JP2023546009A - Ｉｌ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを用いる免疫腫瘍学併用療法 - Google Patents

Ｉｌ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを用いる免疫腫瘍学併用療法 Download PDF

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Abstract

それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、ペムブロリズマブと組み合わせてＩＬ－２コンジュゲートを投与する工程を含む方法が本明細書に開示される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６３／０９０，０３３号、２０２１年３月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１５８，６６９号、および２０２１年４月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１７３，１１４号に対する優先権を主張し、それらのそれぞれの開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
Ｔ細胞の別々の集団が、免疫ホメオスタシスおよび免疫寛容を維持するために免疫系を調節する。例えば、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、病的自己反応性を防ぐことによって免疫系による不適切な応答を防ぎ、一方、細胞傷害性Ｔ細胞は、感染細胞および／または癌性細胞を標的とし、破壊する。一部の例では、Ｔ細胞の異なる集団の調節は、疾患または症状の治療のための選択肢を提供する。
サイトカインには、細胞シグナル伝達タンパク質のファミリー、例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、ならびに先天性および適応性免疫細胞ホメオスタシスに役割を果たしている他の増殖因子が含まれる。サイトカインは、免疫細胞、例えばマクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、および肥満細胞、内皮細胞、線維芽細胞等、ならびに異なる間質細胞によって生成される。一部の例では、サイトカインは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の間のバランスを調節する。
インターロイキンは、ＴおよびＢリンパ球、単球系の細胞、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球、ならびに造血細胞の発達および分化を調節するシグナル伝達タンパク質である。インターロイキンは、ヘルパーＣＤ４＋ＴおよびＢリンパ球、単球、マクロファージ、内皮細胞、ならびに他の組織常在細胞によって産生される。
一部の例では、インターロイキン２（ＩＬ－２）シグナル伝達は、Ｔ細胞応答を調節するため、およびその後、がんを治療するために使用される。よって、一態様では、対象におけるがんを治療する方法であって、抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブと組み合わせてＩＬ－２コンジュゲートを投与する工程を含む方法が本明細書において提供される。
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含み、ＩＬ－２コンジュゲートは、本明細書に記載される非天然アミノ酸残基を６４位に有する配列番号１のアミノ酸配列、例えば配列番号２のアミノ酸配列を含む、方法が本明細書に記載される。
例示的な実施形態は以下を含む。
実施形態１．それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含み、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（ＩＡ）の構造：
Figure 2023546009000002
 （式中、
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000003
 であり；
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000004
 であり；
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000005
 であり；または
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000006
 であり；
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
ｑは１、２、または３であり；
Ｘは構造：
Figure 2023546009000007
 を有するＬ－アミノ酸であり；
Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
により置き換えられている、方法。
実施形態２．それを必要とする対象におけるがんを治療する方法で使用するためのＩＬ－２コンジュゲートであって、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含み、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（ＩＡ）の構造：
Figure 2023546009000008
 （式中、
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000009
 であり；
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000010
 であり；
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000011
 であり；または
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000012
 であり；
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
ｑは１、２、または３であり；
Ｘは構造：
Figure 2023546009000013
 を有するＬ－アミノ酸であり；
Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
により置き換えられている、ＩＬ－２コンジュゲート。
実施形態３．それを必要とする対象におけるがんを治療する方法のための医薬品を製造するためのＩＬ－２コンジュゲートの使用であって、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含み、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（ＩＡ）の構造：
Figure 2023546009000014
 （式中、
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000015
 であり；
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000016
 であり；
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000017
 であり；または
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000018
 であり；
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
ｑは１、２、または３であり；
Ｘは構造：
Figure 2023546009000019
 を有するＬ－アミノ酸であり；
Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
により置き換えられている、使用。
実施形態４．約８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートを対象に投与する工程を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態５．約１６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートを対象に投与することを含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態６．約２４μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートを対象に投与する工程を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態７．約３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートを対象に投与することを含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態８．ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、Ｚは、ＣＨ２であり、Ｙは、
Figure 2023546009000020
 である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態９．ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、Ｙは、ＣＨ２であり、Ｚは、
Figure 2023546009000021
 である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１０．ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、Ｚは、ＣＨ２であり、Ｙは、
Figure 2023546009000022
 である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１１．ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、Ｙは、ＣＨ２であり、Ｚは、
Figure 2023546009000023
 である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１２．ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、ＰＥＧ基は、約３０ｋＤａの平均分子量を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１３．式（ＩＡ）の構造は、式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の構造を有し、または式（ＩＶＡ）および式（ＶＡ）の混合物：
Figure 2023546009000024
 （式中、
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
ｑは１、２、または３である）
である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１４．式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）の構造を有し、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物：
Figure 2023546009000025
 （式中、
ｎは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－ＯＣＨ３が約３０ｋＤａの分子量を有するような整数であり；
ｑは１、２、または３であり；
波線は、置き換えられていない配列番号１内のアミノ酸残基への共有結合を示す）
である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１５．ｑは１である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１６．ｑは２である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１７．ｑは３である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１８．対象は固形腫瘍がんを有する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態１９．対象は転移性固形腫瘍を有する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２０．対象は進行性固形腫瘍を有する、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２１．対象は液体腫瘍を有する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２２．対象は難治性がんを有する、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２３．対象は再発性がんを有する、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２４．がんは、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、古典的なホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性がん、マイクロサテライト安定性がん、胃がん、結腸がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、子宮頸がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、黒色腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、食道がん、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）、グリア芽細胞腫、中皮腫、乳がん、三種陰性乳がん、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、転移性去勢抵抗性前立腺がん、またはＤＮＡダメージ応答（ＤＤＲ）欠損を有する転移性去勢抵抗性前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、中程度から軽度の変異性の腫瘍負荷の腫瘍、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、扁平上皮細胞皮膚がん（ＳＣＳＣ）、低度ＰＤ－Ｌ１発現から非発現の腫瘍、その原発性解剖学的起源部位を超えて肝臓およびＣＮＳに全身的に幡種された腫瘍、ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）から選択される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２５．ＣＤ８＋細胞は少なくとも１．５倍増殖する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２６．ＮＫ細胞は少なくとも約５倍増殖する、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２７．好酸球は約２倍以下しか増殖しない、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２８．ＣＤ４＋細胞は約２倍以下に増殖する、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態２９．ＣＤ８＋細胞および／またはＮＫ細胞の増殖は、ＣＤ４＋細胞および／または好酸球の増殖よりも大きい、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３０．ＩＬ－２コンジュゲートは用量制限毒性を引き起こさない、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３１．は、ＩＬ－２コンジュゲートは重度サイトカイン放出症候群を引き起こさない、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３２．ＩＬ－２コンジュゲートは血管漏出症候群を引き起こさない、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３３．ＩＬ－２コンジュゲートは、約２週毎に１回、約３週毎に１回、または約４週毎に１回対象に投与される、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３４．ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、約２週毎に１回、約３週毎に１回、または約４週毎に１回対象に投与される、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３５．ＩＬ－２コンジュゲートは、薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物である、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３６．ペムブロリズマブは、約２００ｍｇの用量で３週毎に投与される、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３７．ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、別々に投与される、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３８．ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、順次に投与される、実施形態３７に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態３９．ＩＬ－２コンジュゲートは、ペムブロリズマブの前に投与される、実施形態３７または３８に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４０．ＩＬ－２コンジュゲートは、ペムブロリズマブの後に投与される、実施形態３７または３８に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４１．ＩＬ－２コンジュゲートは、皮下投与により対象に投与される、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４２．ＩＬ－２コンジュゲートは、静脈内投与により対象に投与される、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４３．ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、静脈内投与により対象に投与される、実施形態１～４０および４２のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４４．対象は基底細胞癌を有する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４５．対象は扁平上皮癌を有し、場合により、扁平上皮癌は頭頸部扁平上皮癌である、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４６．対象は結腸直腸がんを有する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４７．対象は黒色腫を有する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
実施形態４８．ＩＬ－２コンジュゲートは、約１０時間のインビボ半減期を有する、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の特徴性および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を説明する下記の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られるだろう。
８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ数の変化を示す。ここおよび他所では、「Ｃ１Ｄ１」などの指定は、治療サイクルおよび治療日を示す（例えば、治療サイクル１、１日目）。「ＰＲＥ」は、投与前のベースライン測定値を示し；２４ＨＲは、投与後２４時間を示すなどである。 ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの初回用量の投与後の末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞増殖ピークの変化を示す。データは処置前（Ｃ１Ｄ１）ＣＤ８＋Ｔ細胞数に対して正規化されている。列挙されている値は、倍率変化中央値を示す。 １６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ数の変化を示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における、Ｋｉ６７を発現する末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞数のパーセンテージを示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞数の変化を示す。 ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの初回用量の投与後の末梢ＮＫ細胞増殖ピークの変化を示す。データは処置前（Ｃ１Ｄ１）ＮＫ細胞数に対して正規化されている。列挙されている値は、倍率変化中央値を示す。 １６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞数の変化を示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象におけるＫｉ６７を発現するＮＫ細胞のパーセンテージを示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ数の変化を示す。 ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの初回用量の投与後の末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞増殖ピークの変化を示す。データは、処置前（Ｃ１Ｄ１）ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対して正規化されている。列挙されている値は、倍率変化中央値を示す。 １６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ数の変化を示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象におけるＫｉ６７を発現するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における好中球細胞数の変化を示す。 ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの初回用量の投与後の末梢好中球細胞増殖ピークの変化を示す。データは処置前（Ｃ１Ｄ１）好中球細胞数に対して正規化されている。列挙されている値は、倍率変化中央値を示す。 １６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における好酸球細胞数の変化を示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象におけるＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、およびＩＬ－６の血清レベルを示す。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後のＩＬ－５の血清レベルを示す。ＢＬＱ＝定量限界未満。データは平均としてプロットされている（範囲はＢＬＱ～最大値）。 ８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後のＩＬ－６の血清レベルを示す。ＢＬＱ＝定量限界未満。データは平均としてプロットされている（範囲はＢＬＱ～最大値）。 １６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象におけるＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、およびＩＬ－６の血清レベルを示す。 ペムブロリズマブと共に８μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ペムブロリズマブと共に８μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ペムブロリズマブと共に１６μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ペムブロリズマブと共に１６μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ２４μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞数を示す。 ２４μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＮＫ細胞数を示す。 ２４μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞数の変化を示す。 ２４μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢好酸球細胞数を示す。 ペムブロリズマブと共に２４μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ペムブロリズマブと共に２４μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ＩＬ－２コンジュゲートの投与後の指定される時間における、２４μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブで処置された示される対象におけるＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＩＬ－５のレベルを示す。 ３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞数の変化を示す。 ３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の指定される時間における、示される対象における末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞数を示す。 ペムブロリズマブと共に３２μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ペムブロリズマブと共に３２μｇ／ｋｇの用量で投与された、それぞれ１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を示す。 ＩＬ－２コンジュゲートの投与後の指定される時間における、３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブで処置された示される対象におけるＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＩＬ－５のレベルを示す。
定義
そうでないと定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、特許請求される主題が属する技術の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。上記の一般的説明および下記の詳細な説明は例示的かつ説明的であるだけであり、また特許請求されるいかなる主題も制限しないことが理解されるべきである。参照によって本明細書に組み入れられている資料のいずれかが本開示の表現内容と矛盾する場合、その限度において、該表現内容がコントロールする。本出願において、単数の使用は、具体的にそうでないと述べられない限り、複数を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈がそうでないと明らかに述べていない限り、複数の指示対照を含むことに留意しなければならない。本出願において、「または」の使用は、文脈上そうでないと解さない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定でない。
本明細書における、「一部の実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への参照は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。
本明細書で使用される場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表すことができる。また、約は、正確な量も含む。それゆえに、「約５μＬ」は、「約５μＬ」を、また「５μＬ」をも意味する。通常、用語「約」は、実験誤差の範囲内、例えば、１５％、１０％、または５％以内であると予想されることとなる量を含む。
本明細書で使用されるセクション見出しは、組織化のためだけのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、あらゆる哺乳動物を意味する。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。一部の実施形態では、哺乳動物はヒト以外である。いずれの用語も、ヘルスケアワーカー（例えば、医師、登録看護師、ナースプラクティショナー、医師のアシスタント、病棟勤務員またはホスピス職員）の（例えば定常的な、または断続的な）管理によって特徴付けられる状況を必要としないか、またそれに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「非天然アミノ酸」は、２０種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸を指す。例示的な非天然アミノ酸は、Ｙｏｕｎｇらの、「Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ２０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｅｘｉｃｏｎ」、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５（１５）：１１０３９～１１０４４頁（２０１０年）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられている。
