JP2023541601A - Ｆａｐに対する抗体フラグメント - Google Patents

Ｆａｐに対する抗体フラグメント Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰのエピトープに特異的に結合し、且つ部分構造などのエンティティに連結され得る抗体フラグメントの分野に関する。形成された抗体フラグメント及び化合物は、治療又は診断目的で使用され得る。

Description

本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）のエピトープに特異的に結合し、且つ部分構造などのエンティティに連結され得る抗体フラグメントの分野に関する。前記抗体フラグメントの用途に応じて、この部分構造は、放射性核種であり得る標識であり得る。本発明は、癌の予防及び／又は治療に使用するための標識抗体フラグメントに関する。
癌は、世界中の罹患率及び死亡率の主な原因の１つである。副作用を最小限に抑えながら癌に対抗する改善された治療法が継続的に必要とされている。ＦＡＰは、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）及びまた骨、脳、乳房、結腸直腸、食道、胃、肝臓、肺、卵巣、膵臓、副甲状腺、腎臓などの癌細胞（Ｐｕｒｅら（２０１８年）「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ａｕｇ」；第３７巻（第３２号）：第４３４３～４３５７３頁）で発現又は過剰発現されることが分かっている一方、ＦＡＰは、健康な細胞では発現されないか又は低レベルである。したがって、ＦＡＰは、興味深い癌標的と思われる。これまで、ＦＡＰを標的とする抗体は、治療用抗体として承認されていない。
したがって、当技術分野では、ヒトＦＡＰを標的とする更なる抗体が必要とされている。
ターゲティングベクターの異なる要素である。 ＥＬＩＳＡによって決定される、ヒトＦＡＰ組換えタンパク質、マウスＦＡＰ組換えタンパク質又はヒトＤＰＰ ＩＶ組換えタンパク質に結合するＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４のシグナル対バックグラウンド比である。＊未決定。 ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞及びマウスＦＡＰ発現ＨＥＫ２９３細胞に対する、ＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４の結合のΔｍｆｉ値である。ＨＥＫ－マウスＦＡＰ細胞におけるＶＨＨ Ｂ３及びＧＭ０５３８９細胞におけるＶＨＨ Ｂ４についてのΔｍｆｉ値は、１０よりも小さかった。 ＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨ（Ｂ１、Ｂ２又はＢ３）、メシル酸タラボスタット（阻害剤対照）とプレインキュベートされるか、又はＦＡＰ結合分子を伴わない（陽性対照）ヒトＦＡＰ組換えタンパク質による基質加水分解である。全ての条件について、平均相対蛍光単位（ｎ＝２）を時間の関数で示す。 ２４時間にわたるヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞に対する１３１Ｉ標識Ｂ１（そのＨｉｓ６タグ付け及び非タグ付けバージョン）の細胞保持である。データを平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３）。 ２４時間にわたるヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９及びＨＥＫ－２９３細胞上における１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の細胞保持である。データを平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３）。 ２４時間にわたるヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞上における２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の細胞保持である。データを平均±ＳＤとして表した（ｎ＝３）。 異なる放射性標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１で処置したマウスの生存を表すカプラン・マイヤー曲線である。１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１は、（Ａ１）腫瘍発生を阻害するその能力、及び（Ａ２）結果として生じる処置マウスの延命によって明らかにされるように、確立された皮下ヒト神経膠芽腫瘍（Ｕ８７ ＭＧ）を有するマウスで有効であり；（Ｂ）２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１は、（Ｂ１）腫瘍発生を阻害するその能力、及び（Ｂ２）結果として生じる処置マウスの延命によって明らかにされるように、確立された皮下ヒトＨＥＫ－２９３腫瘍を有するマウスで有効であり；（Ｃ）１７７Ｌｕ標識非標識ＶＨＨ Ｂ１は、（Ｃ１）腫瘍発生を阻害するその能力、及び（Ｃ２）結果として生じる処置マウスの延命によって明らかにされるように、確立された皮下ヒト神経膠芽腫瘍（Ｕ８７ ＭＧ）を有するマウスで有効である。ＭＳ：平均生存。
抗体フラグメント
本発明の第１の態様では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰと特異的に結合する抗体フラグメントが提供される。一実施形態では、前記抗体フラグメントは、配列番号１、２、３、４の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、提供される抗体フラグメントは、以下の少なくとも１つを満たす：
ａ．エピトープは、配列番号２６のアミノ酸２６～７６０内に含まれ、好ましくは、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれ（又はそれを含み）、
ｂ．配列番号２６の少なくともアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８は、前記抗体フラグメントと相互作用し、
ｃ．前記抗体フラグメントは、配列番号１、２、３、４の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって表される。
この態様の一実施形態では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、提供される抗体フラグメントは、以下の少なくとも１つを満たす：
ａ．エピトープは、配列番号２６のアミノ酸２６～７６０内に含まれ、好ましくは、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれ（又はそれを含み）、
ｂ．抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
に特異的に結合し、
ｃ．前記抗体フラグメントは、配列番号１、２、３、４の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって表される。
この態様の一実施形態では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、提供される抗体フラグメントであって、そのエピトープが配列番号２６のアミノ酸２６～７６０の範囲内に含まれる、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
に特異的に結合する。
この態様の一実施形態では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、提供される抗体フラグメントであって、そのエピトープが配列番号２６のアミノ酸６５～９０及び／又は１０１～１４０の範囲内に含まれる（又はそれらを含むそのエピトープを有する）、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
に特異的に結合する。
本出願を通して、ＦＡＰは、ＦＡＰアルファと同義であり、且つポリペプチドのプロリルエンドペプチダーゼＦＡＰに対応し、これは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）とも称される。このタンパク質をコードする遺伝子は、ＦＡＰと呼ばれる。
Figure 2023541601000001
本発明に関連して、「抗体フラグメント」という用語は、抗体又は免疫グロブリンの任意のフラグメントを指す。一実施形態では、抗体フラグメントは、単一ドメイン抗体フラグメントである。一実施形態では、抗体フラグメントは、重鎖抗体（ＶＨＨ）由来の重鎖可変ドメイン又はそのフラグメントである。好ましい実施形態では、単一ドメイン抗体フラグメントは、ＶＨＨ又はそのフラグメントである。本明細書に開示される重鎖抗体（すなわちＶＨＨ）に由来する重鎖可変ドメインは、単一のポリペプチド鎖からなる。本出願に関連して、「抗体フラグメント」という表現は、「単一ドメイン抗体フラグメント」、又は「ＶＨＨ」、又は「ＶＨＨのフラグメント」、又は「ＶＨＨの機能的フラグメント」によって置き換えられ得る。好ましくは、抗体又はＶＨＨのフラグメントは、少なくとも抗体の活性又はＶＨＨの活性をある程度呈するため、機能的フラグメントである。「ある程度」とは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれ超えるものを意味し得る。抗体フラグメント、ＶＨＨ又はＶＨＨのフラグメントの好ましい活性は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対する特異的結合である。「ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対する特異的結合」は、本明細書で後に定義される。
説明の最後に、「抗体」、「抗体フラグメント」、「アゴニスト」、「アンタゴニスト」、「抗体フラグメントのバリアント」のより詳細な定義を提供する。
より具体的には、本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントは、自然免疫系又は適応免疫系、好ましくは自然免疫系又は適応免疫系のタンパク質に由来する。更により詳細には、本明細書に開示されるＶＨＨは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はその任意の好適なフラグメント（通常、ＣＤＲの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基の少なくともいくつかを含む）を含み得る。特に、本明細書に開示されるＶＨＨは、好ましくは、微生物組換え発現系において高収率で生成するのが容易であり、続いて単離及び／又は精製するのに便利である。
本明細書で後により詳細に記載される特定の実施形態によれば、本発明は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰへの結合に特に適した抗体フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、ヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰに特異的に結合する。一実施形態では、抗体フラグメントは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰの細胞外ドメインの一部に結合する。
ヒトＦＡＰは、腫瘍形成機能を有する癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）で特異的に発現、より具体的には過剰発現されるため、標的とされるのに非常に魅力的である（Ｐｕｒｅら（２０１８年）「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」、８月；第３７巻（第３２号）：第４３４３～４３５７頁）。これは、一部の癌細胞（例えば、本明細書で後に開示される白血病、骨、子宮、膵臓、皮膚、筋肉、脳、乳房、結腸直腸、食道、胃、肝臓、肺、卵巣、副甲状腺、腎臓の癌など）でも発現され、且つ健常細胞ではあまり発現されない。したがって、ヒトＦＡＰは、腫瘍抗原又は癌細胞抗原と見なされ得、したがって診断標的及び／又は治療標的として使用され得る。
しかしながら、本発明の抗体フラグメントの他の用途（診断及び治療）も本発明に包含される。そのような他の診断及び／又は治療用途は、癌に関連しないが、線維症、創傷治癒、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、関節炎並びに他の炎症性及び線維性疾患に関連し得る。換言すれば、本発明の抗体フラグメントは、線維症、創傷治癒、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、関節炎並びに他の炎症性及び線維性疾患を診断及び／又は治療するための診断及び／又は治療用途で使用することができる。より詳細な説明は、本明細書で後述する。
本発明の抗体フラグメントは、抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）配列を含み得（又は本明細書で更に記載されるように、そのようなＣＤＲ配列に基づき得、且つ／若しくはそのようなＣＤＲ配列から誘導され得る）、それらは、一般に、本明細書では（すなわちそれぞれＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列として）「ＣＤＲ配列」とも称される。一実施形態では、本明細書に開示されるＶＨＨは、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明は、以下の（一般的な）構造を有する重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメインを提供する：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
本発明に関連して、ＩＭＧＴ命名法は、ＦＲ（フレームワーク領域）ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４並びに対応するＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を定義するために使用される。使用されるＩＭＧＴ命名法の定義は、本明細書において、本発明の定義の目的のための一般的な部分で後に提供される。しかしながら、本発明は、その最も広い意味において、これらのアミノ酸残基のストレッチが、本明細書に開示されるような可変ドメインがヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合することを可能にする限り、これらのアミノ酸残基のストレッチが、本明細書に開示されるような重鎖可変ドメインにおいて有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことに留意されたい。したがって、一般に、本発明は、その最も広い意味において、部分構造などのエンティティにカップリングすることができる単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントに関する。本発明に関連して、部分構造などのエンティティにカップリングした抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントは、化合物と呼ばれ得る。
この部分構造は、標識であり得る。標識は、放射性核種であり得る。代わりに、標識は、非放射性であり得る。本発明の化合物が標識を含む場合、これは、標識化合物と呼ばれ得る。放射性標識化合物は、好ましくは、ＣＡＦ細胞及び／又は癌細胞におけるヒトＦＡＰの発現に関連する癌を処置するために使用される。非放射性標識化合物は、本明細書で後に開示されるように、診断用途で使用されることが好ましい。
別の用途では、この部分構造は、線維症、創傷治癒、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、関節炎並びに他の炎症性及び線維性疾患を治療するための医薬品であり得る。そのような用途では、本発明の抗体フラグメントは、それを処置するために列挙された疾患の部位に医薬品を標的化するために使用される。
好ましい実施形態では、部分構造は、国際公開第２０１３０６４５０８Ａ１号パンフレットに記載のアドレノメデュリンのプロドラッグ、国際公開第２０１４０９７１５１Ａ２号パンフレットに記載のオートタキシン阻害剤、国際公開第２０１４０９１４４６Ａ１号パンフレットに記載のピリミド［４，５－ｂ］キノリン－４，５（３ｈ，１０ｈ）－ジオン誘導体、国際公開第２０１３０６４４５０Ａ１号パンフレットに記載のアミロライド誘導体、国際公開第２０１４１７７５２７Ａ１号パンフレットに記載のピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン誘導体、国際公開第２０１５１７３６８３Ａ１号パンフレットに記載のピラゾロピリジン誘導体又はピラゾロピリミジン誘導体、国際公開第２０１３２６７９７Ａ１号パンフレットに記載のピペリジノ－ジヒドロチエノピリミジンスルホキシド誘導体、国際公開第２０１６０６１１６１Ａ１号パンフレットに記載の２－［１，４］ピリジン－３－イル］－２，３－ジヒドロ－ベンゾジオキシン誘導体、国際公開第２０１４８６７０５Ａ１号パンフレットに記載のピリジン誘導体、国際公開第２０１１１１３８９４Ａ１号パンフレットに記載のピリジン誘導体又はピラジン誘導体、国際公開第２０１６２７１９５Ａ１号パンフレットに記載のアミノピリミジニル誘導体、国際公開第２０１５１７５７９６Ａ１号パンフレットに記載のカルボキサミド誘導体、国際公開第２０１０１２５０８２Ａ１号パンフレットに記載のオキサゾール置換インダゾール誘導体、国際公開第２０１４１２６９７９Ａ１号パンフレットに記載のビスフェニルブタン酸誘導体、国際公開第２０１２３５１５８Ａ１号パンフレットに記載のピラジン誘導体、国際公開第２０１４７２９５６Ａ１号パンフレットに記載のオキサゾリジン－２－オン－ピリミジン誘導体、国際公開第２０１６９６７２１Ａ１号パンフレットに記載のピラゾロピリジナミン誘導体、国際公開第２０１０１０１８４９Ａ１号パンフレットに記載のＮ－（ヘテロ）アリール、２－（ヘテロ）アリール置換アセトアミド誘導体、国際公開第２０１７１１５２０５Ａ１号パンフレットに記載の３－アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン誘導体、国際公開第２０１７２８９２７Ａ１号パンフレットに記載のフェノキシアセトアミド誘導体、国際公開第２０１７２２１１４２Ａ１号パンフレットに記載のＮ－（５－（４－アセチルピペラジン－１－イル）ピリジン－２－イル）－２－（２’－フルオロ－３－メチル－２，４’－ビピリジン－５－イル）アセトアミド誘導体又は２－（２’、３－ジメチル－２，４’－ビピリジン－５－イル）－Ｎ－（５－（ピラジン－２－イル）ピリジン－２－イル）アセトアミド誘導体、国際公開第２０１３１７１１６６Ａ１号パンフレットに記載のキサンチン誘導体、国際公開第２０１３１７４７６８Ａ１号パンフレットに記載のキサンチン誘導体、国際公開第２０１６１５０９０１Ａ１号パンフレットに記載のヘテロシクリルメチル－チエノウラシル誘導体、国際公開第２０１６３７９５４Ａ１号パンフレットに記載のｎ，２－ジアリールキノリン－４－カルボキサミド誘導体、国際公開第２０１２１６８３５０Ａ１号パンフレットに記載のピリジン－２－アミド誘導体、国際公開第２００５０４４８１７Ａ１号パンフレットに記載の細胞接着のモジュレータとして作用するベンズアミド誘導体、国際公開第２０１２１１７０００Ａ１号パンフレットに記載の３－アミノ－ピリジン誘導体、国際公開第２０１２６７９６５Ａ１号パンフレットに記載のＮａｍｐｔ又はｒｏｃｋ阻害剤、国際公開第２０１６１６２４２Ａ１号パンフレットに記載のオキセタン誘導体、国際公開第２０１８１３４６９５Ａ１号パンフレットに記載の１，１，１－トリフルオロ－３－ヒドロキシプロパン－２－イルカルバメート誘導体、国際公開第２０１４１３５５０７Ａ１号パンフレットに記載のピラゾール誘導体、国際公開第２００９１５６４６２Ａ１号パンフレットに記載のインドール誘導体、国際公開第２０１８１５０８８Ａ１号パンフレットに記載の［１，２，３１トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン誘導体、国際公開第２０１６１７７６６０Ａ１号パンフレットに記載のｓｇｃ刺激薬、国際公開第２０１７６０８７９Ａ１号パンフレットに記載のＣＦＴＲタンパク質、国際公開第２０１８１０９６０７Ａ１号パンフレットに記載のベンズイミダゾールの６－カルボン酸又は４－アザ－、５－アザ－、７－アザ－若しくは４，７－ジアザ－ベンズイミダゾール、国際公開第２０１７２８９２６Ａ１号パンフレットに記載のベンズアミド誘導体、国際公開第２０１２８７５１９Ａ１号パンフレットに記載の８－アザビシクロ［３．２．１］オクタン誘導体、国際公開第２０１６７１３７５Ａ１号パンフレットに記載のトリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン誘導体、国際公開第２０１５１０４３５４Ａ１号パンフレットに記載のアリールスルタム誘導体、国際公開第２０１４１５９０５Ａ１号パンフレットに記載の２－（アザインドール－２－イル）ベンズイミダゾール誘導体又は国際公開第２００５１０４７４５Ａ１号パンフレットに記載のキヌクリジン若しくはイソキヌクリジン誘導体である。好ましくは、この実施形態にかかる化合物は、線維症、創傷治癒、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、関節炎並びに／又は他の炎症性及び線維性疾患を治療するための医薬品である。
国際公開第２０１３０６４５０８Ａ１号パンフレット、同第２０１４０９７１５１Ａ２号パンフレット、同第２０１４０９１４４６Ａ１号パンフレット、同第２０１３０６４４５０Ａ１号パンフレット、同第２０１４１７７５２７Ａ１号パンフレット、同第２０１５１７３６８３Ａ１号パンフレット、同第２０１３２６７９７Ａ１号パンフレット、同第２０１６０６１１６１Ａ１号パンフレット、同第２０１４８６７０５Ａ１号パンフレット、同第２０１１１１３８９４Ａ１号パンフレット、同第２０１６２７１９５Ａ１号パンフレット、同第２０１５１７５７９６Ａ１号パンフレット、同第２０１０１２５０８２Ａ１号パンフレット、同第２０１４１２６９７９Ａ１号パンフレット、同第２０１２３５１５８Ａ１号パンフレット、同第２０１４７２９５６Ａ１号パンフレット、同第２０１６９６７２１Ａ１号パンフレット、同第２０１０１０１８４９Ａ１号パンフレット、同第２０１７１１５２０５Ａ１号パンフレット、同第２０１７２８９２７Ａ１号パンフレット、同第２０１７２２１１４２Ａ１号パンフレット、同第２０１３１７１１６６Ａ１号パンフレット、同第２０１３１７４７６８Ａ１号パンフレット、同第２０１６１５０９０１Ａ１号パンフレット、同第２０１６３７９５４Ａ１号パンフレット、同第２０１２１６８３５０Ａ１号パンフレット、同第２００５０４４８１７Ａ１号パンフレット、同第２０１２１１７０００Ａ１号パンフレット、同第２０１２６７９６５Ａ１号パンフレット、同第２０１６１６２４２Ａ１号パンフレット、同第２０１８１３４６９５Ａ１号パンフレット、同第２０１４１３５５０７Ａ１号パンフレット、同第２００９１５６４６２Ａ１号パンフレット、同第２０１８１５０８８Ａ１号パンフレット、同第２０１６１７７６６０Ａ１号パンフレット、同第２０１７６０８７９Ａ１号パンフレット、同第２０１８１０９６０７Ａ１号パンフレット、同第２０１７２８９２６Ａ１号パンフレット、同第２０１２８７５１９Ａ１号パンフレット、同第２０１６７１３７５Ａ１号パンフレット、同第２０１５１０４３５４Ａ１号パンフレット、同第２０１４１５９０５Ａ１号パンフレット及び同第２００５１０４７４５Ａ１号パンフレットは、それらの全体が組み込まれ、それらに開示される全ての化合物は、本出願に関連して、抗体フラグメントに連結された部分構造であり得る。
単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントは、機能的特徴及び／又は構造的特徴によって特徴付けられ得る。構造的特徴の例は、配列に関連し、機能的特徴の例は、前記抗体フラグメントの活性に関連する。活性は、特異的結合活性であり得る。活性は、特異的結合活性の非存在又は特異的結合活性の検出の非存在でもあり得る。
抗体フラグメントの特異的結合は、例えば、バイオパニング、スキャチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）（酵素結合免疫吸着アッセイ、ＥＬＩＳＡとも呼ばれる）、サンドイッチ競合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又はバイオレイヤー干渉法及び当技術分野で公知のそれらの様々な変形形態などを含む、それ自体公知である任意の好適な様式で決定することができる。これらのアッセイの各々を、支持体上又は溶液中に固定化され得るヒトＦＡＰ組換えタンパク質及び／又はマウスＦＡＰ組換えタンパク質を用いてインビトロで行うことができる。代わりに、いくつかの特定の状況下では、これらのアッセイのいくつかは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現する細胞を用いてインビトロで行われ得る。そのような細胞は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを内因的に発現又は過剰発現し得る。評価は、通常、培養培地若しくはＰＢＳ中又は好適な培地若しくは緩衝液中でインビトロにおいて行われる。好ましい細胞は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現する線維芽細胞である。好ましい細胞株は、ＧＭ０５３８９又はＵ－８７ ＭＧであり得る。代わりに、好ましい細胞は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現するトランスフェクトされた細胞である。好ましいトランスフェクト細胞株は、ＨＥＫ２９３であり得る。
代わりに、抗体フラグメントの結合は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現する動物においてインビボで評価され得る。そのような設定では、抗体フラグメントは、好ましくは、標識され、より好ましくは放射性標識され、イメージング技術が使用される。好ましいイメージング技術は、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ、ＰＥＴ／ＣＴ、ＳＰＥＣＴ／ＭＲＩ又はＰＥＴ／ＭＲＩである。ヒト及び／又はマウスＦＡＰを過剰発現する細胞も動物に異種移植され得る。ヒトＦＡＰを発現する本発明のヒトＦＡＰノックインマウスを使用することも可能である。
したがって、本明細書で使用される「インビトロ」という表現は、ヒトＦＡＰ組換えタンパク質及び／又はマウスＦＡＰ組換えタンパク質が支持体若しくは溶液中に固定化されている場合には無細胞アッセイの状況において、又は培養中の細胞の状況において使用される。それとは対照的に、「インビボ」又は「エクスビボ」という用語は、本明細書では、非ヒト動物又はこの非ヒト動物の組織若しくは器官に関連して使用される。通常、「エクスビボ」とは、非ヒト又はヒト動物の組織又は器官に対して定量を行う場合に用いられ、「インビボ」は、非ヒト又はヒト動物に対してイメージング法による定量を行う場合に用いられる。通常、「結合」は、インビトロ条件を用いて評価され、インビボ条件を用いて更に確認される。
本明細書に開示されるインビトロ、インビボ及びエクスビボアッセイでは、陰性対照を使用することが好ましい。ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対する特異的結合を、本明細書で後に説明されるような他の抗原の存在下で評価することも可能である。実験の部では、本発明の抗体フラグメントの特異的結合を評価するためにいくつかのアッセイが使用されている：ＥＬＩＳＡ及びバイオレイヤー干渉法が使用されている実施例４、切断された組織のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング及び／又はエクスビボガンマ計数を用いてヒトＦＡＰノックインマウスにおいて結合が評価されている実施例５、並びに切断された組織のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング及び／又はエクスビボガンマ計数を用いて、ヒトＦＡＰを過剰発現する細胞を含むマウスにおいて結合が評価されている実施例６。
本明細書で使用される場合、「親和性」、「特異的結合」、「結合」、「結合活性」又は「特異的結合活性」という用語は、単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントが、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに結合することで、ヒト及び／又はマウスＦＡＰと抗体フラグメントとの平衡を、それらの結合によって形成される複合体の存在に向けてシフトさせる程度を指す。結合は、ＳＰＲ又はバイオレイヤー干渉法を用いて評価することができる。したがって、例えばヒト及び／又はマウスＦＡＰと抗体フラグメントとが比較的等しい濃度で組み合わされる場合、高親和性の抗体フラグメントは、高濃度の得られる複合体に向けて平衡をシフトさせるように、利用可能なヒト及び／又はマウスＦＡＰに結合するであろう。平衡解離定数（ＫＤ）は、タンパク質結合ドメイン（抗体フラグメント）と抗原性標的（ヒト及び／又はマウスＦＡＰ）との間の親和性を説明するために一般に使用される。典型的には、平衡解離定数は、１０－７Ｍ未満である。好ましくは、平衡解離定数は、１０－８Ｍ未満若しくは１０－９Ｍ未満又はより好ましくは１０－９Ｍ～１０－１２Ｍの範囲である。
本明細書に開示されるような任意の抗体フラグメントは、好ましくは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに、１０－９～１０－１２モル／リットル又は１０－１０～１０－１２モル／リットルの範囲の平衡解離定数（ＫＤ）で（本明細書で定義されるように）特異的に結合するようなものであり、好ましくはバイオレイヤー干渉法を用いて評価される。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントの「特異性」は、親和性及び／又は結合活性に基づいて決定することができる。本明細書に開示されるような抗体フラグメントの「親和性」は、本明細書に開示されるような抗体フラグメントと、それが結合するヒト及び／又はマウスＦＡＰとの解離についての平衡定数によって表される。ＫＤ値が低いほど、本明細書に開示される抗体フラグメントと、それが結合する目的の標的タンパク質との間の結合強度が強くなる。代わりに、親和性は、１／ＫＤに対応する平衡会合定数（ＫＡ）で表すこともできる。本明細書に開示される抗体フラグメントの結合親和性は、目的の特定の標的タンパク質に応じて、当業者に公知の様式で決定することができる。本明細書に開示される抗体フラグメントの「結合活性」とは、本明細書に開示される抗体フラグメントと目的の好適な標的タンパク質との間の結合強度の尺度である。結合活性は、目的の標的タンパク質上の結合部位と、本明細書に開示される抗体フラグメント上の結合部位との間の親和性及び本明細書に開示される抗体フラグメント上に存在する好適な結合部位の数の両方に関連する。ＶＨＨなどの本発明の好ましい抗体フラグメントは、１つのみの単一ドメインを有し、したがって１つのみの結合部位を有する。そのような単一ドメイン抗体フラグメントによって呈される親和性は、サブナノモル濃度範囲であり、したがって単一の結合部位の存在を考慮すると非常に例外的である。約１ミリモルを超えるＫＤ値は、一般に、非結合又は非特異的結合を示すと考えられる。ＫＤは、ｋｏｆｆ又はｋｄ（秒－１又は秒－１で表される）として示される複合体の解離速度定数と、ｋｏｎ又はｋａ（モル－１秒－１又はＭ－１秒－１で表される）として示されるその会合の速度定数との比としても表され得ることが当技術分野で一般的に知られている。特に、本明細書に開示される抗体フラグメントは、０．１～０．００００１秒－１の範囲若しくは１０－２～１０－５秒－１の範囲にわたるｋｏｎ及び／又は１，０００～１０，０００，０００Ｍ－１秒－１の範囲、若しくは１０４～１０７Ｍ－１秒－１の範囲、若しくは１０５～１０７Ｍ－１秒－１の範囲にわたるｋｏｆｆで目的の標的タンパク質（すなわちヒト及び／又はマウスＦＡＰ）に結合する。結合親和性、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ速度は、当業者に公知の手段、例えばＥＬＩＳＡ法、等温滴定熱量測定、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法、蛍光活性化細胞分取分析などによって決定することができる（実施例４を参照されたい）。
好ましい実施形態では、本明細書に開示されるような抗体フラグメントは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに、０．１～０．００００１秒－１の範囲又は１０－２～１０－５秒－１若しくは１０－３～１０－５秒－１の範囲にわたるｋｏｆｆで特異的に結合し、好ましくはバイオレイヤー干渉法を用いて評価される。
好ましい実施形態では、本明細書に開示されるような抗体フラグメントは、好ましくはバイオレイヤー干渉法を用いて評価される、１０－９～１０－１２モル／リットルの範囲にわたるＫＤ及び／又は１０－２～１０－５秒－１の範囲にわたるｋｏｆｆ、より好ましくは１０－９～１０－１２モル／リットルの範囲にわたるＫＤ及び１０－２～１０－５秒－１の範囲にわたるｋｏｆｆでヒト及び／又はマウスＦＡＰに（本明細書で定義されるように）特異的に結合するようなものである。
したがって、本明細書に開示されるような単一ドメイン抗体フラグメント（好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメント）などの抗体フラグメントは、その抗体フラグメントがその標的（又はその少なくとも１つの部分若しくはフラグメント）に対する親和性、特異性を有し、且つ／又はその標的に対して特異的に向けられる場合、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに「特異的に結合する」と言われる。
