JP2023551305A - 超急性拒絶反応を促進するためのがん免疫療法 - Google Patents

超急性拒絶反応を促進するためのがん免疫療法 Download PDF

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Abstract

本願は、腫瘍関連抗原を標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に変換する酵素とを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。酵素は標的化成分に接続されている。二機能性治療用物質を投与する工程を含む、がんを処置するための方法も開示される。TIFF2023551305000035.tif108170

Description

本願は、2020年11月30日に出願された米国仮特許出願第63/119,359号の優先権の恩典を主張する。米国仮特許出願第63/119,359号は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる。
分野
本開示は、超急性拒絶反応を促進するためのがん免疫療法に関する。
背景
併用療法は、実質的に全てのタイプのがんに対する、一般に容認された、よくある処置アプローチであり、数十年にわたって標準的な治療アプローチであった。併用療法が採用される基盤は、がんの変異速度が早いため、一種類の薬剤しか用いられない時には腫瘍細胞の耐性株が急速に発生すると確かめられた化学療法の初期での経験であった。併用療法の目標は、効力を高め、腫瘍の耐性または逃避の発生を最小限にすることである。これは、一般的に、それぞれが異なる作用機構をもつ2種類以上の抗がん剤を使用し、それにより耐性腫瘍細胞の発生を難しくし、かつ可能性を小さくすることで成し遂げられる。2種類以上の薬剤を組み合わせる相加効果または相乗効果が患者の処置の成功と不成功の違いになる場合がある。
多くの併用治療レジメンが腫瘍学分野において周知である。一例として、MOPP(メクロレタミン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾンの頭字語)はホジキン病の根治的処置レジメンである。精巣がんの処置では、いくつかの異なる併用レジメン(全て、シスプラチン、ビンブラスチン、およびブレオマイシンを含む)が受け入れられており、精巣がんは診断症例の98％までで治癒可能である。全部で300を超える異なる併用レジメンが用いられてきた。
併用療法の主な難点は、多くの場合、毒性の増加も引き起こすことである。例えば、体外照射および化学療法などの非外科的がん療法のほとんどの形式が、正常組織および正常細胞に対する毒性副作用と、がん細胞に対する、これらの処置モダリティーの限られた特異性のために効力が限られている。同位体、薬物、および毒素などの毒性薬剤をがん部位に標的化するために抗がん抗体が用いられる時でも、この制約は重要性が高い。なぜなら、抗がん抗体も全身薬剤として、骨髄などの感受性の高い細胞区画に循環するからである。急性放射線傷害では、敗血症の発症とその後の死亡における主因としてリンパ系区画および造血区画の破壊がある。従って、効力を維持しながら、さらには効力を高めながらもがん療法の毒性作用を軽減する方法の需要は大きい。
併用療法の別の選択肢では、免疫療法の最近の進歩から、免疫系ががんに対する応答に関与する可能性があり、これらの応答は極めて有効であり、かつ長続きする可能性があることがはっきりと確かめられている。免疫チェックポイント阻害を用いた、かなりの経験から、その最大の利益は、比較的高い変異量をもつがんに対する適用にあることが示唆されている。だが、このような場合でも、少数の患者しか応答しない。前立腺がんのような一部のがんには、腫瘍微小環境に免疫細胞がない。この免疫細胞の非存在は、時として「コールドな(cold)」微小環境または免疫「砂漠(desert)」と呼ばれ、免疫系を活性化する能力を著しく制限する。キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞および二重特異性T細胞エンゲージャー(bi-specific T cell engager)(BiTE)では、T細胞の溶解機構を誘導してがん細胞を溶解するために腫瘍関連抗原の抗体標的化を利用する。だが今までのところ、CAR-TおよびBiTEの抗腫瘍活性は、よくある固形腫瘍ではなく造血がんに限られている。明らかに、様々ながんを処置するためのさらなる方法がまだ必要とされている。
本開示は、当技術分野における、これらの不備および他の不備を克服することに関する。
概要
本開示の一局面は、腫瘍関連抗原を標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換する酵素とを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。前記酵素は標的化成分に接続されている。
本開示の別の局面は、がんを処置する方法に関する。この方法は、がんを有する対象を選択する工程;本開示に従う二機能性治療用物質を提供する工程;および選択された対象に、がんを処置するのに有効な条件下で二機能性治療用物質を投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、前立腺特異的膜抗原(PSMA)/葉酸加水分解酵素1(FOLH1)受容体を標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記標的化成分に接続されている、グリコシルトランスフェラーゼとを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。
本開示の別の局面は、ヒト上皮増殖因子受容体(HER)ファミリーメンバーを標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記標的化成分に接続されている、グリコシルトランスフェラーゼとを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。
本開示の別の局面は、CD19を標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記標的化成分に接続されている、グリコシルトランスフェラーゼとを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。
腫瘍標的化グリコシルトランスフェラーゼが非自己組織血液型抗原(HBGA)またはα-galグリコトープ(glycotope)を付加することで腫瘍および/またはその血管の糖表現型を変える新規の免疫療法アプローチが提示される。これは腫瘍をHBGA不適合性の同種移植片または異種移植片に効果的に変換する。この多機能性薬剤の例示的な態様は、腫瘍の新生血管を不適合性のHBGAまたは異種移植片に変換し、それによって超急性拒絶反応を開始するようにPSMA/FOLH1を標的化することができる。半世紀の移植経験において、HBGA不適合性の同種移植片またはα-gal発現異種移植片は活発な免疫拒絶反応プロセスを刺激することが記録に残されている。
本明細書に記載のように、腫瘍によって異種抗原または同種抗原の発現を生じさせるために、異種または同種のグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、αgalトランスフェラーゼ(αgalT)または同種グリコシルトランスフェラーゼAおよび/もしくはB酵素が通常これらは全てゴルジにあるが、腫瘍細胞表面に送達される。すなわち、事実上、分子スケール異所性の同種移植片/異種移植片になる。または、αgalT、Aおよび/またはB酵素を、葉酸加水分解酵素1(FOLH1)(前立腺特異的膜抗原(PSMA)とも知られる)もしくは血管内皮増殖因子受容体-2(VEGFR-2)または当業者に公知の他の標的などの腫瘍新生血管性内皮標的に特異的な抗原に標的化することができる。グリコシルトランスフェラーゼ(αgalT、グリコシルトランスフェラーゼAおよび/またはB酵素)の標的化に加えて、それぞれの糖-ヌクレオチドドナー(UDP-galまたはUDP-NAcGal)が供給される。腫瘍にグリコシルトランスフェラーゼ(glycosyltransferse)が存在すると、標的細胞によって分泌された産物を含む既存の糖タンパク質および糖脂質に糖(galまたはNAcGal)が付加されて同種抗原または異種抗原が生じ、それによって強い免疫応答が誘発される。微小環境に分泌された、変換された同種/異種タンパク質は、補体活性化、免疫応答、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘発する多量の自然抗体に結合し、「コールドな」微小環境を「ホットな(hot)」微小環境に変換するのに役立つ。
グリコシルトランスフェラーゼAおよびグリコシルトランスフェラーゼB酵素は353アミノ酸残基のうち4つしか差がなく(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Hakomori, 「Antigen Structure and Genetic Basis of Histo-Blood Groups A, B and O: Their Changes Associated With Human Cancer」, Biochimica et Biophysica Acta 1473:247-266 (1999); Seto et al., 「Sequential Interchange of Four Amino Acids From Blood Group B to Blood Group A Glycosyltransferase Boosts Catalytic Activity and Progressively Modifies Substrate Recognition in Human Recombinant Enzymes」, J. Biol. Chem. 272:14133-14138 (1997)、そのため免疫原性になる可能性は低い。患者血清の研究によって、これらの酵素は予想通りに免疫原性でないことが確かめられている。実際に、これらのHBGA炭水化物産物は高免疫原性であるが、トランスフェラーゼAおよびトランスフェラーゼB酵素は免疫原性であると報告されたことがない。非免疫原性のトランスフェラーゼAまたはB酵素の腫瘍標的化送達は、腫瘍または新生血管の免疫表現型を、高免疫原性の非自己HBGAを発現する表現型に変え、それによって不適合性同種移植片の表現型を呈し、宿主による活発な拒絶反応応答を促進する手段を提供する。
本明細書に記載のように、概念実証のために、ヒト由来GTAまたはGTBを用いて前記のアプローチを検証した。代わりに、ヒトでは変異している/機能しない、かつ他の哺乳動物に由来する異種移植臓器の拒絶反応を引き起こすことを担当する異種α-galトランスフェラーゼ(α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ;α-galT)酵素を利用することができた。α-galT酵素の使用にはα-galTのヒト化または脱免疫(de-immunization)が必要な場合があり、ヒトに対して免疫原性でない、他のグリコシルトランスフェラーゼの相同領域配列の使用を含むが、これに限定されない、これを成し遂げるための当技術分野において公知の方法がある。このようなヒト化または脱免疫方法は、ヒトでの治療剤として使用する前に外来由来抗体をヒト化または脱免疫する目的で広く、かつ首尾よく用いられてきた。しかしながら、患者血清の研究から、これらの酵素は免疫原性でないことが分かっている。
本開示は、腫瘍標的化グリコシルトランスフェラーゼが腫瘍の組織血液型抗原の発現および/またはその血液供給を変える新規の免疫療法アプローチを提示する。これは、腫瘍をHBGA不適合性の同種移植片に効果的に変換する。この多機能性薬剤は、腫瘍新生脈管構造を不適合性HBGAに変換し、それによって超急性拒絶反応を開始するようにPSMA/FOLH1を標的化するのに使用することができる。
本明細書に記載のように、異種移植片または同種移植片に対する活発な免疫応答と、過去半世紀にわたって発展してきた拒絶反応プロセスの理解を基にして補完的なオルソゴナルな免疫療法アプローチが作られた。これを成し遂げるために、宿主体移植片応答のもっとも極端な形態、すなわち超急性拒絶反応(HAR)がモデルとして選択された。
HARは、2つの高度に関連する遺伝子:異種移植片の場合ではα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,3GalT)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Collins, et al., 「Cardiac Xenografts Between Primate Species Provide Evidence for the Importance of the Alpha-Galactosyl Determinant in Hyperacute Rejection」, J. Immunol. 154:5500-5510 (1995))と、同種移植片の場合では、周知の組織血液型抗原(HBGA)遺伝子座(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Milland et al., 「ABO Blood Group and Related Antigens, Natural Antibodies and Transplantation」, Tissue Antigens 68:459-466 (2006))のいずれかにおける祖先変異の結果として発生する。これらの2つの高度に関連する遺伝子は同じ染色体(9q34)上に見出され、45％相同性を有し、同じ先祖遺伝子に由来すると考えられている(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Yamamoto et al., 「Molecular Genetic Basis of the Histo-Blood Group ABO System」, Nature 345:229-233 (1990); Yamamoto et al., 「Sugar-Nucleotide Donor Specificity of Histo-Blood Group A and B Transferases is Based on Amino Acid Substitutions」, J. Biol. Chem. 265:19257-19262 (1990); Yamamoto et al., 「Genomic Organization of Human Histo-Blood Group ABO Genes」, Glycobiology 5:51-58 (1995))。これらの対立遺伝子は、細胞膜発現または分泌に運命づけられた新生タンパク質および脂質に存在する炭水化物(CHO)鎖に末端糖部分を翻訳後に付加するグリコシルトランスフェラーゼをコードする。ヒトおよび旧世界ザルのαGalT酵素は変異のために約2800万年前に不活性化されたが、他の哺乳動物では不活性化されていない(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Macher et al., 「The Gal Alpha1,3Gal Beta1,4GlcNAc-R (Alpha-Gal) Epitope: a Carbohydrate of Unique Evolution and Clinical Relevance」, Biochim. Biophys. 1780:75-88 (2008))。結果として、非霊長類哺乳動物に由来する異種移植された臓器および組織は、ヒトにとっては異物のαgalエピトープを発現する。HBGA遺伝子座の場合、少数の変異によって、A、B、およびOとして古典的に知られている対立遺伝子が生じた。B対立遺伝子は、そのα1,3GalTホモログと同様に、末端GalをCHO鎖に付加するグリコシルトランスフェラーゼB(GTB)をコードする。唯一の違いは、1,2フコースが、隣接するGalに存在する場合にのみ、トランスフェラーゼBはGalを付加することである。トランスフェラーゼAは、Nアセチル化された末端Gal(NAcGal)を付加する点でしか、トランスフェラーゼBと機能的に異ならない。O遺伝子産物はフレームシフト変異のために不活性である(図1)。
これらの3つの活性な酵素によって生じたα-Gal、HBGA A、およびHBGA Bエピトープは、ヒト消化管に生息する細菌を含めて自然界で広範に発現している(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Springer et al., 「Blood Group Isoantibody Stimulation in Man by Feeding Blood Group-Active Bacteria」, J. Clin. Invest. 48:1280-1291 (1969))。結果として、aGalTならびにAおよび/またはB対立遺伝子がないヒトは、これらの細菌由来エピトープによって絶えず免疫化されている。これにより、血漿中免疫グロブリン(Ig)の1％超を構成する、これらの非自己エピトープに対する非常に高レベルの自然抗体(Ab)が生じる(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Galili et al., 「One Percent of Human Circulating B Lymphocytes are Capable of Producing the Natural Anti-Gal Antibody」, Blood 82:2485-2493 (1993); Galili et al., 「A Unique Natural Human IgG Antibody With Anti-Alpha-Galactosyl Specificity」, J. Exp. Med. 160:1519-1531 (1984))。何十億もの異なる特異性にあると推定されるAbレパートリーの多様性を考えると、これは内因性Ig活性の非常に大きな割合に相当する。これらのAbは、IgMと、補体カスケードを活性化し、そして次に血管血栓症を開始することができるIgGで構成される(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Subramaniam et al., 「Distinct Contributions of Complement Factors to Platelet Activation and Fibrin Formation in Venous Thrombus Development」, Blood 129(16):2291-2302 (2017); Foley et al., 「Cross Talk Pathways Between Coagulation and Inflammation」, Circ. Res. 118:1392-1408 (2016); およびConway EM, 「Reincarnation of Ancient Links Between Coagulation and Complement」, J. Thromb. Haemost. 13(Suppl. 1):S121-S32 (2015))。これらのグリコール-エピトープに対してIgAおよびIgEなどの他の免疫グロブリンクラスも作ることができる。実際に、これらの2つの遺伝子に進化的変異があると、転換点に保たれており、初回刺激されており、かつこれらの非自己エピトープのいずれかの出現に対して迅速に、攻撃的に、かつ破壊的に応答する準備ができている免疫学的状態が生まれる。これらの変異の免疫学的作用はヒトにおける異種移植片の成功を妨げてきており、1960年代の腎臓同種移植の初期に、その全体が本明細書において参照により組み入れられるStarzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964)によってHBGA一致の決定的な重要性が最初に認められてから、HBGA一致は、固形臓器移植における、たった一つの最も重要な一致だという理由を説明する。その時から、固形臓器移植におけるHBGA不一致の破滅的作用は、医原性の過誤が起こった非常にまれな場合でしか認められない(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times, Feb 22, 2003)。この背景事情により、宿主のがん細胞によって、および/または腫瘍を供給する血管内皮細胞によって、これらの非自己エピトープのうちの1つの発現を誘導することが目標になった。
図1は、グリコシルトランスフェラーゼの厳密なアクセプター基質特異性を示す。B(またはA)-トランスフェラーゼは、単に、そのそれぞれの糖を、H抗原を発現するグリコシル化部位に付加する。幸運にも、多くの正常組織では、この必要なH抗原が存在しないため、HBGA AまたはBへのオフターゲット変換は阻止される。または、天然でH抗原が無い正常細胞またはがん細胞タイプを意図的に標的とすることが望まれる場合には、これは、AまたはBの添加について説明されたやり方と同様のやり方で、α1-2フコシルトランスフェラーゼも標的化し、フコースドナーとしてGDP-フコースを供給することで成し遂げることができる。フコース/H抗原の添加は、標的化されたAトランスフェラーゼまたはBトランスフェラーゼと同時に行われてもよく、この添加は段階的に行われてもよい(例えば、最初にフコース、次いでAまたはBを添加する)。 図2A～2Bは、キメラAb-GTBタンパク質が免疫反応性および酵素活性を維持することを示す。図2Aは、J591-GTBキメラタンパク質が、ELISAによって測定した親J591抗体と比べて同等の、PSMAへの結合免疫反応性を維持することを示したグラフである。図2Bは、ヌクレオチドドナーであるUDP-14C-ガラクトースから2’-フコシル-ラクトース(2-FL)への14C-ガラクトース転移を触媒する能力によって証明される酵素活性をキメラタンパク質も保持することを示した棒グラフである。この組み込みは、J591-GTB融合タンパク質とそのアクセプター基質である2-FLが存在する時にしか高レベルで起こらない。抗4D5(her2)-GTBを用いて同様の結果が得られた。 図3は、C末端延長によってGTB活性を調節できることを示したグラフである。J591-GTB活性(対照に対する％)を、C末端アミノ酸延長の漸増する長さの関数として示し、UDP-14C-galから2’-フコシル-ラクトース(2-FL)への14C-galの取り込みによって測定した。 図4は、J591-GTBが抗原陽性腫瘍細胞を特異的に変換することを示した画像である。CWR22Rv1異種移植片(異種的にPSMA+/HBGA O)に由来する組織切片をJ591-GTB+UDP-galとインキュベートし、HBGA B発現があるかどうか免疫組織化学染色した(左パネル)。二次抗マウスIg-ペルオキシダーゼを含むが、マウス抗HBGA B(中央のパネル)またはJ591-GTB(右パネル)がない負の対照切片は染色されなかった。 図5は、LNCaP細胞およびPC3細胞に対するJ591-GTBの効果を示した画像である。J591-GTBによってHBGA Bに変換されたLNCaP細胞(PSMA+/HBGA O; 左パネル)。PC3細胞(PSMA-/HBGA O;右パネル)はJ591-GTBによって変換されない。 図6A～6Dは、PC3細胞をPSMAでトランスフェクトし、次いで、J591-GTBで処理したことを示した画像である。図6Aは位相差画像を示す。図6BはPSMA発現細胞を示す。図6CはHBGA B抗原発現を示す。図6Dは図6Bおよび図6Cの合成である。PSMA発現細胞しかHBGA B発現に変換されなかった。PSMA-neg細胞は、主として左の中央と上の中央にあり、HBGA B-negのままである。 図7は、O型RBC懸濁液に加え、J591(上の横列);J591-GTB(中央の横列)、またはJ591-GTB-54aa延長(下の横列)とインキュベートしたLNCaP細胞を示した画像である。左の縦列は位相差画像を示す。中央の縦列はDAPI核染色を示す。右の縦列はマウス抗HBGA B+ヤギ抗マウスIgM-alexa488を示す。PSMA-pos LNCaP細胞は、C末端延長があってもなくても、細胞の原形質膜に結合したJ591-GTBによってHBGA B-posに変換されたが、PSMA-neg RBCは変換されない。 図8A～8Dは、インビトロでの補体媒介性溶解を示した画像である。LNCaP細胞を天然mAb J591またはmAb J591-GTB融合タンパク質のいずれかとインキュベートした。全てのウェルにUDP-galも入れた。その後に、A型患者からの血清を天然抗B Abおよび補体の供給源として添加した。J591-GTB+A型血清の組み合わせ(図8A)によってLNCaPが完全に溶解した。J591-GTB融合タンパク質はA型血清の非存在下では溶解を誘導しなかった(図8B)。融合タンパク質がなければ、A型血清の存在(図8C)にも非存在(図8D)にも関係なく溶解は検出されなかった。 図9は、いくつかの細胞株の補体媒介性細胞傷害を示した画像である。トリパンブルー排除によって観察されるように、いくつかの細胞株の補体媒介性細胞傷害を示した。上パネルをJ591-GTB+UDP-gal+ヒトO型血清で処理した。下パネルでは細胞を同じO血清で処理したが、J591-GTB+UDP-galはなかった。FACSによって求めた死細胞の割合を、それぞれの写真の下に報告した(図10)。FACSのために、J591-GTB+UDP-galのないO型血清が負の対照として役に立った。これに対して、0.1％triton曝露は完全溶解対照となった。 図10A～10Hは、前立腺がんおよび乳がんがHBGA Bにインビボで変換されたことを示した画像である。図10A～10Dは、PBS+UDP-gal(図10A)、b)J591+UDP-gal(図10B)、およびJ591-GTB+UDP-gal(図10C)を投与して24時間後のSCIDマウスにおけるLNCaP異種移植片による連続切片を示す。図10A～10Cは、HBGA Bが免疫組織化学染色されている(全て10x)。図10Dは、PSMAが染色された同じ標本に由来する連続切片を示す。さらに高い倍率と、さらなる異種移植片株については図12A～12Eも参照されたい。図10E～10Hは、PBS+UDP-gal(図10E)、4D5+UDP-gal(図10F)、4D5-GTB+UDP-gal(図10Gおよび10H)で処置した後のMD-MB361乳がん(HER2+)異種移植片を示す。切片はHBGA B発現について免疫組織化学染色されている。別個の原形質膜染色が明らかである。図10Cおよび10Hでは、隣接する結合組織は変換されていない。このことから、免疫表現型変換の特異性は標的腫瘍に制限されることが証明される。 図10-1の説明を参照のこと。 図11A～11Bは、FACSによって測定したヨウ化プロピジウム取り込みとトリパンブルー排除(図9を参照されたい)によって確かめた時のO型血清によるB変換細胞株溶解を示した棒グラフ(図11A)とヒストグラム(図11B)である。B変換の非存在下ではO血清は溶解を引き起こさない。PSMA-pos細胞をJ591-GTB+UDP-galで処理した後に、O型血清はPSMA-pos/B変換細胞株の全てを完全に溶解した。PC3はHBGA O-pos/PSMA-negであり、HBGA Bに変換されず、溶解されなかった。 図11Aの説明を参照のこと。 図11Aの説明を参照のこと。 図11Aの説明を参照のこと。 図12A～12Eは、J591-GTBによるLNCaP、C4-2、およびCWR22Rv1異種移植片のインビボ変換を示した画像である。図12A～12Bは、インビボで、J591[GTBなし](図12A)またはJ591-GTB(図12B)で両方ともUDP-galと共に処置し、マウス抗HBGA Bを用いて免疫組織化学染色したLNCaP異種移植片を示す。高倍率。図12Cは、インビボでJ591-GTB+UDP-galで処置し、マウス抗HBGA Bを用いて免疫組織化学染色したC4-2前立腺がんを示す。高倍率。図12D～12Eは、インビボで、J591-GTB+UDP-galで処置したCWR22Rv1前立腺がん、異種的に、かつ弱いPSMA-posを示す。隣接する結合組織はHBGA Bに変換されなかった。 図13A～13Bは、HBGAのインビボ変換および処置を示したマウスのグラフ(図13A)およびインビボ画像(図13B)である。マウスに、マトリゲルに懸濁した10x106個のC4-2-luc細胞をI.P.移植した。数日後にバイオルミネセンスを測定し、確認された、成長可能な腫瘍がある10匹のマウスを2つの処置群の1つに無作為に割り当てた。全ての担癌マウスに単一用量のJ591-GTB+UDP-gal+ヒトO型血清を与えた。半分のマウスでは、注射前に血清を熱失活させた。活性O型血清で処置したマウスでは、光量子束の平均はその後13日にわたって漸進的に減少したが、不活性化血清で処置したマウスは平均的な腫瘍進行を経験した。13日目の実験終了時に群間のバイオルミネセンスの差は有意であった(p<0.0032)。二度繰り返した実験から、首尾一貫した結果が得られた。 図13Aの説明を参照のこと。 図13Aの説明を参照のこと。 図14A～14Bは、C4-2-luc細胞をIP移植した後に、J591-GTB+UDP-gal+ヒトO型血清(上の横列)(図14A)で1回処置した実験#2の結果を示したインビボ画像およびグラフである。図14Aは、活性O型血清、または前もって熱失活されているO型血清を与えたマウスの画像を示す。熱失活血清を与えたマウスから腫瘍進行が証明されたのに対して(光量子束プロットを参照されたい;図14B)、活性血清を与えたマウスは腫瘍が退縮した。実験1の結果を図13A～13Bに示した。 図14A-1の説明を参照のこと。 図14A-1の説明を参照のこと。 図15は、MM1-S細胞におけるCD19、CD20、およびCD38発現を示したFACSヒストグラムである。フローサイトメトリー分析から、MM1-S多発性骨髄腫細胞株はCD38陽性、CD19陽性、およびCD20陰性であることが分かった。 図16A～16Bは、MM1-S細胞のABO発現を示したFACSヒストグラムである。図16Aは、MM1-S多発性骨髄腫細胞株がA/B陰性であることを示す。図16Bは、MM1-S多発性骨髄腫細胞株がO陽性であることを示す。 図16Aの説明を参照のこと。 図17は、CD19+/O+MM1-Sミエローマ細胞がGTB+UDP-galによってB+に変換できることを示したFACSヒストグラムである。抗CD19、抗CD38、または抗BCMAを用いてGTBをミエローマ細胞に標的化することができる。 図18は、GTBに結合体化した、PSMA結合低分子リガンドであるACUPA(ACUPA-GTB)の使用がHBGA OからHBGA BへのLNCaP変換を誘導することを証明した画像である。これにより、酵素の標的化目的で、抗体(または抗体誘導体)の他に、腫瘍細胞または新血管内皮の表面にある標的抗原に結合する低分子リガンドまたはペプチドも使用できることが証明される。左パネルは、ACUPA-PEG-1500-GTBで処理した細胞を示す。右パネルは、GTBのみで処理した細胞を示す。 図19は、HBGA OからHBGA Bへの変換の特異性を示した画像である。SK-BR5乳がん細胞(PSMA-/O+)をLNCaP前立腺がん細胞(PSMA+/O+)と同時培養した。2種類の細胞タイプは形態によって区別することができる。すなわち、SK-BR5は円形であるのに対して、LNCaP細胞は楕円形/紡錘形である。さらに、LNCaP細胞を緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識した。J591-GTBおよびUDP-galとインキュベートすることでPSMA+LNCaP細胞だけが変換され、PSMA標的がない隣接細胞は変換されない。パネルは、DAPI(左パネル)、GFP(中央のパネル)、および抗B(Cy5)(右パネル)画像化を示す。 図20は、HBGA OからHBGA Bへの変換の特異性を示した画像である。示したように、J591-GTB/UDP-galによってPSMA+細胞だけがB+に変換される。 図21A～21Bは、HBGA OからHBGA Bへの変換の特異性を示したFACSヒストグラムである。変換の特異性は、FACSを用いて、SK-BR5(PSMA-neg)細胞(図21B)と比べて、LNCaP(PSMA+)からHBGA Bに変換するのに必要なJ591(抗PSMA)-GTB濃度(図21A)を比較することによって定量した。両細胞株ともO+である。FACSヒストグラムを示した。SK-BR5のB変換は100μg/mLまでのJ591-GTB濃度でも起こらない。これに対して、PSMA陽性LNCaP細胞の変換は0.012μg/mLと低い濃度でも誘導される。 図21Aの説明を参照のこと。 図22は、HBGA OからHBGA Bへの変換の特異性を示した表およびグラフである。図21A～21BからのMFIの表(左パネル)およびヒストグラムを示した(右パネル)。特異性指数(specificity index)は8,000:1を上回る。 図23は、細胞表面糖タンパク質と分泌型糖タンパク質が両方とも本開示の方法によってグリコシル化されることを示した表およびグラフである。細胞数のグラフ(上パネル)および表(下パネル)を示した。 図24A～24Bは、血清試料中にある抗α1,3GalT抗体の試験を示したプロットである。図24Bは、低光学密度を示した図24Aの拡大図である。 図25は、組換えタンパク質の発現および精製を示したSDS-PAGEゲルである。 図26A～26Bは、scfv-CD19-αGalとCD19-MM1.S細胞(図26A)およびCD19+Raji細胞)(図26B)との結合を示したグラフである。 図27は、CD19+細胞およびCD19-細胞に対するガラクトース転移アッセイを示したグラフである。 図28は、CD19+細胞に対するガラクトース転移アッセイを示したヒストグラムである。 図29は、ヒトB細胞へのscfv-αGTの結合およびαGal転移試験を示した散布図である。 図30は、CD19+細胞に対する血清媒介性溶解アッセイを示したドットプロットである。 図31A～31Bは、αGalトランスフェクトB細胞に対する溶解アッセイを示したグラフである。図31Aは、％溶解を示したグラフである。図31Bは、IgGレベル(MFI)およびIgMレベルを示したグラフである。 図32A～32Cは、scfv-CD19-αGTとUDP-Galのインビトロチェッカーボードアッセイを示す。図32Aは結合を測定し、図32Bはαgal発現を測定し、図32CはヒトPBMCによる溶解を測定する。 図32Aの説明を参照のこと。 図32Aの説明を参照のこと。 図33は、ベースライン時の、ならびに抗CD19 scFv-αGalトランスフェラーゼ融合タンパク質とUDP-galを投与して1時間後、4時間後、1日後、7日後、14日後、30日後、および60日後の％残存B細胞を示した棒グラフである。CD20+/CD3-蛍光を調べることでB細胞数を求めた。CD20を用いて、抗CD19 scFvの存在によるB細胞数の取り違えを回避した。
詳細な説明
