JP2023544142A - ＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列ならびにその組成物を使用した加齢黄斑疾患を処置する方法 - Google Patents

Abstract

加齢黄斑疾患（ＡＭＤ）の処置を必要とする対象にＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列を含むベクターを投与することを含む、加齢黄斑疾患を処置する方法が、本明細書に開示されている。このベクターは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。ｍｉＲ－１４２の標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはウェットＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはドライＡＭＤである。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年９月３０日に出願された米国出願第６３／０８５，９２２号の出願日の利益を主張する。この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照

本出願と共に出願されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：２４９３－０００５ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：２８ＫＢ；作成日２０２１年９月３０日）で電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野

神経系疾患の処置を必要とする対象にＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列を含むベクターを投与することを含む、加齢黄斑疾患を処置する方法が、本明細書に開示されている。

発明の背景技術
加齢黄斑疾患（ＡＭＤ）は、欧州、米国およびオーストラリアにおける視力喪失の主な原因である。８０歳を超える集団のほぼ３分の２は、ドルーゼンおよびＣＮＶ（中心窩下脈絡膜新生血管）の存在を特徴とする、ウェットつまり滲出型に起因するＡＭＤの徴候を有する。ＡＭＤは、網膜中心部の損傷を特徴とする慢性の進行性疾患である。脈絡毛細管、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、およびブルッフ膜（加齢に典型的）の変化がＡＭＤの発病機序の根底にある；しかしながら、病理学的プロセスにおける典型的な加齢性変化の伝達を開始させる機構は知られていない。光受容体の死滅および不可逆的な視力の喪失は、ＲＰＥおよび脈絡膜の病理学的変化の結果となる。最近の研究は、アポトーシスだけでなく、自己貪食および壊死シグナル伝達カスケードも網膜細胞の細胞死に関与することを実証した（Ｔｅｌｅｇｉｎａ ２０１７）。

疾患の「ドライ」および「ウェット」型は分類される。約９０％の症例がＡＭＤの「ドライ」萎縮型である；今日、その処置方法はない。ＡＭＤの「ドライ」型では、ドルーゼンが黄斑領域で診断され、色素の再分布が起こり、色素上皮および脈絡毛細管層の欠陥が現れ、ＲＰＥ細胞萎縮のバックグラウンドに対して光受容体の死滅が起こる。「ウェット」（滲出）型は、ＡＭＤ患者の約１０％で発症し、網膜色素上皮下または神経上皮下のブルッフ膜の欠損を通して新たに生成される血管が内部に伸びることを特徴とする。新たに生成される血管の透過性の増加は、網膜浮腫、滲出、ならびに硝子体および網膜での出血をもたらす（これが最終的に視力喪失の理由になる）。

現在、レーザー誘発性ブルッフ膜光凝固モデルが、最も広く受け入れられており、最も頻繁に使用される実験的マウスＣＮＶモデルである。本明細書に記載のモデルは、脈絡膜から網膜下腔への新しい血管の成長につながるブルッフ膜のレーザー衝撃破裂からなり、ヒトＡＭＤの滲出型の主な特徴を模倣し、トランスジェニックマウスの大きなパネルを使用によりＣＮＶの分子機構を探索する機会を提供する。このモデルは、全身または局所（眼内）投与による新薬の有効性を試験するのに適していることが証明されており、例えば血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）トラップまたはアネコルターブアセテートを用いて、ＡＭＤ患者における薬物効果の予測値を示した（Ｔｅｌｅｇｉｎａ ２０１７）。

網膜の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をブロックすることによって間接的な抗血管新生を提供する３つの主な薬物がある。ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ；Ｎｏｖａｒｔｉｓにより世界的に商品化）は、新生血管ＡＭＤの処置に対して２００６年に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｚｉｍｂｒｏｎ ２０１８）。それは、高親和性でＶＥＧＦ－Ａを標的とし結合する組換えヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１カッパアイソタイプモノクローナル抗原結合断片（Ｆａｂ）である。アフリベルセプト（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ；Ｂａｙｅｒ ＡＧにより世界的に商品化）は２０１１年にＦＤＡによって承認された。それは、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２の２つの重要な結合ドメインとヒトＩｇＧ１の結晶可能断片（Ｆｃ）領域とを組み合わせた融合タンパク質である。最後に、ベバシズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｒｏｃｈｅにより世界的に商品化）は、すべてのＶＥＧＦアイソフォームに結合しブロックする完全長ヒト化抗体である。

酸化ストレスはアポトーシスを引き起こす可能性があり、これはマクロファージを活性化および動員し、炎症を誘発し得る。アポトーシスは、ＣＮＶモデルにおける脈絡膜炎症、したがって血管新生のトリガーの１つであり得る（Ｄｕ ２０１３）。

ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、多因子アポトーシス遺伝子であるＡＩＭＰ２の代替的な拮抗的スプライシングバリアントである。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＡＩＭＰ２の機能を妨げることによって細胞アポトーシスを抑制することが公知である。ＡＩＭＰ２の競合的阻害剤として作用するＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＴＲＡＦ２のユビキチン化／分解の阻害によりＴＮＦ－α媒介性アポトーシスを抑制する。さらに、既に肺癌誘導因子としてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が確認されていることが報告されており、既存の研究では、癌細胞に広く現れるＡＩＭＰ２－ＤＸ２がＡＩＭＰ２の癌抑制機能を妨害することによって癌を誘導することが確認された。さらに、正常細胞におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２の現れは、細胞の癌化を進行させるのに対して、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２の現れの抑制は、癌の成長を抑制し、それによって処置効果を発揮することを発見した。
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、神経系疾患の処置に有用であり得ることも明らかにされている（ＫＲ１０－２０１５－０１４０７２３（２０１７）およびＵＳ２０１９／０２９８８５８（２０１９年）。

Telegina, D. V., O. S. Kozhevnikova, and N. G. Kolosova. "Molecular mechanisms of cell death in retina during development of age-related macular degeneration." Advances in Gerontology 7.1 (2017): 17-24. Hernaendez-Zimbroen, Luis Fernando, et al. "Age-related macular degeneration: new paradigms for treatment and management of AMD." Oxidative medicine and cellular longevity 2018 (2018). Du, Hongjun, et al. "JNK inhibition reduces apoptosis and neovascularization in a murine model of age-related macular degeneration." Proceedings of the National Academy of Sciences 110.6 (2013): 2377-2382.

発明の概要
加齢黄斑疾患（ＡＭＤ）の処置を必要とする対象において加齢黄斑疾患を処置する方法であって、薬学的有効量の、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはウェットＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはドライＡＭＤである。

組換えベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列をさらに含み得る。

ベクターは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターまたはオプシンプロモーターである。

ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側であり得る。

いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。

いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。

ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５のうちの１～１７個の追加の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列はＡＣＴＴＴＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７のうちの１～１５個の追加の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

ｍｉＲ－１４２標的配列は、本明細書に開示されているベクターにおいて２～１０回繰り返され得る。

ベクターはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、トリ肉腫／白血病（ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、単純ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスのベクターであり得る。

いくつかの実施形態では、組換えベクターは、対象に対して、局所的に、硝子体内注射によって、結膜下注射によって、または対象の網膜下腔に投与される。

本明細書に開示されている方法は、追加の治療剤を対象に投与することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブである。
図面の簡単な説明

図１は、例示的な組換えベクターを示す。

図２は、インビトロ環境下での組換えベクターの神経細胞特異的発現を示す。

図３は、ｍｉＲ１４２－３ｐＴの４回繰返し（下線）を有するｍｉＲ１４２－３ｐＴ（標的）配列（配列番号６）を示す。

図４Ａは、１×、２×、および３×繰返しならびに変異を有するｍｉＲ１４２－３ｐＴの概略図を示す。図４Ｂは、ｍｉＲ－１４２－３ｐＴの１×、２×、および３×繰返しによる、ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害を示す。

図５は、コア結合配列がＤＸ２阻害において重要であることを示す。ＤＸ２の有意な阻害を示したＴｓｅｑ ｘ３繰返し（図４Ｂ）を有するベクターおよびＤＸ２構築物を対照として使用した。１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐ処置は、Ｔｓｅｑ ｘ３ベクターを有意に阻害したが、ＤＸ２および変異配列は阻害されなかった。

図６Ａ～図６Ｃは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２およびバリアントのアミノ酸配列の比較である（図６Ｂおよび図６Ｃは、図６Ａの続きである）。 同上。 同上。

図７は、ＣＮＶマウスモデルにおけるＤＸ２の予防力である。ｓｃＡＡＶ２－ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２による処置後のレーザー光凝固部位のフルオレセイン血管造影およびインドシアニングリーン血管造影画像。ウイルス注射レーザー誘発性ＣＮＶの２１日後。

図８は、脈絡膜新生血管面積の比較である。ＧＦＰ対照およびＤＸ２で処置した場合の漏れ面積対ＣＮＶ面積の比。漏れ面積は、ＦＡを使用して全過蛍光面積を測定することによって推定し、ＣＮＶ面積は、ＩＣＧＡを使用して計算した。ＤＸ２での処置によるＣＮＶ面積の変化。測定した全イソレクチンＢ４体積に基づいてＣＮＶ体積を計算した。各群について、ｎ＝１２、^＊Ｐ＜（０．０５）。

