JP2024019739A - 新規ｃｒｉｓｐｒ ｄｎａターゲティング酵素及びシステム - Google Patents

新規ｃｒｉｓｐｒ ｄｎａターゲティング酵素及びシステム Download PDF

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Abstract

【課題】新規ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡターゲティング酵素及びシステムの提供。【解決手段】本開示は、標的化した形で核酸を操作するための新規システム、方法、及び組成物について記載する。本開示は、ＤＮＡなどの核酸を標的化して修飾するための、天然に存在しないエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲシステム、成分、及び方法について記載する。各システムが、一体となって核酸を標的化する１つ以上のタンパク質成分と１つ以上の核酸成分とを含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１４日に出願された米国特許出願第６２／６４２，９１９号明細書；２０１８年５月３日に出願された米国特許出願第６２／６６６，３９７号明細書；２０１８年５月１６日に出願された米国特許出願第６２／６７２，４８９号明細書；２０１８年６月１日に出願された米国特許出願第６２／６７９，６２８号明細書；２０１８年７月２６日に出願された米国特許出願第６２／７０３，８５７号明細書；２０１８年１０月３日に出願された米国特許出願第６２／７４０，８５６号明細書；２０１８年１０月１６日に出願された米国特許出願第６２／７４６，５２８号明細書；２０１８年１１月２７日に出願された米国特許出願第６２／７７２，０３８号明細書；及び２０１８年１２月５日に出願された米国特許出願第６２／７７５，８８５号明細書の優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の内容は、本明細書によって全体として参照により援用される。
本開示は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）及びその成分に関連するベクターシステムを使用するものである、配列ターゲティング及び核酸編集を伴う遺伝子発現制御に用いられるシステム、方法、及び組成物に関する。
近年、ゲノムシーケンシング技術及び解析の進歩が適用されることにより、原核生物の生合成経路からヒト病理に及ぶまでの多種多様な自然領域における生物学的活性の遺伝的基礎に関して重要な洞察が得られている。遺伝子シーケンシング技術が生み出す大量の情報を完全に理解し、評価するためには、対応したゲノム及びエピゲノム操作技術の規模、有効性、及び容易さの向上が必要となる。このような新規ゲノム及びエピゲノムエンジニアリング技術は、バイオテクノロジー、農業、及びヒト治療薬を含めた数多くの領域における新規適用の開発を加速させることになる。
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、まとめてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとして知られ、現在のところ、細菌及び古細菌にファージ感染に対する免疫を付与するものと理解されている。原核生物適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは極めて多様な一群のタンパク質エフェクター、非コードエレメント、並びに遺伝子座構成であり、その幾つかの例がエンジニアリングされ、適合されることにより、重要なバイオテクノロジーが生み出されている。
宿主防御に関与するこのシステムの成分には、ＤＮＡ又はＲＮＡを修飾する能力を有する１つ以上のエフェクタータンパク質と、これらのタンパク質活性をファージＤＮＡ又はＲＮＡ上の特異的配列に標的化することを担うＲＮＡガイドエレメントとが含まれる。ＲＮＡガイドはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）で構成され、１つ又は複数のエフェクタータンパク質による標的核酸の操作を実現するために追加的なトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とすることもある。ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡへのタンパク質結合を担うダイレクトリピートと、所望の核酸標的配列に相補的なスペーサー配列とからなる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列を修飾することにより、別のＤＮＡ又はＲＮＡ標的を標的化するよう再プログラム化し得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大きく２つのクラスに分けることができる：クラス１システムは、一緒になってｃｒＲＮＡの周りに複合体を形成する複数のエフェクタータンパク質で構成され、クラス２システムは、ＲＮＡガイドと複合体化してＤＮＡ又はＲＮＡ基質を標的化する単一のエフェクタータンパク質からなる。クラス２システムのシングルサブユニットのエフェクター組成は、エンジニアリング及び適用移行に一層簡便な成分セットを提供し、従ってこれまでプログラム可能なエフェクターの重要な供給源となっている。従って、新規クラス２システムの発見、エンジニアリング、及び最適化が、ゲノムエンジニアリング及びその他に向けた広範且つ強力なプログラム可能技術につながり得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、古細菌及び細菌において外来性の遺伝エレメントから種を防御する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって例示されるクラス２
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特徴付け及びエンジニアリングにより、ゲノム編集及びその他における多様な一連のバイオテクノロジー適用への道が開かれてきた。それにも関わらず、核酸及びポリヌクレオチド（即ち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意のハイブリッド、誘導体、又は修飾体）を修飾するための、その独自の特性によって新規適用を実現する現在のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを越える更なるプログラム可能なエフェクター及びシステムが依然として必要とされている。
本願中のいかなる文献の引用又は識別情報も、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
本開示は、新規シングルエフェクタークラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの天然に存在しないエンジニアリングされたシステム及び組成物を、ゲノムデータベースからの計算的同定、天然遺伝子座からエンジニアリングされたシステムへの開発、並びに実験的検証及び適用移行の方法と共に提供する。この新規エフェクターは既存のクラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターのオルソログ及びホモログと配列が異なり、またユニークなドメイン構成も有する。これは、限定はされないが、１）新規ＤＮＡ／ＲＮＡ編集特性及び制御機構、２）送達戦略におけるより高い汎用性に比したより小さいサイズ、３）遺伝子型によって惹起される細胞死などの細胞過程、及び４）プログラム可能なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ挿入、切出し、及び動員を含めた更なる特徴を提供する。本明細書に記載される新規ＤＮＡターゲティングシステムがゲノム及びエピゲノム操作技法のツールボックスに加わることにより、特異的でプログラムされた摂動への幅広い適用が実現する。
一般に、本開示は、非天然環境、例えばそのシステムが当初発見された細菌以外の細菌で使用することのできる最小のシステムを作り出すために使用される新規に発見された酵素及び他の成分を含む新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する。
一態様において、本開示は、ｉ）１つ以上のＶ－Ｉ型（ＣＬＵＳＴ．０２９１３０）ＲＮＡガイド又は１つ以上のＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドをコードする１つ以上の核酸であって、ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含む又はそれらからなるＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド；及びｉｉ）Ｖ－Ｉ型（ＣＬＵＳＴ．０２９１３０）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質又はＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする核酸であって、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドへの結合能及びスペーサー配列に相補的な標的核酸配列のターゲティング能を有するＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供し、ここで標的核酸はＤＮＡである。本明細書で使用されるとき、Ｖ－Ｉ型（ＣＬＵＳＴ．０２９１３０）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質とも称され、これらの２つの用語は本開示において同義的に使用される。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は約１１００アミノ酸以下の長さであり（任意のアミノ酸シグナル配列又はそれに融合しているペプチドタグを除く）、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインを含む。一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインには触媒的に不活性なものが一つもないか、１つ、又はそれ以上ある。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はアミノ酸配列Ｘ１ＳＨＸ４ＤＸ６Ｘ７（配列番号２００）（式中、Ｘ１はＳ又はＴであり、Ｘ４はＱ又はＬであり、Ｘ６はＰ又はＳであり、及びＸ７はＦ又はＬである）を含むか又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はアミノ酸配列Ｘ１ＸＤＸＮＸ６Ｘ７ＸＸＸＸ１１（配列番号２０１）（式中、Ｘ１はＡ又はＧ又はＳであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ６はＱ又はＩであり、Ｘ７はＴ又はＳ又はＶであり、及びＸ１０はＴ又はＡである）を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｅ（配列番号２１０）（式中、Ｘ１はＣ又はＦ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＶ又はＷ又はＹであり、Ｘ２はＣ又はＦ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＲ又はＶ又はＷ又はＹであり、及びＸ３はＣ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＶ又はＷ又はＹである）を含むか又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、セット配列番号２００、配列番号２０１、及び配列番号２１０からの２つ以上の配列を含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、表４に提供されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１～５、及び１１～１８）と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｉ１（配列番号３）又はＣａｓ１２ｉ２（配列番号５）のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はＣａｓ１２ｉ１（配列番号３）又はＣａｓ１２ｉ２（配列番号５）である。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、及び標的核酸は、核酸配列５’－ＴＴＮ－３’又は５’－ＴＴＨ－３’又は５’－ＴＴＹ－３’又は５’－ＴＴＣ－３’を含むか又はそれからなるＰＡＭを含むか又はそれからなる。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＲｕｖＣドメインのうちの少なくとも１つの範囲内に１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換には、配列番号３のＤ６４７又はＥ８９４又はＤ９４８に対応するアミノ残基における置換、例えばアラニン置換が含まれる。一部の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換には、配列番号５のＤ５９９又はＥ８３３又はＤ８８６に対応するアミノ残基におけるアラニン置換が含まれる。一部の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上のアミノ酸置換のないＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性と比較したときのＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性の低下を生じさせる。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、３’末端の近位に（スペーサー配列に直接隣接して）ステム－ループ構造を含むダイレクトリピート配列を含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位にステムループを含み、ここでステムは５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位にステムループを含み、ここでステムは５ヌクレオチド長であり、及びループは７ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位にステムループを含み、ここでステムは５ヌクレオチド長であり、及びループは６、７、又は８ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位に配列５’－ＣＣＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号２０２）（式中、Ｎは任意の核酸塩基を指す）を含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位に配列５’－ＧＵＧＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＣＡＣ－３’（配列番号２０３）（式中、Ｎは任意の核酸塩基を指す）を含む。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位に配列５’－ＧＵＧＵＣＮ５－６ＵＧＡＣＡＸ１－３’（配列番号２０４）（式中、Ｎ５－６は任意の５又は６核酸塩基の連続する配列を指し、及びＸ１はＣ又はＴ又はＵを指す）を含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位に配列５’－ＵＣＸ３ＵＸ５Ｘ６Ｘ７ＵＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号２０５）（式中、Ｘ３はＣ又はＴ又はＵを指し、Ｘ５はＡ又はＴ又はＵを指し、Ｘ６はＡ又はＣ又はＧを指し、及びＸ７はＡ又はＧを指す）を含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドダイレクトリピートは３’末端の近位に配列５’－ＣＣＸ３Ｘ４Ｘ５ＣＸ７ＵＵＧＧＣＡＣ－３’（配列番号２０６）（式中、Ｘ３はＣ又はＴ又はＵを指し、Ｘ４はＡ又はＴ又はＵを指し、Ｘ５はＣ又はＴ又はＵを指し、及びＸ７はＡ又はＧを指す）を含む。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、表５Ａに提供されるヌクレオチド配列（例えば、配列番号６～１９、及び１９～２４）と少なくとも８０％同一、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるダイレクトリピート配列を含む。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、表５Ｂに提供されるヌクレオチド配列又はその部分配列（例えば、配列番号１５０～１６３）を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート、スペーサー、ダイレクトリピート配列のコンカテマー化によって構築されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、ここでダイレクトリピート配列は表５Ａに提供され、スペーサーの長さは表５Ｂのスペーサー長１の列に提供される。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート、スペーサー、ダイレクトリピート配列のコンカテマー化によって構築されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、ここでダイレクトリピート配列は表５Ａに提供され、スペーサーの長さは表５Ｂのスペーサー長２の列に提供される。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート、スペーサー、ダイレクトリピート配列のコンカテマー化によって構築されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、ここでダイレクトリピート配列は表５Ａに提供され、スペーサーの長さは表５Ｂのスペーサー長３の列に提供される。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドのスペーサー配列は約１５～約３４ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド）を含むか又はそれからなる。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、スペーサーは１７ヌクレオチド～３１ヌクレオチド長である。
本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＤＮＡである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、核酸配列５’－ＴＴＮ－３’又は５’－ＴＴＨ－３’又は５’－ＴＴＹ－３’又は５’－ＴＴＣ－３’を含むか又はそれからなるＰＡＭを含む。
本明細書に提供されるシステムのいずれかの特定の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸のターゲティングにより、標的核酸に修飾（例えば、一本鎖又は二本鎖切断イベント）が生じる。一部の実施形態において、修飾は欠失イベントである。一部の実施形態において、修飾は挿入イベントである。一部の実施形態において、修飾により細胞毒性及び／又は細胞死が生じる。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は非特異的な（即ち、「コラテラルな」）ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ）活性を有する。本明細書に提供されるシステムのいずれかの特定の実施形態において、本システムはドナー鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を更に含む。
本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、本システムは細胞（例えば、真核細胞（例えば哺乳類細胞）又は原核細胞（例えば細菌細胞））内にある。
別の態様において、本開示は標的核酸のターゲティング及び編集方法を提供し、ここでこの方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む。これはエキソビボ又はインビトロ方法で行うことができる。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法はヒトの生殖細胞系列遺伝子のアイデンティティを修飾しない。
他の態様において、本開示は、標的核酸のある部位におけるペイロード核酸の挿入を標的化する方法を提供し、ここでこの方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む。
更に別の態様において、本開示は、標的核酸におけるある部位からのペイロード核酸の切出しを標的化する方法を提供し、ここでこの方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む。
別の態様において、本開示は、二本鎖標的ＤＮＡの標的鎖（スペーサー相補鎖）の認識に応じた二本鎖標的ＤＮＡの非標的鎖（非スペーサー相補鎖）のターゲティング及びニッキング方法を提供する。この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを二本鎖標的ＤＮＡに接触させることを含む。
更に別の態様において、本開示は、二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを二本鎖標的ＤＮＡに接触させることを含む。
二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法の一部の実施形態において、二本鎖標的ＤＮＡの非標的鎖（非スペーサー相補鎖）は二本鎖標的核酸の標的鎖（スペーサー相補鎖）のニッキング前にニッキングされる。
更に別の態様において、本開示は、二本鎖核酸の特異的編集方法を提供し、この方法は、（ａ）Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質及び配列特異的ニッキング活性を有する１つの他の酵素；（ｂ）当該の他の配列特異的ニッカーゼの活性と比べて逆の鎖をニッキングするようにＶ－Ｉ型エフェクタータンパク質を誘導するＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド；及び（ｃ）二本鎖核酸を接触させることを含み、ここでこの方法により、オフターゲット修飾の可能性が低下することになる。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質はリンカー配列を更に含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質は、ＤＮＡを切断不能なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をもたらす１つ以上の突然変異又はアミノ酸置換を含む。
更に別の態様において、本開示は、二本鎖核酸の塩基編集方法を提供し、この方法は、（ａ）Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質とＤＮＡ修飾活性（例えば、シチジン脱アミノ化）を有するタンパク質ドメインとを含む融合タンパク質；（ｂ）二本鎖核酸を標的化するＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド、及び（ｃ）二本鎖核酸を接触させることを含む。融合タンパク質のＶ－Ｉ型エフェクターは、二本鎖核酸の非標的鎖をニッキングするように修飾されてもよい。一部の実施形態において、融合タンパク質のＶ－Ｉ型エフェクターはヌクレアーゼ欠損であるように修飾されてもよい。ｚｚｚ
別の態様において、本開示は、ＤＮＡ分子の修飾方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムをＤＮＡ分子に接触させることを含む。
本明細書に記載される方法（及びかかる方法における使用のための組成物）のいずれかの一部の実施形態において、細胞は真核細胞である。一部の実施形態において、細胞は動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は癌細胞（例えば、腫瘍細胞）である。一部の実施形態において、細胞は感染性病原体細胞又は感染性病原体に感染した細胞である。一部の実施形態において、細胞は、細菌細胞、ウイルスに感染した細胞、プリオンに感染した細胞、真菌細胞、原虫、又は寄生虫細胞である。
別の態様において、本開示は、それを必要としている対象における病態又は疾患の治療方法及びかかる方法における使用のための組成物を提供する。この方法は、本明細書に記載されるシステムを対象に投与することを含み、ここでスペーサー配列は、病態又は疾患に関連する標的核酸の少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり、ここでＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はＲＮＡガイドと会合して複合体を形成し、ここでこの複合体は、スペーサー配列の少なくとも１５ヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し、及びここで複合体が標的核酸配列に結合すると、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が標的核酸を切断又はサイレンシングし、それにより対象の病態又は疾患を治療する。
本明細書に記載される方法（及びかかる方法における使用のための組成物）の一部の実施形態において、病態又は疾患は癌又は感染性疾患である。一部の実施形態において、病態又は疾患は癌であり、ここで癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質は少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質は少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）の核外移行シグナル（ＮＥＳ）を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質は少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）のＮＬＳと少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）のＮＥＳとを含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、１つ以上のＲＮＡガイドをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、１つ以上のＲＮＡガイドをコードする核酸はプロモーター（例えば、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター）に作動可能に連結されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、標的核酸をコードする核酸は、プロモーター（例えば、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター）に作動可能に連結されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、ベクター中にＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、本システムは、ベクター中に存在するＲＮＡガイドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。
一部の実施形態において、本システムに含まれるベクターはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、及び単純ヘルペスベクターである。一部の実施形態において、本システムに含まれるベクターはファージベクターである。
一部の実施形態において、本明細書に提供されるシステムは送達システム中にある。一部の実施形態において、送達システムは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、及び遺伝子銃である。
本開示はまた、本明細書に記載されるシステムを含む細胞（例えば、真核細胞又は原核細胞（例えば、細菌細胞））も提供する。一部の実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）又は植物細胞である。本開示はまた、本細胞を含む動物モデル（例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、サル、又は類人猿モデル）及び植物モデルも提供する。一部の実施形態において、本方法は、対象、例えば、ヒト患者などの哺乳類の治療に用いられる。哺乳類対象はまた、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、雌ウシ、ヤギ、又はヒツジなど、家畜化された哺乳類であってもよい。
更に別の態様において、本開示は、試料中における標的核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の検出方法を提供し、この方法は、（ａ）本明細書に提供されるシステム及び標識されたレポーター核酸を試料に接触させることであって、ｃｒＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすると、標識されたレポーター核酸の切断が起こること；及び（ｂ）標識されたレポーター核酸の切断によって生成される検出可能シグナルを測定することを含み、それにより試料中における標的核酸の存在を検出する。
一部の実施形態において、標的核酸の検出方法はまた、検出可能シグナルのレベルを参照シグナルレベルと比較すること、及び検出可能シグナルのレベルに基づき試料中の標的核酸の量を決定することも含むことができる。
一部の実施形態において、測定は、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、又は半導体ベースのセンシングを用いて実施される。
一部の実施形態において、標識されたレポーター核酸は、蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、又は消光剤／フルオロフォア対を含むことができ、ここで標識されたレポーター核酸がエフェクタータンパク質によって切断されると、標識されたレポーター核酸によって生成されるシグナルの量の増加又は減少が生じる。
別の態様を見ると、本開示は、標的ＤＮＡの修飾方法を含み、この方法は、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズするように設計される（例えば、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的である）エンジニアリングされたＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドとを含む複合体を標的ＤＮＡに接触させることを含み、及び本システムは、（ａ）システム中にｔｒａｃｒＲＮＡがないこと、及び（ｂ）Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質とＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドとが、標的ＤＮＡに会合する複合体を形成することによって区別され、それにより標的ＤＮＡを修飾する。
特定の実施形態において、標的ＤＮＡを修飾することは、標的ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断すること（例えば、一本鎖切断又は「ニック」を作り出すこと、又は二本鎖切断を作り出すこと）を含む。それに代えて、又は加えて、標的ＤＮＡの修飾は、（ｉ）標的ＤＮＡに結合し、それにより標的ＤＮＡが別の生体分子又は複合体と会合するのを妨げること、又は（ｉｉ）標的ＤＮＡの一部分を巻き戻すことのいずれかを含む。一部の例では、標的ＤＮＡは、５’－ＴＴＮ－３’又は５’－ＴＴＨ－３’又は５’－ＴＴＹ－３’又は５’－ＴＴＣ－３’などの、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。Ｃａｓ１２エフェクタータンパク質は、特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ｉ１エフェクタータンパク質又はＣａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質である。
引き続き本開示のこの態様について、特定の実施形態では、複合体を標的ＤＮＡに接触させることは、例えば（ａ）複合体を細胞に接触させることであって、複合体がインビトロで形成されること、又は（ｂ）Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及びＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドをコードする１つ以上の核酸を細胞に接触させることであって、次にはそれらが細胞によって発現され、且つ細胞内で複合体を形成することにより、細胞内で行われる。ある場合には、細胞は原核細胞である；他の場合には、それは真核細胞である。
別の態様において、本開示は、標的ＤＮＡの改変方法に関し、この方法は、Ｃａｓ１２ｉタンパク質と、標的ＤＮＡ中の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相補性を有する１５～２４ヌクレオチドスペーサー配列を含むＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ又は同様の構造、任意選択で１つ以上のヌクレオチド、核酸塩基又は骨格修飾を含む）とを含むゲノム編集システムであって、しかしｔｒａｃｒＲＮＡを含まないシステムを細胞内の標的ＤＮＡに接触させることを含む。様々な実施形態において、Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、配列番号３と少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、及びＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、配列番号７又は２４のうちの一方と少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性があるダイレクトリピート配列を含む；又はＣａｓ１２ｉタンパク質は、配列番号５と少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、及びＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、配列番号９又は１０のうちの一方と少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性があるダイレクトリピート配列を含む。標的ＤＮＡは、任意選択で細胞性ＤＮＡであり、及び接触させることは、任意選択で、原核細胞又は真核細胞（例えば、哺乳類細胞、植物細胞、又はヒト細胞）などの細胞内で行われる。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、配列番号１～５又は１１～１８のうちの１つと少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態によれば、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、配列番号３によって与えられるアミノ酸配列、又は配列番号５によって与えられるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質の全長は、任意のアミノ酸シグナル配列又はそれに融合しているペプチドタグを除いて１１００アミノ酸未満である。ある場合には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、アミノ酸置換、例えば配列番号３のＤ６４７、Ｅ８９４、若しくはＤ９４８に対応するアミノ酸残基における置換、又は配列番号５のＤ５９９、Ｅ８３３、若しくはＤ８８６に対応するアミノ酸残基における置換を含む。置換は任意選択でアラニンである。
更に別の態様において、本開示は、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と、標的配列に対して少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的な１５～３４ヌクレオチドスペーサー配列を有するエンジニアリングされたＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ又は同様の構造、任意選択で１つ以上のヌクレオチド、核酸塩基又は骨格修飾を含む）とを含むか又はそれからなるエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する。本システムはｔｒａｃｒＲＮＡを含まず、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質とＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドとが、標的配列に会合する複合体を形成する。一部の例では、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質とＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドとの複合体は、標的配列を含むＤＮＡの少なくとも一方の鎖の切断を生じさせる。標的配列は、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含むことができ、このＰＡＭ配列は、任意選択で、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＹ－３’又は５’－ＴＴＨ－３’又は５’－ＴＴＣ－３’である。Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、配列番号７、９、１０、２４、１００、又は１０１のうちの１つと少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するダイレクトリピート配列を含むことができる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びダイレクトリピート配列が配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、又はＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が、配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びダイレクトリピート配列が配列番号１０１と少なくとも９５％の配列同一性を有する。それに代えて、又は加えて、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、（ａ）配列番号３のＤ６４７、Ｅ８９４、又はＤ９４８に対応するアミノ酸残基における置換；及び（ｂ）配列番号５のＤ５９９、Ｅ８３３、又はＤ８８６に対応するアミノ酸残基における置換からなる群から選択されるアミノ酸置換（任意選択で、アラニン置換）を含む。
更に別の態様において、本開示は、本開示の態様のうちの１つに係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（又はゲノム編集システム）をコードする１つ以上の核酸を含む組成物に関する。及び別の態様において、本開示は、本開示の態様のうちの１つに係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（又はゲノム編集システム）をコードするウイルスベクターに関する。
本開示はまた、二本鎖標的ＤＮＡのスペーサー相補鎖の認識に応じた二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法も含み、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを二本鎖標的ＤＮＡに接触させることを含む。
別の態様において、本開示は、二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法を含み、この方法は、本明細書に記載されるとおりのシステムを二本鎖標的ＤＮＡに接触させることを含む。これらの方法において、二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖は、二本鎖標的核酸のスペーサー相補鎖のニッキング前にニッキングされる。
他の実施形態において、本開示は、試料中の標的核酸の検出方法を含み、この方法は、（ａ）本明細書に記載されるとおりのシステム及び標識されたレポーター核酸を試料に接触させることであって、ｃｒＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすると、標識されたレポーター核酸の切断が起こること；及び（ｂ）標識されたレポーター核酸の切断によって生成される検出可能シグナルを測定することを含み、それにより試料中における標的核酸の存在を検出する。これらの方法は、検出可能シグナルのレベルを参照シグナルレベルと比較すること、及び検出可能シグナルのレベルに基づき試料中の標的核酸の量を決定することを更に含み得る。一部の実施形態において、測定は、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、又は半導体ベースのセンシングを用いて実施される。一部の実施形態において、標識されたレポーター核酸は蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、又は消光剤／フルオロフォア対を含み、ここで標識されたレポーター核酸がエフェクタータンパク質によって切断されると、標識されたレポーター核酸によって生成されるシグナルの量の増加又は減少が生じる。
別の態様において、本明細書における方法は、二本鎖核酸を特異的に編集することを含み、この方法は、（ａ）Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター及び配列特異的ニッキング活性を有する１つの他の酵素、及び当該の他の配列特異的ニッカーゼの活性と比べて逆の鎖をニッキングするようにＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターを誘導するｃｒＲＮＡ；及び（ｂ）二本鎖核酸を十分な条件下で十分な長さの時間にわたって接触させることを含み；ここでこの方法により二本鎖切断の形成が生じる。
別の態様は、二本鎖核酸の編集方法を含み、この方法は、（ａ）Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターとＤＮＡ修飾活性を有するタンパク質ドメインと二本鎖核酸を標的化するＲＮＡガイドとを含む融合タンパク質；及び（ｂ）二本鎖核酸を十分な条件下で十分な長さの時間にわたって接触させることを含み；ここで融合タンパク質のＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターは、二本鎖核酸の非標的鎖をニッキングするように修飾される。
