KR20230116878A - 초급성 거부반응을 촉진하기 위한 암 면역요법 - Google Patents

초급성 거부반응을 촉진하기 위한 암 면역요법 Download PDF

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밍 궈
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Abstract

본 출원은 종양-연관된 항원을 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 전환하는, 효소를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다. 효소는 표적화 구성요소에 커플링된다. 또한, 이중-기능적 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법이 개시되어 있다.

Description

초급성 거부반응을 촉진하기 위한 암 면역요법
본 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는, 2020년 11월 30일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/119,359호에 대한 우선권 이익을 주장한다.
분야
본 발명은 초-급성 거부반응을 촉진하기 위한 암 면역요법에 관한 것이다.
배경
병용 요법은 사실상 모든 유형의 암에 대해 일반적인, 허용되는 치료 접근법이며 수십년 동안 표준 치료 접근법이었다. 병용 요법의 채택에 대한 기초는 단일 약제만 이용될 때, 암의 높은 돌연변이율이 종양 세포의 내성균의 급속한 발달을 허용하였다는 것이 결정된 초기 화학요법 경험이었다. 병용 요법의 목표는 효능을 증가시키고 종양 저항성 또는 도피의 발달을 최소화하는 것이다. 이는 일반적으로 각각 상이한 작용 메커니즘을 가져, 저항성 종양 세포의 발달을 더욱 어렵고 덜 가능하게 하는 2 이상의 항암제를 이용함으로써 달성된다. 2 이상의 약제를 조합하는 것의 부가 또는 상승작용 효과는 환자의 성공적 치료와 비성공적 치료 사이의 차이일 수 있다.
많은 병용 치료 식이요법이 종양학 분야에서 잘 알려져 있다. 예로서, MOPP(메클로레타민, 빈크리스틴, 프로카바진, 프레드니손에 대한 두문자어)는 호지킨병(Hodgkins' Disease)에 대한 치유적 치료 식이요법이다. 몇몇 상이한 병용 식이요법(전부 시스플라틴, 빈블라스틴, 및 블레오마이신을 포함함)이 고환암의 치료에서 허용되며, 이는 진단된 경우의 최대 98%에서 치유가능하다. 총, 300 개 초과의 상이한 병용 식이요법이 사용되어 왔다.
병용 요법에 대한 주요 결점은 보통 독소에서의 증가를 또한 야기한다는 것이다. 예를 들어, 비수술적 항암 요법의 대부분의 형태, 예컨대 외부 조사 및 화학요법은 정상 조직 및 세포에 대한 독성 부작용뿐 아니라, 암 세포에 대한 이들 치료 양상의 제한된 특이성 때문에 이들의 효능이 제한된다. 이 제한은 또한 항암 항체가 암 부위에 대해 독성 약제, 예컨대 동위원소, 약물, 및 독소를 표적화시키기 위해 사용될 때 중요한 것이며, 이는 전신 약제로서, 이들이 또한 민감한 세포 구획, 예컨대 골수로 순환하기 때문이다. 급성 방사선 장해에서, 패혈증의 발달 및 이어진 사망에서 주요 인자로서 림프 및 조혈 구획의 파괴가 있다. 따라서, 항암 요법의 독성 효과를 감소시키는 한편, 효능을 유지하거나 더욱 증가시키는 방법은 높은 수요가 있다.
병용 요법에 대한 대안에서, 면역요법에서 최근의 진보는 면역계가 암에 대한 반응에 관계될 수 있고 이들 반응이 매우 효과적이고 내구성일 수 있다는 것을 명확하게 수립하였다. 면역 체크포인트 억제를 이용한 상당한 경험은 이의 최대 이득이 상대적으로 높은 돌연변이 부담을 보유하는 암에 대한 이의 적용에 있다는 것을 제시한다. 그러나, 이러한 경우에도, 소수의 환자만 반응한다. 전립선암과 같은 일부 암은 종양 미세환경에서 면역 세포가 결여된다. 때때로 '저온' 미세환경 또는 면역학적 '사막'으로 지칭되는 면역 세포의 이 부재는 면역계를 활성화시키는 능력을 극심하게 제한한다. 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 및 이중-특이적 T 세포 인게이저(BiTE)는 종양-연관된 항원의 항체 표적화를 이용하여, T-세포 용해 기구가 암 세포를 용해시키도록 지시한다. 그러나 지금까지, CAR-T 및 BiTE 항-종양 활성은 더욱 더 일반적인 고형 종양이 아닌, 혈액암으로 제한되어 왔다. 명확하게, 다양한 암을 치료하기 위한 추가 방법에 대한 필요성이 남아있다.
본 발명은 당업계에서 이들 및 다른 결점을 극복하는 것에 관한 것이다.
요약
본 발명의 일 양태는 종양-연관된 항원을 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하는, 효소를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다. 효소는 표적화 구성요소에 커플링된다.
본 발명의 다른 양태는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 암을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 본 발명에 따른 이중-기능적 치료제를 제공하는 단계; 및 암을 치료하기 위해 효과적인 조건 하에 이중-기능적 치료제를 선택된 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 전립선-특이적 막 항원(PSMA)/엽산 가수분해효소 1(FOLH1) 수용체를 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 상기 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 인간 표피 성장 인자 수용체(HER) 패밀리 멤버를 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 상기 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 CD19를 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 상기 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다.
종양-표적화된 글리코실트랜스퍼라아제가 비-자가 조직-혈액형 항원(HBGA) 또는 알파-gal 글리코토프(glycotope)를 첨가함으로써 종양 및/또는 이의 혈관의 당-표현형을 변경하는 신규 면역-치료 접근법이 제시된다. 이는 종양을 HBGA-양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편으로 효과적으로 전환한다. 이 다기능적 약제의 예시적 실시양태는 PSMA/FOLH1을 표적화하여, 종양 신생-혈관을 미스매치된 HBGA 또는 이종이식편으로 전환하고, 이에 의해 초-급성 거부반응을 개시할 수 있다. 반세기의 이식 경험은 HBGA-양립불가능한 동종이식편 또는 알파-gal 발현 이종이식편이 강력한 면역 거부반응 과정을 자극한다는 것을 기록하였다.
본원에 기재된 바와 같이, 종양에 의한 이종- 또는 동종항원 발현을 생성하기 위해, 이종발생 또는 동종이계 글리코실트랜스퍼라아제, 예를 들어 전부 보통 골지에 상주하는 알파 gal 트랜스퍼라아제(알파 galT) 또는 동종이계 글리코실트랜스퍼라아제 A 및/또는 B 효소가 종양 세포 표면에 전달된다-사실상 분자-규모 이소 동종/이종이식편. 대안적으로, 알파 galT, A 및/또는 B 효소는 종양 신생-혈관 내피 표적, 예컨대 엽산 가수분해효소 1(FOLH1)(전립선-특이적 막 항원(PSMA)으로도 알려짐), 또는 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR-2), 또는 당업계에 알려진 다른 표적에 대해 특이적인 항원에 대해 표적화될 수 있다. 글리코실트랜스퍼라아제(알파 galT, 글리코실트랜스퍼라아제 A 및/또는 B 효소)의 표적화와 함께, 각각의 당-뉴클레오티드 공여체(UDP-gal 또는 UDP-NAcGal)가 공급된다. 종양에서 글리코실트랜스퍼라아제의 존재 하에, 당(gal 또는 NAcGal)은 표적화된 세포에 의해 분비된 생산물을 포함한 기존의 당단백질 및 당지질에 첨가되어, 동종- 또는 이종-항원을 생성하고, 이에 의해 활발한 면역 반응을 촉발시킨다. 미세환경 내로 분비된 전환된 동종/이종 단백질은 풍부한 천연 항체에 결합하여, 보체 활성화, 면역 반응, 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 촉발시키고 공급되어, "저온" 미세환경을 "고온"의 것으로 전환한다.
글리코실트랜스퍼라아제 A 및 B 효소는 이들의 353 개 아미노산 잔기 중 4 개만에 의해 상이하여(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Hakomori, "Antigen Structure and Genetic Basis of Histo-Blood Groups A, B and O: Their Changes Associated With Human Cancer," Biochimica et Biophysica Acta 1473:247-266 (1999); Seto et al., "Sequential Interchange of Four Amino Acids From Blood Group B to Blood Group A Glycosyltransferase Boosts Catalytic Activity and Progressively Modifies Substrate Recognition in Human Recombinant Enzymes," J. Biol. Chem. 272:14133-14138 (1997) 참고), 이들이 면역원성이 될 가능성이 없게 한다. 환자 혈청의 연구는 이들 효소가 예상된 바와 같이 면역원성이 아니라는 것을 확인하였다. 사실, 이들의 HBGA 탄수화물 생산물은 고도로 면역원성인 한편, 트랜스퍼라아제 A 및 B 효소는 면역원성인 것으로 전혀 보고되지 않았다. 비-면역원성 트랜스퍼라아제 A 또는 B 효소의 종양 표적화된 전달은 이에 의해 종양 또는 신생-혈관 면역-표현형을 고도의 면역원성 비-자가 HBGA를 발현하는 것으로 변경하기 위한 수단을 제공한다 - 이에 의해 양립불가능한 동종이식편의 표현형을 추정하고 숙주에 의한 강력한 거부 반응을 유도한다.
본원에 기재된 바와 같이, 개념의 입증을 위해, 접근법은 인간-유래된 GTA 또는 GTB로 입증되었다. 대안적으로, 인간에서 돌연변이되고/비-기능적이고 다른 표유동물로부터의 이종이식된 기관의 거부반응 야기를 담당하는 이종발생 알파-gal 트랜스퍼라아제(알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라아제; 알파-galT) 효소를 이용할 수 있다. 알파-galT 효소의 이용은 알파-galT의 인간화 또는 탈-면역화를 요구할 수 있으며, 비제한적으로, 인간에 대해 면역원성이 아닌 다른 글리코실트랜스퍼라아제의 상동 영역의 서열을 사용하는 것을 포함하여, 이를 달성하기 위해 당업계에 알려진 방법이 있다. 이러한 인간화 또는 탈-면역화 방법은 인간에서 치료제로서의 사용 전에 외래-유래된 항체를 인간화시키거나 탈-면역화시키기 위해 광범위하게 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 환자 혈청의 연구는 이들 효소가 면역원성이 아니라는 것을 나타냈다.
본 발명은 종양-표적화된 글리코실트랜스퍼라아제가 종양 및/또는 이의 혈액 공급의 조직-혈액형 항원 발현을 변경하는 신규 면역-치료 접근법을 제시한다. 이는 종양을 HBGA-양립불가능한 동종이식편으로 효과적으로 전환한다. 이 다기능적 약제가 사용되어, PSMA/FOLH1을 표적화하여, 종양 신생-혈관을 미스매치된 HBGA로 전환하고, 이에 의해 초-급성 거부반응을 개시할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 이종- 또는 동종이식편에 대한 강력한 면역 반응 및 지난 반세기에 걸쳐 발달된 거부반응 과정의 이해에 대해 상보적, 직교 면역치료 접근법이 모델링되었다. 이를 달성하기 위해, 숙주 대 이식편 반응의 가장 극심한 형태인 초-급성 거부반응(HAR)이 모델로서 선택되었다.
HAR은 이종이식편의 경우에 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(알파 1,3 GalT)(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Collins, et al., "Cardiac Xenografts Between Primate Species Provide Evidence for the Importance of the Alpha-Galactosyl Determinant in Hyperacute Rejection," J. Immunol. 154:5500-5510 (1995)) 및 동종이식편의 경우에 잘 알려진 조직-혈액형 항원(HBGA) 유전자좌(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Milland et al., "ABO Blood Group and Related Antigens, Natural Antibodies and Transplantation," Tissue Antigens 68:459-466 (2006))의 2 개의 고도로 관련된 유전자에서의 조상 돌연변이의 결과로서 발생한다. 이들 2 개의 고도로 관련된 유전자는 동일한 염색체(9q34) 상에서 발견되고, 45% 상동성을 보유하고 동일한 조상 유전자로부터 유래된 것으로 여겨진다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Yamamoto et al., "Molecular Genetic Basis of the Histo-Blood Group ABO System," Nature 345:229-233 (1990); Yamamoto et al., "Sugar-Nucleotide Donor Specificity of Histo-Blood Group A and B Transferases is Based on Amino Acid Substitutions," J. Biol. Chem. 265:19257-19262 (1990); Yamamoto et al., "Genomic Organization of Human Histo-Blood Group ABO Genes," Glycobiology 5:51-58 (1995)). 이들 대립유전자는 세포 막 발현 또는 분비가 예정된 초기 단백질 및 지질 상에 존재하는 탄수화물(CHO) 쇄에 말단 당 모이어티를 번역후 첨가하는 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩한다. 돌연변이로 인해, 알파 GalT 효소는 약 2800만년 전에 인간 및 구세계 원숭이에서 비활성화되었지만, 다른 포유동물에서는 그렇지 않았다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Macher et al., "The Gal Alpha1,3Gal Beta1,4GlcNAc-R (Alpha-Gal) Epitope: a Carbohydrate of Unique Evolution and Clinical Relevance," Biochim. Biophys. 1780:75-88 (2008)). 결과적으로, 비-영장류 포유동물로부터 유래된 이종이식된 기관 및 조직은 인간에 대해 외래인 알파 gal 에피토프를 발현한다. HBGA 유전자좌의 경우에, 적은 수의 돌연변이가 전통적으로 A, B 및 O로서 알려진 대립유전자를 야기하였다. B 대립유전자는 이의 알파 1,3 GalT 동족체와 같이 CHO 쇄에 말단 Gal을 첨가하는 글리코실트랜스퍼라아제 B(GTB)를 코딩하며, 유일한 차이점은 1,2 푸코오스가 인접한 Gal 상에 존재하는 경우에만 트랜스퍼라아제 B가 Gal을 첨가한다는 것이다. 트랜스퍼라아제 A는 N-아세틸화되는 말단 Gal(NAcGal)을 첨가한다는 것에서만 트랜스퍼라아제 B와 기능적으로 상이하다. O 유전자 생산물은 프레임시프트 돌연변이로 인해 비활성이다(도 1).
인간 내장에서 서식하는 세균을 포함한 이들 3 개 활성 효소에 의해 생성된 알파-Gal, HBGA A 및 HBGA B 에피토프는 자연에서 광범위하게 발현된다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Springer et al., "Blood Group Isoantibody Stimulation in Man by Feeding Blood Group-Active Bacteria," J. Clin. Invest. 48:1280-1291 (1969)). 결과적으로, aGalT 및 A 및/또는 B 대립유전자가 결여된 인간은 이들 세균으로 유래된 에피토프에 의해 계속 면역화되고 있다. 이는 혈장 면역글로불린(Ig)의 1% 초과를 구성하는 이들 비-자가 에피토프에 대해 매우 높은 수준의 천연 항체(Ab)를 야기한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Galili et al., "One Percent of Human Circulating B Lymphocytes are Capable of Producing the Natural Anti-Gal Antibody," Blood 82:2485-2493 (1993); Galili et al., "A Unique Natural Human IgG Antibody With Anti-Alpha-Galactosyl Specificity," J. Exp. Med. 160:1519-1531 (1984)). 수십억개의 상이한 특이성이 있는 것으로 추정되는 Ab 레퍼토리의 다양성을 고려하면, 이는 내인성 Ig 활성의 거대한 비율을 나타낸다. 이들 Ab는 보체 캐스케이드를 활성화시키고, 결국 혈관 혈전증을 개시할 수 있는 IgM, 및 IgG로 구성된다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Subramaniam et al., "Distinct Contributions of Complement Factors to Platelet Activation and Fibrin Formation in Venous Thrombus Development," Blood 129(16):2291-2302 (2017); Foley et al., "Cross Talk Pathways Between Coagulation and Inflammation," Circ. Res. 118:1392-1408 (2016); 및 Conway EM, "Reincarnation of Ancient Links Between Coagulation and Complement," J. Thromb. Haemost. 13(Suppl. 1):S121-S32 (2015)). 다른 면역글로불린 클래스, 예컨대 IgA 및 IgE가 또한 이들 글리콜-에피토프에 대해 지시될 수 있다. 사실상, 이들 2 개 유전자에서의 진화적 돌연변이는 이들 비-자가 에피토프의 출현에 신속하고, 공격적이고 파괴적으로 반응하도록 대비되고 준비된, 티핑 포인트(tipping point)에서 준비된 면역학적 상태를 생성한다. 이들 돌연변이의 면역학적 효과는 인간에서 성공적 이종-이식을 불가능하게 하였고 이의 핵심 중요성이 1960년대에 신장 동종이식편의 초기에 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964)에 의해 첫번째로 인식되었을 때부터 왜 HBGA 매칭이 고형 기관 이식에서 단일의 가장 중요한 매치인지를 설명한다. 상기 시기부터, 고형 기관 이식에서 HBGA 미스매치의 처참한 효과는 의인성 오차가 발생할 때, 매우 드문 경우에만 나타난다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times, Feb 22, 2003). 이 배경 맥락은 숙주의 암 세포 및/또는 종양을 공급하는 혈관 내피 세포에 의한 이들 비-자가 에피토프 중 하나의 발현을 유도하기 위한 목표를 야기하였다.
도면의 간단한 설명
도 1은 글리코실트랜스퍼라아제의 엄격한 수용체 기질 특이성을 나타낸다. B(또는 A)-트랜스퍼라아제는 H-항원을 발현하는 글리코실화 부위에 이의 각각의 당을 첨가하기만 할 것이다. 우연히, 많은 정상 조직에서 이 필수 H-항원의 부재는 HBGA A 또는 B로의 비-표적 전환을 예방한다. 대안적으로, H-항원이 자연적으로 결여되는 정상 또는 암성 세포 유형을 고의로 표적화하기를 소망하는 이벤트에서, 이는 알파1-2 푸코실트랜스퍼라아제를 또한 표적화하고 푸코오스 공여체로서 GDP-푸코오스를 제공함으로써 A 또는 B를 첨가하는 것에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 달성될 수 있다. 푸코오스/H-항원의 첨가는 표적화된 A 또는 B 트랜스퍼라아제와 동시에 수행될 수 있거나 첨가는 단계적 방식으로 수행될 수 있다(예를 들어, 첫번째로 푸코오스, 그 다음에 A 또는 B 첨가).
도 2a-2b는 키메라 Ab-GTB 단백질이 면역반응성 및 효소적 활성을 유지한다는 것을 나타낸다. 도 2a는 J591-GTB 키메라 단백질이 ELISA에 의해 측정된 부모 J591 항체에 대해 PSMA에 대한 유사한 결합 면역반응성을 유지한다는 것을 나타내는 그래프이다. 도 2b는 키메라 단백질이 또한 UDP-14C-갈락토오스, 뉴클레오티드 공여체로부터 2'-푸코실-락토오스(2-FL)로의 14C-갈락토오스의 전달을 촉매작용하는 이의 능력에 의해 나타낸 효소적 활성을 함유한다는 것을 나타내는 막대 그래프이다. 이 혼입은 J591-GTB 융합 단백질 및 이의 수용체 기질, 2-FL이 존재할 때에만 높은 수준으로 발생한다. 유사한 결과를 항-4D5 (her2)-GTB로 얻었다.
도 3은 GTB 활성이 C-말단 연장에 의해 조절될 수 있다는 것을 나타내는 그래프이다. J591-GTB 활성(대조군의 %)은 C-말단 아미노산 연장의 길이 증가의 함수로서 나타내어지고 UDP-14C-gal로부터 2'-푸코실-락토오스(2-FL)로의 14C-gal의 혼입에 의해 측정된다.
도 4는 J591-GTB가 항원-양성 종양 세포를 특이적으로 전환한다는 것을 나타내는 이미지이다. CWR22Rv1 이종이식편(이종으로 PSMA+/HBGA O)으로부터의 조직 절편을 J591-GTB + UDP-gal과 함께 항온처리하고 HBGA B 발현을 위해 면역조직화학적으로 염색하였다(좌측 패널). 이차 항-뮤린 Ig-퍼옥시다아제를 포함하지만, 각각 마우스 항-HBGA B(중간 패널) 또는 J591-GTB(우측 패널)가 결여된 음성 대조군 절편은 염색하지 않았다.
도 5는 LNCaP 및 PC3 세포 상의 J591-GTB의 효과를 나타내는 이미지이다. LNCaP 세포(PSMA+/HBGA O; 좌측 패널)를 J591-GTB에 의해 HBGA B로 전환하였고; PC3 세포(PSMA-/HBGA O; 우측 패널)는 J591-GTB에 의한 전환을 겪지 않는다.
도 6a-6d는 PSMA로 형질주입된 다음에, J591-GTB로 처치된 PC3 세포를 나타내는 이미지이다. 도 6a는 상 대조 이미지를 나타낸다. 도 6b는 PSMA를 발현하는 세포를 나타낸다. 도 6c는 HBGA B 항원 발현을 나타낸다. 도 6d는 도 6b 및 6c의 병합이다. PSMA를 발현하는 상기 세포만이 HBGA B 발현으로 전환되었다. 주로 좌측 중앙 및 상부 중앙에서 PSMA-neg 세포는 HBGA B-neg로 남아있다.
도 7은 O 형 RBC의 현탁액 내로 스파이크되고 J591(상부 열); J591-GTB(중간 열), 또는 J591-GTB-54aa 연장(하부 열)과 함께 항온처리된 LNCaP 세포를 나타내는 이미지이다. 좌측 칼럼은 상 대조 이미지를 나타낸다. 중간 칼럼은 DAPI 핵 염색을 나타낸다. 우측 칼럼은 뮤린 항-HBGA B + 염소 항-마우스 IgM-alexa488을 나타낸다. PSMA-pos LNCaP 세포는 이들의 원형질막에 결합된, C-말단 연장이 있거나 없이, J591-GTB에 의해 HBGA B-pos로 전환되는 한편, PSMA-neg RBC는 전환되지 않는다.
도 8a-8d는 시험관내(in vitro) 보체-매개된 용해를 나타내는 이미지이다. LNCaP 세포를 천연 mAb J591 또는 mAb J591-GTB 융합 단백질과 함께 항온처리하였다. 모든 웰은 또한 UDP-gal을 얻었다. 그 후에, A 형 환자로부터의 혈청을 천연 항-B Ab 및 보체의 공급원으로서 첨가하였다. J591-GTB + A 형 혈청의 조합(도 8a)은 완전 LNCaP 용해를 야기하였다. J591-GTB 융합 단백질은 A 형 혈청의 부재 하에 용해를 유도하지 않았다(도 8b). 융합 단백질 없이, 용해는 A 형 혈청의 존재(도 8c) 또는 부재(도 8d)와 관계 없이 검출되지 않았다.
도 9는 몇몇 세포주의 보체-매개된 세포독성을 나타내는 이미지이다. 트리판 블루 배제에 의해 관찰된 바와 같은 몇몇 세포주의 보체-매개된 세포독성이 나타나 있다. 상부 패널을 J591-GTB + UDP-gal + 인간 O 형 혈청으로 처치하였다. 하부 패널에서의 세포를 동일한 O 형 혈청을 이용하지만 J591-GTB + UDP-gal이 없이 처치하였다. 사멸된 세포의 비율은 FACS에 의해 결정된 바와 같이 각각의 사진 하에 보고된다(도 10). FACS에 대해, J591-GTB + UDP-gal이 없는 O 형 혈청을 음성 대조군으로서 제공한 반면, 0.1% 삼중양성자 노출은 완전 용해 대조군을 제공하였다.
도 10a-10h는 HBGA B로의 전립선 및 유방암의 생체내(in vivo) 전환을 나타내는 이미지이다. 도 10a-10d는 PBS+ UDP-gal(도 10a), b) J591+ UDP-gal(도 10b), 및 J591-GTB + UDP-gal(도 10c)의 투여 후 24 시간에 SCID 마우스에서 LNCaP 이종이식편을 통한 연속 절편을 나타낸다. 도 10a-10c는 HBGA B에 대해 면역조직화학적으로 염색된다(전부 10x). 도 10d는 PSMA에 대해 염색된 동일한 시료로부터의 연속 절편을 나타낸다. 또한, 높은 출력 및 추가 이종이식편 라인에 대해 도 12a-12e를 참고한다. 도 10e-10h는 PBS + UDP-gal(도 10e), 4D5 + UDP-gal(도 10f), 4D5-GTB + UDP-gal(도 10g 및 10h)을 이용한 처치 후의 MD-MB361 유방암(HER2+) 이종이식편을 나타낸다. 절편은 HBGA B 발현에 대해 면역조직화학적으로 염색된다. 별개 원형질막 염색이 명확하다. 도 10c 및 10h에서, 인접 결합 조직은 전환되지 않으며, 이는 면역-표현형 전환의 특이성이 표적화된 종양으로 제한된다는 것을 나타낸다.
도 11a-11b는 FACS 및 트리판 블루 배제(도 9 참고)에 의해 측정된 프로피디움 아이오다이드 흡수에 의해 결정된 바와 같은 O 형 혈청에 의한 B-전환된 세포주의 용해를 나타내는 막대 그래프(도 11a) 및 히스토그램(도 11b)이다. B-전환 부재 하의 O 혈청은 용해를 야기하지 않는다. PSMA-pos 세포를 J591-GTB + UDP-gal로 처치한 후, O 형 혈청은 PSMA-pos/B-전환된 세포주 전부를 완전히 용해시켰으며; HBGA O-pos/PSMA-neg인 PC3는 HBGA B로 전환되지 않았고 용해되지 않았다.
도 12a-12e는 J591-GTB에 의한 LNCaP, C4-2 및 CWR22Rv1 이종이식편의 생체내 전환을 나타내는 이미지이다. 도 12a-12b는 J591[GTB 없음](도 12a) 또는 J591-GTB(도 12b)와, 둘 다 UDP-gal로 생체내에서 처치되고, 마우스 항-HBGA B로 면역조직화학적으로 염색된 LNCaP 이종이식편; 고출력을 나타낸다. 도 12c는 J591-GTB + UDP-gal로 생체내에서 처치되고, 마우스 항-HBGA B로 면역조직화학적으로 염색된 C4-2 전립선암; 고출력을 나타낸다. 도 12d-12e는 J591-GTB + UDP-gal로 생체내에서 처치된 CWR22Rv1 전립선암, 이종으로 약한 PSMA-pos를 나타낸다. 인접한 결합 조직은 HBGA B로 전환되지 않는다.
