JP2024028850A - 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその製薬用途 - Google Patents
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Abstract
【課題】ハイブリドーマスクリーニングとヒト化技術によって、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、特にヒトＰＤ－Ｌ１に対して高親和力を有する抗体を得ること。【解決手段】ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体分子又はその抗原結合断片を提供した。また、前記抗体分子又はその抗原結合断片の、腫瘍又はがんを治療する薬物の調製における利用を提供した。提供された抗体は従来の抗ＰＤ－Ｌ１抗体に比べると、優れたＰＤ－Ｌ１に対する親和力及び解離レート、低い免疫原性を有すると共に、より良い腫瘍抑制効果を有する。【選択図】なし
Description
本発明はバイオ医薬分野に属し、新規な抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片に関する。また、本発明は、前記抗体又はその機能的断片の利用に関する。
ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４とも称される遺伝子によりコードされる）は、プログラム細胞死因子ＰＤ１のリガンド分子であり、造血細胞と非造血細胞例えばＴ細胞とＢ細胞、及び各種の腫瘍細胞に良く表現されている。ＰＤ－Ｌ１は、膜貫通型タンパク質の一種に属し、免疫グロブリンＶ様ドメインとＣ様ドメインを有する。ＰＤ－Ｌ１がリガンドとしてその受容体分子ＰＤ－１と相互に作用する場合、Ｔ細胞活性化と細胞因子の生成を抑制する。正常な組織感染又は炎症の期間に、免疫反応の安定的状態を維持して自己免疫を防止するためには、この様な相互作用は重要である。また、このような相互作用は、自分の免疫耐性を誘導・維持する面で極めて重要な役を立つが、腫瘍微環境において、一般的に毒性のＴ細胞を失活させ、腫瘍細胞に免疫回避を与える。当該遺伝子の腫瘍細胞における表現は、メラノーマと非小細胞肺がんなどを含む様々なヒト悪性腫瘍にＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１抗体薬物を利用できるか否か目安の一つとして考えられた。
目の前には、複数のＰＤ－Ｌ１モノクローナル薬物が既に市販され、例えば、ロシュに属するＧＥＮＥＴＥＣＨにより研究して作製された始めてのＰＤ－Ｌ１モノクローナル薬Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（商品名Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）は、プラチナ系化学療法で失敗し又は進展された末期膀胱がんの治療に用いれられる。２０１７年には、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、加速して成人と１２歳児童のメルケル細胞癌（ＭＣＣ）の治療に用いられる新規な薬物Ｂａｖｅｎｃｉｏを許可した。当該薬物の主な成分はＡｖｅｌｕｍａｂであり、転移性メルケル細胞癌（ｍＭＣＣ）に対して継続的緩和作用を有する。欧州では、転移性尿路上皮がんを治療するＰＤ－Ｌ１抗体バイオ製剤のライセンス申請もＦＤＡによる優先審査を受けた。２０１８年３月に、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａも、その免疫療法薬Ｉｍｆｉｎｚｉ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）が既に正式にアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）により許可されたことを公開し、手術切除できないＩＩＩ期の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者の治療に用いられる。
そして、目の前にＰＤＬ１のモノクローナル薬物について、親和力と解離速度の面で向上する余地があり、また、臨床試験データから見れば、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ薬の免疫原性が比較的に高いため、抗体に抵抗するものが大量に生じ、当該薬による治療効果を極大に影響した。
本発明が解決しようとする技術課題は、ハイブリドーマスクリーニングとヒト化技術によって、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、特にヒトＰＤ－Ｌ１に対して高親和力を有する抗体を得ることにある。
上記した技術課題に対して、本発明の目的は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその断片を提供し、また、当該抗体又はその断片によってその利用を提供する。本発明に記載された抗体分子の「断片」は、抗体の種々の機能的断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖ断片のような抗原結合部分を含む。
本発明は、以下の技術手段を提供した。
本発明は、一態様において、ＰＤ－Ｌ１、特にヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合でき、そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を参照する抗体又はその断片を提供する。本発明の具体的な実施形態によれば、本発明にかかる抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外領域を免疫原として得られたマウス抗体、及び前記マウス抗体に基づいて得られたキメラ抗体とヒト化抗体である。
具体的には、本発明により提供された抗体又はその断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、その中、前記重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５（ＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６（ＤＩＨＰＧＧＧＦＴＮＹＮＥＫＦＫＶ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７（ＳＫＴＲＤＹＤＡＷＦＡＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８（ＫＳＳＱＳＬＬＹＴＧＮＱＫＮＹＬＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９（ＷＡＳＴＲＥＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（ＱＱＹＹＴＹＲＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（ＧＹＴＦＴＮＹＶＶＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２（ＹＶＮＰＮＮＤＧＴＩＦＮＥＫＦＫＤ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３（ＳＰＦＡＨ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４（ＳＡＳＥＳＶＤＦＹＧＴＳＬＭＱ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５（ＴＡＳＮＶＤＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６（ＨＱＴＲＫＶＰＹＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７（ＧＹＩＦＴＥＹＩＩＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８（ＷＦＹＰＧＳＤＮＩＫＹＮＥＫＦＫＤ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９（ＨＥＴＧＹＦＦＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０（ＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３（ＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４（ＮＩＤＰＹＹＧＶＴＨＹＮＱＫＦＫＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５（ＧＩＰＦＹＧＬＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６（ＧＡＳＳＳＶＳＦＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＱＱＷＮＴＮＰＦＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＡＦＮＩＤＤＴＹＩＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９（ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＤＹＤＰＥＣＱＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０（ＧＬＲＬＰＧＬＶＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２（ＹＴＳＩＬＹＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４（ＧＦＮＩＥＤＴＹＬＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５（ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＹＹＤＰＫＦＱＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６（ＧＬＲＬＰＧＦＰＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８（ＹＴＳＩＬＨＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９（ＧＤＳＩＩＳＧＹＷＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０（ＹＩＳＹＴＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１（ＲＧＥＷＬＬＨＦＤＶ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＳＬＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９（ＷＡＳＴＲＥＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３（ＱＱＹＹＳＹＰＬＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７（ＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８（ＨＨＲＳＰＹＰＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９（ＫＩＷＧＤＧＳＴＤＹＴＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７（ＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０（ＨＱＲＳＰＹＰＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１（ＲＳＳＱＳＩＥＱＳＮＧＮＴＹＬＥ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２（ＫＶＳＮＲＦＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３（ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４（ＳＡＳＳＳＩＮＹＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８（ＨＨＲＳＰＹＰＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５（ＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５（ＤＩＨＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６（ＳＫＴＲＤＹＤＳＷＦＡＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０（ＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ
から選ばれるＣＤＲ組み合わせ（Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３とＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３）を含む、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５（ＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６（ＤＩＨＰＧＧＧＦＴＮＹＮＥＫＦＫＶ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７（ＳＫＴＲＤＹＤＡＷＦＡＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８（ＫＳＳＱＳＬＬＹＴＧＮＱＫＮＹＬＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９（ＷＡＳＴＲＥＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（ＱＱＹＹＴＹＲＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１（ＧＹＴＦＴＮＹＶＶＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２（ＹＶＮＰＮＮＤＧＴＩＦＮＥＫＦＫＤ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３（ＳＰＦＡＨ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４（ＳＡＳＥＳＶＤＦＹＧＴＳＬＭＱ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５（ＴＡＳＮＶＤＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６（ＨＱＴＲＫＶＰＹＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７（ＧＹＩＦＴＥＹＩＩＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８（ＷＦＹＰＧＳＤＮＩＫＹＮＥＫＦＫＤ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９（ＨＥＴＧＹＦＦＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０（ＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３（ＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４（ＮＩＤＰＹＹＧＶＴＨＹＮＱＫＦＫＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５（ＧＩＰＦＹＧＬＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６（ＧＡＳＳＳＶＳＦＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ＱＱＷＮＴＮＰＦＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ＡＦＮＩＤＤＴＹＩＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９（ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＤＹＤＰＥＣＱＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０（ＧＬＲＬＰＧＬＶＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２（ＹＴＳＩＬＹＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４（ＧＦＮＩＥＤＴＹＬＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５（ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＹＹＤＰＫＦＱＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６（ＧＬＲＬＰＧＦＰＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８（ＹＴＳＩＬＨＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９（ＧＤＳＩＩＳＧＹＷＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０（ＹＩＳＹＴＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１（ＲＧＥＷＬＬＨＦＤＶ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２（ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＳＬＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９（ＷＡＳＴＲＥＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３（ＱＱＹＹＳＹＰＬＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７（ＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８（ＨＨＲＳＰＹＰＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９（ＫＩＷＧＤＧＳＴＤＹＴＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７（ＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０（ＨＱＲＳＰＹＰＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１（ＲＳＳＱＳＩＥＱＳＮＧＮＴＹＬＥ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２（ＫＶＳＮＲＦＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３（ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＤＶＭＤＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４（ＳＡＳＳＳＩＮＹＭＨ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８（ＨＨＲＳＰＹＰＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５（ＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５（ＤＩＨＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６（ＳＫＴＲＤＹＤＳＷＦＡＹ）に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０（ＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１（ＤＴＳＫＬＡＳ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ）に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ
から選ばれるＣＤＲ組み合わせ（Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３とＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３）を含む、
本発明により提供された軽重鎖ＣＤＲの組み合わせは、本発明に係る抗体又はその断片に由来し、当業者は、与えられた抗体又はその断片に含まれる可変領域アミノ酸配列に基づいて、その中に含まれるＣＤＲを定常に特定することができる。例えば、本発明の具体的な実施形態によれば、ＡｂＭ定義法を採用して可変領域アミノ酸配列におけるＣＤＲを限定する。
本発明により提供された抗体又はその断片において、好ましくは、前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されたアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれる配列を含み、
及び／又は、
本発明により提供された抗体又はその断片において、好ましくは、前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されたアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれる配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されたアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれる配列を含み、
及び／又は、
本発明により提供された抗体又はその断片において、好ましくは、前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されたアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれる配列を含む。
より好ましくは、前記抗体又はその断片に含まれる重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
から選ばれる。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列との組み合わせ、
から選ばれる。
本発明の全体において、「少なくとも７５％の同一性」とは、７５％～１００％の間の任意のパーセント数値の同一性、例えば７５％、８０％、８５％、９０％、ひいては９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性である。
特に、本発明に係る抗体又はその断片は、少なくとも重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、両方はいずれも上記ＣＤＲ及びその間のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ）を含み、それぞれのドメインは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のように配列されている。更に好ましくは、前記「少なくとも７５％の同一性」によるアミノ酸配列における最大２５％の差異は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域におけるいずれのフレームワーク領域に存在してもよいし、本発明に係る抗体又はその断片において重鎖可変領域と軽鎖可変領域以外のいずれのドメイン又は配列に存在してもよい。前記差異は、いずれの位置でのアミノ酸欠失、付加又は置換によって生じてもよい。
抗原について、本発明に係る抗体又はその断片は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその断片であり、好ましくは、前記抗体は、モノクローン抗体、単鎖抗体、二機能性抗体、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、完全又は一部ヒト化抗体、又はキメラ抗体などのいずれのものであり、又は、前記抗原結合断片は、半抗体又は抗体或いは半抗体の抗原結合断片、例えば、ｓｃＦｖ、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖであり、より好ましくは、前記抗体はＩｇＧである。
可変領域の他、前記抗体又はその断片は更にヒト又はマウス由来の定常領域を含み、好ましくは、ヒト又はマウス由来の重鎖定常領域（ＣＨ）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、好ましくは、前記抗体又はその断片は重鎖と軽鎖を含み、より好ましくは、前記抗体又はその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＥから選ばれる重鎖定常領域及び／又はκ型或いはλ型軽鎖定常領域を含む。
本発明の具体的な実施形態によれは、前記抗体はモノクローン抗体であり、好ましくは、マウス、キメラ又はヒト化モノクローン抗体であり、好ましくは、前記モノクローン抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ１又はＩｇＧ４亜型であり、軽鎖定常領域はκ型であり、
好ましくは、前記モノクローン抗体における重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記モノクローン抗体における軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記モノクローン抗体における重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記モノクローン抗体における軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、別の態様において、本発明に記載された抗体又はその断片をコードし、又は前記抗体又はその断片に含まれる重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、重鎖又は軽鎖をコードする核酸分子を提供する。
本発明に係る核酸分子は、ベクターにクローンされ、そして宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションすることができる。そのため、本発明は、別の態様において、本発明に係る核酸分子を含むベクターを提供する。前記ベクターは、真核表現ベクター、原核表現ベクター、人工染色体及びバクテリオファージベクターなどであってもよい。本発明に係るベクター又は核酸分子は、宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションすることに利用し、保存又は抗体表現などの目的で用いられてもよい。そのため、本発明は、さらに別の態様において、本発明に係る核酸分子及び／又はベクターを含み、又は本発明に係る核酸分子及び／又はベクターにより形質転換又はトランスフェクションされる宿主細胞を提供する。宿主細胞は、いずれの原核又は真核細胞、例えば、細菌又は昆虫、真菌、植物又は動物細胞であってもよい。
本発明により提供された抗体又はその断片は、本分野に既知のいずれの方法で得られてもよい。例えば、まず、本発明により提供された核酸分子から前記抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖を得、そして前記抗体の任意に選択された他のドメインと抗体を組み立ててもよいし、本発明により提供された宿主細胞が前記抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、又は前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖を表現して前記抗体を組み立てることが許容される場合、前記宿主細胞を培養してもよい。任意選択で、前記方法は生成された抗体を回収するステップを更に含んでいる。
本発明により提供された抗体又はその断片、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞は、薬物組成物に含まれ、特に薬物製剤に含まれて、必要に応じて種々の目的で利用してもよい。そのため、本発明はまた、さらに別の態様において、本発明に記載された抗体又はその断片、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞、並びに任意に薬学的に許容されるの補助原料を含む薬物組成物を提供する。
本発明は、さらに別の態様において、前記抗体又はその断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞及び／又は薬物組成物の、疾患を予防又は治療するための薬物の調製における利用を提供し、前記疾患は腫瘍又はがん、例えば、非小細胞肺がん、メラノーマ、膀胱がん、メルケルリンパ腫、皮膚扁平上皮がん、肺がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、肝臓がん、食道がん、非ホジキンリンパ腫、乳がん、甲状腺がん、胃がん、大腸がん、上咽頭がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、喉頭がん、口腔癌、耳や目の腫瘍、胆道がん、胆嚢がん、副腎皮質がん、生殖器系腫瘍、多発性骨髄腫、神経系腫瘍、尿道上皮細胞がんを含む。