本明細書に開示されるようなＶＨＨなどの抗体フラグメント又はそのフラグメントに関して、本明細書に開示されるような抗体フラグメントに存在する用語「結合領域」、「結合部位」又は「相互作用部位」は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対する結合又は特異的結合を担う、本明細書に開示されるような抗体フラグメントに存在するアミノ酸残基の特定の部位、部分、遺伝子座、ドメイン又はストレッチの意味を有するものとする。抗体フラグメント上に存在するこの結合領域は、パラトープと呼ばれる。そのような結合領域は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰと接触している抗体フラグメントの本明細書に開示されるようなアミノ酸配列に由来する特定のアミノ酸残基を含むか、それからなるか又はそれから本質的になる。前記抗体フラグメントと接触しているヒト及び／又はマウスＦＡＰの細胞外ドメインの領域又は一部のアミノ酸若しくは不連続なアミノ酸は、エピトープと呼ばれ得、本明細書で後に定義される。一実施形態では、本発明の抗体フラグメントのファミリーは、本明細書で後に定義されるエピトープ（第２の構造的特徴）を共有する。抗体フラグメントのこのファミリーは、インビトロ及びインビボの両方で魅力的な特性を呈する。インビトロ引力特性は、少なくともそれらの結合親和性及び結合速度論に関連し得るか、又はＦＡＰ酵素活性を調節し得ない。インビボ引力特性は、前記抗体フラグメントが本発明の標識化合物中に存在する場合、それらの体内分布及び腫瘍ターゲティングに少なくとも関連し得る。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」及び「特異的結合」という用語は、一般に、ポリペプチド、特に免疫グロブリン、例えば抗体又は抗体フラグメントなど、例えば単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントがヒト及び／又はマウスＦＡＰなどの特定の抗原に優先的に結合する能力を指す。そのような抗体フラグメントは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対して惹起される抗体フラグメントとしても同定され得る。
ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対する結合は、異なる抗原の均一な混合物において評価され得る。特定の実施形態では、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを、いくつかの実施形態では約１０倍～１００倍又はそれを超えて（例えば、約１０００倍超又は１０，０００を超えて）区別する。
一実施形態では、結合は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現する細胞を用いてインビトロで、任意選択的に本明細書で先に定義されたようにインビボ又はエクスビボで評価され得る。これらの細胞は、ヒト細胞であり得、内因性のヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現し得る。代わりに、これらの細胞は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを過剰発現し得る。ヒト及び／又はマウスＦＡＰを過剰発現する細胞は、ヒト細胞又は非ヒト細胞であり得る。好ましい細胞は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現する線維芽細胞である。好ましいトランスフェクト細胞株は、ＨＥＫ２９３である。ＦＡＰを発現する好ましい細胞株は、ＧＭ０５３８９又はＵ－８７ ＭＧである。ヒトＦＡＰを発現する好ましい癌細胞株は、Ｕ－８７ＭＧである。
一実施形態では、単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する。この評価は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法を用いて行われる。
本発明の単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰのいくつかの天然に存在する又は合成のアナログ、バリアント、突然変異体、対立遺伝子、部分及びフラグメントに結合することも予想される。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントは、抗体フラグメントが結合する（天然／野生型）抗原のエピトープを（依然として）含有する、ヒト及び／又はマウスＦＡＰの少なくともそれらのアナログ、バリアント、突然変異体、対立遺伝子、天然に存在する合成アナログ、部分及びフラグメントに特異的に結合するであろう。
本発明の抗体フラグメントのヒトＦＡＰのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸２６～７６０の範囲内に含まれる。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれる。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０を含む。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せを含む。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれる。
一実施形態では、配列番号２６の以下のアミノ酸：Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及びＹ４５８の少なくとも１つは、抗体フラグメントと結合するか、又は接触するか、又は相互作用する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
に特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び
６）Ｒ１７５、及び
７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
に特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
に特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び
６）Ｒ１７５、及び
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
に特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
に特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び
６）Ｒ１７５、及び
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
に特異的に結合する。
一実施形態では、配列番号２６の以下のアミノ酸：Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及びＹ４５８は、抗体フラグメントと結合するか、又は接触するか、又は相互作用する。これに関連して、ＦＡＰのヒトのアミノ酸は、前記アミノ酸が抗体フラグメントのエピトープに属する場合、本発明の抗体フラグメントによって結合され得る。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントは、本明細書に開示される抗体フラグメントが第２の分子に結合する親和性よりも少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍高い親和性で第１の目的の標的抗原に結合する場合、第２の分子、例えばＦＡＰの最近接ホモログの１つ（すなわちＤＰＰ ＩＶ、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ－Ｊｅａｎｎｅｒｅｔ，Ｌ．ら（２０１７年）、「Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ」、第２１巻：第９７７～９９１頁）などとは対照的に、目的の第１の標的抗原（すなわちヒト及び／又はマウスＦＡＰ）に「特異的」であると言われる。ＤＰＰ ＩＶのアミノ酸配列は、ＦＡＰのアミノ酸配列と５２％の同一性を有し（実施例４ｂを参照されたい）、それでもなお、本発明の抗体フラグメントは、２つの関連するプロリル特異的セリンプロテアーゼを区別することができる。したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示されるような抗体フラグメントが、第２の分子とは対照的に、目的の第１の標的抗原に「特異的」であると言われる場合、これは、目的の第１の標的抗原に（本明細書で定義されるように）特異的に結合し得るが、第２の分子に結合し得ない。本発明に関連して、抗体フラグメントは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰのエピトープに特異的に結合し、いずれもＤＰＰ ＩＶには特異的に結合しない。これは、実施例４ｂで実証されている。
本明細書で互換的に使用される「競合」、「クロスブロッキング」、「交差結合」及び「交差阻害」という用語は、一般に、好適なインビトロ又はインビボアッセイを用いて測定した場合、本明細書に開示される他の抗体、又は他の単一ドメイン抗体フラグメント、又は他の分子のヒト及び／又はマウスＦＡＰへの結合を妨害することができる、本明細書に開示されるＶＨＨなどの抗体フラグメントを指す。ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対するインビトロ結合を試験するために使用される好ましい細胞は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現する細胞である。好ましい細胞株は、本明細書で先に定義したＧＭ０５３８９、Ｕ－８７ＭＧ又はトランスフェクトＨＥＫ２９３であり得る。いくつかの細胞を実験の部で使用した（実施例４ｃを参照されたい）。したがって、より具体的には、本明細書に開示されるような抗体フラグメントを用いる「競合」、「クロスブロッキング」、「交差結合」及び「交差阻害」は、本明細書に開示されるような別の抗体若しくは単一ドメイン抗体フラグメントとヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰとの結合を妨害するか又はそれらと競合し、これにより、その結合を、本明細書に開示されるような「クロスブロッキング」単一ドメイン抗体フラグメントを用いない、本明細書に開示されるような他の単一ドメイン抗体フラグメントのヒト及び／又はマウスＦＡＰとの結合と比較して、好適なインビトロ、細胞又はインビボアッセイを用いて測定される場合、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれを超えて低下させることを意味し得る。一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、ＦＡＰのリガンドと、そのリガンドへの結合について競合しない。結果として、本発明の抗体フラグメントは、この受容体の天然の機能を妨害しないことも予想される。これは、一実施形態では、本発明の抗体フラグメントがヒト及び／又はマウスＦＡＰの天然リガンドと競合せず、したがってインビトロ又はインビボ若しくはエクスビボ環境においてヒトＦＡＰ発現細胞及び／又はマウスＦＡＰ発現細胞への結合が阻害されないことを意味する。実験の部で具体的に例示される全ての抗体フラグメントは、本発明の抗体フラグメントがそのリガンドに結合している場合、実質的なＦＡＰ活性が依然として検出可能であるため、ヒト及び／又はマウスＦＡＰの天然のリガンドと実質的に競合しない（実施例４ｄを参照されたい）。ＦＡＰ活性は、好ましくは、これに関連して、ＦＡＰジペプチジルペプチダーゼ活性又はゼラチナーゼ活性である。本発明に関連して、「実質的」とは、抗体フラグメントが存在しない場合の同じＦＡＰ活性と比較して、ＦＡＰ活性の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％が依然として検出可能であることを意味し得る。したがって、一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、ＦＡＰ活性を実質的に変化させず、これは、好ましくは、ＦＡＰ活性を実質的に阻害しないことを意味する。本発明に関連して、ＦＡＰ活性は、エキソペプチダーゼ活性及び／又はエンドペプチダーゼ活性であり得る。このエキソペプチダーゼ活性は、ＦＡＰジペプチジルペプチダーゼ活性であり得る。一実施形態では、抗体フラグメントは、ＦＡＰジペプチジルペプチダーゼ活性を実質的に阻害しない。このエンドペプチダーゼ活性は、ゼラチナーゼ及び／又はコラゲナーゼ活性であり得る。一実施形態では、抗体フラグメントは、ＦＡＰのＦＡＰゼラチナーゼ活性及び／又はコラゲナーゼ活性を実質的に阻害しない。したがって、一実施形態では、抗体フラグメントは、ヒト及び／又はマウスＦＡＰのモジュレータではない。一実施形態では、抗体フラグメントは、阻害剤ではなく、またヒト及び／又はマウスＦＡＰの活性化剤ではない。ＦＡＰ活性のいずれかは、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ－Ｊｅａｎｎｅｒｅｔ Ｌ．ら（２０１７年）、「Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８０／１４７２８２２２．２０１７．１３７０４５５）に例示されるように評価され得る。ＦＡＰジペプチジルペプチダーゼ活性は、実施例４ｄで使用される技術など、当業者に知られている技術を用いて評価され得る。手短に言えば、ヒトＦＡＰ酵素活性は、蛍光発生基質であるベンジルオキシカルボニル－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－７－アミド－４－メチルクマリン（Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ；Ｂａｃｈｅｍ）を用いて測定され得る。ヒトＦＡＰ組換えタンパク質（実施例４ａ）を、１μＭのＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨの非存在下又は存在下、黒色の９６ウェル平底プレートにおいてアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５）で２００ｎｇ／ｍＬに希釈し得る。阻害剤対照として、抗体フラグメントの代わりに１μＭのメシル酸タラボスタット（ＡｐｅｘＢｉｏ）を加えた。結合平衡に達するまで１時間インキュベートした後、Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ基質を５０μＭの最終濃度で添加した。蛍光マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、３８０ｎｍで励起し、４６０ｎｍで発光検出して、基質のＺ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ及び７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）への酵素的変換を追跡した。蛍光を１分毎に１時間測定した。曲線の傾きは酵素活性の速度に対応する（例として図４を参照されたい）。阻害剤対照も使用することができる。好適な阻害剤は、タラボスタットメタンシン（ＡｐｅｘＢｉｏ）である。
本明細書に開示されるＶＨＨ又はその機能的フラグメントなどの抗体フラグメントは、目的とする２つの異なる標的タンパク質の両方に（本明細書で定義されるように）特異的である場合、目的とするこれらの異なる標的タンパク質を示す「交差反応性」であると言われる。一実施形態では、目的とする２つの異なる標的タンパク質は、ヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰであり得る。
以下では、本発明者らは、本発明の抗体フラグメントのいくつかの構造的特徴（すなわち第１、第２、第３、第４の構造的特徴）について記載する。本発明の抗体フラグメントは、これら４つの構造的特徴の少なくとも１つ又は全ての存在を特徴とし得る：
－ 第３及び第４の構造的特徴、
－ 第１及び第２の構造的特徴、
－ 第１、第２及び第３の構造的特徴
－ 第３及び第４の構造的特徴、
－ 第３の構造的特徴、
－ 第４の構造的特徴、
－ 第１、第３及び第４の構造的特徴、
－ 第２、第３及び第４の構造的特徴、
－ 第１及び第３の構造的特徴、
－ 第１及び第４の構造的特徴、
－ 第２及び第３の構造的特徴、
－ 第２及び第４の構造的特徴
－ 第１、第２、第３及び第４の構造的特徴。
抗体フラグメントの第１の構造的特徴：ＦＡＰの接触領域に基づく
第１の構造的特徴とは、本発明の抗体フラグメントが、配列番号２６のアミノ酸２６～７６０の範囲内に含まれるヒトＦＡＰの領域に接触するか、又は結合するか、又は特異的に結合するか、又は相互作用することである。本発明の抗体フラグメントによって特異的に結合又は標的される配列番号２６のアミノ酸２６～７６０内の領域は、前記一次アミノ酸配列内の線状領域（すなわち線状エピトープ又は連続エピトープ）であり得る。代わりに、前記領域は、線状でなくてもよく、構造的エピトープに対応し得る。通常、線状エピトープは、５～３０アミノ酸長を有するアミノ酸の線状配列を含み、すなわち、これは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸長を有し得る。通常、構造的エピトープは、タンパク質の三次元三次構造において一緒になり、抗体フラグメントと接触する、配列番号２６のアミノ酸２６～７６０内のいくつかの非連続アミノ酸を特徴とする。
抗体フラグメントの第２の構造的特徴に関する以下の段落では、抗体フラグメントの線状エピトープ及び構造的エピトープが定義される。
抗体フラグメントの第２の構造的特徴：抗体フラグメントのエピトープに基づく
ヒト及び／又はマウスＦＡＰのエピトープに特異的に結合する本発明の抗体フラグメントは、代替的に又は上記に定義された第１の構造的特徴と組み合わせて、以下に定義される第２の構造的特徴によっても更に定義され得る。
第２の構造的特徴は、本発明の抗体フラグメントが配列番号２６のアミノ酸２６～７６０内のいくつかのアミノ酸に接触するか、又は結合するか、又は特異的に結合することである。配列番号２６のアミノ酸２６～７６０内のこれらの特定のアミノ酸は、以下で更に定義される。
この第２の構造的特徴の第１の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号２６の６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれるアミノ酸の少なくとも１つに接触するか、又は結合するか、又は特異的に結合する。したがって、同定された６６アミノ酸からの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５又は６６アミノ酸の各組合せは、本発明の抗体フラグメントが接触するために包含される。
この第２の構造的特徴の第２の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及びＹ４５８の少なくとも１つと接触するか、又はそれらに結合するか、又はそれらに特異的に結合する。したがって、同定された３７アミノ酸からの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６又は３７アミノ酸の各組合せは、本発明の抗体フラグメントが接触するために包含される。
この第２の構造的特徴の第３の実施形態では、配列番号１のアミノ酸６５～９０のストレッチは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合するｈＦＡＰの第１の領域を定義する。このストレッチ又は領域内の各アミノ酸は、抗体フラグメントと接触していなくてもよいか、結合していなくてもよいか又は特異的に結合していなくてもよい。一実施形態では、このストレッチ又は領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸は、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。一実施形態では、この第１のストレッチ又は領域は、抗体フラグメントのエピトープである。一実施形態では、抗体フラグメントのエピトープは、この第１のストレッチ又は領域内に含まれる。
好ましくは、この最初のストレッチ内において、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０の少なくとも１つは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
より好ましくは、この最初のストレッチ内において、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０の少なくとも２つは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
更により好ましくは、この最初のストレッチ内において、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９及びＬ９０の少なくとも３つは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
更により好ましくは、好ましくはこの最初のストレッチ内において、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０の全ては、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
最も好ましくは、この最初のストレッチ内において、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０の全ては、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
この第２の構造的特徴の第４の実施形態では、配列番号２６のアミノ酸１０１～１４０のストレッチは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合するｈＦＡＰの第２の領域を定義する。このストレッチ又は領域内の各アミノ酸は、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する必要はない。一実施形態では、このストレッチ又は領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸は、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。一実施形態では、この第２のストレッチ又は領域は、抗体フラグメントのエピトープである。一実施形態では、抗体フラグメントのエピトープは、この第２のストレッチ又は領域内に含まれる。
好ましくは、この第２のストレッチ内において、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７の少なくとも１つは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
より好ましくは、この第２のストレッチ内において、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７の少なくとも２つは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
更により好ましくは、この第２のストレッチ内において、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７の少なくとも３つは、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
最も好ましくは、この第２のストレッチ内において、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７の全ては、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。
この第２の構造的特徴の第５の実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６のＩ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｓ９１、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８などの追加のアミノ酸と更に接触する。
この第２の構造的特徴の第６の実施形態では、上で定義された第１のストレッチ及び第２の伸長又は領域の各々は、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。一実施形態では、これらの２つのストレッチの組合せは、抗体フラグメントの構造的エピトープを定義する。一実施形態では、構造的エピトープは、これらの２つのストレッチの組合せ内に含まれる。これらのストレッチ又は領域の各々の中の各アミノ酸は、抗体フラグメントと接触していなくてもよいか、結合していなくてもよいか又は特異的に結合していなくてもよい。一実施形態では、ストレッチ又は領域の各々の１、２、３、４、５又は６アミノ酸（又は各ストレッチの長さに応じてそれを超える）は、抗体フラグメントと接触するか、結合するか又は特異的に結合する。一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６のＩ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｓ９１、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８などの追加のアミノ酸と更に接触する。
一実施形態では、ヒトＦＡＰのエピトープに特異的に結合する抗体フラグメントが提供され、ここで、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０内に含まれる。任意選択的に、抗体フラグメントは、配列番号２６のＩ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｓ９１、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８などの追加のアミノ酸と更に接触する。
一実施形態では、ヒトＦＡＰのエピトープに特異的に結合する抗体フラグメントが提供され、ここで、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれる。任意選択的に、抗体フラグメントは、配列番号２６のＩ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｓ９１、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８などの追加のアミノ酸と更に接触する。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
と接触するか、又はそれらに結合するか、又はそれらに特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び
６）Ｒ１７５、及び
７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
と接触するか、又はそれらに結合するか、又はそれらに特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
と接触するか、又はそれらに結合するか、又はそれらに特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸、及び
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び
６）Ｒ１７５、及び
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
と接触するか、又はそれらに結合するか、又はそれらに特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び／又は
６）Ｒ１７５、及び／又は
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
と接触するか、又はそれらに結合するか、又はそれらに特異的に結合する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２６の以下のアミノ酸：
１）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも３つのアミノ酸、及び
５）Ｖ１５８及びＧ１５９、及び
６）Ｒ１７５、及び
７）Ｄ４５７及びＹ４５８
と接触するか、又はそれらに結合するか、又はそれらに特異的に結合する。
一実施形態では、配列番号２６の以下のアミノ酸：Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及びＹ４５８は、抗体フラグメントと結合するか、又は接触するか、又は相互作用する。
一実施形態では、配列番号２６の以下のアミノ酸：Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及びＹ４５８は、抗体フラグメントと結合するか、又は接触するか、又は相互作用する。
抗体フラグメントの第３の構造的特徴：全長配列に基づく
第３の構造的特徴とは、本発明の抗体フラグメントが、本発明の抗体フラグメントのファミリーを定義する方法を表す全長アミノ酸配列に関することである。本発明は、配列番号４又はその一部を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表される、構造的に密接に関連する抗体フラグメントのファミリーを開示する。抗体フラグメントＢ１は、配列番号４によって表される（以下の表２を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、上記で定義されるその第１の構造的特徴及び以下で更に定義されるその第３の構造的特徴によって定義され得る。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、上記で定義されるその第２の構造的特徴及び以下で更に定義されるその第３の構造的特徴によって定義され得る。
この第３の構造的特徴の第１の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号４又はその一部と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、この配列との配列同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
この第３の構造的特徴の一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号４又はその一部と少なくとも８１％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、この配列との配列類似性は、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
この第３の構造的特徴の第２の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号４又はその一部と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表され、且つ配列番号４の正確な長さ又は配列番号４の正確な長さよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０アミノ酸だけ長い範囲にわたる長さを有する。
この第３の構造的特徴の一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号４又はその一部と少なくとも８１％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表され、且つ配列番号４の正確な長さ又は配列番号４の正確な長さよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０アミノ酸だけ長い範囲にわたる長さを有する。
例えば、Ｈｉｓタグなどのタグを本発明の抗体フラグメントに付加することができる。通常、Ｈｉｓタグは、４、５、６、７、８、９、１０個のヒスチジンを含む。代替的なタグは、ヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号５３）；ＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号５４）又はシステインタグ（Ｃｙｓタグ）であり得る。システインタグは、１つ又はいくつかのシステインを含むタグである。システインタグの非限定的な例は、Ｃ；ＧＧＣ；ＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＣ（配列番号５５）である。
同一性及び類似性が評価される方法は、説明の最後の定義の目的のための部分で詳細に説明される。通常、同一性が配列番号の参照によって定義される場合、前記同一性は配列番号全体にわたって評価される。しかしながら、同一性（又は類似性）が前記配列の一部（又はフラグメント）にわたって評価されることも本発明に包含される。これに関連して、部分とは、配列番号の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を意味し得る。包含される配列の長さは、同一性（又は類似性）を評価するために使用される配列番号の長さよりも依然として長くてよい（すなわち同一性（若しくは類似性）がこの配列番号の一部にわたって評価されたとしても配列番号のものと同じである、配列番号の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％である長さ、又は配列番号の正確な長さよりも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０アミノ酸だけ長い長さ。
この第３の構造的特徴の第３の実施形態では、抗体フラグメントの長さは、１１０～１３０アミノ酸又は１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９若しくは１３０アミノ酸である。この長さは、抗体フラグメントの配列に付加され得るＨｉｓタグなどのタグの長さを含まない。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号４の正確な長さ又は配列番号４の正確な長さよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０アミノ酸だけ長い範囲にわたる長さを有する。
一実施形態では、抗体フラグメントは、１１０～１３０アミノ酸又は１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９若しくは１３０アミノ酸の範囲にわたる長さを有し、且つ配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む。