用語「抗体」は、本明細書では、最も広い意味合いで使用され、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。「抗体断片」は、無傷の抗体が結合する抗原に結合する、該無傷の抗体の一部分を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド部分とリン酸部分を含む化合物を指す。例示的な天然ヌクレオチドとしては、限定されないが、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）、シチジンジホスフェート（ＣＤＰ）、グアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）、アデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）、シチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）、およびグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシンジホスフェート（ｄＡＤＰ）、チミジンジホスフェート（ｄＴＤＰ）、デオキシシチジンジホスフェート（ｄＣＤＰ）、デオキシグアノシンジホスフェート（ｄＧＤＰ）、デオキシアデノシンモノホスフェート（ｄＡＭＰ）、デオキシチミジンモノホスフェート（ｄＴＭＰ）、デオキシシチジンモノホスフェート（ｄＣＭＰ）、およびデオキシグアノシンモノホスフェート（ｄＧＭＰ）が挙げられる。糖部分としてデオキシリボースを含む例示的な天然デオキシリボヌクレオチドとしては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＧＭＰが挙げられる。糖部分としてリボースを含む例示的な天然リボヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、およびＧＭＰが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「塩基」または「核酸塩基」は、少なくともヌクレオシドまたはヌクレオチド（リボまたはデオキシリボバリアントを含むヌクレオシドおよびヌクレオチド）の核酸塩基部分を指し、ある場合には、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分に対するさらなる改変を含有する。ある場合には、「塩基」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチド全体を表すのにも使用される（例えば、「塩基」は、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡに、またはＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに組み込み可能である）。しかしながら、用語「塩基」は、文脈により必要とされる場合を除き、ヌクレオシドまたはヌクレオチド全体を必然的に表すものと解釈されるべきでない。塩基または核酸塩基の本明細書で提供される化学構造において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基のみが示され、明確にするために、糖部分、および場合により任意のホスフェート残基が省略される。塩基または核酸塩基の本明細書で提供される化学構造において使用される場合、波線は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分がさらに改変される可能性のあるヌクレオシドまたはヌクレオチドの結び付きを表す。一部の実施形態では、波線は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分、例えばペントース等に対する塩基または核酸塩基の連結を表す。一部の実施形態では、ペントースはリボースまたはデオキシリボースである。
一部の実施形態では、核酸塩基は、一般的にヌクレオシドの複素環式塩基部分である。核酸塩基は、天然に存在し得るが、改変される場合もあり、天然塩基との類似性を一切担持しない場合もあり、および／または例えば有機合成により合成される場合もある。特定の実施形態では、核酸塩基は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドにおいて任意の原子または原子の群を含み、原子または原子の群は、別の核酸の塩基と水素結合を使用して、または使用しないで相互作用することができる。特定の実施形態では、非天然核酸塩基は、天然の核酸塩基に由来しない。非天然の核酸塩基は塩基性特性を必ずしも有さないが、しかしながらそれらは簡略化して核酸塩基と呼ばれることに留意すべきである。一部の実施形態では、核酸塩基と呼ぶとき、「（ｄ）」は、核酸塩基はデオキシリボースまたはリボースに連結し得ることを表す一方、括弧の付かない「ｄ」は、核酸塩基はデオキシリボースに連結していることを表す。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基部分と糖部分を含む化合物である。ヌクレオシドとしては、天然に存在するヌクレオシド（ＤＮＡおよびＲＮＡに見出されるような）、無塩基ヌクレオシド、改変型ヌクレオシド、および模倣的塩基および／または糖類を有するヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオシドには、任意の多様な置換基を含むヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドは、核酸塩基と糖の還元基の間のグリコシド結合を通じて形成されるグリコシド化合物であり得る。
化学構造の「類似体」は、該用語が本明細書で使用される場合、親構造から合成により容易に誘導されない場合もあるが、親構造と実質的な類似性を維持する化学構造を指す。一部の実施形態では、ヌクレオチド類似体は、非天然ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ヌクレオシド類似体は、非天然ヌクレオシドである。親化学構造から合成により容易に誘導される、関連する化学構造は、「誘導体」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「用量制限毒性」（ＤＬＴ）は、外的原因のみに明確または明白に関連せず、ＤＬＴについて実施例２に示される基準を満たす、１日目～２９日目（包括的）±１日の処置サイクル内で起こる有害事象として定義される。
本明細書で使用される場合、「重度サイトカイン放出症候群」は、Ｔｅａｃｈｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６年；６巻（６号）；６６４～７９頁に記載のレベル４または５のサイトカイン放出症候群を指す。この文献の開示は参照によって本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用される場合、「ペムブロリズマブ」は、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．により「Ｋｅｙｔｒｕｄａ」という商品名で市販されているヒト化抗ＰＤ－１抗体を指す。
本発明の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈において記載される場合もあるが、該特徴は、個別にまたは任意の適する組合せで提供される場合もある。反対に、本発明は、明確にするため、分離したいくつかの実施形態の文脈において本明細書に記載される場合もあるが、本発明は単一の実施形態においても実施可能である。
ＩＬ－２コンジュゲート
インターロイキン２（ＩＬ－２）は、多面的なタイプ－１サイトカインであり、その構造は、１５．５ｋＤａの４個のα－ヘリックスバンドルを含む。ＩＬ－２の前駆体は、長さが１５３個のアミノ酸残基であり、最初の２０個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成し、残りの２１～１５３個が成熟形態を形成する。ＩＬ－２は、抗原刺激後に主にＣＤ４＋Ｔ細胞によって、ならびにより少ない程度ではあるが、ＣＤ８＋細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、活性化樹状細胞（ＤＣ）、および肥満細胞によって生成される。ＩＬ－２シグナル伝達は、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）サブユニット、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５としても知られる）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２としても知られる）、およびＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２としても知られる）の特定の組合せとの相互作用を介して起こる。ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互作用は、約１０－８ＭのＫｄで「低い親和性」ＩＬ－２受容体複合体を形成する。ＩＬ－２とＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγの相互作用は、約１０－９ＭのＫｄで「中親和性」ＩＬ－２受容体複合体を形成する。ＩＬ－２とすべての３つのサブユニット、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、およびＩＬ－２Ｒγの相互作用は、約＞１０－１１ＭのＫｄで「高親和性」ＩＬ－２受容体複合体を形成する。
一部の例では、「高親和性」ＩＬ－２Ｒαβγ複合体を介するＩＬ－２シグナル伝達は、制御性Ｔ細胞の活性化および増殖を調節する。制御性Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、エフェクター細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞等を抑制によって免疫ホメオスタシスの維持を媒介する。一部の例では、Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺（ｔＴｒｅｇ細胞）から生じる、または末梢（ｐＴｒｅｇ細胞）中のナイーブＴ細胞から誘導される。場合によっては、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢性の寛容のメディエーターとみなされる。実際、１つの研究では、ＣＤ２５－枯渇化末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の移植は、ヌードマウスにおいて種々の自己免疫疾患が生じ、一方、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の同時移植は、自己免疫の発生を抑制した（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、ｅｔ ａｌ．、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＩＬ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎｓ（ＣＤ２５）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１５１～１１６４（１９９５）、その開示は参照により本明細書に組み入れられている）。Ｔｒｅｇ細胞集団の増大は、エフェクターＴ細胞増殖を下方調節し、自己免疫およびＴ細胞抗腫瘍応答を抑制する。
「中親和性」ＩＬ－２Ｒβγ複合体を介するＩＬ－２シグナル伝達は、ＣＤ８＋エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞の活性化および増殖を調節する。ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｃ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、Ｔｃｏｎ、またはキラーＴ細胞としても知られる）は、損傷を受けた細胞、癌性細胞、および病原体感染細胞を認識し死滅させるＴリンパ球である。ＮＫおよびＮＫＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞と類似して、癌性細胞および病原体感染細胞を標的とするリンパ球のいくつかの種類である。
一部の例では、ＩＬ－２シグナル伝達は、Ｔ細胞応答を調節し、続いてがんの治療に利用される。例えば、ＩＬ－２は、がんの治療のためのＴｅｆｆ細胞集団の拡大を誘導するために高用量で投与される。しかしながら、高用量ＩＬ－２は、抗腫瘍免疫応答を鈍らせるＴｒｅｇ細胞の随伴する刺激をさらにもたらす。高用量ＩＬ－２はまた、タイプ２先天性免疫細胞（ＩＬＣ－２）、好酸球、および内皮細胞を含む、脈管構造中のＩＬ－２Ｒアルファ鎖発現細胞の関与によって媒介される毒性有害事象を誘導する。これにより、好酸球増加症、毛細管漏出および脈管漏出症候群（ＶＬＳ）を引き起こす。
養子細胞療法は、医師が、疾患、例えば、増殖性疾患（例えば、がん）ならびに感染性疾患と闘う患者自身の免疫細胞を効果的に利用することを可能にする。ＩＬ－２シグナル伝達の効果は、併用療法における追加の薬剤または方法の存在によってさらに増強される。例えば、ＰＤ－１またはＣＤ２７９としても知られているプログラム細胞死タンパク質１は、ヒト身体の細胞に対する免疫系の応答を調節する役割を果たす、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現される細胞表面受容体である。ＰＤ－１は免疫系を下方制御し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することにより自己寛容性を促進する。これは、自己免疫疾患を予防するが、免疫系によるがん細胞の死滅を妨げる可能性もある。ＰＤ－１は、２つの機序により自己免疫を警戒する。第１に、ＰＤ－１は、リンパ節において抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進する。第２に、ＰＤ－１は、制御性Ｔ細胞（抗炎症性抑制性Ｔ細胞）のアポトーシスを低減させる。ペムブロリズマブは、ＰＤ－１を遮断し、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃することができるヒト化抗ＰＤ－１抗体であり、特定のがんの治療薬として承認されている。
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む方法が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２配列は、配列番号１：
ＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１）
の配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（ＩＡ）の構造：
Figure 2023546009000026
 （式中：
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000027
 であり；
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000028
 であり；
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000029
 であり；または
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000030
 であり；
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
ｑは１、２、または３であり；
Ｘは構造：
Figure 2023546009000031
 を有するＬ－アミノ酸であり；
Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
により置き換えられている。
本明細書に記載される式（ＩＡ）の実施形態またはバリエーションのいずれかでは、ＩＬ－２コンジュゲートは、薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物である。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、溶媒和物である。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、水和物である。
式（ＩＡ）の一部の実施形態では、ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000032
 である。
式（ＩＡ）の一部の実施形態では、ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000033
 である。式（ＩＡ）の一部の実施形態では、ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000034
 である。式（ＩＡ）の一部の実施形態では、ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000035
 である。
式（ＩＡ）の一部の実施形態では、ｑは１である。式（ＩＡ）の一部の実施形態では、ｑは２である。式（ＩＡ）の一部の実施形態では、ｑは３である。
式（ＩＡ）の一部の実施形態では、Ｗは、約２５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基である。式（ＩＡ）の一部の実施形態では、Ｗは、約３０ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基である。式（ＩＡ）の一部の実施形態では、Ｗは、約３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基である
一部の実施形態では、ＩＬ－２配列は、配列番号１：
ＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１）
の配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（Ｉ）の構造：
Figure 2023546009000036
 （式中：
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000037
 であり；
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000038
 であり；
ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000039
 であり；または
ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000040
 であり；
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
Ｘは構造：
Figure 2023546009000041
 を有するＬ－アミノ酸であり；
Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
により置き換えられている。
本明細書に記載される式（Ｉ）の実施形態またはバリエーションのいずれかでは、ＩＬ－２コンジュゲートは、薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物である。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、溶媒和物である。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、水和物である。
式（Ｉ）の一部の実施形態では、ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000042
 である。式（Ｉ）の一部の実施形態では、ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000043
 である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ＺはＣＨ２であり、Ｙは
Figure 2023546009000044
 である。式（Ｉ）の一部の実施形態では、ＹはＣＨ２であり、Ｚは
Figure 2023546009000045
 である。
式（Ｉ）の一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、約３０ｋＤａの平均分子量を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２配列は、配列番号２：
ＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫ［ＡｚＫ＿Ｌ１＿ＰＥＧ３０ｋＤ］ＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２）
の配列を含み、式中、［ＡｚＫ＿Ｌ１＿ＰＥＧ３０ｋＤ］は、ＤＢＣＯ媒介性クリックケミストリーによりＰＥＧに安定的にコンジュゲートして、式（ＩＶＡ）または式（ＶＡ）の構造を含む化合物を形成するＮ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジンであり、ｑは１であり（式（ＩＶ）または式（Ｖ）等）、ＰＥＧ基は、メトキシ基でキャップされた約２５～３５キロダルトン（例えば、約３０ｋＤａ）の平均分子量を有する。「ＤＢＣＯ」という用語は、実施例１のスキーム１および２に図示されるｍＰＥＧ－ＤＢＣＯ化合物を含む等、ジベンゾシクロオクチン基を含む化学部分を意味する。
クリック反応から生成される位置異性体の比は、約１：１または１：１超である。
ＰＥＧは、典型的には、多数の（ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマー（またはＰＥＧがどのように定義されるかに応じて（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）モノマー）を含むことになる。一部の実施形態では、（ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマー（または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）モノマー）の数は、ＰＥＧ基の平均分子量が約３０ｋＤａとなるような数である。
一部の例では、ＰＥＧは、末端キャップポリマー、すなわち、比較的不活性な基、例えば、低級Ｃ１－６アルコキシ基、またはヒドロキシル基でキャップされた少なくとも１つの末端を有するポリマーである。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、メトキシ－ＰＥＧ（一般的には、ｍＰＥＧと称される）であり、これは、ポリマーの一方の末端がメトキシ（－ＯＣＨ３）基であるＰＥＧの直鎖状形態であり、他方の末端は、ヒドロキシル、または場合により化学的に修飾される他の官能基である。
一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、直鎖状または分枝状ＰＥＧ基である。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は直鎖状ＰＥＧ基である。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は分枝状ＰＥＧ基である。一部の実施形態では、ＰＥＧ基はメトキシＰＥＧ基である。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は直鎖状または分枝状メトキシＰＥＧ基である。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は直鎖状メトキシＰＥＧ基である。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は分枝状メトキシＰＥＧ基である。例えば、３０，０００Ｄａ±３，０００Ｄａ、または３０，０００Ｄａ±４，５００Ｄａ、または３０，０００Ｄａ±５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧ基を含むＩＬ－２コンジュゲートは、本開示の範囲内に含まれる。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、アミノ酸残基Ｐ６４は、式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）、または式（ＩＶＡ）および式（ＶＡ）の混合物の構造：
Figure 2023546009000046
 （式中：
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
ｑは１、２、または３であり；
Ｘは構造：
Figure 2023546009000047
 を有し；
Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
により置き換えられている。
式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）、または式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の混合物の一部の実施形態では、ｑは１である。式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）、または式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の混合物の一部の実施形態では、ｑは２である。式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）、または式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の混合物の一部の実施形態では、ｑは３である。
式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）、または式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の混合物の一部の実施形態では、Ｗは、約２５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基である。式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）、または式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の混合物の一部の実施形態では、Ｗは、約３０ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基である。式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）、または式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の混合物の一部の実施形態では、Ｗは、約３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基である。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、式（ＩＡ）の構造は、式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の構造を有し、または式（ＩＶＡ）および式（ＶＡ）の混合物である。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＩＶＡ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＶＡ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＩＶＡ）および式（ＶＡ）の混合物である。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、アミノ酸残基Ｐ６４は、式（ＩＶ）もしくは式（Ｖ）、または式（ＩＶ）および式（Ｖ）の混合物の構造：
Figure 2023546009000048
 （式中：
Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
Ｘは構造：
Figure 2023546009000049
 を有し、Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
により置き換えられている。
式（ＩＶ）もしくは式（Ｖ）または式（ＩＶ）および式（Ｖ）の混合物の一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、約３０ｋＤａの平均分子量を有する。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、式（ＩＡ）の構造は、式（ＩＶ）もしくは式（Ｖ）の構造を有し、または式（ＩＶ）および式（Ｖ）の混合物である。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＩＶ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（Ｖ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＩＶ）および式（Ｖ）の混合物である。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、アミノ酸残基Ｐ６４は、式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物の構造：
Figure 2023546009000050
 （式中：
ｎは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－ＯＣＨ３が約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの分子量を有するような整数であり；
ｑは１、２、または３であり；
波線は、置き換えられていない配列番号１内のアミノ酸残基への共有結合を示す）
により置き換えられている。
式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物の一部の実施形態では、ｑは１である。式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物の一部の実施形態では、ｑは２である。式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物の一部の実施形態では、ｑは３である
式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－ＯＣＨ３が約３０ｋＤａの分子量を有するような整数である。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）の構造を有し、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物である。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩＡ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩＩＡ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物である。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、アミノ酸残基Ｐ６４は、式（ＸＩＩ）もしくは式（ＸＩＩＩ）、または式（ＸＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）の混合物の構造：
Figure 2023546009000051
 （式中、
ｎは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－ＯＣＨ３が約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの分子量を有するような整数であり；
波線は、置き換えられていない配列番号１内のアミノ酸残基への共有結合を示す）
により置き換えられている。
式（ＸＩＩ）もしくは式（ＸＩＩＩ）、または式（ＸＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－ＯＣＨ３が約３０ｋＤａの分子量を有するような整数である。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩ）もしくは式（ＸＩＩＩ）の構造を有し、または式（ＸＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）の混合物である。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩＩ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）の混合物である。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、アミノ酸残基Ｐ６４は、式（ＸＩＶ）もしくは式（ＸＶ）、または式（ＸＩＶ）および式（ＸＶ）の混合物の構造：
Figure 2023546009000052
 （式中、
ｍは、０～２０の整数であり；
ｐは、０～２０の整数であり；
ｎは、ＰＥＧ基が約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するような整数であり；
波線は、置き換えられていない配列番号１内のアミノ酸残基への共有結合を示す）
により置き換えられている。
式（ＸＩＶ）もしくは式（ＸＶ）または式（ＸＩＶ）および式（ＸＶ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、ＰＥＧ基が約３０ｋＤａの平均分子量を有するような整数である。式（ＸＩＶ）もしくは（ＸＶ）または（ＸＩＶ）および（ＸＶ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、ＰＥＧ基が約２５ｋＤａの平均分子量を有するような整数である。式（ＸＩＶ）もしくは（ＸＶ）または（ＸＩＶ）および（ＸＶ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、ＰＥＧ基が約３５ｋＤａの平均分子量を有するような整数である。