図９は、レーザー誘発性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）マウスモデルにおけるＶＥＧＦの発現である。ＣＮＶマウスモデルにおけるＶＥＧＦ発現のウエスタンブロット結果およびＶＥＧＦ倍数変化。ＶＥＧＦ倍数変化をＩｍａｇｅ Ｊによって測定した。各群について、ｎ＝６、^＊Ｐ＜（０．０５）。

図１０は、網膜の断面組織学（Ｈ＆Ｅ染色）である。

図１１Ａ～図１１Ｅは、組織学的網膜厚の組織学的測定である。図１１Ａは、網膜の厚さである。図１１Ｂは、ＲＰＥ（網膜色素上皮）の厚さである。図１１Ｃは、ＯＮＬ（光受容体の外顆粒層）の厚さである。図１１Ｄは、外節の厚さである。図１１Ｅは、ＯＰＬ外網状層）の厚さである。すべての試料は、厚さ１０μｍの視神経を含む切片から得た。網膜へのＤＸ２遺伝子のトランスフェクションは、神経網膜の総厚のリカバリーをもたらした（図１１Ａ）。ＤＸ２のトランスフェクションは、より厚いＲＰＥ層（図１１Ｂ）および光受容体の外節層（図１１Ｃ）を示し、ＤＸ２の発現がＲＰＥ変性および光受容体の繊毛分解を防止することを示した。ＤＸ２のトランスフェクションはまた、より厚い光受容体の外顆粒層（図１１Ｄ）および外網状層（図１１Ｅ）を示し、ＤＸ２の発現が光受容体変性を低減させることを示した。 同上。

図１２は、ＲＰＥ（網膜色素上皮）の完全性および増殖である。ＤＸ２遺伝子のトランスフェクションは、ＲＰＥの増殖を活性化することによってＲＰＥの完全性のリカバリーをもたらした。

図１３は、ＰＲ（光受容体）のリカバリーである。ＤＸ２遺伝子のトランスフェクションは、ＰＲの増殖を活性化することによってＰＲ集団のリカバリーをもたらした。

図１４Ａ～図１４Ｂは、ＲＰＥおよびＰＲの細胞増殖である。Ｋｉ６７の発現を測定して、ＲＰＥおよび光受容体層の増殖を分析した。ＲＰＥ（図１４Ａ）および光受容体の外節層（図１４Ｂ）の増殖は、ＡＡＶ２－ＤＸ２でトランスフェクトされた試料において有意に高かった。

図１５Ａ～図１５Ｆは、網膜の機能的リカバリーである。ＡＡＶ２－ＤＸ２をトランスフェクトした試料の網膜電図は、正常ＥＲＧグラフフォーマットの再獲得の増加を示した（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。ＡＡＶ２－ＤＸ２のトランスフェクションは、ドライＡＭＤモデル（ｍｄｍ１－／－）または陰性対照（ｍｄｍ１－／－＋ＡＡＶ－ＧＦＰ）と比較して、ａ波の振幅の増加（図１５Ｃ）およびレイテンシーの減少（図１５Ｄ）を示し、ＤＸ２の発現が光受容体の電気生理学的機能および視力の損傷を軽減することを示した。ＡＡＶ２－ＤＸ２をトランスフェクトした試料は、ｂ波の振幅（図１５Ｅ）およびレイテンシー（図１５Ｆ）を変化させなかった。 同上。 同上。

発明の詳細な説明
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、多因子アポトーシス遺伝子であるＡＩＭＰ２（アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ複合体相互作用多機能タンパク質２）の代替的な拮抗的スプライシングバリアントである。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＡＩＭＰ２の機能を妨げることによって細胞アポトーシスを抑制することが公知である。

ＡＩＭＰ２の競合的阻害剤として作用するＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＴＲＡＦ２のユビキチン化／分解の阻害によりＴＮＦ－α媒介性アポトーシスを抑制する。

また、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２が神経系疾患を処置できることも明らかになっている（ＵＳ２０１９／０２９８８５８ Ａ１）。

ＡＩＭＰ２－ＤＸ２をアデノ随伴ウイルスに挿入し、結果生じたものを網膜下腔に導入すると、脈絡膜新生血管を効果的に阻害することも明らかにされている。

加齢黄斑疾患（ＡＭＤ）の処置を必要とする対象において加齢黄斑疾患を処置する方法であって、薬学的有効量の、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはウェットＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはドライＡＭＤである。

ＡＭＤに罹患している対象の眼または眼の周辺領域における血管漏出を減少させる、脈絡膜新生血管領域を減少させる、脈絡膜新生血管形成を減少させる、またはＶＥＧＦ発現を減少させる方法であって、薬学的有効量の、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。

本明細書に開示されている組換えベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列をさらに含み得る。ベクターは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣａＭＫＩＩプロモーター、Ｈｂ９プロモーター、またはオプシンプロモーターである。

本明細書に開示されている方法において、いくつかの実施形態では、組換えベクターは、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子およびｍｉＲ－１４２標的配列を含む。ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側であり得る。本明細書に記載のベクターは、神経系細胞でＡＩＭＰ２－ＤＸ２を発現することができるが、白血球およびリンパ系細胞などの造血細胞では発現できない。

ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチド（配列番号２）は、ＡＩＭＰ２（例えば、配列番号１２のａａ配列；例えば、配列番号３のｎｔ配列）のスプライスバリアントであり、ＡＩＭＰ２の第２のエクソン（配列番号１０；配列番号４のｎｔ配列）が省かれている。いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有し、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチドのバリアントまたはアイソフォームも公知であり、当業者によって決定することができる（例えば、配列番号１３～１９を参照）。例えば、図６Ａ～図６Ｃは、ＡＩＭＰ２（配列番号２）およびバリアント、配列番号１３～１９、ならびにＡＩＭＰ２またはＡＩＭＰ２－ＤＸ２のコンセンサスまたはコア配列（配列番号２０）の比較を示す。

いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、またはその中の同一性％の任意の範囲にあるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。

ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、またはその中の同一性％の任意の範囲にあるヌクレオチド配列を含み得る。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。

ｍｉＲ－１４２標的配列（ｍｉＲ－１４２Ｔ）は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５のうちの１～１７個の追加の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５に示されるように、ＡＣＡＣＴＡと、ＡＣＡＣＴＡの５’側または３’側に連続する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の追加のヌクレオチドとの合計とを含むヌクレオチド配列を含み得る。

ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ；ｍｉＲ－１４２－３ｐＴ）に対して少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一なヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。

ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＴＴＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７のうちの１～１５個の追加の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７に示されるように、ＡＣＴＴＴＡと、ＡＣＴＴＴＡの５’側または３’側に連続する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の追加のヌクレオチドの合計とを含むヌクレオチド配列を含み得る。

ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ；ｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）に対して少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一なヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７のヌクレオチド配列を含み得る。

例示的なｍｉＲ１４２－３ｐＴの変異配列：
ＣｃｇｃｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃａｇｔｇｃｃａｇｃｃａａｔｇｔｇｃａｇａｇｇｔｇｇａｔｇａｇｇｔｃｔｔｇｔｇａａａａｃｃｔｇｇｃｔｃｃｔｔｔｔａａｃａｃｇｇｃｃｃｔｃａａｇｃｔｃｃｔｔａａｇｔｇａｃｃａｇａａｇｃｔｔｇｃｔａｇｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａｔｃａｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａｇａｔａｔｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａｔｃａｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａａａｇｃｔｔｇｔａｇｇｇａｔｃｃｇｃｃ（配列番号：２５）である。

変異配列は、以下のように置換されているｍｉＲ１４２ ３ｐＴのコア配列の１つまたはそれを超える領域、例えば４つの領域を指す：（５’－ＡＡＣＡＣＴＡＣ－３’→５’－ＣＣＡＣＴＧＣＡ－３’）。ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＤＸ２の発現の阻害が、ｍｉＲ１４２－３ｐ ｘ１繰返し（１００ｐｍｏｌ）ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列により観察され、ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列におけるコア結合配列の数が増大するにつれて、ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害も増大した。Ｔｓｅｑ ｘ３コア配列含有ベクターは有意な阻害を示したが、変異型の３ｘ配列については阻害が観察されなかった。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御するように機能する非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子内の相補的配列、すなわちｍｉＲＮＡ標的配列との塩基対形成により機能する。ｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に結合し、それらの翻訳を負に制御するか、またはｍＲＮＡ分解を引き起こし得る。現在、２０００を超えるヒトｍｉＲＮＡが同定されており、ｍｉＲｂａｓｅデータベースが公に利用可能である。多くのｍｉＲＮＡは、組織特異的な様式で発現し、組織特異的な機能および分化を維持することにおいて重要な役割を有する。

ｍｉＲＮＡは、遺伝子の転写後段階で作用し、哺乳動物の場合、遺伝子発現の約６０％がｍｉＲＮＡによって制御されることが公知である。ｍｉＲＮＡは、生体内の多様なプロセスにおいて重要な役割を果たし、癌、心障害および神経関連障害との相関を有することが開示されている。例えば、ｍｉＲ－１４２には、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１４２－５ｐが存在し、そのいずれ標的配列も使用することができる。したがって、「ｍｉＲ－１４２」または「ｍｉＲＮＡ－１４２」は、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐを指し、ｍｉＲ－１４２標的配列、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐＴまたはｍｉＲ－１４２－５ｐＴに結合することができる。

ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して５’側または３’側であり得る。

例えば、「ｍｉＲ－１４２－３ｐ」は、その遺伝子の転座がアグレッシブＢ細胞白血病において起こる領域に存在することができ、造血組織（骨髄、脾臓、胸腺など）において発現することが公知である。さらに、ｍｉＲ－１４２－３ｐは、胎児マウスの肝臓（マウスの造血組織）における発現が確認され、造血系の分化に関与していることが公知である。

いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列は、少なくとも２～１０回、少なくとも２～８回、少なくとも２～６回、少なくとも４回、またはその任意の範囲もしくは回数繰り返される。

一例として、例えば、配列番号２３のヌクレオチド配列を有するｍｉＲ－１４２－３ｐは、対応する標的配列、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列を有するがこれに限定されないｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列（ｍｉＲ－１４２－３ｐＴ）を有し得る。例えば、配列番号２４のヌクレオチド配列を有するｍｉＲ－１４２－５ｐは、対応する標的配列、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列を有するがこれに限定されないｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列（ｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）を有し得る。

いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐは、配列番号２３のヌクレオチド配列を有し得、ｍｉＲ－１４２－５ｐは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有し得る。

ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列および／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列（それぞれｍｉＲ－１４２－３ｐＴおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）をＡＩＭＰ２－ＤＸ２の末端に挿入し、ＣＤ４５由来細胞、特にリンパ系および白血球におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２発現の抑制を制御することによって、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２バリアントの過剰発現の副作用を制御することができる組換えベクターが、本明細書に開示されている。したがって、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２バリアントの発現は、注射された神経系細胞および組織のみに制限され得るが、注射された組織領域の主要な集団である非神経系造血細胞では制限され得ない。ｍｉＲ１４２－３ｐは、造血細胞においてのみ発現する。

ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列を含む組換えベクターが、本明細書に開示されている。エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子ならびにｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列を含む組換えベクターが、本明細書に開示されている。

「組換えベクター」という用語は、適切な宿主細胞において標的タンパク質またはＲＮＡとして発現され得るベクター、および挿入された遺伝子が適切に発現されることを可能にするために必須な作動可能に連結された制御因子を含む遺伝子構築物を指す。

「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現の制御配列と、標的タンパク質およびＲＮＡをコードして一般的な機能を発揮する核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、それは、プロモーターをコードする核酸配列および核酸配列の作動性のために連結されたタンパク質またはＲＮＡの発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動可能な連結は、当該技術領域で周知であり、領域特異的なＤＮＡ切断および連結のために当該技術領域で一般的に公知な酵素を使用する遺伝子組換え技術を使用することによって製造することができる。

組換えベクターは、本明細書に開示されているように、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣａＭＫＩＩプロモーター、Ｈｂ９プロモーター、またはオプシンプロモーターである。

組換えベクターは、外因性プロモーターおよびプロモーターに作動可能に連結された外因性遺伝子をさらに含み得る。

本明細書で使用される「外因性遺伝子」は、生物学的に適切な活性化を有するタンパク質またはポリペプチド、および免疫原もしくは抗原タンパク質もしくはポリペプチド、または処置活性化タンパク質もしくはポリペプチドなどの標的産物の暗号化配列を含み得る。

ポリペプチドは、宿主細胞における内因性タンパク質の発現の欠損または欠如を補い得る。遺伝子配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせを含む多様な供給元から誘導され得る。遺伝子配列は、天然イントロンを含むかまたは含まないゲノムＤＮＡを含み得る。さらに、ゲノムＤＮＡは、プロモーター配列またはポリアデニル化配列と共に取得され得る。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、様々な方法で取得され得る。ゲノムＤＮＡは、当該領域で公に知られた方法により、適切な細胞から抽出および精製され得る。あるいは、ｍＲＮＡを使用して、逆転写または細胞から分離することによる他の方法によってｃＤＮＡを産生することができる。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列に相補的な配列、例えばアンチセンスＲＮＡ配列を含み得、アンチセンスＲＮＡを個体に投与して、個体の細胞における相補的ポリヌクレオチドの発現を抑制することができる。

例えば、外因性遺伝子は、エクソン２を喪失したＡＩＭＰ－２スプライシングバリアントであり、ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列は、外因性遺伝子の３’ＵＴＲに連結され得る。ＡＩＭＰ２タンパク質（３１２ａａバージョン：ＡＡＣ５０３９１．１またはＧＩ：１２１５６６９；３２０ａａバージョン：ＡＡＨ１３６３０．１、ＧＩ：１５４８９０２３、ＢＣ０ １３６３０．１）の配列は、文献（３１２ａａバージョン：Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９（２），３２９－３３４（１９９５）／３２０ａａバージョン：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｅ １５，０００ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６），１６８９９－１６９０３（２００２））に記載されている。

「ＡＩＭＰ２スプライシングバリアント」という用語は、エクソン１～４のうちのエクソン２の部分的または全体的な喪失に起因して生成されるバリアントを指す。したがって、バリアントは、ＡＩＭＰ２タンパク質およびヘテロ二量体を形成することによるＡＩＭＰ２の正常な機能の妨害を意味する。注射されたＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、注射された組織以外の組織ではほとんど発現されない。しかしながら、さらなる安全対策として、ｍｉＲ１４２標的配列を挿入して、注射された組織領域における非神経系細胞の主要な集団である造血細胞においてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が発現される可能性を完全にブロックすることが可能である。

組換えベクターは、配列番号１および５を含み得る。

ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する「配列相同性の％」、「同一性％」または「同一％」という用語は、例えば、２つの最適に配置された配列を比較ドメインと比較することによって確認することができ、比較ドメイン内のヌクレオチド配列のいくつかは、２つの配列（付加または欠失を含まない）の最適な配置で参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。

本明細書に開示されているタンパク質は、その天然型アミノ酸配列を有するものだけでなく、バリアントのアミノ酸配列を有するものも含む。

タンパク質のバリアントは、天然アミノ酸配列と１個以上のアミノ酸残基との欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換またはそれらの組み合わせに起因する異なる配列を有するタンパク質を意味する。全体として分子の活性化を改変しないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該領域で知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。

タンパク質またはそのバリアントは、天然抽出、合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５６、１９６３）またはＤＮＡ配列に基づく遺伝子組換え（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、２^ｎｄ Ｅｄ．、１９８９）によって製造され得る。

アミノ酸変異は、親水性、疎水性、電荷およびサイズなどのアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいて起こり得る。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および種類の分析によれば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは正電荷を有する残基；アラニン、グリシンおよびセリンは同様のサイズを有する；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは類似の形状を有することが理解され得る。したがって、このような考察に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、生物学的に機能的等価物とみなすことができる。

１つまたはそれを超える変異の導入では、アミノ酸の疎水性指標が考慮され得る。疎水性指標は、疎水性度および電荷に従って各アミノ酸に割り当てられる：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。

タンパク質の相互作用的な生物学的機能を割り当てる際に、疎水性アミノ酸指標は非常に重要である。類似の疎水性指標を有するアミノ酸で置換が行われる場合にのみ、類似の生物学的活性化を有することが可能である。疎水性指標を参照して変異を導入する事例では、疎水性指標の差が±２以内、±１以内、または±０．５以内であるアミノ酸間の置換。

一方、同様の親水性値を有するアミノ酸間の置換は、同等の生物学的活性化を有するタンパク質を誘導できることも周知である。米国特許第４，５５４，１０１号に示されるように、以下の親水性値が各アミノ酸残基に割り当てられる：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。

親水性値を参照して１つまたはそれを超える変異を導入する事例では、親水性値の差が±２以内、±１以内、または±０．５以内であるがこれらに限定されないアミノ酸間で置換を行うことができる。

分子の活性化を全体的に改変しないタンパク質のアミノ酸交換は、当該領域で知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙを含むアミノ酸残基間のものである。ベクター系は、当該業界で発表されている多様な方法によって構築され得る。具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。

本明細書に開示されているベクターは、クローニングまたは発現のための典型的なベクターとして構築され得る。さらに、ベクターは、宿主として原核または真核細胞を用いて構築され得る。ベクターが発現ベクターであり、原核細胞が宿主として使用される場合、転写を実行するための強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、１ｐｐプロモーター、ｐＬ Ｘプロモーター、ｐＲＸプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、デコード開始のためのリボソーム結合部位および転写／デコード終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５ａなど）を使用する場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．（１９８４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８：１０１８－１０２４）、ファージＸのレフト指向性プロモーター（ｐＬＸプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．およびＨａｇｅｎ，Ｄ．（１９８０）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３９９－４４５）をコントロール部位として使用することができる。

一方、使用され得るベクターは、ウイルスベクター、線状ＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡなどの１種以上であり得る。

「ウイルスベクター」は、遺伝子または遺伝物質を所望の細胞、組織および／または器官に送達することができるウイルスベクターを指す。

ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血病）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウイルス）、および単純ヘルペスウイルスで構成される群から選択される１種以上を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。