別の態様は、細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法を含み、この方法は、本明細書に開示される任意のシステムを細胞、例えば原核細胞又は真核細胞に接触させることを含み、ここでＲＮＡガイドが標的ＤＮＡにハイブリダイズすると、コラテラルＤＮアーゼ活性媒介性細胞死又は休眠が起こる。例えば、細胞は哺乳類細胞、例えば癌細胞であってもよい。細胞は、感染性細胞又は感染性病原体に感染した細胞、例えば、ウイルスに感染した細胞、プリオンに感染した細胞、真菌細胞、原虫、又は寄生虫細胞であってもよい。
別の態様において、本開示は、それを必要としている対象における病態又は疾患の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを対象に投与することを含み、ここでスペーサー配列は、病態又は疾患に関連する標的核酸の少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；ここでＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はＲＮＡガイドと会合して複合体を形成し；
ここで複合体は、スペーサー配列の少なくとも１５ヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し；及びここで複合体が標的核酸配列に結合したことに応じて、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が標的核酸を切断し、それにより対象の病態又は疾患を治療する。例えば、病態又は疾患は癌又は感染性疾患であってもよい。例えば、病態又は疾患は癌であってもよく、ここで癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される。
本開示はまた、医薬としての使用のための、又は癌若しくは感染性疾患の治療若しくは予防における使用のための本明細書に記載されるとおりのシステム又は細胞も含み、例えば、ここで癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される。
本開示はまた、インビトロ又はエキソビボでの
ａ）標的核酸のターゲティング及び編集方法；
ｂ）ＤＮＡ標的核酸の認識に応じた一本鎖ＤＮＡの非特異的分解方法；
ｃ）二本鎖標的ＤＮＡのスペーサー相補鎖の認識に応じた二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法；
ｄ）二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法；
ｅ）試料中の標的核酸の検出方法；
ｆ）二本鎖核酸の特異的編集方法；
ｇ）二本鎖核酸の塩基編集方法；
ｈ）細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法、
ｉ）二本鎖標的ＤＮＡにおけるインデルの作成方法；
ｊ）二本鎖標的ＤＮＡへの配列の挿入方法、又は
ｋ）二本鎖標的ＤＮＡにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における本明細書に記載されるとおりのシステム又は細胞の使用も提供する。
別の態様において、本開示は、
ａ）標的核酸のターゲティング及び編集方法；
ｂ）ＤＮＡ標的核酸の認識に応じた一本鎖ＤＮＡの非特異的分解方法；
ｃ）二本鎖標的ＤＮＡのスペーサー相補鎖の認識に応じた二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法；
ｄ）二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法；
ｅ）試料中の標的核酸の検出方法；
ｆ）二本鎖核酸の特異的編集方法；
ｇ）二本鎖核酸の塩基編集方法；
ｈ）細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法；
ｉ）二本鎖標的ＤＮＡにおけるインデルの作成方法；
ｊ）二本鎖標的ＤＮＡへの配列の挿入方法、又は
ｋ）二本鎖標的ＤＮＡにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における本明細書に記載されるシステム又は細胞の使用を提供し、
ここでこの方法は、ヒトの生殖細胞系列遺伝子のアイデンティティを修飾するプロセスを含まず、且つヒト又は動物の生体の治療方法を含まない。
本明細書に記載される方法において、標的ＤＮＡ若しくは標的核酸の切断はインデルの形成を生じさせるか、又は標的ＤＮＡ若しくは標的核酸の切断は核酸配列の挿入を生じさせるか、又は標的ＤＮＡ若しくは標的核酸の切断は２つの部位における標的ＤＮＡ若しくは標的核酸の切断を含み、それらの２つ部位の間にある配列の欠失若しくは逆位を生じさせる。
本明細書に記載される様々なシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠いていてもよい。一部の実施形態では、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質とＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドとが、標的核酸に会合することによって標的核酸を修飾する複合体を形成する。
本明細書に記載されるシステムの一部の実施形態において、スペーサー配列は１５～４７ヌクレオチド長、例えば、２０～４０ヌクレオチド長、又は２４～３８ヌクレオチド長である。
別の態様において、本開示は、修飾された目的の標的遺伝子座を含む真核細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞を提供し、ここで目的の標的遺伝子座は、前出の請求項のいずれか一項の方法により、又はその組成物の使用によって修飾されたものである。例えば、目的の標的遺伝子座の修飾は、
（ｉ）少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞；
（ｉｉ）少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現が増加するもの；
（ｉｉｉ）少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現が減少するもの；又は
（ｉｖ）編集されたゲノムを含む真核細胞
を生じさせることができる。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される真核細胞の、若しくはそれを含む真核細胞株、若しくはその子孫、又は本明細書に記載される真核細胞を１つ以上含む多細胞生物を提供する。
本開示はまた、本明細書に記載されるとおりの細胞を１つ以上含む植物又は動物モデルも提供する。
別の態様において、本開示は、目的の遺伝子によってコードされる目的の形質が修飾された、植物の作製方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを植物細胞に接触させて、それにより前記目的の遺伝子の修飾又は導入のいずれかを行うこと、及び植物細胞から植物を再生することを含む。
本開示はまた、植物における目的の形質の同定方法も提供し、ここで目的の形質は目的の遺伝子によってコードされ、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを植物細胞に接触させることを含み、それにより目的の遺伝子を同定する。例えば、この方法は、同定された目的の遺伝子を植物細胞又は植物細胞株又は植物生殖質に導入すること及びそれから植物を発生させることであって、それによって植物が目的の遺伝子を含有することを更に含んでもよい。この方法は、植物に目的の形質を呈示させることを含んでもよい。
本開示はまた、一本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法も含み、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む。この方法は、病態又は疾患が感染性であることを含んでもよく、ここで感染性病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）、及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）からなる群から選択される。
本明細書に記載される方法の一部において、標的ＤＮＡの両方の鎖が異なる部位で切断される結果、付着末端型の切断部が生じてもよい。他の実施形態において、標的ＤＮＡの両方の鎖が同じ部位で切断される結果、平滑末端型の二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる。
本明細書に記載される治療法の一部において、病態又は疾患は、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、α１－アンチトリプシン欠乏症、ポンペ病、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ失調症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎疾患、高脂血症、高コレステロール血症、レーベル先天黒内障、鎌状赤血球症、及びβサラセミアからなる群から選択される。
用語「切断イベント」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼによって作り出される標的核酸におけるＤＮＡ切断を指す。一部の実施形態において、切断イベントは二本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態において、切断イベントは一本鎖ＤＮＡ切断である。
用語「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」、「Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」、又は「Ｖ－Ｉ型システム」は、本明細書で使用されるとき、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質（即ち、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質）及び１つ以上のＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド、及び／又はＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質若しくは１つ以上のＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドをコードする核酸、及び任意選択で、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの発現又はＲＮＡガイド又は両方に作動可能に連結されたプロモーターを指す。
用語「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、本明細書で使用されるとき、最初のＣＲＩＳＰＲリピートの最初のヌクレオチドから始まって最後の（末端）ＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドで終わる、ＣＲＩＳＰＲリピートとスペーサーとを含む核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントを指す。典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイ中の各スペーサーは２つのリピート間に位置する。用語「ＣＲＩＳＰＲリピート」、又は「ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート」、又は「ダイレクトリピート」は、本明細書で使用されるとき、複数の短い定方向に反復する配列を指し、これはＣＲＩＳＰＲアレイ内で配列変異をごく僅かしか又は全く示さない。好適には、Ｖ－Ｉ型ダイレクトリピートはステム－ループ構造を形成し得る。
「ステム－ループ構造」は、主に一本鎖のヌクレオチド領域（ループ部分）によって片側が連結されている二本鎖を形成することが公知の、又はそれを形成すると予想されるヌクレオチド領域（ステム部分）を含む二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」及び「フォールドバック」構造もまた、本明細書では、ステム－ループ構造を指して使用される。かかる構造は当該技術分野において周知であり、これらの用語は、当該技術分野におけるその公知の意味と一致して使用される。当該技術分野において公知のとおり、ステム－ループ構造は正確な塩基対合を要件としない。従って、ステムは１つ以上の塩基ミスマッチを含み得る。或いは、塩基対合は正確であってもよく、即ちいかなるミスマッチも含まなくてもよい。一部のＶ－Ｉ型ダイレクトリピートの予想されるステムループ構造を図３に示す。ＲＮＡガイド中に含まれるＶ－Ｉ型ダイレクトリピートのステムは、互いにハイブリダイズする相補的な５核酸塩基で構成され、ループは６、７、又は９ヌクレオチド長である。
用語「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクターによって特異的核酸配列のターゲティングに使用されるガイド配列を含むＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｃｒＲＮＡは、標的認識を媒介するスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質と共に複合体を形成するダイレクトリピート配列（本明細書においてダイレクトリピート又は「ＤＲ」配列と称される）とを含む。
用語「ドナー鋳型核酸」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素が標的核酸を改変した後に１つ以上の細胞タンパク質によって標的核酸の構造を改変するために使用され得る核酸分子を指す。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は二本鎖核酸である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は一本鎖核酸である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は線状である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は環状（例えば、プラスミド）である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は外因性核酸分子である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は内因性核酸分子（例えば、染色体）である。
用語「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「エフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、又は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」、「Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質」、「Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター」、「Ｖ－Ｉ型エフェクター」、又は「Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質」は、本明細書で使用されるとき、酵素活性を実行するタンパク質又はＲＮＡガイドによって指定される核酸上の標的部位に結合するタンパク質を指す。Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム内にある関連するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質はまた、本明細書では「Ｃａｓ１２ｉ」又は「Ｃａｓ１２ｉ酵素」とも称することができる。Ｃａｓ１２ｉ酵素は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる標的ＤＮＡの近くにある関連する短いモチーフを認識することができる。好適には、本開示のＣａｓ１２ｉ酵素は、ＴＴＮ（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを意味する）を含むか又はそれからなるＰＡＭを認識することができる。例えば、ＰＡＭは、ＴＴＮ、ＴＴＨ、ＴＴＹ又はＴＴＣであってもよい。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はエンドヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、及び／又はエキソヌクレアーゼ活性を有する。
用語「ＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体」、「エフェクター複合体」、「二元複合体」、又は「監視複合体」は、本明細書で使用されるとき、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質とＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドとを含む複合体を指す。
用語「ＲＮＡガイド」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるタンパク質の標的核酸へのターゲティングを促進する任意のＲＮＡ分子を指す。例示的「ＲＮＡガイド」としては、限定はされないが、ｃｒＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡ（例えばＤＲ－スペーサー－ＤＲ）、及び成熟ｃｒＲＮＡ（例えば成熟＿ＤＲ－スペーサー、成熟ＤＲ－スペーサー－成熟＿ＤＲ）が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「ターゲティング」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とｃｒＲＮＡなどのＲＮＡガイドとを含む複合体が、標的核酸と同じ又は類似の配列を有しない他の核酸と比較して特定の標的核酸に優先的又は特異的に結合する、例えばハイブリダイズする能力を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「標的核酸」は、ＲＮＡガイド中のスペーサーの全体又は一部に相補的な核酸配列を含む特定の核酸基質を指す。一部の実施形態において、標的核酸は遺伝子又は遺伝子内の配列を含む。一部の実施形態において、標的核酸は非コード領域（例えば、プロモーター）を含む。一部の実施形態において、標的核酸は一本鎖である。一部の実施形態において、標的核酸は二本鎖である。
用語「活性化ＣＲＩＳＰＲ複合体」、「活性化複合体」、又は「三元複合体」は、本明細書で使用されるとき、標的核酸に結合した後又はそれを修飾した後のＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体を指す。
用語「コラテラルＲＮＡ」又は「コラテラルＤＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、活性化ＣＲＩＳＰＲ複合体によって非特異的に切断される核酸基質を指す。
用語「コラテラルＤＮアーゼ活性」は、本明細書でＣＲＩＳＰＲ酵素に言及して使用されるとき、活性化ＣＲＩＳＰＲ複合体の非特異的ＤＮアーゼ活性を指す。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料を使用し得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は全て、全体として参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
Ｖ－Ｉ型（ＣＬＵＳＴ．０２９１３０）ＲＮＡガイド又は前記Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドをコードする核酸であって、ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド；及び
Ｖ－Ｉ型（ＣＬＵＳＴ．０２９１３０）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質又は前記エフェクタータンパク質をコードする核酸であって、前記ＲＮＡガイドへの結合能を有し且つ前記スペーサー配列に相補的な前記標的核酸配列のターゲティング能を有するエフェクタータンパク質
を含み、前記標的核酸がＤＮＡである、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム。
（項目２）
２つ以上のＲＮＡガイドを含む、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が約１１００アミノ酸長未満であり、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインを含む、項目１又は２に記載のシステム。
（項目４）
前記Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドが、前記Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイド内に順番に配置されたダイレクトリピート配列と前記スペーサー配列と第２のダイレクトリピートとを含む、項目１又は２に記載のシステム。
（項目５）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、
アミノ酸配列Ｘ１ＳＨＸ４ＤＸ６Ｘ７（配列番号２００）（式中、Ｘ１はＳ又はＴであり、Ｘ４はＱ又はＬであり、Ｘ６はＰ又はＳであり、及びＸ７はＦ又はＬである）を含むＲｕｖＣドメイン、
アミノ酸配列Ｘ１ＸＤＸＮＸ６Ｘ７ＸＸＸＸ１１（配列番号２０１）（式中、Ｘ１はＡ、Ｇ、又はＳであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ６はＱ又はＩであり、Ｘ７はＴ、Ｓ、又はＶであり、及びＸ１０はＴ又はＡである）を含むＲｕｖＣドメイン；及び
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｅ（配列番号２１０）（式中、Ｘ１はＣ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり、Ｘ２はＣ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、又はＹであり、及びＸ３はＣ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、又はＹである）を含むＲｕｖＣドメイン
のうちの１つ以上を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、表４にあるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目６に記載のシステム。
（項目８）
前記Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドが、前記ダイレクトリピート配列の３’末端の近位にステム－ループ構造を含むダイレクトリピート配列を含み、前記ステム－ループ構造が、
第１のステムヌクレオチド鎖５ヌクレオチド長；
第２のステムヌクレオチド鎖５ヌクレオチド長（前記第１及び第２のステムヌクレオチド鎖は互いにハイブリダイズすることができる）；及び
前記第１及び第２のステムヌクレオチド鎖間に配置されたループヌクレオチド鎖であって、６、７、又は８ヌクレオチドを含むループヌクレオチド鎖
を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目９）
前記ダイレクトリピート配列が、
前記３’末端の近位にある５’－ＣＣＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号２０２）（式中、Ｎは任意の核酸塩基である）；
前記３’末端の近位にある５’－ＧＵＧＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＣＡＣ－３’（配列番号２０３）（式中、Ｎは任意の核酸塩基である）；
前記３’末端の近位にある５’－ＧＵＧＵＣＮ５－６ＵＧＡＣＡＸ１－３’（配列番号２０４）（式中、Ｎ５－６は任意の５又は６核酸塩基の連続配列であり、及びＸ１はＣ又はＴ又はＵである）；
前記３’末端の近位にある５’－ＵＣＸ３ＵＸ５Ｘ６Ｘ７ＵＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号２０５）（式中、Ｘ３はＣ、Ｔ、又はＵであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、又はＵであり、Ｘ６はＡ、Ｃ、又はＧであり、及びＸ７はＡ又はＧである）；
前記３’末端の近位にある５’－ＣＣＸ３Ｘ４Ｘ５ＣＸ７ＵＵＧＧＣＡＣ－３’（配列番号２０６）（式中、Ｘ３はＣ、Ｔ、又はＵであり、Ｘ４はＡ、Ｔ、又はＵであり、Ｘ５はＣ、Ｔ、又はＵであり、及びＸ７はＡ又はＧである）
のうちのいずれか１つを含む、項目１～８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１０）
前記ダイレクトリピート配列が、表５に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む、項目１～９のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１１）
前記ＲＮＡガイドが、順番に配置されたダイレクトリピート配列と前記スペーサー配列と第２のダイレクトリピートとを含み、前記ＲＮＡガイド配列が、表５Ｂに提供されるヌクレオチド配列又はその断片と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含み、前記可変Ｎ領域が前記スペーサーを意味し、且つ表５Ｂに指定されるとおりの長さを有し得る、項目１～１０のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１２）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、及び前記標的核酸が、核酸配列５’－ＴＴＮ－３’（式中、Ｎは任意のヌクレオチドである）、５’－ＴＴＨ－３’、５’－ＴＴＹ－３’、又は５’－ＴＴＣ－３’を含むＰＡＭを含む、項目１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１３）
前記標的核酸がＤＮＡである、項目１～１２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１４）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＲＮＡガイドによる前記標的核酸のターゲティングにより、前記標的核酸の修飾が生じる、項目１～１３のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１５）
前記標的核酸の前記修飾が切断イベントである、項目１４に記載のシステム。
（項目１６）
前記標的核酸の前記修飾がニッキングイベントである、項目１４に記載のシステム。
（項目１７）
前記修飾が細胞毒性を生じさせる、項目１３～１６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１８）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、１つ以上のアミノ酸置換を有しない前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ又はニッカーゼ活性と比較したとき前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ又はニッカーゼ活性の低下を生じさせる１つ以上のアミノ酸置換を前記ＲｕｖＣドメイン内に含む、項目３～１７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１９）
前記１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号３のＤ６４７、Ｅ８９４、又はＤ９４８；又は配列番号５のＤ５９９、Ｅ８３３、又はＤ８８６に対応するアミノ酸残基におけるアラニン置換を含む、項目１８に記載のシステム。
（項目２０）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が塩基編集ドメインに融合される、項目１８又は１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子に融合される、項目１８又は１９に記載のシステム。
（項目２２）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）、又は両方を含む、項目１～２１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２３）
プロモーターに作動可能に連結された、前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする前記核酸を含む、項目１～２２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２４）
前記プロモーターが構成的プロモーターである、項目２３に記載のシステム。
（項目２５）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする前記核酸が細胞での発現にコドン最適化される、項目２３に記載のシステム。
（項目２６）
プロモーターに作動可能に連結された、前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする前記核酸がベクター中にある、項目２３に記載のシステム。
（項目２７）
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、及び単純ヘルペスベクターからなる群から選択される、項目２６に記載のシステム。
（項目２８）
ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、及び遺伝子銃からなる群から選択される送達システム中に存在する、項目１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２９）
標的ＤＮＡ又は前記標的ＤＮＡをコードする核酸を更に含み、前記標的ＤＮＡが、前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列へのハイブリダイズ能を有する配列を含む、項目１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目３０）
ドナー鋳型核酸を更に含む、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム。
（項目３１）
前記ドナー鋳型核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、項目３０に記載のシステム。
（項目３２）
項目１～３１のいずれか一項に記載のシステムを含む細胞。
（項目３３）
前記細胞が真核細胞である、項目３２に記載の細胞。
（項目３４）
前記細胞が原核細胞である、項目３２に記載の細胞。
（項目３５）
標的核酸のターゲティング及び編集方法であって、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む方法。
（項目３６）
標的ＤＮＡの認識に応じた一本鎖ＤＮＡの非特異的分解方法であって、項目１～３６のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む方法。
（項目３７）
二本鎖標的ＤＮＡのスペーサー相補鎖の認識に応じた前記二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法であって、項目１～３６のいずれか一項に記載のシステムを前記二本鎖標的ＤＮＡに接触させることを含む方法。
（項目３８）
二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法であって、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステムを前記二本鎖標的ＤＮＡに接触させることを含む方法。
（項目３９）
前記二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖が、前記二本鎖標的核酸のスペーサー相補鎖のニッキング前にニッキングされる、項目４０に記載の方法。
（項目４０）
試料中の標的核酸の検出方法であって、
（ａ）項目１～３１のいずれか一項に記載のシステム及び標識されたレポーター核酸を前記試料に接触させることであって、前記ｃｒＲＮＡが前記標的核酸にハイブリダイズすると、前記標識されたレポーター核酸の切断が起こること；及び
（ｂ）前記標識されたレポーター核酸の切断によって生成される検出可能シグナルを測定することであって、それにより前記試料中における前記標的核酸の存在を検出することを含む方法。
（項目４１）
前記検出可能シグナルのレベルを参照シグナルレベルと比較すること、及び前記検出可能シグナルの前記レベルに基づき前記試料中の標的核酸の量を決定することを更に含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記測定が、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、又は半導体ベースのセンシングを用いて実施される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記標識されたレポーター核酸が蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、又は消光剤／フルオロフォア対を含み、前記標識されたレポーター核酸が前記エフェクタータンパク質によって切断されると、前記標識されたレポーター核酸によって生成されるシグナルの量の増加又は減少が生じる、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
二本鎖核酸の特異的編集方法であって、
（ａ）Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター及び配列特異的ニッキング活性を有する１つの他の酵素、及び前記他の配列特異的ニッカーゼの前記活性と比べて逆の鎖をニッキングするように前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターを誘導するｃｒＲＮＡ；及び
（ｂ）前記二本鎖核酸
を十分な条件下で十分な長さの時間にわたって接触させることを含み；
前記方法により二本鎖切断の形成が生じる、方法。
（項目４５）
二本鎖核酸の編集方法であって、
（ａ）前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターとＤＮＡ修飾活性を有するタンパク質ドメインと前記二本鎖核酸を標的化するＲＮＡガイドとを含む融合タンパク質；及び
（ｂ）前記二本鎖核酸
を十分な条件下で十分な長さの時間にわたって接触させることを含み；
前記融合タンパク質の前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターが、前記二本鎖核酸の非標的鎖をニッキングするように修飾される、方法。
（項目４６）
細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法であって、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステムを細胞に接触させることを含み、前記ＲＮＡガイドが前記標的ＤＮＡにハイブリダイズすると、コラテラルＤＮアーゼ活性媒介性細胞死又は休眠が起こる、方法。
（項目４７）
前記細胞が原核細胞である、項目４７に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞が真核細胞である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が癌細胞である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞が感染性細胞又は感染性病原体に感染した細胞である、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞が、ウイルスに感染した細胞、プリオンに感染した細胞、真菌細胞、原虫、又は寄生虫細胞である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
それを必要としている対象における病態又は疾患の治療方法であって、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステムを前記対象に投与することを含み、
前記スペーサー配列が、前記病態又は疾患に関連する標的核酸の少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が前記ＲＮＡガイドと会合して複合体を形成し；
前記複合体が、前記スペーサー配列の前記少なくとも１５ヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し；及び
前記複合体が前記標的核酸配列に結合すると、前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が前記標的核酸を切断し、それにより前記対象の前記病態又は疾患を治療する、方法。
（項目５４）
前記病態又は疾患が癌又は感染性疾患である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記病態又は疾患が癌であり、及び前記癌が、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
医薬としての使用のための項目１～３４のいずれか一項に記載のシステム又は細胞。
（項目５７）
癌又は感染性疾患の治療又は予防における使用のための項目１～３５のいずれか一項に記載のシステム又は細胞。
（項目５８）
前記癌が、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される、項目５７に記載の使用のためのシステム又は細胞。
（項目５９）
インビトロ又はエキソビボでの
ａ）標的核酸のターゲティング及び編集方法；
ｂ）ＤＮＡ標的核酸の認識に応じた一本鎖ＤＮＡの非特異的分解方法；
ｃ）二本鎖標的ＤＮＡのスペーサー相補鎖の認識に応じた前記二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法；
ｄ）二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法；
ｅ）試料中の標的核酸の検出方法；
ｆ）二本鎖核酸の特異的編集方法；
ｇ）二本鎖核酸の塩基編集方法；
ｈ）細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法
ｉ）二本鎖標的ＤＮＡにおけるインデルの作成方法；
ｊ）二本鎖標的ＤＮＡへの配列の挿入方法、又は
ｋ）二本鎖標的ＤＮＡにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における項目１～３５のいずれか一項に記載のシステム又は細胞の使用。
（項目６０）
ａ）標的核酸のターゲティング及び編集方法；
ｂ）ＤＮＡ標的核酸の認識に応じた一本鎖ＤＮＡの非特異的分解方法；
ｃ）二本鎖標的ＤＮＡのスペーサー相補鎖の認識に応じた前記二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法；
ｄ）二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法；
ｅ）試料中の標的核酸の検出方法；
ｆ）二本鎖核酸の特異的編集方法；
ｇ）二本鎖核酸の塩基編集方法；
ｈ）細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法；
ｉ）二本鎖標的ＤＮＡにおけるインデルの作成方法；
ｊ）二本鎖標的ＤＮＡへの配列の挿入方法、又は
ｋ）二本鎖標的ＤＮＡにおける配列の欠失又は逆位形成方法
における項目１～３５のいずれか一項に記載のシステム又は細胞の使用であって、
前記方法が、ヒトの生殖細胞系列遺伝子のアイデンティティを修飾するプロセスを含まず、且つ前記ヒト又は動物の生体の治療方法を含まない、使用。
（項目６１）
前記標的ＤＮＡ又は標的核酸の切断がインデルの形成を生じさせる、項目３８又は５３に記載の方法。
（項目６２）
前記標的ＤＮＡ又は標的核酸の切断が核酸配列の挿入を生じさせる、項目３８又は５３に記載の方法。
（項目６３）
前記標的ＤＮＡ又は標的核酸の切断が２つの部位における前記標的ＤＮＡ又は標的核酸の切断を含み、前記２つ部位の間にある配列の欠失又は逆位を生じさせる、項目３８又は５３に記載の方法。
（項目６４）
前記システムがｔｒａｃｒＲＮＡを欠いている、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６５）
前記Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質とＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドとが、前記標的核酸に会合することによって前記標的核酸を修飾する複合体を形成する、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６６）
前記スペーサー配列が１５～４７ヌクレオチド長、例えば、２０～４０ヌクレオチド長、又は２４～３８ヌクレオチド長である、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６７）
修飾された目的の標的遺伝子座を含む真核細胞であって、前記目的の標的遺伝子座が、項目１～６６のいずれか一項に記載の方法により、又はその組成物の使用によって修飾されている、真核細胞。
（項目６８）
前記目的の標的遺伝子座の前記修飾が、
（ｉ）少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む前記真核細胞；
（ｉｉ）少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む前記真核細胞であって、前記少なくとも１つの遺伝子産物の前記発現が増加するもの；
（ｉｉｉ）少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む前記真核細胞であって、前記少なくとも１つの遺伝子産物の前記発現が減少するもの；又は
（ｉｖ）編集されたゲノムを含む前記真核細胞
を生じさせる、項目６７に記載の真核細胞。
（項目６９）
前記真核細胞が哺乳類細胞を含む、項目６７又は６８に記載の真核細胞。
（項目７０）
前記哺乳類細胞がヒト細胞を含む、項目６９に記載の真核細胞。
（項目７１）
項目６７～６９のいずれか一項に記載の真核細胞の又はそれを含む真核細胞株、又はその子孫。
（項目７２）
項目６７～６９のいずれか一項に記載の細胞を１つ以上含む多細胞生物。
（項目７３）
項目６７～６９のいずれか一項に記載の細胞を１つ以上含む植物又は動物モデル。
（項目７４）
目的の遺伝子によってコードされる修飾された目的の形質を有する植物の作製方法であって、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステムを植物細胞に接触させることであって、それにより前記目的の遺伝子の修飾又は導入のいずれかを行うこと、及び前記植物細胞から植物を再生することを含む方法。
（項目７５）