そのため、これに応じて、本発明はまた、必要な被験者に本発明に係る抗体又はその断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞及び／又は薬物組成物を投与することを含む、疾患を予防又は治療する方法を提供し、前記疾患は、腫瘍又はがん、例えば、非小細胞肺がん、メラノーマ、膀胱がん、メルケルリンパ腫、皮膚扁平上皮がん、肺がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、肝臓がん、食道がん、非ホジキンリンパ腫、乳がん、甲状腺がん、胃がん、大腸がん、上咽頭がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、喉頭がん、口腔癌、耳や目の腫瘍、胆道がん、胆嚢がん、副腎皮質がん、生殖器系腫瘍、多発性骨髄腫、神経系腫瘍、尿道上皮細胞がんを含む。好ましくは、前記被験者は哺乳類動物であり、より好ましくは、前記被験者は人である。
本発明は、さらに別の態様において、本発明に係る抗体又はその断片、核酸分子、ベクター、宿主細胞及び／又は薬物組成物を含むキットを提供する。前記キットは、治療又は診断用に用いられてもよい。
本発明は従来技術に比べ、高い親和力でＰＤ－Ｌ１、特にヒトＰＤ－Ｌ１に結合できる新規な抗体を提供した。本発明に係る抗体は従来の抗ＰＤ－Ｌ１抗体に比べ、以下のような利点がある。本発明でスクリーニングされた抗体は、従来の抗体（ＧｅｎｅｔｅｃｈのＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）を例とする）に比べると、ＰＤ－Ｌ１に対する親和力及び解離レートの面ではいずれも向上した。また、初期スクリーニングで得られたマウス抗体を最大限にヒト化改造することによって、抗体の免疫原性が低減された。そして、薬効学試験によれば、本発明により提供された抗体は、より良い腫瘍抑制効果を有することが実証された。
以下、添付図面に基づいて本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明のハイブリドーマ細胞株の培養上清が抗原ＰＤ－Ｌ１に結合したＦＡＣＳ検定結果を示す。
本発明のハイブリドーマ細胞の培養上清がＰＤ－Ｌ１と細胞との結合を阻止したＦＡＣＳ検定結果を示す。
本発明に係る抗体が抗原ＰＤ－Ｌ１に結合したＦＡＣＳ検定結果を示す。
本発明に係る抗体がＰＤ－Ｌ１と細胞との結合を阻止したＦＡＣＳ検定結果を示す。
本発明に係る抗体が抗原ＰＤ－Ｌ１に結合したＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ検定結果を示し、その中、５Ａ：１４Ａ７（ｈｚ）；５Ｂ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ；５Ｃ：１４Ａ７（ｃｈｉ）；５Ｄ：１４Ａ７である。
本発明に係る抗体の動物体内における薬効試験結果を示す。
以下、具体的な実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例はいずれも本発明の範囲を制限することなく、ただ本発明を説明するためのものであることが、当業者にとって理解できる。
以下の実施例におけるテスト方法は、特に説明しない限り、常法である。以下の実施例に用いられる医薬材料、試薬材料などは、特に説明しない限り、いずれも市販のものである。
Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）：Ｇｅｎｅｔｅｃｈ製、商品名Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、ＵＳ２０１６／０３１９０２２Ａ１に開示され、軽重鎖はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を参照する。
実施例１ 本発明のハイブリドーマ細胞の調製
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５４８６２．１由来、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）とマウスＩｇＧ２ａ－ＦＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＨ３１４７０．１由来）を含む融合タンパク質を免疫原として利用してマウスを免疫させ、５匹皮下接種させ、５匹筋肉免疫させ、アジュバントとしてｑｕｉｃｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５Ｗ水溶性アジュバントを利用し、強化免疫後２週間力価を測定し、力価が高い２匹のマウスを選択して免疫強化を行い、３日間後、後述の細胞融合を行う。
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５４８６２．１由来、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）とマウスＩｇＧ２ａ－ＦＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＨ３１４７０．１由来）を含む融合タンパク質を免疫原として利用してマウスを免疫させ、５匹皮下接種させ、５匹筋肉免疫させ、アジュバントとしてｑｕｉｃｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５Ｗ水溶性アジュバントを利用し、強化免疫後２週間力価を測定し、力価が高い２匹のマウスを選択して免疫強化を行い、３日間後、後述の細胞融合を行う。
融合しようとするマウス２匹を採取し、血清を採取した後、解剖して脾臓を取り、脾細胞を分離し、培養された骨髄腫細胞と融合させ、９６ウェルプレートに播種と共に、選択性培地を加えてスクリーニングし、７日間後液を交換し、１０日間後ＥＬＩＳＡ法で検出し、ＯＤ値が陰性コントロールの１０倍以上よりも大きいものを選択してフローサイトメトリーで検出を行う。
ダブル陽性の細胞を選別し、細胞限界希釈法によってサブクローンでプレートに播種し、モノクローン細胞を選別した。選別されたモノクローン細胞から培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ検出及びフローサイトメトリー検出を行い、ダブル陽性の細胞を選別して増幅培養した。
実施例２ 本発明のハイブリドーマ細胞の培養上清とＰＤ－Ｌ１との結合のＥＬＩＳＡ検出
コーティング液でヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５４８６２．１由来、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）とヒトＩｇＧ１－ＦＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＣＡＣ２０４５４．１由来）を含む融合タンパク質を１～２μｇ／ｍｌに希釈し、そして５０～１００μｌ／ウェルで酵素標識プレートのウェルに加え、４℃で一晩過ごし又は３７℃で２時間吸着した。ウェル内の液を除去するとともに、洗浄液によって毎回３～５分間３回洗浄し、乾燥するまでに叩いた。ウェル毎にブロック液２００μｌを加え、４℃で一晩ごし又は３７℃で２時間ブロックした。洗浄液で３回洗浄し、この際に、コーティング板は－２０℃又は４℃で保存して利用に備えてもよい。
コーティング液でヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５４８６２．１由来、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）とヒトＩｇＧ１－ＦＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＣＡＣ２０４５４．１由来）を含む融合タンパク質を１～２μｇ／ｍｌに希釈し、そして５０～１００μｌ／ウェルで酵素標識プレートのウェルに加え、４℃で一晩過ごし又は３７℃で２時間吸着した。ウェル内の液を除去するとともに、洗浄液によって毎回３～５分間３回洗浄し、乾燥するまでに叩いた。ウェル毎にブロック液２００μｌを加え、４℃で一晩ごし又は３７℃で２時間ブロックした。洗浄液で３回洗浄し、この際に、コーティング板は－２０℃又は４℃で保存して利用に備えてもよい。
ウェル毎に検定するハイブリドーマ細胞の培養上清５０～１００μｌを加え、陽性コントロール（融合マウスの血清入り）、陰性コントロール（正常マウスの血清入り）、及びブランクコントロール（培地入り）を同時に設立した。３７℃で１～２時間インキュベートし、洗浄して乾燥するまでに叩いた。そして、ウェル毎に１：１００００希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、品番Ａ９０４４－２ｍｌ）である酵素標識二次抗体５０～１００μｌを加え、３７℃で１～２時間インキュベートし、洗浄して乾燥するまでに叩いた。ウェル毎に新鮮に配合された基質発色液ＴＭＢ ５０－１００μｌを加え、３７℃で１０～３０分間インキュベートした。
２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４を加え反応を停止させ、酵素結合免疫リーダーでＯＤ値を読み取った。
結果判定：Ｐ／Ｎ＞２：１（Ｐは陽性値、Ｎは正常マウス血清値を表す）を陽性とした。陰性コントロールウェルが無色又は無色に近づき、陽性コントロールウェルが明らかに発色すれば、直接に目視で結果を観察できる。
実施例３ 本発明のハイブリドーマ細胞の培養上清とＰＤ－Ｌ１との結合のＦＡＣＳ検出