本開示は、腫瘍関連抗原を標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換する酵素とを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質を開示する。前記酵素は標的化成分に接続されている。
標的化成分は抗体由来(インタクト、一価の単鎖、Fab’2、Fab、scFvなど)でもよく、ペプチドでもよい。標的化部分および酵素部分は融合遺伝子/タンパク質を作製することによって連結されてもよく、生化学的結合体化を介して連結されてもよい。
本開示はまた、がんを処置する方法にも関する。前記方法は、がんを有する対象を選択する工程および本開示に従う二機能性治療用物質を提供する工程を含む。二機能性治療用物質は、がんを処置するのに有効な条件下で、選択された対象に投与される。
本明細書で使用する「処置する」という用語は、対象、例えば、患者に本開示の二機能性治療用物質を適用または投与することを指す。処置は、がん、がんの症状、またはがんの素因を治癒するか、治すか、軽減するか、緩和するか、変えるか、いやすか、寛解させるか、和らげるか、改善するか、または影響を及ぼすことでもよい。
本明細書で使用する「対象」という用語はヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、ハ虫類などを含む。
本明細書で使用する「がん」という用語は、病理組織学的タイプまたは侵襲性の段階に関係なく、全てのタイプのがん成長または発癌プロセス、転移組織または悪性形質転換された細胞、組織、もしくは臓器を含む。
本明細書で使用する「不適合性同種移植片」は、超急性、急性、および/または慢性の免疫拒絶反応を誘導する組織または腫瘍を指す。超急性拒絶反応は臓器移植の数分後から数時間後に、すなわち、本明細書に記載のように二機能性治療用物質が送達されて腫瘍または組織が変換された後に現れる。この急速な拒絶反応は、移植片/腫瘍の壊死につながる血管血栓症を特徴とする。超急性拒絶反応は、移植/変換前にレシピエントにある抗ドナー抗体の存在によって引き起こされる。
本明細書で使用する「標的化成分」は、腫瘍関連抗原に結合するか、または別の方法で一緒になることができる成分である。このような腫瘍関連抗原は、以下の腫瘍関連抗原ならびにそのペプチド断片:FOLH1/PSMA、VEGFR、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD38、CD52、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD79、ソマトスタチン受容体、5T4、gp100、癌胎児抗原(CEA)、マンモグロビンA、メランA/MART-1、MAGE、NY-ESO-1、PSA、チロシナーゼ、HER-2/neu、HER-3、EGFR、hTERT、メソテリン、ネクチン-4、TROP-2、組織因子、MUC-1、CA-125、およびそのペプチド断片、タンパク質MZ2-E、多形性上皮ムチン、葉酸結合タンパク質、がん精巣タンパク質MAGE-1またはMAGE-3またはNY-ESO-1、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、αフェトプロテイン(AFP)、膵臓癌胎児性抗原、CA-15-3、19-9、549、195、扁平上皮癌抗原(SCCA)、卵巣がん抗原(OCA)、膵臓がん関連抗原(PaA)、変異K-rasタンパク質、変異p53、非変異p53、切断型上皮増殖因子受容体(EGFR)、キメラタンパク質p210BCR-ABL、テロメラーゼ、サバイビン、WT1タンパク質、LMP2タンパク質、HPV E6E7タンパク質、イディオタイプタンパク質、ならびにPAPタンパク質を含むが、これに限定されない。前述のリストは腫瘍関連抗原を例示する。さらなる腫瘍関連抗原が当業者に公知である。
抗原は、例えば、肺、乳房、食道、腸、胃、直腸、腎臓-泌尿器系、前立腺、膀胱、脳、甲状腺、肝臓、膵臓、脾臓、皮膚、結合組織、心臓、血液系、または血管系の中にある腫瘍細胞上に存在する抗原またはエピトープでもよい。標的抗原は、細胞膜、分泌タンパク質の表面に、または非膜結合タンパク質の表面に存在する抗原またはエピトープでもよい。分泌タンパク質の例はホルモン、酵素、毒素、および抗菌性ペプチドを含むが、これに限定されない。
標的化成分は、特定の標的化部位、例えば、腫瘍、疾患部位、組織、臓器、細胞タイプ、感染性の細菌またはウイルスなどに局在してもよく、集中してもよい。
例えば、意図される標的化成分は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、アプタマー、炭水化物、または脂質を含む。標的化成分は、細胞表面受容体に対する天然リガンドまたは合成リガンド、例えば、増殖因子、ホルモン、LDL、トランスフェリンなどでもよい。標的化成分は抗体でもよく、この用語は、抗体断片および誘導体、抗体の特徴的な部分、例えば、ファージディスプレイなどの手順を用いて特定することができる単鎖標的化部分を含むことが意図される。標的化成分はまた、天然であっても、(例えば、化学合成を介して)人工的に作り出されていても、標的化ペプチド、標的化ペプチドミメティック、または低分子でもよい。
一態様では、標的化成分は、抗体またはその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、およびアプタマー、および低分子からなる群より選択される。
腫瘍関連抗原に対する抗体は公知である。例えば、腫瘍によって産生されたか、またはそれに関連するマーカーに特異的に結合する抗体および抗体断片が、特に、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Hansenへの米国特許第3,927,193号、ならびにGoldenbergへの米国特許第4,331,647号、同第4,348,376号、同第4,361,544号、同第4,468,457号、同第4,444,744号、同第4,818,709号、および同第4,624,846号に開示されている。特に、腫瘍関連抗原、例えば、胃腸腫瘍、肺腫瘍、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、またはリンパ腫瘍もしくは造血腫瘍、肉腫もしくはメラノーマに対する抗体が有利に用いられる。腫瘍関連抗原に対する抗体は当業者に周知である。
本開示の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体(「イントラボディ(intrabody)」)、抗体断片(例えば、Fv、Fab、およびF(ab)2)、半抗体(half-antibody)、ハイブリッド誘導体、ならびに単鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、および脱免疫またはヒト化された抗体を含む様々な形態で存在し得る(Ed Harlow and David Lane, USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Houston et al., 「Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Bird et al, 「Single-Chain Antigen-Binding Proteins」, Science 242:423-426 (1988)。これらのそれぞれが、その全体が本明細書において参照により組み入れられる)。
本開示の抗体はまた、例えば、バクテリオファージによって発現された抗体またはその断片などの組換えDNA技術を用いて作製されてもよい。代わりに、本開示の抗体をコードおよび発現するDNA分子を合成することによって、または抗体を指定するアミノ酸配列を合成することによって合成抗体が作製される。この場合、DNA配列またはアミノ酸配列は、利用可能な、かつ当技術分野において周知の合成DNA配列技術またはアミノ酸配列技術を用いて入手されている。
モノクローナル抗体産生のための方法は、本明細書に記載の技法を用いて実施されてもよく、または当技術分野において周知である(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、MONOCLONAL ANTIBODIES - PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATIONS (Mary A. Ritter and Heather M. Ladyman eds., 1995))。一般的に、このプロセスは、インビボまたはインビトロのいずれかで以前に、関心対象の抗原で免疫化されている哺乳動物の脾臓から免疫細胞(リンパ球)を入手することを伴う。
または、モノクローナル抗体は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Cabillyらへの米国特許第4,816,567号に記載のように組換えDNA法を用いて作ることができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用してRT-PCRによって単離される。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは適切な発現ベクターにクローニングされ、発現ベクターがなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)細胞、シミアンCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはミエローマ細胞にトランスフェクションによって導入されると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。同様に、ファージディスプレイライブラリーからでも、望ましい種の組換えモノクローナル抗体またはその断片を単離することができる(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、McCafferty et al., 「Phage Antibodies: Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains」, Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., 「Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries」, Nature 352:624-628 (1991);およびMarks et al., 「By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage」, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、別の抗体または誘導体を生じるように組換えDNA技術を用いてさらに改変することができる。例えば、キメラ抗体を生じるように、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常ドメインと置換することができる。または、融合抗体を生じるように、モノクローナル抗体の軽鎖および/または重鎖の定常ドメインを非免疫グロブリンポリペプチドと置換することができる。他の態様では、モノクローナル抗体の望ましい抗体断片を生じるように定常領域が切断または除去される。さらに、可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いてモノクローナル抗体の特異性および親和性を最適化することができる。
本開示のモノクローナル抗体はヒト化抗体でもよい。ヒト化抗体は、可変領域内にある、非ヒト(例えば、マウス)抗体に由来する最小配列を含有する抗体である。このような抗体は、ヒト対象に投与された時に抗原性およびヒト抗マウス抗体応答を低減するように治療的に用いられる。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、最小限の非ヒト配列しかないか、非ヒト配列がないヒト抗体である。ヒト抗体は、ヒトによって産生された抗体であるか、またはヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。
抗体全体に加えて、本開示は、このような抗体の抗原結合部分を含む。このような結合部分は、一価Fab断片、Fv断片(例えば、単鎖抗体、scFv)、ならびに単一の可変VHおよびVLドメイン、ならびにF(ab’)2断片、Bis-scFv、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディなどを含む。これらの抗体断片は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、James Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE 98-118 (Academic Press, 1983)、およびEd Harlow and David Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)に記載のようなタンパク質分解断片化手順などの従来の手順によって作られてもよく、当技術分野において公知の他の方法によって作られてもよい。
さらに、特に抗体断片の場合には血清中半減期を延ばすように抗体を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体断片にある適切な領域を変異させることで、サルベージ受容体結合エピトープを抗体断片に組み込むことで、または(例えば、DNA合成もしくはペプチド合成によって)このエピトープをペプチドタグに組み込み、次いで、抗体断片の末端もしくは中央において融合させることで成し遂げることができる。
抗体模倣物も本開示に従う使用に適している。第10ヒトフィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)に由来するモノボディとして知られる抗体模倣物(Koide et al., 「The Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins」, J. Mol. Biol. 284:1141-1151 (1998); Koide et al., 「Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins: Application to the Estrogen Receptor」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1253-1258 (2002)。これらのそれぞれが、その全体が本明細書において参照により組み入れられる);およびブドウ球菌プロテインAの安定したα-ヘリックス細菌受容体ドメインZに由来するアフィボディ(affibody)として知られる抗体模倣物(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Nord et al., 「Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain」, Nature Biotechnol. 15(8):772-777 (1997))を含むが、それに限定されるわけではない多数の抗体模倣物が当技術分野において公知である。
ある特定の態様では、標的化成分は前立腺特異的膜抗原(PSMA)受容体を標的とする。
本明細書で使用する「PSMA」または「前立腺特異的膜抗原」タンパク質は、哺乳動物PSMA、好ましくはヒトPSMAタンパク質を指す。PSMAは、FOLH1遺伝子によってコードされる時には葉酸加水分解酵素1(FOLH1)と呼ばれる時もある。PSMAの長い転写物は、トランスフェリン受容体と配列相同性を有し、NAALADase活性を有するII型膜貫通受容体として特徴付けられる約100～120kDa分子量のタンパク質産物をコードする(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Carter et al., 「Prostate-Specific Membrane Antigen is a Hydrolase With Substrate and Pharmacologic Characteristics of a Neuropeptidase」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:749-753 (1996); Israeli et al., 「Molecular Cloning of a Complementary DNA Encoding a Prostate-Specific Membrane Antigen」, Cancer Research 53:227-230 (1993))。
本開示の二機能性治療用物質の中の標的化成分としてモノクローナル抗PSMA抗体を使用することができる。好ましくは、このモノクローナル抗体は、PSMAの細胞外ドメイン(すなわち、細胞外に位置するPSMAエピトープ、例えば、ヒトPSMAの約アミノ酸44-750にあるPSMAエピトープ。このアミノ酸残基は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許第5,538,866号に開示されるヒトPSMA配列に対応する))に結合する。ヒトPSMAに対するマウスモノクローナル抗体の例は、ATCCアクセッション番号HB-12101を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されたE99、ATCCアクセッション番号HB-12109を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されたJ415、ATCCアクセッション番号HB-12127を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されたJ533、およびATCCアクセッション番号HB-12126を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されたJ591を含むが、これに限定されない。これらの全てが、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許第6,107,090号および米国特許第6,136,311号に開示される。最も好ましくは、マウスモノクローナル抗体は、HB-12126によって産生されたJ591、またはその全体が本明細書において参照により組み入れられるBanderらへの米国特許第7,045,605号および同第7,514,078号に記載の脱免疫J591抗体である。
一部の態様では、標的化成分はHER受容体ファミリーメンバーを標的とする。HER受容体ファミリーメンバーの例示的な標的化成分はモノクローナル抗体4D5である。
ある特定の態様では、標的化成分は、腫瘍関連抗原に結合するペプチドである。例示的なペプチドは、グルタミン酸-尿素-リジン誘導体、例えば、FOLH1/PSMAに結合する2(3-99S)-5-アミノ-1-カルボキシペンチル)ウレイド)ペンタン二酸(ACUPA)、SSTR2に結合するソマトスタチン誘導体、およびα-v/β-3インテグリンに結合するArg-Gly-Asp(RGD)ペプチドを含むが、それに限定されるわけではない。
本開示と一緒に用いられるペプチドは、天然供給源から公知の単離および精製プロトコールによって入手されてもよく、ペプチドの公知のペプチド配列に従って標準的な固相ペプチド合成法または液相ペプチド合成法によって合成されてもよく、市販の調製物またはペプチドライブラリーから入手されてもよい。天然ペプチドの生物学的結合特性を示し、天然ペプチドの特異的結合特性を保持しているペプチドが本明細書に含まれる。本明細書で使用するペプチドが天然ペプチドの特異的結合特性を保持していれば、本明細書で使用するペプチドの誘導体および類似体は、前記ペプチドの個々のアミノ酸の組成、同一性、および誘導体化の改変を含む。このような改変の例は、D-立体異性体、芳香族アミノ酸の芳香族側鎖における置換、側鎖に、アミノ基またはカルボキシル基を含有するアミノ酸の側鎖におけるアミノ基またはカルボキシル基の誘導体化、前記ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端における置換、前記ペプチドと第2のペプチドまたは生物学的活性部分との結合、ならびに前記ペプチドの環化を含むような任意のアミノ酸の改変を含むだろう(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、G. Van Binst and D. Tourwe, 「Backbone Modifications in Somatostatin Analogues: Relation Between Conformation and Activity」, Peptide Research 5:8-13 (1992))。
本明細書で使用する「低分子」は、典型的に、10,000Da未満、好ましくは5,000Da未満、より好ましくは1,000Da未満、最も好ましくは500Da未満の分子量を有する有機分子、ペプチド分子、または非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターは、化学合成された分子、例えば、コンビナトリアル化学ライブラリーに由来する化合物を含む。
ある特定の態様では、標的化成分はアプタマーである。アプタマーは、高い親和性および特異性で標的分子(例えば、腫瘍関連抗原)に特異的に結合する小さな一本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはRNAオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Ellington et al., 「In Vitro Selection of RNA Molecules That Bind Specific Ligands」, Nature 346:818-822 (1990)、およびJayasena, 「Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics」, Clin. Chem. 45:1628-1650 (1999)に記載されている試験管内進化法(SELEX)と呼ばれるインビトロ選択プロセスを用いて作り出される。MUC1、HER2、HER3、EpCAM、NF-kB、PSMA、CD44、PD-1、CD137、CD134、PDGF、VEGF、およびNCLを含むが、それに限定されるわけではない腫瘍関連抗原を標的化できる、いくつかのアプタマーが開発されている(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Jayasena, 「Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics」, Clin. Chem. 45:1628-1650 (1999))。
本明細書で使用する「酵素」という用語は、標的化成分によって腫瘍または組織に送達された時に、腫瘍または組織を不適合性同種移植片に変換するのを触媒する任意の酵素、タンパク質、またはペプチドを含む。
一態様では、酵素は、翻訳後修飾に関与する酵素であり、トランスフェラーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される。
トランスフェラーゼは、ある分子(ドナーと呼ばれる)から別の分子(アクセプターと呼ばれる)への特定の官能基(例えば、メチル基またはグリコシル基)を転移する酵素クラスのいずれか一つである。
トランスフェラーゼの例示的なグループはグリコシルトランスフェラーゼを含むが、それに限定されるわけではない。グリコシルトランスフェラーゼは、活性化された糖(ドナーNDP-糖)を、タンパク質、糖タンパク質、脂質もしくは糖脂質に、または成長中のオリゴ糖の非還元末端に段階的に付加するのを触媒する(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Lairson et al., 「Glycosyltransferases: Structures, Functions, and Mechanisms」, Annu. Rev. Biochem. 77:521-55 (2008))。グリコシルトランスフェラーゼは当技術分野において周知である。
哺乳動物はグリコシルトランスフェラーゼのために9種類の糖ヌクレオチドドナー:UDP-グルコース、UDP-ガラクトース、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-キシロース、UDP-グルクロン酸、GDP-マンノース、GDP-フコース、およびCMP-シアル酸を利用する。
グリコシルトランスフェラーゼ反応を伴う酵素的糖類合成のために、グリコシルトランスフェラーゼを任意の供給源からクローニング、すなわち単離することができる。多くのクローニングされたグリコシルトランスフェラーゼが公知であり、同様に、これらのポリヌクレオチド配列も公知である(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、「The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases」, Taniguchi et al., 2002, Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes, Springer, Tokyoを参照されたい)。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と、アミノ酸配列を推定できる、グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列も当技術分野において周知である。
本開示の方法において使用することができるグリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴグリコシルトランスフェラーゼを含むが、これに限定されない。適切なグリコシルトランスフェラーゼは、真核生物ならびに原核生物から得られるグリコシルトランスフェラーゼを含む。
グリコシルトランスフェラーゼはABO血液型抗原系の発生にとって重大な意味を持つ。前記のように、ABO血液系は、輸血および固形臓器移植において重要な第一の抗原系である。この組織血液型抗原(HBGA)系は、糖残基(N-アセチルガラクトサミンまたはガラクトース)を共通基質(H抗原)に取り付けるGTAおよび/またはGTBグリコシルトランスフェラーゼの活性によって制御される。この酵素には、取り付けられる炭水化物(N-アセチルガラクトサミン(A)対ガラクトース(B))を変えるか、またはH抗原が改変されないように酵素の機能喪失型を引き起こす(O)、いくつかの表現型バリアントがある。AのバリアントであるA2はN-アセチルガラクトサミン活性とNAc-gal付加のレベルが低下している。これらのバリアントは、現在、血清学によって、および(Al対A2を定義する)レクチン結合によって区別される。血清学によってH抗原の改変を検出することができる、またはAおよび/もしくはBに対して作られた天然抗体の存在を検出することができる(例えば、Bのグリコシル化パターンをもつ人には、Aに対して作られた抗体がある)。
ヒトでは、本明細書中でABO遺伝子座またはABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子座と呼ばれるグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子座は第9染色体に位置し、18kb超のゲノムDNAにまたがる7つのエキソンを含有する。エキソン7は最大のエキソンであり、コード配列の大部分を含有する。ABO遺伝子座には、3つの主な対立遺伝子型:A、B、およびOがある。A「対立遺伝子」(AlまたはA2とも呼ばれる)は、N-アセチルガラクトサミンをH抗原のD-ガラクトース末端に酵素的に付加して、いわゆるA抗原を生じるグリコシルトランスフェラーゼをコードする。B対立遺伝子は、D-ガラクトースをH抗原のD-ガラクトース末端に酵素的に付加し、従って、いわゆるB抗原を作り出すグリコシルトランスフェラーゼをコードする。O対立遺伝子は、グリコシルトランスフェラーゼの非機能型をコードし、その結果、H抗原は改変されず、いわゆるO抗原表現型が生じる。
ゲノムレベルでは、ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は多くの対立遺伝子(約300)を有する。これらの天然の対立遺伝子バリアントは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Yip, 「Sequence Variation at the Human ABO Locus」, Ann. Hum. Genet. 66:1-27 (2002); Hakomori 「Antigen Structure and Genetic Basis of Histo-Blood Group A, B, and O: Their Changes Associated with Human Cancer」, Biochimica et Biophysica Acta 1473:247-266 (1999); Seto et al., 「Sequential Interchange of Four Amino Acids from Blood Group B to Blood Group A Glycosyltransferase Boosts Catalytic Activity and Progressively Modifies Substrate Recognition in Human Recombinant Enzymes」, J. Biol. Chem. 272:14133-14138 (1997)に記載され、本開示の二機能性治療用物質における、その使用が意図される。酵素の触媒部位をコードする配列は遺伝子のエキソン7にある。重要なアミノ酸残基176、235、266、および268は、この活性部位の特異性を制御する。さらに、エキソン6にある共通のヌクレオチド欠失は、完全長グリコシルトランスフェラーゼの合成を消失させる停止コドンを生じ、それによってOまたはヌル表現型が生じる。
従って、一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(acetylgalactosaminlytransferase))、グリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)、α-gal-トランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼA(Gly268Ala)からなる群より選択される。前記のような対立遺伝子バリアントも意図される。
一部の態様では、本開示の方法において用いられるグリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは当業者に公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼは、GDP-フコースからL-フコースをアクセプター糖のヒドロキシ位置に転移する酵素を含む。非ヌクレオチド糖をアクセプターに転移するフコシルトランスフェラーゼも本開示において役に立つ。
一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼは、ヒト化または脱免疫されたグリコシルトランスフェラーゼである。タンパク質をヒト化または脱免疫する方法は当技術分野において公知である。
従って、本開示の一態様は、腫瘍標的化グリコシルトランスフェラーゼによる、腫瘍上での血液型抗原発現および/または腫瘍血液供給の変化に関する。前記のように、これは腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に効果的に変換し、それによって超急性拒絶反応を開始する。
本明細書に記載の二機能性治療用物質は、標的化成分が、ペプチド結合を介して酵素に連結されているタンパク質またはペプチドになるように形成されてもよい。
ある特定の態様では、ペプチド結合を介して酵素に連結されているタンパク質またはペプチド標的化成分はキメラタンパク質または融合タンパク質と呼ばれることがある。本明細書で使用する「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」という用語は、1本の連続したポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結された一続きの連続したアミノ酸、または少なくとも、第1のポリペプチド配列の完全長配列の一部と、少なくとも、第2のポリペプチド配列の完全長配列の一部を含み、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドが異なるポリペプチドである、共有結合もしくは非共有結合によって互いに連結されている一続きのポリペプチド鎖(すなわち、ポリペプチド複合体)を有するポリペプチドを含む。キメラポリペプチドはまた、同じポリペプチドに由来する2つ以上の非連続部分を含むポリペプチドも含む。キメラポリペプチドまたはタンパク質はまた、少なくとも1つの置換を有するポリペプチドも含み、キメラポリペプチドは、第1のポリペプチド配列の一部が第2のポリペプチド配列の一部によって置換されている第1のポリペプチド配列を含む。一続きのポリペプチド鎖は、適切な生化学的リンカーまたはジスルフィド結合を用いて共有結合により連結されてもよい。
標的化成分と酵素の接続はまた化学結合を用いて調製されてもよく(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Brennan et al., 「Preparation of Bispecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1 Fragments」, Science 229:81-3 (1985))、化学カップリングを用いて調製されてもよい(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Shalaby et al., 「Development of Humanized Bispecific Antibodies Reactive With Cytotoxic Lymphocytes and Tumor Cells Overexpressing the HER2 Protooncogene」, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))。
他の態様では、標的化成分と酵素は、水素結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、および疎水性相互作用を含むが、それに限定されるわけではない非共有結合を介して連結されてもよい。
