CN114286825A - 嵌合抗原受体t细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了嵌合抗原受体(CAR)，其包含含有抗体部分(例如，单链可变片段(scFv)抗体)的细胞外靶结合结构域、跨膜结构域、CD30共刺激结构域和初级信号传导结构域。本文还提供了使用该嵌合抗原受体或其组合物来治疗性地治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法。

Description

嵌合抗原受体T细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月24日提交的美国临时申请号62/878,182的优先权，其公开内容出于所有目的据此以全文引用的方式并入。
背景技术
其中将患者自身的T淋巴细胞工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的过继性T细胞免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面已经显示出很大的前景。CAR通常含有3个模块：细胞外靶结合模块、跨膜结构域(TM结构域)和传输激活信号的细胞内信号传导结构域(ICD)。TM结构域主要被认为是结构需求，将CAR锚定在细胞膜中，并且最常见地衍生自调节T细胞功能的分子，诸如CD8和CD28。细胞内模块通常由T细胞受体CD3ζ链和来自Ig(CD28样)或TNF受体(TNFR)超家族的一个或多个共刺激结构域组成。含有CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR迄今为止已经被最广泛地使用，并且它们两者都在临床试验中产生了显著的应答。
在TNF受体家族成员之间的大部分同源性出现在细胞外结构域中，在细胞质结构域中几乎没有同源性。这表明TNF受体家族的不同成员可能利用不同的信号传导途径。与这种假设一致，TNF受体1型和Fas已经显示通过称为死亡结构域的65个氨基酸结构域与一组细胞内信号传导分子相互作用，然而已经发现TNF受体2型和CD40与信号转导分子的肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)家族的成员相关。
CD30是受体蛋白质的TNF1受体超家族的成员。CD30的膜结合形式是120-kDa的595个氨基酸的糖蛋白，其具有188个氨基酸的细胞质结构域。CD30与抗体或与CD30配体的交联在细胞中产生各种效应，包括在T细胞受体接合和NF-kB转录因子诱导后增强原代T细胞的增殖。CD30最初被鉴定为在霍奇金淋巴瘤细胞表面上表达的抗原。随后，显示CD30由具有激活表型的淋巴细胞、生发中心周围的细胞和CD45RO1(记忆)T细胞表达。CD30还可以在发展T辅助2型细胞中起作用。已经显示TNF受体家族成员4-1BB的T细胞激活特性涉及其细胞质结构域与酪氨酸激酶p56lck缔合的特定能力。CD30的细胞质结构域的序列显示与这些受体中的任何受体都几乎没有序列相似性；CD30缺乏明显的死亡结构域或p56lck结合位点。
发明内容
除了其它方面，本发明提供了使用来自CD30的共刺激结构域(在本文中也称为CD30共刺激结构域)的CAR。如本文详细描述和证明的，具有含有来自CD30的共刺激结构域的CAR的T细胞表达比具有含有来自例如CD28或4-1BB的共刺激结构域的CAR的T细胞少得多的PD-1(一种T细胞激活抑制剂)，并且同时展示出相等的细胞毒性潜力。数据表明，来自CD30的共刺激结构域改善了导致T细胞耗竭的功能无反应性(也称为应变力缺乏(anergy))，并且随后提供肿瘤细胞杀伤的优异持久性。由于CD30缺乏被认为对CAR共刺激至关重要的p56lck结合位点，因此这是出乎意料的。
在一个方面，本发明的特征在于包含以下项的嵌合抗原受体(CAR)：(a)包含抗体部分的细胞外靶结合结构域；(b)跨膜结构域；(c)CD30共刺激结构域；和(d)初级信号传导结构域。在一些实施方案中，CD30共刺激结构域包含可以与细胞内TRAF信号传导蛋白结合的序列。在一些实施方案中，可以与细胞内TRAF信号传导蛋白结合的序列对应于具有序列SEQ ID NO:11的全长CD30的残基561-573或578-586。在一些实施方案中，CD30共刺激结构域包含与SEQ ID NO:11的残基561–573或578–586至少80％、85％、90％、95％或100％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，CD30共刺激结构域包含与SEQ ID NO:35的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。
在一些实施方案中，CAR包含多于一个CD30共刺激结构域。在一些实施方案中，除了CD30共刺激结构域之外，CAR还包含至少一个共刺激结构域，该至少一个共刺激结构域包含不同于CD30的共刺激分子的细胞内序列。在一些实施方案中，不同于CD30的共刺激分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。
在一些实施方案中，CAR的抗体部分是单链抗体片段。抗体部分可以是单链Fv(scFv)、单链Fab、单链Fab'、单结构域抗体片段、单结构域多特异性抗体、细胞内抗体、纳米抗体或单链免疫因子。在某些实施方案中，抗体部分是单结构域多特异性抗体(例如，单结构域双特异性抗体)。在某些实施方案中，抗体部分是单链Fv(scFv)，例如串联scFv。
在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域衍生自TCR共受体或T细胞共刺激分子的跨膜结构域。TCR共受体或T细胞共刺激分子可以选自由以下组成的组：CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在某些实施方案中，TCR共受体或T细胞共刺激分子是CD30或CD8。在某些实施方案中，T细胞共刺激分子是CD30。在某些实施方案中，TCR共受体是CD8。
在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域是CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域是CD30或CD8的跨膜结构域。在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域是CD30的跨膜结构域。在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域是CD8的跨膜结构域。在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含选自由SEQ ID NO:26-31组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，初级信号传导结构域包含衍生自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导序列的序列：CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。初级信号传导结构域可以包含衍生自CD3ζ的细胞内信号传导序列的序列。初级信号传导结构域可以包含CD3ζ的细胞内信号传导序列。在某些实施方案中，初级信号传导结构域包含与SEQ ID NO:37的序列至少80％、85％、90％、95％或100％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。
在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含在细胞外靶结合结构域与跨膜结构域之间的肽接头。在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含在跨膜结构域与CD30共刺激结构域之间的肽接头。在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含在CD30共刺激结构域与初级信号传导结构域之间的肽接头。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合疾病相关抗原，例如癌症相关抗原或病毒相关抗原。在某些实施方案中，抗体部分特异性地结合细胞表面抗原。细胞表面抗原可以选自由以下组成的组：蛋白质、碳水化合物和脂质。细胞表面抗原可以是CD19、CD20、CD22、CD47、CD158e、GPC3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D、FcRL5、MUC16、MCT4、PSMA或它们的变体或突变体。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合人CD19。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合人CD22。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合人CD20。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合人CD19和人CD22两者。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合人CD19和人CD20两者。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合人CD20和人CD22两者。在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合人CD19、人CD20和人CD22。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合MHC限制性抗原。例如，抗体部分可以特异性地结合包含甲胎蛋白(AFP)肽和MHC I类蛋白的复合物。在一些实施方案中，AFP肽包含SEQ ID NO:72-82中任一者的序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:83-85的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:86的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:87-89的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:90的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:91-93的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:94的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:95-97的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:98的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:99-101的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ IDNO:102的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:103-105的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:106的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:107-109的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:110的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQID NO:111-113的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:114的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:115-117的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:118的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:119-121的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQID NO:122的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)肽。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:123-125的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:126的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:127-129的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:130的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:131-133的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:134的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:135-137的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQID NO:138的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:139-141的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:142的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:143-145的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:146的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:147-149的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:150的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:151-153的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:154的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:155-157的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:158的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:159-161的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:162的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:163-165的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:68的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:166-168的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:69的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:169-171的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:70的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:172-174的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:71的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:12或13的序列。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合KRAS肽，例如包含KRAS肽和MHC I类蛋白的复合物。在一些实施方案中，KRAS肽包含SEQ ID NO:175-183中任一者的序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:184-186的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:187的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQID NO:188-190的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:191的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:192的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:193-195的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:196的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:197-199的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:200的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:201的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:202-204的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQID NO:205的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:206-208的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:209的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:210的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:211-213的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ IDNO:214的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:215-217的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:218的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:219的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:220-222的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:223的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:224-226的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:227的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:228的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:229-231的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:232的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:233-235的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:236的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:237的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ IDNO:238-240的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:241的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:242-244的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:245的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:246的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:247-249的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:250的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:251-253的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:254的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:255的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合NY-ESO-1肽，例如包含NY-ESO-1肽和MHC I类蛋白的复合物。在一些实施方案中，NY-ESO-1肽包含SEQ ID NO:256-266中任一者的序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:267-269的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:270的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:271-273的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ IDNO:274的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:275-277的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:278的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:279-281的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:282的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQID NO:283-285的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:286的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:287-289的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:290的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:291-293的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQID NO:294的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:295-297的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:298的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:299-301的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:302的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:303-305的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:306的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:307-309的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:310的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:311-313的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:314的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:315-317的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:318的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:319-321的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:322的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合PRAME肽，例如包含PRAME肽和MHC I类蛋白的复合物。在一些实施方案中，PRAME肽包含SEQ ID NO:323-327中任一者的序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:328-330的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:331的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:332-334的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:335的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:336-338的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:339的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:340-342的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQID NO:343的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:344-346的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:347的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:348-350的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:351的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:352-354的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:355的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:356-358的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:359的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:360-362的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:363的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:364-366的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:367的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:368-370的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:371的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:372-374的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:375的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:376-378的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:379的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:380-382的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:383的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合组蛋白H3.3肽，例如包含组蛋白H3.3肽和MHC I类蛋白的复合物。在一些实施方案中，组蛋白H3.3肽包含SEQ ID NO:384-403中任一者的序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:404-406的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:407的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:408-410的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQID NO:411的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:412-414的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:415的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:416-418的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:419的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:420-422的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:423的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:424-426的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:427的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:428-430的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:431的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:432-434的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:435的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:436-438的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:439的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:440-442的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:443的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:444-446的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:447的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:448-450的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:451的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:452-454的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:455的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:456-458的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:459的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:460-462的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:463的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:464-466的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:467的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:468-470的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:471的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:472-474的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:475的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:476-478的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:479的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:480-482的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:483的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:484-486的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:487的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:488-490的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:491的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:492-494的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:495的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:496-498的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:499的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合WT1肽，例如包含WT1肽和MHC I类蛋白的复合物。在一些实施方案中，WT1肽包含SEQ ID NO:500的序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:501-503的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ IDNO:504的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:505-507的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:508的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:509的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:510-512的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:513的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:514-516的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:517的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:518的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:519-521的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:522的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:523-525的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:526的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:527的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ IDNO:528-530的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:531的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:532-534的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:535的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:536的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:537-539的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:540的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:541-543的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:544的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:545的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:546-548的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:549的序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含分别SEQ ID NO:550-552的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:553的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:554的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗体部分特异性地结合PSA肽，例如包含PSA肽和MHC I类蛋白的复合物。在一些实施方案中，PSA肽包含SEQ ID NO:555-565中任一者的序列。在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:566-580中任一者的HCDR1序列、SEQ ID NO:581-594中任一者的HCDR2序列、和SEQ ID NO:595-612中任一者的HCDR3序列，以及任选地具有SEQ IDNO:613-630中任一者的序列的重链可变区；在一些实施方案中，抗体部分包含SEQ ID NO:631-647中任一者的LCDR1序列、SEQ ID NO:648-660中任一者的LCDR2序列、和SEQ ID NO:661-678中任一者的LCDR3序列，以及任选地具有SEQ ID NO:679-696中任一者的序列的轻链可变区。
