CN107875052B

CN107875052B - 紫笋茶化妆水及其制备方法

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Publication number: CN107875052B
Application number: CN201711122256.XA
Authority: CN
Inventors: 霍刚; 马萍; 方婷欢; 张丽华
Original assignee: Osm Biology Co ltd
Current assignee: Osm Biology Co ltd
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN107875052A

Abstract

本发明涉及化妆品领域，具体涉及紫笋茶化妆水及其制备方法。一种紫笋茶化妆水，制备方法如下：1）将水、1,3‑丙二醇、二丙二醇、黄原胶、聚丙烯酸钠加入反应锅中，开启搅拌，加热至75~80℃，分散均匀；2）开冷却循环水，搅拌降温，待温度降至40~45℃时，将紫笋茶提取物和防腐剂加入反应锅中，搅拌溶解完全；3）继续搅拌冷却至料温低于38℃，停止搅拌，结束。本发明的紫笋茶提取物具有卓越的美肤功效，尤其是在肌肤增白方面，它能够有效地抑制体外酪氨酸酶的活性并且能减少或淡化黑素细胞中所含的黑色素。同时，它可以阻击自由基对皮肤细胞的侵害；促进人成纤维细胞的增殖，延缓肌肤衰老。

Description

紫笋茶化妆水及其制备方法

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及紫笋茶化妆水及其制备方法。

背景技术

皮肤颜色的主要影响因素是皮肤中的黑色素，皮肤颜色的深浅与黑色素的含量及转移至角质细胞中黑色素的含量成正比。紫外线照射、女性荷尔蒙及孕素的变化、大气中微小粒子污染物、炎症因子、精神压力、衰老引起的代谢能力下降等等都会引起黑色素含量的变化。黑色素含量的增加会引起皮肤整体颜色的加深以及引起色斑的出现。

在美白类化妆品的开发中，为增白肤色或改善皮肤色素异常沉着，常添加各种美白活性原料，主要为以下原理：

1、抗氧化(也称还原美白)是因为在黑色素的生成过程中氧化自由基参与了部分反应，所以抗氧化对于美白来说也是个关键步骤。

2、抑制“三酶一素”。是指在黑色素形成过程中起到关键作用的四个关键物质，抑制它们四个的活性就阻断了黑色素形成。

3、去角质(代谢美白)的作用是让已经生成的黑色素到皮肤表面，然后把它们代谢掉。

近年来随着消费者对自身健康和安全的日益关注，相对于许多生化合成的化妆品功效原料，来源于天然且功效卓著的原料则更受青睐。

顾渚紫笋茶叶产于浙江省长兴县的顾渚山，又名“湖州紫笋”，是我国著名的上品贡茶。顾渚紫笋作为绿茶中的名茶，含有丰富的多酚类和多种矿物质。这些物质都能够有效起到保健作用，如消脂减肥、健体美容等等。其次还有提神醒脑、增进思维、消除疲劳、抗菌杀菌、降低血脂、血压、解渴消暑、解毒利尿、强心解痉、防龋齿等功效。

发明内容

本发明的第一个目的是提供紫笋茶化妆水，本发明的第二个目的是提供紫笋茶化妆水的制备方法，本发明的紫笋茶提取物具有卓越的美肤功效，尤其是在肌肤增白方面，它能够有效地抑制体外酪氨酸酶的活性并且能减少或淡化黑素细胞中所含的黑色素。同时，它可以阻击自由基对皮肤细胞的侵害；促进人成纤维细胞的增殖，延缓肌肤衰老。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种紫笋茶化妆水，该化妆水的组分及其百分数含量为：

