JP2024058653A

JP2024058653A - 抗ウイルス剤としてのピロリジンメインプロテアーゼ阻害剤

Info

Publication number: JP2024058653A
Application number: JP2023177521A
Authority: JP
Inventors: デイビッド・エイ・デゴイー; マイケル・アール・シュリンプ; デイビッド・ジェイ・ハーディ; ヤーコプ・ルートビヒ; エリック・アール・ミラー; ティモシー・アール・ホッジズ; アルベルト・ムノス; サラ・ジェイ・パールマター; ホワン－チウ・エックス・リー; アルビン・ジャン; エリザベス・エル・ノイー; グレゴリー・エイ・グフェッサー; エドガーズ・ジェクス; ロバート・ジー・シュミット; ジャスティン・ディー・ディートリッヒ; ジーニア・ビー・サール; ボーグスロー・ピー・ノセク; アンドリュー・ボグダン
Original assignee: アッヴィ・インコーポレイテッド
Priority date: 2022-10-14
Filing date: 2023-10-13
Publication date: 2024-04-25
Also published as: US20240158368A1; KR20240052708A; WO2024081351A1

Abstract

【課題】メインプロテアーゼ（ＭＰｒｏ）タンパク質の阻害による、抗ウイルス化合物として有効な化合物を見出すこと。【解決手段】抗ウイルス化合物として有効な、ピロリジンメインプロテアーゼ阻害剤が記載されている。【選択図】なし

Description

本出願は、２０２２年１０月１４日出願の米国仮特許出願第６３／４１６，０３７号、及び２０２３年３月９日出願の米国仮特許出願第６３／４８９，３８９号の利益を主張し、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明は、コロナウイルスを含む多数のウイルスにおいて見出されるメインプロテアーゼ（ＭＰｒｏ）タンパク質の阻害による、抗ウイルス化合物として有効な化合物に関する。

本発明の背景
コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる。ＣＯＶＩＤ－１９及び他のコロナウイルスの感染に伴う症状を軽減することができる低分子化合物が、緊急に必要とされている。

（発明の要旨）
実施形態において、式（ＩＩＩ）

（式中、Ｒ^１は、ＣＮ又はＢｒであり、Ｒ^２は、ＣＦ_３又はシクロプロピルであり、Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、Ｒ^４は、Ｈ又はＦである）を有する抗ウイルス化合物として有効な化合物が見出された。式（ＩＩＩ）を有する化合物の具体例は、化合物（１）及び化合物（２）、又は薬学的に許容されるそれらの塩を含む。

実施形態において、式（ＶＩ）

（式中、Ｒ^１は、ＣＮ又はＢｒであり、Ｒ^２は、ＣＦ_３又はシクロプロピルであり、Ｒ^３は、Ｈ又はＦである）を有する抗ウイルス化合物として有効な化合物が見出された。

式（ＶＩ）を有する化合物の具体例は、化合物（３）又は薬学的に許容されるその塩

である。

別の実施形態において、化合物（１）、化合物（２）、化合物（３）

の構造、又は薬学的に許容されるそれらの塩を有する、有効な抗ウイルス化合物である化合物が見出された。

別の実施形態において、本発明は、以下の構造

によって表される化合物を提供する。

コロナウイルスは、通常、ヒトにおける気道上部の軽度から中度の疾病を引き起こす、ウイルスの大きなファミリーである。しかし、３種のコロナウイルスは、ヒトにおいて、一層深刻な及び致死性の疾患を引き起こす：ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こし、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）は、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。特定されており、中度の呼吸器系感染の一因となる他のコロナウイルスには、ＯＣ４３コロナウイルス、ＨＫＵ１コロナウイルス、２２９Ｅコロナウイルス及びＮＬ６３コロナウイルスが挙げられる。ワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９の蔓延を遅らせ、ＣＯＶＩＤ－１９感染に伴う一層重度の症状を改善することに有効であることが証明されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントの増加、及び内在時間差のため、これらのバリアントに対して有効な新規ワクチンの開発が必要とされ、ＣＯＶＩＤ－１９及び他のコロナウイルスの感染の一層重度の副作用を低減することができる、有効な低分子化合物の必要性が生じている。

これらのウイルス及び他のウイルスの一般的な特徴は、ウイルスに関連するポリタンパク質の開裂を触媒するプロテアーゼが存在することである。これらのポリペプチドの開裂により、成熟した機能性ウイルスが生じる。したがって、これらのプロテアーゼの作用は、ウイルス複製にとって必須である。ウイルスのプロテアーゼは、広域抗ウイルス化合物の開発にとって、魅力的な標的になる。広域抗ウイルス化合物に対する潜在的なプロテアーゼ標的は、コロナウイルスを含む、多数のウイルスにおいて見出されているメインプロテアーゼ（ＭＰｒｏ）タンパク質である。

ＭＰｒｏのその阻害により、抗ウイルス化合物として有効な化合物が見出された。一実施形態において、抗ウイルス化合物は、式（Ｉ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＯＣＦ_３、ＯＣＨＦ_２、Ｃｌ又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^４は、Ｈ、Ｆ又はＣｌであり、
Ｒ^５は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^７は、Ｈ、ＯＣＨ_３又はＦであり、
Ｘは、Ｏ、ＣＲ^１０Ｒ^１１、ＮＲ^１２であり、
Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、ＳＯ_２－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）又はＣＮであり、
Ｒ^１４は、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又は＝Ｏであり、
Ｒ^１５は、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又は－ＯＣ_１～Ｃ_６アルキルである）
の構造を有する。一部の実施形態において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６又はＲ^７のうちの少なくとも１つは、Ｈではない。

用語「アルキル」とは、本明細書において使用する場合、一価の基Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１を含む化学置換基を一般に指し、ｎは、ゼロより大きな整数である。用語「アルキル」は、一価の分岐又は非分岐の無置換炭化水素基を含む。一部の実施形態において、ｎは、１～６である。例示的なアルキル（ａｌｋｙ）基には、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、２－プロペニル（又はアリル）、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル及びｉ－ブチル（又は２－メチルプロピル）が挙げられる。

一実施形態において、抗ウイルス化合物は、式（ＩＩ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＯＣＦ_３、ＯＣＨＦ_２、Ｃｌ又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^４は、Ｈ、Ｆ又はＣｌであり、
Ｒ^５は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^７は、Ｈ、ＯＣＨ_３又はＦである）
の構造を有する。一部の実施形態において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６又はＲ^７のうちの少なくとも１つは、Ｈではない。

一実施形態において、抗ウイルス化合物は、式（ＩＩＩ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ又はＢｒであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^４は、Ｈ又はＦである）
の構造を有する。

式（ＩＩＩ）を有する化合物の具体例は、以下に限定されないが、化合物（１）及び（２）

を含む。

一実施形態において、抗ウイルス化合物は、式（ＩＶ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＯＣＦ_３、ＯＣＨＦ_２、Ｃｌ又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^８は、Ｈ、ＣＨＦ_２、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はＯＣＨ_３であり、
Ｒ^９は、Ｈ、Ｆ又はＣｌであり、
Ｘは、Ｏ、ＣＲ^１０Ｒ^１１又はＮＲ^１２であり、
Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、ＳＯ_２－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）又はＣＮである）の構造を有する。一部の実施形態において、Ｒ^３、Ｒ^８又はＲ^９のうちの少なくとも１つは、Ｈではない。

一実施形態において、抗ウイルス化合物は、式（Ｖ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＯＣＦ_３、ＯＣＨＦ_２、Ｃｌ又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^８は、Ｈ、ＣＨＦ_２、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はＯＣＨ_３であり、
Ｒ^９は、Ｈ、Ｆ又はＣｌである）
の構造を有する。一部の実施形態において、Ｒ^３、Ｒ^８又はＲ^９のうちの少なくとも１つは、Ｈではない。

実施形態において、抗ウイルス化合物は、式（ＶＩ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ又はＢｒであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦである）
の構造を有する。

式（ＶＩ）を有する化合物の具体例は、化合物（３）

である。

一実施形態において、抗ウイルス化合物は、式（ＶＩＩ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＯＣＦ_３、ＯＣＨＦ_２、Ｃｌ又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^４は、Ｈ、Ｆ又はＣｌであり、
Ｒ^５は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^７は、Ｈ、ＯＣＨ_３又はＦであり、
Ｒ^１３は、

である）
の構造を有する。一部の実施形態において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６又はＲ^７のうちの少なくとも１つは、Ｈではない。

本発明の１つ以上の化合物は、これ自体、又は医薬組成物中において、ヒト患者に投与され得、この場合、該化合物は、ＣＯＶＩＤ－１９及び他のコロナウイルスの感染に伴う症状を処置又は改善する用量で、生物学的に好適な担体又は賦形剤と混合される。これらの化合物の混合物もまた、単純な混合物として、又は好適に製剤化された医薬組成物において、患者に投与され得る。治療有効用量とは、本明細書に記載されている疾患又は状態の予防又は弱化をもたらすのに十分な化合物（単数又は複数）のそのような量を指す。

本明細書に記載されている化合物又はその塩が使用されて、コロナウイルス感染に罹患している対象を処置することができる。本化合物は、Ｍｐｒｏの作用を阻害することによって、対象において、コロナウイルスが増殖する能力を低減すると考えられる。Ｍｐｒｏの阻害は、ウイルスに関連するポリタンパク質の開裂を撹乱し、ウイルスが、成熟した機能性ウイルスになること、及び／又は複製することを阻止する。実施形態において、コロナウイルス感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９感染）に罹患している対象を処置する方法は、治療有効量の本明細書に記載されている化合物を投与するステップを含む。コロナウイルス感染を処置するために使用され得る化合物は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている式（ＩＩＩ）を有する化合物及び式（ＶＩ）を有する化合物を含む。コロナウイルス感染を処置するために使用され得る具体的な化合物は、以下に限定されないが、本明細書に記載されている化合物（１）、化合物（２）及び化合物（３）を含む。