従って、標的化成分(例えば、抗体)と酵素の間の融合または連結は、従来の共有結合もしくはイオン結合、遺伝子工学によるタンパク質融合、またはヘテロ二官能性クロスリンカー、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによって成し遂げられ得る。単に、標的化成分と酵素の間に望ましい量の空間を設ける従来の不活性リンカー配列(例えば、ペプチドリンカー)も使用されることがある。このようなリンカーの設計は当業者に周知であり、例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許第8,580,922号;同第5,525,491号;および同第6,165,476号に記載される。共有結合によるタンパク質結合体化のために様々なカップリング剤または架橋結合剤を使用することができる。架橋結合剤の例は、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)を含む(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Karpovsky et al., 「Production of Target-Specific Effector Cells Using Hetero-Cross-Linked Aggregates Containing Anti-Target Cell and Anti-Fc Gamma Receptor Antibodies」, J. Exp. Med. 160(6):1686-701 (1984); Liu et al., 「Heteroantibody Duplexes Target Cells for Lysis by Cytotoxic T Lymphocytes」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(24):8648-52 (1985)を参照されたい)。他の方法は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Paulus, Behring Ins Mitt No 78, 1 18-132 (1985); Brennan et al., 「Preparation of Bispecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1 Fragments」, Science 229:81-83 (1985); Glennie et al., 「Preparation and Performance of Bispecific F(ab’ gamma)2 Antibody Containing Thioether-Linked Fab’ Gamma Fragments」, J. Immunol. 139:2367-2375 (1987)に記載の方法を含む。
標的化成分を酵素に接続するのに多数の他のリンカーを使用することができる。例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Saito et al., Adv. Drug Delivery Reviews 55:199-215 (2003)に記載のようにジスルフィド結合を使用することができる。ヒドラゾン、ケタール、および/またはアコニット酸を含む、エンドソームまたは腫瘍環境において見出される低pHに対して感受性のリンカーも使用することができる。ハイブリッドリンカー、例えば、2つ以上の、可能性のある切断部位、例えば、ジスルフィドおよびヒドラゾンを有するリンカーも使用することができる。ペプチダーゼ感受性リンカー、例えば、腫瘍特異的ペプチダーゼ、例えば、PSAによる切断に対して感受性のリンカーも使用することができる。PEGリンカーも使用することができる(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Wiiest et al., Oncogene 21:4257-4265 (2002))。例示的なリンカーは、ヒドラゾンおよびジスルフィドハイブリッドリンカー(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Hamann et al., Bioconjugate Chem. 13:47-58 (2002); Hamann et al., Bioconjug Chem. 13(1):40-6 (2002)を参照されたい);SPP(免疫原);ならびにPierce Biotechnology, Incから入手可能な様々なリンカーを含む。一部の態様では、リンカーは、SSP(ジスルフィドリンカー。Immunogenから入手可能)であり、リンカーと抗体の比は、例えば、7:1～4:1でもよい。様々なスペーサーとリンカー配列が当技術分野において公知であり、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Chen et al., 「Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality」, Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-69 (2013)に記載されている。
「ペプチドリンカー」またはスペーサーという用語は、二機能性治療用物質のポリペプチドの標的化成分と酵素部分をつなぐか、または接続する短いペプチド断片を指す。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合で連結されたアミノ酸で構成される。例えば、ペプチドリンカーは、小さなアミノ酸残基または親水性アミノ酸残基(例えば、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギンなど)を含んでもよい。例えば、ペプチドリンカーは、長さが少なくとも5アミノ酸の、または長さが約5～約100アミノ酸の、または長さが約10～50アミノ酸の、または長さが約10～15アミノ酸アミノ酸配列を有するペプチドである。
一例では、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のある大多数のアミノ酸で構成される。従って、さらなる例では、リンカーはポリグリシン、ポリアラニン、またはポリセリンである。
当業者は、一般的に用いられる多くのペプチドリンカーが本開示の態様において使用され得ることを理解する。ある特定の態様では、短いペプチドリンカーは、リンカー長を増やすために反復単位、例えば、2回反復リンカー、3回反復リンカー、または4回反復リンカーを含んでもよい。一例では、リンカーは式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:1)を含むか、または式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n Ser(SEQ ID NO:2)を含み、式中、nは3～6の数である。一部の態様では、リンカーは(G4S)3リンカー(SEQ ID NO:67)である。
非ペプチドリンカーまたはスペーサーも可能である。例えば、アルキルリンカー、例えば、s=2～20である-NH-(CH2)s-C(O)-を使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル(例えば、C1-C6)、低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニルなどの任意の非立体障害基でさらに置換することができる。例示的な非ペプチドリンカーは、100～5000kD、好ましくは1000～2000kD、より好ましくは1500kDの分子量を有するPEGリンカーまたはスペーサーである。
本開示に従う二機能性治療用物質は、N末端がC末端に接続されてもよい。N末端とC末端は、それぞれ、本開示の二機能性治療用タンパク質のN末端領域または部分とC末端領域または部分を指すために本明細書において用いられる。本開示の一部の態様では、本開示の二機能性治療用物質のC末端部分およびN末端部分は隣接してつながれる。別の態様では、本開示の二機能性治療用物質のC末端部分とN末端部分は介在性のスペーサーによって接続される。一態様では、スペーサーは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多いアミノ酸残基のポリペプチド配列でもよい。一部の態様では、本開示の二機能性治療用物質のC末端部分および/またはN末端部分は、それぞれ、本開示のキメラタンパク質のC末端残基および/またはN末端残基に接続された、さらなる部分を含んでもよい。一部の態様では、さらなる部分は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多いアミノ酸残基のポリペプチド配列でもよい。一部の態様では、このようなさらなる部分を有するC末端部分および/またはN末端部分は、それぞれ、標的化成分の対応する天然N末端部分および/または酵素のC末端部分の活性を維持する。一部の態様では、このようなさらなる部分を有するN末端部分および/またはC末端部分は、それぞれ、標的化成分の対応する天然N末端部分および/または酵素のC末端部分と比較して向上および/または延長した活性を有する。他の態様では、本開示の二機能性治療用物質のC末端部分および/またはN末端部分は、それぞれ、本開示のキメラタンパク質のC末端残基および/またはN末端残基に接続された、さらなる部分を全く含まない。
一態様では、N末端領域は標的化成分を含む。ある特定の態様では、標的化成分は、単量体単鎖抗体、Fab断片、Fab’2、scFv、および他の抗体断片誘導体、例えば、ミニボディ、ダイアボディ、およびトリアボディを含むが、それに限定されるわけではない、抗体またはその抗原結合部分である。抗体または抗原結合断片はFcRn結合ドメインを維持してもよく、欠失してもよい。
一態様では、N末端領域はヒトJ591重鎖を含み、以下のようなSEQ ID NO:3のアミノ酸配列(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、GenBankアクセッション番号CCA78124.1)またはその部分を有する。
Figure 2023551305000002
別の態様では、N末端領域はヒトJ591軽鎖を含み、以下のようなSEQ ID NO:4のアミノ酸配列(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、GenBankアクセッション番号CCA78125.1)またはその部分を有する。
Figure 2023551305000003
別の態様では、N末端領域はヒト4D5重鎖を含み、以下のようなSEQ ID NO:5のアミノ酸配列またはその部分を有する。
Figure 2023551305000004
別の態様では、N末端領域はヒト4D5軽鎖を含み、以下のようなSEQ ID NO:6のアミノ酸配列またはその部分を有する。
Figure 2023551305000005
上記に従って、一部の態様ではC末端領域は酵素を含む。
一態様では、C末端領域は、グリコシルトランスフェラーゼB(GTB)の触媒ドメインを含み、以下のようなSEQ ID NO:7のアミノ酸配列(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、GenBankアクセッション番号AM423112.1)またはその部分を有する。
Figure 2023551305000006
別の態様では、C末端領域は、GTBおよびGTAのハイブリッド配列を生じる「cisA,B」配列を含み、以下のようなSEQ ID NO:8のアミノ酸配列(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、GenBankアクセッション番号ABL75287.1)またはその部分を有する。
Figure 2023551305000007
別の態様では、C末端領域はグリコシルトランスフェラーゼA(GTA)の触媒ドメインを含み、以下のようなSEQ ID NO:9のアミノ酸配列(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、GenBankアクセッション番号AFB74122.1)またはその部分を有する。
Figure 2023551305000008
ある特定の態様では、腫瘍関連抗原を有する腫瘍はH抗原を発現する。本明細書で使用する「H抗原」は、末端二糖フコース-ガラクトースを有するオリゴ糖鎖であって、フコースがα-(1-2)-結合を有するオリゴ糖鎖を指す。H抗原はフコシルトランスフェラーゼによって産生され、ABO血液型系においてA抗原またはB抗原を産生するための基本要素である。
従って、本開示はまた、がんを処置する方法にも関する。前記方法は、がんを有する対象を選択する工程、および本開示に従う二機能性治療用物質を提供する工程を含む。二機能性治療用物質は、がんを処置するのに有効な条件下で、選択された対象に投与される。
本明細書に記載の二機能性治療用物質を用いて、前立腺腫瘍、副腎皮質癌腫瘍、肛門腫瘍、虫垂腫瘍、星状細胞腫(小児小脳または大脳)、基底細胞癌、胆管腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、乳腺腫瘍、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚部腫瘍、小児腫瘍、軟骨肉腫、結腸腫瘍、皮膚T細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞性腫瘍、子宮内膜腫瘍、食道腫瘍、ユーイング肉腫、網膜芽細胞腫、胆嚢腫瘍、胃(gastric)(胃(stomach))腫瘍、消化管間質腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頚部腫瘍、心臓腫瘍、肝細胞(肝臓)腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭腫瘍、島細胞癌(内分泌膵臓)、カポジ肉腫、腎臓腫瘍、喉頭腫瘍、唇および口腔腫瘍、非小細胞肺腫瘍、細胞肺腫瘍、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞腫瘍、中皮腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、鼻咽頭腫瘍、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔腫瘍、中咽頭腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、胸膜肺、原発性中枢神経系リンパ腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、軟部組織肉腫、子宮肉腫、皮膚腫瘍(非メラノーマ)、小腸腫瘍、扁平上皮癌、胃腫瘍、精巣腫瘍、咽頭腫瘍、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺腫瘍、絨毛性腫瘍、ならびに尿道腫瘍を含むが、これに限定されない実質的に任意のH抗原発現腫瘍を処置することができる。
造血がんまたはリンパ系がん、中胚葉由来がん、肉腫、神経外胚葉性がんなどを含むが、これに限定されない一部のがんはH抗原を発現しないことがある。これは、Hの存在または非存在を明らかにするUlexレクチン結合を用いて腫瘍試料のフローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって容易に確かめることができる。Hが存在しない時、本願を用いた処置は2つのやり方で成し遂げることができる。すなわち、以前に述べられたように、標的化グリコシルトランスフェラーゼの前に、または標的化グリコシルトランスフェラーゼと同時にH抗原を付加するように標的化フコシルトランスフェラーゼが用いられてもよい。または、末端ガラクトースを付加することができ、かつ1,2フコース(H抗原)の存在を必要としないαgalT酵素が標的化されてもよい。
一態様では、二機能性治療用物質の標的化成分は、腫瘍血管内皮上にあるPSMA受容体を標的とする。PSMA発現は様々な腫瘍の腫瘍新生血管において報告されているが、正常組織脈管構造には存在しない。PSMA陽性血管内皮を有する例示的な組織タイプは、腎臓、肺、結腸、胃、乳房、脳、膵臓、肝臓、膀胱、食道、副腎、頭頚部、メラノーマ、および脳の腫瘍を含むが、それに限定されるわけではない。他の態様は、前立腺がん細胞の表面に発現するPSMAの標的化、乳房および他のHER2陽性がんの表面にあるHER2の標的化、B細胞系列がんの表面にあるCD19の標的化、ならびに結腸直腸がんの表面にあるCEAの標的化を含む。他の適用可能な標的は前記で説明されている。
本開示の一部の局面は、本明細書中の表1および表2に示されるような1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRのアミノ酸配列を含む標的化成分を含む二機能性治療用物質に関する。一部の態様では、標的化成分は、改変されたアミノ酸配列を含み、改変されたアミノ酸配列は、表1および表2に示されるCDR配列のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する。
(表１)適切な標的化成分抗体の重鎖CDR配列
Figure 2023551305000009
*その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許出願公開第2006/0088539号、図2A～2Bを参照されたい。**その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許第5,821,337号、図1A～1Bを参照されたい。***その全体が本明細書において参照により組み入れられる、EP2059536;PCT/US2007/075932を参照されたい。
(表２)適切な標的化成分抗体の軽鎖CDR配列
Figure 2023551305000010
*その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許出願公開第2006/0088539号、図2A～2Bを参照されたい。**その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許第5,821,337号、図1A～1Bを参照されたい。***その全体が本明細書において参照により組み入れられる、EP2059536;PCT/US2007/075932を参照されたい。
一部の態様では、本明細書に記載の抗体ベース分子の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域は、それぞれ、ヒトの、またはヒト化された免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域および/または軽鎖フレームワーク領域をさらに含む。
本開示の一部の態様では、標的化成分は、本明細書中の表3に示される配列の1つまたは2つを含む。一部の態様では、標的化成分は、改変されたアミノ酸配列を含み、改変されたアミノ酸配列は、表3に示される配列のうちのいずれか1つまたは2つに対して少なくとも80％の配列同一性を有する。
(表３)抗体可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)抗体配列
Figure 2023551305000011
†相補性決定領域を太字の字体で示した。
*その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許出願公開第2006/0088539、図2A～2Bを参照されたい。**その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許第5,821,337号、図1A～1Bを参照されたい。***その全体が本明細書において参照により組み入れられる、EP2059536;PCT/US2007/075932を参照されたい。
本明細書において開示される標的化ドメインの重鎖CDR配列および/または軽鎖CDR配列に対する適切なアミノ酸改変は、例えば、上記のような本明細書において開示されるCDR配列の結合特性と同様の、または向上した結合特性を有するバリアントCDR配列をもたさす保存的置換または機能的に等価なアミノ酸残基置換を含む。抗体と、その標的(例えば、PSMA、CD14、HER2)との結合を維持または向上する、(CDRの長さに応じて)1個、2個、3個、4個、5個、またはそれより多いアミノ酸置換を含有する表1および表2のCDRが本開示に含まれる。結果として生じる改変されたCDRは、表1および2のCDRに対して配列が少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％類似する。表1の重鎖CDR配列ならびに/または表1および表2の軽鎖CDR配列に対する適切なアミノ酸改変は、例えば、表1および表2のCDR配列の結合特性と同様の、または向上した結合特性を有するバリアントCDR配列をもたらす、保存的置換または機能的に等価なアミノ酸残基置換を含む。保存的置換は、側鎖の点で関連するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、4つのファミリー:(1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸);(2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン);(3)無極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン);および(4)無電荷極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)に分けることができる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは一緒に芳香族アミノ酸として分類されるときもある。または、アミノ酸レパートリーは、(1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸);(2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、(3)脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン)。セリンおよびスレオニンは任意で脂肪族-ヒドロキシルとして別に分類される;(4)芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン);(5)アミド(アスパラギン、グルタミン);ならびに(6)含硫黄(システインおよびメチオニン)として分類されることがある(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981)。表1の重鎖CDR配列および表2の軽鎖CDR配列に対して非保存的置換も加えることができる。非保存的置換は、CDRの結合特性を改善または向上するために、CDRの1つまたは複数のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸クラスに由来する1つまたは複数のアミノ酸残基で置換することを伴う。表1の重鎖可変領域CDRのアミノ酸配列および/または表2の軽鎖可変領域CDRのアミノ酸配列は、標的(例えば、PSMA、CD19、HER2)結合を維持または向上する1つまたは複数の内部中立アミノ酸挿入または欠失をさらに含んでもよい。
一部の態様では、標的化ドメインのVH鎖は、上記の表3に示したVHアミノ酸配列のいずれか一つ、または表3に列挙したVHアミノ酸配列のいずれか一つに対して少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む。例えば、本明細書に記載の標的化ドメインは、(i)SEQ ID NO:30に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;(ii)SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;または(iii)SEQ ID NO:34に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含んでもよい。
一部の態様では、標的化ドメインのVL鎖は、上記の表3に示したVLアミノ酸配列のいずれか一つ、または表3で列挙されるVLアミノ酸配列のいずれか一つに対して少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む。例えば、本明細書に記載の標的化ドメインは、(i)SEQ ID NO:29に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;(ii)SEQ ID NO:31に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または(iii)SEQ ID NO:33に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
一部の態様では、本明細書において開示される標的化ドメインは、(i)SEQ ID NO:30に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:29に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;(ii)SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:31に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または(iii)SEQ ID NO:33に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
本開示の標的化ドメインは結合親和性の点で説明または指定され得る。従って、一部の態様では、本開示の標的化ドメインは、1μM、500nM、250nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、または1nMより少ない解離定数またはKDを有する標的化ドメインを含む。
本開示の一部の局面は、前立腺特異的膜抗原(PSMA)/葉酸加水分解酵素1(FOLH1)受容体を標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記標的化成分に接続されている、グリコシルトランスフェラーゼとを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。本開示のこの局面は、前立腺がんを有する対象の処置において有用である。
一部の態様では、標的化成分は重鎖可変領を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:10の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:10に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域1(CDR-H1)と、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:13の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:13に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域2(CDR-H2)と、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:16の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:16に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域3(CDR-H3)を含む。重鎖CDR配列の配列は、上記の表1に示される。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:28(上記の表3)に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
標的化成分は軽鎖可変領域をさらに含んでもよく、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:19の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:19に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域1(CDR-L1)と、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:22の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:22に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域2(CDR-L2)と、SEQ ID NO:25のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:25の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:25に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域3(CDR-L3)を含む。軽鎖CDR配列の配列は、上記の表2に示される。
一部の態様では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:29(上記の表3)に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:10のCDR-H1、SEQ ID NO:13のCDR-H2、およびSEQ ID NO:16のCDR-H3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:19のCDR-L1、SEQ ID NO:22のCDR-L2、およびSEQ ID NO:25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域とを含む。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:28に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:29(表3)に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
一部の態様では、標的化成分は任意でシグナル伝達ペプチドをさらに含み、シグナル伝達ペプチドは、SEQ ID NO:34のアミノ酸1～19の配列を有する。
一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ)およびグリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)からなる群より選択される。
一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼはグリコシルトランスフェラーゼA(「GTA」)であり、以下のようにSEQ ID NO:64のアミノ酸配列またはその部分を有する。
Figure 2023551305000012
一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼはグリコシルトランスフェラーゼB(「GTB」)であり、以下のようにSEQ ID NO:65のアミノ酸配列またはその部分を有する。
Figure 2023551305000013
適切なさらなるグリコシラーゼが下記で説明される。一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼはマーモセットα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(aa90-376)であり、以下のようにSEQ ID NO:66のアミノ酸配列またはその部分を有する。
Figure 2023551305000014
一部の態様では、二機能性治療用物質は、(i)SEQ ID NO:34またはSEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;(ii)SEQ ID NO:37またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;(iii)SEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;(iv)SEQ ID NO:43またはSEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;(v)SEQ ID NO:46のアミノ酸配列;(vi)SEQ ID NO:47のアミノ酸配列;(vii)SEQ ID NO:48のアミノ酸配列;または(viii)SEQ ID NO:49のアミノ酸配列(表4)を含む。
(表４)J591二機能性治療用タンパク質配列
Figure 2023551305000015
Figure 2023551305000016
Figure 2023551305000017
Figure 2023551305000018
Figure 2023551305000019
Figure 2023551305000020
Figure 2023551305000021
Figure 2023551305000022