作为优选，该化妆水的组分及其百分数含量为：

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种所述的紫笋茶化妆水的制备方法，该方法包括下列步骤：

1)将水、1,3-丙二醇、二丙二醇、黄原胶、聚丙烯酸钠加入反应锅中，开启搅拌，加热至75～80℃，分散均匀；

2)开冷却循环水，搅拌降温，待温度降至40～45℃时，将紫笋茶提取物和防腐剂加入反应锅中，搅拌溶解完全；

3)继续搅拌冷却至料温低于38℃，停止搅拌，结束。

本发明紫笋茶提取物为由紫笋茶经水提、有机溶剂提取或超临界CO2提取方法的液态或固态成分。作为优选，所述的有机溶剂选用乙醇、丁二醇、丙酮中的一种或多种。

本发明的紫笋茶提取物具有卓越的美肤功效，尤其是在肌肤增白方面，它能够有效地抑制体外酪氨酸酶的活性并且能减少或淡化黑素细胞中所含的黑色素。同时，它可以阻击自由基对皮肤细胞的侵害；促进人成纤维细胞的增殖，延缓肌肤衰老。

本发明以体外培养的人角质形成细胞(HaCaT细胞)，人成纤维细胞(HSF细胞)，人黑色素瘤细胞(A375细胞)为研究对象，通过MTT、L-DOPA氧化法、DPPH清除自由基实验、cell-based ELISA、western blot、细胞免疫组化等实验方法研究紫笋茶相应体外功效。结果显示紫笋茶提取液在适当浓度范围内(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g*L^-1)具有显著促进HaCaT细胞和HSF细胞增殖的作用，同时具有极强的抗氧化活性，并且紫笋茶显著抑制了黑色素的合成和转运途径中的关键受体，包括酪氨酸酶(TYP)，酪氨酸相关蛋白2(TRP-2)，黑素细胞黑素皮质素受体1(MC1R)，蛋白酶激活受体2(PAR-2)，并且紫笋茶能够促进透明质酸合成酶1 (HAS1)的表达。综合上述结果表明，紫笋茶在体外水平具有良好的抗衰老、抗氧化及抑制黑色素合成与转移的作用。

附图说明

图1紫笋茶促进HaCaT细胞增殖实验。结果表示为:平均值±SD；**p<0.01vsblank， *p<0.05vs blank，n＝6。

图2紫笋茶促进HSF细胞增殖实验。结果表示为:平均值±SD；**p<0.01vs blank，*p<0.05vs blank，N＝6。

图3DPPH自由基清除率。结果表示为:平均值±SD；N＝2。

图4酪氨酸酶活性变化率。N＝1。

图5 Cell-based elisa检测紫笋茶对A375细胞受体MC1R表达影响。结果表示为:平均值±SD；*p<0.05vs blank，**p<0.01vs blank，N＝5。

图6A：Western blot检测紫笋茶对A375细胞受体蛋白MC1R表达影响。B：蛋白条带灰度分析。结果表示为:平均值±SD；*p<0.05vs blank，**p<0.01vs blank，N＝3。

图7Cell-based elisa检测紫笋茶对A375细胞受体蛋白TRP-2表达影响。结果表示为: 平均值±SD；*p<0.05vs blank，**p<0.01vs blank，N＝5。

图8Cell-based elisa检测紫笋茶对角质细胞受体PAR-2表达影响。结果表示为:平均值±SD；*p<0.05vs blank，**p<0.01vs blank，N＝5。

图9Cell immunohistochemical检测紫笋茶对HaCaT细胞PAR-2表达影响。(A)blank组， (B)紫笋茶0.2g*L^-1，(C)紫笋茶0.4g*L^-1，(D)紫笋茶0.6g*L^-1，(E)紫笋茶0.8g*L^-1，(F)紫笋茶1.0g*L^-1。根据计分原则，(A)为强阳性(+++)，(B)为强阳性(+++)，(C)和(D)为阳性(++)，(E)和(F)为弱阳性(+)。