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５４８６２．１由来、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）遺伝子断片を合成し、ＰＬＶＸウィルスパッキングベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｅ ｍｉｘ、品番６３１２７５）に構築し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションしてウィルスをパッキングし、当該ウィルスでＨＥＫ２９３細胞を感染し、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を加え、スクリーニングして耐薬細胞株、即ちＰＤ－Ｌ１を安定に表現するＨＥＫ２９３を得、２９３Ｔ－ｈ－ＰＤＬ１と名付け、そして、２％ ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞濃度１×１０７個細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５４８６２．１由来、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）遺伝子断片を合成し、ＰＬＶＸウィルスパッキングベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｅ ｍｉｘ、品番６３１２７５）に構築し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションしてウィルスをパッキングし、当該ウィルスでＨＥＫ２９３細胞を感染し、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を加え、スクリーニングして耐薬細胞株、即ちＰＤ－Ｌ１を安定に表現するＨＥＫ２９３を得、２９３Ｔ－ｈ－ＰＤＬ１と名付け、そして、２％ ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞濃度１×１０７個細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
フローサイトメトリーチューブ（サンプル管）毎に細胞懸濁液５０μｌを入り、そして検定するハイブリドーマ細胞の培養上清又は陽性コントロール抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）５０μｌを加え、４℃で６０分間インキュベートした。フローサイトメトリーチューブ毎にフローサイトメトリー用の緩衝液１ｍｌを加え、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去し、繰り返して３回洗浄した。コントロール管１（培養上清と後述の二次抗体を加えることなく、ただ細胞懸濁液入り）とコントロール管２（培養上清を加えることなく、ただ細胞懸濁液と後述の二次抗体入り）を同時に設けた。
そして、フローサイトメトリーチューブ毎にフローサイトメトリー用の緩衝液１００μｌを加えて再び懸濁させ、テスト要求に基づいてＰＥ標識された抗マウスＦｃラベルの二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番４０９３０４）５μｌを加えて、４℃で遮光して３０分間インキュベートし、そしてフローサイトメトリー用の緩衝液１ｍｌを加え、室温下で１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去し、繰り返して３回洗浄した。
また、フローサイトメトリーチューブ毎にフローサイトメトリー用の緩衝液２５０μｌを加え、再び懸濁させて均一に混合し、機器に置いて検出した。
ＦＡＣＳ結合の検定結果を表１と図１に示す。
実施例４ 本発明のハイブリドーマ細胞の培養上清がＰＤ－Ｌ１と細胞との結合を阻止したＦＡＣＳ検出
ヒトＰＤ－１タンパク（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の第２４位～第１７０位）遺伝子断片を合成し、ＰＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に構築し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、プレートに塗り、３７℃で一晩培養した。モノクローンコロニーを選定し、菌を揺らんで酵素切断して同定し、プラスミドを抽出し、シークエンシング検証し、正しいクローンを選定してプラスミドを抽出し、保存して使用に備えた。
ヒトＰＤ－１タンパク（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の第２４位～第１７０位）遺伝子断片を合成し、ＰＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に構築し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、プレートに塗り、３７℃で一晩培養した。モノクローンコロニーを選定し、菌を揺らんで酵素切断して同定し、プラスミドを抽出し、シークエンシング検証し、正しいクローンを選定してプラスミドを抽出し、保存して使用に備えた。
２９３Ｔ細胞を回復させ、連続して２回継代後、２×１０６個細胞／１０ｍｌ／皿でプレートに播種し、１６ｈ～２４ｈ後、細胞密度が７０％～８０％に成長した時に、上記真核表現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、３７℃で５％ＣＯ２培養器において培養した。１２ｈ～１６ｈ培養後、培地を除去し、液を交換し、４８～５６ｈ後、対応量のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加えた。１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ＋１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎで連続して１０日培養した。細胞の成長状態が良好であると、多クローン細胞を得たと一応に判断し、フローサイトメトリー検出を行った。
陽性の多クローン細胞を取り、ウェル毎に０．５個細胞でプレートに播種し、７日後モノクローンを選択して増幅培養した。選択されたモノクローンをＦＡＣＳ検出し、陽性細胞、即ちｈ－ＰＤ１を安定に表現する２９３Ｔ細胞を選択し、２９３Ｔ－ｈ－ＰＤ１細胞と名付けた。
ＦＡＣＳ緩衝液で当該細胞を１回洗浄し、２～５×１０５個細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、ウェル毎にハイブリドーマ上清５０μＬ又は陽性コントロール抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）と実施例２における融合タンパク質ＰＤ－Ｌ１（ｈＦＣ ｔａｇ）５００ｎｇとの予備混合液を加え、２時間インキュベートした。そして、ウェル毎にＦＡＣＳ緩衝液４００μｌを加えて２回洗浄し、ＰＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体を加え、１時間インキュベートした後、ウェル毎にＦＡＣＳ緩衝液４００μｌを加えて２回洗浄した。機器に置いて検出した。
ＦＡＣＳ阻止の検定結果を表２と図２に示す。
実施例５ 本発明のハイブリドーマ細胞の培養上清とＰＤ－Ｌ１との結合の親和力検出
テスト方法：
１．同種に属するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｐを選択して利用した。
２．９６ウェルプレートを取り、ウェル毎に２００μｌ ＳＤ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１％ ＢＳＡ）を加え、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔに入り、予め循環した。
３．抗体を固定し、上清精製後の抗体濃度としては１０μｇ／ｍｌを採用した。
４．ヒトＰＤ－Ｌ１タンパクの細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）をそれぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭの６つの勾配に希釈し、対応するウェルに加えた。
５．機器に置いて検出した。
テスト方法：
１．同種に属するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｐを選択して利用した。
２．９６ウェルプレートを取り、ウェル毎に２００μｌ ＳＤ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１％ ＢＳＡ）を加え、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔに入り、予め循環した。
３．抗体を固定し、上清精製後の抗体濃度としては１０μｇ／ｍｌを採用した。
４．ヒトＰＤ－Ｌ１タンパクの細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）をそれぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭの６つの勾配に希釈し、対応するウェルに加えた。
５．機器に置いて検出した。
結果を表３に示す。
上記したテストに基づいて対応するハイブリドーマ細胞株を選択し、モノクローン細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、シークエンシングベクターに導入してシークエンシング分析を行った。
例示的なマウス抗体の配列は以下の通りであり、その中、下線を引くのはＣＤＲである（ＡｂＭ定義法による）。マウス抗体の名付けはその由来するハイブリドーマ細胞株に基づく。
Ａ１（マウス抗体１４Ａ７）
＞１４Ａ７－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＭＳＣＫＡＴＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＶＧＤＩＨＰＧＧＧＦＴＮＹＮＥＫＦＫＶＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＧＳＫＴＲＤＹＤＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞１４Ａ７－ＶＬ
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＞１４Ａ７－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＭＳＣＫＡＴＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＶＧＤＩＨＰＧＧＧＦＴＮＹＮＥＫＦＫＶＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＧＳＫＴＲＤＹＤＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞１４Ａ７－ＶＬ
ＤＩＶＭＴＱＡＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＬＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＫＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＹＹＴＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
Ａ２（マウス抗体１５Ｇ１０）
＞１５Ｇ１０－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＴＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＶＶＨＷＶＫＱＮＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＶＮＰＮＮＤＧＴＩＦＮＥＫＦＫＤＫＡＩＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＰＦＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞１５Ｇ１０－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＴＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＳＡＳＥＳＶＤＦＹＧＴＳＬＭＱＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＶＹＴＡＳＮＶＤＳＥＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＮＩＨＰＶＥＥＤＤＩＡＭＹＦＣＨＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
＞１５Ｇ１０－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＴＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＶＶＨＷＶＫＱＮＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＶＮＰＮＮＤＧＴＩＦＮＥＫＦＫＤＫＡＩＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＰＦＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞１５Ｇ１０－ＶＬ
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Ａ３（マウス抗体１３Ｃ９）
＞１３Ｃ９－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＧＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＥＹＩＩＨＷＶＫＱＲＳＧＱＧＬＥＷＩＧＷＦＹＰＧＳＤＮＩＫＹＮＥＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＶＹＭＥＬＳＲＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＨＥＴＧＹＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
＞１３Ｃ９－ＶＬ
ＤＩＶＩＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
＞１３Ｃ９－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＧＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＥＹＩＩＨＷＶＫＱＲＳＧＱＧＬＥＷＩＧＷＦＹＰＧＳＤＮＩＫＹＮＥＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＶＹＭＥＬＳＲＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＨＥＴＧＹＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
＞１３Ｃ９－ＶＬ
ＤＩＶＩＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
Ａ４（マウス抗体１８Ｂ４）
＞１８Ｂ４－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＫＱＳＮＧＫＳＬＥＷＩＧＮＩＤＰＹＹＧＶＴＨＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＥＳＳＳＴＡＳＭＱＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＧＩＰＦＹＧＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞１８Ｂ４－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＧＡＳＳＳＶＳＦＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＮＴＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡ
＞１８Ｂ４－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＫＱＳＮＧＫＳＬＥＷＩＧＮＩＤＰＹＹＧＶＴＨＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＥＳＳＳＴＡＳＭＱＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＧＩＰＦＹＧＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞１８Ｂ４－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＧＡＳＳＳＶＳＦＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＮＴＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡ
Ａ５（マウス抗体２８Ｂ１）
＞２８Ｂ１－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＭＬＳＣＴＡＳＡＦＮＩＤＤＴＹＩＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＮＴＤＹＤＰＥＣＱＧＫＡＴＩＴＴＤＭＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＬＲＬＰＧＬＶＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞２８Ｂ１－ＶＬ
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＞２８Ｂ１－ＶＨ
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＞２８Ｂ１－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＩＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＮＴＬＥＥＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＩＲＡ
Ａ６（マウス抗体２２Ｂ１０）
＞２２Ｂ１０－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＥＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＥＤＴＹＬＨＷＶＮＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＮＴＹＹＤＰＫＦＱＧＫＡＴＩＴＴＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＲＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＲＬＰＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞２２Ｂ１０－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＴＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＩＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＡＩＳＮＬＤＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ
＞２２Ｂ１０－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＥＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＥＤＴＹＬＨＷＶＮＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＮＴＹＹＤＰＫＦＱＧＫＡＴＩＴＴＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＲＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＲＬＰＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞２２Ｂ１０－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＴＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＩＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＡＩＳＮＬＤＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ
Ａ７（マウス抗体４Ｇ７）