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:34またはSEQ ID NO:35の位置20～770のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質と、SEQ ID NO:36の位置20～233のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質とを含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:37またはSEQ ID NO:38の位置20～540のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質と、SEQ ID NO:39の位置20～233のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質とを含み、任意で、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:37またはSEQ ID NO:38の位置20～558のアミノ酸配列を含む第1の部分を含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質と、SEQ ID NO:42の位置1～214のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質とを含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:43またはSEQ ID NO:44の位置20～831のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質と、SEQ ID NO:45の位置1～214のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質とを含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:46またはSEQ ID NO:47の位置1～767のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:48またはSEQ ID NO:49の位置20～591のアミノ酸配列を含み、任意で、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:37またはSEQ ID NO:38の位置20～597の配列を含む。
本開示の別の局面は、ヒト上皮増殖因子受容体(HER)ファミリーメンバーを標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記標的化成分に接続されている、グリコシルトランスフェラーゼとを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。本開示のこの局面は、乳がんまたは任意のHER2発現がんを有する対象の処置において有用である。
一部の態様では、標的化成分は重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:11の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:11に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域1(CDR-H1)と、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:14に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域2(CDR-H2)と、SEQ ID NO:17のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:17の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:17に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域3(CDR-H3)を含む。重鎖CDR配列の配列は、上記の表1に示される。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:30に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(上記の表3)を含む。
標的化成分は軽鎖可変領域をさらに含んでもよく、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:20の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:20に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域1(CDR-L1)と、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:23の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:23に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域2(CDR-L2)と、SEQ ID NO:26のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:26の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:26に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域3(CDR-L3)を含む。軽鎖CDR配列の配列は、上記の表2に示される。
一部の態様では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:31に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列(上記の表3)を含む。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:11のCDR-H1、SEQ ID NO:14のCDR-H2、およびSEQ ID NO:17のCDR-H3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:20のCDR-L1、SEQ ID NO:23のCDR-L2、およびSEQ ID NO:26のCDR-L3を含む軽鎖可変領域とを含む。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:30に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:31に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(表3)を含む。
一部の態様では、標的化成分はシグナル伝達ペプチドをさらに含み、任意で、シグナル伝達ペプチドはSEQ ID NO:50のアミノ酸1～19の配列を有する。
適切なグリコシルトランスフェラーゼが下記で詳述される。
一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ)およびグリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)からなる群より選択される。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、(i)SEQ ID NO:50またはSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;(ii)SEQ ID NO:53またはSEQ ID NO:54のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:55のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;(iii)SEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:58のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;(iv) SEQ ID NO:59のアミノ酸配列;(v)SEQ ID NO:60のアミノ酸配列;(vi)SEQ ID NO:61のアミノ酸配列;または(vii)SEQ ID NO:62のアミノ酸配列(表5)を含む。
(表５)4D5二機能性治療用タンパク質配列
Figure 2023551305000023
Figure 2023551305000024
Figure 2023551305000025
Figure 2023551305000026
Figure 2023551305000027
Figure 2023551305000028
Figure 2023551305000029
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:50またはSEQ ID NO:51の位置20～774のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質と、SEQ ID NO:52の位置20～233のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質とを含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:53またはSEQ ID NO:54の位置20～563のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質と、SEQ ID NO:55の位置20～233のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質とを含み、任意で、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:53またはSEQ ID NO:54の位置20～569のアミノ酸配列を含む第1の部分を含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質と、SEQ ID NO:58の位置1～214のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質とを含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:59またはSEQ ID NO:60の位置1～555のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:61またはSEQ ID NO:62の位置20～593のアミノ酸配列を含み、任意で、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:61またはSEQ ID NO:62の位置20～599の配列を含む。
本開示の別の局面は、CD19を標的とする標的化成分と、前記標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記標的化成分に接続されている、グリコシルトランスフェラーゼとを含む、がんを処置するための二機能性治療用物質に関する。本開示のこの局面は、B細胞またはB細胞活性を無くす必要性がある対象の処置において有用である。一部の態様では、本開示のこの局面は、リンパ腫(例えば、B細胞リンパ腫)、B細胞白血病、および/または自己免疫疾患を処置するのに有用である。
一部の態様では、標的化成分は重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:12のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:12の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:12に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域1(CDR-H1)と、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:15に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域2(CDR-H2)と、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:18の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:18に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域3(CDR-H3)を含む。重鎖CDR配列の配列は、上記の表1に示される。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(上記の表3)を含む。
標的化成分は軽鎖可変領域をさらに含んでもよく、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:21の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:21に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域1(CDR-L1)と、SEQ ID NO:24のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:24の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:24に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域2(CDR-L2)と、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:27の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)であって、前記改変された配列がSEQ ID NO:27に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、相補性決定領域3(CDR-L3)を含む。軽鎖CDR配列の配列は、上記の表2に示される。
一部の態様では、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列(上記の表3)を含む。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:12のCDR-H1、SEQ ID NO:15のCDR-H2、およびSEQ ID NO:18のCDR-H3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:21のCDR-L1、SEQ ID NO:24のCDR-L2、およびSEQ ID NO:27のCDR-L3を含む軽鎖可変領域とを含む。
一部の態様では、標的化成分は、SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:33に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(表3)を含む。
一部の態様では、標的化成分はシグナル伝達ペプチドをさらに含み、任意で、シグナル伝達ペプチドはSEQ ID NO:63のアミノ酸1～19の配列を有する。
適切なグリコシルトランスフェラーゼは下記で詳述される。
一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ)およびグリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)からなる群より選択される。
一部の態様では、グリコシルトランスフェラーゼは、SEQ ID NO:66の配列を有するマーモセットα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(aa90-376)である。
一部の態様では、二機能性治療用物質はSEQ ID NO:63のアミノ酸配列(表6)を含む。
(表６)オベキセリマブ二機能性治療用タンパク質配列
Figure 2023551305000030
一部の態様では、二機能性治療用物質は、SEQ ID NO:63の位置20～584のアミノ酸配列、SEQ ID NO:63の位置20～578のアミノ酸配列、SEQ ID NO:63の位置20～287のアミノ酸配列、SEQ ID NO:63の位置20～272のアミノ酸配列、SEQ ID NO:63の位置20～160のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:63の位置20～140のアミノ酸配列を含む。
本開示の二機能性治療用物質の正確な投与量は、処置しようとする患者を考慮して医師個人によって選択されることが理解される。一般的に、投与量および投与は、処置されている患者に有効量の薬剤を提供するように調整される。本明細書で使用する、二機能性治療用物質の「有効量」は、望ましい生物学的応答を誘発するのに必要な量を指す。当業者に理解されるように、本開示の二機能性治療用物質の有効量は、望ましい生物学的エンドポイント、送達しようとする薬物、標的組織、投与経路などのような要因に応じて変化することがある。例えば、二機能性治療用物質の有効量は、腫瘍サイズを望ましい期間にわたって望ましい量分だけ縮小する量でもよい。考慮され得る、さらなる要因は、疾患状態の重篤度;処置されている患者の年齢、体重、および性別;食事、投与の時間および頻度;薬物組み合わせ;反応感受性;ならびに療法に対する寛容/応答を含む。
「有効量」はまた、障害、例えば、がんの発症もしくは再発が起こるのを予防もしくは遅延する際に、またはその症状を処置する際に、対象に単回投与または複数回投与する時に有効な、本明細書に記載の二機能性治療用物質の量を指す「予防的有効量」でもよい。
一般的に、用量は、単一薬剤として与えられた時には二機能性治療用物質の最大耐用量(MTD)の約25％～約100％でもよい。組成物に基づいて用量は1回送達されてもよく、連続して、例えば、連続ポンプによって連続して送達されてもよく、定期的な間隔で送達されてもよい。投与量は、望ましい薬物レベルに達するように適切に、局所で、または全身で調整されてもよい。このような用量で、対象における応答が不十分な場合には、患者の寛容が許す程度まで、さらに高い用量(または異なる、より局所的な送達経路で、さらに高い有効な用量)が用いられる場合がある。化合物の適切な全身レベルに達するために、連続IV投薬、例えば、24時間にわたる連続IV投薬、または1日に複数回の投薬も意図される。例として、二機能性治療用物質が任意の週数にわたって1週間に1回、2回、3回、もしくはそれより多く投与されるように、または二機能性治療用物質が複数回(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回、22回、もしくは24回)投与され、投与が週1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、9週間に1回、または10週間に1回行われるように、投与計画を変更することができる。例えば、二機能性治療用物質は、上記で引用された投与量レベルで少なくとも2回、3回、または4回投与することができ、投与は4～8週間ごとに1回行われる。対象が、二機能性治療用物質に対して有害反応を示さなければ、および/またはがんの1つもしくは複数の症状が改善するか、もしくは同じ状態のままであれば、さらなる1つまたは複数の用量を与えることができる。一部の態様では、投薬間の期間が延びるにつれて二機能性治療用物質の量を増やすことができる。
二機能性治療用物質の生体内分布および薬物動態は、異なる標的化成分について異なる場合がある。例として、完全長のインタクトな抗体で構成される大きな二機能性治療用物質は血漿内半減期および全身半減期が長く、循環中にとどまる傾向がある。このような二機能性治療用物質はまた肝臓を通って排出される可能性が高く、正常組織に浸透する可能性が低い。逆に、例えば、標的化ペプチドまたは低分子リガンドで構成される小さな二機能性治療用物質は半減期が短くなり、腎臓/尿路を通って排出され、正常組織および腫瘍に急速に浸透する傾向がある。
本開示の方法の実施において、対象においてがんを処置するために投与工程が行われる。一態様では、投与前に、がんを有する対象が選択される。このような投与は全身で行われてもよく、腫瘍部位への直接投与または局所投与を介して行われてもよい。例として、適切な全身投与方法は、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、または鼻腔内注入、腔内注入もしくは膀胱内注入による投与、眼内投与、動脈内投与、病巣内投与、あるいは粘膜への適用を含むが、それに限定されるわけではない。適切な局所投与方法は、カテーテル留置、移植、直接注射、皮膚/経皮適用、または関連組織への門脈投与、または当技術分野において一般に知られている他の任意の局所投与技法、方法、もしくは手順を含むが、それに限定されるわけではない。二機能性治療用物質の送達に影響を及ぼす方法は、(例えば、抗体標的化成分またはペプチド標的化成分を有する)二機能性治療用物質のタイプおよび処置しようとする疾患に応じて変化する。
本開示の二機能性治療用物質は、例えば、不活性希釈剤と共に、または同化できる食用担体と共に経口投与されてもよく、ハードシェル(hard shell)またはソフトシェル(soft shell)カプセルの中に封入されてもよく、圧縮されて錠剤にされてもよく、食事の食物と一緒に直接、取り入れられてもよい。本開示の二機能性治療用物質はまた、徐放カプセルまたはナノチューブのような装置の中に取り入れられて徐放投与されてもよい。このような装置は時間および投与量に関して融通性を与える。経口治療投与の場合、本開示の薬剤は賦形剤と一緒に取り入れられてもよく、錠剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップなどの形で使用されてもよい。このような組成物および製剤は薬剤の少なくとも0.1％を含有しなければならないが、これより少ない濃度が有効であり、かつ実際に最適になる場合がある。これらの組成物中の薬剤のパーセントは、もちろん、変更される場合があり、都合よく、単位重量の約2％～約60％になる場合がある。このような治療的に有用な組成物中にある本開示の二機能性治療用物質の量は、適切な投与量が得られるような量である。
本開示の二機能性治療用物質が非経口投与される時、薬剤の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水に溶解して調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油に溶解した、その混合物に溶解して調製することもできる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、または鉱油である。一般的に、水、食塩水、デキストロース水溶液および関連する糖液、ならびにグリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが、特に注射液にとって好ましい液体担体である。通常の保管および使用の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を阻止するために防腐剤を含有する。
注射使用に適した薬学的製剤は、滅菌した水溶液または水性分散液、および滅菌した注射用の溶液または分散液を即時調製するための滅菌した散剤を含む。すべての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に液状でならなければならない。剤形はまた製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守らなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール)、その適切な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒でもよい。
本開示の二機能性治療用物質を全身送達することが望ましい場合、本開示の二機能性治療用物質は、注射による、例えば、大量瞬時投与または連続注入による非経口投与用に処方されることがある。注射用の製剤は単位剤形で、例えば、添加された防腐剤と一緒に、アンプルに入れて、またはマルチドーズ容器に入れて提示されてもよい。前記組成物は、油性または水性ビヒクルに溶解した懸濁液、溶液、またはエマルジョンのような形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および/または分散剤などの処方剤を含有してもよい。
本開示の二機能性治療用物質の腹腔内投与またはくも膜下腔内投与は注入ポンプ装置を用いて成し遂げることもできる。このような装置を用いると、複数回の注射および複数回の操作なしで望ましい化合物の連続注入が可能になる。
上記で説明された製剤に加えて、二機能性治療用物質はデポー製剤として処方されることがある。このような長時間作用型製剤は、適切なポリマー材料または疎水性材料(例えば、許容される油の中にあるエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂を用いて処方されてもよく、やや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として処方されてもよい。
本開示の別の局面は、本開示の二機能性治療用物質と薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
二機能性治療用物質は上記で説明されている。
本開示の方法において使用するための二機能性治療用物質を含有する薬学的組成物は、下記のような薬学的に許容される担体と、1種類または複数種の活性薬剤と、適切な送達ビヒクルを含んでもよい。適切な送達ビヒクルは、ウイルス、細菌、生分解性マイクロスフェア、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、コラーゲンミニペレット、およびコクリエート（cochleate）を含むが、これに限定されない。
本開示の一態様では、薬学的組成物または製剤は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Semple et al., 「Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery」, Nature Biotech. 28:172-176 (2010)、BumcrotらへのWO2011/034798、BumcrotらへのWO2009/111658、およびBumcrotらへのWO2010/105209に記載のように核酸-脂質粒子を形成するように脂質製剤にカプセル化される。
本開示の別の態様では、送達ビヒクルはナノ粒子である。様々なナノ粒子送達ビヒクルが当技術分野において公知であり、本開示の二機能性治療用物質を送達するのに適している(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、van Vlerken et al., 「Multi-functional Polymeric Nanoparticles for Tumour-Targeted Drug Delivery」, Expert Opin. Drug Deliv. 3(2):205-216 (2006)を参照されたい)。適切なナノ粒子は、ポリ(β-アミノエステル)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Sawicki et al., 「Nanoparticle Delivery of Suicide DNA for Epithelial Ovarian Cancer Cell Therapy」, Adv. Exp. Med. Biol. 622:209-219 (2008))、ポリエチレンイミン-alt-ポリ(エチレングリコール)コポリマー(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Park et al., 「Degradable Polyethylenimine-alt-Poly(ethylene glycol) Copolymers As Novel Gene Carriers」, J. Control Release 105(3):367-80 (2005)、およびPark et al., 「Intratumoral Administration of Anti-KITENIN shRNA-Loaded PEI-alt-PEG Nanoparticles Suppressed Colon Carcinoma Established Subcutaneously in Mice」, J Nanosci. Nanotechnology 10(5):3280-3 (2010))、およびリポソームに封入されたsiRNA ナノ粒子(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Kenny et al., 「Novel Multifunctional Nanoparticle Mediates siRNA Tumor Delivery, Visualization and Therapeutic Tumor Reduction In Vivo」, J. Control Release 149(2): 111-116 (2011))を含むが、それに限定されるわけではない。本開示における使用に適した他のナノ粒子送達ビヒクルは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Prakashらへの米国特許出願公開第2010/0215724号に開示されるマイクロカプセルナノチューブ装置を含む。
本開示の別の態様では、薬学的組成物はリポソーム送達ビヒクル中に含まれる。「リポソーム」という用語は、1つまたは複数の球状二重層の形で並べられた両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性内部を有する単層小胞または多層小胞である。水性部分は、送達しようとする組成物を含有する。カチオン性リポソームは細胞壁と融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは細胞壁と効率的に融合できないが、インビボではマクロファージによって取り込まれる。
リポソームのいくつかの利点は、生体適合性および生分解性があること、多種多様な水溶性薬物および脂質可溶性薬物を取り込むこと、カプセル化された薬物を代謝および分解から保護することを含む。リポソーム製剤の調製において重要な考慮すべき事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水体積である。
リポソームは、活性成分を作用部位に移動および送達するのに有用である。リポソーム膜は生体膜と構造上似ているので、リポソームが組織に適用されると細胞膜と一体化し始め、リポソームと細胞の一体化が進行するにつれて、リポソームの内容物は、活性薬剤が作用し得る細胞に注がれる。
本開示において使用するためのリポソームを調製するための方法は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Bangham et al., 「Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids」, J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965);Hsuへの米国特許第5,653,996号;Leeらへの米国特許第5,643,599号;Hollandらへの米国特許第5,885,613号;Dzau & Kanedaへの米国特許第5,631,237号、およびLoughreyらへの米国特許第5,059,421号に開示される方法を含む。
本開示の別の態様では、送達ビヒクルはウイルスベクターである。ウイルスベクターは核酸分子の送達に特に適しているが、二機能性治療用物質をコードする分子を送達するのにも使用することができる。適切な遺伝子療法ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターを含むが、それに限定されるわけではない。
その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Berkner, 「Development of Adenovirus Vectors for the Expression of Heterologous Genes」, Biotechniques 6:616-627 (1988)、Rosenfeld et al., 「Adenovirus-Mediated Transfer of a Recombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene to the Lung Epithelium In Vivo」, Science 252:431-434 (1991)、CurielらへのWO 93/07283、PerricaudetらへのWO 93/06223、およびCurielらへのWO 93/07282に記載のように、アデノウイルスウイルスベクター送達ビヒクルを容易に調製および利用することができる。その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Shi et al., 「Therapeutic Expression of an Anti-Death Receptor-5 Single-Chain Fixed Variable Region Prevents Tumor Growth in Mice」, Cancer Res. 66:11946-53 (2006); Fukuchi et al., 「Anti-Aβ Single-Chain Antibody Delivery via Adeno-Associated Virus for Treatment of Alzheimer's Disease」, Neurobiol. Dis. 23:502-511 (2006); Chatterjee et al., 「Dual-Target Inhibition of HIV-1 In Vitro by Means of an Adeno-Associated Virus Antisense Vector」, Science 258:1485-1488 (1992); Ponnazhagan et al., 「Suppression of Human Alpha-Globin Gene Expression Mediated by the Recombinant Adeno-Associated Virus 2-Based Antisense Vectors」, J. Exp. Med. 179:733-738 (1994);およびZhou et al., 「Adeno-associated Virus 2-Mediated Transduction and Erythroid Cell-Specific Expression of a Human Beta-Globin Gene」, Gene Ther. 3:223-229 (1996)に記載のように、アデノ随伴ウイルス送達ビヒクルを構築および使用して、本開示の二機能性治療用物質を細胞に送達することができる。これらのビヒクルのインビボ使用は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Flotte et al., 「Stable in Vivo Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator With an Adeno-Associated Virus Vector」, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:10613-10617 (1993)、およびKaplitt et al., 「Long-Term Gene Expression and Phenotypic Correction Using Adeno-Associated Virus Vectors in the Mammalian Brain」, Nature Genet. 8:148-153 (1994)に記載されている。さらなるタイプのアデノウイルスベクターは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Wickhamらへの米国特許第6,057,155号;Boutらへの米国特許第6,033,908号;Wilsonらへの米国特許第6,001,557号;Chamberlainらへの米国特許第5,994,132号;Kochanekらへの米国特許第5,981,225号;Spoonerらへの米国特許第5,885,808号;およびCurielへの米国特許第5,871,727号に記載されている。