一部の実施形態では、ｍは０～１５の整数である。一部の実施形態では、ｍは０～１０の整数である。一部の実施形態では、ｍは０～５の整数である。一部の実施形態では、ｍは１～３の整数である。一部の実施形態では、ｍは１である。一部の実施形態では、ｍは２である。一部の実施形態では、ｍは３である。一部の実施形態では、ｍは４である。一部の実施形態では、ｍは５である。一部の実施形態では、ｍは６である。一部の実施形態では、ｍは７である。一部の実施形態では、ｍは８である。一部の実施形態では、ｍは９である。一部の実施形態では、ｍは１０である。
一部の実施形態では、ｐは０～１５の整数である。一部の実施形態では、ｐは０～１０の整数である。一部の実施形態では、ｐは０～５の整数である。一部の実施形態では、ｐは１～３の整数である。一部の実施形態では、ｐは１である。一部の実施形態では、ｐは２である。一部の実施形態では、ｐは３である。一部の実施形態では、ｐは４である。一部の実施形態では、ｐは５である。一部の実施形態では、ｐは６である。一部の実施形態では、ｐは７である。一部の実施形態では、ｐは８である。一部の実施形態では、ｐは９である。一部の実施形態では、ｐは１０である。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＶ）もしくは式（ＸＶ）の構造を有し、または式（ＸＩＶ）および式（ＸＶ）の混合物である。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＶ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＶ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＶ）および式（ＸＶ）の混合物である。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、アミノ酸残基Ｐ６４は、式（ＸＶＩ）もしくは式（ＸＶＩＩ）または式（ＸＶＩ）および式（ＸＶＩＩ）の混合物の構造：
Figure 2023546009000053
 （式中、
ｍは、０～２０の整数であり；
ｎは、ＰＥＧ基が約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するような整数であり；
波線は、置き換えられていない配列番号１内のアミノ酸残基への共有結合を示す）
により置き換えられている。
式（ＸＶＩ）もしくは式（ＸＶＩＩ）または式（ＸＶＩ）および式（ＸＶＩＩ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、ＰＥＧ基が約３０ｋＤａの平均分子量を有するような整数である。式（ＸＶＩ）もしくは式（ＸＶＩＩ）、または式（ＸＶＩ）および式（ＸＶＩＩ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、ＰＥＧ基が約２５ｋＤａの平均分子量を有するような整数である。式（ＸＶＩ）もしくは式（ＸＶＩＩ）、または式（ＸＶＩ）および式（ＸＶＩＩ）の混合物の一部の実施形態では、ｎは、ＰＥＧ基が約３５ｋＤａの平均分子量を有するような整数である。
一部の実施形態では、ｍは０～１５の整数である。一部の実施形態では、ｍは０～１０の整数である。一部の実施形態では、ｍは０～５の整数である。一部の実施形態では、ｍは１～３の整数である。一部の実施形態では、ｍは１である。一部の実施形態では、ｍは２である。一部の実施形態では、ｍは３である。一部の実施形態では、ｍは４である。一部の実施形態では、ｍは５である。一部の実施形態では、ｍは６である。一部の実施形態では、ｍは７である。一部の実施形態では、ｍは８である。一部の実施形態では、ｍは９である。一部の実施形態では、ｍは１０である。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＶＩ）もしくは式（ＸＶＩＩ）の構造を有し、または式（ＸＶＩ）および式（ＸＶＩＩ）の混合物である。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＶＩ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＶＩＩ）の構造を有する。一部の実施形態では、式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＶＩ）および式（ＸＶＩＩ）の混合物である。
式（ＩＡ）またはその任意のバリエーションの一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、約１０時間のインビボ半減期を有する。
コンジュゲーション化学
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートは、１，３－双極性環状付加反応を含むコンジュゲーション反応により調製することができる。一部の実施形態では、１，３－双極性環状付加反応は、アジドとアルキンとの反応（「クリック」反応）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲーション反応は、スキームＩに概説される反応を含み、ここで、Ｘは、配列番号１のＰ６４位の非天然アミノ酸である。
Figure 2023546009000054
一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、本明細書に記載されるＰＥＧ基を含む。一部の実施形態では、反応基は、アルキンまたはアジドを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲーション反応は、スキームＩＩで概説される反応を含み、ここで、Ｘは、配列番号１のＰ６４位の非天然アミノ酸である。
Figure 2023546009000055
一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲーション反応は、スキームＩＩＩで概説される反応を含み、ここで、Ｘは、配列番号１のＰ６４位の非天然アミノ酸である。
Figure 2023546009000056
一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲーション反応は、スキームＩＶに概説される反応を含み、ここで、Ｘは、配列番号１のＰ６４位の非天然アミノ酸である。
Figure 2023546009000057
一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲーション反応は、アジド部分、例えば、Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）に由来するアミノ酸残基を含有するタンパク質中に含有されるものと、歪んだシクロアルキン、例えば、ジベンゾシクロオクチン基を含む化学的部分であるＤＢＣＯに由来するものとの間の付加環化反応を含む。ＤＢＣＯ部分を含むＰＥＧ基は、市販されているか、または当業者に公知の方法により調製することができる。例示的な反応をスキームＶおよびＶＩに示す。
Figure 2023546009000058
Figure 2023546009000059
コンジュゲーション反応、例えば、本明細書に記載されるクリック反応は、単一の位置異性体または位置異性体の混合物を生成し得る。一部の例では、位置異性体の比は、約１：１である。一部の例では、位置異性体の比は、約２：１である。一部の例では、位置異性体の比は、約１．５：１である。一部の例では、位置異性体の比は、約１．２：１である。一部の例では、位置異性体の比は、約１．１：１である。一部の例では、位置異性体の比は、１：１超である。
ＩＬ－２ポリペプチドの産生
一部の例では、本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートは、天然のアミノ酸突然変異または非天然のアミノ酸突然変異を含有し、組換えにより生成されるか、または化学的に合成される。一部の例では、本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートは、例えば、宿主細胞系によって、または無細胞系において、組換えにより生成される。
一部の例では、ＩＬ－２コンジュゲートは、宿主細胞系を介して、組換えにより生成される。場合によっては、宿主細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または植物細胞）または原核細胞（例えば、グラム陽性菌またはグラム陰性菌）である。場合によっては、真核宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。場合によっては、哺乳動物宿主細胞は、安定した細胞株、またはそれ自体のゲノム中に、目的の遺伝的材料を組み込んでおり、細胞分裂の多くの世代の後に、遺伝的材料の産物を発現する能力を有する細胞株である。その他の場合には、哺乳動物宿主細胞は、一過性の細胞株、またはそれ自体のゲノム中に，目的の遺伝的材料を組み込んでおらず、細胞分裂の多くの世代の後に、遺伝的材料の産物を発現する能力を有していない細胞株である。
例示的な哺乳動物宿主細胞として、２９３Ｔ細胞株、２９３Ａ細胞株、２９３ＦＴ細胞株、２９３Ｆ細胞、２９３Ｈ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）Ｔ－ＲＥｘ（商標）２９３細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－２９３細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－３Ｔ３細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＢＨＫ細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＣＨＯ細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＣＶ－１細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３ＭＳＲ細胞株、ＧＳ－ＣＨＯ細胞株、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞、Ｔ－ＲＥｘ（商標）Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｔ－ＲＥｘ（商標）－２９３細胞株、Ｔ－ＲＥｘ（商標）－ＣＨＯ細胞株、およびＴ－ＲＥｘ（商標）－ＨｅＬａ細胞株が挙げられる。
一部の実施形態では、真核宿主細胞は、昆虫宿主細胞である。例示的な昆虫宿主細胞として、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）属Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞、およびｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、真核宿主細胞は、酵母宿主細胞である。例示的な酵母宿主細胞として、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）酵母株、例えば、ＧＳ１１５、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８ＨおよびＸ－３３、ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母株、例えばＩＮＶＳｃ１が挙げられる。
一部の実施形態では、真核宿主細胞は、植物宿主細胞である。一部の例では、植物細胞は、藻類由来の細胞を含む。例示的な植物細胞株として、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）１３７ｃまたはシアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＰＰＣ ７９４２由来の株が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、原核宿主細胞である。例示的な原核宿主細胞として、ＢＬ２１、Ｍａｃｈ１（商標）、ＤＨ１０Ｂ（商標）、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）、ＯｍｎｉＭａｘ（商標）、ＭｅｇａＸ（商標）、ＤＨ１２Ｓ（商標）、ＩＮＶ１１０、ＴＯＰ１０Ｆ’、ＩＮＶαＦ、ＴＯＰ１０／Ｐ３、ｃｃｄＢ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＩＲ１、ＰＩＲ２、Ｓｔｂｌ２（商標）、Ｓｔｂｌ３（商標）またはＳｔｂｌ４（商標）が挙げられる。
一部の例では、本明細書に記載されるＩＬ－２ポリペプチドの産生に適したポリ核酸分子またはベクターとして、真核生物または原核生物の源に由来する適切なあらゆるベクターが挙げられる。例示的なポリ核酸分子またはベクターとして、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、昆虫、酵母（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ））、藻類、または哺乳動物の源由来のベクターが挙げられる。細菌ベクターの例として、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ７５、ｐＢＡＤベクターシリーズ、ｐＢＡＤＭベクターシリーズ、ｐＥＴベクターシリーズ、ｐＥＴＭベクターシリーズ、ｐＧＥＸベクターシリーズ、ｐＨＡＴ、ｐＨＡＴ２、ｐＭａｌ－ｃ２、ｐＭａｌ－ｐ２、ｐＱＥベクターシリーズ、ｐＲＳＥＴ Ａ、ｐＲＳＥＴ Ｂ、ｐＲＳＥＴ Ｃ、ｐＴｒｃＨｉｓ２シリーズ、ｐＺＡ３１－Ｌｕｃ、ｐＺＥ２１－ＭＣＳ－１、ｐＦＬＡＧ ＡＴＳ、ｐＦＬＡＧ ＣＴＳ、ｐＦＬＡＧ ＭＡＣ、ｐＦＬＡＧ Ｓｈｉｆｔ－１２ｃ、ｐＴＡＣ－ＭＡＴ－１、ｐＦＬＡＧ ＣＴＣまたはｐＴＡＣ－ＭＡＴ－２が挙げられる。
昆虫ベクターの例として、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃ ＤＵＡＬ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＥＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ Ｍ３０ａ、ｐＦａｓｔＢａｃｔ Ｍ３０ｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ、Ｍ３０ｃ、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１０、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１１、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１２、ＦＬＡＧベクター、例えばｐＰｏｌｈ－ＦＬＡＧ１もしくはｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ ２またはＭＡＴベクター、例えばｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ１もしくはｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ２が挙げられる。
酵母ベクターの例として、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（登録商標）１５ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１７ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＹＥＳ－ＤＥＳＴ５２ベクター、ｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクター、ｐＡＯ８１５ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属ベクター、ｐＦＬＤ１ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ））ベクター、ｐＧＡＰＺＡ，Ｂ，＆Ｃピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ））ベクター、ｐＰＩＣ３．５Ｋピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属ベクター、ｐＰＩＣ６ Ａ，Ｂ，＆Ｃピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属ベクター、ｐＰＩＣ９Ｋピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属ベクター、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＮＴ Ａ，Ｂ，＆Ｃ酵母ベクターまたはｐＹＥＳ３／ＣＴ酵母ベクターが挙げられる。
藻類ベクターの例として、ｐＣｈｌａｍｙ－４ベクターまたはＭＣＳベクターが挙げられる。
哺乳動物ベクターの例として、一過性の発現ベクターまたは安定した発現ベクターが挙げられる。例示的な哺乳動物の一過性の発現ベクターとして、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ ８、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ １９、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２３、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ２、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ６ａ，ｂ，ｃ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ５．１、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ５ａ、ｂ、ｃ、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ ７．１、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ２０、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２４、ｐＣＭＶ－ＦＬＡＧ－ＭＡＴ１、ｐＣＭＶ－ＦＬＡＧ－ＭＡＴ２、ｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ ３またはｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ ４が挙げられる。例示的な哺乳動物の安定した発現ベクターとして、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ３、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ ９、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ １３、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２１、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２５、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ４、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ １０、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ １４、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２２、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２６、ｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ １またはｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ ２が挙げられる。
一部の例では、無細胞系が、本明細書に記載されるＩＬ－２ポリペプチドの産生に用いられる。場合によっては、無細胞系は、細胞由来の細胞質および／または核構成要素の混合物を含み、インビトロ核酸合成に適している。一部の例では、無細胞系は、原核細胞構成要素を利用する。他の例では、無細胞系は、真核細胞構成要素を利用する。核酸合成は、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）属細胞、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）属卵、古細菌、またはＨｅＬａ細胞に基づく無細胞系において達成される。例示的な無細胞系として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ系、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７ Ｓ３０系またはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、ＸｐｒｅｓｓＣＦおよびＸｐｒｅｓｓＣＦ＋が挙げられる。
無細胞翻訳系は、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、シンセターゼ、放出因子、リボソーム、シャペロンタンパク質、翻訳開始因子および伸長因子、天然のアミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸等の構成要素、ならびに／またはタンパク質発現に用いられる他の構成要素を様々に含む。そのような構成要素は、場合により、収量を向上させるか、合成速度を高めるか、タンパク質生成物忠実性を増大させるか、または非天然アミノ酸を組み込むように修飾されている。一部の実施形態では、本明細書に記載されるサイトカインは、米国特許第８，７７８，６３１号；米国特許出願公開第２０１７／０２８３４６９号；米国特許出願公開第２０１８／００５１０６５号；米国特許出願公開第２０１４／０３１５２４５号；または米国特許第８，７７８，６３１号に記載される無細胞翻訳系を用いて合成される。これら文献のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。一部の実施形態では、無細胞翻訳系は、修飾放出因子を含み、または系からの１つもしくはそれ以上の放出因子の除去すらも含む。一部の実施形態では、無細胞翻訳系は、プロテアーゼ濃度の引下げを含む。一部の実施形態では、無細胞翻訳系は、非天然アミノ酸をコードするのに用いられるコドンが再割当てされている修飾ｔＲＮＡを含む。一部の実施形態では、非天然アミノ酸の組み込み用の、本明細書に記載されるシンセターゼが、無細胞翻訳系に用いられる。一部の実施形態では、ｔＲＮＡが無細胞翻訳系に加えられる前に、酵素的方法または化学的方法を用いて、非天然アミノ酸がｔＲＮＡに予めロードされている。一部の実施形態では、無細胞翻訳系用の構成要素は、修飾された生物、例えば修飾された細菌、酵母、または他の生物から得られる。
一部の実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、発現宿主系を介して、または無細胞系を介して、環状に置換された形態として生成される。
非天然アミノ酸を含むサイトカインポリペプチドの産生
直交性遺伝的コードまたは拡張遺伝的コードを本開示において用いることができ、その中では、ＩＬ－２ポリペプチドの核酸配列内に存在する１つまたはそれ以上の特定のコドンが、非天然アミノ酸をコードするように割り当てられているので、これを、直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対を用いることによってＩＬ－２中に遺伝的に組み込むことができる。直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、非天然アミノ酸でｔＲＮＡを付加することができ、非天然アミノ酸をポリペプチド鎖中にコドンに応じて組み込むことができる。
一部の例では、コドンは、コドンアンバー、オーカー、オパール、または四つ組コドンである。場合によっては、コドンは、非天然アミノ酸を有するように用いられることとなる直交性ｔＲＮＡに対応する。場合によっては、コドンはアンバーである。その他の場合には、コドンは直交性コドンである。
一部の例では、コドンは四つ組コドンであり、これは、直交性リボソームｒｉｂｏ－Ｑ１によってデコードされる。場合によっては、四つ組コドンは、Ｎｅｕｍａｎｎら、「Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｖｉａ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ－ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ」、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻（７２８７号）：第４４１～４４４頁（２０１０年）に示される通りであり、その開示は参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の例では、本開示において用いられるコドンは、リコードされるコドン、例えば、同義コドン、または代替コドンで置き換えられるレアコドンである。場合によっては、リコードされるコドンは、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏら、「Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ｒｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｏｄｏｎ ｃｈｏｉｃｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｅｄ ｂｙ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒａｒｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、ＰＮＡＳ、１１３巻（３８号）：Ｅ５５８８～５５９７頁（２０１６年）に記載される通りである。場合によっては、リコードされるコドンは、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｏｓｔｒｏｖら、「Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏｗａｒｄ ａ ５７－ｃｏｄｏｎ ｇｅｎｏｍｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３巻（６３０１号）：８１９～８２２頁（２０１６年）に記載される通りである。
一部の例では、非天然核酸が、ＩＬ－２中への１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸の組み込みをもたらすように利用される。例示的な非天然核酸として、以下に限定されないが、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、２－アミノアデニン－９－イル、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが挙げられる。特定の非天然核酸、例えば５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン、二重鎖形成の安定性を増大させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャス核酸、サイズ拡張核酸、フッ化核酸、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンが挙げられる）。５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチル、他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、三環ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンズオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、フェノキサジンシチジン（例えば９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［ｌ，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられているもの、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、アザシトシン、５－ブロモシトシン、ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシルおよび５－ヨードウラシル、２－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、２－チオ－チミン、４－チオ－チミン、５－プロピニル－ウラシル、４－チオ－ウラシル、Ｎ４－エチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－ヒドロキシシトシン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、ならびにその開示が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第３，６８７，８０８号；米国特許第４，８４５，２０５号；米国特許第４，９１０，３００号；米国特許第４，９４８，８８２号；米国特許第５，０９３，２３２号；米国特許第５，１３０，３０２号；米国特許第５，１３４，０６６号；米国特許第５，１７５，２７３号；米国特許第５，３６７，０６６号；米国特許第５，４３２，２７２号；米国特許第５，４５７，１８７号；米国特許第５，４５９，２５５号；米国特許第５，４８４，９０８号；米国特許第５，５０２，１７７号；米国特許第５，５２５，７１１号；米国特許第５，５５２，５４０号；米国特許第５，５８７，４６９号；米国特許第５，５９４，１２１号；米国特許第５，５９６，０９１号；米国特許第５，６１４，６１７号；米国特許第５，６４５，９８５号；米国特許第５，６８１，９４１号；米国特許第５，７５０，６９２号；米国特許第５，７６３，５８８号；米国特許第５，８３０，６５３号および米国特許第６，００５，０９６号；国際公開第９９／６２９２３号；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、（２００１年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９巻：８０７～８１３頁；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０年、８５８～８５９頁；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、国際版、１９９１年、３０巻、６１３頁；ならびにＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年、２７３～２８８頁に記載されるもの。さらなる塩基修飾を、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、国際版、１９９１年、３０巻、６１３頁；ならびにＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９～３０２頁、ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年において見出すことができ、それらのそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
種々の複素環塩基および種々の糖部分（および糖類似体）を含む非天然核酸が、当技術分野において利用可能であり、核酸は、場合によっては、天然に存在する核酸の主な５つの塩基構成要素以外の１つまたはいくつかの複素環塩基を含む。例えば、複素環塩基として、場合によっては、ウラシル－５－イル、シトシン－５－イル、アデニン－７－イル、アデニン－８－イル、グアニン－７－イル、グアニン－８－イル、４－アミノピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－３－イル基が挙げられ、ここで、プリンは９－位置を介して、ピリミジンは１－位置を介して、ピロロピリミジンは７－位置を介して、ピラゾロピリミジンは１－位置を介して、核酸の糖部分に結合している。