도 13a-13b는 HBGA의 생체내 전환 및 처치를 나타내는 그래프(도 13a) 및 마우스의 생체내 이미지(도 13b)이다. Matrigel에 현탁된 10 x 106 C4-2-luc 세포를 마우스에 I.P.로 이식하였다. 며칠 후, 생물발광을 측정하고 확인된 생존가능 종양을 갖는 10 마리 마우스를 2 개 처치 암(arm) 중 하나에 무작위로 할당하였다. 모든 종양-보유 마우스는 J591-GTB + UDP-gal + 인간 O 형 혈청의 단일 용량을 받았고; 마우스 중 절반에서, 혈청을 주사 전에 열-비활성화시켰다. 활성 O 형 혈청으로 처치된 마우스에서, 평균 광자 플럭스는 뒤따른 13 일에 걸쳐 점진적으로 감소된 반면, 비활성화된 혈청을 갖는 것은 평균 종양 진행을 경험하였다. 13 일차에 실험 종료시, 그룹 사이의 생물발광에서의 차이는 유의미하였다(p<0.0032). 중복 실험은 일관된 결과를 산출하였다.
도 14a-14b는 C4-2-luc 세포를 IP로 이식한 후, J591-GTB + UDP-gal + 인간 O 형 혈청을 이용한 단일 처치가 이어진 실험 #2의 결과를 나타내는 생체내 이미지 및 그래프이다(상부 열)(도 14a). 도 14a는 활성 O 형 혈청 또는 이전에 열-비활성화된 O 형 혈청을 받은 마우스의 이미지를 나타낸다. 열-비활성화된 혈청을 받은 마우스는 종양 진행을 나타낸 반면(광자 플럭스의 플롯; 도 14b 참고), 활성 혈청을 받은 것은 종양 퇴행을 경험하였으며; 실험 1 결과는 도 13a-13b에 나타나 있다.
도 15는 MM1-S 세포에서 CD19, CD20, 및 CD38 발현을 나타내는 FACS 히스토그램이다. 유세포분석은 MM1-S 다발성 골수종 세포주가 CD38 양성, CD19 양성, 및 CD20 음성이라는 것을 나타내었다.
도 16a-16b는 MM1-S 세포의 ABO 발현을 나타내는 FACS 히스토그램이다. 도 16a는 다발성 골수종 세포주가 A/B 음성이라는 것을 나타낸다. 도 16b는 MM1-S 다발성 골수종 세포주가 O 양성이라는 것을 나타낸다.
도 17은 CD19+/O+ MM1-S 골수종 세포가 GTB + UDP-gal에 의해 B+로 전환될 수 있다는 것을 나타내는 FACS 히스토그램이다. GTB는 항-CD19, 항-CD38, 또는 항-BCMA를 사용하여 골수종 세포에 대해 표적화될 수 있다.
도 18은 HBGA O로부터 HBGA B로 LNCaP의 전환을 지시하기 위한 GTB에 접합된(ACUPA-GTB), PSMA에 결합하는 소분자 리간드인 ACUPA의 사용을 나타내는 이미지이다. 이는 항체(또는 항체 유도체)와 함께, 종양 세포 또는 신생-혈관 내피 상의 표적 항원에 결합하는 소분자 리간드 또는 펩티드가 또한 효소를 표적화하는 목적을 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 좌측 패널은 ACUPA-PEG-1500-GTB 처치된 세포를 나타낸다. 우측 패널은 GTB 단독으로 처치된 세포를 나타낸다.
도 19는 HBGA O로부터 HBGA B로의 전환의 특이성을 나타내는 이미지이다. SK-BR5 유방암 세포(PSMA-/O+)를 LNCaP 전립선암 세포(PSMA+/O+)와 함께 공동-배양하였다. 2 개 세포 유형은 형태학에 의해 구별될 수 있다: SK-BR5는 원형인 반면, LNCaP 세포는 타원형/방추형이다. 또한, LNCaP 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)로 마킹된다. J591-GTB 및 UDP-gal과의 항온처리는 PSMA+ LNCaP 세포만을 전환하지만, PSMA 표적이 결여된 이웃 세포는 그렇지 않다. 패널은 DAPI(좌측 패널), GFP(중간 패널), 및 항-B(Cy5)(우측 패널) 영상화를 나타낸다.
도 20은 HBGA O로부터 HBGA B로의 전환의 특이성을 나타내는 이미지이다. 나타낸 바와 같이, PSMA+ 세포만이 J591-GTB/UDP-gal에 의해 B+로 전환된다.
도 21a-21b는 HBGA O로부터 HBGA B로의 전환의 특이성을 나타내는 FACS 히스토그램이다. 전환의 특이성을 SK-BR5(PSMA-neg) 세포(도 21b)에 대해 HBGA B(도 21a)로 LNCaP(PSMA+)를 전환하기 위해 요구되는 J591(항-PSMA)-GTB의 농도를 비교함으로써 FACS를 사용하여 정량화하였다. 양측 세포주는 O+이다. FACS 히스토그램이 나타나 있다. SK-BR5 B 전환은 최대 100 ㎍/mL의 J591-GTB의 농도에서도 발생하지 않는다. 비교에 의해, 0.012 ㎍/mL 만큼 낮은 농도는 PSMA-양성 LNCaP 세포의 전환을 유도한다.
도 22는 HBGA O로부터 HBGA B로의 전환의 특이성을 나타내는 표 및 그래프이다. 도 21a-21b로부터의 MFI의 표(좌측 패널) 및 히스토그램이 나타나 있다(우측 패널). 특이성 지수는 8,000:1을 초과한다.
도 23은 양측 세포 표면 및 분비된 당단백질이 본 발명의 방법에 의해 글리코실화되는 것을 나타내는 표 및 그래프이다. 세포 계수의 그래프(상부 패널) 및 표(하부 패널)가 나타나 있다.
도 24a-24b는 혈청 샘플에서 항-α1,3GalT 항체에 대한 시험을 나타내는 플롯이다. 도 24b는 낮은 광학 밀도를 나타내는 도 24a의 확대도이다.
도 25는 재조합 단백질의 발현 및 정제를 나타내는 SDS-PAGE 겔이다.
도 26a-26b는 CD19- MM1.S 세포(도 26a) 및 CD19+ Raji 세포(도 26b)에 대한 scfv-CD19-αGal의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 27은 CD19+ 및 CD19- 세포의 혼합물에 대한 갈락토오스 전달 분석을 나타내는 그래프이다.
도 28은 CD19+ 세포에 대한 갈락토오스 전달 분석을 나타내는 히스토그램이다.
도 29는 인간 B-세포에 대한 scfv-αGT의 결합 및 αGal 전달을 나타내는 산포도이다.
도 30은 CD19+ 세포에 대한 혈청 매개된 용해 분석을 나타내는 점도표이다.
도 31a-31b는 αGal 전달된 B-세포에 대한 용해 분석을 나타내는 그래프이다. 도 31a는 % 용해를 나타내는 그래프이다. 도 31b는 IgG 수준(MFI) 및 IgM 수준을 나타내는 그래프이다.
도 32a-32c는 scfv-CD19-αGT 및 UDP-Gal의 시험관내 체커보드 분석을 나타낸다. 도 32a는 결합을 측정하고, 도 32b는 알파 gal 발현을 측정하고, 도 32c는 인간 PBMC에 의한 용해를 측정한다.
도 33은 기준선 및 항-CD19 scFv-알파 Gal 트랜스퍼라아제 융합 단백질 및 UDP-gal의 투여 후 1 시간, 4 시간, 1 일, 7 일, 14 일, 30 일, 및 60 일의 % 남아있는 B-세포를 나타내는 막대 그래프이다. B-세포 계수를 CD20+/CD3- 형광을 시험함으로서 결정하였다. CD20을 사용하여, 항-CD19 scFv의 존재에 의한 B-세포 계수 혼동을 회피하였다.
상세한 설명
본 발명은 종양-연관된 항원을 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하는, 효소를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제를 교시한다. 효소는 표적화 구성요소에 커플링된다.
표적화 구성요소는 유래된 항체(무손상, 1가 단일 쇄, Fab'2, Fab, scFv 또는 다른 것) 또는 펩티드일 수 있다. 표적화 및 효소 모이어티는 융합 유전자/단백질의 생성을 통해 또는 생화학 접합을 통해 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 암을 치료하는 방법에 적용된다. 방법은 암을 갖는 대상체를 선택하는 단계 및 본 발명에 따른 이중-기능적 치료제를 제공하는 단계를 포함한다. 이중-기능적 치료제는 암을 치료하기에 효과적인 조건 하에 선택된 대상체에 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다"는 대상체, 예를 들어 환자에 대한 본 발명의 이중-기능적 치료제의 적용 또는 투여를 지칭한다. 치료는 암, 암의 증상 또는 암을 향한 성향을 치유하거나(cure), 치유하거나(heal), 경감시키거나(alleviate), 완화하거나(relieve), 변경하거나(alter), 개선하거나(remedy), 개선하거나(ameliorate), 완화하거나(palliate), 개선하거나(improve) 영향을 미치는 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 병태조직학적 유형 또는 침습성의 단계와 관계 없이, 모든 유형의 암성 성장 또는 종양발생 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "양립불가능한 동종이식편"은 초-급성, 급성 및/또는 만성 면역 거부반응을 유도하는 조직 또는 종양을 지칭한다. 초-급성 거부반응은 기관 이식 후, 또는 본원에 기재된 바와 같이, 이중기능적 치료제의 전달시 종양 또는 조직의 전환 후 수분 내지 수시간 내에 나타난다. 이 급속 거부반응은 이식편/종양 괴사를 야기하는 혈관 혈전증이 특징이다. 초급성 거부반응은 이식/전환 전에 수용체에서 존재하는 항-공여체 항체의 존재에 의해 야기된다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적화 구성요소"는 종양-연관된 항원에 결합하거나 그렇지 않으면 이와 연관될 수 있는 구성요소이다. 이러한 종양 연관된 항원은, 비제한적으로, FOLH1/PSMA, VEGFR, CD19, CD20, CD25, CD30, CD33, CD38, CD52, B 세포 성숙 항원(BCMA), CD79, 소마토스타틴 수용체, 5T4, gp100, 암배 항원(CEA), 맘모글로빈 A, 멜란 A/MART-1, MAGE, NY-ESO-1, PSA, 티로시나아제, HER-2/neu, HER-3, EGFR, hTERT, 메소텔린, 넥틴-4, TROP-2, 조직 인자, MUC-1, CA-125, 및 이의 펩티드 단편, 단백질 MZ2-E, 다형성 상피 뮤신, 엽산-결합 단백질, 암 고환 단백질 MAGE-1 또는 MAGE-3 또는 NY-ESO-1, 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG), 알파 태아단백질(AFP), 췌장 종양태아 항원, CA- 15-3,19-9, 549, 195, 편평세포 암종 항원(SCCA), 난소암 항원(OCA), 췌장암 연관된 항원(PaA), 돌연변이체 K-ras 단백질, 돌연변이체 p53, 비돌연변이체 p53, 절단된 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 키메라 단백질 p210BCR-ABL, 텔로머라아제, 수르비빈, WT1 단백질, LMP2 단백질, HPV E6 E7 단백질, 이디오타입 단백질, 및 PAP 단백질뿐 아니라, 이들의 펩티드 단편을 포함한다. 상기 목록은 종양-연관된 항원을 예시하고; 추가 종양-연관된 항원은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
항원은 예를 들어, 폐, 유방, 식도, 장, 위, 직장, 비뇨기계, 전립선, 방광, 뇌, 갑상선, 간, 췌장, 비장, 피부, 결합 조직, 심장, 혈액계, 또는 혈관계 내에 위치한 종양 세포 상에 존재하는 항원 또는 에피토프일 수 있다. 표적 항원은 세포막, 분비된 단백질, 또는 비-막 결합된 단백질 상에 존재하는 항원 또는 에피토프일 수 있다. 분비된 단백질의 예는, 비제한적으로, 호르몬, 효소, 독소 및 항미생물 펩티드를 포함한다.
표적화 구성요소는 특정 표적화된 부위, 예를 들어 종양, 질환 부위, 조직, 기관, 세포의 유형, 감염성 세균 또는 바이러스 등에서 국소화되거나 집중될 수 있다.
예를 들어, 고려되는 표적화 구성요소는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 당단백질, 압타머, 탄수화물, 또는 지질을 포함한다. 표적화 구성요소는 세포 표면 수용체에 대한 천연 발생 또는 합성 리간드, 예를 들어 성장 인자, 호르몬, LDL, 트랜스페린 등일 수 있다. 표적화 구성요소는 항체일 수 있고, 상기 용어는 항체 단편 및 유도체, 항체의 특징적 부분, 단일 쇄 표적화 모이어티를 포함하는 것으로 의도되며, 이는 예를 들어 파지 디스플레이와 같은 절차를 사용하여 확인될 수 있다. 표적화 구성요소는 또한 천연-발생이거나 인공적으로 생성된(예를 들어, 화학적 합성을 통함) 표적화 펩티드, 표적화 펩티드모방체, 또는 소분자일 수 있다.
일 실시양태에서, 표적화 구성요소는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단백질, 펩티드, 및 압타머, 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
종양-연관된 항원에 대한 항체는 알려져 있다. 예를 들어, 종양에 의해 생산되거나 이와 연관된 마커에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편은 그 중에서도 Hansen에 대한 미국 특허 제3,927,193호, 및 Goldenberg에 대한 미국 특허 제4,331,647호, 제4,348,376호, 제4,361,544호, 제4,468,457호, 제4,444,744호, 제4,818,709호 및 제4,624,846호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특히, 종양-연관된 항원, 예를 들어 위장, 폐, 유방, 전립선, 난소, 고환, 뇌 또는 림프 또는 혈액 종양, 육종 또는 흑색종에 대한 항체가 유리하게 사용된다. 종양-연관된 항원에 대한 항체는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 항체는 예를 들어, 다클론 항체, 단클론 항체, 세포내 항체("인트라바디"), 항체 단편(예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab)2), 절반-항체, 하이브리드 유도체뿐 아니라, 단일 쇄 항체(scFv), 키메라 항체 및 탈-면역화되거나 인간화된 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(각각 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Houston et al., "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Bird et al, "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426 (1988)).
본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 박테리오파지에 의해 발현된 항체 또는 이의 단편과 같이 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 합성 항체는 본 발명의 항체를 코딩하고 발현하는 DNA 분자의 합성 또는 항체를 구체화하는 아미노산 서열의 합성에 의해 생성되고, DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 이용가능하고 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 얻어졌다.
단클론 항체 생산을 위한 방법은 본원에 기재되거나 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 수행될 수 있다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Monoclonal Antibodies - Production, Engineering and Clinical Applications (Mary A. Ritter and Heather M. Ladyman eds., 1995)). 일반적으로, 과정은 생체내 또는 시험관내에서 관심 항원으로 이전에 면역화된 포유동물의 비장으로부터 면역 세포(림프구)를 얻는 단계를 포함한다.
대안적으로, 단클론 항체는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Cabilly et al에 대한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 단클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리된다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 그 다음에 적합한 발현 벡터 내로 클로닝되고, 이와 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 E. coli 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포로 형질주입될 때, 단클론 항체는 숙주 세포에 의해 생성된다. 또한, 소망하는 종의 재조합 단클론 항체 또는 이의 단편은 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 McCafferty et al., "Phage Antibodies: Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains," Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., "Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries," Nature 352:624-628 (1991); 및 Marks et al., "By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage," J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)).
단클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 재조합 DNA 기술을 사용하여 추가로 변형되어, 대안적 항체 또는 유도체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 마우스 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 인간 항체로부터 유래된 상기 영역에 의해 치환되어, 키메라 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 단클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 불변 도메인은 비-면역글로불린 폴리펩티드에 의해 치환되어, 융합 항체를 생성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 불변 영역은 절단되거나 제거되어, 단클론 항체의 소망하는 항체 단편을 생성한다. 또한, 가변 영역의 부위-지시된 또는 고-밀도 돌연변이유발이 사용되어, 단클론 항체의 특이성 및 친화도를 최적화할 수 있다.
본 발명의 단클론 항체는 인간화된 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 가변 영역 내에 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 최소 서열을 함유하는 항체이다. 이러한 항체는 치료적으로 사용되어, 인간 대상체에 투여될 때 항원성 및 인간 항-마우스 항체 반응을 감소시킨다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로 최소 비-인간 서열을 갖거나 갖지 않는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간에 의해 생산된 항체 또는 인간에 의해 생산된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
전체 항체와 함께, 본 발명은 이러한 항체의 항원 결합 부분을 포함한다. 이러한 결합 부분은 1가 Fab 단편, Fv 단편(예를 들어, 단일-쇄 항체, scFv), 및 단일 가변 VH 및 VL 도메인, 및 F(ab')2 단편, Bis-scFv, 디아바디, 트리아바디, 미니바디 등을 포함한다. 이들 항체 단편은 전통적인 절차, 예컨대 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 James Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 98-118 (Academic Press, 1983) and Ed Harlow and David Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)에 기재된 바와 같은 단백질가수분해 단편화 절차, 또는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 제조될 수 있다.
특히 항체 단편의 경우에, 이의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체를 변형하는 것이 추가로 바람직할 수 있다. 이는 예를 들어, 항체 단편에서 적절한 영역의 돌연변이에 의한 항체 단편 내로의 구조 수용체 결합 에피토프의 혼입에 의해 또는 펩티드 태그 내로 에피토프를 혼입하고, 이는 그 다음에 말단 또는 중간에서 항체 단편에 융합됨으로써(예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의함) 달성될 수 있다.
항체 모방체가 또한 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다. 비제한적으로, 제10 인간 피브로넥틴 III 형 도메인(10Fn3)으로부터 유래되는 모노바디로서 알려진 것(각각 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Koide et al., "The Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins," J. Mol. Biol. 284:1141-1151 (1998); Koide et al., "Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins: Application to the Estrogen Receptor," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1253-1258 (2002)); 및 포도구균 단백질 A의 안정적인 알파-나선 세균 수용체 도메인 Z로부터 유래되는 애피바디로서 알려진 것(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Nord et al., "Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain," Nature Biotechnol. 15(8):772-777 (1997))을 포함하여 다수의 항체 모방체가 당업계에 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 표적화 구성요소는 전립선-특이적 막 항원(PSMA) 수용체를 표적화한다.
본원에 사용된 바와 같이, "PSMA" 또는 "전립선-특이적 막 항원" 단백질은 포유동물 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA 단백질을 지칭한다. PSMA는 때때로 엽산 가수분해효소 1(FOLH1)로서 지칭되며, 이는 PSMA가 FOLH1유전자에 의해 코딩되기 때문이다. PSMA의 긴 전사체는 트랜스페린 수용체와 서열 상동성을 갖고 NAALADase 활성을 갖는 II 형 막관통 수용체가 특징인 약 100-120 kDa 분자량의 단백질 생산물을 코딩한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Carter et al., "Prostate-Specific Membrane Antigen is a Hydrolase With Substrate and Pharmacologic Characteristics of a Neuropeptidase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:749-753 (1996); Israeli et al., "Molecular Cloning of a Complementary DNA Encoding a Prostate-Specific Membrane Antigen," Cancer Research 53:227-230 (1993)).
단클론 항-PSMA 항체는 본 발명의 이중-기능적 치료제에서 표적화 구성요소로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 단클론 항체는 PSMA의 세포외 도메인(즉, 인간 PSMA의 약 아미노산 44-750에서와 같이 세포의 외부에 위치한 PSMA의 에피토프, 이의 아미노산 잔기는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,538,866에 개시된 인간 PSMA 서열에 대응함)에 결합한다. 인간 PSMA에 대한 뮤린 단클론 항체의 예는, 비제한적으로, E99, J415, J533 및 J591을 포함하며, 이는 각각 ATCC 등록 번호 HB-12101, HB-12109, HB-12127, 및 HB-12126을 갖는 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고, 이들 전부는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,107,090호 및 미국 특허 제6,136,311호에 개시되어 있다. 가장 바람직하게는, 뮤린 단클론 항체는 HB-12126에 의해 생산된 J591, 또는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Bander et al.에 대한 미국 특허 제7,045,605호 및 제7,514,078호에 기재된 탈-면역화된 J591 항체이다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 HER 수용체 패밀리 멤버를 표적화한다. HER 수용체 패밀리 멤버의 예시적 표적화 구성요소는 단클론 항체 4D5이다.
특정 실시양태에서, 표적화 구성요소는 종양-연관된 항원에 결합하는 펩티드이다. 예시적 펩티드는, 비제한적으로, 글루타메이트-요소-라이신 유도체, 예컨대 FOLH1/PSMA에 결합하는 2-(3-99S)-5-아미노-1-카복시펜틸)우레이도) 펜탄디오산(ACUPA), SSTR2에 결합하는 소마토스타틴 유도체, 및 알파-v/베타-3 인테그린에 결합하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드를 포함한다.
본 발명과 함께 사용되는 펩티드는 천연 공급원으로부터 알려진 단리 및 정제 프로토콜에 의해 얻어질 수 있거나, 펩티드의 알려진 펩티드 서열에 따른 표준 고체 또는 용액 상 펩티드 합성 방법에 의해 합성될 수 있거나, 상업적으로 이용가능한 제제 또는 펩티드 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 본원은 천연 펩티드의 생물학적 결합 특성을 나타내고 천연 펩티드의 특이적 결합 특징을 함유하는 펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 펩티드의 유도체 및 유사체는 펩티드의 개별 아미노산의 조성, 독자성, 및 유도체화에서의 변형을 포함하며, 단 펩티드는 천연 펩티드의 특이적 결합 특성을 함유한다. 이러한 변형의 예는 아미노산 중 임의의 것의 변형을 포함하여, D-입체 이성질체, 방향족 아미노산의 방향족 측쇄에서의 치환, 측쇄에 아미노 또는 카복실기를 함유하는 아미노산의 측쇄에서의 아미노 또는 카복실기의 유도체화, 펩티드의 아미노 또는 카복시 말단에서의 치환, 제2 펩티드 또는 생물학적 활성 모이어티에 대한 펩티드의 연결, 및 펩티드의 고리화를 포함할 것이다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 G. Van Binst and D. Tourwe, "Backbone Modifications in Somatostatin Analogues: Relation Between Conformation and Activity," Peptide Research 5:8-13 (1992)).
본원에 사용된 바와 같이, "소분자"는 통상적으로 10,000 Da 미만, 바람직하게는 5,000 Da 미만, 더욱 바람직하게는 1,000 Da 미만, 및 가장 바람직하게는 500 Da 미만의 분자량을 갖는 유기, 펩티드 또는 비-펩티드 분자이다. 이 클래스의 조절자는 화학적으로 합성된 분자, 예를 들어 조합 화학 라이브러리로부터의 화합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표적화 구성요소는 압타머이다. 압타머는 높은 친화도 및 특이성으로 이들의 표적 분자(예를 들어, 종양-연관된 항원)에 특이적으로 결합하는 작은 단일-가닥 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 압타머는 기하급수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)(SELEX)로 지칭되는 시험관내 선택 과정을 사용하여 생성되며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Ellington et al., "In Vitro Selection of RNA Molecules That Bind Specific Ligands," Nature 346:818-822 (1990) 및 Jayasena, "Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics," Clin. Chem. 45:1628-1650 (1999)에 기재되어 있다. 비제한적으로, MUC1, HER2, HER3, EpCAM, NF-kB, PSMA, CD44, PD-1, CD137, CD134, PDGF, VEGF, 및 NCL을 포함한 종양-연관된 항원을 표적화할 수 있는 몇몇 압타머가 개발되었다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Jayasena, "Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics," Clin. Chem. 45:1628-1650 (1999)).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효소"는 표적화 구성요소에 의해 종양 또는 조직에 전달될 때, 양립불가능한 동종이식편으로의 종양 또는 조직의 전환을 촉매작용하는 임의의 효소, 단백질 또는 펩티드를 포함한다.
일 실시양태에서, 효소는 번역후 변형에 관련된 효소이고 트랜스퍼라아제 및 글리코실트랜스퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
트랜스퍼라아제는 하나의 분자(소위 공여체)로부터 다른 것(소위 수용체)로의 특정 관능기(예를 들어, 메틸 또는 글리코실기)의 전달을 일으키는 효소의 클래수 중 어느 하나이다.
트랜스퍼라아제의 예시적 그룹은, 비제한적으로, 글리코실트랜스퍼라아제를 포함한다. 글리코실트랜스퍼라아제는 단계적 방식으로 단백질, 당단백질, 지질 또는 당지질 또는 성장하는 올리고당의 비-환원 말단에 대한 활성화된 당(공여체 NDP-당)의 첨가를 촉매작용한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Lairson et al., "Glycosyltransferases: Structures, Functions, and Mechanisms," Annu. Rev. Biochem. 77:521-55 (2008)). 글리코실트랜스퍼라아제는 당업계에 잘 알려져 있다.
포유동물은 글리코실트랜스퍼라아제에 대해 UDP-글루코오스, UDP-갈락토오스, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, UDP-크실로오스, UDP-글루쿠론산, GDP-만노오스, GDP-푸코오스, 및 CMP-시알산의 9 개 당 뉴클레오티드 공여체를 이용한다.
글리코실트랜스퍼라아제 반응을 포함하는 효소적 당류 합성을 위해, 글리코실트랜스퍼라아제가 임의의 공급원으로부터 클로닝되거나, 단리될 수 있다. 많은 클로닝된 글리코실트랜스퍼라아제가 알려져 있으며, 이들의 폴리뉴클레오티드 서열도 마찬가지이다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases," Taniguchi et al., 2002, Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes, Springer, Tokyo 참고). 글리코실트랜스퍼라아제 아미노산 서열 및 아미노산 서열이 추론될 수 있는 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 또한 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 글리코실트랜스퍼라아제는, 비제한적으로, 갈락토실트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 글루코실트랜스퍼라아제, N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라아제, 글루쿠로닐트랜스퍼라아제, 시알릴트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제, 글루쿠론산 트랜스퍼라아제, 갈락투론산 트랜스퍼라아제, 및 올리고글리코실트랜스퍼라아제를 포함한다. 적합한 글리코실트랜스퍼라아제는 진핵생물뿐 아니라, 원핵생물로부터 얻어진 것을 포함한다.
글리코실트랜스퍼라아제는 ABO 혈액형 항원 시스템의 발생에 대해 중요하다. 상기 기재된 바와 같이, ABO 혈액 시스템은 수혈 및 고형 기관 이식에서 중요한 주요 항원 시스템이다. 이 조직-혈액형 항원(HBGA) 시스템은 공통 기질(H 항원)에 당 잔기(N- 아세틸갈락토스아민 또는 갈락토오스)를 부착하는 GTA 및/또는 GTB 글리코실트랜스퍼라아제의 활성에 의해 제어된다. 효소는 부착된 탄수화물을 변경하거나(N-아세틸갈락토스아민(A) 대 갈락토오스(B)) 효소의 기능의 손실을 야기하여, H 항원이 변형되지 않는(O) 몇몇 표현형 변이체를 갖는다. A의 변이체, A2는 N- 아세틸갈락토스아민 활성 및 NAc-gal 첨가의 감소된 수준을 갖는다. 이들 변이체는 현재 혈청학 및 렉틴 결합(Al 대 A2을 정의함)에 의해 식별된다. 혈청학은 H 항원의 변형을 검출할 수 있거나 A 및/또는 B에 대해 지시된 천연-발생 항체의 존재를 검출할 수 있다(예를 들어, 글리코실화의 B 패턴을 갖는 인간은 A에 대해 지시된 항체를 가질 것임).