核酸分子を標的細胞に送達するために、感染性形質転換系を形成するように改変されているレトロウイルスベクターも使用することができる。このようなタイプのレトロウイルスベクターの1つが、本明細書において参照により組み入れられる、Krieglerらへの米国特許第5,849,586号に開示される。本開示における使用に適した他の核酸送達ビヒクルは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Luらへの米国特許出願公開第20070219118号に開示される核酸送達ビヒクルを含む。
使用される感染性形質転換系のタイプに関係なく、核酸を望ましい細胞タイプに送達するために、感染性形質転換系を標的化しなければならない。例えば、細胞(例えば、がん細胞)のクラスターに送達するために、細胞感染の可能性を高めるように、高力価の感染性形質転換系を、この細胞の部位の中に直接注射することができる。次いで、感染した細胞は、腫瘍関連抗原を標的とする核酸分子を発現する。この発現系は、標的組織または標的細胞における核酸分子の発現の強度および特異性を制御または調節するためにプロモーターをさらに含有してもよい。
前記のように、転移性疾患を処置するための本開示の組成物の有効用量は、がんのタイプおよび段階、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、投与される他の薬物または療法、ならびに他の医学的合併症に関係する患者の身体状態を含む多くの異なるに応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために調整する必要がある。
本開示の薬学的組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の本開示の二機能性治療用物質を含んでもよい。「治療的有効量」は、望ましい治療的結果を実現するのに必要な投与量で、および期間にわたって、望ましい治療的結果を実現するのに有効な量を指す。二機能性治療用物質の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに二機能性治療用物質が個体において望ましい応答を誘発する能力などの要因に応じて変化することがある。治療的有効量はまた、治療的に有益な作用が二機能性治療用物質の任意の毒性作用または有害作用よりも大きくなる量である。「治療的有効投与量」は、好ましくは、測定可能なパラメータ、例えば、腫瘍成長速度を未処置対象と比べて少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約80％阻害する。化合物が、測定可能なパラメータ、例えば、がんを阻害する能力は、ヒト腫瘍での効力を予測する動物モデル系において評価することができる。または、組成物のこの性質は、当業者に公知のアッセイによって、化合物の阻害能力、例えば、インビトロでの阻害を調べることで評価することができる。
「予防的有効量」は、望ましい予防的結果を実現するのに必要な投与量で、および期間にわたって、望ましい予防的結果を実現するのに有効な量を指す。典型的に、予防用量は疾患の前または疾患の初期段階で対象において用いられるので、予防的有効量は治療的有効量より少ない。
ある特定の態様では、投与する工程は、ヌクレオチド糖ウリジン二リン酸ガラクトース(UDP-gal)、ウリジン二リン酸-N-アセチルガラクトサミン(UDP-NAcGal)、および/またはグアノシン二リン酸-フコース(GDP-フコース)を投与することをさらに含む。
UDP-gal、UDP-NAcGal、および/またはGDP-フコースは、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経口経路、直腸経路、または当技術分野において公知の他の任意の経路を含むが、これに限定されない任意の適切な経路によって投与することができる。さらに、UDP-gal、UDP-NAcGal、および/またはGDP-フコースが、標的化された二機能性酵素と同時発生で投与されてもよく、二機能性標的化酵素の後に投与されてもよい。後者、すなわち、後の投与の場合、標的化された酵素とヌクレオチド糖との間隔は1分～1週間でもよい。好ましい態様では、間隔は1分～48時間である。
本明細書に記載の二機能性治療用物質は他の療法と組み合わせて使用されてもよい。本明細書で使用する「組み合わせて」投与されるとは、障害に対象がかかっている間に、2つの(またはそれより多い)異なる処置が対象に送達されることを意味する。例えば、対象が障害と診断された後であり、かつ障害が治癒するか、もしくは無くなる前に、または処置が他の理由で中止する前に、2つ以上の処置が送達される。一部の態様では、ある処置の送達は、第2の処置の送達が開始する時でもまだ続いており、そのため、投与期間に重複がある。これは本明細書中で「同時の」または「同時発生送達」と呼ばれる。他の態様では、他方の処置の送達が開始する前に、一方の処置の送達が終了する。一部の態様では、併用投与のために処置の効果が大きくなる。例えば、第2の処置の効果の方が大きい。例えば、第2の処置の方が少ないが同等の効果が認められる。または、第2の処置は、第1の処置の非存在下で投与される場合に認められるものよりも大きな程度で症状を軽減する。または、第1の処置と類似の状況が認められる。一部の態様では、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメータの軽減が、他方の非存在下で送達される一方の処置で観察されるものよりも大きくなるような送達である。2つの処置の効果は、部分的に相加的な効果でもよく、全体的に相加的な効果でもよく、相加的な効果よりも大きくてもよい。送達は、第2の送達が送達された時に、送達された第1の処置の効果が依然として検出できるような送達でもよい。
例示的な治療剤は、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール(その全体が本明細書において参照により組み入れられる米国特許第5,208,020号を参照されたい)、CC-1065(その全体が本明細書において参照により組み入れられる米国特許第5,475,092号、同第5,585,499号、同第5,846,545号を参照されたい)およびその類似体またはホモログを含む。治療剤は、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタルミン(mechloretharnine)、チオエパクロランブシル(thioepa chlorambucil)、CC-1065、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis-ジクロロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド)を含むが、これに限定されない。
他の態様では、二機能性治療用物質は、外科手術、放射線、凍結手術、および/または温熱療法を含む他の治療的処置モダリティーと組み合わせて投与される。このような併用療法では、低投与量の投与治療剤が有利に利用され、従って、様々な単独療法に関連する、起こり得る毒性または合併症が回避される場合がある。
他の態様では、二機能性治療用物質は、免疫調節剤、例えば、IL-1、IL-24、IL-6、またはIL-12、またはインターフェロンαもしくはγと組み合わせて投与される。
本開示のさらなる局面は、本開示の二機能性治療用物質をコードする核酸(例えば、ポリヌクレオチド)分子を提供する。前記ポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖および/もしくは二本鎖いずれかのDNA、cDNA、PNA、RNA、もしくはその組み合わせ、または天然形態もしくは合成形態のポリヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートバックボーンを有するポリヌクレオチドでもよく、二機能性治療用物質をコードする限りイントロンを含有してもよく、含有しなくてもよい。もちろん、ポリヌクレオチドは、天然ペプチド結合によって天然アミノ酸残基がつながっているペプチドしかコードできない。本開示のなおさらなる局面は、本開示に従う二機能性治療用物質を発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、相補的付着末端を介して、ポリヌクレオチド、特にDNAをベクターに連結するための様々な方法が開発されてきた。例えば、ベクターDNAに挿入しようとするDNAセグメントに相補的ホモポリマー領域を付加することができる。次いで、相補的ホモポリマーテール間の水素結合によってベクターとDNAセグメントをつないで、組換えDNA分子を形成する。
1つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーは、DNAセグメントとベクターをつなぐ代替方法を提供する。様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーが、International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, USAを含む多数の供給元から市販されている。本開示の二機能性治療用物質をコードするDNAを改変する望ましい方法では、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Higuchi et al., 「A General Method of In Vitro Preparation and Specific Mutagenesis of DNA Fragments: Study of Protein and DNA Interactions」, Nucleic Acids Res. 16(15):7351-67 (1988)に開示されるようにポリメラーゼ連鎖反応を使用する。この方法は、例えば、適切な制限部位における操作によってDNAを適切なベクターに導入するのに用いられてもよく、当技術分野において公知のように他の有用なやり方でDNAを改変するのに用いられてもよい。
本開示の核酸は、特定の発現系に好ましい、または好ましくないコドンを有するように選択される場合がある。例として、大腸菌、酵母、ヒト、昆虫、NS0、またはCHO細胞における発現のために配列が最適化されるように、核酸は、少なくとも1つのコドン、好ましくは少なくとも10％または20％のコドンが変えられている核酸でもよい。
典型的に、二機能性治療用物質をコードするポリヌクレオチドは、望ましい宿主細胞において機能するプロモーターの制御下に配置される。多種多様なプロモーターが周知であり、特定の開示に応じて本開示の発現ベクターにおいて使用することができる。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターの活性がある細胞に左右される。任意で、他の発現制御配列、例えば、リボソーム結合部位、転写終結部位なども含まれる。これらの制御配列の1つまたは複数を含む構築物は「発現ベクター」と呼ばれる。従って、本開示は、望ましい宿主細胞における高レベル発現のために、二機能性治療用物質をコードする核酸分子が組み込まれている発現ベクターを提供する。
特定の宿主細胞における使用に適した発現制御配列は、その細胞において発現している遺伝子をクローニングすることによって得られることが多い。一般的に用いられる原核生物制御配列は、転写開始のためにプロモーターと任意でオペレーターを、リボソーム結合部位配列と一緒に含むことが本明細書において定義され、βラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プロモーター系(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Change et al., Nature 198:1056 (1977))、トリプトファン(trp)プロモーター系(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980))、tacプロモーター(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25 (1983))、ならびにλ由来PLプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Shimatake et al.,Nature 292:128 (1981))のような一般的に用いられるプロモーターを含む。しかしながら、原核生物において機能する任意の利用可能なプロモーターを使用することができる。
大腸菌以外の原核細胞において二機能性治療用物質を発現させるために、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要とされる。このようなプロモーターは、その種からクローニングされている遺伝子から入手することができる。または、異種プロモーターを使用することができる。例えば、ハイブリッドtrp-lacプロモーターは大腸菌の他にバチルス属(Bacillus)において機能する。
本開示の発現カセットにはリボソーム結合部位(RBS)が便利に含まれる。大腸菌の中にあるRBSは、例えば、開始コドンの3～11ヌクレオチド上流にある3～9ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Shine and Dalgarno, 「Determinant of Cistron Specificity in Bacterial Ribosomes」, Nature 254:34-38 (1975); Steitz, In Biological regulation and development: Gene expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, New York))。
哺乳動物細胞の場合、制御配列は、プロモーターと、好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサーとポリアデニル化配列を含み、スプライスドナーおよびアクセプター配列を含んでもよい。
構成的プロモーターまたは調節性プロモーターのいずれかを本開示において使用することができる。調節性プロモーターが有利な場合がある。なぜなら、二機能性治療用物質の発現が誘導される前に宿主細胞を高密度まで増殖できるからである。高レベルの異種タンパク質発現は場合によっては細胞増殖を遅くする。誘導性プロモーターは、遺伝子発現を誘導するプロモーターであり、この場合、発現レベルは、例えば、温度、pH、嫌気条件または好気条件、光、転写因子、および化学物質などの環境要因または発生要因によって変えることができる。このようなプロモーターは本明細書中では「誘導性」プロモーターと呼ばれ、「誘導性」プロモーターを用いると二機能性治療用物質の発現のタイミングを制御することが可能になる。大腸菌および他の細菌宿主細胞の場合、誘導性プロモーターは当業者に公知である。これらは、例えば、lacプロモーター、バクテリオファージλPLプロモーター、ハイブリッドtrp-lacプロモーター(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Amann et al. Gene 25:167 (1983); de Boer et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:21 (1983))、およびバクテリオファージ T7 プロモーター (その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Studier et al. J. Mol. Biol (1986).; Tabor et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82: 1074-8 (1985))を含む。
本開示の二機能性治療用物質を発現させるのに用いられる発現ベクターに選択マーカーが組み込まれることが多い。これらの遺伝子は、選択培養培地中で増殖されている形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要な遺伝子産物、例えば、タンパク質をコードすることができる。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されなかった宿主細胞は培養培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする。または、選択マーカーは、栄養要求欠損を補うか、または複合培地から利用できない重要な栄養分を供給するタンパク質をコードしてもよい。例えば、桿菌の場合はD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。多くの場合、ベクターは、例えば、大腸菌において機能するか、または宿主細胞に導入される前にベクターが複製される他の細胞において機能する1種類の選択マーカーを有する。多数の種類の選択マーカーが当業者に公知である。
上記で列挙された成分の1つまたは複数を含有する適切な核酸構築物の構築では、上記で引用された参考文献に記載のような標準的な連結法を使用する。単離されたプラスミドまたはDNA断片は、必要とされる核酸構築物(例えば、プラスミド)を生じるのに望ましい形で切断、適応、および再連結される。構築されたプラスミドにおいて正しい配列を確認するために、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化などの標準的な技法によって、および/または公知の方法に従う配列決定によって分析することができる。これらの目的を達成するための分子クローニング法は当技術分野において公知である。組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニング方法およびインビトロ増幅方法は当業者に周知である。多くのクローニング実習を通じて当業者を導くのに十分なこれらの技法および指示の例は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業(1998 Supplement)(Ausubel)に見られる。
本開示の核酸構築物および発現ベクターを構築するための出発物質としての使用に適した様々な一般的なベクターが当技術分野において周知である。細菌におけるクローニングの場合、一般的なベクターは、pBR322由来ベクター、例えば、pBLUESCRIP(商標)、およびλ-ファージ由来ベクターを含む。酵母において、ベクターは、Yeast Integratingプラスミド(例えば、YIp5)およびYeast Replicatingプラスミド(YRpシリーズプラスミド)およびpGPD-2を含む。哺乳動物細胞における発現は、pSV2、pBC12BI、およびp91023、ならびに溶解性ウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルス)、エピソームウイルスベクター(例えば、ウシパピローマウイルス)、ならびにレトロウイルスベクター(例えば、マウスレトロウイルス)を含む一般に利用可能な様々なプラスミドを用いて実現することができる。
次いで、本開示の二機能性治療用物質を含むポリペプチドを産生するように、核酸を適切な宿主において発現することができる。従って、本開示の二機能性治療用物質をコードする核酸は、本明細書に含まれる開示を考慮して適切に改変されて、発現ベクターを構築するように公知の技法に従って使用され、次いで、本開示の二機能性治療用物質を発現および産生する目的で適切な宿主細胞を形質転換するために発現ベクターが使用される。このような技法は下記で説明され、例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、米国特許第4,440,859号、同第4,530,901号、同第4,582,800号、同第4,677,063号、同第4,678,751号、同第4,704,362号、同第4,710,463号、同第4,757,006号、同第4,766,075号、および同第4,810,648号に開示される方法も含む。
発現ベクターを、選択された宿主細胞に導入するための方法は特に重要でなく、このような方法は当業者に公知である。例えば、発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換によって、大腸菌を含む原核細胞に導入することができ、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションによって真核細胞に導入することができる。他の形質転換方法も適している。
本開示の二機能性治療用物質はまた他の細菌タンパク質にも連結することができる。このアプローチは高収率をもたらすことが多い。なぜなら、正常な原核生物制御配列は転写および翻訳を誘導するからである。大腸菌において、異種タンパク質を発現させるためにlacZ融合が用いられることが多い。pUR、pEX、およびpMR100シリーズなどの適切なベクターを容易に利用することができる。ある特定の用途では、精製後に融合タンパク質から非酵素アミノ酸を切断することが望ましい場合がある。これは、臭化シアン、プロテアーゼ、または第Xa因子による切断を含む、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれでも成し遂げることができる(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Itakura et al., Science (1977) 198: 1056; Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 106; Nagai et al., Nature (1984) 309: 810; Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 561を参照されたい)。切断部位は、融合タンパク質の遺伝子の望ましい切断点の中に操作することができる。
1つの発現ベクターの中に複数種の転写カセットを配置することで、またはクローニング戦略に用いられる発現ベクターごとに異なる選択マーカーを利用することで、1つの宿主細胞の中に複数種の二機能性治療用物質を発現することができる。
二機能性治療用物質は、硫安沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる(おおまかには、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. New York (1990)を参照されたい)。少なくとも約70～90％均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、98～99％またはそれより大きな均一性が最も好ましい。例として、二機能性治療用物質の標的化成分が抗体である時に、イオン交換クロマトグラフィーなどの抗体結合クロマトグラフィーを使用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、またはその両方でもよい。陰イオン交換クロマトグラフィーのタイプは、Q Sepharose Fast Flow(登録商標)、MacroPrep High Q Support(登録商標)、DEAE Sepharose Fast Flow(登録商標)、およびMacro-Prep DEAE(登録商標)を含むが、それに限定されるわけではない。陽イオン交換クロマトグラフィーのタイプは、SP Sepharose Fast Flow(登録商標)、Source 30S(登録商標)、CM Sepharose Fast Flow(登録商標)、Macro-Prep CM Support(登録商標)、およびMacro-Prep High S Support(登録商標)を含むが、それに限定されるわけではない。
本開示の二機能性治療用物質の精製を容易にするために、二機能性治療用物質をコードする核酸はまた、親和性結合試薬が利用可能なエピトープまたは「タグ」、すなわち、精製タグのコード配列も含んでよい。適切なエピトープの例はmycおよびV-5レポーター遺伝子を含む。これらのエピトープを有する融合タンパク質の組換え産生に有用な発現ベクターが市販されている(例えば、Invitrogen(Carlsbad Calif.)ベクターpcDNA3.1/Myc-HisおよびpcDNA3.1/V5-Hisが哺乳動物細胞における発現に適している)。本開示の二機能性治療用物質にタグを取り付けるのに適した、さらなる発現ベクター、および対応する検出系は当業者に公知であり、いくつかが市販されている(例えば、「FLAG」(Kodak, Rochester N.Y.)。適切なタグの別の例は、金属キレートアフィニティリガンドに結合することができるポリヒスチジン配列である。典型的に、6個の隣接するヒスチジンが用いられるが、6個より多い、または6個より少ないヒスチジンを使用することができる。ポリヒスチジンタグ用の結合部分として役立つことができる適切な金属キレートアフィニティリガンドはニトリロ三酢酸(NTA)を含む(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Hochuli, E. (1990) 「Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents」 In Genetic Engineering: Principles and Methods, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, New York;Qiagen (Santa Clarita, Calif.)から市販されている)。
精製タグはマルトース結合ドメインおよびデンプン結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は当業者に公知である。デンプン結合ドメインは、その全体が本明細書において参照により組み入れられるWO99/15636に記載されている。
以下の実施例は、本開示の態様の実施を例示することを目的とするが、決して、本開示の範囲を限定することを目的としない。
材料および方法
細胞株
ヒト前立腺がん細胞株LNCaPおよびPC3はAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA)から購入した。CWR22Rv1は、Thomas Pretlow, MD, Case Western Reserve Universityからの寄贈品であった。乳がん細胞株MDA-MB-361は、Christel Larbouret, (Institute of Cancer Research of Montpellier (France))からの寄贈品であった。LNCaP、PC3、およびCWR22Rv1を、2mM L-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、および10％熱失活胎仔ウシ血清(FBS)(全サプリメントをGemini Bio-products, West Sacramento, CAから入手した)を加えたRPMI1640培地中で維持した。MDA-MB-361を、1％ペニシリン-ストレプトマイシンおよび20％FBSを加えたL-15培地(ATCC)中で維持した。
抗体
その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Liu et al., 「Monoclonal Antibodies to the Extracellular Domain of Prostate Specific Membrane Antigen Also React With Tumor Vascular Endothelium」, Cancer Res. 57:3629-3634 (1997)、Banderらへの米国特許第7,045,605号、およびBanderらへの米国特許第7,514,078号に記載のように、モノクローナル抗体(mAb)J591抗FOLH1/PSMA、マウスおよび脱免疫を作製した。MAb 3E6抗PSMA、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ポリマー結合ヤギ抗マウスIgおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトIgGはDako(Carpinteria, CA)から購入した。MAb 4D5はハーセプチン(Genentech/Roche)として購入した。MAb 抗A抗体および抗B抗体はOrtho Diagnostic Systems(Raritan, NJ)から購入した。O/H抗原検出用の、α結合フコース残基を認識するコマツナギ(Ulex europaeus)レクチンはSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。ロバ抗ヒトIgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヒトIgG、アルカリホスファターゼ結合ロバ抗ヒトIgG、FITC結合ロバ抗マウスIg、およびFITC結合ロバ抗ヒトIgはJackson ImmunoResearch Laboratories(West Grove, PA)から購入した。抗Flag M2はSigma-Aldrichから入手した。IRDye 800CW-ヤギ抗マウス二次抗体はLI-COR Biosciences(Lincoln, Nebraska)から購入した。
本研究において使用したDNAプラスミド
以下の実施例において概説されるように、任意の望ましい標的化AbもしくはAb構築物またはペプチドと、GTB、GTA、およびフコシルトランスフェラーゼ(FUT1またはFUT2)を含むが、これに限定されない任意のグリコシルトランスフェラーゼのために一連のプラスミドを構築することができる。
トランスフェクションまたはコトランスフェクションの後に宿主細胞において過剰発現されるDNAプラスミドおよびそのタンパク質産物を簡潔な説明と一緒に以下に列挙する。各プラスミドはDNAプラスミド(そのタンパク質産物)の名称:簡潔な説明で述べられる。pMG145(H鎖):このプラスミドをトランスフェクションによって宿主細胞に導入するとhuJ591重鎖が生じる。pMG135(L鎖):このプラスミドでトランスフェクションするとhuJ591軽鎖(L)が生じる。pMG145およびpMG135(huJ591抗体):これらの2種類のプラスミドでコトランスフェクションすると重鎖および軽鎖ならびに機能的huJ591抗体が同時発現する。pMG181(H鎖-GTB):このプラスミドでトランスフェクションすると、N末端にhuJ591重鎖(H)と、C末端にGTBがある融合タンパク質が生じる(以下を参照されたい)。pMG181およびpMG135(huJ591-GTB融合抗体):これらの2種類のプラスミドでコトランスフェクションすると、GTBを含む重鎖および軽鎖が生じる。
GTBおよびhuJ591または4D5重鎖-GTB(H-GTB)融合発現プラスミドの構築
触媒ドメイン(アミノ酸57-354)を含むα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(GTB)の領域を、テンプレートとしてGTBコードプラスミドpBBBBを用いてPCRによってサブクローニングした。融合タンパク質を追跡するために、または融合タンパク質の精製を助けるために、所望であれば3’末端にFlagおよびHisタグが付加される場合がある。例えば、抗体-GTB融合タンパク質を構築するために、huJ591重鎖(H)をコードするDNA配列をGTB触媒ドメインDNA配列に連結して、プラスミドpMG181を得た。4D5-GTBまたは任意のAb(またはAb誘導体もしくはペプチド)-GTB(またはA抗原についてはGTAの触媒ドメイン)を作製するのにも同じ手順に従う。または、H抗原の合成を標的とすることが望ましい場合には、FUT1またはFUT2の触媒ドメインを組み込むことができる。グリコシルトランスフェラーゼ酵素はAb構築物の重鎖または軽鎖のいずれかのC末端に優先的に連結される。
Ab配列と酵素配列との間に(G4S)3スペーサー配列を挿入した。または、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Chen et al., 「Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality」, Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-69 (2013)に記載のように様々な融合タンパク質リンカーまたはスペーサーを使用することができる。
DNAトランスフェクションおよび融合タンパク質発現
huJ591-GTB(同様に4D5-GTB)融合抗体産生のために、CHO細胞を、FreeStyle MAX(ThermoFisher scientific)を用いて製造業者の説明書に従ってpMG181(H鎖-GTB)およびpMG135(L鎖)でコトランスフェクトした。トランスフェクションの5日後に、融合抗体を含有する上清を収集し、Amicon Ultra 10K遠心フィルター(Merck Millipore)によって濃縮した。
過剰発現された融合タンパク質の精製
huJ591を、プロテインG-sepharose(GE healthcare)を用いて製造業者の説明書に従って精製した。J591-GTBを、抗FLAG M2アフィニティゲル(Sigma-Aldrich)を用いて製造業者の説明書に従って精製した。手短に述べると、融合タンパク質を含有する上清をM2アフィニティゲルと2時間インキュベートした後に洗浄して、3xFLAGペプチド(Sigma-Aldrich)を用いて溶出させ、PBSに対して透析した。
