JP2024034945A - 骨髄異形成症候群検査キット - Google Patents
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Abstract
【課題】MDSの予後予測に関連するSF3B1遺伝子変異を高精度に検出する。【解決手段】SF3B1遺伝子におけるMDSと関連する複数の変異箇所における検出対象塩基に対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を使用する。【選択図】図1
Description
本発明は、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndromes:MDS)に関連する遺伝子変異を検査するための骨髄異形成症候群検査キットに関する。
骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndromes:MDS)は、異形成を伴う造血細胞の異常な増殖とアポトーシスによる細胞死によって特徴づけられる造血器腫瘍である。MDSの病態解明が進むにつれ、French-American-British(FAB)グループによる分類や、World Health Organization(WHO)による分類が改訂されている。
現在、臨床所見として慢性貧血を主とするが、ときに出血傾向及び発熱を認める場合、末梢血で1血球系以上の持続的な血球減少を認める等のMDSが疑われる場合、以下の基準によりMDSが診断される。
A.必須基準
1)末梢血と骨髄の芽球比率が30%未満(WHO分類では20%未満)
2)血球減少や異形成の原因となる他の造血器あるいは非造血器疾患が除外できる。
3)末梢血の単球数が1×109/L未満
4)t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q12), inv(16)(p13q22)又はt(16;16)(p13;q22)の染色体異常を認めない。
B.決定的基準
1)骨髄塗抹標本において異形成が、異形成の程度の区分でLOW以上である。
2)分染法又はfluorescence in situ hybridization(FISH)法で骨髄異形成症候群が推測される染色体異常を認める。
C.補助基準
1)骨髄異形成症候群で認められる遺伝子変異が証明できる。(例、TET2遺伝子変異、DNMT3A遺伝子変異、ASXL1遺伝子変異、SF3B1遺伝子変異、TP53遺伝子変異など)
2)網羅的ゲノム解析で、ゲノム変異が証明できる。
3)フローサイトメトリーで異常な形質を有する骨髄系細胞が証明できる。
A.必須基準
1)末梢血と骨髄の芽球比率が30%未満(WHO分類では20%未満)
2)血球減少や異形成の原因となる他の造血器あるいは非造血器疾患が除外できる。
3)末梢血の単球数が1×109/L未満
4)t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q12), inv(16)(p13q22)又はt(16;16)(p13;q22)の染色体異常を認めない。
B.決定的基準
1)骨髄塗抹標本において異形成が、異形成の程度の区分でLOW以上である。
2)分染法又はfluorescence in situ hybridization(FISH)法で骨髄異形成症候群が推測される染色体異常を認める。
C.補助基準
1)骨髄異形成症候群で認められる遺伝子変異が証明できる。(例、TET2遺伝子変異、DNMT3A遺伝子変異、ASXL1遺伝子変異、SF3B1遺伝子変異、TP53遺伝子変異など)
2)網羅的ゲノム解析で、ゲノム変異が証明できる。
3)フローサイトメトリーで異常な形質を有する骨髄系細胞が証明できる。
骨髄異形成症候群診療の参照ガイド、令和1年改訂版
以上のように、MDSの診断において補助的基準として幾つかの遺伝子変異が挙げられている。なかでも、SF3B1遺伝子変異については、MDSの予後予測に非常に重要な情報となる。しかしながら、SF3B1遺伝子変異については変異箇所が隣接、近接しているため、これら複数の変異部位を含むように増幅した核酸断片(ターゲット核酸)を核酸プローブで検出する際、ターゲット核酸の検出効率が低下するといった問題があった。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、変異箇所が隣接して存在するSF3B1遺伝子変異を高精度に検出することを目的としている。
本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、プローブ核酸を用いて、SF3B1遺伝子における隣接して存在する検出対象の変異を検出する際の検出効率を向上できる技術を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
(1)SF3B1遺伝子における骨髄異形成症候群と関連する複数の変異箇所を検出する遺伝子変異検出キットにおいて、
上記複数の変異箇所を含む領域を増幅するプライマーセットと、
上記複数の変異箇所における検出対象塩基それぞれに対応する複数の変異型プローブと、
上記プライマーセットで増幅される、上記複数の変異箇所を含むターゲット核酸及び上記複数の変異箇所における検出対象塩基それぞれに対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸のうち、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸とを含む、骨髄異形成症候群に関連する遺伝子変異評価用キット。
(2)上記検出対象塩基は、SF3B1遺伝子がコードするSF3B1タンパク質におけるE622D、R625C、R625H、R625L、H662Q、K666N、K666T、K666R、K666E、K666Q及びK666Mからなる群から選ばれる変異をコードする塩基であり、上記複数の非検出対象塩基は、SF3B1タンパク質における622番目のE(グルタミン酸)をコードする塩基、625番目のR(アルギニン)をコードする塩基、662番目のH(ヒスチジン)をコードする塩基及び666番目のK(リシン)をコードする塩基からなることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(3)前記ブロッキング用核酸は、SF3B1タンパク質における622番目のE(グルタミン酸)をコードする塩基及び625番目のR(アルギニン)をコードする塩基に対して相補的な塩基配列を含む及び/又はSF3B1タンパク質における662番目のH(ヒスチジン)をコードする塩基及び666番目のK(リシン)をコードする塩基に対して相補的な塩基配列を含むことを特徴とする(2)記載の遺伝子変異評価用キット。