在另一个方面，本公开的特征还在于整体或部分编码本文所述的任何CAR的核酸分子。
在另一个方面，本公开的特征还在于包含上文所述的核酸分子的载体。
在另一个方面，本公开的特征还在于CD30-CAR效应细胞：(a)表达本文所述的任何一种CAR，或(b)包含上文所述的核酸分子或载体。在某些实施方案中，效应细胞是T细胞。
在另一个方面，本公开的特征还在于一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的任何CAR、上文所述的核酸分子、上文所述的载体或上文所述的CD30-CAR效应细胞、以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在另一个方面，本公开的特征还在于一种杀死靶细胞的方法，该方法包括：使一个或多个靶细胞与一个或多个本文所述的CD30-CAR效应细胞在足以使得CD30-CAR效应细胞介导对靶细胞的杀伤的条件和持续时间下接触，其中该靶细胞表达对该CD30-CAR效应细胞具有特异性的抗原，并且其中该CD30-CAR效应细胞在接触该靶细胞时表达低细胞耗竭水平。
在一些实施方案中，CD30-CAR效应T细胞表达低水平的耗竭标志物，该耗竭标志物选自由以下组成的组：PD-1、TIM-3和LAG-3。在一些实施方案中，该CD30-CAR效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，该CD30-CAR效应T细胞表达低水平的PD-1。在一些实施方案中，该CD30-CAR效应T细胞表达低水平的TIM-3。在一些实施方案中，该CD30-CAR效应T细胞表达低水平的LAG-3。在一些实施方案中，该CD30-CAR效应细胞与表达包含CD28共刺激结构域的CAR的对应效应细胞相比表达更低水平的PD-1、TIM-3或LAG-3。例如，该CD30-CAR效应细胞与对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的PD-1，并且其中该CD30-CAR效应细胞与对应的CD28 CAR效应细胞的PD-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。例如，该CD30-CAR效应细胞与对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的TIM-3，并且其中该CD30-CAR效应细胞与对应的CD28 CAR效应细胞的TIM-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。例如，该CD30-CAR效应细胞与对应的CD28CAR效应细胞相比表达更低水平的LAG-3，并且其中该CD30-CAR效应细胞与对应的CD28 CAR效应细胞的LAG-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
在一些实施方案中，该CD30-CAR效应T细胞与表达包含4-1BB共刺激结构域的CAR的对应效应T细胞相比表达更低水平的PD-1、TIM-3或LAG-3。例如，该CD30-CAR效应T细胞与对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低细胞耗竭水平的PD-1，并且其中该CD30-CAR效应细胞与对应的4-1BB CAR效应细胞的PD-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。例如，该CD30-CAR效应细胞与对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低水平的TIM-3，并且其中该CD30-CAR效应细胞与对应的4-1BB CAR效应细胞的TIM-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。例如，该CD30-CAR效应细胞与对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低水平的LAG-3，并且其中该CD30-CAR效应细胞与对应的4-1BB CAR效应细胞的LAG-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
在一些实施方案中，“对应效应细胞”是指包含CAR的参考效应细胞，该CAR包含与受试者效应细胞中的CAR相同的细胞外靶结合结构域和初级信号传导结构域，但具有不同的共刺激结构域。受试者效应细胞中的CAR具有CD30共刺激结构域。对应效应细胞中的CAR(例如，参考效应细胞)不具有CD30共刺激结构域。在一些实施方案中，对应效应细胞中的CAR(例如，参考效应细胞)具有CD28共刺激结构域或4-1BB共刺激结构域。对应效应细胞的CAR可以具有与受试者效应细胞中的CAR相同的跨膜结构域。其还可以具有来自受试者效应细胞中的CAR的不同跨膜结构域。在一些实施方案中，对应效应细胞中的CAR具有CD28跨膜结构域和CD28共刺激结构域，而受试者效应细胞中的CAR具有CD30或CD8跨膜结构域和CD30共刺激结构域。在一些实施方案中，对应效应细胞中的CAR具有CD8跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域，而受试者效应细胞中的CAR具有CD8或CD30跨膜结构域和CD30共刺激结构域。在一些实施方案中，可以将包含CD30共刺激结构域的效应细胞在测量例如耗竭标志物(例如，PD-1、TIM-3或LAG-3)水平的相同条件下与对应效应细胞进行比较。
在这一方面的一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，该癌细胞来自选自由以下组成的组的癌症：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，癌细胞是血液癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是实体瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞是感染病毒的细胞，例如来自由选自由以下组成的组的病毒引起的病毒感染的感染病毒的细胞：巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、人乳头瘤病毒(HPV)、传染性软疣病毒(MCV)、人T细胞白血病病毒1(HTLV-1)、HIV(人免疫缺陷病毒)和丙型肝炎病毒(HCV)。
在另一个方面，本公开的特征在于一种治疗疾病的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何CAR、上文所述的核酸分子、上文所述的载体、上文所述的CD30-CAR效应细胞或上文所述的药物组合物的步骤。在一些实施方案中，该疾病为癌症。该癌症可以选自由以下组成的组：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，该癌症为血液癌。在一些实施方案中，该癌症为实体瘤癌症。在一些实施方案中，该疾病为病毒感染。
在另一个方面，本公开的特征在于一种预防和/或逆转受试者的T细胞耗竭的方法，该方法包括向所述受试者施用本文所述的任何CAR、上文所述的核酸分子、上文所述的载体、上文所述的CD30-CAR效应细胞或上文所述的药物组合物的步骤。在一些实施方案中，该方法降低T细胞中耗竭标志物的表达，例如，耗竭标志物可以选自由PD-1、TIM-3和LAG-3组成的组。
定义
本发明的范围由所附权利要求限定，并且不受本文所述的特定实施方案限制；阅读本公开的本领域技术人员将觉察到可以等同于此类所描述的实施方案或以其它方式在权利要求的范围内的各种修改。
通常，除非另有明确说明，否则本文所使用的术语根据其在本领域中的理解含义。下面提供了某些术语的外在定义；在整个本说明书中的这些和其它术语在特定实例中的含义对于本领域技术人员而言将从上下文中变得清楚。
为了可以更容易地理解本发明，下面首先定义了某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其它术语的附加定义。
施用：如本文所用，术语“施用”是指将组合物施用于受试者或系统(例如，施用于细胞、器官、组织、生物体或相关组分或其组分的集合)。普通技术人员将了解，施用途径可以根据例如组合物所施用的受试者或系统、组合物的性质、施用的目的等而变化。例如，在某些实施方案中，向动物受试者(例如，向人类)施用可以是通过支气管(包括通过支气管滴注)、经颊、肠内、真皮间、动脉内、皮内、胃内、肝内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、瘤内、静脉内、心室内、粘膜、鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、经皮、阴道和/或玻璃体进行。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇给药。在一些实施方案中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)。
亲和力：如本领域已知的，“亲和力”是特定配体与其配偶体结合的紧密度的量度。可以不同方式测量亲和力。在一些实施方案中，通过定量测定来测量亲和力。在一些此类实施方案中，结合配偶体浓度可以固定在过量的配体浓度以便模拟生理条件。可替代地或另外地，在一些实施方案中，可以改变结合配偶体浓度和/或配体浓度。在一些此类实施方案中，可以将亲和力与在相当的条件(例如，浓度)下的参考进行比较。
亲和力成熟的(或亲和力成熟的抗体)：如本文所用，是指具有其在一个或多个CDR(或在一些实施方案中，框架区)中的一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变导致与不具有那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力的改善。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体将具有对靶抗原的纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。可以通过本领域已知的多种程序中的任一种程序产生亲和力成熟的抗体。Marks等人，1992,BioTechnology 10:779-783描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变例如由以下文献描述：Barbas等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.91:3809-3813；Schier等人，1995,Gene 169:147-155；Yelton等人,1995.J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7):3310-9；以及Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.226:889-896。具有改善的结合特性的结合剂的选择由以下文献描述：Thie等人，2009，Methods Mol.Bio.525:309-22。
药剂：如本文所用，可以指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖化物、脂质、小分子、金属或它们的组合。在一些实施方案中，药剂是或包含天然产物，因为其在自然界中发现和/或从自然界中获得。在一些实施方案中，药剂是或包含一个或多个为人造的实体，因为其被设计、被工程化和/或通过人工的作用产生和/或在自然界中未发现。在一些实施方案中，药剂能以在分离或纯的形式被利用；在一些实施方案中，药剂能以粗产物形式被利用。在一些实施方案中，可以将潜在药剂作为例如可被筛选以鉴定或表征它们中的活性药剂的集合或文库提供。可以根据本发明利用的药剂的一些特定实施方案包括小分子、抗体、适体、核酸(例如，siRNA、shRNA、DNA/RNA杂交体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施方案中，药剂是或包含聚合物。在一些实施方案中，药剂不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物。在一些实施方案中，药剂含有至少一个聚合物部分。在一些实施方案中，药剂缺乏或基本上不含任何聚合物部分。
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准L-氨基酸中的任一种标准L-氨基酸。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是否是合成制备还是从天然来源获得。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或置换。可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或用可以改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的其它化学基团置换来修饰肽中的氨基酸(包括羧基和/或氨基末端氨基酸)。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一个或多个翻译后修饰，诸如与一种或多种化学实体(例如，甲基基团、乙酸根基团、乙酰基基团、磷酸根基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸根基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用术语的上下文中将显而易见其是指游离氨基酸还是指肽的残基。
动物：如本文所用，是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任一性别和在任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指在任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗或猴)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。
抗体部分：如本文所用，该术语涵盖全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区通常含有三个高度可变环(称为互补决定区(CDR))(轻链(LC)CDR包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDR包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani的惯例来限定或鉴定(Al-Lazikani 1997；Chothia1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)。重链或轻链的三个CDR插入已知为框架区(FR)的侧翼延伸段之间，该FR比CDR更高度保守并且形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。基于它们重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体被分配为多个类别。抗体的五个主要类别或同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。将几种主要抗体类别划分为亚类，诸如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
抗原结合片段或抗原结合部分：如本文所用，术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指抗体片段，包括例如双抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼源化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scFv)结合的相同抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合片段可以包含来自与来自一种或多种不同人抗体的框架区接枝的特定人抗体的一个或多个CDR。
生物活性：如本文所用，是指通过感兴趣的药剂或实体实现的可观察到的生物效应或结果。例如，在一些实施方案中，特异性结合相互作用是生物活性。在一些实施方案中，调整(例如，诱导、增强或抑制)生物途径或事件是生物活性。在一些实施方案中，通过检测由感兴趣的生物途径或事件产生的直接或间接产物来评估生物活性的存在或程度。
双特异性抗体：如本文所用，是指其中结合部分中的至少一个和通常两个结合部分是或包含抗体部分的双特异性结合剂。各种不同的双特异性抗体结构是本领域已知的。在一些实施方案中，双特异性抗体中是或包含抗体部分的每个结合部分包括VH区和/或VL区；在一些此类实施方案中，该VH区和/或VL区是在特定单克隆抗体中发现的那些区域。在一些实施方案中，在双特异性抗体含有两个抗体部分的情况下，每个抗体部分包括来自不同单克隆抗体的VH区和/或VL区。
如本文所用，术语“双特异性抗体”还指具有两个离散结合部分的多肽，每个离散结合部分结合不同的靶。在一些实施方案中，双特异性结合抗体是单一多肽；在一些实施方案中，双特异性结合抗体是或包含多个肽，在一些此类实施方案中，该多个肽可以彼此共价缔合，例如通过交联。在一些实施方案中，双特异性结合抗体的两个结合部分识别相同靶(例如，抗原)的不同位点(例如，表位)；在一些实施方案中，该两个结合部分识别不同的靶。在一些实施方案中，双特异性结合抗体能够同时结合具有不同结构的两个靶。
载剂：如本文所用，是指施用组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在一些示例性实施方案中，载剂可以包括无菌液体，例如水和油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。在一些实施方案中，载剂是或包括一种或多种固体组分。
CDR：如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”旨在表示在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原组合位点。重链和轻链的可变区中的每个可变区中存在三个CDR，对于可变区中的每个可变区该三个CDR被命名为CDR1、CDR2和CDR3。“CDR的组”或“CDR组”是指出现在能够结合抗原的单个可变区中的一组三个或六个CDR，或是指能够结合抗原的同源重链和轻链可变区的CDR。这些特定区域已经由以下文献描述：Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人，U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人，J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，用于指代抗体或接枝抗体或其变体的CDR的任一定义的应用旨在处于本文所定义和使用的术语的范围内。作为比较，在下表1中示出了涵盖如由上文引用的参考文献中的每一篇参考文献所定义的CDR的氨基酸残基。CDR预测算法和界面是本领域已知的，包括例如Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人，Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；以及Adolf-Bryfogle J.等人，Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。本段落中引用的参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中以用于本发明中，并且可能包含在本文的一个或多个权利要求中。
表1
Figure BDA0003522887730000201
Figure BDA0003522887730000211
1残基编号遵循Kabat等人，同上的命名法
2残基编号遵循Chothia等人，同上的命名法
3残基编号遵循MacCallum等人，同上的命名法
4残基编号遵循Lefranc等人，同上的命名法
5残基编号遵循Honegger和Plückthun，同上的命名法
嵌合抗原受体(CAR)：如本文所用，是指含有细胞外靶结合(例如，抗原结合)结构域的人工构建的杂交单链蛋白质或单链多肽，直接或间接与跨膜结构域(“TM结构域”，例如，共刺激分子的跨膜结构域)连接，其进而直接或间接地与包含初级免疫细胞信号传导结构域的细胞内信号传导结构域(ISD)(例如，参与T细胞或NK细胞激活的一个ISD)连接。细胞外靶结合结构域可以是衍生自抗体的单链可变片段(scFv)。除了scFv之外，其它单链抗原结合结构域也可以用于CAR中，例如，串联scFv、单结构域抗体片段(VHH或sdAb)、单结构域双特异性抗体(BsAb)、细胞内抗体、纳米抗体、单链形式的免疫因子、以及单链形式的Fab、Fab'或(Fab’)2。细胞外靶结合结构域可以经由柔性铰链/间隔区连接到TM结构域。细胞内信号传导结构域(ISD)包含初级信号传导序列或初级免疫细胞信号传导序列，其可以来自抗原依赖性的TCR相关T细胞激活分子，例如，TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内结构域的一部分。ISD还可以包含共刺激信号传导序列；例如，抗原独立性共刺激分子(诸如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体等)的细胞内结构域的一部分。CAR的特性包括其重定向免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)的能力、以MHC限制性(在TCR模拟抗体的情况下)或非MHC限制性(在针对细胞表面蛋白的抗体的情况下)方式针对选定靶的特异性和反应性、利用单克隆抗体的抗原结合特性。非MHC限制性抗原识别为表达CAR的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)提供识别独立于抗原处理的抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。
目前存在三代CAR。“第一代”CAR通常是由scFv作为抗原结合结构域融合到与细胞质/细胞内结构域融合的跨膜结构域构成的单链多肽，该细胞质/细胞内结构域包含初级免疫细胞信号传导序列诸如来自CD3ζ链(其是来自内源性TCR的信号的初级传递器)的细胞内结构域。“第一代”CAR可以独立于HLA介导的抗原呈递通过单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域提供从头抗原识别并引起CD4+和CD8+T细胞两者的激活。“第二代”CAR将来自各种共刺激分子(例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40)的细胞内结构域添加到CAR的初级免疫细胞信号传导序列以向T细胞提供另外的信号。因此，“第二代”CAR包含提供共刺激(例如，CD28或4-IBB)和激活(例如，CD3ζ)的片段。临床前研究表明，“第二代”CAR可以改善T细胞的抗肿瘤活性。例如，在靶向患有慢性淋巴母细胞白血病(CLL)和急性淋巴母细胞白血病(ALL)的患者的CD19分子的临床试验中证明了“第二代”CAR修饰的T细胞的稳健功效。“第三代”CAR包含提供多种共刺激(例如，CD28和4-1BB)和激活(例如，CD3ζ)的那些片段。描述了CAR T疗法的实例，参见例如美国专利号10,221,245(其描述了具有抗CD19细胞外靶结合结构域、来自CD8的跨膜结构域、来自4-1BB的共刺激结构域和来自CD3ζ的初级信号传导结构域的CARCTL019)以及美国专利号9,855,298(其描述了具有抗CD19细胞外靶结合结构域、来自CD28的共刺激结构域和来自CD3ζ的初级信号传导结构域的CAR)。
过继性细胞疗法：过继性细胞疗法是通常包括分离和离体扩增和/或操纵免疫细胞(例如，NK细胞或T细胞)并且随后向患者施用这些细胞例如用于治疗癌症的一种治疗方法。所施用的细胞可以是自体的或同种异体的。可以已知方式中的任何一种方式(包括例如通过使用RNA和DNA转染、病毒转导、电穿孔，所有这些都是本领域已知的技术)操纵细胞以表达工程化受体(包括CAR)。
术语“过继性细胞治疗组合物”是指包含适合于过继性细胞转移的细胞的任何组合物。在示例性实施方案中，过继性细胞治疗组合物包含选自由以下组成的组的细胞类型：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和CAR(即，嵌合抗原受体)和/或修饰的淋巴细胞(例如，CAR T细胞)。在另一个实施方案中，过继性细胞治疗组合物包含选自由以下组成的组的细胞类型：T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、δγT细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞。在另一个实施方案中，TIL、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、δγT细胞、调节性T细胞或外周血单核细胞形成过继性细胞治疗组合物。在一个实施方案中，过继性细胞治疗组合物包含T细胞。
在一些实施方案中，细胞中表达的包含CD30共刺激结构域的CAR是第一代、第二代或第三代CAR，如上文所述。根据本发明公开的主题，本文提供的工程化免疫细胞的CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。WO 2019032699描述了共表达CAR和诱导型双特异性抗体的T细胞。
相当的：如本文所用，是指两种或更多种药剂、实体、情况、条件集合等可能彼此不相同，但足够类似以允许在其间进行比较，使得基于观察到的差异或相似性可以合理地得出结论。在一些实施方案中，相当的条件集合、情况、个体或群体的特征在于多个基本上相同的特征和一个或少量不同的特征。在上下文中，本领域普通技术人员将理解，对于两种或更多种此类药剂、实体、情况、条件集合等在任何给定情况下需要什么程度的同一性以被认为是相当的。例如，本领域普通技术人员将理解，当以足够数量和类型的基本上相同的特征来表征以保证合理的结论，即由在不同的情况、个体或群体的集合下或用不同的情况、个体或群体的集合所获得的结果或所观察到的现象的差异由变化的那些特征的变化引起或指示变化的那些特征的变化时，情况、个体或群体的集合彼此是相当的。
对照：如本文所用，是指“对照”是结果与之比较的标准的本领域理解的含义。通常，将对照用于通过分离变量来增加实验的完整性以便关于此类变量得出结论。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时执行以提供比较器的反应或测定。如本文所用，“对照”可以指“对照抗体”。“对照抗体”可以是如本文所述的人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR接枝的抗体、多特异性抗体或双特异性抗体、如本文所述不同的抗体、或亲本抗体。在一个实验中，应用“测试”(即，所测试的变量)。在第二个实验中，不应用“对照”(所测试的变量)。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，以前进行的测试或测定，或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包含印刷或以其它方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。
对应于：如本文所用，指定感兴趣的多肽中的氨基酸残基的位置/同一性。本领域普通技术人员将了解，出于简单的目的，通常使用基于参考相关多肽的规范编号系统来指定多肽中的残基，使得“对应于”位置190处的残基的氨基酸例如实际上不必是在特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于在参考多肽中的190处发现的残基；本领域普通技术人员容易地了解如何鉴定“对应”氨基酸。
检测实体/药剂：如本文所用，是指可检测的任何元素、分子、官能团、化合物、片段或部分。在一些实施方案中，提供或使用单独的检测实体。在一些实施方案中，提供和/或利用与另一种药剂缔合(例如，连接)的检测实体。检测实体的实例包括但不限于：各种配体、放射性核素(例如，3H、14C、18F、19F、32P、35S、135I、125I、123I、64Cu、187Re、111In、90Y、99mTc、177Lu、89Zr等)、荧光染料(关于特定的示例性荧光染料，参见下文)、化学发光剂(例如，吖啶酯、稳定的二氧杂环己烷等)、生物发光剂、光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)、纳米团簇、顺磁性金属离子、酶(关于酶的具体实例，参见下文)、比色标记(例如染料、胶体金等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原和抗血清或单克隆抗体对其可用的蛋白质。
效应子功能：如本文所用，是指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体介导的细胞毒性(CMC)。在一些实施方案中，效应子功能是在结合抗原之后运作的效应子功能、独立于抗原结合运作的效应子功能、或两者。
效应细胞：如本文所用，是指介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。在一些实施方案中，效应细胞可以包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大的粒状淋巴细胞、朗格汉斯(Langerhans)细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞中的一种或多种并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
经工程化：如本文所用，通常是指由人工操纵的方面。例如，在一些实施方案中，当不以自然界中的顺序连接在一起的两个或更多个序列通过人工操纵而在经工程化多核苷酸中直接彼此连接时，多核苷酸可被视为“经工程化”。在一些特定的此类实施方案中，经工程化多核苷酸可以包含自然界中存在的与第一编码序列可操作缔合但不与第二编码序列可操作缔合的调控序列，所述调控序列通过人工连接而使得其与第二编码序列可操作缔合。可替代地或另外地，在一些实施方案中，各自编码在自然界中彼此不连接的多肽元件或结构域的第一核酸序列和第二核酸序列可以在单个经工程化的多核苷酸中彼此连接。相比之下，在一些实施方案中，如果细胞或生物体已被操纵而使得其遗传信息被改变(例如，之前不存在的新遗传物质已经被引入，或者之前存在的遗传物质已被改变或移除)，则该细胞或生物体可以被视为“经工程化”。如通常实践并且由本领域的技术人员所理解的，即使实际的操纵是对先前的实体进行的，经工程化多核苷酸或细胞的后代通常仍然被称为“经工程化”。此外，本领域的技术人员将了解，可以通过多种可用的方法来实现如本文所述的“工程化”。例如，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及通过使用计算机系统进行选择或设计(例如，核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体的选择或设计)，该计算机系统被编程以进行分析或比较，或者以其他方式分析、建议和/或选择序列、改变等)。可替代地或另外地，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及使用体外化学合成方法和/或重组核酸技术(例如核酸扩增(例如经由聚合酶链反应)杂交、突变、转化、转染等)和/或多种受控交配方法中的任一种。如将由本领域的技术人员所了解，多种确立的此类技术(例如，用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染等))是本领域熟知的并且在整个本说明书中所引用和/或讨论的多篇一般和更具体的参考文献中有描述。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。
表位：如本文所用，包括由免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性地识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团构成。在一些实施方案中，当抗原采用相关三维构象时，此类化学原子或基团被表面暴露。在一些实施方案中，当抗原采用这样的构象时，此类化学原子或基团在空间中彼此物理地接近。在一些实施方案中，当抗原采用替代构象(例如，是线性化的)时，至少一些此类化学原子是彼此物理地分离的基团。本文所述的抗体部分可以与以下表位结合，该表位包含介于7个与50个之间的氨基酸(例如，介于7个与50个之间的连续氨基酸)，例如，介于7个与45个之间、介于7个和介于7个与40个之间、介于7个与35个之间、介于7个与30个之间、介于7个与25个之间、介于7个与20个之间、介于7个与15个之间、介于7个与10个之间、介于10个与50个之间、介于15个与50个之间、介于20个与50个之间、介于25个与50个之间、介于30个与50个之间、介于35个与50个之间、介于40个与50个之间、介于45个与50个之间、介于10个与45个之间、介于15个与40个之间、介于20个与35个之间、或介于25个与30个之间的氨基酸。
赋形剂：如本文所用，是指可以包含在药物组合物中例如以提供或有助于所需的稠度或稳定作用的非治疗剂。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
表达盒：如本文所用，是指当引入宿主细胞中时分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。
异源的：如本文所用，是指不在宿主细胞或宿主生物体中天然存在的多核苷酸或多肽。可以使用熟知的重组方法例如使用包含任选地与启动子连接的异源多核苷酸的表达盒将异源多核苷酸或多肽引入宿主细胞或宿主生物体中。
框架或框架区：如本文所用，是指可变区减去CDR的序列。因为可以通过不同系统确定CDR序列，所以同样地框架序列受到相应不同的解释。在每条链上，六个CDR将重链和轻链上的框架区划分为四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1定位于FR1与FR2之间、CDR2定位于FR2与FR3之间并且CDR3定位于FR3与FR4之间。在不指定特定子区域作为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，框架区(如其它)表示单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。如本文所用，FR表示四个子区域中的一个子区域，FR1例如表示与可变区的氨基末端最接近并且相对于CDR1的5'的第一框架区，并且FRs表示构成框架区的子区域中的两个或更多个子区域。