图10cell-based elisa检测紫笋茶对HSF细胞受体HAS1表达影响。结果表示为:平均值±SD；*p<0.05vs blank，N＝5。

具体实施方式

以下实施例1-4中所述紫笋茶提取物产自浙江长兴。

实施例1 化妆水的制备

组成化妆水的组分及其百分数含量为：

上述护肤霜的制备方法，包括下列步骤：将甘油、1,3-丙二醇、聚丙烯酸钠和水加入水相锅，加热搅拌至75～80℃，分散均匀，作为A相；将甲基葡糖倍半硬脂酸酯、PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇、异十六烷、乳木果油、聚二甲基硅氧烷、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、生育酚加入油锅中，加热搅拌至75～80℃，搅拌至完全熔解，作为B相；将A相抽入均质反应锅中，开启搅拌，抽入B相，均质5分钟，加入SIMULGEL 305，高速均质3分钟，开启冷却循环水，搅拌降温；至40～45℃时加入紫笋茶提取物、香精和防腐剂，搅拌均匀；继续搅拌至料温不高于38℃后，停止搅拌，结束。

实施例2 护肤乳液的制备

组成护肤乳液的组分及其百分数含量为：

上述护肤乳液的制备方法，包括下列步骤：将水、1,3丙二醇、丁二醇、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物、鲸蜡醇磷酸酯钾加入水相锅，加热搅拌至75～80℃，搅拌分散均匀，作为A相；将山嵛醇、角鲨烷、乳木果油、聚二甲基硅氧烷、辛酸/癸酸甘油三酯、矿油加入油锅中，加热搅拌至75～80℃，搅拌至完全熔解，作为B相；将A相抽入均质反应锅中，开启搅拌，抽入B相，均质5分钟，开启冷却循环水，搅拌降温；至40～45℃时加入紫笋茶提取物、香精和防腐剂，搅拌溶解完全；继续搅拌至料温不高于38℃后，停止搅拌，结束。

实施例3 化妆水的制备

组成护肤水的组分及其百分数含量为：

上述护肤水的制备方法，包括下列步骤：将水、1,3-丙二醇、二丙二醇、黄原胶、聚丙烯酸钠加入反应锅中，开启搅拌，加热至75～80℃，分散均匀；开冷却循环水，搅拌降温，待温度降至40～45℃时，将紫笋茶提取物和防腐剂加入反应锅中，搅拌溶解完全；继续搅拌冷却至料温低于38℃，停止搅拌，结束。

实施例4 洗面奶的制备

组成洗面奶的组分及其百分数含量为：

上述洗面奶的制备方法，包括下列步骤：将水、月桂醇聚醚磷酸钾、甘油、PEG-120甲基葡糖二油酸酯加入反应锅中，开启搅拌，加热至75～80℃，搅拌分散均匀；开冷却循环水，搅拌降温，至65～70℃，加入丙烯酸(酯)类共聚物、椰油酰两性基乙酸钠、柠檬酸、月桂基羟基磺基甜菜碱、PEG-7甘油椰油酸酯，分散均匀；待温度降至40～45℃时，加入紫笋茶提取物、香精和防腐剂，搅拌分散均匀；继续搅拌冷却至低于38℃，停止搅拌，结束。

试验例

由于紫笋茶独特的地理条件以及未见于其相关功效研究文献，因此本研究针对紫笋茶进行了其相关体外功效类研究，观察其作为活性成分在体外水平对皮肤的功效作用。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

紫笋茶提取液，欧诗漫生物股份有限公司；DMEM培养基，Thermo scientific公司；胎牛血清，Thermo scientific公司；A375细胞，上海康朗生物科技有限公司；HSF细胞，上海康朗生物科技有限公司；HaCaT细胞，上海中科院细胞库；噻唑蓝(MTT)，Sigma公司；PAR-2兔抗人抗体，BIOSS生物科技有限公司；TRP-2兔抗人抗体，BIOSS生物科技有限公司；MCIR兔抗人抗体，BIOSS生物科技有限公司；羊抗兔IgG抗体，BIOSS生物科技有限公司；SABC 免疫组化试剂盒，BOSTER生物科技有限公司；Multiskan GO全波长酶标仪，Thermoscientific 公司；CKX53倒置成像显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司；5200Multi全自动化学发光/荧光图像分析系统，上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 体外细胞培养