また、一部の実施形態では、ヌクレオチド類似体は、ホスフェート部分にて修飾されている。修飾ホスフェート部分として、以下に限定されないが、２つのヌクレオチド間の結合にて修飾があるものが挙げられ、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが挙げられる）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートが挙げられる）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートを含有する。２つのヌクレオチド間のこれらのホスフェート結合または修飾ホスフェート結合は、３’－５’結合または２’－５’結合を介していること、結合は、反転した極性、例えば３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’を含有することが理解される。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形態が挙げられる。多数の米国特許が、修飾ホスフェートを含有するヌクレオチドを製造して用いる方法を教示しており、以下に限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；米国特許第４，４６９，８６３号；米国特許第４，４７６，３０１号；米国特許第５，０２３，２４３号；米国特許第５，１７７，１９６号；米国特許第５，１８８，８９７号；米国特許第５，２６４，４２３号；米国特許第５，２７６，０１９号；米国特許第５，２７８，３０２号；米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，３２１，１３１号；米国特許第５，３９９，６７６号；米国特許第５，４０５，９３９号；米国特許第５，４５３，４９６号；米国特許第５，４５５，２３３号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７６，９２５号；米国特許第５，５１９，１２６号；米国特許第５，５３６，８２１号；米国特許第５，５４１，３０６号；米国特許第５，５５０，１１１号；米国特許第５，５６３，２５３号；米国特許第５，５７１，７９９号；米国特許第５，５８７，３６１号；および米国特許第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの特許のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の実施形態では、非天然核酸は、２’，３’－ジデオキシ－２’，３’－ジデヒドロヌクレオシド（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００６４６０号）、５’－置換ＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３９６１号；Ｓａｈａら、Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、１９９５年、６０巻、７８８～７８９頁；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９年、９巻、８８５～８９０頁；およびＭｉｋｈａｉｌｏｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９１年、１０巻（１～３号）、３３９～３４３頁；Ｌｅｏｎｉｄら、１９９５年、１４巻（３～５号）、９０１～９０５頁；およびＥｐｐａｃｈｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２００４年、８７巻、３００４～３０２０頁；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０００／００４７２０号；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００２３４２号；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３２１６号；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２０４３５号；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１５４７９号；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４８４号；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５６７１８号；国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６７５６０号）、または修飾塩基を有するモノホスフェートとして製造される５’－置換モノマー（Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２００４年、２３巻（１および２号）、３１７～３３７頁）を含み、これらのそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の実施形態では、非天然核酸は、糖環の５’－位置および２’－位置にて（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９９３号）、５’－ＣＨ２置換２’－Ｏ保護ヌクレオシド等の修飾を含む（Ｗｕら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２０００年、８３巻、１１２７～１１４３頁およびＷｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９９年、１０巻、９２１～９２４頁）。場合によっては、非天然核酸は、オリゴヌクレオチド中への組み込みのために調製されたアミド連結ヌクレオシドダイマーを含み、ダイマー内の３’連結ヌクレオシド（５’から３’）は、２’－ＯＣＨ３および５’－（Ｓ）－ＣＨ３を含む（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９７年、１２８７～１２９０頁）。非天然核酸は、２’－置換５’－ＣＨ２（またはＯ）修飾ヌクレオシドを含んでもよい（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１０２０号）。非天然核酸は、５’－メチレンホスホネートＤＮＡおよびＲＮＡモノマー、ならびにダイマーを含んでもよい（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、１９９３年、３４巻、２７２３～２７２６頁；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９５年、７巻、７０３～７０５頁；およびＨｕｔｔｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２００２年、８５巻、２７７７～２８０６頁）。非天然核酸は、２’－置換を有する５’－ホスホネートモノマー（米国特許出願公開第２００６／００７４０３５号）および他の修飾５’－ホスホネートモノマー（国際公開第１９９７／３５８６９号）を含んでもよい。非天然核酸は、５’－修飾メチレンホスホネートモノマー（ＥＰ６１４９０７号およびＥＰ６２９６３３号）を含んでもよい。非天然核酸は、５’－位置および／または６’－位置にてヒドロキシル基を含む５’－または６’－ホスホネートリボヌクレオシドの類似体を含んでもよい（Ｃｈｅｎら、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｕｌｆｕｒ ａｎｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ、２００２年、７７７巻、１７８３～１７８６頁；Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、８巻、２５０１～２５０９頁；Ｇａｌｌｉｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００７年、９２５～９３３頁；およびＨａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６年、１９巻（８号）、１０２９～１０３３頁）。非天然核酸は、５’－ホスフェート基を有する５’－ホスホネートデオキシリボヌクレオシドモノマーおよびダイマーを含んでもよい（Ｎａｗｒｏｔら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００６年、１６巻（１号）、６８～８２頁）。非天然核酸は、６’－ホスホネート基を有するヌクレオシドを含んでもよく、５’－位置および／または６’－位置は、置換されていないか、またはチオ－ｔｅｒｔ－ブチル基（ＳＣ（ＣＨ３）３）（およびその類似体）；メチレンアミノ基（ＣＨ２ＮＨ２）（およびその類似体）もしくはシアノ基（ＣＮ）（およびその類似体）で置換されている（Ｆａｉｒｈｕｒｓｔら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、２００１年、４巻、４６７～４７２頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８６年、２９巻、１０３０～１０３８頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８２年、２５巻、１１７９～１１８４頁；Ｖｒｕｄｈｕｌａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８７年、３０巻、８８８－８９４頁；Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６年、１９巻、１３７１～１３７７頁；Ｇｅｚｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９８３年、１０５巻（２６号）、７６３８～７６４０頁；およびＨａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９７３年、９５巻（１３号）、４４０４～４４１４頁）。この段落に列挙される参照のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
また、一部の実施形態では、非天然核酸は、糖部分の修飾を含む。場合によっては、核酸は、１つまたはそれ以上のヌクレオシドを含有し、糖基は修飾されている。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増大、または他の一部の有益な生物学的性質を与え得る。特定の実施形態では、核酸は、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例は、限定されないが、置換基の付加を含む（５’置換基および／または２’置換基；二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するような２つの環原子の架橋；Ｓ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基）によるリボシル環酸素原子の置き換え；およびそれらの組合せを含む）。化学修飾糖の例は、国際公開第２００８／１０１１５７号、米国特許出願公開第２００５／０１３０９２３号、および国際公開第２００７／１３４１８１号において見出すことができ、これらの特許のそれぞれの開示が、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の例では、修飾核酸は、修飾糖または糖類似体を含む。ゆえに、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖「類似体」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシル形態であってもフラノシル形態であってもよい。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、または２’－Ｏ－アルキルリボースのフラノシドであってもよく、糖は、各複素環塩基に、［アルファ］または［ベータ］アノマー配置で結合している。糖修飾は、以下に限定されないが、２’－アルコキシ－ＲＮＡ類似体、２’－アミノ－ＲＮＡ類似体、２’－フルオロ－ＤＮＡ、および２’－アルコキシ－またはアミノ－ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含む。例えば、糖修飾は、２’－Ｏ－メチル－ウリジンを含んでも、２’－Ｏ－メチル－シチジンを含んでもよい。糖修飾は、２’－Ｏ－アルキル置換デオキシリボヌクレオシドおよび２’－Ｏ－エチレングリコール様リボヌクレオシドを含む。これらの糖または糖類似体、および各「ヌクレオシド」（そのような糖または類似体が、複素環塩基（核酸塩基）に結合している）の調製が知られている。また、糖修飾をして、他の修飾と組み合わせてもよい。
糖部分への修飾として、リボースおよびデオキシリボースの天然の修飾、および非天然の修飾が挙げられる。糖修飾は、以下に限定されないが、２’位置にて以下の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルを含み、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されているか、または置換されていないＣ１～Ｃ１０、アルキルもしくはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。また、２’糖修飾は、以下に限定されないが、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは、１～約１０である）を含む。
２’位置での他の修飾は、以下に限定されないが：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、Ｏ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、リポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を向上させる基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を向上させる基、および類似の性質を有する他の置換基を含む。また、類似の修飾が、３’末端ヌクレオチド上の、または２’－５’連結オリゴヌクレオチド内の糖上の他の位置、特に糖の３’位置、５’末端ヌクレオチドの５’位置にてなされる。また、修飾糖は、ＣＨ２およびＳ等の架橋環酸素にて修飾を含有するものを含む。また、ヌクレオチド糖類似体は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模擬物を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示しており、かつ広範な塩基修飾を詳述かつ記載する多数の米国特許が存在し、例えば、米国特許第４，９８１，９５７号；米国特許第５，１１８，８００号；米国特許第５，３１９，０８０号；米国特許第５，３５９，０４４号；米国特許第５，３９３，８７８号；米国特許第５，４４６，１３７号；米国特許第５，４６６，７８６号；米国特許第５，５１４，７８５号；米国特許第５，５１９，１３４号；米国特許第５，５６７，８１１号；米国特許第５，５７６，４２７号；米国特許第５，５９１，７２２号；米国特許第５，５９７，９０９号；米国特許第５，６１０，３００号；米国特許第５，６２７，０５３号；米国特許第５，６３９，８７３号；米国特許第５，６４６，２６５号；米国特許第５，６５８，８７３号；米国特許第５，６７０，６３３号；米国特許第４，８４５，２０５号；米国特許第５，１３０，３０２号；米国特許第５，１３４，０６６号；米国特許第５，１７５，２７３号；米国特許第５，３６７，０６６号；米国特許第５，４３２，２７２号；米国特許第５，４５７，１８７号；米国特許第５，４５９，２５５号；米国特許第５，４８４，９０８号；米国特許第５，５０２，１７７号；米国特許第５，５２５，７１１号；米国特許第５，５５２，５４０号；米国特許第５，５８７，４６９号；米国特許第５，５９４，１２１号；米国特許第５，５９６，０９１号；米国特許第５，６１４，６１７号；米国特許第５，６８１，９４１号；および米国特許第５，７００，９２０号があり、これらの特許のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
修飾糖部分を有する核酸の例として、以下に限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３および２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含む核酸が挙げられる。また、２’位置での置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）およびＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択することができ、式中、ＲｍおよびＲｎは、それぞれ独立して、Ｈ、または置換されたかもしくは置換されていないＣ１～Ｃ１０アルキルである。
特定の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含む。特定のそのような実施形態では、二環式核酸は、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間に架橋を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含み、その中で架橋は、４’から２’の二環式核酸を含む。そのような４’から２’の二環式核酸の例として、以下に限定されないが、式：４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’、ならびにそれらの類似体（米国特許第７，３９９，８４５号参照）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’およびその類似体（国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２００８／１５０７２９号、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号、米国特許第７，４２７，６７２号、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０９巻、７４号、１１８～１３４頁、および国際公開第２００８／１５４４０１号参照）の１つが挙げられる。また、例えば：Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８年、４巻、４５５～４５６頁；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８年、５４巻、３６０７～３６３０頁；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００年、９７巻、５６３３～５６３８頁；Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８年、８巻、２２１９～２２２２頁；Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３巻、１００３５～１００３９頁；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００７年、１２９巻（２６号）８３６２～８３７９頁；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ、２００１年、２巻、５５８－５６１頁；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ、２００１年、８巻、１～７頁；Ｏｒａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００１年、３巻、２３９～２４３頁；米国特許第４，８４９，５１３号；米国特許第５，０１５，７３３号；米国特許第５，１１８，８００号；米国特許第５，１１８，８０２号；米国特許第７，０５３，２０７号；米国特許第６，２６８，４９０号；米国特許第６，７７０，７４８号；米国特許第６，７９４，４９９号；米国特許第７，０３４，１３３号；米国特許第６，５２５，１９１号；米国特許第６，６７０，４６１号；および米国特許第７，３９９，８４５号；国際公開第２００４／１０６３５６号、国際公開第１９９４／１４２２６号、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００７／０９００７１号および国際公開第２００７／１３４１８１号；米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号、米国特許出願公開第２００７／０２８７８３１号および米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号；米国仮特許出願第６０／９８９，５７４号、米国仮特許出願第６１／０２６，９９５号、米国仮特許出願第６１／０２６，９９８号、米国仮特許出願第６１／０５６，５６４号、米国仮特許出願第６１／０８６，２３１号、米国仮特許出願第６１／０９７，７８７号および米国仮特許出願第６１／０９９，８４４号；ならびに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号および国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号参照。この段落に列挙される各参考文献の開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
特定の実施形態では、核酸は、連結核酸を含む。核酸は、あらゆる核酸間連結を用いて、一緒に連結することができる。核酸間連結基の２つの主要なクラスは、リン原子の有無によって定義される。代表的なリン含有核酸間連結として、以下に限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデートおよびホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的な非リン含有核酸間連結基として、以下に限定されないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）；シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；Ｎ，Ｎ＊－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３））が挙げられる。特定の実施形態では、キラル原子を有する核酸間連結は、ラセミ混合物として、別個の鏡像異性体、例えば、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートとして調製することができる。非天然核酸は、単一の修飾を含有してもよい。非天然核酸は、部分の１つの内部に、または異なる部分間に、複数の修飾を含有してもよい。
核酸に対する骨格ホスフェート修飾は、以下に限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエートおよびボラノホスフェートを含み、あらゆる組合せで用いることができる。また、他の非ホスフェート結合を用いてもよい。
一部の実施形態では、骨格修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合）は、修飾核酸に免疫調節性活性を付与することができ、かつ／またはその安定性をインビボで増強することができる。
一部の例では、リン誘導体（または修飾リン酸基）が、糖または糖類似体部分に結合しており、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート等であり得る。修飾ホスフェート結合または非ホスフェート結合を含有する例示的なポリヌクレオチドは、Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、１９９６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：１８４１～１８４８頁；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、１９９６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：２３１８～２３２３頁；Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：２９６６～２９７３頁；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、１９９７年、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ：ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ」（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（ＣｈａｄｗｉｃｋおよびＣａｒｄｅｗ編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）；Ｚｏｎ、１９９３年、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ」（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１６５～１９０頁）；Ｍｉｌｌｅｒら、１９７１年、ＪＡＣＳ ９３巻：６６５７～６６６５頁；Ｊａｇｅｒら、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７巻：７２４７～７２４６頁；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９７年、ＪＯＣ ６２巻：７２７８～７２８７頁；米国特許第５，４５３，４９６号；ならびにＭｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８巻：１１５７～１１７９頁において見出すことができ、これらのそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
場合によっては、骨格修飾は、ホスホジエステル結合を、代わりの部分、例えばアニオン基、中性基、またはカチオン基で置き換えることを含む。そのような修飾の例として、以下が挙げられる：アニオンヌクレオシド間結合；Ｎ３’からＰ５’のホスホロアミデート修飾；ボラノホスフェートＤＮＡ；プロオリゴヌクレオチド；中性ヌクレオシド間結合、例えばメチルホスホネート；アミド連結ＤＮＡ；メチレン（メチルイミノ）結合；ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合；スルホニル基を含有する骨格；モルフォリノオリゴ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；および正に帯電するデオキシリボ核グアニジン（ＤＮＧ）オリゴ（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８巻：１１５７～１１７９頁。その開示は、参照によって本明細書に組み入れられる）。修飾核酸は、１つまたはそれ以上の修飾を含むキメラ骨格または混合骨格、例えば、ホスホジエステル結合およびホスホロチオネート結合の組合せ等のホスフェート結合の組合せを含んでもよい。
ホスフェートの代わりの例として、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つもしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子間結合もしくは複素環ヌクレオシド間結合が挙げられる。これらとして、モルフォリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のものを有するものが挙げられる。多数の米国特許が、これらのタイプのホスフェート置き換えを形成して用いる方法を開示しており、以下に限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；米国特許第５，１６６，３１５号；米国特許第５，１８５，４４４号；米国特許第５，２１４，１３４号；米国特許第５，２１６，１４１号；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，２６４，５６２号；米国特許第５，２６４，５６４号；米国特許第５，４０５，９３８号；米国特許第５，４３４，２５７号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７０，９６７号；米国特許第５，４８９，６７７号；米国特許第５，５４１，３０７号；米国特許第５，５６１，２２５号；米国特許第５，５９６，０８６号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６１８，７０４号；米国特許第５，６２３，０７０号；米国特許第５，６６３，３１２号；米国特許第５，６３３，３６０号；米国特許第５，６７７，４３７号；および米国特許第５，６７７，４３９号が挙げられる。また、ヌクレオチド置換において、ヌクレオチドの糖部分およびホスフェート部分の双方を、例えばアミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができることが理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；米国特許第５，７１４，３３１号；および米国特許第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子を形成して用いる方法を教示しており、これらの特許はそれぞれ、参照によって本明細書に組み入れられる。また、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５４巻、１４９７～１５００頁参照。また、他のタイプの分子（コンジュゲート）を、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結して、例えば細胞吸収を増強することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に連結することができる。そのようなコンジュゲートは、以下に限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、８６巻、６５５３～６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４年、４巻、１０５３～１０６０頁）、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２年、６６０巻、３０６～３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３年、３巻、２７６５～２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２年、２０巻、５３３～５３８頁）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭ５ＯＪ、１９９１年、１０巻、１１１１～１１１８頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０年、２５９巻、３２７～３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３年、７５巻、４９～５４頁）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセリンもしくはトリエチルアンモニウム１－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－Ｓ－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻、３６５１～３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０年、１８巻、３７７７～３７８３頁）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５年、１４巻、９６９～９７３頁）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻、３６５１～３６５４頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５年、１２６４巻、２２９～２３７頁）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６年、２７７巻、９２３～９３７頁）を含む。多数の米国特許が、そのようなコンジュゲートの調製を教示しており、以下に限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；米国特許第４，９４８，８８２号；米国特許第５，２１８，１０５号；米国特許第５，５２５，４６５号；米国特許第５，５４１，３１３号；米国特許第５，５４５，７３０号；米国特許第５，５５２，５３８号；米国特許第５，５７８，７１７；米国特許第５，５８０，７３１号；米国特許第５，５８０，７３１号；米国特許第５，５９１，５８４号；米国特許第５，１０９，１２４号；米国特許第５，１１８，８０２号；米国特許第５，１３８，０４５号；米国特許第５，４１４，０７７号；米国特許第５，４８６，６０３号；米国特許第５，５１２，４３９号；米国特許第５，５７８，７１８号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第４，５８７，０４４号；米国特許第４，６０５，７３５号；米国特許第４，６６７，０２５号；米国特許第４，７６２，７７９号；米国特許第４，７８９，７３７号；米国特許第４，８２４，９４１号；米国特許第４，８３５，２６３号；米国特許第４，８７６，３３５号；米国特許第４，９０４，５８２号；米国特許第４，９５８，０１３号；米国特許第５，０８２，８３０号；米国特許第５，１１２，９６３号；米国特許第５，２１４，１３６号；米国特許第５，０８２，８３０号；米国特許第５，１１２，９６３号；米国特許第５，２１４，１３６号；米国特許第５，２４５，０２２号；米国特許第５，２５４，４６９号；米国特許第５，２５８，５０６号；米国特許第５，２６２，５３６号；米国特許第５，２７２，２５０号；米国特許第５，２９２，８７３号；米国特許第５，３１７，０９８号；米国特許第５，３７１，２４１号；米国特許第５，３９１，７２３号；米国特許第５，４１６，２０３号；米国特許第５，４５１，４６３号；米国特許第５，５１０，４７５号；米国特許第５，５１２，６６７号；米国特許第５，５１４，７８５号；米国特許第５，５６５，５５２号；米国特許第５，５６７，８１０号；米国特許第５，５７４，１４２号；米国特許第５，５８５，４８１号；米国特許第５，５８７，３７１号；米国特許第５，５９５，７２６号；米国特許第５，５９７，６９６号；米国特許第５，５９９，９２３号；米国特許第５，５９９，９２８号および米国特許第５，６８８，９４１号が挙げられる。この段落に列挙される参照のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