宿主细胞：如本文所用，是指已经向其中引入了外源DNA(重组或以其它方式)的细胞。本领域技术人员在阅读本公开后将理解，此类术语不仅指特定的受试者细胞，而且还指这样的细胞的后代。因为某些修饰可以因突变或环境影响而出现在后续世代中，所以这样的后代事实上可以与亲本细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括选自适合于表达外源DNA(例如，重组核酸序列)的任何生命王国的原核和真核细胞。示例性细胞包括原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞、或细胞融合物(例如杂交瘤或四重杂交瘤(quadroma))。在一些实施方案中，宿主细胞是人、猴、无尾猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的并且选自以下细胞：CHO(例如CHO Kl、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏细胞(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、塞尔托利细胞(Sertoli cell)、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞、以及来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
人抗体：如本文所用，旨在包括具有从人免疫球蛋白序列产生(或组装)的可变区和恒定区的抗体。在一些实施方案中，抗体(或抗体部分)可以被认为是“人”的，即使其氨基酸序列包括例如在一个或多个CDR以及尤其是CDR3中的、不由人种系免疫球蛋白序列编码的残基或元素(例如，包括例如可以(最初)通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的序列变化)。人抗体、人抗体部分和它们的片段可以从人免疫细胞中分离或通过重组或合成(包括半合成)产生。
人源化：如本领域已知的，术语“人源化”通常用于指其氨基酸序列包含来自非人物种(例如，小鼠)中产生的参考抗体的VH区和VL区序列、但也包含相对于旨在使其更多“人样”(即，更类似于人种系可变序列)的参考抗体的在那些序列中的修饰的抗体(或部分)。在一些实施方案中，“人源化”抗体(或抗体部分)是免疫特异性地结合感兴趣的抗原并且具有基本上含有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区以及基本上含有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的“人源化”抗体(或抗体部分)。人源化抗体包含至少一个以及通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体免疫球蛋白)的那些，并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一些实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域两者。抗体还可以包含重链恒定区的CH1、铰链、CH2、CH3和任选地CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化VL区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化VH区。在一些某些实施方案中，人源化抗体含有人源化VH区和VL区。
亲水性：如本文所用，术语“亲水性”和/或“极性”是指与水混合或容易地溶解在水中的趋势。
疏水性：如本文所用，术语“疏水性”和/或“非极性”是指排斥水、不与水组合或不能容易地溶解在水中的趋势。
改进、增加或减少：如本文所用，或它们的语法等同物指示相对于基线测量值的值，该基线测量值诸如为在开始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量值、或在不存在本文所述的治疗的情况下在一个对照个体(或多个对照个体)中的测量值。“对照个体”是患有与受治疗的个体相同形式的疾病或伤害的个体。在一些实施方案中，与在接受治疗之前的个体或与对照个体相比，用于使用本文所述的CAR治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法可以将在个体中的细胞凋亡增加(例如，将肿瘤细胞凋亡增加)至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。在一些实施方案中，与在接受治疗之前的个体或与对照个体相比，用于使用本文所述的CAR治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法可以将在个体中的肿瘤大小减少(例如，将肿瘤大小减小)至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在体外：如本文所用，是指在人造环境中(例如在试管或反应容器中，在细胞培养物等中)而不是在多细胞生物体内发生的事件。
在体内：如本文所用，是指在多细胞生物体(诸如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的语境中，该术语可以用于指在活细胞内(与例如体外系统相对)发生的事件。
分离：如本文所用，是指已经(1)在最初产生时(无论在自然界中和/或在实验设置中)从其所关联的组分中的至少一些组分中分开的物质和/或实体，和/或(2)经人工设计、生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以从约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的它们最初所关联的其它组分中分开。在一些实施方案中，分离的药剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其它组分，则它是“纯的”。在一些实施方案中，如将由本领域的技术人员所理解，在与某些其它组分(例如，一种或多种载剂或赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等))组合后，物质仍可以被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施方案中，计算不包括此类载剂或赋形剂的物质的分离百分比或纯度。仅举一个例子，在一些实施方案中，在自然界中存在的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸a)在因其衍生的起源或来源而不与在自然界中在其天然状态下伴随其的一些或全部组分关联时；b)在其实质上不含与在自然界中产生其的物种相同的物种的其它多肽或核酸时；c)在由不是在自然界中产生其的物种的细胞或其它表达系统表达或以其他方式与这些细胞或其它表达系统的组分关联时，被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成或在与在自然界中产生多肽的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施方案中，已历经一种或多种纯化技术的多肽在其已与a)在自然界中与其关联的；和/或b)当最初产生时与其关联的其他组分分开的程度上可被认为是“分离的”多肽。
KD：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其配偶体(例如，抗体药剂或其结合组分结合的表位)的复合物的解离常数。
koff：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其配偶体(例如，抗体药剂或其结合组分结合的表位)的复合物解离的解离速率常数。
kon：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)与其配偶体(例如，抗体药剂或其结合组分结合的表位)结合的结合速率常数。
接头：如本文所用，用于指多元件多肽的将不同元件彼此连接的那个部分。例如，本领域普通技术人员会了解，其结构包括两个或更多个功能性或组织性结构域的多肽通常包括将该功能性或组织性结构域彼此连接的在此类结构域之间的氨基酸延伸段。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有通式S1-L-S2的总体结构，其中S1和S2可以是相同的或不同的，并且表示通过接头彼此缔合的两个结构域。在一些实施方案中，接头为至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个氨基酸长。在一些实施方案中，接头具有介于3个与7个之间的氨基酸、介于7个与15个之间的氨基酸、或介于20个与30个之间(例如，介于20个与25个之间或介于25个与30个之间)的氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是给多肽提供柔性。在工程化本领域已知的多肽(例如，融合多肽)时可以适当地使用各种不同的接头元件(参见例如，Holliger,P.等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448；Poljak,R.J.等人，1994,Structure 2:1121-1123)。
多价结合抗体(或多特异性抗体)：如本文所用，是指能够结合可以在同一分子上或在不同分子上的两种或更多种抗原的抗体。在一些实施方案中，如本文所述的多价结合抗体被工程化成具有两个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的蛋白质。如本文所述的多价结合抗体是指能够结合两个或更多个相关或不相关靶的抗体。多价结合抗体可以由单个抗体部分的多个拷贝或不同抗体部分的多个拷贝构成。此类抗体能够结合两种或更多种抗原并且可以是四价或多价的。多价结合抗体可以另外地包含治疗剂，例如免疫调节剂、毒素或RNase。在一些实施方案中，如本文所述的多价结合抗体能够同时结合至少两个具有不同结构的靶，例如，两种不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位。本发明的多价结合抗体可以是单特异性的(能够结合一种抗原)或多特异性(能够结合两种或更多种抗原)，并且可以由两个重链多肽和两个轻链多肽构成。在一些实施方案中，每个结合位点由重链可变结构域和轻链可变结构域构成，其中总共六个CDR涉及每个抗原结合位点的抗原结合。
核酸：如本文所用，在其最广泛的意义上，是指作为寡核苷酸链或可以掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是作为寡核苷酸链或可以通过磷酸二酯键掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文中将清楚的是，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基，包含一个或多个天然核酸残基，或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸是一种或多种核酸类似物，包含一种或多种核酸类似物，或由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物不同于核酸，因为核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”、或由一个或多个“肽核酸”组成，这些肽核酸是本领域已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被视为在本发明的范围内。可替代地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯键和/或5'-N-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含一个或多个天然核苷、或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、嵌入型碱基以及它们的组合)、包含一个或多个核苷类似物或由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施方案中，核酸包含一种或多种与天然核酸中的那些糖相比被修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物(诸如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸通过下述方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶促合成、在重组细胞或系统中的复制以及化学合成。在一些实施方案中，核酸为至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、20个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或更多个残基长。在一些实施方案中，核酸是单链的。在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，“核酸”具有包含至少一个元件的核苷酸序列，该至少一个元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施方案中，核酸具有酶促活性。
可操作地连接：如本文所用，是指其中所描述的组分处于允许它们以它们的预期方式发挥功能的关系中的并置。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，使得在与该控制序列相容的条件下实现该编码序列的表达。“可操作地连接”的序列包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列和按照反式或在一定距离发挥作用以控制所述感兴趣基因的表达控制序列。如本文所用的术语“表达控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括这样的组分：它们的存在对于表达和加工来说是必需的，并且还可以包括这样的附加组分，它们的存在是有利的，例如前导序列和融合伴侣序列。
生理条件：如本文所用，具有其在本领域理解的含义，是指细胞或生物体生活和/或繁殖的条件。在一些实施方案中，该术语是指对于生物体或细胞系统可以在自然界中存在的外部或内部环境的条件。在一些实施方案中，生理条件是存在于人或非人动物体内的那些条件，尤其是存在于手术部位处和/或手术部位内的那些条件。生理条件通常包括例如20-40℃的温度范围、大气压力1、pH 6-8、1-20mM的葡萄糖浓度、在大气水平的氧浓度和如它在地球上遇到的重力。在一些实施方案中，实验室中的条件被操纵和/或维持在生理条件下。在一些实施方案中，在生物体中遇到生理条件。
多肽：如本文所用，是指氨基酸的任何聚合链。在一些实施方案中，氨基酸通过肽键或经修饰的肽键彼此连接。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有不在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有因为它是合成设计和/或产生的而被工程化的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者，或者由其组成。在一些实施方案中，多肽可以包含仅天然氨基酸或仅非天然氨基酸，或者由仅天然氨基酸或仅非天然氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包含L-氨基酸。
在一些实施方案中，多肽可以包括一个或多个侧基或其它修饰，例如，在多肽的N末端、在多肽的C末端、或其任何组合，修饰或附接到一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可以选自由以下组成的组：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括它们的组合。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可以是或包含stapled多肽。在一些实施方案中，术语“多肽”可以附加到参考多肽、活性或结构的名称中；在此类情形中，其在本文中用于指共享相关活性或结构并且因此可以被认为是相同类别或多肽家族的成员的多肽。对于每个这样的类别，本说明书提供了和/或本领域技术人员将了解在其氨基酸序列和/或功能已知的类别内的示例性多肽；在一些实施方案中，此类示例性多肽是多肽类别的参考多肽。
在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员与该类别的参考多肽(在一些实施方案中，与该类别中的所有多肽)显示显著的序列同源性或同一性，共享共同的序列基序(例如，特征序列元件)和/或共享共同活性(在一些实施方案中，在相当的水平或在指定范围内)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示与参考多肽的总体序列同源性或同一性程度为至少约30％至40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，和/或包括显示出非常高的序列同一性(通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％)的至少一个区域(即，在一些实施方案中可以是或包含特征序列元件的保守区)。这样的保守区通常涵盖至少三个至四个以及通常至多20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区涵盖至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个连续氨基酸的至少一个延伸段。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含亲本多肽的片段或由其组成。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含多个片段或由多个片段组成，多个片段中的每一个片段相对于彼此以与感兴趣的多肽中发现的空间排列不同的空间排列在相同亲本多肽中发现(例如在亲本中直接连接的片段可以在感兴趣的多肽中在空间上分开，或反之亦然，和/或片段可以在感兴趣的多肽中以与在亲本中不同的次序存在)，使得感兴趣的多肽是其亲本多肽的衍生物。
预防：如本文所用，当与疾病、病症和/或病状的发生结合使用时，是指降低发展疾病、病症和/或病状的风险和/或延迟疾病、病症或病状的一种或多种特征或症状的发作。当疾病、病症或病状的发作已经延迟了预定时间段时，预防可以被认为是完全的。
重组：如本文所用，旨在指通过重组手段设计、工程化、制备、表达、产生或分离的多肽(例如，抗体或抗体部分)，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽、从重组组合的合并人类多肽文库分离的多肽(Hoogenboom H.R.,1997,TIB Tech.15:62-70；Azzazy H.和Highsmith W.E.,2002,Clin.Biochem.35:425-45；Gavilondo J.V.和LarrickJ.W.,2002,Bio Techniques 29:128-45；Hoogenboom H.和Chames P.,2000,Immunol.Today 21:371-8)、从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.等人，1992,Nucl.Acids Res.20:6287-95；Kellermann S-A.和Green L.L.,2002,Curr.Opin.Biotech.13:593-7；Little,M.等人，2000,Immunol.Today 21:364-70；Murphy,A.J.等人，2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-8)或通过涉及彼此剪接所选定序列元件的任何其它方式制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一个或多个是天然存在的。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一个或多个是通过计算机模拟设计的。在一些实施方案中，一个或多个此类选定的序列元件由已知序列元件(例如，来自天然或合成来源)的诱变(例如，体内或体外)产生。例如，在一些实施方案中，重组抗体由在感兴趣的源生物体(例如，人、小鼠等)的种系中发现的序列构成。在一些实施方案中，重组抗体具有由诱变(例如，体外或体内，例如在转基因动物中)产生的氨基酸序列，使得该重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是在从种系VH和VL序列来源和与之相关的同时可以不天然存在于体内种系抗体组库内的序列。
参考：如本文所用，描述了如本文所述进行比较的标准、对照或其它适当的参考。例如，在一些实施方案中，参考是与感兴趣的药剂、动物、个体、群体、样品、序列、步骤系列、条件集合或值比较的标准或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列、步骤系列、条件集合或值。在一些实施方案中，基本上与感兴趣的测试或确定同时测试和/或确定参考。在一些实施方案中，参考是历史参考，任选地体现在有形介质中。通常，如本领域技术人员将理解的，在与感兴趣的评估中利用的条件相当的条件下确定或表征参考。
特异性结合：如本文所用，是指结合剂在发生结合的环境中对可能的配偶体进行区分的能力。当存在其它潜在靶时与一个特定靶相互作用的结合剂被称为“特异性地结合”与其相互作用的靶。在一些实施方案中，通过检测或确定结合剂与其配偶体之间的缔合程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或确定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或确定结合剂竞争在其配偶体与另一实体之间的替代相互作用的能力来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过在一系列浓度范围内执行此类检测或确定来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过确定在同源靶和非同源靶之间的结合亲和力的差异来评估特异性结合。例如，结合剂可以具有比对非同源靶的结合亲和力高约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍的对同源靶的结合亲和力。
特异性：如本领域已知的，“特异性”是特定配体将其结合配偶体与其它潜在结合配偶体进行区分的能力的量度。
受试者：如本文所用，意指任何哺乳动物，包括人。在本发明的某些实施方案中，该受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，使用术语“个体”或“患者”，并且旨在可与“受试者”互换。本发明还考虑了药物组合物的施用和/或治疗方法在子宫中的表现。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或几乎全部范围或程度的定性状况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)进行至完成和/或进行至完全，或实现或避免绝对的结果。因此本文使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象固有的完全性的潜在缺乏。
基本序列同源性：如本文所用，短语“基本同源性”是指氨基酸序列或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所了解，如果两个序列在对应的位置上含有同源的残基，则它们通常被认为是“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。可替代地，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域的普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或被归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的置换通常可以被认为是“同源”置换。典型的氨基酸分类总结如下：
Figure BDA0003522887730000371
如本领域中所熟知，氨基酸序列或核酸序列可以使用多种算法中的任何算法来进行比较，该算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。此类示例性程序描述于Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-410；Altschul等人，1996,Meth.Enzymology 266:460-480；Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Baxevanis等人，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人，(编辑)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology,第132卷),Humana Press,1999。除了鉴定同源序列以外，上文提及的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基在残基的相关延伸段上有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多是同源的，则认为这两个序列是基本上同源的。在一些实施方案中，相关延伸段是完整序列。在一些实施方案中，相关延伸段是至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个、至少425个、至少450个、至少475个、至少500个或更多个残基。
表面等离子体共振：如本文所用，是指允许实时分析特异性结合相互作用的光学现象，例如通过检测在生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变，诸如通过使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden和Piscataway,N.J.)。关于另外的描述，参见Jonsson,U.等人，1993,Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.等人，1991,Biotechniques11:620-627；Johnsson,B.等人，1995,J.Mol.Recognit.8:125-131；以及Johnsson,B.等人，1991,Anal.Biochem.198:268-277。
治疗剂：如本文所用，通常是指当施用于生物体时引发期望的药理学效果的任何药剂。在一些实施方案中，如果药剂在适当群体中展示出统计上显著的效果，那么该药剂被视为治疗剂。在一些实施方案中，适当群体可以是模型生物体的群体。在一些实施方案中，可以通过各种标准来定义适当群体，诸如某个年龄组、性别、遗传背景、预先存在的临床病状等。在一些实施方案中，治疗剂是可以用于缓解、改善、缓解、抑制、预防疾病、病症和/或病状，延迟疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发生率的物质。在一些实施方案中，“治疗剂”是在其可以被销售供施用于人类之前已经或需要获得政府机构批准的药剂。在一些实施方案中，“治疗剂”是需要医疗处方来施用于人类的药剂。
治疗有效量：如本文所用，意指所施用的产生期望效果的量。在一些实施方案中，该术语是指当根据治疗给药方案施用于患有或易患疾病、病症和/或病状的群体时足以治疗该疾病、病症和/或病状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的发生率和/或降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的严重程度和/或延迟疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的发作的量。本领域普通技术人员将了解，术语“治疗有效量”实际上不要求在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是在施用于需要这种治疗的患者时在相当多的受试者中提供特定的所需药理学反应的量。在一些实施方案中，提及治疗有效量可以指在一种或多种特定组织(例如，受疾病、病症或病状影响的组织)或流体(例如，血液、唾液、血清、汗液、眼泪、尿液等)中测量到的量。本领域的普通技术人员将会了解，在一些实施方案中，可以单剂量配制和/或施用治疗有效量的特定药剂或疗法。在一些实施方案中，可以多个剂量(例如作为给药方案的一部分)配制和/或施用治疗有效的药剂。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)在其最广泛的意义上是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症或病状的一种或多种症状、特征和/或病因，延迟其发作，降低其严重程度，和/或降低其发生率的物质(例如，所提供的组合物)的任何施用。在一些实施方案中，可以将这种治疗施用于未表现出相关疾病、病症和/或病状的体征的受试者和/或用于仅表现出疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者。可替代地或另外地，在一些实施方案中，可以将治疗施用于表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定体征的受试者。在一些实施方案中，可以将治疗用于已被诊断为患有相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，可以将治疗用于已知具有与发展相关疾病、病症和/或病状的风险增加在统计学上相关的一种或多种易感因素的受试者。
变体：如本文所用，术语“变体”是指与参考实体相比在一个或多个化学部分的存在或水平方面显示出与参考实体显著的结构同一性但与参考实体在结构上不同的实体。在许多实施方案中，变体与其参考实体在功能上也不同。通常，特定实体是否正确被认为是参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将了解，任何生物学或化学参考实体具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共享一个或多个此类特征性结构元件的不同化学实体。仅举几个例子，多肽可以具有由在线性或三维空间上相对于彼此具有指定位置和/或有助于特定生物学功能的多个氨基酸构成的特征性序列元件，核酸可以具有由在线性或三维空间上相对于彼此具有指定位置的多个核苷酸残基构成的特征性序列元件。例如，变体多肽可以由于氨基酸序列的一个或多个差异和/或与多肽主链共价附接的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)的一个或多个差异而不同于参考多肽。在一些实施方案中，变体多肽显示出与参考多肽至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。可替代地或另外地，在一些实施方案中，变体多肽不与参考多肽共享至少一个特征性序列元件。
在一些实施方案中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽共享参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，变体多肽缺乏参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，与参考多肽相比，变体多肽显示出一种或多种生物活性的水平降低。在许多实施方案中，如果感兴趣的多肽具有与亲本的氨基酸序列相同但在特定位置处具有少量序列改变的氨基酸序列，则认为该感兴趣的多肽是亲本或参考多肽的“变体”。通常，与亲本相比，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基被置换。在一些实施方案中，与亲本相比，变体具有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个置换的残基。通常，变体具有非常少量(例如，少于5个、4个、3个、2个或1个)的置换的官能残基(即，参与特定生物活性的残基)的数量。此外，与亲本相比，变体通常具有不超过5个、4个、3个、2个或1个插入或缺失，并且通常没有插入或缺失。此外，任何添加或缺失通常都少于约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个，并且通常少于约5个、约4个、约3个或约2个残基。在一些实施方案中，亲本或参考多肽是在自然界中存在的多肽。如本领域普通技术人员将理解，特定感兴趣的多肽的多个变体通常可以在自然界中存在，特别是当感兴趣的多肽是感染因子多肽时。
载体：如本文所用，是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。可以将其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体在引入宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
野生型：如本文所用，术语“野生型”具有其本领域理解的含义，是指具有如在自然界中在“正常”(相对于突变的、变异的、患病的、改变的等)状态或环境中存在的结构和/或活性的实体。本领域的普通技术人员将会了解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。
附图说明
图1：CD8+受体CAR T细胞的流式细胞术分析。图1示出了在靶接合之前T细胞分化标志物CCR7和CD45RA在CAR-T细胞中的表达。在Q1(低CCR7和高CD45RA表达水平)、Q2(高CCR7和高CD45RA)、Q3(高CCR7和低CD45RA)和Q4(低CCR7和低CD45RA)中的值分别表示在该群体中属于效应、原初、中央记忆和效应记忆T细胞亚群的T细胞的百分比。
图2：一组所测试的αCD19 CAR对CD19+Nalm6白血病细胞系的T细胞介导的短期靶细胞杀伤(16小时)。
图3A：在Nalm6靶细胞接合后αCD19 CAR T细胞的CFSE稀释/增殖测定。分别示出了在第一次接合和第二次接合后第3天和第7天的αCD19-CAR T细胞的增殖。
图3B：在与Raji细胞接合后CAR T细胞的CFSE稀释曲线。
图4A和4B：由表达一组αCD19 CAR的T细胞介导的对Nalm6靶细胞的杀伤。图4A示出了CD3+αCD19 CAR-T细胞的数量，并且图4B示出了在若干次接合后剩余的CD19+靶细胞的数量。
图5A和5B：在与αCD19+Nalm6或Raji靶细胞第二次接合后3天(E2D3)在αCD19-CD28z和-CD30z CAR T细胞中的耗竭标志物PD-1表达的测量。
图6A和6B：在与Nalm6或Raji细胞第二次接合后3天(E2D3)在αCD19-CD8T-41BBz和-CD8T-CD30z CAR T细胞中的耗竭标志物PD-1表达。
图7A和7B：在与Nalm6接合的情况下在αCD19 CAR T细胞中PD-1表达随时间(E1D3-E2D7)的MFI。
图7C和7D：在与Raji细胞接合的情况下在αCD19 CAR T细胞中PD-1表达随时间(E1D3-E2D7)的MFI。
图8：在AFP+HepG2细胞系上测试了一组αAFP CAR T细胞的短期杀伤(16小时)。
图9：分别在第一次接合后和第二次接合后第3天和第7天在与AFP+靶细胞系HepG2接合后αAFP CAR-T细胞的CFSE增殖测定。
图10A和10B：在与HepG2靶细胞第二次接合后第3天在αAFP CAR T细胞中的PD-1表达的MFI。
图11A和11B：在多个时间点中在HepG2接合后在αAFP CAR T细胞中的中值荧光强度(MFI)的比较。
图12A和12B：通过αCD19-CAR对Raji靶细胞的杀伤。图12A示出了在与表达αCD19CAR的T细胞接合后的几天时段期间对Raji细胞的杀伤。图12B示出了在接合后的相同时间段内的αCD19 CD3+CAR T细胞。
图13A：在接合后几天αCD19-CD30z和αCD19-CD8T-41BBz CAR T细胞对Raji靶细胞的杀伤。
图13B：在与Raji靶细胞接合后的几天期间剩余的αCD19-CD30z和αCD19-CD8T-41BBz CAR T细胞计数。
具体实施方式
本发明涉及以下发现：CAR使用来自CD30的共刺激结构域(在本文中也称为CD30共刺激结构域)，以及表达这些CAR的T细胞的PD-1(T细胞激活抑制剂)表达远远少于具有含有来自例如CD28或4-1BB的共刺激结构域的CAR的T细胞。具有包含CD30共刺激结构域的CAR的T细胞提供了优异的肿瘤细胞杀伤持续性。本发明还提供了此类CAR和表达此类CAR的T细胞治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的用途。
I.嵌合抗原受体(CAR)
本公开提供了包含以下项的嵌合抗原受体(CAR)：(a)包含抗体部分的细胞外靶结合结构域；(b)跨膜结构域；(c)CD30共刺激结构域；和(d)初级信号传导结构域。共刺激结构域和初级信号传导结构域是CAR的细胞内信号传导结构域的部分。如本文所描述和所展示的，具有含有来自CD30的共刺激结构域的CAR的T细胞表达比具有含有来自例如CD28或4-1BB的共刺激结构域的CAR的T细胞少得多的PD-1(一种T细胞激活抑制剂)。具有含有来自CD30的共刺激结构域的CAR的T细胞也表现出细胞毒性潜力的持久性。来自CD30的共刺激结构域可以改善导致T细胞耗竭的功能无反应性，即应变力缺乏。CD30共刺激结构域向T细胞提供优异的肿瘤细胞杀伤持久性的能力是出乎意料的，因为CD30缺乏被认为对CAR共刺激至关重要的p56lck结合位点。
在一些实施方案中，间隔结构域可以存在于(a)与(b)之间、(b)与(c)之间和/或(c)与(d)之间。间隔结构域可以是用于连接CAR的两个部分的任何寡核苷酸或多肽。间隔结构域可以包含至多约300个氨基酸，包括例如约10个至约100个或约25个至约50个氨基酸。本文所述的CAR的示例性序列可以在非正式序列表的表格中找到。在一些实施方案中，将具有myc标签的CAR用于体外和临床前测定。对于体内使用(即在人类中的体内使用)，使用不含myc标签的对应CAR构建体。
靶抗原
在一些实施方案中，本文所述的CAR包含与细胞表面抗原特异性地结合的抗原结合模块，其中所述细胞表面抗原是CD19、CD20、CD22、CD47、CD158e、GPC3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D、FcRL5、MUC16、MCT4、或PSMA，包括它们的变体或突变体。与完整抗原(例如，细胞表面抗原)的特异性结合有时被称为“非MHC限制性结合”。在一些实施方案中，本文所述的CAR包含与含有肽和MHC蛋白的复合物特异性地结合的抗原结合模块，其中该肽衍生自选自由以下组成的组的蛋白质：WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、FoxP3、组蛋白H3.3和PSA，包括它们的变体或突变体。与包含肽和MHC蛋白的复合物的特异性结合有时被称为“MHC限制性结合”。
