CN116854787B - 一种Cas7-11蛋白的抑制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Cas7‑11蛋白的抑制剂及其应用，属于基因编辑领域。本发明对TPR‑CHAT蛋白进行截短获得具有抑制Cas7‑11活性的TCN蛋白。相比较于由751 aa组成的TPR‑CHAT蛋白，由65 aa组成的小尺寸TCN在保留了高抑制活性的同时，增加了在基因编辑和调控应用中的可行性。而且其结构灵活性使得它更容易进行合成和工程化改造；其次较小的TCN蛋白可以更方便地与其他基因编辑工具或调控元件进行组合；最后，较小的TCN蛋白更不容易被宿主免疫系统检测和清除，从而提高了在体内应用的效果和持久性。
Description
技术领域
本发明涉及一种Cas7-11蛋白的抑制剂及其应用，主要涉及一种来自于Desulfonema ishimotonii（Di）菌属的III-E型CRISPR-Cas7-11蛋白活性抑制剂TCN，属于基因编辑领域。
背景技术
Cas7-11是一种RNA导向的RNA内切酶，是CRISPR系统中的一种RNA干扰效应器。它通过与特定的crRNA形成复合物，靶向RNA并引导Cas7-11切割靶RNA。Cas7-11被广泛应用于基因调控和基因表达调控研究。然而，在某些应用中，对Cas7-11活性的抑制需求越来越迫切，以实现更精确的基因调控和基因编辑。目前TPR-CHAT蛋白的发现为抑制CRISPR-Cas7-11系统的活性提供了工具，并为基因编辑和调控技术的精确性和灵活性提供了新的可能性。但将TPR-CHAT蛋白有效地递送到目标细胞或组织中可能具有挑战性。TPR-CHAT蛋白需要穿过细胞膜，并在细胞内达到足够的浓度才能有效地抑制CRISPR-Cas7-11系统。因此，需要进一步研究和开发Cas7-11抑制剂，以提供更精确、高效的Cas7-11调控工具，并在基因治疗、疾病诊断和治疗等领域中发挥重要作用。
发明内容
为了解决这一问题，本发明在来源于于Desulfonema ishimotonii菌属的TPR-CHAT蛋白结构基础上进行工程化改造，即通过功能实验和比对分析，工程化改造了TCN基因序列，并经过蛋白表达和纯化，获得了具有抑制Cas7-11活性的TCN蛋白。
本发明的第一个目的是提供一种抑制Cas7-11活性的多肽，所述多肽如下：
（a）具有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；
（b）将SEQ ID NO.1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制Cas7-11活性的功能的由(a)衍生的多肽。
本发明的第二个目的是提供一种多核苷酸，所述多核苷酸含有如下核苷酸序列：
（a）编码所述多肽的多核苷酸；
（b）与多核苷酸（a）互补的多核苷酸。
本发明的第三个目的是提供含有所述多核苷酸的载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述多肽、或含有所述多核苷酸、或含有所述载体的宿主细胞。
在一种实施方式中，所述宿主细胞包括真核细胞或原核细胞。
本发明的第五个目的是提供一种Cas7-11蛋白的抑制剂，所述抑制剂含有所述多肽或所述多核苷酸或所述载体或所述宿主细胞。
在一种实施方式中，所述抑制剂包含一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的第六个目的是提供一种基因编辑试剂盒，所述试剂盒包含所述多肽或所述多核苷酸或所述载体或所述宿主细胞或所述抑制剂。
在一种实施方式中，所述试剂盒中含有Cas7-11蛋白和/或缓冲液。
本发明第七个目的是提供一种调控Cas7-11蛋白活性的方法，所述方法为将所述多肽或所述抑制剂与Cas7-11或含有Cas7-11的细胞接触。
本发明还提供了所述多肽或所述多核苷酸或所述载体或所述宿主细胞或所述抑制剂在调控CRISPR/Cas基因编辑系统中的应用。
本发明还提供了所述多肽或所述多核苷酸或所述载体或所述宿主细胞或所述抑制剂在制备调控CRISPR/Cas基因编辑系统的试剂中的应用。
有益效果：