인간에서, 본원에서 ABO 유전자좌 또는 ABO 글리코실트랜스퍼라아제 유전자좌로서 지칭되는 글리코실트랜스퍼라아제 유전자좌는 염색체 9 상에 위치하고 18 kb 초과의 게놈 DNA에 걸친 7 개 엑손을 함유한다. 엑손 7은 최대이고 코딩 서열의 대부분을 함유한다. ABO 유전자좌는 A, B, 및 O의 3 개 주요 대립유전자 형태를 갖는다. A "대립유전자"(Al 또는 A2로도 지칭됨)는 H 항원의 D-갈락토오스 말단에 N-아세틸갈락토스아민을 효소적으로 첨가하는 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하여, 소위 A 항원을 생산한다. B 대립유전자는 H 항원의 D-갈락토오스 말단에 D-갈락토오스를 효소적으로 첨가하는 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하고, 따라서 소위 B 항원을 생성한다. O 대립유전자는 글리코실트랜스퍼라아제의 비기능적 형태를 코딩하여, 비변형된 H 항원을 야기하고, 소위 O 항원 표현형을 생성한다.
게놈 수준에서, ABO 글리코실트랜스퍼라아제 유전자는 많은 대립유전자(~300)를 갖는다. 이들 천연 발생 대립유전자 변이체는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Yip, "Sequence Variation at the Human ABO Locus," Ann. Hum. Genet. 66:1-27 (2002); Hakomori "Antigen Structure and Genetic Basis of Histo-Blood Group A, B, and O: Their Changes Associated with Human Cancer," Biochimica et Biophysica Acta 1473:247-266 (1999); Seto et al., "Sequential Interchange of Four Amino Acids from Blood Group B to Blood Group A Glycosyltransferase Boosts Catalytic Activity and Progressively Modifies Substrate Recognition in Human Recombinant Enzymes," J. Biol. Chem. 272:14133-14138 (1997)에 기재되어 있으며, 본 발명의 이중-기능적 치료제에서 이들의 용도가 고려된다. 효소의 촉매작용 부위를 코딩하는 서열은 유전자의 엑손 7에 놓여 있고; 핵심 아미노산 잔기 176, 235, 266, 및 268은 이 활성 부위의 특이성을 제어한다. 또한, 엑손 6에서 공통 뉴클레오티드 결실은 전장 글리코실트랜스퍼라아제의 합성을 폐지하는 정지 코돈을 생성하여, O 또는 무효(null) 표현형을 야기한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제), 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제), 알파-gal-트랜스퍼라아제, 및 글리코실트랜스퍼라아제 A(Gly268Ala)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 기재된 바와 같은 대립유전자 변이체가 또한 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 글리코실트랜스퍼라아제는 푸코실트랜스퍼라아제이다. 푸코실트랜스퍼라아제는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예시적 푸코실트랜스퍼라아제는 GDP-푸코오스로부터 수용체 당의 하이드록시 위치에 L-푸코오스를 전달하는 효소를 포함한다. 수용체에 비-뉴클레오티드 당을 전달하는 푸코실트랜스퍼라아제가 또한 본 발명에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 인간화된 또는 탈-인간화된 글리코실트랜스퍼라아제이다. 단백질을 인간화하고/하거나 탈-면역화하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시양태는 종양 상에서 혈액형 항원 발현의 변경 및/또는 종양-표적화된 글리코실트랜스퍼라아제에 의한 종양의 혈액 공급에 관한 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 이는 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효과적으로 전환하고, 이에 의해 초-급성 거부반응을 개시한다.
본원에 기재된 이중-기능적 치료제는 표적화 구성요소가 펩티드 결합을 통해 효소에 연결된 단백질 또는 펩티드이도록 형성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 펩티드 결합을 통해 효소에 연결된 단백질 또는 펩티드 표적화 구성요소는 키메라 또는 융합 단백질로 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 단일 연속 폴리펩티드 쇄, 즉 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 인접 아미노산 또는 제1 폴리펩티드 서열의 전장 서열의 적어도 일부 및 제2 폴리펩티드 서열의 전장 서열의 적어도 일부를 포함하고, 제1 및 제2 폴리펩티드가 상이한 폴리펩티드인, 서로 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결된 일련의 폴리펩티드 쇄(즉, 폴리펩티드 복합체)를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 키메라 폴리펩티드는 또한 동일한 키메라 폴리펩티드로부터 유래된 2 이상의 비-인접 부분을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 키메라 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 적어도 하나의 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 키메라 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 서열의 부분이 제2 폴리펩티드 서열의 부분에 의해 치환된 제1 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일련의 폴리펩티드 쇄는 적합한 생화학 링커 또는 디설파이드 결합을 사용하여 공유결합으로 연결될 수 있다.
표적화 구성요소 및 효소의 커플링은 또한 화학적 연결(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Brennan et al., "Preparation of Bispecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1 Fragments," Science 229:81-3 (1985)), 또는 화학적 커플링(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Shalaby et al., "Development of Humanized Bispecific Antibodies Reactive With Cytotoxic Lymphocytes and Tumor Cells Overexpressing the HER2 Protooncogene," J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))을 사용하여 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 표적화 구성요소 및 효소는, 비제한적으로, 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 힘(Van der Waals force), 및 소수성 상호작용을 포함하는 비-공유 결합을 통해 연결될 수 있다.
따라서, 표적화 구성요소(예를 들어, 항체)와 효소 사이의 융합 또는 연결은 전통적인 공유 또는 이온 결합, 유전자 조작을 통한 단백질 융합, 또는 헤테로이중기능적 가교제, 예를 들어 카보디이미드, 글루타르알데하이드 등에 의해 달성될 수 있다. 표적화 구성요소와 효소 사이에 소망하는 양의 공간을 간단하게 제공하는 전통적인 불활성 링커 서열(예를 들어, 펩티드 링커)이 또한 사용될 수 있다. 이러한 링커의 설계는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,580,922호; 제5,525,491호; 및 제6,165,476호에 기재되어 있다. 다양한 커플링 또는 가교제가 단백질의 공유 결합을 위해 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸- 티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 -카복실레이트(설포- SMCC)를 포함한다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Karpovsky et al., "Production of Target-Specific Effector Cells Using Hetero-Cross-Linked Aggregates Containing Anti-Target Cell and Anti-Fc Gamma Receptor Antibodies," J. Exp. Med. 160(6):1686-701 (1984); Liu et al., "Heteroantibody Duplexes Target Cells for Lysis by Cytotoxic T Lymphocytes," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(24):8648-52 (1985) 참고). 다른 방법은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Paulus, Behring Ins Mitt No 78, 1 18-132 (1985); Brennan et al., "Preparation of Bispecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1 Fragments," Science 229:81-83 (1985); Glennie et al., "Preparation and Performance of Bispecific F(ab' gamma)2 Antibody Containing Thioether-Linked Fab' Gamma Fragments," J. Immunol. 139:2367-2375 (1987)에 기재된 것을 포함한다.
다수의 다른 링커가 사용되어, 효소에 표적화 구성요소를 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Saito et al., Adv. Drug Delivery Reviews 55:199-215 (2003)에 기재된 바와 같이 디설파이드 결합이 사용될 수 있다. 하이드라존, 케탈 및/또는 아코니트산을 포함하여, 엔도솜 또는 종양 환경에서 발견되는 낮은 pH에 대해 민감한 링커가 또한 사용될 수 있다. 하이브리드 링커, 예를 들어 2 이상의 잠재적 절단 부위를 갖는 링커, 예를 들어 디설파이드 및 하이드라존이 또한 사용될 수 있다. 펩티다아제-민감성 링커, 예를 들어 종양-특이적 펩티다아제, 예를 들어 PSA에 의한 절단에 대해 민감한 링커가 또한 사용될 수 있다. PEG 링커가 또한 사용될 수 있다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Wiiest et al., Oncogene 21:4257-4265 (2002)). 예시적 링커는 하이드라존 및 디설파이드 하이브리드 링커(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Hamann et al., Bioconjugate Chem. 13:47-58 (2002); Hamann et al., Bioconjug Chem. 13(1):40-6 (2002) 참고); SPP(Immunogen); 및 Pierce Biotechnology, Inc.로부터 이용가능한 다양한 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 SSP(Immunogen으로부터 이용가능한 디설파이드 링커)이고, 링커 대 항체의 비는 예를 들어, 7:1 내지 4:1로 달라질 수 있다. 다양한 스페이서 및 링커 서열이 당업계에 알려져 있고 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Chen et al., "Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality," Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-69 (2013)에 기재되어 있다.
용어 '펩티드 링커' 또는 스페이서는 표적화 구성요소와 이중-기능적 치료제의 폴리펩티드의 효소 모이어티를 연결하거나 커플링하는 짧은 펩티드 단편을 지칭한다. 링커는 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어진다. 예를 들어, 펩티드 링커는 짧은 아미노산 잔기 또는 친수성 아미노산 잔기(예를 들어, 글리신, 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파르트산, 아스파라긴 등)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 적어도 5 개 아미노산의 길이, 또는 약 5 내지 약 100 개 아미노산의 길이, 또는 약 10 내지 50 개 아미노산의 길이, 또는 약 10 내지 15 개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.
일 예에서, 링커는 글리신 및 알라닌과 같은 입체 비장애되는 다수의 아미노산으로 이루어진다. 따라서, 추가 예에서, 링커는 폴리글리신, 폴리알라닌 또는 폴리세린이다.
통상의 기술자는 많은 일반적으로 사용되는 펩티드 링커가 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 특정 실시양태에서, 짧은 펩티드 링커는 반복 단위를 포함하여, 링커 길이를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 이중, 삼중 또는 사중 반복된 링커. 일 예에서, 링커는 식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(서열번호 1) 또는 식 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n Ser(서열번호 2)를 포함하고, 상기 식에서 n은 3 내지 6의 수이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (G4S)3 링커(서열번호 67)이다.
비-펩티드 링커 또는 스페이서가 또한 가능하다. 예를 들어, 알킬 링커, 예컨대 -NH-(CH2)s-C(O)-(상기 식에서, s = 2-20)가 사용될 수 있다. 이들 알킬 링커는 임의의 비-입체 장애 기, 예컨대 저가 알킬(예를 들어, C1-C6), 저가 아실, 할로겐(예를 들어, Cl, Br), CN, NH2, 페닐에 의해 추가로 치환될 수 있다. 예시적 비-펩티드 링커는 100 내지 5000 kD, 바람직하게는 1000 내지 2000 kD, 및 더욱 바람직하게는 1500 kD의 분자량을 갖는 PEG 링커 또는 스페이서이다.
본 발명에 따른 이중기능적 치료제는 C-말단에 커플링된 N-말단을 포함할 수 있다. N-말단 및 C-말단은 본원에서 각각 본 발명의 이중기능적 치료제 단백질의 N-말단 영역 또는 부분 및 C-말단 영역 또는 부분을 지칭하기 위해 사용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중기능적 치료제의 C-말단 부분 및 N-말단 부분은 인접하여 결합된다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 이중기능적 치료제의 C-말단 부분 및 N-말단 부분은 개재 스페이서에 의해 커플링된다. 일 실시양태에서, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중기능적 치료제의 C-말단 부분 및/또는 N-말단 부분은 각각 본 발명의 키메라 단백질의 C-말단 잔기 및/또는 N-말단 잔기에 커플링된 추가 부분(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 부분(들)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 추가 부분(들)을 갖는 N-말단 부분 및/또는 C-말단 부분은 각각 표적화 구성요소의 대응하는 천연 발생 N-말단 부분 및/또는 효소의 C-말단 부분의 활성을 유지할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 추가 부분(들)을 갖는 N-말단 부분 및/또는 C-말단 부분은 각각 표적화 구성요소의 대응하는 천연 발생 N-말단 부분 및/또는 효소의 C-말단 부분과 비교하여 향상되고/되거나 연장된 활성을 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중기능적 치료제의 C-말단 부분 및/또는 N-말단 부분은 각각 본 발명의 키메라 단백질의 C-말단 잔기 및/또는 N-말단 잔기에 커플링된 임의의 추가 부분(들)을 포함하지 않는다.
일 실시양태에서, N-말단 영역은 표적화 구성요소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적화 구성요소는, 비제한적으로, 모노머 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fab'2, scFv, 및 다른 항체 단편 유도체, 예컨대 미니바디, 디아바디, 및 트리아바디를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다. 항체 또는 항원-결합 단편은 FcRn-결합 도메인을 유지하거나 결실될 수 있다.
일 실시양태에서, N-말단 영역은 인간 J591 중쇄를 포함하고 다음과 같은 서열번호 3의 아미노산 서열(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록번호 CCA78124.1), 또는 이의 부분을 갖는다:
다른 실시양태에서, N-말단 영역은 인간 J591 경쇄를 포함하고 다음과 같은 서열번호 4의 아미노산 서열(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록번호 CCA78125.1), 또는 이의 부분을 갖는다:
다른 실시양태에서, N-말단 영역은 인간 4D5 중쇄를 포함하고 다음과 같은 서열번호 5의 아미노산 서열, 또는 이의 부분을 갖는다:
다른 실시양태에서, N-말단 영역은 인간 4D5 경쇄를 포함하고 다음과 같은 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 이의 부분을 갖는다:
상기에 따르면, 일부 실시양태에서, C-말단 영역은 효소를 포함한다.
일 실시양태에서, C-말단 영역은 글리코실트랜스퍼라아제 B(GTB)의 촉매작용 도메인을 포함하고 다음과 같은 서열번호 7의 아미노산 서열(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록번호 AM423112.1), 또는 이의 부분을 갖는다:
다른 실시양태에서, C-말단 영역은 GTB 및 GTA의 하이브리드 서열을 생성하는 "시스 A,B" 서열을 포함하고 다음과 같은 서열번호 8의 아미노산 서열(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록번호 ABL75287.1), 또는 이의 부분을 갖는다:
다른 실시양태에서, C-말단 영역은 글리코실트랜스퍼라아제 A(GTA)의 촉매작용 도메인을 포함하고 다음과 같은 서열번호 9의 아미노산 서열(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 GenBank 등록번호 AFB74122.1), 또는 이의 부분을 갖는다:
특정 실시양태에서, 종양-연관된 항원을 갖는 종양은 H-항원을 발현한다. 본원에 사용된 바와 같이, "H-항원"은 말단 이당류 푸코오스-갈락토오스를 갖고, 푸코오스가 알파-(1-2)- 연결을 갖는 올리고당 쇄를 지칭한다. H-항원은 푸코실트랜스퍼라아제에 의해 생산되고 ABO 혈액형 시스템 내에서 A 또는 B 항원의 생산을 위한 구성 요소이다.
따라서, 본 발명은 또한 암을 치료하는 방법에 적용된다. 방법은 암을 갖는 대상체를 선택하는 단계 및 본 발명에 따른 이중-기능적 치료제를 제공하는 단계를 포함한다. 이중-기능적 치료제는 암을 치료하기에 효과적인 조건 하에 선택된 대상체에 투여된다.
사실상, 비제한적으로, 전립선 종양, 부신피질 암종 종양, 항문 종양, 맹장 종양, 성상세포종(아동기 소뇌 또는 대뇌), 기저-세포 암종, 담관 종양, 방광 종양, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌 줄기 신경교종, 뇌실막세포종, 속질모세포종, 유방 종양, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 카르시노이드 종양, 자궁경부 종양, 아동기 종양, 연골육종, 결장 종양, 피부 T-세포 림프종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 자궁내막 종양, 식도 종양, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 망막모세포종, 담낭 종양, 위(위) 종양, 위징관 기질 종양, 생식 세포 종양, 임신 영양막 종양, 두경부 종양, 심장 종양, 간세포(간) 종양, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 하인두 종양, 섬세포 암종(내분비 췌장), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 신장 종양, 후두 종양, 입술 및 구강 종양, 비소세포 폐 종양, 소세포 폐 종양, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포(Merkel cell) 종양, 중피종, 다발성 내분비샘 종양, 다발성 골수종, 비인두 종양, 신경모세포종, 희소돌기아교세포종, 구강 종양, 구강인두 종양, 난소 종양, 췌장 종양, 흉막폐아세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘 종양, 연조직 육종, 자궁 육종, 피부 종양(비-흑색종), 소장 종양, 편평세포 암종, 위 종양, 고환 종양, 인후 종양, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 종양, 영양막 종양, 및 요도 종양을 포함하는, H-항원을 발현하는 임의의 종양이 본원에 기재된 이중기능적 치료제로 치료될 수 있다.
비제한적으로, 조혈 또는 림프 암, 중배엽 유래된 암, 육종, 신경외배엽 암 등을 포함하는 일부 암은 H 항원을 발현하지 않을 수 있다. 이는 H의 존재 또는 부재를 드러내기 위한 Ulex 렉틴 결합을 사용한 종양 샘플의 유세포분석 또는 면역조직화학에 의해 용이하게 결정될 수 있다. H가 부재할 때, 본 발명을 사용한 치료는 2 개 방식으로 달성될 수 있다: 하나는 이전에 기재된 바와 같이 표적화된 글리코실트랜스퍼라아제 전에 또는 그와 동시에 H 항원을 첨가하기 위해 표적화된 푸코실트랜스퍼라아제를 이용할 수 있다. 대안적으로, 하나는 말단 갈락토오스를 첨가할 수 있고 1,2 푸코오스(H 항원)의 존재를 요구하지 않는 알파 galT 효소를 표적화할 수 있다.
일 실시양태에서, 이중-기능적 치료제의 표적화 구성요소는 종양 혈관 내피 상의 PSMA 수용체를 표적화한다. PSMA 발현은 다양한 종양의 종양 신생-혈관에서 보고되었지만 정상 조직 혈관에서 부재한다. PSMA-양성 혈관 내피를 갖는 예시적 조직 유형은, 비제한적으로, 신장, 폐, 결장, 위, 유방, 뇌, 췌장, 간, 방광, 식도, 부신, 두경부, 흑색종, 및 뇌 종양을 포함한다. 다른 실시양태는 전립선암 세포의 표면 상에 발현된 PSMA를 표적화하는 것, 유방 및 다른 HER2-양성 암 상의 HER2를 표적화하는 것, B-세포 계통 암 상의 CD19를 표적화하는 것, 및 대장암 상의 CEA를 표적화하는 것을 포함한다. 다른 적용가능한 표적은 상기 기재되어 있다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 표 1 및 2에 제공된 바와 같은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 표적화 구성요소를 포함하는 이중-기능적 치료제에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 변형된 아미노산 서열은 표 1 및 2에 제공된 CDR 서열 중 어느 하나, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체-기반 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 각각 인간 또는 인간화된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 본원의 표 3에서 제공된 서열 중 하나 또는 2 개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 변형된 아미노산 서열은 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나 또는 2 개와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
본원에 개시된 표적화 도메인의 중쇄 CDR 서열 및/또는 경쇄 CDR 서열에 대한 적합한 아미노산 변형은 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 본원에 개시된 CDR 서열의 것에 대한 유사하거나 향상된 결합 특징을 갖는 변이체 CDR 서열을 야기하는 보존적 치환 또는 기능적으로 동등한 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 본 발명에 의해 항체의 이의 표적(예를 들어, PSMA, CD14, HER2)에 대한 결합을 유지하거나 향상시키는 1, 2, 3, 4, 5 이상의 아미노산 치환(CDR의 길이에 따름)을 함유하는 표 1 및 2의 CDR이 포함된다. 생성된 변형된 CDR은 표 1 및 2의 CDR과 서열에서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하다. 표 1의 중쇄 CDR 서열 및/또는 표 1 및 2의 경쇄 CDR 서열에 대한 적합한 아미노산 변형은 예를 들어, 표 1 및 2의 CDR 서열의 것에 대한 유사하거나 향상된 결합 특징을 갖는 변이체 CDR 서열을 야기하는 보존적 치환 또는 기능적으로 동등한 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 보존적 치환은 이들의 측쇄에서 관련되는 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 것이다. 유전자 코딩된 아미노산은 (1) 산성(아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘); (3) 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 및 (4) 비하전된 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신)의 4 개 패밀리로 나뉘어질 수 있다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다. 대안적으로, 아미노산 레퍼토리는 (1) 산성(아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성(라이신, 아르기닌 히스티딘), (3) 선택적으로 지방족-하이드록실로서 별도로 그룹화되는 세린 및 트레오닌을 갖는 지방족(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌); (4) 방향족(페닐알라닌, 티로신, 트립토판); (5) 아미드(아스파라긴, 글루타민); 및 (6) 황-함유(시스테인 및 메티오닌)으로 그룹화될 수 있다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981). 비-보존적 치환이 또한 표 1의 중쇄 CDR 서열 및 표 2의 경쇄 CDR 서열에 대해 이루어질 수 있다. 비-보존적 치환은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 클래스의 아미노산으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환하여, CDR의 결합 특성을 개선하거나 향상시키는 것을 포함한다. 표 1의 중쇄 가변 영역 CDR 및/또는 표 2의 경쇄 가변 영역 CDR의 아미노산 서열은 표적(예를 들어, PSMA, CD19, HER2) 결합을 유지하거나 향상시키는 하나 이상의 내부 중성 아미노산 삽입 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 도메인의 VH 쇄는 상기 표 3에 제공된 VH 아미노산 서열 중 어느 하나, 또는 표 3에 열거된 VH 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 도메인은 (i) 서열번호 30과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 (iii) 서열번호 34와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 도메인의 VL 쇄는 상기 표 3에 제공된 VL 아미노산 서열 중 어느 하나, 또는 표 3에 열거된 VL 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 도메인은 (i) 서열번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 31과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (iii) 서열번호 33과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화 도메인은 (i) 서열번호 30과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (iii) 서열번호 33과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 표적화 도메인은 이들의 결합 친화도의 측면에서 기재되거나 구체화될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 표적화 도메인은 1 μM, 500 nM, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 미만의 해리 상수 또는 KD를 갖는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 전립선-특이적 막 항원(PSMA)/엽산 가수분해효소 1(FOLH1) 수용체를 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 상기 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 이 양태는 전립선암을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 10의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1(CDR-H1); 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 13의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 2(CDR-H2); 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 16의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 중쇄 CDR 서열의 서열은 상기 표 1에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다(상기 표 3).
표적화 구성요소는 경쇄 가변 영역를 추가로 포함할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 19의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 1(CDR-L1); 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 서열번호 22와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 22의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 2(CDR-L2); 및 서열번호 25의 아미노산 서열 또는 서열번호 25와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 25의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 경쇄 CDR 서열의 서열은 상기 표 2에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(상기 표 3).
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 10의 CDR-H1, 서열번호 13의 CDR-H2, 및 서열번호 16의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19의 CDR-L1, 서열번호 22의 CDR-L2, 및 서열번호 25의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다(표 3).
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 시그널링 펩티드를 추가로 포함하고, 선택적으로 시그널링 펩티드는 서열번호 34의 아미노산 1-19의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제) 및 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 글리코실트랜스퍼라아제 A("GTA")이고 다음과 같은 서열번호 64의 아미노산 서열, 또는 이의 부분을 갖는다:
일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 글리코실트랜스퍼라아제 B("GTB")이고 다음과 같은 서열번호 65의 아미노산 서열, 또는 이의 부분을 갖는다:
적합한 추가 글리코실라아제가 하기에 기재된다. 일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 마모셋(Marmoset) α-1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(aa90-376)이고 다음과 같은 서열번호 66의 아미노산 서열, 또는 이의 부분을 갖는다:
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 (i) 서열번호 34 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질; (ii) 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질; (iii) 서열번호 40 또는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질; (iv) 서열번호 43 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질; (v) 서열번호 46의 아미노산 서열; (vi) 서열번호 47의 아미노산 서열; (vii) 서열번호 48의 아미노산 서열; 또는 (viii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함한다(표 4).
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 34 또는 서열번호 35의 위치 20-770의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 36의 위치 20-233의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 위치 20-540의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 39의 위치 20-233의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 포함하고, 선택적으로 이중-기능적 치료제는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 위치 20-558의 아미노산 서열을 포함하는 제1 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 40 또는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 42의 위치 1-214의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 43 또는 서열번호 44의 위치 20-831의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 45의 위치 1-214의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 46 또는 서열번호 47의 위치 1-767의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 48 또는 서열번호 49의 위치 20-591의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 이중-기능적 치료제는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 위치 20-597의 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 인간 표피 성장 인자 수용체(HER) 패밀리 멤버를 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 상기 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 이 양태는 유방암 또는 임의의 HER2 발현 암을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 11의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1(CDR-H1); 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 14의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 2(CDR-H2); 및 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 17의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 중쇄 CDR 서열의 서열은 상기 표 1에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 30과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다(상기 표 3).
표적화 구성요소는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 1(CDR-L1); 서열번호 23의 아미노산 서열, 또는 서열번호 23과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 23의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 2(CDR-L2); 및 서열번호 26의 아미노산 서열, 또는 서열번호 26과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 26의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 경쇄 CDR 서열의 서열은 상기 표 2에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 31과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(상기 표 3).
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2, 및 서열번호 17의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20의 CDR-L1, 서열번호 23의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 30과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다(표 3).
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 시그널링 펩티드를 추가로 포함하고, 선택적으로 시그널링 펩티드는 서열번호 50의 아미노산 1-19의 서열을 갖는다.
적합한 글리코실트랜스퍼라아제가 하기에 상세히 기재된다.
일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제) 및 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 (i) 서열번호 50 또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질; (ii) 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질; (iii) 서열번호 56 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질; (iv) 서열번호 59의 아미노산 서열; (v) 서열번호 60의 아미노산 서열; (vi) 서열번호 61의 아미노산 서열; 또는 (vii) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함한다(표 5).
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 50 또는 서열번호 51의 위치 20-774의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 52의 위치 20-233의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 53 또는 서열번호 54의 위치 20-563의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 55의 위치 20-233의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 포함하고, 선택적으로 이중-기능적 치료제는 서열번호 53 또는 서열번호 54의 위치 20-569의 아미노산 서열을 포함하는 제1 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 56 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 58의 위치 1-214의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 59 또는 서열번호 60의 위치 1-555의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 61 또는 서열번호 62의 위치 20-593의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 이중-기능적 치료제는 서열번호 61 또는 서열번호 62의 위치 20-599의 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 CD19를 표적화하는 표적화 구성요소 및 상기 표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 상기 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 이 양태는 B-세포 또는 B-세포 활성의 제거에 대한 필요성을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이 양태는 림프종(예를 들어, B 세포 림프종), B-세포 백혈병, 및/또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 유용하다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 12의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1(CDR-H1); 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 15의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 2(CDR-H2); 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 18의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 3(CDR-H3)을 포함한다. 중쇄 CDR 서열의 서열은 상기 표 1에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다(상기 표 3).