抗ウイルス化合物の合成
スキーム

スキーム１に示されている通り、式（１）の化合物（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、本明細書において定義されている通りである）を、塩化２，２，６，６－テトラメチルピペリジニルマグネシウム塩化リチウム、次いで、二酸化炭素ガスにより処理し、式（２）の化合物を得ることができる。この反応は、以下に限定されないが、テトラヒドロフランなどの溶媒中、低温において、通常、行われる。以下に限定されないが、ジイソプロピルエチルアミン、ジイソプロピルアミン又はトリエチルアミンなどの塩基の存在下において、式（２）の化合物と（Ｒ）－ｔｅｒｔ－ブチルピロリジン－３－イルカルバメートの反応により、式（３）の化合物を得ることができる。この反応は、高温において、及び以下に限定されないが、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド又はＮ－メチルピロリジノンなどの溶媒中において、通常、行われる。式（４）の化合物は、ＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート）の存在下において、式（３）の化合物を、モルホリン、次いで、以下に限定されないが、トリエチルアミンなどの塩基と反応させることによって調製され得る。この反応は、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどの溶媒中、周囲温度付近に反応混合物を維持しながら、通常、行われる。式（５）の化合物を得る、式（４）の化合物のＢｏｃ基の除去は、以下に限定されないが、シクロペンチルメチルエーテルなどの溶媒中、以下に限定されないが、塩酸などの酸を使用して行われ得る。

式（６）の化合物（Ｒ^３は、本明細書において定義されている通りである）は、酢酸中、式（７）の化合物（Ｒ^４は、本明細書において定義されている通りである）と反応させて、式（８）の化合物を得ることができる。この反応は、高温において、通常行われ、酢酸ナトリウムなどの塩基を含んでもよい。

式（８）の化合物は、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどの溶媒中、ＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）と反応させて、次いで、式（５）の化合物とＮ－メチルモルホリンとの混合物を添加すると、式（ＩＩＩ）の化合物を得ることができる。この反応は、周囲温度において、通常、行われる。

スキーム２は、式（ＶＩＩ）の化合物の合成を示す。式（９）のキノロン酸化合物（Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６及びＲ^７は、本明細書において定義されている通りである）は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、及び以下に限定されないが、ＥＤＣ（１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）などのカップリング試薬により処理することによって、式（１０）の活性化エステル種に変換することができる。この反応は、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどの溶媒中、周囲温度において、通常、行われる。

スキーム１に記載されている通りに調製することができる、式（３）のアミン（Ｒ^１及びＲ^２は、本明細書において定義されている通りである）は、以下に限定されないが、ジオキサンなどの溶媒中、塩酸などの酸により処理すると、式（１１）の化合物を得ることができる。

式（１０）の化合物は、式（１１）の化合物とカップリングさせて、式（１２）の化合物を得ることができる。この反応は、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどの溶媒中、周囲温度において、通常、行われる。式（１２）の化合物は、トリエチルアミンなどの塩基、及びＨＡＴＵ又はＥＤＣなどのカップリング剤の存在下、式（１３）の一級アミン又は二級アミン（Ｒ^１３は、本明細書に記載されている通りである）とのカップリングによって、式（ＶＩＩ）の化合物に変換され得る。この反応は、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどの溶媒中、周囲温度において、通常、行われる。

スキーム３に示されている通り、式（１４）の化合物（Ｒ^３、Ｒ^８及びＲ^９は、本明細書に記載されている通りである）は、ＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）などのカップリング剤との処理後に、式（１３）の化合物（Ｒ^１、Ｒ^２及びＸは、本明細書に記載されている通りである）と反応させて、式（１５）の化合物を得ることができる。この反応は、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどの溶媒中、周囲温度において、通常、行われる。式（１５）の化合物は、アセトニトリル中、塩化トリメチルシリル及びヨウ化カリウムからインシチュで形成させた、ヨウ化トリメチルシリルなどの試薬により処理し、式（ＩＶ）の化合物を得ることができる。この反応は、以下に限定されないが、アセトニトリルなどの溶媒中、高温において、通常、行われる。

［実施例１］
化合物（２）（Ｒ）－Ｎ－（１－（４－シアノ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）－８－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボオキサミドの合成

化合物２Ａ－塩化２，２，６，６－テトラメチルピペリジニルマグネシウム塩化リチウム錯体のテトラヒドロフラン中溶液の合成

この手順は、ｄｏｓＳａｎｔｏｓら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０２１年、ｖ２３、１９、７３９６－７４００ページから適用させた。１．３Ｍの塩化イソプロピルマグネシウム塩化リチウム錯体のテトラヒドロフラン中溶液（２００ｍＬ、２６０ｍｍｏｌ）を含有する５００ｍＬの丸底一つ口（２４／４０）フラスコを、窒素雰囲気下、１０分間かけてゆっくりと添加した２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（４６．３ｍＬ、２７３ｍｍｏｌ）により処理した。このフラスコをアルミニウムホイルで蓋をして、この混合物を４８時間、撹拌した。塩化２，２，６，６－テトラメチルピペリジニルマグネシウム塩化リチウム錯体（２Ａ）の得られた溶液は滴定を行わず、テトラヒドロフラン中、１．１Ｍであると見なした。

化合物２Ｂ－５－シアノ－２－フルオロ－３－（トリフルオロメチル）安息香酸の合成

３Ｌの１つ口丸底フラスコにおいて、４－フルオロ－３－（トリフルオロメチル）ベンゾニトリル（５０ｇ、２６４ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（１Ｌ）中溶液を、窒素雰囲気下、ドライアイス／アセトン浴中、－４０℃まで冷却し、約１５分間かけて、１．１Ｍの塩化２，２，６，６－テトラメチルピペリジニルマグネシウム塩化リチウム錯体のテトラヒドロフラン中溶液（２６４ｍＬ、２９１ｍｍｏｌ；化合物２Ａ）によりゆっくりと処理し、添加中、内温を－３５℃未満に維持した。この混合物を－１７℃まで温め、次に、１５分間、－１７℃～－１６℃の間に維持した。この混合物を－７８℃まで冷却し、二酸化炭素ガス流により処理した。二酸化炭素流は、ドライアイス（約２００ｇ）を含有する１Ｌの１つ口（２４／４０）丸底フラスコを使用して発生させた。ドライアイスを含有したフラスコに、カニューレ（約１３ゲージの内径、約８５ｍｍ長）を通したセプタム（２４／４０）を取り付け、カニューレのもう一方の端部を反応混合物に入れた。最初の５分間、二酸化炭素をゆっくりと添加している間、反応の内温を約－７５℃まで温めた。次に、ドライアイスを含む１Ｌのフラスコを、穏やかに温めて、ＣＯ_２の流量を増加し、この反応混合物を１０分間かけて、－７０℃まで徐々に温めた。二酸化炭素ガスの添加をさらに５分間（合計で２０分間）維持した（反応の内温は、この時点で－６９℃であった）。次に、この反応混合物をドライアイス浴から取り出し、温めた。反応が－１０℃に到達すると、氷浴中で冷却したヘプタン（２．５Ｌ）及び１Ｍ水性ＨＣｌ（７５０ｍＬ）を含有する、冷却した（約５℃）かき混ぜた６Ｌのエルレンマイヤーフラスコに、上記の混合物を小分けにして注ぎ入れた。得られた混合物を５Ｌの分液漏斗に移送した。最小量の１Ｍ水性ＨＣｌ、次いで酢酸エチルを使用して、フラスコ中の残留物をすすぎ、分液漏斗に入れた。この混合物を数分間、振とうして、存在した物質を溶解させた。有機層を分離し、さらに１Ｍ水性ＨＣｌ（７５０ｍＬ）により洗浄した。次に、有機層を飽和水性炭酸水素ナトリウム（５００ｍＬ）と水（５００ｍＬ）との１：１混合物により抽出した。この混合物を数分間、振とうした。この下側の水層を、氷浴中において冷却した、酢酸エチル（１．５Ｌ）及び３Ｍ水性ＨＣｌ（３５０ｍＬ）を含有する、かき混ぜた４Ｌのエルレンマイヤーフラスコに、直ちにゆっくりと（約５分間かけて）加えた。酢酸エチル層を分離し、ブライン（２×５０ｍＬ）で２回、洗浄し、脱水（硫酸マグネシウム）してろ過した。ろ液を濃縮すると、表題化合物（２Ｂ）が得られた。¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ ppm 8.55 (dd, J = 6.0, 2.3 Hz, 1H), 8.18 - 8.13 (m, 1H), 7.28 (bs, 1H).。

化合物２Ｃ－（Ｒ）－２－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ピロリジン－１－イル）－５－シアノ－３－（トリフルオロメチル）安息香酸の合成

化合物２Ｂ（２８．０ｇ、１２０ｍｍｏｌ）、（Ｒ）－ｔｅｒｔ－ブチルピロリジン－３－イルカルバメート（２３．９ｇ、１２８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（５２．３ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１９０ｍＬ）中溶液を６０℃において一晩、加熱し、室温にして、濃縮し、溶媒の大部分を除去した。残留混合物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２００ｍＬ）と１Ｍ水性クエン酸（２００ｍＬ）との間に分配し、分離した水相をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１００ｍＬ及び５０ｍＬ）により２回、抽出した。合わせた有機相を水、次にブラインにより洗浄し、脱水（Ｎａ_２ＳＯ_４）してろ過した。このろ液を濃縮すると、表題化合物（２Ｃ）が得られ、これをさらに精製することなく、次の工程に使用した。MS (APCI, M+H⁺) m/z 400; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 13.6 (bs, 1H), 8.21 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 4.12 - 4.02 (m, 1H), 3.54 - 3.46 (m, 1H), 3.44 - 3.3 (m, 2H), 3.15 (dd, J = 9.7, 5.5 Hz, 1H), 2.16 - 2.06 (m, 1H), 1.88 - 1.79 (m, 1H), 1.37 (s, 9H).。

化合物２Ｄ－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（１－（４－シアノ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）カルバメートの合成

化合物２Ｃ（≦１２０ｍｍｏｌ）及びモルホリン（１４．０ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）中溶液を、１０分間かけて、ＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート）（５４．７５ｇ、１４４ｍｍｏｌ）により処理し、水浴を利用して内温を２８℃未満に維持し、次いで、１２分間かけて、最初は一層、ゆっくりとトリエチルアミン（４２ｍＬ、３０１ｍｍｏｌ）により処理し、内温を３０℃未満に維持した。４０分後、この反応混合物を水（１５００ｍＬ）に注ぎ入れて、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５００、２５０及び２５０ｍＬ）により３回、抽出した。合わせた抽出物を水（５００ｍＬ）、次に、ブラインにより洗浄し、脱水（Ｎａ_２ＳＯ_４）してろ過した。このろ液を濃縮して、表題化合物をさらに精製することなく使用した。MS (APCI, M+H⁺) m/z 469; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 8.17 - 8.13 (m, 1H), 7.92 - 7.88 (m, 1H), 7.15 - 6.97 (m, 1H), 4.06 - 3.91 (m, 1H), 3.75 - 3.20 (m, 11H), 3.17 - 3.04 (m, 1H), 2.12 - 2.02 (m, 1H), 1.87 - 1.76 (m, 1H), 1.38 (s, 9H).