この第３の構造的特徴の第４の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号４又はその一部の少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表され、抗体フラグメントの長さは、８０～１５０アミノ酸又は９０～１４０、若しくは１００～１３０、若しくは１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９若しくは１３０アミノ酸である。一実施形態では、これらの配列の少なくとも１つとの配列同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
この第３の構造的特徴の一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号４又はその一部の少なくとも１つと少なくとも８１％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表され、抗体フラグメントの長さは、８０～１５０アミノ酸又は９０～１４０、若しくは１００～１３０、若しくは１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９若しくは１３０アミノ酸である。一実施形態では、これらの配列の少なくとも１つとの配列類似性は、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、本明細書で前に定義された配列番号２６のアミノ酸のストレッチ又は領域（すなわち配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０）の少なくとも一方（好ましくは両方）に接触するか、結合するか又は特異的に結合する。一実施形態では、前記抗体フラグメントのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸のこれらのストレッチ又は領域内に含まれる。
更に、一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、構造的エピトープについて、本明細書で前に定義された配列番号２６のアミノ酸のストレッチ又は領域の組合せ（すなわち配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０）を有する。一実施形態では、前記抗体フラグメントの構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸のこれらのストレッチ又は領域内に含まれる。
これらのエピトープは、抗体フラグメントのファミリーを定義する。抗体フラグメントのこのファミリーは、これらのエピトープ、線状エピトープ及び／又はこの構造的エピトープの少なくとも１つを共有する。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、
－ 配列番号４又はその一部（第３の構造的特徴）と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表され、
－ これは、エピトープについて、配列番号２６（第２の構造的特徴）の６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれるアミノ酸ストレッチ又は領域を有する。
一実施形態では、この配列との配列同一性（又は類似性）は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号４の正確な長さ又は配列番号４の正確な長さよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０アミノ酸だけ長い範囲にわたる長さを有する。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、
－ 配列番号４又はその一部（第３の構造的特徴）と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表され、
－ 配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つに接触するか、又は結合するか、又はそれらに特異的に結合する。（第２の構造的特徴）。
一実施形態では、この配列との配列同一性（又は類似性）は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号４の正確な長さ又は配列番号４の正確な長さよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０アミノ酸だけ長い範囲にわたる長さを有する。
第２の構造的特徴の他の実施形態の各々は、第３の構造的特徴の各実施形態と組み合わされ得る。
第４の構造的特徴：ＣＤＲ／ＣＤＲ移植
第４の構造的特徴において、本発明の抗体フラグメント、好ましくは本明細書に開示されるＶＨＨは、配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域と、配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域と、配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域とを含む群から選択されるＣＤＲ配列の少なくとも１つの組合せを含むアミノ酸配列によって表される。前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の１つ又は２つのアミノ酸は、得られた抗体フラグメントの活性を実質的に変化させることなく、別の１つのアミノ酸で置換され得る。抗体フラグメントのいずれのフレームワーク領域についても同様である。これらの抗体フラグメントバリアントの各々も本発明に包含される。前記抗体フラグメントバリアントの活性は、本明細書で先に定義した特異的結合活性である。本発明に関連して、「実質的」とは、初期ＣＤＲ及び／又はＦＲ領域を有する抗体フラグメントの活性と比較して、前記結合活性の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％が依然として検出可能であることを意味し得る。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、（一般的な）構造を有するか、又はそれに由来する重鎖抗体を含む重鎖可変ドメインを提供する：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
（式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、これらは、本明細書で更に定義される通りである（ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対して惹起された重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を列挙する表２を参照されたい））。
Figure 2023541601000002
本発明は、本明細書に開示される抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメント（又はそれらを発現するためのヌクレオチド配列）の起源に関して限定されず、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ若しくはそのフラグメント又は本明細書に開示されるヌクレオチド配列が生成又は取得される（又は取得されている）方法に関しても限定されないことに留意されたい。したがって、本明細書に開示される抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントは、天然に存在するアミノ酸配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成アミノ酸配列であり得る。抗体フラグメントを単離するための方法及び抗体フラグメントを生成するための方法並びに抗体フラグメント、これらの核酸分子を含む構築物及びこれらの構築物を含む細胞をコードする核酸分子は、説明の最後において定義部分で詳細に開示されている。
本発明の具体的であるが、非限定的な態様では、抗体フラグメントのアミノ酸配列は、天然に存在する免疫グロブリン配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成免疫グロブリン配列であり、「ヒト化」免疫グロブリン配列（例えば、部分的又は完全にヒト化されたマウス又はウサギ免疫グロブリン配列、特に部分的又は完全にヒト化されたＶＨＨ配列）、「ラクダ化」免疫グロブリン配列並びに（例えば、合成、ランダム又は天然に存在する免疫グロブリン配列から出発する）親和性成熟、ＣＤＲ移植、ベニア化、異なる免疫グロブリン配列に由来するフラグメントの組合せ、重複プライマを用いたＰＣＲアセンブリ及び当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術などの技術によって得られた免疫グロブリン配列；又は前述のいずれかの任意の好適な組合せを含むが、これらに限定されない。本明細書に開示されるような抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントはまた、本発明の１つ以上の更なる（部分的又は完全な）ヒト化アミノ酸配列を提供するために、本明細書に更に記載されるように好適にヒト化され得る。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、ＣＤＲ移植を用いる上記の抗体フラグメントに由来する。
好ましい抗体フラグメントは、以下を含む：
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域、配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ２領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ１領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域及び配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ３領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
同様に、アミノ酸配列が合成又は半合成配列（部分的にヒト化された配列など）を含む場合、前記配列は、本明細書に開示される１つ以上の更なる（部分的又は完全に）ヒト化アミノ酸配列を提供するように、本明細書に再度記載される通りに任意選択的に更に好適にヒト化され得る。説明の最後に、「アゴニスト」、「アンタゴニスト」、「抗体フラグメントのバリアント」、「抗体フラグメントの翻訳後構造特性評価」のより詳細な定義を提供する。
特に、ヒト化抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨは、ヒト化置換であり、且つ／又はヒト化置換に対応する、少なくとも１つのアミノ酸残基（特に少なくとも１つのフレームワーク残基における）が存在するアミノ酸配列によって表され得る。加えて又は代替的に、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより、他の潜在的に有用なヒト化置換を確認することができ、その後、このように決定された潜在的に有用なヒト化置換の１つ以上（又はそれらの組合せ）を（本明細書で更に説明するようにそれ自体公知の任意の様式で）前記ＶＨＨ配列に導入することができ、得られたヒト化ＶＨＨ配列又はその機能的フラグメントは、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル並びに／又は他の所望の特性について試験することができる。このようにして、限られた程度の試行錯誤により、他の好適なヒト化置換（又はそれらの好適な組合せ）を当業者によって決定することができる。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、上記で定義されるその第１の構造的特徴及び本明細書で更に定義されるその第４の構造的特徴によって定義され得る。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、上記で定義されるその第２の構造的特徴及び本明細書で更に定義されるその第４の構造的特徴によって定義され得る。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、上記で定義されるその第２の構造的特徴並びに本明細書で更に定義されるその第３の構造的特徴及びその第４の構造的特徴によって定義され得る。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、本明細書で前に定義された配列番号２６のアミノ酸のストレッチ又は領域（すなわち配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０）の少なくとも一方（好ましくは両方）に接触するか、結合するか又は特異的に結合する。一実施形態では、前記抗体フラグメントのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸のこれらのストレッチ又は領域内に含まれる。
更に、本発明の抗体フラグメントは、構造的エピトープについて、本明細書で前に定義された配列番号２６のアミノ酸のストレッチ又は領域の組合せ（すなわち配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０）を有する。一実施形態では、前記抗体フラグメントの構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸のこれらのストレッチ又は領域の組合せ内に含まれる。
これらのエピトープは、抗体フラグメントのファミリーを定義する。抗体フラグメントのこのファミリーは、これらのエピトープ、線状エピトープ及び／又はこの構造的エピトープの少なくとも１つを共有する。
好ましい抗体フラグメントは、以下を含む：
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域、配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ２領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ１領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域及び配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ３領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメント（第４の構造的特徴）に由来し得る。
また、好ましい抗体フラグメントは、
－ 配列番号２６の６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれるアミノ酸ストレッチ又は領域内に含まれるエピトープを有する（第２の構造的特徴）。
好ましい抗体フラグメントは、以下を含む：
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域、配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ２領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域及び配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ１領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域及び配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域。ＦＲ領域は、表２で同定される通りであり得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。ＣＤＲ３領域は、別の抗体フラグメントに由来する。
－ 配列番号１を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号２を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメントに由来し得る。
－ 配列番号３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域であり、これは、別の抗体フラグメント由来のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含み、且つ表２で同定されるＦＲを有し得る。代わりに、ＦＲ領域は、別の抗体フラグメント（第４の構造的特徴）に由来し得る。
また、好ましい抗体フラグメントは、
－ 配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つに接触するか、又は結合するか、又はそれらに特異的に結合する（第２の構造的特徴）。
第２の構造的特徴の他の実施形態の各々は、第４の構造的特徴の各実施形態と組み合わされ得る。
一実施形態では、抗体フラグメント、好ましくは本発明のＶＨＨ（又はそのフラグメント）は、本明細書で同定される第１の構造的特徴、及び／又は第２の構造的特徴、及び／又は第３の構造的特徴、及び／又は第４の構造的特徴によって表される。代わりに又は前記構造的特徴と組み合わせて、前記抗体フラグメント、好ましくは本発明のＶＨＨ（又はそのフラグメント）は、以下の機能的特徴の少なくとも１つを特徴とする：
－ ヒト及び／又はマウスＦＡＰと特異的に結合し、好ましくはヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰと特異的に結合すること、及び
－ ＦＡＰ活性を調節しないこと。
特異的結合は、本明細書で先に記載されている。最も好ましくは、抗体フラグメントは、好ましくはバイオレイヤー干渉法を用いて評価される、１０－９～１０－１２モル／リットルの範囲にわたるＫＤ及び／又は１０－２～１０－５秒－１の範囲にわたるｋｏｆｆ、より好ましくは１０－９～１０－１２モル／リットルの範囲にわたるＫＤ及び１０－２～１０－５秒－１の範囲にわたるｋｏｆｆでヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する。
抗体フラグメントがモジュレータではない（すなわち阻害剤ではなく、ヒト及び／又はマウスＦＡＰの活性化剤ではない）可能性があるという事実に関する第２の機能的特徴も本明細書で詳細に記載される。
したがって、一実施形態では、本発明の抗体フラグメント、ＶＨＨ又はＶＨＨのフラグメントは、少なくとも１つの構造的特徴及び／又は少なくとも１つの機能的特徴を満たすべきである。
追加の抗体フラグメント
更なる態様では、先に開示されたものと同様の構造的及び／又は機能的特徴を有する追加の抗体フラグメントが提供され、違いは、以下に定義されるそれらの全長配列、それらのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４配列である（表３及び更に本文を参照されたい）。
単一ドメイン抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントなどのこれらの追加の抗体フラグメントは、機能的特徴及び／又は構造的特徴によって特徴付けられ得る。構造的特徴の例は配列に関連し、機能的特徴の例は前記抗体フラグメントの活性（すなわち本明細書で先に定義されたような抗体フラグメントについて全て先に定義された、結合活性及びＦＡＰ活性の調節の非存在）に関連する。本明細書で上記に存在し、且つ「抗体フラグメント」、「その活性」、「その結合」、「交差結合」（すなわち競合）、「親和性」、「結合活性」及び／又は「特異性」の定義に関連する文言は、これらの追加の抗体フラグメントにも適用される。別段の指示がない限り、第１の態様の抗体フラグメントに関する全ての定義は、追加の抗体フラグメントにも適用される。同じことは、抗体フラグメントが使用される本発明の全てのその後の態様（抗体フラグメントを含む化合物、ターゲティング用途のための化合物、標識化合物、組成物、キット、抗体フラグメント及び標識化合物の診断的使用、標識化合物の治療的使用）に当てはまる。
一実施形態では、本発明の追加的な抗体フラグメントは、本明細書で前に定義された配列番号２６のアミノ酸のストレッチ又は領域（すなわち配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０）の少なくとも一方（好ましくは両方）に接触するか、結合するか又は特異的に結合する。一実施形態では、前記抗体フラグメントのエピトープは、配列番号２６のアミノ酸のこれらのストレッチ又は領域内に含まれる。
更に、一実施形態では、本発明の追加的な抗体フラグメントは、構造的エピトープについて、本明細書で前に定義された配列番号２６のアミノ酸のストレッチ又は領域の組合せ（すなわち配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０）を有する。一実施形態では、前記抗体フラグメントの構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸のこれらのストレッチ又は領域の組合せ内に含まれる。
これらのエピトープは、抗体フラグメントのファミリーを定義する。抗体フラグメントのこのファミリーは、これらのエピトープ、線状エピトープ及び／又はこの構造的エピトープの少なくとも１つを共有する。
これらの追加の抗体フラグメントは、他のものと同じ方法で使用することができた。本明細書で前又は後に提供される全ての機能的定義は、この追加の抗体フラグメントにも適用される。本明細書で既に定義されている抗体フラグメントの第１の構造的特徴及び第２の構造的特徴は、これらの追加の抗体フラグメントにも適用される。
以下では、本発明者らは、本発明の追加の抗体フラグメントのいくつかの更なる構造的特徴を記載する。本発明の抗体フラグメントは、これらの構造的特徴：第１、第２、第３及び第４の構造的特徴の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は全ての存在を特徴とし得る。
ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであり、前記抗体フラグメントは、配列番号８、５、６、７、１２、９、１０、１１の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、この配列のいずれかとの配列同一性は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであり、前記抗体フラグメントは、配列番号１６、１３、１４、１５の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、この配列のいずれかとの配列同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号８、５、６、７又はその一部と少なくとも９１％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、この配列との配列類似性は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号９、１０、１１、１２又はその一部と少なくとも８９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、この配列との配列類似性は、少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号１３、１４、１５、１６又はその一部と少なくとも８１％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、この配列との配列類似性は、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、追加の抗体フラグメントの長さは、１１０～１３０アミノ酸又は１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９若しくは１３０アミノ酸である。この長さは、抗体フラグメントの配列に付加され得るＨｉｓタグなどのタグの長さを含まない。いくつかのＨｉｓタグは、本明細書で前に既に定義されている。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメントは、
－ 配列番号８、５、６、７、１２、９、１０、１１の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
－ 配列番号２６の６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれるアミノ酸ストレッチ又は領域内に含まれるエピトープを有する（第２の構造的特徴）。
一実施形態では、この配列との配列同一性（又は類似性）は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメントは、
－ 配列番号８、５、６、７、１２、９、１０、１１の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
－ 配列番号２６の６５～９０及び１０１～１４０内に含まれるアミノ酸ストレッチ又は領域の組合せ内に含まれる構造的エピトープを有する（第２の構造的特徴）。
一実施形態では、この配列との配列同一性（又は類似性）は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメントは、
－ 配列番号８、５、６、７、１２、９、１０、１１の少なくとも１つ又はその一部と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
－ 配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つに接触するか、又は結合するか、又はそれらに特異的に結合する（第２の構造的特徴）。
一実施形態では、この配列との配列同一性（又は類似性）は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメントは、ＣＤＲ移植を用いて且つ表３のＣＤＲ配列を用いて、任意選択的に表２のＣＤＲと組み合わせて、上記の抗体フラグメントに由来する。表２及び表３のＦＲ領域との組合せも組み合わせることができる。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメント、好ましくは本明細書に開示されるＶＨＨは、配列番号５、９、１３を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ１領域と、配列番号６、１０、１４を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ２領域と、配列番号７、１１、１５を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるＣＤＲ３領域とを含む群から選択されるＣＤＲ配列の少なくとも１つの組合せを含むアミノ酸配列によって表される。前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の１つ又は２つのアミノ酸は、得られた抗体フラグメントの活性を実質的に変化させることなく、別の１つのアミノ酸で置換され得る。追加の抗体フラグメント（関連する追加の抗体フラグメントのＦＲ領域の各々の配列番号については、表３を参照されたい）のフレームワーク領域のいずれについても、同じことが当てはまる。これらの抗体フラグメントバリアントの各々も本発明に包含される。前記抗体フラグメントバリアントの活性は、本明細書で先に定義した特異的結合活性である。本発明に関連して、「実質的」とは、初期ＣＤＲ及び／又はＦＲ領域を有する抗体フラグメントの活性と比較して、前記結合活性の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％が依然として検出可能であることを意味し得る。
第１の態様の抗体フラグメントのＣＤＲ領域及び／又はＦＲ領域（表２を参照されたい）を追加の抗体フラグメントのＣＤＲ領域及び／又はＦＲ領域（表３を参照されたい）と組み合わせることも包含される。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメントは、上記で同定されたＣＤＲを参照することによって定義され、これは、配列番号２６の６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれるアミノ酸ストレッチ又は領域内に含まれるエピトープを有する（第２の構造的特徴）。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメントは、上記で同定されたＣＤＲを参照することによって定義され、これは、配列番号２６の６５～９０及び１０１～１４０内に含まれるアミノ酸ストレッチ又は領域の組合せ内に含まれる構造的エピトープを有する（第２の構造的特徴）。
一実施形態では、本発明の追加の抗体フラグメントは、上記で同定されたＣＤＲを参照することによって定義され、配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つに接触するか、又は結合するか、又は特異的に結合する（第２の構造的特徴）。
Figure 2023541601000003
Figure 2023541601000004
抗体フラグメントを含む化合物
更なる態様では、抗体フラグメント、好ましくは先の態様で定義されたＶＨＨ又はそのフラグメントが提供され、前記抗体フラグメント、好ましくは前記ＶＨＨ又はそのフラグメントは、部分構造などのエンティティに連結又はカップリングされる。本発明に関連して、部分構造などのエンティティに連結した抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントは、化合物と呼ばれ得る。したがって、本出願に関連して、化合物は、本発明の抗体フラグメント及びエンティティを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。
本明細書で先に開示されるように、本発明の抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ（又はそのフラグメント）は、本明細書で同定される構造的特徴（好ましくは第１及び／又は第２の構造的特徴）によって表される。代替的に又は前記構造的特徴との組合せにおいて、前記抗体フラグメント、好ましくは本発明のＶＨＨ（又はそのフラグメント）は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰと特異的に結合する機能的特徴によって特徴付けられ、好ましくは、これは、ヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰと特異的に結合する機能的特徴によって特徴付けられる。一実施形態では、前記抗体フラグメント、好ましくは本発明のＶＨＨ（又はそのフラグメント）は、この抗体フラグメントがモジュレータ（すなわち阻害剤ではなく、ヒト及び／又はマウスＦＡＰの活性化剤ではない）ではないという機能的特徴を特徴とする。したがって、本発明の抗体フラグメント、ＶＨＨ又はＶＨＨのフラグメントは、構造的特徴及び／又は機能的特徴の少なくとも１つを満たすべきである。
エンティティ及び抗体フラグメントは、互いに連結又はカップリングされ得る。エンティティは、本明細書で後述するように細胞であり得る。エンティティが細胞である場合、「エンティティに連結又はカップリングされた抗体フラグメント」という表現は、抗体フラグメントが前記細胞内又は前記細胞上で発現されることを意味する。本発明の抗体フラグメントをコードする核酸分子は、本明細書で後に開示される。
部分構造の同一性及び／又は連結の種類は、抗体フラグメント、又は部分構造、又は化合物について想定される用途の種類に応じて異なり得る。部分構造は、本明細書で定義される分子又は標識であり得る。
ターゲティング用途のための化合物
一実施形態では、抗体フラグメント（好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメント）に連結される部分構造は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰを発現する細胞、組織、器官に送達される分子である。本発明に関連して、「化合物」は、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメント（全て本明細書で定義される）であるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなり、前記抗体フラグメントは、前記細胞、組織、器官に送達される部分構造、好ましくは分子に連結されている。ＦＡＰを発現する細胞、組織、器官に作用することが知られている任意の部分構造、分子又は医薬品は、潜在的に本発明によって包含され、且つ本発明の抗体フラグメントに連結され得るであろう。分子は、ペプチド、小分子又は核酸であり得る。ペプチドは、サイトカインであり得る。小分子は、化学療法薬であり得る。エンティティは、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＢＩＴＥ又はＬＩＴＥなどの細胞であり得る。
一実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、ＡｃＴａｋｉｎｅ（標的上活性サイトカイン）又はＡｃＴａｆｅｒｏｎ（ＩＦＮα系ＡｃＴａｋｉｎｅ）、好ましくは国際公開第２０１７０７７３８２Ａ１号パンフレット、同第２０１７１３４３０１Ａ１号パンフレット、同第２０１７１９４７８３Ａ１号パンフレット、同第２０１７１９４７８２Ａ２号パンフレット、同第２０１８０７７８９３Ａ１号パンフレット、同第２０１８１４１９６４Ａ１号パンフレット、同第２０１８１４４９９９Ａ１号パンフレット、同第２０１９０３２６６１Ａ１号パンフレット、同第２０１９０３２６６３Ａ１号パンフレット、同第２０１９０３２６６２Ａ１号パンフレット、同第２０１９１４８０８９Ａ１号パンフレット、同第２０１９１９１５１９Ａ１号パンフレット又は同第２０２００３３６４６Ａ１号パンフレットに記載のＡｃＴａｋｉｎｅ又はＡｃＴａｆｅｒｏｎである。この実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、好ましくは、癌用医薬品である。更に、抗体フラグメントに連結された部分構造を含む化合物は、好ましくは、癌のための医薬品である。
一実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、ピロロベンゾジアゼピン、好ましくは国際公開第２０１４０５７０７４Ａ１号パンフレット、同第２０１５０５２３２２Ａ１号パンフレット、同第２０１４１４０１７４Ａ１号パンフレット、同第２０１５０５２３２１Ａ１号パンフレット、同第２０１７１８６８９４Ａ１号パンフレット、同第２０１７１３７５５５Ａ１号パンフレット、同第２０１７１３７５５３Ａ１号パンフレット、同第２０１６０３８３８３Ａ１号パンフレット又は同第２０１８１９２９４４Ａ１号パンフレットに記載されるものなどのピロロベンゾジアゼピン二量体であり、本明細書において、より好ましくは、前記ピロロベンゾジアゼピン二量体は、以下からなる群から選択される：