ウエスタンブロット分析
融合タンパク質を含有する上清または精製画分を還元条件下および非還元条件下で4～20％SDS-PAGEゲル(Life Technology)で分離し、フッ化ポリビニリデン膜(PVDF)(Millipore, Billerica, MA)に転写した。膜を5％ドライミルク/PBSTで60分間ブロックした。抗flag M2を膜と60分間インキュベートした。洗浄後、IRDye 800CW-ヤギ抗マウス二次抗体を膜と60分間インキュベートした。洗浄後、Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences)を用いて膜を分析した。
免疫染色
実験前に24時間、細胞(2x105/ウェル)を12ウェルプレートの中でカバーガラス上で増殖させた。細胞を、PBSに溶解した4％パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、その後にPBSで3回洗浄した。ヒト組織血液型抗原を検出するために、マウスモノクローナル抗A抗体または抗B抗体をRTで60分間添加した。PBSで洗浄した後に、細胞をFITC結合ロバ抗マウス免疫グロブリンと60分間インキュベートし、PBSで洗浄した。HBGA Oの発現は、細胞をFITC結合コマツナギアグルチニンとRTで60分間インキュベートし、その後にUV顕微鏡下で視覚化することによって検出された。PSMA検出のためにhuJ591をRTで60分間添加した。PBSで洗浄した後に、細胞をFITC結合抗ヒトIgで60分間染色し、PBSで洗浄した。カバーガラスをマウントし、UV顕微鏡下で調べた。
異種移植片腫瘍に由来する組織切片を免疫染色するために、パラフィン切片におけるPSMA発現の検出には3E6を使用し、凍結切片にはhuJ591を使用した。血液型抗原に対する抗体は上記と同じであった。スライドをHisto-Clearに入れることでパラフィン切片を脱パラフィンし、その後に段階的なアルコールと、Tris-緩衝食塩水-Tween 20(TBST)による洗浄によって再水和した。脱パラフィンおよび再水和した切片をTarget Retrieval Solution pH9.0(Dako)に入れ、ウォーターバス(95～99℃)に入れて30分間加熱した。切片をTBSTで洗浄した。ペルオキシダーゼブロックを5分間添加した。TBSTで洗浄した後に、mAbをRTで60分間添加した。抗体結合はペルオキシダーゼ標識ポリマー結合ヤギ抗マウスIgおよび3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)基質を用いて検出された。10％ヘマトキシリンで対比染色した後に切片を視覚化した。インビボで細胞表面PSMAに結合したJ591-GTB融合抗体を検出するのに凍結切片を使用した。凍結切片を、予め冷却したアセトンで10分間固定し、次いで、PBSで洗浄した。ペルオキシダーゼブロックを5分間添加した。PBSで洗浄した後に、前記のように西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトIgGに続いてDABと対比染色によってJ591-GTBが検出された。huJ591と直接インキュベートした切片を正の対照として使用した。
競合ELISA
プレートを、0.05M炭酸緩衝液(pH9.5)に溶解した15μg/mlの7E11抗体(PSMAのN末端/細胞質ドメインに結合する抗体)で4℃で一晩コーティングした。ウェルを、PBSに溶解した2％HSAでRTで30分間ブロックし、洗浄した。1:8に希釈したLNCaP細胞溶解産物(PSMAを含有する)をRTで60分間添加した。PBSで洗浄した後に、マウスJ591抗体の段階希釈液(30μl)を60分間添加し、次いで、J591-GTBまたはhuJ591を含有する上清(1.6μgIg/ml;30μl)と4℃で一晩コインキュベートした。洗浄後、ロバ抗ヒトIgG-アルカリホスファターゼ(1:1,000)をRTで60分間添加した。洗浄後、プレートをpNPP(Sigma)とインキュベートし、405nmで読み取った。
インビトロでの血液型抗原変換
細胞(2x105)を12ウェルプレートの中にあるカバーガラス上で24時間増殖させた。カバーガラスをPBSで洗浄し、湿ったチャンバーに移した。次いで、細胞をhuJ591-GTB(または4D5-GTB)融合抗体+UDP-ガラクトースと37℃で30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、細胞をPFAで固定した。細胞表面上のB抗原変換が、前記のように免疫染色によって検出された。
インビトロでがん細胞がHBGA Bに変換された後の正常ヒトO血清またはA血清の溶解活性
LNCaP細胞を60ウェルマイクロタイタープレート上で増殖させた。細胞を、天然J591またはJ591-GTB融合タンパク質のいずれかとインキュベートしたか、またはどちらの薬剤ともインキュベートしなかった。全てのウェルにUDP-galも入れた。その後、A型患者またはO型患者に由来する血清を天然抗B Abと補体の供給源として添加した。対照ウェルには、GTBなしで、または血清なしでJ591を入れた。3時間後にウェルを洗浄し、メタノールで固定し、2％ギムザ染料と25分間インキュベートした後に洗浄し、読み取った。同様の方法を用いて、懸濁した前立腺がん細胞株および乳がん細胞株のさらに大きなパネルを試験した。溶解活性は、トリパンブルー排除と、FACSによって測定したヨウ化プロピジウム取り込みの両方によって評価した。
インビボでの血液型抗原変換
Institutional Animal Care and Use Committee(IUCUC)により承認されたプロトコールの下で、6～8 週齢のNOD SCIDマウス(Charles River, Wilmington, MA)に、200μlマトリゲル(Corning Life Sciences, Bedford, MD)に懸濁した5x106個の細胞を皮下注射した。動物実験において細胞株LNCaP、CWR22Rv1、PC3、およびMDA-MB-361を使用した。14～21日後に、確立された腫瘍は8～10mm直径に達した。HuJ591、huJ591-GTB、4D5、または4D5-GTBを静脈内(IV)または腫瘍内に注射した。UDP-galをIV、腹腔内(IP)、または皮下(SQ)に注射した。1日目、2日目、または3日目にマウスを安楽死させ、腫瘍と他の臓器を収集した。各腫瘍の半分を、OCT化合物を用いて凍結切片のために調製した。パラフィン切片を調製するために、もう半分をリン酸緩衝ホルマリンに入れた。免疫染色は前記で説明した。
NOD/SCIDマウスにおける腹腔内異種移植片モデルも、去勢抵抗性ヒトPC細胞株C4-2-ルシフェラーゼを用いて開発した。このモデルでは、ヒト血漿をIP注射して、IV経路使用時に水分過負荷を引き起こすことなく天然Abと補体を供給することができる。10x106個のC4-2-luc細胞をIP注射して数日後、およびバイオルミネセンスイメージングにより腫瘍取り込みを確認した後に、それぞれが同等の中央値/範囲のバイオルミネセンス光量子束のある5匹の動物からなる2つの群に、J591-GTB、UDP-gal、およびヒトO型血清による単回IP処置を与えた。対照群の場合、O型血清を注射前に熱失活させた。約2週間にわたって3～4日ごとに各動物の全束を測定した。
実施例1-抗体-グリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質の作製
最初に、複数の機能性を有する高汎用性モジュラーシステムを提供するプロトタイプ構築物である、腫瘍標的化Abとグリコシルトランスフェラーゼで構成されるキメラタンパク質を作製した。(1)異なる腫瘍関連抗原を標的化できるようにAb特異性は交換可能である。このような腫瘍抗原標的の例は、FOLH1/PSMA、VEGFr、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD38、CD52、CD79、B細胞成熟抗原(BCMA)、ソマトスタチン受容体(例えば、SSTR1-5)、5T4、gp100、CEA、マンモグロビンA、メランA/MART-1、PSA、チロシナーゼ、HER-2/neu、EGFr、hTERT、MUC1、メソテリン、ネクチン-4、TROP-2、および当技術分野において公知の多くの他の腫瘍抗原標的を含むが、これに限定されない。構造の標的化部分は、インタクト(完全長二量体)から、単量体単鎖Ab構造、Fab、Fab’2、scFvまたは他のAb断片誘導体、例えば、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディなどまで異なってもよい。これらはFcRn結合ドメインを維持してもよく、欠失してもよい。または、標的化部分は、標的化された抗原に結合するペプチドでもよい。例には、グルタミン酸-尿素-リジン誘導体、例えば、FOLH1/PSMAに結合するACUPA(2-(3-((S)-5-アミノ-1-カルボキシペンチル)ウレイド)ペンタン二酸)、SSTR2に結合するソマトスタチン誘導体、増殖中の内皮細胞上に発現するα-v/β-3インテグリンに結合するArg-Gly-Asp(RGD)ペプチド、および当技術分野において公知の他の標的化ペプチドを含むが、これに限定されない。これらの種類の標的化薬剤と、これらの異なる物理的性質により、異なる薬物動態および生体内分布を調整することが可能になる。例えば、大きな分子構築物、例えば、FcRn(新生児受容体)結合部位を含む完全長のインタクトなAbは血漿中半減期および全身半減期が長く、循環中にとどまる傾向がある。大きな分子構築物は、腎臓ではなく肝臓を通って排出される可能性が高く、介在する正常細胞層および密着結合のために正常組織に浸透する可能性が低い。逆に、小さく、FcRn結合がなく、抗体ではなく標的化ペプチドを用いて作られた構築物は、半減期が短くなり、腎臓/尿路を通って排出される可能性が高く、正常組織および腫瘍に急速に浸透する傾向がある。標的結合の特異性に加えて、これらの異なる物理的性質、PK、および生体内分布は、構築された薬剤の有害事象プロファイルに影響を及ぼす。(2)グリコシルトランスフェラーゼ成分は、天然の対立遺伝子バリアントと、その機能性を調整するのに利用できる、それぞれの特性の知識のかなりの体系に基づいて変更することができる。グリコシルトランスフェラーゼ成分はまた、天然ではヒトに存在しない高免疫原性α-galエピトープを生じるα-gal-トランスフェラーゼも含むことがある。翻訳後修飾に関与するあらゆる酵素の使用が可能である。グリコシル化に加えて他の例はリン酸化および脂質修飾である。
遺伝子操作された融合タンパク質の作製のさらなる代替として、2つの個別部分の化学結合を用いることで標的化薬剤と翻訳後酵素を連結することができる。このような化学的結合は当業者に公知である。
最初の概念実証の取り組みのために、3種類の十分に特徴付けられ、臨床的に検証されたAb、すなわちJ591(抗FOLH1/PSMA(葉酸加水分解酵素-1/前立腺特異的膜抗原))、4D5(トラスツズマブ;抗her2)、およびオベキセリマブ(抗CD19);4種類のAb構造、すなわちインタクトな二量体、インタクトな単量体、Fab、およびscFv、ならびに4種類のグリコシルトランスフェラーゼバリアント、すなわちα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(GTB;AF134414)、α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(GTA;AF134415)、α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(α-1,3-GalTまたはα-GalT;EC2.4.1.87)、ならびに下記の全く新規の構造を選択した。GTBはα1,3結合でヌクレオチド-ドナーUDP-galからガラクトース部分をアクセプターH抗原に転移して、Galα(1-3)[Fucα(1-2)]Galβ1,4 GlcNAc-R(HBGA B)を形成する。GTBは活性のためにH抗原がα1-2結合フコースで修飾されていることを必要とする。なぜなら、Bトランスフェラーゼは未修飾の2型前駆体に付加しないからである。α-1,3-GalTはα1,3結合でヌクレオチド-ドナーUDP-galからガラクトース部分をGalβ1,4 GlcNAc-Rに転移する。この酵素は活性のためにH抗原がα1-2結合フコースで修飾されていることを必要としない。HBGA O型およびA型の個体は集団の85～90％を構成するのでGTBを選択した(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Galili et al., 「A Unique Natural Human IgG Antibody With Anti-Alpha-Galactosyl Specificity」, J. Exp. Med. 160:1519-1531 (1984))。以前に述べられたように、これらの個体は高レベルの抗HBGA B抗体を有する。α-1,3-GalTは、末端Galを、H抗原を形成しない細胞、例えば、造血細胞または間葉系細胞に由来する細胞に付加できるので選択された。GTBの選択は、実質的に同一の構造の結果として、HBGA Bと交差反応する高レベルのポリクローナル抗gal活性(異種移植片の超急性拒絶反応を担う)の結果としてさらに利益を得る(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Macher et al., 「The Gal Alpha1,3Gal beta1,4GlcNAc-R (Alpha-Gal) Epitope: a Carbohydrate of Unique Evolution and Clinical Relevance」, Biochim. Biophys. 1780:75-88 (2008))。GTB(またはGTA、α-GalT、またはFUT)配列から、酵素活性に不必要な短い細胞質領域、膜貫通領域、およびステム領域を切除し、それぞれの抗体(または誘導体)またはペプチド配列と交換してキメラタンパク質を作り出した。その抗体またはペプチドドメインが、原形質膜に位置するコグネイト抗原に結合することで膜結合が再構成される。キメラタンパク質のELISAアッセイによって、インタクトまたは抗体断片が使用されたかどうかに関係なく、それぞれのAb結合特異性と免疫反応性はそのまま残っていることが確かめられた(図2A～2B)。UDP-14C-galから合成基質(フコシル-ラクトース(FL))への14C-gal組み込みも、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Yamamoto et al., 「Amino Acid Residue at Codon 268 Determines Both Activity and Nucleotide-Sugar Donor Substrate Specificity of Human Histo-Blood Group A and B Transferases. In Vitro Mutagenesis Study」, J. Biol.Chem. 271:10515-10520 (1996)に記載のように測定した。(図2A～2B)から高いGTB活性が維持されることが裏付けられた。
このような融合タンパク質を遺伝子工学によって作り出すことに加えて、当技術分野における知識の1つを用いると、標的化タンパク質、ペプチド、または他の生物製剤を、細胞タンパク質を翻訳後修飾できるエフェクター酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ)に化学的に連結することができる。
実施例2-グリコシルトランスフェラーゼ活性の機能性の調整
A、B、およびO対立遺伝子に関する深い知識により、この成分の機能性をさらに洗練させる十分な機会が与えられる。例えば、選択することができた別の対立遺伝子バリアントの中には、いわゆる、最も重要な2つのアミノ酸残基(GTAのaa266および268(leuおよびgly)ならびにGTBのaa266および268(methおよびala))を交換してハイブリッド配列(methおよびgly)を作製した「cisA,B」配列がある(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Yazer et al., 「The Cis-AB Blood Group Phenotype: Fundamental Lessons in Glycobiology」, Transfus. Med. Rev. 20:207-217 (2006))。このcis A,B酵素配列はHBGA AとBの特異性を両方とも合成する。
酵素活性を調節して酵素の効力を調整するのを可能にする他の配列が知られている。例えば、GTAの2つの天然変異対立遺伝子(Ae101およびA201と呼ぶ)に基づいて全く新規のバージョンのGTBを開発した。Ae101は一塩基挿入を有し、A201は一塩基欠失を有する。それぞれがあるとフレームシフトが起こる。フレームシフトによって、それぞれ、C末端に37アミノ酸延長および21アミノ酸延長のあるトランスフェラーゼが産生される。結果として生じた、延長のある、これらのトランスフェラーゼには、1/30～1/50以下になった酵素活性がある(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Yip, 「Sequence Variation at the Human ABO Locus」, Annals of Human Genetics 66:1-27 (2002))。これらの2つの変異対立遺伝子はGTAという面に関して定義されたが、このような変異対立遺伝子はGTBの場合には説明されたことがない。それにもかかわらず、終止コドンの前に様々な長さの多様なアミノ酸配列を挿入することによってGTBにC末端配列延長を直接組み込むことで全く新規の配列を作製した。2、7、14、および54アミノ酸の延長を組み込んだ4バージョンのGTBを試験した時に、GTB活性は93％まで漸進的に低下した(図3)。これにより、腫瘍もしくは組織に関連するエンドプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼ、例えば、PSA、メタロプロテイナーゼなどの存在下で延長を切り離す切断可能な配列を組み込むことで、前記のように望ましい活性レベルならびにオンオフスイッチを調整できる機構が得られる。延長のための任意の配列選択は従事者の裁量にあり、その唯一の要件は、下記のように測定することができる酵素活性の望ましいレベルを実現するように配列が選択されることと、非免疫原性であることである。非免疫原性は、天然の非免疫原性タンパク質(例えば、アルブミン)の配列情報を用いて成し遂げられてもよく、免疫原性を引き出すか、または決定する、当技術分野において公知の方法によって、例えば、T細胞結合モチーフを排除することによって成し遂げられてもよい。
実施例3-インビトロでのHBGA B同種抗原の誘導性発現
構築物の機能性を証明するために、全て天然でHBGA Oであるヒト前立腺がん細胞株LNCaP(PSMA-高)、CWR22Rv1(PSMA異種および低)、ならびにPC-3(PSMA-neg)をキメラJ591(抗FOLH1/PSMA)-GTBまたはJ591(GTBなし)と両方ともUDP-galと一緒に、インビトロで、およびSCIDマウス由来異種移植片組織切片上でインキュベートした。キメラJ591-GTB+UDP-galとインキュベートした細胞株および組織切片はHBGA Bに変換されたのに対して、J591(GTBなし)+UDP-galとインキュベートした細胞株および組織切片はHBGA Bに変換されなかった。このことから、変換にはGTBが必要だったことが証明される(図4)。
インビトロでは、J591-GTBはLNCaP(PSMA-高)をHBGA OからHBGA Bに変換したのに対して、PC3(PSMA-neg)を変換しなかった(図5)。PSMAでトランスフェクトされているPC3細胞(PC3-PSMA)を試験することで、HBGA変換の高度の特異性が確かめられた。これらのPSMA異種発現細胞において、PSMA-pos細胞だけが変換された。隣接するPSMA-neg細胞は変換されなかった(図6)。
HBGA O LNCaP細胞を、O型全血+UDP-GalとJ591またはJ591-GTBまたはJ591-GTB-54アミノ酸延長の中でもコインキュベートした。図7に示したように、J591は細胞を全く変換せず、これに対して、J591-GTBは延長があっても延長がなくてもLNCaP細胞をO型からHBGA B型に変換したが、RBCを変換しなかった。
実施例4-がん細胞がHBGA Bに変換された後の正常ヒトO血清またはA血清の溶解活性
インビトロアッセイを用いて、HBGA B発現に変換された後の前立腺がん細胞または乳がん細胞を正常ヒトO血清およびA血清が溶解する溶解能力を試験した。図8A～8Dは、LNCaP細胞(HBGA O)がJ591-GTB+UDP-gal+ヒトA(またはO血清)（抗B成分と補体成分の供給源として）とインキュベートされると溶解されることを示す。ヒトA血清またはO血清を取り除くと、および/またはJ591-GTBを、GTBのないJ591と交換すると溶解は起こらなかった。
全てHBGA Oである、さらに大きな前立腺がん細胞株パネルをトリパンブルー排除(図9)と、FACS分析によるヨウ化プロピジウム取り込み(図10)によってアッセイした。これらの株うち4種類の株(LNCaP、VCaP、MDA-PCa-2b、およびCWR22Rv1)が高レベルから低レベルまで様々なレベルのPSMAを発現し、J591-GTB+天然抗B Ab+内因性補体を含有するヒトO血清またはA血清とインキュベートされると全てが溶解された。5番目の細胞株であるPC3はPSMA-negであり、変換されず、溶解しなかった(図11A～11B)。乳がん細胞株MDA-MB-361を用いて、キメラ剤mAb 4D5-GTBによる変換後に同様の結果が得られた。
実施例5-インビボでのHBGA発現の変換
ヒトでのHBGA不適合固形臓器移植の急速な拒絶反応と破壊は、腎臓同種移植の初期から十分に記録に残され、かつ十分に確立された現象であるので(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、T. Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964); L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times. (2003))、重大な意味を持つインビボ実験は、全身投与の腫瘍標的化アプローチを用いて、通常はゴルジ/ERの内部で機能する同種異系グリコシルトランスフェラーゼを腫瘍細胞の原形質膜に「分子移植(molecular transplant)」することで、確立されたヒトがんのHBGAを高免疫原性HBGAのHBGAに変換できることを証明することであった。概念実証のために、最も一般的なタイプの固形腫瘍のうちの2つである前立腺がんおよび乳がんから得られた2種類の臨床的に十分に確立された腫瘍関連抗原(FOLH1/PSMAおよびHER2)を選択した。標的発現レベルの点で広い範囲を発現する複数の腫瘍株を試験した。PSMA-pos前立腺がんLNCaP、C4-2、およびCWR22Rv1、ならびにher2-pos乳がん、MDA-MB361をNOD SCIDマウスの皮下部位に確立した。J591-GTBまたは4D5/トラスツズマブ-GTBをIV投与した。UDP-galをIV、IP、または皮下経路によって投与した。J591-GTBおよび4D5/トラスツズマブ-GTBは、それぞれ、PSMA-pos前立腺がんおよびher2-pos乳がんを変換した(図10A～10H。図12A～12Eも参照されたい)。
IV投与またはSQ投与と比べてUDP-galをIP投与した後ではHBGA B変換は不十分であった。HBGA発現は原形質膜にはっきりと存在した。予想されたように、Ab-GTBを、それぞれのAbのみと交換するとHBGA B発現は起こらなかった。他のどの組織でも変換は検出できず、動物は毒性証拠を全く生じなかった。
実施例6-インビボでの抗腫瘍活性
動物モデルにおける、Ab-GTBによって誘導されたHBGA発現変換に起因する抗腫瘍活性の試験はいくつかの困難を突きつけた。なぜなら、マウスとラットは両方ともcisA,B対立遺伝子ならびにα1,3GalT対立遺伝子を発現するからである。結果として、これらのげっ歯類モデルはHBGA A陽性、B陽性、α1,3gal陽性であり、従って、これらの糖構造の全てに対して寛容である。さらに、マウスは、非常に弱いか、不活性の補体系を有し(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Bergman et al., Cancer Immunol. Immunother. (2000) 49:259-266; Drake et al., 「Passive Administration of Antiserum and Complement in Producing Anti-EL4 Cytotoxic Activity in the Serum of C57BL/6 Mice」, J Natl. Cancer Inst. 50:909-14 (1973); Ong et al., 「Mouse Strains With Typical Mammalian Levels of Complement Activity」, J. Immunol. Methods 125:147-158 (1989))、場合によっては、ヒトを含む他の種の補体活性の機能を阻害さえする(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Ratelade et al., 「Inhibitor(s) of the Classical Complement Pathway in Mouse Serum Limit the Utility of Mice as Experimental Models of Neuromyelitisoptica」, Mol. Immunol. 62:104-113 (2014))。実際に、正常ヒト血漿の補体活性をC57BL/6血漿の存在下でアッセイした。ヒト補体溶解活性は約33％低下することが見出された。これらの動物モデルに天然Abが存在しないことと、弱いか、または阻害性でさえある補体系を克服する目的で、必要な天然Abと機能的な補体タンパク質を供給するためには動物の血漿をヒトO型またはA型血漿とほぼ完全に交換することが必要になるだろう。この血漿交換は身体的に実現不可能であり、水分過負荷をもたらし、ヒト定常状態を反映する適切な免疫グロブリン生体内分布平衡を提供せず、天然マウス血漿の阻害作用によって損なわれるだろう。これらの問題は、去勢抵抗性ヒトPC細胞株C4-2-ルシフェラーゼを用いてNOD/SCIDマウスにおいて腹腔内異種移植片モデルを開発することによって克服された。このモデルでは、水分過負荷を引き起こすことなく天然Abと補体を供給するためにヒト血漿をIP注射することができた。10x106個のC4-2-luc細胞をIP注射して数日後、およびバイオルミネセンスイメージングにより腫瘍取り込みを確認した後に、それぞれが同等の中央値/範囲のバイオルミネセンス光量子束のある5匹の動物からなる2つの群に、J591-GTB、UDP-galおよびヒトO型血清による単回IP処置を与えた。対照群の場合、O型血清を注射前に熱失活させた。約2週間にわたって3～4日ごとに各動物の全束を測定した。熱失活血清が与えられた動物は13日目までに有意な腫瘍進行を経験した。これに対して、活性補体を含有する血清で処置した動物は対照群の束と比べて80％退縮した(p=0.0032;図13A～13B)。二度繰り返した実験から、首尾一貫した結果が得られた(図14A～14B)。
実施例1～6の考察
がんに対する免疫応答は不適合性同種移植片に対する応答とはかなり異なる。本明細書に記載のように、非自己、高免疫原性の表現型である不適合性HBGA発現を発現するように腫瘍細胞を選択的に改変する戦略が提示される。ヒトにおけるHBGA不適合性同種移植片の迅速かつ破壊的な結果はStarzlによって腎臓同種移植の初期に出され(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、T. Starzl, Experience In Renal Transplantation.(WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964))、ドナー-レシピエントマッチングの不可欠かつ重要な部分であるHBGA適合性試験につながった。誤りが起こり、HBGA適合性の要件が破られた、まれにしか起こらない場合だけ、この戒めが繰り返され、補強される(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times (2003))。
この戦略を実施するために、臨床面で検証された、腫瘍に制限された抗体(抗FOLH1/PSMAおよび抗HER2によって例示される)をGTBと融合させて1つの二機能性タンパク質を生成した。様々な抗体断片、ペプチド/リガンド、および構築物を用いて標的化グリコシルトランスフェラーゼ(GT)が同じように構築されている。ヒトにおいて不適合性ABO同種移植の結果は十分に証明されているが、この取り組みにおける難題は、通常はゴルジに見出される翻訳後グリコシルトランスフェラーゼ機能を腫瘍(または新生血管内皮)細胞表面に分子的に「移植する」ことであり、このことを、全身投与の、腫瘍に標的化されるやり方で行うことであった。
これらのキメラタンパク質はインビトロとインビボで両方とも様々ながん細胞株のHBGAを首尾よく変えた。動物実験ではオフターゲットのHBGA変換も毒性も認められなかった。本明細書において示したようなHBGA不適合性細胞は、臨床移植の場で何回も証明されているように、がん患者において発生すると予想される応答である補体媒介性溶解を誘発する(その全体が本明細書において参照により組み入れられる, L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times (2003); T. Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964))。
新HBGAの生合成には、HBGAが付加されるために、GTと、標的細胞の糖タンパク質上および糖脂質上にある(フコシル化)H抗原「アクセプター構造」が両方とも存在することが必要である(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Milland et al., 「ABO Blood Group and Related Antigens, Natural Antibodies and Transplantation」, Tissue Antigens 68:459-466 (2006)。肺、胃、結腸直腸、乳房、前立腺、卵巣、膀胱、膵臓などを含む多様な癌がH抗原を発現するので、これらの腫瘍タイプは、この戦略の候補になるだろう。(1)標的化されたGTB(またはGTA)酵素が結合しないため、(2)多くの正常細胞タイプ(例えば、骨髄、肝臓、脾臓、腎臓、心筋、中枢神経系および末梢神経系など)には、必要とされるHAgが存在せず、これらの部位でのGTB(またはGTA)トランスフェラーゼ活性が妨げられるため、正常な非標的細胞はHBGA変換を受けない。FOLH1/PSMA発現は多種多様な腫瘍の腫瘍新生血管において報告されているが、正常組織の脈管構造には存在しない。FOLH1/PSMA陽性の新生血管を有する腫瘍タイプの例は、腎臓腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、乳腺腫瘍、脳腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍、副腎腫瘍、頭頚部腫瘍、メラノーマ、および脳腫瘍などを含む。精巣、リンパ系、および肉腫は、一般的ではないが、時としてFOLH1陽性になることがある。腫瘍新生血管におけるFOLH1/PSMA発現の標的化は、多種多様な腫瘍の血管床内にあるHBGA発現を変える手段を提供する。そして次に、これは、誤ったHBGAの固形組織同種移植片において見られる同じような超急性拒絶反応現象につながるだろう(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times (2003); T. Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964))。
前記反応の酵素の性質は増幅作用をもたらす。なぜなら、それぞれの標的化された酵素分子は非常に多くのアクセプター分子を変換するからである。さらに、Abによって標的化される腫瘍関連抗原そのものが酵素的に変換されるだけでなく、酵素の範囲内にある、全ての隣接分子も酵素的に変換される。そして、ほとんどの細胞表面分子は複数のグリコシル化部位を有し、FOLH1/PSMAは、例えば、10個(FOLH1/PSMAが、普通、ホモ二量体として発現されることを考えるのであれば20個）のグリコシル化部位を有するので、このアプローチによって作製することができる非自己HBGA部位の量はかなり多い。さらに、標的化された新生血管細胞または腫瘍細胞が分泌した糖タンパク質もHBGA変換され、腫瘍微小環境において補体活性化が起こり、それによって腫瘍周囲の免疫環境が強化される。
これらの上記の要因、すなわち、酵素増幅、直接標的化される分子と隣接分子および分泌型糖タンパク質の変換、ならびに豊富なグリコシル化部位の乗数は、弱く発現している腫瘍関連抗原標的の場合でも、腫瘍細胞による、および腫瘍微小環境内での前例のない高免疫原性抗原発現レベルをもたらすはずである。HBGA O患者およびA患者は集団の約85％を構成するので、概念実証の取り組みではGTBを利用した。さらに、異種移植を妨げるポリクローナル抗gal活性がHBGA Bと交差反応するので(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Macher et al., 「The Gal alpha1,3Gal beta1,4GlcNAc-R (alpha-Gal) Epitope: a Carbohydrate of Unique Evolution and Clinical Relevance」, Biochim. Biophys. 1780:75-88 (2008))、腫瘍および/またはその血液供給によるHBGA Bの誘導性発現により、HBGA Bは、高レベルの炎症と超急性拒絶反応を媒介することができる補体結合抗体による前例のないレベルの攻撃の標的になる。この戦略は、A活性とB活性を両方とももつGTを用いることでHBGA O、A、およびB患者(集団の約95％)をカバーするように拡張できるかもしれない。これは、いわゆる、cisAB GTにおいて天然で起こる変異であり、HBGA AおよびBを両方とも生じる、GTAの1個のヌクレオチド/アミノ酸変化803G>C(Gly268Ala)によって実現可能である。このアプローチは、天然の抗A抗体も抗B抗体もないAB患者(集団の約5％)を除く全ての患者に適用可能だろう。