レトロウイルスは、宿主細胞のゲノムに対する組込み機能を有し、人体に対して無害であるが、組込み時に正常細胞の機能を抑制すること、多様な細胞に感染する能力、容易な増殖、およそ１～７ｋｂの外部遺伝子を収容すること、および複製欠損ウイルスを生成することを含む特徴を有し得る。しかしながら、レトロウイルスはまた、有糸分裂後の細胞への感染の困難さ、インビボ条件下での遺伝子送達、およびインビトロ条件下で体細胞を増殖させる必要性を含む欠点を有し得る。さらに、レトロウイルスは、癌原遺伝子に組み込まれ得、それによって細胞壊死の可能性を呈するので、自然変異のリスクを有する。

一方、アデノウイルスは、中程度のサイズの細胞の核内であっても複製すること、臨床的に無毒であること、外部遺伝子を挿入されたとしても安定であること、遺伝子の再編成や喪失がないこと、真核生物の形質転換、および宿主細胞の染色体に組み込まれても安定に高レベルで発現することを含む、クローニングベクターとして様々な利点を有する。アデノウイルスの良好な宿主細胞は、ヒトにおける造血、リンパ系および骨髄腫の原因である細胞である。しかしながら、線状ＤＮＡであり、ウイルスの感染率が低いことに伴い、感染したウイルスをリカバーすることは容易ではないため、増殖は困難である。さらに、送達された遺伝子の発現は１～２週間の間に最も大規模であり、発現は一部の細胞においてのみ３～４週間にわたって持続される。別の課題は、高い免疫抗原性を有することである。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、前述の問題を補完することができ、遺伝子治療剤として多くの利点を有するため、近年好まれている。これは、アデノサテライトウイルスとも呼ばれる。アデノ随伴ウイルス粒子の直径は２０ｎｍであり、人体に対してほとんど害がないことが公知である。したがって、欧州での遺伝子治療剤としての販売が承認された。

ＡＡＶは、複製のために補助ウイルスを必要とする一本鎖でのプロウイルスであり、ＡＡＶゲノムは、感染した細胞の１９番染色体の特定の領域に挿入され得る４，６８０ｂｐを有する。導入遺伝子は、各々１４５ｂｐの２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列セクションおよびシグナル配列セクションによって接続された血漿ＤＮＡに挿入される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐセクションを発現する他のプラスミドＤＮＡと共にトランスフェクションが実行され、アデノウイルスは補助ウイルスとして添加される。ＡＡＶは、遺伝子を送達する広範囲の宿主細胞、反復投与時の免疫学的副作用がほとんどない、および遺伝子発現期間が長いという利点を有する。さらに、ＡＡＶゲノムが宿主細胞の染色体に組み込まれたとしても、宿主の遺伝子発現を改変または再編成せずに安全である。

アデノ随伴ウイルスは、合計４つの血清型を有することが公知である。標的遺伝子の送達に使用され得る多くのアデノ随伴ウイルスの血清型の中で、最も広く研究されているベクターはアデノ随伴ウイルス血清型２であり、現在、嚢胞性線維症、血友病およびカナバン病の臨床遺伝子の送達に使用されている。さらに、近年、癌遺伝子治療の領域において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の将来性が高まっている（Ｄｕ ２０１３）。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス血清型２を使用することができる。適切なウイルスベクターを選択して適用することは可能であるが、これに限定されない。

さらに、ベクターが発現ベクターであり、宿主として真核細胞を使用する場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：ポストアデノウイルスプロモーター、ワクチンウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶ ＴＫプロモーター）が使用され得る。具体的には、レトロウイルスのＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターおよびオプシンプロモーターで構成される群から選択されるプロモーターで構成される群から選択される１種以上を含み得るが、これらに限定されない。さらに、それは一般に、転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。

本明細書に開示されているベクターは、タンパク質の精製をより容易にするために必要に応じて他の配列と融合され得る。例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）、６ｘＨｉｓ（ヘキサヒスチジン；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などの融合した配列を使用することができるが、これらに限定されない。さらに、発現ベクターは、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンを含む選択マーカーとして当該業界で一般的に使用される抗生物質に対する耐性遺伝子を含み得る。

さらに、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐなどのｍｉＲ－１４２それぞれの標的配列（ｍｉＲ－１４２－３ｐＴおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）を含む組換えベクターを含む遺伝子キャリアが本明細書に開示されている。

「遺伝子導入」という用語は、一般に転写および発現のための細胞への遺伝物質の送達を含む。その方法は、タンパク質発現および処置目的に対して理想的である。ＤＮＡトランスフェクションおよびウイルス形質導入などの多様な送達方法が発表されている。それは、送達される遺伝子の高い送達効率および高レベルの発現、ならびに必要に応じて自然環境に優しいことまたはシュードタイピングによって特定の受容体および／または細胞型を標的化する可能性に起因するウイルス媒介性遺伝子導入を意味する。

遺伝子キャリアは、組換えベクターに形質転換された形質転換体であり得、形質転換には、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するすべての方法が含まれ、当該領域で発表されているように、宿主細胞に従って適切な標準技術を選択し実行することが可能である。そのような方法には、エレクトロポレーション、プロトプラズムの融合、リン酸カルシウム（ＣａＰ０_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、シリコーンカーバイド繊維の使用との混合、アグリバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストランおよびリポフェクタミンなどが含まれるが、これらに限定されない。

遺伝子キャリアは、ニューロンにおける外因性遺伝子の発現を目的とする。したがって、それはＣＤ４５由来細胞における外因性遺伝子の発現を抑制し、脳組織における外因性遺伝子の発現を増加させ得る。ＣＤ４５の大部分は、造血細胞に位置する膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼである。細胞は、細胞表面に位置する分子に従って定義され得、ＣＤ４５は、すべての白血球群およびＢリンパ球の細胞マーカーである。遺伝子キャリアは、ＣＤ４５由来細胞、特にリンパ系および白血球の範囲の細胞では発現されない。

遺伝子キャリアは、薬理学的に使用され得るキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含み得る。

さらに、組換えベクターを対応する実体に導入する段階を含む、外因性遺伝子をニューロンに送達および発現する方法が、本明細書に開示されている。

方法は、脳の組織における外因性遺伝子の発現を増加させ、他の組織における外因性遺伝子の発現を制御し得る。

さらに、１）プロモーター；２）作動を可能にするようにプロモーターと連結された標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および３）ヌクレオチド配列の３’ＵＴＲに挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐを標的とするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含むベクターが、本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、１）プロモーター；２）作動を可能にするようにプロモーターと連結された標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および３）ヌクレオチド配列の３’ＵＴＲに挿入されたｍｉＲ－１４２－５ｐを標的とするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み得る。

「発現カセット」という用語は、標的タンパク質をコードする遺伝子ならびにプロモーターおよびシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むので、シグナルペプチドの下流に作動可能に連結された標的タンパク質の産生および分泌のための発現を実行することができる単位カセットを指す。分泌発現カセットは、分泌系と混合して使用され得る。標的タンパク質の効率的な産生を補助し得る多様な因子が、そのような発現カセットの内外に含まれ得る。

さらに、エクソン２を喪失したＡＩＭＰ－２スプライシングバリアントをコードするヌクレオチド配列、およびヌクレオチド配列の３’ＵＴＲに連結されたｍｉＲ－１４２－３ｐを標的とするヌクレオチド配列を含む、ＡＭＤのための予防用または治療用製剤が、本明細書中に開示されている。

したがって、本明細書に開示されているベクターのいずれかを投与することを含む、それを必要とする対象のＡＭＤを処置する方法も本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはウェットＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤはドライＡＭＤである。

本明細書に開示されているベクターは、限定されないが、アポトーシスの阻害、ジスキネジアの改良、および／または酸化ストレスの阻害をもたらし、したがってＡＭＤを予防または処置することができる。

「処置」という用語は、ＡＭＤの完全な処置だけでなく、本明細書に開示されている薬理学的薬剤の適用の結果としてのＡＭＤの全体的な症候の部分的な処置、改善および／または低減も含む。

「予防」という用語は、本明細書に開示されている薬理学的薬剤を変性脳障害の実体に適用することによって、認知障害、行動障害および脳神経の破壊などの症候または現象を抑制またはブロックすることにより、ＡＭＤの全体的な症候の発生を事前に予防することを意味する。

活性成分以外のアジュバントは、本明細書に開示されている薬理学的薬剤に追加して含めることができる。アジュバントは、当該技術領域において公知のものである限り制限なく使用することができるが、例えばフロイントの完全および不完全アジュバントをさらに含むことにより、免疫力を高めることができる。

本明細書に開示されている薬理学的薬剤は、活性成分を薬理学的に許容される担体と混合した様式で製造され得る。ここで、薬理学的に許容される担体には、薬理学の領域で一般的に使用される担体、賦形剤および希釈剤が含まれる。本明細書に開示されている薬理学的薬剤に使用され得る薬理学的に許容される担体には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マリトール、スターチ、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に開示されている薬理学的薬剤は、それぞれの一般的な製造方法に従って、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、およびエアゾール剤などの経口投与用、ならびに外用、坐薬、または消毒注射液剤などを含む種々な様式で製造されることによって使用され得る。