化合物２Ｅ－（Ｒ）－４－（３－アミノピロリジン－１－イル）－３－（モルホリン－４－カルボニル）－５－（トリフルオロメチル）ベンゾニトリル塩酸塩の合成

化合物２Ｄ（≦１２０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（３００ｍＬ）に溶解し、シクロペンチルメチルエーテル中の３ＭＨＣｌ（１２０ｍＬ、３６０ｍｍｏｌ）により処理し、１時間、撹拌した後、冷蔵庫に一晩、置いた。次に、この反応混合物を濃縮すると、表題化合物（２Ｅ）が得られ、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＡＰＣＩ、Ｍ＋Ｈ^＋）ｍ／ｚ３６９。

化合物２Ｆ－８－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸の合成

７－フルオロインドリン－２，３－ジオン（５５ｇ、３３３ｍｍｏｌ）、マロン酸（４１．６ｇ、４００ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（６８．３ｇ、８３３ｍｍｏｌ）の酢酸（５００ｍＬ）中懸濁液を１１２℃において一晩、加熱した。この反応混合物を室温まで冷却し、冷０．４Ｍ水性ＨＣｌ（２２００ｍＬ）に注ぎ入れた。沈殿物をろ過により採集し、氷冷水（約２５０ｍＬ）、次いでメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（約１００ｍＬ）により徹底的にすすぎ、次に、高真空を用いてアセトニトリルから２回、濃縮した。物質の大部分を１Ｍ水性ＮａＯＨ（３７０ｍＬ）に溶解し、０．１Ｍ水性ＮａＯＨ（５０ｍＬ）のすすぎ液を用いて、珪藻土に通してろ過した。次に、ろ液をジクロロメタン（３ｘ２００ｍＬ）により３回、洗浄し、これによって脱色された。この水層を珪藻土に再度、通してろ過した後、濃水性ＨＣｌ（３３ｍＬ、約０．４モル）を滴下して添加することによって水層を酸性にした。この物質をろ過により採集した。加熱及び真空下において長期間、乾燥した後、この物質を水（１Ｌ）により処理し、この混合物を少量の１Ｍ水性ＨＣｌを添加することによって酸性にした。懸濁液を８０℃まで加熱し、次に、室温までゆっくりと冷却した。得られた物質をろ過により採集し、０．０１Ｍ水性ＨＣｌ（１５０ｍＬ）により洗浄して、真空下、８０℃において乾燥すると、表題化合物（２Ｆ）が得られた。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 14.00 (bs, 1H), 12.07 (bs, 1H), 8.00 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 7.49 (ddd, J = 11.0, 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.23 (ddd, J = 8.2, 8.1, 5.2 Hz, 1H), 6.95 (s, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm 165.75 - 165.73 (m), 160.30, 148.75 (d, J = 246.0 Hz), 140.85 - 140.80 (m), 128.11 (d, J = 13.7 Hz), 123.85, 121.60 - 121.53 (m), 121.53 - 121.43 (m), 117.70 - 117.65 (m), 115.33 (d, J = 17.2 Hz); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm -130.47 (dd, J = 10.9, 5.3 Hz); MS (APCI, M+H⁺) m/z 208.

化合物２Ｇ－（Ｒ）－Ｎ－（１－（４－シアノ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）－８－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボオキサミド（２）の合成

無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３６０ｍＬ）中の化合物２Ｆ（２９．８４ｇ、１４４ｍｍｏｌ）の混合物に、室温において１２分間かけて、ＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）（４３．１７ｇ、１５６ｍｍｏｌ）を加えた。この懸濁液を４０分間、撹拌した後、この懸濁液を、化合物２Ｅ（≦１２０ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（１６ｍＬ、１４６ｍｍｏｌ）の、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）すすぎ液を含むＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１２０ｍＬ）中懸濁液に、８分間かけて加えた。４０分後、この反応混合物を高速に撹拌した０．１Ｍ水性Ｋ_２ＨＰＯ_４（２．５Ｌ）に加え、４：１の酢酸イソプロピル／ヘプタンにより４回、次に、酢酸イソプロピル単独で１回、抽出した。生成物は、合わせた抽出物から沈殿し始め、これをデカンテーション、及びろ過によって分離し、次に、ジクロロメタンにより洗浄した。残留水相を酢酸イソプロピルにより２回、さらに抽出し、すべての有機抽出物を一緒にして、次に、追加の０．１Ｍ水性Ｋ_２ＨＰＯ_４、次いで水により洗浄し、脱水（Ｎａ_２ＳＯ_４）してろ過した。ろ液を、上で採集した物質のジクロロメタン洗液と共に濃縮した。残留物を濃縮して、アセトニトリル／ＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、ろ過してシリカ上のクロマトグラフィー（２０～１００％アセトニトリル／ＣＨ_２Ｃｌ_２）によって精製した。採集したフラクションを少量になるまで濃縮し、酢酸エチル中で一晩、撹拌した。

懸濁液を７０℃において２０分間、加熱し、次に、室温までゆっくりと冷却した。メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを撹拌して入れ、懸濁液を０℃まで冷却し、精製した生成物を、１：１酢酸エチル／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、次いでメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルのすすぎ液を用いてろ過により採集した後、真空下、加熱して乾燥した。前の抽出から先に得られた物質も酢酸エチル中で撹拌し、７０℃において加熱し、次に、室温までゆっくりと冷却した。メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを撹拌して入れ、懸濁液を０℃まで冷却し、精製生物を、１：１酢酸エチル／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルのすすぎ液、次いでメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いてろ過することによって採集した。この物質を真空下で一晩、乾燥し、表題化合物（２）を得た。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 11.96 (s, 1H), 9.03 - 8.84 (m, 1H), 8.21 - 8.18 (m, 1H), 7.98 - 7.93 (m, 1H), 7.56 - 7.50 (m, 1H), 7.49 - 7.43 (m, 1H), 7.21 - 7.15 (m, 1H), 6.66 - 6.59 (m, 1H), 4.51 - 4.40 (m, 1H), 3.73 - 3.55 (m, 6H), 3.54 - 3.22 (m, 6H), 2.29 - 2.18 (m, 1H), 2.07 - 1.95 (m, 1H); ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm 11.47 (bs, 1H), 8.77 - 8.47 (m, 1H), 8.09 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.54 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.39 (ddd, J = 11.0, 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.15 (ddd, J = 8.1, 8.1, 5.1 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 4.54 - 4.43 (m, 1H), 3.74 - 3.20 (m, 12H), 2.31 - 2.21 (m, 1H), 2.06 - 1.96 (m, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm 166.61, 165.97, 161.31, 149.59 (d, J = 246.3 Hz), 148.95, 146.10 - 146.03 (m), 136.00, 135.65, 133.13 (q, J = 6.1 Hz), 128.84 - 128.63 (m), 123.76 (q, J = 273.7 Hz), 122.19, 122.16, 122.12, 121.60, 118.99 - 118.91 (m), 117.75, 116.17 (d, J = 17.3 Hz), 105.57, 66.04, 57.95, 51.06, 50.35, 47.74, 42.35, 31.54; ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ ppm -57.54 - -58.10 (m), -130.02 - -130.15 (m); ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm -58.37 - -58.97 (m), -130.96 (dd, J = 11.0, 5.1 Hz). MS (APCI, M+H⁺) m/z 558.

［実施例２］
－化合物（１）の合成

（Ｒ）－Ｎ－（１－（４－ブロモ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）－８－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボオキサミド（１）

化合物１Ａ－５－ブロモ－２－フルオロ－３－（トリフルオロメチル）安息香酸の合成

３Ｌの１つ口丸底フラスコにおいて、５－ブロモ－２－フルオロベンゾトリフルオリド（６４．２ｇ、２６４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１Ｌ）中溶液を、窒素雰囲気下、－４０℃まで冷却し、１５分間かけて１．１Ｍ塩化２，２，６，６－テトラメチルピペリジニルマグネシウム塩化リチウム錯体のテトラヒドロフラン中溶液（２６４ｍＬ、２９０ｍｍｏｌ）により処理し、次に、０℃まで温めた。この混合物を０℃において１５分間、撹拌し、次に、－７８℃まで冷却した。この混合物を二酸化炭素ガス流により処理した。二酸化炭素流は、ドライアイス（約２００ｇ）を含有する１Ｌの１つ口（２４／４０）丸底フラスコを使用して発生させた。ドライアイスを含有したフラスコに、カニューレ（約１３ゲージの内径、約８５ｍｍ長）を通したセプタム（２４／４０）を取り付け、カニューレのもう一方の端部を反応混合物に入れた。最初の５分間にＣＯ_２をゆっくりと添加している間、反応物の内温を約－７５℃まで穏やかに温めた。次に、ドライアイスを含む１Ｌのフラスコを、穏やかに温めて、ＣＯ_２の流量を増加させて、この反応混合物を１０分間かけて、－７０℃まで徐々に温めた。ＣＯ_２添加をさらに５分間（合計で２０分間）維持した（反応の内温は、この時点で－６９℃であった）。この反応混合物をドライアイス浴から取り出し、温めた。反応が－１０℃に到達すると、氷浴中で冷却したヘプタン（２．５Ｌ）及び１Ｍ水性ＨＣｌ（７５０ｍＬ）を含有する、冷却した（約５℃）かき混ぜた６Ｌのエルレンマイヤーフラスコに、上記の混合物を小分けにして注ぎ入れた。得られた混合物を５Ｌの分液漏斗に移送した。最小量の１Ｍ水性ＨＣｌ、次いで酢酸エチルを使用して、フラスコ中の残留物をすすぎ、分液漏斗に入れた。分液漏斗中のこの混合物を数分間、振とうした。有機層を分離し、さらに１Ｍ水性ＨＣｌ（７５０ｍＬ）により洗浄した。次に、有機層を飽和水性ＮａＨＣＯ_３（５００ｍＬ）と水（５００ｍＬ）との１：１混合物により抽出した。分液漏斗中のこの混合物を数分間、振とうした。次に、この下側の水層を約５分間かけて、氷浴中において冷却した、酢酸エチル（１．５Ｌ）及び３Ｍ水性ＨＣｌ（３５０ｍＬ）を含有する、かき混ぜた４Ｌのエルレンマイヤーフラスコに加えた。酢酸エチル層を分離し、ブライン（２ｘ５０ｍＬ）で２回、洗浄し、脱水（硫酸マグネシウム）してろ過した。ろ液を濃縮すると、表題化合物（１Ａ）が得られた。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ ppm 8.34 (dd, J = 5.8, 2.6 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 5.6, 2.6 Hz, 1H). ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 14.02 (s, 1H), 8.26 (dd, J = 6.0, 2.6 Hz, 1H), 8.23 (dd, J = 5.7, 2.6 Hz, 1H).