在一些实施方案中，根据包含与靶抗原特异性地结合的抗体部分的本文所述的任何CAR，该抗体部分包含对该靶抗原具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2017/066136A2)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如，包含SEQID NO:62的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VH结构域、和/或包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VL结构域、或在其中所含的CDR)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD20具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如，包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VH结构域、和/或包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VL结构域、或在其中所含的CDR)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，2018年3月30日提交的USSN 62/650,955和2019年3月29日提交的PCT/US2019/025032)，它们的内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如，包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VH结构域、和/或包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VL结构域、或在其中所含的CDR)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如，包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VH结构域、和/或包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VL结构域、或在其中所含的CDR)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD47具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2018/200585A1)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对CD47具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如，包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VH结构域、和/或包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VL结构域、或在其中所含的CDR)。
在一些实施方案中，该抗体部分包含对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2018/200586A1，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如，包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VH结构域、和/或包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VL结构域、或在其中所含的CDR)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(例如，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VH结构域、和/或包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的VL结构域、或在其中所含的CDR)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对ROR1具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/187220和WO2016/187216)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对ROR2具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/142768)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对BCMA具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/090327和WO2016/090320)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对GPRC5D具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/090329和WO2016/090312)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对FCRL5具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/090337)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对MUC16具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，2019年5月8日提交的USSN 62/845,065和2018年11月16日提交的USSN62/768,730，它们的内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对MCT4具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，2019年3月21日提交的PCT/US2019/023402，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对PSMA具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，2019年6月17日提交的PCT/US2019/037534，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对WT-1肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2012/135854、WO2015/070078和WO2015/070061)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对AFP肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/161390)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对HPV16-E7肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/182957)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对NY-ESO-1肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/210365)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对PRAME肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/191246)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对EBV-LMP2A肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/201124)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对KRAS肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2016/154047)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对PSA肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2017/015634)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对FoxP3肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，2018年2月14日提交的PCT/US2019/018112，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对组蛋白H3.3肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2018/132597)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对HIV-1肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分的CDR或可变结构域(VH和/或VL结构域)(参见例如，WO2018057967)。在一些实施方案中，该抗体部分是包含VH结构域和VL结构域的scFv(单链可变片段)。在一些实施方案中，该scFv包含抗原结合模块，该抗原结合模块特异性地结合包含肽和MHC蛋白的复合物(称为肽/MHC复合物)。
表A列出了其片段或肽可以通过CAR靶向的示例性蛋白质。还列出了此类T细胞可以治疗的可能疾病，特别是可能的癌症。
表A
Figure BDA0003522887730000471
细胞外靶结合结构域
本文所述的CAR的细胞外靶结合结构域可以包含抗体部分或其抗原结合片段。在某些实施方案中，细胞外靶结合结构域可以是衍生自抗体的单链可变片段(scFv)、串联scFv、单结构域抗体片段(VHH或sdAb)、单结构域双特异性抗体(BsAb)、细胞内抗体、纳米抗体、单链形式的免疫因子、以及单链形式的Fab、Fab'或(Fab’)2。在其它实施方案中，细胞外靶结合结构域可以是包含可变片段的共价结合的多条链的抗体部分。细胞外靶结合结构域可以经由柔性铰链/间隔区连接到TM结构域。
scFv和串联scFv
本文所述的CAR可以包含作为单链Fv(scFv)抗体的抗体部分。scFv抗体可以包含轻链可变区和重链可变区，其中该轻链可变区和该重链可变区可以通过合成接头使用重组方法连接以制备单个多肽链。在一些实施方案中，scFv可以具有结构“(N末端)轻链可变区-接头-重链可变区(C末端)”，其中该重链可变区通过接头连接到轻链可变区的C末端。在其它实施方案中，scFv可以具有结构“(N末端)重链可变区-接头-轻链可变区(C末端)”，其中该轻链可变区通过接头连接到重链可变区的C末端。接头可以是包含2个至200个(例如，2个、3个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个)氨基酸的多肽。合适的接头可以含有柔性氨基酸残基，诸如甘氨酸和丝氨酸。
本文所述的CAR可以包含细胞外靶结合结构域，该细胞外靶结合结构域包含抗体部分，该抗体部分是包含第一scFv和第二scFv的串联scFv(在本文中也称为“串联scFv多特异性抗体”)。在一些实施方案中，串联scFv多特异性抗体还包含至少一个(诸如至少约2个、3个、4个、5个或更多个中的任一者)另外的scFv。
在一些实施方案中，提供了串联scFv多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含a)与靶配体的细胞外区域特异性地结合的第一scFv、以及b)第二scFv。在一些实施方案中，靶配体是CD22，并且第一scFv特异性地结合CD22的细胞外区域。在一些实施方案中，靶配体是CD19，并且第一scFv特异性地结合CD19的细胞外区域。在一些实施方案中，靶配体是包含甲胎蛋白(AFP)肽和MHC I类蛋白的复合物，并且第一scFv特异性地结合该复合物但是不结合单独的AFP或AFP肽或单独的MHC。
在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合另一种抗原。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合癌细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合不表达CD22的细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合不表达CD19的细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合不表达AFP肽的细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合细胞毒性细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合淋巴细胞表面上的抗原，该淋巴细胞诸如T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合效应T细胞(诸如细胞毒性T细胞)表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scFv特异性地结合效应细胞表面上的抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68、GDS2D、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。
在一些实施方案中，第一scFv是人的、人源化的或半合成的。在一些实施方案中，第二scFv是人的、人源化的或半合成的。在一些实施方案中，第一scFv和第二scFv两者都是人的、人源化的或半合成的。在一些实施方案中，串联scFv多特异性抗体还包含至少一个(诸如至少约2个、3个、4个、5个或更多个中的任一者)另外的scFv。
在一些实施方案中，提供了串联scFv多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含a)与靶抗原的细胞外区域特异性地结合的第一scFv、以及b)第二scFv，其中该串联scFv多特异性抗体是串联二scFv或串联三scFv。在一些实施方案中，串联scFv多特异性抗体是串联二scFv。在一些实施方案中，串联scFv多特异性抗体是双特异性T细胞衔接器。
在一些实施方案中，串联二scFv双特异性抗体以如下Kd与靶抗原的细胞外区域或其一部分结合，该Kd介于约0.1pM至约500nM之间(诸如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，串联二scFv双特异性抗体以如下Kd与靶抗原的细胞外区域或其一部分结合，该Kd介于约1nM至约500nM之间(诸如约1nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。
在本领域中已知多种技术用于设计、构建和/或产生多特异性抗体。可以构建利用全长免疫球蛋白框架(例如，IgG)、单链可变片段(scFv)或其组合的多特异性抗体。双特异性抗体可以由如上文所述的两个scFv单元构成。在抗肿瘤免疫疗法的情况下，包含两个串联的单链可变片段(scFv)的双特异性抗体可以被设计成使得结合肿瘤抗原的scFv与接合T细胞(即，通过结合T细胞上的CD3)的scFv连接。因此，T细胞被募集到肿瘤位点以介导对肿瘤细胞的杀伤。可以例如通过将识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链组合来制备双特异性抗体。在一些实施方案中，通过分子功能，双特异性结合剂结合在其两个结合臂中的一个结合臂(一个VH/VL对)上的一个抗原(或表位)，并且结合在其第二臂(不同的VH/VL对)上的不同抗原(或表位)。通过该定义，双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中)，并且对于其结合的每个抗原是单价的。在某些实施方案中，根据本发明的双特异性结合剂包含第一scFv和第二scFv。在一些某些实施方案中，第一scFv连接到第二scFv的C末端。在一些某些实施方案中，第二scFv连接到第一scFv的C末端。在一些某些实施方案中，scFv通过接头(例如，SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:38))彼此连接。在一些某些实施方案中，scFv在没有接头的情况下彼此连接。
接头可以是包含2个至200个(例如，2个、3个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个)氨基酸的多肽。合适的接头可以含有柔性氨基酸残基，诸如甘氨酸和丝氨酸。在某些实施方案中，接头可以含有GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:39)、GGSG(SEQ ID NO:40)或SGGG(SEQ ID NO:41)的基序(例如多个或重复基序)。在一些实施方案中，接头可以具有序列GSGS(SEQ ID NO:42)、GSGSGS(SEQ IDNO:43)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:44)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:45)、GGSGGS(SEQ ID NO:46)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO:47)、GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:48)、GGSG(SEQ ID NO:49)、GGSGGGSG(SEQ ID NO:50)或GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:51)。在其它实施方案中，接头还可以含有除甘氨酸和丝氨酸以外的氨基酸，例如，SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:38)。
跨膜结构域(TM)
跨膜结构域可以来源于天然来源和/或来源于合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本发明中特别使用的跨膜区可以衍生自T细胞受体的α、β、δ、γ或ζ链、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD30、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154(即，至少包含它们的跨膜区)。在一些实施方案中，可以基于例如结合跨膜结构域或由跨膜结构域诱导的细胞因子的各种其它蛋白质或反式元件的性质来选择跨膜结构域。例如，衍生自CD30的跨膜结构域缺乏p56lck激酶的结合位点、TNF受体家族中的共同基序。在一些实施方案中，本发明中特别使用的跨膜区可以衍生自CD8(即，至少包含它的跨膜区)，例如，包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列的跨膜区。在一些实施方案中，本发明中特别使用的跨膜区可以衍生自CD30(即，至少包含它的跨膜区)，例如，包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列的跨膜区。
在某些实施方案中，可以基于靶抗原选择跨膜结构域。例如，含有对AFP肽/MHC复合物具有特异性的抗体部分和衍生自CD8的跨膜结构域的CAR似乎具有比含有衍生自CD30的跨膜结构域的对应CAR更好的体外杀伤特性。在含有对CD19具有特异性的抗体部分的CAR中未观察到此结果。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其可以主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，可以在合成跨膜结构域的每个末端找到苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，具有例如介于约2个与约10个之间(诸如约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个中的任一者)的氨基酸长度的短的寡肽或多肽接头可以形成在本文所述的CAR的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的连接。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，跨膜结构域包含部分细胞外结构域(ECD)。例如，衍生自CD8或CD30的跨膜结构域包含ECD。在一些实施方案中，ECD将CAR的跨膜结构域与细胞外靶结合结构域连接。
在一些实施方案中，使用天然与CAR的细胞内信号传导结构域中的序列之一相关的跨膜结构域(例如，如果抗CD22 CAR(或抗CD19 CAR或抗AFP CAR)细胞内信号传导结构域包含CD30共刺激序列，则CAR的跨膜结构域衍生自CD30跨膜结构域)。在一些实施方案中，可以通过氨基酸置换来选择或修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
细胞内信号传导结构域
CAR的细胞内信号传导结构域负责激活CAR已经置于其中的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的一部分。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的情况下，可以使用这种截短的部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号即可。因此，术语“细胞内信号传导结构域”意在包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
用于在本发明的CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和协同起作用以引发抗原受体接合后的信号转导的共同受体的细胞质序列、以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
已知通过单独的TCR产生的信号不足以完全激活T细胞并且还需要二级或共刺激信号。因此，T细胞激活可以说是由两个不同类别的细胞内信号传导序列介导：通过TCR(初级信号传导序列)引发抗原依赖性初级激活的那些和以抗原非依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号(共刺激信号传导序列)的那些。
初级信号传导序列以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激性方式起作用的初级信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。在一些实施方案中，本文所述的CAR包含一个或多个ITAM。
含有在本发明中特别使用的初级信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，含有初级信号传导序列的ITAM衍生自CD3ζ。
在一些实施方案中，CAR包含衍生自CD3ζ的初级信号传导序列。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ细胞内信号传导序列它本身或与在本发明的CAR的上下文中有用的任何其它期望的细胞内信号传导序列组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ初级细胞内信号传导序列和CD30共刺激信号传导序列。如本文所描述的，具有含有来自CD30的共刺激结构域的CAR的T细胞表达比具有含有来自例如CD28或4-1BB的共刺激结构域的CAR的T细胞少得多的PD-1(一种T细胞激活抑制剂)。具有含有来自CD30的共刺激结构域的CAR的T细胞也表现出细胞毒性潜力的持久性。来自CD30的共刺激结构域可以改善导致T细胞耗竭的功能无反应性，即应变力缺乏。CD30共刺激结构域向T细胞提供优异的肿瘤细胞杀伤持久性的能力是出乎意料的，因为CD30缺乏被认为对CAR共刺激至关重要的p56lck结合位点。
因此，例如，在一些实施方案中，提供了一种CAR，其包含：a)包含与靶配体的细胞外结构域或其部分特异性地结合的抗体部分的细胞外靶结合结构域，b)跨膜结构域，以及c)包含CD30共刺激结构域和初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域能够激活免疫细胞。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导序列和共刺激信号传导序列。在一些实施方案中，初级信号传导序列包含CD3ζ细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，共刺激信号传导序列包含CD30细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ初级细胞内信号传导序列和CD30细胞内信号传导序列。
II.多特异性抗体
本文所述的CAR可以包含作为多特异性抗体的抗体部分。多特异性抗体可以包含第一结合部分和第二结合部分(诸如第二抗原结合部分)。多特异性抗体是对至少两种不同抗原或表位具有结合特异性(例如，双特异性抗体对两种抗原或表位具有结合特异性)的抗体。还设想了具有超过两种特异性的多特异性抗体。例如，可以制备三特异性抗体(参见例如，Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991))。应当了解，本领域技术人员可以选择本文所述的单个多特异性抗体的适当特征以彼此组合形成本发明的多特异性抗体。
因此，例如，在一些实施方案中，提供了包含a)与第一靶抗原的细胞外区域特异性地结合的第一结合部分和b)第二结合部分(诸如抗原结合部分)的多特异性(例如，双特异性)抗体。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合不同的靶抗原。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合在细胞(诸如细胞毒性细胞)的表面上的抗原。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合淋巴细胞表面上的抗原，该淋巴细胞诸如T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合效应T细胞，诸如细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或T杀伤细胞)。
在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合肿瘤抗原。肿瘤抗原的实例包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、CA15-3、CA27-29、CA19-9、CA-125、钙视网膜蛋白、癌胚抗原、CD34、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、上皮膜蛋白(EMA)、因子VIII、CD31FL1、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液状蛋白(GCDFP-15)、HMB-45、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、抑制素、角蛋白、CD45、淋巴细胞标志物MART-1(Melan-A)、Myo Dl、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、前列腺特异性抗原、S100蛋白、平滑肌肌动蛋白(SMA)、突触囊泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、肿瘤M2-PK、和波形蛋白。
在一些实施方案中，双特异性抗体中的第二抗原结合部分结合CD3。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合CD3ε。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合CD3ε的激动性表位。如本文所用，术语“激动性表位”意指(a)在多特异性抗体结合时，任选地在结合同一细胞上的若干种多特异性抗体时，允许所述多特异性抗体激活T细胞受体(TCR)信号传导并诱导T细胞激活的表位，和/或(b)仅由CD3的ε链的氨基酸残基构成并且当在T细胞上在其天然环境中呈现(即，被TCR、CD3γ链等包围)时可接近以被所述多特异性抗体结合的表位，和/或(c)在结合所述多特异性抗体时不会导致CD3ε相对于CD3γ的空间位置的稳定化的表位。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合效应细胞表面上的抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68、GDS2D、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。在其它实施方案中，第二抗原结合部分结合补体系统的组分(诸如C1q)。C1q是激活血清补体系统的C1酶复合物的亚基。在其它实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合Fc受体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合Fcγ受体(FcγR)。FcγR可以是自然杀伤(NK)细胞表面上存在的FcγRIII、或者在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞表面上存在的FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIBI、FcγRIIB2和FcγRIIIB中的一个。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是Fc区或其功能片段。如在该上下文中使用的“功能片段”是指抗体Fc区的片段，其仍然能够以足够的特异性和亲和力与FcR结合(特别是与FcγR结合)以允许携带FcγR的效应细胞(特别是巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞)通过细胞毒性裂解或吞噬作用杀死靶细胞。功能性Fc片段能够竞争性地抑制原始的全长Fc部分与FcR(诸如激活FcγRI)的结合。在一些实施方案中，功能性Fc片段保留其对激活FcγR的亲和力的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，Fc区或其功能片段是增强的Fc区或其功能片段。如本文所用，术语“增强的Fc区”是指被修饰以增强Fc受体介导的效应子功能(特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体介导的吞噬作用)的Fc区。这可以如本领域已知的那样实现，例如通过以导致对在自然杀伤(NK)细胞上表达的激活受体(例如，在自然杀伤(NK)细胞上表达的FcγRIIIA(CD16A))的亲和力增加和/或与抑制性受体(例如，FcγRIIB1/B2(CD32B))的结合降低的方式改变Fc区。
在一些实施方案中，多特异性抗体允许杀死抗原呈递靶细胞和/或可以有效地重定向CTL以裂解呈递靶的靶细胞。在一些实施方案中，本发明的多特异性(例如，双特异性)抗体显示范围为10ng/ml至500ng/ml的体外EC50，并且能够以约1:1至约50:1(诸如从约1:1至约15:1或从约2:1至约10:1)的CTL与靶细胞的比率通过CTL诱导约50％靶细胞的重定向裂解。
在一些实施方案中，多特异性(例如，双特异性)抗体能够以裂解靶细胞的方式交联刺激或未刺激的CTL和靶细胞。这提供了多特异性抗体发挥其期望的活性不需要靶特异性T细胞克隆的产生或树突状细胞的常见抗原呈递的优点。在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体能够重定向CTL以在不存在其它激活信号的情况下裂解靶细胞。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合CD3(例如，特异性地结合CD3ε)，并且不需要通过CD28和/或IL-2的信号传导来重定向CTL以裂解靶细胞。
用于测量多特异性抗体同时结合两种抗原(例如，在两种不同细胞上的抗原)的偏好的方法在本领域技术人员的正常能力范围内。例如，当第二结合部分特异性地结合第二抗原时，可以将多特异性抗体与第一抗原+/第二抗原-细胞和第一抗原-/第二抗原+细胞的混合物接触。然后，可以通过本领域已知的显微镜检查或荧光激活细胞分选(FACS)评估多特异性抗体阳性单细胞的数量和通过多特异性抗体交联的细胞数量。
在一些实施方案中，多特异性抗体是例如双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、二-双抗体、串联scFv、串联双scFv(例如，双特异性T细胞衔接器)、串联三scFv、三抗体、双特异性Fab2、二-微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合物、双亲和力再靶向(DART)抗体、双可变结构域(DVD)抗体、IgG-scFab、scFab-ds-scFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合物、对接和锁定(dock and lock，DNL)抗体、杵臼结构(KiH)抗体(由KiH技术制备的双特异性IgG)、DuoBody(由DuoBody技术制备的双特异性IgG)、单结构域抗体片段(VHH或sdAb)、单结构域双特异性抗体(BsAb)、细胞内抗体、纳米抗体、单链形式的免疫因子、异源内聚体抗体或异源缀合物抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是单链抗体片段。在一些实施方案中，多特异性抗体是串联scFv(例如，串联双scFv，诸如双特异性T细胞衔接器)。
III.抗体-药物缀合物
在一些实施方案中，提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含抗体部分和治疗剂(在本文中也称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性的、细胞抑制的或以其它方式防止或降低靶细胞分裂的能力的毒素。使用ADC来局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)(Syrigos和Epenetos,Anticancer Research 19:605-614(1999)；Niculescu-Duvaz和Springer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997)；美国专利号4,975,278)允许将药物部分靶向递送至靶细胞和在其中的细胞内积累，其中这些未缀合治疗剂的全身施用可能导致对正常细胞以及寻找被消除的靶细胞的不可接受的毒性水平(Baldwin等人，Lancet(Mar.15,1986):603-605(1986)；Thorpe,(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review,”在Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications中，A.Pinchera等人(编辑)，第475-506页)。由此在最小毒性的情况下寻求最大功效。
在免疫缀合物(例如，ADC)中使用的治疗剂包括例如道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人，Cancer Immunol.Immunother.21:183-187(1986))。在免疫缀合物中使用的毒素包括细菌毒素，诸如白喉毒素、植物毒素(诸如篦麻毒素)、小分子毒素(诸如格尔德霉素)(Mandler等人，J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等人，BioconjugateChem.13:786-791(2002))、美登木素(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996))和卡奇霉素(Lode等人，Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993))。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制作用。当与大的抗体或蛋白质受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或具有较少活性。
可以使用的酶促活性毒素及其片段包括例如白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的)外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒素A链、α八叠球菌素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本文还设想了抗体部分和一种或多种小分子毒素的免疫缀合物(例如，ADC)，该小分子毒素诸如卡奇霉素、美登木素、多拉司他汀、aurostatin、单端孢霉烯和CC1065、以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
在一些实施方案中，提供了包含具有细胞内活性的治疗剂的免疫缀合物(例如，ADC)。在一些实施方案中，免疫缀合物是内化的并且治疗剂是阻断细胞的蛋白质合成细胞毒素，从而导致细胞死亡。在一些实施方案中，治疗剂是包含具有核糖体灭活活性的多肽的细胞毒素，包括例如白树毒素、bouganin、皂草素、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、bryodin、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌外毒素A以及它们的变体。在一些实施方案中，在治疗剂是包含具有核糖体灭活活性的多肽的细胞毒素的情况下，免疫缀合物必须在与靶细胞结合时内化以便使蛋白质对细胞产生细胞毒性。