製剤に製造される場合、一般的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤および界面活性剤などの、希釈剤または賦形剤を製造に使用することができる。経口投与用の固形製剤には、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤が含まれ、これらの固形製剤は、スターチ、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、およびゼラチンなどの１種以上の賦形剤を活性成分と混合することにより製造され得る。さらに、単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの潤滑剤も使用され得る。経口投与用の液体製剤には、一般的に使用されている希釈剤である水および流動パラフィン以外に、保湿剤、甘味剤、香味・保存剤などの各種賦形剤を含む懸濁液剤、内服用液剤、油剤、およびシロップ剤などが含まれる。非経口投与用の製剤には、滅菌水溶液、非水溶媒、懸濁剤、油剤、凍結乾燥剤および坐剤が含まれる。非水溶媒および懸濁溶液として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびオリーブ油などの植物油、エチレートなどの注射用エステルが使用され得る。坐剤用の薬剤には、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、ツイーン（ｔｗｅｅｎ（登録商標））６１、カカオ油、ラウリン油およびグリセロゼラチンなどが含まれる。

本明細書に開示されている薬理学的薬剤は、多様なチャネルを介して実体に投与され得る。経口投与、ならびに静脈内、筋肉、皮下および腹腔内注射などのすべての投与様式が使用され得る。

いくつかの実施形態では、組換えベクターは、対象に対して、局所的に、硝子体内注射によって、結膜下注射によって、または対象の網膜下腔に投与される。

本明細書に開示されている方法は、追加の治療剤を対象に投与することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ラニビズマブ、アフリベルセプト、および／またはベバシズマブである。

本明細書に開示されている治療剤の投与の望ましい用量は、製剤の生産方法、投与様式、患者の年齢、体重および性別、疾患の症候の程度、食事、投与期間、投与経路、排出速度および反応感受性などを含む様々な要因に応じて異なる。それにもかかわらず、それは対応する製造業者によって適切に選択され得る。

しかしながら、処置効果について、熟練した医師は、標的化した処置のための有効用量を決定し、処方することができる。例えば、処置薬剤には、静脈内、皮下および筋肉注射、ならびにマイクロニードルを使用した脳室または脊髄への方向注射が含まれる。複数回の注射および反復投与が可能であり、例えば、有効用量は、ベクターの場合は０．０５～１５ｍｇ／ｋｇ、組換えウイルスの場合は５×１０^１１～３．３×１０^１４ウイルス粒子（２．５×１０^１２～１．５×１０^１６ＩＵ）／ｋｇ、細胞では５×１０^２～５×１０^７細胞／ｋｇである。望ましくは、用量は、ベクターの場合は０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、組換えウイルスの場合は５×１０^１２～３．３×１０^１３粒子（２．５×１０^１３から１．５×１０^１５ＩＵ）／ｋｇ、細胞の場合は５×１０^３～５×１０^６細胞／ｋｇであり、週に２～３回の投与レートである。用量は厳密には制限されない。むしろ、患者の症状および神経性障害の現れの程度に従って修正され得る。他の皮下脂肪および筋肉注射ならびに患部への直接投与のための有効用量は、９×１０^１０～３．３×１０^１４の組換えウイルス粒子であり、１０ｃｍ間隔で週に２～３回のレートである。用量は厳密には制限されない。むしろ、患者の症状および神経性障害の現れの程度に従って修正され得る。より具体的には、本明細書に開示される薬理学的薬剤は、１×１０^１０～１×１０^１２ｖｇ（ウイルスゲノム）／ｍＬの組換えアデノ随伴ウイルスを含み得、一般に、２週間にわたって２日に１回、１×１０^１２ｖｇを注射することが賢明である。それは、１日１回投与され得るか、または１日を通して数回の投与のために用量を分割することによって投与され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、０．１×１０^８ｖｇ～５００×１０^８ｖｇ、１×１０^８ｖｇ～１００×１０^８ｖｇ、１×１０^８ｖｇ～１０×１０^８ｖｇ、例えば５×１０^８ｖｇ、またはそれに由来する任意の範囲の用量で投与され得る。ＩＶ注射の場合、例えば、ＩＶ注射用の体重に基づいて、ｖｇをヒト用の用量に変換することができる。局所組織注射の場合、例えば、標的細胞数および有効ＭＯＩ（感染多重度）に基づいて、ｖｇをヒト用の用量に変換することもできる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、例えば網膜下注射、硝子体内注射、または脈絡膜下注射によって対象に注射され得る。注射は液体の形態であり得る。他の実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、点眼剤または軟膏の形態で対象に投与され得る。

薬理学的製剤は、経口および非経口投与可能な多様な様式で生産され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、脳または脊髄に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、定位注射によって脳に投与され得る。

経口投与薬剤には、丸剤、錠剤、硬質および軟質カプセル、液剤、懸濁液剤、油剤、シロップ剤および顆粒剤などが含まれる。これらの薬剤は、活性成分に加えて、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン）および流動促進剤（ｇｌｙｄｅｎｔｓ）（例：シリカ、タルクならびにステアリン酸およびそのマグネシウムもしくはカルシウム塩、ならびに／またはポリエチレングリコール）を含み得る。さらに、丸剤は、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、スターチペースト、ゼラチン、トラガカンチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリジンなどの結合剤を含有し得、状況に応じて、スターチ、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩または同様の混合物などの崩壊剤および／あるいは吸収剤、着色剤、香味剤および甘味料を含有し得る。薬剤は、一般的な混合、造粒またはコーティング法によって製造され得る。

ざらに、注射剤は、非経口投与される製剤の代表的な形態である。そのような注射剤用の溶媒には、水、リンガー液、等張性生理食塩水および懸濁液が含まれる。注射剤の滅菌固定油を溶媒または懸濁媒体として使用することができ、モノ－およびジ－グリセリドを含む任意の非刺激性固定油をそのような目的のために使用することができる。さらに、注射剤は、オレイン酸などの脂肪酸を使用することができる。

以下の実行例を使用して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の実行例は、発明の内容を特定する目的のためだけであって、本発明の適用をその例に限定するものではない。

実施例
実施例１．組換えベクターの作製
ＣＤ４５の大部分は、造血細胞の膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼであり、細胞表面の分子に従って細胞を定義するために使用され得る。ＣＤ４５は、すべての白血球群およびＢリンパ球のマーカーである。ＣＤ４５由来細胞、特にリンパ系および白血球細胞において発現されず、ニューロンにおいてのみ特異的に発現される組換えベクターが作製されている。組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ複合体相互作用多機能性タンパク質２（ＡＩＭＰ２）のエクソン２が欠失したスプライシングバリアント、およびＡＩＭＰ２スプライシングバリアントの発現を制御することができるｍｉＲＮＡを含む。

注射された神経系組織においてＡＩＭＰ２スプライシングバリアントの特異的発現を誘導するために、組換えベクターを分布の安全対策として作製した。また、これは、注射された組織領域における非神経系細胞の主要な集団である造血細胞においてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が発現される可能性を完全にブロックするために行われた。
実施例１．１．ＡＩＭＰ２バリアントの作製

ＡＩＭＰ２は、アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）の形成に関与するタンパク質の１つであり、多因子アポトーシスタンパク質として作用する。ＡＩＭＰ２のエクソン２が欠失したバリアントを発現するプラスミドを構築するために、ＡＩＭＰ２スプライシングバリアントのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃにクローニングした。Ｈ３２２ ｃＤＮＡに結合したＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１リンカーを有するプライマーを使用してＡＩＭＰ２スプライシングバリアントを増幅した後、ＥｃｏＲｌおよびＸｈｏ１を使用してｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃにサブクローニングを実行した。

配列番号１のヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するＡＩＭＰ２バリアントを使用した。
実施例１．２．ｍｉＲＮＡの選別およびその標的配列の選択

上記のように、分布の安全対策として、注射された神経系細胞におけるＡＩＭＰ２バリアントの発現を限定し、注射された組織領域における非神経系細胞の主要な集団である造血細胞においてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が発現される可能性を完全にブロックするために、組換えベクターを上記のように作製した。

この目的のために、白血球およびリンパ系関連細胞を生成する造血細胞においてのみ特異的に発現されるｍｉＲ－１４２－３ｐを標的として選択した。ｍｉＲ－１４２－３ｐのみを標的とする配列を作製するために、マウスＢ細胞のマイクロアレイデータおよびｍｉＲ^－１４２－３ｐが標的とする遺伝子のコンピュータプログラミング（ｍｉｒＳＶＲスコア）を使用した。ｍｉＲ－１４２－３ｐは、配列番号で示されるヌクレオチド配列である。配列番号５であるｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列はｍｉＲ－１４２－３ｐに結合する。

ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列には、Ｎｈｅ１およびＨｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂｍｔ１部位配列（ｃｃａｇａａｇｃｔｔｇｃｔａｇｃ；配列番号２１）およびＨｉｎｄ Ｈ部位配列（ａａｇｃｔｔｇｔａｇ；配列番号２２）が含まれる。ｍｉＲ－１４２－３ｐＴは、それらを接続するリンカー（ｔｃａｃおよびｇａｔａｔｃ）を用いて４回繰り返された配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る（図４；配列番号６）。
実施例１－３．組換えベクターの作製

組換えベクターを作製するために、ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列（配列番号５）をＡＩＭＰ２バリアント（配列番号１）の３’ＵＴＲに挿入した。ＡＩＭＰ－２バリアントおよびｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列の接続は、塩基配列番号６で示され、具体的には、Ｎｈｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を使用して切断および挿入された。組換えベクターを図１に示す。
実施例２．インビトロでの組換えベクターの神経細胞特異的発現の確認