표적화 구성요소는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 21의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 1(CDR-L1); 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 서열번호 24와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 24의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 2(CDR-L2); 및 서열번호 27의 아미노산 서열 또는 서열번호 27과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 27의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 경쇄 CDR 서열의 서열은 상기 표 2에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(상기 표 3).
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 12의 CDR-H1, 서열번호 15의 CDR-H2, 및 서열번호 18의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21의 CDR-L1, 서열번호 24의 CDR-L2, 및 서열번호 27의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 33과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다(표 3).
일부 실시양태에서, 표적화 구성요소는 시그널링 펩티드를 추가로 포함하고, 선택적으로 시그널링 펩티드는 서열번호 63의 아미노산 1-19의 서열을 갖는다.
적합한 글리코실트랜스퍼라아제는 하기에 상세히 기재된다.
일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제) 및 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 글리코실트랜스퍼라아제는 서열번호 66의 서열을 갖는 마모셋 α-1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(aa90-376)이다.
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함한다(표 6).
일부 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 서열번호 63의 위치 20-584의 아미노산 서열, 서열번호 63의 위치 20-578의 아미노산 서열, 서열번호 63의 위치 20-287의 아미노산 서열, 서열번호 63의 위치 20-272의 아미노산 서열, 서열번호 63의 위치 20-160의 아미노산 서열, 또는 서열번호 63의 위치20-140의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 이중-기능적 치료제의 정확한 용량은 치료될 환자의 측면에서 개별 의사에 의해 선택된다는 것이 인식될 것이다. 일반적으로, 투여량 및 투여는 치료되는 환자에 약제의 유효량을 제공하기 위해 조정된다. 본원에 사용된 바와 같이, 이중-기능적 치료제의 "유효량"은 소망하는 생물학적 반응을 유도하기 위해 필요한 양을 지칭한다. 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명의 이중-기능적 치료제의 유효량은 소망하는 생물학적 종점, 전달될 약물, 표적 조직, 투여의 경로 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 이중-기능적 치료제의 유효량은 소망하는 기간에 걸쳐 소망하는 양만큼 종양 크기에서의 감소를 야기하는 양일 수 있다. 고려될 수 있는 추가 인자는 질병 상태의 중증도; 치료되는 환자의 연령, 체중 및 성별; 투여의 식습관, 시간 및 빈도; 약물 조합; 반응 민감성; 및 요법에 대한 내성/반응을 포함한다.
"유효량"은 또한 "예방적 유효량"일 수 있으며, 이는 장애, 예를 들어 암의 개시 또는 재발의 발생의 예방 또는 지연, 또는 이의 증상의 치료에서, 대상체에 대한 단일- 또는 다중-용량 투여시 효과적인, 본원에 기재된 바와 같은 이중-기능적 치료제의 양을 지칭한다.
일반적으로, 용량은 단일 약제로서 주어질 때, 이중-기능적 치료제의 최대 허용 용량(MTD)의 약 25% 내지 약 100%의 범위일 수 있다. 조성물을 기초로 하여, 용량은 예컨대 연속 펌프에 의해, 또는 주기적 간격으로 1 회, 연속으로 전달될 수 있다. 투여량은 국소로, 또는 전신으로 소망하는 약물 수준을 달성하기 위해 적절하게 조정될 수 있다. 대상체에서 반응이 이러한 용량에서 불충분한 경우에, 더욱 높은 용량(또는 상이한, 더욱 국소화된 전달 경로에 의한 높은 유효 용량)이 환자 내성이 허용하는 정도까지 이용될 수 있다. 예를 들어, 24 시간에 걸친 연속 IV 투여 또는 매일 다중 용량이 또한 화합물의 적절한 전신 수준을 달성하기 위해 고려된다. 예로서, 투여량 스케줄은 이중-기능적 치료제가 임의의 수의 주 동안 주 당 1, 2, 3 회 이상 투여되거나 이중-기능적 치료제가 1 주 1 회, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 주마다 1회 발생하는 투여로 1 회 초과(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22 또는 24 회)로 투여되도록 달라질 수 있다. 예를 들어, 이중-기능적 치료제는 4 내지 8 주마다 1 회 발생하는 투여로 상기 원용된 투여량 수준에서 적어도 2, 3 또는 4 회 투여될 수 있다. 대상체가 이중-기능적 치료제에 대한 역반응을 나타내지 않고/않거나 암의 하나 이상의 증상이 개선되거나 동일하게 유지되는 경우, 추가 용량 또는 용량들이 주어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 사이의 기간이 증가할수록, 이중-기능적 치료제의 양은 증가될 수 있다.
이중-기능적 치료제의 생배분 및 약물동태학은 상이한 표적화 구성요소에 대해 상이할 수 있다. 예로서, 전장, 무손상 항체로 구성된 큰 이중-기능적 치료제는 긴 혈장 및 전신 반감기를 가질 것이고 순환계에 남아있는 경향이 있을 것이다. 이러한 이중-기능적 치료제는 또한 간을 통해 분비될 가능성이 더욱 있을 것이고 정상 조직 내로 침투할 가능성이 덜 있을 것이다. 반대로, 표적화 펩티드 또는 소분자 리간드로 구성된 작은 이중-기능적 치료제는 예를 들어, 짧은 반감기를 갖고, 신장/요로를 통해 분비되고 정상 조직 및 종양을 더욱 용이하게 침투하는 경향이 있을 것이다.
본 발명의 방법을 실행 시, 투여 단계가 수행되어, 대상체에서 암을 치료한다. 일 실시양태에서, 암을 갖는 대상체는 투여 단계 전에 선택된다. 이러한 투여는 전신으로 또는 종양 부위에 대한 지시 또는 국소 투여를 통해 수행될 수 있다. 예로서, 전신 투여의 적합한 방식은, 비제한적으로, 구강으로, 국부로, 경피로, 비경구적으로, 피내로, 근육내로, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 또는 비강내 점적에 의해, 강내 또는 방광내 점적에 의해, 안구내로, 동맥내로, 병변내로, 또는 점막에 대한 적용에 의한 것을 포함한다. 국소 투여의 적합한 방식은, 비제한적으로, 도뇨, 이식, 직접 주사, 피부/경피 적용, 또는 관련 조직에 대한 간문맥 투여, 또는 당업계에 일반적으로 알려진 임의의 다른 국소 투여 기술, 방법 또는 절차에 의한 것을 포함한다. 이중-기능적 치료제의 전달에 영향을 주는 방식은 이중-기능적 치료제의 유형(예를 들어, 항체 표적화 구성요소 또는 펩티드 표적화 구성요소를 가짐) 및 치료될 질환에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 이중-기능적 치료제는 예를 들어, 불활성 희석제와 함께, 또는 동화가능 식용 담체와 함께 구강으로 투여될 수 있거나, 이는 단단하거나 부드러운 껍질 캡슐에 동봉될 수 있거나, 이는 정제로 압축될 수 있거나, 이들은 식습관의 음식으로 직접 혼입될 수 있다. 본 발명의 이중-기능적 치료제는 또한 지효성 캡슐 또는 나노튜브와 같은 장치 내에 혼입된 지효성 방식으로 투여될 수 있다. 이러한 장치는 시간 및 투여량에 대해 유연성을 제공한다. 구강 치료 투여에 대해, 본 발명의 약제는 부형제와 함께 혼입될 수 있고 정제, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 0.1%의 약제를 함유할 것이지만, 낮은 농도가 효과적일 수 있고 사실 최적일 수 있다. 이들 조성물에서 약제의 비율은 물론 달라질 수 있고 편리하게는 단위 중량의 약 2% 내지 약 60%일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물에서 본 발명의 이중-기능적 치료제의 양은 적합한 투여량이 얻어질 정도이다.
본 발명의 이중-기능적 치료제가 비경구적으로 투여될 때, 약제의 용액 또는 현탁액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 오일 중 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물에서 제조될 수 있다. 예시적 오일은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 또는 광유이다. 일반적으로, 물, 생리식염수, 수성 덱스트로오스 및 관련된 당 용액, 및 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 특히 주사액에 대해 바람직한 액체 담체이다. 저장 및 사용의 일상 조건 하에, 이들 제제는 보존제를 함유하여, 미생물의 성장을 예방한다.
주사 용도에 적합한 약학 제형은 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 멸균 수용액 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균이어야 하고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에 안정적이어야 하고 미생물, 예컨대 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다.
본 발명의 이중-기능적 치료제를 전신으로 전달하는 것이 바람직할 때, 이는 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구적 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은 단위 투여량 형태로, 예를 들어 첨가된 보존제를 갖는 앰플 또는 다중-용량 용기에 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
본 발명의 이중-기능적 치료제의 복강내 또는 척추강내 투여는 또한 주입 펌프 장치를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 장치는 다중 주사 및 다중 조작을 회피하는 소망하는 화합물의 연속 주입을 허용한다.
이전에 기재된 제형과 함게, 이중-기능적 치료제는 또한 데포제로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기-작용 제형은 적합한 폴리머 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능 오일 중 에멀션) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 이중-기능적 치료제 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
이중-기능적 치료제는 상기 기재되어 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 이중-기능적 치료제를 함유하는 약학 조성물은 하기 기재된 바와 같은 약학적 허용 담체, 하나 이상의 활성제, 및 적합한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 적합한 전달 비히클은, 비제한적으로, 바이러스, 세균, 생물분해성 마이크로스피어, 마이크로입자, 나노입자, 리포솜, 콜라겐 미니펠릿, 및 코클리에이트(cochleate)를 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 약학 조성물 또는 제형은 액체 제형에서 캡슐화되어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Semple et al., "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery," Nature Biotech. 28:172-176 (2010), Bumcrot et al.에 대한 WO2011/034798호, Bumcrot et al.에 대한 WO2009/111658호, 및 Bumcrot et al.에 대한 WO2010/105209호에 기재된 바와 같이 핵산-액체 입자를 형성한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 전달 비히클은 나노입자이다. 다양한 나노입자 전달 비히클이 당업계에 알려져 있으며 본 발명의 이중-기능적 치료제의 전달에 적합하다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 van Vlerken et al., "Multi-functional Polymeric Nanoparticles for Tumour-Targeted Drug Delivery," Expert Opin. Drug Deliv. 3(2):205-216 (2006) 참고). 적합한 나노입자는, 비제한적으로, 폴리(베타-아미노 에스테르)(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Sawicki et al., "Nanoparticle Delivery of Suicide DNA for Epithelial Ovarian Cancer Cell Therapy," Adv. Exp. Med. Biol. 622:209-219 (2008)), 폴리에틸렌이민-알트-폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Park et al., "Degradable Polyethylenimine-alt-Poly(ethylene glycol) Copolymers As Novel Gene Carriers," J. Control Release 105(3):367-80 (2005) 및 Park et al., "Intratumoral Administration of Anti-KITENIN shRNA-Loaded PEI-alt-PEG Nanoparticles Suppressed Colon Carcinoma Established Subcutaneously in Mice," J Nanosci. Nanotechnology 10(5):3280-3 (2010)), 및 리포솜-포획된 siRNA 나노입자(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Kenny et al., "Novel Multifunctional Nanoparticle Mediates siRNA Tumor Delivery, Visualization and Therapeutic Tumor Reduction In Vivo," J. Control Release 149(2): 111-116 (2011))를 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 나노입자 전달 비히클은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Prakash et al.에 대한 미국 특허 공개 제2010/0215724호에 개시된 마이크로캡슐 나노튜브 장치를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 리포솜 전달 비히클 내에 함유된다. 용어 "리포솜"은 구형 이중층 또는 이중층들로 배열된 양극성 지질로 구성된 소수포를 의미한다. 리포솜은 친유성 물질로부터 형성된 막 및 수성 내부를 갖는 단일막 또는 다중막 소수포이다. 수성 부분은 전달될 조성물을 함유한다. 양이온 리포솜은 세포 벽에 융합될 수 있는 이점을 보유한다. 비-양이온 리포솜은 세포 벽과 효율적으로 융합될 수 없지만, 생체내에서 대식세포에 의해 흡수된다.
리포솜의 몇몇 이점은 이들의 생체적합성 및 생물분해성, 광범위한 수용성 및 지용성 약물의 혼입을 포함하고; 이들은 대사 및 분해로부터 캡슐화된 약물에 대한 보호를 제공한다. 리포솜 제형의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소수포 크기, 및 리포솜의 수성 부피이다.
리포솜은 작용 부위에 대한 활성 성분의 이동 및 전달을 위해 유용하다. 리포솜 막은 생체막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포솜이 조직에 적용될 때, 리포솜은 세포막과 통합되기 시작하고 리포솜 및 세포의 통합이 진행될수록, 리포솜 내용물은 활성제가 작용할 수 있는 세포 내로 흐른다.
본 발명에서 사용하기 위한 리포솜을 제조하기 위한 방법은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Bangham et al., "Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids," J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965); Hsu에 대한 미국 특허 제5,653,996호; Lee et al.에 대한 미국 특허 제5,643,599호; Holland et al.에 대한 미국 특허 제5,885,613호; Dzau & Kaneda에 대한 미국 특허 제5,631,237호, 및 Loughrey et al.에 대한 미국 특허 제5,059,421호에 개시된 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 전달 비히클은 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 핵산 분자의 전달에 특히 적합하지만, 또한 이중-기능적 치료제를 코딩하는 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 유전자 요법 벡터는, 비제한적으로, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 헤르페스 바이러스 벡터를 포함한다.
아데노바이러스 벡터 전달 비히클은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Berkner, "Development of Adenovirus Vectors for the Expression of Heterologous Genes," Biotechniques 6:616-627 (1988), Rosenfeld et al., "Adenovirus-Mediated Transfer of a Recombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene to the Lung Epithelium In Vivo," Science 252:431-434 (1991), Curiel et al.에 대한 WO 93/07283호, Perricaudet et al.에 대한 WO 93/06223호, 및 Curiel et al.에 대한 WO 93/07282호에 기재된 바와 같이 용이하게 제조되고 이용될 수 있다. 아데노-연관 바이러스 전달 비히클은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Shi et al., "Therapeutic Expression of an Anti-Death Receptor-5 Single-Chain Fixed Variable Region Prevents Tumor Growth in Mice," Cancer Res. 66:11946-53 (2006); Fukuchi et al., "Anti-Aβ Single-Chain Antibody Delivery via Adeno-Associated Virus for Treatment of Alzheimer's Disease," Neurobiol. Dis. 23:502-511 (2006); Chatterjee et al., "Dual-Target Inhibition of HIV-1 In Vitro by Means of an Adeno-Associated Virus Antisense Vector," Science 258:1485-1488 (1992); Ponnazhagan et al., "Suppression of Human Alpha-Globin Gene Expression Mediated by the Recombinant Adeno-Associated Virus 2-Based Antisense Vectors," J. Exp. Med. 179:733-738 (1994); 및 Zhou et al., "Adeno-associated Virus 2-Mediated Transduction and Erythroid Cell-Specific Expression of a Human Beta-Globin Gene," Gene Ther. 3:223-229 (1996)에 기재된 바와 같이 세포에 본 발명의 이중-기능적 치료제를 전달하기 위해 구축되고 사용될 수 있다. 이들 비히클의 생체내 사용은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Flotte et al., "Stable in Vivo Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator With an Adeno-Associated Virus Vector," Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:10613-10617 (1993) 및 Kaplitt et al., "Long-Term Gene Expression and Phenotypic Correction Using Adeno-Associated Virus Vectors in the Mammalian Brain," Nature Genet. 8:148-153 (1994)에 기재되어 있다. 아데노바이러스 벡터의 추가 유형은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Wickham et al.에 대한 미국 특허 제6,057,155호; Bout et al.에 대한 미국 특허 제6,033,908호; Wilson et al.에 대한 미국 특허 제6,001,557호; Chamberlain et al.에 대한 미국 특허 제5,994,132호; Kochanek et al.에 대한 미국 특허 제5,981,225호; Spooner et al.에 대한 미국 특허 제5,885,808호; 및 Curiel에 대한 미국 특허 제5,871,727호에 기재되어 있다.
감염 형질전환 시스템을 형성하기 위해 변형된 레트로바이러스 벡터가 또한 사용되어, 표적 세포에 핵산 분자를 전달할 수 있다. 레트로바이러스 벡터의 하나의 이러한 유형은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Kriegler et al.에 대한 미국 특허 제5,849,586호에 개시되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 핵산 전달 비히클은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Lu et al.에 대한 미국 특허 공개 제20070219118호에 개시된 것을 포함한다.
이용되는 감염 형질전환 시스템의 유형과 관계 없이, 이는 소망하는 세포 유형에 대한 핵산의 전달을 위해 표적화되어야 한다. 예를 들어, 세포(예를 들어, 암 세포)의 집락 내로의 전달을 위해 높은 역가의 감염 형질전환 시스템이 상기 세포의 부위 내로 직접 주사되어, 세포 감염의 가능성을 향상시킬 수 있다. 감염된 세포는 그 다음에, 종양-연관된 항원을 표적화하는 핵산 분자를 발현할 것이다. 발현 시스템은 표적 조직 또는 세포에서 핵산 분자의 발현의 강도 및 특이성을 제어하거나 조절하기 위해 프로모터를 추가로 함유할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물의 유효 용량은 대사 질환의 치료를 위해 암의 유형 및 단계, 투여의 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 투여되는 다른 의약 또는 요법, 및 다른 의학적 합병증에 대한 환자의 신체적 상태를 포함한 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 이중-기능적 치료제의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 소망하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간에 대해 효과적인 양을 지칭한다. 이중-기능적 치료제의 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 소망하는 반응을 유도하는 이중-기능적 치료제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 이중-기능적 치료제의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 큰 것이다. "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 측정가능 파라미터를, 예를 들어 종양 성장률을 미처치된 대상체에 대해 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 측정가능 파라미터, 예를 들어 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능이 예측되는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 특성은 통상의 기술자에게 알려진 분석에 의한 시험관내 억제와 같이 억제하는 화합물의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다.
"예방적 유효량"은 소망하는 예방 효과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간에 대해 효과적인 양을 지칭한다. 통상적으로, 예방적 용량은 질환의 초기 단계 전에 또는 초기 단계에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량에 비해 적을 것이다.
특정 실시양태에서, 투여 단계는 뉴클레오티드 당 우리딘 디포스페이트 갈락토오스(UDP-gal), 우리딘 디포스페이트-N-아세틸갈락토스아민(UDP-NAcGal), 및/또는 구아노신 디포스페이트-푸코오스(GDP-푸코오스)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
UDP-gal, UDP-NAcGal, 및/또는 GDP-푸코오스는, 비제한적으로, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 구강, 직장, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 경로를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, UDP-gal, UDP-NAcGal, 및/또는 GDP-푸코오스는 이중-기능적 표적화된 효소와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 후자의 경우, 즉 후속 투여에서, 표적화된 효소와 뉴클레오티드 당 사이의 간격은 1 분 내지 1 주의 범위일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 간격은 1 분 내지 48 시간의 범위이다.
본원에 기재된 이중-기능적 치료제는 다른 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "조합하여" 투여되는 것은 2 개(또는 그 이상)의 상이한 치료가 장애를 갖는 대상체의 고통의 과정 동안 대상체에 전달되는 것, 예를 들어 대상체가 장애로 진단된 후 및 장애가 치유되거나 제거되거나 치료가 다른 이유로 중단되기 전에 2 이상의 치료가 전달되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 제2 전달이 개시될 때 여전히 발생하고 있어, 투여의 측면에서 중첩이 있다. 이는 본원에서 "동시(simultaneous)" 또는 "동시(concurrent) 전달"로서 지칭된다. 다른 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 개시되기 전에 종료된다. 일부 실시양태에서, 치료는 조합된 투여 때문에 더욱 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 더욱 효과적이고, 예를 들어 동등한 효과가 적은 제2 치료로 나타나거나, 제2 치료가 제1 치료의 부재 하에 투여되는 경우 나타날 것에 비해 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 유사한 상황이 제1 치료로 나타난다. 일부 실시양태에서, 전달은 증상에서의 감소, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터가 다른 것의 부재 하에 전달된 하나의 치료로 관찰될 것에 비해 크도록 이루어진다. 2 개 치료의 효과는 부분적으로 가산적이거나, 전체적으로 가산적이거나, 가산적인 것에 비해 클 수 있다. 전달은 제2 치료가 전달될 때, 전달된 제1 치료의 효과가 여전히 검출가능하도록 이루어질 수 있다.
예시적 치료제는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신, 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄시놀(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,208,020호 참고), CC-1065(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,475,092호, 제5,585,499호, 제5,846,545호 참고) 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는, 비제한적으로, 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타르닌, 티오에파 클로람부실, CC-1065, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(예전에, 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(예전에, 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 탁솔 및 마이탄시노이드)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 수술, 방사선, 냉동수술, 및/또는 온열요법을 포함한 다른 치료적 치료 양식과 조합하여 투여된다. 이러한 병용 요법은 낮은 투여량의 투여된 치료제를 유리하게 이용할 수 있으며, 따라서 가능한 독성 또는 다양한 단일요법과 연관된 합병증을 회피할 수 있다.
다른 실시양태에서, 이중-기능적 치료제는 면역조절제, 예를 들어 IL-1, IL-24, IL-6, 또는 IL-12, 또는 인터페론 알파 또는 감마와 조합하여 투여된다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 이중-기능적 치료제를 코딩하는 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 분자를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이의 조합, 단일- 및/또는 이중-가닥, 또는 폴리뉴클레오티드의 천연 또는 안정화된 형태, 예를 들어 포스포로티오에이트 백본을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있고 이는 이중-기능적 치료제를 코딩하는 한 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 물론, 천연 발생 펩티드 결합에 의해 결합된 천연 발생 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩가능하다. 본 발명의 또 추가 양태는 본 발명에 따른 이중-기능적 치료제를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 상보적 결합 말단을 통해 벡터에 폴리뉴클레오티드, 특히 DNA를 연결하기 위해 다양한 방법이 개발되었다. 예를 들어, 상보적 호모폴리머 관이 DNA 세그먼트에 첨가되어, 벡터 DNA에 삽입될 수 있다. 벡터 및 DNA 세그먼트는 그 다음에 상보적 호모폴리머 꼬리 사이의 수소 결합에 의해 결합되어, 재조합 DNA 분자를 형성한다.
하나 이상의 제한 부위를 함유하는 합성 링커는 벡터에 DNA 세그먼트를 결합하는 대안적 방법을 제공한다. 다양한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커는 International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, USA를 포함한 다수의 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 이중-기능적 치료제를 코딩하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Higuchi et al., "A General Method of In Vitro Preparation and Specific Mutagenesis of DNA Fragments: Study of Protein and DNA Interactions," Nucleic Acids Res. 16(15):7351-67 (1988)에 의해 개시된 바와 같은 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용한다. 이 방법은 예를 들어, 적합한 제한 부위에서의 조작에 의해 DNA를 적합한 벡터 내로 도입하기 위해 사용될 수 있거나, 당업계에 알려진 바와 같은 다른 유용한 방식으로 DNA를 변형하는 것이 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 바람직하거나, 비-바람직한 코돈을 갖는 것에 대해, 특정 발현 시스템에 대해 선택될 수 있다. 예로서, 핵산은 적어도 하나의 코돈, 바람직하게는 적어도 10% 또는 20%의 코돈이 변경되어, 서열이 E. coli., 효모, 인간, 곤충, NS0, 또는 CHO 세포에서의 발현을 위해 최적화되는 것일 수 있다.
통상적으로, 이중-기능적 치료제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 소망하는 숙주 세포에서 기능적인 프로모터의 제어 하에 위치한다. 광범위한 다양한 프로모터가 잘 알려져 있으며, 특정 개시내용에 따라, 본 발명의 발현 벡터에서 사용될 수 있다. 보통, 선택된 프로모터는 프로모터가 활성일 세포에 의존한다. 다른 발현 제어 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위, 전사 종결 부위 등이 또한 선택적으로 포함된다. 이들 제어 서열 중 하나 이상을 포함하는 구축물은 "발현 벡터"로 지칭된다. 따라서, 본 발명은 이중-기능적 치료제를 코딩하는 핵산 분자가 소망하는 숙주 세포에서 고수준 발현을 위해 혼입되는 발현 벡터를 제공한다.
특정 숙주 세포에서 사용하기에 적합한 발현 제어 서열은 보통 상기 세포에서 발현되는 유전자를 클로닝함으로써 얻어진다. 리보솜 결합 부위 서열과 함께, 선택적으로 오퍼레이터를 갖는 전사 개시를 위한 프로모터를 포함하는 것으로 본원에 정의되는, 일반적으로 사용되는 원핵생물 제어 서열은 이러한 일반적으로 사용되는 프로모터, 예컨대 베타-락타마아제(페니실리나아제) 및 락토오스(lac) 프로모터 시스템(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Change et al., Nature 198:1056 (1977)), 트립토판(trp) 프로모터 시스템(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)), tac 프로모터(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25 (1983)); 및 람다-유래된 PL 프로모터 및 N-유전자 리보솜 결합 부위(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Shimatake et al., Nature 292:128 (1981))를 포함한다. 그러나, 원핵생물에서 기능하는 임의의 이용가능한 프로모터가 사용될 수 있다.
E. coli 이외의 원핵생물 세포에서 이중-기능적 치료제의 발현을 위해, 특정 원핵생물 종에서 기능하는 프로모터가 요구된다. 이러한 프로모터는 종으로부터 클로닝된 유전자로부터 얻어질 수 있거나, 이종 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 trp-lac 프로모터는 E. coli와 함께 바실루스(Bacillus)에서 기능한다.
리보솜 결합 부위(RBS)는 본 발명의 발현 카세트에 편리하게 포함된다. E. coli에서 RBS는 예를 들어, 개시 코돈의 3-11 개 뉴클레오티드 상부에 위치한 길이가 3-9 개 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열로 구성된다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Shine and Dalgarno, "Determinant of Cistron Specificity in Bacterial Ribosomes," Nature 254:34-38 (1975); Steitz, In Biological regulation and development: Gene expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, New York)).
포유동물 세포에 대해, 제어 서열은 프로모터 및 바람직하게는 면역글로불린 유전자, SV40, 거대세포바이러스 등으로부터 유래된 인핸서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 것이고, 스플라이스 공여체 및 수용체 서열을 포함할 수 있다.
구성적 또는 조절된 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 조절된 프로모터가 유리할 수 있으며, 이는 이중-기능적 치료제의 발현이 유도되기 전에 숙주 세포가 높은 밀도로 성장할 수 있기 때문이다. 이종 단백질의 고수준 발현은 일부 상황에서 세포 성장을 늦춘다. 유도성 프로모터는 유전자의 발현을 지시하는 프로모터이며, 발현의 수준은 예를 들어, 온도, pH, 무산소 또는 유산소 조건, 빛, 전사 인자 및 화학물질과 같은 환경적 또는 발달 인자에 의해 변경가능하다. 이러한 프로모터는 본원에서 "유도성" 프로모터로 지칭되며, 이는 이중-기능적 치료제의 발현의 시기를 제어하게 한다. E. coli 및 다른 세균 숙주 세포에 대해, 유도성 프로모터는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 이들은 예를 들어, lac 프로모터, 박테리오파지 람다 PL 프로모터, 하이브리드 trp-lac 프로모터(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Amann et al. Gene 25:167 (1983); de Boer et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:21 (1983)), 및 박테리오파지 T7 프로모터(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Studier et al. J. Mol. Biol (1986).; Tabor et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82: 1074-8 (1985))를 포함한다.