場合によっては、非天然核酸はさらに、非天然の塩基対を形成する。非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）をインビボ条件下で形成することができる例示的な非天然ヌクレオチドとして、以下に限定されないが、ＴＡＴ１、ｄＴＡＴ１、５ＦＭ、ｄ５ＦＭ、ＴＰＴ３、ｄＴＰＴ３、５ＳＩＣＳ、ｄ５ＳＩＣＳ、ＮａＭ、ｄＮａＭ、ＣＮＭＯ、ｄＣＮＭＯ、およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、非天然ヌクレオチドとしては：
Figure 2023546009000060
 が挙げられる。例示的な非天然塩基対としては、（ｄ）ＴＰＴ３－（ｄ）ＮａＭ；（ｄ）５ＳＩＣＳ－（ｄ）ＮａＭ；（ｄ）ＣＮＭＯ－（ｄ）ＴＡＴ１；（ｄ）ＮａＭ－（ｄ）ＴＡＴ１；（ｄ）ＣＮＭＯ－（ｄ）ＴＰＴ３；および（ｄ）５ＦＭ－（ｄ）ＴＡＴ１が挙げられる。
本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを調製するのに用いることができる非天然ＵＢＰを形成することができる非天然ヌクレオチドの他の例を、Ｄｉｅｎら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、２０１８年、１４０巻：１６１１５～１６１２３頁；Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、２０１７年、１３９巻：１１４２７～１１４３３頁；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、２０１８年、１４０巻：７５８～７６５頁；Ｄｈａｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４年、４２巻：１０２３５～１０２４４頁；Ｍａｌｙｓｈｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年、５０９巻：３８５～３８８頁；Ｂｅｔｚら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、２０１３年、１３５巻：１８６３７～１８６４３頁；Ｌａｖｅｒｇｎｅら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１３年、１３５巻：５４０８～５４１９頁；およびＭａｌｙｓｈｅｖら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１２年、１０９巻：１２００５～１２０１０頁において見出すことができ、これらのそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。一部の実施形態では、非天然ヌクレオチドとして、以下が挙げられる：
Figure 2023546009000061
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを調製するのに用いることができる非天然ヌクレオチドは、式
Figure 2023546009000062
 の化合物に由来し得、
式中、Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、およびアジドから選択され；
波線は、リボシルまたは２’－デオキシリボシルへの結合を示し、リボシル部分または２’－デオキシリボシル部分の５’ヒドロキシ基は、遊離形態であり、モノホスフェート基、ジホスフェート基、トリホスフェート基、α－チオトリホスフェート基、β－チオトリホスフェート基、またはγ－チオトリホスフェート基に結合され、またはＲＮＡもしくはＤＮＡに、またはＲＮＡ類似体もしくはＤＮＡ類似体に含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを調製するのに用いることができる非天然ヌクレオチドは、式
Figure 2023546009000063
 の化合物に由来し得、
式中、
各Ｘは、独立して炭素または窒素であり；
Ｒ２は、Ｘが窒素である場合に不在であり、Ｘが炭素である場合に存在し、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノール、ハロゲン、シアノ、またはアジドであり、
Ｙは、硫黄、酸素、セレン、または第二級アミンであり；
Ｅは、酸素、硫黄、またはセレンであり；ならびに
波線は、リボシル部分、デオキシリボシル部分、もしくはジデオキシリボシル部分またはその類似体への結合点を示し、リボシル部分、デオキシリボシル部分、もしくはジデオキシリボシル部分またはその類似体は、遊離形態であり、モノホスフェート基、ジホスフェート基、トリホスフェート基、α－チオトリホスフェート基、β－チオトリホスフェート基、もしくはγ－チオトリホスフェート基に結合され、またはＲＮＡもしくはＤＮＡに、またはＲＮＡ類似体もしくはＤＮＡ類似体に含まれる。
一部の実施形態では、各Ｘは炭素である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＸは炭素である。一部の実施形態では、１つのＸは炭素である。一部の実施形態では、少なくとも２つのＸは炭素である。一部の実施形態では、２つのＸは炭素である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＸは窒素である。一部の実施形態では、１つのＸは窒素である。一部の実施形態では、少なくとも２つのＸは窒素である。一部の実施形態では、２つのＸは窒素である。
一部の実施形態では、Ｙは硫黄である。一部の実施形態では、Ｙは酸素である。一部の実施形態では、Ｙはセレンである。一部の実施形態では、Ｙは第二級アミンである。
一部の実施形態では、Ｅは硫黄である。一部の実施形態では、Ｅは酸素である。一部の実施形態では、Ｅはセレンである。
一部の実施形態では、Ｘが炭素である場合、Ｒ２は存在する。一部の実施形態では、Ｘが窒素である場合、Ｒ２は不在である。一部の実施形態では、各Ｒ２は、存在する場合、水素である。一部の実施形態では、Ｒ２は、アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピルである。一部の実施形態では、Ｒ２は、アルケニル、例えば－ＣＨ２＝ＣＨ２である。一部の実施形態では、Ｒ２は、アルキニル、例えばエチニルである。一部の実施形態では、Ｒ２はメトキシである。一部の実施形態では、Ｒ２はメタンチオールである。一部の実施形態では、Ｒ２はメタンセレノールである。一部の実施形態では、Ｒ２は、ハロゲン、例えばクロロ、ブロモ、またはフルオロである。一部の実施形態では、Ｒ２はシアノである。一部の実施形態では、Ｒ２はアジドである。
一部の実施形態では、Ｅは硫黄であり、Ｙは硫黄であり、各Ｘは独立して炭素または窒素である。一部の実施形態では、Ｅは硫黄であり、Ｙは硫黄であり、各Ｘは炭素である。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを調製するのに用いることができる非天然ヌクレオチドは、
Figure 2023546009000064
 に由来し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを調製するのに用いることができる非天然ヌクレオチドとしては、
Figure 2023546009000065
Figure 2023546009000066
 またはそれらの塩が挙げられる。
一部の実施形態では、非天然の塩基対は、Ｄｕｍａｓら、「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｄｏｎ ｒｅａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ－Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６巻：５０～６９頁（２０１５年）に記載される非天然アミノ酸を生成する。この文献の開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の実施形態では、非天然アミノ酸は、非天然核酸を含む合成コドンによってサイトカイン（例えばＩＬポリペプチド）に組み込まれる。一部の例では、非天然アミノ酸は、直交する修飾シンセターゼ／ｔＲＮＡ対によってサイトカインに組み込まれる。このような直交した対は、ａ）他の内因性アミノ酸の非天然ｔＲＮＡ上への付加、およびｂ）非天然アミノ酸の他の内因性ｔＲＮＡ上への付加を最小限にしながら、非天然ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を付加することができる非天然シンセターゼを含む。このような直交した対は、ａ）内因性シンセターゼによって他の内因性アミノ酸を付加されることを避けながら、非天然シンセターゼによる付加を受けることが可能なｔＲＮＡを含む。一部の実施形態では、このような対は、細菌、酵母、古細菌、またはヒト供給源等の種々の生物から同定される。一部の実施形態では、直交性シンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、単一の生物由来の成分を含む。一部の実施形態では、直交性シンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、２つの異なる生物由来の成分を含む。一部の実施形態では、直交性シンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、修飾前に２つの異なるアミノ酸の翻訳を促進する成分を含む。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾アラニンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾アルギニンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾アスパラギンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾アスパラギン酸シンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾システインシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾グルタミンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾グルタミン酸シンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾アラニングリシンである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾ヒスチジンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾ロイシンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾イソロイシンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾リジンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾メチオニンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾フェニルアラニンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾プロリンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾セリンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾トレオニンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾トリプトファンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾チロシンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾バリンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性シンセターゼは、修飾ホスホセリンシンセターゼである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾アラニンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾アルギニンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾アスパラギンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾アスパラギン酸ｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾システインｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾グルタミンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾グルタミン酸ｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾アラニングリシンである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾ヒスチジンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾ロイシンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾イソロイシンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾リジンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾メチオニンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾フェニルアラニンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾プロリンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾セリンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾トレオニンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾トリプトファンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾チロシンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾バリンｔＲＮＡである。一部の実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、修飾ホスホセリンｔＲＮＡである。
一部の実施形態では、非天然アミノ酸は、アミノアシル（ａａＲＳまたはＲＳ）－ｔＲＮＡシンセターゼ－ｔＲＮＡ対によってサイトカイン（例えばＩＬポリペプチド）に組み込まれる。例示的なａａＲＳ－ｔＲＮＡ対としては、限定されないが、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍｊ－Ｔｙｒ）ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対、大腸菌ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｔＲＮＡＣＵＡ対、大腸菌ＬｅｕＲＳ（Ｅｃ－Ｌｅｕ）／バチルス・ステアロサーモフィルスｔＲＮＡＣＵＡ対、およびピロリシル－ｔＲＮＡ対が挙げられる。一部の例では、非天然アミノ酸は、Ｍｊ－ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によってサイトカイン（例えばＩＬポリペプチド）に組み込まれる。Ｍｊ－ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によって組み込むことができる例示的なＵＡＡとしては、限定されないが、パラ置換フェニルアラニン誘導体、例えば、ｐ－アミノフェニルアラニンおよびｐ－メトイフェニルアラニン；メタ置換チロシン誘導体、例えば、３－アミノチロシン、３－ニトロチロシン、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、および３－ヨードチロシン；フェニルセレノシステイン；ｐ－ボロノフェニルアラニン；およびｏ－ニトロベンジルチロシンが挙げられる。
一部の例では、非天然アミノ酸は、Ｅｃ－Ｔｙｒ／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ－Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によってサイトカイン（例えばＩＬポリペプチド）に組み込まれる。Ｅｃ－Ｔｙｒ／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ－Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によって組み込まれ得る例示的なＵＡＡとしては、限定されないが、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、またはアジド置換基を含むフェニルアラニン誘導体；Ｏ－プロパルギルチロシン；α－アミノカプリル酸、Ｏ－メチルチロシン、Ｏ－ニトロベンジルシステイン；および３－（ナフタレン－２－イルアミノ）－２－アミノ－プロパン酸が挙げられる。
一部の例では、非天然アミノ酸は、ピロリシル－ｔＲＮＡ対によってサイトカイン（例えばＩＬポリペプチド）に組み込まれる。場合によっては、ＰｙｌＲＳは、古細菌、例えば、メタン生成古細菌から得られる。場合によっては、ＰｙｌＲＳは、メタノサルキナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、またはメタノサルキナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）から得られる。ピロリシルｔＲＮＡ対によって組み込まれ得る例示的なＵＡＡとしては、限定されないが、アミドおよびカルバメート置換リジン、例えば、２－アミノ－６－（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－カルボキサミド）ヘキサン酸、Ｎ－ε－Ｄ－プロリル－Ｌ－リジンおよびＮ－ε－シクロペンチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン；Ｎ－ε－アクリロイル－Ｌ－リジン；Ｎ－ε－［（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン；およびＮ－ε－（１－メチルシクロプロ－２－エンカルボキサミド）リジンが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートは、メタノサルキナ・バルケリ ピロリシル－ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）によって非天然アミノ酸、例えば、Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を選択的に付加される、Ｍ．マゼイｔＲＮＡの使用によって調製される。他の方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１７、５５１（７６８２）：６４４－６４７に開示されるものであり、その開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の例では、米国特許第９，９８８，６１９号および米国特許第９，９３８，５１６号に開示されるシンセターゼによって、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されるサイトカイン（例えばＩＬポリペプチド）に組み込まれ、これらの特許のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
本明細書に開示される構築物またはベクターが導入されている宿主細胞は、目的のｔＲＮＡ、ｔＲＮＡシンセターゼおよびタンパク質が産生されるような適切な培地中で培養されるか、または維持される。また、培地は、非天然アミノ酸を、目的のタンパク質が非天然アミノ酸を組み込むように含む。また、一部の実施形態では、細菌、植物または藻類由来のヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＮＴＴ）が、宿主細胞中に存在する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートは、ＮＴＴを発現する宿主細胞の使用によって調製される。一部の実施形態では、宿主細胞に用いられるヌクレオチドヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、ＴｐＮＴＴ１、ＴｐＮＴＴ２、ＴｐＮＴＴ３、ＴｐＮＴＴ４、ＴｐＮＴＴ５、ＴｐＮＴＴ６、ＴｐＮＴＴ７、ＴｐＮＴＴ８（Ｔ．シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５、ＰｔＮＴＴ６（Ｐ．トリコルナータム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、ＧｓＮＴＴ（ガルジエリア・スルフラリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ））、ＡｔＮＴＴ１、ＡｔＮＴＴ２（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、ＣｔＮＴＴ１、ＣｔＮＴＴ２（クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、ＰａｍＮＴＴ１、ＰａｍＮＴＴ２（プロトクラミジア・アモエボフィラ（Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌａ））、ＣｃＮＴＴ（ケディバクター・カリオフィルス（Ｃａｅｄｉｂａｃｔｅｒ ｃａｒｙｏｐｈｉｌｕｓ））、ＲｐＮＴＴ１（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ））から選択することができる。一部の実施形態では、ＮＴＴは、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５およびＰｔＮＴＴ６から選択される。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ１である。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ２である。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ３である。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ４である。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ５である。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ６である。用いることができる他のＮＴＴが、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１７年、５５１巻（７６８２号）：６４４～６４７頁；Ｍａｌｙｓｈｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１４年（５０９巻（７５００号）、３８５～３８８頁；およびＺｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１７年、１１４巻：１３１７～１３２２頁において開示されている。
直交性ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を付加して、非天然アミノ酸をポリペプチド鎖中にコドンに応じて組み込む。例示的なａａＲＳ－ｔＲＮＡ対として、以下に限定されないが、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍｊ－Ｔｙｒ）ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｔＲＮＡＣＵＡ対、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬｅｕＲＳ（Ｅｃ－Ｌｅｕ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｔＲＮＡＣＵＡ対およびピロリジル－ｔＲＮＡ対が挙げられる。本開示に従って用いることができる他のａａＲＳ－ｔＲＮＡ対として、Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．、２０１８年、１４０巻：１４４７～１４５４頁；およびＺｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１７年、１１４巻：１３１７～１３２２頁に記載される、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来するものが挙げられ、そのそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の実施形態では、提供されるのは、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを、ＮＴＴおよびｔＲＮＡシンセターゼを発現する細胞系において調製する方法である。本明細書に記載される一部の実施形態では、ＮＴＴは、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５およびＰｔＮＴＴ６から選択され、ｔＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）から選択される。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ１であり、ｔＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来する。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ２であり、ｔＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来する。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ３であり、ｔＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来する。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ３であり、ｔＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来する。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ４であり、ＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来する。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ５であり、ｔＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来する。一部の実施形態では、ＮＴＴはＰｔＮＴＴ６であり、ＲＮＡシンセターゼは、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来する。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートは、（ａ）ヌクレオチド三リン酸トランスポーターＰｔＮＴＴ２（全長タンパク質の最初の６５アミノ酸残基が欠失している切断されたバリアントを含む）、（ｂ）所望のアミノ酸配列を有するＩＬ－２バリアントをコードし、かつ、Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）等の非天然アミノ酸が組み込まれることとなる所望の位置にてコドンを提供するように、第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドを含む非天然の塩基対を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含むプラスミド、（ｃ）Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）に由来するｔＲＮＡをコードし、かつ、天然の配列の代わりに、認識されるアンチコドンを（ＩＬ－２バリアントのコドンに）提供するように非天然ヌクレオチドを含むプラスミド、ならびに（ｄ）ｔＲＮＡをコードする同じプラスミドであっても異なるプラスミドであってもよい、Ｍ．バルケリ（Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ）由来ピロリジル－ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）をコードするプラスミドを含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の細胞内で調製することができる。一部の実施形態では、細胞はさらに、１つまたはそれ以上の非天然塩基を含むデオキシリボ三リン酸が補充される。一部の実施形態では、細胞はさらに、１つまたはそれ以上の非天然塩基を含むリボ三リン酸が補充される。一部の実施形態では、細胞はさらに、１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸、例えばＮ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）が補充される。一部の実施形態では、所望のＩＬ－２バリアントのアミノ酸配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１を有するタンパク質をコードする配列の６４位にコドンＡＸＣを含み、Ｘは非天然ヌクレオチドである。一部の実施形態では、細胞はさらに、タンパク質発現プラスミドであっても別のプラスミドであってもよいプラスミドを含み、これは、天然の配列の代わりに、ＡＸＣマッチングアンチコドンＧＹＴを含むＭ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）由来の直交性ｔＲＮＡ遺伝子をコードし、Ｙは、相補的である非天然ヌクレオチドであり、コドン内の非天然ヌクレオチドと同じであっても異なってもよい。一部の実施形態では、コドン内の非天然ヌクレオチドは、アンチコドン内の非天然ヌクレオチドと異なり、かつ相補的である。一部の実施形態では、コドン内の非天然ヌクレオチドは、アンチコドン内の非天然ヌクレオチドと同じである。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチド内の非天然の塩基対を含む第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドは、