ｍｉＲ１４２－３ｐは造血細胞においてのみ特異的に発現するため、組換えベクターのｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列の発現によるＡＩＭＰ２バリアントのノックダウンにより、特定の細胞におけるＡＩＭＰ２バリアントの発現の程度を確認した。

具体的には、組換えベクターの処置を行わない群（ＳＨＡＭ）、空／対照ベクターで処理された群（ＮＣベクター）、単一ＡＩＭＰ２バリアントベクターで処理された群（ｐｓｃＡＡＶ＿ＤＸ２）および組換えベクターで処置された群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐＴ）があった。すべてのベクターの濃度はｕｇ／ｕｌの単位であり、各群を２．５ｕｌ（２．５ｕｇ）で処置した。各処置群において、ＡＩＭＰ２バリアントのノックダウンを確認しながら、ＴＨＰ－１細胞株（ヒト単球性白血病細胞）およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株（神経芽細胞腫）に対して処置を行った。ｑＰＣＲは、下記表１のプライマーを使用して実行した（１５秒間の変性、６０℃の温度下で３０秒間の４０サイクルにわたるアニーリングおよび伸長）。
表１

その結果、ＳＨＡＭおよびＮＣベクター群ではＡＩＭＰ２バリアントが発現しないことが確認された。さらに、単一ＡＩＭＰ２バリアントベクターで処理された群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２）のＴＨＰ－１細胞株およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株の両方で発現が確認され、それによって神経細胞特異的発現が誘導されないことが確認された。一方、組換えベクターで処置された群では、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株においてのみＡＩＭＰ２バリアントが特異的に発現することが確認された（図２）。
実施例３．材料および方法
実施例３．１．ｑＲＴ－ＰＣＲ

全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、脊髄から単離した。抽出されたＲＮＡを分光光度計（ＡＳＰ－２６８０、ＡＣＴｇｅｎｅ、ＵＳＡ）によって定量化のために、定量した。ｃＤＮＡを作製するために、逆転写を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルにより行った。得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用したリアルタイムＰＣＲに使用した。２－ΔΔＣｔ統計解析には二連での結果の発現データを使用し、正規化にはＧＡＤＰＨ発現を使用した。
実施例３－２．ｍｉＲ１４２－３ｐ阻害実験

ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ－１４２－３ｐ阻害は、ｘ１ ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列から観察することができた。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して、ｘ１、ｘ２、およびｘ３繰返しｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列ベクター、加えて１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐで一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡの量をＰＣＲによって分析した。ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害は、Ｔｓｅｑ ｘ１繰返しｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列から観察された（図４Ｂ）。
実施例４
実施例４．１．コア結合配列の阻害効果のために作成した３種類のベクター

Ｔｓｅｑ ｘ１は１つのコア結合配列を含み、Ｔｓｅｑ ｘ２は２つのコア結合配列を含み、Ｔｓｅｑ ｘ３は３つのコア結合配列を含む（図４Ａ）。

ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ（１００ｐｍｏｌ）阻害は、ｘ１繰返しｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列から観察され始めた。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して、ｘ１、ｘ２、およびｘ３繰返しｍｉＲ－１４２－３ｐ Ｔｓｅｑベクター、加えて１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐで一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡ量をＰＣＲによって分析した。ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列におけるコア結合配列の数が増加すると、ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害も増大した。Ｔｓｅｑ ｘ３コア配列を含むベクターは有意な阻害を示した（図４Ｂ）。
実施例４－２．コア配列変異．

マウスＢ細胞マイクロアレイデータおよびｍｉＲ－１４２－３ｐ標的遺伝子のｍｉｒＳＶＲスコアを使用して、コア配列を予測した。コア配列の４つの領域を以下のように置換した：（５’－ＡＡＣＡＣＴＡＣ－３’→５’－ＣＣＡＣＴＧＣＡ－３’）（オリジナル配列については図３、模式図については図４Ａを参照）。
実施例４．３．コア結合配列は、重要なＤＸ２阻害である。

４つのコア配列を置換した（図４Ａ）。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して、ＤＸ２－ｍｉＲ－１４２－３ｐ Ｔｓｅｑ ｘ３繰返しベクター（Ｔｓｅｑ３ｘ）またはコア配列変異型ベクター（ｍｕｔ）、および１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐで一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡの発現をＰＣＲによって分析した。ＤＸ２の有意な阻害を示したＴｓｅｑ ｘ３繰返しベクター（図４Ｂ）およびＤＸ２構築物を対照として使用した。１００ｐｍｏｌのｍｉＲ１４２－３ｐ処置は、Ｔｓｅｑ ｘ３ベクターを有意に阻害したが、ＤＸ２およびｍｕｔ配列は阻害されなかった（図５）。

実施例５．ウェットＡＭＤマウスモデル

材料および方法

５－１．動物実験

動物を、特定の病原体のない条件下および一定の環境条件下（２１℃～２３℃の温度、５０～６０％の湿度および１２時間の明／暗サイクル）で個々のケージに収容した。各群のマウスの左眼（Ｏｃｕｌａｒ ｓｉｎｉｓｔｅｒ）（ＯＳ、左眼）はＡＡＶ－ＧＦＰで処置し、右眼（Ｏｃｕｌａｒ Ｄｅｘｔｅｒ）（ＯＤ、右眼）はＡＡＶ－ＤＸ２で処置した（注射：５×１０^８ｖｇ）。網膜下注射の１週間および１０週間後、レーザー光凝固装置を使用し、眼底のＲＰＥ層はレーザーを誘導して、それぞれ３週間、３ヶ月のウェットＡＭＤモデルを作成する。レーザー処置の２週間、２ヶ月後、マウスの眼球を単離する。

５－１－１．網膜下注射は、以下のプロトコルを使用して行った。

齧歯動物を麻酔する。イソフルラン吸入を通じた１００ｍｇ／ｍｌのケタミンおよび１０ｍｇ／ｍｌのキシラジン（２０μｌ／１０ｇ体重）の腹腔内注射の使用。その足の一方を挟むことによって、動物が深く麻酔されていることを確実にする。フリンチする場合は、さらに数分待って、網膜下注射を開始する前に再度試みる。注射される眼が天井に向くように、齧歯動物をその姿勢で置く。解剖用顕微鏡下で、皮膚を穏やかに引き伸ばして、眼がソケットからわずかに上に飛び出すようにし（一時的な突出）、頭を耳のすぐ上の２本の指で保持し、顎によってよりアクセス可能になり、皮膚を瞼に平行に穏やかに引き伸ばして、眼がソケットからわずかに上に飛び出すようにする。３８Ｇ滅菌マイクロチップ針（ＩＮＣＹＴＯ、ＫＲ）、リンバスの直下に、針で水晶体に触れるのを避けるような角度で穴を開ける。頭部の把持を維持しながら、使い捨ての鋭利な針を眼から引き抜く。予め装填されたブラント針付きシリンジをマイクロマニピュレータに取り付けるか、またはそれを手で保持した後、ブラント針付きシリンジの先端を穴を通して挿入し、再度水晶体に触れないように注意し、抵抗を感じるまで非常に穏やかに眼に押し込む。すべての動きを最小限に保ち、慎重にウイルスを網膜下腔にゆっくり注射する。ＡＡＶ２－ＧＦＰをＯＳ（左）に注射した。ＡＡＶ２－ＤＸ２をＯＤ（右）に注射した。シリンジをゆっくりと引き抜く。保湿用点眼液をさして、眼の潤いを保つ。再び腹ばい姿勢になるまで動物をモニターし続ける。

５－１－２．以下のプロトコルを使用して、マウスレーザー誘発性ＣＮＶモデルを得た。

マウスへの誘発性レーザーの前に、レーザーおよび細隙灯を容易にアクセスできる場所に配置する。レーザーをオンにし、所定のパラメータに設定する。齧歯動物を麻酔する。イソフルラン吸入を通じた１００ｍｇ／ｍｌのケタミンおよび１０ｍｇ／ｍｌのキシラジン（２０μｌ／１０ｇ体重）の腹腔内注射の使用。マウスを横にし、局所麻酔のために１滴（約３０μｌ）のテトラカイン塩酸塩を各眼に入れる。溶液が効果を発揮するまで２分間待つ。

瞳孔拡張のために１滴の局所トロピカミドで前のステップを繰り返す。あるいは、拡張のためにフェニレフリン塩酸塩（２．５％）を使用する。適切な時間が経過した後、速やかにマウスをマウスステージ上に載せ、ステージを細隙灯のチンレスト上に載置する。細隙灯を最も弱い光の明るさで点灯し、瞳孔拡張の程度をチェックする。瞳孔が十分に拡張していない場合（約２．５～３ｍｍ）、マウスを動物加温器に戻し、待つ。あるいは、別の１滴のトロピカミドを投与する。眼が十分に拡張したら、レーザー手順に進む。

視神経の視覚化のために理想的な配置となるように、マウスステージ上のマウスの場所を調整する。マウスをそのホルダ上に向け、マウスが細隙灯ビームに対して垂直になるように水平に寝かせ、頭部を一方の側にし、尾部を他方の側にする。

