―カドヘリンノックダウン株が分泌する液性因子によってメラノサイトは活性化され、メラニンの産生が増大することが示された。

実施例５：メラニン取り込みへの影響
合成メラニン（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳに懸濁し、１％溶液（Ｗ／Ｖ）を調製した。ソニケーションをかけてメラニンの凝集を破砕した後、実施例２に記載の方法で得たＥ－カドヘリンノックダウン（ΔＥ－Ｃａｄ）株及び野生（Ｃｏｎｔｒｏｌ）株に、終濃度０．００２％（Ｗ／Ｖ）となるようメラニン溶液を添加した。添加直後より、ＢｉｏＳｔａｔｉｏｎ ＣＴ（Ｎｉｋｏｎ）を用いて３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で１２時間、１５分間隔でメラニンの取り込みを撮影した。得られたデータはＩｍａｇｅＪを用いて二値化をした（図５）。Ｅ－カドヘリンノックダウン株（ΔＥ－Ｃａｄ）株においてメラニンの取り込み量が増加していた。

実施例６：Ｅ－カドヘリン発現を増大させる候補薬物のスクリーニング
ケラチノサイトを３ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／１ｍＬで１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で４８時間培養した。候補薬物として、０．０１％及び０．００５％エイジツエキス（水／エタノール抽出）、１％及び０．１％トウキンセンカエキス（水/ブチレングリコール抽出）、及び０．１％及び０．０５％キイチゴエキス（水/ブチレングリコール抽出）を添加して、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で２４時間培養後、細胞を回収した。候補薬物の希釈にはＤＭＳＯを用いた。対照群には、同量のＤＭＳＯを添加し、３７℃５％ＣＯ_２雰囲気下で２４時間培養後、細胞を回収した。回収した細胞について、実施例３に記載の方法でＲＮＡを抽出し、逆転写後、以下のプライマーセットを用いて定量ＰＣＲを行った。結果を図６に示す。エイジツエキス、トウキンセンカエキス、及びキイチゴエキスは、Ｅ－カドヘリン発現促進作用を有した。

Claims (15)

1. 皮膚ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を制御することを含む、美容方法。
2. 前記美容方法が、シミの改善を含む、請求項１に記載の美容方法。
3. シミ部位において、Ｅ－カドヘリン発現を促進することを含む、請求項１又は２に記載の美容方法。
4. Ｅ－カドヘリン発現の促進により、メラノサイトの停滞抑制、メラニン取り込み正常化、及びメラノサイト活性化の抑制からなる群から選ばれる少なくとも１の作用を発揮する、請求項１～３のいずれか一項に記載の美容方法。
5. Ｅ－カドヘリン発現の促進が、Ｅ－カドヘリン発現促進剤を皮膚に適用することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の美容方法。
6. Ｅ－カドヘリン発現促進剤は、エイジツエキス、トウキンセンカエキス、キイチゴエキスからなる群から選ばれる少なくとも１のエキスを含む、請求項５に記載の美容方法。
7. ケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を指標としたメラノサイト鎮静化剤のスクリーニング方法。
8. 以下の：
   候補成分を含む培地でケラチノサイトを培養する工程、
   培養後のケラチノサイトにおいてＥ－カドヘリン発現を測定する工程、及び
   測定されたＥ－カドヘリン発現を、対照のＥ－カドヘリン発現と比較する工程
   を含み、Ｅ－カドヘリン発現が促進した場合に、候補成分をメラノサイト鎮静化剤としてスクリーニングする、請求項７に記載のスクリーニング方法。
9. メラノサイト鎮静化剤が、シミ改善剤である、請求項７又は８に記載のスクリーニング方法。
10. エイジツエキス、トウキンセンカエキス、キイチゴエキスからなる群から選ばれる少なくとも１のエキスを含む、Ｅ－カドヘリン発現促進剤。
11. 前記Ｅ－カドヘリン発現促進剤が、メラノサイト停滞抑制剤、メラノサイト活性化抑制剤、メラニン取り込み正常化剤からなる群から選ばれる、請求項１０に記載のＥ－カドヘリン発現促進剤。
12. Ｅ－カドヘリン発現促進剤が、シミ改善剤である、請求項１０又は１１に記載のＥ－カドヘリン発現促進剤。
13. Ｅ－カドヘリン発現を指標とした将来のシミ形成の予測方法。
14. 採取されたケラチノサイトにおいて、Ｅ－カドヘリンの発現を測定する工程；及び
    Ｅ－カドヘリンの発現を、閾値と比較することで、将来のシミ形成を予測する工程
    を含む、請求項１３に記載の予測方法。
15. Ｅ－カドヘリン発現が、タンパク量又はｍＲＮＡ量である、請求項１３又は１４に記載の予測方法。

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