Figure 2023546009000067
 に由来し得る。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチド内の非天然の塩基対を含む第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドは、
Figure 2023546009000068
 に由来し得る。一部の実施形態おいて、第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドのトリホスフェートは、
Figure 2023546009000069
 またはそれらの塩を含む。一部の実施形態おいて、第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドのトリホスフェートは、
Figure 2023546009000070
 またはそれらの塩を含む。一部の実施形態では、第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドに由来するｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000071
 に由来する非天然ヌクレオチドを含むコドンを含み得る。一部の実施形態では、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡの非天然ヌクレオチドを含むコドンを認識する非天然ヌクレオチドを含むアンチコドンを含み得る。Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡ内のアンチコドンは、
Figure 2023546009000072
 に由来する非天然ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000073
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000074
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000075
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000076
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000077
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000078
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000079
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000080
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000081
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000082
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000083
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000084
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000085
 に由来する非天然ヌクレオチドを含み、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000086
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000087
 に由来する非天然ヌクレオチドを含み、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000088
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000089
 に由来する非天然ヌクレオチドを含み、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000090
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、
Figure 2023546009000091
 に由来する非天然ヌクレオチドを含み、ｔＲＮＡは、
Figure 2023546009000092
 に由来する非天然ヌクレオチドを含む。宿主細胞は、適切な栄養素を含有する培地中で培養され、（ａ）コドンを有するサイトカイン遺伝子をコードするプラスミドの複製に必須である１つまたはそれ以上の非天然塩基を含むデオキシリボヌクレオシドのトリホスフェート、（ｂ）（ｉ）サイトカインのコード配列に対応しており、かつ１つまたはそれ以上の非天然塩基を含むコドンを含有するｍＲＮＡ、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の非天然塩基を含むアンチコドンを含有するｔＲＮＡの転写に必須の１つまたはそれ以上の非天然塩基を含むリボヌクレオシドのトリホスフェート、ならびに（ｃ）目的のサイトカインのポリペプチド配列中に組み込まれることとなる非天然アミノ酸が補充される。続いて、宿主細胞は、目的のタンパク質の発現を可能にする条件下で維持される。
発現される、結果として生じるＡｚＫ含有タンパク質は、当業者に知られている方法によって精製することができ、その後、当業者に知られている条件の下で、本明細書に開示される所望の平均分子量を有するＰＥＧ鎖を含むＤＢＣＯ等のアルキンと反応させて、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを与えることができる。他の方法が当業者に知られており、例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１７年、５５１巻（７６８２号）：６４４～６４７頁；国際公開第２０１５１５７５５５号；国際公開第２０１５０２１４３２号；国際公開第２０１６１１５１６８号；国際公開第２０１７１０６７６７号；国際公開第２０１７２２３５２８号；国際公開第２０１９０１４２６２号；国際公開第２０１９０１４２６７号；国際公開第２０１９０２８４１９号；および国際公開第２０１９／０２８４２５号に開示されるものがあり、これらのそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
発現される、１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸、例えばＡｚｋを含む、結果として生じるタンパク質は、当業者に知られている方法によって精製することができ、その後、当業者に知られている条件の下で、本明細書に開示される所望の平均分子量を有するＰＥＧ鎖を含むＤＢＣＯ等のアルキンと反応させて、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲートを与えることができる。他の方法が当業者に知られており、例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１７年、５５１巻（７６８２号）：６４４～６４７頁；国際公開第２０１５１５７５５５号；国際公開第２０１５０２１４３２号；国際公開第２０１６１１５１６８号；国際公開第２０１７１０６７６７号；国際公開第２０１７２２３５２８号；国際公開第２０１９０１４２６２号；国際公開第２０１９０１４２６７号；国際公開第２０１９０２８４１９号；および国際公開第２０１９／０２８４２５号に開示されるものがあり、これらのそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
これ以外にも、非天然アミノ酸を含むＩＬ－２ポリペプチドは、ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含み、１つまたはそれ以上のインフレーム直交性（終止）コドンを有する、目的の核酸配列を含む、本明細書に記載される核酸構築物を宿主細胞中に導入することによって調製される。宿主細胞は、適切な栄養素を含有する培地中で培養され、（ａ）新しいコドンおよびアンチコドンを有するサイトカイン遺伝子をコードするプラスミドの複製に必要とされる１つまたはそれ以上の非天然塩基を含むデオキシリボヌクレオシドのトリホスフェート、（ｂ）（ｉ）コドンを含有するサイトカイン配列、および（ｉｉ）アンチコドンを含有する直交性ｔＲＮＡに対応するｍＲＮＡの転写に必要とされるリボヌクレオシドのトリホスフェート、ならびに（ｃ）非天然アミノ酸が補充される。続いて、宿主細胞は、目的のタンパク質の発現を可能にする条件下で維持される。非天然アミノ酸は、ポリペプチド鎖中に非天然コドンに応じて組み込まれる。例えば、１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸は、ＩＬ－２ポリペプチド中に組み込まれる。これ以外にも、２つまたはそれ以上の非天然アミノ酸を、タンパク質内の２つまたはそれ以上の部位にてＩＬ－２ポリペプチド中に組み込んでもよい。
非天然アミノ酸を組み込んでいるＩＬ－２ポリペプチドが宿主細胞内に産生されると、そこから、酵素的溶解、化学的溶解、および／または浸透圧溶解、ならびに物理的破壊が挙げられる、当技術分野において知られている種々の技術によって抽出することができる。ＩＬ－２ポリペプチドは、当技術分野において知られている標準的な技術、例えば分取イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、または当業者に知られている他のあらゆる適切な技術によって精製することができる。
適切な宿主細胞として、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＢＬ２１（ＤＥ３））が挙げられるが、最も適切には、宿主細胞は、真核細胞、例えば、昆虫細胞（例えば、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）等のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）属）、酵母細胞、線虫（例えばＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、マウス（例えばハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞、ヒト２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、およびマウス赤白血病（ＭＥＬ）細胞）、ヒト細胞、または他の真核細胞である。他の適切な宿主細胞が、当業者に知られている。適切には、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞または昆虫細胞である。一部の実施形態では、適切な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む。
本発明の実施形態において通常用いることができる他の適切な宿主細胞は、実施例のセクションに述べられているものである。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術または形質移入技術を介して、宿主細胞中に導入することができる。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」および「形質移入」は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介形質移入、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる、外来の核酸分子（例えばＤＮＡ）を宿主細胞中に導入する種々の十分に認識された技術に言及することが意図される。宿主細胞を形質転換するか、または形質移入するのに適した方法が、当技術分野において周知である。
細胞株を生じさせる場合、通常、安定した細胞株が調製されることが好ましい。例えば哺乳動物細胞の安定した形質移入のために、用いられる発現ベクターおよび形質移入技術に応じて、僅かな細胞しか、そのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込むことができないことが知られている。これらの組み込み体を識別して選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性について）をコードする遺伝子が、通常、目的の遺伝子と共に、宿主細胞中に導入される。好ましい選択マーカーとして、薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与するものが挙げられる。同じベクター上に選択マーカーをコードする核酸分子を宿主細胞中に導入することもできるし、別個のベクター上に選択マーカーをコードする核酸分子を導入することもできる。導入された核酸分子が安定して形質移入された細胞は、薬物選択によって識別することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残ることとなる一方、他の細胞は死亡する）。
一実施形態では、本明細書に記載される構築物は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。安定した組み込みの利点は、個々の細胞間または個々のクローン間で、均一性が達成されるというものである。別の利点は、最も良いプロデューサの選択を実行することができるというものである。したがって、安定した細胞株を生じさせることが所望される。別の実施形態では、本明細書に記載される構築物は、宿主細胞中に形質移入される。宿主細胞中に構築物を形質移入する利点は、タンパク質の収量を最大にすることができるというものである。一態様において、本明細書に記載される核酸構築物またはベクターを含む細胞が記載される。
治療方法
一態様では、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、対象に、（ａ）約１６μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、対象に、（ａ）約２４μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、対象に、（ａ）約３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。
別の態様では、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法で使用するためのＩＬ－２コンジュゲートであって、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む、ＩＬ－２コンジュゲートが本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約１６μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約２４μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。
さらなる態様では、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法のための医薬品を製造するためのＩＬ－２コンジュゲートの使用であって、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む、使用が本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約１６μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約２４μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。
一部の態様では、それを必要とする対象におけるＣＤ８＋および／またはＮＫ細胞を刺激するためのＩＬ－２コンジュゲートの使用であって、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む、使用が本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約１６μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約２４μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、対象に、（ａ）約３２μｇ／ｋｇの本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含む。
がんの種類
一部の実施形態では、がんは、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、古典的なホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性がん、マイクロサテライト安定性がん、胃がん、結腸がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、子宮頸がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、黒色腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、食道がん、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）、グリア芽細胞腫、中皮腫、乳がん、三種陰性乳がん、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、転移性去勢抵抗性前立腺がん、またはＤＮＡダメージ応答（ＤＤＲ）欠損を有する転移性去勢抵抗性前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、中程度から軽度の変異性の腫瘍負荷の腫瘍、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、扁平上皮細胞皮膚がん（ＳＣＳＣ）、低度ＰＤ－Ｌ１発現から非発現の腫瘍、その原発性解剖学的起源部位を超えて肝臓およびＣＮＳに全身的に幡種された腫瘍、ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）から選択される。
一部の実施形態では、対象におけるがんは、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、尿路上皮癌、黒色腫、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、および頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）から選択される。一部の実施形態では、がんは腎細胞癌（ＲＣＣ）である。一部の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、がんは尿路上皮癌である。一部の実施形態では、がんは黒色腫である。一部の実施形態では、がんはメルケル細胞癌（ＭＣＣ）である。一部の実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）である。
一部の実施形態では、がんは固形腫瘍の形態である。一部の実施形態では、がんは、進行性または転移性固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは液体腫瘍の形態である。一部の実施形態では、がんは難治性がんである。一部の実施形態では、がんは再発性がんである。
投与
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、鼻腔内、動脈内、関節内、皮内、硝子体内、骨髄内輸液、腹腔内、または髄腔内投与により、対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、静脈内、皮下、または筋肉内投与により対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、皮下または静脈内投与により対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、静脈内投与により対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、皮下投与により対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、筋肉内投与により対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、静脈内投与により対象に投与される。
ＩＬ－２コンジュゲートは、１回よりも多く、例えば、２回、３回、４回、５回、またはそれよりも多く投与することができる。一部の実施形態では、治療期間は、最大２４か月間、例えば１か月間、２か月間、３か月間、６か月間、９か月間、１２か月間、１５か月間、１８か月間、２１か月間または２４か月間である。一部の実施形態では、治療期間は、最大さらに２４か月間さらに延長される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、ペムブロリズマブの投与とは別々に、対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、対象に順次に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、ペムブロリズマブの対象への投与前に対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、ペムブロリズマブの対象への投与後に対象に投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、対象に同時に投与される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、それを必要とする対象に、約２週毎に１回、約３週毎に１回、または約４週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、それを必要とする対象に、２週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、それを必要としている対象に、３週間に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、それを必要とする対象に、４週間に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、約１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日毎に１回投与される。
一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、約２週毎に１回、約３週毎に１回、または約４週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、２週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、３週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、４週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、約１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日毎に１回投与される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、約２週毎に１回、約３週毎に１回、または約４週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、２週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、３週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、それを必要とする対象に、４週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、約１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日毎に１回投与される。
一部の例では、所望の用量は、単回用量で、または同時に（もしくは短期間において）、もしくは適する間隔をおいて投与される分割された用量として、例えば１日当たり２、３、４個、またはそれを上回るサブ用量として好都合に提供される。
一部の実施形態では、ペムブロリズマブは、３週毎に約２００ｍｇの用量で投与される。
対象
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与は、成人に対するものである。一部の実施形態では、成人は男性である。他の実施形態では、成人は女性である。一部の実施形態では、成人は、少なくとも２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、または９５歳である。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与は、乳児、小児、または青年に対するものである。一部の実施形態では、対象は、少なくとも１月齢、２月齢、３月齢、６月齢、９月齢または１２月齢である。一部の実施形態では、対象は、少なくとも１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、または１９歳である。
一部の実施形態では、対象は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１によって決定される測定可能な疾患（すなわち、がん）を有する。一部の実施形態では、対象は、０または１の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスを有すると決定されている。一部の実施形態では、対象は、医師によって決定される、十分な心血管機能、血液学的機能、肝機能、および腎臓機能を有する。一部の実施形態では、対象は、１２週間以上の平均余命を有すると（例えば、医師によって）決定されている。一部の実施形態では、対象は、最初の治療用量の投与前に以前の抗がん治療を受けていた。
一部の実施形態では、対象は固形腫瘍がんを有する。一部の実施形態では、対象は転移性固形腫瘍を有する。一部の実施形態では、対象は進行性固形腫瘍を有する。一部の実施形態では、対象は難治性がんを有する。一部の実施形態では、対象は再発性がんを有する。
一部の実施形態では、対象は、本明細書に開示されるＩＬ－２コンジュゲート、ＰＥＧ、ペグ化薬物、ペムブロリズマブのいずれに対しても既知の過敏症または禁忌を有さない。
投与の効果
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与は、完全奏功、部分奏功、または安定を提供する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後、対象は、固形腫瘍における免疫関連の応答評価基準（ｉＲＥＣＩＳＴ）によって測定される応答を経験する。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後、対象は、ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１による奏功率（ＯＲＲ）を経験する。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後、対象は、ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１による奏功期間（ＤＯＲ）を経験する。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後、対象は、ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１による無増悪生存期間（ＰＦＳ）を経験する。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後、対象は、ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１による全生存期間を経験する。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後、対象は、ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１による奏功までの期間（ＴＴＲ）を経験する。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後、対象は、ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１による病勢コントロール率（ＤＣＲ）を経験する。これらの実施形態のいずれかでは、対象の経験は、対象の撮影された放射線画像の医師によるレビューに基づく。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に脈管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード２、グレード３、またはグレード４の脈管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード２の脈管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード３の脈管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード４の脈管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に血管緊張の欠如を引き起こさない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に血漿タンパク質および液の血管外スペースへの溢出を引き起こさない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に低血圧および器官灌流の減少を引き起こさない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に好中球機能障害を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に走化性の減少を引き起こさない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に播種性感染のリスク増加に関連しない。一部の実施形態では、播種性感染は、敗血症または細菌性心内膜炎である。一部の実施形態では、播種性感染は、敗血症である。一部の実施形態では、播種性感染は、細菌性心内膜炎である。一部の実施形態では、対象は、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与前に、任意の既存の細菌感染について治療される。一部の実施形態では、対象は、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与前に、オキサシリン、ナフシリン、シプロフロキサシン、およびバンコマイシンから選択される抗菌剤で治療される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象における自己免疫疾患または炎症性障害の既存のまたは初期の提示を悪化させない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象における自己免疫疾患の既存のまたは初期の提示を悪化させない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象における炎症性障害の既存のまたは初期の提示を悪化させない。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、クローン病、強皮症、甲状腺炎、炎症性関節炎、真性糖尿病、眼球重症筋無力症（ｏｃｕｌｏ－ｂｕｌｂａｒ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、半月体ＩｇＡ糸球体腎炎、胆嚢炎、大脳血管炎、スチーブンス－ジョンソン症候群および類天疱瘡から選択される。