植物における目的の形質の同定方法であって、前記目的の形質が目的の遺伝子によってコードされ、項目１～３４のいずれか一項に記載のシステムを植物細胞に接触させることを含み、それにより前記目的の遺伝子を同定する、方法。
（項目７６）
前記同定された目的の遺伝子を植物細胞又は植物細胞株又は植物生殖質に導入すること、及びそれから植物を発生させることを更に含み、それによって前記植物が前記目的の遺伝子を含有する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記植物が前記目的の形質を呈する、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
一本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法であって、項目１～３１のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む方法。
（項目７９）
前記病態又は疾患が感染性であり、前記感染性病原体が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）、及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）からなる群から選択される、項目６９に記載の方法。
（項目８０）
標的ＤＮＡの両方の鎖が異なる部位で切断される結果、付着末端型の切断が生じる、項目３８に記載の方法。
（項目８１）
標的ＤＮＡの両方の鎖が同じ部位で切断される結果、平滑末端型の二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる、項目３８に記載の方法。
（項目８２）
前記病態又は疾患が、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、α１－アンチトリプシン欠乏症、ポンペ病、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ失調症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎疾患、高脂血症、高コレステロール血症、レーベル先天黒内障、鎌状赤血球症、及びβサラセミアからなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
これらの図は、様々なタンパク質クラスターの遺伝子座解析の結果を表す一連の概略図並びに核酸及びアミノ酸配列を含む。
図１Ａ～図１Ｂは共に、Ｖ型エフェクター（Ｃａｓ１２タンパク質）の分類ツリーを示す。各枝について、対応するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座の構成を示し、ここでｔｒａｃｒＲＮＡが必要な場合、ＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する白色の長方形で示す。ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）システムはＣａｓ１２ｉとして示す。 図１Ａ～図１Ｂは共に、Ｖ型エフェクター（Ｃａｓ１２タンパク質）の分類ツリーを示す。各枝について、対応するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座の構成を示し、ここでｔｒａｃｒＲＮＡが必要な場合、ＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する白色の長方形で示す。ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）システムはＣａｓ１２ｉとして示す。 図２Ａは、Ｃａｓ１２ｉと称されるＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）エフェクターの機能性ドメインの概略表現である。灰色の塗り潰しの網掛けはＣ末端ＲｕｖＣドメインの位置を指示し、ここでは３個の保存配列モチーフ（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）中の触媒残基が指示され、縮尺どおりに図示される。架橋ヘリックスドメインの位置を上付きの添字ｈで指示する。図２Ｂは、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の相対位置をＲｕｖＣ Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩで表示する。 図３は、Ｖ－Ｉ型ダイレクトリピート配列の各例のＲＮＡ転写物の予測される二次構造を示す一群の概略図である。 図４Ａは、インビボスクリーンエフェクター及び非コードプラスミドの設計の概略表現である。２個のＤＲが隣接する且つＪ２３１１９によって発現されるｐＡＣＹＣ１８４又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子の両鎖から均一にサンプリングした非反復スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイライブラリを設計した。 図４Ｂは、ネガティブ選択スクリーニングワークフローの概略表現である；１）ＣＲＩＳＰＲアレイライブラリをエフェクタープラスミドにクローニングした、２）エフェクタープラスミド、及び存在する場合には非コードプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、続いてｐＡＣＹＣ１８４又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子からのＤＮＡ又はＲＮＡ転写物に対して干渉を付与するＣＲＩＳＰＲアレイのネガティブ選択用に成長させた、３）エフェクタープラスミドの標的化したシーケンシングを用いて枯渇したＣＲＩＳＰＲアレイを同定し、及びスモールＲＮＡシーケンシングを用いて成熟ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを同定した。 図５Ａ～図５Ｂ及び図５Ｃ～図５Ｄは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２について、枯渇した及び枯渇しなかった標的の密度を示すグラフ表現である。ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子の両方を標的化するスペーサーであって強力に枯渇したものを別個のプロットに示す。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。 図５Ａ～図５Ｂ及び図５Ｃ～図５Ｄは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２について、枯渇した及び枯渇しなかった標的の密度を示すグラフ表現である。ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子の両方を標的化するスペーサーであって強力に枯渇したものを別個のプロットに示す。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。 図５Ａ～図５Ｂ及び図５Ｃ～図５Ｄは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２について、枯渇した及び枯渇しなかった標的の密度を示すグラフ表現である。ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子の両方を標的化するスペーサーであって強力に枯渇したものを別個のプロットに示す。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。 図５Ａ～図５Ｂ及び図５Ｃ～図５Ｄは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２について、枯渇した及び枯渇しなかった標的の密度を示すグラフ表現である。ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子の両方を標的化するスペーサーであって強力に枯渇したものを別個のプロットに示す。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。 図６Ａ及び図６Ｂは、ＲｕｖＣ－Ｉ触媒残基アスパラギン酸（Ｃａｓ１２ｉ１については６４７位にあり、Ｃａｓ１２ｉ２については５９９位にある）をアラニンに突然変異させる効果を示す散布図である。各点がスペーサーに相当し、値は、軸に指定される条件下（野生型対突然変異体）での枯渇倍数を示す。高い値ほど枯渇が強力である（即ち生存コロニーが少ない）ことを示す。 図６Ａ及び図６Ｂは、ＲｕｖＣ－Ｉ触媒残基アスパラギン酸（Ｃａｓ１２ｉ１については６４７位にあり、Ｃａｓ１２ｉ２については５９９位にある）をアラニンに突然変異させる効果を示す散布図である。各点がスペーサーに相当し、値は、軸に指定される条件下（野生型対突然変異体）での枯渇倍数を示す。高い値ほど枯渇が強力である（即ち生存コロニーが少ない）ことを示す。 図７Ａ及び図７Ｂは、スクリーニングするＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに非コード配列を加える効果又はそれを取り除く効果を示す散布図である。各点がスペーサーに相当し、値は、軸に指定される条件下（野生型対突然変異体）での枯渇倍数を示す。高い値ほど枯渇が強力である（即ち生存コロニーが少ない）ことを示す。 図７Ａ及び図７Ｂは、スクリーニングするＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに非コード配列を加える効果又はそれを取り除く効果を示す散布図である。各点がスペーサーに相当し、値は、軸に指定される条件下（野生型対突然変異体）での枯渇倍数を示す。高い値ほど枯渇が強力である（即ち生存コロニーが少ない）ことを示す。 図８Ａ及び図８Ｂは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２についてのスクリーニング集計結果のヒートマップである。このヒートマップは、ダイレクトリピートの向き、非コード配列の必要性、並びにインタクトなＲｕｖＣドメイン要件（ここでｄＣａｓ１２ｉはＲｕｖＣ－Ｉドメインの触媒活性残基中の点突然変異を指す）などの従属変量に分解する。Ｙ軸は、ライブラリ標的を、標的化するのがｐＡＣＹＣ１８４か、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＧ）か、又はターゲティング鎖の種別（Ｓ、センス；ＡＳ、アンチセンス）の構成特徴に分解する。Ｃａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２インビボスクリーンは、それぞれＥｎｄｕｒａ Ｓｔｂｌ３及びＥ． ｃｌｏｎｉ（登録商標）コンピテント細胞株で実行した。Ｃａｓ１２ｉ１又はＣａｓ１２ｉ２エフェクターを含まない陰性対照において強力に枯渇したＣＲＩＳＰＲアレイをそれぞれの分析から差し引く。 図８Ａ及び図８Ｂは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２についてのスクリーニング集計結果のヒートマップである。このヒートマップは、ダイレクトリピートの向き、非コード配列の必要性、並びにインタクトなＲｕｖＣドメイン要件（ここでｄＣａｓ１２ｉはＲｕｖＣ－Ｉドメインの触媒活性残基中の点突然変異を指す）などの従属変量に分解する。Ｙ軸は、ライブラリ標的を、標的化するのがｐＡＣＹＣ１８４か、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＧ）か、又はターゲティング鎖の種別（Ｓ、センス；ＡＳ、アンチセンス）の構成特徴に分解する。Ｃａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２インビボスクリーンは、それぞれＥｎｄｕｒａ Ｓｔｂｌ３及びＥ． ｃｌｏｎｉ（登録商標）コンピテント細胞株で実行した。Ｃａｓ１２ｉ１又はＣａｓ１２ｉ２エフェクターを含まない陰性対照において強力に枯渇したＣＲＩＳＰＲアレイをそれぞれの分析から差し引く。 図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２インビボスクリーンからの強力に枯渇したスペーサーについて標的に隣接する配列から同定される５’ＰＡＭモチーフのｗｅｂｌｏｇｏである。 図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２インビボスクリーンからの強力に枯渇したスペーサーについて標的に隣接する配列から同定される５’ＰＡＭモチーフのｗｅｂｌｏｇｏである。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、標的及び隣接ヌクレオチドの可能な全ての順列についてのビットスコアのバイオリンプロットであり、Ｃａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２が各々、スペーサー標的の５’側に２番目及び３番目の位置における単一の２ｎｔ ＰＡＭモチーフに対してのみ優先傾向があることが確認される。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、標的及び隣接ヌクレオチドの可能な全ての順列についてのビットスコアのバイオリンプロットであり、Ｃａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２が各々、スペーサー標的の５’側に２番目及び３番目の位置における単一の２ｎｔ ＰＡＭモチーフに対してのみ優先傾向があることが確認される。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２システムの成熟ｃｒＲＮＡを明らかにする、最小Ｃａｓ１２ｉシステムのインビボスクリーニング試料のスモールＲＮＡシーケンシングのリードマッピングを示す。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２システムの成熟ｃｒＲＮＡを明らかにする、最小Ｃａｓ１２ｉシステムのインビボスクリーニング試料のスモールＲＮＡシーケンシングのリードマッピングを示す。 図１２は、Ｃａｓ１２ｉ１エフェクタータンパク質によるプレｃｒＲＮＡプロセシングを示す変性ゲルである。２４ｎｔリピート及び２８ｎｔスペーサーを含む最小ＣＲＩＳＰＲアレイ（リピート－スペーサー－リピート－スペーサー－リピート）から発現するプレｃｒＲＮＡについてのＣａｓ１２ｉ１によるマグネシウム非依存的プロセシング。プレｃｒＲＮＡをＣａｓ１２ｉ１と共に３７℃で３０分間インキュベートし、１５％ＴＢＥ－尿素ゲル上で分析した。 図１３は、ＩＲ８００色素で標識した標的（左）又は非標的（右）ｓｓＤＮＡについての漸増用量のＣａｓ１２ｉ１二元複合体による操作を示すゲルの表現である。試料は１５％ＴＢＥ－尿素変性ゲル電気泳動によって分析した。 図１４は、標識されていない標的（左）又は非標的（右）ｓｓＤＮＡの存在下でのＩＲ８００色素で標識したコラテラルｓｓＤＮＡ（標的との配列類似性なし）についての漸増用量のＣａｓ１２ｉ１二元複合体による操作を示すゲルの表現である。試料は１５％ＴＢＥ－尿素変性ゲル電気泳動によって分析した。 図１５は、ＩＲ８００色素で標識した標的（左）又は非標的（右）ｄｓＤＮＡについての漸増用量のＣａｓ１２ｉ１二元複合体による操作を示すゲルの表現である。試料は１５％ＴＢＥ－尿素変性ゲル電気泳動によって分析した。 図１６は、ＩＲ８００色素で標識した標的ｄｓＤＮＡについての漸増用量のＣａｓ１２ｉ１二元複合体による及び直接クエンチした（左）又はクエンチ前にＳ１ヌクレアーゼで処理した（右）操作を示すゲルの表現である。試料は４～２０％ＴＢＥ未変性ゲル電気泳動法によって分析した。 図１７Ａ及び図１７Ｂは、ｄｓＤＮＡ標的鎖（スペーサー相補的；「ＳＣ」）対非標的鎖（非スペーサー相補的；「ＮＳＣ」）の非対称な切断効率を示すゲルの表現である。図１７Ａは、ＩＲ８００によって画像化した変性ゲルであり（標識ＤＮＡのみ）、一方、図１７Ｂは、ＳＹＢＲ染色によって画像化した変性ゲルである（全ＤＮＡ）。各ゲルが、５’ＩＲ８００標識ＮＳＣ鎖（左）、又は５’ＩＲ８００標識ＳＣ鎖（右）を含むｄｓＤＮＡに対する漸増濃度のＣａｓ１２ｉ１二元複合体による切断又はニッキング活性を示す。Ｃａｓ１２ｉ１二元複合体は、Ｃａｓ１２ｉ１をプレｃｒＲＮＡと３７℃で１０分間プレインキュベートした後、基質に加えて３７℃で１時間インキュベートすることにより形成した。 図１７Ａ及び図１７Ｂは、ｄｓＤＮＡ標的鎖（スペーサー相補的；「ＳＣ」）対非標的鎖（非スペーサー相補的；「ＮＳＣ」）の非対称な切断効率を示すゲルの表現である。図１７Ａは、ＩＲ８００によって画像化した変性ゲルであり（標識ＤＮＡのみ）、一方、図１７Ｂは、ＳＹＢＲ染色によって画像化した変性ゲルである（全ＤＮＡ）。各ゲルが、５’ＩＲ８００標識ＮＳＣ鎖（左）、又は５’ＩＲ８００標識ＳＣ鎖（右）を含むｄｓＤＮＡに対する漸増濃度のＣａｓ１２ｉ１二元複合体による切断又はニッキング活性を示す。Ｃａｓ１２ｉ１二元複合体は、Ｃａｓ１２ｉ１をプレｃｒＲＮＡと３７℃で１０分間プレインキュベートした後、基質に加えて３７℃で１時間インキュベートすることにより形成した。 図１８Ａは、遺伝子サイレンシングを検出するインビトロアッセイの設計の概略図である。ワンポット反応（外側の境界線によって示される）において、Ｃａｓ１２ｉエフェクター、ＲＮＡガイド、及びシグマ因子２８をコードする線状ＤＮＡ鋳型が、再構成されたＩＶＴＴ（インビトロ転写及び翻訳）試薬及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼコア酵素（ＲＮＡＰｃと表示される）と組み合わされる。ＲＮＡガイドによって標的化されるＧＦＰをコードするＤＮＡプラスミドが含まれ、内部対照としてのＲＦＰを発現する非標的線状ＤＮＡ鋳型も同じく含まれる。ＧＦＰ及びＲＦＰは両方ともにシグマ因子２８プロモーター（ｆｌｉＣ）から発現し、ＧＦＰ及びＲＦＰ蛍光は５分毎に最長１２時間まで測定される。 図１８Ｂは、インビトロ遺伝子サイレンシングアッセイで基質として使用されるＧＦＰコードプラスミドの設計の概略表現である。このプラスミドはｓｉｇ２８プロモーター下でＧＦＰをコードし、エンジニアリングされたＲＮＡガイドが、プロモーター領域及びＧＦＰ遺伝子の両方の鎖を標的化するように設計される（両方の向きの短いブロック矢印によって表示される）。 図１９Ａ及び図１９Ｂは、基質ＧＦＰコード領域の鋳型鎖（図１９Ａ）及びコード鎖（図１９Ｂ）に相補的な配列を含むガイドを含む複合体中の指示されるとおりのＶ－Ｉ型エフェクターによる１２時間（７２０分、ｘ軸）にわたるＧＦＰ蛍光枯渇倍数（ｙ軸）を示すグラフである。ＧＦＰ蛍光枯渇倍数は、ＧＦＰを標的化するＲＮＡガイドを含む複合体中のＶ－Ｉ型エフェクターの規格化ＧＦＰ蛍光と比べた、非標的ＲＮＡガイドを含む複合体中のＶ－Ｉ型エフェクターによる規格化ＧＦＰ蛍光の比として計算する。Ｃａｓ１２ｉ１（実線）は、突然変異型Ｃａｓ１２ｉ１ Ｄ６４７Ａ又はＣａｓ１２ｉ１ Ｅ８９４Ａ又はＣａｓ１２ｉ１ Ｄ９４８Ａの各々の活性と比較してより高い枯渇（遺伝子サイレンシング）を示す。 図１９Ａ及び図１９Ｂは、基質ＧＦＰコード領域の鋳型鎖（図１９Ａ）及びコード鎖（図１９Ｂ）に相補的な配列を含むガイドを含む複合体中の指示されるとおりのＶ－Ｉ型エフェクターによる１２時間（７２０分、ｘ軸）にわたるＧＦＰ蛍光枯渇倍数（ｙ軸）を示すグラフである。ＧＦＰ蛍光枯渇倍数は、ＧＦＰを標的化するＲＮＡガイドを含む複合体中のＶ－Ｉ型エフェクターの規格化ＧＦＰ蛍光と比べた、非標的ＲＮＡガイドを含む複合体中のＶ－Ｉ型エフェクターによる規格化ＧＦＰ蛍光の比として計算する。Ｃａｓ１２ｉ１（実線）は、突然変異型Ｃａｓ１２ｉ１ Ｄ６４７Ａ又はＣａｓ１２ｉ１ Ｅ８９４Ａ又はＣａｓ１２ｉ１ Ｄ９４８Ａの各々の活性と比較してより高い枯渇（遺伝子サイレンシング）を示す。 図２０は、インビトロプール型スクリーニングで使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのインビトロ再構成における種々の形態のタンパク質及び／又はＲＮＡを示す。転写方向はＴ７プロモーター矢印の向きが指し示す。 図２１は、インビトロプール型スクリーニング用のｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質の一実施形態を示す。標的配列には５’側及び３’側の両方で６個の縮重塩基（「Ｎ」）が隣接し、これらは次世代シーケンシング後の下流データ解析用の基準マークとして使用される共通領域に隣り合っている。ｄｓＤＮＡ基質では、３’側基準マークへのプライマーのプレアニーリング後におけるＤＮＡポリメラーゼＩフィルインを用いて第２鎖合成が完了する。 図２２は、再構成されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとのインキュベーション後におけるｓｓＤＮＡ断片の一方向シーケンシングライブラリ調製の概略図を示す。 図２３は、再構成されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとのインキュベーション後におけるｄｓＤＮＡ断片で可能な双方向シーケンシングライブラリ調製の概略図を示す。両方の切断断片にシーケンシングアダプターをライゲートし、次にアダプターに共通で且つｄｓＤＮＡ基質に共通のプライマーの組み合わせを使用して選択することができる。 図２４Ａ～図２４Ｂは、Ａ）Ｉ７／Ｐ７の標的化した増幅及び付加のためのＩ５／Ｐ５ライゲーションアダプター及び３’基準、又はＢ）Ｉ５／Ｐ５の標的化した増幅及び付加のためのＩ７／Ｐ７ライゲーションアダプター及び５’基準を使用した次世代シーケンシングライブラリ調製及びリードアウトによって捕捉された完全長及び切断産物の形態を示す。 図２４Ａ～図２４Ｂは、Ａ）Ｉ７／Ｐ７の標的化した増幅及び付加のためのＩ５／Ｐ５ライゲーションアダプター及び３’基準、又はＢ）Ｉ５／Ｐ５の標的化した増幅及び付加のためのＩ７／Ｐ７ライゲーションアダプター及び５’基準を使用した次世代シーケンシングライブラリ調製及びリードアウトによって捕捉された完全長及び切断産物の形態を示す。 図２５Ａ～図２５Ｂは、それぞれ、Ａ）ｓｓＤＮＡ標的長さマッピング及びＢ）基質長さマッピングについての概略図を示す。 図２５Ａ～図２５Ｂは、それぞれ、Ａ）ｓｓＤＮＡ標的長さマッピング及びＢ）基質長さマッピングについての概略図を示す。 図２６Ａ～図２６Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図２６Ａ～図２６Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図２７Ａ～図２７Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ標的長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図２７Ａ～図２７Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ標的長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図２８Ａ～図２８Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さ（Ｘ）対標的長さ（Ｙ）の分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図２８Ａ～図２８Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さ（Ｘ）対標的長さ（Ｙ）の分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図２９は、ＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間の非標的鎖切断に関連するＣａｓ１２ｉ１についての５’ＴＴＮ ＰＡＭモチーフ（標的配列の左）を示すｗｅｂｌｏｇｏを示す。Ｃａｓ１２ｉ１標的の右側に関してＰＡＭ配列要件は認められない。 図３０は、非標的鎖のＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間に観察される切断及び標的鎖のＰＡＭから相対的に＋１９／＋２０ヌクレオチドの間の切断が示すＣａｓ１２ｉ１による二本鎖ＤＮＡ切断に関連する５ｎｔ ３’オーバーハングを示す。 図３１Ａ～図３１Ｂは、非標的ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３１Ａ～図３１Ｂは、非標的ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３２Ａ～図３２Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するボトム鎖（不活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３２Ａ～図３２Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するボトム鎖（不活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３３Ａ～図３３Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３３Ａ～図３３Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３４Ａ～図３４Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ標的長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３４Ａ～図３４Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ標的長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３５Ａ～図３５Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さ（Ｘ）対標的長さ（Ｙ）の分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３５Ａ～図３５Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖（活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さ（Ｘ）対標的長さ（Ｙ）の分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３６は、ＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間の非標的鎖切断に関連するＣａｓ１２ｉ２についての５’ＴＴＮ ＰＡＭモチーフ（標的配列の左）を示すｗｅｂｌｏｇｏを示す。Ｃａｓ１２ｉ２標的の右側に関してＰＡＭ配列要件は認められない。 図３７は、非標的鎖のＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間に観察される切断及び標的鎖のＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間の切断が示すＣａｓ１２ｉ２による二本鎖ＤＮＡ切断に関連する平滑末端型切断を示す。 図３８Ａ～図３８Ｂは、非標的ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３８Ａ～図３８Ｂは、非標的ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３９Ａ～図３９Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するボトム鎖（不活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図３９Ａ～図３９Ｂは、ｄｓＤＮＡを標的化するボトム鎖（不活性な向き）ｃｒＲＮＡ（赤色）対ａｐｏ（エフェクターのみ）対照（青色）を含む複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２についてのｄｓＤＮＡ基質長さの分布を示す。（Ａ）完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。（Ｂ）基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーでリードアウト用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。 図４０は、本明細書に記載されるとおりのＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムの哺乳類検証に使用されるコンストラクトの概略図である。エフェクターは哺乳類コドン最適化され、タンパク質のＣ末端にヌクレオプラスミン核局在化配列（ｎｐＮＬＳ）が付加される。プラスミドからの哺乳類発現には、ＥＦ１αショートプロモーター（ＥＦＳ）及びｂＧＨ由来のポリＡ配列（ｂＧＨｐＡ）を使用する。ＲＮＡガイドは線状ｄｓＤＮＡ断片から発現し、これはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｕ６）によってドライブされる。この概略図には異なる実施態様が記載され、ＲＮＡガイドは、図示される構成にある、単一の標的を担持するプレｃｒＲＮＡ、成熟ｃｒＲＮＡ、又は複数の標的とマルチプレックス化したもののいずれかとして発現する。 図４１Ａは、図４０に記載されるエフェクター及びＲＮＡガイドコンストラクトの一過性トランスフェクション後７２時間における２９３Ｔ細胞株のＶＥＧＦＡ遺伝子座に標的化されるＣａｓ１２ｉ２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターによって誘導されたインデル活性を示す棒グラフである。種々のＲＮＡガイド設計をアッセイしており、これらは様々な程度の有効性を呈する。エラーバーは３レプリケートでのＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。 図４１Ｂは、次世代シーケンシングからの代表的なインデルの表現である。ＴＴＣ ＰＡＭ配列に表示を付し、代表的なインデルはＰＡＭの下流２０ｂｐ以上に起こっている。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ防御システムの幅広い天然の多様性には、プログラム可能なバイオテクノロジーに生かすことのできる様々な活性機構及び機能要素が含まれている。天然のシステムでは、これらの機構及びパラメータが外来ＤＮＡ及びウイルスに対する効率的な防御を実現する一方で、自己と非自己の判別を提供して自己標的化を回避している。エンジニアリングされたシステムでは、同じ機構及びパラメータがまた、分子技術の多様なツールボックスを提供し、ターゲティング空間の境界を画定する。例えば、システムＣａ９及びＣａ１３ａはカノニカルなＤＮＡ及びＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有し、そのターゲティング空間は、それぞれ、標的となるＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）及び標的となるＲＮＡ上のプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）によって画定される。
本明細書に記載される方法を用いて、シングルサブユニットのクラス２エフェクターシステム内に、ＲＮＡによるプログラムが可能な核酸操作の能力を拡張することのできる更なる機構及びパラメータが発見された。
一態様において、本開示は、天然に存在するゲノム配列内の特定の他の特徴との強力な共出現パターンを呈する新規タンパク質ファミリーを探索及び同定するための計算的方法及びアルゴリズムの使用に関する。特定の実施形態において、これらの計算的方法は、ＣＲＩＳＰＲアレイにごく近接して共出現するタンパク質ファミリーを同定することに関する。しかしながら、本明細書に開示される方法は、非コード及びタンパク質コードの両方の（例えば、細菌遺伝子座の非コード範囲にあるファージ配列の断片；又はＣＲＩＳＰＲ
Ｃａｓ１タンパク質）、他の特徴にごく近接した範囲内に天然に出現するタンパク質の同定において有用である。本明細書に記載される方法及び計算は１つ以上の計算装置で実施されてもよいことが理解される。
一部の実施形態において、ゲノム又はメタゲノムデータベースから一組のゲノム配列が入手される。データベースは、ショートリード、又はコンティグレベルデータ、又はアセンブルされたスキャフォールド、又は生物の完全ゲノム配列を含む。同様に、データベースは、原核生物、若しくは真核生物からのゲノム配列データを含んでもよく、又はメタゲノム環境試料からのデータを含んでもよい。データベースリポジトリの例としては、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＲｅｆＳｅｑ、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ、ＮＣＢＩの全ゲノムショットガン（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｏｔｇｕｎ：ＷＧＳ）、及びジョイントゲノム研究所（Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＪＧＩ）の統合微生物ゲノム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ：ＩＭＧ）が挙げられる。
一部の実施形態において、指定される最小長さのゲノム配列データの選択には、最小サイズ要件が課される。特定の例示的実施形態において、最小コンティグ長さは、１００ヌクレオチド、５００ｎｔ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、４０ｋｂ、又は５０ｋｂであってもよい。
一部の実施形態において、公知の又は予測されるタンパク質は、完全な又は選択された一組のゲノム配列データから抽出される。一部の実施形態において、公知の又は予測されるタンパク質は、ソースデータベースによって提供されるコード配列（ＣＤＳ）アノテーションを抽出することから取られる。一部の実施形態において、予測タンパク質は、計算的方法を適用してヌクレオチド配列からタンパク質を同定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＭａｒｋスイートを使用してゲノム配列からタンパク質が予測される。一部の実施形態では、Ｐｒｏｄｉｇａｌを使用してゲノム配列からタンパク質が予測される。一部の実施形態では、同じ一組の配列データに対して複数のタンパク質予測アルゴリズムが用いられ、得られる一組のタンパク質から重複が排除されてもよい。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイはゲノム配列データから同定される。一部の実施形態では、ＰＩＬＥＲ－ＣＲを使用してＣＲＩＳＰＲアレイが同定される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ認識ツール（ＣＲＩＳＰＲ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ：ＣＲＴ）を使用してＣＲＩＳＰＲアレイが同定される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、最小限の回数（例えば２、３、又は４回）繰り返されるヌクレオチドモチーフを同定する発見的手法によって同定され、ここで繰り返されるモチーフの連続する出現間の間隔は、指定される長さ（例えば、５０、１００、又は１５０ヌクレオチド）を超えない。一部の実施形態では、同じ一組の配列データに対して複数のＣＲＩＳＰＲアレイ同定ツールが用いられ、得られる一組のＣＲＩＳＰＲアレイから重複が排除されてもよい。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイにごく近接しているタンパク質が同定される。一部の実施形態において、近接性はヌクレオチド距離として定義され、２０ｋｂ、１５ｋｂ、又は５ｋｂ以内であってもよい。一部の実施形態において、近接性は、タンパク質とＣＲＩＳＰＲアレイとの間にあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の数として定義され、特定の例示的距離は、１０、５、４、３、２、１、又は０個のＯＲＦであり得る。ＣＲＩＳＰＲアレイとごく近接した範囲内にあると同定されたタンパク質は、次に相同タンパク質クラスターにまとめられる。一部の実施形態では、ｂｌａｓｔｃｌｕｓｔを使用してタンパク質クラスターが形成される。特定の他の実施形態では、ｍｍｓｅｑｓ２を使用してタンパク質クラスターが形成される。
タンパク質クラスターのメンバー間にＣＲＩＳＰＲアレイとの強力な共出現パターンを確立するため、予め編成された完全な一組の公知の及び予測されるタンパク質に対してタンパク質ファミリーの各メンバーのＢＬＡＳＴ検索が実施されてもよい。一部の実施形態では、ＵＢＬＡＳＴ又はｍｍｓｅｑｓ２を使用して類似のタンパク質が検索されてもよい。一部の実施形態では、ファミリー内のタンパク質の代表的なサブセットについてのみ検索が実施されてもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイとごく近接した範囲内にあるタンパク質のクラスターがメトリックによって順位付けされるか又はフィルタリングされることにより共出現が決定される。１つの例示的メトリックは、特定のＥ値閾値に至るまでのＢＬＡＳＴマッチの数に対するタンパク質クラスター内の要素の数の比である。一部の実施形態では、一定のＥ値閾値が使用されてもよい。他の実施形態では、Ｅ値閾値は、タンパク質クラスターの最も離れたメンバーによって決定されてもよい。一部の実施形態において、大域的な一組のタンパク質がクラスター化され、共出現メトリックは、含まれる１つ又は複数の大域的クラスターの要素の数に対するＣＲＩＳＰＲ関連クラスターの要素の数の比である。
一部の実施形態において、手動でのレビュープロセスを用いることにより、クラスター中のタンパク質の天然に存在する遺伝子座構造に基づいてエンジニアリングされるシステムの潜在的機能性及び最小限の一組の成分が評価される。一部の実施形態において、手動でのレビューにはタンパク質クラスターの図解表現が役立ち得るとともに、これは、ペアワイズでの配列類似性、系統樹、供給源生物／環境、予測される機能性ドメイン、及び遺伝子座構造の図解描写を含む情報を含み得る。一部の実施形態において、遺伝子座構造の図解描写は、高い代表性を有する近隣タンパク質ファミリーをフィルタリングし得る。一部の実施形態において、代表性は、含んでいる１つ又は複数の大域的クラスターの１つ又は複数のサイズに対する関連する近隣タンパク質の数の比によって計算されてもよい。特定の例示的実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、天然に存在する遺伝子座のＣＲＩＳＰＲアレイ構造の描写を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、推定ＣＲＩＳＰＲアレイの長さに対する保存されたダイレクトリピートの数、又は推定ＣＲＩＳＰＲアレイの長さに対するユニークなスペーサー配列の数の描写を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、ＣＲＩＳＰＲアレイとの推定エフェクターの様々な共出現メトリックの描写を含み、新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを予測し、及びその成分を同定し得る。
プール型スクリーニング
エンジニアリングされた新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性を効率的に検証し、同時に種々の活性機構及び機能パラメータを偏りのない方法で評価するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において新規プール型スクリーニング手法を用いる。第一に、新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの保存タンパク質及び非コードエレメントの計算的同定から、ＤＮＡ合成及び分子クローニングを用いて個別の成分を単一の人工発現ベクター（一実施形態ではｐＥＴ－２８ａ＋骨格をベースとする）にアセンブルする。第２の実施形態では、エフェクター及び非コードエレメントを単一のｍＲＮＡ転写物に転写し、異なるリボソーム結合部位を用いて個々のエフェクターを翻訳する。
第二に、天然のｃｒＲＮＡ及びターゲティングスペーサーを、第２のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を標的化する非天然スペーサーを含むプロセシングされていないｃｒＲＮＡのライブラリに置き換える。このｃｒＲＮＡライブラリをタンパク質エフェクター及び非コードエレメントを含むベクター骨格（例えばｐＥＴ－２８ａ＋）にクローニングし、その後、続いてこのライブラリをｐＡＣＹＣ１８４プラスミド標的と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。結果的に、得られる各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ただ１つのターゲティングスペーサーを含む。代替的実施形態では、非天然スペーサーを含むプロセシングされていないｃｒＲＮＡのライブラリが、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８；及びＧｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（１９）：５６７３－８４（これらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどの資料から引用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子を更に標的化する。この実施形態において、必須遺伝子機能を破壊する新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの正の標的化された活性は、細胞死又は成長停止を生じさせる。一部の実施形態において、必須遺伝子ターゲティングスペーサーをｐＡＣＹＣ１８４標的と組み合わせて、アッセイに別の次元を加えることができる。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する非コード配列、推定エフェクター又はアクセサリーオープンリーディングフレーム、及びｔｒａｃｒＲＮＡエレメントの指標となる予測されるアンチリピートを共にコンカテマー化し、ｐＡＣＹＣ１８４にクローニングして、ｌａｃ及びＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターによって発現させた。