－ （１１Ｓ，１１ａＳ）－４－（（２Ｒ，５Ｒ）－３７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５－イソプロピル－２－メチル－４，７，３５－トリオキソ－１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１－オクタオキサ－３，６，３４－トリアザヘプタトリアコンタナミド）ベンジル１１－ヒドロキシ－８－（（５－（（（１１Ｓ，１１ａＳ）－１１－ヒドロキシ－１０－（（（４－（（１０Ｒ，１３Ｒ）－１０－イソプロピル－１３－メチル－８，１１－ジオキソ－２，５－ジオキサ－９，１２－ジアザテトラデカンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－７－メトキシ－２－メチル－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル）オキシ）ペンチル）オキシ）－７－メトキシ－２－メチル－５－オキソ－１１，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－１０（５Ｈ）－カルボキシレート、
－ （Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（２－（２－（２－（２－（４－（（（８－メトキシ－２－（６－メトキシナフタレン－２－イル）－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－７－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）プロパンアミド、
－ （Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（２－（２－（２－（２－（４－（（（２－メチレン－５－オキソ－２，３，５，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－７－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）プロパンアミド、
－ １－（３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（３－（（（Ｓ）－８－（（５－（（（Ｓ）－７－メトキシ－２－メチル－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－８－イル）オキシ）ペンチル）オキシ）－２－メチル－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－７－イル）オキシ）プロピル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－アミド、
－ ３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（２－（２－（２－（２－（４－（（（（Ｓ）－８－（（５－（（（Ｓ）－７－メトキシ－２－メチル－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－８－イル）オキシ）ペンチル）オキシ）－２－メチル－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－７－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）プロパンアミド、
－ １－（３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパンアミド）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（Ｓ）－７－メトキシ－８－（（５－（（（Ｓ）－７－メトキシ－２－（４－（４－メチルピペラジン－１－イル）フェニル）－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－８－イル）オキシ）ペンチル）オキシ）－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－２－イル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－アミド、
－ ６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（Ｓ）－８－（３－（（（Ｓ）－２－（３－フルオロ－４－メトキシフェニル）－７－メトキシ－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［エルピロロ［１，２－ａｌ［１，４１ジアゼピン－８－イル）オキシ）プロポキシ）－７－メトキシ－５－オキソ－５，１１ａ－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［エルピロロ［１，２－ａｌＨ，４１ジアゼピン－２－イル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）ヘキサンアミド、
－ （Ｒ）－２－（（３－ニトロピリジン－２－イル）ジスルファニル）プロピル（１１Ｓ，１１ａＳ）－１１－ヒドロキシ－７－メトキシ－８－（３－（（（Ｓ）－７－メトキシ－２－メチレン－５－オキソ－２，３，５，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル）オキシ）プロポキシ）－２－メチレン－５－オキソ－２，３，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－１０（５Ｈ）－カルボキシレート、
－ ４－（（２Ｓ，５Ｓ）－３７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１イル）－５－イソプロピル－２－メチル－４，７，３５－トリオキソ－１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１－オクタオキサ－３，６，３４－トリアザヘプタトリアコンタナミド）ベンジル（１１Ｓ，１１ａＳ）－１１－ヒドロキシ－７－メトキシ－８－（３－（（（Ｓ）－７－メトキシ－２－メチレン－５－オキソ－２，３，５１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－８－イル）オキシ）プロポキシ）－２－メチレン－５－オキソ－２，３，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアゼピン－１０（５Ｈ）－カルボキシレート、及び
－ ４－（（２Ｓ，５Ｓ）－３７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－５－イソプロピル－２－メチル－４，７，３５－トリオキソ－１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１－オクタオキサ－３，６，３４－トリアザヘプタトリアコンタナミド）ベンジル（１１Ｓ，１１ａＳ）－１１－ヒドロキシ－８－（３－（（（１１Ｓ，１１ａＳ）－１１－ヒドロキシ－１０－（（（４－（（１０Ｓ，１３Ｓ）－１０－イソプロピル－１３－メチル－８，１１－ジオキソ－２，５－ジオキサ－９，１２－ジアザテトラデカン－１４－アミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－７－メトキシ－２－メチレン－５－オキソ－２，３，５，１０，１１，１１ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル）オキシ）プロポキシ）－７－メトキシ－２－メチレン－５－オキソ－２，３，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－１０（５Ｈ）－カルボキシレート。
上記の実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、好ましくは、癌用医薬品である。更に、抗体フラグメントに連結された部分構造を含む化合物は、好ましくは、癌のための医薬品である。
一実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、国際公開第２０１７２１１８０９Ａ１号パンフレットに記載されるものなどの八配位トリウムキレート剤である。この実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、好ましくは、癌用医薬品である。更に、抗体フラグメントに連結された部分構造を含む化合物は、好ましくは、癌のための医薬品である。
一実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、国際公開第２０１５１６２２９３Ａ１号パンフレットに記載のドラスタチン又はアウリスタチンである。この実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、好ましくは、癌用医薬品である。更に、抗体フラグメントに連結された部分構造を含む化合物は、好ましくは、癌のための医薬品である。
一実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、国際公開第２０１５１１８０３０Ａ２号パンフレットに記載されるものなどの細胞溶解素又はＮｉｇｒｉｎ－ｂ Ａ鎖である。この実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、好ましくは、癌用医薬品である。更に、抗体フラグメントに連結された部分構造を含む化合物は、好ましくは、癌のための医薬品である。
一実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、国際公開第２０１５１０３９９０Ａ１号パンフレットに記載されるものなど、２－プロピルトリアゾロ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、４－アミノ－２－（エトキシメチル）－ａ，ａ－ジ－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール、１－（４－アミノ－２－エチルアミノメチルイミダゾ－［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－２－メチルプロパン－２－オール、Ｎ－［４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル－］メタンスルホンアミド、４－アミノ－２－エトキシメチル－ａａ－ジメチル－６，７，８，９－テトラヒドロ－１ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール、４－アミノ－ａａ－ジメチル－２－メトキシエチル－１ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール、１－｛２－［３－（ベンジルオキシ）プロポキシ］エチル｝－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、Ｎ－［４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル］－ｎ’－ブチル尿素、Ｎ１－［２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）エチル］－２－アミノ－４－メチルペンタンアミド、Ｎ－（２－｛２－［４－アミノ－２－（２－メトキシエチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］エトキシ｝エチル）－ｎ’－フェニル尿素、１－（２－アミノ－２－メチルプロピル）－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、１－｛４－［（３，５－ジクロロフェニル）スルホンｙｌ］ブチル｝－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、Ｎ－（２－｛２－［４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］エトキシ｝エチル）－Ｎ’－シクロヘキシル尿素、Ｎ－｛３－［４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］プロピル｝－ｎ’－（３－シアノフェニル）チオ尿素、Ｎ－［３－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－２，２－ジメチルプロピル］ベンズアミド、２－ブチル－１－［３－（メチルスルホンイル）プロピル］－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、Ｎ－｛２－［４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－１，１－ジメチルエチル｝－２－エトキシアセトアミド、１－［４－アミノ－２－エトキシメチル－７－（ピリジン－４－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－２－メチルプロパン－２－オール、１－［４－アミノ－２－（エトキシメチル）－７－（ピリジン－３－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－２－メチルプロパン－２－オール、Ｎ－｛３－［４－アミノ－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－２－（メトキシエチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－７－イル］フェニル｝メタンスルホンアミド、１－［４－アミノ－７－（５－ヒドロキシメチルピリジン－３－イル）－２－（２－メトキシエチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－２－メチルプロパン－２－オール、３－［４－アミノ－２－（エトキシメチル）－７－（ピリジン－３－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］プロパン－１，２－ジオール、１－［２－（４－アミノ－２－エトキシメチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－１，１－ジメチルエチル］－３－プロピル尿素、１－［２－（４－アミノ－２－エトキシメチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－１，１－ジメチルエチル］－３－シクロペンチル尿素、１－［（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メチル］－２－（エトキシメチル）－７－（４－ヒドロキシメチルフェニル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、４－［４－アミノ－２－エトキシメチル－１－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－７－イル］－Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチルベンズアミド、２－エトキシメチル－Ｎ１－イソプロピル－６，７，８，９－テトラヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１，４－ジアミン、１－［４－アミノ－２－エチル－７－（ピリジン－４－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－２－メチルプロパン－２－オール、Ｎ－［４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル］メタンスルホンアミド又はＮ－［４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル］－Ｎ’－シクロヘキシル尿素である。この実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、好ましくは、癌用医薬品である。更に、抗体フラグメントに連結された部分構造を含む化合物は、好ましくは、癌のための医薬品である。
一実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、国際公開第２０１５０５１１９９Ａ２号パンフレットに記載されるものなどのシュードモナス外毒素である。この実施形態では、抗体フラグメントに連結された部分構造は、好ましくは、癌用医薬品である。更に、抗体フラグメントに連結された部分構造を含む化合物は、好ましくは、癌のための医薬品である。
国際公開第２０１７１３７５５３Ａ１号パンフレット、同第２０１６０３８３８３Ａ１号パンフレット、同第２０１８１９２９４４Ａ１号パンフレット、同第２０１５０５１１９９Ａ２号パンフレット、同第２０１７２１１８０９Ａ１号パンフレット、同第２０１４０５７０７４Ａ１号パンフレット、同第２０１５０５２３２２Ａ１号パンフレット、同第２０１４１４０１７４Ａ１号パンフレット、同第２０１５０５２３２１Ａ１号パンフレット、同第２０１７１８６８９４Ａ１号パンフレット、同第２０１７１３７５５５Ａ１号パンフレット、同第２０１５１６２２９３Ａ１号パンフレット、同第２０１５１１８０３０Ａ２号パンフレット、同第２０１５１０３９９０Ａ１号パンフレット、同第２０１７０７７３８２Ａ１号パンフレット、同第２０１７１３４３０１Ａ１号パンフレット、同第２０１７１９４７８３Ａ１号パンフレット、同第２０１７１９４７８２Ａ２号パンフレット、同第２０１８０７７８９３Ａ１号パンフレット、同第２０１８１４１９６４Ａ１号パンフレット、同第２０１８１４４９９９Ａ１号パンフレット、同第２０１９０３２６６１Ａ１号パンフレット、同第２０１９０３２６６３Ａ１号パンフレット、同第２０１９０３２６６２Ａ１号パンフレット、同第２０１９１４８０８９Ａ１号パンフレット、同第２０１９１９１５１９Ａ１号パンフレット及び同第２０２００３３６４６Ａ１号パンフレットは、これらの全体が組み込まれ、これらに開示されている全ての化合物は、本出願に関連して、抗体フラグメントに連結される部分構造であり得る。
標識化合物
更なる態様では、先の態様の１つで定義された抗体フラグメント、好ましくはヒト及び／若しくはマウスＦＡＰに特異的に結合する重鎖抗体（ＶＨＨ）又はそのフラグメントを含むか、又はそれからなるか、又はそれから本質的になる標識化合物が提供され、ここで、前記抗体フラグメントは、標識である部分構造に連結される。
一実施形態では、標識は、放射性核種（すなわち放射性標識）である。抗体フラグメントを放射性核種に標識するプロセスは、説明の最後の定義部分で詳細に開示されている。好ましい実施形態では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメント、好ましくは重鎖抗体（ＶＨＨ）又はそのフラグメントは、部分構造に連結され、その部分構造は、放射性核種である。
この態様では、放射性核種にカップリングした抗体フラグメント、好ましくは重鎖抗体（ＶＨＨ）又はそのフラグメントは、標識又は放射性標識化合物と呼ばれ得る。
一実施形態では、そのような標識化合物は、本明細書で先に定義された構造的特徴（第１の構造的特徴及び／若しくは第２の構造的特徴並びに／又は本明細書で定義された機能的特徴（すなわちヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合し、好ましくはヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰに特異的に結合し、且つ／又はＦＡＰのモジュレータではない）の少なくとも１つ）の少なくとも１つを満たす。
特に治療用途のために本発明の抗体フラグメントに連結することができる好適な放射性核種、好ましくは本明細書に開示されるＶＨＨの例は、例えば、限定されないが、アクチニウム－２２５、アスタチン－２１１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、セシウム－１３７、クロム－５１、コバルト－６０、銅－６７、ジスプロシウム－１６５、エルビウム－１６９、フェルミウム－２５５、金－１９８、ホルミウム－１６６、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、イリジウム－１９２、鉄－５９、鉛－２１２、ルテチウム－１７７、モリブデン－９９、パラジウム－１０３、リン－３２、カリウム－４２、レニウム－１８６、レニウム－１８８、サマリウム－１５３、ラジウム－２２３、ラジウム－２２４、ルテニウム－１０６、スカンジウム－４７、ナトリウム－２４、ストロンチウム－８９、テルビウム－１４９、テルビウム－１６１、テルビウム－１４９、トリウム－２２７、キセノン－１３３、イッテルビウム－１６９、イッテルビウム－１７７及びイットリウム－９０からなる群から選択されるが、これらに限定されない放射性同位体を含む、α線放出放射性核種及びβ－線放出放射性核種からなる群から非限定的に選択することができる。
なお更なる特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物中に存在する放射性核種は、ヨウ素－１３１である。
なお更なる特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物中に存在する放射性核種は、アクチニウム－２２５である。
なお更なる特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物中に存在する放射性核種は、ルテチウム－１７７である。
特に診断用途のために本発明の抗体フラグメントに連結することができる好適な放射性核種、好ましくは本明細書に開示されるＶＨＨの例は、例えば、ヨウ素－１３１、イットリウム－９０、ヨウ素－１２５、ルテチウム－１７７、レニウム－１８６、レニウム－１８８、スカンジウム－４３、スカンジウム－４４、テクネチウム－９９ｍ、テルビウム－１６１、インジウム－１１１、キセノン－１３３、タリウム－２０１、フッ素－１８、ガリウム－６８、ガリウム－６７、銅－６７、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２４、ジルコニウム－８９及び銅－６４からなる群から選択されるものを含む、陽電子放出放射性同位体（ＰＥＴ）又はγ線放出放射性同位体（ＳＰＥＣＴ）からなる群から非限定的に選択することができる。
なお更なる特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物中に存在する放射性核種は、ヨウ素－１３１である。
なお更なる特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物中に存在する放射性核種は、アクチニウム－２２５である。
なお更なる特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物中に存在する放射性核種は、ルテチウム－１７７である。
特にセラノスティック（すなわち診断的及び治療的）用途のために本発明の抗体フラグメントに連結することができる好適な放射性核種、好ましくは本明細書に開示されるＶＨＨの例は、例えば、限定されないが、アクチニウム－２２５、ビスマス－２１３、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、ルテチウム－１７７、イットリウム－９０、銅－６７、レニウム－１８６、レニウム－１８８及びテルビウム－１６１からなる群から非限定的に選択することができる。
一実施形態では、抗体フラグメント、好ましくは重鎖抗体（ＶＨＨ）又はそのフラグメントを分離するリンカーは、ベンゾエートリンカーである。好ましくは、このベンゾエートリンカーは、Ｎ－スクシンイミジル－４－グアニジノメチル－３－［Ｉ－１３１］ヨードベンゾエート（ＳＧＭＩＢ）又はその好適な誘導体を含む。代わりに、２－［ビス［２－［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］アミノ］酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０四酢酸（ＤＯＴＡ）若しくはＮ，Ｎ’－ビス［（６－カルボキシ－２－ピリジル）メチル］－４，１３ジアザ－１８－クラウン－６（ＭＡＣＲＯＰＡ）又はこれらの誘導体を使用し得る。
一実施形態では、標識化合物は、
－ ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント、
－ ＤＴＰＡ又はＤＯＴＡを介してルテチウム－１７７に連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント、
－ ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント、又は
－ テクネチウム－９９ｍに連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント
である。
これらの標識化合物の各々を合成し、実験の部で試験した。
好ましい実施形態では、標識化合物は、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれ、前記抗体フラグメントは、ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている、抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれ、前記抗体フラグメントは、ＤＯＴＡ又はＤＴＰＡを介してルテチウム－１７７に連結されている、抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれ、抗体フラグメントは、ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている、前記抗体フラグメント、又は
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／又は１０１～１４０内に含まれ、前記抗体フラグメントは、テクネチウム－９９ｍに連結されている、抗体フラグメント
である。
好ましい実施形態では、標識化合物は、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、前記抗体フラグメントは、ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている、抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、前記抗体フラグメントは、ＤＯＴＡ又はＤＴＰＡを介してルテチウム－１７７に連結されている、抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、抗体フラグメントは、ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている、前記抗体フラグメント、又は
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、前記抗体フラグメントは、テクネチウム－９９ｍに連結されている、抗体フラグメント
である。
好ましい実施形態では、標識化合物は、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つは、前記抗体フラグメントと相互作用し、前記抗体フラグメントは、ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている、抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つは、前記抗体フラグメントと相互作用し、前記抗体フラグメントは、ＤＯＴＡ又はＤＴＰＡを介してルテチウム－１７７に連結されている、抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つは、前記抗体フラグメントと相互作用し、前記抗体フラグメントは、ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている、抗体フラグメント、又は
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号２６のアミノ酸Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６、Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１、Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１、Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７、Ｖ１５８、Ｇ１５９、Ｒ１７５、Ｄ４５７及び／又はＹ４５８の少なくとも１つは、前記抗体フラグメントと相互作用し、前記抗体フラグメントは、テクネチウム－９９ｍに連結されている、抗体フラグメント
である。
好ましい実施形態では、標識化合物は、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列又はその一部によって表され、ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列又はその一部によって表され、ＤＯＴＡ又はＤＴＰＡを介してルテチウム－１７７に連結されている抗体フラグメント、
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列又はその一部によって表され、ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている抗体フラグメント、又は
－ ヒトＦＡＰ及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列又はその一部によって表され、テクネチウム－９９ｍに連結されている抗体フラグメント
である。
一実施形態では、この配列との配列同一性（又は類似性）は、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。その一部は、本明細書で既に定義されている。
第１、第２、第３又は第４の構造的特徴及び／又は機能的特徴（すなわちヒト及び／又はマウスＦＡＰと特異的に結合し、好ましくはヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰと特異的に結合し、且つＦＡＰ活性を調節しない）に関する他の実施形態の各々を組み合わせて、本発明の標識化合物を更に定義することができる。
標識化合物は、癌抗原と見なされるヒト及び／又はマウスＦＡＰに対して特異的に向けられる。標識化合物は、診断分子及び／又は治療分子として使用することができる。一実施形態では、診断又は治療される疾患は、癌である。
本明細書で使用される場合、ヒトＦＡＰとは、「癌細胞特異的抗原」、「癌特異的抗原」、「癌抗原」、「～上に存在する標的タンパク質」、「～に発現される標的タンパク質」及び／又は「癌細胞に特異的」、「癌細胞特異的標的（タンパク質）」」、「癌（細胞）関連抗原」と見なされ、これらは、本明細書で互換的に使用され、且つヒトＦＡＰが主に癌細胞上並びに腫瘍の近傍及び／又は転移の近傍に存在する（又は主にそこで発現する）という事実を指す。ＦＡＰは、腫瘍形成機能を有する癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）で特異的に発現、より特異的には過剰発現される。これは、一部の癌細胞（例えば、白血病、骨、子宮、膵臓、皮膚、筋肉、脳、乳房、結腸直腸、食道、胃、肝臓、肺、卵巣、副甲状腺、腎臓の癌など）でも発現される（Ｐｕｒｅら（２０１８年）「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ａｕｇ」；第３７巻（第３２号）：第４３４３～４３５７頁、本明細書で後に開示）。ＦＡＰは、健康な細胞ではほとんど発現されない。したがって、ヒトＦＡＰは、腫瘍抗原又は癌細胞抗原と見なされ得、したがって診断標的及び／又は治療標的として使用され得る。
例えば、ヒトＦＡＰは、癌関連線維芽細胞で発現される。本明細書で使用される場合、用語「ＦＡＰ陽性」、又は「ＦＡＰを発現すること」、又は「ＦＡＰを過剰発現すること」とは、ＦＡＰタンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌性若しくは悪性のヒト細胞及び／又は癌関連線維芽細胞若しくは組織を指し得、したがって、これは、正常な健康な細胞と比較して異常に高いレベルのＦＡＰ遺伝子及び／又はＦＡＰタンパク質を有する。これに関連して、「過剰発現」とは、発現が対照細胞株における発現の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えることを意味し得る。対照細胞株は、健常細胞又は非疾患細胞であり得る。
別の実施形態では、標識化合物中に存在する標識は、非放射性標識である。一実施形態では、そのような非放射性標識は、蛍光標識である。この非放射性標識化合物は、本明細書で定義される診断用途に使用することができる。代替的な用途には、画像誘導手術又は光線力学療法が含まれる。診断用途に適した蛍光標識の例としては、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ変形、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（フルオレセイン）、クマリン、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、パシフィックオレンジ、ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン）が挙げられる。画像誘導手術に適した蛍光標識の例としては、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ６８０－ＲＤ、ＺＷ８００－１、ＦＮＩＲ（例えば、Ｐｉｅｔｅｒｊａｎ Ｄｅｂｉｅら、「Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（２０１９年）；第１０巻：第５１０号、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１９．００５１０、ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６５２７７８０ ＰＭＩＤ：３１１３９０８５）が挙げられる。光線力学的療法に適した蛍光標識の例としては、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸが挙げられる。ほとんどの標識はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ又はＬｉｃｏｒから入手することができる。