(4)上記検出対象塩基は、更に、SF3B1タンパク質におけるK700E、G742Dをコードする塩基であり、当該塩基を検出する変異型プローブと、これら変異箇所を含む領域を増幅するプライマーセットを含むことを特徴とする(2)記載の遺伝子変異評価用キット。
(5)上記ブロッキング用核酸は、前記複数の非検出対象塩基に対応する塩基が5’側から2塩基より内側、且つ、3’側から3塩基より内側に位置することを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(6)上記複数の変異型プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイを含むことを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(7)上記変異型プローブは、上記複数の検出対象塩基に対応する領域を複数回繰り返して有することを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(8)上記(1)~(7)いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、SF3B1遺伝子における骨髄異形成症候群と関連する複数の変異箇所における検出対象塩基を同定する、骨髄異形成症候群の診断に関するデータ分析方法。
(9)上記遺伝子変異評価用キットは、上記複数の変異型プローブに対応する野生型プローブを更に備えており、
上記変異型プローブからのシグナル強度及び上記野生型プローブからのシグナル強度を測定し、式:[変異型プローブのシグナル強度]/([野生型プローブのシグナル強度]+[変異型プローブのシグナル強度])により各遺伝子変異について判定値を算出し、
判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に変異を有すると判定する(8)記載のデータ分析方法。
上記複数の変異箇所を含む領域を増幅するプライマーセットと、
上記複数の変異箇所における検出対象塩基それぞれに対応する複数の変異型プローブと、
上記プライマーセットで増幅される、上記複数の変異箇所を含むターゲット核酸及び上記複数の変異箇所における検出対象塩基それぞれに対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸のうち、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸とを含む、骨髄異形成症候群に関連する遺伝子変異評価用キット。
(2)上記検出対象塩基は、SF3B1遺伝子がコードするSF3B1タンパク質におけるE622D、R625C、R625H、R625L、H662Q、K666N、K666T、K666R、K666E、K666Q及びK666Mからなる群から選ばれる変異をコードする塩基であり、上記複数の非検出対象塩基は、SF3B1タンパク質における622番目のE(グルタミン酸)をコードする塩基、625番目のR(アルギニン)をコードする塩基、662番目のH(ヒスチジン)をコードする塩基及び666番目のK(リシン)をコードする塩基からなることを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(3)前記ブロッキング用核酸は、SF3B1タンパク質における622番目のE(グルタミン酸)をコードする塩基及び625番目のR(アルギニン)をコードする塩基に対して相補的な塩基配列を含む及び/又はSF3B1タンパク質における662番目のH(ヒスチジン)をコードする塩基及び666番目のK(リシン)をコードする塩基に対して相補的な塩基配列を含むことを特徴とする(2)記載の遺伝子変異評価用キット。
(4)上記検出対象塩基は、更に、SF3B1タンパク質におけるK700E、G742Dをコードする塩基であり、当該塩基を検出する変異型プローブと、これら変異箇所を含む領域を増幅するプライマーセットを含むことを特徴とする(2)記載の遺伝子変異評価用キット。
(5)上記ブロッキング用核酸は、前記複数の非検出対象塩基に対応する塩基が5’側から2塩基より内側、且つ、3’側から3塩基より内側に位置することを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(6)上記複数の変異型プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイを含むことを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(7)上記変異型プローブは、上記複数の検出対象塩基に対応する領域を複数回繰り返して有することを特徴とする(1)記載の遺伝子変異評価用キット。
(8)上記(1)~(7)いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、SF3B1遺伝子における骨髄異形成症候群と関連する複数の変異箇所における検出対象塩基を同定する、骨髄異形成症候群の診断に関するデータ分析方法。
(9)上記遺伝子変異評価用キットは、上記複数の変異型プローブに対応する野生型プローブを更に備えており、
上記変異型プローブからのシグナル強度及び上記野生型プローブからのシグナル強度を測定し、式:[変異型プローブのシグナル強度]/([野生型プローブのシグナル強度]+[変異型プローブのシグナル強度])により各遺伝子変異について判定値を算出し、
判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に変異を有すると判定する(8)記載のデータ分析方法。