本发明对TPR-CHAT蛋白进行截短获得具有抑制Cas7-11活性的TCN蛋白。通过Cas7-11-crRNA-TCN复合物的冷冻电镜结构表明，TCN占据了靶RNA的结合腔，并使复合物的构象更加稳定，同时进一步的生化实验表明，TCN通过阻断Cas7-11与靶RNA的结合，从而有效地抑制了Cas7-11的RNA切割活性。相比较于由751 aa（氨基酸）组成的TPR-CHAT蛋白，由65 aa组成的TCN在保留了高抑制活性的同时，其更小的尺寸利于递送，增加了其在基因编辑和调控应用中的可行性，而且其结构灵活性使得它更容易进行合成和工程化改造。其次较小的TCN蛋白可以更方便地与其他基因编辑工具或调控元件进行组合；最后，较小的TCN蛋白可能更不容易被宿主免疫系统检测和清除，从而增加了其应用的可能性。因此，本发明为基因编辑工程提供了一个更具有实用性的Cas7-11抑制剂。
附图说明
图1 体外切割实验1；
图2 TCN的表达鉴定，a，SDS-PAGE鉴定，b，分子筛层析；
图3 Cas7-11-crRNA-TCN复合物的表达鉴定图，a，SDS-PAGE鉴定，b，分子筛层析；
图4 Cas7-11-crRNA-TCN复合物的整体结构示意图，a：蛋白冷冻电镜密度图，该图是通过冷冻电镜收集大量数据，经过分类计算后重构出的蛋白结构的3D电镜密度图，b:蛋白冷冻电镜密度图对应的蛋白原子结构图，该图是以冷冻电镜密度图为基础，根据不同氨基酸的原子结构搭建而成；
图5 电泳迁移率实验；
图6 体外切割实验2。
具体实施方式
下述实施例中涉及到的生物材料：
质粒pET28a-SUMO：商品化质粒。
质粒pET28a-SUMO-Cas7-11：将Cas7-11构建至pET28a-SUMO的NotI和BamHI酶切位点之间，获得携带Cas7-11的重组质粒pET28a-SUMO-Cas7-11。
D429A/D654A-Cas7-11-crRNA：D429/D654是Cas7-11核酸酶中位于Cas7结构域上的催化位点，将Cas7-11核酸酶中第429位和第654位的天冬氨酸突变为丙氨酸，得到D429A/D654A-Cas7-11-crRNA。仅具有结合靶标RNA活性而不具有切割活性。
实施例1 TPR-CHAT蛋白抑制CRISPR-Cas7-11系统的核酸切割活性
属于Desulfonema ishimotonii（Di）菌属的TPR-CHAT蛋白可以抑制CRISPR-Cas7-11系统的核酸切割活性，这为基因编辑和调控技术的精确性和灵活性提供了新的可能性。设置1~7组实验进行核切割活性验证实验，以第1组为对照组，2、3和4组验证Cas7-11蛋白能否在crRNA的参与下对靶ssRNA进行切割，并通过改变WT-Cas7-11的量来验证Cas7-11切割靶ssRNA的最适浓度，5、6和7组为验证TPR-CHAT对Cas7-11核酸酶活性的影响。使用软件imageJ测量每组数据的灰度值，并将第1组的切割效率量化为1，计算其他组的切割效率。全长的DiCas7-11在引导RNA（crRNA）的存在下，切割标记的靶标RNA，实验组第2、3和4组的切割效率分别为第1组的2.21、2.48和2.88倍，即随着浓度的增加，切割量增加。当存在TPR-CHAT时，实验组第5、6和7组的切割效率分别为第一组的1.80、1.00和0.99倍，即该过程被抑制，且随着TPR-CHAT的浓度增加抑制效率增强（图1）。
核酸切割活性验证实验的步骤如下：
（1）8 M尿素-TBE凝胶（15%）配置：称取尿素24 g，加入18.75 g Acryl/Bis 40%Solution（29:1）和5 mL 10×TBE溶液，室温溶解，待完全溶解后加入20 μL TEMED和166 μL30% APS，使用DEPC水定容至50 mL，混合均匀后加入至提前安装好的胶板中。
（2）样品准备：1.3 mg/mL WT-Cas7-11，20 μM crRNA，2 μM ssRNA，4 U RNaseinhibitor，buffer（40 mM Tris，pH=7.5，60 mM NaCl，6 mM MgCl2），1 mg/mL protease K，180 mM EDTA，11 M尿素；
crRNA的序列：
5’-GGUUGGAAAGCCGGUUUUCUUUGAUGUCACGGAACCUUUGUUGUCUUCGACAUGGGUAAUCCUCAU-3’。