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、クローン病である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、強皮症である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、甲状腺炎である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、炎症性関節炎である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、真性糖尿病である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、眼球重症筋無力症である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、半月体ＩｇＡ糸球体腎炎である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、胆嚢炎である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、大脳血管炎である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、スチーブンス－ジョンソン症候群である。一部の実施形態では、対象における自己免疫疾患または炎症性障害は、類天疱瘡である。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に精神状態の変化、言語障害、皮質盲、肢または歩行の失調（ｌｉｍｂ ｏｒ ｇａｉｔ ａｔａｘｉａ）、幻覚、撹拌、緩和、または昏睡を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に発作を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、公知の発作障害を有する対象に禁忌でない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に毛細管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード２、グレード３、またはグレード４の毛細管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード２の毛細管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード３の毛細管漏出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象にグレード４の毛細管漏出症候群を引き起こさない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、投与後に対象に平均動脈圧の低下を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に低血圧を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象の収縮期圧のベースライン収縮期圧からの９０ｍｍＨｇまたは２０ｍｍＨｇ未満の低下の体験の原因にならない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に浮腫または腎臓もしくは肝機能の障害を引き起こさない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象に好酸球増加症を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象の１μＬ当たり５００を超える末梢血中の好酸球数の原因にならない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象の１μＬ当たり５００から１５００を超える末梢血中の好酸球数の原因にならない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象の１μＬ当たり１５００から１μＬ当たり５０００を超える末梢血中の好酸球数の原因にならない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象の１μＬ当たり５０００を超える末梢血中の好酸球数の原因にならない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、向精神薬の現行のレジメンにおいて、対象に禁忌でない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、腎毒性、骨髄毒性、心毒性、または肝毒性薬の現行のレジメンにおいて、対象に禁忌でない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、アミノグリコシド、細胞傷害性化学療法、ドキソルビシン、メトトレキサート、またはアスパラギナーゼの現行のレジメンにおいて、対象に禁忌でない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、抗新生物剤を含有する組合せレジメンを受ける対象に禁忌でない。一部の実施形態では、抗新生物剤は、ダカルバジン、シス－プラチナ、タモキシフェンおよびインターフェロン－アルファから選択される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、投与後に対象に１つまたはそれ以上のグレード４の有害事象を引き起こさない。一部の実施形態では、グレード４の有害事象は、低体温；ショック；徐脈；心室性期外収縮；心筋虚血；失神；出血；心房性不整脈；静脈炎；第２度房室ブロック；心内膜炎；心嚢貯留液；末梢性壊疽；血栓症；冠動脈障害；口内炎；悪心および嘔吐；肝機能試験異常；胃腸出血；吐血；血性下痢；胃腸障害；腸穿孔；膵炎；貧血；白血球減少症；白血球増多症；低カルシウム血症；アルカリホスファターゼ増加；血中尿素窒素（ＢＵＮ）増加；高尿酸血症；非タンパク性窒素（ＮＰＮ）増加；呼吸性アシドーシス；傾眠；撹拌；神経障害；妄想反応；痙攣；大発作痙攣（ｇｒａｎｄ ｍａｌ ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎ）；譫妄；喘息、肺性水腫；過換気；低酸素症；喀血；換気低下；気胸；散瞳；瞳孔障害；腎機能異常；腎不全；および急性腎尿細管壊死から選択される。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象の群への投与は、投与後に１％超の対象に１つまたはそれ以上のグレード４の有害事象を引き起こさない。一部の実施形態では、グレード４の有害事象は、低体温；ショック；徐脈；心室性期外収縮；心筋虚血；失神；出血；心房性不整脈；静脈炎；第２度房室ブロック；心内膜炎；心嚢貯留液；末梢性壊疽；血栓症；冠動脈障害；口内炎；悪心および嘔吐；肝機能試験異常；胃腸出血；吐血；血性下痢；胃腸障害；腸穿孔；膵炎；貧血；白血球減少症；白血球増多症；低カルシウム血症；アルカリホスファターゼ増加；血中尿素窒素（ＢＵＮ）増加；高尿酸血症；非タンパク性窒素（ＮＰＮ）増加；呼吸性アシドーシス；傾眠；撹拌；神経障害；妄想反応；痙攣；大発作痙攣；譫妄；喘息、肺性水腫；過換気；低酸素症；喀血；換気低下；気胸；散瞳；瞳孔障害；腎機能異常；腎不全；および急性腎尿細管壊死から選択される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象の群への投与は、投与後に１％超の対象に１つまたはそれ以上の有害事象を引き起こさなく、１つまたはそれ以上の有害事象は、十二指腸潰瘍；腸壊死；心筋炎；上室性頻脈；視神経炎に二次的な永続性または一過性の失明；一過性脳虚血発作；髄膜炎；脳浮腫；心外膜炎；アレルギー性間質性腎炎；および気管食道瘻から選択される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象の群への投与は、投与後に１％超の対象に１つまたはそれ以上の有害事象を引き起こさなく、１つまたはそれ以上の有害事象は、悪性高熱症；心停止；心筋梗塞；肺塞栓；発作；腸穿孔；肝臓または腎不全；自殺に至る重篤なうつ；肺水腫；呼吸停止；呼吸不全から選択される。
一部の実施形態では、対象に対するＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与は、対象においてＣＤ８＋細胞を刺激する。一部の実施形態では、対象に対するＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与は、対象においてＮＫ細胞を刺激する。刺激は、例えば、投与の約４、５、６、もしくは７日後、または投与の約１、２、３、もしくは４週間後に、対象においてＣＤ８＋細胞の数が増加することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、メモリーＣＤ８＋細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、エフェクターＣＤ８＋細胞を含む。刺激は、例えば、投与の約４、５、６、もしくは７日後、または投与の約１、２、３、もしくは４週間後に、対象においてＫｉ６７陽性であるＣＤ８＋細胞の数が増加することを含んでいてもよい。刺激は、例えば、投与の約４、５、６、もしくは７日後、または投与の約１、２、３、もしくは４週間後に、対象においてＮＫ細胞の数が増加することを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後に対象において、少なくとも１．６倍、１．７倍、１．８倍、または１．９倍等、少なくとも１．５倍増殖する。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後に対象において、少なくとも５．５倍、６倍、または６．５倍等、少なくとも５倍増殖する。一部の実施形態では、好酸球は、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後に対象において、少なくとも１．５倍、１．４倍、または１．３倍等、２倍以下しか増殖しない。一部の実施形態では、ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後に対象において、少なくとも１．８倍、１．７倍、または１．６倍等、２倍以下しか増殖しない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与後の、対象におけるＣＤ８＋細胞および／またはＮＫ細胞の増殖は、ＣＤ４＋細胞および／または好酸球の増殖よりも大きい。一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞の増殖は、ＣＤ４＋細胞の増殖よりも大きい。一部の実施形態では、ＮＫ細胞の増殖は、ＣＤ４＋細胞の増殖よりも大きい。一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞の増殖は、好酸球の増殖よりも大きい。一部の実施形態では、ＮＫ細胞の増殖は、好酸球の増殖よりも大きい。増殖倍数は、ＩＬ－２コンジュゲートの投与前に測定されたベースライン値に対して決定される。一部の実施形態では、増殖倍数は、投与の約４、５、６、もしくは７日後、または投与の約１、２、３、または４週間後等、投与後の時点のいずれかで決定される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象の末梢性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数を増加させるが、対象の末梢性ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の数を増加させない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、対象の末梢性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数を増加させるが、対象の末梢性好酸球の数を増加させない。一部の実施形態では、対象にＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを投与すると、対象の末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数が増加するが、対象の腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数は増加することなく、対象の腫瘍内ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の数も増加しない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、集中治療施設、または心肺もしくは集中治療医学における熟練した専門医の利用を必要としない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、集中治療施設、または心肺もしくは集中治療医学における熟練した専門医の利用を必要としない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、集中治療施設の利用を必要としない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの対象への投与は、心肺または集中治療医学における熟練した専門医の利用を必要としない。
一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与は、用量制限毒性を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブの投与は、重度サイトカイン放出症候群を引き起こさない。一部の実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、抗薬物抗体（ＡＤＡ）、すなわちＩＬ－２コンジュゲートに対する抗体を誘導しない。一部の実施形態では、ＡＤＡの誘導の欠如は、ＰＥＧに対する抗体の直接イムノアッセイおよび／またはＩＬ－２コンジュゲートに対する抗体のＥＬＩＳＡにより決定される。ＩＬ－２コンジュゲートは、ＡＤＡの測定レベルがベースライン（治療前）レベルまたは未処置対照のレベルと統計的に区別できない場合、ＡＤＡを誘導しないとみなされる。
追加の薬剤
一部の実施形態では、方法は、ペムブロリズマブに加えて、治療有効量の１つまたはそれ以上の化学療法剤を対象に投与する工程をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の化学療法剤は、１つまたはそれ以上の白金に基づく化学療法剤を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の化学療法剤は、カルボプラチンおよびペメトレキセドを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の化学療法剤は、カルボプラチンおよびナノ粒子アルブミン結合パクリタキセルを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の化学療法剤は、カルボプラチンおよびドセタキセルを含む。一部の実施形態では、対象におけるがんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。
キット／製品
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態では、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の方法および組成物に用いられるキットおよび製品である。そのようなキットは、バイアルおよびチューブ等の１つまたはそれ以上のコンテナを受けるように区画されている、キャリア、パッケージ、またはコンテナを含み、各コンテナは、本明細書に記載される方法に用いられることとなる別個の要素の１つを含む。適切なコンテナの例として、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。一実施形態では、コンテナは、ガラスまたはプラスチック等の種々の材料から形成される。
キットは典型的に、コンテンツおよび／または指示事項を記載する標識、ならびに指示事項を記したパッケージ内の印刷物を含む。また、一セットの指示事項が典型的に含まれることとなる。
一実施形態では、標識は、コンテナ上にあるか、またはコンテナに関連する。一実施形態では、標識は、標識を形成する文字、数字または他の記号がコンテナそれ自体に添付されるか、成形されるか、またはエッチングされる場合、コンテナ上にあり、標識は、例えばパッケージ内の印刷物として、コンテナを保持するレセプタクルまたはキャリア内に存在する場合、コンテナに関連する。一実施形態では、標識は、コンテンツが特定の治療用途に用いられるべきであることを示すために用いられる。また、標識は、例えば本明細書に記載される方法における、コンテンツの使用指示を示す。
特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される化合物を含有する１つまたはそれ以上の単位剤型を含有するパックまたはディスペンサー装置内に示される。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含有する。一実施形態では、パックまたはディスペンサー装置は、投与についての指示事項が付随する。また、一実施形態では、パックまたはディスペンサーは、医薬の製造、使用または販売を管理する政府機関によって処方される形態のコンテナに関連する通知を伴い、当該通知は、ヒト投与または獣医学的投与用の薬物の形態の機関による承認を反映する。そのような通知は、例えば、薬物についての米国食品医薬品局によって承認される標識、または認可された製品内の印刷物である。また、一実施形態では、適合する医薬キャリア内に製剤化される、本明細書で提供される化合物を含有する組成物が、調製され、適切なコンテナ内に入れられ、そして示される症状の治療について標識される。
これらの実施例は、説明を目的とするのみで提供されるものであり、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
ペグ化ＩＬ－２コンジュゲートの調製
本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートを調製するための詳細を含む例示的な方法をこの実施例に提供する。
バイオコンジュゲーション用として採用されたＩＬ－２を、
（ａ）
（ｉ）所望のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、その遺伝子が非天然アミノ酸Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）が組み込まれた所望の位置においてコドンを提供するための第１の非天然塩基対を含有するタンパク質と、
（ｉｉ）Ｍ．マゼイＰｙｌに由来するｔＲＮＡであって、その遺伝子がその天然配列の代わりにマッチングアンチコドンを提供するための第２の非天然のヌクレオチドを含むｔＲＮＡと
をコードする発現プラスミドと、
（ｂ）Ｍ．バルケリ由来のピロリジル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）をコードするプラスミドと、
（ｃ）Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）と、
（ｄ）完全長タンパク質の最初の６５個のアミノ酸残基が削除された、ヌクレオチドトリホスフェートトランスポーターＰｔＮＴＴ２のトランケートされたバリアントと
を使用する、本明細書に開示される方法を使用して、大腸菌において封入体として発現させた。所望のＩＬ－２バリアントのアミノ酸配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｐ６４が本明細書に記載される非天然アミノ酸で置き換えられている、配列番号１を有するタンパク質をコードする配列のコドン６４としてコドンＡＸＣを含有した。Ｍ．マゼイ由来の直交性ｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドは、その天然配列の代わりにＡＸＣマッチングアンチコドンであるＧＹＴ（ただし、Ｙは本明細書に開示されるような非天然ヌクレオチドである）を含んだ。ＸおよびＹを、本明細書に開示されるような非天然ヌクレオチドｄＴＰＴ３およびｄＮａＭから選択した。発現したタンパク質を封入体から抽出し、標準的な手順を使用して再度折り畳んだ後、ＤＢＣＯ媒介式の銅フリークリックケミストリーを使用して、ＡｚＫ含有ＩＬ－２生成物を部位特異的にペグ化し、安定な共有結合性のｍＰＥＧ部分をＡｚＫに連結した。例示的な反応をスキーム１および２に示す（ｎは繰り返しＰＥＧ単位の数を示す）。ＡｚＫ部分とＤＢＣＯアルキニル部分との反応は、１つの位置異性体生成物または位置異性体生成物の混合物をもたらすことができる。
Figure 2023546009000093
Figure 2023546009000094
ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブ投与後のバイオマーカー効果の臨床研究。
ペムブロリズマブと組み合わせた、本明細書に記載されるＩＬ－２コンジュゲートのインビボ投与の免疫学的効果を特徴付けるための研究を実施した。ＩＬ－２コンジュゲートは配列番号２を含み、式中、６４位はＡｚＫ＿Ｌ１＿ＰＥＧ３０ｋＤであり、ＡｚＫ＿Ｌ１＿ＰＥＧ３０ｋＤは、式（ＩＶ）もしくは式（Ｖ）または式（ＩＶ）および式（Ｖ）の混合物ならびに３０ｋＤａの直鎖状ｍＰＥＧ鎖の構造であると定義される。このＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１を含むＩＬ－２コンジュゲートであって、式中、６４位は、式（ＩＶ）もしくは式（Ｖ）または式（ＩＶ）および式（Ｖ）の混合物ならびに３０ｋＤａの直鎖状ｍＰＥＧ鎖の構造により置き換えられているＩＬ－２コンジュゲートであると記述することもできる。このＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１を含むＩＬ－２コンジュゲートであって、式中、６４位は、式（ＸＩＩ）もしくは式（ＸＩＩＩ）または式（ＸＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）の混合物ならびに３０ｋＤａの直鎖状ｍＰＥＧ鎖の構造により置き換えられているＩＬ－２コンジュゲートであると記述することもできる。この化合物を、実施例１に記載の通りに、６４位のプロリンがＮ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジンＡｚＫで置き換えられている配列番号１を有するタンパク質をまず調製する方法を使用して調製した。次いで、ＡｚＫ含有タンパク質を、平均分子量３０ｋＤａを有するメトキシ直鎖状ＰＥＧ基を含むＤＢＣＯとクリックケミストリー条件下で反応させ、続いて標準的手順を使用して精製および製剤化した。
ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを、３０分間にわたってＩＶ注入により３週毎に投与した［Ｑ３Ｗ］。下記のバイオマーカーに対する効果を、安全性および／または効能の代替予測因子として分析した：
好酸球増加症（上昇した末梢好酸球数）：脈管漏出症候群（ＶＬＳ）に関連した細胞（好酸球）のＩＬ－２誘発増殖の細胞代替マーカー；
インターロイキン５（ＩＬ－５）：２型自然リンパ球のＩＬ－２誘発活性化ならびに好酸球増加症および潜在的にＶＬＳにつながるこの化学誘引物質の放出のサイトカイン代替マーカー；
インターロイキン６（ＩＬ－６）：ＩＬ－２誘発サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のサイトカイン代替マーカー；および
インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）：ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞のＩＬ－２誘発活性化のサイトカイン代替マーカー。
以下のバイオマーカーの細胞数に対する効果を、抗腫瘍免疫活性の代替予測因子として分析した。
末梢ＣＤ８＋エフェクター細胞：浸潤すると、潜在的治療応答を誘発する代替マーカーになる末梢のこれらの標的細胞のＩＬ－２誘発増殖のマーカー；
末梢ＣＤ８＋メモリー細胞：浸潤すると、潜在的に持続性の潜在的治療およびメモリー集団の維持を誘発する代替マーカーになる末梢のこれらの標的細胞のＩＬ－２誘発増殖のマーカー；
末梢ＮＫ細胞：浸潤すると、潜在的に急速な治療反応を誘発する代替マーカーになる末梢のこれらの標的細胞のＩＬ－２誘導増殖のマーカー；および
末梢ＣＤ４＋調節性細胞：浸潤すると、免疫抑制ＴＭＥおよびエフェクターベースの治療効果の相殺を誘発する代替マーカーになる末梢のこれらの標的細胞のＩＬ－２誘導増殖のマーカー。
対象は、スクリーニング時に≧１８歳のヒト男性または女性だった。対象はすべて、抗がん療法による治療を以前に受けたことがあり、以下の少なくとも１つを満たしていた：治療関連毒性がＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従ってグレード０もしくは１（脱毛症が予想される）に回復したこと；または治療関連毒性がＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従って少なくともグレード２に回復し、メディカルモニター（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒ）の事前承認を得たこと。最も一般的な腫瘍には、子宮頸がん、頭頸部扁平上皮癌、基底細胞癌、黒色腫、および非小細胞肺がんが含まれていた。
対象は、以下の基準も満たしていた：インフォームドコンセントを提供したこと。Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）のパフォーマンスステータスが０または１であること。治験責任医師が決定して平均余命が１２週間以上であること。進行性および／または転移性固形腫瘍の診断が組織学的または細胞学的に確認されたこと。進行性もしくは転移性固形腫瘍を有する対象が、標準治療を拒否しているか；または臨床的利益をもたらすことになる合理的な標準治療が存在しないか；または標準療法に非耐容性であるか、効果的でないか、もしくはアクセスできないこと。疾患がＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に従って測定可能であること。以下を含む検査パラメーターが適切であること：絶対リンパ球数が正常値下限の≧０．５倍；血小板数≧１００×１０９／Ｌ；ヘモグロビン≧９．０ｇ／ｄＬ（２週間以内に増殖因子または輸血がないこと；ＥＳＡおよびＣＳＦ投与のためには１週間のウォッシュアウトで十分である）；絶対好中球数≧１．５×１０９／Ｌ（２週間以内に増殖因子がないこと）；プロトロンビン時間（ＰＴ）および部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）が正常値上限（ＵＬＮ）の≦１．５倍；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）がＵＬＮの≦２．５倍であること、ただし肝転移が存在する場合はＵＬＮの≦５倍であってもよい；総ビリルビン≦１．５×ＵＬＮ。閉経前の女性および閉経後１２か月未満の女性は、試験治療を開始する前の７日以内に血清妊娠検査が陰性であった。
８μｇ／ｋｇおよび１６μｇ／ｋｇ用量で治療したコホート
Ｑ３Ｗ投与。進行性または転移性固形腫瘍を有し、年齢が４２～７０歳の範囲の成人１０人（男性６人［６０％］、女性４人［４０％］、白人９人［９０％］）が、（ａ）８μｇ／ｋｇ用量ＩＶ Ｑ３Ｗまたは１６μｇ／ｋｇ用量ＩＶ Ｑ３ＷのＩＬ－２コンジュゲートおよびｂ）２００ｍｇ ＩＶ Ｑ３Ｗの用量のペムブロリズマブを順次に少なくとも１サイクル受けた。ここで、および実施例２の全体を通して、薬物質量／ｋｇ対象（例えば、８μｇ／ｋｇ）は、ＰＥＧおよびリンカー質量を除いたＩＬ－２質量を指す。以下の結果は、８μｇ／ｋｇ用量ＩＶ Ｑ３Ｗおよびペムブロリズマブ（４人の対象）または１６μｇ／ｋｇ用量ＩＶ Ｑ３Ｗおよびペムブロリズマブ（６人の対象）を受け、２～１９サイクルの治療を受けた対象に関するものである。
８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを受けた２人の対象では、９か月＋の期間にわたって継続して部分奏功が確認された（ＰＲ；ＰＤ－１ナイーブ基底細胞癌１人、頭頸部扁平上皮癌１人、以前に抗ＰＤ－１を受けていた）。１６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを受けた１人の対象（非小細胞肺がん）は、約６か月間にわたって疾患安定化を示した。６人の対象は疾患進行を示し（６週目評価時）；１人の対象は初期疾患安定化を示した（６週目評価時；その後疾患は進行した）。８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを受けた４人の対象は、投与後ＣＤ８＋Ｋｉ６７発現レベルの増加を示した（１５％～７０％）。
８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを受けた頭頸部扁平上皮癌を有する５９歳の男性１人は、１８サイクルを受け、部分奏功が確認された（８サイクル後に３９％減少；１１サイクル後に４７％減少）。この対象は、以前に２回の抗ＰＤ１治療を含む４系統の全身療法を受けており；抗ＰＤ１治療に対する最も良好な応答は疾患の安定だった。
８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを受けた基底細胞癌を有する５０歳の男性１人は、１７サイクルを受け、部分奏功が確認された（２サイクル後に５０％減少および８サイクル後に８０％減少）。この対象は、以前に手術および放射線療法を受けていた。
免疫感受性腫瘍を有する他の患者における最大腫瘍応答は、黒色腫（２３％および１１％成長）、基底細胞癌（４％成長）、および非小細胞肺がん（１８％低減）であることが見出された。
ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の末梢増殖ピークは、８μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを受けた対象では、平均でベースラインの２．０６倍だった。４人の対象すべてが、ほぼ１００％の投与後ＮＫ細胞Ｋｉ６７発現レベルを示した。対象は、投与後ＮＫ細胞末梢増殖ピークが、３日目に平均でベースラインの６．７３倍だった。ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の末梢増殖ピークは、１６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブを受けた対象では、平均でベースラインの３．７１倍だった。
効能バイオマーカー。末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞数を測定した（図１Ａ～１Ｃ）。一部の対象においては以前の投与の３週間後に、ベースラインを超える延長したＣＤ８＋増殖（例えば、２倍変化以上）が観察された。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞のパーセンテージも測定した（図２）。
末梢ＮＫ細胞数を図３Ａ～３Ｃに示す。一部の対象においては以前の投与の３週間後に、ベースラインを超える延長したＮＫ細胞増殖（例えば、２倍変化以上）が観察された。Ｋｉ６７を発現するＮＫ細胞のパーセンテージも測定した（図４）。
末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞数を図５Ａ～５Ｃに示す。Ｋｉ６７を発現するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージも測定した（図６）。
好酸球数を測定した（図７Ａ～７Ｃ）。測定値は、Ｐｉｓａｎｉら、Ｂｌｏｏｄ １９９１年９月１５日；７８巻（６号）：１５３８～４４頁に報告されるように、ＩＬ－２誘発好酸球増加症を有する患者において一貫して２３２８～１５９５８好酸球／μＬの範囲未満であった。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５、およびＩＬ－６のレベルも測定した（図８Ａ～８Ｄ）。測定値によると、ＩＦＮ－γは誘導されたが、それぞれＶＬＳおよびＣＲＳに関連するサイトカインであるＩＬ－５およびＩＬ－６は、少量誘導されたことが示されている。
８μｇ／ｋｇの用量で投与された、１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を、それぞれ図９Ａおよび図９Ｂに示す。１６μｇ／ｋｇの用量で投与された、１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を、それぞれ図９Ｃおよび図９Ｄに示す。