化合物１Ｂ－（Ｒ）－５－ブロモ－２－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ピロリジン－１－イル）－３－（トリフルオロメチル）安息香酸

選択肢１、Ｋ_２ＣＯ_３法
機械式撹拌器を装備した１Ｌの３つ口丸底フラスコにおいて、ジメチルスルホキシド（４００ｍＬ）中の化合物１Ａ（４０ｇ、１３９ｍｍｏｌ）、（Ｒ）－３－（Ｂｏｃ－アミノ）ピロリジン（３１．１ｇ、１６７ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（７７ｇ、５５７ｍｍｏｌ）からなる混合物を、窒素雰囲気下、１２５℃において２０時間、機械的に撹拌した。この混合物を冷却すると、かなり濃厚になった。水浴中に冷却した、１Ｍ水性ＨＣｌ（１Ｌ）及びヘプタン（１Ｌ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）との混合物を含む、かき混ぜた４Ｌのエルレンマイヤーフラスコに、上記の混合物を小分けにして加えた。この混合物を分液漏斗に移送し、振とうし、層を分離した。次に、水層をヘプタン（５００ｍＬ）と酢酸エチル（１００ｍＬ）との混合物により抽出した。有機層を合わせ、０．０１Ｍ水性ＨＣｌ（２ｘ４００ｍＬ）により２回、洗浄し、ブライン（５０ｍＬ）により洗浄して脱水（硫酸マグネシウム）し、ろ過した。ろ液を濃縮すると、表題化合物（１Ｂ）と５－ブロモ－２－フルオロ－３－（トリフルオロメチル）安息香酸との混合物が得られた。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 13.78 (s, 1H), 8.05 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.09 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.32 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 3.22 - 3.13 (m, 2H), 3.00 - 2.94 (m, 1H), 2.14 - 2.04 (m, 1H), 1.81 (dq, J = 12.0, 8.0 Hz, 1H), 1.38 (s, 9H); LC/MS (ESI+) m/z 453,455 (M+H)⁺.

化合物１Ｃ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－イウム（Ｒ）－５－ブロモ－２－（３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ピロリジン－１－イル）－３－（トリフルオロメチル）ベンゾエートの合成

選択肢２、ＴＭＰ法
無水１－メチル－２－ピロリジノン（１８０ｍＬ）中の（Ｒ）－３－（Ｂｏｃ－アミノ）ピロリジン（４３．８ｇ、２３５ｍｍｏｌ）、化合物１Ａ（４５ｇ、１５７ｍｍｏｌ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（６６．４ｇ、４７０ｍｍｏｌ）からなる混合物を窒素雰囲気下、１００℃まで一晩、加熱した。反応混合物の少量の一定分量を試験管に移し、水により希釈した。この一定分量／水の混合物を、スパチュラを用いて約４５分間、断続的に撹拌し、沈殿物が形成した。次に、この反応混合物を加熱マントルから取り出し、冷却した。内温を３４℃まで冷却すると、この混合物を水（９０ｍＬ）により約９分間かけて、処理した。この混合物を５分間、撹拌し、次に、一定分量からの沈殿物により処理し、この混合物を室温で１時間、撹拌した。次に、この混合物を５５℃まで加熱し、さらなる水（２７０ｍＬ）により３５分間かけて処理し、次に、室温において４時間、撹拌した。物質をブフナー漏斗中にろ過により採集し、水（３ｘ２２５ｍＬ）により洗浄し、ブフナー漏斗中、１時間、真空流により乾燥し、次に、６５℃において真空下、一晩、乾燥すると、表題化合物（１Ｃ）が得られた。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 8.43 (s, 2H), 7.66 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.12 - 4.04 (m, 1H), 3.45 - 3.38 (m, 2H), 3.12 - 3.04 (m, 2H), 2.00 - 1.90 (m, 1H), 1.73 - 1.63 (m, 3H), 1.58 - 1.52 (m, 4H), 1.39 (s, 9H), 1.35 (s, 12H); ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm 7.72 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 4.14 - 4.06 (m, 1H), 3.46 (dd, J = 8.7, 6.6 Hz, 1H), 3.41 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 3.15 - 3.09 (m, 2H), 2.01 (dtd, J = 12.0, 7.8, 6.4 Hz, 1H), 1.79 - 1.65 (m, 3H), 1.58 - 1.53 (m, 5H), 1.41 (s, 9H), 1.34 (s, 12H); LC/MS (ESI+) m/z 453,455 (M+H)⁺.

化合物１Ｄ－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（１－（４－ブロモ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）カルバメートの合成

選択肢１、化合物１Ｂから
化合物１Ｂ（６３．０ｇ、１３９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３４０ｍＬ）中溶液を０℃まで冷却し、モルホリン（１４．５３ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）により処理し（２℃から６℃まで軽度の発熱）、冷却して２℃に戻し、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（６８．７ｇ、１８１ｍｍｏｌ）を３分の１ずつの分量で処理（各分量の添加後に４℃までの軽度の発熱）し、反応温度が８℃を超えて発熱しないよう、トリエチルアミン（４８．４ｍＬ、３４８ｍｍｏｌ）によりゆっくりと処理した。この反応物を室温において４５分間、撹拌した。この混合物をヘプタン（５００ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）の溶液により希釈し、０℃まで冷却した。この混合物を、氷浴において０℃付近の１．６Ｌの水を含む、かき混ぜた４Ｌのエルレンマイヤーフラスコに加えた。この混合物を４Ｌの分液漏斗に移送し、層を分離した。水層をヘプタン（５００ｍＬ）と酢酸エチル（１００ｍＬ）との混合物により抽出した。有機層を合わせ、水により２回、洗浄（２ｘ４００ｍＬ）し、ブライン（５０ｍＬ）により洗浄して脱水（硫酸マグネシウム）し、ろ過した。ろ液を濃縮し、ほぼ１００ｍＬの体積にした。スパチュラを使用して、フラスコの側面から物質を擦り落とした。

この物質をろ過により採集し、４０：１のヘプタン：酢酸エチルによって洗浄すると物質が得られ、これを５０℃において一晩、真空下で乾燥すると、（５－ブロモ－２－フルオロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）（モルホリノ）メタノンが混入した、所望の生成物である（Ｒ）－ｔｅｒｔ－ブチル（１－（４－ブロモ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）カルバメートが得られた。この反応からの生成物を別の実施に由来する同一生成物と一緒にし、酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解した。この溶液をヘプタンにより希釈し、１：１ヘプタン：酢酸エチルにより溶出する、シリカゲル（２００ｇのシリカゲル、２４ｃｍ×４．５ｃｍカラム）上でクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含むフラクションを濃縮した。残留物をヘプタン（３５０ｍＬ）により処理し、フラスコを約１５分間、手作業によりかき混ぜて、この物質の大部分を溶解した。この混合物を室温において１５分間、静置した。この物質をフラスコの側面から擦り落とした。この物質をろ過により採集し、ヘプタンを用いて洗浄した。この物質を真空下、５５℃で約１．５時間、乾燥すると、表題化合物（１Ｄ）が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 7.86 (m, 1H), 7.81 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H), 7.79 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H), 6.98 (d, J = 6.7 Hz, 0.5H), 6.82 (d, J = 6.8 Hz, 0.5H), 3.96 (m, 1H), 3.77 - 3.54 (m, 3H), 3.46 (m, 1H), 3.36 - 3.13 (s, 4.5H), 3.10 (q, J = 7.5 Hz, 0.5H), 2.97 (dd, J = 8.9, 5.9 Hz, 0.5H), 2.90 (t, J = 7.4 Hz, 0.5H), 2.08 - 1.99 (m, 1H), 1.82 - 1.67 (m, 1H), 1.38 (s, 4.5H), 1.38 (s, 4.5H); LC/MS (ESI+) m/z 522,524 (M+H)⁺.

選択肢２、化合物１Ｃから
化合物１Ｃ（６０ｇ、１０１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２４０ｍＬ）中溶液を０℃まで冷却し、モルホリン（１０．５５ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）（３℃までの軽度の発熱）によりゆっくりと処理し、２５分間かけて小分けにして１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（４９．９ｇ、１３１ｍｍｏｌ）により処理（添加の間、２．７～３．３℃の間の軽度の発熱）し、反応温度が４℃を超えて発熱しないよう、トリエチルアミン（３５．２ｍＬ、２５２ｍｍｏｌ）によりゆっくりと処理した。この反応混合物を冷却浴から取り出し、室温において２０分間、撹拌した。この反応混合物を酢酸エチル（４５ｍＬ）により希釈し、氷浴中で約３Ｃまで冷却し、冷却（氷浴）してかき混ぜた、酢酸エチル（４５ｍＬ）、ヘプタン（４５０ｍＬ）及び水（１．２Ｌ）を含有する４Ｌのエルレンマイヤーフラスコに移した。この混合物を分液漏斗に移送した。この混合物を振とう後、層を分離し、水層を５：１のヘプタン：酢酸エチル（５００ｍＬ）により抽出した。

合わせた有機層を水（２ｘ３００ｍＬ）により２回、洗浄し、ブラインにより洗浄し、脱水（硫酸マグネシウム）してろ過した。ろ液をほぼ２００ｍＬの量になるまで濃縮した。フラスコの側面に付着した物質を、スパチュラを使用して擦り落とした。この物質をろ過によって単離し、冷（約５℃）の４０：１のヘプタン：酢酸エチルにより洗浄し、真空流下、３０分間、乾燥し、次に、６５℃の乾燥オーブン中、真空下、一晩、乾燥すると、表題化合物（１Ｄ）が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 7.86 (m, 1H), 7.81 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H), 7.79 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H), 6.98 (d, J = 6.7 Hz, 0.5H), 6.82 (d, J = 6.8 Hz, 0.5H), 3.96 (m, 1H), 3.77 - 3.54 (m, 3H), 3.46 (m, 1H), 3.36 - 3.13 (s, 4.5H), 3.10 (q, J = 7.5 Hz, 0.5H), 2.97 (dd, J = 8.9, 5.9 Hz, 0.5H), 2.90 (t, J = 7.4 Hz, 0.5H), 2.08 - 1.99 (m, 1H), 1.82 - 1.67 (m, 1H), 1.38 (s, 4.5H), 1.38 (s, 4.5H); LC/MS (ESI+) m/z 522,524 (M+H)⁺.