ssRNA的序列：
5’-AAACAUGAGGAUUACCCAUGUCGAAGACAACAAAGAAGUUCAACUCUUUA-3’。
（3）实验组5~7中，先将WT-Cas7-11、crRNA和TPR-CHAT于37℃孵育30 min，加入ssRNA和RNase inhibitor继续37℃孵育1 h，加入终浓度为400 μM尿素，6 mM EDTA，3 mg/mL proteinase K并于50℃反应30 min。实验组1~4中，直接将表1中的组分在37℃孵育1 h，再加入终浓度为400 μM尿素，6 mM EDTA，3 mg/mL proteinase K并于50℃反应30 min。反应结束后，每个样品中均加入5 M尿素，再加入6×RNA去离子甲酰胺凝胶上样缓冲液，于95℃反应10 min后立即置于冰水浴中放置5 min后上样。实验分组如表1所示：
表1 实验分组
（4）核酸电泳凝胶：样品于250 V电泳150 min。电泳结束后使用iBright 1500曝光。
实施例2 工程化改造TPR-CHAT蛋白
工程化改造了TPR-CHAT蛋白，保留N端的65个氨基酸，命名为TCN。
（1）重组载体的构建
首先在NCBI数据库中查找编码来源于Desulfonema ishimotonii的TPR-CHAT蛋白的基因序列，并委托生工生物工程有限公司合成，以该序列为模板，设计引物F1/R1通过PCR扩增TPR-CHAT基因，并构建到大肠杆菌表达载体pET28a-SUMO的XhoI酶切位点中。在TPR-CHAT基因的C末端通过PCR引入STREP标签(WRHPQFGG)。构建得到质粒pET28a-SUMO-TPR-CHAT。
F1：atggacgccgtgggcttgacgcggccgcataatgcttaagtcgaacagaaag，
R1：gtggtggtggtggtgctcgattatttttcaaactgcgggtgggaccacgcgc。
以构建得到质粒pET28a-SUMO-TPR-CHAT，设计引物F2/R2进行全质粒PCR扩增，截短TPR-CHAT的C端序列（66-751aa），并将获得的质粒命名为pET28a-SUMO-TCN。
F2：TTCAAACTGCGGGTGGGACCAATCACGGAACTGGCTCAGCTGAGAGAAGCTATTCGGGCG；
R2：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGATTATTTTTCAAACTGCGGGTGGGACCACGCGCTA。
（2）蛋白的表达与纯化
采用常规的分子克隆技术，将步骤（1）的构建的表达TPR-CHAT或TCN的重组载体分别转化至大肠杆菌中，在大肠杆菌中表达并经纯化后以SDS-PAGE鉴定，结果表明蛋白表达成功（图2 a），通过经分子筛层析的进一步分离，得到性质较为均一的TCN蛋白（图2 b）和TPR-CHAT蛋白。
实施例3 Cas7-11-crRNA和TCN共表达
（1）重组载体的构建
采用实施例2相同的方法，将表达载体pET28a-SUMO替换为pET28a-SUMO-Cas7-11，构建获得质粒pET28a-SUMO-Cas7-11-TPR-CHAT；截短TPR-CHAT的C端序列（66-751aa），构建获得质粒pET28a-SUMO-Cas7-11-TCN。
（2）蛋白的表达与纯化
采用常规的分子克隆技术，将步骤（1）的重组载体转化至大肠杆菌中，表达并纯化后的复合物经SDS-PAGE验证，结果显示TCN和Cas7-11依然能够形成复合物（图3 a），且经分子筛层析进一步纯化得到性质较为均一的复合物（图3 b）。
对比例1 工程化改造TPR-CHAT蛋白
针对TPR-CHAT蛋白进行了其他截短，即只保留其C端的686 aa（CTD）。采用实施例2同样的方法表达于纯化得到性质较为均一的CTD蛋白。
采用实施例3中相同的方法构建Cas7-11-crRNA和CTD共表达载体并进行蛋白纯化。
实施例4 复合物的表征
（1）冷冻电镜技术
应用冷冻电镜技术，经过单颗粒筛选、2D分类以及3D重构等计算方法得到了分辨率为2.8 Å的Cas7-11-crRNA-TCN复合物结构（图4）