在一些实施方案中，提供了包含用于破坏DNA的治疗剂的免疫缀合物(例如，ADC)。在一些实施方案中，用于破坏DNA的治疗剂例如选自由以下组成的组：烯二炔(enediyne)(例如，卡奇霉素和埃斯波霉素)和非烯二炔小分子药剂(例如，博来霉素、甲锭丙基-EDTA-Fe(II))。
本发明还设想了在抗体部分与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切核酸酶(诸如脱氧核糖核酸酶；DNase))之间形成的免疫缀合物(例如，ADC)。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含用于破坏微管蛋白的药剂。此类药剂可以包括例如根霉素/美坦辛、紫杉醇、长春新碱和长春碱、秋水仙碱、auristatin、多拉司他汀10MMAE和peloruside A。
在一些实施方案中，免疫缀合物(例如，ADC)包含烷化剂，该烷化剂包括例如Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNU NSC 409962、白消安NSC 750、羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)NSC 271674、CBDCA NSC 241240、CCNU NSC 79037、CHIPNSC 256927、瘤可宁NSC 3088、氯脲菌素NSC 178248、顺铂NSC 119875、氯乙矾NSC 338947、氰基吗啉代多柔比星NSC 357704、cyclodisone NSC 348948、环氧乳醇NSC 132313、氟多潘NSC 73754、hepsulfam NSC 329680、海恩酮NSC 142982、美法仑NSC 8806、甲基CCNU NSC95441、丝裂霉素C NSC 26980、mitozolamide NSC 353451、氮芥NSC 762、PCNU NSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪双酮NSC 135758、哌泊溴烷NSC 25154、泊非霉素NSC 56410、螺乙内芥NSC 172112、替罗昔隆NSC 296934、四铂NSC 363812、塞替派NSC 6396、三乙撑密胺NSC9706、尿嘧啶氮芥NSC 34462和Yoshi-864 NSC 102627。
在一些实施方案中，免疫缀合物(例如，ADC)包含高放射性原子。各种放射性同位素可用于生产放射性缀合的抗体。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素。
在一些实施方案中，可以将抗体部分与在肿瘤预靶向中利用的“受体”(诸如链霉亲和素)缀合，其中抗体-受体缀合物施用于患者，然后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物并且然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，免疫缀合物(例如，ADC)可以包含与前药激活酶缀合的抗体部分。在一些此类实施方案中，前药激活酶将前药转化为活性药物，诸如抗病毒药物。在一些实施方案中，此类免疫缀合物在抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)中是有用的。可以与抗体缀合的酶包括但不限于可用于将含磷酸酯的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸酯的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将含肽的前药转化为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧肽酶；可用于将糖基化的前药转化为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将用β内酰胺衍生化的药物转化为游离药物的β内酰胺酶；以及可用于分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基在其胺基氮出衍生化的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶。在一些实施方案中，酶可以通过本领域熟知的重组DNA技术与抗体部分共价地结合。参见例如，Neuberger等人，Nature 312:604-608(1984)。
在一些实施方案中，免疫缀合物的治疗部分(例如，ADC)可以是核酸。可以使用的核酸包括但不限于：反义RNA、基因或其它多核苷酸(包括核酸类似物，诸如硫代鸟嘌呤和硫代嘌呤)。
本申请还提供了包含与效应分子附接的抗体部分的免疫缀合物(例如，ADC)，其中该效应分子是标签，该标签可以间接或直接产生可检测信号。这些免疫缀合物可以用于研究或诊断应用，例如用于体内检测癌症。标签优选地能够直接或间接地产生可检测信号。例如，标签可以是不透射线的或放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，诸如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，标签是用于闪烁法研究的放射性原子，例如99Tc或123I；或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的旋转标签，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与各种金属螯合剂复合并且与抗体缀合，例如用于PET成像(WO2011/056983)。
在一些实施方案中，免疫缀合物可间接地检测。例如，对免疫缀合物具有特异性并且含有可检测标签的第二抗体可以用于检测免疫缀合物。
IV.CAR免疫细胞
本发明提供在了其表面上呈递根据本文所述的任何CAR的CAR的一种免疫细胞(诸如T细胞)(这样的免疫细胞在本文中也被称为“CAR免疫细胞”)。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码CAR的核酸，其中该CAR由该核酸表达并且定位于该免疫细胞表面。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞和抑制T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞被修饰以阻断或减少免疫细胞的一种或多种内源性TCR亚基的表达。例如，在一些实施方案中，免疫细胞是经修饰以阻断或减少TCRα和/或β链的表达的αβT细胞，或者免疫细胞是经修饰以阻断或减少TCRγ和/或δ链的表达的γδT细胞。对细胞的破坏基因表达的修饰包括本领域已知的任何此类技术，包括例如RNA干扰(例如，siRNA、shRNA、miRNA)、基因编辑(例如，基于CRISPR或TALEN的基因敲除)等。
在示例性实施方案中，本公开的细胞是免疫细胞或免疫系统的细胞。因此，细胞可以是B淋巴细胞、T淋巴细胞、胸腺细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、骨髓单核细胞性细胞、巨核细胞、外周血单核细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞。在示例性方面，细胞是T淋巴细胞。在示例性方面，T淋巴细胞是CD8+、CD4+、CD8+/CD4+或T调节性(T-reg)细胞。在示例性实施方案中，将T淋巴细胞基因工程化以沉默内源性TCR的表达。在示例性方面，细胞是自然杀伤(NK)细胞。
例如，在一些实施方案中，提供了免疫细胞(诸如T细胞)，其包含编码根据本文所述的任何CAR的CAR的核酸，其中该CAR由该核酸表达并且定位于该免疫细胞表面。在一些实施方案中，CAR核酸序列包含在载体中。载体可以选自例如由以下组成的组：哺乳动物表达载体和病毒载体(诸如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的那些)。在一些实施方案中，载体中的一种或多种被整合到免疫细胞的宿主基因组中。在一些实施方案中，CAR核酸序列处于启动子的控制下。在一些实施方案中，启动子是诱导型的。在一些实施方案中，启动子与CAR核酸序列的5'末端可操作地连接。在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞和抑制T细胞。
因此，在一些实施方案中，提供了在其表面上表达本文所述的CAR的CAR免疫细胞(诸如T细胞)，其中该CAR免疫细胞包含：编码该CAR的CAR多肽链的CAR核酸序列，其中该CAR多肽链由该CAR核酸序列表达以形成该CAR，并且其中该CAR定位于该免疫细胞的表面。
V.Fc变体
在一些实施方案中，本文所述的CAR可以包含变体Fc区，其中该变体Fc区可以包含相对于参考Fc区(或亲本Fc区或野生型Fc区)的至少一个氨基酸修饰。可以在Fc区中制造氨基酸修饰以改变效应子功能和/或增加CAR的血清稳定性。包含变体Fc区的CAR可以表现出对Fc受体(例如，FcγR)的改变的亲和力，条件是该变体Fc区在基于Fc-Fc受体相互作用的晶体学和结构分析(诸如由Sondermann等人，2000,Nature,406:267-273所公开的那些)与Fc受体发生直接接触的位置处不具有置换。在与Fc受体(诸如FcγR)发生直接接触的Fc区内的位置的实例是氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C'/E环)和氨基酸327-332(F/G)环。在一些实施方案中，包含变体Fc区的CAR可以包含基于结构和晶体学分析与FcγR发生直接接触的至少一个残基的修饰。
产生变体Fc区的在Fc区中的氨基酸修饰是本领域已知的，该氨基酸修饰例如改变对激活和/或抑制性受体的亲和力，导致改进的效应子功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC))，增加对C1q的结合亲和力，减少或消除FcR结合，增加半衰期(参见例如美国专利号9,051,373、9,040,041、8,937,158、8,883,973、8,883,147、8,858,937、8,852,586、8,809,503、8,802,823、8,802,820、8,795,661、8,753,629、8,753,628、8,735,547、8,735,545、8,734,791、8,697,396、8,546,543、8,475,792、8,399,618、8,394,925、8,388,955、8,383,109、8,367,805、8,362,210、8,338,574、8,324,351、8,318,907、8,188,231、8,124,731、8,101,720、8,093,359、8,093,357、8,088,376、8,084,582、8,039,592、8,012,476、7,799,900、7,790,858、7,785,791、7,741,072、7,704,497、7,662,925、7,416,727、7,371,826、7,364,731、7,335,742、7,332,581、7,317,091、7,297,775、7,122,637、7,083,784、6,737,056、6,538,124、6,528,624和6,194,551)。
在一些实施方案中，与亲本Fc区(例如，非糖基化)相比，变体Fc区可以具有不同的糖基化模式。在一些实施方案中，不同的糖基化模式可以由不同细胞系(例如，工程化细胞系)中的表达产生。
本文所述的CAR可以包含以更大的亲和力与一种或多种FcγR结合的变体Fc区。如下文所讨论，此类CAR优选地更有效地介导效应子功能。在一些实施方案中，本文所述的CAR可以包含以更弱的亲和力与一种或多种FcγR结合的变体Fc区。在某些情况下，例如在其作用机制涉及阻断或拮抗作用但不杀死携带靶抗原的细胞的CAR的情况下，可能需要减少或消除效应子功能。在一些实施方案中，增加的效应子功能可以针对肿瘤细胞和表达外源抗原的细胞。
VI.CAR生产
所提供的CAR或其部分或编码它们的核酸可以通过任何可用的方式生产。生产方法是本领域熟知的。用于产生抗体(例如，scFv抗体、单克隆抗体和/或多克隆抗体)的技术在本领域中是可用的。应当了解，各种动物物种可以用于生产抗血清，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗、猴和鸡。动物的选择可以根据易于操作、成本或血清的期望量来决定，如本领域技术人员已知的。应当了解，抗体也可以通过产生对于感兴趣的免疫球蛋白重链和轻链序列是转基因的哺乳动物或植物(例如，对于人免疫球蛋白重链和轻链基因是转基因的转基因啮齿动物)而转基因地生产。结合在哺乳动物中的转基因生产，可以在山羊、牛或其它哺乳动物的奶中生产和从山羊、牛或其它哺乳动物的奶中回收抗体(参见例如美国专利号5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957；这些美国专利以全文引用的方式并入本文)。可替代地，可以在鸡中制备抗体，从而生产IgY分子(Schade等人，1996,ALTEX13(5):80-85)。
尽管本文中广泛讨论了采用含有人抗体的CAR的实施方案(即，包括人CDR序列的人重链和轻链可变区序列)，但是本发明还提供了含有非人抗体的CAR。在一些实施方案中，非人抗体包含来自如本文所述的抗体的人CDR序列、以及非人框架序列。在一些实施方案中，非人框架序列包括可以用于使用如本文所述的一个或多个人CDR序列产生合成的重链和/或轻链可变区的任何序列，包括例如由小鼠、大鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗、猴、鸡等产生的序列。在一些实施方案中，所提供的CAR包括通过将如本文所述的一个或多个人CDR序列接枝到非人框架序列(例如，小鼠或鸡框架序列)上产生的抗体。在许多实施方案中，所提供的CAR包含或是人抗体(例如，人单克隆抗体或其片段、人抗原结合蛋白或多肽、人多特异性抗体(例如，人双特异性抗体)、具有人免疫球蛋白多肽的一种或多种结构组分的人多肽)。
在一些实施方案中，适合用于本发明的抗体是近似人类的灵长类动物抗体。例如，可以在例如国际专利申请公开号1991/11465中和在Losman等人，1990,Int.J.Cancer 46:310中找到用于在狒狒中产生治疗有用的抗体的通用技术。在一些实施方案中，可以使用杂交瘤方法来制备抗体(例如，单克隆抗体)(Milstein和Cuello,1983,Nature 305(5934):537-40)。在一些实施方案中，也可以通过重组方法来制备抗体(例如，单克隆抗体)(参见例如，美国专利号4,166,452)。
与通过B细胞永生化产生抗体相关的许多困难都可以使用噬菌体展示在大肠杆菌或酵母中通过工程化和表达CAR组分来克服。为了确保高亲和力抗体的回收，组合免疫球蛋白文库通常必须含有大的组库大小。典型的策略利用从免疫小鼠的淋巴细胞或脾细胞中获得的mRNA，以使用逆转录酶合成cDNA。通过PCR单独扩增重链和轻链基因并且将它们连接到噬菌体克隆载体中。可以产生两个不同的文库，一个含有重链基因，一个含有轻链基因。文库可以是原初的或它们可以是半合成的，即所有氨基酸(半胱氨酸例外)同样可能存在于CDR中的任何给定位置处。从每个文库分离噬菌体DNA，并且将重链和轻链序列连接在一起并包装以形成组合文库。每个噬菌体含有一对随机的重链和轻链cDNA，并且在感染大肠杆菌时引导在感染细胞中的CAR中的多肽的表达。为了鉴定识别感兴趣的抗原的CAR，铺板噬菌体文库，并将存在于斑块中的CAR分子转移到过滤器中。将过滤器与放射性标记的抗原一起孵育，然后洗涤以去除过量的未结合配体。放射自显影图上的放射性斑点鉴定含有结合抗原的CAR的斑块。可替代地，鉴定识别感兴趣的抗原的CAR可以通过以下方式来实现：噬菌体与抗原(该抗原与固体支持物(例如珠粒或哺乳动物细胞)结合)的迭代结合、然后去除非结合的噬菌体并洗脱特异性地结合的噬菌体。在此类实施方案中，首先将抗原生物素化以固定到例如链霉亲和素缀合的Dynabeads M-280上。将噬菌体文库与细胞、珠或其它固体支持物一起孵育，并且通过洗涤去除非结合的噬菌体。选择结合感兴趣的抗原的CAR噬菌体克隆并测试进行进一步表征。
一旦选择，可以通过流式细胞术测试阳性克隆与在活细胞表面上表达的感兴趣的抗原的结合。简而言之，可以将噬菌体克隆与表达抗原或不表达抗原的细胞(例如，经工程化以表达感兴趣的抗原、或天然地表达抗原的那些细胞)一起孵育。可以将细胞洗涤，并且然后用小鼠抗M13外壳蛋白单克隆抗体标记。可以将细胞再次洗涤并且在流式细胞术之前用荧光缀合的第二抗体(例如，FITC山羊(Fab)2抗小鼠IgG)标记。可用于生产人免疫球蛋白噬菌体文库的克隆和表达载体可以例如从Stratagene Cloning Systems(La Jolla,CA)获得。
可以采用类似的策略来获得高亲和力scFv克隆。可以通过使用与所有已知VH、Vκ和Vλ基因家族对应的PCR引物从非免疫人供体中分离V基因来构建具有大组库的文库。在扩增后，可以组合Vκ和Vλ池以形成一个池。可以将这些片段连接到噬菌粒载体中。可以将scFv接头(例如，(G4S)n)连接到VL片段上游(或如此期望的VH片段上游)的噬菌粒上。可以扩增VH和接头-VL片段(或VL和接头-VH片段)和将它们组装在JH区域上。可以将所得的VH-接头-VL(或VL-接头-VH)片段连接到噬菌粒载体中。噬菌粒文库可以使用如上文所述的过滤器或使用免疫管(Nunc；Maxisorp)淘洗。类似的结果可以通过从免疫的兔的淋巴细胞或脾细胞构建组合免疫球蛋白文库并通过在巴斯德毕赤酵母中表达scFv来实现(参见例如，Ridder等人，1995,Biotechnology,13:255-260)。另外，在分离适当的scFv抗体后，可以通过亲和力成熟过程(诸如诱变和链改组)来获得更高的结合亲和力和较慢的解离速率(参见例如，Jackson等人，1998,Br.J.Cancer,78:181-188)；Osbourn等人，1996,Immunotechnology,2:181-196)。
可以使用各种技术(即，将人Ig基因引入其中内源性Ig基因已被部分或完全失活的转基因动物中，可以利用该转基因动物来合成人抗体)来生产人抗体。在一些实施方案中，可以通过免疫经工程化以响应于用人抗原的抗原攻击而制造人抗体的非人动物来制造人抗体。
还可以例如通过利用经工程化以表达编码CAR的核酸的宿主细胞系统来生产所提供的CAR。可替代地或另外地，所提供的CAR可以通过化学合成(例如，使用自动化肽合成器或基因合成编码CAR的核酸)部分或完全制备。可以使用任何适当的载体或表达盒来表达本文所述的CAR。各种载体(例如，病毒载体)和表达盒是本领域已知的，并且可以如本领域已知的那样(例如，使用连续或补料分批培养系统)培养其中可以引入此类载体或表达盒的细胞。在一些实施方案中，可以将细胞进行基因工程化；用于基因工程化细胞以表达工程化多肽的技术是本领域熟知的(参见例如，Ausabel等人，编辑，1990,Current Protocols inMolecular Biology(Wiley,New York))。
可以纯化本文所述的CAR，即使用过滤、离心和/或多种色谱技术(诸如HPLC或亲和色谱)。在一些实施方案中，通过包括用酶(诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过化学还原来切割二硫键获得所提供的CAR的片段。
应当了解，可以改善CAR的特性和/或活性的方式工程化、生产和/或纯化所提供的CAR。例如，改善的特性包括但不限于增加的稳定性、改善的结合亲和力和/或亲合力、增加的结合特异性、增加的生产、减少的聚集、降低的非特异性结合等。在一些实施方案中，所提供的CAR可以包含改善蛋白质稳定性、抗原结合、表达水平的一个或多个氨基酸置换(例如，在免疫球蛋白或其片段(例如，scFv抗体)的上下文中的框架区中)，或提供治疗剂、诊断剂或检测剂的缀合的位点或位置。
纯化标签
在一些实施方案中，可以将纯化标签连接到本文所述的CAR上。纯化标签是指可以用于纯化、分离或鉴定多肽的任何长度的肽。可以将纯化标签连接到多肽上(例如，连接到多肽的N末端或C末端上)，以帮助纯化多肽和/或从例如细胞裂解物混合物中分离多肽。在一些实施方案中，纯化标签与对纯化标签具有特定亲和力的另一个部分结合。在一些实施方案中，将与纯化标签特异性地结合的此类部分附接到固体支持物(诸如基质、树脂或琼脂糖珠)上。可以连接到CAR的纯化标签的实例包括但不限于六组氨酸肽、血球凝集素(HA)肽、FLAG肽和myc肽。在一些实施方案中，可以将两个或更多个纯化标签连接到CAR(例如，六组氨酸肽和HA肽)上。六组氨酸肽(HHHHHH(SEQ ID NO:53))以微摩尔亲和力与镍官能化琼脂糖亲和柱结合。在一些实施方案中，HA肽包括序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO:54)或YPYDVPDYAS(SEQ ID NO:55)。在一些实施方案中，HA肽包括整数倍的序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO:54)或YPYDVPDYAS(SEQ ID NO:55)的串联系列(例如，3xYPYDVPDYA或3xYPYDVPDYAS)。在一些实施方案中，FLAG肽包含序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:56)。在一些实施方案中，FLAG肽包含整数倍的序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:56)的串联系列(例如，3xDYKDDDDK)。在一些实施方案中，myc肽包含序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:57)。在一些实施方案中，myc肽包含整数倍的序列EQKLISEEDL的串联系列(例如，3xEQKLISEEDL)。
VII.治疗剂和检测剂
可以治疗剂或检测剂与本文所述的CAR附接。治疗剂可以是任何类别的化学实体，包括例如但不限于蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、小有机分子、非生物聚合物、金属、离子、放射性同位素等。在一些实施方案中，根据本发明使用的治疗剂可以具有与治疗癌症一种或多种症状或病因相关的生物活性。在一些实施方案中，根据本发明使用的治疗剂可以具有与免疫系统的调节和/或T细胞介导的细胞毒性的增强相关的生物活性。在一些实施方案中，根据本发明使用的治疗剂具有一种或多种其它活性。
检测剂可以包含例如由于其特定功能特性和/或化学特性可以使用测定来检测的任何部分。此类药剂的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标签、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、着色颗粒或配体(诸如生物素)。
许多检测剂是本领域已知的，如其与蛋白质和肽的附接的系统(参见例如，美国专利号5,021,236；4,938,948；和4,472,509)。此类检测剂的实例包括顺磁性离子、放射性同位素、荧光团、NMR可检测物质、X射线成像剂等。例如，在一些实施方案中，顺磁性离子是铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、镧(III)、金(III)、铅(II)和/或铋(III)中的一种或多种。
放射性同位素可以是锕-225、砹-211、铋-212、碳-14、铬-51、氯-36、钴-57、钴-58、铜-67、铕-152、镓-67、氢-3、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131、铟-111、铁-59、铅-212、镥-177、磷-32、镭-223、镭-224、铼-186、铼-188、硒-75、硫-35、锝(technicium)-99m、钍-227、钇-90和锆-89中的一种或多种。可以根据本领域熟知的技术生产放射性标记的CAR。
荧光标签可以是或可以包括以下中的一种或多种：Alexa 350,Alexa 430,AMCA,BODIPY 630/650,BODIPY 650/665,BODIPY-FL,BODIPY-R6G,BODIPY-TMR,BODIPY-TRX、级联蓝(Cascade Blue)、Cy3,Cy5,6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX,6-JOE、俄勒冈绿(OregonGreen)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、罗丹明绿(Rhodamine Green)、罗丹明红(Rhodamine Red)、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明、和/或德克萨斯红(Texas Red)等。
VIII.治疗方法
本发明的CAR和/或组合物可以施用于个体(例如，哺乳动物，诸如人类)以治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)。
可以使用本文所述的方法中的任一种治疗的癌症包括不被血管化的肿瘤或尚未实质上血管化的肿瘤、以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。待用本发明的CAR和CAR细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤、黑色素瘤、神经内分泌肿瘤和胶质瘤以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤(malignant tumor)、以及恶性肿瘤(malignancies)(例如，肉瘤、癌、黑色素瘤和胶质瘤)。还包括成年人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。
设想通过本文所述的方法中的任何方法治疗的实体瘤包括CNS肿瘤，诸如胶质瘤(例如，脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也被称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤(诸如高级星形细胞瘤)、小儿胶质瘤或胶质母细胞瘤(诸如小儿高级胶质瘤(HGG)和扩散型内因性脑桥胶质瘤(DIPG))、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、许旺细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑脊膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移灶。
在一些实施方案中，癌症是小儿胶质瘤。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是低级胶质瘤。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是高级胶质瘤(HGG)。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是扩散型内因性脑桥胶质瘤(DIPG)。在一些实施方案中，DIPG为II级的。在一些实施方案中，DIPG为III级的。在一些实施方案中，DIPG为IV级的。
设想用于治疗的另外的实体瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤(诸如透明细胞软骨肉瘤)、软骨母细胞瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、Wilms肿瘤、宫颈癌(例如，宫颈癌和侵袭前宫颈发育不良)，肛门、肛管或直肠肛门、阴道的癌症，外阴癌(例如，鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌和纤维肉瘤)、阴茎癌、口咽癌、头癌(例如，鳞状细胞癌)、颈癌(例如，鳞状细胞癌)、睾丸癌(例如，精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、莱迪希细胞细胞肿瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤和脂肪瘤)、膀胱癌(bladder carcinoma)、黑色素瘤、子宫癌(例如，子宫内膜癌)和尿道上皮癌(例如，鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌、输尿管癌和膀胱癌(urinary bladdercancer))。
设想通过本文所述的方法中的任何方法治疗的血液癌包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病以及成髓细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高级形式)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
其它癌症的实例包括但不限于急性淋巴细胞性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、促淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病和非急性淋巴细胞性白血病(null-acute lymphoblastic leukemia)。
可以例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、至进展的时间、存活持续时间、无进展存活期、总体应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评价癌症治疗。可以采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射性成像测量应答。
在用于治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的任何方法的一些实施方案中，该CAR在被施用于个体之前与细胞(诸如免疫细胞，例如T细胞)缀合。因此，例如，提供了治疗个体中的癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法，该方法包括a)将本文所述的CAR或其抗体部分与细胞(诸如免疫细胞，例如，T细胞)缀合以形成CAR/细胞缀合物，和b)向该个体施用有效量的包含该CAR/细胞缀合物的组合物。在一些实施方案中，细胞来源于该个体。在一些实施方案中，细胞不来源于该个体。在一些实施方案中，通过与细胞表面上的分子共价连接将CAR与细胞缀合。在一些实施方案中，通过与细胞表面上的分子非共价连接将CAR与细胞缀合。在一些实施方案中，通过将CAR的一部分插入细胞的外膜中将CAR与细胞缀合。
可以例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、至进展的时间、存活持续时间、无进展存活期、总体应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评价治疗。可以采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射性成像测量应答。
在一些实施方案中，治疗的功效可以测量为肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，其可以使用等式100-(T/C x 100)来计算，其中T是经治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积，并且C是未经治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在一些实施方案中，％TGI为约2％、约4％、约6、约8％、10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或超过95％。
IX.CAR效应细胞疗法
本申请还提供了使用如本文所述的CAR将效应细胞(诸如原代T细胞)的特异性重定向到癌细胞的方法。因此，本发明还提供了刺激对哺乳动物中的靶细胞群或包含癌细胞的组织的效应细胞介导的反应(诸如T细胞介导的免疫应答)的方法，该方法包括向该哺乳动物施用表达如本文所述的CAR的效应细胞(诸如T细胞)的步骤。在一些实施方案中，“刺激”免疫细胞是指引发效应细胞介导的反应(诸如T细胞介导的免疫应答)，其不同于激活免疫细胞。
可以将表达CAR的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)输注到有需要的接受者中。所输注的细胞能够杀死接受者中的癌细胞。在一些实施方案中，与抗体疗法不同，CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)能够在体内复制，从而导致长期持久性，这可能导致持续的肿瘤控制。
在一些实施方案中，CAR效应细胞是可以经历稳健的体内T细胞扩增并且可以持续延长的时间量的CAR T细胞。在一些实施方案中，本发明的CAR T细胞发展成特定的记忆T细胞，其可以被再激活以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。
本发明的CAR T细胞(诸如CAR T细胞)还可以用作哺乳动物中的离体免疫和/或体内疗法的一类疫苗。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物之前在体外发生以下中的至少一者：i)细胞的扩增，ii)将编码CAR的核酸引入细胞中，和/或iii)细胞的冷冻保存。离体程序是本领域熟知的。简而言之，从哺乳动物(优选地，人)分离细胞并用表达本文所公开的CAR的载体对其进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR细胞施用于哺乳动物接受者以提供治疗益处。该哺乳动物接受者可以是人，并且CAR细胞对于接受者可以是自体的。可替代地，细胞对于接受者而言可以是同种异体的、同基因的或异种的。用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的程序描述于美国专利号5,199,942(其以引用的方式并入本文)中，可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞的离体扩增的任何特定方法。简而言之，离体培养和扩增T细胞包括：(1)从外周血单核细胞(PBMC)收集T细胞；和(2)离体扩增此类细胞。除了在美国专利号5,199,942中所描述的细胞生长因子以外，其它因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可以用于培养和扩增细胞。
除了根据离体免疫使用基于细胞的疫苗以外，本发明还提供用于体内免疫以引发针对患者中的抗原的免疫应答的组合物和方法。本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)可以单独施用或与稀释剂和/或其它组分(诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群)组合作为药物组合物施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的CAR效应细胞(诸如T细胞)。此类组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施方案中，将CAR效应细胞(诸如T细胞)组合物配制用于通过静脉内、鞘内、颅内、脑内或脑室内途径施用。
可以在考虑年龄、体重、肿瘤尺寸、感染的程度或转移和患者(受试者)状况的个体差异的情况下由医师确定待施用的本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物的精确量。在一些实施方案中，以约104个至约109个细胞/kg体重，诸如约104个至约105个、约105个至约106个、约106个至约107个、约107个至约108个、或约108个至约109个细胞/kg体重中的任一者(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用包含CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)的药物组合物。也可以将CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物以这些剂量施用多次。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如，Rosenberg等人，NewEng.J.of Med.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在一些实施方案中，可能期望将激活的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)施用于受试者，并且随后再抽取血液(或进行单采术)，根据本发明从其激活T细胞，并且用这些激活的和扩增的T细胞再输注到患者中。此过程可以每几周进行多次。在一些实施方案中，可以从抽取的10cc到400cc血液中激活T细胞。在一些实施方案中，从抽取的20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc血液中激活T细胞。
CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)的施用可以以任何便利的方式进行，该任何便利的方式包括通过注射、摄入、输注、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下地、皮内地、瘤内地、结节内地、髓内地、肌肉内地、鞘内地、颅内地、脑内地、脑室内地、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内地施用于患者。在一些实施方案中，通过皮内或皮下注射向患者施用本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物。在一些实施方案中，通过鞘内注射施用本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物。在一些实施方案中，通过颅内注射施用本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物。在一些实施方案中，通过脑内注射施用本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物。在一些实施方案中，通过脑室内注射施用本发明的CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)组合物。CAR效应细胞(诸如CAR T细胞)的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
X.使用CAR诊断和成像的方法
可以将标记的CAR用于诊断目的以检测、诊断或监测癌症。例如，可以将本文所述的CAR用于原位、体内、离体、和体外诊断测定或成像测定中。