선택가능 마커는 보통 본 발명의 이중-기능적 치료제를 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 내로 혼입된다. 이들 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장한 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장을 위해 필요한 유전자 생산물, 예컨대 단백질을 코딩할 수 있다. 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 않을 것이다. 통상적인 선택 유전자는 암피실린, 네오마이신, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린과 같은 항생제 또는 다른 독소에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩한다. 대안적으로, 선택가능 마커는 영양요구성 결핍을 보완하거나 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 핵심 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세미화효소를 코딩하는 유전자를 코딩할 수 있다. 보통, 벡터는 E. coli, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되기 전에 복제되는 다른 세포에서 기능적인 하나의 선택가능 마커를 가질 것이다. 다수의 선택가능 마커가 통상의 기술자에게 알려져 있다.
상기 열거된 구성요소 중 하나 이상을 함유하는 적합한 핵산 구축물의 구축은 상기 원용된 참고문헌에 기재된 바와 같은 표준 결찰 기술을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 절단되고, 맞춤화되고, 소망하는 형태로 재-결찰되어, 요구되는 핵산 구축물(예를 들어, 플라스미드)을 생성한다. 구축된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위해, 플라스미드는 표준 기술에 의해, 예컨대 제한 엔도뉴클레아제 분해, 및/또는 알려진 방법에 따른 서열분석에 의해 분석될 수 있다. 이들 목적을 달성하기 위한 분자 클로닝 기술이 당업계에 알려져 있다. 재조합 핵산의 구축에 적합한 광범위한 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법이 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 많은 클로닝 연습을 통해 통상의 기술자를 지시하기에 충분한 이들 기술 및 설명의 예는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); 및 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement) (Ausubel)에서 발견된다.
본 발명의 핵산 구축물 및 발현 벡터를 구축하기 위한 출발 물질로서 사용하기에 적합한 다양한 공통 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 세균에서 클로닝을 위해, 공통 벡터는 pBR322 유래된 벡터, 예컨대 pBLUESCRIP™, 및 λ-파지 유래된 벡터를 포함한다. 효모에서, 벡터는 효모 통합 플라스미드(예를 들어, YIp5) 및 효모 복제 플라스미드(YRp 시리즈 플라스미드) 및 pGPD-2를 포함한다. 포유동물 세포에서 발현은 pSV2, pBC12BI, 및 p91023을 포함한 다양한 일반적으로 이용가능한 플라스미드뿐 아니라, 용해 바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 및 바큘로바이러스), 에피솜 바이러스 벡터(예를 들어, 소유두종바이러스), 및 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 레트로바이러스)를 사용하여 달성될 수 있다.
핵산은 그 다음에 본 발명의 이중-기능적 치료제를 포함하는 폴리펩티드를 생산하기에 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이중-기능적 치료제를 코딩하는 핵산은 알려진 기술에 따라 사용되고, 본원에 함유된 교시의 측면에서 적절하게 변형되어, 발현 벡터를 구축할 수 있고, 이는 그 다음에 본 발명의 이중-기능적 치료제의 발현 및 생산을 위해 적절한 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용된다. 이러한 기술은 하기에 기재되고 또한 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,440,859호, 제4,530,901호, 제4,582,800호, 제4,677,063호, 제4,678,751호, 제4,704,362호, 제4,710,463호, 제4,757,006호, 제4,766,075호, 및 제4,810,648호에 개시된 것을 포함한다.
선택된 숙주 세포 내로 발현 벡터를 도입하기 위한 방법은 특별히 핵심적이지 않고, 이러한 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 염화칼슘 형질전환에 의해 E. coli를 포함하는 원핵생물 세포 내로, 및 인산칼슘 처치 또는 전기천공에 의해 진핵생물 세포 내로 도입될 수 있다. 다른 형질전환 방법이 또한 적합하다.
본 발명의 이중-기능적 치료제는 또한 다른 세균 단백질에 추가로 연결될 수 있다. 이 접근법은 보통 높은 수율을 야기하며, 이는 정상 원핵생물 제어 서열이 전사 및 번역을 지시하기 때문이다. E. coli에서, lacZ 융합은 보통 이종 단백질을 발현하기 위해 사용된다. 적합한 벡터, 예컨대 pUR, pEX, 및 pMR100 시리즈가 용이하게 이용가능하다. 특정 적용에서, 정제 후 융합 단백질로부터 비-효소 아미노산을 절단하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 사이아노젠 브로마이드, 프로테아제에 의하거나, 인자 Xa 에 의한 절단을 포함한, 당업계에 알려진 몇몇 방법 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Itakura et al., Science (1977) 198: 1056; Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 106; Nagai et al., Nature (1984) 309: 810; Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 561 참고). 절단 부위는 소망하는 절단 지점에서 융합 단백질에 대한 유전자로 조작될 수 있다.
하나 초과의 이중-기능적 치료제는 단일 발현 벡터에서 다중 전사 카세트를 위치시킴으로써, 또는 클로닝 전략에서 이용되는 발현 벡터 각각에 대한 상이한 선택가능 마커를 이용함으로써 단일 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
이중-기능적 치료제는 암모늄 설페이트 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 당업계에 알려진 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. New York (1990) 참고). 적어도 약 70 내지 90% 동질성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 동질성이 가장 바람직하다. 예로서, 이중-기능적 치료제의 표적화 구성요소가 항체일 때, 항체 결합 크로마토그래피, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 둘 다일 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피의 유형은, 비제한적으로, Q Sepharose Fast Flow®, MacroPrep High Q Support®, DEAE Sepharose Fast Flow®, 및 Macro-Prep DEAE®을 포함한다. 양이온 교환 크로마토그래피의 유형은, 비제한적으로, SP Sepharose Fast Flow®, Source 30S®, CM Sepharose Fast Flow®, Macro-Prep CM Support®, 및 Macro-Prep High S Support®을 포함한다.
본 발명의 이중-기능적 치료제의 정제를 용이하게 하기 위해, 이중-기능적 치료제를 코딩하는 핵산은 또한 에피토프 또는 친화도 결합 시약이 이용가능한 "태그", 즉 정제 태그에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 적합한 에피토프의 예는 myc 및 V-5 리포터 유전자를 포함하고; 이들 에피토프를 갖는 융합 단백질의 재조합 생산을 위해 유용한 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, Invitrogen (Carlsbad Calif.) 벡터 pcDNA3.1/Myc-His 및 pcDNA3.1/V5-His가 포유동물 세포에서 발현에 적합함). 태그를 본 발명의 이중-기능적 치료제에 부착하기에 적합한 추가 발현 벡터, 및 대응하는 검출 시스템은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 몇몇은 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, "FLAG" (Kodak, Rochester N.Y.)). 적합한 태그의 다른 예는 금속 킬레이트 친화도 리간드에 결합할 수 있는 폴리히스티딘 서열이다. 통상적으로, 6 개 인접 히스티딘이 사용되지만, 6 개 초과 또는 미만을 사용할 수 있다. 폴리히스티딘 태그에 대한 결합 모이어티로서 제공될 수 있는 적합한 금속 킬레이트 친화도 리간드는 니트릴로-트리-아세트산(NTA)을 포함한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Hochuli, E. (1990) "Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents" In Genetic Engineering: Principles and Methods, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, New York; Qiagen(Santa Clarita, Calif.)으로부터 상업적으로 이용가능함).
정제 태그는 또한 말토오스 결합 도메인 및 전분 결합 도메인을 포함한다. 말토오스 결합 도메인 단백질의 정제는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 전분 결합 도메인은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 WO 99/15636호에 기재되어 있다.
실시예
하기 실시예는 발명의 실시양태의 실시를 예시하는 것으로 의도되지만, 이의 범위를 제한하는 것으로 의도된 수단은 아니다.
물질 및 방법
세포주. 인간 전립선암 세포주 LNCaP 및 PC3를 미국형 배양물 보관소(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)로부터 구매하였다. CWR22Rv1은 Thomas Pretlow, MD, 케이스 웨스턴 리저브 대학교(Case Western Reserve University)로부터의 기증품이었다. 유방암 세포주 MDA-MB-361은 Christel Larbouret(몽펠리에 암 연구소(Institute of Cancer Research of Montpellier)(France))로부터의 기증품이었다. LNCaP, PC3 및 CWR22Rv1을 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 열 비활성화된 소태아혈청(FBS)이 보충된 RPMI1640 배지에서 유지하였다(모든 보충제는 Gemini Bio-products, West Sacramento, CA로부터의 것임). MDA-MB-361을 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 20% FBS가 보충된 L-15 배지(ATCC)에서 유지하였다.
항체. 뮤린 및 탈-면역화된 단클론 항체(mAb) J591 항-FOLH1/PSMA를 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Liu et al., "Monoclonal Antibodies to the Extracellular Domain of Prostate Specific Membrane Antigen Also React With Tumor Vascular Endothelium," Cancer Res. 57:3629-3634 (1997), Bander et al.에 대한 미국 특허 제7,045,605호, 및 Bander et al.에 대한 미국 특허 제7,514,078호에 기재된 바와 같이 생성하였다. MAb 3E6 항-PSMA, 꽃양배추 퍼옥시다아제-표지된 폴리머 접합된 염소 항-마우스 Ig 및 꽃양배추 퍼옥시다아제 접합된 토끼 항-인간 IgG를 Dako(Carpinteria, CA)로부터 구매하였다. MAb 4D5를 Herceptin(Genentech/Roche)으로서 구매하였다. MAb 항-A 및 항-B 항체를 Ortho Diagnostic Systems(Raritan, NJ)로부터 구매하였다. O/H 항원의 검출을 위해 알파-연결된 푸코오스 잔기를 인식하는 울렉스 에우로파에우스(Ulex europaeus) 렉틴을 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. 당나귀 항-인간 IgG, 꽃양배추 퍼옥시다아제-접합된 당나귀 항-인간 IgG, 알칼린 포스파타아제-접합된 당나귀 항-인간 IgG, FITC-접합된 당나귀 항-마우스 Ig 및 FITC-접합된 당나귀 항-인간 Ig를 Jackson ImmunoResearch Laboratories(West Grove, PA)로부터 구매하였다. 항-Flag M2는 Sigma-Aldrich로부터의 것이었다. IRDye 800CW-염소 항-마우스 이차 항체를 LI-COR Biosciences(Lincoln, Nebraska)로부터 구매하였다.
이 연구에서 사용된 DNA 플라스미드. 일련의 플라스미드를 하기 실시예에 개요 서술된 바와 같이 임의의 소망하는 표적화 Ab 또는 Ab 구축물 또는 펩티드 + 비제한적으로, GTB, GTA 및 푸코실트랜스퍼라아제(FUT1 또는 FUT2)를 포함하는 임의의 글리코실트랜스퍼라아제에 대해 구축할 수 있다.
DNA 플라스미드 및 형질주입 또는 공동-형질주입 후 숙주 세포에서 과잉-발현된 이들의 단백질 생산물이 간략한 설명과 함께 하기에 열거된다. 각각의 플라스미드가 다음과 같이 기재된다: DNA 플라스미드(이의 단백질 생산물)의 지정: 간략한 설명. pMG 145(H 쇄): 숙주 세포 내로의 이 플라스미드의 형질주입은 huJ591 중쇄를 생성한다. pMG 135(L 쇄): 이 플라스미드의 형질주입은 huJ591 경쇄(L)를 생성한다. pMG 145 및 pMG 135(huJ591 항체): 이들 2 개 플라스미드의 공동-형질주입은 중쇄 및 경쇄 및 기능적 huJ591 항체의 공동-발현을 야기한다. pMG 181(H 쇄-GTB): 이 플라스미드의 형질주입은 N-말단에서 huJ591 중쇄(H) 및 C-말단에서 GTB를 갖는 융합 단백질을 생성한다(하기 참고). pMG 181 및 pMG 135(huJ591-GTB 융합 항체): 이들 2 개 플라스미드의 공동-형질주입은 GTB를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 생산한다.
GTB 및 huJ591 또는 4D5 중쇄-GTB(H-GTB) 융합 발현 플라스미드의 구축. 촉매작용 도메인(아미노산 57-354)을 포함하는 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(GTB)의 영역을 주형으로서 GTB-코딩 플라스미드 pBBBB를 사용하는 PCR에 의해 서브클로닝하였다. 소망하는 경우, Flag 및 His 태그를 3' 말단에 첨가하여, 융합 단백질의 정제에 뒤따르거나 이를 도울 수 있다. 예를 들어, 항체-GTB 융합 단백질을 구축하기 위해, huJ591 중쇄(H)를 코딩하는 DNA 서열을 GTB 촉매작용 도메인 DNA 서열에 대해 결찰시켜, 플라스미드 pMG181을 야기하였다. 동일한 절차가 또한 이어져, 4D5-GTB 또는 임의의 Ab(또는 Ab 유도체 또는 펩티드)-GTB(또는 A 항원에 대한 GTA의 촉매작용 도메인)를 생성한다. 또는, H 항원의 합성을 표적화하기를 소망하는 경우에, FUT1 또는 FUT2의 촉매작용 도메인을 혼입할 수 있다. 글리코실트랜스퍼라아제 효소를 Ab 구축물의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서 우선적으로 결찰시킨다.
Ab 서열과 효소 서열 사이에, (G4S)3 스페이서 서열을 삽입하였다. 대안적으로, 다양한 융합 단백질 링커 또는 스페이서를 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Chen et al., "Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality," Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-69 (2013)에 의해 기재된 바와 같이 사용할 수 있다.
DNA 형질주입 및 융합 단백질 발현. huJ591-GTB(및 4D5-GTB에 대해 유사함) 융합 항체 생산을 위해, CHO 세포를 제조사의 지시에 따라 FreeStyle MAX(ThermoFisher scientific)를 사용하여 pMG181(H-쇄-GTB) 및 pMG135(L-쇄)로 공동-형질주입하였다. 융합 항체를 함유하는 상청액을 형질주입 후 5 일에 수집하고 Amicon Ultra 10K 원심분리 필터(Merck Millipore)에 의해 농축하였다.
과잉-발현된 융합 단백질의 정제. huJ591을 제조사의 지시에 따라 단백질 G-세파로오스(GE healthcare)를 사용하여 정제하였다. J591-GTB를 제조사의 지시에 따라 항-FLAG M2 친화도 겔(Sigma-Aldrich)을 사용하여 정제하였다. 간략하게는, 융합 단백질을 함유하는 상청액을 2 시간 동안 M2 친화도 겔과 함께 항온처리한 후, 세척하고, 3xFLAG 펩티드(Sigma-Aldrich)로 용출하고, PBS에 대한 투석이 이어졌다.
웨스턴 블롯 분석. 융합 단백질 또는 정제된 분획을 함유하는 상청액을 환원 및 비-환원 조건 하에 4-20% SDS-PAGE 겔(Life Technology)에 의해 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(PVDF)(Millipore, Billerica, MA)에 전달하였다. 막을 60 분 동안 5% 분유/PBST로 차단하였다. 항-flag M2를 60 분 동안 막과 함께 항온처리하였다. 세척 후, IRDye 800CW-염소 항-마우스 이차 항체를 60 분 동안 막과 함께 항온처리하였다. 세척 후, 막을 Odyssey 적외선 영상화 시스템(LI-COR Biosciences)을 사용하여 분석하였다.
면역염색. 세포(2x105/웰)를 실험 전에 24 시간 동안 12-웰 플레이트에서 커버 슬립 상에서 성장시켰다. 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 후, 3 회 PBS 세척이 이어졌다. 인간 조직-혈액형 항원의 검출을 위해, 뮤린 단클론 항-A 또는 항-B 항체를 RT에서 60 분 동안 첨가하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 60 분 동안 FITC-접합된 당나귀 항-마우스 면역글로불린과 함께 항온처리하고 PBS로 세척하였다. HBGA O의 발현을 RT에서 60 분 동안 세포를 FITC-접합된 울렉스 에우로파에우스 응집소와 함께 항온처리한 후, UV 현미경 하의 시각화에 의해 검출하였다. PSMA의 검출을 위해, huJ591을 RT에서 60 분 동안 첨가하였다. PBS 세척 후, 세포를 60 분 동안 FITC-접합된 항-인간 Ig로 염색하고 PBS로 세척하였다. 커버 슬립을 장착하고 UV 현미경 하에서 시험하였다.
이종이식편 종양으로부터의 조직 절편의 면역염색을 위해, 3E6을 파라핀 절편에서 PSMA 발현의 검출에 대해 사용하고, 동결 절편에 대해 huJ591을 사용하였다. 혈액형 항원에 대한 항체는 상기와 동일하였다. Histo-Clear에 슬라이드를 위치시킨 후, 등급화된 알코올을 통해 재수화시키고 Tris-완충 생리식염수-Tween 20(TBST)에서 세척함으로써 파라핀 절편을 탈파라핀화하였다. 탈파라핀화되고 재수화된 절편을 표적 회수 용액 pH 9.0(Dako)에 위치시키고 30 분 동안 수조(95-99oC)에서 가열하였다. 절편을 TBST에서 세척하였다. 퍼옥시다아제 블록을 5 분 동안 첨가하였다. TBST에서 세척한 후, mAb를 RT에서 60 분 동안 첨가하였다. 항체 결합을 퍼옥시다아제-표지된 폴리머 접합된 염소 항-마우스 Ig 및 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 기질을 사용하여 검출하였다. 절편을 10% 헤마톡실린으로 대조염색한 후 시각화하였다. 동결 절편을 생체내에서 세포 표면 PSMA에 결합된 J591-GTB 융합 항체의 검출을 위해 사용하였다. 동결 절편을 10 분 동안 사전-냉각된 아세톤으로 고정한 다음에, PBS에서 세척하였다. 퍼옥시다아제 블록을 5 분 동안 첨가하였다. PBS에서 세척한 후, J591-GTB를 꽃양배추 퍼옥시다아제 접합된 토끼 항-인간 IgG 후, 상기 기재된 바와 같이 DAB 및 대조염색으로 검출하였다. huJ591과 직접 항온처리된 절편을 양성 대조군으로서 사용하였다.
경쟁 ELISA. 플레이트를 0.05 M 카보네이트 완충액(pH 9.5) 중 15 ㎍/mL의 7E11 항체(PSMA의 N-말단/세포질 도메인에 결합하는 항체)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰을 RT에서 30 분 동안 PBS에서 2% HAS로 차단하고 세척하였다. 1:8 희석의 LNCaP 세포 용해물(PSMA를 함유함)을 RT에서 60 분 동안 첨가하였다. PBS로 세척한 후, 뮤린 J591 항체의 연속 희석액(30 μL)을 60 분 동안 첨가한 다음에, 밤새 4℃에서 J591-GTB 또는 huJ591을 함유한 상청액(1.6 ㎍ Ig/mL; 30 μL)과 함께 공동-항온처리하였다. 세척한 후, 당나귀 항-인간 IgG-알칼린 포스파타아제(1:1,000)를 RT에서 60 분 동안 첨가하였다. 세척한 후, 플레이트를 pNPP(Sigma)와 함께 항온처리하고 405 nm에서 판독하였다.
시험관내 혈액형 항원 전환. 세포(2x105)를 24 시간 동안 12-웰 플레이트에서 커버 슬립 상에서 성장시켰다. 커버 슬립을 PBS로 세척하고 습식 챔버로 전달하였다. 세포를 그 다음에 37℃에서 30 분 동안 huJ591-GTB(또는 4D5-GTB) 융합 항체 + UDP-갈락토오스와 함께 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 PFA로 고정하였다. 세포 표면 상의 B 항원 전환을 상기 기재된 바와 같은 면역염색에 의해 검출하였다.
시험관내 에서 HBGA B로의 암 세포 전환 후 정상 인간 O 또는 A 혈청의 용해 활성. LNCaP 세포를 60 웰 미량역가 플레이트 상에서 성장시켰다. 세포를 천연 J591 또는 J591-GTB 융합 단백질과 함께 또는 약제 없이 항온처리하였고; 모든 웰에는 또한 UDP-gal이 주어졌다. 그 후에, A 또는 O 형 환자로부터의 혈청을 천연 항-B Ab 및 보체의 공급원으로서 첨가하였고; 대조군 웰에는 GTB가 없는 J591이 주어지거나 혈청이 주어지지 않았다. 3 시간 후, 웰을 세척하고, 메탄올로 고정하고 세척 및 판독 전에 25 분 동안 2% 김자 염색(Giemsa stain)과 함께 항온처리하였다. 유사한 방법을 사용하여, 현탁액 중 전립선 및 유방암 세포주의 큰 패널을 시험하였다. 용해 활성을 트리판 블루 배제 및 FACS에 의해 측정된 프로피디움 아이오다이드 흡수 둘 다에 의해 평가하였다.
생체내 혈액형 항원 전환.
동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)(IUCUC)-승인된 프로토콜 하에, 6-8 주령의 NOD SCID 마우스(Charles River, Wilmington, MA)에 200 μL Matrigel(Corning Life Sciences, Bedford, MD)에 현탁된 5x106 세포를 피하로 주사하였다. 세포주 LNCaP, CWR22Rv1, PC3 및 MDA-MB-361을 동물 실험에서 사용하였다. 14 내지 21 일 후, 수립된 종양은 8 내지 10 mm 직경에 도달하였다. HuJ591, huJ591-GTB, 4D5, 또는 4D5-GTB를 정맥내로(IV) 또는 종양내로 주사하였다. UDP-gal을 IV, 복강내로(IP), 또는 피하로(SQ) 주사하였다. 마우스를 1, 2, 또는 3 일차에 안락사시키고 다른 기관을 수집하였다. 각각의 종양 절반을 OCT 화합물을 이용한 동결 절편을 위해 제조하고; 나머지 절반을 파라핀 절편의 제조를 위해 인산염-완충 포르말린에 위치시켰다. 면역염색은 상기 기재되어 있다.
NOD/SCID 마우스에서 복강내 이종이식편 모델을 또한 거세-저항성 인간 PC 세포주 C4-2-루시페라아제를 사용하여 개발하였다. 이 모델에서, 인간 혈장을 IP 주사하여, IV 경로를 사용할 때의 유체 과부하를 야기하지 않으면서 천연 Ab 및 보체를 제공할 수 있다. 10x106 C4-2-luc 세포의 IP 주사 및 생물-발광 영상화에 의한 종양 흡수를 학인한지 수일 후, 각각 생물-발광 광자 플럭스의 유사한 중앙/범위를 갖는 5 마리 동물의 2 개 그룹은 J591-GTB, UDP-gal 및 인간 O 형 혈청을 이용한 단일 IP 처치를 받았다. 대조군에 대해, O 형 혈청을 주사 전에 열-비활성화하였다. 각각의 동물의 총 플럭스를 대략 2 주 동안 3-4 일마다 측정하였다.
실시예 1 - 항체-글리코실트랜스퍼라아제 융합 단백질 생성
첫번째로, 종양 표적화된 Ab 및 글리코실트랜스퍼라아제, 다중 기능을 보유하는 고도의 다용도, 모듈식 시스템을 제공하는 원형 구축물로 구성된 키메라 단백질을 생성하였다: (1) Ab 특이성은 상이한 종양-연관된 항원의 표적화를 허용하기 위해 상호교환가능하다. 이러한 종양 항원 표적의 예는, 비제한적으로, FOLH1/PSMA, VEGFr, CD19, CD20, CD25, CD30, CD33, CD38, CD52, CD79, B-세포 성숙 항원(BCMA), 소마토스타틴 수용체(예를 들어, SSTR1-5), 5T4, gp100, CEA, 맘모글로빈 A, 멜란 A/MART-1, PSA, 티로시나아제, HER-2/neu, EGFr, hTERT, MUC1, 메소텔린, 넥틴-4, TROP-2, 및 당업계에 알려진 많은 다른 것을 포함한다. 구조의 표적화 부분은 무손상(전장 다이머)으로부터 모노머 단일 쇄 Ab 구조, Fab, Fab'2, scFv 또는 다른 Ab 단편 유도체, 예컨대 미니바디, 디아바디, 트리아바디 등으로 달라질 수 있다. 이들은 FcRn-결합 도메인을 유지하거나 결실시킬 수 있다. 대안적으로, 표적화 모이어티는 표적화된 항원에 결합하는 펩티드일 수 있고; 예는, 비제한적으로, FOLH1/PSMA에 결합하는 ACUPA (2-(3-((S)-5-아미노-1-카복시펜틸)우레이도) 펜탄디오산)과 같은 글루타메이트-요소-라이신 유도체, SSTR2에 결합하는 소마토스타틴 유도체, 증식하는 내피 세포 상에 발현되는 알파-v/베타-3 인테그린에 결합하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드 및 당업계에 알려진 다른 표적화 펩티드를 포함한다. 표적화제의 이들 변이체 및 이들의 상이한 물리적 특성은 상이한 약물동태학 및 생배분의 맞춤화를 허용한다. 예를 들어, 큰 분자 구축물, 예컨대 FcRn(신생 수용체) 결합 부위를 포함하는 전장, 무손상 Ab는 긴 혈장 및 전신 반감기를 가질 것이고 순환에서 유지되는 경향이 있을 것이고; 이들은 신장보다는 간을 통해 더욱 분비될 수 있을 것이고; 개재 정상 세포 층 및 단단한 접합으로 인해 정상 조직 내로 덜 침투할 수 있을 것이다. 반대로, 작고, FcRn 결합이 결여되고, 항체보다는 표적화 펩티드로 제조된 구축물은 짧은 반감기를 갖는 경향이 있을 것이고, 신장/요로을 통해 더욱 분비될 수 있을 것이고 정상 조직 및 종양을 더욱 용이하게 침투할 수 있을 것이다. 표적화 결합의 특이성과 함께, 이들 상이한 물리적 특성, PK 및 생배분은 구축된 약제의 유해 효과 프로파일에 영향을 줄 것이다. (2) 글리코실트랜스퍼라아제 구성요소는 천연 발생 대립유전자 변이체의 지식의 실질적 몸체 및 이의 기능성을 맞춤화하기 위해 개발될 수 있는 이들의 각각의 특성을 기초로 하여 달라질 수 있다. 이는 또한 인간에서 자연적으로 부재한 고도의 면역원성 알파-gal 에피토프를 생성하는 알파-gal-트랜스퍼라아제를 포함할 수 있다. 번역후 변형에 관련된 임의의 효소의 사용이 가능하다. 글리코실화와 함께, 다른 예는 인산화 및 지질화이다.