Cas7-11-crRNA-TCN结构揭示了Cas7-11中的Cas7.4（V1,317-R1,336 aa）在结合TCN后变得稳定有序。TCN和Cas7.4（V1,317-R1,336 aa）之间通过氢键和非键相互作用稳定了Cas7-11-crRNA复合物从而阻碍了靶标RNA的结合，从而调控了Cas7-11切割靶RNA活性。
（2）电泳迁移率实验
将实施例2和对比例1中制备蛋白TPR-CHAT/TCN/CTD和D429A/D654A-Cas7-11-crRNA在体外和ssRNA孵育，通过15%非变性PAGE凝胶验证在调控蛋白各部分的影响下验证D429A/D654A-DiCas7-11-crRNA是否会结合ssRNA。
（a）15% 非变性PAGE凝胶配置：取18.75 g Acryl/Bis 40% Solution（29:1）和5mL 10×TBE溶液，加入20 μL TEMED和166 μL 30% APS，使用DEPC水定容至50 mL，混合均匀后加入至提前安装好的胶板中。
（b）样品准备：1.3 mg/mL D429A/D654A-Cas7-11-crRNA，2 μM ssRNA，4 U RNaseinhibitor，buffer（40 mM Tris，pH=7.5，60 mM NaCl，6 mM MgCl2），1 mg/mL protease K，180 mM EDTA，11 M尿素。
（c）实验组2~4中，先将1.3 mg/mL D429A/D654A-Cas7-11-crRNA和TPR-CHAT/TCN/CTD于37℃孵育30 min，再加入ssRNA和RNase inhibitor继续37℃孵育1 h，加入终浓度为400 μM尿素，6 mM EDTA，3 mg/mL proteinase K并于50℃反应30 min。实验组1中，直接将表2中的组合在37℃孵育1 h，加入终浓度为400 μM尿素，6 mM EDTA，3 mg/mL proteinaseK并于50℃反应30 min。反应结束后，每个样品中均加入5 M尿素，再加入6×RNA去离子甲酰胺凝胶上样缓冲液，于95℃反应10 min后立即置于冰水浴中放置5 min后上样。实验分组如表2所示：
表2 实验分组
（d）核酸电泳凝胶：样品于250 V电泳150 min。电泳结束后使用iBright 1500曝光。
电泳迁移率实验结果表明，孵育单独表达纯化的TCN有效地干扰了Cas7-11-crRNA复合物与靶RNA结合（图5），而CTD无法干扰Cas7-11-crRNA复合物与靶RNA的结合。
（3）体外切割实验
实验步骤：
（a）8 M尿素-TBE凝胶（15%）配置：称取尿素24 g，加入18.75 g Acryl/Bis 40%Solution（29:1）和5 mL 10× TBE溶液，室温溶解，待完全溶解后加入20 μL TEMED和166 μL 30% APS，使用DEPC水定容至50 mL，混合均匀后加入至提前安装好的胶板中。
（b）样品准备：1.3 mg/mL WT-Cas7-11-crRNA，1.3 mg/mL TPR-CHAT/CTD/TCN，2 μM ssRNA，4 U RNase inhibitor，buffer（40 mM Tris，pH=7.5，60 mM NaCl，6 mM MgCl2），1mg/mL protease K，180 mM EDTA，11 M尿素。
（c）实验组2~4中，先将1.3 mg/mL WT-Cas7-11-crRNA和TPR-CHAT/CTD/TCN于37℃孵育30 min，再加入其他ssRNA和RNase inhibitor继续37℃孵育1 h，加入终浓度为400 μM尿素，6 mM EDTA，3 mg/mL proteinase K并于50℃反应30 min。实验组1中，直接将表2中的组合在37℃孵育1 h，加入终浓度为400 μM尿素，6 mM EDTA，3 mg/mL proteinase K并于50℃反应30 min。反应结束后，每个样品中均加入5 M尿素，再加入6× RNA去离子甲酰胺凝胶上样缓冲液，于95℃反应10 min后立即置于冰水浴中放置5 min后上样。实验分组如表3所示：
表3 实验分组
（d）核酸电泳凝胶：样品于250 V电泳150 min。电泳结束后使用iBright 1500曝光。