HaCaT细胞、A375细胞、HSF细胞培养均使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，复苏冻存的细胞，培养至3-4代至对数生长期，进行实验。

1.2.2 细胞增殖实验

采用传代3-4代生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的细胞，将生长接近融合的HaCaT细胞或HSF细胞以1×10⁵细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板。培养24h细胞贴壁后，将细胞分为空白组、样品组进行培养，样品组加入适当浓度紫笋茶提取液，培养24h后加入MTT培养4h后，DMSO溶解，测定OD值。

1.2.3 DPPH清除自由基实验

配制约1mmol*L^-1DPPH无水乙醇溶液，与适当浓度紫笋茶提取液混合，避光密闭静置 30min，测定OD值。

1.2.4 酪氨酸酶抑制实验

采用传代3-4代生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的细胞，将生长接近融合的A375 细胞以1×10⁶细胞/孔的密度均匀接种于24孔培养板。培养24h细胞贴壁后，将细胞分为空白组、样品组进行培养，样品组加入适当浓度紫笋茶提取液。培养24h后，使用L-DOPA氧化法进行酪氨酸酶的抑制实验。

1.2.5 Cell-based ELISA实验

采用传代3-4代生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的细胞，将生长接近融合的细胞以1×10⁵细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板。培养24h细胞贴壁后，将细胞分为空白组、样品组进行培养，样品组加入适当浓度紫笋茶提取液。培养24h后进行ELISA检测。

1.2.6 Western blot实验

采用传代3-4代生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的细胞，将生长接近融合的A375 细胞以1×10⁶细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板。培养24h细胞贴壁后，将细胞分为空白组、样品组进行培养，样品组加入适当浓度紫笋茶提取液。培养24h提取细胞总蛋白，进行western blot检测。

1.2.7 细胞免疫组化实验

采用传代3-4代生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的细胞，将生长接近融合的A375 细胞以1×10⁶细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板。培养24h细胞贴壁后，将细胞分为空白组、样品组进行培养，样品组加入适当浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g*L^-1)紫笋茶提取液。培养24h后进行cell immunohistochemical实验。

1.2.8 统计学分析

采用相应统计学软件进行统计学分析，数据以x±s表示，并进行t检验或单向方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 紫笋茶对HaCaT细胞生长影响

样品组选择适当浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g*L^-1)紫笋茶提取液直接作用于HaCaT 细胞水平，观察细胞生长状况。实验结果如图1所示，结果表示为平均值±SD。发现当紫笋茶浓度为0.2-1.0g*L^-1范围内显著促进角质细胞生长，且当浓度为0.2-0.6g*L^-1浓度时具有极显著性增殖作用，且具统计学意义。

2.2 紫笋茶对HSF细胞生长影响

选取适当浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g*L^-1)紫笋茶提取液直接作用于HSF细胞水平，观察细胞生长状况。实验结果如图2所示。发现紫笋茶提取液浓度在0.2-1.0g*L^-1范围时， HSF细胞生长受到显著性促进作用，尤其当浓度为0.6-0.8g*L^-1浓度时具有极显著性增殖作用，且具统计学意义。因此可以认为紫笋茶在一定范围浓度下能够显著促进成纤维细胞增殖，具有一定抗衰老作用。

2.3 DPPH自由基清除实验

皮肤的衰老与机体的衰老一样，均和自由基有着重要的关系，因此检测紫笋茶对自由基的清除作用对于其抗衰老的功效至关重要，综合上述实验结果，使用适当浓度(0.2、0.4、0.6、 0.8、1.0g*L^-1)紫笋茶提取液进行DPPH自由基清除实验。结果(图3)显示紫笋茶提取液在浓度为0.2-1.0g*L^-1时，自由基清除率随浓度增加而呈现递增效果，尤其在浓度0.4-1.0g*L^-1时，自由基清除率均达到80％以上。