本発明に係る遺伝子変異評価用キットによれば、ブロッキング用核酸により、ターゲット核酸と同時に増幅された非ターゲット核酸と変異型プローブとの非特異的ハイブリダイズを抑制することができる。よって、本発明に係る遺伝子変異評価用キットによれば、SF3B1遺伝子に含まれる骨髄異形成症候群と関連する複数の変異箇所における検出対象塩基を含むターゲット核酸を変異型プローブにより高精度に検出することができる。
本発明に係る骨髄異形成症候群の診断に関するデータ分析方法では、ブロッキング用核酸により、ターゲット核酸と同時に増幅された非ターゲット核酸と変異型プローブとの非特異的ハイブリダイズを抑制することができる。よって、本発明に係る骨髄異形成症候群の診断に関するデータ分析方法では、SF3B1遺伝子に含まれる骨髄異形成症候群と関連する複数の変異箇所における検出対象塩基を含むターゲット核酸を変異型プローブにより高精度に検出することができ、骨髄異形成症候群の診断に関して正確な分析が可能となる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndromes:MDS)の診断において補助的基準として挙げられている遺伝子変異のうち、SF3B1遺伝子に存在する変異を検出対象としている。本明細書において、変異を検出するとは、当該変異における塩基を特定すること(タイピング)を意味する。
本発明では、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndromes:MDS)の診断において補助的基準として挙げられている遺伝子変異のうち、SF3B1遺伝子に存在する変異を検出対象としている。本明細書において、変異を検出するとは、当該変異における塩基を特定すること(タイピング)を意味する。
本発明では、特に検出対象とする複数の変異箇所において取りうる塩基のうち、所定の塩基を検出対象塩基と称し、その他の塩基を非検出対象塩基と称する。特に、本発明では、検出対象とする変異箇所において、所定の変異を特定する塩基を検出対象塩基と称し、その他の塩基を非検出対象塩基と称することもできる。例えば、検出対象の変異箇所がA(アデニン)又はC(シトシン)を取りうる一塩基の置換変異である場合、いずれか一方の塩基、すなわちA(アデニン)を検出対象塩基とすることができる。
なお、SF3B1遺伝子に存在する変異については、MDSにおける予後良好因子であることを示すことが知られている。具体的には、SF3B1遺伝子がコードするSF3B1タンパク質において、以下の置換変異を有する場合に予後良好と判定される。予後良好を示す置換変異としては、E622D、R625C、R625H、R625L、H662Q、K666N、K666T、K666R、K666E、K666Q、K666M、K700E及びG742Dを挙げることができる。すなわち、SF3B1タンパク質における622番目のE(グルタミン酸)がD(アスパラギン酸)に変異するか、625番目のR(アルギニン)がC(システイン)、H(ヒスチジン)又はL(ロイシン)に変異するか、662番目のH(ヒスチジン)がQ(グルタミン)に変異するか、666番目のK(リシン)がN(アスパラギン)、T(チロシン)、R(アルギニン)、E(グルタミン酸)、Q(グルタミン)又はM(メチオニン)に変異するか、700番目のK(リシン)がE(グルタミン酸)に変異するか、742番目のG(グリシン)がD(アスパラギン酸)に変異した場合、MDSにおける予後良好であると判断できる。
すなわち、本発明においては、これら置換変異における変異後のアミノ酸をコードする塩基(コドン)を検出対象塩基とすることができる。特に、本発明では、プライマーセットを用いて複数の検出対象塩基を含むターゲット核酸を核酸増幅反応により増幅し、当該ターゲット核酸に含まれる検出対象塩基をそれぞれ核酸プローブで検出する。例えば、SF3B1遺伝子がコードするSF3B1タンパク質における622番目のアミノ酸をコードするコドン及び625番目のアミノ酸をコードするコドンを含むターゲット核酸をプライマーセットにより増幅することができる。また、SF3B1タンパク質における662番目のアミノ酸をコードするコドン及び666番目のアミノ酸をコードするコドンを含むターゲット核酸をプライマーセットにより増幅することができる。また、SF3B1タンパク質における622番目のアミノ酸をコードするコドンから666番目のアミノ酸をコードするコドンまでを含むターゲット核酸をプライマーセットにより増幅することもできる。
また、本発明においては、上記置換変異のうち、SF3B1タンパク質における700番目のアミノ酸をコードするコドン及び742番目のアミノ酸をコードするコドンを含むターゲット核酸をプライマーセットにより増幅しても良い。
以上のように、本発明では、SF3B1タンパク質における622番目のアミノ酸をコードするコドン、625番目のアミノ酸をコードするコドン、662番目のアミノ酸をコードするコドン及び666番目のアミノ酸をコードするコドンを含むターゲット核酸;SF3B1タンパク質における700番目のアミノ酸をコードするコドン及び742番目のアミノ酸をコードするコドンを含むターゲット核酸からなる2種類のターゲット核酸を増幅する。
なお、ターゲット核酸としては、生物個体、組織及び細胞採取から採取した転写産物から逆転写反応により得られるcDNAとしても良い。ターゲット核酸の塩基長としては、特に限定されないが、例えば60~1000塩基とすることができ、60~500塩基とすることが好ましく、60~400塩基とすることがより好ましい。
なお、検出対象塩基を含むターゲット核酸に対して、当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む核酸分子(核酸断片)を非ターゲット核酸と称する。例えば、上記検出対象とする複数の変異において取りうる塩基のうち、1つの塩基を検出対象塩基とした場合、検出対象塩基以外の塩基を非検出対象塩基とする。より具体的に、一塩基が置換変異する変異箇所における塩基がA(アデニン)又はC(シトシン)を取りうる場合、A(アデニン)を検出対象塩基とすると、C(シトシン)が非検出対象塩基ということになる。