本明細書に記載の方法は、最近の成功した免疫療法アプローチと多くの特徴を共有し、かつ補い合う関係にある。T細胞溶解機構を利用するCAR-Tおよび二重特異性Abアプローチと同様に、本アプローチは補体カスケードの溶解機構を使用する。直接的な溶解作用以上に、腫瘍微小環境内で補体カスケードの誘発は、T細胞の初回抗原刺激を促進するために、細胞性免疫応答の効力を向上させる橋渡しとして役立つ(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Kopf et al., 「Complement Component C3 Promotes T-cell Priming and Lung Migration to Control Acute Influenza Virus Infection」, Nature Med. 8:373-378 (2002))、C3がAPCを活性化した時に(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Baudino et al., 「C3 Opsonization Regulates Endocytic Handling of Apoptotic Cells Resulting in Enhanced T-cell Responses to Cargo-Derived Antigens」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:1503-1508 (2014); Surace et al., 「Complement is a Central Mediator of Radiotherapy-Induced Tumor-Specific Immunity and Clinical Response」, Immunity 42:767-777 (2015))。さらに、最近、C3の断片である遊離C3dの遊離が、(アポトーシスを介して)Tregを枯渇させ、パーフォリン、TNF-α、および IFN-γを産生するCD8+ T細胞の浸潤を増加させ、T細胞によるPD-1 発現を減少させることが示されている(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Platt et al., 「C3d Regulates Immune Checkpoint Blockade and Enhances Antitumor Immunity」, JCI Insight. 2:e90201 (2017))。さらに、補体系を活性化すると、炎症を誘導し、炎症細胞を動員する、C3aおよびC5aなどの走化性因子が生じる。これは「コールドな」腫瘍微小環境を、免疫応答をもっと助ける「ホットな」微小環境に変換するだろう。要するに、本明細書に記載のアプローチは、体液性免疫系と補体カスケードを直接使用することで、ならびに細胞性免疫応答の強化におけるその役割によってがんに対する免疫攻撃の幅と強度を広げる可能性を提供する。
実施例7-抗CD19-GTBを用いたMM1-SのB変換
図15～17は、HBGA Bを発現するようにCD19陽性/HBGA O陽性ミエローマ細胞を変換する能力を示す。この場合、組織培養で継代されているMM1-Sミエローマ細胞を、CD19、CD20、CD38(図15)、HBGA A、HBGA Bに対するマウスモノクローナル抗体(Fisher Scientific(Ortho)を用いて、HBGA Oを検出するためにUlex-FITC またはUlex-Dylight(Vector Labs)(図16A～16B)を用いて蛍光標識細胞分取(FACS)によって試験した。MM1-S細胞を各抗体と1時間インキュベートし、細胞を洗浄し、次いで、抗マウスIgM-Alexa488または647(Jackson ImmunoResearch)などの適切な二次抗体とインキュベートした。この場合、一次抗体は、IgMまたは一次抗体がIgGである時にはタグ化抗マウスIgGであった。もう1回洗浄した後に、細胞をFACSによって分析した。図17に示したように、MM1-S細胞を抗CD19-GTB融合タンパク質+UDP-galとインキュベートし、FACSによってHBGA B発現を未処理細胞と比較した。
図15は、MM1-Sミエローマ細胞がCD20陰性、CD19+、およびCD38+であることを示す。図16A～16Bは、MM1-S細胞がHBGA A陰性およびB陰性であるが(図16A)、HBGA O陽性(図16B)であることを示す。図17は、抗CD19-GTB融合タンパク質+UDP-galとインキュベートしたMM1-S細胞が、未処理細胞と比べて高レベルHBGA B発現に変換されることを示す。
これらの実験は、外来抗原:HBGA Bを発現するような腫瘍標的変換の別の例を示す。この場合、標的は、B細胞新生物にも存在するB細胞マーカーであるCD19である。これは造血腫瘍タイプの変換であるのに対して、他の実施例に示される前立腺(PSMA)および乳房(HER2)は固形腫瘍の例である。
実施例8-抗体または抗体誘導体に代わるものとして低分子リガンドを介してグリコシルトランスフェラーゼを標的化する
図18は、GTAまたはGTBまたはα-galの標的化が抗体ベースの構築物だけでなく、ペプチド/低分子リガンドベースの標的化薬剤でも行うことができることを証明する。この場合、GTB酵素を、PSMAに結合するガラクトース-尿素-リジンベースのリガンドである2-(3-((S)-5-アミノ-1-カルボキシペンチル)ウレイド)ペンタン二酸(ACUPA)と結合体化した。高レベル結合を成し遂げるために、ACUPAとGTB部分との間にPEG1500スペーサーを使用した。これにより、ACUPAよりずっと大きなGTA/GTB酵素からの立体妨害なく、ACUPAがPSMA酵素ポケットに結合するのに十分な立体的自由が得られた。
図18は、ACUPA-PEG1500-GTBが、LNCaP細胞をHBGA OからHBGA Bに変換できることを示す(左パネル)。標的化用のACUPA部分のない純粋なGTBを使用すると変換は起こらなかった(右パネル)。
150kdの大きな抗体から、単量体(75Kd)、Fab’2(100kd)、Fab(50kd)、scFv(25kd)などの小さな抗体由来フォーマット、ACUPA(1.0kd)などの短いペプチドまで様々な標的化部分を使用する融通性があると、様々な薬物動態学的特性と生体内分布特性を有する融合タンパク質の構築が可能になる。融合タンパク質が大きいほど循環が長期間になり、血液区画に長期間とどまり、肝臓を通じて排出される傾向があるのに対して、構築物が小さいほど血清中半減期が短くなり、腫瘍標的に素早く到達/接触し、腎臓によって排出される傾向がある。これらの様々な選択肢を利用して、様々な腫瘍タイプ(例えば、血液腫瘍対固形腫瘍)の要件に応じて療法を調整することができる。
実施例9-変換の特異性と正確さ;バイスタンダー効果の非存在
図19および20に示したように、乳がん細胞株であるSK-BR5(PSMA陰性)とLNCaP(PSMA陽性)前立腺がん細胞株を同時培養した。これらの細胞は特徴的な形態をもつので区別することができる。すなわち、SK-BR5は球形であり、図19の視野の中央と上部(赤色の丸)の近くに2つのクラスターが見られる。LNCaPの方が細長く、これらの細胞は識別マーカーとしてGFPも発現する。
培養物をJ591-GTB+UDP-galで処理した時に、PSMA陽性細胞上にしかHBGA B(Cy5(紫色)で染色)は現れない。隣接するPSMA陰性SKBR5細胞クラスター(赤色の丸の中に強調されている)は、変換された細胞のすぐ近くにあってもHBGA Bに変換されていない。同様に、図20は、同じ、区別可能な細胞タイプを示す。左パネルは、DAPIで染色された細胞核の全てを示す。中央のパネルは、GFP発現のために緑色蛍光のある紡錘状のLNCaP細胞を示す。J591-GTB+UDP-galで処理した後である右パネルは、PSMA陽性LNCaP細胞にしかHBGA Bが発現しておらず、それに対してPSMA陰性SK-BR5細胞がHBGA B陰性のままであることを示す。
これにより、高度の特異性とバイスタンダー効果の非存在が証明される。すなわち、隣接する細胞であっても、直接標的化され、融合タンパク質に結合しない限り変換されない。
実施例10-特異性指数の定量
図21A～21Bおよび図22は、同じ2種類のPSMA陽性細胞株とPSMA陰性細胞株に対して特異性指数を定量する。100μg/mLから0.003μg/mLの様々な濃度の抗PSMA-GTBを一つ一つ、それぞれの細胞株とヌクレオチドドナーUDP-galの存在下でインキュベートした。変換の特異性を、FACSを用いて、LNCaP(PSMA+)をHBGA Bに変換するのに必要なJ591(抗PSMA)-GTB濃度をSK-BR5(PSMA陰性)細胞と比較することで定量した。両細胞株ともO+である。FACSヒストグラムを図21A～21Bに示した。12.5ug/mLを超える濃度は12.5ug/mL曲線に重なり、閲覧を簡単にするためにFACSヒストグラムから除かれていることに留意されたい。
100ug/mLまでのJ591-GTB濃度でもSK-BR5のB変換は起こらない。比べると、0.012ug/mLと少ない濃度の抗PSMA-GTBはPSMA陽性細胞の変換を誘導し始める。このデータを図22にヒストグラムの形で表示した。このことから、融合タンパク質は、PSMA陽性細胞に対してPSMA陰性細胞よりも少なくとも8,196倍特異的であることが分かる。これは、融合タンパク質がPSMA陽性細胞に直接結合し、PSMA陽性細胞の細胞表面に集まり、その酵素機能を果たす能力に起因する。酵素が標的細胞表面に結合しない場合には、酵素反応はかなり弱いか、または存在しない。現実性の理由により100ug/mLを上回る濃度は試験しなかった。特異性指数の計算値は実際に8,000倍をかなり上回る可能性がある。
図19～22は、非常に素晴らしい変換反応特異性が標的陽性細胞にのみ限定されることと、細胞が標的陰性であり、融合タンパク質に結合しなければ、変換/標的陽性細胞に隣接する細胞でも変換されないバイスタンダー効果の欠如を証明する。
実施例11-細胞表面糖タンパク質と分泌型糖タンパク質が両方とも、この方法によってグリコシル化される
細胞表面糖タンパク質と分泌型糖タンパク質が両方ともゴルジ/小胞体内で同じ細胞プロセスによってグリコシル化されるので、細胞表面分子のHBGAが変換されるのに加えて、標的細胞によって分泌された糖タンパク質もHBGA変換される。この例示的な場合では分泌型糖タンパク質はHBGA B陽性に変換される。LNCaP細胞をJ591-GTB+UDP-galで5時間処理した(10ug/ml抗PSMA-GTB+100μM UDP-gal)。負の対照として、別の一組のLNCaP細胞をUDP-galなしで10μg/ml 抗PSMA-GTBとインキュベートした。正の対照として、細胞表面変換の測定を、バックグラウンド対照として役立つ未変換細胞と一緒に行った。5時間のインキュベーション後に、それぞれの一組の細胞から、分泌型糖タンパク質を含有する使用済み培地を収集し、Amicon3,000ダルトンカットオフを用いて10倍濃縮した。使用済み培地をプレートのウェルに吸着させ、IgM 抗HBGA Bの後に抗マウスIgM-アルカリホスファターゼを用いてHBGA Bが存在するかどうかElisaによって分析した。
図23は、分泌タンパク質上のHBGA Bの存在について、変換された培地が、負の対照(未変換の使用済み培地)と比べて陽性であったことを示す。
これにより、HBGA B変換は細胞表面に限定されず、標的細胞によって分泌された糖タンパク質も含むことが証明される。インビボでは、このことから、これらの変換された分泌型糖タンパク質は腫瘍細胞外空間に浸透し、天然抗B抗体に結合され、補体を誘発し、炎症誘発性微小環境を生じさせ、走化性を介して炎症細胞および免疫細胞を動員し、さらに腫瘍微小環境を「ホットな」微小環境に変換することが示唆される。
実施例12-α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(aGalT)の利用の分析
ヒトのグリコシルトランスフェラーゼAまたはグリコシルトランスフェラーゼB酵素を使用することに加えて、別の態様は、全哺乳動物において機能するが、ヒトと旧世界ザルでは進化的変異のために不活性である酵素α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(aGalT、EC2.4.1.87)を利用する。GTA、GTB、およびα1,3GalTは高度に相同であり、同じ先祖遺伝子に由来すると考えられている。GTBと同様に、αGalTは細胞表面型および分泌型の糖タンパク質および糖脂質の炭水化物鎖に末端α1,3ガラクトースを付加するが、GTBとは異なり、αGalTは、そのGalをH抗原フコースアクセプター構造の非存在下で付加することができる。全てのヒトは機能的αGalTがなく、従って、この末端α1,3Galエピトープを発現しないので、全ての循環免疫グロブリンの約1％からなると見積もられるIgM、IgG、IgA、およびIgEクラスの高レベルの抗αGal抗体を有する。機能的aGalTを有し、血管を含む組織の表面に末端α1,3Galを発現する他の哺乳動物から異種移植を妨げるのは、このα1,3Galエピトープの免疫原性である。
αGalTを用いると、対象の血液型に応じてGTAまたはGTBを選択する必要がなくなる。このため、HBGA AまたはBに対する自然抗体がないが、α1,3Galに対する抗体があるAB血液型患者において、この処置アプローチを使用することも可能になる。αGalTの場合、アクセプターとしてH抗原フコースを必要としないので、対応できる組織タイプも広がる。例えば、造血細胞および間葉系由来細胞(ならびにこれらの細胞タイプに由来する腫瘍)ならびに他の組織にはH抗原アクセプターは発現しない。これらの組織/腫瘍はGTAでもGTBでも対応できず、α1,3GalTによって対応できるだろう。
αGalトランスフェラーゼ使用への関心の1つは、ヒトが酵素の機能的バージョンを発現しなければ、ヒトにおいて酵素それ自体に免疫原性があるかどうかである。これがもし本当なら、反復投与のために酵素はヒト化または脱免疫されることが必要になるだろう。この関心は、抗αGalT抗体が存在するのかどうか見るために、異なる血液型の50人の無作為に選択された患者に由来する血清をアッセイすることで評価された。
α1,3GalT(500ng/ml)を96ウェルHalf Area High Bindマイクロプレート中で37℃で一晩コーティングすることでELISAアッセイを行った。負の対照ウェルには酵素をコーティングしなかった。PBS-HSA(5％)で洗浄およびブロックした後に、50人の異なるドナーに由来する血清をプレートに室温(RT)で2時間添加した。これは、21人のO型患者、20人のA型患者、3人のB型患者、および6人のAB型患者に由来する血清を含んだ。洗浄後、抗ヒトIgG+IgM-Alk Phos抗体溶液を添加し、その後にPNPPを添加し、405nmでプレートを読み取ることで抗α1,3GT抗体が検出された。α1,3GTが正しくコーティングされることを確かなものにするために、α1,3GTがHisタグで標識されているので、このタンパク質は抗His-タグ抗体を使用することで検出された(正の対照)。別の対照として、AP抗ヒトIgG+IgMが機能することを確かなものにするために、500ng/mlのBSAをコーティングし、ヒト血清(HBGA A)に由来する抗BSA抗体を、同じ方法を用いて測定した。
50の血清はどれもα1,3GalTに対する抗体を含まないことが見出された(図24A～24B)。これは、GTAおよびGTBを含むが、これに限定されない多種多様なグリコシルトランスフェラーゼの相同性に起因すると推定される。この結果から、αGalエピトープを生じるために、融合タンパク質が免疫原性をもつことを気にすることなく、融合タンパク質にαGalT酵素を使用できることが分かる。従って、脱免疫またはヒト化を必要とする可能性は低い。
実施例13-組換えα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(aGalT)の発現および精製
GTAおよびGTBを用いたアプローチ同様に、α1,3GalT配列の一部(aa90-376)と融合した抗CD19 scFvを構築した。使用したscFv配列は、カニクイザルCD19とヒトCD19を両方とも認識し、それらに結合する、Seattle Geneticsのデニンツズマブ(Denintuzumab)(Den)およびXencorのオベキセリマブ(Obx)に由来した。Ab-GTB構築において以前に説明した同じ(G4S)3スペーサー/リンカーを使用した。αGalTについては、376アミノ酸残基を有し、グリコシルトランスフェラーゼの一般的なトポロジー:6aaの細胞質ドメイン、16aaの膜貫通ドメイン、および酵素活性を含有する内腔ドメインにある354aaと一致するマーモセット配列を選択した。
マーモセットα1,3GTのステム領域は67アミノ酸で構成され、酵素の内腔部分のアミノ酸23-89に及ぶ。これは酵素活性に影響を及ぼすことなく除去することができる。切断型90-376α1,3GTは機能し、融合タンパク質のために選択された。この酵素にHisタグを付加した。構築物をExpi293F細胞において発現させ、金属アフィニティカラムを用いて精製した。
抗hisでプローブしたSDS-PAGE電気泳動から、適切な予想分子量において、望ましい構築物の高純度調製物が明らかになった(図25)。
実施例14-抗CD19 scFv-αGalT構築物の機能性および特異性の調査
抗CD19 scFv-αGalT構築物の機能性および特異性を証明するために、H抗原アクセプター構造もHBGA AまたはBも発現しない造血標的:RajiBリンパ腫細胞上にあるCD19を選択した。CD19も、検証された腫瘍標的である。機能性に加えて、CD19-neg MM1.S細胞とコインキュベートしたCD19+Raji細胞へのαGal付加を比較することで特異性を評価した。
CD19陽性がん細胞株Raji-GFPをCD19陰性がん細胞(MM1.S)と異なる比で混合し、scfv-αGalT構築物(10μg/ml)およびUDP-Gal(5mM)と37℃で1時間インキュベートした。次いで、α1,3Galエピトープの存在を抗α1,3Gal抗体を用いてフローサイトメトリーによって評価した。Raji-GFP細胞とMM1.S細胞を区別するためにRaji-GFP細胞を使用した。
融合タンパク質はCD19陽性Raji細胞に結合し、1～10μg/mLで飽和するが、CD19陰性MM1.S細胞には結合しない(図26A～26B)。抗CD19 scFv-aGalT構築物はCD19-pos Raji細胞に末端α1,3Galを付加したが、CD10-neg MM1.S細胞がCD19-pos Raji細胞の30倍過剰量で存在する時でも、CD10-neg MM1.S細胞に末端α1,3Galを付加しなかった(図27)。MM1.SはRaji細胞に対して高い比であっても、scfv-αGalT融合タンパク質+UDP-Galの存在下で、決してαGal陽性にならなかった。
α1,3GalTそのものにはscFv結合ドメインがなく、Gal部分を付加しない。このことから、α1,3Galを付加するには融合タンパク質の抗体(または断片)部分を介した結合が必要とされることが証明される(図28)。さらに、UDP-galが添加されなかった時には、Galは標的細胞に付加されなかった。UDP-galの存在下ではα1,3Gal部分は付加されるが、HBGA Bに対する抗体が結合しないことで証明されたようにHBGA Bエピトープを生じない(図28)。
実施例15-抗CD19 scFv-aGalTが新鮮ヒトリンパ球を変換する能力
同様に、抗CD19 scFv-aGalTが新鮮ヒトリンパ球を変換する能力を試験した。抗CD19構築物の存在により結果を歪めることを避けるために、この実験ではB細胞を特定するために抗CD20を使用した。細胞を、示された濃度のUDP-galのみ、Obx CD19-αGalTのみ、またはObxCD19-αGalT+UDP-galの両方とインキュベートした。2チャンネルFACSを用いて、CD19-αGalTの結合(ｘ軸)と、αGalエピトープの発現(y軸)を測定した(図29)。未処理の負の対照も行った。
CD20陰性細胞は融合タンパク質を結合せず、α1,3Galを発現するように変換されなかった(図29、上パネル)。CD20陽性細胞(図29、下パネル)は融合タンパク質の結合を示し、UDP-galも添加した時だけα1,3Galを発現するように変換された。
実施例16-CD19陽性Raji-GFP細胞に対する、異なる血液型ドナーに由来するヒト血清の溶解機能性
CD19陽性Raji-GFP細胞に対する、異なる血液型ドナーに由来するヒト血清の溶解機能性を試験した。CD19+Raji-GFP細胞をUDP-Gal(5mM)と共に、または伴わずにObx-αGT(10μg/ml)と37℃で1時間インキュベートした。次いで、異なるドナーに由来する血清を細胞に添加し、37℃で4時間インキュベートした。細胞の生存率をフローサイトメトリーによってGFP発現を測定することで評価した。
抗CD19 scFv-aGalT変換を完了して末端α1,3Galを発現させるためのヌクレオシドドナーとしてUDP-galが提供されない場合、バックグラウンド溶解しか見られなかった(図30)。だが、UDP-galが含まれ、αgalが変換された時には、変換された細胞をヒト血清は溶解した。この実験では、O型血清およびA型血清はB型血清またはAB型血清よりも大きな溶解を引き起こすことが見出された。
実施例17-自己血清を用いた新鮮ヒトB細胞の変換および溶解
(同じドナーに由来する)自己血清を用いて新鮮ヒトB細胞の変換および溶解を調べるために上記を拡張した。ここでは、個々のドナーの抗α1,3Gal IgGレベルおよびIgMレベルも測定した。異なる血液型のドナーに由来するヒトPBMCをObx-αGT(10μg/ml)およびUDP-Gal(5mM)と37℃で1時間インキュベートした。ヒトIgGおよびヒトIgMが結合するかどうか抗γ鎖特異的抗体または抗μ鎖特異的抗体を用いて、細胞アリコートをFACSによって分析した。次いで、同じドナーに由来する血清を別の細胞アリコートに添加し、37℃で4時間インキュベートした。抗CD20を用いたフローサイトメトリーによってB細胞枯渇を測定した。
変換された細胞の最も大きな程度の溶解がA型患者およびO型患者において見出された。これは個々の患者の抗α1,3 Galレベルと一致した(図31A～31B)。このことから、処置前に抗αgalを測定することで、この処置アプローチに患者が応答する可能性が大きいか、または小さいか予測できると示唆される。さらに高いレベルの抗αgal抗体を刺激するために、一部の患者、特に、B型またはAB型はα1,3gal抗原への曝露による初回抗原刺激から利益を得る可能性があることも示唆される。これは、この治療的アプローチの少なくとも1週間前に、αgalを含有する多糖または糖タンパク質を皮下投与することによって起こる可能性がある。または、初回処置サイクルのαgalエピトープ誘導が、後のサイクルのために存在するように抗αgal抗体産生を刺激するのに役立つかもしれない。当技術分野における知識の一つは、処置前の抗αgalレベルと、処置前の抗αgalレベルと応答との関係について一連の患者を評価し、閾値を決定することができる。閾値未満では、初回抗原刺激がなければ応答が起こる可能性は小さくなる。
実施例18-自己血清を用いてヒトドナーCD19細胞溶解を発生させるための抗CD19 scFv-aGalTおよびUDP-galの最適濃度の決定
自己血清を用いてヒトドナーCD19細胞溶解を発生させるための抗CD19 scFv-aGalTおよびUDP-galの最適濃度を決定した。αGal変換細胞に対して血清媒介性溶解を誘導することが知られているHBGA A型ドナー由来ヒトPBMCを様々な濃度のObx-αGTおよびUDP-Galと37℃で1時間インキュベートした。次いで、同じドナーに由来する血清を細胞に添加し、37℃で4時間インキュベートした。結合とα1,3Gal転移とB細胞枯渇をフローサイトメトリーによって評価した。
抗CD19 scFv-aGalTは約10ug/mLでCD19細胞を飽和させた(図32A～32C)。約10mMのUDP-gal濃度でα1,3galの発現は最も良かった。10ug/mLの抗CD19 scFv-aGalTと、5～20mMの範囲のUDP-galを用いるとB細胞溶解は最大になった。>10ug/mL、特に、CD19の飽和点を上回る>/=25ug/mLの抗CD19 scFv-aGalT濃度でB細胞溶解は漸進的に減った。これは、結合しなかった抗CD19 scFv-aGalTがUDP-galにおいて競合し、それによって、細胞に結合した抗CD19 scFv-aGalTに利用可能なUDP-galが減ったためである可能性が高い。
scFv-aGalTおよびUDP-galの濃度はがん標的抗原に応じて変化することがあり、腫瘍細胞膜上でのその密度と溶解効力は抗α1,3Gal抗体(IgMおよび/またはIgGおよび/またはIgAおよび/またはIgE)のレベルに応じて変化することがある。これらのパラメータは全て処置前に測定することができ、当業者は、一人一人の患者を処置するために様々な成分の最適濃度を決定し得る。
実施例19-抗CD19 scFv-αGalトランスフェラーゼの操作
オベキセリマブ-scFv-α-1,3 Gal(SEQ ID NO:63)は、vH-vL方向で、(G4S)3リンカーを介してオベキセリマブ単鎖可変断片(scFv)をマーモセット由来α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ(aa90-376)のN末端に融合することによって構築された。アフィニティクロマトグラフィー精製を可能にするために6Hisタグを融合タンパク質のC末端に付加した。
前記のタンパク質をWuXi Biologicsにおいて作製した。簡単に言うと、オベキセリマブ-scFv-α-1,3 Galをコードする標的DNA配列(SEQ ID NO:63)をコドン最適化し、合成し、WuXi Biologicsの知的財産権によって保護されている発現ベクターにサブクローニングした。2LまでスケールアップしたCHO細胞における一過的トランスフェクションにより融合タンパク質を発現させた。3段階カラム精製プロセスによって細胞培養上清からオベキセリマブ-scFv-α-1,3Galを精製した。最初の捕獲段階でニッケルアフィニティクロマトグラフィー、その後に陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、<1EU/mgのエンドトキシンレベルで95％のタンパク質純度を得た。精製タンパク質を、20mg/mlのヒスチジン緩衝液pH6.0に溶解して処方した。タンパク質純度をSDS-PAGEおよびSEC-HPLCによって評価し、エンドトキシンレベルを試験した。
実施例20-抗CD19 scFv-αGalトランスフェラーゼ融合タンパク質+UDP-Galによる非ヒト霊長類のインビボ処置
次に、非ヒト霊長類を抗CD19 scFv-αGalトランスフェラーゼ融合タンパク質+UDP-Galでインビボ処置するとCD19+B細胞数または毒性が少なくなるかどうか調べた。
許容される検査値を確かめるために、ならびにベースラインB細胞数およびT細胞数を測定するために2匹のカニクイザル(それぞれ5kg体重)がベースライン血液検査を受けた。次に、0時にカニクイザルに抗CD19 scFv-αGalトランスフェラーゼ(SEQ ID NO:63)を静脈内注射し、その後にUDP-galを注射した。
処置して1時間後、4時間後、および24時間後、ならびに7日目、14日目、30日目、および60日目に全血球数、血清化学、肝機能検査、および全リンパ球、B細胞数、およびT細胞数を測定した(図33)。CD20+/CD3-蛍光を調べることでB細胞数を求めた。CD20を用いて、抗CD19 scFvの存在によるB細胞数の取り違えを回避した。
第1の対象サルを抗CD19 scFv-α-Galトランスフェラーゼ+UDP-Galで処置すると、処置して7日後にCD19/CD20+B細胞は70％少なくなった。これはベースラインレベルに戻る前に8週間続いた。もっと最近になって、さらに高用量の抗CD19 scFv-α-Galトランスフェラーゼを与えた第2のサルは、4時間で行った最初の測定時にB細胞が80％減少していた。この対象サルには、獣医師によって観察される、目に見える毒性徴候はなかった。対象サルの体重は変化しなかった。血液検査時に対象サルには、測定可能な毒性徴候はなかった。第1のサルでは、CD19/CD20数以外の血液検査値は2ヶ月の経過観察中に安定した状態で推移した。第2のサルには48時間までしかデータがなかったが、今もなお研究されている。
これらの結果から、本明細書において開示される方法によって非ヒト霊長類を安全に処置することができ、処置によって、標的細胞が大幅に少なくなることが証明される。
実施例21-腫瘍標的化二機能性治療用タンパク質の操作
腫瘍標的化抗体のH鎖をグリコシルトランスフェラーゼ酵素と遺伝子融合することによって腫瘍標的化融合タンパク質を構築した。本明細書に記載の実施例では、GTA(SEQ ID NO:64)およびGTB(SEQ ID NO:65)は既知のヒト配列に由来するのに対して、αGalTはマーモセット配列(SEQ ID NO:66)に由来する。本明細書において提示される実施例において用いられる翻訳後酵素は全て、ゴルジおよび/または小胞体の小胞膜の中で天然に発現していた。本明細書に記載の二機能性融合タンパク質を構築するために、酵素機能に不必要な酵素部分(例えば、小胞外領域、膜貫通領域、およびステム領域)は取り除かれている。
本明細書において前述したように、融合タンパク質の腫瘍標的化部分は完全長Ab、Fab’2、Fab、scFv、単量体Ab、またはその任意のAb/免疫グロブリン誘導体でもよい。融合タンパク質の酵素部分は任意の翻訳後修飾酵素でよい。その配列は、一般的に、ヒトであるか、ヒト化されているか、(非ヒト霊長類から)霊長類化されているか、または別の方法で脱免疫されている。酵素への標的化部分の取り付けはリンカー/スペーサーを用いてもよく、用いなくてもよい。本明細書において提供される実施例では、(G4S)3(SEQ ID NO:67)リンカー/スペーサーが使用されるが、当業者に公知の任意のリンカー/スペーサーを使用することができる。
これらの融合タンパク質の調製はモジュール方式であり、そのため、本明細書において提供されるいくつかの実施例に従って、任意の腫瘍/組織標的化部分を任意の翻訳後酵素と融合することができる。huJ591および4D5二機能性治療用物質の操作および作製において用いられる配列を表7に示した。
(表７)配列
Figure 2023551305000031
Figure 2023551305000032
Figure 2023551305000033
Figure 2023551305000034
huJ591-GTB
huJ591-GTB(H鎖)(SEQ ID NO:34)は、huJ591重鎖(SEQ ID NO:68)をヒトGTB(aa57-354)(SEQ ID NO:69)のN末端に連結することによって構築した。huJ591-LC(L鎖)(SEQ ID NO:36)は、アフィニティクロマトグラフィー精製を容易にするために6His-タグ(SEQ ID NO:70)をhuJ591-LC(SEQ ID NO:70)のC末端に付加することによって構築した。
H鎖およびL鎖をコードするDNA配列をpcDNA3.1発現ベクターにサブクローニングした。タンパク質産生は、CHO細胞へのH鎖およびL鎖のコトランスフェクションによる一過的発現方法を用いて行った。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清からhuJ591-GTB融合タンパク質を精製し、SDS-PAGEによって評価した。
huJ591Fab-GTB
huJ591Fab-GTB(H鎖)(SEQ ID NO:37)は、huJ591重鎖の切断型断片(VH-CH1-部分ヒンジ配列)(SEQ ID NO:72)をヒトGTB(aa57-354)(SEQ ID NO:69)のN末端に連結することによって構築した。発現のモニタリングおよびアフィニティクロマトグラフィー精製を容易にするために、Myc/hisタグ(SEQ ID NO:73)をC末端に付加した。huJ591-LC(L鎖)(SEQ ID NO:39)はhuJ591軽鎖配列(SEQ ID NO:71)をコードする。
H鎖およびL鎖をコードするDNA配列をpcDNA3.1発現ベクターにサブクローニングした。タンパク質産生は、CHO細胞へのH鎖およびL鎖のコトランスフェクションによる一過的発現方法を用いて行った。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清からFab-GTB融合タンパク質を精製し、SDS-PAGEによって評価した。
huJ591-HC67-GTB
huJ591-HC67-GTB(H鎖)(SEQ ID NO:40)は、(G4S)3(SEQ ID NO:67)リンカーを介してhuJ591重鎖(SEQ ID NO:74)をヒト GTB(aa57-354)(SEQ ID NO:69)のN末端に連結することによって構築した。変更されたaaは、表4には太字の二重下線で、表7には太字の文字で表示されている。J591-LC(L鎖)(SEQ ID NO:42)は、アフィニティクロマトグラフィー精製を容易にするために6His-タグ(SEQ ID NO:70)をJ591-LC(SEQ ID NO:71)のC末端に付加することによって構築した。
単量体Fc融合タンパク質の産生は以下のように行った。J591HC67-GTBとL鎖をコードするDNA配列を合成し、発現ベクターにサブクローニングし、コトランスフェクションによってCHO細胞に導入した。細胞培養上清を収集した。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーを用いてJ591HC67-GTB融合タンパク質を精製し、SDS-PAGEによって評価した。
huJ591-HC67-GTB54aa
GTBのC末端に54aaテール(SEQ ID NO:75)を付加することによって、huJ591-HC67-GTB(H鎖)(SEQ ID NO:74)からhuJ591-HC67-GTB54aa(H鎖)(SEQ ID NO:43)を改変した。huJ591-LC(L鎖)(SEQ ID NO:45)は、アフィニティクロマトグラフィー精製を容易にするために6His-タグ(SEQ ID NO:70)をC末端に付加することによって構築した。
タンパク質産生は、一過的発現方法を用いてコトランスフェクションによってH鎖およびL鎖をCHO細胞に導入することによって行った。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清からhuJ591-GTB融合タンパク質を精製し、SDS-PAGEによって評価した。
huJ591scFv-Fc67-GTB
huJ591scFv-Fc67-GTB(SEQ ID NO:46)は(N末端からC末端にかけて)huJ591単鎖可変断片(scFv)/J591Fc断片(SEQ ID NO:76)、ヒトGTB(aa57-354)(SEQ ID NO:69)をコードする。Fc(SEQ ID NO:76)とGTB(SEQ ID NO:69)との間に(G4S)3(SEQ ID NO:67)リンカーを付加した。