유전자 조작된 융합 단백질의 생성에 대한 추가 대안으로서, 2 개 개별 모이어티의 화학적 연결의 사용에 의한 표적화제 및 번역후 효소의 연결을 달성할 수 있다. 이러한 화학적 연결은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
초기 개념 증명 노력을 위해, 3 개의 잘 특징화된, 임상적으로 입증된 Ab를 선택하였다: J591(항-FOLH1/PSMA(엽산 가수분해효소-1/전립선-특이적 막 항원)), 4D5(트라스투주맙; 항-her2), 및 오벡셀리맙(항-CD19); 4 개 Ab 구조: 무손상 다이머, 무손상 모노머, Fab 및 scFv, 및 4 개 글리코실트랜스퍼라아제 변이체: α 1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(GTB; AF134414), 알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제(GTA; AF134415), α-1,3-갈락토실트랜스퍼라아제(α-1,3-GalT 또는 α-GalT; EC 2.4.1.87), 및 하기 기재된 완전 신규 구조. GTB는 갈락토오스 모이어티를 α1,3 연결에서 뉴클레오티드-공여체 UDP-gal로부터 수용체 H 항원으로 전달하여, Gal α (1-3)[Fuc α (1-2)]Gal β1,4 GlcNAc-R(HBGA B)을 형성하고; GTB는 활성을 위해 H 항원의 α1-2-연결된 푸코오스 변형을 요구하며, 이는 B 트랜스퍼라아제가 비변형된 2-형 전구체에 첨가되지 않기 때문이다. α-1,3-GalT는 갈락토오스 모이어티를 α1,3 연결에서 뉴클레오티드-공여체 UDP-gal로부터 Gal β1,4 GlcNAc-R로 전달하고; 이 효소는 활성을 위해 H 항원의 α1-2-연결된 푸코오스 변형을 요구하지 않는다. GTB를 선택하였으며, 이는 HBGA O 및 A 형 개체가 집단의 85-90%를 구성하고(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Galili et al., "A Unique Natural Human IgG Antibody With Anti-Alpha-Galactosyl Specificity," J. Exp. Med. 160:1519-1531 (1984)), 이전에 나타낸 바와 같이, 이들 개체가 높은 수준의 항-HBGA B 항체를 보유하기 때문이다. α-1,3-GalT를 선택하였으며, 이는 조혈 또는 간충직 세포로부터 유래된 것과 같은 H-항원을 형성하지 않는 세포에 말단 Gal을 첨가할 수 있기 때문이다. GTB의 선택은 이들의 실질적으로 동일한 구조의 결과로서 HBGA B와 교차-반응하는 높은 수준의 다클론 항-gal 활성(이종이식편의 초-급성 거부반응을 담당함)의 결과로서 추가로 유익하다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Macher et al., "The Gal alpha1,3Gal beta1,4GlcNAc-R (alpha-Gal) Epitope: a Carbohydrate of Unique Evolution and Clinical Relevance," Biochim. Biophys. 1780:75-88 (2008)). GTB(또는 GTA, α-GalT, 또는 FUT) 서열로부터, 효소적 활성을 위해 필요하지 않은 짧은 세포질, 막관통 및 줄기 영역을 삭제하고 각각의 항체(또는 유도체) 또는 키메라 단백질을 생성하는 펩티드 서열로 치환하였으며, 이의 막 결합은 원형질막 상에 위치한 이의 동족 항원에 결합하는 항체 또는 펩티드 도메인을 통해 재구축된다. 키메라 단백질의 ELISA 분석은 무손상 또는 항체 단편이 사용된지 여부와 관계 없이 무손상인 채로 유지되는 각각의 Ab 결합 특이성 및 면역반응성(도 2a-2b)을 확인하였다. UDP-14C-gal로부터 합성 기질(푸코실-락토오스(FL)) 내로의 14C-gal의 혼입을 또한 높은 GTB 활성의 유지를 확인한, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Yamamoto et al., "Amino Acid Residue at Codon 268 Determines Both Activity and Nucleotide-Sugar Donor Substrate Specificity of Human Histo-Blood Group A and B Transferases. In Vitro Mutagenesis Study," J. Biol.Chem. 271:10515-10520 (1996)에 의해 기재된 바와 같이 측정하였다(도 2a-2b).
유전자 조작에 의한 이러한 융합 단백질 생성과 함께, 통상의 기술자는 세포 단백질을 번역후 변형할 수 있는 이펙터 효소(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라아제)에 표적화 단백질, 펩티드 또는 다른 생물제제를 화학적으로 연결할 수 있다.
실시예 2 - 글리코실트랜스퍼라아제 활성의 기능성 맞춤화
A, B 및 O 대립유전자에 대한 깊은 지식은 이 구성요소의 기능성을 추가로 개선하기 위한 충분한 기회를 제공한다. 예를 들어, 선택될 수 있는 대안적 대립유전자 변이체는 2 개 최대 핵심 아미노산 잔기(GTA(leu 및 gly) 및 GTB(meth 및 ala)의 aa 266 및 268)가 상호교환되어, 하이브리드 서열(meth 및 gly)을 생성하는 소위 "시스 A,B" 서열이다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Yazer et al., "The 시스-AB Blood Group Phenotype: Fundamental Lessons in Glycobiology," Transfus. Med. Rev. 20:207-217 (2006)). 이 시스 A,B 효소 서열은 HBGA A 및 B 특이성 둘 다를 합성한다.
효소의 활성을 조절하여 이의 역가를 적정하게 하는 다른 서열이 알려져 있다. 예를 들어, GTB의 완전 신규 버전을 GTA의 2 개 천연 발생 돌연변이체 대립유전자를 기초로 하여 개발하였다(Ae101 및 A201로 지정됨). Ae101은 단일 염기 삽입을 갖고 A201은 단일 염기 결실을 갖고; 각각은 프레임시프트를 야기한다. 프레임시프트는 이들의 C-말단에서 각각 37 및 21 개 아미노산 연장을 갖는 트랜스퍼라아제를 생산한다. 이들 생성된 트랜스퍼라아제는 이들의 연장과 함께 30-50 배 이상 감소되는 효소적 활성을 갖는다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Yip, "Sequence Variation at the Human ABO Locus," Annals of Human Genetics 66:1-27 (2002)). 이들 2 개 돌연변이체 대립유전자는 GTA의 맥락에서 정의되었지만, 이러한 돌연변이체 대립유전자는 GTB의 경우에 기재되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 종결 코돈 전에 달라진 길이의 다양한 아미노산 서열을 삽입함으로써 C-말단 서열 연장을 GTB 내로 직접 혼입함으로써 완전 신규 서열을 생성하였다. 2, 7, 14 및 54 개 아미노산의 연장을 혼입한 GTB의 4 개 버전을 시험하였을 때, GTB 활성은 최대 93% 점진적으로 감소하여(도 3), 종양- 또는 조직-관련된 엔도프로테아제 또는 엔도펩티다아제, 예컨대 PSA, 금속단백분해효소 등의 존재 하에 연장을 폐기할 절단가능 서열을 혼입함으로써 상기 기재된 바와 같이 활성의 소망하는 수준으로 돌리거나 스위치를 끄고 켤 수 있는 메커니즘을 제공한다. 연장에 대한 선택적, 서열 선택은 의사의 선택에 있고, 이의 유일한 요구는 그것이 효소적 활성의 소망하는 수준을 달성하기 위해 선택되고, 이는 하기 기재된 바와 같이 측정될 수 있으며, 이는 비-면역원성이라는 것이다. 비-면역원성은 천연, 비-면역원성 단백질(예를 들어, 알부민)의 서열 정보를 사용함으로써 달성될 수 있거나 이는 면역원성을 구동하거나 결정하기 위해 당업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어 T-세포 결합 모티프를 제거함으로써 달성될 수 있다.
실시예 3 - 시험관내 유도된 HBGA B 동종항원 발현
구축물의 기능성을 나타내기 위해, 전부 자연적으로 HBGA O인 인간 전립선암 세포주 LNCaP(PSMA-높음), CWR22Rv1(PSMA-이종 및 낮음), 및 PC-3(PSMA-neg)을 키메라 J591(항-FOLH1/PSMA)-GTB 또는 J591(GTB 없음)과 함께 항온처리하였으며, 둘 다 UDP-gal을 갖고, 시험관내이고 SCID 마우스-유래된 이종이식편 조직 절편 상에 있었다. 키메라 J591-GTB + UDP-gal과 함께 항온처리된 세포주 및 조직 절편은 HBGA B로 전환된 반면, J591(GTB 없음) + UDP-gal과 함께 항온처리된 것은 그렇지 않았으며, 이는 GTB가 전환을 위해 필요하였다는 것을 나타낸다(도 4).
시험관내에서, J591-GTB는 LNCaP(PSMA-높음)를 HBGA O로부터 HBGA B로 전환시킨 한편, PC3(PSMA-neg)는 전환시키지 않았다(도 5). 높은 정도의 특이성의 HBGA 전환을 PSMA로 형질주입된 PC3 세포(PC3-PSMA)를 시험함으로써 확인하였다. PSMA를 이종으로 발현하는 이들 세포에서, PSMA-pos였던 세포만을 전환시켰고; 인접한 PSMA-neg 세포는 전환시키지 않았다(도 6).
HBGA O LNCaP 세포를 또한 O 형 전혈 + UDP-Gal 및 J591 또는 J591-GTB 또는 J591-GTB-54 아미노산 연장에서 공동-항온처리하엿다. 도 7에 나타낸 바와 같이, J591은 임의의 세포를 전환시키지 않은 한편, 연장을 갖거나 갖지 않는 J591-GTB는 LNCaP 세포를 O 형으로부터 HBGA B로 전환시켰지만, RBC는 그렇지 않았다.
실시예 4 - HBGA B로의 암 세포 전환 후 정상 인간 O 또는 A 혈청의 용해 활성
시험관내 분석을 사용하여, HBGA B 발현으로의 전환 후 전립선 또는 유방암 세포를 용해시키는 정상 인간 O 및 A 혈청의 용해 용량을 시험하였다. 도 8a-8d는 LNCaP 세포(HBGA O)가 항-B 및 보체 구성요소의 공급원으로서 J591-GTB + UDP-gal + 인간 A(또는 O 혈청)과 함께 항온처리될 때 용해된다는 것을 나타낸다. 인간 A 또는 O 혈청을 생략하고/하거나 J591-GTB를 GTB가 없는 J591로 치환하는 것은 용해를 야기하지 않았다.
트리판 블루 배제(도 9) 및 FACS 분석에 의한 프로피디움 아이오다이드의 흡수(도 10) 둘 다에 의해 전부 HBGA O인 전립선암 세포주의 큰 패널을 분석하였다. 이들 라인 중 4 개(LNCaP, VCaP, MDA-PCa-2b, 및 CWR22Rv1)는 높은 것에서 낮은 것까지 다양한 수준의 PSMA를 발현하며, 전부 J591-GTB + 천연 항-B Ab + 내인성 보체를 함유하는 인간 O 또는 A와 함께 항온처리되었을 때 용해되었다. PSMA-neg인 제5 세포주, PC3은 전환되지 않았고 용해되지 않았다(도 11a-11b). 유사한 결과를 키메라제 mAb 4D5-GTB에 의한 전환 후 유방암 세포주 MDA-MB-361로 얻었다.
실시예 5 - 생체내 HBGA 발현의 전환
HBGA-미스매치된 고형 기관 이식편의 급속 거부반응 및 파괴는 신장 동종이식편의 초기부터 인간에서 잘 기록되고 잘 수립된 현상이기 때문에(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 T. Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964); L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times. (2003)), 핵심 생체내 실험은 수립된 인간 암의 HBGA가 전신으로 투여된 종양-표적화된 접근법을 사용하여 종양 세포의 원형질막에 대해 골지/ER 내에서 정상적으로 기능하는, 동종이계 글리코실트랜스퍼라아제의 "분자 이식편"에 의해 고도의 면역원성 HBGA의 것으로 전환될 수 있는지를 결정하기 위한 것이다. 개념의 입증을 위해, 각각 고형 종양의 가장 일반적인 유형 중 2 개, 전립선 및 유방암으로부터 유래된 2 개의 임상적으로 잘 수립된 종양-연관된 항원(FOLH1/PSMA 및 HER2)을 선택하였다. 표적 발현 수준에서 광범위하게 발현하는 다중 종양 라인을 시험하였다. PSMA-pos 전립선암 LNCaP, C4-2 및 CWR22Rv1 및 her2-pos 유방암, MDA-MB361을 NOD SCID 마우스에서 피하 부위에서 수립하였다. J591-GTB 또는 4D5/트라스투주맙-GTB를 IV로 투여하였고; UDP-gal을 IV, IP 또는 피하 경로에 의해 투여하였다. J591-GTB 및 4D5/트라스투주맙-GTB는 각각 PSMA-pos 전립선암 및 her2-pos 유방암을 전환시켰다(도 10a-10h. 또한, 도 12a-12e 참고).
HBGA B 전환은 IV 또는 SQ 투여에 대해 UDP-gal의 IP 투여 후 열악하였다. HBGA 발현은 원형질막에서 명확하게 존재하였다. 예상된 바와 같이, Ab-GTB를 각각의 Ab 단독으로 치환하는 것은 HBGA B 발현을 야기하지 않았다. 전환은 임의의 다른 조직에서 검출가능하지 않았을 뿐 아니라, 동물은 독성의 임의의 증거를 발생시키지 않았다.
실시예 6 - 생체내 항-종양 활성
동물 모델에서 HBGA 발현의 Ab-GTB 지시된 전환으로부터 야기된 항-종양 활성을 표적화하는 것은 몇몇 장애물을 제시하였으며, 이는 마우스 및 래트 둘 다 시스 A,B 대립유전자뿐 아니라, α1,3 GalT 대립유전자를 발현하기 때문이다. 결과적으로, 이들 설치류 모델은 HBGA A- 및 B-양성 및 알파 1,3 gal-양성 둘 다이고, 따라서 이들 당-구조 전부에 대해 내성이 있다. 또한, 마우스는 비활성 보체계에 예외적으로 약하고(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Bergman et al., Cancer Immunol. Immunother. (2000) 49:259-266; Drake et al., "Passive Administration of Antiserum and Complement in Producing Anti-EL4 Cytotoxic Activity in the Serum of C57BL/6 Mice," J Natl. Cancer Inst. 50:909-14 (1973); Ong et al., "Mouse Strains With Typical Mammalian Levels of Complement Activity," J. Immunol. Methods 125:147-158 (1989)), 일부 경우에 인간을 포함한 다른 종의 보체 활성의 기능을 억제하기도 한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Ratelade et al., "Inhibitor(s) of the Classical Complement Pathway in Mouse Serum Limit the Utility of Mice as Experimental Models of Neuromyelitisoptica," Mol. Immunol. 62:104-113 (2014)). 사실, 정상 인간 혈장의 보체 활성을 C57BL/6 혈장의 존재 하에 분석하였으며 인간 보체 용해 활성이 대략 33% 감소되었다는 것을 발견하였다. 이들 동물 모델에서 천연 Ab의 부재 및 약하거나, 더욱 억제성인 보체계를 극복하기 위해, 필요한 천연 Ab 및 기능적 보체 단백질을 제공하기 위해 인간 O 또는 A 형 혈장을 이용한 동물의 혈장의 거의 완전 치환을 요구할 것이다. 이 혈장 치환은 신체적으로 비현실적이고, 유체 과부하를 야기하고, 인간 정상 상태를 반영하는 적절한 면역글로불린 생배분 평형을 제공하는데 실패하고, 천연 마우스 혈장의 억제 효과에 의해 절충될 것이다. 인간 혈장이 IP 주사되어, 유체 과부하를 야기하지 않으면서 천연 Ab 및 보체를 제공하는 거세-저항성 인간 PC 세포주 C4-2-루시페라아제를 사용하여 NOD/SCID 마우스에서 복강내 이종이식편 모델을 개발함으로서 이들 이슈를 극복하였다. 10x106 C4-2-luc 세포의 IP 주사 및 생물-발광 영상화에 의한 종양 흡수를 확인한 지 수일 후, 각각 생물-발광 광자 플럭스의 유사한 중앙/범위를 갖는 5 마리 동물의 2 개 그룹은 J591-GTB, UDP-gal 및 인간 O 형 혈청을 이용한 단일 IP 처치를 받았다. 대조군에 대해, O 형 혈청을 주사 전에 열-비활성화하였다. 각각의 동물의 총 플럭스를 대략 2 주 동안 3-4 일마다 측정하였다. 열-비활성화된 혈청을 받은 동물은 13 일차에 상당한 종양 진행을 경험한 반면, 활성 보체를 함유하는 혈청으로 처치된 동물은 대조군의 플럭스에 대해 80% 퇴행되었다(p=0.0032; 도 13a-13b). 이중 실험은 일관된 결과를 제공하였다(도 14a-14b).
실시예 1-6의 논의
암에 대한 면역 반응은 양립불가능한 동종이식편에 대한 반응과 현저히 상이하다. 본원에 기재된 바와 같이, 종양 세포를 선택적으로 변형하여, 비-자가, 고도의 면역원성 표현형을 발현-양립불가능한 HBGA 발현-하기 위한 전략이 제시된다. 인간에서 HBGA-양립불가능한 동종이식편의 신속하고 파괴적인 결과가 신장 동종이식편의 초기에 Starzl에 의해 이루어졌으며(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 T. Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964)), 공여체-수용체 매칭의 필수적이고 핵심적인 부분으로서 HBGA 양립성 시험을 야기하였다. 오차가 발생하고 HBGA 양립성 요구가 위반되는 드문 경우에만 이 교훈이 반복되고 강화된다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times (2003)).
전략을 실행하기 위해, 임상적으로 입증된 종양-제한된 항체(항-FOLH1/PSMA 및 항-HER2에 의해 예시됨)를 GTB에 융합하여, 단일, 이중-기능적 단백질을 생산하였다. 표적화된 글리코실트랜스퍼라아제(GT)를 다양한 항체 단편, 펩티드/리간드, 및 구축물을 사용하여 유사하게 구축하였다. 인간에서 양립불가능한 ABO 동종이식편의 결과는 잘 수립된 한편, 이 노력에서의 도전은 보통 골지에서 발견되는 번역후 글리코실트랜스퍼라아제 기능을 종양(또는 신생-혈관 내피) 세포 표면에 분자적으로 "이식"하고, 전신으로 투여되는 종양-표적화된 방식으로 수행하는 것이었다.
이들 키메라 단백질은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 다양한 암 세포주의 HBGA를 성공적으로 변경하였다. 비-표적 HBGA 전환 또는 독성은 동물 실험에서 나타나지 않았다. 본원에 나타낸 바와 같이, HBGA-양립불가능한 세포는 임상 이식 환경에서 여러 번 나타낸 바와 같이 암 환자에서 발생할 것으로 예상되는 반응인 보체-매개된 용해를 촉발시킨다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times (2003); T. Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964)).
신생-HBGA의 생합성은 첨가될 HBGA에 대해 표적 세포 당단백질 및 당지질 상의 GT 및 (푸코실화된) H 항원 "수용체 구조" 둘 다의 존재를 요구한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Milland et al., "ABO Blood Group and Related Antigens, Natural Antibodies and Transplantation," Tissue Antigens 68:459-466 (2006)). 폐, 위, 대장, 유방, 전립선, 난소, 방광, 췌장 등을 포함한 다수의 암종은 H 항원을 발현하기 때문에, 이들 종양 유형은 이 전략에 대한 후보일 것이다. 정상, 비-표적 세포는 (1) 표적화된 GTB(또는 GTA) 효소의 결합의 결여 및 (2) 이들 부위에서 GTB(또는 GTA) 트랜스퍼라아제 활성을 불가능하게 하는 많은 정상 세포 유형(예를 들어, 골수, 간, 비장, 신장, 심근, 중추 및 말초 신경계 등)으로부터 요구되는 H Ag의 부재로 인해 HBGA 전환을 겪지 않는다. FOLH1/PSMA 발현은 광범위한 다양한 종양의 종양 신생-혈관에서 보고되었지만 정상 조직 혈관에서는 부재하였다. FOLH1/PSMA-양성 신생-혈관을 갖는 종양 유형의 예는 신장, 폐, 결장, 위, 유방, 뇌, 췌장, 간, 방광 식도, 부신, 두경부, 흑색종 및 뇌 종양 등을 포함한다. 덜 일반적이지만, 가끔 FOLH1-양성은 고환, 림프 및 육종이다. 종양 신생-혈관에서 FOLH1/PSMA 발현을 표적화하는 것은 광범위한 다양한 종양의 혈관상 내에서 HBGA 발현을 변경하기 위한 수단을 제공한다. 이는 결국 잘못된 HBGA의 고형 조직 동종이식편에서 나타나는 초-급성 거부반응의 유사한 현상을 야기할 것이다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 L. Altman, Doctors Discuss Transplant Mistake. New York Times (2003); T. Starzl, Experience In Renal Transplantation. (WB Saunders Company, Philadelphia, PA, chapter 6 (1964) 참고).
반응의 효소적 특성은 증폭 효과를 제공하며, 이는 각각의 표적화된 효소 분자가 많은 수용체 분자를 전환시키기 때문이다. 또한, Ab-표적화된 종양-연관된 항원 자체가 효소적으로 전환될 뿐 아니라, 효소의 범위 내에 있는 모든 이웃 분자도 효소적으로 전환된다. 또한, 대부분의 세포 표면 분자는 다중 글리코실화 부위를 갖기 때문에-예를 들어, FOLH1/PSMA는 10 개 글리코실화 부위(FOLH1/PSMA가 호모-다이머로서 정상적으로 발현되는 것을 고려하는 경우, 20 개)를 가짐-이 접근법에 의해 생성될 수 있는 비-자가 HBGA 부위의 정량은 매우 상당하다. 또한, 표적화된 신생-혈관 또는 종양 세포에 의해 분비되는 당단백질은 또한 HBGA 전환을 거쳐, 종양 미세환경에서 보체 활성화를 야기하며, 이에 의해 종양 주위 면역 환경을 향상시킨다.
이들 상술한 인자-효소 증폭, 직접 표적화될 뿐 아니라, 이웃인 분자 및 분비된 당단백질 둘 다의 전환, 및 풍부한 글리코실화 부위의 증배인자-는 약하게 발현된 종양-연관된 항원 표적의 경우에도 종양 세포에 의해 종양 미세환경 내에서 전례 없는 고도의 면역원성 항원 발현을 야기할 것이다. HBGA O 및 A 환자는 집단의 대략 85%를 구성하기 때문에, GTB를 개념 입증 노력에서 이용하였다. 또한, 이종-이식을 불가능하게 하는 다클론 항-gal 활성은 HBGA B와 교차-반응하기 때문에(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Macher et al., "The Gal alpha1,3Gal beta1,4GlcNAc-R (alpha-Gal) Epitope: a Carbohydrate of Unique Evolution and Clinical Relevance," Biochim. Biophys.1780:75-88 (2008)), 종양 및/또는 이의 혈액 공급에 의한 HBGA B의 유도된 발현은 이를 높은 수준의 염증 및 초-급성 거부반응을 매개할 수 있는 보체-고정 항체에 의한 전례 없는 수준의 공격의 표적이 되게 한다. 전략은 확장되어, A 및 B 활성 둘 다를 갖는 GT의 사용에 의해 HBGA O, A 및 B 환자(집단의 95%)를 커버할 수 있다. 이는 소위 시스 AB GT에서 자연적으로 발생하는 돌연변이이고 HBGA A 및 B 둘 다를 생성하는, GTA의 단일 뉴클레오티드/아미노산 변화 803G>C(Gly268Ala)에 의해 달성가능하다. 접근법은 천연 항-A뿐 아니라, -B 항체도 보유하지 않는 AB 환자(집단의 5%)를 제외한 전부에 대해 적용가능할 것이다.
본원에 기재된 방법은 최근의 성공적 면역치료 접근법과 많은 특징을 공유하고, 이에 대해 상보적이다. T-세포 용해 기구를 이용하는 CAR-T 및 이중-특이적 Ab 접근법과 유사하게, 본 접근법은 보체 캐스케이드의 용해 기구를 이용한다. 또한, 직접 용해 효과를 넘어, 종양 미세환경 내에서 보체 캐스케이드를 촉발시키는 것은 C3가 APC를 활성화시키는 바와 같이 세포 면역 반응의 역가를 향상시키기 위한 가교로서 제공되어(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Baudino et al., "C3 Opsonization Regulates Endocytic Handling of Apoptotic Cells Resulting in Enhanced T-cell Responses to Cargo-Derived Antigens," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:1503-1508 (2014); Surace et al., "Complement is a Central Mediator of Radiotherapy-Induced Tumor-Specific Immunity and Clinical Response," Immunity 42:767-777 (2015)), T 세포 프라이밍을 촉진한다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Kopf et al., "Complement Component C3 Promotes T-cell Priming and Lung Migration to Control Acute Influenza Virus Infection," Nature Med. 8:373-378 (2002)). 또한, 유리 C3d, C3의 단편의 결찰은 최근에 Treg를 고갈시키고(아폽토시스를 통함), 퍼포린, TNF-α 및 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T-세포의 침윤을 증가시키고, T 세포에 의한 PD-1 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Platt et al., "C3d Regulates Immune Checkpoint Blockade and Enhances Antitumor Immunity," JCI Insight. 2:e90201 (2017)). 또한, 보체계의 활성화는 염증을 유도하고 염증 세포를 모집하는 C3a 및 C5a와 같은 화학주성 인자를 생성한다. 이는 '저온' 종양 미세환경을 '고온' 미세환경으로 전환하여, 면역 반응을 추가로 도울 것이다. 요컨대, 본원에 기재된 접근법은 체액 면역계 및 보체 캐스케이드를 직접 이용하고 세포 면역 반응 향상에서 이의 역할에 의해 암 상의 면역 공격의 폭 및 강도를 확장시킬 가능성을 제공한다.
실시예 7 - 항-CD19-GTB를 이용한 MM1-S의 B 전환
도 15-17은 CD19-양성/HBGA O-양성 골수종 세포를 전환하여, HBGA B를 발현하는 능력을 나타낸다. 이 경우에, 조직 배양액에서 계대배양된 MM1-S 골수종 세포를 CD19, CD20, CD38(도 15), HBGA A, HBGA B(Fisher Scientific(Ortho) 및 Ulex-FITC 또는 Ulex-Dylight(Vector Labs)에 대한 뮤린 단클론 항체를 사용한 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 시험하여, HBGA O를 검출하였다(도 16a-16b). MM1-S 세포를 각각의 항체와 함께 1 시간 동안 항온처리하고, 세포를 세척한 다음에, 적절한 이차 항체, 예컨대 항-마우스 IgM-Alexa 488 또는 647(Jackson ImmunoResearch)과 함께 항온처리하였으며, 일차가 IgG일 때, 일차 항체는 IgM 또는 태그된 항-마우스 IgG였다. 다른 세척 후, 세포를 FACS에 의해 분석하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, MM1-S 세포를 항-CD19-GTB 융합 단백질 + UDP-gal과 함께 항온처리하며, HBGA B 발현을 FACS에 의해 미처치된 세포와 비교한다.