非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸は、当該変異をコードする領域に非検出対象塩基が存在する場合、上述のように一対のプライマーセットを用いて検出対象塩基を含むターゲット核酸を取得する際に同時に取得される。例えば、ターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、一方のアレルが非検出対象塩基であれば、ターゲット核酸とともに非ターゲット核酸が増幅されることとなる。
検出対象塩基を含むターゲット核酸を検出するには、ターゲット核酸において、少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを使用する。核酸プローブは、特に限定されないが、例えば10~30塩基長とすることができ、15~26塩基長とすることが好ましい。また、検出対象塩基に相補的な塩基は、核酸プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなる核酸プローブについては5’末端又は3’末端方向に1つずれている場合を含む意味である。
なお、本発明においては、ターゲット核酸には複数の変異箇所が含まれている。これら複数の変異箇所における検出対象塩基は、それぞれ異なる核酸プローブによって検出される。すなわち、変異箇所毎に検出対象塩基に対応する核酸プローブを準備し、これら核酸プローブによって検出対象塩基を検出する。
また、核酸プローブは、検出対象塩基に対応する領域が複数繰り返した塩基配列を含むことが好ましい。すなわち、核酸プローブは、ターゲット核酸とハイブリダイズできる領域を複数備えることが好ましい。ここで、検出対象塩基に対応する領域の繰り返し回数は、特に限定されず、2~10回とすることができ、2~5回とすることが好ましく、2~3回とすることがより好ましい。核酸プローブをこのように構成することによって、ターゲット核酸の検出感度を向上させることができる。
特に、本発明においては、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを防止するため、ブロッキング用核酸を使用する。ブロッキング用核酸は、非ターゲット核酸における複数の非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する。よって、ブロッキング用核酸は、複数の検出対象塩基を有するターゲット核酸と各検出対象核酸に対応する核酸プローブとがハイブリダイズできる条件下において、複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とハイブリダイズすることができる。
具体的に、ブロッキング用核酸において、非ターゲット核酸における複数の非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列とは、野生型SF3B1タンパク質における622番目のグルタミン酸をコードするコドンに対して相補的な塩基配列、625番目のアルギニンをコードするコドンに対して相補的な塩基配列、662番目のヒスチジンをコードするコドンに対して相補的な塩基配列、及び666番目のリシンをコードするコドンに対して相補的な塩基配列からなる群から選ばれる2以上の塩基配列を含む意味である。具体的に、本発明では、野生型SF3B1タンパク質における622番目のグルタミン酸をコードするコドンと625番目のアルギニンをコードするコドンに対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸と、野生型SF3B1タンパク質における662番目のヒスチジンをコードするコドンと666番目のリシンをコードするコドンに対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸とを使用することができる。
ブロッキング用核酸において、複数の非検出対象塩基に対応する塩基の位置は特に限定されない。特に、非検出対象塩基に対応する塩基は、ブロッキング用核酸における5’側から2塩基より内側、且つ、3’側から3塩基より内側に位置することが好ましい。ブロッキング用核酸において非検出対象塩基に対応する塩基の位置を上記範囲とすることによって、ターゲット核酸と核酸プローブとがハイブリダイズできる条件下において、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸とを確実にハイブリダイズさせることができる。
上記SF3B1遺伝子の変異検出に用いるブロッキング用核酸においては、複数の非検出対象塩基を含む領域が、野生型SF3B1タンパク質における622番目のグルタミン酸をコードするコドンと625番目のアルギニンをコードするコドン、及び野生型SF3B1タンパク質における662番目のヒスチジンをコードするコドンと666番目のリシンをコードするコドンのそれぞれにおいて5塩基以上15塩基以内の近傍に存在している。このように近接した位置に複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対応するブロッキング用核酸を用意することで、非ターゲット核酸に対してブロッキング用核酸を精度よくハイブリダイズさせることができる。
また、ブロッキング用核酸としては、特に限定されないが、核酸プローブの塩基長に対して60%以上の長さであることが好ましい。また、ブロッキング用核酸は、核酸プローブの塩基長よりも短い長さであることが好ましい。例えば核酸プローブの長さが25塩基長とすると、ブロッキング用核酸の塩基長は14~24塩基長であることが好ましい。
さらにまた、本発明において、ブロッキング用核酸の濃度は、特に限定されないが、例えば、非ターゲット核酸の濃度及び/又はターゲット核酸の濃度に応じて、プライマー濃度に応じて適宜設定することができる。具体的にブロッキング用核酸の組成物中の濃度は、0.01~1.0μMとすることができ、0.05~1.0μMとすることが好ましく、0.125~1.0μMとすることがより好ましい。