本发明的另外的实施方案包括诊断个体(例如，哺乳动物，诸如人)的癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法。该方法包括检测个体中的抗原呈递细胞。在一些实施方案中，提供了诊断个体(例如，哺乳动物，诸如人)的癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法，该方法包括(a)将有效量的根据上文所述的任何实施方案的标记的抗体部分施用于该个体；和(b)确定个体中的标签水平，使得高于阈值水平的标签水平指示个体患有癌症。阈值水平可以通过各种方法确定，该各种方法包括例如通过在患有癌症的第一组个体中和不具有癌症的第二组个体中检测根据上文所述的诊断方法的标签，并且将阈值设置成允许在该第一组与该第二组之间进行区分的水平。在一些实施方案中，该阈值水平为零，并且该方法包括确定个体中的标签的存在或不存在。在一些实施方案中，该方法还包括在施用步骤(a)之后等待一个时间间隔以允许标记的抗体部分优先集中在个体中表达抗原的部位处(并且等待未结合的标记抗体部分被清除)。在一些实施方案中，该方法还包括减去标签的背景水平。背景水平可以通过各种方法来确定，该各种方法包括例如通过检测在施用标记的抗体部分之前的个体中的标签，或者通过在不具有癌症的个体中检测根据上文所述的诊断方法的标签。
本发明的抗体部分可以用于使用本领域技术人员已知的方法测定生物样品中的抗原呈递细胞的水平。合适的抗体标签是本领域已知的并且包括酶标签，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、钐(153Sm)、镥(177Lu)、钆(159Gd)、钷(149Pm)、镧(140La)、镱(175Yb)、钬(166Ho)、钇(90Y)、钪(47Sc)、铼(186Re、188Re)、镨(142Pr)、铑(105Rh)和钌(97Ru)；鲁米诺；荧光标签，诸如荧光素和罗丹明；以及生物素。
本领域已知的技术可以应用于本发明的标记的抗体部分。此类技术包括但不限于使用双官能缀合剂(参见例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)。除了以上测定之外，各种体内和离体测定对于技术人员而言是可获得的。例如，人们可以将受试者体内的细胞暴露于任选地用可检测标签(例如，放射性同位素)标记的抗体部分，并且可以评价该抗体部分与细胞的结合，例如，通过外部扫描放射性或通过分析源自先前暴露于该抗体部分的受试者的样品(例如，活检或其它生物样品)。
XI.药物组合物
本文还提供了包含本文所述的CAR的组合物(诸如药物组合物，在本文中也被称为配制品)、编码在本文所述的CAR中含有的一种或多种多肽的核酸、包含核酸的表达盒或表达CAR的宿主细胞。在一些实施方案中，组合物还包含与CAR相关的细胞(诸如效应细胞，例如，T细胞)。在一些实施方案中，提供了一种包含CAR和药学上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含与CAR相关的细胞(诸如效应细胞，例如，T细胞)。
CAR的合适配制品通过将具有期望纯度的CAR与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来获得(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑(1980))，其呈冻干制剂或水溶液形式。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性配制品描述于WO98/56418中，其以引用的方式明确地并入本文中。适于皮下施用的冻干配制品描述于WO97/04801中。此类冻干配制品可以用合适的稀释剂重构为高蛋白质浓度，并且重构的配制品可以皮下施用于本文中待治疗的个体。阳离子脂质体或脂质体可以用于将本发明的CAR递送到细胞中。
本文的配制品还可包含除CAR之外的一种或多种所治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。例如，可能期望进一步提供除CAR之外的抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的CAR的量、疾病或病症或治疗的类型以及上文所论述的其他因素。这些通常以与如本文所述的相同的剂量和施用途径或者以迄今为止采用的剂量的约1％至99％使用。
CAR也可包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如，分别在胶体药物递送体系(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑(1980)中。可制备持续释放制剂。
可以制备CAR的持续释放制剂。持续释放制剂的合适的示例包括含有CAR(或其片段)的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品的形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能够释放分子持续100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间段。当包封的CAR在身体内保持长时间时，它们可能由于在37℃下暴露于水分而变性或聚集，导致生物活性丧失并且免疫原性可能发生变化。根据所涉及的机制，可以设计用于稳定CAR的合理策略。例如，如果发现聚合机制是通过硫代二硫化物互换的分子间S-S键形成，则稳定可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现。
在一些实施方案中，将CAR配制在包含柠檬酸盐、NaCl、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(Tween 80)或前述任何组合的缓冲液中。在一些实施方案中，将CAR配制在包含约100mM至约150mM甘氨酸的缓冲液中。在一些实施方案中，将CAR配制在包含约50mM至约100mM NaCl的缓冲液中。在一些实施方案中，将CAR配制在包含约10mM至约50mM乙酸盐的缓冲液中。在一些实施方案中，将CAR配制在包含约10mM至约50mM琥珀酸盐的缓冲液中。在一些实施方案中，将CAR配制在包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中。在一些实施方案中，将CAR配制在pH介于约5.1与5.6之间的缓冲液中。在一些实施方案中，将CAR配制在包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸和0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中，其中所述配制品处于pH 5.5。
用于体内施用的配制品必须是无菌的。这易于通过例如经由无菌过滤膜过滤来实现。
XII.剂量和施用
施用于个体(诸如人类)的CAR组合物的剂量可以根据特定组合物、施用模式和待治疗的疾病类型而变化。在一些实施方案中，CAR组合物的量足以在个体中产生完全应答。在一些实施方案中，CAR组合物的量足以在个体中产生部分应答。在一些实施方案中，所施用的CAR组合物的量(例如，当单独施用时)足以在用该CAR组合物治疗的个体群体中产生大于约2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％中的任一者的总体应答率。可以例如基于肿瘤生长抑制百分比(％TGI)来确定个体对本文所述方法的治疗的应答。
在一些实施方案中，组合物的量足以延长个体的总存活期。在一些实施方案中，组合物的量(例如当一起施用时)足以在用该CAR组合物治疗的个体群体中产生大于约2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或77％的临床益处。
在一些实施方案中，组合物的量是与治疗之前在相同受试者中对应的肿瘤尺寸、癌细胞数量或肿瘤生长速率相比或与未接受治疗的其它受试者的对应活性相比，足以将肿瘤的尺寸减小、将癌细胞数量减少或将肿瘤生长速率降低至少约2％、4％、6％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的量。可以将标准方法用于测量这种效果的量级，诸如使用纯化酶的体外测定、基于细胞的测定、动物模型或人类测试。
在一些实施方案中，组合物中CAR的量低于诱导毒理学作用(即，高于临床上可接受的毒性水平的作用)的水平或处于当将组合物施用于个体时可以控制或耐受潜在的副作用的水平。在一些实施方案中，组合物的量接近在相同给药方案之后组合物的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施方案中，组合物的量为MTD的大于约80％、90％、95％或98％中的任一者。在一些实施方案中，组合物中CAR的量包括在约0.001μg至约1000μg的范围内。在任何上述方面的一些实施方案中，组合物中CAR的有效量在约0.1μg/kg总体重至约100mg/kg总体重的范围内。
CAR组合物可以经由各种途径施用于个体(诸如人)，该各种途径包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、鼻内、吸入、囊内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、颅内、脑内、脑室内、经粘膜和经皮。在一些实施方案中，可以使用组合物的持续连续释放配制品。在一些实施方案中，静脉内地施用组合物。在一些实施方案中，动脉内地施用组合物。在一些实施方案中，腹膜内地施用组合物。在一些实施方案中，鞘内地施用组合物。在一些实施方案中，颅内地施用组合物。在一些实施方案中，脑内地施用组合物。在一些实施方案中，脑室内地施用组合物。在一些实施方案中，鼻内地施用组合物。
XIII.制造方法
本公开还提供了一种制造如当前所公开的细胞的方法。如果第一靶和第三靶是患病或感染细胞的抗原，则细胞可以被认为是治疗细胞。在示例性方面，所述方法包括使细胞与包含以下项的组合物接触：(i)包含编码细胞表面受体的第一核苷酸序列的核酸，该细胞表面受体包含与第一靶结合的细胞外结构域(ECD)；跨膜结构域(TMD)；和包含T细胞信号传导分子的至少一部分的细胞内结构域(ICD)，以及(ii)包含编码与第二靶和第三靶结合的抗原结合蛋白的第二核苷酸序列的核酸，其中该第二核苷酸序列的表达在该第一靶与该细胞表面受体结合后被激活。包含核酸的组合物可以是本文所述的那些组合物中的任一种。在示例性方面，与组合物接触的细胞是免疫细胞。在示例性方面，细胞从人类获得。在一些方面，该方法包括从人类获得免疫细胞，然后使该细胞与表达载体系统接触。在示例性方面，该方法包括培养细胞持续足以将细胞扩增到至少106个细胞的群体的时间段。在示例性方面，将细胞扩增到至少107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个或更多个细胞的群体。
递送用于在细胞中表达的核酸的方法是本领域已知的，并且包括例如使用阳离子脂质的脂质递送或其他化学方法(例如，磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、聚凝胺)、电穿孔或病毒递送。参见例如，Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2001),Nayerossadat等人，AdvBiomed Res 1:27(2012)；以及Hesier,William(编辑),Gene Delivery to MammalianCells，第1卷，Non-viral Gene Transfer Techniques,Methods in Molecular Biology,Humana Press,(2004)。
实施例
材料和方法
细胞样品、细胞系和抗体
细胞系HepG2(ATCC HB-8065；HLA-A2+、AFP+、GPC3+)、SK-HEP-1(ATCC HTB-52；HLA-A2+、AFP-)、Raji(ATCC CCL-86；CD19+)、Nalm6(ATCC CRL-1567；CD19+)、RPMI-8226(ATCCCRM-CCL-155，ROR1+)、LNCaP(ATCC CRL-1740；PSMA+)、和IM9(ATCC CCL-159；HLA-A2+、NY-ESO-l+)从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。
HepG2是表达AFP和GPC3的肝细胞癌细胞系；SK-HEP-1是不表达AFP的肝腺癌细胞系。Raji是表达CD19的伯基特淋巴瘤细胞系。Nalm6是也表达CD19的白血病细胞系。RPMI-8226细胞是表达ROR1的骨髓瘤细胞。LNCaP前列腺肿瘤细胞系表达PSMA。IM9是表达NY-ESO-1的多发性骨髓瘤细胞系。将所有细胞系在补充有10％FBS和2mM谷氨酰胺的RPMI1640或DMEM中在37℃/5％CO2下培养。
购买针对人或小鼠CD3、CD4、CD8、CD28、CCR7、CD45RA或myc标签的抗体(Invitrogen)；AFP158/HLA-A*02:01特异性抗体、CD19特异性抗体、ROR1特异性抗体、GPC3特异性抗体、PSMA特异性抗体和NY-ESO-1抗体在Eureka Therapeutics内部开发并生产。使用BD FACS Canto II收集流式细胞术数据并使用FlowJo软件包进行分析。
所有肽均购买自并由Elim Biopharma合成。肽为>90％纯的。将肽以10mg/mL溶解于DMSO中或在盐水中稀释，并冷冻在-80℃。通过用重组HLA-A*02:01和β2微球蛋白(β2M)使肽重新折叠来产生生物素化的单链AFP158/HLA-A*02:01和对照肽/HLA-A*02:01复合物单体。通过BirA酶将BSP肽连接到HLA-A*02:01细胞外结构域(ECD)的C末端来使该单体生物素化。将荧光标记的链霉亲和素与生物素化的肽/HLA-A*02:01复合物单体混合以形成荧光标记的肽/HLA-A*02:01四聚体。
例如通过用编码CAR的载体转染293T细胞来生产含有嵌合CAR的慢病毒。在存在白介素2(IL-2)的情况下100U/ml用CD3/CD28珠(
Figure BDA0003522887730000791
Invitrogen)刺激一天之后将原代人T细胞用于转导。将浓缩的慢病毒应用于Retronectin(Takara)涂覆的6孔板中的T细胞，持续96小时。通过流式细胞术评估抗AFP和抗AFP嵌合CAR的转导效率。对于抗CD19 CAR，使用PE缀合的抗CD19抗个体基因型抗体进行测定。对于抗AFP CAR，使用分别具有PE缀合的链霉亲和素或抗myc抗体的生物素化的AFP158/HLA-A*02:01四聚体(“AFP158四聚体”)。在第5天和之后每3-4天进行重复流式细胞术分析。
用编码CAR的载体转导细胞系。转导后五天，使用抗myc抗体产生细胞裂解物以用于western印迹。
通过Cytox 96非放射性LDH细胞毒性测定(Promega)来测定肿瘤细胞毒性。使用负面耗竭CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD66b、CD123、血型糖蛋白A表达细胞的EasySep人T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)从富含PBMC的全血中制备CD3+T细胞。根据制造商的方案，将人T细胞激活并且用例如CD3/CD28 Dynabeads(Invitrogen)扩增。将激活的T细胞(ATC)培养并维持在具有10％FBS加100U/ml IL-2的RPMI 1640培养基中并且在第7-14天使用。激活的T细胞(免疫细胞)和靶细胞以各种效应物与靶比率(例如，2.5:1或5:1)共培养16小时并测定细胞毒性。
实施例1-CAR设计
如下表2中所描述，设想和制备各种CAR设计。
表2
Figure BDA0003522887730000801
如下表3中所描述，设想和制备其他CAR设计。
表3
Figure BDA0003522887730000811
Figure BDA0003522887730000821
实施例2-接合之前的CAR T细胞
在确定靶细胞接合之前表达CAR的T细胞群中代表的T细胞亚群的组成的测定中，使用标志物CCR7(记忆T细胞)和CD45RA(原初T细胞)对CD8+受体+CAR T细胞进行流式细胞术分析。图1和下表4示出了在αCD19 CAR T细胞上分化标志物CCR7和CD45RA的分布。这些数据指示，表达αCD19-CD30z CAR的T细胞包含比与靶细胞接合之前的-CD28z CAR更少的分化(更多的原初)群体以及更多的中央记忆T细胞。将抗CD19-CD8T-CD30z的分化状态与图1和表4中的-CD8T-41BBz CAR T细胞进行比较，与-CD8-41BBz转导的T细胞相比，-CD8T-CD30z群体中的中央记忆T细胞群也更大。
表4.靶接合之前的CCR7+CD8+T细胞
Figure BDA0003522887730000822
Figure BDA0003522887730000831
靶接合之前的分化状态可能影响表达CAR的T细胞的存活率和在体外或在体内持续的能力、以及有助于CAR T细胞的抗肿瘤功效的能力。当响应于遇到抗原时，原初T细胞增殖并分化成效应细胞，其大多数执行破坏靶的工作并且然后死亡，然而小部分的T细胞最终发展成可以将针对特定靶的T细胞免疫力储存的长寿命的记忆T细胞。在记忆T细胞中，发现中央记忆T细胞比效应记忆T细胞具有更长的寿命并且能够产生效应记忆T细胞，但反之则不能。因此，发展成和维持记忆T细胞(尤其是中央记忆T细胞)的能力是潜在成功的T细胞疗法的重要和期望的特征。
实施例3-抗CD19 CAR T细胞的短期靶细胞杀伤
进行基于FACS的测定，比较了各种CAR-T细胞的短期杀伤能力。图2证明了抗CD19-CD30z CAR T细胞显示出与-CD28z CAR T细胞相当的靶细胞杀伤(Nalm6)。抗CD19-CD8T-CD30z CAR T细胞同样显示出与-CD8T-41BBz CAR T细胞相当的靶细胞杀伤。
激活的T细胞和靶细胞以5:1的比率与αCD19或αAFP抗体一起共培养16小时。通过测量培养物上清液中的LDH活性来确定特异性杀伤。通过LDH细胞毒性测定(Promega)来测定肿瘤细胞毒性。根据制造商的方案，将购买自AllCells的人T细胞激活并用CD3/CD28Dynabeads(Invitrogen)扩增。将激活的T细胞(ATC)培养并维持在具有10％FBS加100U/mlIL-2的RPMI 1640培养基中并且在第7-14天使用。通过FACS分析，T细胞为>99％CD3+的。激活的T细胞(效应细胞)和靶细胞(Nalm6或HepG2细胞)以5:1的比率分别与不同浓度的αCD19或αAFP抗体一起共培养16小时。然后通过测量培养物上清液中的LDH活性来确定细胞毒性。
实施例4-抗CD19 CAR T细胞增殖
遗传修饰的T细胞的增殖和持久性对于过继性T细胞转移疗法在治疗癌症时的成功至关重要。为了测定CAR对T细胞增殖和持久性的影响，我们将T细胞用细胞内染料CFSE标记并观察在用肿瘤细胞刺激时T细胞分裂时染料的稀释。我们还能够通过计数在指定日剩余的CFSE阳性细胞的数量来测量T细胞的持久性。
相应的T细胞是血清饥饿过夜的，并且使用CellTrace CFSE(Thermo FisherC34554)用CFSE标记的。将100,000个T细胞在2:1的E:T比率下孵育，并且使用流式细胞术观察在指定日T细胞分裂时的CFSE染料的连续稀释。用FAC计数T细胞的总数。
如图3A和3B所示，在所测试的抗CD19 CAR-T细胞、-CD28z和-CD30z或-CD8T-CD30z和-CD8T-41BBz CAR T细胞中在靶细胞接合后的抗CD19 CAR T细胞增殖显示出响应于与Nalm6(A)和Raji(B)细胞接合两者随时间的稳健细胞分裂水平，如通过CFSE稀释所测量的。
实施例5-在多次癌细胞接合后抗CD19 CAR T细胞的长期杀伤
将对靶细胞进行计数的基于FACS的测定用于比较CAR T细胞的长期杀伤潜力。如图4A和4B所示，抗CD19 CAR有效地介导在接合后几天内测量的以人CD19特异性方式杀伤癌细胞系。图4A示出了在接合后几天内(E1D3至E3D7)的Nalm6靶细胞计数。图4B示出了在相同时期内测量的T细胞数。本实验中的效应物与靶比率最初为5:1。图4A中的结果显示，具有CD30 TM和CD30z IC区的抗CD19-CAR T细胞(αCD19-CD30z)与具有CD28 TM和CD28z IC的对应CAR T细胞(αCD19-CD28z)和具有CD8 TM和4-1BB IC的对应的CAR T细胞(αCD19-CD8T-41BBz)相比杀死更多的Nalm6肿瘤细胞。图4B中的结果显示，具有CD30 TM和CD30z IC的抗CD19-CAR T细胞与具有CD28 TM和CD28z IC的对应CAR T细胞和具有CD8 TM和4-1BB IC的对应的CAR T细胞相比以更高的比率存活更长的时间。
如图12A、12B、13A和13B所示，还通过与Raji细胞共培养来测量通过抗CD19 CAR T细胞的长期杀伤。在图12A中，具有-CD30z和-CD8T-41BBz的抗CD19 CAR T细胞显示出在几天内测量的在靶细胞杀伤中的相当功效。图12B示出了具有CD30 TM和CD30z IC的抗CD19-CAR T细胞与具有CD28 TM和CD28z IC的对应CAR T细胞和具有CD8 TM和4-1BB IC的对应的CAR T细胞相比以高的比率存活更长的时间。
在图13A和13B中，使用Raji细胞作为靶，在长期杀伤测定中将抗CD19-CD30z CART细胞与对应的-CD8T-41BBz CAR T细胞进行比较。结果显示，具有CD30 TM和CD30z IC的CAR T细胞与对应的CD8T-41BB CAR T细胞相比杀死更多的靶细胞并且存活更佳。
我们用与不同的TM和共刺激结构域配对的各种抗体部分的实验揭示了对于抗CD19-CAR，CD30TM-CD30z CAR和CD8TM-CD30z CAR两种配置都能够杀死Nalm6和Raji细胞，但是前者似乎稍微更好地起作用。相反，对于抗AFP-CAR，CD30TM-CD30z CAR仅显示出低水平的HepG2细胞杀伤，而CD8T-CD30z CAR配置显著更能够杀死HepG2细胞。
实施例6-在与靶细胞共培养之后抗CD19 CAR T细胞中的T细胞耗竭标志物的表达
为了检查抗原刺激时在CAR转导的细胞上表达的耗竭标志物的水平，使用EasySep人T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)从富含PBMC的全血制备CD3+T细胞，并且如上文所述用CD3/CD28 Dynabeads激活。激活和扩增的细胞群为通过流式细胞术确定的>99％CD3+。然后将这些细胞用编码含有αCD19-CD28z、αCD19-CD30z或αCD19-CD8T-41BBz或αCD19-CD8T-CD30z CAR构建体(分别为SEQ ID NO:1、2、4和3)的CAR的慢病毒载体转导，持续7-9天。使用抗CD19抗体和抗CD4抗体以及针对耗竭标志物PD-1、LAG3或TIM3的抗体，将转导的细胞与靶细胞一起以2.5:1的效应物与靶比率共培养16小时。通过流式细胞术分析转导的T细胞上的耗竭标志物的水平。图5A和5B示出了在与靶Nalm6细胞第二次接合后第3天的-CD30z和-CD28z CAR T细胞中PD-1表达的MFI。图6A和6B示出了-CD8T-CD30z和-CD8T-41BBzCAR T细胞在同一天的MFI值。
图7A和7B示出了在接合后第3天到第5天在CAR T细胞的表面上抗CD19 CAR对三种耗竭标志物PD-1、TIM3和LAG3表达的影响。表5A和5B比较了在较长时间段内抗CD19-CD30z和-CD8T-CD30z CAR T细胞与抗CD19-CD28z和-CD8T-41BBz CAR T细胞的MFI值的比率。这些实验表明，在阻抑CAR T细胞中的PD-1、LAG3或TIM3的表达方面，-CD30z CAR优于-CD28z或-CD8T-41BBz CAR。暗示了抗CD30z或抗CD8T-CD30z CAR T细胞与-CD28或-CD8T-41BBCAR T细胞相比可能在接合后能够持续更长时间，延迟T细胞耗竭(应变力缺乏)。
表5A.在Nalm6细胞接合后在一组αCD19 CAR T细胞中的耗竭标志物PD-1、TIM3和 LAG3随时间推移的MFI的比较
Figure BDA0003522887730000861
表5B.在与Raji靶细胞接合后几天在αCD19 CAR T细胞上表达的耗竭标志物PD-1 和LAG3
Figure BDA0003522887730000862
Figure BDA0003522887730000871
按照如本文所述的相同方案，除了测量耗竭标志物表达之外，还可以测量干细胞标志物的表达以进一步解决诱导的应变力缺乏的概念。干细胞标志物的实例包括但不限于干细胞抗原-1(Sca-1)、Bcl-2和IL-2和IL-15受体β链(CD122)。干细胞标志物水平将测量转导的T细胞的起始群体的剩余T细胞记忆亚群，这对于在实体瘤微环境中维持很重要。
实施例7-抗AFP CAR T细胞的短期靶细胞杀伤
使用上文针对在Nalm6靶细胞中的短期杀伤所描述的方法，图8示出了由抗AFP-CD30z CAR T细胞介导的HepG2杀伤与CD28z CAR T细胞相当并且CD8T-CD30z CAR T细胞杀伤与CD8T-41BBz CAR T细胞相当。几天内存活的CD3+抗AFP CAR T细胞的数量也是相当的。
实施例8-抗AFP CAR T细胞增殖
如图9所示，使用上文针对CFSE稀释测定所描述的方法，在所测试的抗AFP CAR-T细胞(-CD28z和-CD30z或-CD8T-CD30z和-CD8T-41BBz CAR T细胞)之间在靶细胞接合后抗AFP CAR T细胞增殖显示在HepG2接合后随时间推移的剧烈的细胞分裂水平。
实施例9-通过抗AFP CAR T细胞的长期杀伤
除了使用HepG2 AFP+肝细胞细胞系之外，使用如针对抗CD19 CAR T细胞所描述的相同的用于长期杀伤的方法测量了αAFP CAR T细胞对肝癌靶细胞的长期效果。结果表明，在多天测定期间，在所分析的抗AFP CAR(-CD28z、-CD8T-41BBz和-CD8T-CD30z)中CD30 CART细胞数量保持在相当且显著的水平。另外，在所测试的CAR T细胞中类似地观察到对HepG2靶细胞的长期杀伤。
实施例10-抗AFP CAR T细胞中的PD-1耗竭标志物
在图10A和10B中，如上文针对抗CD19 CAR T细胞所描述的除了使用HepG2细胞系之外通过MFI所测量的在抗AFP CAR T细胞中的耗竭标志物PD-1表达表明，在CD8T-CD30zCAR T细胞中的PD-1表达水平显著低于CD28z CAR T细胞中的PD-1表达水平。同样，表达CD8T-CD30z的CAR T细胞显示出与CD8T-41BB CAR T细胞相比对PD-1表达的阻抑。
实施例11-在与HepG2靶细胞接合后的几天在αAFP CAR T细胞上表达的耗竭标志 物PD-1、TIM3和LAG3的体外杀伤、T细胞增殖和表达
如上文所述从富集PBMC的全血中制备CD3+T细胞，并且还用编码抗AFP-CAR构建体-CD28z、和-CD30z或-CD8T-41BBz和-CD8T-CD30z(分别为SEQ ID NO:5、6、8和7)的慢病毒载体转导7-9天。然后将转导的细胞与靶细胞一起以2.5:1的效应物与靶比率共培养16小时，并且用AFP158四聚体和抗CD4抗体以及针对耗竭标志物PD-1、LAG3或TIM3的抗体共染色。通过在四聚体+(即，转导的)T细胞上门控通过流式细胞术分析在转导的T细胞上的耗竭标志物的水平。
图11A和11B中示出了代表随时间推移在抗AFP CAR T细胞中的PD-1、TIM3和LAG3表达的中值MFI值的比较。通过-CD30z CAR受体的接合导致与通过-CD28z CAR受体激活的T细胞相比累积较少耗竭标志物的T细胞。表6比较了与-CD28z和-CD8T-41BB CAR相比在HepG2接合后在抗AFP-CD30z和-CD8-CD30z CAR中的MFI值的比率。
表6：在与HepG2靶细胞接合后几天在αAFP CAR T细胞上表达的耗竭标志物PD-1、 TIM3和LAG3
Figure BDA0003522887730000881
Figure BDA0003522887730000891
实施例12–在αROR1 CAR T细胞中的耗竭标志物的比较
我们先前已经证明(WO2016187220、WO2016187216)，靶向ROR1的抗体或CAR在抗原依赖性杀伤测定中在体外和体内肿瘤模型中都是有效的。为了进一步解决ROR1作为B淋巴细胞癌症的靶的有效性，我们在使用CD30、CD28和4-1BB共刺激区域的第2代CD8T-CD30zCAR T细胞中表达ROR1。在过夜杀伤测定中和在长期杀伤测定中，如使用ROR1+RPMI-8226骨髓瘤细胞系通过LDH释放所测量的，预期αROR1-CD30z CAR比其-CD28z和-4-1BBz对应物表现更好。
在两个独立的流式细胞术测定中，在靶细胞接合之前和之后测量ROR1+T细胞的增殖和存活。CD8+受体+CAR-T细胞的FACS分析预期在靶接合之前显示出在CD4+受体+CAR T细胞中增强的T细胞分化标志物CCR7和CD45RA表达。预期值Q2和Q3显示αROR1-CD30z T细胞比表达αROR1-CD28z或-41BBz的T细胞包含更多的原初群体。
在RPMI-8226ROR1+靶细胞接合后进行αROR1-CAR T细胞的CFSE稀释/增殖(FACS)测定。通过在细胞分裂时CFSE荧光的减少来测量在接合后第3天(E1D3)和第7天(E2D7)αROR1-CAR T细胞的增殖。预期增殖在所有测试的T细胞群中是相当的。
还分析了在与RPMI-8226ROR1+靶细胞接合后随时间推移在αROR1 CAR T细胞中的耗竭标志物表达(PD-1、TIM3和LAG3)。我们期望αROR1-CD30z T细胞比αROR1-CD28z和-41BBz CAR T细胞表达实质上更少的所有标志物。
实施例13-αGPC3、αNY-ESO-1和αPSMA CAR T细胞的表型
使用针对αCD19 CAR T细胞所描述的测定(参见方法)，针对(a)增殖能力、(b)对靶细胞的细胞毒性和(c)耗竭标志物的表达，通过具有各种共刺激结构域的αGPC3、αNY-ESO-1和αPSMA CAR在T细胞中的表达来分析实体瘤免疫疗法靶GPC3、NY-ESO-1和PSMA的比较。
GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)是在许多实体瘤上呈递的表面表达的癌症靶抗原。其是硫酸肝素蛋白聚糖家族的成员，并且成熟形式通过糖基磷脂酰肌醇锚(GPI)栓系到细胞表面上。我们先前已经描述了针对GPC3的表面结合变体的抗体部分(WO2018200586)。GPC3免疫疗法的靶将是实体瘤，诸如HCC、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、卵黄囊瘤、绒毛膜癌、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、Wilms肿瘤、睾丸非精原细胞瘤性生殖细胞肿瘤、胃癌和脂肪肉瘤。
NY-ESO-1肿瘤抗原是属于癌症睾丸抗原家族的18kDa细胞内蛋白。我们先前已经描述了NY-ESO-1抗体的特性(WO2016210365)；其具有衍生自针对肽-MHC复合物的抗体的结合结构域，称为TCR模拟物。本文所述的NY-ESO-1 CAR衍生自该出版物中所公开的抗体；潜在的免疫疗法将针对实体瘤NY-ESO-1阳性靶，诸如膀胱癌、乳腺癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤或甲状腺癌。
PSMA(前列腺特异性膜抗原)是在前列腺癌(腺癌)中高度表达的II型跨膜糖蛋白，并且由叶酸水解酶1基因编码。我们先前的工作描述了抗PMSA/抗CD3双特异性抗体(WO2019032699)。本文所述的抗PSMA CAR衍生自双特异性抗体的PSMA部分。
上文针对GPC3、NY-ESO-1和PSMA引用的专利申请中的方法和实施例提供了在靶细胞杀伤、CAR T细胞增殖和耗竭标志物表达方面测试本发明的CAR所必需的指导和材料。我们预期这些CAR的表达将进一步证实CD30共刺激结构域向表达CAR的T细胞赋予耗竭抗性表型的假设。
实施例14-体内功效研究
人肝细胞癌异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
使用SCID-浅褐色小鼠中的SK-HEP-1-AFP-MG的皮下(s.c.)模型测试了用本文所述的CAR转导的T细胞的体内抗肿瘤活性。将SK-HEP-1-AFP-MG细胞以5×106个细胞/小鼠皮下植入SCID-浅褐色小鼠右侧。当平均肿瘤体积达到100mm3时，基于肿瘤体积将动物随机分配到两个接受以下项的组(每组8只小鼠)：(i)模拟物转导的T细胞和(ii)CAR转导的T细胞。在随机分组后立即通过每两周一次静脉内(i.v.)注射每只小鼠107个模拟物或CAR转导的T细胞持续三个剂量来治疗动物。紧密监测小鼠的一般健康状况、可能的不良反应(如果有的话)和肿瘤体积的变化。模拟物和CAR转导的T细胞在当前剂量和时间表下具有良好耐受性。虽然SK-HEP-1-AFP-MG肿瘤在静脉内施用模拟物或abTCR转导的T细胞后继续生长，但与模拟物T细胞治疗的肿瘤相比，CAR转导的T细胞治疗的肿瘤的生长速率更慢。
在较大的SK-HEP-1-AFP-MG s.c.肿瘤中进一步评估CAR转导的T细胞的抗肿瘤活性。在用携带SK-HEP-1-AFP-MG肿瘤的小鼠的研究中，当平均肿瘤体积达到300mm3时，将动物随机分到两个组中(n＝每组4只小鼠)。动物未接受治疗或接受单次肿瘤内(i.t.)注射每只小鼠107个abTCR转导的T细胞。CAR转导的T细胞的肿瘤内递送减慢了大的SK-HEP-1-AFP-MG肿瘤的生长，如通过肿瘤体积随时间的变化所测量的。静脉内和肿瘤内施用abTCR转导的T细胞显著抑制了SK-HEP-1-AFP-MG的建立的皮下异种移植物的生长。
淋巴瘤异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
在NOD SCID γ(NSG)小鼠中的人淋巴瘤异种移植物模型中测试用CAR转导的T细胞的体内抗肿瘤活性。Raji-luc-GFP细胞购买自Comparative Biosciences,Inc.(Sunnyville,California 94085)并且在37℃下在具有5％CO2的加湿气氛中在RPMI培养基+10％FBS和1％L-谷氨酰胺中培养。在用编码萤火虫萤光素酶(luc)和绿色荧光蛋白两者的双报告基因稳定转染之后从CD19阳性伯基特淋巴瘤细胞系Raji衍生Raji-luc-GFP细胞，产生可以使用生物发光成像体内追溯的细胞。NSG小鼠购买自Jackson Laboratories(BarHarbor,ME USA 04609)并且在实验之前适应至少7天。将Raji-luc-GFP细胞再悬浮于PBS中并且通过尾静脉以1×106个细胞/100μl/小鼠静脉内(i.v.)植入NSG小鼠中。肿瘤植入后五天，使用Xenogen IVIS成像系统对动物成像，用于评估肿瘤负荷。在平均光子发射为6.7×105个光子时基于光子发射将小鼠随机分到以下四个组(n＝每组6只小鼠)：(i)无治疗、(ii)模拟物转导的人T细胞、和(iii)CAR-T治疗的。在随机分组后立即以每只小鼠107个细胞的剂量用模拟物或CAR-T细胞静脉内治疗动物，每两周一次，持续3个剂量。
给药后紧密监测动物。使用Xenogen IVIS系统进行生物发光成像，每周一次，持续长达8周。
如上文所描述的进行动物研究以评价用CAR转导的T细胞的体内抗肿瘤能力。
在本研究中使用6-8周龄的雌性NSG小鼠。在37℃下在具有5％CO2的加湿气氛中在RPMI培养基+10％FBS和1％L-谷氨酰胺中培养Raji-luc-GFP细胞系。将Raji-luc-GFP细胞重悬浮于PBS中并以1x106个细胞/100μl/小鼠静脉内植入到40只NSG小鼠中。
在肿瘤植入后四天，使用Ivis Spectrum对小鼠进行成像以确认肿瘤生长。然后基于光子发射将小鼠随机分到六个组中进行以下处理(n＝6只小鼠/组)：1)媒介物剂(PBS)；2)模拟物(8x106个模拟物转导的T细胞)；3)CAR(8×106个用CAR转导的T细胞)。
在肿瘤植入后对动物进行紧密监测，并用800万个受体阳性T细胞给药。称重动物，并且在研究的持续时间内每周进行两次Xenogen成像。显示以下状况的动物被安乐死并记录为“条件性死亡”：a)急性不良响应：吃力的呼吸、震颤、被动行为(食欲丧失和昏睡)；b)超过25％初始体重的体重损失；和c)影响小鼠运动的肢体麻痹。
所有CAR T细胞在体内靶向和裂解Raji肿瘤，证明在CAR平台中抑制肿瘤生长的功效。
白血病异种移植物模型中的体内抗肿瘤活性
在NSG小鼠中的人白血病异种移植物模型中测试用CAR转导的T细胞的体内抗肿瘤活性。在37℃下在具有5％CO2的加湿气氛中在RPMI培养基+10％FBS中培养Nalm6-luc-GFP细胞。在用编码萤火虫萤光素酶(luc)和绿色荧光蛋白两者的双报告基因稳定转染之后从急性淋巴细胞性白血病细胞系Nalm6衍生Nalm6-luc-GFP细胞，产生可以使用生物发光成像体内追溯的细胞。NSG小鼠购买自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME USA 04609)并且在实验之前适应至少3天。将Nalm6-luc-GFP细胞再悬浮于PBS中并且通过尾静脉以5×105个细胞/100μl/小鼠静脉内(i.v.)植入三十只6-8周龄的雌性NSG小鼠中。肿瘤植入后四天，使用Xenogen IVIS成像系统对动物成像，用于评估肿瘤负荷。基于光子发射将小鼠随机分到以下四个组中：(i)媒介物，仅PBS(n＝6只小鼠)；(ii)10×106个模拟物转导的人T细胞(n＝6只小鼠)，和(iii)5×106个CAR T细胞。
在肿瘤植入后紧密监测动物并用受体阳性T细胞给药。称重动物，并且在研究的持续时间内每周进行两次Xenogen成像。显示以下状况的动物被安乐死并记录为“条件性死亡”：a)急性不良响应：吃力的呼吸、震颤、被动行为(食欲丧失和昏睡)；b)超过25％初始体重的体重损失；和c)影响小鼠运动的肢体麻痹。
在治疗后24小时，从每组3只小鼠收集血液。在治疗后7天和13天，从每个组的代表性小鼠收集血液，并且使用来自Affymetrix eBioscience,Inc.的“123count eBeads”试剂盒通过流式细胞术进行分析，以确定每μl血液中的CD3+T细胞、表达CAR的T细胞和肿瘤细胞的数量、以及在T细胞上的PD-1表达水平。治疗后13天，对每组2只小鼠实施安乐死并且通过流式细胞术分析骨髓提取物中的CD3+/CAR T细胞、肿瘤细胞的存在和在T细胞上的PD-1表达水平。
与治疗后13天的媒介物和模拟物治疗的对照动物相比，用CAR T细胞治疗的小鼠显示出外周血和骨髓两者中肿瘤细胞(由FITC染色指示)的减少。在用CAR T细胞治疗的小鼠中，对于CD4+和CD8+T细胞两者，来自外周血和骨髓两者的T细胞表面上的PD-1(T细胞耗竭标志物)的表达水平降低了，。这些结果表明，在表达CD30 CAR的T细胞中T细胞耗竭被阻抑。
实施例15-记忆细胞从抗CD19 CAR T细胞的发展和维持