도 15는 MM1-S 골수종 세포가 CD20-음성, CD19+ 및 CD38+라는 것을 나타낸다. 도 16a-16b는 MM1-S 세포가 HBGA A- 및 B-음성이지만(도 16a), HBGA O-양성(도 16b)이라는 것을 나타낸다. 도 17은 항-CD19-GTB 융합 단백질 + UDP-gal과 함께 항온처리된 MM1-S 세포가 미처치된 세포에 대해 고수준 HBGA B 발현으로 전환된다는 것을 나타낸다.
이들 실험은 외래 항원: HBGA B를 발현하기 위한 종양-표적화된 전환의 다른 예를 제공한다. 이 경우에, 표적은 악성 B-세포 상에 또한 존재하는 B-세포 마커인 CD19이다. 이는 또한 혈액 종양 유형의 전환을 나타내는 반면, 다른 예를 제공하였다-전립선(PSMA) 및 유방(HER2)은 고형 종양의 예이다.
실시예 8 - 항체 또는 항체 유도체에 대한 대안으로서 소분자 리간드를 통한 글리코실트랜스퍼라아제 표적화
도 18은 GTA 또는 GTB 또는 알파-gal의 표적화를 항체-기반 구축물에 의해서뿐만 아니라, 펩티드/소분자 리간드-기반 표적화제에 의해서도 수행할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 경우에, GTB 효소를 PSMA에 결합하는 갈락토오스-요소-라이신-기반 리간드인 2-(3-((S)-5-아미노-1-카복시펜틸)우레이도) 펜탄디오산(ACUPA)에 접합시켰다. 고수준 결합을 달성하기 위해, PEG 1500 스페이서를 ACUPA와 GTB 모이어티 사이에 사용하였다. 이는 ACUPA에 대해 적절한 입체적 자유를 제공하여, 더욱 큰 GTA/GTB 효소로부터의 입체적 간섭 없이 PSMA 효소 주머니를 결합시켰다.
도 18은 ACUPA-PEG1500-GTB가 LNCaP 세포를 HBGA O로부터 HBGA B로 전환할 수 있다는 것을 나타낸다(좌측 패널). 표적화를 위한 ACUPA 모이어티가 없는 순수 GTB의 사용은 전환을 야기하지 않았다(우측 패널).
150kd의 큰 항체로부터 작은 항체-유래된 포맷, 예컨대 모노머(75Kd), Fab'2(100kd), Fab(50kd), scFv(25kd), 짧은 펩티드, 예컨대 ACUPA(1.0kd)에 이르기까지 다양한 표적화 모이어티의 사용에 대한 유연성은 다양한 약물동태학 및 생배분 특성을 갖는 융합 단백질의 구축을 가능하게 한다. 큰 융합 단백질은 오래 순환할 것이고, 혈액 구획에 오래 남아있고, 간을 통해 분배되는 경향이 있는 반면, 작은 구축물은 짧은 혈청 반감기를 갖고, 신속하게 종양 표적에 도달/접촉하고, 신장에 의해 분비되는 경향이 있을 것이다. 이들 다양한 옵션은 상이한 종양 유형(예를 들어, 혈액 대 고형 종양)의 요구에 따라 요법을 맞춤화하는 이점을 취할 수 있다.
실시예 9 - 전환의 특이성 및 정확성; 방관자 효과의 부재
도 19 및 20에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포주, SK-BR5(PSMA-음성) 및 LNCaP(PSMA-양성) 전립선암 세포주를 공동-배양하였다. 세포는 이들이 별개 형태학을 갖기 때문에 구별될 수 있다: SK-BR5는 원형이고 2 개 집락이 도 19에서 영역의 중앙 및 상부 근처(적색 원)에 보인다. LNCaP는 더욱 방추형이고 이들 세포는 또한 확인 마커로서 GFP를 발현한다.
배양액을 J591-GTB + UDP-gal로 처치하였을 때, HBGA B(Cy5로 염색됨(보라색))는 PSMA-양성 세포 상에서만 나타난다. PSMA-음성 SKBR5 세포(적색 원 내에 강조됨)의 이웃 집락은 전환되는 세포와 인접하였음에도 불구하고 HBGA B로 전환되지 않는다. 유사하게는, 도 20은 동일한 구별가능한 세포 유형을 나타낸다. 좌측 패널은 DAPI로 염색된 모든 세포 핵을 나타낸다. 중간 패널은 GFP 발현으로 인해 이들의 녹색 형광을 갖는 방추형 LNCaP 세포를 나타낸다. 우측 패널은 J591-GTB + UDP-gal로 처치 후, HBGA B가 PSMA-양성 LNCaP 세포에 의해서만 발현되는 반면, PSMA-음성 SK-BR5 세포는 HBGA B-음성을 유지한다는 것을 나타낸다.
이는 높은 정도의 특이성뿐 아니라, 방관자 효과의 부재 둘 다를 나타낸다-이웃 세포도 이들이 융합 단백질을 직접 표적화고 결합하지 않는 경우, 전환되지 않는다.
실시예 10 - 특이성 지수 정량화
도 21a-21b 및 22는 동일한 2 개 PSMA-양성 및 -음성 세포주에 대한 특이성 지수를 정량화한다. 100 ㎍/mL로부터 0.003 ㎍/mL에 이르는 상이한 농도의 항-PSMA-GTB를 뉴클레오티드 공여체 UDP-gal의 존재 하에 각각의 세포주와 함께 개별적으로 항온처리하였다. 전환의 특이성을 SK-BR5(PSMA-음성) 세포에 대해 LNCaP(PSMA+)를 HBGA B로 전환시키기 위해 요구되는 J591(항-PSMA)-GTB의 농도를 비교함으로써 FACS를 사용하여 정량화하였다. 양측 세포주는 O+이다. FACS 히스토그램을 도 21a-21b에 나타내었다. 12.5 ug/mL 초과의 농도는 12.5 ug/mL 곡선에 덮어씌우고 보기 간단하도록 FACS 히스토그램에서 제외된다.
SK-BR5의 B 전환은 최대 100 ug/mL인 J591-GTB의 농도에서도 발생하지 않는다. 비교에 의해, 0.012 ug/mL만큼 낮은 농도의 항-PSMA-GTB는 PSMA-양성 세포의 전환을 유도하기 시작한다. 이 데이터를 도 22에 히스토그램 형태로 나타내었다. 이는 융합 단백질이 PSMA-음성인 세포에 비해 PSMA-양성 세포에 대해 적어도 8,196 배 더 특이적이라는 것을 나타낸다. 이는 세포 표면에 집중되고 이의 효소적 기능을 수행하는, PSMA-양성 세포에 직접 결합하는 융합 단백질의 능력으로부터 야기된다. 효소적 반응은 효소가 표적화된 세포 표면에 결합하지 않는 경우, 더욱 약하거나 존재하지 않는다. 100 ug/mL 초과의 농도를 실현가능성의 이유로 시험하지 않았으며; 계산된 특이성 지수가 실제로 8,000 배 더욱 큰 것이 기능하다.
도 19-22는 표적-양성 세포로만 제한되는 전환 반응의 정교한 특이성 및 방관자 효과의 결여를 나타내고, 이에 의해 전환/표적-양성 세포를 이웃하는 세포도 상기 세포가 표적-음성이고 융합 단백질에 결합하지 않는 경우, 전환되지 않는다.
실시예 11 - 세포 표면 및 분비된 당단백질 둘 다 이 방법에 의해 글리코실화된다.
세포 표면 및 분비된 당단백질 둘 다 세포 표면 분자의 HBGA 전환과 함께, 골지/소포체에서 동일한 세포 과정에 의해 글리코실화되기 때문에, 표적화된 세포에 의해 분비된 당단백질은 또한 전환된 HBGA가 된다. 이 예시적 경우에, 분비된 당단백질은 HBGA B-양성으로 전환된다. LNCaP 세포를 5 시간 동안 J591-GTB + UDP-gal로 처치하였다(10ug/mL 항-PSMA-GTB + 100 μM UDP-gal). 음성 대조군으로서, LNCaP 세포의 다른 세트를 UDP-gal이 없이 10 ㎍/mL 항-PSMA-GTB와 함께 항온처리하였다. 양성 대조군으로서, 세포 표면 전환의 측정을 백그라운드 대조군으로서 제공되는 비전환된 세포로 수행하였다. 5 시간 항온처리 후, 분비된 당단백질을 함유하는 사용된 배지를 세포의 각각의 세트로부터 수집하고 Amicon 3,000 달톤 컷오프를 사용하여 10 배 농축하였다. 사용된 배지를 플레이트의 웰에 흡착시키고 IgM 항-HBGA B, 이어서 항-마우스 IgM-알칼린 포스파타아제를 사용하여 HBGA B의 존재에 대해 Elisa에 의해 분석하였다.
도 23은 음성 대조군(비-전환된 사용된 배지)에 대해, 전환된 배지가 분비된 단백질 상의 HBGA B의 존재에 대해 양성이었다는 것을 나타낸다.
이는 HBGA B 전환이 세포 표면으로 제한되지 않지만, 표적화된 세포에 의해 분비된 당단백질을 또한 포함한다는 것을 나타낸다. 생체내에서, 이는 이들 전환된, 분비된 당단백질이 종양 세포외 공간을 침투하고, 천연 항-B 항체에 의해 결합되고, 보체를 촉발시키고 전염증 미세환경을 생성하고, 화학주성을 통해 염증 및 면역 세포를 모집하고 종양미세환경을 '고온'의 것으로 추가로 전환할 것이라는 것을 제시한다.
실시예 12 - 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(aGalT)의 이용의 분석
인간 글리코실트랜스퍼라아제 A 또는 B 효소 사용과 함께, 다른 실시양태는 모든 포유동물에서 기능적이지만 진화적 돌연변이로 인해 인간 및 구세계 원숭이에서 비활성인 효소 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(aGalT, EC 2.4.1.87)를 이용한다. GTA, GTB, 및 알파 1,3 GalT는 고도로 상동이고 동일한 선조 유전자로부터 유래된 것으로 여겨진다. GTB와 마찬가지로, 알파 GalT는 세포 표면의 탄수화물 쇄 및 분비된 당단백질 및 당지질에 말단 알파 1,3 갈락토오스를 첨가하지만, GTB와 달리, 알파 GalT는 H-항원 푸코오스 수용체 구조의 부재 하에 이의 Gal을 첨가할 수 있다. 모든 인간은 기능적 알파 GalT가 결여되고, 따라서 이 말단 알파 1,3 Gal 에피토프의 발현이 결여되기 때문에, 이들은 전부 모든 순환 면역글로불린의 대략 1%로 구성되는 것으로 추정되는 IgM, IgG, IgA 및 IgE의 항-알파 Gal 항체의 증가된 수준을 보유한다. 이는 기능적 aGalT를 갖고 이들의 혈관을 포함한 이들의 조직 상에서 말단 알파 1,3 Gal을 발현하는 다른 포유동물의 이종이식을 예방하는 이 알파 1,3 Gal 에피토프의 면역원성이다.
알파 GalT의 사용은 대상체의 혈액형에 따라 GTA 또는 GTB를 선택할 필요성을 폐지시킨다. 이는 또한 HBGA A 또는 B에 대한 천연 항체를 보유하지 않지만, 알파 1,3 Gal에 대한 항체를 보유하는 혈액형 AB인 환자에서 이 치료 접근법의 사용을 허용한다. 알파 GalT의 경우에 수용체로서 H-항원 푸코오스에 대한 요구를 없애는 것은 또한 해결될 수 있는 조직 유형을 넓힌다. 예를 들어, 조혈 세포 및 간충직-유래된 세포(및 이들 세포 유형으로부터 유래된 종양)뿐 아니라, 다른 조직은 H 항원 수용체의 발현이 결여된다. 이들 조직/종양은 GTA 또는 GTB로 해결불가능할 것이지만, 알파 1,3 GalT로 해결될 수 있다.
알파 Gal 트랜스퍼라아제의 사용에 대한 하나의 우려사항은 인간이 효소의 기능적 버전을 발현하지 않는 것을 고려하여 효소 자체가 인간에서 면역원성일지 여부이다. 이러한 경우에, 반복된 투여는 효소가 인간화되거나 탈-면역화될 것을 요구할 것이다. 이 우려사항을 임의의 항-알파 GalT 항체가 존재하는 경우를 보기 위해 상이한 혈액형의 50 명의 무작위로 선택된 환자로부터의 혈청을 분석함으로써 평가하였다.
37℃에서 밤새 96-웰 Half Area High Bind 마이크로플레이트에서 α1,3GalT(500 ng/mL)를 코팅함으로써 ELISA 분석을 수행하였다. 음성 대조군 웰을 효소로 코팅하지 않았다. 세척하고 PBS-HSA(5%)로 차단한 후, 50 개의 상이한 공여체로부터의 혈청을 실온(RT)에서 2 시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 이는 21 명의 O, 20 명의 A, 3 명의 B, 및 6 명의 AB 형 환자로부터의 혈청을 포함하였다. 세척한 후, 항-인간 IgG + IgM-Alk Phos 항체 용액을 첨가한 후, PNPP를 첨가하고 405 nm에서 플레이트를 판독함으로써 항-α1,3GT 항체를 검출하였다. α1,3GT를 정확하게 코팅하였는지를 보장하기 위해, 항 His-태그 항체를 사용함으로써 단백질을 검출하였으며, 이는 α1,3GT를 His 태그로 표지하였기 때문이다(양성 대조군). 다른 대조군으로서, AP 항-인간 IgG + IgM이 기능적이었다는 것을 보장하기 위해, BSA를 500 ng/mL로 코팅하고 인간 혈청으로부터의 항-BSA 항체(HBGA A)를 동일한 방법을 사용하여 측정하였다.
50 개 혈청 중 어느 것도 알파 1,3 GalT에 대한 항체를 함유하지 않았다는 것을 발견하였다(도 24a-24b). 이는, 비제한적으로, GTA 및 GTB를 포함하는 광범위한 다양한 글리코실트랜스퍼라아제의 상동성으로 인한 것이라는 것을 가정한다. 이 결과는 융합 단백질이 면역원성일 우려사항 없이 알파 Gal 에피토프를 생성하기 위해 융합 단백질에서 알파 GalT 효소를 사용할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 이는 탈-면역화 또는 인간화를 요구하지 않을 수 있다.
실시예 13 - 재조합 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(aGalT)의 발현 및 정제
알파 1,3 GalT 서열(aa90-376)의 부분에 융합된 항-CD19 scFv를 GTA 및 GTB를 이용한 접근법과 유사하게 구축하였다. 사용된 scFv 서열을 Seattle Genetics로부터의 데닌투주맙(Den) 및 Xencor로부터의 오벡셀리맙(Obx)으로부터 유도하였으며, 이는 시노몰구스(cynomolgus) 및 인간 CD19 둘 다를 인식하고 결합한다. Ab-GTB의 구축에서 이전에 기재된 바와 동일한 (G4S)3 스페이서/링커를 사용하였다. 알파 GalT에 대해, 376 개 아미노산 잔기를 갖고 글리코실트랜스퍼라아제의 일반 위상과 일치하는 마모셋 서열을 선택하였다: 6 개 aa 세포질 도메인, 16 개 aa 막관통 도메인, 및 효소적 활성을 함유하는 루미날(luminal) 도메인에서 354 개 aa.
마모셋 α1,3GT의 줄기 영역은 67 개 아미노산으로 구성되고 효소의 루미날 부분의 아미노산 23-89에 걸쳐 있고; 이는 효소 활성에 영향을 주지 않으면서 제거될 수 있다. 절단된 90-376 α1,3GT는 기능적이고 융합 단백질에 대해 선택하였다. His 태그를 효소에 첨가하였다. 구축물을 Expi293F 세포에서 발현시키고 금속 친화도 칼럼을 사용하여 정제하였다.
항-his로 조사된 SDS-PAGE 전기영동은 이들의 적절한, 예측된 분자량에서 소망하는 구축물의 고도로 순수한 제제를 드러냈다(도 25).
실시예 14 - 항-CD19 scFv-알파 GalT 구축물의 기능성 및 특이성의 시험
항-CD19 scFv-알파 GalT 구축물의 기능성 및 특이성을 나타내기 위해, H-항원 수용체 구조 또는 HBGA A 또는 B를 발현하지 않는 조혈 표적을 선택하였다: Raji B-림프종 세포 상의 CD19. CD19는 또한 입증된 종양 표적이다. 기능성과 함께, CD19-neg MM1.S 세포와 공동-항온처리된 CD19+ Raji 세포에 대한 알파 Gal 첨가를 비교함으로써 특이성을 평가하였다.
CD19-양성 암 세포주 Raji-GFP를 상이한 비로 CD19-음성 암 세포(MM1.S)와 혼합하고 37℃에서 1 시간 동안 scfv-αGalT 구축물(10 ㎍/mL) 및 UDP-Gal(5 mM)과 함께 항온처리하였다. α1,3Gal 에피토프의 존재를 그 다음에 항-α1,3Gal 항체를 사용한 유세포분석에 의해 평가하고; Raji-GFP 세포를 사용하여, MM1.S 세포로부터 이들을 구별하였다.
융합 단백질은 1-10 ㎍/mL에서 포화되는 CD19-양성 Raji 세포에 결합하지만, CD19-음성 MM1.S 세포에 결합하지 않는다(도 26a-26b). 항-CD19 scFv-aGalT 구축물은 말단 알파 1,3 Gal을 CD19-pos Raji 세포에 첨가하였지만, CD10-neg MM1.S 세포에는 대해서는, 후자가 전자에 대해 30 배 초과로 존재하였을 때에도 그렇지 않았다(도 27). MM1.S는 Raji 세포에 대해 높은 비에서도 scfv-αGalT 융합 단백질 + UDP-Gal의 존재 하에 αGal 양성이 되지 않았다.
알파 1,3 GalT 자체는 scFv 결합 도메인 없이 Gal 모이어티를 첨가하지 않으며, 이는 융합 단백질의 항체(또는 단편) 모이어티를 통한 결합이 알파 1,3 Gal 첨가를 위해 요구된다는 것을 나타낸다(도 28). 또한, UDP-gal을 첨가하지 않았을 때, Gal은 표적 세포에 첨가되지 않았다. UDP-gal의 존재 하에, 알파 1,3 Gal 모이어티를 첨가하였지만, 이는 HBGA B에 대한 항체에 의한 결합의 결여에 의해 나타난 바와 같이 HBGA B 에피토프를 생성하지 않는다(도 28).
실시예 15 - 신선한 인간 림프구를 전환시키는 항-CD19 scFv-aGalT의 능력
유사하게는, 신선한 인간 림프구를 전환시키는 항-CD19 scFv-aGalT의 능력을 시험하였다. 항-CD19 구축물의 존재로 인한 왜곡된 결과를 회피하기 위해, 항-CD20을 사용하여, 이 실험에서 B-세포를 확인하였다. 세포를 UDP-gal 단독, Obx CD19-알파 GalT 단독, 또는 나타낸 농도에서 Obx CD19-알파 GalT + UDP-gal 둘 다와 함께 항온처리하였다. 2 채널 FACS를 사용하여, CD19-알파GalT의 결합(X-축) 및 알파 Gal 에피토프의 발현(Y-축) 둘 다를 측정하였다(도 29). 무 처치 음성 대조군을 또한 실행하였다.
CD20-음성 세포는 융합 단백질에 결합하지 않았을 뿐 아니라, 이들은 알파 1,3 Gal을 발현하도록 전환되지 않았다(도 29, 상부 패널). CD20-양성 세포(도 29, 하부 패널)는 융합 단백질의 결합을 나타내었고 UDP-gal을 또한 첨가하였을 때에만, 알파 1,3 Gal을 발현하도록 전환되었다.
실시예 16 - CD19-양성 Raji-GFP 세포 상의 상이한 혈액형 공여체로부터의 인간 혈청의 용해 기능성
CD19-양성 Raji-GFP 세포 상의 상이한 혈액형 공여체로부터의 인간 혈청의 용해 기능성을 시험하였다. CD19+ Raji-GFP 세포를 37℃에서 1 시간 동안 UDP-Gal(5 mM)이 있거나 없이 Obx-αGT(10 ㎍/mL)와 함께 항온처리하였다. 상이한 공여체로부터의 혈청을 그 다음에 세포에 첨가하고 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 세포의 생존력을 이들의 GFP 발현을 측정함으로써 유세포분석에 의해 평가하였다.
UDP-gal이 말단 알파 1,3 Gal을 발현하기 위한 항-CD19 scFv-aGalT 전환을 완료하기 위한 뉴클레오시드 공여체로서 제공되지 않는 경우, 백그라운드 용해만이 나타났다(도 30). 그러나, UDP-gal을 포함시키고 알파 gal 전환이 발생하였을 때, 인간 혈청은 전환된 세포를 용해시켰다. 이 실험에서, O 및 A 형 혈청은 B 또는 AB 형 혈청에 비해 큰 용해를 야기하였다는 것을 발견하였다.
실시예 17 - 자가 혈청을 사용한 신선한 인간 B-세포의 전환 및 용해
상기 것을 자가 혈청(동일한 공여체로부터의 것)을 사용한 신선한 인간 B-세포의 전환 및 용해를 조사하는 것으로 확장하였으며, 항-알파 1,3 Gal IgG 및 IgM 수준의 개별 공여체의 수준을 또한 측정하였다. 상이한 혈액형의 공여체로부터의 인간 PBMC를 37℃에서 1 시간 동안 Obx-αGT(10 ㎍/mL) 및 UDP-Gal(5 mM)과 함께 항온처리하였다. 세포의 분취량을 항-감마 또는 항-뮤 쇄-특이적 항체를 사용하여 인간 IgG 및 인간 IgM의 결합에 대해 FACS에 의해 분석하였다. 동일한 공여체로부터의 혈청을 그 다음에 세포의 다른 분취량에 첨가하고 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. B-세포 고갈을 항-CD20을 사용하여 유세포분석에 의해 측정하였다.
전환된 세포의 용해의 최대 정도를 A 및 O 형의 환자에 의해 발견하였고, 이는 항-알파 1,3 Gal의 개별 환자의 수준과 대응하였다(도 31a-31b). 이는 처치 전에 항-알파 gal을 측정하는 것이 이 처치 접근법에 대해 더욱 반응하거나 덜 반응할 수 있는 환자의 예측을 허용한다는 것을 제시한다. 이는 또한 일부 환자, 특히 B 또는 AB 형이 항-알파 gal 항체의 높은 수준을 자극하기 위해 알파 1,3 gal 항원에 대한 노출에 의한 프라이밍으로부터 이득을 얻을 수 있다는 것을 제시한다. 이는 이 치료 접근법 전에 적어도 1 주에 다당류 또는 당단백질을 함유하는 알파 gal을 피하로 투여함으로써 발생할 수 있거나, 대안적으로 알파 gal 에피토프의 초기 처치 사이클의 도입은 후속 사이클을 위해 존재할 항-알파 gal 항체의 생산을 자극하기 위해 제공될 수 있다. 통상의 기술자는 이들의 처치 전 항-알파 gal 수준 및 반응에 대한 이들의 관계에 대해 일련의 환자를 평가하고 그 미만에서 반응이 프라이밍 없이 덜 가능한 임계를 결정할 수 있다.
실시예 18 - 자가 혈청을 사용한 인간 공여체 CD19 세포 용해를 생성하기 위한 항-CD19 scFv-aGalT 및 UDP-gal의 최적 농도의 결정
자가 혈청을 사용한 인간 공여체 CD19 세포 용해를 생성하기 위한 항-CD19 scFv-aGalT 및 UDP-gal의 최적 농도를 결정하였다. αGal 전환된 세포 상에서 혈청-매개된 용해를 유도하는 것으로 알려진 HBGA A 형 공여체로부터의 인간 PBMC를 37℃에서 1 시간 동안 상이한 농도의 Obx-αGT 및 UDP-Gal과 함께 항온처리하였다. 그 다음에, 동일한 공여체로부터의 혈청을 세포에 첨가하고 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 결합, α1,3Gal 전달 및 B-세포 고갈을 유세포분석에 의해 평가하였다.
항-CD19 scFv-aGalT는 대략 10 ug/mL에서 CD19 세포를 포화시켰다(도 32a-32c). 알파 1,3 gal의 발현은 대략 10 mM의 UDP-gal 농도에서 최고였다. B-세포 용해는 10 ug/mL의 항-CD19 scFv-aGalT 및 5-20 mM 범위의 UDP-gal로 최대였다. B-세포 용해는 CD19의 포화점을 초과하여, 항-CD19 scFv-aGalT > 10 ug/mL 및, 특히 >/= 25 ug/mL의 농도에서 점진적으로 감소되었다. 이는 비결합된 항-CD19 scFv-aGalT가 UDP-gal에 대해 경쟁하고, 이에 의해 세포 결합된 항-CD19 scFv-aGalT에 대해 이용가능한 UDP-gal을 감소시키는 것으로 인한 것일 수 있다.
scFv-aGalT 및 UDP-gal의 농도는 암 표적 항원에 따라 달라질 수 있고, 종양 세포 막 상의 이의 밀도 및 용해 효능은 항-알파 1,3 Gal 항체(IgM 및/또는 IgG 및/또는 IgA 및/또는 IgE)의 수준에 따라 달라질 수 있다. 이들 파라미터 전부를 처치 전에 측정할 수 있으며, 통상의 기술자는 각각의 개별 환자의 처치를 위한 다양한 구성요소의 최적 농도를 결정할 수 있다.
실시예 19 - 항-CD19 scFv-알파 Gal 트랜스퍼라아제의 조작
(G4S)3 링커를 통한 마모셋 유래된 α-1,3 갈락토실트랜스퍼라아제(aa90-376)의 N-말단에 대해 vH-vL 배향으로 오벡셀리맙 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 융합함으로써 오벡셀리맙-scFv-α-1,3 Gal(서열번호 63)을 구축하였다. 6His 태그를 융합 단백질의 C-말단에 첨가하여, 친화도 크로마토그래피 정제를 가능하게 하였다.
단백질의 생성을 WuXi Biologics에서 수행하였다. 간략하게는, 오벡셀리맙-scFv-α-1,3 Gal(서열번호 63)을 코딩하는 표적 DNA 서열을 코돈 최적화하고, 합성하고, WuXi Biologics의 사유 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 최대 2 L로 스케일 업된 CHO 세포에서의 일시적 형질주입에 의해 융합 단백질을 발현시켰다. 오벡셀리맙-scFv-α-1,3 Gal을 3 단계 칼럼 정제 과정에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 니켈 친화도 크로마토그래피를 초기 포획 단계에서 사용한 후, 음이온-교환 크로마토그래피 및 그 다음에 크기 배제 크로마토그래피가 이어져, 내독소 수준 <1 EU/mg를 갖는 95% 단백질 순도를 얻었다. 정제된 단백질을 20 mg/mL의 히스티딘 완충액 pH 6.0에서 제형화하였다. 단백질 순도를 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의해 평가하고 내독소 수준을 시험하였다.