組成物
更なる態様では、ＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントを含むか又はそれから本質的になる組成物が提供される。更なる態様では、前記抗体フラグメントが部分構造などのエンティティに連結されている場合、化合物を含むか又はそれから本質的になる組成物も提供される。組成物は、賦形剤を含む。賦形剤は、診断及び／又は治療目的に許容されるべきである。一実施形態では、組成物は、医薬組成物である。別の実施形態では、組成物は、診断用組成物である。組成物が医薬組成物及び診断用組成物であることも本発明に包含される。本発明の好適な製剤は、本明細書の最後の定義部に開示される。
本明細書で定義される診断用組成物は、スクリーニング用量又は層別用量を含み得、したがってスクリーニング組成物又は層別組成物と称され得る。
本明細書で想定されるような医薬組成物は、ヒトＦＡＰに関連する疾患及び障害の予防及び／又は処置で使用され得る。一実施形態では、疾患は、ヒトＦＡＰの発現又は過剰発現に関連する癌である。特に、本出願は、温血動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトにおける予防的及び／又は治療的使用に適した医薬組成物を提供する。
キット
更なる態様では、キットも提供される。そのようなキットは、本明細書に記載の診断及び治療用途に適している。そのような用途には、本発明の抗体フラグメントの使用、部分構造などのエンティティに連結された抗体フラグメントを含む本発明の化合物の使用が含まれ、前記部分構造は、放射性標識又は非放射性標識である。キットのより詳細な定義は、説明の最後の定義の目的のための部分で詳細に説明される。
抗体フラグメント及び標識化合物の診断的使用
更なる態様では、抗体フラグメント若しくは標識化合物又はこれらを含む組成物が、対象又は前記対象の単離された試料におけるヒトＦＡＰの発現を評価するために使用される方法が提供される。この方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）本明細書で同定される抗体フラグメント又は標識化合物を提供すること、
（ｂ）それを対象に投与するか、又はそれを対象の単離された試料と接触させること、
（ｃ）前記対象又は前記対象の前記単離された試料におけるヒトＦＡＰの発現を評価すること。
この方法は、診断法と称され得る。この方法は、インビトロ又はインビボ方法であり得る。この方法は、対象又は前記対象の単離された試料におけるヒトＦＡＰの発現の局在化を可能にし得、且つ前記対象における特定の疾患、及び／又は障害、及び／又は状態の予想及び／又は予後診断を可能にし得る。一実施形態では、この方法は、癌治療又は創傷治癒治療又は線維症治療などの特定の治療に応答する可能性が高い患者を同定するための層別化法であり得る。したがって、更なる態様では、抗体フラグメント若しくは標識化合物又はこれらを含む組成物を使用して対象を層別化し、且つ対象が癌治療又は創傷治癒治療又は線維症治療などの特定の治療に応答する可能性があるかどうかを評価する方法が提供される。この方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）本明細書で同定される抗体フラグメント又は標識化合物を提供すること、
（ｂ）対象又は対象の単離された試料にそれを投与すること、
（ｃ）前記対象又は前記対象の前記単離試料におけるヒトＦＡＰの発現を評価すること、及び
（ｄ）対象が、本発明の標識化合物を含むものなどの医学的治療に応答性である可能性が高いかどうかを決定すること。
本発明の抗体フラグメントは、このような診断法で使用され得る。本発明の抗体フラグメントは、それ自体、そのような方法で使用するために、標識にカップリングする必要はない。そのような方法は、ＥＬＩＳＡであり得る。
任意選択的に、上で定義された方法が放射性標識化合物を用いて実施される場合、治療に適した放射性標識化合物又はそのバージョンは、治療として対象に投与される。対象は、好ましくは、ヒトである。本明細書で先に定義したようなあらゆる放射性標識化合物がこの方法に好適である。詳細な情報は、本明細書で同定される標識化合物を生成／提供及び投与するために、説明の最後の定義部に開示されている。診断目的及び治療目的のための標識化合物の投与は、同様である。この態様にかかる方法は、インビトロ法、エクスビボ法であり得る。
一実施形態では、スクリーニング用量又はバイオマーカ用量が対象又は前記対象の単離された試料に投与される。詳細な定義は、特に、治療用量の定義と比較することによって後に提供される。
診断方法の一実施形態では、標識化合物は、
－ ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント、
－ ＤＴＰＡ又はＤＯＴＡを介してルテチウム－１７７に連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント、又は
－ テクネチウム－９９ｍに連結されている、本明細書で先に定義された抗体フラグメント
である。
これらの標識化合物の各々を合成し、実験の部で試験した。
対象におけるヒトＦＡＰの発現の評価は、好ましくは、説明の最後の定義の目的のための部分に開示されるようなイメージングを用いて行われる。代わりに、対象におけるヒトＦＡＰの発現の評価は、好ましくは、対象の単離された試料を用いて行われる。本発明に関連して、対象の単離された試料は、前記対象からの組織又は液体試料であり得る。液体は、血清であり得る。患者から単離された試料は、生検又は腫瘍生検と呼ばれ得る。
（標識）化合物の治療的使用
更なる態様では、医薬品として使用するための抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ若しくはそのフラグメント、又は化合物若しくは標識化合物、又は組成物（全て本明細書で定義される通り）が提供される。
一実施形態では、化合物は、抗体フラグメント（好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメント）に連結される部分構造などのエンティティを含み、前記部分構造は、ＦＡＰを発現又は過剰発現する細胞、組織、器官に送達されるべき分子である。分子は、ペプチド又は小分子、核酸であり得る。ペプチドは、サイトカインであり得る。小分子は、化学療法薬であり得る。エンティティは、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＢＩＴＥ又はＬＩＴＥなどの細胞であり得る。この化合物又はそれを含む組成物は、ＦＡＰの発現又は過剰発現に関連する疾患又は状態を処置するための医薬品であり得る。
ＦＡＰを発現する細胞、組織、器官に作用することが知られている任意の部分構造、分子又は医薬品は、潜在的に本発明によって包含され、且つ本発明の抗体フラグメントに連結され得るであろう。
別の実施形態では、化合物は、標識化合物であり、前記標識化合物又はそれを含む組成物は、癌を治療するための医薬品である。一実施形態では、前記癌は、癌又は腫瘍細胞又は転移した病変部におけるヒトＦＡＰの発現に関連する。治療される癌は、転移性であり得、好ましくは、転移性細胞は、脳、骨、肝臓、肺に見られる。ＦＡＰの発現に関連する癌は、白血病、骨、子宮、膵臓、ＧＥＰ－ＮＥＴ（胃腸膵臓神経内分泌腫瘍）、皮膚、筋肉、脳、乳房、結腸直腸、食道、胃、肝臓、肺、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、卵巣、副甲状腺、腎臓の癌細胞、ＣＵＰ（原発性が不明な癌）、前立腺、小腸、ＣＣＣ（胆管細胞癌）、肉腫のいずれかであり得る（Ｐｕｒｅら（２０１８年）「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」、８月；第３７巻（第３２号）：第４３４３～４３５７頁及びＦｒｅｄｅｒｉｋ Ｇｉｅｓｅｌら、「Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ」、２０１９年５月１日、第６０巻補足１、概要２８９）。
しかしながら、本発明は、これらのタイプの癌に限定されない。対象が、ヒトＦＡＰを発現又は過剰発現する癌細胞を有することが疑われると直ちに、標識化合物又はそれを含む組成物が使用され得る。
一実施形態では、対象は、本発明の標識化合物を用いて最初に診断された後、同じ又は異なる標識化合物で治療される。核種の同一性は、診断及び治療用途において同じではない場合がある。
この治療方法又は使用の一実施形態では、標識化合物は、
－ ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント、
－ ＤＴＰＡ又はＤＯＴＡを介してルテチウム－１７７に連結されている、本明細書で先に定義されたような抗体フラグメント、又は
－ ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている、本明細書で先に定義された抗体フラグメント
である。
これらの標識化合物の各々を合成し、実験の部で試験した。
本発明に関連して、疾患又は病態又は障害は、それぞれ標識化合物の投与が行われた場合、予防又は治療され、且つ
－ 前記疾患若しくは病態若しくは障害に関連する少なくとも１つの症状の改善、及び／又は
－ 前記疾患若しくは病態若しくは障害に関連する少なくとも１つのパラメータの改善
において得られた。
改善は、化合物、それぞれの標識化合物を投与した少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後に観察され得る。代わりに、化合物、それぞれ標識化合物の投与の少なくとも１ヶ月後、６ヶ月後に改善が観察され得る。想定される用量及び投与様式は、本明細書の最後の定義部で更に開示される。
標識化合物又はそれを含む組成物は、以下の少なくとも１つが満たされる場合に抗癌活性を呈する：
（処置されていないもの若しくは対照で処置されたもの又は処置開始時の対象と比較して）
－ ヒトＦＡＰを発現する腫瘍細胞、癌細胞及び／又はＣＡＦを死滅させることができる、
－ そのような腫瘍細胞又は癌細胞の成長及び／又は増殖を低減又は遅延させることができる。
－ 原発腫瘍又は転移巣のサイズを縮小することができる、
－ 転移及び／又は腫瘍細胞遊走の発生を遅延させることができる、
－ 腫瘍重量又は成長の増加を遅延させることができる、
－少なくとも１ヶ月、数ヶ月又はそれを超えて患者の生存期間を延ばすことができる。
標識化合物の投与後の生存癌細胞及び／又は生存腫瘍細胞の数が初期の生存癌細胞及び／又は初期の生存腫瘍細胞の数の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満である場合、抗癌活性が同定又は決定され得る。
標識化合物の投与後の原発腫瘍のサイズ及び／又は転移巣のサイズが前記原発腫瘍のサイズ及び／又は前記転移巣のサイズの９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満である場合、抗癌活性が同定又は決定されている可能性がある。
腫瘍細胞死は、細胞死をインビトロで測定するための分子イメージング剤である放射性標識アネキシンＡ５の測定及びＩＣＨなどの癌患者における非侵襲的な測定によって評価され得る（Ｓｃｈｕｔｔｅｒｓ Ｋ．ら、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」（２０１０年）；ｄｅ Ｓａｉｎｔ－Ｈｕｂｅｒｔ Ｍ．ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４８巻：第１７８頁、２００９年）。ＩＣＨは、説明の最後の定義部で定義されている。
腫瘍成長は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％又はそれを超えて阻害され得る。腫瘍成長は、当業者に公知の技術を用いて評価することができる。腫瘍成長は、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピュータ断層イメージング法）を用いて評価することができる。
特定の実施形態では、腫瘍重量増加又は腫瘍成長は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％又はそれを超えて阻害され得る。腫瘍重量又は腫瘍成長は、当業者に公知の技術を用いて評価することができる。腫瘍成長の検出又は腫瘍細胞の増殖の検出は、グルコース類似体２－［１８Ｆ］－フルオロ－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（ＦＤＧ－ＰＥＴ）又は［１８Ｆ］－’３－フルオロ－’３－デオキシ－Ｌ－チミジン（ＦＬＴ－ＰＥＴ）を用いた陽電子放射断層撮影でグルコース利用の変化を測定することにより、インビボで評価され得る。エクスビボ代替物は、Ｋｉ６７による腫瘍生検の染色であり得る。
転移の発生及び／又は腫瘍細胞遊走の遅延は、少なくとも１週間、１ヶ月、数ヶ月、１年以上の遅延であり得る。転移の存在は、ＭＲＩ、ＣＴ若しくはエコー検査又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出を可能にする技術を用いて評価することができる。後者の試験の例は、末梢血からのＣＴＣのＥｐＣａｍベースの磁気選別である、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣ試験（Ｖｅｒｉｄｅｘ）である。
特定の実施形態では、腫瘍成長は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日若しくは１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月又はそれを超えて遅延又は阻害され得る。特定の実施形態では、転移の発生は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月又はそれを超えて遅延する。
本発明の標識化合物は、ヒトＦＡＰを発現する癌、又は腫瘍細胞、又は転移巣、又はＣＡＦに結合すると、放射線毒性の機序によってその抗癌活性を発揮する。
腫瘍細胞、癌細胞、病変、転移巣及び標識化合物の用量は、定義と題したセクションで定義されている。
更なる態様では、疾患、及び／又は障害、及び／又は病態の予防及び／又は治療のための方法であって、それを必要とする対象に、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ若しくはそのフラグメント又は本明細書で想定される化合物若しくは標識化合物若しくは組成物を投与することを含む方法が提供される。この方法の全ての特徴は、本明細書で先に定義されている。
非ヒト哺乳動物
更なる態様では、ヒトＦＡＰの発現を可能にする核酸構築物を含む非ヒト動物が提供される。非ヒト動物は、哺乳動物であり得る。好ましい哺乳動物には、マウス、ラット、ウサギが含まれる。そのような動物は、当業者に公知の一般的な知識技術を用いて得ることができる。一実施形態では、そのような非ヒト動物は、その内因性ＦＡＰをもはや発現しないように改変され得る。一実施形態では、非ヒト動物の内因性ＦＡＰは、ヒトＦＡＰ遺伝子によって置き換えられている。ヒトＦＡＰコード核酸は、配列番号２５によって表される。この遺伝子の置き換えは、当業者に公知の相同組換えによって行うことができる。一実施形態では、使用されるターゲティングベクターは、配列番号２７を含む。好ましい実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、配列番号２７を含むターゲティングベクターは、当業者に公知の技術を用いて導入されている。得られたマウスは、もはやマウスＦＡＰを発現せず、代わりにヒトＦＡＰを発現する。一実施形態では、マウスは、実施例２に記載されるように得られている。一実施形態では、ヒトＦＡＰの発現は、本発明の標識化合物によって前記非ヒト動物において評価される。代わりに、それは、ヒトＦＡＰに特異的であることが知られている他の抗体又は抗体フラグメント、例えば市販のマウス抗ヒト線維芽細胞活性化タンパク質アルファＡＰＣコンジュゲート化抗体など（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ３７１５Ａ）を用いて評価することができる。ヒトＦＡＰの発現がこの非ヒト動物において検証されたら、この発現を使用して、本発明の抗体フラグメント、化合物又は標識化合物の機能性を評価することができる。したがって、この非ヒト動物は、ヒトＦＡＰに特異的に結合する分子をスクリーニングするための方法において、好ましくは本発明の新規な抗体フラグメント又は化合物で使用され得る。
定義
以下の用語又は定義は、単に本発明の理解を促進するために提供される。本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者にとって同じ意味を有する。専門家は、当技術分野の定義及び用語について、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９年）；及びＡｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（補足４７）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９年）を参照されたい。本明細書で提供される定義は、当業者によって理解される範囲よりも小さい範囲を有すると解釈されるべきではない。
特に示されていない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術及び操作は、当業者に明らかであるように、それ自体が公知の様式で実行することができ、且つ実行されている。例えば、標準的なハンドブック、上記で参照された一般的な背景技術及びそこに引用されている更なる参考文献が再び参照される。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａ）」及び「その」は、文脈上他に明確に指示されない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
本明細書で使用される「含んでいる」、「含む」及び「構成される」という用語は、「包含している」、「包含する」又は「含有している」、「含有する」と同義であり、且つ包括的又は非限定的であり、追加の列挙されていない部材、要素又は方法工程を除外しない。生成物又は組成物（「から本質的になる生成物」又は「から本質的になる組成物」）に関連して使用される「から本質的になる」という表現は、追加の分子が存在し得るが、そのような分子が前記製品又は組成物の特徴／活性／機能性を、変化／改変させないことを意味する。例えば、組成物自体が抗体フラグメントの１つと同様の特徴／活性／機能性を呈する場合、組成物は、抗体フラグメントから本質的になり得る。
端点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包含される全ての数及び分数並びに列挙された端点を含む。
パラメータ、量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」という用語は、特定の値の＋／－１０％以下、好ましくは＋／－５％以下、より好ましくは＋／－１％以下、更により好ましくは＋／－０．１％以下の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示された発明において実行するのに好適である場合に限る。修飾語「約」が指す値自体も具体的に且つ好ましくは開示されていることを理解されたい。
ポリペプチド／核酸分子及び同一性／類似性
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は、それらの完全名によって又は標準的な３文字若しくは１文字のアミノ酸コードに従ってのいずれかで示される。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、且つコードされたアミノ酸及びコードされていないアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。「ペプチド」は、通常、最大５０アミノ酸の長さを有するアミノ酸のポリマーでもある。ポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列によって表される。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」という用語は、互換的に使用され、且つデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はそれらのアナログのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。核酸分子は、主にその塩基配列を特徴とする核酸配列によって表される。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、且つ既知又は未知の任意の機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマが挙げられる。核酸分子は、直鎖状又は環状であり得る。
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、同じ又は異なるタクソンに由来する２つの高分子間、特に２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド間の少なくとも二次的な構造的同一性又は類似性を意味し、ここで、前記類似性は、共通の祖先に起因するものである。したがって、「ホモログ」という用語は、前記二次構造類似性及び任意選択的に三次構造類似性を有するそのような関連高分子を示す。２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性（のパーセンテージ）」は、当業者に公知の方法を用いて、例えば第２のヌクレオチド配列の対応する位置のヌクレオチドと同一である第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドの数を第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で除算し、１００％を乗じるか、又はＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔなどの配列アラインメントのための公知のコンピュータアルゴリズムを使用することによって計算することができる。２つのアミノ酸配列間の配列類似性の程度を決定する際、当業者は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換され、且つポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性にほとんど又は本質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換として一般に記載することができる、いわゆる「保存剤」アミノ酸置換を考慮し得る。可能な保存的アミノ酸置換は、当業者に明らかであろう。アミノ酸配列及び核酸配列は、それらの全長にわたって１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であると言われる。
本出願を通して、特定のアミノ酸配列の配列番号（例として、配列番号Ｙをとる）を指すたびに、これは、配列番号Ｙのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドによって置き換え得る。
本明細書に記載の各アミノ酸配列は、所与のアミノ酸配列とのその同一性パーセンテージ（少なくとも８０％）により、更なる好ましい実施形態では、それぞれ所与のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性を有する。好ましい実施形態では、配列同一性は、本明細書で同定される配列の全長を比較することによって決定される。本明細書に記載の各アミノ酸配列は、所与のアミノ酸配列とのその類似性パーセンテージ（少なくとも８１％）により、更なる好ましい実施形態では、それぞれ所与のアミノ酸配列と少なくとも８１％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える類似性を有する。好ましい実施形態では、配列類似性は、本明細書で同定される配列の全長を比較することによって決定される。本明細書で別段示されない限り、所与の配列番号との同一性又は類似性は、前記配列の全長（すなわちその全長にわたって又は全体として）に基づく同一性又は類似性を意味する。
「配列同一性」は、本明細書では、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、本明細書で同定される配列番号全体又はその一部内のそれらの同一性を評価することによって定義される。その一部は、配列番号の長さの少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を意味し得る。
当技術分野では、「同一性」は、そのような配列のストリング間の一致によって決定され得るように、アミノ酸配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定するものではないが、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」、第Ｉ分、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；及び「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、「ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．」、第４８巻：第１０７３頁（１９８８年）を含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験した配列間で最大のマッチを与えるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第１２巻（第１号）：第３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２１５巻：第４０３～４１０頁（１９９０年））、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（Ｍａｄｅｉｒａ，Ｆ．ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第４７巻（第Ｗ１号）：第Ｗ６３６～Ｗ６４１頁」（２０１９年））が挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公的に入手可能である（「ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２１５巻：第４０３～４１０頁（１９９０年））。ＥＭＢＯＳＳプログラムはＥＭＢＬ－ＥＢＩから公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を決定することもできる。使用される好ましいプログラムはＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅプログラムである。
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータには、以下が含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第４８巻（第３号）：第４４３～４５３頁（１９７０年）；比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆからのＢＬＯＳＵＭ６２、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．」第８９巻：第１０９１５～１０９１９頁（１９９２年）；ギャップ開始ペナルティ（Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ）：１０；及びギャップ延長ペナルティ（Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ Ｐｅｎａｌｔｙ）：０．５。これらのパラメータに有用なプログラムは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩからＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅプログラムとして公開されている。前述のパラメータは、タンパク質のＧｌｏｂａｌ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅアラインメントのデフォルトパラメータである（末端ギャップに対するペナルティなし）。
核酸比較のための好ましいパラメータには、以下が含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第４８巻：第４４３～４５３頁（１９７０年）；比較マトリックス：ＤＮＡｆｕｌｌ；ギャップ開始ペナルティ：１０；ギャップ延長ペナルティ：０．５。これらのパラメータに有用なプログラムは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩからＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅプログラムとして公開されている。前述のパラメータは、ヌクレオチド配列のＧｌｏｂａｌ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅアラインメントのデフォルトパラメータである（末端ギャップに対するペナルティなし）。
任意選択的に、アミノ酸類似性の程度を決定する際、当業者に明らかなように、当業者は、いわゆる「保存剤」アミノ酸置換も考慮し得る。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンである。脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンである。アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンである。芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンである。塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン及びヒスチジンである。酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。天然に存在するアミノ酸の各々に対する好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａ～Ｓｅｒ；Ａｒｇ～Ｌｙｓ又はＧｌｎ；Ａｓｎ～Ａｓｐ、Ｈｉｓ又はＳｅｒ；Ａｓｐ～Ｇｌｕ又はＡｓｎ；Ｇｌｎ～Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ；Ｇｌｕ～Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ；Ｈｉｓ～Ｔｙｒ又はＡｓｎ；Ｉｌｅ～Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＭｅｔ；Ｌｅｕ～Ｉｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌ；Ｌｙｓ～Ａｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕ；Ｍｅｔ～Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅ；Ｐｈｅ～Ｔｒｐ又はＴｙｒ；Ｓｅｒ～Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＡｓｎ；Ｔｈｒ～Ｓｅｒ；Ｔｒｐ～Ｔｙｒ又はＰｈｅ；Ｔｙｒ～Ｈｉｓ、Ｔｒｐ又はＰｈｅ；及びＶａｌ～Ｉｌｅ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換バリアントは、開示される配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は、保存的である。
ヒトＦＡＰに対する好適な抗体フラグメントの単離方法
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体フラグメント（好ましくはＶＨＨ）又はそのフラグメントは、固形腫瘍及び／又は癌細胞上に存在し、且つ／又は固形腫瘍及び／又は癌細胞に特異的である、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに対する親和性選択によって得られる。特定の固形腫瘍抗原又は癌細胞に対する親和性選択によって好適なポリペプチドを得ることは、例えば、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨをその表面（例えば、バクテリオファージ）に発現する細胞のセット、集合体又はライブラリを、腫瘍特異的抗原及び／又は癌細胞特異的抗原に対する結合についてスクリーニングすることによって行われ得る。それらの全ては、本質的に以下の非限定的な工程を含む、それ自体が公知の様式で行われ得る：（ａ）分枝が潜在的な癌薬物の標的であることが公知である、腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子の単離された溶液又は懸濁液を得ること；（ｂ）前記タンパク質標的分子に対するＶＨＨライブラリからのバイオパンニングファージ又は他の細胞；（ｃ）腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子に結合するファージ又は他の細胞を単離すること；（ｄ）個々の結合ファージ又は他の細胞からＶＨＨインサートをコードするヌクレオチド配列を決定すること；（ｅ）組換えタンパク質発現を用いて、この配列に従った量のＶＨＨを生成すること；（ｆ）前記腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子に対する前記ＶＨＨドメインの親和性を決定すること；及び任意選択的は、（ｇ）バイオアッセイにおいて前記ＶＨＨドメインの殺腫瘍活性又は抗癌活性を試験すること。ＶＨＨドメインと腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子との間の親和性を決定するために、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．」第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されるように、当技術分野で一般的な慣行である酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含む様々な方法を使用し得る。平衡解離定数は、ポリペプチドとその標的分子との間の親和性を記述するために一般的に使用される。典型的には、平衡解離定数は、１０－７Ｍ未満である。好ましくは、平衡解離定数は、１０－８Ｍ未満若しくは１０－９Ｍ未満又はより好ましくは１０－９Ｍ～１０－１２Ｍの範囲にわたる。