マウスをわずかに回転させ、頭部がレーザーオペレーターにより近づくように約１７０°の角度にする。

マウスを理想的に配置した後、２５ｍｍ×２５ｍｍのガラス製カバースリップ上に１滴の人工涙液を置く。１滴の人工涙液をマウスの反対側の眼に置く－これにより、眼が確実に潤い、白内障形成の遅延に役立つ。

親指および人差し指の間でカバースリップの角を保持する；ガラスが両方の指の先端の間で圧迫されるような位置。支持および手の安定化のために、残りの３本の指を動物の体に優しく巻き付ける。ガラス製カバースリップをマウスの眼に容易に置くことができるように手を配置する。安定した配置が得られたら、ガラス製カバースリップをマウスの眼の上に慎重に（人工涙の液滴は依然として付着した状態で）押す。レーザービームの散乱または反射を防止するために、カバースリップがレーザービームに対して可能な限り垂直に配置されていることを確認する。カバースリップは、角膜を平らにするためのコンタクトレンズとして作用する。網膜が視覚化され得るまで、細隙灯を通してフリーハンドで見てフォーカスを切り替える。網膜は、視覚化された位置に応じて淡黄色／赤色を有し、明確な赤色の血管が可視化され得る。視神経を視覚化するまで、マウスの頭部および／またはカバースリップをゆっくりと慎重に操作する。視神経は黄色になり、そこから複数の血管が放射状に広がる。オペレーターが視神経の視覚化を確認したら、レーザー集束ビームをオンにする。レーザービームがオンになったら、レーザー集束ビームを所望の位置（視神経から約１ディスク直径）に移動させる。レーザービームを眼底のＲＰＥに集束させる。最も鋭く最も鮮明なレーザービームを有することによって、適切な集束が達成される。照準ビームが楕円形または焦点が合っていないように見える場合、細隙灯のフォーカスを切り替えるか、ガラス製カバースリップを再配置する。照準ビームがＲＰＥに集束すると、レーザーのフットトリガを使用してレーザー投光を開始する。レーザー投光直後の気泡の出現に注意する。レーザーショットの輪郭は明確であり、決してかすんではならない。すべての所望のＣＮＶ位置について前の３つのステップを繰り返す（通常、視神経の周りの３、６、９、および１２時のクロックポジションで）。

各レーザーショット投光の位置および結果、ならびに眼に対する各投光ショットの結果（成功、かすみ、出血など）をノートブックに記録する。使用しないときは、レーザーを確実にスタンバイモードにする。必要に応じて、安定化のために反対の手および新しいカバースリップを使用して、マウスの他の眼に対して前のすべてのステップを繰り返す。すべての所望のレーザーショットが投光された後、レーザーおよび細隙灯をオフにする。

カバースリップを捨て、麻酔からのリカバリーのためにマウスを加温器に置く。負傷がないかどうかを肉眼で（ａｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ）検査し、１滴の人工涙液を入れて眼の潤いを保ち、将来の白内障の発症を潜在的に予防する。マウスが麻酔からリカバーしたら、ケージに戻す。

５－１－３．フルオレセイン血管造影法

角膜および水晶体の除去後、眼を４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）で２時間固定した。ＲＰＥ／脈絡膜／強膜の後眼杯を切開し、硝子体を除去した。後眼杯を（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７またはＦＩＴＣ）コンジュゲートされたイソレクチンＢ４（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に４℃で一晩インキュベートして、浸潤している脈絡膜血管を標識した。

５－１－４．血管新生因子の発現

細胞を回収し、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を含有するＰＢＳで溶解した。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェルにロードし、ニトロセルロース膜フィルタに１００Ｖで２時間転写した。膜を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）を用いて室温で１時間ブロックし、抗ＶＥＧＦおよび抗βアクチン抗体を用いて室温で１時間プローブした。膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、続いて二次抗体と共に室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、免疫反応性バンドを検出した。データを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量化した。
実施例５－２．結果

ｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２で処置されたマウスは、レーザー誘発性脈絡膜新生血管を減弱させる。

レーザー誘発性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）は、ウェットＡＭＤに対して広く使用される動物モデルである。このモデルでは、レーザーを使用してブルッフ膜を乱し、下にある脈絡膜血管が色素上皮の下の空間に侵入し成長することを可能にする。５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１２）にｓｃＡＡＶ２－ＧＦＰ（対照）またはｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２の網膜下注射を行った（０日目）。注射の２１日後、レーザー光凝固によってＣＮＶを生成した（２１日目）。レーザー処置の１４日後、フルオレセイン血管造影およびＩＣＧ血管造影を行った（３５日目）。翌日、マウスを屠殺し、脈絡膜フラットマウントを作製し、（ＦＩＴＣ）コンジュゲートされたイソレクチンＢ４で染色した（図７）（３６日目）。新しい血管形成によって引き起こされる血管漏出が、フルオレセイン血管造影によってレーザー誘発性光凝固部位で明確に観察された。ＩＣＧ血管造影を使用して脈絡膜の血管造影図を取得する。フラットマウントを使用して、明確に画定されたイソレクチン陽性ＣＮＶの存在および面積を評価した。ＤＸ２の注射は、フルオレセイン血管造影において、ＧＦＰ注射対照と比較して血管漏出の減少を示した（図７）。同様に、ＤＸ２を注射されたマウスは、ＩＣＧ血管造影において、ＧＦＰを注射されたマウスと比較してＣＮＶ面積の減少を示した（図７）。また、イソレクチン－Ｂ４で染色された脈絡膜フラットマウントは、ＤＸ２を注射されたマウスにおけるＣＮＶ形成領域の有意な減少を実証している（図７）。

ＣＮＶ面積に対する漏れ面積の比は、フルオレセイン血管造影（ＦＡ）を使用して総過蛍光面積を測定し、ＩＣＧＡを使用してＣＮＶ面積を測定することによって推定した（図８）。イソレクチンＢ４染色を使用したブルッフ膜の平均ＣＮＶ面積はまた、ＧＦＰ対照と比較して、ＤＸ２を注射されたマウスで有意に小さかった（ｎ＝１２）（図８）。この結果に基づけば、ＣＮＶマウスモデルにおいてＤＸ２は予防効果を有した。

炎症細胞、特に（マクロファージ）は、ブルッフ膜破壊、ＲＰＥ萎縮、およびＣＮＶの領域を含むＡＭＤ病変の近く／内で組織学的に実証されている。ＣＮＶ病変における（マクロファージ）は、ＶＥＧＦなどの血管新生促進因子およびＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインを分泌することが示されている。図８では、ＤＸ２を注射されたマウスの炎症細胞の数は、ＧＦＰ対照ＣＮＶ細胞と比較して有意に少ない。

過剰量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、黄斑下の異常な血管の成長および漏出を引き起こし、中心視の不可逆的な喪失をもたらす。この文脈において、ウェットＡＭＤの処置のためにＶＥＧＦを標的とする抗血管新生療法の開発に向けた多くの努力がなされてきた。これらの薬物は、ＡＭＤの進行を遅らせ、場合によっては血管新生を抑制することによって視力を改善することが示されている。ここで、本発明者らは、レーザー誘発性脈絡膜新生血管マウスに事前にＤＸ２を処置し、ＶＥＧＦの発現に関してＧＦＰで処置されたマウスと比較した（ｎ＝６）（図９）。興味深いことに、ＤＸ２で処置されたマウスは、ＧＦＰで処置されたマウスと比較してより少ない発現を示した。このデータはまた、ＣＮＶモデルマウスに対するＤＸ２の予防効果を示した。
実施例６．ドライＡＭＤマウスモデル

材料および方法

６－１．動物実験

ドライＡＭＤマウスモデル実験の場合、Ｍｄｍ１－／－（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＫＯ）マウスは、ドライＡＭＤおよび遺伝性網膜変性の両方に対して、進行性光受容体およびＲＰＥ変性を示す。動物を、特定の病原体のない条件下および一定の環境条件下（２１℃～２３℃の温度、５０～６０％の湿度および１２時間の明／暗サイクル）で個々のケージに収容した。３週齢の網膜下腔へのＡＡＶ２－ＤＸ２および陰性対照（ＡＡＶ２－ＧＦＰ）の注射。網膜の組織学的測定および機能的リカバリーを３月齢で行った。

６－２．ドライＡＭＤおよび網膜変性に対するＤＸ２の治療効果

３週齢のＭｄｍ１－／－マウスに、３８Ｇ滅菌マイクロチップ針（ＩＮＣＹＴＯ、ＫＲ）を使用し、網膜創傷を最小限に抑えるために経強膜注射によって、４μｌの体積のＡＡＶ２－ＤＸ２／ＡＡＶ２－ＧＦＰを網膜下腔に注射した。ＡＡＶ２－ＧＦＰ／ＤＸ２を同じ動物に注射した。ＡＡＶ２－ＧＦＰをＯＳ（左）に注射した。ＡＡＶ２－ＤＸ２をＯＤ（右）に注射した。

６－２－３．電気生理学的機能評価

３月齢のマウスを使用した。最終測定のために、野生型（ｎ＝１１）、ｍｄｍ１－／－（ｎ＝６）、ｍｄｍ１－／－（ＡＡＶ２＋ＧＦＰ）（ｎ＝６）およびｍｄｍ１－／－（ＡＡＶ２＋ＤＸ２）（ｎ＝７）を評価した。