本实施例显示，在靶刺激之后，抗CD19 CAR T细胞发展成并维持高的记忆T细胞群，包括中央记忆和效应记忆T细胞。为了确定表达抗CD19 CAR对T细胞发展成并维持记忆T细胞的能力的作用，我们测量了记忆T细胞标志物CCR7和CD45RA的细胞表面表达。如本领域已知的，具有高CCR7表达水平和低CD45RA表达水平的T细胞被认为是中央记忆T细胞，具有低CCR7和低CD45RA表达水平的T细胞是效应记忆T细胞；具有低CCR7和高CD45RA表达水平的T细胞是效应T细胞，而具有高CCR7和高CD45RA的T细胞是从胸腺释放的原初T细胞，但是也是不能引起免疫应答。原初T细胞需要激活、靶/抗原激发/识别，以分化为不同的T亚群(EurJ Immunol.2013年11月；43(11):2797-809.doi:10.1002/eji.201343751。电子出版于2013年10月30日。The who's who of T-cell differentiation:human memory T-cellsubsets.Mahnke YD1,Brodie TM,Sallusto F,Roederer M,Lugli E.)。当响应于遇到抗原时，原初T细胞增殖并分化成效应细胞，其大多数执行破坏靶的工作并且死亡，然而小部分的T细胞在再次暴露于它们的同源抗原时最终发展成可以将针对肿瘤或病毒靶的T细胞免疫功能“储存”的长寿命的记忆T细胞。在记忆T细胞中，发现中央记忆T细胞比效应记忆T细胞具有更长的寿命并且能够产生效应记忆T细胞，但反之则不能。因此，发展成和维持记忆T细胞(尤其是中央记忆T细胞)的能力是潜在成功的T细胞疗法的重要和期望的特征。
将原代T细胞进行模拟物转导或用编码各种CAR构建体的载体转导。将效应细胞与100,000个Nalm6靶细胞和100,000个T细胞一起以1.2:1的效应物与靶比率在96孔板中孵育，并且孵育7天(所有孔具有相同的总T细胞数)。然后每7天用每孔100,000个Nalm6细胞再攻击细胞。
每个不同的T细胞和靶细胞混合物样品以重复进行，以确保至少一个混合物可用于在每个选定日进行定量。在第四次和第五次靶细胞接合(E4和E5)之前将效应细胞和靶细胞混合物以1:6稀释以避免由于显著的T细胞扩增而导致T细胞的过高密度性，使得先前剩余的细胞中的仅六分之一被100,000个Nalm6细胞再攻击。
在每次靶细胞接合后的选定日，将来自每个样品的孔中的整个细胞混合物都用针对CCR7和CD45RA的抗体染色并通过流式细胞术进行分析。计数受体+T细胞数，并且基于其CCR7和CD45RA表达水平将细胞分组为各种T细胞类型：中央记忆T细胞(CD45RA-CCR7+)、效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-)、效应T细胞(CD45RA+CCR7-)和原初T细胞(CD45RA+CCR7+)。计算各种类型的T细胞在受体+T细胞的总数中的百分比。在一些实验中，还用针对CD8或CD4的抗体染色细胞以确定所计数的T细胞的CD8-CD4特征。
在如下所示的各种抗CD19 CAR T细胞组与Nalm6靶细胞接合多次之后对中央记忆或效应记忆T细胞进行计数。表7A-7E中示出了结果，包括记忆细胞计数以及来自CD30-CART细胞组的记忆细胞计数与来自CD28-CAR T或4-1BB-CAR T细胞组的记忆细胞计数的计算比率。
表7A.中央记忆T细胞(Tcm)计数以及总CD8+CD30-CAR与CD28-CAR T的比率。
Figure BDA0003522887730000951
表7B.中央记忆T细胞(Tcm)计数以及总CD8+受体+CD30-CAR与CD28-CAR T的比率。
Figure BDA0003522887730000952
表7C.中央记忆T细胞(Tcm)计数以及总CD8+CD30-CAR与CD8T-41BB-CAR T的比率。
Figure BDA0003522887730000953
表7D.中央记忆T细胞(Tcm)计数以及CD8+受体+CD30-CAR与CD8T-41BB-CAR T的比 率。
Figure BDA0003522887730000961
表7E.效应记忆T细胞(Tem)计数以及总CD8+CD30-CAR与CD8T-41BB-CAR的比率。
Figure BDA0003522887730000962
表7F.效应记忆T细胞(Tem)计数以及CD8+受体+CD30-CAR与CD8T-41BB-CAR的比率。
Figure BDA0003522887730000963
这些令人惊讶的结果显示表达CAR+CD30的CD8+细胞毒性T细胞能够发展和维持的中央记忆和效应记忆T细胞的数量和百分比高于表达CAR+CD28或CAR+41BB CD8+T细胞。这些结果表明，CAR+CD30 T细胞平台是用于治疗癌症患者(包括患有B细胞恶性肿瘤的患者)的极佳T细胞疗法平台。
示例性实施方案
根据本发明公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗体部分的细胞外靶结合结构域；
(b)跨膜结构域；
(c)CD30共刺激结构域；以及
(d)初级信号传导结构域。
2.根据实施方案1所述的CAR，其中所述CD30共刺激结构域包含能够与细胞内TRAF信号传导蛋白结合的序列。
3.根据实施方案2所述的CAR，其中所述能够与细胞内TRAF信号传导蛋白结合的序列对应于具有SEQ ID NO:11的序列的全长CD30的残基561-573或578-586。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的CAR，其中所述CD30共刺激结构域包含与SEQID NO:11的残基561-573或578-586至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的CAR，其中所述CD30共刺激结构域包含与SEQID NO:35的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含多于一个CD30共刺激结构域。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含至少一个共刺激结构域，所述至少一个共刺激结构域包含不同于CD30的共刺激分子的细胞内序列。
8.根据实施方案7所述的CAR，其中不同于CD30的共刺激分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分是单链抗体片段。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分是单链Fv(scFv)、单链Fab、单链Fab'、单结构域抗体片段、单结构域多特异性抗体、细胞内抗体(intrabody)、纳米抗体(nanobody)或单链免疫因子。
11.根据实施方案10所述的CAR，其中所述抗体部分是单结构域多特异性抗体。
12.根据实施方案11所述的CAR，其中所述单结构域多特异性抗体是单结构域双特异性抗体。
13.根据实施方案10至12中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分是单链Fv(scFv)。
14.根据实施方案13所述的CAR，其中所述scFv是串联scFv。
15.根据实施方案1至14中任一项所述的CAR，其中所述CAR的所述跨膜结构域衍生自TCR共受体或T细胞共刺激分子的跨膜结构域。
16.根据实施方案15所述的CAR，其中所述TCR共受体或T细胞共刺激分子选自由以下组成的组：CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
17.根据实施方案15或16所述的CAR，其中所述TCR共受体或T细胞共刺激分子是CD30或CD8。
18.根据实施方案17所述的CAR，其中所述T细胞共刺激分子是CD30。
19.根据实施方案17所述的CAR，其中所述TCR共受体是CD8。
20.根据实施方案1至14中任一项所述的CAR，其中所述CAR的所述跨膜结构域是CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。
21.根据实施方案20所述的CAR，其中所述CAR的所述跨膜结构域CAR是CD30或CD8的跨膜结构域。
22.根据实施方案21所述的CAR，其中所述CAR的所述跨膜结构域是CD30的跨膜结构域。
23.根据实施方案21所述的CAR，其中所述CAR的所述跨膜结构域是CD8的跨膜结构域。
24.根据实施方案1至23中任一项所述的CAR，其中所述CAR的所述跨膜结构域包含选自由SEQ ID NO:26-31组成的组的氨基酸序列。
25.根据实施方案1至24中任一项所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域包含衍生自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导序列的序列：CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
26.根据实施方案1至25中任一项所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域包含衍生自CD3ζ的细胞内信号传导序列的序列。
27.根据实施方案26所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域包含CD3ζ的细胞内信号传导序列。
28.根据实施方案1至27中任一项所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域包含与SEQ ID NO:37的序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
29.根据实施方案1至28中任一项所述的CAR，其还包含在所述细胞外靶结合结构域与所述跨膜结构域之间的肽接头。
30.根据实施方案1至29中任一项所述的CAR，其还包含在所述跨膜结构域与所述CD30共刺激结构域之间的肽接头。
31.根据实施方案1至30中任一项所述的CAR，其还包含在所述CD30共刺激结构域与所述初级信号传导结构域之间的肽接头。
32.根据实施方案1至31中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合疾病相关抗原。
33.根据实施方案32所述的CAR，其中所述疾病相关抗原是癌症相关抗原。
34.根据实施方案32所述的CAR，其中所述疾病相关抗原是病毒相关抗原。
35.根据实施方案1至34中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合细胞表面抗原。
36.根据实施方案35所述的CAR，其中所述细胞表面抗原选自由以下组成的组：蛋白质、碳水化合物和脂质。
37.根据实施方案35或36所述的CAR，其中所述细胞表面抗原是CD19、CD20、CD22、CD47、CD158e、GPC3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D、FcRL5、MUC16、MCT4、PSMA或它们的变体或突变体。
38.根据实施方案1至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合人CD19。
39.根据实施方案1至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合人CD22。
40.根据实施方案1至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合人CD20。
41.根据实施方案1至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合人CD19和人CD22两者。
42.根据实施方案1至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合人CD19和人CD20两者。
43.根据实施方案1至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合人CD20和人CD22两者。
44.根据实施方案1至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合人CD19、人CD20和人CD22。
45.根据实施方案38至44中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD30的跨膜结构域。
46.根据实施方案1至34中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合MHC限制性抗原。
47.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含甲胎蛋白(AFP)肽和MHC I类蛋白的复合物。
48.根据实施方案47所述的CAR，其中所述AFP肽包含SEQ ID NO:72-82中任一者的序列。
49.根据实施方案47或48所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:83-85的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:86的序列的重链可变区。
50.根据实施方案47至49中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ IDNO:87-89的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:90的序列的轻链可变区。
51.根据实施方案47或48所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:91-93的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:94的序列的重链可变区。
52.根据实施方案47、48和51中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:95-97的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:98的序列的轻链可变区。
53.根据实施方案47或48所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:99-101的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:102的序列的重链可变区。
54.根据实施方案47、48和53中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:103-105的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:106的序列的轻链可变区。
55.根据实施方案47或48所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:107-109的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:110的序列的重链可变区。
56.根据实施方案47、48和55中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:111-113的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:114的序列的轻链可变区。
57.根据实施方案47或48所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:115-117的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:118的序列的重链可变区。
58.根据实施方案47、48和57中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:119-121的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:122的序列的轻链可变区。
59.根据实施方案1至33和35至37中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)肽。
60.根据实施方案59所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:123-125的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:126的序列的重链可变区。
61.根据实施方案59或60所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:127-129的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:130的序列的轻链可变区。
62.根据实施方案59所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:131-133的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:134的序列的重链可变区。
63.根据实施方案59或62所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:135-137的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:138的序列的轻链可变区。
64.根据实施方案59所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:139-141的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:142的序列的重链可变区。
65.根据实施方案59或64所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:143-145的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:146的序列的轻链可变区。
66.根据实施方案59所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:147-149的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:150的序列的重链可变区。
67.根据实施方案59或66所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:151-153的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:154的序列的轻链可变区。
68.根据实施方案59所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:155-157的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:158的序列的重链可变区。
69.根据实施方案59或68所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:159-161的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:162的序列的轻链可变区。
70.根据实施方案59所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:163-165的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:68的序列的重链可变区。
71.根据实施方案59或70所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:166-168的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:69的序列的轻链可变区。
72.根据实施方案59所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:169-171的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:70的序列的重链可变区。
73.根据实施方案59或72所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:172-174的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:71的序列的轻链可变区。
74.根据实施方案70至73中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:12或13的序列。
75.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含KRAS肽和MHC I类蛋白的复合物。
76.根据实施方案75所述的CAR，其中所述KRAS肽包含SEQ ID NO:175-183中任一者的序列。
77.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:184-186的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:187的序列的重链可变区。
78.根据实施方案75至77中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ IDNO:188-190的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:191的序列的轻链可变区。
79.根据实施方案75至78中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:192的序列。
80.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:193-195的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:196的序列的重链可变区。
81.根据实施方案75、76和80中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:197-199的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:200的序列的轻链可变区。
82.根据实施方案75、76、80和81中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQID NO:201的序列。
83.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:202-204的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:205的序列的重链可变区。
84.根据实施方案75、76和83中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:206-208的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:209的序列的轻链可变区。
85.根据实施方案75、76、83和84中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQID NO:210的序列。
86.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:211-213的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:214的序列的重链可变区。
87.根据实施方案75、76和86中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:215-217的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:218的序列的轻链可变区。
88.根据实施方案75、76、86和87中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQID NO:219的序列。
89.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:220-222的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:223的序列的重链可变区。
90.根据实施方案75、76和89中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:224-226的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:227的序列的轻链可变区。
91.根据实施方案75、76、89和90中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQID NO:228的序列。
92.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:229-231的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:232的序列的重链可变区。
93.根据实施方案75、76和92中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:233-235的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:236的序列的轻链可变区。
94.根据实施方案75、76、92和93中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQID NO:237的序列。
95.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:238-240的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:241的序列的重链可变区。
96.根据实施方案75、76和95中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:242-244的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:245的序列的轻链可变区。
97.根据实施方案75、76、95和96中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQID NO:246的序列。
98.根据实施方案75或76所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:247-249的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:250的序列的重链可变区。
99.根据实施方案75、76和98中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:251-253的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:254的序列的轻链可变区。
100.根据实施方案75、76、98和99中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQID NO:255的序列。
101.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含NY-ESO-1肽和MHC I类蛋白的复合物。
102.根据实施方案101所述的CAR，其中所述NY-ESO-1肽包含SEQ ID NO:256-266中任一者的序列。
103.根据实施方案101或102所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:267-269的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:270的序列的重链可变区。
104.根据实施方案101至103中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:271-273的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:274的序列的轻链可变区。
105.根据实施方案101或102所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:275-277的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:278的序列的重链可变区。
106.根据实施方案101、102和105中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:279-281的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:282的序列的轻链可变区。
107.根据实施方案101或102所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:283-285的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:286的序列的重链可变区。
108.根据实施方案101、102和107中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:287-289的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:290的序列的轻链可变区。
109.根据实施方案101或102所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:291-293的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:294的序列的重链可变区。
110.根据实施方案101、102和109中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:295-297的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:298的序列的轻链可变区。
111.根据实施方案101或102所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:299-301的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:302的序列的重链可变区。
112.根据实施方案101、102和111中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:303-305的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:306的序列的轻链可变区。
113.根据实施方案101或102所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:307-309的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:310的序列的重链可变区。
114.根据实施方案101、102和113中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:311-313的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:314的序列的轻链可变区。
115.根据实施方案101或102所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:315-317的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:318的序列的重链可变区。
116.根据实施方案101、102和115中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:319-321的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:322的序列的轻链可变区。
117.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含PRAME肽和MHC I类蛋白的复合物。
118.根据实施方案117所述的CAR，其中所述PRAME肽包含SEQ ID NO:323-327中任一者的序列。
119.根据实施方案117或118所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:328-330的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:331的序列的重链可变区。
120.根据实施方案117至119中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:332-334的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:335的序列的轻链可变区。
121.根据实施方案117或118所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:336-338的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:339的序列的重链可变区。
122.根据实施方案117、118和121中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:340-342的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:343的序列的轻链可变区。
123.根据实施方案117或118所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:344-346的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:347的序列的重链可变区。
124.根据实施方案117、118和123中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:348-350的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:351的序列的轻链可变区。
125.根据实施方案117或118所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:352-354的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:355的序列的重链可变区。
126.根据实施方案117、118和125中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:356-358的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:359的序列的轻链可变区。
127.根据实施方案117或118所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:360-362的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:363的序列的重链可变区。
128.根据实施方案117、118和127中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:364-366的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:367的序列的轻链可变区。
129.根据实施方案117或118所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:368-370的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:371的序列的重链可变区。
130.根据实施方案117、118和129中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:372-374的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:375的序列的轻链可变区。
131.根据实施方案117或118所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:376-378的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:379的序列的重链可变区。
132.根据实施方案117、118和131中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:380-382的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:383的序列的轻链可变区。
133.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含组蛋白H3.3肽和MHC I类蛋白的复合物。
134.根据实施方案133所述的CAR，其中所述组蛋白H3.3肽包含SEQ ID NO:384-403中任一者的序列。
135.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:404-406的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:407的序列的重链可变区。
136.根据实施方案133至135中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:408-410的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:411的序列的轻链可变区。
137.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:412-414的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:415的序列的重链可变区。
138.根据实施方案133、134和137中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:416-418的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:419的序列的轻链可变区。