以上のように、本発明では、SF3B1遺伝子に含まれる変異を検出する際に上述したブロッキング用核酸を使用するため、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。また、ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する塩基を有するため、複数の検出対象塩基に対応する複数の核酸プローブのいずれともハイブリダイズすることを防止することができる。このため、本発明を適用することによって、ターゲット核酸における複数の検出対象塩基のそれぞれを核酸プローブで検出する場合であっても高精度に検出することができる。
上述したブロッキング用核酸は、核酸分子同士の相補的な結合を意味するハイブリダイゼーションを含むならば、如何なる系にも使用することができる。すなわち、上述したブロッキング用核酸は、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーションに使用することができる。特に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、担体(基板、中空繊維、微粒子を含む)に核酸プローブを固定し、固定化した核酸プローブを用いてターゲット核酸を検出(定性、定量を含む)する系に使用することが好ましい。より具体的に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、核酸プローブを基板に固定したDNAマイクロアレイ(DNAチップ)を用いてターゲット核酸を検出する際に使用することが最も好ましい。
なお、ブロッキング用核酸としては、上述した複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対応するものに加えて、野生型SF3B1タンパク質の700番目のリシンをコードする塩基配列を含む非ターゲット核酸に対応するブロッキング用核酸及び/又は野生型SF3B1タンパク質の742番目のグリシンをコードする塩基配列を含む非ターゲット核酸に対応するブロッキング用核酸を使用してもよい。
なお、核酸プローブ及びブロッキング用核酸は、より好ましくは一本鎖DNAである。核酸プローブ及びブロッキング用核酸は、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
本例において、核酸プローブは、その5’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイの形態で用いるのが好ましい。担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カーボンファイバーに代表される炭素などの導電体材料;単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI(シリコン・オン・インシュレータ)などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材;ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料;ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
なお担体として、好ましくは表面にダイヤモンドライクカーボン(DLC:Diamond Like Carbon)等のカーボン層と、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基及び活性エステル基等の化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
このように作製したDNAマイクロアレイを用いて被検者における、ターゲット核酸を検出することができる。これには、被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、ターゲット核酸(及び非ターゲット核酸)を増幅する工程と、DNAマイクロアレイを用いて増幅された核酸を検出する工程とを含む。
被検者は通常ヒトであり、骨髄異形成症候群に罹患した患者を挙げることができる。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料(血液、血清、血漿、骨髄液など)、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。
まず、被検者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール/クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、ターゲット核酸(及び非ターゲット核酸)を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン(DIG)やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、SF3B1遺伝子に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸(具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸)、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
上記のようにして得られた増幅核酸には、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸が含まれる。核酸プローブとターゲット核酸のハイブリダイゼーション反応を行い、核酸プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、核酸プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。
このとき、上述した本発明では、ブロッキング用核酸により非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができる。ハイブリダイゼーション用バッファー組成物を用いたハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2%SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。すなわち、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物には、ハイブリダイゼーション反応に必要な塩、例えばSSCや、公知のブロッキング剤、例えばSDSが含まれていても良い。