抗体
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体及びそれらのフラグメント、例えばＦａｂＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及び親抗体の抗原結合機能を保持する他のフラグメントなどを指す。したがって、抗体は、免疫グロブリン若しくは糖タンパク質又はそのフラグメント若しくは部分又は改変免疫グロブリン様フレームワーク内に含まれる抗原結合部分を含む構築物又は非免疫グロブリン様フレームワーク若しくは足場を含む構築物内に含まれる抗原結合部分を指し得る。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、均一な抗体集団を有する抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種又は供給源に関して限定されず、作製される様式によって限定されることも意図されない。この用語は、全免疫グロブリン並びに抗体の抗原結合機能を保持するフラグメント及び他のものを包含する。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体を本発明で使用することができる。しかしながら、実際には、モノクローナル抗体を生成するために必要とされるハイブリッド細胞株又はハイブリドーマを作製する際に使用するためのラット又はマウス細胞株の利用可能性のために、抗体は、典型的にはラット又はマウス起源のものである。
本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、不均一な抗体集団を有する抗体組成物を指す。ポリクローナル抗体は、免疫化動物又は選択されたヒト由来のプール血清に由来することが多い。
本明細書で使用される場合、「抗体又はそのフラグメントの重鎖可変ドメイン」は、（ｉ）ラクダ科動物又はサメ類の重鎖抗体の重鎖の可変ドメインを含むが、これらに限定されない、天然で軽鎖を欠いている重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（以下でＶＨＨとも示される）、又は（ｉｉ）従来の４本鎖抗体の重鎖のラクダ化（本明細書で更に定義）可変ドメイン（以下でラクダ化ＶＨとも示される）を含むが、これに限定されない、従来の４本鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（以下でＶＨとも示される）若しくは限定されないが、腫瘍抗原若しくは癌細胞上に存在する抗原に結合するのに特に適しており、且つ及び本明細書に開示されるＶＨＨ（若しくは本明細書に開示されるＶＨＨのＣＤＲ配列に基づく及び／若しくは由来し得る）に存在し、且つ／若しくはこれに組み込まれ得るアミノ酸残基（すなわち小ペプチド）の１つ以上のストレッチなど、その任意のフラグメントを意味する。一実施形態では、ＶＨＨのフラグメントは、機能的フラグメントである。
本明細書で以下に更に記載されるように、抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列及び構造は、それに限定されるものではないが、当技術分野及び本明細書において以下でそれぞれ「フレームワーク領域１」若しくは「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」若しくは「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」若しくは「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」若しくは「ＦＲ４」と称される４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」から構成されると考えることができ、これらのフレームワーク領域は、当技術分野においてそれぞれ「相補性決定領域１」若しくは「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」若しくは「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」若しくは「ＣＤＲ３」と称される３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」によって中断されている。
本明細書で使用される場合、抗体に関連して、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、Ｈ（重）鎖又はＬ（軽）鎖（それぞれＶＨ及びＶＬとも略される）のいずれかの可変領域を指し、且つ抗原標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性を説明する。このような領域は、「超可変領域」とも称される。ＣＤＲは、可変領域内のアミノ酸の不連続なストレッチを表すが、種にかかわらず、可変重鎖及び可変軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置配置は、可変鎖のアミノ酸配列内に同様の配置を有することが分かっている。全てのカノニカルな抗体の可変重鎖及び可変軽鎖は、各３つのＣＤＲ領域を有し、それぞれの軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）について、各々が他のＣＤＲ領域と不連続である（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称される）。
本明細書において以下で更に記載されるように、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨを含む）におけるアミノ酸残基の総数は、１１０～１３０の領域でもあり得る。しかしながら、抗体の重鎖可変ドメインの部分、フラグメント又はアナログは、そのような部分、フラグメント又はアナログが、これらの部分、フラグメント若しくはアナログが由来する抗体の元の重鎖可変ドメインの機能的活性（の少なくとも一部）を保持し、且つ／又は結合特異性（の少なくとも一部）を保持する限り、それらの長さ及び／又はサイズに関して特に限定されないことに留意すべきである。これらの部分、フラグメント若しくはアナログが由来する抗体の元の重鎖可変ドメインの機能的活性（の少なくとも一部）を保持し、且つ／又は結合特異性（の少なくとも一部）を保持する部分、フラグメント又はアナログは、本明細書では、重鎖可変ドメインの「機能的フラグメント」とも更に称される。
抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨを含む）のアミノ酸残基は、好ましくは、記載のＩＭＧＴ命名法によって与えられるＶドメイン（免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）のＩＭＧＴ固有の番号付けに従って番号付けされる（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ら、１９９７年「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ」第１８巻：第５０９頁、ＰＭＩＤ：９３８６３４２；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．、１９９９年「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ」第７巻：第１３２～１３６頁及びＬｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ら、２００３年、「Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第２７巻：第５５～７７頁、ＰＭＩＤ：１２４７７５０１）。この番号付けによれば（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ（２００３年）の表１を参照されたい）、保存されたアミノ酸、例として、システイン２３（１ｓｔ－ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ－ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ－ＣＹＳ）、フェニルアラニン又はトリプトファン１１８（Ｊ－ＰＨＥ又はＪ－ＴＲＰ）は、常に同じ位置を有する。ＩＭＧＴの固有の番号付けは、フレームワーク領域（ＦＲ１－ＩＭＧＴ：１～２６位、ＦＲ２－ＩＭＧＴ：３９～５５位、ＦＲ３－ＩＭＧＴ：６６～１０４位及びＦＲ４－ＩＭＧＴ：１１８～１２８位）並びに相補性決定領域：ＣＤＲ１－ＩＭＧＴ：２７～３８、ＣＤＲ２－ＩＭＧＴ：５６～６５及びＣＤＲ３－ＩＭＧＴ：１０５～１１７の標準化された区切りを提供する。ギャップは非占有位置を表す。ＣＤＲ１－ＩＭＧＴ及びＣＤＲ２－ＩＭＧＴ（それぞれ１２及び１０アミノ酸長未満）のギャップを、ＣＤＲ－ＩＭＧＴループの最上部に置く。再編成されたＣＤＲ３－ＩＭＧＴの塩基長は１３アミノ酸（１０５～１１７位）であり、これは、１５アミノ酸のＪＵＮＣＴＩＯＮ（Ｊ－ＴＲＰ又はＪ－ＰＨＥ１１８に対する２ｎｄ－ＣＹＳ１０４）に対応する。ＣＤＲ３－ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸未満である場合、ループの上部から、次の順序１１１、１１２、１１０、１１３、１０９、１１４などでギャップが作製される。ＣＤＲ３－ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸を超える場合、ＣＤＲ３－ＩＭＧＴループの上部の１１１～１１２位に以下の順序１１２．１、１１１．１、１１２．２、１１１．２、１１２．３、１１１．３などで追加の位置が作製される。
これに関して、ＶＨＨドメインについて当技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は、変動し得、且つＩＭＧＴ番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応しなくてもよい（すなわちＩＭＧＴ番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列に占有されていなくてもよいか、又は実際の配列がＩＭＧＴ番号付けによって許容される数よりも多くのアミノ酸残基を含み得る）ことに留意すべきである。これは、一般に、ＩＭＧＴによる番号付けが実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応しても又はしなくてもよいことを意味する。
代わりに、抗体の可変ドメインのアミノ酸残基（ＶＨＨ又はＶＨを含む）は、Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔら、１９８７年、アメリカ国立衛生研究所；１９８７年、第８０４頁、発行番号１６５～４６２）に従って番号付けすることができる。免疫グロブリンＶ領域のＩＭＧＴとＫａｂａｔの番号付けの対応は、例えば、Ｌｅｆｒａｎｃら（２００３年）の表２に見出すことができる。
重鎖抗体及びその可変ドメインの一般的な説明については、とりわけ、一般的な背景技術として、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．ら（２０１３年）「Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第８２巻：第７７５～７９７頁を参照されたい。
一般に、本明細書で使用される「重鎖可変ドメイン」という用語は、その最も広い意味で、特定の生物学的供給源又は特定の調製方法に限定されないことに留意されたい。例えば、以下により詳細に考察されるように、本明細書に開示されるような重鎖抗体（すなわちＶＨＨ）に由来する重鎖可変ドメインは、（１）天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離することにより；（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現により；（３）任意の動物種、特にヒトなどの哺乳動物の種由来の天然に存在するＶＨドメインの「ラクダ化」（以下に記載）若しくはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現により；（４）Ｗｅｉｚａｏ Ｃ．ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ」（２００９年）第５２５巻：第８１～９９頁）に記載の「ドメイン抗体」若しくは「ｄＡｂ」の「ラクダ化」若しくはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現により、（５）タンパク質、ポリペプチド若しくは他のアミノ酸配列を調製するための合成若しくは半合成技術を用いて；（６）核酸合成のための技術を用いてＶＨＨをコードする核酸を調製し、続いて、このようにして得られた核酸を発現させることにより；及び／又は（７）上記の任意の組合せにより得ることができる。上記を実行するための好適な方法及び技術は、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば本明細書で以下により詳細に説明する方法及び技術を含む。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体フラグメントなどの抗体フラグメントは、それが生成される宿主細胞及び／又は培地から抽出又は精製されている場合、本明細書で使用される「（～において）本質的に単離された（形態）」と見なされる。
抗体フラグメントのバリアント
本発明は、本発明の抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ配列又はそのフラグメント（又はそれらを発現するために使用される本発明のヌクレオチド配列）の起源に関して限定されないことに留意すべきである。更に、本発明は、本明細書に開示される抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ配列又はヌクレオチド配列が産生又は取得された方法に関しても限定されない。したがって、本明細書に開示されるアミノ酸配列は、合成又は半合成のアミノ酸配列、ポリペプチド又はタンパク質であり得る。
本発明は、抗体フラグメントの部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、バリアント及び／若しくは誘導体、好ましくは本明細書に開示されるようなヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに特異的に結合するＶＨＨ並びに／又はそのような部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、バリアント及び／若しくは誘導体の１つ以上を含むか若しくはこれらから本質的になるポリペプチドも、これらの部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、バリアント及び／又は誘導体が本明細書で想定される目的のために好適である限り（ＦＡＰを発現する細胞、組織又は器官、それに連結され、且つ放射性核種に連結される場合には診断用途及び治療用途で使用されるために好適である分子を送達する限り）包含する。本発明にかかるそのような部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、バリアント及び／又は誘導体は、
－ ヒト及び／又はマウスＦＡＰ、好ましくは両方のＦＡＰに特異的に結合し、
－ 好ましくはＦＡＰのモジュレータではなく、好ましくはＦＡＰの阻害剤ではない。
例えば、本発明は、本明細書でＣＤＲ配列又は抗体フラグメントの一部とも称され、且つ配列番号１、２、３として同定される、アミノ酸残基（すなわち小ペプチド）のいくつかのストレッチ、例えばヒト及び／又はマウスＦＡＰへの結合に特に適している抗体フラグメント又はその一部の配列、好ましくは本明細書に開示されるようなＶＨＨの配列を表す配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する配列などを提供する。
例えば、本発明は、本明細書でＣＤＲ配列又は抗体フラグメントの一部とも称され、且つ配列番号５、６、７として同定される、アミノ酸残基（すなわち小ペプチド）のいくつかのストレッチ、例えばヒト及び／又はマウスＦＡＰへの結合に特に適している抗体フラグメント又はその一部の配列、好ましくは本明細書に開示されるようなＶＨＨの配列を表す配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有する配列などを提供する。
例えば、本発明は、本明細書でＣＤＲ配列又は抗体フラグメントの一部とも称され、且つ配列番号９、１０、１１として同定される、アミノ酸残基（すなわち小ペプチド）のいくつかのストレッチ、例えばヒト及び／又はマウスＦＡＰへの結合に特に適している抗体フラグメント又はその一部の配列、好ましくは本明細書に開示されるようなＶＨＨの配列を表す配列番号１２と少なくとも８０％の同一性を有する配列などを提供する。
例えば、本発明は、本明細書でＣＤＲ配列又は抗体フラグメントの一部とも称され、且つ配列番号１３、１４、１５として同定される、アミノ酸残基（すなわち小ペプチド）のいくつかのストレッチ、例えばヒト及び／又はマウスＦＡＰへの結合に特に適している抗体フラグメント又はその一部の配列、好ましくは本明細書に開示されるようなＶＨＨの配列を表す配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有する配列などを提供する。
これらのストレッチは、抗体フラグメント、好ましくは本明細書に開示されるＶＨＨの機能的フラグメントであると見なされ得、且つ本明細書に開示されるＶＨＨ若しくは化合物若しくは標識化合物などであるが、これらに限定されない任意の好適な足場（タンパク質）中に存在し、且つ／又はそれらに組み込まれ得、特にそれらがその好適な足場又はＶＨＨの抗原結合部位（の一部）を形成するようにする。しかしながら、本発明は、その最も広い意味において、これらのアミノ酸残基のストレッチが、本明細書に開示されるようなこれらの足場又は抗体フラグメント（好ましくはＶＨＨ）がヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合することを可能にする限り、これらのアミノ酸残基のストレッチが、本明細書に開示されるような足場又は抗体フラグメント（好ましくはＶＨＨ）において有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことが注目されるべきである。
抗体フラグメントの更なる翻訳後構造特性評価
特定の態様では、本明細書に開示されるようなヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨドメイン又はそのフラグメントは、任意選択的に、１つ以上の更なる基、部分構造又は残基に１つ以上のリンカーを介して連結され得る。これらの１つ以上の更なる基、部分構造又は残基は、目的の他の標的への結合に役立ち得る。そのような更なる基、残基、部分構造及び／又は結合部位は、本明細書に開示される抗体フラグメントに更なる機能性を提供しても又はしなくてもよく、且つ本明細書に開示される抗体フラグメントの特性を改変しても又はしなくてもよいことが明らかなはずである。そのような基、残基、部分構造又は結合単位は、例えば、生物学的に活性であり得る化学基でもあり得る。
これらの基、部分構造又は残基は、特定の実施形態では、重鎖可変ドメインにＮ末端又はＣ末端に連結されており、特にＣ末端に連結されている。
特定の実施形態では、抗体フラグメント、好ましくは本明細書に開示されるようなヒトＦＡＰ抗原及び／又はマウスＦＡＰ抗原に特異的に結合するＶＨＨドメイン又はフラグメントも化学的に改変され得る。例えば、そのような改変は、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨドメインへの又はその上への、１つ以上の官能基、残基又は部分構造の導入又は連結を含み得る。これらの基、残基又は部分構造は、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨドメインに１つ以上の所望の特性又は官能性を付与し得る。そのような官能基の例は、当業者に明らかであろう。
例えば、そのような官能基の抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨドメイン又はそのフラグメントへの導入又は連結は、それらの溶解性及び／若しくは安定性の増加、それらの毒性の低減又は任意の望ましくない副作用の排除若しくは減弱並びに／又は他の有利な特性をもたらし得る。
特定の実施形態では、１つ以上の基、残基又は部分構造は、１つ以上の好適なリンカー又はスペーサを介して、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨドメイン又はそのフラグメントに連結される。
本明細書に開示される、ＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントの２つ以上の結合部位の全てがヒト及び／又はマウスＦＡＰのアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分構造、エピトープ、ドメイン又はストレッチに対して向けられるか又はそれらに特異的に結合する場合、本明細書に開示されるような抗体フラグメントは、「二価」（単一ドメイン抗体フラグメントにおける２つの結合部位の場合）又は多価（単一ドメイン抗体フラグメントにおける２つを超える結合部位の場合）、例えば三価などであると言われる。
一実施形態では、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントは、一価形式で存在する。
本明細書で使用される場合、ＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントを指す場合の「一価」という用語は、モノマー形態の抗体フラグメントを示す。一価抗体フラグメントは、１つの結合部位のみを含有する。これに関連して、ＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントの結合部位は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰのアミノ酸残基の特定の部位、決定基、部分構造、エピトープ、ドメイン又はストレッチに対して向けられるか又はそれらに特異的に結合する、抗体フラグメントの配列番号１、２及び／若しくは３によって表される１つ以上の「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」並びに／又は抗配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するとして本明細書で同定される１つ以上の領域を包含する。
特に好ましい実施形態では、本発明は、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのモノマー形態のフラグメント、すなわち１つのＶＨＨドメインのみを含む抗体フラグメントを提供する。このような分子の小さいサイズは、治療／診断用途にとって魅力的である。特定の用途では、最適な治療効果に達するために高い組織浸透が必要な場合、そのような小さいサイズも魅力的であり得る。
しかしながら、代替的な実施形態では、本発明は、二価（又は多価）又は二重特異性又は（多重特異性）ポリペプチドをもたらす抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又は２つ以上の同一又は異なるＶＨＨドメインを含むフラグメントも提供する。
抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントは、そのモノマー形態、特に代替の実施形態で存在し得るが、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントの２つ以上は、互いに連結されるか又は相互接続され得る。特定の実施形態では、２つ以上の抗体フラグメント、好ましくは２つ以上のＶＨＨ又はそのフラグメントは、１つ以上の好適なリンカー又はスペーサを介して互いに連結される。本明細書に開示されるようなそのような抗体フラグメントのカップリングに使用するための好適なスペーサ又はリンカーは、当業者に明らかであり、一般にペプチド及び／又はタンパク質を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカー又はスペーサであり得る。
いくつかの特に好適なリンカー又はスペーサとしては、例えば、ポリペプチドリンカー、例えばグリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン／セリンリンカー、グリシン及びセリンに富むリンカーなど、又は大部分が極性のポリペプチドフラグメントから構成されるリンカー又はホモ若しくはヘテロ二官能性の化学架橋化合物、例えばグルタルアルデヒド又は任意選択的にＰＥＧ間隔のマレイミド若しくはＮＨＳエステルが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、ポリペプチドリンカー又はスペーサは、１～５０アミノ酸、例えば１～３０、特に１～１０アミノ酸残基などの長さを有する好適なアミノ酸配列であり得る。リンカーの長さ、可撓性の程度及び／又は他の特性は、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントの特性（腫瘍標的又は癌細胞上の標的に対する親和性、特異性又は結合活性が含まれるが、これらに限定されない）又は薬理学的挙動に何らかの影響を及ぼし得ることが明らかなはずである。２つ以上のリンカーを使用する場合、これらのリンカーは、同じであるか又は異なり得ることが明らかである。本発明に関連して及びその開示において、当業者は、一切の過度の実験的負担なしに、本明細書に開示される抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントをカップリングする目的のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
本明細書で使用される場合、ＶＨＨ又はその機能的フラグメントなどの抗体フラグメントを指す場合の「非タグ付け」という用語は、外来性ポリペプチド配列を含まない（例えば、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ配列又は好ましくは医薬品に連結された及び／若しくは本明細書に記載の放射性同位体で標識されたそのフラグメントのみを含有）抗体フラグメントを示す。例示的な外来性ポリペプチド配列には、カルボキシ末端ポリペプチドタグ、例えばＨｉｓタグ、システイン含有タグ（例えば、Ｐｒｕｓｚｙｎｓｋｉら（２０１３年）「Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ」第４０巻：第５２～５９頁）及び／又はＭｙｃタグが含まれる。Ｈｉｓタグは、４、５、６、７、８、９、１０個のヒスチジンを含有し得る。一実施形態では、６個のヒスチジンが存在する。
一実施形態では、存在し得る１つ以上の基、残基又は部分構造はまた、本明細書に開示される抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はその機能的フラグメントの二量体化などの多量体化を誘導しない。
したがって、一実施形態では、ＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントは、二量体化などの多量体化を誘導するタグを欠いており、好ましくはシステイン含有タグ、好ましくはＧＧＣタグを欠いている。
したがって、一実施形態では、ＶＨＨなどの抗体フラグメント又はそのフラグメントは、カルボキシ末端ポリペプチドタグを欠いており、好ましくはタグ付けされていない。
有利には、Ｈｉｓタグ付け及びＭｙｃ－Ｈｉｓタグ付け抗体フラグメントなどのポリペプチドタグ付けと比較して、カルボキシ末端ポリペプチドタグのない抗体フラグメントを用いた場合、腎臓保持が有意に減少することが示された（Ｄ’Ｈｕｙｖｅｔｔｅｒら（２０１４年）、「Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．」第４巻（第７号）：第７０８～２０頁）。
本明細書に開示されるＶＨＨなどの抗体フラグメントに言及する場合の「二重特異性」という用語は、（ａ）本明細書に開示されるような抗体フラグメントの２つ以上の結合部位が、ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに対して向けられるものであるか若しくはヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに特異的に結合するが、ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰの同じ部位、決定基、部分、エピトープ、ドメイン若しくはアミノ酸残基のストレッチに対するものではなく（すなわち異なる）、本明細書で開示された抗体フラグメントは、「二重特異性」（抗体フラグメント上の２つの結合部位の場合若しくは多重特異性（抗体フラグメント上の３つ以上の結合部位の場合）と言われること、又は（ｂ）本明細書に開示されている抗体フラグメントの２つ以上の結合部位は、目的の異なる標的分子に対して向けられるか若しくはこれに特異的に結合することのいずれかを暗示する。「多重特異性」という用語は、本明細書に開示される抗体フラグメント上に３つ以上の結合部位が存在する場合に使用される。
したがって、本明細書で使用される「二重特異性」ＶＨＨなどの「二重特異性」抗体フラグメント又は「多重特異性」ＶＨＨなどの「多重特異性」抗体フラグメントは、それぞれ２つ又は少なくとも２つの結合部位を含む本明細書に開示されるＶＨＨなどの抗体フラグメントの意味を有するものとし、これらの２つ以上の結合部位は、異なる結合特異性を有する。したがって、本明細書に開示されるＶＨＨなどの抗体フラグメントは、それぞれ２つ又は３つ以上の異なる結合領域が同じモノマー抗体フラグメントに存在する場合、「二重特異性」又は「多重特異性」と見なされる。
本明細書に開示される抗体フラグメント（特にＶＨＨ又はそのフラグメントなど）の「半減期」は、一般に、本明細書に開示される抗体フラグメントのインビボ血清濃度が５０％低下するのに必要な時間と定義することができる。本明細書に開示される抗体フラグメントのインビボ半減期は、薬物動態分析などの当業者に公知の任意の様式で決定することができる。当業者に明らかなように、半減期は、ｔ１／２－アルファ、ｔ１／２－ベータ及び曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを用いて表すことができる。インビボでの半減期の増加は、一般に、パラメータｔ１／２－アルファ、ｔ１／２－ベータ及び曲線下面積（ＡＵＣ）の１つ以上、好ましくは３つ全ての増加を特徴とする。
本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなどの抗体フラグメントに言及する場合の「寿命延長」という用語は、抗体フラグメントの半減期を延長するように抗体フラグメントが改変されていることを示すために使用される。抗体及び抗体フラグメントの半減期を延長するための戦略は当技術分野で周知であり、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの半減期を延長する１つ以上の基又は部分構造、抗体Ｆｃフラグメント又は血清アルブミンなどの血清タンパク質を標的とする抗原結合抗体フラグメントへの（化学的又はその他の）連結が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、一実施形態では、ＶＨＨなどの抗体フラグメント又はその機能的フラグメントは、非寿命延長である。
抗体フラグメントをコードする核酸分子
更なる態様では、本発明は、本明細書で定義される抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はその好適なフラグメントをコードする核酸配列によって表される核酸分子を提供する。
一実施形態では、この核酸分子は、配列番号３３～３６のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むか、それからなるか又はそれから本質的になる核酸配列によって表される。好ましくは、同一性は、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％である。同一性は、通常、前記配列番号の全長にわたって評価される。しかしながら、本明細書で定義される前記配列番号の一部にわたって同一性が評価されることは排除されない。
これらの核酸配列は、ベクター又は遺伝子構築物又はポリヌクレオチドの形態でもあり得る。本明細書に開示される核酸配列は、合成若しくは半合成配列、ライブラリ（特に発現ライブラリ）から単離されたヌクレオチド配列、重複プライマを用いてＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列又はそれ自体が公知であるＤＮＡ合成のための技術を用いて調製されたヌクレオチド配列であり得る。
Figure 2023541601000005
構築物、ベクター、宿主細胞
本明細書に開示される遺伝子構築物は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物は、意図された宿主細胞又は宿主生物の形質転換に好適な形態、意図された宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに好適な形態又は意図された宿主生物における独立した複製、維持及び／若しくは遺伝に好適な形態でもあり得る。例としては、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾンなどのベクターの形態であり得る。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわちインビトロ及び／又はインビボ（例えば、好適な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系における）の発現を提供することができるベクターであり得る。
したがって、別の更なる態様では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸配列を含むベクターも提供する。
なお更なる態様では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上の核酸配列、したがって１つ以上のアミノ酸配列を含み、且つ好ましくは発現するか又は発現することができる宿主、又は宿主細胞、又は細胞を提供する。宿主又は宿主細胞の好適な例は、当業者に明らかであろう。