第三に、抗生物質選択下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させる。一実施形態において、三重抗生物質選択：エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターシステムを含むｐＥＴ－２８ａ＋ベクターの形質転換の成功を確認するためのカナマイシン、並びにｐＡＣＹＣ１８４標的ベクターの同時形質転換の成功を確認するためのクロラムフェニコール及びテトラサイクリンが用いられる。ｐＡＣＹＣ１８４は通常、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンに対する耐性を付与するため、抗生物質選択下では、このプラスミドを標的化する新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの正の活性により、エフェクター、非コードエレメント、及びｃｒＲＮＡライブラリの特異的活性エレメントを活性に発現する細胞が排除されることになる。早い時点と比較した後の時点における生存細胞集団を調べると、典型的には不活性ｃｒＲＮＡと比較してシグナルの枯渇がもたらされる。一部の実施形態において、二重抗生物質選択が用いられる。例えば、クロラムフェニコール又はテトラサイクリンのいずれかを抜き取って選択圧を除去すると、ターゲティング基質、配列特異性、及び効力に関する新規情報を得ることができる。一部の実施形態では、カナマイシンのみを使用して、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターシステムを含むｐＥＴ－２８ａ＋ベクターの形質転換の成功が確認される。この実施形態は、成長の変化を観察するためにカナマイシン以外の更なる選択が必要ないため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子を標的化するスペーサーを含むライブラリに好適である。この実施形態では、クロラムフェニコール及びテトラサイクリン依存性が取り除かれ、ライブラリ中のそれらの標的（存在する場合）が、ターゲティング基質、配列特異性、及び効力に関するネガティブ又はポジティブの更なる情報源を提供する。
ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性に影響を及ぼし得る多様な一組の特徴及び配列を含むため、プール型スクリーンからの活性ｃｒＲＮＡをｐＡＣＹＣ１８４にマッピングすることにより、種々の活性機構及び機能パラメータを示唆するものであり得る活性パターンが仮説にとらわれず幅広く提供される。このようにして、異種原核生物種における新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの再構成に必要な特徴をより包括的に試験し、研究することができる。
本明細書に記載されるインビボプール型スクリーンの特定の重要な利点としては、以下が挙げられる：
（１）汎用性－プラスミド設計により、複数のエフェクター及び／又は非コードエレメントを発現させることが可能になる；ライブラリクローニング戦略により、計算的に予測されたｃｒＲＮＡの両方の転写方向の発現が実現する；
（２）活性機構及び機能パラメータの包括的試験を用いることにより、ＤＮＡ又はＲＮＡ切断を含めた多様な干渉機構を評価し；転写、プラスミドＤＮＡ複製などの特徴の共出現；及びｃｒＲＮＡライブラリについてのフランキング配列を調べて、４Ｎの複雑さ等価のＰＡＭを確実に決定することができる；
（３）感度－ｐＡＣＹＣ１８４は低コピープラスミドであり、僅かな干渉率であっても、プラスミドによってコードされる抗生物質耐性を除去することができるため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ活性について高感度を実現する；及び
（４）効率－プール型スクリーニングは、ＲＮＡシーケンシングについてより高い速度及びスループットを実現する最適化された分子生物学ステップを含み、タンパク質発現試料をスクリーンにおける生存細胞から直接採取することができる。
以下の実施例で更に詳細に考察するとおり、このインビボプール型スクリーンを用いてその作動可能なエレメント、機構及びパラメータ、並びにその天然細胞環境の外部でエンジニアリングされたシステムにおいて活性であり再プログラム化されるその能力を評価することにより、本明細書に記載される新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリーを評価した。
インビトロプール型スクリーニング
インビトロプール型スクリーニング手法もまた用いることができ、これはインビボプール型スクリーンを補完する。インビトロプール型スクリーンは、迅速な生化学的特徴付け及びＣＲＩＳＰＲシステムからシステムの活性に必要な必須成分への縮約を実現する。一実施形態では、無細胞インビトロ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）システムを用いることにより、ＣＲＩＳＰＲシステムの非コード及びエフェクタータンパク質をコードするＤＮＡからＲＮＡ及びタンパク質が直接合成され、従ってＦＰＬＣ精製したタンパク質に頼る従来の生化学アッセイと比べてより多数の異なる別個のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターシステムを評価するための、より高速でより高いスループットの方法が実現する。より高いスループット及び効率の生化学反応を実現することに加えて、インビトロスクリーニングには、上記に記載されるインビボプール型スクリーニング手法を補完するものとなる幾つかの利点がある。
（１）エンリッチメント及び枯渇の両方のシグナルの直接的な観察－インビトロプール型スクリーニングは、切断産物を直接捕捉してシーケンシングすることにより活性エフェクターシステムについての特異的切断部位、切断パターン、及び配列モチーフを同定することができる切断エンリッチメント、並びに切断されていない集団中における特異的標的の枯渇からの負のシグナルが活性の代理として用いられる標的枯渇の両方のリードアウトを実現する。インビボプール型スクリーンは標的枯渇リードアウトを利用するため、エンリッチメントモードがエフェクター活性に関する更なる洞察を提供する。
（２）反応成分及び環境のより高い制御－専売ＩＶＴＴの十分に定義付けられた成分及び活性が、インビボスクリーンの複雑な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞環境と比較したとき、反応成分の正確な制御により、更なる活性翻訳に必要な最小成分の同定を実現する。加えて、活性が亢進し、又はリードアウトが容易となるように、反応成分に非天然修飾が行われてもよい；例えば、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質にホスホロチオエート化結合を加えると、エキソヌクレアーゼによる基質分解が制限されることによりノイズが低下する。
（３）毒性／成長阻害タンパク質に対するロバスト性－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞成長にとって毒性であり得るタンパク質について、インビトロプール型スクリーンは、生細胞を成長抑制に曝すことなく機能スクリーニングを実現する。これは最終的には、タンパク質選択及びスクリーニングにおけるより高い汎用性を実現する。
インビボ及びインビトロプール型スクリーンの組み合わせを用いてその作動可能なエレメント、機構及びパラメータ、並びにその天然細胞環境の外部でエンジニアリングされたシステムにおいて活性であり再プログラム化されるその能力を評価することにより、本明細書に記載される新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリーを評価した。
ＲｕｖＣドメインを有するクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター
一態様において、本開示は、本明細書においてＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと称されるクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供する。このクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣドメインを有する単離されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と、ＲＮＡガイド、ガイドＲＮＡ、又はｇＲＮＡとも称される、ＤＮＡ配列などの標的核酸配列に相補的なスペーサー配列を含む単離されたｃｒＲＮＡとを含む。
好適には、ＲｕｖＣドメインを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＲｕｖＣ ＩＩＩモチーフ、Ｘ１ＳＨＸ４ＤＸ６Ｘ７（配列番号２００）（式中、Ｘ１はＳ又はＴであり、Ｘ４はＱ又はＬであり、Ｘ６はＰ又はＳであり、及びＸ７はＦ又はＬである）；ＲｕｖＣ Ｉモチーフ、Ｘ１ＸＤＸＮＸ６Ｘ７ＸＸＸＸ１１（配列番号２０１）（式中、Ｘ１はＡ又はＧ又はＳであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ６はＱ又はＩであり、Ｘ７はＴ又はＳ又はＶであり、及びＸ１１はＴ又はＡである）；及びＲｕｖＣ ＩＩモチーフ、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｅ（配列番号２１０）（式中、Ｘ１はＣ又はＦ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＶ又はＷ又はＹであり、Ｘ２はＣ又はＦ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＲ又はＶ又はＷ又はＹであり、及びＸ３はＣ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＶ又はＷ又はＹである）の一組からの１つ又はモチーフを含み得る。
好適には、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣドメインを有するＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターとＶ－Ｉ型ｃｒＲＮＡとを含む。好適には、Ｃａｓ１２ｉエフェクターは約１１００アミノ酸長以下であり、標的ＤＮＡ中のＰＡＭを認識する機能性ＰＡＭ相互作用ドメインを含む。Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドに結合してＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを形成する能力を有し、ここでＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、５ヌクレオチドステム及び６、７、又は８ヌクレオチドのループのステム－ループ構造を含む。Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡが存在しなくても配列特異的ＤＮＡを標的化してそれに結合する能力を有する。
一部の実施形態において、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、他の成分を含み得る二元複合体を形成する。二元複合体は、ＲＮＡガイド中のスペーサー配列に相補的な核酸基質（即ち、配列特異的基質又は標的核酸）への結合時に活性化される。一部の実施形態において、配列特異的基質は二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、配列特異的基質は一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、配列特異性は、ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）中のスペーサー配列と標的基質の完全な一致を必要とする。他の実施形態において、配列特異性は、ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）中のスペーサー配列と標的基質の部分的な（連続的又は非連続的な）一致を必要とする。配列特異性は、特定の実施形態において、スペーサー配列に近接するプロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）配列と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質によって認識されるカノニカルなＰＡＭ配列との間の完全な一致を更に必要とする。一部の例では、完全なＰＡＭ配列一致は必要でなく、二元複合体とＤＮＡ基質との配列特異的会合には部分的一致で十分である。
一部の実施形態において、標的核酸基質は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である。一部の実施形態において、標的核酸基質はｄｓＤＮＡであり、ＰＡＭを含む。一部の実施形態において、二元複合体は標的配列特異的ｄｓＤＮＡ基質をそれへの結合時に修飾する。一部の実施形態において、二元複合体は標的ｄｓＤＮＡ基質の非標的鎖を優先的にニッキングする。一部の実施形態において、二元複合体は標的ｄｓＤＮＡ基質の両方の鎖を切断する。一部の実施形態において、二元複合体は標的ｄｓＤＮＡ基質の両方の鎖を付着末端切断で切断する。一部の実施形態において、二元複合体は標的ｄｓＤＮＡ基質に平滑末端二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。
一部の実施形態において、標的核酸基質は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。一部の実施形態において、標的核酸基質はｓｓＤＮＡであり、ＰＡＭを含まない。一部の実施形態において、二元複合体は標的配列特異的ｓｓＤＮＡ基質をそれへの結合時に修飾する。一部の実施形態において、二元複合体は標的ｓｓＤＮＡ基質を切断する。
一部の実施形態において、二元複合体は標的基質への結合時に活性化した状態になる。一部の実施形態において、活性化した複合体は、「複数回の代謝回転」活性を呈し、従って標的基質への作用時（例えば、それの切断時）、活性化した複合体は活性化した状態のままである。一部の実施形態において、二元複合体は「単回の代謝回転」活性を呈し、従って標的基質への作用時、二元複合体は不活性状態に戻る。一部の実施形態において、活性化した複合体は非特異的な（即ち、「コラテラル」）切断活性を呈し、従って活性化した複合体は、標的と配列類似性のない核酸を切断する。一部の実施形態において、コラテラル核酸基質はｓｓＤＮＡである。
ＣＲＩＳＰＲ酵素修飾
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ酵素
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合、減少したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較したとき少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ不活性化となるようにＣＲＩＳＰＲ酵素を修飾することができる。ヌクレアーゼ活性は、幾つかの方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ又はＰＡＭ相互作用ドメインへの突然変異の導入によって減少させることができる。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ活性の触媒残基が同定され、それらのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基（例えば、グリシン又はアラニン）に置換することによりヌクレアーゼ活性を減少させてもよい。Ｃａｓ１２ｉ１についてかかる突然変異の例としては、Ｄ６４７Ａ又はＥ８９４Ａ又はＤ９４８Ａが挙げられる。Ｃａｓ１２ｉ２についてかかる突然変異の例としては、Ｄ５９９Ａ又はＥ８３３Ａ又はＤ８８６Ａが挙げられる。
不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の機能性ドメインを含むか（例えば、融合タンパク質、リンカーペプチド、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（ＧＳ）ペプチドリンカー等を介して）、又はそれと関連付けられる（例えば、複数のタンパク質の共発現を通じて）ことができる。こうした機能性ドメインは様々な活性、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、及びスイッチ活性（例えば、光誘導性）を有することができる。一部の実施形態において、機能性ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＶＰ６４、ＶＰ１６、Ｆｏｋ１、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１、及びビオチン－ＡＰＥＸである。
不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素上に１つ以上の機能性ドメインを位置させることにより、その機能性ドメインが帰属する機能的効果による影響を標的に及ぼすのに正しい空間上の向きとなることが可能になる。例えば、機能性ドメインが転写活性化因子（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、又はｐ６５）である場合、その転写活性化因子は、それが標的の転写に影響を及ぼすことが可能になる空間上の向きに置かれる。同様に、転写リプレッサーが標的の転写に影響を及ぼすように位置し、及びヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）が標的を切断又は部分的に切断するように位置する。一部の実施形態において、機能性ドメインはＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端に位置する。一部の実施形態において、機能性ドメインはＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ末端に位置する。一部の実施形態において、不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｎ末端に第１の機能性ドメイン及びＣ末端に第２の機能性ドメインを含むように修飾される。
スプリット酵素
本開示はまた、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素のスプリットバージョンも提供する。スプリットバージョンのＣＲＩＳＰＲ酵素は送達に有利であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は酵素の２つの部分に分割され、それらが一緒になって実質的に機能性のＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
分割は、１つ又は複数の触媒ドメインが影響を受けないような方法で行われ得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素はヌクレアーゼとして機能してもよく、又は本質的に（例えば、その触媒ドメインにある１つ又は複数の突然変異に起因して）触媒活性がごく僅かしかない又は全くないＲＮＡ結合タンパク質である不活性化された酵素であってもよい。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼローブ及びα－ヘリックスローブが別個のポリペプチドとして発現する。これらのローブはそれ自体には相互作用を及ぼさないが、ＲＮＡガイドがそれらを複合体へと動員し、その複合体が完全長ＣＲＩＳＰＲ酵素の活性を再現し、部位特異的ＤＮＡ切断を触媒する。修飾されたＲＮＡガイドを使用すると、二量化が妨げられることによりスプリット酵素活性が無効になり、誘導性の二量化システムの開発が可能となる。スプリット酵素については、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１２．１０（２０１５）：２９８４－２９８９（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、スプリット酵素は、例えばラパマイシン感受性二量化ドメインを利用することにより、二量化パートナーに融合されてもよい。これにより、ＣＲＩＳＰＲ酵素活性を時間的に制御するための化学誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素の作成が可能になる。このようにして２つの断片に分割されていることによりＣＲＩＳＰＲ酵素を化学誘導性にすることができ、ＣＲＩＳＰＲ酵素の制御された再アセンブルにはラパマイシン感受性二量化ドメインを使用することができる。
分割点は、典型的にはインシリコで設計され、コンストラクトにクローニングされる。この過程でスプリット酵素に突然変異が導入されてもよく、非機能性ドメインが除去されてもよい。一部の実施形態において、スプリットＣＲＩＳＰＲ酵素の２つの部分又は断片（即ち、Ｎ末端及びＣ末端断片）は、例えば野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素の配列の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％を含む完全なＣＲＩＳＰＲ酵素を形成することができる。
自己活性化型又は不活性化型酵素
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、自己活性化型又は自己不活性化型であるように設計されてもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は自己不活性化型である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするコンストラクトに標的配列を導入することができる。従ってＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を切断するとともに、それによって酵素をコードするコンストラクトがその発現を自己不活性化し得る。自己不活性化ＣＲＩＳＰＲシステムの構築方法については、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｅ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｖ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（２０１６）：Ｓ５０（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の他の実施形態では、弱いプロモーター（例えば、７ＳＫプロモーター）の制御下で発現する更なるＲＮＡガイドが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を標的化して、その発現を（例えば、核酸の転写及び／又は翻訳を妨げることにより）妨げ及び／又は阻止することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素と、ＲＮＡガイドと、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を標的化するＲＮＡガイドとを発現するベクターを細胞にトランスフェクトすると、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸の効率的な破壊につながり、ＣＲＩＳＰＲ酵素レベルを低下させることができ、従ってゲノム編集活性を制限することができる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素のゲノム編集活性は、哺乳類細胞における内因性ＲＮＡシグネチャ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を通じて調節することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡの５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ相補配列を用いることにより、ＣＲＩＳＰＲ酵素スイッチを作ることができる。このスイッチは、標的細胞中のｍｉＲＮＡに選択的且つ効率的に応答する。従って、このスイッチは、異種細胞集団内で内因性ｍｉＲＮＡ活性を感知することによりゲノム編集を差次的に制御し得る。従って、このスイッチシステムは、細胞内ｍｉＲＮＡ情報に基づく細胞型選択的なゲノム編集及び細胞エンジニアリングのフレームワークを提供し得る（Ｈｉｒｏｓａｗａ，Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．“Ｃｅｌｌ－ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｗｉｔｃｈ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１７ Ｊｕｌ ２７；４５（１３）：ｅ１１８）。
誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導性、例えば、光誘導性又は化学誘導性であってもよい。この機構により、ＣＲＩＳＰＲ酵素中の機能性ドメインを公知のトリガーによって活性化させることが可能になる。光誘導能は、当該技術分野において公知の様々な方法により、例えば、スプリットＣＲＩＳＰＲ酵素においてＣＲＹ２ＰＨＲ／ＣＩＢＮ対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．“Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，５００．７４６３（２０１３）：４７２を参照のこと）。化学誘導能は、例えば、スプリットＣＲＩＳＰＲ酵素においてＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る。ラパマイシンは融合複合体の形成に必要であり、従ってＣＲＩＳＰＲ酵素を活性化する（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｖｏｌｚ，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，“Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３．２（２０１５）：１３９－１４２を参照のこと）。
更に、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現は、誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御下での転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導性遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導性遺伝子発現システムによって調節することができる。ＲＮＡとして送達される場合、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の発現は、小分子様テトラサイクリンを感知することのできるリボスイッチによって調節されてもよい（例えば、Ｇｏｌｄｆｌｅｓｓ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４０．９（２０１２）：ｅ６４－ｅ６４を参照のこと）。
誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素及び誘導性ＣＲＩＳＰＲシステムの様々な実施形態が、例えば、米国特許第８８７１４４５号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号明細書、及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
機能性突然変異
本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素に様々な突然変異又は修飾を導入して特異性及び／又はロバスト性を改善することができる。一部の実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するアミノ酸残基が同定される。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、例えば、ＰＡＭを認識するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、異なるＰＡＭを認識するように更に修飾されてもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、例えば本明細書に記載されるとおりの、別のＰＡＭを認識することができる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、このタンパク質のＮ末端又はＣ末端に取り付けられた少なくとも１個の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の）核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３００）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３０１）のヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３０２）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３０３）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３０４）を有するｈＲＮＰＡ１Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－αからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３０５）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３０６）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３０７）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３０８）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３０９）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３１０）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３１１）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３１２）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３１３）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３１４）；及びヒトグルココルチコイド受容体の配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３１５）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に取り付けられた少なくとも１個の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の）核外移行シグナル（ＮＥＳ）を含む。好ましい実施形態において、Ｃ末端及び／又はＮ末端ＮＬＳ又はＮＥＳは、真核細胞、例えばヒト細胞における最適な発現及び核ターゲティングのために取り付けられる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、１つ以上の機能活性が改変される。例えば、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、そのヘリカーゼ活性が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、そのヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はエキソヌクレアーゼ活性）が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ＲＮＡガイドと機能的に関連するその能力が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、標的核酸と機能的に関連するその能力が改変される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は標的核酸分子の切断能を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的核酸分子の両方の鎖を切断する。しかしながら、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、その切断活性が改変される。例えば、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、この酵素が標的核酸の切断能を有しないものとなる１つ以上の突然変異を含んでもよい。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、この酵素が標的核酸の一本鎖の切断能（即ち、ニッカーゼ活性）を有するものとなる１つ以上の突然変異を含んでもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡガイドがハイブリダイズする鎖に相補的な標的核酸の鎖を切断する能力を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡガイドがハイブリダイズする標的核酸の鎖を切断する能力を有する。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の所望の機能活性（例えば、ヌクレアーゼ活性及び機能的にＲＮＡガイドと相互作用する能力）を保持しつつ酵素のサイズを縮小させるため、１つ以上のアミノ酸残基に欠失を含むようにエンジニアリングされてもよい。このトランケート型ＣＲＩＳＰＲ酵素は有利には、負荷に制限のある送達システムとの組み合わせで用いられてもよい。
一態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を提供する。別の態様において、本開示はまた、本明細書に記載されるアミノ酸配列と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列も提供する。
一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載される配列と同じである一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続又は非連続ヌクレオチド）を少なくとも有する。一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載される配列と異なる一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続又は非連続ヌクレオチド）を少なくとも有する。
一部の実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列と同じである一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続又は非連続アミノ酸残基）を少なくとも有する。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列と異なる一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続又は非連続アミノ酸残基）を少なくとも有する。
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、それらの配列が最適な比較を目的としてアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントとなるように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入されてもよく、及び比較を目的として非相同配列が無視されてもよい）。一般に、比較を目的としてアラインメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％でなければならず、及び一部の実施形態では、参照配列の長さの少なくとも９０％、９５％、又は１００％である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されているとき、次にはそれらの分子は当該の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。本開示の目的上、配列の比較及び２つの配列間におけるパーセント同一性の決定は、ギャップペナルティーを１２、ギャップ伸長ペナルティーを４、及びフレームシフトギャップペナルティーを５としたＢｌｏｓｕｍ ６２スコアリング行列を用いて達成することができる。
本明細書に記載される生化学及び診断適用以外にも、本明細書に記載されるプログラム可能なＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムには、ゲノムの治療用修飾など、真核細胞における重要な適用があり、修飾の例としては、限定はされないが、遺伝子型修正、遺伝子ノックアウト、遺伝子配列挿入／欠失（相同組換え修復又は他の方法による）、単一ヌクレオチド修飾、又は遺伝子調節が挙げられる。これらの遺伝子修飾モダリティは、Ｃａｓ１２ｉのヌクレアーゼ活性、ダブルニッキング、又は更なるエフェクタードメインに融合した触媒的に不活性なＣａｓ１２ｉのプログラム可能なＤＮＡ結合を用いることができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びアクセサリータンパク質は、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、又はｍｙｃタグを含めた１つ以上のペプチドタグに融合することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質）など、検出可能部分に融合することができる。及び一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質は、このタンパク質を組織、細胞、又は細胞の領域に侵入又は局在化させるペプチド又は非ペプチド部分に融合される。例えば、本開示のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質（Ｃａｓ１２ｉなど）は、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）ＮＬＳ、ｃ－Ｍｙｃ ＮＬＳ、又は他の好適な単節型ＮＬＳなどの核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に融合されてもよく、且つ単独で融合されても（即ち、単一のＮＬＳ）、又はコンカテマー化されてもよい（例えば、２、３、４個等のＮＬＳの鎖）。
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質にタグが融合される実施形態において、かかるタグは、例えば、液体クロマトグラフィー又は固定化したアフィニティー若しくはイオン交換試薬を利用するビーズ分離による、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の親和性ベース又は電荷ベースの精製を促進し得る。非限定的な例として、本開示の組換えＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ１２ｉなど）はポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを含み、精製のため、固定化された金属イオンを含むクロマトグラフィーカラムにロードされる（例えば、樹脂上に固定化されたキレートリガンドによってキレートされたＺｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋イオン、この樹脂は、個々に調製された樹脂又は市販の樹脂若しくはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって商品化されているＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムなどの既製のカラムであってもよい）。ローディングステップの後、カラムは任意選択で、例えば１つ以上の好適な緩衝溶液を使用してリンスされ、次にＨｉｓタグが付加されたタンパク質が好適な溶出緩衝液を使用して溶出される。それに代えて又は加えて、本開示の組換えＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質がＦＬＡＧタグを利用する場合、かかるタンパク質は、本業界で公知の免疫沈降法を用いて精製されてもよい。タグが付加された本開示のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質について他の好適な精製方法が当業者には明らかであろう。
本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質）は、核酸分子又はポリペプチドのいずれとしても送達又は使用することができる。核酸分子を使用する場合、以下で更に詳細に考察するとおり、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸分子をコドン最適化することができる。核酸は、任意の目的の生物、詳細にはヒト細胞又は細菌での使用にコドン最適化することができる。例えば、核酸は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト霊長類を含めた任意の非ヒト真核生物向けにコドン最適化することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」において容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。特定の配列を特定の宿主細胞での発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）など、利用可能である。
一部の例では、真核生物（例えば、ヒト、又は他の哺乳類細胞）細胞で発現させるためのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質をコードする本開示の核酸は、１つ以上のイントロン、即ち、第１の端部（例えば、５’末端）にスプライスドナー配列を含み、且つ第２の端部（例えば、３’末端）にスプライスアクセプター配列を含む１つ以上の非コード配列を含む。本開示の様々な実施形態において、限定なしに、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）イントロン、β－グロビンイントロン、及び合成イントロンを含め、任意の好適なスプライスドナー／スプライスアクセプターを使用することができる。それに代えて又は加えて、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はアクセサリータンパク質をコードする本開示の核酸は、ＤＮＡコード配列の３’末端に、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの転写終結シグナルを含み得る。一部の例では、ポリＡシグナルは、ＳＶ４０イントロンなどのイントロンにごく近接して、又はそれに隣接して位置する。
ＲＮＡガイド