化合物１Ｅ－（Ｒ）－（２－（３－アミノピロリジン－１－イル）－５－ブロモ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）（モルホリノ）メタノン塩酸塩の合成

化合物１Ｄ（７９．２ｇ、１５２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１６０ｍＬ、無水）中懸濁液を、シクロペンチルメチルエーテル中の３ＭＨＣｌ（１５２ｍＬ、４５５ｍｍｏｌ）により処理した。この混合物を室温において一晩、撹拌した。次に、この混合物を回転式蒸発器で濃縮すると、表題化合物（１Ｅ）が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 8.51 - 8.39 (m, 3H), 7.89 (見かけd, J = 2.4 Hz, 1H), 7.86 (見かけdd, J = 4.3, 2.4 Hz, 1H), 3.78 - 3.35 (m, 8H), 3.32 - 3.07 (m, 5H), 2.27 - 2.19 (m, 1H), 1.98 - 1.85 (m, 1H); LC/MS (ESI+) m/z 422,424 (M+H)⁺.

化合物１Ｆ－（Ｒ）－Ｎ－（１－（４－ブロモ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）－８－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボオキサミドの合成

８－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸（７．６６ｇ、３７．０ｍｍｏｌ；化合物２Ｆ）と、先に粉砕したＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）（１１．０７ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）との混合物を無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１１０ｍＬ）に入れて、３０分間、撹拌した。次に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）すすぎ液と共に、化合物１Ｅ（約２８．７ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（４．０７ｍＬ、３７．０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中溶液を加えた。４０分後、この反応混合物を高速に撹拌した水（７５０ｍＬ）にゆっくりと加えた。得られた懸濁液を７℃まで冷却し、氷冷水のすすぎ液を用いて、この物質をろ過することにより採集した。採集用フラスコを交換し、ジクロロメタンを使用して物質をすすいだ。ろ液中で分離した水相をジクロロメタンにより抽出し、合わせた抽出物を希ブラインにより洗浄して脱水（Ｎａ_２ＳＯ_４）し、濃縮してろ過し、シリカ上でクロマトグラフィー（４０～１００％の酢酸エチル／ジクロロメタン）にかけた。適切なフラクションを合わせて、濃縮し、次にアセトニトリルにとった。懸濁液を酢酸エチルにより希釈し、酢酸エチルすすぎ液を用いてこの物質をろ過により採集した。

ろ液からかなりの分量のさらなる物質が沈殿し、これらもろ過によって採集したが、１：１酢酸エチル／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにより洗浄した。この物質を真空下で一晩置き、次に、砕いて、穏やかに加熱しながら、真空下でさらに乾燥すると、表題化合物が得られた。最終的に、追加量の物質が、最初の方のろ液から得られ、１００％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにより洗浄し、次に、穏やかに加熱しながら、真空下で乾燥すると、さらなる表題化合物（１）が得られた。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 11.95 (s, 1H), 8.98 - 8.78 (m, 1H), 7.91 - 7.87 (m, 1H), 7.86 - 7.82 (m, 1H), 7.56 - 7.50 (m, 1H), 7.50 - 7.43 (m, 1H), 7.22 - 7.15 (m, 1H), 6.66 - 6.59 (m, 1H), 4.48 - 4.37 (m, 1H), 3.74 - 3.42 (m, 7H), 3.32 - 3.06 (m, 5H), 2.28 - 2.14 (m, 1H), 2.01 - 1.85 (m, 1H); ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 120℃) δ ppm 11.24 (bs, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.79 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.59 - 7.52 (m, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 1H), 7.17 - 7.10 (m, 1H), 6.59 (s, 1H), 4.52 - 4.41 (m, 1H), 3.70 - 3.20 (m, 11H), 3.19 - 3.12 (m, 1H), 2.28 - 2.18 (m, 1H), 2.01 - 1.91 (m, 1H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm 165.40, 164.92, 160.40, 148.65 (d, J = 246.3 Hz), 145.32 - 145.24 (m), 143.44, 139.57, 134.05, 130.85 (q, J = 29.5 Hz), 130.08 (q, J = 5.8 Hz), 127.91 - 127.69 (m), 122.58 (q, J = 274.1 Hz), 121.30 - 121.22 (m), 121.24 - 121.16 (m), 120.59, 118.10 - 118.02 (m), 116.72, 115.21 (d, J = 17.3 Hz), 65.15, 57.22, 50.36, 49.59, 46.82, 41.35, 30.91; ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm -60.16 (s), -131.01 (dd, J = 11.0, 5.2 Hz); MS (ESI, M+H⁺) m/z 611/613.

［実施例３］
－化合物（３）の合成

（Ｒ）－Ｎ－（１－（４－ブロモ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）－３－フルオロ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－４－カルボオキサミド

化合物３Ａ－（Ｒ）－Ｎ－（１－（４－ブロモ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）－３－フルオロ－２－メトキシ－６－メチルイソニコチンアミドの合成

３－フルオロ－２－メトキシ－６－メチルイソニコチン酸（７７３ｍｇ、４．１７ｍｍｏｌ）及び４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン－４－イウムクロリド（１．２５２ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）からなる混合物を無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に入れて、音波処理してより大きな試薬の粒子を砕き、室温において４０分間、撹拌した。次に、ガラス製ピペットを用いて、この懸濁液を化合物１Ｅ（１．５９９ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（４２０μＬ、３．８２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中溶液に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）すすぎ液と共に移した。２０分後、この反応混合物を、高速に撹拌した水（７０ｍＬ）に、アセトニトリルすすぎ液と共に滴下して加えた。得られた懸濁液を、水氷浴を用いて５℃まで冷却し、物質を氷冷水により徹底的に洗浄しながらろ過により採集し、次に、穏やかな加熱及び窒素流と共に真空下で乾燥した。この物質をクロロホルムに溶解した。かなり多い水層が存在した。有機層を分離して、脱水（Ｎａ_２ＳＯ_４）し、シリカゲルに通して最初に７０％ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルにより溶出し、次に、ヘプタンにより溶出し、次に、１００％ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルによりさらに溶出してろ過すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm 8.27 8.16 (m, 1H), 7.82 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.46 4.37 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.72 3.43 (m, 7H), 3.34 3.16 (m, 4H), 3.11 3.04 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.25 2.15 (m, 1H), 1.95 1.85 (m, 1H). LC/MS (ESI+) m/z 589,591 (M+H)⁺.

化合物３Ｂ－（Ｒ）－Ｎ－（１－（４－ブロモ－２－（モルホリン－４－カルボニル）－６－（トリフルオロメチル）フェニル）ピロリジン－３－イル）－３－フルオロ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－４－カルボオキサミド（３）の合成

窒素下、化合物３Ａ（１．８８３ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（２．６５ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１５ｍＬ）中懸濁液に、クロロトリメチルシラン（２．０２ｍＬ、１５．９ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。この反応混合物を６５℃まで加熱し、４時間、６５℃に維持した。次に、この混合物を水氷浴により冷却し、２Ｍ水性Ｋ_２ＣＯ_３を用いてクエンチした。水性ＨＣｌを加えて、ｐＨを７に調節した。この混合物を酢酸エチルにより数回、抽出した。合わせた抽出物を脱水（Ｎａ_２ＳＯ_４）してろ過し、ろ液を濃縮した。残留物をシリカゲルにおいてクロマトグラフィーにかけ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２０～１００％の酢酸エチルのグラジエントを用いて溶出し、次に、酢酸エチル中の２％メタノールによりさらに溶出すると、表題化合物（３）が得られた。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.22 (s, 1H), 8.70 8.50 (m, 1H), 7.90 7.86 (m, 1H), 7.85 7.81 (m, 1H), 6.00 5.94 (m, 1H), 4.41 4.29 (m, 1H), 3.75 3.38 (m, 7H), 3.31 3.13 (m, 4H), 3.08 2.97 (m, 1H), 2.23 2.10 (m, 4H), 1.93 1.78 (m, 1H). LC/MS (ESI+) m/z 575,577 (M+H)⁺. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 90℃) δ ppm 11.88 (bs, 1H), 8.19 (bs, 1H), 7.84 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.41 (h, J = 6.6 Hz, 1H), 3.76 - 3.04 (m, 12H), 2.26 - 2.15 (m, 4H), 1.95 - 1.84 (m, 1H).

［実施例４］
－ビルディングブロックの合成
３，８－ジフルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸

酢酸（３９０ｍＬ）中に２－フルオロマロン酸（５０ｇ、４１０ｍｍｏｌ）及び７－フルオロインドリン－２，３－ジオン（４５．１ｇ、２７３ｍｍｏｌ）を懸濁させて、この懸濁液を１６時間、９０℃まで加熱した。この混合物を１時間かけて室温まで冷却し、次に、沈殿物をろ過により採集した。この物質を３０ｍＬの酢酸により洗浄し、次に、漏斗中において、空気流下、一定重量になるまで乾燥すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.61 (s, 1H), 7.49 (ddd, J = 11.0, 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.44 (dt, J = 8.2, 0.9 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 8.1, 5.0 Hz, 1H); MS (LSI) m/z = 226 (M+H)⁺.

３－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸

４－ブロモ－２－フルオロ－３－オキソ－Ｎ－フェニルブタンアミド

アセトニトリル（３２．８ｍＬ）中の４－ブロモ－３－オキソ－Ｎ－フェニルブタンアミド（１．５５７５ｇ、４．９３ｍｍｏｌ）及び（１－クロロメチル－４－フルオロ－１，４－ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボレート））（１．９２０ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）からなる混合物を２時間、６０℃に加熱した。この反応物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。得られた残留物をジクロロメタンに溶解し、水（２×）により洗浄した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムにより脱水し、ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＳｅｌｅｋｔ、０～２５％酢酸エチル／ヘキサン、５０ｇＢｉｏｔａｇｅＳＦａｒＨＣシリカカラム）により精製し、表題化合物が得られた。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ ppm 7.98 (s, 1H), 7.52 (dt, J = 7.8, 1.1 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 8.5, 7.5 Hz, 2H), 7.23 - 7.17 (m, 1H), 5.78 (d, J = 48.5 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 13.0, 0.7 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 12.9, 2.7 Hz, 1H); MS (APCI) m/z = 274 (M+H)⁺.