抗体フラグメントの生成方法及び製造方法
本発明は更に、抗体フラグメント（特にＶＨＨ又はそのフラグメントなど）並びにこれら及び宿主細胞をコードする核酸、これらの抗体フラグメント、特にＶＨＨ又はそのフラグメントなどを含む生成物及び組成物を、調製又は産生する方法を提供する。そのような方法のいくつかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書の更なる説明から明らかになるであろう。
当業者に明らかなように、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を調製するための１つの特に有用な方法は、一般に、以下の工程を含む：
（ａ）抗体フラグメント、特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなどをコードするヌクレオチド配列を発現させること、及び
（ｂ）任意選択的に、前記抗体フラグメントを単離及び／又は精製すること。
抗体フラグメントをコードする核酸はベクター又は遺伝子構築物に含まれ得る。
本明細書で想定される特定の実施形態では、抗体フラグメント（特にＶＨＨ又はそのフラグメントなど）は、ＶＨＨ配列のランダムなライブラリを産生することと、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合することができるＶＨＨ配列についてこのライブラリをスクリーニングすることとを伴う方法によって得ることができる。
したがって、特定の実施形態では、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を調製するための方法は、以下の工程を含む：
（ａ）ＶＨＨドメインのアミノ酸配列のセット、集合体又はライブラリを提供すること；及び
（ｂ）ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに結合することができるアミノ酸配列及び／又はヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに対する親和性を有することができるアミノ酸配列について、アミノ酸配列の前記セット、集合体又はライブラリをスクリーニングすること、及び
（ｃ）ヒト及び／又はマウスＦＡＰに結合し得、且つ／又はヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに対する親和性を有し得るアミノ酸配列を単離すること。
そのような方法では、ＶＨＨ配列のセット、集合体又はライブラリは、アミノ酸配列の任意の好適なセット、集合体又はライブラリであり得る。例えば、アミノ酸配列のセット、集合体又はライブラリは、免疫グロブリンフラグメント配列（本明細書に記載）のセット、集合体又はライブラリ、例えば免疫グロブリンフラグメント配列のナイーブセット、集合体又はライブラリ（免疫グロブリンフラグメント配列の合成若しくは半合成セット、集合体若しくはライブラリ；及び／又は親和性成熟に供された免疫グロブリンフラグメント配列のセット、集合体若しくはライブラリ）などであり得る。
この方法の特定の実施形態では、ＶＨＨ配列のセット、集合体又はライブラリは、免疫グロブリンフラグメント配列の免疫セット、集合体又はライブラリであり得、例えばヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰ又はそれらに基づく若しくはそれらに由来する好適な抗原決定基（例えば、その抗原性部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープなど）で好適に免疫化された哺乳動物に由来する免疫グロブリンフラグメント配列の免疫セット、集合体又はライブラリであり得る。特定の一態様では、前記抗原決定基は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープであり得る。
上記の方法において、ＶＨＨ配列のセット、集合体又はライブラリは、例えば、スクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微生物（酵母など）上に提示され得る。（集合、集合体又はライブラリ）アミノ酸配列を表示及びスクリーニングするための好適な方法、技術及び宿主生物は、例えば、本明細書の更なる開示に基づいて当業者に明らかであろう。「Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第２３巻第９号第１１０５～１１１６頁（２００５年）による総説も参照されたい。
他の実施形態では、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を産生する方法は、少なくとも以下の工程を含む：
（ａ）ＶＨＨドメインアミノ酸配列を発現する細胞の集合体又は試料を提供すること；
（ｂ）ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに結合し得、且つ／又はこれらに対する親和性を有し得るアミノ酸配列を発現する細胞について、細胞の前記集合体又は試料をスクリーニングすること；及び
（ｃ）（ｉ）前記アミノ酸配列を単離すること；又は（ｉｉ）前記細胞から前記アミノ酸配列をコードする核酸配列を単離し、続いて前記アミノ酸配列を発現させることのいずれか。
細胞の集合体又は試料は、例えば、Ｂ細胞の集合体又は試料であり得る。この方法において、細胞の試料は、ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰ又はそれらに基づく若しくはそれらに由来する好適な抗原決定基（例えば、その抗原性部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープなど）で好適に免疫化された哺乳動物にも由来し得る。特定の一実施形態では、抗原決定基は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープであり得る。
他の実施形態では、抗体フラグメント（特にヒト及び／又はマウスＦＡＰに対する、本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を産生するための方法は、少なくとも以下の工程を含み得る：
（ａ）ＶＨＨドメインアミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、集合体又はライブラリを提供すること；
（ｂ）ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに結合することができる並びに／又はこれらに対する親和性を有し得るアミノ酸配列をコードする核酸配列について、核酸配列の前記セット、集合体又はライブラリをスクリーニングすること；及び
（ｃ）前記核酸配列を単離し、続いて前記アミノ酸配列を発現させること。
上記の方法において、アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、集合体又はライブラリは、例えば、免疫グロブリンフラグメント配列のナイーブセット、集合体又はライブラリをコードする核酸配列のセット、集合体又はライブラリ（免疫グロブリンフラグメント配列の合成若しくは半合成のセット、集合体若しくはライブラリをコードする核酸配列のセット、集合体又はライブラリ；及び／又は親和性成熟に供された免疫グロブリンフラグメント配列のセット、集合体若しくはライブラリをコードする核酸配列のセット、集合体若しくはライブラリ）であり得る。
特に、そのような方法において、核酸配列のセット、集合体又はライブラリは、抗体フラグメント（特にヒト及び／又はマウスＦＡＰ（本明細書で定義）に対する本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）の抗体フラグメントのセット、集合体又はライブラリをコードする。
上記の方法において、ヌクレオチド配列のセット、集合体又はライブラリは、例えば、スクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微生物（酵母など）上に提示され得る。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を表示及びスクリーニングする（セット、集合体又はライブラリ）ための好適な方法、技術並びに宿主生物は、例えば、本明細書の更なる開示に基づいて当業者に明らかであろう。「Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第２３巻第９号第１１０５～１１１６頁（２００５年）による総説も参照されたい。
本発明は、上記の方法又は代替的には上記の方法の１つを含む方法及び前記抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を決定する追加の少なくとも工程によって得ることができる又は得られる抗体フラグメント、特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）と、前記抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を、それ自体が公知の様式において、例えば好適な宿主細胞若しくは宿主生物における発現などによって又は化学合成によって発現又は合成することとに関する。
いくつかの場合、本明細書で想定されるようなヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を生成するための方法は、ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに対する検出可能な結合親和性又はこれらに対する検出可能なインビトロ効果を有する、少なくとも１つの抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を、アミノ酸配列ライブラリから単離する工程を更に含む場合がある。
これらの方法は、少なくとも１つの抗体フラグメント（特にヒト及び／又はマウスＦＡＰの活性に対する検出可能な結合親和性を又はこれらの活性に対する検出可能なインビトロ効果を有する、本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）をコードする配列を増幅する工程を更に含む場合がある。例えば、本明細書に記載の方法の選択工程から得られる特定のアミノ酸配列を示すファージクローンは、宿主細菌の再感染及び成長培地中におけるインキュベーションによって増幅され得る。
特定の実施形態では、これらの方法は、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに結合することができる、１つ以上のアミノ酸配列の配列を決定することを包含し得る。
アミノ酸配列のセット、集合体又はライブラリに含まれる、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）が好適な細胞又はファージ又は粒子に提示される場合、前記細胞又はファージ又は粒子から、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を単離することが可能である。このようにして、選択されたアミノ酸配列ライブラリメンバーのヌクレオチド配列を、日常的な配列決定方法によって決定することができる。
更なる特定の実施形態では、本明細書で想定される抗体フラグメント（特にＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を生成する方法は、実際の所望のアミノ酸配列を得るために、好適な条件下における宿主生物中で前記ヌクレオチド配列を発現させる工程を含む。この工程は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
加えて、得られた抗体フラグメント（特にヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰの活性についての検出可能な結合親和性を有し、且つ／又はこれらの活性に対する検出可能なインビトロ効果を何ら有しない、本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）は、任意選択的にそれらの配列が同定された後、可溶性タンパク質構築物として合成され得る。
例としては、上記の方法によって得られるか、得ることができるか又は選択される、本明細書に開示される抗体フラグメント（特にＶＨＨ又はそのフラグメントなど）は、当技術分野で公知の組換え又は化学合成方法を用いて合成することができる。上記の方法によって得られるか、得ることができるか又は選択されるアミノ酸配列は、遺伝子工学技術によって生成することもできる。したがって、上記の方法によって得られるか、得ることができるか又は選択される、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を合成するための方法は、宿主細胞を、ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰの活性に対する検出可能な結合親和性を有し、且つ／又はこれらの活性に対する検出可能なインビトロ効果を何ら有しないアミノ酸配列をコードする核酸又はベクターで形質転換すること又は感染させることを含む場合がある。したがって、ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰの不活性に対して検出可能な結合親和性を有し、且つ／又はこれらの不活性に対して検出可能なインビトロ効果を何ら有しない、本明細書に開示されるような抗体フラグメント（特にＶＨＨなど）又はそのフラグメントを、組換えＤＮＡ法によって作製することができる。アミノ酸配列をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に合成することができる。調製されると、ＤＮＡは発現ベクターに導入することができ、これは次いで、組換え宿主細胞及び／又はこれらの組換え宿主細胞が存在する培地中のアミノ酸配列の発現を得るために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞又は任意の好適な発現系に形質転換又はトランスフェクトすることができる。
タンパク質発現及び精製の当業者に知られているように、好適な発現系を用いて発現ベクターから生成された抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）は、容易な精製のために、例えばＨｉｓタグ又は他の配列タグで（典型的には、アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端で）タグ付けされ得ることを理解されたい。
核酸又はベクターの宿主細胞への形質転換又はトランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及び生物学を含む、当業者に公知の様々な手段によって達成され得る。
所望の重鎖可変ドメイン配列の発現に好適な宿主細胞は、インビトロ又はインビボに位置するかどうかにかかわらず、任意の真核細胞又は原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞及び昆虫細胞などの細菌細胞）であり得る。例えば、宿主細胞はトランスジェニック植物に位置し得る。
したがって、本出願は、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）をコードし、且つ好適な条件下においてそれらのアミノ酸配列を発現する核酸配列又はベクターを宿主細胞に形質転換、トランスフェクト又は感染させることを含む、ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰの活性に対する検出可能な結合親和性又はこれらの活性に対する検出可能なインビトロ効果を有する、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を生成するための方法も提供する。
更に別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される医薬組成物を製造する（「又はその生成」は、均等な表現である）方法を更に提供する。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される医薬組成物を生成する方法であって、以下の工程：
－ ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、少なくとも１つの抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を得ることと、
－ 前記抗体フラグメント、特にＶＨＨ又はそのフラグメントなどを医薬組成物に製剤化することと
を少なくとも含む方法を提供する。
これらの方法の特定の実施形態では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、少なくとも１つの抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を得る工程は、以下を含む：
（ａ）ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）をコードするヌクレオチド配列を発現させること、及び任意選択的に、
（ｂ）抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を単離及び／又は精製すること。
これらの方法の他の特定の実施形態では、ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する、少なくとも１つの抗体フラグメント（特に本明細書に開示されるようなＶＨＨ又はそのフラグメントなど）を得る工程は、以下を含む：
（ａ）ＶＨＨドメイン配列又はＶＨＨ配列のフラグメントのセット、集合体又はライブラリを提供すること、
（ｂ）ヒトＦＡＰ及び／若しくはマウスＦＡＰに特異的に結合する並びに／又はこれらに対する親和性を有する配列について、ＶＨＨドメイン配列又はそのフラグメントの配列の前記セット、集合体又はライブラリをスクリーニングすること、及び任意選択的に、
（ｃ）ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する並びに／又はこれらに対する親和性を有する、ＶＨＨ配列又はそのフラグメントの配列を単離すること。
抗体フラグメントを標識するためのプロセス
放射性核種をタンパク質に組み込むために利用可能な様々な放射性標識戦略が存在する。放射化学者のための技術の選択は、主に使用される放射性核種に依存する。ヨウ素の放射性同位体は、求電子置換によって分子に直接組み込まれるか、又はコンジュゲーションを介して間接的に組み込まれる能力を有する。他方で、放射性金属は、キレート剤との錯体形成を介して標識される。多くの金属放射性核種は、キレート剤と安定な錯体を形成する能力を有し、したがってタンパク質とのコンジュゲーションを可能にする。ヨウ素核種による放射性標識分子は、薬学的な放射化学において非常に重要である。３０を超える異なる同定されたヨウ素同位体があるが、放射性ヨウ素化学で一般的に使用されているのは、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉの４つのみである。
タンパク質の直接放射性ヨウ素標識は、腫瘍ターゲティング又は癌細胞ターゲティング放射性医薬品の合成のための重要な方法である。一般に、タンパク質放射性ヨウ素標識の２つの基本的なアプローチがある。最も直接的なアプローチは、チロシン残基及びヒスチジン残基における求電子置換を用いた、直接的なタンパク質標識である。放射性ヨウ化物（ｒａｄｉｏｉｏｄｉｄｅ）をその場で酸化して求電子剤＊Ｉ＋を作製する。これは、クロラミンＴ、ヨードゲン（登録商標）及びＮ－ハロスクシンイミドのような酸化剤を用いて行われる。産生された求電子剤は、アミノ酸チロシンの電子に富む芳香環を攻撃し、σ錯体を形成する。この置換は、σ錯体を安定化する電子供与性ヒドロキシル基に起因して、チロシン残基において行われる。タンパク質の標識化は温和な条件下で行わなければならないため、チロシンへのヨウ素の付着は非常に適している。
この方法は温和な条件下で行われ、タンパク質の標識化に最適である。しかしながら、これは、タンパク質が接近可能なチロシン又はヒスチジン残基を含有する場合にのみ可能である。
コンジュゲーションを介するタンパク質の間接ヨウ素化は、頻繁に使用される代替方法である。このアプローチでは、放射性ヨウ素標識とタンパク質への取り込みの両方を可能にするために、２つの官能基を含有する補欠分子族の適用によってヨウ素が組み込まれる。放射性ヨウ素標識に使用される様々な補欠分子族があるが、最も頻繁に使用されるのは、Ｎ－スクシンイミジル－５－［＊Ｉ］ヨード－３－ピリジンカルボキシル（［１３１Ｉ］ＳＩＰＣ）及びＮ－スクシンイミジル－３－［＊Ｉ］－ヨードベンゾエート（［＊Ｉ］ＳＩＢ）である。両方の活性エステルは、タンパク質のアミノ基にコンジュゲートされ、高いインビボ安定性を呈する。
芳香族基のアシル化のための別の補欠分子族は、Ｎ－スクシンイミジル－４－グアニジノメチル－３－［Ｉ－１３１］ヨードベンゾエート（［Ｉ－１３１］ＳＧＭＩＢ）である。
本発明の特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物は、Ｎ－スクシンイミジル－４－グアニジノメチル－３－［Ｉ－１３１］ヨードベンゾエート（［Ｉ－１３１］ＳＧＭＩＢ）又はその好適な誘導体若しくはバリアントを用いて、ヨウ素－１３１で標識される。
放射線療法の詳細なプロトコルは、専門家に容易に利用可能である（「Ｃａｎｃｅｒ Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、Ｈｕｄｄａｒｔ ＲＡ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ（２００２年））。当業者は、疾患の性質及び患者の構成に応じて、好適な投与及び適用スケジュールを決定する方法を知っている。特に、当業者は、用量制限毒性（ＤＬＴ）をどのように評価するか、及びそれに応じて最大耐量（ＭＴＤ）をどのように決定するかを知っている。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるその標識化合物は、約８００ｍＣｉ未満、例として約１５０ｍＣｉ未満など、例として約３０ｍＣｉ未満など、例えば約１５ｍＣｉ未満などの放射線量で投与される。
特定の実施形態では、放射性免疫複合体は、放射性核種に応じて、約０．５ｍＣｉ／ｍｇ～約８０００ｍＣｉ／ｍｇなど、例として１ｍＣｉ／ｍｇ～約１５００ｍＣｉ／ｍｇなど、例として１ｍＣｉ／ｍｇ～約３００ｍＣｉ／ｍｇなど、例として１ｍＣｉ／ｍｇ～約１５０ｍＣｉ／ｍｇなどの比活性を有し、静脈内、腹腔内又は髄腔内経路などの他の経路を介して投与され得る。治療の所望の期間及び有効性に応じて、本明細書に開示される標識化合物は、他の治療薬又は放射線増感剤と組み合わせて、１回又は数回投与され得る。適用される標識化合物の量は、癌腫の正確な性質に依存する。投与当たりの放射能の用量は、有効であるように充分高くなければならないが、用量制限毒性（ＤＬＴ）未満でなければならない。
製剤化／治療／診断における使用
より更なる態様では、１つ以上の抗体フラグメント、好ましくは本明細書に開示されるＶＨＨ若しくはそのフラグメント及び／又は本明細書で想定される核酸配列と、任意選択的に少なくとも１つの許容される担体とを含む組成物が提供される。
特定の具体的な実施形態によれば、本明細書で想定される組成物は、少なくとも１つの他の化合物を更に任意選択的に含み得る。
本明細書で使用される場合、「スクリーニング用量」又は「バイオマーカ用量」は、治療のための対象を選択するのに充分である本明細書に記載の標識化合物などの薬剤の用量であって、例えば対象の癌細胞又は固形腫瘍に結合し、その後、例えばプラナーガンマカメライメージング、単一光子放射形コンピュータ断層撮影法又は陽電子放射断層撮影法などのガンマカメライメージングを用いて対象をイメージングすることにより、任意選択的にＸ線イメージング、コンピュータ断層撮影法及び／又は磁気共鳴イメージングなどの非核イメージング技術と組み合わせて、癌細胞又は固形腫瘍の位置で検出され得る用量などである。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量は、治療上有効ではない用量である。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量は、本明細書に記載の治療用量とは異なる（例えば、これより低い）。
本明細書で使用される場合、「治療用量」とは、そのような治療を必要とする対象（例えば、癌を有する対象）の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％において、治療上有効である、本明細書に記載の標識化合物などの薬剤の用量である。いくつかの実施形態では、治療用量は、本明細書に記載のスクリーニング用量よりも高い。
本明細書で使用される場合、「対象のイメージング」とは、本明細書に記載の標識化合物を検出することができる装置を用いて、対象の１つ以上の画像を捕捉することを指す。１つ以上の画像は、画像を（例えば、１つ以上の画像のコントラスト又は輝度を調整することによって）強化するために、コンピュータプログラム及び／又は当業者によって更に変更され得る。本明細書に記載の標識化合物を検出することができる任意の装置、例えばプラナーガンマカメライメージングなどのガンマカメライメージング、単一光子放射形コンピュータ断層撮影若しくは陽電子放出断層撮影のための装置又は核撮像技術をＸ線撮像、コンピュータ断層撮影法及び／若しくは磁気共鳴撮像などの解剖学的撮像技術と組み合わせることができる装置を使用することが考えられる。例えば、そのような装置は、単一光子放射形コンピュータ断層撮影法／コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）又は陽電子放射形コンピュータ断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）イメージングのための装置であり得る。そのような装置は当技術分野で公知であり、市販されている。
いくつかの実施形態では、スクリーニング用量の投与とイメージングによる検出とは、少なくとも約１分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日間又は少なくとも約７日間だけ離れている。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量の投与及び検出は、約１時間～約２４時間だけ離される。
いくつかの実施形態では、スクリーニング用量及び治療用量は、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも約２ヶ月又は少なくとも約６ヶ月離れて投与される。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量及び治療用量は、約１日～約６ヶ月間空けて（例えば、約１日～約２ヶ月間、約１日～約１ヶ月間又は約１日～約１週間空けて）投与される。
スクリーニング用量及び治療用量は、各々独立して、全身的、局在的又は局所的などの任意の好適な経路によって投与され得る。例示的な経路には、静脈内、腹腔内及び髄腔内投与が含まれる。利用される特定の経路は、いくつかの実施形態では、疾患の性質（例えば、腫瘍又は癌細胞のタイプ、グレード、位置及びステージなど）及び対象の種類（例えば、種、構成、年齢、性別、体重など）に依存し得る。
全ての診断及び治療用途のために本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、一般に、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ又はヒツジなどの哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は、癌を有する対象（例えば、癌を有するヒト対象）である。癌を有する対象を同定するための方法には、腫瘍抗原又は他の腫瘍バイオマーカの検出、遺伝子検査、ＭＲＩ、Ｘ線、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャン、生検及びそれらの組合せが含まれる。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「診断」、「予測」及び／又は「予後診断」という用語は、特定の疾患及び／又は障害及び／又は状態を診断、予測及び／又は予後診断することを含み、それにより特定の疾患及び／若しくは障害及び／若しくは病態の発症及び／若しくは存在を予測し、且つ／又は特定の疾患及び／若しくは障害及び／若しくは病態の進行及び／若しくは持続期間を予測し、且つ／又は特定の疾患及び／又は若しくは障害及び／若しくは病態に罹患している患者の治療に対する応答を予測することを含む。
標識化合物、標識化合物を含む組成物又は提供される診断若しくは治療用途のいずれか１つのいくつかの実施形態では、スクリーニング用量（すなわち診断方法で使用）は、治療上有効ではない用量である。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量は、本明細書に記載の治療用量よりも低い（例えば、本明細書に記載の治療用量よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍若しくは少なくとも約１０００倍低いか、又は本明細書に記載の治療用量よりも少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３２０、少なくとも約３４０、少なくとも約３６０、少なくとも約３８０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約５０００、少なくとも約１００００、少なくとも約１３０００、少なくとも約１５０００、少なくとも約１８０００又は少なくとも約２００００ＭＢｑ低い）。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量は、約１０ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約２０ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約３０ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約４０ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約５０ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約１００ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約２００ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約３００ＭＢｑ～約４００ＭＢｑ、約１０ＭＢｑ～約３００ＭＢｑ、約２０ＭＢｑ～約３００ＭＢｑ、約３０ＭＢｑ～約３００ＭＢｑ、約４０ＭＢｑ～約３００ＭＢｑ、約５０ＭＢｑ～約３００ＭＢｑ、約１００ＭＢｑ～約３００ＭＢｑ又は約２００ＭＢｑ～約３００ＭＢｑである。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量は、３、約７ＭＢｑ～約３７０ＭＢｑである。本明細書に記載の任意のスクリーニング用量は、本明細書に記載の任意の治療用量と組み合わされ得ることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、治療用量は、本明細書に記載の治療用量よりも高い（例えば、本明細書に記載のスクリーニング用量よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍若しくは少なくとも約１０００倍高いか、又は本明細書に記載のスクリーニング用量よりも少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３２０、少なくとも約３４０、少なくとも約３６０、少なくとも約３８０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約５０００、少なくとも約１００００、少なくとも約１３０００、少なくとも約１５０００、少なくとも約１８０００又は少なくとも約２００００ＭＢｑ高い）。いくつかの実施形態では、治療用量は、約３００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約４００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約５００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約１０００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約２０００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約３０００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約４０００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約５０００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約１００００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約５０００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約１００００ＭＢｑ～約２００００ＭＢｑ、約３００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑ、約４００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑ、約５００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑ、約１０００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑ、約２０００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑ、約３０００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑ、約４０００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑ又は約５０００ＭＢｑ～約１００００ＭＢｑである。提供される方法のいずれか一つのいくつかの実施形態では、治療用量は、約３７０ＭＢｑ～約１８５００ＭＢｑである。