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは少なくとも１つのＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドを含む。多くのＲＮＡガイドの構成が当該技術分野において公知である（例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット及び同第２０１５／０７００８３号パンフレット（これらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは複数のＲＮＡガイド（例えば、２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上のＲＮＡガイド）を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは少なくとも１つのＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド又は少なくとも１つのＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドはｃｒＲＮＡを含む。概して、本明細書に記載されるｃｒＲＮＡはダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に連結したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列、スペーサー配列、及びダイレクトリピート配列（ＤＲ－スペーサー－ＤＲ）を含み、これは他のＣＲＩＳＰＲシステムにおける前駆体ｃｒＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）構成に典型的なものである。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、トランケート型ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列を含み、これはプロセシングされた又は成熟ｃｒＲＮＡに典型的なものである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質はＲＮＡガイドと複合体を形成し、スペーサー配列が、スペーサー配列に相補的な標的核酸との配列特異的結合へと複合体を導く。
好適には、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは少なくとも１つのＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド又はＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドをコードする核酸を含み、ここでＲＮＡガイドはダイレクトリピートを含む。好適には、Ｖ－Ｉ型ＲＮＡガイドは、例えば本明細書に記載されるとおりの、ステムループ構造などの二次構造を形成してもよい。
ダイレクトリピートは、互いに相補的であってもよい２つのヌクレオチドストレッチを含むことができ、これらは介在ヌクレオチドによって隔てられ、従ってダイレクトリピートがハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する結果、２つの相補的なヌクレオチドストレッチがステムを形成し、且つ介在ヌクレオチドがループ又はヘアピンを形成するステム－ループ構造が生じ得る（図３）。例えば、「ループ」を形成する介在ヌクレオチドは、約６ヌクレオチド～約８ヌクレオチド、又は約７ヌクレオチドの長さを有する。異なる実施形態において、ステムは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は５塩基対を含むことができる。
好適には、ダイレクトリピートは、介在する約７ヌクレオチドによって隔てられた約５ヌクレオチド長である２つの相補的なヌクレオチドストレッチを含むことができる。
Ｖ－Ｉ型システムの一部の例示的ダイレクトリピートが図３に例示され、好適には天然に存在するＶ－Ｉ型ダイレクトリピートから逸脱するとき、当業者は、図３に例示されるかかるダイレクトリピートの構造を模倣し得る。
ダイレクトリピートは、約２２～４０ヌクレオチド、又は約２３～３８ヌクレオチド又は約２３～３６ヌクレオチドを含むか又はそれからなることができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは複数のＲＮＡガイド（例えば、２、３、４、５、１０、１５個、又はそれ以上）又は複数のＲＮＡガイドをコードする複数の核酸を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列と、標的核酸に対するハイブリダイズ能を有する（例えば、適切な条件下でそれにハイブリダイズする）スペーサー配列とを含むか又はそれからなり、ここでダイレクトリピート配列は、その３’末端の近位に、及びスペーサー配列に隣接して、５’－ＣＣＧＵＣＮＮＮＮＮＮＮＧＡＣＧＧ－３’（配列番号２０２）を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列と、標的核酸に対するハイブリダイズ能を有する（例えば、適切な条件下でそれにハイブリダイズする）スペーサー配列とを含むか又はそれからなり、ここでダイレクトリピート配列は、その３’末端の近位に、及びスペーサー配列に隣接して、５’－ＧＵＧＣＣＮＮＮＮＮＮＮＧＧＣＡＣ－３’（配列番号２０３）を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列と、標的核酸に対するハイブリダイズ能を有する（例えば、適切な条件下でそれにハイブリダイズする）スペーサー配列とを含むか又はそれからなり、ここでダイレクトリピート配列は、３’末端の近位に、及びスペーサー配列に隣接して５’－ＧＵＧＵＣＮ５－６ＵＧＡＣＡＸ１－３’（配列番号２０４）（式中、Ｎ５－６は任意の５又は６核酸塩基の連続する配列を指し、及びＸ１はＣ又はＴ又はＵを指す）を含む。
ＲＮＡガイドダイレクトリピート配列及びエフェクタータンパク質の対の例が表５Ａに提供される。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表５Ａに掲載される核酸配列（例えば、配列番号６～１０、１９～２４）を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、最初の３個の５’ヌクレオチドのトランケーションを有する表５Ａに掲載される核酸配列を有する核酸を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、最初の４個の５’ヌクレオチドのトランケーションを有する表５Ａに掲載される核酸配列を有する核酸を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、最初の５個の５’ヌクレオチドのトランケーションを有する表５Ａに掲載される核酸配列を有する核酸を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、最初の６個の５’ヌクレオチドのトランケーションを有する表５Ａに掲載される核酸配列を有する核酸を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、最初の７個の５’ヌクレオチドのトランケーションを有する表５Ａに掲載される核酸配列を有する核酸を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、最初の８個の５’ヌクレオチドのトランケーションを有する表５Ａに掲載される核酸配列を有する核酸を含むか又はそれからなる。
ＲＮＡガイドのマルチプレックス化
ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターは２つ以上のＲＮＡガイドを利用し、従ってこれらのエフェクター、並びにそれらを含むシステム及び複合体が複数の異なる核酸標的を標的化する能力を実現することが実証されている。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは複数のＲＮＡガイド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０個、又はそれ以上のＲＮＡガイド）を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは単一のＲＮＡ鎖又は単一のＲＮＡ鎖をコードする核酸を含み、ここでＲＮＡガイドはタンデムに配置される。単一のＲＮＡ鎖は、同じＲＮＡガイドの複数のコピー、異なるＲＮＡガイドの複数のコピー、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
一部の実施形態において、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、異なる標的核酸に向けられる複数のＲＮＡガイドと複合体化して送達される。一部の実施形態において、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、各々が異なる標的核酸に特異的な複数のＲＮＡガイドと共送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を用いたマルチプレックス化の方法については、例えば、米国特許第９，７９０，４９０号明細書、及び欧州特許第３００９５１１号明細書（これらの各々の内容全体は参照により本明細書に明示的に援用される）に記載されている。
ＲＮＡガイド修飾
スペーサー長さ
ＲＮＡガイドのスペーサー長さは約１５～５０ヌクレオチドの範囲であってもよい。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー長さは、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１６～２２ヌクレオチド、１７～２０ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチド）、２３～２５ヌクレオチド（例えば、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）、２４～２７ヌクレオチド、２７～３０ヌクレオチド、３０～４５ヌクレオチド（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、又は４５ヌクレオチド）、３０又は３５～４０ヌクレオチド、４１～４５ヌクレオチド、４５～５０ヌクレオチド、又はそれ以上である。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー長さは３１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのダイレクトリピート長さは少なくとも２１ヌクレオチドであり、又は２１～３７ヌクレオチド（例えば、２３、２４、２５、３０、３５、又は３６ヌクレオチド）である。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのダイレクトリピート長さは２３ヌクレオチドである。
ＲＮＡガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体の形成及び標的への結合の成功は許容するが、同時にヌクレアーゼ活性の成功は許容しない（即ち、ヌクレアーゼ活性のない／インデルを生じさせない）ような方法で修飾されてもよい。こうした修飾ガイド配列は、「デッドガイド」又は「デッドガイド配列」と称される。こうしたデッドガイド又はデッドガイド配列はヌクレアーゼ活性の点で触媒的に不活性又はコンホメーション的に不活性であってもよい。デッドガイド配列は、典型的には、活性なＲＮＡ切断を生じるそれぞれのガイド配列よりも短い。一部の実施形態において、デッドガイドは、ヌクレアーゼ活性を有するそれぞれのＲＮＡガイドと比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％短い。ＲＮＡガイドのデッドガイド配列は、１３～１５ヌクレオチド長（例えば、１３、１４、又は１５ヌクレオチド長）、１５～１９ヌクレオチド長、又は１７～１８ヌクレオチド長（例えば、１７ヌクレオチド長）であってもよい。
従って、一態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりの機能性ＣＲＩＳＰＲ酵素と、ＲＮＡガイド（ｇＲＮＡ）とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲシステムを提供し、ここでｇＲＮＡはデッドガイド配列を含み、従ってｇＲＮＡは、検出可能な切断活性なしにＣＲＩＳＰＲシステムが細胞の目的のゲノム遺伝子座に向けられるような標的配列へのハイブリダイズ能を有する。
デッドガイドの詳細な説明は、例えば、国際公開第２０１６０９４８７２号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。
誘導性ガイド
ＲＮＡガイドは、誘導性システムの成分として作成することができる。このシステムの誘導可能な性質により、遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となる。一部の実施形態において、誘導性システムの刺激としては、例えば、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー、及び／又は熱エネルギーが挙げられる。
一部の実施形態において、ＲＮＡガイドの転写は、誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御下での転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導性遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導性遺伝子発現システムによって調節することができる。誘導性システムの他の例としては、例えば、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）、又は光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。これらの誘導性システムは、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第８７９５９６５号明細書（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
化学修飾
ＲＮＡガイドのリン酸骨格、糖、及び／又は塩基に化学修飾を適用することができる。ホスホロチオエートなどの骨格修飾はリン酸骨格上の電荷を修飾し、オリゴヌクレオチドの送達及びヌクレアーゼ耐性に役立つ（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，“Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２４（２０１４），ｐｐ．３７４－３８７を参照のこと）；２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｆ、及びロックド核酸（ＬＮＡ）などの糖修飾は、塩基対合及びヌクレアーゼ耐性の両方を亢進させる（例えば、Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．“Ｆｕｌｌｙ ２‘－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４８．４（２００５）：９０１－９０４を参照のこと）。化学修飾塩基、とりわけ２－チオウリジン又はＮ６－メチルアデノシンなどは、より強い塩基対合又はより弱い塩基対合のいずれも可能にすることができる（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ－ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２ Ａｕｇ ２０；３：１５４を参照のこと）。加えて、ＲＮＡは、蛍光色素、ポリエチレングリコール、又はタンパク質を含めた種々の機能性部分との５’末端及び３’末端の両方のコンジュゲーションに適している。
化学的に合成されるＲＮＡガイド分子には、幅広い種類の修飾を適用することができる。例えば、オリゴヌクレオチドを２’－ＯＭｅで修飾してヌクレアーゼ耐性を改善すると、ワトソン・クリック塩基対合の結合エネルギーを変化させることができる。更には、２’－ＯＭｅ修飾は、オリゴヌクレオチドがトランスフェクション試薬、タンパク質又は細胞中の任意の他の分子とどのように相互作用するかに影響を及ぼし得る。これらの修飾の効果は経験的試験によって決定することができる。
一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは１つ以上のホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、塩基対合を亢進させること及び／又はヌクレアーゼ耐性を増加させることを目的として１つ以上のロックド核酸を含む。
これらの化学修飾の概要については、例えば、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇｕｉｄｅ
ＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｓｅｐ １０；２３３：７４－８３；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び米国特許第８７９５９６５ Ｂ２号明細書（この各々が全体として参照により援用される）を参照することができる。
配列修飾
本明細書に記載されるＲＮＡガイド及びｃｒＲＮＡの配列及び長さは最適化することができる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドの最適化された長さは、プロセシングされた形態のｃｒＲＮＡを同定することによるか、又はｃｒＲＮＡのＲＮＡガイドについての経験的な長さ研究によって決定されてもよい。
ＲＮＡガイドはまた、１つ以上のアプタマー配列も含むことができる。アプタマーは、特異的な標的分子に結合することのできるオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター、又は遺伝子リプレッサーに特異的であってもよい。一部の実施形態において、アプタマーはタンパク質に特異的であり、次にはそのタンパク質が特異的遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター、又は遺伝子リプレッサーに特異的であって、それを動員し／それに結合するものであってもよい。エフェクター、アクチベーター、又はリプレッサーは融合タンパク質の形態で存在することができる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、同じアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列を有する。一部の実施形態において、２つ以上のアプタマー配列は異なるアダプタータンパク質に特異的である。アダプタータンパク質としては、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１を挙げることができる。従って、一部の実施形態において、アプタマーは、本明細書に記載されるとおりのアダプタータンパク質のうちのいずれか１つに特異的に結合する結合タンパク質から選択される。一部の実施形態において、アプタマー配列はＭＳ２ループである。アプタマーの詳細な説明については、例えば、Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｃａｓ９ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０１６ Ｎｏｖ １６；４４（２０）：９５５５－９５６４；及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
ガイド：標的配列一致要件
古典的ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又は１００％であってもよい。一部の実施形態において、相補性の程度は１００％である。ＲＮＡガイドは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長、又はそれ以上であってもよい。
オフターゲット相互作用を減少させるため、例えば、相補性が低い標的配列と相互作用するガイドを減少させるため、ＣＲＩＳＰＲシステムに突然変異を導入して、ＣＲＩＳＰＲシステムが標的配列と、８０％、８５％、９０％、又は９５％より高い相補性を有するオフターゲット配列との間を区別できるようにしてもよい。一部の実施形態において、相補性の程度は、８０％～９５％、例えば、約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％である（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２、又は３個のミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットとの間を区別する）。従って、一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は９９．９％より高い。一部の実施形態において、相補性の程度は１００％である。
当該分野では、機能性となるのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は要件とならないことが公知である。スペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含め、スペーサー配列と標的配列との間へのミスマッチ、例えば１個以上のミスマッチ、例えば１又は２個のミスマッチの導入により、切断効率の調節を生かすことができる。ミスマッチ、例えば二重ミスマッチが中心寄りに位置するほど（即ち、３’末端又は５’末端にあるのでない）；切断効率がより大きい影響を受ける。従って、スペーサー配列に沿ったミスマッチ位置の選択により、切断効率を調節することができる。例えば、標的の１００％未満の切断が（例えば、細胞集団中で）所望される場合、スペーサー配列にスペーサーと標的配列との間の１又は２個のミスマッチを導入してもよい。
選択の生物での使用に向けたＣＲＩＳＰＲシステムの最適化
コドン最適化
本発明は、可能なコドン選択に基づき組み合わせを選択することによって作り出され得るｃＤＮＡなどの核酸の可能な全ての変形例を企図する。これらの組み合わせは、天然に存在する変異体をコードするポリヌクレオチドに適用されるとおりの標準的なトリプレット遺伝子コードに従い作り出され、かかる変形例の全てが具体的に開示されていると見なされるべきである。本明細書には、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））及びヒト細胞での発現にコドン最適化されたＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ関連エフェクタータンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列が開示される。例えば、ヒト細胞にコドン最適化された配列は、ヒト細胞に低頻度で出現するヌクレオチド配列中のコドンに代えて、ヒト細胞に高頻度で出現するコドンを用いることにより作成し得る。コドンの出現頻度は、当該技術分野において公知の方法により計算的に決定することができる。様々な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ヒト、マウス、ラット、ブタ、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎ）、トウモロコシ、及びタバコ）についてのこうしたコドン頻度の計算例が公開されており、又はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）コドン使用頻度表ツールなどの資料によって利用可能になる（以下には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びヒトについての例示的なコドン使用表が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲシステムの使用方法
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムには、非常に多数の細胞型における標的ポリヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、又は活性化）を含め、多種多様な有用性がある。このＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ検出（例えば、特異的高感度酵素レポーターアンロッキング（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｌｏｃｋｉｎｇ：ＳＨＥＲＬＯＣＫ））、核酸の追跡及び標識、エンリッチメントアッセイ（バックグラウンドからの所望の配列の抽出）、循環腫瘍ＤＮＡの検出、次世代ライブラリの調製、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定、及び様々な遺伝的障害の治療において、幅広い範囲にわたる適用を有する。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、Ｃａｓ１２ｉタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲシステムは活性の増加を呈し得るか、又はＤＮＡプラスミド、スーパーコイルＤＮＡ、若しくは転写活性のあるゲノム遺伝子座など、特定の環境におけるターゲティング時に優先的に活性であり得る。
ゲノム編集システム概論
用語「ゲノム編集システム」は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ編集活性を有する本開示のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、上記に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも２つの成分：ＲＮＡガイドとコグネイトＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含む。本開示の特定の実施形態において、エフェクターはＣａｓ１２ｉタンパク質であり、ＲＮＡガイドはコグネイトＶ－Ｉ型ＲＮＡガイドである。上記に記載したとおり、これらの２つの成分が複合体を形成し、この複合体は、特異的核酸配列に会合して、当該の核酸配列内又はその周辺で、例えば、一本鎖切断（ＳＳＢ又はニック）、二本鎖切断（ＤＳＢ）、核酸塩基修飾、ＤＮＡメチル化又は脱メチル化、クロマチン修飾等のうちの１つ以上を作り出すことによりＤＮＡを編集する能力を有する。
特定の実施形態では、ゲノム編集システムは一過性に活性であり（例えば、上記で考察したとおりの誘導性ＣＲＩＳＰＲエフェクターを取り込む）、一方、他の実施形態では、このシステムは構成的である（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム成分の発現を１つ以上の強力なプロモーターが制御している核酸によってコードされる）。
本開示のゲノム編集システムは、細胞への導入時、（ａ）内因性ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、限定なしに、例えば、目的の遺伝子標的、遺伝子のエクソン配列、遺伝子のイントロン配列、遺伝子又は遺伝子群の調節エレメント等をコードするＤＮＡを含めたもの；（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）などの内因性ゲノム外ＤＮＡ；及び／又は（ｃ）組み込まれていないウイルスゲノム、プラスミド、人工染色体などの外因性ＤＮＡ等を改変し得る。本開示全体を通じて、これらのＤＮＡ基質は「標的ＤＮＡ」と称される。
ゲノム編集がＳＳＢ又はＤＳＢの生成によって働く例において、本システムによって起こる改変は、短いＤＮＡ挿入又は欠失の形態をとることができ、これらはまとめて「インデル」と称される。これらのインデルは、典型的にはＰＡＭ配列に近接した及び／又はスペーサー配列の相補性領域内にある予測される切断部位の範囲内又はその近位に形成されてもよく、しかしある場合にはインデルはかかる予測される切断部位の外側に出現し得る。いかなる理論によっても拘束されることを望むものではないが、インデルは多くの場合に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの「エラープローン」ＤＮＡ損傷修復経路によるＳＳＢ又はＤＳＢの修復結果であると考えられる。
ある場合には、ゲノム編集を用いて２つのＤＳＢが互いから５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、又は２０００塩基対以内に生成され、これは、一方又は両方の切断部位におけるインデルの形成、並びにそれらのＤＳＢの間に置かれたＤＮＡ配列の欠失又は逆位を含め、１つ以上の結果をもたらす。
或いは、本開示のゲノム編集システムは、新規配列の組込みを通じて標的ＤＮＡを改変し得る。これらの新規配列は、標的ＤＮＡの既存の配列と異なってもよく（非限定的な例として、平滑末端のライゲーションによるＮＨＥＪによって組み込まれる）、又は標的化されるＤＮＡの領域と相同な１つ以上の領域を有するＤＮＡ鋳型に対応してもよい。鋳型となる相同配列の組込みは、「相同組換え修復」又は「ＨＤＲ」とも称される。ＨＤＲの鋳型ＤＮＡは、限定なしに、標的ＤＮＡと同じ染色体のもう一方のコピーに位置する相同配列の形態、標的ＤＮＡと同じ遺伝子クラスターからの相同配列等を含め、細胞にとって内因性であってもよい。それに代えて、又は加えて、鋳型ＤＮＡは、限定なしに、遊離線状又は環状ＤＮＡとして、１つ以上のゲノム編集システム成分に（共有結合的又は非共有結合的に）結合したＤＮＡとして、又はベクターゲノムの一部として、外因的に提供されてもよい。
一部の例では、編集は、Ｍａｔｔｈｅｗ Ｈ．Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．“ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＣＲＩＳＰＲｉ）ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８，２１８０－２１９６（２０１３）（これは全体として及びあらゆる目的から参照により援用される）により記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ媒介性干渉による遺伝子の一時的又は永久的なサイレンシングを含む。
ゲノム編集システムは、限定なしに、部位特異的核酸塩基修飾、ＤＮＡメチル化若しくは脱メチル化、又はクロマチン修飾を媒介する１つ以上の異種機能性ドメインを含め、他の成分を含み得る。ある場合には、異種機能性ドメインは、例えば直接的なペプチド結合又は介在ペプチドリンカーにより、Ｃａｓ１２ｉなどのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に共有結合的に結合する。この種の融合については、以下に更に詳細に記載する。一部の実施形態において、異種機能性ドメインは、例えば化学的架橋により、ｃｒＲＮＡに共有結合的に結合する。及び一部の実施形態において、１つ以上の官能基がＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び／又はｃｒＲＮＡと非共有結合的に会合してもよい。これは、ｃｒＲＮＡ及び／又は異種官能基に付加されたアプタマー、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に融合したペプチドモチーフ及び異種機能性ドメインに融合したかかるモチーフに結合するように構成される結合ドメイン、又はその逆により、様々に行われる。
ゲノム編集システム設計及びゲノム編集の結果については、本明細書の他の部分に更に詳細に記載する。
ＤＮＡ／ＲＮＡ検出
一態様において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＤＮＡセンシングによるＤＮＡ／ＲＮＡ検出において使用することができる。シングルエフェクターＲＮＡ誘導型ＤＮアーゼをＲＮＡガイドで再プログラム化することにより、特異的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）センシング用のプラットフォームがもたらされ得る。そのＤＮＡ標的の認識時、活性化したＣＲＩＳＰＲ Ｖ－Ｉ型エフェクタータンパク質は、標的配列との配列類似性のない近隣ｓｓＤＮＡの「コラテラル」切断に関与する。このＲＮＡによってプログラム化されるコラテラル切断活性により、ＣＲＩＳＰＲシステムが特異的ＤＮＡの存在を標識ｓｓＤＮＡの非特異的分解によって検出することが可能となる。
ＤＮＡ検出適用においては、コラテラルｓｓＤＮアーゼ活性をレポーターと組み合わせることができ、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ標的化ＣＲＩＳＰＲトランスレポーター（ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｔｒａｎｓ
ｒｅｐｏｒｔｅｒ：ＤＥＴＥＣＴＲ）法と呼ばれる方法などであり、これは増幅と組み合わせたとき、アトモル濃度のＤＮＡ検出感度を実現する（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６０（６３８７）：４３６－４３９，２０１８を参照のこと）（これは全体として参照により本明細書に援用される）。本明細書に記載される酵素を使用する一つの適用は、インビトロ環境における非標的ｓｓＤＮＡの分解である。フルオロフォア及び消光剤に連結した「レポーター」ｓｓＤＮＡ分子もまた、未知のＤＮＡ試料（一本鎖又は二本鎖のいずれか）と共にこのインビトロシステムに加えることができる。未知のＤＮＡ片中に標的配列を認識すると、Ｖ－Ｉ型エフェクターを含有するこの監視複合体がレポーターｓｓＤＮＡを切断し、蛍光リードアウトが生じる。
他の実施形態において、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法（特異的高感度酵素レポーターアンロッキング（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ））もまた、核酸増幅及びレポーターｓｓＤＮＡのコラテラル切断に基づいたアトモル濃度（又は単一分子）感度のインビトロ核酸検出プラットフォームを提供し、標的のリアルタイム検出を可能にする。ＳＨＥＲＬＯＣＫにおけるＣＲＩＳＰＲの使用方法については、例えば、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５６（６３３６）：４３８－４４２（２０１７）（これは全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、マルチプレックス化したエラーロバストな蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＭＥＲＦＩＳＨ）において使用することができる。こうした方法については、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ，ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ
ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５ Ａｐｒ ２４；３４８（６２３３）：ａａａ６０９０（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、試料（例えば、臨床試料、細胞、又は細胞ライセート）中の標的ＤＮＡを検出することができる。本明細書に記載されるＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のコラテラルＤＮアーゼ活性は、エフェクタータンパク質が標的核酸に結合したとき活性化される。目的の標的ＤＮＡに結合すると、エフェクタータンパク質が標識されたデテクターｓｓＤＮＡを切断するためシグナルが生成され又はそれが変化し（例えば、シグナルの増加又はシグナルの減少）、それにより試料中の標的ＤＮＡの定性的及び定量的検出が可能となる。試料中のＤＮＡの特異的検出及び定量化は、診断法を含め、数多くの適用を可能にする。
一部の実施形態において、本方法は、ａ）試料に（ｉ）ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）及び／又はＲＮＡガイドをコードする核酸であって、ダイレクトリピート配列と標的ＲＮＡへのハイブリダイズ能を有するスペーサー配列とからなるＲＮＡガイド；（ｉｉ）ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及び／又はエフェクタータンパク質をコードする核酸；及び（ｉｉｉ）標識されたデテクターｓｓＤＮＡを接触させることであって；エフェクタータンパク質はＲＮＡガイドと会合して監視複合体を形成し；監視複合体は標的ＤＮＡにハイブリダイズし；及び監視複合体が標的ＤＮＡに結合すると、エフェクタータンパク質がコラテラルＤＮアーゼ活性を呈し、標識されたデテクターｓｓＤＮＡを切断すること；及びｂ）標識されたデテクターｓｓＤＮＡの切断によって生成される検出可能シグナルを測定することであって、前記測定することが、試料中の標的ＤＮＡの検出を提供することを含む。
一部の実施形態において、本方法は、検出可能シグナルを参照シグナルと比較すること及び試料中の標的ＤＮＡの量を決定することを更に含む。一部の実施形態において、測定は、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、及び半導体ベースのセンシングを用いて実施される。一部の実施形態において、標識されたデテクターｓｓＤＮＡは、蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対、又は消光剤／フルオロフォア対を含む。一部の実施形態において、標識されたデテクターｓｓＤＮＡがエフェクタータンパク質によって切断されると、標識されたデテクターｓｓＤＮＡによって生成される検出可能シグナルの量が減少又は増加する。一部の実施形態において、標識されたデテクターｓｓＤＮＡはエフェクタータンパク質による切断前に第１の検出可能シグナルを生成し、エフェクタータンパク質による切断後に第２の検出可能シグナルを生成する。
一部の実施形態において、検出可能シグナルは、標識されたデテクターｓｓＤＮＡがエフェクタータンパク質によって切断されたときに生成される。一部の実施形態において、標識されたデテクターｓｓＤＮＡは、修飾核酸塩基、修飾糖部分、修飾核酸結合、又はこれらの組み合わせを含む。
一部の実施形態において、本方法は、試料中の複数の独立した標的ＤＮＡ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０個、又はそれ以上の標的ＲＮＡ）のマルチチャンネル検出を含み、これは、複数のＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用することによるもので、各々が異なるオルソロガスなエフェクタータンパク質と、対応するＲＮＡガイドとを含むことにより、試料中の複数の標的ＤＮＡの区別が可能となる。一部の実施形態において、本方法は、試料中の複数の独立した標的ＤＮＡのマルチチャンネル検出を含み、これは、複数例のＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの使用によるもので、各々が区別可能なコラテラルｓｓＤＮアーゼ基質を有するオルソロガスなエフェクタータンパク質を含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を使用した試料中のＤＮＡの検出方法については、例えば、米国特許出願公開第２０１７／０３６２６４４号明細書（この内容全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
核酸の追跡及び標識
細胞過程は、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡの間での分子相互作用網に依存する。タンパク質－ＤＮＡ及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用の正確な検出は、かかる過程を理解する鍵である。インビトロ近接性標識技法は、レポーター基、例えば光活性化可能な基と組み合わせたアフィニティータグを用いることにより、インビトロで目的のタンパク質又はＤＮＡの近くにあるポリペプチド及びＤＮＡを標識する。紫外線照射後、光活性化可能な基がタグ付加分子にごく近接したタンパク質及び他の分子と反応し、それによってそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収し、同定することができる。このＤＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば、プローブを選択のＤＮＡ配列に標的化することができる。こうした適用はまた、動物モデルにおいても疾患又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングに適用することができる。核酸の追跡及び標識方法については、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
ペアＣＲＩＳＰＲニッカーゼを使用したゲノム編集
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムをタンデムで使用して、一対のＲＮＡガイドによって標的遺伝子座の対向する両鎖に標的化される２つのＣａｓ１２ｉニッキング酵素、又は１つのＣａｓ１２ｉ酵素とニッキング活性を有する１つの他のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ酵素とが、オーバーハングを伴う二本鎖切断を生成できるようにすることができる。この方法によれば、両方の酵素がニックを生成する遺伝子座においてのみ二本鎖切断が生じると予想されるため、オフターゲット修飾の可能性が低下し、従ってゲノム編集の特異性が増加し得る。この方法は「ダブルニッキング」又は「ペアニッカーゼ」戦略と称され、例えば、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｏｕｂｌｅ ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ｃｅｌｌ，２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０－１３８９、及びＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３ Ａｕｇ ０１；３１：８３３－８３８（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
ペアニッカーゼの最初の適用は、哺乳類細胞株におけるこの戦略の有用性を実証した。ペアニッカーゼの適用は、モデル植物シロイヌナズナ（例えば、Ｆａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｏｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｂａｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，”Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ７９（２）：３４８－５９（２０１４）、及びＳｈｉｍｌ ｅｔ ａｌ．，““Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｎ
ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｏｒ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ａｓ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｐｒｏｇｅｎｙ，”Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ８０（６）：１１３９－５０（２０１４）；コメなどの作物（例えば、Ｍｉｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｖｉａ Ｃａｓ９ Ｐａｉｒｅｄ Ｎｉｃｋａｓｅｓ ｉｎ Ｒｉｃｅ，”Ｐｌａｎｔ
ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ５７（５）：１０５８－６８（２０１６）及びコムギ（例えば、Ｃｚｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ
Ｔｏｏｌｋｉｔ ｔｏ Ｅｎａｂｌｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，”Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２９：１１９６－１２１７（２０１７）；細菌（例えば、Ｓｔａｎｄａｇｅ－Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｎｉｃｋａｓｅｓ，”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４（１１）：１２１７－２５（２０１５）；及び治療目的で初代ヒト細胞（例えば、Ｄａｂｒｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＧ Ｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ Ｇｅｎｅ ｂｙ Ｃａｓ９ Ｎｉｃｋａｓｅｓ，”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２：７５（２０１８）、及びＫｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｔ ａｎｄ Ｐａｓｔｅ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＫＲＴ１４ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｖｉａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｎｉｃｋａｓｅｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５（１１）：２５８５－２５９８（２０１７））（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）において記載されている。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはまた、例えば、Ｓａｎｔｏ ＆ Ｐａｉｋ，“Ａ ｓｐｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｓｐＪＣＲＩＳＰＲ）ｒｅｖｅａｌｓ ｈｕｍａｎ ＦＯＸＯ３Ｂ ｔｏ ｂｅ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ，”Ｇｅｎｅ ６７３：９５－１０１（２０１８）に記載されるとおり、ペアニッカーゼとして使用してスプライスジャンクションを検出することもできる。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはまた、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｙｏｔｏｎｉｃ
Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ Ｔｙｐｅ １ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（１１）：２６１７－２６３０（２０１８）に記載されるとおり、ペアニッカーゼとして使用して標的遺伝子座にＤＮＡ分子を挿入することもできる。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはまた、例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＲＡＭＰ１ ｋｎｏｃｋｉｎ ｃａｔｔｌｅ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ
ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８（１）：１３（２０１７）に記載されるとおり、シングルニッカーゼとして使用して遺伝子を挿入することもできる。
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼを使用した塩基編集の亢進
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集の効率を増強することができる。塩基編集では、ＤＮＡヌクレオチド修飾活性（例えば、シチジン脱アミノ化）を有するタンパク質ドメインが、突然変異によってもはや二本鎖ＤＮＡ切断活性を持たないように不活性化されたプログラム可能なＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ酵素に融合される。一部の実施形態において、プログラム可能なＣａｓタンパク質としてニッカーゼを使用すると、例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ，”Ｎａｔｕｒｅ ５３３：４２０－４２４（２０１６）、及びＮｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６３０５）：ａａｆ８７２９（２０１６）（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、塩基編集効率が向上することが示されている。標的遺伝子座の非編集鎖をニッキングするニッカーゼは、内在性ＤＮＡ修復経路－ミスマッチ修復又はロングパッチ塩基除去修復など、所望のアレルに対する塩基編集によって生成されたミスマッチを優先的に解消するもの－を刺激するか、又は触媒編集ドメインが標的ＤＮＡにより接近し易くすると仮定される。
ニッカーゼ及びＤＮＡポリメラーゼによる標的化した突然変異誘発及びＤＮＡ標識
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ニッキングされたＤＮＡに作用するタンパク質と併せて使用することができる。一つのかかるタンパク質クラスは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ又はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのニックトランスレーションＤＮＡポリメラーゼである。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ）をエラープローンＤＮＡポリメラーゼＩに融合することができる。この融合タンパク質はＲＮＡガイドによって標的化され、標的ＤＮＡ部位にニックを生成することができる。次にＤＮＡポリメラーゼがニックにおいてＤＮＡ合成を開始すると、下流ヌクレオチドが置換され、及びエラープローンポリメラーゼが使用されるため、標的遺伝子座の突然変異誘発が生じる。様々なプロセシング能力、忠実度、及び取込み誤りバイアスを備えるポリメラーゼ変異体を使用して、生成される突然変異体の特性に影響を与え得る。ＥｖｏｌｖＲと呼ばれるこの方法については、例えば、Ｈａｌｐｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ａ ｔｕｎａｂｌｅ
ｗｉｎｄｏｗ，”Ｎａｔｕｒｅ ５６０，２４８－２５２（２０１８）（これは全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載される。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ニックトランスレーションＤＮＡ標識プロトコルにおいて使用することができる。１９７７年にＲｉｇｂｙ ｅｔ ａｌによって初めて記載されたニックトランスレーションは、ＤＮＡ分子に１つ以上のニックを作り出すＤＮアーゼＩなどのＤＮＡニッキング酵素と共にＤＮＡをインキュベートすることを含む。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩなどのニックトランスレーションＤＮＡポリメラーゼを使用してニッキング部位に標識された核酸残基を取り込む。古典的なニックトランスレーション標識プロトコルの変形例を用いた、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼがプログラム可能であることを利用してテロメア反復配列に蛍光色素を共有結合的にタグ付けする方法が、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１９０４－１９１５（２０１７）（これは全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載されている。この方法は、単一分子レベルでのハプロタイプに分解したテロメア長分析を実現する。
核酸の追跡及び標識
細胞過程は、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡの間での分子相互作用網に依存する。タンパク質－ＤＮＡ及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用の正確な検出は、かかる過程を理解する鍵である。インビトロ近接性標識技法は、レポーター基、例えば光活性化可能な基と組み合わせたアフィニティータグを用いることにより、インビトロで目的のタンパク質又はＲＮＡの近くにあるポリペプチド及びＲＮＡを標識する。紫外線照射後、光活性化可能な基がタグ付加分子にごく近接したタンパク質及び他の分子と反応し、それによってそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収し、同定することができる。このＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば、プローブを選択のＲＮＡ配列に標的化することができる。こうした適用はまた、動物モデルにおいても疾患又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングに適用することができる。核酸の追跡及び標識方法については、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
ハイスループットスクリーニング
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリの調製に使用することができる。例えば、費用対効果の高いＮＧＳライブラリを作成するため、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して標的遺伝子のコード配列を破壊することができ、同時に次世代シーケンシングによって（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭシステムで）、ＣＲＩＳＰＲ酵素がトランスフェクトされたクローンをスクリーニングすることができる。ＮＧＳライブラリの調製方法に関する詳細な説明については、例えば、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１５．１（２０１４）：１００２（これは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
エンジニアリングされた微生物
微生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、及び微細藻類）は、合成生物学に広く用いられている。合成生物学の発展には、様々な臨床応用を含め、幅広い有用性がある。例えば、本明細書に記載されるプログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、例えば癌関連ＲＮＡを標的転写物として用いる標的化した細胞死のため、毒性ドメインのタンパク質を分割することができる。更に、例えばキナーゼ又は酵素などの適切なエフェクターとの融合複合体により、合成生物系においてタンパク質間相互作用が関わる経路に影響を及ぼすことができる。
一部の実施形態において、ファージ配列を標的化するＲＮＡガイド配列を微生物に導入することができる。従って、本開示はまた、微生物（例えば産生菌株）にファージ感染に対するワクチンを接種する方法も提供する。
一部の実施形態において、本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して微生物をエンジニアリングすることにより、例えば、収率を改善し又は発酵効率を改善することができる。例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖からバイオ燃料若しくはバイオポリマーを生成し、又は発酵性糖源としての農業廃棄物に由来する植物由来のリグノセルロースを分解することができる。より詳細には、本明細書に記載される方法を使用して、バイオ燃料生産に必要な内因性遺伝子の発現を修飾し、及び／又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を修飾することができる。これらの微生物エンジニアリング方法については、例えば、Ｖｅｒｗａａｌ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ｅｎａｂｌｅｓ
ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ｙｅａｓｔ，２０１７ Ｓｅｐ ８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｙｅａ．３２７８；及びＨｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｆｒｏｍ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２０１５ Ｎｏｖ １；３３：１１９４－２０３（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、バイオエネルギー研究のモデル生物である中温性セルロース分解細菌クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）など、修復経路が欠損した微生物をエンジニアリングすることができる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼを使用して標的遺伝子座にシングルニックを導入することができ、それによって外因的に供給されたＤＮＡ鋳型の相同組換えによる挿入を生じさせてもよい。どのようにＣＲＩＳＰＲニッカーゼを使用して修復欠損微生物を編集するかに関する詳細な方法については、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ
ｖｉａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｎｉｃｋａｓｅ，”Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８１：４４２３－４４３１（２０１５）（これは全体として本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して細胞（例えば、エンジニアリングされた微生物などの微生物）の死滅又は休眠を誘導することができる。これらの方法を用いて、限定はされないが、哺乳類細胞（例えば、癌細胞、又は組織培養細胞）、原虫、真菌細胞、ウイルスに感染した細胞、細胞内細菌に感染した細胞、細胞内原虫に感染した細胞、プリオンに感染した細胞、細菌（例えば、病原性及び非病原性細菌）、原虫、並びに単細胞及び多細胞性寄生虫を含め、原核細胞及び真核細胞を含めた数多くの細胞型の休眠又は死滅を誘導することができる。例えば、合成生物学の分野では、エンジニアリングされた微生物（例えば、細菌）を制御してその伝播又は播種を防止する機構を有することが極めて望ましい。本明細書に記載されるシステムは、エンジニアリングされた微生物の伝播又は播種を調節及び／又は防止する「キルスイッチ」として使用することができる。更に、当該技術分野では、現行の抗生物質治療に代わる選択肢が必要とされている。
本明細書に記載されるシステムはまた、特定の微生物集団（例えば、細菌集団）を死滅させ又は制御することが望ましい適用においても使用することができる。例えば、本明細書に記載されるシステムは、属特異的、種特異的、又は株特異的な核酸（例えば、ＤＮＡ）を標的化するＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）を含んでもよく、細胞に送達することができる。複合体化して標的核酸に結合すると、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性が微生物内で必須機能を破壊するため、最終的に休眠又は死滅が起こる。一部の実施形態において、本方法は、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質又はこのエフェクタータンパク質をコードする核酸と、ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）又はＲＮＡガイドをコードする核酸であって、スペーサー配列が標的核酸の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれ以上）に対して相補的であるＲＮＡガイドとを含む本明細書に記載されるシステムを細胞に接触させることを含む。
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性は、プログラムされた細胞死、細胞毒性、アポトーシス、壊死、ネクロトーシス、細胞死、細胞周期停止、細胞アネルギー、細胞成長の低下、又は細胞増殖の低下を誘導することができる。例えば、細菌では、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質によるＤＮＡの切断は静菌性又は殺菌性であり得る。
植物における適用
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、植物において幅広い種類の有用性がある。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して植物のゲノムをエンジニアリングすることができる（例えば、生産を向上させる、所望の翻訳後修飾を有する生産品にする、又は工業製品を生産するための遺伝子を導入する）。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、植物に所望の形質を（例えば、ゲノムに対する遺伝性修飾を伴い又は伴わず）導入し、又は植物細胞若しくは全植物における内因性遺伝子の発現を調節することができる。本開示のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ１２ｉシステム）を使用して編集することのできる植物は単子葉類又は双子葉類であってよく、限定なしに、ベニバナ、トウモロコシ、大麻、コメ、サトウキビ、キャノーラ、モロコシ、タバコ、ライムギ、オオムギ、コムギ、アワ、オートムギ、ピーナッツ、ジャガイモ、スイッチグラス、芝草、ダイズ、アルファルファ、ヒマワリ、綿、及びシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）が挙げられる。本開示はまた、本開示の方法により及び／又は本開示のＣＲＩＳＰＲシステムを利用して作り出された形質を有する植物も包含する。
一部の実施形態において、本ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、特異的タンパク質、例えば、アレルゲンタンパク質（例えば、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、サヤマメ、及びヤエナリ中のアレルゲンタンパク質）をコードする遺伝子を同定、編集、及び／又はサイレンシングすることができる。タンパク質をコードする遺伝子を同定、編集、及び／又はサイレンシングする方法に関する詳細な説明については、例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｎｄ ｌｅｇｕｍｅ ａｌｌｅｒｇｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１（３）：２２２－８（２０１１）、及び国際公開第２０１６２０５７６４ Ａ１号パンフレット（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
遺伝子ドライブ
遺伝子ドライブは、特定の遺伝子又は遺伝子群の遺伝形質に有利な偏りが出る現象である。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ドライブを構築することができる。例えば、遺伝子の特定のアレルを標的化して破壊することにより、細胞に第２のアレルをコピーさせて配列を固定するようにＣＲＩＳＰＲシステムを設計することができる。このコピーのため、第１のアレルが第２のアレルに変換されることになり、子孫に第２のアレルが遺伝する可能性が高くなる。どのように本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ドライブを構築するかに関する詳細な方法については、例えば、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｖｅｃｔｏｒ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１６ Ｊａｎ；３４（１）：７８－８３（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
プール型スクリーニング
本明細書に記載されるとおり、プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、細胞増殖、薬剤耐性、及びウイルス感染などの生物学的機構に関与する遺伝子を同定するための強力なツールである。細胞がバルクで本明細書に記載されるＲＮＡガイド（ｇＲＮＡ）コードベクターのライブラリによって形質導入され、選択的チャレンジの適用前及び適用後にｇＲＮＡの分布が測定される。プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーンは、細胞生存及び増殖に影響を及ぼす機構に対して良好に機能し、個々の遺伝子の活性の測定にまで（例えば、エンジニアリングされたレポーター細胞株を使用することにより）拡張することができる。一度に１つの遺伝子のみが標的化されるアレイ化されたＣＲＩＳＰＲスクリーンでは、ＲＮＡ－ｓｅｑをリードアウトとして使用することが可能になる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムは単一細胞ＣＲＩＳＰＲスクリーンに使用することができる。プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニングに関する詳細な説明については、例えば、Ｄａｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅａｄ－ｏｕｔ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１７ Ｍａｒ；１４（３）：２９７－３０１（これは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
飽和突然変異誘発（「バッシング（ｂａｓｈｉｎｇ）」）
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはインサイチュー飽和突然変異誘発に使用することができる。一部の実施形態では、プール型ＲＮＡガイドライブラリを使用して、特定の遺伝子又は調節エレメントに関するインサイチュー飽和突然変異誘発を実施することができる。かかる方法では、決定的な最小の特徴及びそれらの遺伝子又は調節エレメント（例えば、エンハンサー）の個別的な脆弱性を明らかにすることができる。これらの方法については、例えば、Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，２０１５ Ｎｏｖ １２；５２７（７５７７）：１９２－７（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
治療上の適用
哺乳類細胞コンテクストで活性を有する本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２）は、多様な範囲にわたる治療上の適用を有し得る。更に、各ヌクレアーゼオルソログが、それを特定のターゲティング、治療、又は送達モダリティに有利にするユニークな特性（例えば、サイズ、ＰＡＭ等）を有し得るため、最大の治療利益を付与するヌクレアーゼを割り当てる上でオルソログ選択は重要である。
特定の疾患に対する療法としての遺伝子編集の適合性に影響を与える要因は多数ある。ヌクレアーゼベースの遺伝子療法では、主要な治療的編集手法は遺伝子破壊及び遺伝子修正であるとされている。前者において、遺伝子破壊は概して、標的細胞の内因性非相同末端結合ＤＮＡ修復機構を活性化するイベント（ヌクレアーゼ誘導性の標的化された二本鎖切断など）に伴い起こり、それによって生じるインデルが、多くの場合に機能喪失突然変異をもたらし、それが患者に有益となることが意図される。後者、遺伝子修正は、ヌクレアーゼ活性を利用することにより、鋳型ＤＮＡ（内因性か、それとも外因性か、一本鎖か、それとも二本鎖かに関わらず）の助けを借りて代替的なＤＮＡ修復経路（相同組換え修復、又はＨＤＲなど）を誘導する。鋳型化されるＤＮＡは、疾患の原因となる突然変異の内因的修正、又はその他、選択的遺伝子座（一般にはＡＡＶＳ１などのセーフハーバー遺伝子座）への治療用トランス遺伝子の挿入のいずれかである。外因性ドナー鋳型核酸の設計方法については、例えば、国際公開第２０１６０９４８７４ Ａ１号パンフレット（この内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される）に記載されている。このような編集モダリティのいずれかを用いる療法に必要なものは、特定の疾患の遺伝子調節因子の理解である；疾患は必ずしも単一遺伝子病である必要はないが、突然変異がどのように疾患の進行又は転帰をもたらし得るかに関する洞察は、遺伝子療法の潜在的な有効性に関して指針を提供するのに重要である。
限定されることは望まないが、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを利用して以下の疾患を治療することができ、ここでは具体的な疾患分野に対してＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムを適合させるのに役立つ関連参考文献に加えて、具体的な遺伝子標的が特定される；ＣＦＴＲを標的化することによる嚢胞性線維症（国際公開第２０１５１５７０７０Ａ２号パンフレット）、ジストロフィン（ＤＭＤ）を標的化することによるデュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィー（国際公開第２０１６１６１３８０Ａ１号パンフレット）、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）を標的化することによるα１－アンチトリプシン欠乏症（国際公開第２０１７１６５８６２Ａ１号パンフレット）、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）を標的化することによるポンペ病、別名ＩＩ型糖原病などのリソソーム蓄積障害、ＤＭＰＫを標的化することによる筋強直性ジストロフィー、ＨＴＴを標的化することによるハンチントン病、ＦＭＲ１を標的化することによる脆弱Ｘ、フラタキシンを標的化することによるフリードライヒ失調症、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的化することによる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＡｐｏＬ１を標的化することによる遺伝性慢性腎疾患、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３、ＡＮＧＰＴＬ３、ＬＰＡを標的化することによる心血管疾患及び高脂血症（Ｎａｔｕｒｅ ５５５，Ｓ２３－Ｓ２５（２０１８））、及びＣＥＰ２９０を標的化することによるレーベル先天黒内障１０型（ＬＣＡ１０）などの先天性失明（Ｍａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１９ Ｆｅｂ；２５（２）：２２９－２３３）。前述の疾患の大多数はインビボ遺伝子編集手法で最良に治療され、ここでは、疾患に関与する細胞型及び組織が、治療利益を生じるのに十分な用量及び効率でインサイチューで編集される必要がある。インビボ送達の幾つかの課題について、以下の「ＣＲＩＳＰＲシステムの送達」の節に記載するが、一般には、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターの遺伝子サイズが小さいことにより、アデノ随伴ウイルスなど、ペイロードに制限のあるウイルスベクターへのより汎用性の高いパッケージングが実現する。
細胞が患者の体から取り出され、次に編集された後、患者に移植し戻されるエキソビボ編集は、遺伝子編集技術の貴重な治療機会を呈する。体外で細胞を操作する能力は、電気穿孔及びヌクレオフェクションなど、タンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡを細胞に高い効率で送達するための、インビボコンテクストには適しない技術を使用可能であることに始まり、毒性を（オフターゲット効果などから）判定し、次には更に、編集された細胞を成功裏に選択及び拡大して、治療上の利点を提供する集団を産生可能であることにまで及ぶ範囲の、多くの利点を呈する。これらの利点は、機能を維持しつつ回収して処理し、次に体に戻すことに成功し得る細胞型及び集団が比較的少ないことによって相殺される。限定されることは望まないが、それにも関わらず、本明細書に記載されるシステムを使用したエキソビボゲノム編集に適している重篤な疾患がある。例えば、国際公開第２０１５１４８８６３Ａ２号パンフレットが参考となるとおりの鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、及び国際公開第２０１５１４８８６０Ａ１号パンフレットが参考となるとおりのβ－サラセミアは、両方とも、病態生理学の理解によって疾患治療のための造血幹細胞における幾つもの異なる編集モダリティが実現している疾患の例である。βサラセミア及びＳＣＤは、両方とも、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの破壊によって胎児ヘモグロビンのレベルを上昇させることにより治療し得る（Ｐｓａｔｈａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｓｅｐ ２１によってジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して例示されるとおり）。加えて、遺伝子修正方法を用いて、ＳＣＤ及びβサラセミアの有害な突然変異を復帰させることができる。別の例では、セーフハーバー遺伝子座から発現するβグロビンを加えることにより、エキソビボ遺伝子編集の別の代替的治療戦略がもたらされる。
造血幹細胞のエキソビボ編集からの当然の帰結として、免疫細胞もまた編集することができる。癌免疫療法においては、一つの治療様式は、国際公開第２０１５１６１２７６Ａ２号パンフレットが参考となるとおり、Ｔ細胞などの免疫細胞を修飾して癌を認識し、それと闘うことである。コストを低減しつつ有効性及び利用し易さを高めるためには、「既製品」の同種異系Ｔ細胞療法の創製が魅力的であり、遺伝子編集には、表面抗原を修飾して任意の免疫学的副作用を最小限に抑える潜在的能力がある（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１８ Ａｕｇ ３１）。
別の実施形態では、本発明を使用して、ウイルス又は他の病原体をそのライフサイクルの二本鎖ＤＮＡ中間段階で標的化する。具体的には、初期感染が永久的に持続する潜伏感染となって残るウイルスのターゲティングには、多大な治療的価値があり得る。以下の例では、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２については国際公開第２０１５１５３７８９Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１５１５３７９１Ａ１号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７５４７５Ａ１号パンフレット、及びＨＩＶについては国際公開第２０１５１４８６７０Ａ１号パンフレット及び国際公開第２０１６１８３２３６Ａ１号パンフレットが参考となるとおり、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムはウイルスゲノム（ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２又はＨＩＶに伴うものなど）の直接的なターゲティングに使用することができ、又は感染を実現する受容体を減少若しくは消失させてウイルス（ＨＩＶ）に対して抵抗性にするための宿主細胞の編集に使用することができる。
別の態様において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、酵素的に不活性なＣａｓ１２ｉを土台として利用して、その上にタンパク質ドメインを取り付けることにより、転写活性化、抑制、塩基編集、及びメチル化／脱メチル化などの活性を付与することのできる更なる機能を実現するようにエンジニアリングすることができる。
従って、本開示は、本明細書に開示される疾患のいずれかの治療又は予防における使用のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及び細胞を提供する。
ＣＲＩＳＰＲシステムの送達
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム、又はその成分、その核酸分子、又はその成分をコードする若しくは提供する核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミド、ウイルス送達ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、及び他のウイルスベクターなどの様々な送達システム、又はＶ－Ｉ型エフェクターとその１つ又は複数のコグネイトＲＮＡガイドとからなるリボ核タンパク質複合体のヌクレオフェクション又は電気穿孔などの方法によって送達することができる。タンパク質及び１つ以上のＲＮＡガイドは、１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。細菌適用については、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの成分のいずれかをコードする核酸は、ファージを使用して細菌に送達することができる。例示的ファージとしては、限定はされないが、Ｔ４ファージ、Ｍｕ、λファージ、Ｔ５ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージ、φ２９、Ｍ１３、ＭＳ２、Ｑβ、及びφＸ１７４が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉内注射、静脈内投与、経皮投与、鼻腔内投与、経口投与、又は粘膜投与によって目的の組織に送達される。かかる送達は、単回用量又は複数回用量のいずれによるものであってもよい。当業者は、本明細書において実際に送達される投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、組織、治療対象の全般的な状態、求められる形質転換／修飾の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／修飾の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
特定の実施形態において、送達は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９によるものであり、これは少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスを含有する単回用量で投与することができる。一部の実施形態において、用量は少なくとも約１×１０６粒子、少なくとも約１×１０７粒子、少なくとも約１×１０８粒子、又は少なくとも約１×１０９粒子のアデノ随伴ウイルスである。送達方法及び用量については、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第８，４５４，９７２号明細書（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。組換えＡＡＶのゲノムペイロードは限られているため、本明細書に記載されるＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のサイズが小さいことにより、エフェクター及びＲＮＡガイドを効率的且つ細胞型特異的発現に必要な適切な制御配列（例えば、プロモーター）と共にパッケージングする際に、より高い汎用性が実現する。
一部の実施形態において、送達は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターによるものである。例えば、一部の実施形態において、修飾ＡＡＶベクターが送達に使用されてもよい。修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈｌＯ、修飾ＡＡＶベクター（例えば、修飾ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ６）及びシュードタイプＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／６）を含めた幾つかのカプシド型のうちの１つ以上をベースとし得る。ｒＡＡＶ粒子の作製に使用し得る例示的ＡＡＶベクター及び技法は当該技術分野において公知である（例えば、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２（３）：１０４５－５４；Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｎｄｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｓ１：００８；Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－６０）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書及び同第５，１７３，４１４号明細書；及び国際公開第２０１５／０５４６５３号パンフレット及び同第９３／２４６４１号パンフレット（これらの各々は参照により援用される）を参照のこと）。
一部の実施形態において、送達はプラスミドによるものである。投薬量は、応答を引き出すのに十分な数のプラスミドであり得る。ある場合には、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、約０．１～約２ｍｇであってもよい。プラスミドは概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流にある且つそれに作動可能に連結された転写ターミネーターを含むことになる。プラスミドはまた、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＲＮＡ成分もコードすることができるが、代わりに、これらのうちの１つ以上が異なるベクターにコードされてもよい。投与頻度は、医学又は獣医学の実践者（例えば、医師、獣医師）、又は当業者の範囲内にある。
別の実施形態において、送達はリポソーム又はリポフェクチン製剤などによるものであり、当業者に公知の方法によって調製することができる。かかる方法については、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第５，５９３，９７２号明細書；同第５，５８９，４６６号明細書；及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、送達はナノ粒子又はエキソソームによるものである。例えば、エキソソームはＲＮＡの送達に特に有用であることが示されている。
この新規ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の成分を細胞に導入する更なる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用によるものである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドがＣＲＩＳＰＲ酵素に連結される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又はＲＮＡガイドが１つ以上のＣＰＰとカップリングされ、それらを細胞内部へと有効に輸送する（例えば、植物プロトプラスト）。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又は１つ又は複数のＲＮＡガイドが、細胞送達のため１つ以上のＣＰＰにカップリングされている１つ以上の環状又は非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。
ＣＰＰは、生体分子を受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドである。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物配列を有するペプチド、及びキメラ又は双節型ペプチドであってもよい。ＣＰＰの例としては、例えば、Ｔａｔ（これはＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核転写活性化因子タンパク質である）、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列、ポリアルギニンペプチドＡｒｇ配列、グアニンリッチ分子輸送体、及びスイートアローペプチドが挙げられる。ＣＰＰ及びその使用方法については、例えば、Ｈａｅｌｌｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１５；１３２４：３９－５８；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０－７；及び国際公開第２０１６２０５７６４ Ａ１号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
リボ核タンパク質複合体としてのＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムの電気穿孔又はヌクレオフェクションによる送達は、精製されたＣａｓ１２ｉタンパク質がＲＮＡガイドとプレインキュベートされ、目的の細胞に電気穿孔（又はヌクレオフェクト）されるものであり、遺伝子編集のためＣＲＩＳＰＲシステムを細胞に効率的に導入する別の方法である。これは、エキソビボゲノム編集及び細胞療法の開発に特に有用であり、かかる方法については、Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ
ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ，２０１８ Ｊｕｌ；５５９（７７１４）：４０５－４０９に記載されている。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムのための様々な送達方法はまた、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書、欧州特許第３００９５１１号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）にも記載されている。