４－（ブロモメチル）－３－フルオロキノリン－２（１Ｈ）－オン

硫酸（濃）（２．９０ｍＬ）中の４－ブロモ－２－フルオロ－３－オキソ－Ｎ－フェニルブタンアミド（０．７５６ｇ、２．７６ｍｍｏｌ）の混合物を１時間、４５℃まで加熱した。次に、この反応物を室温まで冷却し、氷水に注ぎ入れた。得られた物質をろ過し、水、１０％水性ＮａＨＣＯ_３により洗浄し、再度、水により洗浄すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ ppm 9.83 (s, 1H), 7.71 (dd, J = 5.7, 3.3 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 5.7, 3.3 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 2.1 Hz, 2H); MS (LSI) m/z = 256 (M+H)⁺.

３－フルオロ－４－（ヒドロキシメチル）キノリン－２（１Ｈ）－オン

１Ｍ水性ＮａＯＨ（４．１３ｍＬ、４．１３ｍｍｏｌ）中の４－（ブロモメチル）－３－フルオロキノリン－２（１Ｈ）－オン（０．５２９ｇ、２．０６４ｍｍｏｌ）の混合物を３０分間、７０℃まで加熱した。反応物を室温まで冷却し、水により希釈した。水層を最初に、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルにより、次に、酢酸エチルにより洗浄した。次に、水層を３Ｍ水性ＨＣｌによりｐＨ約２へと酸性にし、酢酸エチルにより抽出した（×３）。後の３回分の酢酸エチル層を一緒にし、ブラインにより洗浄し、無水硫酸ナトリウムにより脱水してろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、表題化合物が得られた。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 10.99 (s, 1H), 7.96 (tt, J = 16.0, 8.0 Hz, 1H), 7.52 - 7.42 (m, 1H), 7.33 (q, J = 9.4, 8.7 Hz, 2H), 5.16 - 4.95 (m, 2H); MS (LSI) m/z = 194 (M+H)⁺.

３－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボアルデヒド

３－フルオロ－４－（ヒドロキシメチル）キノリン－２（１Ｈ）－オン（０．１４６ｇ、０．７５５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５．０３ｍＬ）中溶液に、０℃において、デス－マーチンペルヨージナン（１，１，１－トリス（アセチルオキシ）－１，１－ジヒドロ－１，２－ベンゾジオキソール－３－（１Ｈ）－オン）（０．３５２ｇ、０．８３０ｍｍｏｌ）を加えた。２時間、撹拌しながら、この反応物を室温までゆっくりと温めた。水（５滴）を加え、この混合物を１時間、撹拌した。次に、この反応物を酢酸エチルにより希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムと飽和チオ硫酸ナトリウムとの１：１混合物を用いて２回洗浄した。次に、有機相をブラインにより洗浄し、無水硫酸ナトリウムにより脱水してろ過し、ろ液を減圧下で濃縮すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.69 (s, 1H), 10.56 (s, 1H), 8.49 (dt, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 7.56 (ddd, J = 8.5, 7.2, 1.4 Hz, 1H), 7.40 (ddd, J = 8.2, 1.3, 0.5 Hz, 1H), 7.32 (ddd, J = 8.3, 7.2, 1.3 Hz, 1H); MS (LSI) m/z = 192 (M+H)⁺.

テトラヒドロフラン（５．００ｍＬ）及びｔｅｒｔ－ブタノール（１．２５ｍＬ）の４：１混合物中の３－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボアルデヒド（０．１０８ｇ、０．５６４ｍｍｏｌ）及び２－メチル－２－ブテン（０．５９８ｍＬ、５．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、亜塩素酸ナトリウム（０．２０４ｇ、２．２５８ｍｍｏｌ）及びリン酸二水素ナトリウム（０．５４２ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）の水（５．００ｍＬ）中溶液を加え、この反応物を室温において１時間、撹拌した。次に、この反応物を水及び酢酸エチルにより希釈し、層を分離し、所望の生成物は水層に存在した。濃ＨＣｌを用いて水層を酸性にしてｐＨ約２にし、酢酸エチルにより抽出した（３×）。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムにより脱水してろ過し、ろ液を減圧下で濃縮すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.53 (s, 1H), 7.60 (dd, J = 8.1, 1.4 Hz, 1H), 7.57 (ddd, J = 8.5, 7.1, 1.4 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 8.3, 1.2 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.6, 7.1, 1.1 Hz, 1H); MS (LSI) m/z = 208 (M+H)⁺.

３，７，８－トリフルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸

３，７，８－トリフルオロ－４－（ヒドロキシメチル）キノリン－２（１Ｈ）－オン

４－（ブロモメチル）－３－フルオロキノリン－２（１Ｈ）－オンを４－（ブロモメチル）－３，７，８－トリフルオロキノリン－２（１Ｈ）－オンに置き換えて、３－フルオロ－４－（ヒドロキシメチル）キノリン－２（１Ｈ）－オンに関する手順に従って合成した。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 10.33 - 9.71 (m, 1H), 7.74 (ddd, J = 9.2, 4.8, 2.1 Hz, 1H), 7.15 (td, J = 9.4, 7.5 Hz, 1H), 7.01 - 6.94 (m, 1H), 5.01 (d, J = 2.6 Hz, 2H); MS (LSI) m/z = 230 (M+H)⁺.

３，７，８－トリフルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボアルデヒド

３－フルオロ－４－（ヒドロキシメチル）キノリン－２（１Ｈ）－オンを３，７，８－トリフルオロ－４－（ヒドロキシメチル）キノリン－２（１Ｈ）－オンに置き代えて、３－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボアルデヒドに関する手順に従って合成した。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.70 (s, 1H), 10.51 (s, 1H), 8.33 (ddd, J = 9.4, 5.4, 2.2 Hz, 1H), 7.36 (q, J = 9.0 Hz, 1H); MS (LSI) m/z = 260 (M+CH₃OH+H)⁺.

３－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボアルデヒドを３，７，８－トリフルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボアルデヒドに置き代えて、３－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸に関する手順に従って合成した。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.76 (s, 1H), 7.47 (ddd, J = 9.2, 5.1, 1.9 Hz, 1H), 7.37 (td, J = 9.7, 7.2 Hz, 1H); MS (LSI) m/z = 242 (M-H)^-.

５－メトキシ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸

１－アセチル－４－メトキシインドリン－２，３－ジオン

無水酢酸（１．３９ｍＬ、１４．７１ｍｍｏｌ）中の４－メトキシインドリン－２，３－ジオン（１．００２ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）の混合物を１５５℃まで加熱した。３時間、還流した後、反応物を室温まで冷却し、沈殿した物質をろ過により採集し、ジエチルエーテルにより洗浄し、減圧下で乾燥すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 7.98 (dd, J = 8.2, 0.6 Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 8.7, 8.2 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 2.73 (s, 3H); MS (APCI) m/z = 252 (M+H)⁺.

水酸化ナトリウム（０．４２３ｇ、１０．５７ｍｍｏｌ）の水（６．６１ｍＬ）中溶液に、１－アセチル－４－メトキシインドリン－２，３－ジオン（１．１５９ｇ、５．２９ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を３時間、加熱して還流した。反応物を０℃まで冷却し、３Ｍ水性ＨＣｌによりｐＨ１にした。沈殿した物質をろ過により採集し、ジエチルエーテルにより洗浄し、減圧下で乾燥すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 13.27 (s, 1H), 11.90 (s, 1H), 7.49 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 6.31 (s, 1H), 3.82 (s, 3H); MS (APCI) m/z = 220 (M+H)⁺.

８－クロロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－４－カルボン酸

７－クロロインドリン－２，３－ジオン（９７０ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ）、マロン酸（６６７ｍｇ、６．４１ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１．１０ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）の酢酸（７ｍＬ）中懸濁液を１００℃において一晩、加熱した。この反応混合物を室温にし、３℃において水（３５ｍＬ）に加えて生成物を沈殿させて、この生成物をろ過により採集して水により洗浄し、真空下で乾燥すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 10.91 (bs, 1H), 8.10 (dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 7.8, 1.3 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 8.2, 7.8 Hz, 1H), 6.64 (s, 1H).

５－フルオロ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－４－カルボン酸

６－ブロモ－３－フルオロ－２－メチルイソニコチン酸

６－ブロモ－３－フルオロ－２－メチルピリジン（１．９０ｇ、１０ｍｍｏｌ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ）のテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中溶液に、－７８℃において、リチウムジイソプロピルアミド溶液（テトラヒドロフラン／ヘプタン／エチルベンゼン中の２Ｍ、６．００ｍＬ、１２．００ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を滴下して加えた。１時間、撹拌した後、二酸化炭素を３０分間、上記の溶液に通気した。次に、この反応物を水によりクエンチし、酢酸エチルにより洗浄した。次に、有機相を１ＭＮａＯＨ（水性）により２回、抽出した。次に、濃塩酸を用いて合わせた水相を酸性にしてｐＨ１にし、得られた混合物を酢酸エチルにより３回、抽出した。次に、合わせた有機層を硫酸マグネシウムにより脱水してろ過し、ろ液を減圧下で濃縮すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 14.17 (s, 1H), 7.74 (dd, J = 4.5, 0.8 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 3.3, 0.6 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 234/236 (M+H)⁺.

水（０．４ｍＬ）及びジメチルスルホキシド（０．４ｍＬ）中の６－ブロモ－３－フルオロ－２－メチルイソニコチン酸（１００ｍｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム（１４４ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（８．１ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）及び１，１０－フェナントロリン（１５．４ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）からなる混合物を１００℃に加熱した。１８時間後、この反応物を水により希釈し、珪藻土のパッドに通してろ過した。次に、ろ液を１ＭＨＣｌ（水性）により酸性にし、減圧下で濃縮した。残留物を逆相ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒｓＸｂｒｉｄｇｅＰｒｅｐＣ１８カラム、８０ｍＬ／分、５～９５％ＭｅＣＮ／水中の０．１％ＴＦＡ）によって精製し、フラクションを含有する生成物を凍結乾燥すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 12.28 (s, 1H), 6.58 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 2.54 (s, 1H), 2.26 (d, J = 3.1 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 172 (M+H)⁺.