抗薬物抗体（ＡＤＡ）。各投与サイクル後、治療した対象に由来する試料を抗薬物抗体（ＡＤＡ）についてアッセイした。抗ポリエチレングリコール自己抗体を、直接イムノアッセイにより検出した（検出限界：３６ｎｇ／ｍＬ）。ブリッジングＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＥＬＩＳＡを、４．６６ｎｇ／ｍＬの検出限界を有する標識形態のＩＬ－２コンジュゲートで実施した。加えて、ＣＴＬＬ－２細胞株を使用して、ＩＬ－２コンジュゲートに対する中和抗体についての細胞ベースアッセイを実施し、ＳＴＡＴ５リン酸化を読出し値として用いた（検出限界：６．３μｇ／ｍＬ）。
試料は、２人の患者が２サイクルを受け、他の２人の患者が１０または１１サイクルを受けた４人の対象から各投与サイクル後に収集および分析した。アッセイ特異的カットポイントは、ＩＬ－２コンジュゲートＡＤＡアッセイの場合は１．０９またはそれよりも高い、ＰＥＧ ＡＤＡアッセイの場合は２．０８のシグナル対ネガティブ比であると、アッセイ認定中に決定した。ＩＬ－２コンジュゲートアッセイで陽性結果または未確定結果を示した試料は、試料および対照を確認用バッファー（ブロッキング溶液中１０μｇ／ｍＬのＩＬ－２コンジュゲート）の存在下および非存在下でアッセイする確認試験に供した。ＰＥＧアッセイで陽性結果または未確定結果を示した試料は、試料および対照を確認用バッファー（６％ウマ血清中１０μｇ／ｍＬのＩＬ－２コンジュゲート）の存在下および非存在下でアッセイする確認試験に供した。試料の吸光度シグナルが、検出ステップにおいて、アッセイ認定中に決定されたアッセイ特異的カットポイント（ＩＬ－２コンジュゲートの場合は１４．５％、ＰＥＧの場合は４２．４％）と等しくまたはそれよりも大きく阻害された場合、試料は「確認された」とみなされることになる。ＩＬ－２コンジュゲートまたはＰＥＧに対する確認されたＡＤＡは検出されなかった（データは示さず）。
結果の要約；議論。対象はすべて、投与後ＣＤ８＋Ｋｉ６７発現レベルの上昇を示し（図２）、ＣＤ８＋Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞の末梢増殖は、平均でベースラインの１．９５倍だった。４人の対象はすべて、投与後ＮＫ細胞Ｋｉ６７発現レベルの上昇も示し（図４）、ＮＫ細胞の末梢増殖は３日目では平均でベースラインの６．７３倍だった。ＩＬ－５およびＩＬ－６レベルに意味のある上昇はなかった。
ＡＥは、因果属性にかかわらず、医薬品を投与された臨床調査対象における任意の有害な医学的出来事であった。用量制限毒性を、外的原因のみに明確または明白に関連せず、下記基準の少なくとも１つを満たす治療サイクルの１日目～２９日目（包含的）±１日内に起こるＡＥとして定義した：
・７日間以上続くグレード３好中球減少症（絶対好中球数＜１０００／ｍｍ３＞５００／ｍｍ３）、または任意の期間のグレード４好中球減少症
・グレード３＋発熱性好中球減少症
・グレード４＋血小板減少症（血小板数＜２５，０００／ｍｍ３）
・５日間以上続く、または臨床的に有意な出血を伴うもしくは血小板輸血を要するグレード３＋血小板減少症（血小板数＜５０，０００～２５，０００／ｍｍ３）
・１０日以内に少なくとも１，０００細胞／ｍｍ３の絶対好中球数および少なくとも７５，０００細胞／ｍｍ３の血小板数の回復基準を満たせない
・５日間以上続く任意の他のグレード４＋血液毒性
・胆汁うっ滞または別の原因、例えばウイルス感染もしくは他の薬物の証拠なしにＵＬＮの２倍超のビリルビンと組み合わせたグレード３＋ＡＬＴまたはＡＳＴ（すなわち、Ｈｙの法則）
・前投薬で起こるグレード３輸注関連反応；グレード４輸注関連反応
・体液貯留および肺水腫に関連する低血圧として定義されるグレード３脈管漏出症候群
・グレード３＋アナフィラキシー
・グレード３＋低血圧
・許容される標準治療医療管理開始の７日以内にグレード２未満に回復しないグレード３＋ＡＥ
・グレード３＋サイトカイン放出症候群。
下記例外を非血液学的ＡＥに適用した：
・３日以内に最適な医療管理でグレード２以下に回復するグレード３疲労、悪心、嘔吐、または下痢
・グレード３発熱（２４時間以下にわたる４０℃超によって定義される）
・前投薬なしで起こるグレード３輸注関連反応；その後の投与は前投薬を使用すべきであり、反応が起こる場合、それはＤＬＴであるだろう
・許容される標準治療医療管理（例えば、全身コルチコステロイド療法）開始の７日以内にグレード２以下に回復するグレード３関節痛または発疹
対象が肝臓転移に間接的と考えられるベースラインでグレード１または２のＡＬＴまたはＡＳＴ上昇を有していた場合、グレード３上昇は、ベースラインの３倍以上でなければならず、７日間超続かなければならない。
深刻なＡＥを、下記転帰のいずれかをもたらすいずれかのＡＥとして定義した：死亡；生命を脅かすＡＥ；入院もしくは既存の入院の延長；正常な生活機能を行う能力の持続的もしくは著しい無能状態もしくは実質的な破壊；または先天異常／先天性欠損。死亡をもたらさない、生命を脅かさない、または入院を要さない重要な医学的イベントは、適切な医学的判断に基づいて、対象を危険にさらすおそれがあり、上に列挙した転帰のうちの１つを予防するための医学的または外科的介入を要するおそれがある場合、深刻であると考えられる。このような医学的イベントの例としては、救急処置室もしくは自宅での集中治療を要するアレルギー性気管支痙攣、入院患者の入院をもたらさない血液疾患もしくは痙攣、または薬物依存もしくは薬物乱用の発症が挙げられる。
いずれの用量でも用量制限毒性は報告されず、中止に結び付く治療関連有害事象（ＴＲＡＥ）はなかった。２つのＴＲＡＥが投薬量低減に結び付いた。１６μｇ／ｋｇ用量ＩＶ Ｑ３Ｗで治療された６人の患者のうち３人で、５つの治療関連重篤ＡＥが報告された。
少なくとも９人の対象がＴＲＡＥを経験した。ＳＯＣによる全グレードのうち最も一般的なＴＲＡＥ（＞２人の患者）には、一般・全身障害および投与状態（９／１０）、臨床検査（６／１０人の対象）、代謝および栄養（４／１０）、神経系障害（４／１０）、呼吸器、胸部および縦隔障害（４／１０）、血管障害（３／１０）、皮膚および皮下障害（３／１０）、血液およびリンパ障害、心臓障害、胃腸障害、免疫系障害、感染症および寄生虫症、ならびに筋骨格（２／１０）が含まれていた。優先使用語によるＴＥＡＥを表１に詳述する。
Figure 2023546009000095
治療関連ＡＥは、一過性であり、一般に認められている標準治療で回復した。発熱、低血圧、および低酸素のＡＥは、ＩＬ－５／ＩＬ－６サイトカイン上昇と相関しなかった。累積毒性も、末端器官毒性も、血管漏出症候群も、好酸球増加症も観察されなかった。ＩＬ－５レベルは、検出の最低レベルであったかそれを下まわっていたままだった。１人の対象は、Ｇ２低血圧を示したが、水分補給で回復した。１人の対象は、Ｇ３サイトカイン放出症候群（発熱＋昇圧薬を必要とする低血圧；対象はベースライン起立性低血圧を示した）を示し、用量低減に結び付いた。バイタルサインに対する顕著な影響はなく、ＱＴｃ延長も、他の心臓毒性もなかった。このように、ペムブロリズマブと組み合わせたＩＬ－２コンジュゲートは、有望なＰＤデータを示し、耐容性は概して良好であり、ＴＲＡＥによる中止はなかった。ＩＬ－２コンジュゲートのインビボ半減期は約１０時間であると決定された。全体として、結果は、ＩＬ－２コンジュゲートの非アルファ優先的活性を裏付けるものと考えられ、免疫感受性腫瘍を有する患者において、ペムブロリズマブと組み合わせた場合の許容可能な安全性プロファイル、ならびに有望なＰＤおよび活性の予備的証拠を示している。
２４μｇ／ｋｇ用量で治療したコホート
進行性または転移性固形腫瘍を有する、年齢中央値５１．５歳で、範囲が４６～６６歳である６人の個人（男性［１００％］、４人［６６．７％］の白人））が、２４μｇ／ｋｇ用量Ｑ３ＷのＩＬ－２コンジュゲートを受けた。腫瘍の種類には、肺がん、基底細胞癌、および結腸がんが含まれていた。
各対象を、ａ）２４μｇ／ｋｇの用量で３０分間ＩＶ注入により投与したＩＬ－２コンジュゲート、およびｂ）２００ｍｇの用量でＩＶ投与したペムブロリズマブで順次に治療した。治療は３週毎に［Ｑ３Ｗ］施した。８μｇ／ｋｇおよび１６μｇ／ｋｇ用量のＩＬ－２コンジュゲートでの、上記に記載されるものと同じバイオマーカーに対する効果を、安全性および／または効能の代替予測因子として分析した。こうした研究の対象は、８μｇ／ｋｇおよび１６μｇ／ｋｇ用量で治療した対象と同じ基準を満たしていた。
６人の対象のうち５人（８３．３％）が少なくとも１つのＴＥＡＥを経験し、６人の対象のうち４人（６６．７％）が少なくとも１つのグレード３～４の関連ＴＥＡＥを経験した（グレード３が１人およびグレード４が３人）。グレード３のＡＬＴ／ＡＳＴ上昇が１人（グレード３の低リン血症も有する）、グレード４のリンパ球数減少が３人（グレード３のＡＳＴ／ＡＬＴ上昇、グレード２のＣＲＳを伴うグレード２の高ビリルビン血症－ＤＬＴを有する対象におけるもの）だった。リンパ球数は４８時間で少なくともグレード３に回復した。
２人の対象が関連ＳＡＥを経験した：１人は、ステロイド調整を必要とする副腎機能不全を有する対象におけるグレード１の発熱、１人は、グレード３のＡＳＴ／ＡＬＴ上昇およびＧ２高ビリルビン血症に関連するグレード２のサイトカイン放出症候群（水分およびデキサメタゾンを必要とする発熱および低血圧）。ＤＬＴが１例あった：対象は、グレード２のＣＲＳ（水分補給およびデキサメタゾンを必要とする発熱および低血圧）に関連するグレード２の高ビリルビン血症を伴うグレード３のＡＳＴ／ＡＬＴ上昇を示した。この対象の場合、Ｃ２Ｄ１で用量を低減させた。ＴＥＡＥに起因する投薬中止はなかった。ＴＥＡＥを表２に詳述する。
Figure 2023546009000096
以下の関連事象が報告された：輸液ボーラス、酸素補給、およびデキサメタゾンで管理され、回復にはＣ２Ｄ１での用量低減を必要とした、グレード２のＣＲＳ（発熱、低血圧［ＢＰ９７／５６ｍｍＨｇ］および低酸素血症［ＳｐＯ２ ９２％］）の設定における、グレード３のＡＳＴ／ＡＬＴおよびグレード２のビリルビン（ＤＬＴ）が１件；支持療法および酸素（Ｃ２Ｄ１）を必要とした発熱、悪寒、寒気、および低酸素血症（９２％）の患者１人；アルコール依存症の設定においてＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブに関連すると推定され、他の症状を伴わないグレード３のＡＳＴ／ＡＬＴ（Ｃ２Ｄ８）が１件；ならびにグレード４のリンパ球数減少が３件。
効能バイオマーカー。末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞数を測定した（図１０）。末梢ＮＫ細胞数を図１１に示す。末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞数を図１２に示し、末梢好中球細胞数を図１３に示す。
１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を、それぞれ図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。
サイトカインレベル（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＩＬ－５）を図１５に示す。
このように、ペムブロリズマブと組み合わせたＩＬ－２コンジュゲートは、有望なＰＤデータを示し、耐容性が概して良好であり、ＴＲＡＥによる中止はなかった。全体として、結果は、ＩＬ－２コンジュゲートの非アルファ優先的活性を裏付けるものと考えられ、免疫感受性腫瘍を有する患者において、ペムブロリズマブと組み合わせた場合の許容可能な安全性プロファイル、ならびに有望なＰＤおよび活性の予備的証拠を示している。
３２μｇ／ｋｇ用量で治療したコホート
進行性または転移性固形腫瘍を有する３人の個人が、３２μｇ／ｋｇ用量Ｑ３ＷのＩＬ－２コンジュゲートを受けた。腫瘍の種類には、卵巣癌が含まれていた。
各対象を、ａ）３２μｇ／ｋｇの用量で３０分間ＩＶ注入により投与されるＩＬ－２コンジュゲート、およびｂ）２００ｍｇの用量でＩＶ投与されるペムブロリズマブで順次に治療した。治療は３週毎に［Ｑ３Ｗ］施した。８μｇ／ｋｇおよび１６μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲート用量での、上記に記載されるものと同じバイオマーカーに対する効果を、安全性および／または効能の代替予測因子として分析した。こうした研究の対象は、８μｇ／ｋｇおよび１６μｇ／ｋｇ用量で治療した対象と同じ基準を満たしていた。
３人の対象すべて（１００％）が少なくとも１つのＴＥＡＥを経験し、３人の対象のうち１人（３３．３％）が少なくとも１つのグレード３～４の関連ＴＥＡＥを経験した（グレード４が１人）。グレード４のリンパ球数減少が１例あった（対象はＧ３発熱も示した）。グレード１の発熱および２４時間の入院を必要とするグレード１の頻脈（Ｃ２Ｄ２～Ｃ２Ｄ３）の１つの関連ＳＡＥがあった。これは支持療法で回復した。ＤＬＴはなく、ＴＥＡＥに起因する投薬中止もなかった。ＴＥＡＥを表３に詳述する。
Figure 2023546009000097
効能バイオマーカー。末梢ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞数を測定した（図１６）。末梢ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞数を図１７に示す。
１サイクル後および２サイクル後のＩＬ－２コンジュゲートの平均濃度を、それぞれ図１８Ａおよび図１８Ｂに示す。
サイトカインレベル（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＩＬ－５）を図１９に示す。
このように、ペムブロリズマブと組み合わせたＩＬ－２コンジュゲートは、有望なＰＤデータを示し、耐容性が概して良好であり、ＴＥＡＥによる中止はなかった。全体として、結果は、ＩＬ－２コンジュゲートの非アルファ優先的活性を裏付けるものと考えられ、免疫感受性腫瘍を有する患者において、ペムブロリズマブと組み合わせた場合の許容可能な安全性プロファイル、ならびに有望なＰＤおよび活性の予備的証拠を示している。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示されており説明されているが、そのような実施形態が単なる例として提供されていることは、当業者であれば明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数のバリエーション、変更、および置換を思い付くだろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態に対する様々な代替が本発明の実施で採用されることを理解すべきである。下記の特許請求の範囲が本発明の範囲を画定し、それにより、この特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにこれらの均等物がカバーされることが意図されている。本明細書で引用されたすべての特許および科学文献の開示は、参照によって本明細書にそのまま明示的に組み入れられている。

Claims (47)

  1. それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、（ａ）約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇのＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含み、前記ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（ＩＡ）の構造：
    Figure 2023546009000098
     （式中、
    ＺはＣＨ２であり、Ｙは
    Figure 2023546009000099
     であり；
    ＹはＣＨ２であり、Ｚは
    Figure 2023546009000100
     であり；
    ＺはＣＨ２であり、Ｙは
    Figure 2023546009000101
     であり；または
    ＹはＣＨ２であり、Ｚは
    Figure 2023546009000102
     であり；
    Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
    ｑは１、２、または３であり；
    Ｘは構造：
    Figure 2023546009000103
     を有するＬ－アミノ酸であり；
    Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
    Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
    により置き換えられている、方法。
  2. それを必要とする対象におけるがんを治療する方法で使用するためのＩＬ－２コンジュゲートであって、前記方法は、前記対象に、約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇの前記ＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含み、前記ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（ＩＡ）の構造：
    Figure 2023546009000104
     （式中：
    ＺはＣＨ２であり、Ｙは
    Figure 2023546009000105
     であり；
    ＹはＣＨ２であり、Ｚは
    Figure 2023546009000106
     であり；
    ＺはＣＨ２であり、Ｙは
    Figure 2023546009000107
     であり；または
    ＹはＣＨ２であり、Ｚは
    Figure 2023546009000108
     であり；
    Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
    ｑは１、２、または３であり；
    Ｘは構造：
    Figure 2023546009000109
     を有するＬ－アミノ酸であり；
    Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
    Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
    により置き換えられている、ＩＬ－２コンジュゲート。
  3. それを必要とする対象におけるがんを治療する方法のための医薬品を製造するためのＩＬ－２コンジュゲートの使用であって、前記方法は、前記対象に、約８μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、または３２μｇ／ｋｇの前記ＩＬ－２コンジュゲートおよび（ｂ）ペムブロリズマブを投与する工程を含み、前記ＩＬ－２コンジュゲートは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、式中、Ｐ６４位のアミノ酸は、式（ＩＡ）の構造：
    Figure 2023546009000110
     （式中、
    ＺはＣＨ２であり、Ｙは
    Figure 2023546009000111
     であり；
    ＹはＣＨ２であり、Ｚは
    Figure 2023546009000112
     であり；
    ＺはＣＨ２であり、Ｙは
    Figure 2023546009000113
     であり；または
    ＹはＣＨ２であり、Ｚは
    Figure 2023546009000114
     であり；
    Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
    ｑは１、２、または３であり；
    Ｘは構造：
    Figure 2023546009000115
     を有するＬ－アミノ酸であり；
    Ｘ－１は、先行するアミノ酸残基への結合点を示し；
    Ｘ＋１は、後続するアミノ酸残基への結合点を示す）
    により置き換えられている、使用。
  4. 約８μｇ／ｋｇの前記ＩＬ－２コンジュゲートを前記対象に投与する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法、ＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  5. 約１６μｇ／ｋｇの前記ＩＬ－２コンジュゲートを前記対象に投与する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法、ＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  6. 約２４μｇ／ｋｇの前記ＩＬ－２コンジュゲートを前記対象に投与する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法、ＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  7. 約３２μｇ／ｋｇの前記ＩＬ－２コンジュゲートを前記対象に投与する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法、ＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  8. 前記ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、ＺはＣＨ２であり、Ｙは、
    Figure 2023546009000116
     である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  9. 前記ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、ＹはＣＨ２であり、Ｚは、
    Figure 2023546009000117
     である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  10. 前記ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、ＺはＣＨ２であり、Ｙは、
    Figure 2023546009000118
     である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  11. 前記ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、ＹはＣＨ２であり、Ｚは、
    Figure 2023546009000119
     である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  12. 前記ＩＬ－２コンジュゲートにおいて、前記ＰＥＧ基は、約３０ｋＤａの平均分子量を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  13. 式（ＩＡ）の構造が、式（ＩＶＡ）もしくは式（ＶＡ）の構造を有し、または式（ＩＶＡ）および式（ＶＡ）の混合物：
    Figure 2023546009000120
     （式中、
    Ｗは、約２５ｋＤａ～３５ｋＤａの平均分子量を有するＰＥＧ基であり；
    ｑは１、２、または３である）
    である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  14. 式（ＩＡ）の構造は、式（ＸＩＩＡ）もしくは式（ＸＩＩＩＡ）の構造を有し、または式（ＸＩＩＡ）および式（ＸＩＩＩＡ）の混合物：
    Figure 2023546009000121
     （式中、
    ｎは、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－ＯＣＨ３が約３０ｋＤａの分子量を有するような整数であり；
    ｑは１、２、または３であり；
    波線は、置き換えられていない配列番号１内のアミノ酸残基への共有結合を示す）
    である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  15. ｑは１である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  16. ｑは２である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  17. ｑは３である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  18. 前記対象は固形腫瘍がんを有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  19. 前記対象は転移性固形腫瘍を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  20. 前記対象は進行性固形腫瘍を有する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  21. 前記対象は液体腫瘍を有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  22. 前記対象は難治性がんを有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  23. 前記対象は再発性がんを有する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  24. 前記がんは、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、古典的なホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性がん、マイクロサテライト安定性がん、胃がん、結腸がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、子宮頸がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、黒色腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、食道がん、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）、グリア芽細胞腫、中皮腫、乳がん、三種陰性乳がん、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、転移性去勢抵抗性前立腺がん、またはＤＮＡダメージ応答（ＤＤＲ）欠損を有する転移性去勢抵抗性前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、中程度から軽度の変異性の腫瘍負荷の腫瘍、皮膚扁平上皮細胞癌（ＣＳＣＣ）、扁平上皮細胞皮膚がん（ＳＣＳＣ）、低度ＰＤ－Ｌ１発現から非発現の腫瘍、その原発性解剖学的起源部位を超えて肝臓およびＣＮＳに全身的に幡種された腫瘍、ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）から選択される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  25. ＣＤ８＋細胞は少なくとも１．５倍増殖する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  26. ＮＫ細胞は少なくとも約５倍増殖する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  27. 好酸球は約２倍以下に増殖する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  28. ＣＤ４＋細胞は約２倍以下に増殖する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  29. ＣＤ８＋細胞および／またはＮＫ細胞の増殖は、ＣＤ４＋細胞および／または好酸球の増殖よりも大きい、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  30. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは用量制限毒性を引き起こさない、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  31. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは重度サイトカイン放出症候群を引き起こさない、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  32. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは血管漏出症候群を引き起こさない、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  33. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは、約２週毎に１回、約３週毎に１回、または約４週毎に１回前記対象に投与される、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  34. 前記ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、約２週毎に１回、約３週毎に１回、または約４週毎に１回前記対象に投与される、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  35. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは、薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  36. ペムブロリズマブは、約２００ｍｇの用量で３週毎に投与される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  37. 前記ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、別々に投与される、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  38. 前記ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、順次に投与される、請求項３７に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  39. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは、ペムブロリズマブの前に投与される、請求項３７または３８に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  40. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは、ペムブロリズマブの後に投与される、請求項３７または３８に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  41. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは皮下投与により前記対象に投与される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  42. 前記ＩＬ－２コンジュゲートは静脈内投与により前記対象に投与される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  43. 前記ＩＬ－２コンジュゲートおよびペムブロリズマブは、静脈内投与により前記対象に投与される、請求項１～４０および４２のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  44. 前記対象は基底細胞癌を有する、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  45. 前記対象は扁平上皮癌を有し、場合により、前記扁平上皮癌は頭頸部扁平上皮癌である、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  46. 前記対象は結腸直腸がんを有する、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
  47. 前記対象は黒色腫を有する、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＩＬ－２コンジュゲート、または使用。
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