同样使用imageJ软件测量每一组的灰度值，将第一组的切割效率量化为1，测得第2、3和4组的切割效率为2.15、1.02和0.95，这证明了TCN和全长的TPR-CHAT具有类似的功能，即能够降低或抑制Cas7-11的核酸酶活性（图6）。
实施例5 体内切割实验
实验组为密码子优化的DiCas7-11-TCN的表达载体，对照组为密码子优化的DiCas7-11表达载体。
（1）设计构建哺乳动物细胞中的表达载体
合成密码子优化的DiCas7-11-TCN/DiCas7-11序列，进行PCR扩增并克隆到哺乳动物表达载体中（如pDF0158和pDF0159等）。双荧光素酶报告基因也通过PCR扩增，并将EF1α和CMV两个启动子进行组装。合成全长和成熟的DR（direct repeat）序列来构建哺乳动物DiCas7-11-TCN/DiCas7-11的引导表达载体。
（2）哺乳动物细胞的准备
本次实验使用HEK293FT细胞系。在转染前16小时将细胞培养到每孔20,000个细胞的密度，使细胞达到90%的融合度后再进行转染。
（3）哺乳动物细胞RNA敲除实验
为了用双荧光素报告基因构建体评估哺乳动物细胞中的RNA基因敲除情况，本次实验使用转染试剂（如Lipofectamine 2000（赛默飞世尔科技公司））将DiCas7-11-TCN/DiCas7-11表达载体与引导表达质粒和敲除报告基因载体共转染至HEK293FT细胞。48小时后，收集细胞，并使用Gaussia荧光素酶检测试剂（GAR-2B；Targeting Systems）和Cypridina（Vargula）荧光素酶检测试剂（VLAR-2；Targeting Systems）试剂盒测量两种荧光素酶活性。用Gluc值除以Cluc值，对荧光素酶测量值进行归一化处理，从而对各孔之间的差异进行标准化。测得的标准化荧光素酶值越低，说明报告基因的敲除效率越高，实验组和对照组的荧光素酶值之间的差异，可以反映TCN对DiCas7-11核酸酶活性的影响。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1. 一种抑制Cas7-11活性的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列为（a）或（b）：
（a）编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；
（b）与多核苷酸（a）互补的多核苷酸。
3.含有权利要求2所述多核苷酸的载体。
4.表达权利要求1所述多肽、或含有权利要求2所述多核苷酸、或含有权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.一种Cas7-11蛋白的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂含有权利要求1所述多肽、或权利要求2所述多核苷酸、或权利要求3所述载体或权利要求4所述宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含一种或多种药学上可接受的载体。
7.一种基因编辑试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述多肽、或权利要求2所述多核苷酸、或权利要求3所述载体或权利要求4所述宿主细胞、或权利要求5或6所述抑制剂。
8.根据权利要求7所述基因编辑试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有Cas7-11蛋白和/或缓冲液。
9.一种非疾病治疗目的的调控Cas7-11蛋白活性的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述多肽或权利要求5或6所述抑制剂与Cas7-11蛋白或含有Cas7-11蛋白的细胞接触。
10.权利要求1所述多肽、或权利要求2所述多核苷酸、或权利要求3所述载体或权利要求4所述宿主细胞、或权利要求5或权利要求6所述抑制剂在制备调控CRISPR/Cas基因编辑系统的试剂中的应用。
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