2.4 紫笋茶对酪氨酸酶活性抑制影响

在皮肤中黑色素细胞对受到环境和邻近细胞导致的各种内在的和外在因素的影响，包括 UV、MSH、ASP、ET1、DKK1以及大量的生长因子和细胞因子，表皮色素的过度沉着主要由于过多的黑色素合成，以及/或过多的黑色素转移至角质细胞，为了使色素沉着皮肤淡化，主要目的是一直黑色素的合成，并切断其转移途径^[3]。

黑素细胞生物合成黑素以酪氨酸为底物，在酪氨酸酶的作用下合成黑色素，黑色素生成量则与酪氨酸酶的活性相关，因此控制酪氨酸酶的活性即可控制黑色素的生成量^[4]。使用适当浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g*L^-1)紫笋茶提取液作用于A375细胞，进行酪氨酸酶抑制实验。试验结果(图4、表1)显示，与初始值相比，紫笋茶提取液作用后A375细胞内的酪氨酸酶活性变化率随浓度增加而下降，浓度为1.0g*L^-1时，相比于初始值，酪氨酸酶活性降低了23.3％(表1)，即此时酪氨酸酶抑制最强。

表1 酪氨酸酶活性变化率

2.5 紫笋茶对MC1R蛋白表达作用的影响

α-MSH作为一个黑皮质素家族的天然存在的内源性肽，可刺激黑色素合成，α-MSH在色素沉淀区域通过结合黑色素细胞膜表面MC1R受体发挥作用^[5,6]。而黑素细胞黑素皮质素受体 1(MC1R)表达在人黑素细胞表面，为一类G蛋白偶联受体，是α-MSH在黑色素细胞的受体，调控黑色素细胞增殖和功能的关键蛋白。同时，现在已经有研究发现，MC1R不仅仅影响色素沉着，还涉及活化人类黑色素细胞中DNA损伤反应，包括了DNA修复途径^[7,8,9]。

本实验通过cell-based ELISA实验，结果如图5显示，随着紫笋茶浓度上升，A375细胞表达MSH受体MC1R蛋白下降，具浓度依赖性；浓度为0.4-1.0g*L^-1时，MC1R蛋白表达受到显著性抑制，尤其浓度为0.6-1.0g*L^-1时，蛋白表达量受到极显著性抑制，具统计学意义。

进一步进行western blot实验验证发现(图6)，在适当浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g*L^-1) 的紫笋茶提取液，随着浓度的上升，A375细胞表达MC1R蛋白下降，具浓度依赖性；通过Tanon自带分析软件将蛋白条带进行灰度分析，结果由MC1R/β-actin表示，当紫笋茶浓度为0.6-1.0g*L^-1时，MC1R蛋白表达受到极显著抑制，具统计学意义，尤其0.8-1.0g*L^-1浓度时，蛋白抑制率达到50％以上，得到相互验证目的。

2.6 紫笋茶对TRP-2蛋白表达作用的影响

前文已经提到，酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)能够催化黑素色合成过程的后续的步骤，加速黑素生成的作用^[10]。根据实验结果(图7)显示，紫笋茶浓度为0.2-1.0g*L^-1，随着紫笋茶浓度上升，A375细胞TRP-2蛋白表达下降，具浓度依赖性，当其浓度为0.2-1.0g*L^-1时，TRP-2 蛋白表达受到具统计学意义的显著性抑制，尤其浓度为0.6-1.0g*L^-1时，蛋白表达量受到极显著性抑制。

2.7 紫笋茶对PAR-2蛋白表达作用影响

蛋白激活酶受体2(PAR-2)仅在角质形成细胞中表达，并不在黑色素细胞中表达。有研究人员通过三维共培养角质形成细胞与黑色素细胞等方法，发现角质形成细胞中黑色素的上升与黑色素的转运有关联，但与黑色素的合成无关，并进一步发现PAR-2参与了黑色素的转运过程，是主要的黑色素转运关键受体蛋白，研究证明，其可介导角质形成细胞主动吞噬黑素小体，以及参与黑色素的转运，从而能够调节皮肤色素沉着^[11,12,^13]。