光受容体の機能評価のための網膜電図には、ＯｃｕＳｃｉｅｎｃｅ（登録商標）ＨＭｓＥＲＧを使用した。マウスにアベルチン（１％）で麻酔をかけ、麻酔を３％イソフルラン吸入で維持し、生理学的条件を維持するために温熱パッドに置いた。１滴の２％ヒプロメロース液滴を、角膜との接触を維持し、それを湿らせたままにするために、銀包埋糸電極を伴う齧歯動物接触レンズ上に置いた。暗さおよび眼の均一な照明のために、マウスを直径７６ｍｍのＧａｎｚｆｅｌｄドームに置いた。測定は、ＩＳＣＥＶ－Ｅｘｔｅｎｄｅｄ全視野ＥＲＧ標準プロトコル下で行った。データをＥＲＧＶＩＥＷを使用して分析し、３０００ｍｃｄ．ｓ／ｍ^２、０．１０Ｈｚのフラッシュ強度で分析するために、組み合わせた標準Ｒｏｄ＆Ｃｏｎｅ応答値を選択した。光受容体細胞の機能についてａ波分析を行った。双極および水平細胞の機能についてｂ波分析を行った。ａ波およびｂ波の振幅およびレイテンシー値を分析した。

６－２－４．組織学的測定

ＥＲＧ後、すべてのマウスを安楽死させ、眼球を採取した。眼球を４％ＰＦＡで４℃にて一晩固定した。眼球を３０％スクロースで脱水し、組織凍結切片のためにＯＣＴ化合物で包埋した。すべての網膜凍結切片試料を、厚さ１０μｍ切片を含む視神経から得た。

網膜の凍結切片を分析した。Ｈ＆Ｅを層厚分析のために使用した。層厚分析は、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳプログラムを用いて行った。免疫蛍光を、ＲＰＥ６５およびオプシンの発現、ならびに増殖評価（Ｋｉ６７）のために使用した。免疫蛍光ＲＯＩセットおよび重複係数測定値をＩｍａｇｅ Ｊで測定した。

６－２－５．統計解析

スチューデントのｔ検定を一次分析のために使用した。Ｐ値をｍｄｍ１－／－（ＡＡＶ２＋ＤＸ２）と比較した。リカバリー評価のために、Ｐ値を野生型と比較した。全データについて、ルービン（Ｌｅｖｅｎｅ）の分散の均一性検定、ＡＮＯＶＡ検定、および事後（ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）（Ｔ３）、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）ＨＳＤ）評価を、ＩＢＭ ＳＰＳＳ統計２３を用いて行った。

６－２－６．結果

図１０は、網膜の断面組織学（Ｈ＆Ｅ染色）を示す。

図１１Ａ～図１１Ｅは、組織学的網膜厚の組織学的測定を示す。図１１Ａは網膜の厚さを示す。図１１Ｂは、ＲＰＥ（網膜色素上皮）の厚さを示す。図１１Ｃは、ＯＮＬ（光受容体の外顆粒層）の厚さを示す。図１１Ｄは、外節の厚さを示す。図１１Ｅは、ＯＰＬ外網状層）の厚さを示す。すべての試料は、厚さ１０μｍの視神経を含む切片から得た。網膜へのＤＸ２遺伝子のトランスフェクションは、神経網膜の総厚のリカバリーをもたらした（図１１Ａ）。ＤＸ２のトランスフェクションは、より厚いＲＰＥ層（図１１Ｂ）および光受容体の外節層（図１１Ｃ）を示し、ＤＸ２の発現がＲＰＥ変性および光受容体の繊毛分解を防止することを示唆した。ＤＸ２のトランスフェクションはまた、より厚い光受容体の外顆粒層（図１１Ｄ）および外網状層（図１１Ｅ）を示し、ＤＸ２の発現が光受容体変性を低減させることを示した。

図１２は、ＲＰＥ（網膜色素上皮）の完全性および増殖を示す。ＤＸ２遺伝子のトランスフェクションは、ＲＰＥの増殖を活性化することによってＲＰＥの完全性のリカバリーをもたらした。

図１３は、ＰＲ（光受容体）のリカバリーを示す。ＤＸ２遺伝子のトランスフェクションは、ＰＲの増殖を活性化することによってＰＲ集団のリカバリーをもたらした。

図１４Ａ～図１４Ｂは、ＲＰＥおよびＰＲの細胞増殖を示す。Ｋｉ６７の発現を測定して、ＲＰＥおよび光受容体層の増殖を分析した。ＲＰＥ（図１４Ａ）および光受容体の外節層（図１４Ｂ）の増殖は、ＡＡＶ２－ＤＸ２でトランスフェクトされた試料において有意に高かった。

図１５Ａ～図１５Ｄは、網膜の機能的リカバリーを示す。ＡＡＶ２－ＤＸ２のトランスフェクションは、ドライＡＭＤモデル（ｍｄｍ１－／－）または陰性対照（ｍｄｍ１－／－＋ＡＡＶ－ＧＦＰ）と比較して、ａ波の振幅の増加（図１５Ａ）およびレイテンシーの減少（図１５Ｂ）を示し、ＤＸ２の発現が光受容体の電気生理学的機能および視力の損傷を軽減することを示した。ＡＡＶ２－ＤＸ２でトランスフェクトされた試料は、ドライＡＭＤモデル（ｍｄｍ１－／－）と比較して、ｂ波の振幅の変化を示さなかった（図１５Ｃ）が、レイテンシーを減少させた（図１５Ｄ）。これは、ＤＸ２がＲＰＥおよび光受容体のみに影響を及ぼし、双極細胞（光受容体後のニューロン）には影響を及ぼさないことを示唆している。

ＡＡＶ２－ＤＸ２をトランスフェクトした試料の網膜電図は、正常ＥＲＧグラフフォーマットの再獲得の増加を示した（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。ＡＡＶ２－ＤＸ２でトランスフェクトされた試料は、ドライＡＭＤモデル（ｍｄｍ１－／－）より、ａ波の振幅のわずかな増加（図１５Ｃ）およびレイテンシーの減少（図１５Ｄ）を示し、ＤＸ２の発現が光受容体の電気生理学的機能の損傷を軽減することを示した。ＡＡＶ２－ＤＸ２でトランスフェクトされた試料は、ｂ波の振幅を変化させなかった（図１５Ｅ）が、ドライＡＭＤモデル（ｍｄｍ１－／－）よりもレイテンシーを減少させた（図１５Ｆ）ことを示した。

参考文献
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Telegina, D. V., O. S. Kozhevnikova, and N. G. Kolosova. "Molecular mechanisms of cell death in retina during development of age-related macular degeneration." Advances in Gerontology 7.1 (2017): 17-24.

Hernaendez-Zimbroen, Luis Fernando, et al. "Age-related macular degeneration: new paradigms for treatment and management of AMD." Oxidative medicine and cellular longevity 2018 (2018).

Du, Hongjun, et al. "JNK inhibition reduces apoptosis and neovascularization in a murine model of age-related macular degeneration." Proceedings of the National Academy of Sciences 110.6 (2013): 2377-2382.

Brown et al., Endogenous microRNA regulation suppresses transgene expression in hematopoietic lineages and enables stable gene transfer, Nature Med. 12:585-591 (2006).

Brown et al., Endogenous microRNA can broadly exploited to regulate transggene expression acording to tissue, lineage and diffferentiation state, Nature Biotech. 25:12457-1467 (2007).

具体的な実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにし得るので、他の者は、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、当該分野の技術の知識を適用することによって、様々な適用のために容易に改変および／または適合させることができる。したがって、そのような適合および改変は、本明細書に提示されている教示およびガイダンスに基づき、開示されている実施形態の均等物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書の表現または用語は、本明細書の用語または表現が教示およびガイダンスに照らして当業者によって解釈されるように、限定ではなく説明を目的とするものであることを理解されたい。

本発明の広がりおよび範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。

本明細書に記載の様々な態様、実施形態、およびオプションのすべては、ありとあらゆる変形形態で組み合わされ得る。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (25)

1. 加齢黄斑疾患（ＡＭＤ）の処置を必要とする対象において前記加齢黄斑疾患を処置する方法であって、薬学的有効量の、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
2. 前記ＡＭＤがウェットＡＭＤである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＡＭＤがドライＡＭＤである、請求項１に記載の方法。
4. 前記ベクターがｍｉＲ－１４２標的配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ベクターが、前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記プロモーターが、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣａＭＫＩＩプロモーター、Ｈｂ９プロモーター、またはオプシンプロモーターである、請求項５に記載の方法。
7. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側である、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号１０または１１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号１０または１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列がＡＣＡＣＴＡを含む、請求項４～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５のうちの１～１７個の追加の連続したヌクレオチドを含む、請求項４～１１に記載の方法。
14. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、配列番号５（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項４～１１のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列がＡＣＴＴＴＡを含む、請求項４～１１のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７のうちの１～１５個の追加の連続したヌクレオチドを含む、請求項４～１１に記載の方法。
18. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、配列番号７（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項４～１１のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が２～１０回繰り返される、請求項４～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、トリ肉腫／白血病（ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスのベクターである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記組換えベクターが、前記対象に対して、局所的に、硝子体内注射によって、結膜下注射によって、または前記対象の網膜下腔に投与される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 追加の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記追加の治療剤が、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブである、請求項２４に記載の方法。