＞４Ｇ７－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＩＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＥＬＥＹＭＧＹＩＳＹＴＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＳＩＩＲＤＴＦＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＧＥＷＬＬＨＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
＞４Ｇ７－ＶＬ
ＤＩＶＭＴＱＡＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＶＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
＞４Ｇ７－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＩＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＥＬＥＹＭＧＹＩＳＹＴＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＳＩＩＲＤＴＦＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＧＥＷＬＬＨＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
＞４Ｇ７－ＶＬ
ＤＩＶＭＴＱＡＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＶＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
Ａ８（マウス抗体８Ａ２）
＞８Ａ２－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞８Ａ２－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＥＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＨＲＳＰＹＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
＞８Ａ２－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞８Ａ２－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＥＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＨＲＳＰＹＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
Ａ９（マウス抗体７Ｅ５）
＞７Ｅ５－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＳＴＤＹＴＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＶＮＳＬＱＴＤＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞７Ｅ５－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＥＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＲＳＰＹＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
＞７Ｅ５－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＳＴＤＹＴＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＶＮＳＬＱＴＤＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞７Ｅ５－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＥＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＲＳＰＹＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
Ａ１０（マウス抗体２Ｅ５）
＞２Ｅ５－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＥＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞２Ｅ５－ＶＬ
ＤＶＬＭＴＱＩＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＥＱＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＳＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
＞２Ｅ５－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＥＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞２Ｅ５－ＶＬ
ＤＶＬＭＴＱＩＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＥＱＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＳＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
Ａ１１（マウス抗体１０Ａ３）
＞１０Ａ３－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＥＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞１０Ａ３－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＩＮＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＥＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＨＲＳＰＹＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
＞１０Ａ３－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＫＩＷＧＤＧＩＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＥＤＴＡＲＹＹＣＡＲＤＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞１０Ａ３－ＶＬ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＩＮＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＥＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＨＲＳＰＹＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
Ａ１２（マウス抗体６Ｇ５）
＞６Ｇ５－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＭＳＣＫＡＴＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＤＩＨＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＧＳＫＴＲＤＹＤＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞６Ｇ５－ＶＬ
ＤＩＶＩＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
＞６Ｇ５－ＶＨ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＭＳＣＫＡＴＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＤＩＨＰＧＧＧＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＧＳＫＴＲＤＹＤＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＞６Ｇ５－ＶＬ
ＤＩＶＩＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＫＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
実施例６ 本発明に係る抗体のヒト化改造
Ａ１抗体（マウス抗体１４Ａ７）を選択して抗体のヒト化を行った。当該抗体と異なるヒト化鋳型との配列類似性、表現量及び軽重鎖の組み合わせが既に薬となった抗体に利用されたかなどを総合に考えた。軽重鎖類似性の値が２００よりも大きく、表現量が５０ｍｇ／ｍｌよりも大きく、また軽重鎖の組み合わせが既に薬となった抗体に利用されたなどの要因で、最後にヒト化配列であるＩＧＨＶ１－４６＊０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）とＩＧＫＶ１－５＊０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をそれぞれ重鎖と軽鎖の鋳型として選択した。Ａ１マウス由来のモノクローナルを相同モデル化し、Ｆａｂドメインの構造を模擬した。相同モデル化計算によって、予測されたＡ１抗体のＦａｂ構造を最後に得た。