また、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と上述したブロッキング用核酸を含む組成物とを予め混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズを行った後、反応液をDNAマイクロアレイに接触させてターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を進行させても良い。或いは、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と上述したブロッキング用核酸を含む組成物とをDNAマイクロアレイ上にて混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズ並びにターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズを同時に進行させても良い。
以上のように、上述したブロッキング用核酸を使用することで、SF3B1遺伝子に存在するMDSの予後に関連する変異を高精度に同定することができる。具体的には、被検者(MDS患者)のゲノムDNAにおいて、E622D、R625C、R625H、R625L、H662Q、K666N、K666T、K666R、K666E、K666Q、K666M、K700E及びG742Dからなる群から選ばれる少なくとも1つの変異が同定された場合、当該被検者におけるMDSの予後は良好であると判断することができる。
ここで、変異を同定する方法の一例としては、上述したターゲット核酸に含まれる検出対象塩基核酸に対応する核酸プローブ(変異型プローブと称する場合もある)と、非検出対象塩基に対応する核酸プローブ(野生型プローブと称する場合もある)とを用い、変異型プローブからのシグナル強度及び上記野生型プローブからのシグナル強度に基づいて判断する方法が挙げられる。より具体的には下記式により判定値を算出し、判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に変異を有すると判定することができる。
式:判定値=[変異型プローブのシグナル強度]/([野生型プローブのシグナル強度]+[変異型プローブのシグナル強度])
この判定値を上述した各変異について算出し、各変異の同定することができ、その結果に基づいて被検者におけるMDSの診断や予後を判断することができる。
式:判定値=[変異型プローブのシグナル強度]/([野生型プローブのシグナル強度]+[変異型プローブのシグナル強度])
この判定値を上述した各変異について算出し、各変異の同定することができ、その結果に基づいて被検者におけるMDSの診断や予後を判断することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
1.サンプル調製
本実施例では、野生型及び変異型モデル検体として、SF3B1遺伝子配列を搭載したプラスミドDNAを用いた。5%変異型モデル検体は野生型プラスミドと変異型プラスミドを95:5の割合で混合したものである。
1.サンプル調製
本実施例では、野生型及び変異型モデル検体として、SF3B1遺伝子配列を搭載したプラスミドDNAを用いた。5%変異型モデル検体は野生型プラスミドと変異型プラスミドを95:5の割合で混合したものである。
本実施例では、表1に示した遺伝子変異を検出するため、当該遺伝子変異を含む対象領域を増幅した。
本実施例では、表1に示した対象領域を増幅するため、表2に示したプライマーを設計した。
以上のように調製したDNAサンプルを用いて、SF3B1遺伝子について対象領域をPCRにより増幅した。なお、PCRでは鋳型となるモデル検体を2pg/μLとした。反応液組成を表3に示した。
そして、PCRのサーマルサイクルを、95℃で5分間の後、95℃で30秒、56℃で30秒及び72℃で90秒を1サイクルとして40サイクル行い、その後、72℃で10分間とし、最終的に4℃を維持した。
本実施例では、表1に示したSF3B1遺伝子における1986C>G、1997A>G変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表4にまとめて示した。
2.遺伝子変異の検出
上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規定温度(52℃)に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標識オリゴDNA(ライフテクノロジーズジャパン社製))2μLを混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せた後、チップを予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱ごと52℃に設定したハイブリダイズオーブン内で1時間反応させた。ハイブリダイズ反応終了後、ハイブリカバーをはずしたチップを0.1×SSC/0.1% SDS溶液中で上下に数回振とうして洗浄した。その後、チップの蛍光強度を検出するまで1×SSC溶液(室温)に浸した。
上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規定温度(52℃)に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標識オリゴDNA(ライフテクノロジーズジャパン社製))2μLを混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せた後、チップを予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱ごと52℃に設定したハイブリダイズオーブン内で1時間反応させた。ハイブリダイズ反応終了後、ハイブリカバーをはずしたチップを0.1×SSC/0.1% SDS溶液中で上下に数回振とうして洗浄した。その後、チップの蛍光強度を検出するまで1×SSC溶液(室温)に浸した。