３－フルオロ－２－メトキシ－６－メチルイソニコチン酸

３－フルオロ－２－メトキシ－６－メチルピリジン（３００ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ）のテトラヒドロフラン（１０．６ｍＬ）中溶液に、－７８℃において、リチウムジイソプロピルアミド溶液（テトラヒドロフラン／ヘプタン／エチルベンゼン中の２Ｍ、１．２８ｍＬ、２．５５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を滴下して加えた。１時間、撹拌した後、二酸化炭素を４５分間、上記の溶液に通気した。次に、この反応物を１ＭＮａＯＨ（水性）によりクエンチし、酢酸エチルにより洗浄した。次に、有機相を１ＭＮａＯＨ（水性）により２回、抽出した。次に、合わせた水相を１ＭＨＣｌ（水性）を用いて酸性にしてｐＨ３にし、得られた混合物をジクロロメタンにより３回、抽出した。次に、合わせた有機層を硫酸マグネシウムにより脱水してろ過し、ろ液を減圧下で濃縮すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 13.81 (s, 1H), 7.12 (dd, J = 4.0, 0.8 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 2.44 - 2.34 (m, 3H); MS (ESI+) m/z 186 (M+H)⁺.

３－クロロ－５－フルオロ－６－メトキシ－２－メチルイソニコチン酸

３－フルオロ－２－メトキシ－６－メチルイソニコチン酸（５０ｇ、２７０ｍｍｏｌ）の酢酸（２５０ｍｌ）中溶液を２０℃まで冷却した。Ｎ－クロロスクシンイミド（４３．３ｇ、３２４ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を１００℃において１６時間、撹拌した。ＴＬＣにより、出発原料が消費し、新しいスポットが発見されたことが示された。この反応混合物を水に注ぎ入れて、曇りのある溶液を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）により抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムにより脱水し、ろ過してろ液を減圧下で濃縮すると、表題化合物が得られた。¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) d 8.65 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.46 (d, J = 1.3 Hz, 3H).

化合物４～８５は、必要に応じてビルディングブロックに置き換えて、実施例１～４に記載されている条件によって調製した。

生物学的アッセイ及びデータ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３及び２２９ＥＭｐｒｏ生化学プロテアーゼ活性アッセイ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｍｐｒｏ生化学的アッセイは、最適化アッセイ用緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．１、８００ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭＴＣＥＰ（（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン））、０．００５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））中、１ｎＭの組換えＭｐｒｏ及び５μＭの基質と共に、周囲温度において３８４ウェルＰｒｏｘｉ－Ｐｌｕｓプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ米国）において８μＬ中で行った。アッセイ緩衝液中、阻害剤をＭｐｒｏと共に１０分間、事前インキュベートした後、ＦＲＥＴ適合性ペプチド基質（ＴＡＭＲＡ）－ｄＰＥＧ２－Ｓ－Ａ－Ｖ－Ｌ－Ｑ－Ｓ－Ｇ－ｄＰＥＧ２－Ｋ（ＱＳＹ７）－アミドを添加することによって開始した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ米国）において、５３１／５７９励起／発光フィルターを使用して、蛍光を２０分時に測定した。データを酵素のない対照を差し引いたＤＭＳＯに対して正規化した。阻害剤のＩＣ_５０及びＫｉは、様々な濃度の阻害剤の１１点上において、Ｄｏｔｍａｔｉｃｓソフトウェアを使用して解析した。各阻害剤は、別の日に少なくとも２回、試験した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の場合、２ｎＭＭｐｒｏ及び５μＭの基質を、ＭＥＲＳの場合、５ｎＭＭｐｒｏ及び５μＭ、ＯＣ４３の場合、１ｎＭのＭｐｒｏ及び２μＭの基質、２２９Ｅの場合、３ｎＭＭｐｒｏ及び２μＭの基質を、個々のＭｐｒｏ生化学プロテアーゼ活性アッセイに使用した。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＨｅＬａ－ＡＣＥ２ハイコンテントスクリーニングアッセイ
化合物を３８４ウェルμｃｌｅａｒボトムプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に音響的に移送し、ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を、プレートにおいて、ウェルあたり１．０×１０^３細胞の密度において、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）に播種した。プレート培養した細胞をＢＳＬ３施設に送り、ここで、アッセイ用培地に希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（株ＶｅｒｏＥ６細胞において増殖させたＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）を加え、約３０～５０％の感染細胞に到達させた。プレートを３４℃、５％ＣＯ_２において、２４時間インキュベートし、次に、８％ホルムアルデヒドを用いて固定した。固定細胞を、一次抗体としてヒトポリクローナル血清、二次抗体としてヤギ抗ヒトＨ＋ＬコンジュゲートされているＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）Ｐｌｕｓ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びアンチフェード－４６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色して、ＤＮＡを染色し、固定化とその後の一次抗体による染色及び二次抗体による染色との間にＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（リン酸緩衝生理食塩水）洗浄した。

１０×の対物レンズを使用して、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（登録商標）ＭｉｃｒｏＣｏｎｆｏｃａｌＨｉｇｈ－ＣｏｎｔｅｎｔＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用し、プレートを画像化し、ウェルあたり４視野を画像化した。画像は、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ－ＷａｖｅｌｅｎｇｔｈＣｅｌｌＳｃｏｒｉｎｇＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅ（ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、米国）を使用して解析し、ＤＡＰＩ染色により宿主細胞の核を特定し（画像内の細胞の総数）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫蛍光シグナルにより、感染細胞の特定に導いた。

未感染宿主細胞の細胞毒性カウンタースクリーニング
化合物を１，５３６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｇｌｅｎｄａｌｅ、ＡＺ米国）に音響的に移送した。ＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を感染アッセイに関して記載した通りに維持し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、４００細胞／ウェルでアッセイレディプレートに播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２において２４時間、インキュベートした。生存細胞を評価するため、２μＬの水中に希釈した５０％Ｃｅｌｌ－ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を細胞に加え、発光をＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において測定した。

データ解析
一次インビトロスクリーニング及び宿主細胞の細胞毒性カウンタースクリーニングデータを、ＧｅｎｅｄａｔａＳｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）、バージョン１６．０にアップロードした。データは、阻害剤対照（抗ウイルス効果の場合、２．５μＭレムデシビル、及び感染した宿主細胞毒性の場合、１０μＭのピューロマイシン）を含まない中性（ＤＭＳＯ）に対して正規化した。非感染宿主細胞の細胞毒性カウンタースクリーニングの場合、４０μＭのピューロマイシン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）をポジティブ対照として使用した。用量応答に関しては、実験化合物を異なるアッセイ用プレートにおいて、技術的に三連で試験し、用量曲線を４パラメータＨｉｌｌ式にあてはめた。

ＯＣ４３抗ウイルス及び細胞毒性アッセイ
Ｈｕｈ－７細胞を、９６ウェルプレートにおいて、播種（ウェルあたり１０，０００細胞）した。翌日、ＣＯ４３ウイルスのほぼ１００フォーカス形成単位を含む接種材料の存在下、又は非存在下、培養培地を２％ＦＢＳ及び段階的に希釈した化合物を含有する新しい培地と交換した。このプレートを３３℃、５％ＣＯ_２において４８時間、インキュベートした。ＯＣ４３感染したプレートを固定し、ウイルス核タンパク質に対して免疫染色し、感染細胞を特定した一方、非感染細胞を含むプレートは、製造業者の使用説明書に準拠してＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏによって細胞生存率（すなわち、化合物の細胞毒性）に関して評価した。免疫染色に関すると、感染細胞を２０分間、核染色Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４１を含む４％ホルマリン溶液中に固定化し、３０分間、１０％ＢＳＡ及び０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００によりブロッッキングし、１：２，０００に希釈した抗ＯＣ４３抗体（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）により１時間、染色し、ＰＢＳにより３回洗浄して、１：１，０００に希釈した抗マウス－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体により１時間、染色し、ＰＢＳを用いて洗浄した。各ウェル中のＯＣ４３病巣の数を、ＴｈｅｒｍｏＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ７ＬＺＲプラットフォームを使用するハイコンテント顕微鏡法によって定量した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（バージョン５）ソフトウェアを使用する非線形回帰解析によって、ＥＣ_５０及びＣＣ_５０値を計算した。

２２９Ｅ抗ウイルス及び細胞毒性アッセイ
Ｈｕｈ－７細胞を、９６ウェルプレートにおいて、播種（ウェルあたり５，０００細胞）した。翌日、２２９Ｅ接種材料（約０．０３のＭＯＩ）の存在下又は非存在下、培養培地を２％ＦＢＳ及び段階的に希釈した化合物を含有する新しい培地と交換した。プレートを３５℃、５％ＣＯ_２において、５日間、インキュベートし、感染細胞において、ウイルスに広範囲の細胞変性作用を誘導させた。２２９Ｅウイルスの存在下、又は非存在下、化合物と共にインキュベートした細胞の生存率を、製造業者の使用説明書に準拠して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ米国）によって求めた。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（バージョン５）ソフトウェアによって、ＥＣ_５０及びＣＣ_５０値を計算した。

表１、２及び３は、本明細書に記載されているプロトコルに準拠して試験した例示的な化合物、並びにそれらの個々のスペクトルデータ及び阻害データの一覧表示である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２並びに他のヒト及び動物のコロナウイルスに対する、化合物２の抗ウイルス活性

化合物２は、ＡＣＥ２を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＡＣＥ２）又は一次ＨＢＥＣを使用すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｍｐｒｏ生化学的アッセイ及びＳＡＲＳＣｏＶ－２抗ウイルスアッセイにおいて高いインビトロ効力があることを実証した（表４）。

ＨｅＬａ－ＡＣＥ２を使用する上記の抗ウイルスアッセイにおいて、化合物２は、ＣＣ_５０＞４０，０００ｎＭを示し、３，５００を超える選択性指数（ＣＣ_５０／ＥＣ_５０）を生じた。化合物２の細胞毒性もまた、他の細胞系を用いて評価した。化合物２は、Ａ５４９及びＨｕｈ－７などのヒト細胞系、並びにアフリカミドリザル細胞系のＶｅｒｏにおいて、ＣＣ_５０値＞１００，０００ｎＭを有した。化合物２のミトコンドリア毒性の可能性を、グルコース及びガラクトースベースの培地において、複数のミトコンドリアに富む細胞タイプ（増殖性及び非増殖性）において評価した。本検討は、両方のタイプの培地において、Ｐ－ｇｐ阻害剤であるバルスポダールと共に、及びこれを使用しないで、化合物２により処理した、３種の増殖性細胞タイプ（Ａ１７２、ＰＣ３及びＨｅｐＧ２）、及びＩＰＳＣ誘導性心筋細胞（非増殖性）を含んだ。ポジティブ対照であるロテノンは、ガラクトースベースの培地（ミトコンドリア酸化的リン酸化へのエネルギー生成を制限）において、４種の細胞のすべてに対して細胞毒性の顕著な増大を示し、ミトコンドリア毒性があることを明確に示した。対照的に、化合物２は、最大で３００μＭ（試験した最高用量）の濃度において、いずれの培地でも毒性を示さず、ミトコンドリア毒性がないことが示された。