Ａ１抗体（マウス抗体１４Ａ７）を選択して抗体のヒト化を行った。当該抗体と異なるヒト化鋳型との配列類似性、表現量及び軽重鎖の組み合わせが既に薬となった抗体に利用されたかなどを総合に考えた。軽重鎖類似性の値が２００よりも大きく、表現量が５０ｍｇ／ｍｌよりも大きく、また軽重鎖の組み合わせが既に薬となった抗体に利用されたなどの要因で、最後にヒト化配列であるＩＧＨＶ１－４６＊０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）とＩＧＫＶ１－５＊０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をそれぞれ重鎖と軽鎖の鋳型として選択した。Ａ１マウス由来のモノクローナルを相同モデル化し、Ｆａｂドメインの構造を模擬した。相同モデル化計算によって、予測されたＡ１抗体のＦａｂ構造を最後に得た。
予測されたＦａｂ構造及び重鎖とＩＧＨＶ１－４６＊０１配列との対比分析によって、ＣＤＲドメインを全てヒト化鋳型に置き換え、構造模擬及び動力学計算を行った。構造模擬及び動力学分析によって、ＣＤＲ構造に影響するいくつかのアミノ酸をマウス由来のものとして保留し、最後の重鎖バーションは、ＣＤＲドメイン及び６８Ａ、７０Ｌなどを元のマウスのアミノ酸とする以外、他のマウス由来のアミノ酸が全て対応するＩＧＨＶ１－４６＊０１鋳型のヒトアミノ酸に置き換えられた。
予測されたＦａｂ構造及び軽鎖とＩＧＫＶ１－５＊０１配列との対比分析によって、ＣＤＲドメインを全てヒト化鋳型に置き換え、構造模擬及び動力学計算を行った。構造模擬及び動力学分析によって、ＣＤＲ構造に影響するいくつかのアミノ酸をマウス由来のものとして保留し、最後の軽鎖バーションは、ＣＤＲドメインを元のマウスのアミノ酸として保留する以外、他のマウス由来のアミノ酸が全て対応するＩＧＫＶ１－５＊０５鋳型のヒトアミノ酸に置き換えられた。
Ａ１抗体のヒト化抗体の配列は以下の通りである。
＞ＶＨヒト化配列１４Ａ７－ＶＨ－ｈｚ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＧＤＩＨＰＧＧＧＦＴＮＹＮＥＫＦＫＶＲＡＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＳＫＴＲＤＹＤＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
＞ＶＬヒト化配列１４Ａ７－ＶＬ－ｈｚ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＴＹＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
＞ＶＨヒト化配列１４Ａ７－ＶＨ－ｈｚ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＥＹＴＦＴＮＮＷＩＡＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＧＤＩＨＰＧＧＧＦＴＮＹＮＥＫＦＫＶＲＡＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＳＫＴＲＤＹＤＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
＞ＶＬヒト化配列１４Ａ７－ＶＬ－ｈｚ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＴＹＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示された配列を重鎖定常領域とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示された配列を軽鎖定常領域とし、シークエンシングによって得られた、ＰＤ－Ｌ１ターゲットに対する抗体ＤＮＡ配列については、改めてプライマーを設計し、対応するキメラ抗体及びヒト化抗体の遺伝子を合成し、真核表現ベクターに導入し、ＤＨ５ａｌｐｈａコンピテント細胞に形質転換し、３７℃恒温培養器において一晩培養し、モノクローン菌株を選択してシークエンシング同定した。配列が正しい菌株を選択して、菌を揺らぎ、プラスミドを抽出し、哺乳動物表現細胞２９３Ｆにトランスフェクションし、３７℃、５％ＣＯ２の培養器に置き、７日間表現・培養した。
表現上清を採取し、遠心・ろ過し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーカラムを選択して精製し、精製された抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で純度を検出し、ＢＣＡタンパク質検出キットで抗体濃度を検出し、分配して－８０℃冷蔵庫に保存して利用に備えた。その中、キメラ抗体を「マウス抗体略称（ｃｈｉ）」と名付け、ヒト化抗体を「マウス抗体略称（ｈｚ）」と名付けた。
実施例７ 本発明に係る抗体とＰＤ－Ｌ１との結合のＦＡＣＳ検出
テストの過程は、フローサイトメトリーチューブ毎に細胞懸濁液５０μｌを加えた後、検定する抗体、陽性コントロール抗体（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）又は陰性参照抗体（ｈＩｇＧ１）を加えた点以外、実施例３を参照し、濃度を図３に示す。コントロール管１（抗体と二次抗体を加えることなく、ただ細胞懸濁液入り）とコントロール管２（抗体を加えることなく、ただ細胞懸濁液と二次抗体入り）を同時に設置した。
テストの過程は、フローサイトメトリーチューブ毎に細胞懸濁液５０μｌを加えた後、検定する抗体、陽性コントロール抗体（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）又は陰性参照抗体（ｈＩｇＧ１）を加えた点以外、実施例３を参照し、濃度を図３に示す。コントロール管１（抗体と二次抗体を加えることなく、ただ細胞懸濁液入り）とコントロール管２（抗体を加えることなく、ただ細胞懸濁液と二次抗体入り）を同時に設置した。
ＦＡＣＳ結合の検定結果を表４及び図３に示す。
実施例８ 本発明に係る抗体がＰＤ－Ｌ１と細胞との結合を阻止したＦＡＣＳ検出
テストの過程は、ウェル毎に検定する抗体、陽性コントロール抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）又は陰性参照抗体（ｈＩｇＧ１）を加えた点以外、実施例４を参照し、濃度を図４に示す。
テストの過程は、ウェル毎に検定する抗体、陽性コントロール抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）又は陰性参照抗体（ｈＩｇＧ１）を加えた点以外、実施例４を参照し、濃度を図４に示す。
ＦＡＣＳ阻止の検定結果を表５と図４に示す。
実施例９ 本発明に係る抗体とＰＤ－Ｌ１との結合の親和力検出
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパクの細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）をＰＢＳ緩衝液で最大濃度３０ｎＭの溶液に調製し、６つの濃度に３倍希釈し、濃度０をコントロールとした。ＰＢＳで本発明に係るマウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を２０ｎＭの溶液に調製した。
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパクの細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）をＰＢＳ緩衝液で最大濃度３０ｎＭの溶液に調製し、６つの濃度に３倍希釈し、濃度０をコントロールとした。ＰＢＳで本発明に係るマウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を２０ｎＭの溶液に調製した。
親和力検出機器としてＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔを利用して抗体と抗原の親和力を測定した。具体的な操作方法は実施例５を参照した。
テスト結果を表６と図５に示す。
実施例１０ 本発明に係るヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の動物体内における薬効試験
実施例４を参照し、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）遺伝子断片を合成し、ＰＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に構築し、ｈ－ＰＤＬ１付き真核表現ベクターを得、プラスミドを抽出した。
実施例４を参照し、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の細胞外領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第１９位～第２３８位）遺伝子断片を合成し、ＰＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に構築し、ｈ－ＰＤＬ１付き真核表現ベクターを得、プラスミドを抽出した。
２９３Ｔ細胞をＭＣ３８細胞に変えた以外、同様に実施例４を参照し、ｈ－ＰＤＬ１を安定に表現したＭＣ３８細胞を得、ＭＣ３８－ｈ－ＰＤＬ１細胞と名付けた。
ＭＣ３８－ｈ－ＰＤＬ１細胞を回復させ、体外培養し、０．３×１０Ｅ８細胞を得た、６～８週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃマウス３０匹を１週間馴染み飼育し、重量を測った。表７に示す接種条件で細胞を接種した。
表７．マウス接種情報
給薬開始後、マウスの体重及び腫瘍体積を計測した。結果を図６に示す。
以上の本発明の具体的な実施形態の記載は、本発明を制限することなく、当業者は本発明に基づいて各種の変更又は変形をすることができ、本発明の精神から離れない限り、いずれも本発明の請求の範囲に属する。
Claims (1)
- 重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に順次に示されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に順次に示されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３との組み合わせ
から選ばれるＣＤＲ組み合わせを含むことを特徴とする、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片。
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