また、本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表5に示したブロッカーオリゴDNA(ブロッキング用核酸)を添加した。ブロッカーオリゴDNAは、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるように、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計されている。従来は一つの変異に対して1種類のブロッカーを添加する方法をとっていたが、本実施例では、近接する複数の変異箇所を含む配列のブロッカーオリゴDNAを設計した。すなわち、複数の変異箇所に対して1種類のブロッカーオリゴDNAを添加することで感度向上を図った。比較例として、複数の変異箇所それぞれに対して設計したブロッカーオリゴDNAを添加する従来手法で設計されたブロッカー配列を表6に示した。
検出直前にチップにカバーフィルムを被せ、BIOSHOT(東洋鋼鈑製)でチップの蛍光強度を検出した。
結果を図1に示した。1986は、従来のブロッカー(1986W-3B)を添加したとき、ブロッカー濃度の上昇に伴い変異型プローブの特異的シグナルが減少していることが分かる。これは、近接する1997のブロッカー(1997W-4B)の配列が変異型プローブの配列と一部重なっていることから、1986を含む変異産物と結合したことが要因と考えられる。一方、共通ブロッカー(1986_1997W-4)を使用した場合には、ブロッカー濃度が上昇しても変異型プローブの特異的シグナルが維持されていることが分かる。複数の変異部位を含むブロッカーを使用することで、変異型産物への意図しない結合が抑えられ、特異性が高まったと考えられる。1997でも同様に、従来のブロッカー(1997W-4B)ではブロッカー濃度が上昇するとともに変異プローブの特異的シグナルが減少する傾向にあるが、共通ブロッカー(1986_1997W-4)ではブロッカー濃度が上昇しても変異型プローブの特異的シグナルが維持されていることが確認された。
[実施例2]
本実施例では、実施例1で使用したモデル検体、実施例1で設計したプライマーを用いて実施例1と同様の手順によりPCRを実施した。本実施例では、表1に示したSF3B1遺伝子における1866G>T、1874G>T変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表7にまとめて示した。
本実施例では、実施例1で使用したモデル検体、実施例1で設計したプライマーを用いて実施例1と同様の手順によりPCRを実施した。本実施例では、表1に示したSF3B1遺伝子における1866G>T、1874G>T変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表7にまとめて示した。
ハイブリダイズ反応およびチップ蛍光強度の検出を実施した。なお、本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表8に示したブロッカーオリゴDNAを添加した。また、非検出対象塩基に対応する塩基が端部近傍に位置するように設計したブロッカーオリゴDNAを表9に示した。
結果を図2に示した。実施例1と同様に、表9に示したブロッカーオリゴDNAを使用した場合、ブロッカー濃度の上昇に伴い変異型プローブの特異的シグナルが減少していることが分かる。表9に示したブロッカーオリゴDNAの配列には、1866、1874の両方の変異が含まれており、変異型産物は1塩基のミスマッチが存在する。しかし、非検出対象塩基に対応する塩基が端部近傍(末端から1塩基)であるため特異性が低く、変異型産物と結合したと考えられる。一方、表8に示した共通ブロッカーでは、1866、1874共にブロッカー濃度が上昇しても特異的シグナルが維持されており、共通ブロッカーが有効に作用していることが確認された。
[実施例3]
本実施例では、実施例1で使用したモデル検体(変異型5%モデル検体のみ)、実施例1で設計したプライマーを用いて実施例1と同様の手順によりPCRを実施した。また、ハイブリダイズ反応に用いるプローブDNAにおいて、検出対象の遺伝子領域を繰り返して連結したプローブDNA(タンデムプローブ)を設計し、配列を繰り返さない通常プローブと共にDNAチップに搭載した。
本実施例では、実施例1で使用したモデル検体(変異型5%モデル検体のみ)、実施例1で設計したプライマーを用いて実施例1と同様の手順によりPCRを実施した。また、ハイブリダイズ反応に用いるプローブDNAにおいて、検出対象の遺伝子領域を繰り返して連結したプローブDNA(タンデムプローブ)を設計し、配列を繰り返さない通常プローブと共にDNAチップに搭載した。
本実施例で設計した各プローブ配列は表10にまとめて示した。また、ハイブリダイズ反応およびチップ蛍光強度の検出については、実施例3と同様の手順により実施した。
結果を図3に示す。図3に示したように、通常プローブと比較し、配列を2回繰り返すタンデムプローブを使用した場合には、蛍光強度が1.5~2倍に増強し、その結果、検出感度が向上することが確認された。
[実施例4]
本実施例では、実施例1で使用したモデル検体、実施例1で設計したプライマーを用いてPCRを実施した。本実施例で実施したPCRの反応液組成を表11に示した。また、本実施例では、PCRのサーマルサイクルを、95℃で5分間の後、95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で90秒を1サイクルとして40サイクル行い、その後、72℃で10分間とし、最終的に4℃を維持した。
本実施例では、実施例1で使用したモデル検体、実施例1で設計したプライマーを用いてPCRを実施した。本実施例で実施したPCRの反応液組成を表11に示した。また、本実施例では、PCRのサーマルサイクルを、95℃で5分間の後、95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で90秒を1サイクルとして40サイクル行い、その後、72℃で10分間とし、最終的に4℃を維持した。