通过cell-based ELISA实验(图8)，发现随着紫笋茶浓度上升，HaCaT细胞PAR-2蛋白表达下降，具浓度依赖性，尤其浓度为0.6-1.0g*L^-1时，PAR-2蛋白表达受到显著性抑制。随后进行cell immunohistochemical进行验证实验(图9)，数据图由10X 20倍显微镜下拍摄，随机选择6个视野，发现随着紫笋茶浓度上升，可明显观察到，HaCaT细胞棕黄色变淡，具浓度依赖性，符合图8结果所示。

2.8 紫笋茶对HAS1蛋白表达作用的影响

透明质酸是一类高分子量葡萄糖胺聚糖，是细胞外基质主要成分，是天然存在于人体皮肤的具有保水功能的聚合物，为皮肤细胞外基质的主要成分，具有保水、润滑、调节渗透压等作用，保护正常的细胞免受毒性细胞、自由基等侵袭，可以促进细胞增殖、分化，还可以调控胶原蛋白的合成，作为皮肤天然保湿因子被广泛认为具有较强的保湿与抗衰老的效果^[14,15,16]。透明质酸合成酶存在于质膜上，能够特异性作用于透明质酸合成过程。

通过cell-based ELISA实验发现(图9)，发现随着紫笋茶浓度上升，HSF细胞HAS1蛋白表达有所增加，当浓度为0.8-1.0g*L^-1时，HAS1蛋白表达受到显著性促进作用。

3 实验结论

紫笋茶作为一种未有文献验证其在护肤领域的功能的茶类，本研究在体外水平研究及验证其作为活性成分在皮肤细胞抗老、美白、抗氧化等功效上的作用。研究发现在适宜浓度范围内紫笋茶显著促进了角质细胞和成纤维细胞的增殖(图1，图2)，极强的抗氧化作用(图 3)。并且紫笋茶具有极强的抑制TYR活性及抑制TRP-2蛋白表达的作用(图4，图7)，同时对MC1R这一受体具有极显著的抑制作用(图5，图6)，说明了紫笋茶能够抑制黑色素生物合成途径。随后通过实验进一步发现紫笋茶对黑色素转运过程，尤其角质形成细胞吞噬黑色素小体过程发挥较强作用。并且针对天然保湿因子透明质酸的合成，发现紫笋茶良好的促进 HAS1表达的作用(图10)。综合上述实验结果，紫笋茶在一定程度上具有抗氧化、美白及抗衰老的美容功效，可作为添加剂应用到护肤品中。

Claims

1.一种紫笋茶化妆水，其特征在于，该化妆水的组分及其百分数含量为：

成分含量%

1,3-丙二醇 2~8

二丙二醇 0.5~3

黄原胶 0.01~0.1

聚丙烯酸钠 0.05~0.5

EDTA二钠 0.01~0.10

紫笋茶提取物 0.1~2.0

防腐剂适量

水余量；

其中，所述的紫笋茶提取物由紫笋茶经水提、有机溶剂提取或超临界CO₂提取方法的液态或固态成分。

2.如权利要求1所述的紫笋茶化妆水，其特征在于，所述的有机溶剂选用乙醇、丁二醇、丙酮中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种紫笋茶化妆水，其特征在于，该化妆水的组分及其百分数含量为：

成分含量%

1,3-丙二醇 5

二丙二醇 1

黄原胶 0.05

聚丙烯酸钠 0.1

EDTA二钠 0.02

紫笋茶提取物 0.5

防腐剂适量

水余量。

4.一种权利要求1或2或3所述的紫笋茶化妆水的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1）将水、1,3-丙二醇、二丙二醇、黄原胶、聚丙烯酸钠加入反应锅中，开启搅拌，加热至75~80℃，分散均匀；

2）开冷却循环水，搅拌降温，待温度降至40~45℃时，将紫笋茶提取物和防腐剂加入反应锅中，搅拌溶解完全；

3）继续搅拌冷却至料温低于38℃，停止搅拌，结束。