Ｍｐｒｏ触媒部位は、ヒトコロナウイルス全体に高度に保存されており、したがって、化合物２の効力を、ヒト又は動物に感染することが知られている１４種のコロナウイルス（ヒトにスピルオーバーするリスクが高い２種のコウモリコロナウイルスを含む）のパネルに対する生化学的Ｍｐｒｏアッセイにおいて評価した（表５）。これらの１４種のコロナウイルスは、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、２２９Ｅ、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、ＭＨＶ、ＷＩＶ１、ＨＫＵ９、ＦＩＰＶ、ＰＥＤＶ、ＩＢＶ及びＨＫＵ１１を含む、４種の属のコロナウイルスの各々に由来するメンバーを包含する。化合物２は、生化学アッセイにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｍｐｒｏに対して０．１５ｎＭのＫｉを示した。さらに、化合物２は、４種の追加のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３及び２２９Ｅ）に由来するＭｐｒｏに対して高い効力（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＫｉに対して≦１２倍率変化）を保持している一方、ＮＬ６３及びＨＫＵ１に由来するＭｐｒｏに対して、より弱い効力を示した。化合物２はまた、ＷＩＶ１、ＦＩＰＶ及びＰＥＤＶなどの動物のコロナウイルスに由来するＭｐｒｏに対して、高い生化学的効力があることを実証した。

化合物２は、ヒトプロテアーゼ（トロンビン、エラスターゼ、カスパーゼ－２、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ［カテプシンＬ２］及びキモトリプシン）、ブタプロテアーゼペプシン及びＨＩＶ－１ウイルスプロテアーゼのパネルに対して試験した場合、１０μＭ（カテプシンＦの場合、２０μＭ）において、これらのプロテアーゼのいずれに対しても、明らかな阻害がないことを実証し、化合物２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｍｐｒｏに対して高い特異性を有することを示している。

Ｍｐｒｏ触媒部位は、ヒトコロナウイルス全体に高度に保存されており、したがって、化合物の効力を、ヒト又は動物に感染することが知られている１４種のコロナウイルス（ヒトにスピルオーバーするリスクが高い２種のコウモリコロナウイルスを含む）のパネルに対する生化学的Ｍｐｒｏアッセイにおいて評価した（表６）。これらの１４種のコロナウイルスは、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、２２９Ｅ、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、ＭＨＶ、ＷＩＶ１、ＨＫＵ９、ＦＩＰＶ、ＰＥＤＶ、ＩＢＶ及びＨＫＵ１１を含む、４種の属のコロナウイルスの各々に由来するメンバーを包含する。化合物１及び２は、４種の追加のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３及び２２９Ｅ）に由来するＭｐｒｏに対して高い効力（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＫｉに対して≦１２倍率変化）を保持している一方、ＮＬ６３及びＨＫＵ１に由来するＭｐｒｏに対して、より弱い効力を示す。化合物１及び２はまた、ＷＩＶ１、ＦＩＰＶ及びＰＥＤＶなどの動物のコロナウイルスに由来するＭｐｒｏに対して、高い生化学的効力があることを実証する。

化合物１及び２は、ＡＣＥ２を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＡＣＥ２）又は一次ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を使用すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｍｐｒｏ生化学的アッセイ及びＳＡＲＳＣｏＶ－２抗ウイルスアッセイにおいて高いインビトロ効力があることを実証した（表７）。

ＡＬＩＨＢＥＣ培養条件
ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ－ＡＬＩＭｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、パーツ番号０５００１）を使用し、少なくとも４週間、気液界面（ＡＬＩ）において、１μｍのＰＥＴフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、パーツ番号ＰＳＲＰ００４Ｒ５）を備えたＭｉｌｌｉｃｅｌｌ－９６細胞培養インサートプレートにおいて、正常な一次ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）（Ｌｏｎｚａ、パーツ番号ＣＣ－２５４０、ロット１８ＴＬ０５７５８３）を、３７℃、５０％ＣＯ２において培養した。ＨＢＥＣを最初に細胞培養フラスコにおいて増殖させた後に、ウェルあたり１０，０００細胞を播種し、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔＥｘ－ＰｌｕｓＭｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、パーツ番号０５０４０）に沈めた。１週間後、細胞をＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ－ＡＬＩＭｅｄｉｕｍに切替え、頂端表面から培地を除去することによってＡＬＩを開始した。培地を少なくとも４週間、２～３日ごとに交換し、細胞の分化が可能となるように気液界面を維持する。感染させる１日前に、細胞を９６ウェルレシーバープレート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、パーツ番号ＭＡＣＡＣ０ＲＳ５）に移送し、ＢＳＬ－３施設に送り、平衡にする。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＡＬＩＨＢＥＣスクリーニングアッセイ
感染の当日、化合物を手作業によりディープ９６ウェルプレート中のＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ－ＡＬＩｍｅｄｉａに希釈する。感染させる直前に、細胞の頂端表面を３７℃の水浴（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４０４０１３３）中において事前加温したカルシウム及びマグネシウムを含むＤＰＢＳを用いて１回、洗浄し、側底培地を培地中の化合物希釈液と交換する。４１，４５０ＰＦＵＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０）を５０μＬのＤＰＢＳ中の頂端表面に加え、３４℃、５％ＣＯ２において２時間、インキュベートし、この後に、接種材料を取り除き、細胞をＤＰＢＳにより１回、洗浄する。化合物及び培地を感染して２４時間後及び４８時間後に新しくする。頂端表面に１５０μＬのＤＰＢＳを１５分間、添加することによって、感染して７２時間後に、頂端部の洗液を採集する。ＰｕｒｅＬｉｎｋＰｒｏ９６ＶｉｒａｌＲＮＡ／ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、パーツ番号１２２８００９６Ａ）を使用してＲＮＡの分離を行うまで、頂端部の洗液を－８０℃において保管し、ウイルスのＲＮＡレベルを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＰｌａｔｉｎｕｍ One－ＳｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、パーツ番号１１７３２０８８）、並びに２０１９－ｎＣｏＶＮ１ＣＤＣＰｒｉｍｅｒｓ及びＰｒｏｂｅＳｅｔ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、パーツ番号１０００６８３０、１０００６８３１、１０００６８３２）を使用するＲＴ－ｑＰＣＲによって分析する。

細胞毒性スクリーニング
感染して７２時間後に、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａ、パーツ番号１１６４４７９３００１）を使用して細胞毒性を評価する。側底チャンバから１００μＬの培地を採集し、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、パーツ番号３５９９）に移す。各アッセイに、反応混合物を新しく調製し、１００μＬをウェルに加える。プレートを室温において３０分間、インキュベートし、光から保護した後、吸光度をＣＬＡＲＩＯｓｔａｒＰｌｕｓマイクロプレートリーダー（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）を使用して４９０ｎｍにおいて測定する。

データ解析
各試料に対するウイルス負荷（ｐｆｕ当量／ｍＬ）は、ウイルス保存液の段階希釈から分離したＲＮＡを使用して生成した標準曲線に基づいて求める。次に、ウイルス負荷のｌｏｇ１０分の低下を、中性ＤＭＳＯ対照と比較して、各実験化合物に対して求める。用量応答実験に関すると、データをＧｅｎｅｄａｔａＳｃｒｅｅｎｅｒ（バージョン１６．０）にアップロードし、阻害剤対照（５μＭのナファモスタット）を含まない中性（ＤＭＳＯ）に対してＰＦＵ当量／ｍＬを正規化し、曲線を４パラメータＨｉｌｌ式にあてはめる。細胞毒性スクリーニングに関しては、実験試料に対して平均値をとり、ポジティブ対照であるピューロマイシン（５μＭ）の百分率として表す。抗ウイルス性と細胞毒性の読取りの両方に関して、技術的三連複製を行う。

ミクロソーム安定性：ＮＡＤＰＨの存在下、ｐＨ７．４（ＫＰＯ_４緩衝液）、３７℃において、アナログ（０．５μＭ）を、０、５、１０、１５、２０及び３０分間、ラット又はヒトミクロソーム（０．２５ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。１：１のＣＨ_３ＣＮ：ＭｅＯＨを用いて実験を停止し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。カルブタミドの内部標準を使用した。表８。

標的外結合アッセイのパネルにおいて、化合物２（１０μＭ）は、対照特異的結合又は酵素阻害を＞５０％、置き換えなかった。化合物２は、ヒトプロテアーゼ（トロンビン、エラスターゼ、カスパーゼ－２、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ［カテプシンＬ２］及びキモトリプシン）、ブタプロテアーゼペプシン及びＨＩＶ－１ウイルスプロテアーゼのパネルに対して試験した場合、１０μＭ（カテプシンＦの場合、２０μＭ）において、これらのプロテアーゼのいずれに対しても、明らかな阻害がないことを実証した。

上記の詳細説明及び添付の実施例は、単に例示に過ぎず、本発明の範囲に関する限定として見なされるべきでなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってしか規定されないことが理解される。開示された実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者に明白である。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、製剤及び／又は使用方法に関するものを非限定的に含む、このような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書において引用されている刊行物、特許及び特許出願はすべて、すべての目的のため、それらの全体が参照により組み込まれている。

Claims

式（ＩＩＩ）：

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ又はＢｒであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^４は、Ｈ又はＦである）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
前記化合物が、以下の構造

を有する、請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
前記化合物が、以下の構造

を有する、請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
式（ＶＩ）

（式中、
Ｒ^１は、ＣＮ又はＢｒであり、
Ｒ^２は、ＣＦ_３又はシクロプロピルであり、
Ｒ^３は、Ｈ又はＦである）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
化合物が、以下の構造

を有する、請求項４に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
請求項１に記載の化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
ＣＯＶＩＤ－１９感染に罹患している対象を処置する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物を対象に投与し、ＣＯＶＩＤ－１９感染を処置するステップを含む、方法。
以下の構造：

によって表される化合物。