실시예 20 - 항-CD19 scFv-알파 Gal 트랜스퍼라아제 융합 단백질 + UDP-Gal을 이용한 비-인간 영장류의 생체내 처치
그 다음에, 항 CD19 scFv-알파 Gal 트랜스퍼라아제 융합 단백질 + UDP-Gal을 이용한 비-인간 영장류의 생체내 처치가 CD19+ B-세포 계수 또는 독성의 감소를 야기하였는지 여부를 조사하였다.
2 마리 시노몰구스 원숭이(각각 5 kg 체중)를 기준선 혈액 시험을 거쳐, 허용가능한 실험실 값을 확인하고 기준선 B-세포 및 T-세포 계수를 측정하였다. 그 다음에, 시노몰구스 원숭이에 0 시에 항-CD19 scFv-알파 Gal 트랜스퍼라아제(서열번호 63)의 정맥내 주사 후, UDP-gal의 주사를 투여하였다.
온혈구계산, 혈청 화학, 간 기능 시험, 및 총 림프구, B-세포 계수, 및 T-세포 계수를 처치 후 1 시간, 4 시간, 및 24 시간, 및 7, 14, 30, 및 60 일차에 측정하였다(도 33). B-세포 계수를 CD20+/CD3- 형광을 시험함으로써 결정하였다. CD20을 사용하여, 항-CD19 scFv의 존재에 의한 B-세포 계수 혼동을 회피하였다.
항-CD19 scFv-알파-Gal 트랜스퍼라아제 + UDP-Gal을 이용한 제1 대상체 원숭이의 처치는 처치 후 7 일차에 CD19/CD20+ B-세포에서 70% 감소를 야기하였으며, 이는 이의 기준선 수준으로 돌아가기 전에 8 주 지속되었다. 높은 용량의 항-CD19 scFv-알파-Gal 트랜스퍼라아제를 더욱 최근에 받은 제2 원숭이는 4 시간에 수행된 제1 측정에서 80% B-세포 감소를 가졌다. 대상체 원숭이는 수의사에 의해 관찰된 독성의 가시적 징후를 갖지 않았다. 대상체 원숭이의 중량은 변화되지 않은채 남아있었다. 이들은 혈액 시험 상에서 독성의 측정가능한 징후를 갖지 않았다. 제1 원숭이에서, CD19/CD20 계수 이외의 혈액 시험된 실험실 값은 2 개월 추적 동안 안정적으로 남아있었다. 제2 원숭이는 최대 48 시간까지만 데이터를 가지며 그녀는 여전히 연구중이다.
이들 결과는 비-인간 영장류가 본원에 개시된 방법에 의해 안전하게 처치될 수 있고 처치가 표적화된 세포에서 상당한 감소를 야기한다는 것을 나타낸다.
실시예 21 - 종양-표적화된 이중-기능적 치료제 단백질의 조작
글리코실트랜스퍼라아제 효소에 종양 표적화 항체의 H 쇄를 유전적으로 융합함으로써 종양-표적화된 융합 단백질을 구축하였다. 본원에 기재된 실시예에서, GTA(서열번호 64) 및 GTB(서열번호 65)를 이들의 알려진 인간 서열로부터 유도하는 한편, αGalT를 마모셋 서열(서열번호 66)로부터 유도한다. 본원에 제시된 실시예에서 사용된 번역후 효소를 전부 골지 및/또는 소포체 방광 막에서 자연적으로 발현시켰다. 본원에 기재된 이중-기능적 융합 단백질 구축을 위해, 효소적 기능을 위해 필요하지 않은 효소의 부분(예를 들어, 방광외, 막관통 및 줄기 영역)을 생략하였다.
상기 기재된 바와 같이, 융합 단백질의 종양-표적화 부분은 전장 Ab, Fab'2, Fab, scFv, 모노머 Ab 또는 이의 임의의 Ab/면역글로불린 유도체일 수 있다. 융합 단백질의 효소적 부분은 임의의 번역후 변형 효소일 수 있고; 이의 서열은 일반적으로 인간이거나, 인간화되거나, 영장류화되거나(비-인간 영장류로부터의 것) 이와 달리 탈면역화될 것이다. 효소에 대한 표적화 모이어티의 부착은 링커/스페이서를 이용하거나 이용하지 않을 수 있다. 본원에 제공된 실시예에서, (G4S)3(서열번호 67) 링커/스페이서를 사용하지만, 통상의 기술자에게 알려진 임의의 링커/스페이서가 사용될 수 있다.
이들 융합 단백질의 제제는 모듈식이어서, 임의의 종양/조작 표적화 모이어티는 본원에 제공된 몇몇 실시예에 따라 임의의 번역후 효소에 융합될 수 있다. huJ591 및 4D5 이중-기능적 치료제의 조작 및 생성에서 사용된 서열이 표 7에서 제공된다.
huJ591-GTB
인간 GTB(aa 57-354)(서열번호 69)의 N-말단에 huJ591 중쇄(서열번호 68)를 결찰시킴으로써 huJ591-GTB(H 쇄)(서열번호 34)를 구축하였다. huJ591-LC(서열번호 70)의 C-말단에 6His-태그(서열번호 70)를 첨가하여, 친화도 크로마토그래피 정제를 용이하게 함으로써 huJ591-LC(L 쇄)(서열번호 36)를 구축하였다.
H 및 L 쇄를 코딩하는 DNA 서열을 pcDNA 3.1 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 단백질 생산을 CHO 세포 내로의 H 및 L 쇄의 공동-형질주입에 의한 일시적 발현 방법을 사용하여 수행하였다. huJ591-GTB 융합 단백질을 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하고 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
huJ591Fab-GTB
인간 GTB(aa 57-354)(서열번호 69)의 N-말단에 huJ591 중쇄(VH-CH1- 부분 힌지 서열)(서열번호 72)의 절단된 단편을 결찰시킴으로써 huJ591Fab-GTB(H 쇄)(서열번호 37)를 구축하였다. Myc/his 태그(서열번호 73)를 C-말단에 첨가하여, 발현 모니터링 및 친화도 크로마토그래피를 용이하게 하였다. huJ591-LC(L 쇄)(서열번호 39)는 huJ591 경쇄 서열(서열번호 71)을 코딩한다.
H 및 L 쇄를 코딩하는 DNA 서열을 pcDNA 3.1 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 단백질 생산을 CHO 세포 내로의 H-쇄 및 L-쇄의 공동-형질주입에 의한 일시적 발현 방법을 사용하여 수행하였다. Fab-GTB 융합 단백질을 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하고 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
huJ591-HC67-GTB
(G4S)3(서열번호 67) 링커를 통해 인간 GTB(aa 57-354)(서열번호 69)의 N-말단에 huJ591 중쇄(서열번호 74)를 결찰시킴으로써 huJ591-HC67-GTB(H 쇄)(서열번호 40)를 구축하였다. 변화된 aa를 표 4에서 볼드체 이중 밑줄 및 표 7에서 볼드체로 표지한다. J591-LC(서열번호 71)의 C-말단에 6His-태그(서열번호 70)를 첨가하여, 친화도 크로마토그래피를 용이하게 함으로써 J591-LC(L 쇄)(서열번호 42)를 구축하였다.
모노머 Fc 융합 단백질 생산을 다음과 같이 수행하였다. J591HC67-GTB 및 L 쇄를 코딩하는 DNA 서열을 합성하고, 발현 벡터 내로 서브클로닝하고, CHO 세포 내로 공동-형질주입하였다. 세포 배양 상청액을 수집하였다. J591HC67-GTB 융합 단백질을 니켈 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하고 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
huJ591-HC67-GTB54aa
GTB의 C-말단에 54aa 꼬리(서열번호 75)를 첨가함으로써 huJ591-HC67-GTB(H 쇄)(서열번호 74)로부터 huJ591-HC67-GTB54aa(H 쇄)(서열번호 43)를 변형시켰다. C-말단에 6His-태그(서열번호 70)를 첨가하여, 친화도 크로마토그래피 정제를 용이하게 함으로써 huJ591-LC(L 쇄)(서열번호 45)를 구축하였다.
단백질 생산을 CHO 세포 내로의 H 쇄 및 L 쇄의 공동-형질주입에 의한 일시적 발현 방법을 사용하여 수행하였다. huJ591-GTB 융합 단백질을 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하고 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
huJ591scFv-Fc67-GTB
huJ591scFv-Fc67-GTB(서열번호 46)는 (N에서 C 말단으로) huJ591 단일 쇄 가변 단편(scFv)/J591 Fc 단편(서열번호 76), 인간 GTB(aa 57-354)(서열번호 69)를 코딩한다. (G4S)3(서열번호 67) 링커를 Fc(서열번호 76)와 GTB(서열번호 69) 사이에 첨가하였다.
huJ591scFv-Fc67-GTB(서열번호 46)를 코딩하는 DNA 서열을 합성하고, 발현 벡터 내로 서브클로닝시키고, CHO 세포 내로 형질주입하였다. 세포 배양 상청액을 수집하였다. huJ591scFv-Fc67-GTB(서열번호 46) 융합 단백질을 니켈 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하고 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
huJ591scFv-GTB
huJ591scFv-GTB(서열번호 48)는 (N에서 C 말단으로) huJ591 단일 쇄 가변 단편(scFv)(서열번호 77)의 탈-면역화된 버전, 인간 GTB(aa 57-354)(서열번호 69)를 코딩한다. (G4S)3(서열번호 67) 링커를 scFv(서열번호 77)와 GTB(서열번호 69) 사이에 첨가하였다. Myc/His 태그(서열번호 73)를 C-말단에 첨가하여, 발현 모니터링 및 친화도 크로마토그래피 정제를 용이하게 하였다.
huJ591scFv-GTB(서열번호 48)를 코딩하는 DNA 서열을 pcDNA 3.1 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 단백질 생산을 CHO 세포 내로의 플라스미드의 형질주입에 의한 일시적 발현을 사용하여 수행하였다. huJ591scFv-GTB 융합 단백질을 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하고 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
GTA 구축물
huJ591-GTA(서열번호 35), huJ591Fab-GTA(서열번호 38), huJ591-HC67-GTA(서열번호 41), huJ591scFv-Fc67-GTA(서열번호 47), 및 huJ591scFv-GTA(서열번호 49)의 재조합 단백질을 생성하기 위해 상기 기재된 DNA 구축물에서 GTB 서열(서열번호 69) 대신에 인간 GTA(aa 57-354) 서열(서열번호 78)을 또한 사용하였다.
트라스투주맙(4D5) 구축물
유방 및 다른 암 상의 HER2를 표적화하기 위해, 본원에 기재된 DNA 구축물에서 huJ591 서열 대신에 트라스투주맙(4D5) 서열을 사용하여, 4D5-GTA(서열번호 51), 4D5Fab-GTA(서열번호 54), 4D5HC67-GTA(서열번호 57), 4D5scFv-Fc67-GTA(서열번호 60), 4D5scFv-GTA(서열번호 62), 4D5-GTB(서열번호 50), 4D5Fab-GTB(서열번호 53), 4D5HC67-GTB(서열번호 56), 4D5scFv-Fc67-GTB(서열번호 59), 및 4D5scFv-GTB(서열번호 61)의 재조합 단백질을 생성하였다.
바람직한 실시양태가 본원에 상세히 도시되고 기재되어 있으나, 다양한 변형, 추가, 치환 등이 본 발명의 의의를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있고, 따라서 이들은 다음 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다는 것이 통상의 기술자에게 명확할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CORNELL UNIVERSITY <120> CANCER IMMUNOTHERAPIES TO PROMOTE HYPERACUTE REJECTION <130> 147402.008272 <140> PCT/US2021/061180 <141> 2021-11-30 <150> 63/119,359 <151> 2020-11-30 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Ser at position 16 and Gly at positions 17-20 are either all present or all absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(25) <223> Ser at position 21 and Gly at positions 22-25 are either all present or all absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(30) <223> Ser at position 26 and Gly at positions 27-30 are either all present or all absent <400> 2 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens 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Claims (94)

  1. 종양-연관된 항원을 표적화하는 표적화 구성요소, 및
    표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 표적화 구성요소에 커플링되는, 효소
    를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제.
  2. 제1항에 있어서,
    종양-연관된 항원이 FOLH1/PSMA, VEGFR, CD19, CD20, CD25, CD30, CD33, CD38, CD52, B 세포 성숙 항원(BCMA), CD79, 소마토스타틴 수용체, 5T4, gp100, CEA, 멜란 A/MART-1, MAGE, NY-ESO-1, PSA, 티로시나아제, HER-2, HER-3, EGFR, hTERT, MUC1, 메소텔린, 넥틴-4, TROP-2, 조직 인자 및 CA-125로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-기능적 치료제.
  3. 제1항에 있어서,
    표적화 구성요소가 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단백질, 펩티드, 압타머 및 소분자 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-기능적 치료제.
  4. 제3항에 있어서,
    표적화 구성요소가 펩티드 결합을 통해 효소에 연결된 펩티드인, 이중-기능적 치료제.
  5. 제4항에 있어서,
    표적화 구성요소가 항체 또는 이의 항원-결합 유도체 또는 단편인, 이중-기능적 치료제.
  6. 제1항에 있어서,
    표적화 구성요소 및 효소가 유전자 조작되어, 융합 단백질을 생산하는, 이중-기능적 치료제.
  7. 제1항에 있어서,
    표적화 구성요소 및 효소가 화학적으로 연결되는, 이중-기능적 치료제.
  8. 제3항에 있어서,
    표적화 구성요소가 개입 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서로 효소에 화학적으로 연결된 소분자 리간드인, 이중-기능적 치료제.
  9. 제8항에 있어서,
    표적화 구성요소가 개입 PEG 스페이서로 효소에 화학적으로 연결된 ACUPA [2-(3-((S)-5-아미노-1카복스펜틸)우레이도)펜탄디오산]인, 이중-기능적 치료제.
  10. 제1항에 있어서,
    효소가 번역후 변형에 관련된 효소이고 트랜스퍼라아제 및 글리코실트랜스퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-기능적 치료제.
  11. 제10항에 있어서,
    번역후 변형에 관련된 효소가 트랜스퍼라아제인, 이중-기능적 치료제.
  12. 제11항에 있어서,
    트랜스퍼라아제가 글리코실트랜스퍼라아제인, 이중-기능적 치료제.
  13. 제12항에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라아제가 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제), 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제), 알파-gal-트랜스퍼라아제, 글리코실트랜스퍼라아제 A(Gly268Ala) 및 푸코실트랜스퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-기능적 치료제.
  14. 제1항에 있어서,
    효소가 이의 C-말단에서 첨부된 제2 아미노산 서열을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  15. 제14항에 있어서,
    제2 아미노산 서열이 효소와 첨부된 제2 서열 사이에 절단가능 아미노산 서열을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  16. 제15항에 있어서,
    절단가능 아미노산 서열이 PSA, 기질 금속단백분해효소 또는 카텝신 B에 의해 절단가능한, 이중-기능적 치료제.
  17. 제1항에 있어서,
    종양-연관된 항원을 갖는 종양이 H-항원을 발현하는, 이중-기능적 치료제.
  18. 제1항에 있어서,
    종양-연관된 항원을 갖는 종양이 폐암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 혈액암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 방광암, 신장암, 뇌암, 간암, 식도암, 부신암, 두경부암, 흑색종 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인, 이중-기능적 치료제.
  19. 제18항에 있어서,
    암이 전립선암인, 이중-기능적 치료제.
  20. 제19항에 있어서,
    표적화 구성요소가 전립선-특이적 막 항원(PSMA)/엽산 가수분해효소 1(FOLH1) 수용체를 표적화하는, 이중-기능적 치료제.
  21. 제19항에 있어서,
    표적화 구성요소가 PSMA 수용체 항체 또는 PSMA 수용체 항체의 유도체인, 이중-기능적 치료제.
  22. 제19항에 있어서,
    표적화 구성요소가 J591, J415, J533 및 E99로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체인, 이중-기능적 치료제.
  23. 제17항에 있어서,
    암이 유방암인, 이중-기능적 치료제.
  24. 제23항에 있어서,
    표적화 구성요소가 HER 수용체 패밀리 멤버를 표적화하는, 이중-기능적 치료제.
  25. 제24항에 있어서,
    표적화 구성요소가 단클론 항체 4D5인, 이중-기능적 치료제.
  26. 제17항에 있어서,
    암이 B-세포 계통의 혈액암인, 이중-기능적 치료제.
  27. 제26항에 있어서,
    표적화 구성요소가 CD19를 표적화하는, 이중-기능적 치료제.
  28. 제27항에 있어서,
    표적화 구성요소가 단클론 항체 오벡셀리맙 또는 데닌투주맙인, 이중-기능적 치료제.
  29. 암을 갖는 대상체를 선택하는 단계;
    제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 이중-기능적 치료제를 제공하는 단계; 및
    암을 치료하기 위해 효과적인 조건 하에 이중-기능적 치료제를 선택된 대상체에 투여하는 단계
    를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    대상체가 인간인, 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    종양 연관된 항원이 FOLH1/PSMA, VEGFR, CD19, CD20, CD25, CD30, CD33, CD38, CD52, B 세포 성숙 항원(BCMA), CD79, 소마토스타틴 수용체, 5T4, gp100, CEA, 멜란 A/MART-1, MAGE, NY-ESO-1, PSA, 티로시나아제, HER-2, HER-3, EGFR, hTERT, MUC1, 메소텔린, 넥틴-4, TROP-2, 조직 인자 및 CA-125로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  32. 제29항에 있어서,
    표적화 구성요소가 항체 또는 이의 결합 단편, 단백질, 펩티드 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    표적화 구성요소가 펩티드 결합을 통해 효소에 연결된 펩티드인, 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    표적화 구성요소가 항체 또는 이의 항원-결합 유도체 또는 단편인, 방법.
  35. 제29항에 있어서,
    표적화 구성요소 및 효소가 유전자 조작되어, 융합 단백질을 생산하는 것인, 방법.
  36. 제29항에 있어서,
    표적화 구성요소 및 효소가 화학적으로 연결되는 것인, 방법.
  37. 제29항에 있어서,
    표적화 구성요소가 개입 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서로 효소에 화학적으로 연결된 소분자/리간드인, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    표적화 구성요소가 개입 PEG 스페이서로 효소에 화학적으로 연결된 ACUPA [2-(3-((S)-5-아미노-1-카보펜틸)우레이도)펜탄디오산)인, 방법.
  39. 제29항에 있어서,
    효소가 번역후 변형에 관련된 효소이고 글리코실화, 트랜스퍼라아제, 및 글리코실트랜스퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    번역후 변형에 관련된 효소가 트랜스퍼라아제인, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    트랜스퍼라아제가 글리코실트랜스퍼라아제인, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라아제가 글리코실트랜스퍼라아제 A, 글리코실트랜스퍼라아제 B, 알파-gal-트랜스퍼라아제, 글리코실트랜스퍼라아제 A(Gly268Ala) 및 푸코실트랜스퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  43. 제29항에 있어서,
    효소가 이의 C-말단에서 첨부된 제2 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    제2 아미노산 서열이 효소와 첨부된 제2 서열 사이에 절단가능 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    절단가능 아미노산 서열이 PSA, 기질 금속단백분해효소 또는 카텝신 B에 의해 절단가능한 것인, 방법.
  46. 제29항에 있어서,
    암이 H-항원을 발현하는 것인, 방법.
  47. 제29항에 있어서,
    암이 폐암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 혈액암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 방광암, 신장암, 뇌암, 간암, 식도암, 부신암, 두경부암, 흑색종 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    암이 전립선암인, 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    표적화 구성요소가 전립선-특이적 막 항원(PSMA)/엽산 가수분해효소 1(FOLH1) 수용체를 표적화하는 것인, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    표적화 구성요소가 PSMA 수용체 항체 또는 PSMA 수용체 항체의 유도체인, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    표적화 구성요소가 J591, J415, J533 및 E99로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체인, 방법.
  52. 제47항에 있어서,
    암이 유방암인, 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    표적화 구성요소가 HER 수용체 패밀리 멤버를 표적화하는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    표적화 구성요소가 단클론 항체 4D5인, 방법.
  55. 제47항에 있어서,
    암이 B-세포 계통의 혈액암인, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    표적화 구성요소가 CD19를 표적화하는 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    표적화 구성요소가 단클론 항체 오벡셀리맙 또는 데닌투주맙인, 방법.
  58. 제29항에 있어서,
    투여가
    우리딘 디포스페이트-갈락토오스(UDP-gal), 우리딘 디포스페이트-N-아세틸갈락토스아민(UDP-NAcGal) 및/또는 구아노신 디포스페이트-푸코오스(GDP-푸코오스)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인,
    방법.
  59. 제49항에 있어서,
    표적화 구성요소가 종양 혈관 내피 상의 PSMA 수용체를 표적화하는 것인, 방법.
  60. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 이중-기능적 치료제, 및
    약학적 허용 담체
    를 포함하는, 약학 조성물.
  61. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 이중-기능적 치료제를 코딩하는 핵산 분자.
  62. 제61항에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 구축물.
  63. 제61항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  64. 제61항에 따른 핵산 분자로 형질전환된 재조합 숙주 세포.
  65. 전립선-특이적 막 항원(PSMA)/엽산 가수분해효소 1(FOLH1) 수용체를 표적화하는 표적화 구성요소, 및
    표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제
    를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제.
  66. 제65항에 있어서,
    표적화 구성요소가 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역이
    서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 10의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1(CDR-H1);
    서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 13의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 2(CDR-H2); 및
    서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 16의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 3(CDR-H3)
    을 포함하는,
    이중-기능적 치료제.
  67. 제65항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서,
    표적화 구성요소가 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 경쇄 가변 영역이
    서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 19의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 1(CDR-L1);
    서열번호 22의 아미노산 서열 또는 서열번호 22와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 22의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 2(CDR-L2); 및
    서열번호 25의 아미노산 서열 또는 서열번호 25와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 25의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 3(CDR-L3)
    을 포함하는,
    이중-기능적 치료제.
  69. 제65항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  70. 제65항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 10의 CDR-H1, 서열번호 13의 CDR-H2 및 서열번호 16의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19의 CDR-L1, 서열번호 22의 CDR-L2 및 서열번호 25의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  71. 제65항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 28과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 29와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  72. 제65항에 있어서,
    표적화 구성요소가 시그널링 펩티드를 추가로 포함하고, 선택적으로 시그널링 펩티드가 서열번호 34의 아미노산 1-19의 서열을 갖는, 이중-기능적 치료제.
  73. 제65항에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라아제가 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제) 및 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-기능적 치료제.
  74. 제65항에 있어서,
    (i) 서열번호 34 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질;
    (ii) 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질;
    (iii) 서열번호 40 또는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질;
    (iv) 서열번호 43 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질;
    (v) 서열번호 46의 아미노산 서열;
    (vi) 서열번호 47의 아미노산 서열;
    (vii) 서열번호 48의 아미노산 서열; 또는
    (viii) 서열번호 49의 아미노산 서열
    을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  75. 인간 표피 성장 인자 수용체(HER) 패밀리 멤버를 표적화하는 표적화 구성요소, 및
    표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제
    를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제.
  76. 제75항에 있어서,
    표적화 구성요소가 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역이
    서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 11의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1(CDR-H1);
    서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 14의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 2(CDR-H2); 및
    서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 17의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 3(CDR-H3)
    을 포함하는,
    이중-기능적 치료제.
  77. 제75항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 30과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서,
    표적화 구성요소가 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 경쇄 가변 영역이
    서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 20의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 1(CDR-L1);
    서열번호 23의 아미노산 서열 또는 서열번호 23과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 23의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 2(CDR-L2); 및
    서열번호 26의 아미노산 서열 또는 서열번호 26과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 26의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 3(CDR-L3)
    을 포함하는,
    이중-기능적 치료제.
  79. 제75항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 31과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  80. 제75항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2 및 서열번호 17의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20의 CDR-L1, 서열번호 23의 CDR-L2 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  81. 제75항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 30과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  82. 제75항에 있어서,
    표적화 구성요소가 시그널링 펩티드를 추가로 포함하고, 선택적으로 시그널링 펩티드가 서열번호 50의 아미노산 1-19의 서열을 갖는, 이중-기능적 치료제.
  83. 제75항에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라아제가 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제) 및 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-기능적 치료제.
  84. 제75항에 있어서,
    (i) 서열번호 50 또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질;
    (ii) 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질;
    (iii) 서열번호 56 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제1 단백질 및 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제2 단백질;
    (iv) 서열번호 59의 아미노산 서열;
    (v) 서열번호 60의 아미노산 서열;
    (vi) 서열번호 61의 아미노산 서열; 또는
    (vii) 서열번호 62의 아미노산 서열
    을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  85. CD19를 표적화하는 표적화 구성요소, 및
    표적화 구성요소에 의해 종양에 전달될 때, 종양 표현형을 양립불가능한 동종이식편 또는 이종이식편의 것으로 효소적으로 전환하고, 표적화 구성요소에 커플링되는, 글리코실트랜스퍼라아제
    를 포함하는, 암을 치료하기 위한 이중-기능적 치료제.
  86. 제85항에 있어서,
    표적화 구성요소가 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역이
    서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 12의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1(CDR-H1);
    서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 15의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 2(CDR-H2); 및
    서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 18의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 3(CDR-H3)
    을 포함하는,
    이중-기능적 치료제.
  87. 제85항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서,
    표적화 구성요소가 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 경쇄 가변 영역이
    서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 21의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 1(CDR-L1);
    서열번호 24의 아미노산 서열 또는 서열번호 24와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 24의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 2(CDR-L2); 및
    서열번호 27의 아미노산 서열 또는 서열번호 27과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 서열번호 27의 변형된 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역 3(CDR-L3)
    을 포함하는,
    이중-기능적 치료제.
  89. 제85항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  90. 제85항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 12의 CDR-H1, 서열번호 15의 CDR-H2 및 서열번호 18의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21의 CDR-L1, 서열번호 24의 CDR-L2 및 서열번호 27의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  91. 제85항에 있어서,
    표적화 구성요소가 서열번호 32와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 33과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
  92. 제85항에 있어서,
    표적화 구성요소가 시그널링 펩티드를 추가로 포함하고, 선택적으로 시그널링 펩티드가 서열번호 63의 아미노산 1-19의 서열을 갖는, 이중-기능적 치료제.
  93. 제85항에 있어서,
    글리코실트랜스퍼라아제가 글리코실트랜스퍼라아제 A(알파 1-3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제), 글리코실트랜스퍼라아제 B(알파 1-3-갈락토실트랜스퍼라아제) 및 마모셋(Marmoset) α-1,3 갈락토실트랜스퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-기능적 치료제.
  94. 제85항에 있어서,
    서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는, 이중-기능적 치료제.
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