139.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:420-422的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:423的序列的重链可变区。
140.根据实施方案133、134和139中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:424-426的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:427的序列的轻链可变区。
141.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:428-430的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:431的序列的重链可变区。
142.根据实施方案133、134和141中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:432-434的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:435的序列的轻链可变区。
143.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:436-438的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:439的序列的重链可变区。
144.根据实施方案133、134和143中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:440-442的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:443的序列的轻链可变区。
145.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:444-446的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:447的序列的重链可变区。
146.根据实施方案133、134和145中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:448-450的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:451的序列的轻链可变区。
147.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:452-454的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:455的序列的重链可变区。
148.根据实施方案133、134和147中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:456-458的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:459的序列的轻链可变区。
149.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:460-462的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:463的序列的重链可变区。
150.根据实施方案133、134和149中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:464-466的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:467的序列的轻链可变区。
151.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:468-470的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:471的序列的重链可变区。
152.根据实施方案133、134和151中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:472-474的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:475的序列的轻链可变区。
153.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:476-478的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:479的序列的重链可变区。
154.根据实施方案133、134和153中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:480-482的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:483的序列的轻链可变区。
155.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:484-486的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:487的序列的重链可变区。
156.根据实施方案133、134和155中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:488-490的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:491的序列的轻链可变区。
157.根据实施方案133或134所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:492-494的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:495的序列的重链可变区。
158.根据实施方案133、134和157中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:496-498的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:499的序列的轻链可变区。
159.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含WT1肽和MHC I类蛋白的复合物。
160.根据实施方案159所述的CAR，其中所述WT1肽包含SEQ ID NO:500的序列。
161.根据实施方案159或160所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:501-503的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:504的序列的重链可变区。
162.根据实施方案159至161中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:505-507的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:508的序列的轻链可变区。
163.根据实施方案159至162中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ IDNO:509的序列。
164.根据实施方案159或160所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:510-512的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:513的序列的重链可变区。
165.根据实施方案159、160和164中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:514-516的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:517的序列的轻链可变区。
166.根据实施方案159、160、164和165中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:518的序列。
167.根据实施方案159或160所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:519-521的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:522的序列的重链可变区。
168.根据实施方案159、160和167中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:523-525的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:526的序列的轻链可变区。
169.根据实施方案159、160、167和168中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:527的序列。
170.根据实施方案159或160所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:528-530的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:531的序列的重链可变区。
171.根据实施方案159、160和170中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:532-534的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:535的序列的轻链可变区。
172.根据实施方案159、160、170和171中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:536的序列。
173.根据实施方案159或160所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:537-539的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:540的序列的重链可变区。
174.根据实施方案159、160和173中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:541-543的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:544的序列的轻链可变区。
175.根据实施方案159、160、173和174中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:545的序列。
176.根据实施方案159或160所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:546-548的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:549的序列的重链可变区。
177.根据实施方案159、160和176中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:550-552的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:553的序列的轻链可变区。
178.根据实施方案159、160、176和177中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:554的序列。
179.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含PSA肽和MHC I类蛋白的复合物。
180.根据实施方案179所述的CAR，其中所述PSA肽包含SEQ ID NO:555-565中任一者的序列。
181.根据实施方案179或180所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:566-580中任一者的HCDR1序列、SEQ ID NO:581-594中任一者的HCDR2序列、和SEQ ID NO:595-612中任一者的HCDR3序列，以及任选地具有SEQ ID NO:613-630中任一者的序列的重链可变区。
182.根据实施方案179至181所述的CAR，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:631-647中任一者的LCDR1序列、SEQ ID NO:648-660中任一者的LCDR2序列、和SEQ ID NO:661-678中任一者的LCDR3序列，以及任选地具有SEQ ID NO:679-696中任一者的序列的轻链可变区。
183.根据实施方案46所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合包含ROR1肽和MHC I类蛋白的复合物。
184.根据实施方案183所述的CAR，其中所述ROR1肽包含SEQ ID NO:697-700中任一者的序列。
185.根据实施方案183或184所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:701-703的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:704的序列的重链可变区。
186.根据实施方案183至185中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQID NO:705-707的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:708的序列的轻链可变区。
187.根据实施方案183或184所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:709-711的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:712的序列的重链可变区。
188.根据实施方案183、184和187中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分包含分别SEQ ID NO:713-715的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列，以及任选地具有SEQ ID NO:716的序列的轻链可变区。
189.一种核酸分子，其全部或部分编码根据实施方案1至188中任一项所述的CAR。
190.一种载体，其包含根据实施方案189所述的核酸分子。
191.一种CD30-CAR效应细胞，其：(a)表达根据实施方案1至188中任一项所述的CAR，或(b)包含根据实施方案189所述的核酸分子或根据实施方案190所述的载体。
192.根据实施方案191所述的CD30-CAR效应细胞，其中所述效应细胞是T细胞。
193.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至188中任一项所述的CAR、根据实施方案189所述的核酸分子、根据实施方案190所述的载体或根据实施方案191或192所述的CD30-CAR效应细胞、以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
194.一种杀伤靶细胞的方法，包括：
使一个或多个靶细胞与一个或多个根据实施方案191或192所述的CD30-CAR效应细胞在足以使得所述CD30-CAR效应细胞介导对所述靶细胞的杀伤的条件和持续时间下接触，
其中所述靶细胞表达对所述CD30-CAR效应细胞具有特异性的抗原，并且
其中所述CD30-CAR效应细胞在接触所述靶细胞时表达低细胞耗竭水平。
195.根据实施方案194所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞表达低水平的耗竭标志物，所述耗竭标志物选自由以下组成的组：PD-1、TIM-3和LAG-3。
196.根据实施方案194或195所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞是T细胞。
197.根据实施方案194至196中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞表达低水平的PD-1。
198.根据实施方案194至197中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞表达低水平的TIM-3。
199.根据实施方案194至198中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞表达低水平的LAG-3。
200.根据实施方案194至199中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞与表达包含CD28共刺激结构域的CAR的对应效应细胞相比表达更低水平的PD-1、TIM-3或LAG-3。
201.根据实施方案194至200中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞与对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的PD-1，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞的PD-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
202.根据实施方案194至201中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的TIM-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞的TIM-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
203.根据实施方案194至202中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的LAG-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞的LAG-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
204.根据实施方案194至203中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞与表达包含4-1BB共刺激结构域的CAR的对应效应T细胞相比表达更低水平的PD-1、TIM-3或LAG-3。
205.根据实施方案194至204中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞与对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低细胞耗竭水平的PD-1，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞的PD-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
206.根据实施方案194至205中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低水平的TIM-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞的TIM-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
207.根据实施方案194至206中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低水平的LAG-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞的LAG-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
208.根据实施方案194至207中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
209.根据实施方案208所述的方法，其中所述癌细胞来自选自由以下组成的组的癌症：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。
210.根据实施方案208或209所述的方法，其中所述癌细胞是血液癌细胞。
211.根据实施方案208或209所述的方法，其中所述癌细胞是实体瘤细胞。
212.根据实施方案194至207中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是感染病毒的细胞。
213.根据实施方案212所述的方法，其中所述感染病毒的细胞来自由选自由以下组成的组的病毒引起的病毒感染：巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、人乳头瘤病毒(HPV)、传染性软疣病毒(MCV)、人T细胞白血病病毒1(HTLV-1)、HIV(人免疫缺陷病毒)和丙型肝炎病毒(HCV)。
214.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案1至188中任一项所述的CAR、根据实施方案189所述的核酸分子、根据实施方案190所述的载体、根据实施方案191或192所述的CD30-CAR效应细胞或者向所述受试者施用根据实施方案193所述的药物组合物的步骤。
215.根据实施方案214所述的方法，其中所述疾病是癌症。
216.根据实施方案215所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。
217.根据实施方案215或216所述的方法，其中所述癌症为血液学癌症。
218.根据实施方案215或216所述的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症。
219.根据实施方案214所述的方法，其中所述疾病是病毒感染。
220.一种预防和/或逆转受试者的T细胞耗竭的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案1至188中任一项所述的CAR、根据实施方案189所述的核酸分子、根据实施方案190所述的载体、根据实施方案191或192所述的CD30-CAR效应细胞或者向所述受试者施用根据实施方案193所述的包含所述核酸分子或所述载体的药物组合物。
221.根据实施方案220所述的方法，其中所述方法降低T细胞中的耗竭标志物的表达。
222.根据实施方案220或221所述的方法，其中所述耗竭标志物选自由以下组成的组：PD-1、TIM-3和LAG-3。
223.一种在受试者中产生中央记忆T细胞和/或效应记忆T细胞的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案1至188中任一项所述的CAR、根据实施方案189所述的核酸分子、根据实施方案190所述的载体、根据实施方案191或192所述的CD30-CAR效应细胞或者向所述受试者施用根据实施方案193所述的包含所述核酸分子或所述载体的药物组合物。
224.根据实施方案223所述的方法，其中所述方法：
(a)增加所述受试者中的中央记忆T细胞的数量和/或中央记忆T细胞在所有T细胞中的百分比；并且/或者
(b)增加所述受试者中的中央记忆T细胞的数量和/或中央记忆T细胞在所有T细胞中的百分比。
225.一种在体外产生中央记忆T细胞和/或效应记忆T细胞的方法，其包括：
使一个或多个靶细胞与根据实施方案191至192中任一项所述的CD30-CAR效应细胞在足以使得所述效应细胞发展成中央记忆T细胞和/或效应记忆T细胞的条件和持续时间下接触，其中所述靶细胞表达对所述效应细胞具有特异性的抗原。
226.根据实施方案225所述的方法，其中所述方法：
(a)增加中央记忆T细胞的数量和/或中央记忆T细胞在从所述效应细胞传留下来的所有T细胞中的百分比；并且/或者
(b)增加中央记忆T细胞的数量和/或中央记忆T细胞在从所述效应细胞传留下来的所有T细胞中的百分比。
227.根据实施方案225或226所述的方法，其中所述方法：
(a)产生比表达包含CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR的对应效应细胞更高数量的中央记忆T细胞和/或更高百分比的中央记忆T细胞；并且/或者
(b)产生比表达包含CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR的对应效应细胞更高数量的效应记忆T细胞和/或更高百分比的效应记忆T细胞。
228.根据实施方案227所述的方法，其中所述方法产生至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％更高数量的：
(a)相比于表达包含CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR的对应效应细胞的中央记忆T细胞和/或百分比的中央记忆T细胞；并且/或者
(b)相比于表达包含CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR的对应效应细胞的中央记忆T细胞和/或百分比的中央记忆T细胞；
229.根据实施方案225至228中任一项所述的方法，其中所述中央记忆T细胞表达高水平的CCR7和低水平的CD45RA。
230.根据实施方案225至229中任一项所述的方法，其中所述中央记忆T细胞是CD8+T细胞。
非正式序列表
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在不脱离本公开的范围的情况下，来自本文所述的任何实施方案或在附图中的一个或多个特征可以与附图中的、本文所述的任何其它实施方案的一个或多个特征组合。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入一样。尽管出于清楚理解的目的已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述公开内容，但是根据本公开的教导对本领域普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对其进行某些改变和修改。

Claims (37)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)包含抗体部分的细胞外靶结合结构域；
(b)跨膜结构域；
(c)CD30共刺激结构域；以及
(d)初级信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述CD30共刺激结构域包含能够与细胞内TRAF信号传导蛋白结合的序列。
3.根据权利要求2所述的CAR，其中所述能够与细胞内TRAF信号传导蛋白结合的序列对应于具有SEQ ID NO:11的序列的全长CD30的残基561-573或578-586。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的CAR，其中所述CD30共刺激结构域包含与SEQ IDNO:11的残基561-573或578-586至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的CAR，其中所述CD30共刺激结构域包含与SEQ IDNO:35的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含多于一个CD30共刺激结构域。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含至少一个共刺激结构域，所述至少一个共刺激结构域包含不同于CD30的共刺激分子的细胞内序列，并且任选地其中所述不同于CD30的共刺激分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分是单链抗体片段、单链Fv(scFv)、单链Fab、单链Fab'、单结构域抗体片段、单结构域多特异性抗体、细胞内抗体、纳米抗体或单链免疫因子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中：
(a)所述CAR的所述跨膜结构域衍生自TCR共受体或T细胞共刺激分子的跨膜结构域，并且任选地其中所述TCR共受体或T细胞共刺激分子选自由以下组成的组：CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154；或
(b)所述CAR的所述跨膜结构域是CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的CAR，其中所述CAR的所述跨膜结构域包含选自由SEQ ID NO:26-31组成的组的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域包含衍生自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导序列的序列：CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域包含与SEQID NO:37的序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的CAR，其还包含在所述细胞外靶结合结构域与所述跨膜结构域之间的肽接头、和/或在所述跨膜结构域与所述CD30共刺激结构域之间的肽接头、和/或在所述CD30共刺激结构域与所述初级信号传导结构域之间的肽接头。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合疾病相关抗原。
15.根据权利要求14所述的CAR，其中所述疾病相关抗原是癌症相关抗原或病毒相关抗原。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合细胞表面抗原，任选地其中所述细胞表面抗原选自由以下组成的组：蛋白质、碳水化合物和脂质，并且进一步任选地其中所述细胞表面抗原是CD19、CD20、CD22、CD47、CD158e、GPC3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D、FcRL5、MUC16、MCT4、PSMA或它们的变体或突变体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合MHC限制性抗原。
18.根据权利要求17所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合：
(a)包含甲胎蛋白(AFP)肽和MHC I类蛋白的复合物；或
(b)包含KRAS肽和MHC I类蛋白的复合物；或
(c)包含NY-ESO-1肽和MHC I类蛋白的复合物；或
(d)包含PRAME肽和MHC I类蛋白的复合物；或
(e)包含组蛋白H3.3肽和MHC I类蛋白的复合物；或
(f)包含WT1肽和MHC I类蛋白的复合物；或
(g)包含PSA肽和MHC I类蛋白的复合物；或
(h)包含ROR1肽和MHC I类蛋白的复合物。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗体部分特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)肽。
20.一种核酸分子，其全部或部分编码根据权利要求1至19中任一项所述的CAR。
21.一种载体，其包含根据权利要求20所述的核酸分子。
22.一种CD30-CAR效应细胞，其：(a)表达根据权利要求1至19中任一项所述的CAR，或(b)包含根据权利要求20所述的核酸分子或根据权利要求21所述的载体，任选地其中所述效应细胞是T细胞。
23.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的CAR、根据权利要求20所述的核酸分子、根据权利要求21所述的载体或根据权利要求22所述的CD30-CAR效应细胞、以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
24.一种杀伤靶细胞的方法，其包括：
使一个或多个靶细胞与一个或多个根据权利要求22所述的CD30-CAR效应细胞在足以使得所述CD30-CAR效应细胞介导对所述靶细胞的杀伤的条件和持续时间下接触，
其中所述靶细胞表达对所述CD30-CAR效应细胞具有特异性的抗原，并且
其中所述CD30-CAR效应细胞在接触所述靶细胞时表达低细胞耗竭水平，并且
任选地其中所述CD30-CAR效应细胞是T细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞表达低水平的耗竭标志物，所述耗竭标志物选自由以下组成的组：PD-1、TIM-3和LAG-3。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述CD30-CAR效应细胞与表达包含CD28共刺激结构域的CAR的对应效应细胞相比表达更低水平的PD-1、TIM-3或LAG-3。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中：
(a)所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的PD-1，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞的PD-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低；并且/或者
(b)所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的TIM-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞的TIM-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低；并且/或者
(c)所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞相比表达更低水平的LAG-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的CD28 CAR效应细胞的LAG-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述CD30-CAR效应T细胞与表达包含4-1BB共刺激结构域的CAR的对应效应T细胞相比表达更低水平的PD-1、TIM-3或LAG-3。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中：
(a)所述CD30-CAR效应T细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低细胞耗竭水平的PD-1，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞的PD-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低；并且/或者
(b)所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低水平的TIM-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞的TIM-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低；并且/或者
(c)所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞相比表达更低水平的LAG-3，并且其中所述CD30-CAR效应细胞与所述对应的4-1BB CAR效应细胞的LAG-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞，任选地其中所述癌细胞来自选自由以下组成的组的癌症：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌，并且/或者任选地其中所述癌细胞是血液癌细胞、实体瘤细胞或感染病毒的细胞。
31.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1至19中任一项所述的CAR、根据权利要求20所述的核酸分子、根据权利要求21所述的载体、根据权利要求22所述的CD30-CAR效应细胞或者向所述受试者施用根据权利要求23所述的药物组合物的步骤。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病是癌症，任选地其中所述癌症选自由以下组成的组：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌，并且/或者任选地其中所述癌症是血液癌或实体瘤癌症。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病是病毒感染。
34.一种预防和/或逆转受试者的T细胞耗竭的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至19中任一项所述的CAR、根据权利要求20所述的核酸分子、根据权利要求21所述的载体、根据权利要求22所述的CD30-CAR效应细胞或者向所述受试者施用包含所述核酸分子或所述载体的根据权利要求23所述的药物组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法降低T细胞中耗竭标志物的表达，任选地其中所述耗竭标志物选自由PD-1、TIM-3和LAG-3组成的组。
36.一种在受试者中产生中央记忆T细胞和/或效应记忆T细胞的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至19中任一项所述的CAR、根据权利要求20所述的核酸分子、根据权利要求21所述的载体、根据权利要求22所述的CD30-CAR效应细胞或者向所述受试者施用包含所述核酸分子或所述载体的根据权利要求23所述的药物组合物。
37.一种在体外产生中央记忆T细胞和/或效应记忆T细胞的方法，其包括：
使一个或多个靶细胞与根据权利要求22所述的CD30-CAR效应细胞在足以使得所述效应细胞发展成中央记忆T细胞的条件和持续时间下接触，其中所述靶细胞表达对所述效应细胞具有特异性的抗原。
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