本実施例では、表1に示したSF3B1遺伝子における変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表12にまとめて示した。表12中、Iはデオキシイノシンを意味している。
なお、ハイブリダイズ反応およびチップ蛍光強度の検出については、自動化検出装置(HySHOT HT-32またはBIOSHOT HT-32(医療機器届出番号:13B3X10232HT3201)、東洋鋼鈑製)を使用した。PCR産物30μlとハイブリダイズ緩衝液15μlを混合し、自動化検出装置にセットした。洗浄液(0.1×SSC/0.1%SDS溶液)、リンス液及び検出液(1×SSC)を調製し、装置の取り扱い説明書に従い、混合液、洗浄液、リンス液を自動検出装置にセットした。測定プログラムは表13のように設定した。
以上のように測定した野生型プローブ及び変異型プローブにおける蛍光強度を用い、表1に示したSF3B1遺伝子変異について下記式によって判定値を算出した。
判定値=[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの蛍光強度])
本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表14に示したブロッカーオリゴDNA mixを添加した。
判定値=[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの蛍光強度])
本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表14に示したブロッカーオリゴDNA mixを添加した。
結果を図4に示した。表1で示した遺伝子変異について、野生型モデル検体における各野生型プローブの蛍光強度はすべて10000以上であり、判定に十分な強度を得られた。また、変異型プローブへの非特異的な結合は4000以下であった。次に、変異型5%モデル検体における各プローブの蛍光強度はすべて10000以上と判定に十分な強度を得られた。また、判定値は、変異型モデル検体と野生型モデル検体の差が全て0.2以上であり、良好な分離であった。以上より、野生型モデル検体と変異型5%モデル検体を明確に区別して同時に検出できることが明らかとなった。
Claims (9)
- SF3B1遺伝子における骨髄異形成症候群と関連する複数の変異箇所を検出する遺伝子変異検出キットにおいて、
上記複数の変異箇所を含む領域を増幅するプライマーセットと、
上記複数の変異箇所における検出対象塩基それぞれに対応する複数の変異型プローブと、
上記プライマーセットで増幅される、上記複数の変異箇所を含むターゲット核酸及び上記複数の変異箇所における検出対象塩基それぞれに対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸のうち、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸とを含む、骨髄異形成症候群に関連する遺伝子変異評価用キット。 - 上記検出対象塩基は、SF3B1遺伝子がコードするSF3B1タンパク質におけるE622D、R625C、R625H、R625L、H662Q、K666N、K666T、K666R、K666E、K666Q及びK666Mからなる群から選ばれる変異をコードする塩基であり、上記複数の非検出対象塩基は、SF3B1タンパク質における622番目のE(グルタミン酸)をコードする塩基、625番目のR(アルギニン)をコードする塩基、662番目のH(ヒスチジン)をコードする塩基及び666番目のK(リシン)をコードする塩基からなることを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- 上記ブロッキング用核酸は、SF3B1タンパク質における622番目のE(グルタミン酸)をコードする塩基及び625番目のR(アルギニン)をコードする塩基に対して相補的な塩基配列を含む及び/又はSF3B1タンパク質における662番目のH(ヒスチジン)をコードする塩基及び666番目のK(リシン)をコードする塩基に対して相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項2記載の遺伝子変異評価用キット。
- 上記検出対象塩基は、更に、SF3B1タンパク質におけるK700E、G742Dをコードする塩基であり、当該塩基を検出する変異型プローブと、これら変異箇所を含む領域を増幅するプライマーセットを含むことを特徴とする請求項2記載の遺伝子変異評価用キット。
- 上記ブロッキング用核酸は、前記複数の非検出対象塩基に対応する塩基が5’側から2塩基より内側、且つ、3’側から3塩基より内側に位置することを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- 上記複数の変異型プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイを含むことを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- 上記変異型プローブは、上記複数の検出対象塩基に対応する領域を複数回繰り返して有することを特徴とする請求項1記載の遺伝子変異評価用キット。
- 請求項1乃至7いずれか一項記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、SF3B1遺伝子における骨髄異形成症候群と関連する複数の変異箇所における検出対象塩基を同定する、骨髄異形成症候群の診断に関するデータ分析方法。
- 上記遺伝子変異評価用キットは、上記複数の変異型プローブに対応する野生型プローブを更に備えており、
上記変異型プローブからのシグナル強度及び上記野生型プローブからのシグナル強度を測定し、式:[変異型プローブのシグナル強度]/([野生型プローブのシグナル強度]+[変異型プローブのシグナル強度])により各遺伝子変異について判定値を算出し、
判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に変異を有すると判定する請求項8記載のデータ分析方法。
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