キット
本開示はまた、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを利用した本開示の様々な方法を実行するためのキットも包含する。本開示の一つの例示的なキットは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びコグネイトｃｒＲＮＡをコードする１つ以上の核酸、及び／又は（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とコグネイトｃｒＲＮＡとのリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態において、本キットは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質とＣａｓ１２ｉガイドＲＮＡとを含む。上記に記載したとおり、タンパク質とガイドＲＮＡとの複合体は、ＳＳＢ形成、ＤＳＢ形成、ＣＲＩＳＰＲ干渉、核酸塩基修飾、ＤＮＡメチル化又は脱メチル化、クロマチン修飾等の編集活性を有する。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性が低下した変異体など、変異体である。
本開示のキットはまた、任意選択で、反応緩衝液、洗浄緩衝液、１つ以上の制御材料（例えば、基質又はＣＲＩＳＰＲシステム成分をコードする核酸）等のうちの１つ以上を含めた追加的な試薬も含む。本開示のキットはまた、任意選択で、キットに提供される材料を使用した本開示の方法の実施に関する説明書も含む。この説明書は、物理的形式で、例えばキットの他のアイテムと共に物理的に包装されている印刷文書として提供され、及び／又はデジタル形式、例えば、ウェブサイトからダウンロード可能な又はコンピュータ可読媒体上に提供されるデジタル発行された文書で提供される。
以下の例に本発明を更に記載するが、これらの例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分の同定（図１～図３）
このタンパク質ファミリーは、淡水環境から採取された無培養のメタゲノム配列に見られるＣＲＩＳＰＲシステムに関連する大型のシングルエフェクターを表す（表３）。Ｃａｓ１２ｉと称されるＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）エフェクターには、表３及び表４に詳説する例示的タンパク質が含まれる。これらのシステムの例示的ダイレクトリピート配列を表５に示す。
ＮＣＢＩ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＧｅｎＢａｎｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１，Ｄ３６－４２；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＲｅｆＳｅｑ）：ｃｕｒｒｅｎｔ
ｓｔａｔｕｓ，ｎｅｗ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｐｏｌｉｃｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０，Ｄ１３０－１３５）、ＮＣＢＩ全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）、及びＤＯＥ ＪＧＩ統合微生物ゲノム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ）（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＩＭＧ：ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｇｅｎｏｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０，Ｄ１１５－１２２）からゲノム及びメタゲノム配列をダウンロードして集約することにより、２９３，９８５個の推定ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのデータベースを構築し、その範囲内で本発明者らは新規ヌクレアーゼシステムを同定した。このパイプラインエンジニアリング手法は、中間段階で最小限のフィルタリングを実施することにより新規ＣＲＩＳＰＲエフェクター発見のための探索空間を拡張し、バイアスを低減する。
容易にアラインメント可能なＣａｓ１２タンパク質群の多重アラインメントから抽出された配列プロファイルを比較することにより、図１Ａ～図１Ｂに示す分類ツリーが作成された。プロファイル間比較は、ＨＨｓｅａｒｃｈを用いて実施した（Ｓｏｅｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＨＭＭ－ＨＭＭ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．２１，９５１－９６０）；２つのプロファイル間のスコアを自己スコアの最小値によって規格化し、自然対数目盛上の距離行列に変換した。この距離行列からＵＰＧＭＡデンドログラムを作成し直した。２つの距離単位の深さにおけるツリー（自己スコアと比べたｅ－２Ｄ＝０．０２のペアワイズＨＨｓｅａｒｃｈスコアに対応する）が、典型的にはプロファイル類似度を確実に復元し、サブタイプ分類の指針として働き得る（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
図２Ａ及び図２Ｂに示すＣａｓ１２ｉのドメイン構成は、エフェクターがＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの活性触媒残基を含むことを指示している。加えて、図３に示される、Ｖ－Ｉ型遺伝子座について最も頻出するダイレクトリピートの予測二次構造は、多くの例示的Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡで保存されているステム－ループ構造を指示している。
実施例２：エンジニアリングされたＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのインビボ細菌検証（図４Ａ～図１０Ｂ）
Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分を同定したことで、本発明者らは機能検証に２つのシステムを選択し、一方はＣａｓ１２ｉ１と称されるエフェクターを含むもの（配列番号３）、及び他方はＣａｓ１２ｉ２と称されるエフェクターを含むもの（配列番号５）であった。
方法
遺伝子合成及びオリゴライブラリクローニング
ＣＲＩＳＰＲエフェクター、アクセサリータンパク質の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化タンパク質配列をｐＥＴ－２８ａ（＋）（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にクローニングしてエフェクタープラスミドを作成した。Ｃａｓ遺伝子（１５０ｎｔの末端ＣＤＳコード配列を含む）又はＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する非コード配列をｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に合成して（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、非コードプラスミドを作成した（図４Ａ）。配列表にある指示されるプライマーを使用した部位特異的突然変異誘発により、エフェクター突然変異体（例えば、Ｄ５１３Ａ又はＡ５１３Ｄ）プラスミドをクローニングした：配列変化は初めにＰＣＲ断片に導入し、次にＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックス又はＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎアセンブリマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造者の指示に従い使用してそれらをプラスミドにアセンブルし直した。
プール型スペーサーライブラリについて、本発明者らは初めに、「リピート－スペーサー－リピート」配列の最小ＣＲＩＳＰＲアレイを発現するようにオリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＯＬＳ）プール（Ａｇｉｌｅｎｔ）を計算的に設計した。「リピート」エレメントは、エフェクターに関連するＣＲＩＳＰＲアレイに見られるコンセンサスダイレクトリピート配列に由来したものであり、「スペーサー」は、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子を標的化する約８，９００個の配列、又は配列を標的化しない陰性対照に相当する。スペーサー長さは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られるスペーサー長さの最頻値によって決定した。最小ＣＲＩＳＰＲアレイに隣接して、より大規模なオリゴ合成プールからの特異的ライブラリの増幅を実現するユニークなＰＣＲプライミング部位があった。
本発明者らは次に、最小ＣＲＩＳＰＲアレイライブラリをエフェクタープラスミドにクローニングしてエフェクタープラスミドライブラリを作成した。本発明者らは、ユニークな分子識別子である隣接制限部位、及びＰＣＲ（ＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２ｘ ＰＣＲマスターミックス）を用いたオリゴライブラリ上でのアレイ発現用のＪ２３１１９プロモーターを付加し、次にＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、エフェクターの完全なプラスミドライブラリをそのターゲティングアレイとアセンブルした。これが、スクリーンの「入力ライブラリ」に相当した。
インビボ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）スクリーン
本発明者らは、特に指示されない限りエレクトロコンピテントなＥ．ｃｌｏｎｉ ＥＸＰＲＥＳＳ ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してインビボスクリーンを実施した。コンピテント細胞をエフェクタープラスミド及び／又は非コードで共形質転換した（図４Ｂ）。１．０ｍｍキュベットで製造者のプロトコルに従いＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を用いて細胞を「入力ライブラリ」で電気穿孔した。クロラムフェニコール（Ｆｉｓｈｅｒ）及びカナマイシン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）の両方を含有するバイオアッセイプレートに細胞をプレーティングし、１１時間成長させた後、本発明者らは近似コロニー数を推定することにより十分なライブラリ表現を確認し、細胞を回収した。
ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して回収した細胞からプラスミドＤＮＡ画分を抽出することにより「出力ライブラリ」を作成し、一方、回収した細胞をＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（登録商標）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中で溶解させた後、続いてＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して抽出することにより全ＲＮＡ＝１７ｎｔを回収した。
入力及び出力ライブラリの両方に対し、エフェクタープラスミドライブラリのＣＲＩＳＰＲアレイカセットに隣接した且つＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングケミストリーに適合性のあるバーコード及びハンドルを含むカスタムのプライマーを使用してＰＣＲを実施することにより、ＤＮＡ枯渇シグナル用の次世代シーケンシングライブラリを調製した。次にこのライブラリを規格化し、プールし、Ｎｅｘｔｓｅｑ ５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードして、エフェクターの活性を評価した。
細菌スクリーンシーケンシング解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用してスクリーン入力及び出力ライブラリの次世代シーケンシングデータをデマルチプレックス化した。各試料について得られたｆａｓｔｑファイル中のリードが、スクリーニングプラスミドライブラリ用のＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを含んだ。ＣＲＩＳＰＲアレイのダイレクトリピート配列を用いてアレイの向きを決定し、スペーサー配列をソース（ｐＡＣＹＣ１８４又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子）又は陰性対照配列（ＧＦＰ）にマッピングすることにより対応する標的を決定した。各試料について、所与のプラスミドライブラリ中の各ユニークなアレイエレメントのリード総数（ｒａ）をカウントし、以下のとおり規格化した：（ｒａ＋１）／全てのライブラリアレイエレメントの総リード数。所与のアレイエレメントに関する規格化出力リード数を規格化入力リード数で除すことにより、枯渇スコアを計算した。
酵素活性及び細菌細胞死を生じさせる特異的パラメータを同定するため、本発明者らは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて入力及び出力プラスミドライブラリのＰＣＲ産物中における個々のＣＲＩＳＰＲアレイ（即ち、リピート－スペーサー－リピート）の表現を定量化し、比較した。本発明者らは、各ＣＲＩＳＰＲアレイについての枯渇倍数を、規格化入力リード数を規格化出力リード数（ゼロ除算を回避するため１を足した）で除したものとして定義した。アレイは、枯渇倍数が３より大きい場合に「強力に枯渇した」と見なした。バイオロジカルレプリケートにわたるアレイ枯渇倍数を計算する際には、本発明者らは全実験にわたる所与のＣＲＩＳＰＲアレイについての最大枯渇倍数値をとった（即ち、強力に枯渇したアレイは、全てのバイオロジカルレプリケートで強力に枯渇していなければならない）。本発明者らは、各スペーサー標的について、アレイ枯渇倍数及び以下の特徴：標的鎖、転写物ターゲティング、ＯＲＩターゲティング、標的配列モチーフ、フランキング配列モチーフ、及び標的二次構造を含む行列を作成した。本発明者らは、この行列中の異なる特徴がＶ－Ｉ型システムについての標的枯渇を説明する程度を調べ、それにより単一のスクリーン内で機能パラメータの広範な調査を得た。
結果
図５Ａ～図５Ｄは、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）必須遺伝子を標的化するＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２についての強力に枯渇した標的の位置を示す。注目すべきことに、強力に枯渇した標的の位置は、潜在的標的空間全体にわたって分散しているように見える。
本発明者らは、Ｖ－Ｉ型エフェクター、Ｃａｓ１２ｉ１（１０９４ａａ）、及びＣａｓ１２ｉ２（１０５４ａａ）のｄｓＤＮＡ干渉活性が、ＲｕｖＣ Ｉモチーフ中の保存されたアスパラギン酸の突然変異によって消失することを見出した（図６Ａ、及び図６Ｂ）。Ｃａｓ１２ｉのＲｕｖＣ依存性ｄｓＤＮＡ干渉活性は、ＣＲＩＳＰＲアレイ又はｃａｓ遺伝子に隣接する非コード配列に要件がないこと示し（図７Ａ及び図７Ｂ）、最小Ｖ－Ｉ干渉モジュールがエフェクター及びｃｒＲＮＡのみを含むことが示される（図８Ａ及び図８Ｂ）。
インビボスクリーンからの強力に枯渇したアレイに対応する標的隣接配列の分析は、Ｃａｓ１２ｉによるｄｓＤＮＡ干渉がＰＡＭ依存性であることを示している。具体的には、本発明者らは、Ｃａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２が両方とも５’ＴＴＮ ＰＡＭ優先性を示したことを見出した（図９Ａ～図９Ｂ及び図１０Ａ～図１０Ｂ）。これらの結果は、コンパクトなＣａｓ１２ｉエフェクターが自律的ＰＡＭ依存性ｄｓＤＮＡ干渉能力を有することを示唆している。
実施例３：エンジニアリングされたＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの生化学的機構の特徴付け（図１１Ａ～図１３、図１５～図１７Ｂ）
Ｃａｓ１２ｉはインビボでプレｃｒＲＮＡをプロセシングする
Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムについてのｃｒＲＮＡバイオジェネシスを調べるため、本発明者らは、細菌スクリーンからのＣａｓ１２ｉ及び最小ＣＲＩＳＰＲアレイライブラリを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からスモールＲＮＡを精製し、シーケンシングした。図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＲＮＡ－シーケンシングリードの累積を示し、それぞれＣａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２成熟ｃｒＲＮＡの強力なコンセンサス形態、並びにスペーサー長さの分布が示される。観察された最も一般的なスペーサー長さは２１であり、長さのばらつきは１６ｎｔ～２２ｎｔであった。
Ｃａｓ１２ｉ１を含むＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムについて、成熟ｃｒＲＮＡは５’－ＡＵＵＵＵＵＧＵＧＣＣＣＡＵＣＧＵＵＧＧＣＡＣ［スペーサー］－３’（配列番号１００）の形態をとることができる。
Ｃａｓ１２ｉ２を含むＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムについて、成熟ｃｒＲＮＡは５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧ［スペーサー］－３’（配列番号１０１）の形態をとることができる。
Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｐｌｕｓ ｗｉｔｈ ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、回収した細菌から全ＲＮＡを抽出することにより、インビボ細菌スクリーンからのスモールＲＮＡのシーケンシングを実施した。Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａを使用してリボソームＲＮＡを除去した後、続いてＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キットを使用してクリーンアップした。得られたリボソームＲＮＡ枯渇全ＲＮＡをＡＴＰ不含Ｔ４ ＰＮＫで３時間処理して３’－Ｐ末端をエンリッチし、その後、ＡＴＰを加え、反応物を更に１時間インキュベートして５’－ＯＨ末端をエンリッチした。次に試料をカラム精製し、ＲＮＡ ５’ポリホスファターゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）とインキュベートし、再びカラム精製した後、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して次世代シーケンシング用に調製した。このライブラリをＮｅｘｔｓｅｑ ５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でのペアエンドシーケンシングにかけ、得られたペアエンドアラインメントをＧｅｎｅｉｏｕｓ １１．０．２（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ）を用いて分析した。
Ｃａｓ１２ｉエフェクター精製
エフェクターベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に形質転換し、Ｔ７プロモーター下で発現させた。形質転換細胞を初めに３ｍＬルリアブロス（Ｓｉｇｍａ）＋５０ｕｇ／ｍＬカナマイシン中で一晩成長させた後、続いて１Ｌのテリフィックブロス培地（Ｓｉｇｍａ）＋５０ｕｇ／ｍＬカナマイシンに１ｍＬの一晩培養物を接種した。１～１．５のＯＤ６００になるまで細胞を３７℃で成長させて、次に０．２ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導した。次に培養物を２０℃で更に１４～１８時間成長させた。培養物を回収し、遠心によってペレット化し、次に８０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１４ｍＭ ２－メルカプトエタノール、及び５％グリセロール）＋プロテアーゼ阻害薬（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。細胞破壊器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ）で細胞を溶解させて、次に４℃において２８，０００×ｇで２０分間の遠心を２回行うことによりライセートを清澄化した。このライセートを５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードし、次にＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって１０ｍＭから２５０ｍＭへのイミダゾール勾配で精製した。低塩濃度緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．８、５００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１４ｍＭ ２－メルカプトエタノール、及び５％グリセロール）中でＣａｓ１２ｉ１を精製した。精製後、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流し、適切なサイズのタンパク質を含有する画分をプールし、１０ｋＤ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心ユニットを用いて濃縮した。Ｑｕｂｉｔタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、タンパク質濃度を決定した。
Ｃａｓ１２ｉはインビトロでプレｃｒＲＮＡをプロセシングする
Ｃａｓ１２ｉ１が自律的ｃｒＲＮＡバイオジェネシス能力を有するかどうかを決定するため、本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製したエフェクタータンパク質を、最小ＣＲＩＳＰＲアレイ（リピート－スペーサー－リピート－スペーサー－リピート）から発現するプレｃｒＲＮＡと共にインキュベートした。本発明者らは、精製したＣａｓ１２ｉ１が、インビボスモールＲＮＡｓｅｑから同定される成熟ｃｒＲＮＡと一致する断片へとプレｃｒＲＮＡをプロセシングすることを観察し、Ｃａｓ１２ｉ１が自律的プレｃｒＲＮＡプロセシング能力を有することが示唆された（図１２）。
Ｃａｓ１２ｉ１のプレｃｒＲＮＡプロセシングアッセイを切断緩衝液中１００ｎＭの最終プレｃｒ－ＲＮＡ濃度において３７℃で３０分間実施した。この反応は、Ｃａｓ１２ｉに最適化した切断緩衝液（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で実施した。１ｕｇ／ｕＬのプロテイナーゼＫ（Ａｍｂｉｏｎ）を加えて反応をクエンチし、３７℃で１５分間インキュベートした。反応物に５０ｍＭ ＥＤＴＡを加えた後、等容積の２×ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、６５℃で３分間変性させた。１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で試料を分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で５分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ（Ｂｉｏｒａｄ）で画像化した。標識したプレｃｒＲＮＡを含有するゲルを初めにＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘスキャナ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で画像化した後、ＳＹＢＲ染色した。
強力に枯渇したアレイを使用したＣａｓ１２ｉ１ ＤＮＡ操作
Ｃａｓ１２ｉ１の干渉活性機構を探るため、本発明者らは、インビボネガティブ選択スクリーンから強力に枯渇したＣＲＩＳＰＲアレイ配列を選択し、ＤＲ－スペーサー－ＤＲ－スペーサー－ＤＲ配列を有するプレｃｒＲＮＡを作成した。プレｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡの第２のスペーサーに相補的な標的配列を含有する１２８ｎｔ ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質へとＣａｓ１２ｉ１を標的化するように設計した。本発明者らは、エフェクタータンパク質とプレｃｒＲＮＡとからなるＣａｓ１２ｉ１二元複合体が６２．５ｎＭ複合体濃度での飽和まで１００ｎＭの標的ｓｓＤＮＡを切断したことを観察した（図１３）。切断されたｓｓＤＮＡから短い断片又は単一ヌクレオチドに至るまでの更なる分解が高い複合体濃度で観察されたが、これは、二元複合体がｓｓＤＮＡ標的に結合することにより活性化されたコラテラルｓｓＤＮＡ切断を示唆するものである（図１３）。
Ｃａｓ１２ｉのｄｓＤＮＡ干渉活性を探るため、本発明者らは、非スペーサー相補鎖上に５’末端標識を含む標的ｄｓＤＮＡ基質へとＣａｓ１２ｉ１二元複合体を標的化した。ｄｓＤＮＡ切断及びニッキング活性の両方を包括的に評価するため、得られたｄｓＤＮＡ切断反応物を異なる分析用の３つの画分に分割した。最初の２つの画分はクエンチし、それぞれ変性又は非変性ゲル電気泳動条件によって分析した。３つ目の画分は０．１ＵのＳ１ヌクレアーゼで処理して任意のｄｓＤＮＡニックを二本鎖切断に変換し、クエンチし、非変性ゲル電気泳動によって分析した。
本発明者らは変性条件下で用量依存的切断を観察したが、これは、標的ニッキング又はｄｓＤＮＡ切断のいずれかを示唆するものである（図１５）。Ｓ１ヌクレアーゼ処理のない非変性条件下では、本発明者らは、入力ｄｓＤＮＡよりもやや低い電気泳動移動度で移動した一次産物の用量依存的増加を観察したが、これは、ニッキングされたｄｓＤＮＡ産物を示唆するものである（図１６）。これらの産物をＳ１ヌクレアーゼとインキュベートすると、上方にシフトしたバンドがより小さいｄｓＤＮＡ産物に変換されたが、これは、ニッキングされたｄｓＤＮＡから二本鎖切断へのＳ１の媒介による変換を指示するものである（図１６）。本発明者らはまた、高い濃度及び長いインキュベーション時間でｄｓＤＮＡ切断産物が少ないことも観察しており、Ｃａｓ１２ｉ１が、標的ｄｓＤＮＡのスペーサー相補（「ＳＣ」）鎖及び非スペーサー相補（「ＮＳＣ」）鎖を実質的に異なる効率で切断するｄｓＤＮＡヌクレアーゼであることが示される（図１７Ａ）。
ｄｓＤＮＡ基質のスペーサー相補鎖の５’標識を伴うニッキング活性の観察は、Ｃａｓ１２ｉ１が、ｃｒＲＮＡ－標的ＤＮＡハイブリッドの逆のＤＮＡ鎖を優先的にニッキングすることを示唆している。Ｃａｓ１２ｉ１によるＤＮＡ鎖切断のこのバイアスを検証するため、本発明者らは、スペーサー相補鎖の５’末端又は非スペーサー相補鎖の５’末端のいずれかをＩＲ８００色素で標識したｄｓＤＮＡ基質を作成した。低濃度のエフェクター複合体では、本発明者らは、ＤＮＡ二重鎖のＮＳＣ鎖の切断のみを観察した一方、高濃度のエフェクター複合体では、ＮＳＣ鎖及びＳＣ鎖の両方の切断が観察された（図１７Ａ～図１７Ｂ）。全ての核酸産物を標識するＳＹＢＲ染色と、ＩＲ８００色素を使用した鎖特異的標識とを比較すると、全体的な切断産物蓄積と比べた鎖産物形成比率の差が明らかになる。これらの結果は、順序立った一連のイベントがｄｓＤＮＡ干渉につながり、従ってＣａｓ１２ｉ１二元複合体は初めにＮＳＣ鎖をニッキングし、次にＳＣ鎖をより低い効率で切断してｄｓＤＮＡ切断を生じさせることを示唆している。まとめると、これらの知見は、Ｃａｓ１２ｉが、自律的プレｃｒＲＮＡプロセシング、ｓｓＤＮＡ標的及びコラテラル切断、及びｄｓＤＮＡ切断の能力を有するエフェクターであることを示している。この一連の触媒活性は、非スペーサー相補鎖切断に顕著に偏っているため優先的なｄｓＤＮＡニッキングが生じることを除いては、Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂと良く似ている。
ｃｒＲＮＡ及び基質ＲＮＡ調製
ｃｒＲＮＡ及び基質ＲＮＡ用の一本鎖ＤＮＡオリゴ鋳型をＩＤＴに注文した。ＮＥＢＮＥＸＴ Ｈｉｆｉ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して基質ＲＮＡ及びプレｃｒＲＮＡ鋳型をＰＣＲ増幅することにより、二本鎖インビトロ転写（ＩＶＴ）鋳型ＤＮＡを作成した。Ｔ７プライマーを鋳型とアニーリングした後、続いてＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して伸長することにより、成熟ｃｒ－ＲＮＡ用の二本鎖ＤＮＡ鋳型を作成した。アニーリングは、９５℃で５分間、続いて－５℃／分の低下で４℃までインキュベートすることにより実施した。インビトロ転写は、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ高収率ＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｄｓＤＮＡ鋳型をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと３７℃で３時間インキュベートすることにより実施した。インキュベーション後、ＩＶＴ試料をＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理し、次にＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。ＩＶＴから作成された成熟ｃｒ－ＲＮＡを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＲＮＡ５’－ポリホスファターゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）によって３７℃で２時間処理して、それぞれ５’－ヒドロキシル又は５’－一リン酸を作成した後、続いてＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でクリーンアップした。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって濃度を測定した。
生化学的特徴付けＣａｓ１２ｉに使用されるプレｃｒＲＮＡ配列は表６に含まれる。ｃｒＲＮＡの調製用オリゴヌクレオチド鋳型及びプライマーは表９に含まれる。
ＩＲ－８００標識基質ＲＮＡ及びＤＮＡの調製
ＩＶＴからのＲＮＡ基質を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって３７℃で３０分間処理することにより５’－三リン酸を５’末端ヒドロキシル基に変換し、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。５’ＥｎｄＴａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）でＤＮＡ及びＲＮＡ基質の５’末端ヒドロキシル基にチオール末端基を付加し、次に基質をＩＲＤｙｅ ８００ＣＷマレイミド（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット又はＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して基質を精製した。非標的（非スペーサー相補的）ｓｓＤＮＡ鎖を標識し、プライマーとアニーリングして、次にＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって２５℃で１５分間伸長させることにより、標識されたｄｓＤＮＡ基質を作成した。これらの基質をＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって濃度を測定した。
Ｃａｓ１２ｉの生化学的特徴付けに使用されるＲＮＡ及びＤＮＡ基質配列は表７及び表８に含まれる。
Ｃａｓ１２ｉによる標的切断アッセイ
ｓｓＤＮＡ：最適化した切断緩衝液（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中でｓｓＤＮＡによるＣａｓ１２ｉ標的切断アッセイを実施した。１：２モル濃度比のＣａｓ１２ｉ：プレｃｒＲＮＡを３７℃で１０分間インキュベートし、続いて氷上に移すことにより、二元複合体を形成した。更なる複合体希釈は全て、タンパク質：ＲＮＡ比を一定に保ちながら氷上で行った。この複合体を１００ｎＭ ＩＲ８００標識基質に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。反応物をＲＮアーゼカクテル及びプロテイナーゼＫで処理し、上記のとおり分析した。
ｄｓＤＮＡ：最適化した切断緩衝液中にｄｓＤＮＡ標的切断アッセイを３７℃で１時間セットアップした。上記に記載したとおり二元複合体を形成し、１００ｎＭ ｄｓＤＮＡ基質に加えた。初めに反応物を３７℃で１５分間のインキュベーションによってＲＮアーゼカクテルで処理した。次に、これを３７℃で１５分間のインキュベーションによってプロテイナーゼＫで処理した。ｄｓＤＮＡ切断産物を検出するため、この反応物を先述のとおり１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで分析した。Ｃａｓ１２ｉのニッキング活性を検出するため、反応物をプロテイナーゼＫ処理後にＳＰＲＩ精製し、３つの画分に分割した。１つの画分は、上記に記載したとおり１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで分析した。もう１つの画分は５×ｈｉ－ｄｅｎｓｉｔｙ ＴＢＥ試料緩衝液と混合し、非変性４～２０％ＴＢＥゲルで分析することにより、ニッキングされたｄｓＤＮＡ産物を検出した。最後の画分は、０．０１Ｕ／ｕＬのＳ１ヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と５０℃で１時間インキュベートしてニックを二本鎖切断に変換し、続いて５×ｈｉ－ｄｅｎｓｉｔｙ ＴＢＥ試料緩衝液と混合し、非変性４～２０％ＴＢＥゲルで分析した。ゲルは全て、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘスキャナで画像化した後、５分間ＳＹＢＲ染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ｉｍａｇｅｒで画像化した。
ニッキングされた鎖を同定するため、標的鎖（ｃｒＲＮＡに相補的）又は非標的鎖（非スペーサー相補的、ｃｒＲＮＡと同じ配列）のいずれかを標識することによりｄｓＤＮＡを調製した。切断反応を記載されるとおり実施した。次に標識された鎖を対応するプライマーとアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって２５℃で１５分間伸長させた。次にＳＰＲＩ精製を用いてｄｓＤＮＡ基質を精製した。
実施例４：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの迅速評価のためのインビトロプール型スクリーニング（図２０～図２５）
本明細書に記載されるとおり、インビトロプール型スクリーニングは、生化学的評価の実施に効率的なハイスループット方法として働く。概要として、本発明者らはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのインビトロ再構成から始める（図２０）。一実施形態では、１つ又は複数のエフェクタータンパク質の発現をドライブするＴ７－ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するｄｓＤＮＡ鋳型を使用し、且つ反応用のタンパク質を作製するインビトロ転写及び翻訳試薬を使用してエフェクタータンパク質を作製する。別の実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、可能な全てのＲＮＡの向きを調べるためＰＣＲを用いてトップ鎖又はボトム鎖のいずれかの転写方向に付加されたＴ７プロモーター配列を含む。図２０に示されるとおり、ａｐｏ型はエフェクターのみを含み、二元型はエフェクタータンパク質とＴ７ 転写物最小ＣＲＩＳＰＲアレイとを含み、二元＋ｔｒａｃｒＲＮＡ型はインキュベーション用に複合体に任意のＴ７転写ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントを加える。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのヌクレオチド鎖切断活性が、アッセイされる主要な生化学的活性である。図２１は、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質の一形態を示し、ここで標的配列は両側に６縮重塩基が隣接して、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ切断活性をゲート制御し得る可能なＰＡＭ配列のプールを作り出す。ＰＡＭ配列の他、基質は、基質ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡを選択的にエンリッチする下流次世代シーケンシングライブラリ調製プロトコルを促進するとともに切断産物のマッピングを促進するユニーク配列を提供するように設計された５’及び３’基準マークを含む。一実施形態において、ｄｓＤＮＡ基質は、ショートＤＮＡプライマー及びＤＮＡポリメラーゼＩを用いた５’から３’方向への第２鎖合成によって生成される。最小ＣＲＩＳＰＲアレイにおける異なる標的のプール、並びに異なるｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ配列のライブラリを用いて同様の反応を実施することができる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ切断反応は、予め形成されたＡｐｏ／二元／二元－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体をターゲティング基質又は非ターゲティング基質のいずれかと混合し、インキュベートすることによって実施される。ゲル電気泳動などの他の方法が可能であるが、最高の感度及び塩基対分解能による切断捕捉に有用な実施形態は、エフェクター複合体とのインキュベーション後のｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ基質の次世代シーケンシングである。図２２は、ｓｓＤＮＡ基質のエンリッチメント用ライブラリ調製を説明する概略図である。基準マーク内にある十分に定義された配列にプライマーをアニーリングすることにより、第２鎖合成及び末端修復が起こり、カットされているｓｓＤＮＡ及びカットされていないｓｓＤＮＡの両方に相当するｄｓＤＮＡ断片が作製される。以降、この新しく形成されたｄｓＤＮＡ分子が、アダプターライゲーションの基質であり、その後、ライゲーションアダプターに相補的な１つのプライマー（Ｉ５／Ｐ５）と、元のｓｓＤＮＡ基質の３’基準に相補的なもう１つ（Ｉ７／Ｐ７）とを使用して選択的ＰＣＲが実施される。これにより、最終的には、図２４Ａに示されるとおりの完全長並びに切断され分解したｓｓＤＮＡ産物の両方を含むシーケンシングライブラリが作製される。ｄｓＤＮＡリードアウトＮＧＳライブラリ調製は、プライマーアニーリング及び第２鎖合成の必要なしに始まり、そのため末端修復及び続くアダプターライゲーションを直接実施することができる。図２３は、ｓｓＤＮＡ調製と同様に、切断された／分解した断片並びに切断されていない断片の両方を標識するライブラリ調製の一般的な概要を説明する。注目すべきことに、ｄｓＤＮＡ切断断片のいずれの末端も、ＰＣＲプライマーの選択に基づきエンリッチすることができる。図２４Ａに示される一実施形態では、リードアウト用のｄｓＤＮＡ操作次世代シーケンシングライブラリは、完全長基質又は切断基質の５’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び基質の３’基準配列に相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーで調製することができる。図２４Ｂに示される一実施形態では、リードアウト用のＤＮＡ操作次世代シーケンシングライブラリは、基質の５’基準配列に相補的な（及びＩ５／Ｐ５配列を含有する）第１のプライマー及び完全長基質又は切断基質の３’末端にライゲートされたハンドルに相補的な（及びＩ７／Ｐ７配列を含有する）第２のプライマーで調製することができる。それぞれ図２５Ａ～図２５Ｂに図示されるとおり、ＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ操作実験から得られたＮＧＳリードから標的長さ及び基質長さを抽出することができる。抽出された標的長さ及び基質長さを用いて、ＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡニッキング又は切断の存在を調べることができる。
実施例５：Ｖ－Ｉ１型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのｄｓＤＮＡ切断活性の特徴付け（図２６～図３２）
Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分を計算的に同定したことで、本発明者らは、エフェクターＣａｓ１２ｉ１を含むＶ－Ｉ１型システムからの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断活性を調べた。
ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖発現によるｃｒＲＮＡを有する複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ１により、図２６Ａ～図２６Ｂに示されるとおり、ａｐｏ（エフェクターのみ）対照に存在しないトランケート型標的長さ集団が生じた。５’ライゲーションアダプターを使用して、且つ３’基準に関して選択して調製したライブラリ（図２４Ａに図示されるとおり）は、標的配列内の＋２４位にＡｐｏ対照に存在しない切断産物を示した。この結果は、ＰＡＭから相対的に＋２４ヌクレオチドと＋２５ヌクレオチドとの間での非標的ｄｓＤＮＡ鎖又はｄｓＤＮＡの両方の鎖のいずれかのニッキングを示している。標的長さ分析は＋２４にピークを示すことから、ヌクレオチド＋２４と＋２５との間での標的のトランケーションが示される（図２７Ａ）。このトランケート型標的配列集団は基質長さと一致することから、標的配列のヌクレオチド＋２４と＋２５との間での非標的ｄｓＤＮＡ鎖の切断が示される（図２８Ａ）。
３’ライゲーションアダプターを使用して、且つ５’基準に関して選択して調製したライブラリ（図２４Ｂに図示されるとおり）は、標的配列内の－９位（２８ｎｔ標的を考慮すると＋１９）に対照に存在しない切断産物を示した。この結果は、ＰＡＭから相対的に＋１９ヌクレオチドと＋２０ヌクレオチドとの間における標的ｄｓＤＮＡ鎖又はｄｓＤＮＡの両方の鎖のいずれかのニッキングを示している。標的長さ分析はＰＡＭから－９ヌクレオチド（２８ｎｔ完全長標的）にピークを示すことから、ヌクレオチド＋１９と＋２０との間での標的のトランケーションが示される（図２７Ｂ）。このトランケート型標的配列集団は基質長さと一致することから、標的配列のヌクレオチド＋１９と＋２０との間での標的ｄｓＤＮＡ鎖の切断が示される（図２８Ｂ）。
ＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間の非標的鎖切断を示す基質に関する配列モチーフ分析から、Ｃａｓ１２ｉ１について標的配列の左の５’ＴＴＮ ＰＡＭモチーフが明らかになった（図２９）。Ｃａｓ１２ｉ１標的の右側については、ＰＡＭ配列要件は認められなかった。まとめると、Ｃａｓ１２ｉ１のインビトロスクリーニングは、ＴＴＮ ＰＡＭから相対的に非標的鎖の＋２４／＋２５ヌクレオチド間における優勢なニッキングを示し、これらの産物のかなりの割合が、ＰＡＭから相対的に＋１９／＋２０ヌクレオチド間での標的鎖の切断によって５ｎｔ ３’オーバーハンーバーハングを伴う二本鎖切断に変換される（図３０）。
トップ鎖発現による非標的ｃｒＲＮＡを有する複合体中のＣａｓ１２ｉ１のターゲティングによっては、相対的なｄｓＤＮＡの操作は起こらなかったことから、Ｃａｓ１２ｉ１切断特異性がｃｒＲＮＡスペーサーによって付与されることが示される（図３１Ａ～図３１Ｂ）。Ｃａｓ１２ｉ１は、ｄｓＤＮＡ基質を標的化するボトム鎖発現によるｃｒＲＮＡの存在下では切断活性がないことを示しており、活性なＣａｓ１２ｉ１複合体の形成にはトップ鎖の向きのｃｒＲＮＡが必要であることが示される（図３２Ａ～図３２Ｂ）。
実施例６：Ｖ－Ｉ２型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのｄｓＤＮＡ切断活性の特徴付け（図３３～図３９）
Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分を計算的に同定したことで、本発明者らは、エフェクターＣａｓ１２ｉ２を含むＶ－Ｉ２型システムからの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断活性を調べた。
ｄｓＤＮＡを標的化するトップ鎖発現によるｃｒＲＮＡを有する複合体中のＩＶＴＴ発現によるＣａｓ１２ｉ２により、図３３Ａ～図３３Ｂに示されるとおり、ａｐｏ（エフェクターのみ）対照に存在しないトランケート型標的長さ集団が生じた。５’ライゲーションアダプターを使用して、且つ３’基準に関して選択して調製したライブラリ（図２４Ａに図示されるとおり）は、標的配列内の＋２４位にＡｐｏ対照に存在しない切断産物を示した。この結果は、ＰＡＭから相対的に＋２４ヌクレオチドと＋２５ヌクレオチドとの間における非標的ｄｓＤＮＡ鎖又はｄｓＤＮＡの両方の鎖のいずれかのニッキングを示している。標的長さ分析は＋２４にピークを示すことから、ヌクレオチド＋２４と＋２５との間での標的のトランケーションが示される（図３４Ａ）。このトランケート型標的配列集団は基質長さと一致することから、標的配列のヌクレオチド＋２４と＋２５との間での非標的ｄｓＤＮＡ鎖の切断が示される（図３５Ａ）。
３’ライゲーションアダプターを使用して、且つ５’基準に関して選択して調製したライブラリ（図３３Ｂに図示されるとおり）は、標的配列内の－７位（３１ｎｔ標的を考慮すると＋２４）にＡｐｏ対照に存在しない切断産物を示した。この結果は、ＰＡＭから相対的に＋２４ヌクレオチドと＋２５ヌクレオチドとの間での標的ｄｓＤＮＡ鎖又はｄｓＤＮＡの両方の鎖のいずれかのニッキングを示している。標的長さ分析はＰＡＭから－７ヌクレオチド（２８ｎｔ完全長標的）にピークを示すことから、ヌクレオチド＋２４と＋２５との間での標的のトランケーションが示される（図３４Ｂ）。このトランケート型標的配列集団は基質長さと一致することから、標的配列のヌクレオチド＋２４と＋２５との間での標的ｄｓＤＮＡ鎖の切断が示される（図３５Ｂ）。
ＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間の非標的鎖切断を示す基質に関する配列モチーフ分析から、Ｃａｓ１２ｉ２について標的配列の左の５’ＴＴＮ ＰＡＭモチーフが明らかになった（図３６）。Ｃａｓ１２ｉ２標的の右側についてはＰＡＭ配列要件は認められなかった。まとめると、Ｃａｓ１２ｉ２のインビトロスクリーニングは、ＴＴＮ ＰＡＭから相対的に非標的鎖の＋２４／＋２５ヌクレオチド間における優勢なニッキングを示し、これらの産物のかなりの割合が、ＰＡＭから相対的に＋２４／＋２５ヌクレオチドの間での標的鎖の切断によって平滑末端型切断で二本鎖切断に変換される（図３７）。
トップ鎖発現による非標的ｃｒＲＮＡを有する複合体中のＣａｓ１２ｉ２のターゲティングによっては相対的なｄｓＤＮＡの操作は起こらなかったことから、Ｃａｓ１２ｉ２切断特異性がｃｒＲＮＡスペーサーによって付与されることが示される（図３８Ａ～図３８Ｂ）。Ｃａｓ１２ｉ２は、ｄｓＤＮＡ基質を標的化するボトム鎖発現によるｃｒＲＮＡの存在下では切断活性がないことを示しており、活性なＣａｓ１２ｉ２複合体の形成にはトップ鎖の向きのｃｒＲＮＡが必要であることが示される（図３９Ａ～図３９Ｂ）。
実施例７：ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムはインビトロでの遺伝子サイレンシングに使用することができる
新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性の迅速検証のため、インビボ遺伝子サイレンシング活性を模倣するインビトロ遺伝子サイレンシングアッセイ（図１８Ａ及び図１８Ｂ）を開発した。このアッセイは同時に、天然細胞環境外で種々の活性機構及び機能パラメータを偏りのない方法で評価することができる。
第一に、再構成したＩＶＴＴ（インビトロ転写及び翻訳）システムに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼコア酵素を補足して、遺伝子発現（タンパク質合成）がＴ７プロモーターから起こるのみならず、対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグマ因子が存在する限り任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターからも起こることを可能にした。
第二に、迅速なハイスループット実験法を促進するため、ＰＣＲ反応から生成された線状ＤＮＡ鋳型を直接使用した。これらの線状ＤＮＡ鋳型は、Ｖ－Ｉ型エフェクター、ＲＮＡガイド、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグマ因子２８をコードするものを含んだ。これらのＤＮＡ鋳型を再構成ＩＶＴＴ試薬とインキュベートすると、Ｖ－Ｉ型エフェクターとＲＮＡガイドとの共発現、及びＲＮＰ（リボ核タンパク質複合体）の形成が生じる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグマ因子２８はまた、以下に記載するとおりの続くＧＦＰ及びＲＦＰの発現のためにも発現させた。
第三に、標的基質として、シグマ因子２８プロモーターから発現するＧＦＰをコードする線状又はプラスミドＤＮＡを上記のインキュベーション反応に含めて、新規に合成されたＲＮＰが標的基質に直ちに到達するようにした。内部対照として、シグマ因子２８プロモーターから発現するＲＦＰをコードする非標的線状ＤＮＡもまた含めた。ＲＮＡポリメラーゼコア酵素単独は、十分なシグマ因子２８タンパク質が合成されるまでシグマ因子２８プロモーターを認識しない。このＧＦＰ及びＲＦＰ発現の遅延により、新規に合成されたＲＮＰがＧＦＰ標的基質に干渉することが可能となり、その結果ＧＦＰ発現が低下し、ＧＦＰ蛍光が枯渇する可能性がある。他方で、ＲＦＰ発現は負の影響を受けなかったことから、これはタンパク質合成及び蛍光測定の内部対照として働く。
本明細書に記載されるインビトロ遺伝子サイレンシングアッセイの特定の重要な利点としては、以下が挙げられる：
（１）モジュール性－再構成ＩＶＴＴは、個々に精製された成分からなる合成システムであり、アッセイを種々の制御及び活性のためにカスタム設計することが可能となる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの各成分は別個の線状ＤＮＡ鋳型にコードされるため、異なるエフェクター、エフェクター変異体、及びＲＮＡガイドの組み合わせの迅速なアッセイが可能となる；
（２）複雑性－このアッセイはＲＮＡ転写及びタンパク質合成に必須の成分を全て含むため、ＤＮＡ及びＲＮＡ切断、並びに転写依存性干渉など、多様な干渉機構を一回のワンポット反応で試験することが可能となる。このアッセイの動態学的蛍光リードアウトは、エンドポイント活性アッセイと比べて大幅に多いデータ点を提供する；
（３）感度－このアッセイはエフェクター及びＲＮＡガイド合成を基質干渉と組み合わせるため、新規に合成されたＲＮＰ（エフェクタータンパク質とＲＮＡガイドとのリボ核タンパク質複合体）が同じ反応内で基質と直ちに相互作用することが可能となる。別個の精製ステップがなく、従って潜在的に少量のＲＮＰでシグナルの生成に十分とすることが可能となる。更に、ＤＮＡ鋳型１個につき１００個を超えるＧＦＰタンパク質を生成することのできる組み合わされたＧＦＰ転写及び翻訳に起因して、ＧＦＰ発現の干渉が増幅される。
（４）効率－このアッセイは、ハイスループットプラットフォームと高度な適合性があるように設計される。そのモジュール性に起因して、一般に入手可能な液体ハンドリング機器によって９６、３８４及び１５３６ウェルフォーマットでアッセイの全ての成分を加えることができ、一般に入手可能なプレート蛍光光度計によって蛍光を測定することができる。
（５）関連性－このアッセイは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質がその天然細胞環境外でインビトロでエンジニアリングされるシステムにおいて転写及び翻訳時に遺伝子発現に干渉する能力を試験する。この遺伝子サイレンシングアッセイによって測定された高活性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターがまた、哺乳類細胞における遺伝子編集にも高度に効率的である可能性があり得る。
このアッセイは、プラスミドＤＮＡにコードされたＧＦＰを標的化するときに本明細書に示されるとおりのＣａｓ１２ｉエフェクター複合体が及ぼす遺伝子サイレンシング効果の測定に使用されている。複数のＶ－Ｉ型ＲＮＡガイド－１つがＧＦＰ配列の鋳型鎖に相補的なスペーサー配列を含み、もう１つがＧＦＰ配列のコード鎖に相補的なスペーサー配列を含むものが設計される。次に、Ｃａｓ１２ｉ１エフェクタータンパク質による遺伝子サイレンシングの程度を突然変異体Ｃａｓ１２ｉ１ Ｄ６４７Ａ、Ｃａｓ１２ｉ１ Ｅ８９４Ａ、及びＣａｓ１２ｉ１ Ｄ９４８Ａと比較した。
図１９Ａは、鋳型鎖に相補的なＲＮＡガイドと複合体化したときの４つの試験したＣａｓ１２ｉエフェクターの各々の枯渇倍数を示す。この場合、優先的にニッキングされる非標的鎖は、コード鎖である。Ｃａｓ１２ｉ１は４００分後に約２倍の枯渇倍数のＧＦＰ発現を示すが、３つの突然変異型の各々は、より低い枯渇程度を示す。
図１９Ｂは、コード鎖に相補的なＲＮＡガイドと複合体化したときの４つの試験したＣａｓ１２ｉ１エフェクターの各々の枯渇倍数を示す。この場合、優先的にニッキングされる非標的鎖は、鋳型鎖である。この構成では、ＲＮＡポリメラーゼが機能性ＲＮＡ転写物を生じさせる能力がＣａｓ１２ｉ１によって大幅に損なわれたように見え、Ｃａｓ１２ｉの場合には枯渇が４倍を超える。３つの突然変異型の遺伝子サイレンシング能力は大幅に低下しているように見える。
まとめると、図１９Ａ及び図１９Ｂに示されるデータは、コード鎖及び鋳型鎖の両方を標的化するＲＮＡガイドを使用するとき、このアッセイがＣａｓ１２ｉ１の遺伝子サイレンシング活性の検出に有効であることを示している。鋳型鎖を標的とするよりもコード鎖を標的としたときの方が大幅に高い枯渇となることから、Ｃａｓ１２ｉ１が非標的鎖を優先的にニッキングすることによってＧＦＰ発現に干渉することが示唆される。３つのＣａｓ１２ｉ１突然変異体はいずれも、仮想触媒残基（アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ））をアラニン（Ａ）に置換する。これらのＣａｓ１２ｉ１突然変異体のサイレンシング活性の低下は、単に結合というよりむしろ、ＤＮＡ鎖切断（ＤＮＡ ｓｔａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、Ｃａｓ１２ｉ１による遺伝子サイレンシング機構の根底にあることを更に裏付ける。
実施例８：ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは蛍光レポーターと共に核酸種の特異的検出に使用することができる
Ｃａｓ１２ｉタンパク質のヌクレアーゼ活性（即ち、ｃｒＲＮＡスペーサーに相補的な標的ｓｓＤＮＡ基質によって活性化される非特異的コラテラルＤＮアーゼ活性）により、こうしたエフェクターは核酸種の検出への使用に有望な候補となる。これらの方法の一部は既に記載されており（例えば、Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．“Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２
ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｏｃｔ １３；５３８（７６２４）：２７０－２７３を参照のこと）、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）、Ｃｈｅｎ
ｅｔ ａｌ．２０１８、及びＧｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎｄ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｗｉｔｈ Ｃａｓ１３，Ｃａｓ１２ａ，ａｎｄ Ｃｓｍ６”Ｓｃｉｅｎｃｅ １５ Ｆｅｂ ２０１８：ｅａａｑ０１７９）は、Ｃａｓ１３ａを使用した一般的なＲＮＡ検出原理について記載し（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６））、これは検出感度を増加させるための増幅及び更なるＣａｓ１３ａ酵素の最適化によって補足され（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７））、及び最近では、マルチプレックス化した核酸検出を検出感度の増加と共に実現するため、更なるＲＮＡ標的、オルソロガス及びパラロガス酵素、並びにＣｓｍ６アクチベーターを含めることにより補足されている（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８））。このツールキットにＣａｓ１２ｉを加えると、核酸検出のための直交性の活性の更なるチャンネルが提供される。
色素標識されたコラテラルＤＮＡが低い標的ｓｓＤＮＡ濃度で効率的に切断されたこと、及びバックグラウンドヌクレアーゼ活性が非ターゲティング基質で限られていたことを考えると、Ｃａｓ１２ｉ１のインビトロ生化学的活性は、それが高感度核酸検出への適用に有望であり得ることを示唆している（図１４）。Ｃａｓ１２ｉ１を高感度核酸検出適用に適合させるには、限定はされないが、コラテラル活性の高感度リードアウトに基質を最適化すること、及びスペーサーと標的基質との間の１塩基当たりのミスマッチ許容度を特定することを含め、幾つかのステップが必要である。
核酸検出に最適な基質の同定は、両方のＤＮＡ基質に対するＣａｓ１２ｉコラテラル活性の切断産物に関して次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を実施することにより情報を得てもよい。次世代シーケンシングライブラリへと調製されるのになおも十分なサイズである切断断片を生じさせるため、酵素濃度をタイトレートするか、又はインキュベーション時間を調整する必要があり得る。ＮＧＳデータは、酵素切断部位及び隣接塩基の優先性を明らかにする。Ｃａｓ１３ａ及びｂファミリー内の個々のエフェクターがＲＮＡ切断について異なるジヌクレオチド塩基優先性を有し、著しく異なる切断規模及び信号対雑音比を生じることが実証されている（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８））。従ってコラテラルＮＧＳデータは、Ｃａｓ１２ｉについての優先性に関してより良い洞察を実現する。Ｃａｓ１２ｉコラテラル切断のジヌクレオチド優先性を同定するための別個の実験的手法は、定義付けられた配列と比べてより幅広い配列空間を有するように、縮重Ｎが連続位置にあるコラテラルＤＮＡ基質を作製することである。ＮＧＳデータのライブラリ調製及び分析が同様に進めば、切断についての塩基優先性を同定し得る。優先性を確認するには、合成されたショートＤＮＡを５’末端及び３’末端のフルオロフォア／消光剤対と共に含有するコラテラル基質を切断反応に導入して信号対雑音比を評価することができる。Ｃａｓ１２ｉ１が長さ優先性を有するかどうかを決定するため、コラテラルＤＮＡ基質の長さに関して更なる最適化を行うことができる。
好ましい基質を同定したが、決定すべき別の重要なパラメータはＣａｓ１２ｉシステムのミスマッチ許容性であり、これは、一塩基対ミスマッチを区別する酵素の能力に影響を与えるガイド設計にそれが意味合いを持つためである。ミスマッチ許容性は、異なる位置及び種類のミスマッチ（例えば、挿入／欠失、一塩基対ミスマッチ、隣接した二重ミスマッチ、離れた二重ミスマッチ、三重ミスマッチ、及びそれ以上）を担持する標的のパネルを設計することにより決定されてもよい。ミスマッチ許容性は、様々な量のミスマッチを含有する標的についてコラテラルＤＮＡの切断量を評価することにより測定されてもよい。例として、コラテラルＤＮＡ基質は、対向する両側にフルオロフォアと消光剤とを含有するショートｓｓＤＮＡプローブであってもよい。Ｃａｓ１２ｉエフェクター、ＲＮＡガイド、及び標的配列に異なる数のミスマッチ、挿入及び欠失を含有する標的基質を含む反応について、改変された標的ＤＮＡ配列のターゲティングによるＣａｓ１２ｉシステムの活性化が成功すると、蛍光プローブのコラテラル切断が生じることになる。ひいては、切断されたコラテラル基質を意味する得られた蛍光計測値について、陰性対照試料を用いてバックグラウンドを差し引き、完全に一致する標的からのシグナルに対して規格化することにより、標的改変がＣａｓ１２ｉによるコラテラル切断効率に及ぼす影響を推定することができる。ＰＡＭからの相対的な標的長さに対するＣａｓ１２ｉ酵素によるミスマッチ、挿入、及び欠失許容性の得られたマップを用いて、異なる核酸種間の特異的検出又は区別のため異なるＤＮＡ配列又は遺伝子型の間を区別するのに最適なＲＮＡガイドを設計することができる。蛍光定量的切断リードアウト及び好ましいコラテラル基質を用いれば、完全に一致した配列に対する蛍光活性の比較により、酵素が最も高い感度を示すミスマッチの位置及び種類を決定し得る。
この最適化プロセスを更には他のＣａｓ１２ｉオルソログに適用して、異なる特性を有し得る他のシステムを生み出すことができる。例えば、コラテラル切断の直交性のジヌクレオチド優先性は、別個の検出チャンネルを生成する助けとなり得る。
実施例９．ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムをペアニッキングに使用して高度に特異的なｄｓＤＮＡ操作を実現することができる
ＣＬＵＳＴ．０２９１３０エフェクターＣａｓ１２ｉは、非標的鎖のニッキングを通じてｄｓＤＮＡを操作する能力を有する（図１５、図１６、図１７Ａ～図１７Ｂ）。触媒的に不活性化されたＣａｓ１２ｉがまたＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと融合されて、ｄｓＤＮＡの結合及びニッキング能力を有する融合タンパク質が作成されてもよい。これらの方法の一部については、以前記載されている。Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ａｕｇ ２０１３は、Ｃａｓ９を使用したダブルニッキングの一般的原理及び最適化について記載している；Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）“Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｔｏ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ Ａｐｒ ２０１４は、ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合体を使用したダブルニッキングの原理について記載している。
ペアＣａｓ１２ｉニッカーゼを使用すると、以下のとおりの高度に特異的なｄｓＤＮＡ操作が実現する。ｄｓＤＮＡ標的領域の一方の鎖を標的化するｃｒＲＮＡを有する第１のＣａｓ１２ｉ複合体と、ｄｓＤＮＡの逆鎖を標的化する第２のＣａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ複合体とが共に導入され、ｄｓＤＮＡ切断反応を実現する。Ｃａｓ１２ｉ複合体を異なるｄｓＤＮＡ鎖に標的化することにより、第１及び第２のＣａｓ１２ｉ複合体が対向するｄｓＤＮＡ鎖を切断する結果、二本鎖切断が生じる。
ダブルニッキングによるｄｓＤＮＡ二本鎖切断の形成効率を最適化するため、それらの予想ヌクレアーゼ切断部位が異なる長さだけ離れているｃｒＲＮＡスペーサー配列対を選択する。標的置換が異なるＣａｓ１２ｉペアニッカーゼによるｄｓＤＮＡのトップ鎖及びボトム鎖の切断は、異なる長さの配列オーバーハングを生じさせるため、二本鎖切断の形成効率が異なることになる。ペアニッカーゼ標的は、３’又は５’オーバーハング、又は平滑末端（オーバーハング長さが０）のいずれかの二本鎖切断を生成する特定の向きで選択することができる。
Ｃａｓ１２ｉ１及びＣａｓ１２ｉ２－ＷＴ酵素が５’ＴＴＮ ＰＡＭを含有するニッキング適用について、ＰＡＭ「アウト」（対を成す標的の外側にＰＡＭがある）のペアニッカーゼ標的の向きは５’オーバーハングを生じ、一方、ＰＡＭが標的対の内側にあるニッカーゼ標的の対は３’オーバーハングを生じる。一部の例では３’及び５’オーバーハングは１～２００ｎｔの範囲である。一部の例では、３’及び５’オーバーハングは２０～１００ｎｔである。
自律的プレｃｒＲＮＡプロセシングは、２つの別個のゲノム遺伝子座を単一のｃｒＲＮＡ転写物から標的化できることに伴い、ダブルニッキング適用のためのＣａｓ１２ｉ送達を促進する（図１２）。その点で、Ｃａｓ１２ｉ及びｄｓＤＮＡの対向する両鎖をニッキングするためＣａｓ１２ｉを標的化する２つのスペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイは、単一のウイルスベクター又はプラスミドから発現させることができる。Ｃａｓ１２ｉ及びＣＲＩＳＰＲアレイはまた、別個のプラスミド又はウイルスベクターで送達することもできる。次にＣａｓ１２ｉタンパク質がＣＲＩＳＰＲアレイを２つのコグネイトｃｒＲＮＡにプロセシングして、それらが ペアニッキング複合体の形成をもたらす。ウイルスベクターは、それぞれ細菌又は哺乳類細胞への送達用のファージ又はアデノ随伴ウイルスを含むことができる。
ウイルス又はプラスミド送達方法の他、ペアニッキング複合体は、ペアｃｒＲＮＡエレメントの両方を含む複合体が共送達されるように、ナノ粒子又は他の直接的なタンパク質送達方法を用いて直接送達することができる。更に、タンパク質をウイルスベクターによるか、又は直接細胞に送達し、続いてダブルニッキング用の２つのペアスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイを直接送達することができる。一部の例では、ＲＮＡの直接送達のため、ＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（特に、トリアンテナ型ＧａｌＮＡｃ）などの少なくとも１つの糖部分にコンジュゲートされてもよい。
実施例１０：真核生物及び哺乳類活性へのＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムエフェクターの適合
真核生物適用向けのＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを開発するため、初めにタンパク質エフェクターをコードするコンストラクトを哺乳類細胞での発現にコドン最適化し、任意選択でエフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれか一方又は両方に特異的局在化タグを付加した。こうした局在化タグには、ゲノムＤＮＡの修飾のためエフェクターを核に局在化させる核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列などの配列が含まれ得る。これらの配列については、上記の「機能性突然変異」の節に記載される。局在化タグを含む哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１２ｉエフェクターをコードするようにエンジニアリングされた天然に存在しないヌクレオチド配列の一部の例を表１０に提供する。蛍光タンパク質などの他のアクセサリータンパク質が更に付加されてもよい。ロバストな「スーパーフォールディング（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｉｎｇ）」タンパク質、例えばスーパーフォールディング緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを加えると、エフェクターに付加したときの哺乳類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ酵素の活性が増加し得ることが実証されている（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５５０（７６７５）：２８０－４、及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８（６３６６）：１０１９－２７）。
次に、Ｃａｓ１２ｉ並びに付加されたアクセサリータンパク質及び局在化シグナルをコードするコドン最適化配列を、適切な５’コザック真核生物翻訳開始配列、真核生物プロモーター、及びポリアデニル化シグナルと共に真核細胞発現ベクターにクローニングした。哺乳類発現ベクターでは、これらのプロモーターには、例えば、いくつか例を挙げれば、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＥＦＳ、ＣＡＧ、ＳＶ４０などの一般的なプロモーター、並びに神経細胞発現用のＳｙｎ及びＣａｍＫＩＩａなどの細胞型特異的ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、並びにヘパトサイト発現用のサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が含まれ得る。同様に、有用なポリアデニル化シグナルには、限定はされないが、ＳＶ４０、ｈＧＨ、及びＢＧＨが含まれる。かかるコンストラクトの発現を増加させるため、ＷＰＲＥなど、更なる転写物安定化又は転写物核外移行エレメントを使用することができる。プレｃｒＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡの発現には、Ｈ１又はＵ６などのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することができる。
適用及びパッケージング方法に応じて、真核細胞発現ベクターは、レンチウイルスプラスミド骨格、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド骨格、又は組換えウイルスベクター産生における使用が可能な類似のプラスミド骨格であってもよい。注目すべきことに、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓエフェクタータンパク質、例えばＣａｓ１２ｉタンパク質はサイズが小さいため、理想的には、そのｃｒＲＮＡ及び適切な制御配列と共に単一のアデノ随伴ウイルス粒子にパッケージングするのに好適となる；ＡＡＶの４．７ｋｂというパッケージングサイズ限界のため、特に発現制御に大型の細胞型特異的プロモーターが使用される場合に、大型エフェクターの使用は不可能であり得る。
配列、送達ベクター、及び方法を真核生物及び哺乳類使用に適合させた後、本明細書に記載されるとおりの異なるＣａｓ１２ｉコンストラクトを性能に関して特徴付けた。初期の特徴付けは、上記に記載したとおり真核生物使用に適合した、Ｃａｓ１２ｉシステムの最小成分を発現するＤＮＡコンストラクトのリポフェクションによって実施した。一実施形態において、Ｃａｓ１２ｉエフェクターは哺乳類コドン最適化され、タンパク質のＣ末端にヌクレオプラスミン核局在化配列（ｎｐＮＬＳ）が付加される。エフェクターの発現は伸長因子１αショート（ＥＦＳ）プロモーターによってドライブされ、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルを用いて終結させる（表１０）。Ｃａｓ１２ｉシステム用のコグネイトＲＮＡガイドの発現には、（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－２３０８）を参考に、Ｕ６プロモーターを含む二本鎖線状ＰＣＲ産物を使用した。この手法は、多数のｓｇＲＮＡをプラスミドクローニング及び配列検証にかけて試験するのに良く適している。（図４０）エフェクタープラスミド及びＵ６－ガイドＰＣＲ断片を約１：２モル濃度比のプラスミド対ＰＣＲ産物で、２４ウェルプレートフォーマットについて４００ｎｇのエフェクタープラスミド及び３０ｎｇのＵ６－ガイドＰＣＲ産物として２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。結果として生じた遺伝子編集イベントについて、標的部位周辺での標的化したＰＣＲアンプリコンの次世代シーケンシングを用いて評価した（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８２７－３２）。
Ｃａｓ１２ｉ２の初期評価からは、ＴＴＣ ＰＡＭを含む標的部位においてＶＥＧＦＡ遺伝子座で１３％のインデル活性が得られた。本発明者らは、図４１に記載されるとおりの異なるＲＮＡガイド設計を試験し、ここではプレｃｒＲＮＡを使用して最も強力なインデル効率が達成され、及びスペーサー長さが短いほどインデル率は低下した。Ｃａｓ１２ｉ２によって作り出されたインデルを調べると、インデルの優勢な位置がＰＡＭ配列から相対的に＋２０を中心とすることが明らかになる。
Ｖ－Ｉ型エフェクターのマルチプレックス化は、エフェクターの能力を有するプレｃｒＲＮＡプロセシングを用いて達成され、ここでは異なる配列を含む複数の標的を単一のＲＮＡガイド上にプログラム化することができる。このように、治療適用に向けて複数の遺伝子又はＤＮＡ標的を同時に操作することができる。ＲＮＡガイド設計の一実施形態は、エフェクターの内因性プレｃｒＲＮＡプロセシングによる１つ、２つ、又はそれ以上の遺伝子座の同時ターゲティングを実現するように反復した、プロセシングされていないＤＲ配列が介在する標的配列からなるＣＲＩＳＰＲアレイから発現するプレｃｒＲＮＡである。
様々なコンストラクト構成及びアクセサリー配列を個々の標的に対して試験することに加えて、プール型ライブラリベースの手法を用いることにより、１）哺乳類細胞における特定のＣａｓ１２ｉタンパク質の任意のターゲティング依存性、並びに２）ターゲティングｃｒＲＮＡの長さに沿ったミスマッチ位置及び組み合わせの効果が決定される。簡潔に言えば、プール型ライブラリは、異なるフランキング配列並びにスクリーニング実験に使用される１つ又は複数のガイドとのミスマッチを含む標的ＤＮＡを発現するプラスミドを含み、従って標的認識及び切断の成功によってライブラリからの配列の枯渇が生じる。更に、標的化したインデルシーケンシング又は偏りのないゲノムワイドな切断アッセイを用いて、ＣＬＵＳＴ．０２９１３０（Ｖ－Ｉ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特異性を評価することができる（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．“ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｆｅｂ；３３（２）：１８７－１９７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ：ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｍａｒ；１２（３）：２３７－４３、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ：ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓ，”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｊｕｎ；１４（６）：６０７－６１４）。
加えて、Ｃａｓ１２ｉタンパク質の機能的範囲を拡大するため突然変異が作り出される。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインの保存残基がアラニンに突然変異している（Ｃａｓ１２ｉ１についてＤ６４７Ａ突然変異及びＣａｓ１２ｉ２についてＤ５９９Ａ突然変異など）触媒的に不活性なＣａｓ１２ｉタンパク質を作製することができる。触媒的に不活性なＣａｓ１２ｉバージョン（ｄＣａｓ１２ｉと称される）はそのプログラム可能なＤＮＡ結合活性を保持しているが、標的又はコラテラルｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡを切断することはもはやできなくなっている。ｄＣａｓ１２ｉの直接的な用途には、免疫沈降及び転写抑制が含まれる。ｄＣａｓ１２ｉタンパク質に他のドメインを付加することにより、更なる機能性が提供される。
これらのドメインの活性としては、限定はされないが、ＤＮＡ塩基修飾（例えば：ｅｃＴＡＤ及びその進化型、ＡＰＯＢＥＣ）、ＤＮＡメチル化（ｍ６Ａメチルトランスフェラーゼ及びデメチラーゼ）、局在化因子（ＫＤＥＬ保持配列、ミトコンドリア標的シグナル）、転写修飾因子（例えば：ＫＲＡＢ、ＶＰ６４）が挙げられる。加えて、光ゲート制御（クリプトクロム）及び化学誘導性成分（ＦＫＢＰ－ＦＲＢ化学誘導性二量化）などのドメインを付加して更なる制御を提供することができる。
かかる融合タンパク質の活性の最適化には、ｄＣａｓ１２ｉを付加ドメインとつなぐリンカーを比較する系統的な方法が必要である。これらのリンカーとしては、限定はされないが、様々な組み合わせ及び長さの可動性グリシン－セリン（ＧＳ）リンカー、α－ヘリックス形成ＥＡＡＡＫ配列などの非可動性リンカー、ＸＴＥＮリンカー（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；２７：１１８６－１１９０）、並びにこれらの種々の組み合わせを挙げることができる（表１１を参照のこと）。次に様々な設計が同じｃｒＲＮＡ標的複合体及び機能性リードアウトに関して並行してアッセイされ、どれが所望の特性を生み出すかが決定される。
標的化したＤＮＡ塩基修飾における使用にＣａｓ１２ｉを適合させるため（例えば、Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ Ｏｃｔ ２０１７を参照のこと）、本発明者らは、最も高い内因性哺乳類ＤＮＡ切断活性を生じたＣａｓ１２ｉオルソログ及びＮＬＳの組み合わせから始め、ＲｕｖＣドメインの保存残基を突然変異させて触媒的に不活性な酵素（ｄＣａｓ１２ｉ）を作成する。次に、ｄＣａｓ１２ｉ－ＮＬＳと塩基編集ドメインとの間にリンカーを使用して融合タンパク質を作成する。初めは、このドメインは、以前過剰活性及びｄｓＤＮＡ Ａ・ＴジヌクレオチドからＧ・Ｃへの修飾のためにエンジニアリングされたｅｃＴａｄＡ（ｗｔ）／ｅｃＴａｄＡ＊（７．１０）ヘテロ二量体（以下ｄＣａｓ１２ｉ－ＴａｄＡヘテロ二量体と称する）からなることになる（表１１）。小型のＣａｓ１２ｉとこれまでに特徴付けられているＣａｓ９エフェクターとの間にあり得る構造的差異を考慮すれば、別のリンカー設計及び長さが塩基編集融合タンパク質の最適設計をもたらし得る。
ｄＣａｓ１２ｉ由来の塩基編集体の活性を評価するため、ｄＣａｓ１２ｉ－ＴａｄＡヘテロ二量体コンストラクト、ｃｒＲＮＡを発現するプラスミド、及び内因性遺伝子座でなくレポーターを標的化する場合には、任意選択でレポータープラスミドをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトする。一過性トランスフェクションの４８時間後にこの細胞を回収し、ＤＮＡを抽出し、次世代シーケンシング用に調製する。陰性対照非ターゲティングｃｒＲＮＡと比べたターゲティングｃｒＲＮＡを含む試料の遺伝子座の塩基組成分析が編集効率に関する情報を提供し、及びトランスクリプトームのより幅広い変化の分析がオフターゲット活性に関する情報をもたらすことになる。
Ｃａｓ１２ｉを使用したＤＮＡ塩基編集システムを開発することの一つの特別な利点は、既存のＣａｓ９及びＣａｓ１２ａエフェクターよりも小さいというサイズの小ささが、タンパク質をトランケートする必要のない、ｄＣａｓ１２ｉ－ＴａｄＡヘテロ二量体のそのｃｒＲＮＡ及び制御エレメントと併せたＡＡＶへのより容易なパッケージングを実現することである。このオールインワンＡＡＶベクターは、組織におけるインビボ塩基編集のより高い有効性を実現し、これはＣａｓ１２ｉの治療適用への道として特に関連性がある。
Ｃａｓ１２ｉ及びＲＮＡガイドを使用した編集に加えて、更なる鋳型ＤＮＡ配列をＡＡＶウイルスベクターなどのベクターで、或いは線状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ断片として、共送達することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）による鋳型ＤＮＡの挿入のため、目的の遺伝子座に挿入しようとするペイロード配列、並びに所望の挿入部位に隣接する内在性配列に相同なフランキング配列を含む鋳型配列が設計される。一部の例において、（例えば：１ｋｂ未満の長さ）未満の短いＤＮＡペイロードの挿入には、フランキング相同配列は短くてもよい（例えば：１５～２００ｎｔ長の範囲）。他の場合に、長いＤＮＡペイロード（例えば：１ｋｂ以上の長さ）の挿入には、効率的なＨＤＲを促進するため長い相同フランキング配列が必要となる（例えば：２００ｎｔ長より長い）。鋳型ＤＮＡフランキング領域に相同な配列間におけるＨＤＲのための標的ゲノム遺伝子座の切断により、ＨＤＲ頻度は大幅に増加し得る。ＨＤＲを促進するＣａｓ１２ｉ切断イベントとしては、限定はされないが、ｄｓＤＮＡ切断、ダブルニッキング、及び一本鎖ニッキング活性が挙げられる。
ｄｓＤＮＡ断片は、Ｃａｓ１２ｉを使用したダブルニッキングによって生じるオーバーハングに相補的なオーバーハング配列を含み得る。インサートとダブルニッキングオーバーハングとの対合及び続く内在性ＤＮＡ修復機構によるライゲーションにより、ダブルニッキング部位における鋳型ＤＮＡのシームレスな挿入がもたらされる。
これらの結果は、真核細胞における活性、具体的には哺乳類細胞におけるゲノム編集のため、コンパクトなＶ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲファミリーのメンバーをエンジニアリングし得ることを示唆している。哺乳類機能性Ｖ－Ｉ型エフェクターは、ＤＮＡ結合の土台上への更なるエンジニアリングに基づく追加的な技術の開発を実現する。
実施例１１．Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して、ゲノム複製、ウイルス伝播、プラスミド伝播、細胞死、又は細胞休眠の遺伝子型ゲート制御を提供することができる
Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及びｃｒＲＮＡが特異的ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ標的にハイブリダイズすると、基質のニッキング又は切断が生じる。かかる活性が細胞中の特異的ＤＮＡ標的の存在に依存することは、それが特異的な基礎遺伝子型に基づく特異的ゲノム材料又は細胞集団のターゲティングを実現するため、貴重である。真核生物、原核生物、及びウイルス／プラスミドセッティングの両方において、ゲノム複製、細胞死、又は細胞休眠のかかる制御に向けた適用が多数存在する。
原核生物、ウイルス、及びプラスミド適用には、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、Ｖ－Ｉ型エフェクターとＲＮＡガイドとを含む）は、遺伝子型特異的に特定の原核生物集団（例えば、細菌集団）のゲノム複製を停止させ、及び／又は細胞死又は休眠を誘導するために（例えば、インビトロ又はインビボで）送達することができる。例えば、Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、特定のウイルス、プラスミド、又は原核生物属、種、又は株を特異的に標的化する１つ以上のＲＮＡガイドを含むことができる。図５Ａ～図５Ｄに示されるとおり、Ｖ－Ｉ型システムによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において抗生物質耐性を付与するプラスミドＤＮＡの切断、ニッキング、又はそれへの干渉が、それらの配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特異的枯渇を生じさせる。ウイルス、プラスミド、又は原核生物の特異的ターゲティングは、望ましくない細菌（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）などの病原性細菌）の死滅又は休眠を誘導するためにそれを用い得るため、多くの治療利益がある。加えて、本明細書に提供されるＶ－Ｉ型システムは、特異的遺伝子型を有する原核細胞を標的化するために使用されてもよい。ヒトに定着する微生物多様性の中では、ごく少数の細菌株のみが病原性を誘導し得る。更に、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）などの病原性株の中であっても、細菌集団の全てのメンバーが常に活性な、疾患を引き起こす状態で存在するとは限らない。従って、ウイルス、プラスミド、又は原核細胞の遺伝子型に基づくＶ－Ｉ型システムのターゲティングにより、マイクロバイオーム全体を破壊することなく、どのゲノム又は細胞集団が標的化されるかについての特異的制御が可能となる。
加えて、細菌株は、遺伝回路又は環境的に制御された発現エレメントを用いて、エンジニアリングされた細菌株の成長、コロニー形成、及び／又は排出を制限する遺伝的キルスイッチが生成されるように容易にエンジニアリングすることができる。例えば、Ｖ－Ｉ型エフェクター及び特異的ｃｒＲＮＡの発現は、低温感受性タンパク質（ＰｃｓｐＡ）、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）、化学誘導性システム（Ｔｅｔ、Ｌａｃ、ＡｒａＣ）など、外部刺激に応答して発現するタンパク質をコードする遺伝子の調節領域に由来するプロモーターを使用して制御することができる。Ｖ－Ｉ型システムの１つ以上のエレメントの制御された発現により、環境刺激への曝露時に限り完全に機能性のシステムを発現させることが可能となり、これによりシステムの遺伝子型特異的ＤＮＡ干渉活性がもたらされ、ひいては細胞死又は休眠が誘導される。本明細書に記載されるもののようなＣａｓ１２ｉエフェクターを含むキルスイッチは、毒素／抗毒素システム（例えば、ＣｃｄＢ／ＣｃｄＡ ＩＩ型毒素／抗毒素システム）などの従来のキルスイッチ設計と比べて、プロモーター（例えば、環境刺激依存性プロモーター）からの漏出発現によって影響を受け得る相対的なタンパク質発現率に依存せず、従ってキルスイッチのより正確な制御が可能となるため有利であり得る。
他の実施形態
本発明はその詳細な説明を伴い説明されているが、前述の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変形例が、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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