huJ591scFv-Fc67-GTB(SEQ ID NO:46)をコードするDNA配列を合成し、発現ベクターにサブクローニングし、トランスフェクションによってCHO細胞に導入した。細胞培養上清を収集した。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーを用いてhuJ591scFv-Fc67-GTB(SEQ ID NO:46)融合タンパク質を精製し、SDS-PAGEによって評価した。
huJ591scFv-GTB
huJ591scFv-GTB(SEQ ID NO:48)は(N末端からC末端にかけて)脱免疫バージョンのhuJ591単鎖可変断片(scFv)(SEQ ID NO:77)、ヒトGTB(aa57-354)(SEQ ID NO:69)をコードする。scFv(SEQ ID NO:77)とGTB(SEQ ID NO:69)との間に(G4S)3(SEQ ID NO:67)リンカーを付加した。発現のモニタリングおよびアフィニティクロマトグラフィー精製を容易にするためにMyc/hisタグ(SEQ ID NO:73)をC末端に付加した。
huJ591scFv-GTB(SEQ ID NO:48)をコードするDNA配列をpcDNA3.1発現ベクターにサブクローニングした。タンパク質産生は、一過的発現方法を用いてトランスフェクションによってプラスミドをCHO細胞に導入することによって行った。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養上清からhuJ591scFv-GTB融合タンパク質を精製し、SDS-PAGEによって評価した。
GTA構築物
前記のDNA構築物中にあるGTB配列(SEQ ID NO:69)の代わりにヒトGTA(aa57-354)配列(SEQ ID NO:78)を使用して、以下の組換えタンパク質:huJ591-GTA(SEQ ID NO:35)、huJ591Fab-GTA(SEQ ID NO:38)、huJ591-HC67-GTA(SEQ ID NO:41)、huJ591scFv-Fc67-GTA(SEQ ID NO:47)、およびhuJ591scFv-GTA(SEQ ID NO:49)も作製した。
トラスツズマブ(4D5)構築物
乳がんおよび他のがんの表面にあるHER2を標的化するために、本明細書に記載のDNA構築物中のhuJ591配列の代わりにトラスツズマブ(4D5)配列を使用して、以下の組換えタンパク質:4D5-GTA(SEQ ID NO:51)、4D5Fab-GTA(SEQ ID NO:54)、4D5HC67-GTA(SEQ ID NO:57)、4D5scFv-Fc67-GTA(SEQ ID NO:60)、4D5scFv-GTA(SEQ ID NO:62)、4D5-GTB(SEQ ID NO:50)、4D5Fab-GTB(SEQ ID NO:53)、4D5HC67-GTB(SEQ ID NO:56)、4D5scFv-Fc67-GTB(SEQ ID NO:59)、および4D5scFv-GTB(SEQ ID NO:61)を作製した。
好ましい態様が本明細書において詳細に描写および説明されたが、本開示の精神から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを加えることができ、従って、これらが、以下の特許請求の範囲に定義されるように本開示の範囲内だとみなされることは関連する分野の当業者に明らかである。

Claims (94)

  1. 腫瘍関連抗原を標的とする標的化成分と、
    該標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換する酵素であって、該標的化成分に接続されている、該酵素と
    を含む、がんを処置するための二機能性治療用物質。
  2. 腫瘍関連抗原が、FOLH1/PSMA、VEGFR、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD38、CD52、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD79、ソマトスタチン受容体、5T4、gp100、CEA、メランA/MART-1、MAGE、NY-ESO-1、PSA、チロシナーゼ、HER-2、HER-3、EGFR、hTERT、MUC1、メソテリン、ネクチン-4、TROP-2、組織因子、およびCA-125からなる群より選択される、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  3. 前記標的化成分が、抗体またはその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、アプタマー、および低分子リガンドからなる群より選択される、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  4. 前記標的化成分が、ペプチド結合を介して酵素に連結されているペプチドである、請求項3記載の二機能性治療用物質。
  5. 前記標的化成分が、抗体またはその抗原結合誘導体もしくは断片である、請求項4記載の二機能性治療用物質。
  6. 前記標的化成分と酵素が融合タンパク質を産生するように遺伝子操作されている、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  7. 前記標的化成分と酵素が化学的に連結されている、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  8. 前記標的化成分が、介在性のポリエチレングリコール(PEG)スペーサーを用いて酵素に化学的に連結されている低分子リガンドである、請求項3記載の二機能性治療用物質。
  9. 前記標的化成分が、介在性のPEGスペーサーを用いて酵素に化学的に連結されているACUPA[2-(3-((S)-5-アミノ-1カルボキシペンチル)ウレイド)ペンタン二酸]である、請求項8記載の二機能性治療用物質。
  10. 前記酵素が、翻訳後修飾に関与する酵素であり、トランスフェラーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  11. 翻訳後修飾に関与する酵素がトランスフェラーゼである、請求項10記載の二機能性治療用物質。
  12. トランスフェラーゼがグリコシルトランスフェラーゼである、請求項11記載の二機能性治療用物質。
  13. グリコシルトランスフェラーゼが、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ)、グリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)、α-gal-トランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼA(Gly268Ala)、およびフコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項12記載の二機能性治療用物質。
  14. 前記酵素が、そのC末端に、付け加えられた第2のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  15. 前記第2のアミノ酸配列が、酵素と、付け加えられた第2の配列との間に、切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項14記載の二機能性治療用物質。
  16. 切断可能なアミノ酸配列が、PSA、マトリックスメタロプロテイナーゼ、またはカテプシンBによって切断可能である、請求項15記載の二機能性治療用物質。
  17. 腫瘍関連抗原を有する腫瘍がH抗原を発現する、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  18. 腫瘍関連抗原を有する腫瘍が、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、血液がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、脳がん、肝臓がん、食道がん、副腎がん、頭頚部がん、メラノーマ、および膵臓がんからなる群より選択されるがんに由来する、請求項1記載の二機能性治療用物質。
  19. がんが前立腺がんである、請求項18記載の二機能性治療用物質。
  20. 前記標的化成分が前立腺特異的膜抗原(PSMA)/葉酸加水分解酵素1(FOLH1)受容体を標的とする、請求項19記載の二機能性治療用物質。
  21. 前記標的化成分がPSMA受容体抗体またはPSMA受容体抗体の誘導体である、請求項19記載の二機能性治療用物質。
  22. 前記標的化成分が、J591、J415、J533、およびE99からなる群より選択される抗体である、請求項19記載の二機能性治療用物質。
  23. がんが乳がんである、請求項17記載の二機能性治療用物質。
  24. 前記標的化成分がHER受容体ファミリーメンバーを標的とする、請求項23記載の二機能性治療用物質。
  25. 前記標的化成分がモノクローナル抗体4D5である、請求項24記載の二機能性治療用物質。
  26. がんがB細胞系列の血液がんである、請求項17記載の二機能性治療用物質。
  27. 前記標的化成分がCD19を標的とする、請求項26記載の二機能性治療用物質。
  28. 前記標的化成分がモノクローナル抗体オベキセリマブまたはデニンツズマブである、請求項27記載の二機能性治療用物質。
  29. がんを有する対象を選択する工程と、
    請求項1～28のいずれか一項記載の二機能性治療用物質を準備する工程と、
    選択された対象に、がんを処置するのに有効な条件下で該二機能性治療用物質を投与する工程
    を含む、がんを処置する方法。
  30. 対象がヒトである、請求項29記載の方法。
  31. 腫瘍関連抗原が、FOLH1/PSMA、VEGFR、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD38、CD52、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD79、ソマトスタチン受容体、5T4、gp100、CEA、メランA/MART-1、MAGE、NY-ESO-1、PSA、チロシナーゼ、HER-2、HER-3、EGFR、hTERT、MUC1、メソテリン、ネクチン-4、TROP-2、組織因子、およびCA-125からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
  32. 前記標的化成分が、抗体またはその結合断片、タンパク質、ペプチド、および低分子からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
  33. 前記標的化成分が、ペプチド結合を介して酵素に連結されているペプチドである、請求項32記載の方法。
  34. 前記標的化成分が抗体またはその抗原結合誘導体もしくは断片である、請求項32記載の方法。
  35. 前記標的化成分と酵素が融合タンパク質を産生するように遺伝子操作されている、請求項29記載の方法。
  36. 前記標的化成分と酵素が化学的に連結されている、請求項29記載の方法。
  37. 前記標的化成分が、介在性のポリエチレングリコール(PEG)スペーサーを用いて酵素に化学的に連結されている低分子/リガンドである、請求項29記載の方法。
  38. 前記標的化成分が、介在性のPEGスペーサーを用いて酵素に化学的に連結されているACUPA[2-(3-((S)-5-アミノ-1カルボペンチル)ウレイド)ペンタン二酸]である、請求項37記載の方法。
  39. 前記酵素が、翻訳後修飾に関与する酵素であり、グリコシル化、トランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
  40. 翻訳後修飾に関与する酵素がトランスフェラーゼである、請求項39記載の方法。
  41. トランスフェラーゼがグリコシルトランスフェラーゼである、請求項40記載の方法。
  42. グリコシルトランスフェラーゼが、グリコシルトランスフェラーゼA、グリコシルトランスフェラーゼB、α-gal-トランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼA(Gly268Ala)、およびフコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項41記載の方法。
  43. 前記酵素が、そのC末端に、付け加えられた第2のアミノ酸配列を含む、請求項29記載の方法。
  44. 前記第2のアミノ酸配列が、酵素と、付け加えられた第2の配列との間に、切断可能なアミノ酸配列を含む、請求項43記載の方法。
  45. 切断可能なアミノ酸配列が、PSA、マトリックスメタロプロテイナーゼ、またはカテプシンBによって切断可能である、請求項44記載の方法。
  46. がんがH抗原を発現する、請求項29記載の方法。
  47. がんが、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、血液がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、脳がん、肝臓がん、食道がん、副腎がん、頭頚部がん、メラノーマ、および膵臓がんからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
  48. がんが前立腺がんである、請求項47記載の方法。
  49. 前記標的化成分が前立腺特異的膜抗原(PSMA)/葉酸加水分解酵素1(FOLH1)受容体を標的とする、請求項48記載の方法。
  50. 前記標的化成分がPSMA受容体抗体またはPSMA受容体抗体の誘導体である、請求項49記載の方法。
  51. 前記標的化成分が、J591、J415、J533、およびE99からなる群より選択される抗体である、請求項50記載の方法。
  52. がんが乳がんである、請求項47記載の方法。
  53. 前記標的化成分がHER受容体ファミリーメンバーを標的とする、請求項52記載の方法。
  54. 前記標的化成分がモノクローナル抗体4D5である、請求項53記載の方法。
  55. がんがB細胞系列の血液がんである、請求項47記載の方法。
  56. 前記標的化成分がCD19を標的とする、請求項55記載の方法。
  57. 前記標的化成分がモノクローナル抗体オベキセリマブまたはデニンツズマブである、請求項56記載の方法。
  58. 前記投与する工程が、
    ウリジン二リン酸-ガラクトース(UDP-gal)、ウリジン二リン酸-N-アセチルガラクトサミン(UDP-NAcGal)、および/またはグアノシン二リン酸-フコース(GDP-フコース)を投与すること
    をさらに含む、請求項29記載の方法。
  59. 前記標的化成分が、腫瘍血管内皮上のPSMA受容体を標的とする、請求項49記載の方法。
  60. 請求項1～28のいずれか一項記載の二機能性治療用物質と、
    薬学的に許容される担体と
    を含む、薬学的組成物。
  61. 請求項1～28のいずれか一項記載の二機能性治療用物質をコードする、核酸分子。
  62. 請求項61記載の核酸分子を含む、核酸構築物。
  63. 請求項61記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
  64. 請求項61記載の核酸分子で形質転換された、組換え宿主細胞。
  65. 前立腺特異的膜抗原(PSMA)/葉酸加水分解酵素1(FOLH1)受容体を標的とする標的化成分と、
    該標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、該標的化成分に接続されている、該グリコシルトランスフェラーゼと
    を含む、がんを処置するための二機能性治療用物質。
  66. 前記標的化成分が重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、
    SEQ ID NO:10のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:10の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)であって、該改変された配列が、SEQ ID NO:10に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域1(CDR-H1)と、
    SEQ ID NO:13のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:13の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:13に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域2(CDR-H2)と、
    SEQ ID NO:16のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:16の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:16に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域3(CDR-H3)と
    を含む、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  67. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:28に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  68. 前記標的化成分が軽鎖可変領域をさらに含み、該軽鎖可変領域が、
    SEQ ID NO:19のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:19の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:19に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域1(CDR-L1)と、
    SEQ ID NO:22のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:22の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:22に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域2(CDR-L2)と、
    SEQ ID NO:25のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:25の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:25に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域3(CDR-L3)と
    を含む、請求項66または67記載の二機能性治療用物質。
  69. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:29に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  70. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:10のCDR-H1、SEQ ID NO:13のCDR-H2、およびSEQ ID NO:16のCDR-H3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:19のCDR-L1、SEQ ID NO:22のCDR-L2、およびSEQ ID NO:25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  71. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:28に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:29に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  72. 前記標的化成分がシグナル伝達ペプチドをさらに含み、任意で、シグナル伝達ペプチドがSEQ ID NO:34のアミノ酸1～19の配列を有する、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  73. グリコシルトランスフェラーゼが、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ)、およびグリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)からなる群より選択される、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  74. (i)SEQ ID NO:34またはSEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;
    (ii)SEQ ID NO:37またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;
    (iii)SEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;
    (iv)SEQ ID NO:43またはSEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;
    (v)SEQ ID NO:46のアミノ酸配列;
    (vi)SEQ ID NO:47のアミノ酸配列;
    (vii)SEQ ID NO:48のアミノ酸配列;または
    (viii)SEQ ID NO:49のアミノ酸配列
    を含む、請求項65記載の二機能性治療用物質。
  75. ヒト上皮増殖因子受容体(HER)ファミリーメンバーを標的とする標的化成分と、
    該標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、該標的化成分に接続されている、該グリコシルトランスフェラーゼと
    を含む、がんを処置するための二機能性治療用物質。
  76. 前記標的化成分が重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、
    SEQ ID NO:11のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:11の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:11に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域1(CDR-H1)と、
    SEQ ID NO:14のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:14に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域2(CDR-H2)と、
    SEQ ID NO:17のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:17の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:17に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域3(CDR-H3)と
    を含む、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  77. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:30に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  78. 前記標的化成分が軽鎖可変領域をさらに含み、該軽鎖可変領域が、
    SEQ ID NO:20のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:20の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:20に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域1(CDR-L1)と、
    SEQ ID NO:23のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:23の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:23に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域2(CDR-L2)と、
    SEQ ID NO:26のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:26の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:26に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域3(CDR-L3)と
    を含む、請求項76または請求項77記載の二機能性治療用物質。
  79. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:31に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  80. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:11のCDR-H1、SEQ ID NO:14のCDR-H2、および SEQ ID NO:17のCDR-H3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:20のCDR-L1、SEQ ID NO:23のCDR-L2、およびSEQ ID NO:26のCDR-L3を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  81. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:30に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:31に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  82. 前記標的化成分がシグナル伝達ペプチドをさらに含み、任意で、シグナル伝達ペプチドがSEQ ID NO:50のアミノ酸1～19の配列を有する、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  83. グリコシルトランスフェラーゼが、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ)およびグリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)からなる群より選択される、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  84. (i)SEQ ID NO:50またはSEQID NO: 51のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;
    (ii)SEQ ID NO:53またはSEQ ID NO:54のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:55のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;
    (iii)SEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む第1のタンパク質、およびSEQ ID NO:58のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質;
    (iv)SEQ ID NO:59のアミノ酸配列;
    (v)SEQ ID NO:60のアミノ酸配列;
    (vi)SEQ ID NO:61のアミノ酸配列;または
    (vii)SEQ ID NO:62のアミノ酸配列
    を含む、請求項75記載の二機能性治療用物質。
  85. CD19を標的とする標的化成分と、
    該標的化成分によって腫瘍に送達された時に、腫瘍表現型を、不適合性の同種移植片または異種移植片の表現型に酵素的に変換するグリコシルトランスフェラーゼであって、該標的化成分に接続されている、該グリコシルトランスフェラーゼと
    を含む、がんを処置するための二機能性治療用物質。
  86. 前記標的化成分が重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、
    SEQ ID NO:12のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:12の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域1(CDR-H1)であって、該改変された配列が、SEQ ID NO:12に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域1(CDR-H1)と、
    SEQ ID NO:15のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域2(CDR-H2)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:15に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域2(CDR-H2)と、
    SEQ ID NO:18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:18の改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-H3)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:18に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域3(CDR-H3)と
    を含む、請求項85記載の二機能性治療用物質。
  87. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項85記載の二機能性治療用物質。
  88. 前記標的化成分が軽鎖可変領域をさらに含み、該軽鎖可変領域が、
    SEQ ID NO:21のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:21の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:21に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域1(CDR-L1)と、
    SEQ ID NO:24のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:24の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:24に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域2(CDR-L2)と、
    SEQ ID NO:27のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:27の改変されたアミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-L3)であって、該改変された配列がSEQ ID NO:27に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、該相補性決定領域3(CDR-L3)と
    を含む、請求項86または請求項87記載の二機能性治療用物質。
  89. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項85記載の二機能性治療用物質。
  90. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:12のCDR-H1、SEQ ID NO:15のCDR-H2、およびSEQ ID NO:18のCDR-H3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:21のCDR-L1、SEQ ID NO:24のCDR-L2、およびSEQ ID NO:27のCDR-L3を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項85記載の二機能性治療用物質。
  91. 前記標的化成分が、SEQ ID NO:32に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO:33に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項85記載の二機能性治療用物質。
  92. 前記標的化成分がシグナル伝達ペプチドをさらに含み、任意で、シグナル伝達ペプチドがSEQ ID NO:63のアミノ酸1～19の配列を有する、請求項85記載の二機能性治療用物質。
  93. グリコシルトランスフェラーゼが、グリコシルトランスフェラーゼA(α1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ)、グリコシルトランスフェラーゼB(α1-3-ガラクトシルトランスフェラーゼ)、およびマーモセットα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項85記載の二機能性。
  94. SEQ ID NO:63のアミノ酸配列を含む、請求項85記載の二機能性治療用物質。
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