スクリーニング用量及び／又は治療用量は、好都合には、単回用量において又は好適な間隔で投与される分割用量（これも下位用量であり得る）として提示され得る。治療用量の投与レジメンは、長期（例えば、少なくとも２週間、例えば数ヶ月又は数年）又は毎日の治療を含み得る。いくつかの実施形態では、治療用量の投与レジメンは、１日１回～１ヶ月に１回、例えば１日１回～２週間に１回など、例えば限定するものではないが、週に１回で変動し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、１回又は数回、また断続的に、例として数日間、数週間又は数ヶ月間にわたって毎日投与され得る。
利用される特定のスクリーニング用量及び治療用量は、いくつかの実施形態では、疾患の性質（例えば、癌だけでなく、また腫瘍若しくは癌細胞のタイプ、グレード及びステージなど、又は本明細書で同定される他の疾患のいずれかなど）及び対象のタイプ（例えば、種、構成、年齢、性別、体重など）に依存し得る。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の診断及び治療用途のためのキットなどのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の標識化合物のスクリーニング用量及び同じ化合物の治療用量を含む。スクリーニング用量及び治療用量は、本明細書に記載される。
キットのいずれか１つのいくつかの実施形態では、キットは、スクリーニング用量及び治療用量を注射するための１つ以上の手段を更に含む。いくつかの実施形態では、スクリーニング用量及び治療用量は、各々、注射手段で個別に収容される。いくつかの実施形態では、注射手段はシリンジである。キットのいずれか１つのいくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法（例えば、本明細書に記載されるような対象を層別化及び処置する方法）を実施するための説明書を更に含む。説明書は、任意の好適な形態、例えば印刷形態（例えば、紙又は積層インサート又はラベルとして）又は電子形態（例えば、ディスク又はＵＳＢスティック上）であり得る。
用量、投与経路、適用スキーム、反復及び治療期間は、一般に、疾患（腫瘍若しくは癌細胞のタイプ、グレード及び病期又は本明細書で更に定義される疾患若しくは病態のタイプ、グレード及び病期）及び患者（構成、年齢、性別など）の性質に依存し、治療に関与する熟練した医療専門家によって決定される。上記の開示された組合せの成分の可能な用量に関して、処置を担当する医療専門家は、用量制限毒性又は他の重篤な副作用が発生するかどうかを慎重に監視し、それらを管理するために必要な工程を行うことが明らかである。
一般に、薬学的（診断的及び治療的）使用のために、本明細書で想定される抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はそのフラグメントを含む（標識された）化合物は、本明細書で想定される（標識された）化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤及び／又はアジュバントと、任意選択的に１つ以上の更なる薬学的に活性なポリペプチド及び／若しくは化合物とを含む医薬製剤又は医薬組成物として製剤化され得る。そのような標識化合物又はそれを含む組成物は、腹腔内、静脈内又は髄腔内投与などの他の投与に好適であり得る。したがって、（標識された）化合物及び／又はそれを含む組成物は、例えば、使用される特定の医薬製剤又は組成物に応じて、腫瘍又は癌細胞の位置、種類及び起源に応じて、対象となる組織又は器官に全身的、局在的又は局所的に、好ましくは腹腔内、静脈内又は髄腔内に投与することができる。臨床医は、好適な投与経路及びそのような投与に使用される好適な医薬製剤又は組成物を選択することができる。同じことは、ＦＡＰを発現又は過剰発現する細胞、組織又は器官へ医薬品を送達することになる化合物についても当てはまる。
注射又は注入に好適な医薬剤形は、任意選択的にリポソームにカプセル化された滅菌注射液又は注入可能な溶液若しくは分散液の、即時調製に適合した活性成分を含む、滅菌水溶液、又は分散液、又は滅菌粉末を含むことができる。全ての場合において、最終的な剤形は、製造及び貯蔵の条件下で滅菌され、流動性であり、且つ安定でなければならない。液体担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体分散媒であり得る。
予防及び／又は治療に使用するために本明細書で想定される（標識された）化合物の量は、特定の抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ又はその機能的フラグメントだけでなく、投与経路、治療される症状の性質並びに患者の年齢及び症状によっても変化し得、最終的に主治医又は臨床医の裁量による。本明細書で想定される（標識）化合物の投薬量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植片又は器官に応じても変化し得る。
特に、本明細書で想定される（標識された）化合物は、とりわけ、処置される病態及び患者の重症度に基づいて、医師によって決定される量で投与される。典型的には、各疾患適応症について、連続的に（例えば、注入によって）、１日１回の用量として又は１日中に複数回に分割された投薬量としてのいずれかで、１日当たり体重１ｋｇ当たりで投与される量を指定して、最適な用量が決定される。臨床医は、一般に、本明細書で言及される因子に応じて、好適な１日用量を決定することができる。特定の場合、臨床医は、例えば、上記の要因及び彼の専門家の判断に基づいて、これらの量から逸脱することを選択し得ることも明らかであろう。
本明細書で想定されるその（標識）化合物の有用な投薬量は、動物モデルにおけるそれらのインビトロ活性及び／又はインビボ活性を決定することによって決定することができる。本発明の非ヒト動物は、この目的のために使用され得る（実施例２を参照されたい）。
特定の実施形態では、本発明は、１０μｇ～１０ｍｇ、又は１０μｇ～７ｍｇ、又は１０μｇ～５ｍｇ、又は１０μｇ～２ｍｇ、又は１０μｇ～１．５ｍｇ、又は１０μｇ～１ｍｇの範囲にわたる用量のＶＨＨで、それを必要とする対象へ標識化合物を投与することにより、癌（好ましくは癌細胞上及び／又はＣＡＦ上でのヒトＦＡＰの発現に関連する癌）の予防及び／又は処置で使用するための本明細書に開示されるような標識化合物を提供する。更なる特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、１０μｇ～２ｍｇの範囲にわたる用量、特に１０μｇ～１．５ｍｇの範囲又は１００μｇ～１ｍｇの範囲にわたる用量の標識化合物などの標識化合物を投与することにより、癌の予防及び／又は治療に使用するための本明細書に開示される標識化合物を提供する。
したがって、投与当たりに患者に適用される放射能の用量は、有効であるのに充分に高くなければならないが、用量制限毒性（ＤＬＴ）未満でなければならない。例えば１３１－ヨウ素を有する放射性標識抗体を含む医薬組成物の場合、最大耐量（ＭＴＤ）を決定しなければならず、これは、治療状況において超えてはならない。
本明細書で想定される化合物及び標識化合物並びに／又はそれらを含む組成物は、予防又は治療される疾患又は障害を予防及び／又は治療するのに好適な治療のレジメンに従って投与される。臨床医は、一般に、好適な治療レジメンを決定することができる。一般に、治療レジメンは、標識化合物又はそれを含む１つ以上の組成物を、１つ以上の薬学的有効量又は用量で投与することを含む。
所望の用量は、好都合には、単回用量において又は好適な間隔で投与される分割用量（これも位用量であり得る）として提示され得る。投与レジメンは、長期（すなわち少なくとも２週間、例えば数ヶ月又は数年）又は毎日の治療を含み得る。特に、投与レジメンは、１日１回～１ヶ月に１回、例えば１日１回～２週間に１回など、例えば限定されないが、週に１回などで変化し得る。したがって、治療の所望の期間及び有効性に応じて、本明細書に開示される標識化合物又はそれを含む組成物は、１回又は数回、また断続的に、例として数日間、数週間又は数ヶ月間にわたって毎日及び異なる投薬量で投与され得る。本明細書に開示される標識化合物又は組成物の適用量は、特定の癌疾患の性質に依存する。複数回投与が好ましい。しかしながら、放射性標識材料は、典型的には、１週間～２０週間間隔、又は２週間～１０週間間隔、又は２週間～８週間間隔、又は３週間～６週間間隔、又は３週間～５週間間隔、又は４週間ごとに投与される。しかしながら、当業者は、投与を２つ以上の適用に分割することを選択する方法を知っており、これは、互いに直後に又は例えば１日～４週間の範囲の他の所定の間隔で適用され得る。
特に、本明細書で想定される標識化合物は、本明細書で引用される疾患及び障害の予防並びに／若しくは治療に使用されるか、又は使用され得る他の薬学的に活性な化合物若しくは原理と組み合わせて使用され得、その結果、相乗効果が得られても又は得られなくてもよい。そのような化合物及び原理の例並びにそれらを投与するための経路、方法及び医薬製剤又は組成物は、臨床医に明らかであろう。
本発明に関連して、「～と組み合わせて」、「併用療法において」又は「併用治療において」とは、本明細書に開示される標識化合物又は本明細書に開示されるこれらの標識化合物を含む組成物が、１つ以上の他の薬学的に活性な化合物又は原理と共に、患者がそのような組合せの有益な効果から利益を得ることができるレジメンで患者に適用されることを意味するものとする。特に、両方の治療は、時間的に近接して患者に適用される。好ましい実施形態では、両方の治療は、４週間（２８日間）以内に患者に適用される。より好ましくは、両方の処置は、２週間（１４日間）以内、より好ましくは１週間（７日間）以内に適用される。好ましい実施形態では、２つの治療は、２日又は３日以内に適用される。別の好ましい実施形態では、２つの治療を、同じ日に、すなわち２４時間以内に適用する。別の実施形態では、２つの治療は、４時間以内、又は２時間以内、又は１時間以内に適用される。別の実施形態では、２つの治療を、並行して、すなわち同時に適用するか、又は２つの投与を時間的に重複させる。
特定の非限定的な実施形態では、本明細書に開示されるこれらの標識化合物を含む標識化合物又は組成物は、それを含む分子又は組成物と共に適用され、それを含む前記分子又は組成物は、標識化合物の腎臓保持を最適化し、したがって減少させることができる。本発明に関連して、「一緒に適用される」は、広く解釈されるべきである。これは、１つ又は２つの異なる組成物への同時の適用を包含することを意味する。これは、２つの異なる組成物への連続的な適用も包含する。
そのような分子は改質ゼラチンなどの血漿又は代用血液であり得る。これに関連して使用され得る改質ゼラチンの例は、Ｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（商標）である。そのような血漿又は代用血液の使用は、腎臓における標識化合物の保持を最適化し、したがって減少させ、したがって望ましくない副作用を最適化すると予想される。そのような血漿又は代用血液を本発明の化合物と共に用いる利点は、実施例８及び実施例９で実証されている。
そのような分子の別の例は、正に荷電されたアミノ酸又は少なくとも１つの正に荷電されたアミノ酸を含む組成物であり得る。好適な正荷電アミノ酸の例は、アルギニン、リジン及び／又はヒスチジンである。そのような組成物の例はＡｍｉｎｏｍｅｄｉｘ（商標）である。正荷電アミノ酸使用は、参照により明示的に組み込まれる、国際公開第２０１４／２０４８５４号パンフレットに広く記載されている。
特定の非限定的な実施形態では、本明細書に開示されるこれらの標識化合物を含む標識化合物又は組成物は、免疫療法と共に適用される。一実施形態では、１つ以上の治療用抗体又は治療用抗体フラグメントを用いる。したがって、これらの特定の非限定的な実施形態では、本明細書に開示される標識化合物又はこれらの標識化合物を含む組成物を用いた放射免疫療法は、１つ以上の治療用抗体又は治療用抗体フラグメントを用いた通常の免疫療法と組み合わされる。更なる特定の実施形態では、本明細書に開示される標識化合物又は本明細書に開示されるこれらの標識化合物を含む組成物は、１つ以上の治療用抗体又は治療用抗体フラグメントとの併用療法又は組合せ治療法で使用される。
一実施形態では、本明細書で定義される標識化合物及び追加の抗体又は抗体フラグメントを含む併用療法が提供される。
例えば、本明細書に開示される標識化合物又はこれらの標識化合物及び１つ以上の治療用抗体又は治療用抗体フラグメントを含む組成物は、同時に注入され得るか、又は注入は、時間的に重複し得る。２つの薬物が同時に投与される場合、これらは、１つの単一の医薬製剤に一緒に製剤化され得るか、又は２つの異なる医薬製剤からの投与の直前に、例えば１つの単一の注入溶液に溶解若しくは希釈することによって一緒に混合され得る。別の実施形態では、２つの薬物は、別々に、すなわち２つの独立した医薬組成物として投与される。好ましい一実施形態では、２つの治療の投与は、患者の体内の腫瘍細胞が有効量の細胞傷害性薬物及び放射線に同時に曝露される方法である。別の好ましい実施形態では、有効量である、本明細書に開示される標識化合物又は本明細書に開示されるこれらの標識化合物を含む組成物と、１つ以上の治療用抗体又は治療用抗体フラグメントとの両方が同時に腫瘍の部位に存在する。本発明は、定義される組合せに加えて投与される更なる薬剤の使用も包含する。これは、例えば、１つ以上の更なる化学療法剤であり得る。これは、投与される他の薬物のいずれかの望ましくない副作用を予防、抑制又は改善するために適用される１つ以上の薬剤でもあり得る。例えば、白血球の増殖を刺激するサイトカインを適用して、白血球減少症又は好中球減少症の影響を改善することができる。
本明細書に記載の化合物又は標識化合物及びこれらを含む組成物の有効性は、関与する特定の疾患又は障害に応じて、任意の好適なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ及び／若しくはそれ自体公知の動物モデル又はそれらの任意の組合せを用いて試験することができる。好適なアッセイ及び動物モデルは、当業者に明らかであろう。好適な動物モデルは、本発明の一態様として実施例２に開示され、ヒトＦＡＰを発現する非ヒト動物である。
当業者は一般に、ヒト及び／又はマウスＦＡＰへの結合並びに１つ以上の癌関連疾患及び線維性障害に関するそれらの治療効果及び／又は予防効果について、抗体フラグメント、好ましくはＶＨＨ若しくはそのフラグメント又は化合物若しくは標識化合物或いはそれらを含む組成物（全て本明細書で定義）を試験するための、好適なインビトロ若しくはインビボアッセイ、細胞アッセイ又は動物モデルを選択することができるであろう。そのようなアッセイは、本明細書に開示されるイメージングアッセイであり得る。
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の１つ又は複数の結果を達成するために必要な量を意味する。
本明細書で使用される場合、「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」、「モニタすること」及び「アッセイすること」という用語は、互換的に使用され、定量的及び定性的判定の両方を含む。
本明細書で使用される場合、「予防及び／又は治療」という用語は、特定の疾患、及び／又は障害、及び／又は病態を予防及び／又は治療すること、特定の疾患、及び／又は障害、及び／又は病態の発症を予防すること、特定の疾患、及び／又は障害、及び／又は病態の進行を減速又は逆転させること、特定の疾患、及び／又は障害、及び／又は病態に関連する１つ以上の症状の発症を予防又は減速させること、特定の疾患、及び／又は障害、及び／又は病態に関連する１つ以上の症状を軽減及び／又は緩和すること、特定の疾患、及び／又は障害、及び／又は病態の重症度及び／又は持続期間を減少させること並びに概して治療されている対象又は患者にとって有益である本明細書に開示される抗体フラグメントの任意の予防又は治療効果を含む。
癌／腫瘍／転移細胞
本明細書で使用される場合、「腫瘍細胞」という用語は、原発性又は転移性腫瘍病変に存在する細胞を指す。これに関連して、腫瘍は癌細胞からなるだけでなく、形質転換細胞と非形質転換細胞との間に複雑な双方向相互作用が存在する、器官様構造と見なされるべきである。形質転換細胞の悪性度は、線維芽細胞、脂肪細胞、血液及びリンパ管からなり得るが、広範囲の免疫細胞によってもかなり浸潤され得る、間質からの好適な支持構造を必要とする。本発明に関連して、腫瘍細胞は、線維芽細胞、好ましくはＣＡＦでもあり得る。
「固形腫瘍」又は「腫瘍」とは、原発腫瘍及び／又は転移（どこに位置するかにかかわらない）を意味する。
本明細書で使用される場合、「癌細胞」という用語は、制御されない成長で異常且つ無制限に分裂して再生し、分裂して身体の他の部分に移動し、転移と呼ばれる別の部位を形成することができる細胞を指す。
本明細書で使用される「病変」とは、損傷又は疾患に起因する、身体組織又は器官の任意の異常な変化を指すことができる。癌の用語において、病変とは、典型的には腫瘍を指す。
本明細書で使用される「原発腫瘍」という用語は、腫瘍の進行が開始し、進行して癌性塊を生じた、解剖学的部位で成長する腫瘍である。
本明細書で使用される「転移巣」という用語は、それらの元の位置から身体の他の部分に広がった悪性又は癌性の腫瘍を指す。互換的に使用され得る関連する医学用語には、末期癌、進行癌又は転移性疾患が含まれる。一般に、転移巣は不治であると考えられるが、癌細胞の広がりを制御し、個体の平均余命を潜在的に延長するために、治療が利用可能であることが多い。
転移は、体内のその起源部位を越えた癌の広がりの用語である。したがって、転移巣とは、原発腫瘍の元の開始点から離れた位置に見られる癌性腫瘍である。転移性腫瘍は、原発腫瘍からの細胞が分離し、リンパ系及び血流を介して身体の遠位部分に移動するとき場合に生じる。代わりに、元の腫瘍からの細胞は、隣接する器官又は組織で新しい腫瘍に播種され得る。本明細書で使用される「転移性疾患」とは、末期癌を指し、癌細胞が元の腫瘍の近くのリンパ節に見られる場合にはステージＩＩＩ又は癌細胞が原発腫瘍部位をはるかに超えて身体の離れた部分まで移動した場合にはステージＩＶであるとする、癌の医学的分類を指す。転移巣は、脳、肺、肝臓又は骨で最も一般的に見られる。転移性癌を有する個体は、任意の症状を経験することも又はしないこともあり、症状は、転移した細胞が移動した領域に関連し得る。転移巣が体内に存在すると、個体の癌は、ほとんどの癌型で不治であると考えられる。これは、利用可能な処置で全ての既存の癌細胞を根絶することが過度に困難であることを意味する。この場合、治療の目標は、可能な限り最高の生活の質を維持し、潜在的に個人の平均余命を延ばすために腫瘍の成長を遅らせることになる。場合によっては、転移巣を有する人々は、症状管理のための好適な治療で数年間生存することができる。
放射性標識／標識／放射性核種／用量
本明細書で使用される場合、「標識化合物」のような「標識された」という用語は、その抗体フラグメント又はＶＨＨ若しくはそのフラグメントの放射性同位体標識を指し、抗体フラグメント又はＶＨＨ若しくはそのフラグメントは、放射性核種をそのアミノ酸配列構造に含めるか、カップリングするか又は化学的に連結することによって標識される。
本明細書で使用される場合、「放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ）」、「放射性核種（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｎｕｃｌｉｄｅ）」、「放射性同位体（ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）」又は「放射性同位体（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｓｏｔｏｐｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され、核内又は内部変換を介してのいずれかで新たに作製された放射線粒子に付与されるために利用可能な過剰エネルギーを特徴とする、不安定な核を有する原子を指す。このプロセス中、放射性核種は放射性崩壊を受け、ガンマ線及び／又はアルファ粒子若しくはベータ粒子などの亜原子粒子の放射をもたらすと言われている。これらの放射は、電離放射線を構成する。放射性核種は、天然に存在するか又は人工的に生成され得る。
ＩＨＣ技術
本明細書で使用される「免疫組織化学（ＩＨＣ）」という用語は、生体組織の切片中の抗原に特異的に結合する抗体の原理を利用することにより、組織切片の細胞中の抗原（例えば、タンパク質）を検出するプロセスを指す。免疫組織化学染色は、癌性腫瘍に見られるようなものなどの異常細胞の診断に広く使用されている。ＩＨＣは、生物学的組織の異なる部分におけるバイオマーカ及び示差的発現タンパク質の分布及び局在化を理解するための基礎研究でも広く使用されている。
Figure 2023541601000006
Figure 2023541601000007
本明細書で引用される全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。別段の定義がない限り、技術用語及び科学用語を含む、本発明の開示に使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。更なる指針により、本発明の教示をよりよく理解するために用語定義が含まれる。本明細書に記載の各実施形態は、特に明記しない限り、本明細書に記載の他の任意の実施形態と組み合わされ得る。
本発明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によって更に説明される。
実施例１：ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４並びにそれらのバリアントの生成
ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４のヘマグルチニンタグ付け及びヘキサヒスチジンタグ付け（ＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付け）バリアント（配列番号１７～２０）を、ＶＨＨファージミドベクターで形質導入された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＫ６細胞で生成し、Ｖｉｎｃｋｅ，Ｃ．ら（２０１２年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第９０７巻：第１４５～１７６頁のプロトコルなどの標準的なプロトコルに従って、凍結融解法又は浸透圧ショック法のいずれかによってペリプラズムから抽出した。要するに、細菌をＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中で成長させ、指数成長期にＶＨＨ発現を誘導した。一晩の成長中、ＶＨＨをペリプラズムに移動させ、ペリプラズムから凍結融解サイクルによって抽出した。代わりに、浸透圧ショックによってＶＨＨをペリプラズムから収集し、ＨＩＳ選択懸濁液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とのバッチインキュベーション及び０．５Ｍイミダゾールによる段階的溶出によって固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）により、８０％超の純度まで精製した。溶出液を、ＰＢＳ中で平衡化したＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるゲル濾過クロマトグラフィを介して脱塩した。
ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４のヘキサヒスチジンタグ付け（Ｈｉｓ６タグ付け）バリアント（配列番号２１～２４）を、ＶＨＨ組換え発現プラスミドで形質転換し、且つＶｉｎｃｋｅ，Ｃ．ら（２０１２年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第９０７巻：第１４５～１７６頁のプロトコルなどの標準的なプロトコルに従って、ＩＭＡＣ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によってペリプラズムから精製した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＫ６細胞中で生成した。要するに、細菌をＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中で成長させ、指数成長期にＶＨＨ発現を誘導した。一晩の成長中、ＶＨＨをペリプラズムに移動させて、浸透圧ショック後にこれらをペリプラズムから収集した。ＨＩＳ選択懸濁液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とのバッチインキュベーション、続いて０．５Ｍイミダゾールによる段階的溶出により、ＩＭＡＣを介してペリプラズム抽出物からＶＨＨを精製した。続いて、ＳＥＣは、ＰＢＳ中で平衡化した、ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＰＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。
Ｂａｌｄｉら（２００５年）「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．」第２１巻（第１号）：第１４８～５３頁などの標準的なプロトコルに従って、エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３－Ｅ細胞において、ＶＨＨ Ｂ１の非タグ付けバリアント（配列番号４）を生成した。トランスフェクションの６日後、ＶＨＨを含有する馴化培地を遠心分離によって採取した。ＶＨＨを、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．０で平衡化したＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて且つ塩勾配を採用して、陽イオン交換クロマトグラフィによって採取した培地から精製した。溶出液画分を、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０．でｐＨ７．０まで中和した。続いて、ＳＥＣは、ＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／６００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。
Figure 2023541601000008
実施例２：ノックインマウス
ヒトＦＡＰノックイン（ＫＩ）マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける第２染色体上のマウスＦＡＰ遺伝子のエクソン１における開始コドンの後の、ヒトＦＡＰ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００４４６０．５由来；配列番号２５、配列番号２６をコードする）の相同組換えによる導入によって産生した（遺伝子ＩＤ：１４０８９、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７９８６．３）。これにより、正常なマウスＦＡＰ遺伝子の機能的発現が破壊され、代わりに、マウスＦＡＰプロモータの下でのヒトＦＡＰの発現が駆動される。
ＫＩマウスでは、マウスＦＡＰのエクソン１におけるＡＴＧ開始コドンからイントロン２の一部までの領域が「ヒトＦＡＰ ＣＤＳ－ポリＡ」カセットで置き換えられている。
ターゲティングベクターの異なる要素を図１に概略的に示す。「ヒトＦＡＰ ＣＤＳ－ポリＡ」カセットは「５’アーム」から「３’アーム」まで伸長する。ターゲティングベクターの１７０８６ｂｐ配列は配列番号２７である。
「ヒトＦＡＰ ＣＤＳ－ポリＡ」カセットは、以下の関連要素を含む：
１．マウスＦＡＰ５’非翻訳領域及びエクソン１の一部（開始コドンまで）を包含する第１の相同アーム（図１の「５’アーム」）は、ヌクレオチド１７０４～３８２１である。相同アームを、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＡＣライブラリからのＢＡＣクローンＲＰ２３－１６１Ｂ２４又はＲＰ２４－３０８Ｉ１０を鋳型として用いて、ＰＣＲによって産生する。
２．マウスＦＡＰエクソン１は、ヌクレオチド３６５２で開始する
３．マウスＦＡＰ開始コドンはヌクレオチド３８２２からヌクレオチド３８２４までである
４．図１において「ヒトＦＡＰ ＣＤＳ」と示される、ヒトＦＡＰコード配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４４６０．５に由来；配列番号２５）は、ヌクレオチド３８２２～ヌクレオチド６１０４である
５．ウサギベータ－グロビンポリアデニル化配列（図１の「ｒＢＧｐＡ」は、ヌクレオチド６１０５～６６２６である
６．ＥＳ細胞の正の選択に使用されるネオマイシン耐性遺伝子（図１の「Ｎｅｏカセット」）は、ｒＢＧｐＡシグナル配列と第２の相同アームとの間にあり、且つ２つのＬｏｘＰ部位に隣接している（図１の「ｌｏｘＰ（ｒ）」、ヌクレオチド６６４０～６６７３及び１０４０６～１０４３９）
７．マウスＦＡＰイントロン２の一部を包含する第２の相同アーム（図１の「３’アーム」）は、ヌクレオチド１０５０６～１４４２６である。相同アームを、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＡＣライブラリからのＢＡＣクローンＲＰ２３－１６１Ｂ２４又はＲＰ２４－３０８Ｉ１０を鋳型として用いて、ＰＣＲによって産生する。
ターゲティングベクターは、追加的に以下を含む：
１．第１の相同アームの上流に位置する、相同組換えを受けていないＥＳ細胞の負の選択に使用されるジフテリア毒素Ａ遺伝子（図１の「ＤＴＡカセット」）
２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるターゲティングベクターの正の選択のために使用される、アンピシリン耐性遺伝子（図１の「Ａｍｐ」）
ターゲティングベクターをＲＦＬＰ分析及び配列決定によって検証する。ターゲティングベクターを、ＮｏｔＩ ＤＮＡ制限酵素で線状化し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションする。個々のクローンをネオマイシンでの正の選択後に選択した。選択されたＥＳクローンの遺伝子型を核型分析、ロングレンジゲノムＰＣＲ及びサザンブロット分析によって検証する。
選択されたＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６アルビノ胚盤胞に微量注入し、次いで、ＣＤ－１偽妊娠雌に再移植した。雄Ｆ０ファウンダーマウスを、それらの毛色及びゲノムＰＣＲによって同定した。Ｆ０ファウンダーマウスをＣ５７ＢＬ／６雌と交配した。生殖系列の伝達の際、ネオマイシンカセットはゲノムから自己欠失する。Ｆ１子孫をゲノムＰＣＲ分析によって遺伝子型決定した。Ｆ１ヘテロ接合性ＫＩマウスを、３つの異なるＥＳクローンから産生し、交配した。ヘテロ接合性ＫＩマウスは子孫の予想されるメンデル遺伝比で飼育された。これは、ヒトＦＡＰノックイン構築物の充分性及び毒性の欠如を示す。ヘテロ接合体遺伝子型及びホモ接合体遺伝子型の両方がいかなる巨視的異常もなしに少なくとも１年間生存可能であった。
公開された前臨床データから、マウスＦＡＰが血液、リンパ節、骨、子宮、膵臓、皮膚及び筋肉などのいくつかの器官及び組織に存在することが示される（Ｐｕｒｅら（２０１８年）「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」、８月；第３７巻（第３２号）：第４３４３～４３５７頁；Ｋｅａｎｅら（２０１４年）「ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ」第４巻第４３～５４頁）。いくつかの報告は、この上昇した取込みの少なくとも一部の、マウスＦＡＰの血流中への活発な排出（しかし、ヒトＦＡＰでは排出しない）に関連する（Ｋｅａｎｅら（２０１４年）「ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ」第４巻第４３～５４頁）。ヒトＦＡＰノックインマウスにおいて用いる実施例５（実施例５ａ）に記載される結果は、ヒト／マウス交差反応性ＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１が静脈内投与される場合、この上昇した取り込みが存在しないことを明らかにしており、これは、ヒトＦＡＰがそれまでに排出されていないことを示す。これは、本明細書に記載のヒトＦＡＰノックインマウスがヒトの状況を正確に表すことを意味する。
実施例５（実施例５ｂ）に記載される追加的結果は、ヒト／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ１が野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける治癒創傷でのマウスＦＡＰ発現線維芽細胞及びホモ接合型ヒトＦＡＰノックインマウスにおけるヒトＦＡＰ発現線維芽細胞を特異的に結合する一方、マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ４が野生型マウスにおける治癒創傷でマウスＦＡＰ発現線維芽細胞をターゲティングすることのみができ、ホモ接合型ヒトＦＡＰノックインマウスではターゲティングできなかったことを示す。この観察結果は、実施例５で使用された動物モデルにおけるヒトＦＡＰノックの真の検証として役立つ。
実施例３：標識化合物の合成
Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨは、１４０ｋｅＶの光子エネルギーで検出可能なガンマ線を放出するため、診断目的のためにテクネチウム－９９ｍ（９９ｍＴｃ）により放射性標識される。要するに、Ｘａｖｉｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．」（２０１２年）；第９１１巻：第４８５～９０頁に記載のように、それらのＨｉｓ６タグで［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］により標識される。［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］を、１ｍｇ／ｍＬのＶＨＨ溶液に添加し、３７～５０°Ｃで９０分間インキュベートした。標識後、９９ｍＴｃ－ＶＨＨ溶液を、ＰＢＳで予め平衡化した使い捨てサイズ排除カラム上で精製して、未結合の［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］を除去し、更なる使用前に０．２２μｍフィルタに通した。品質管理（ＱＣ）を即時薄層クロマトグラフィによって行った。
以下の実施例では、ＦＡＰターゲティングＨｉｓ６タグ付けＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（配列番号２１～２４）を、診断用放射性同位体９９ｍＴｃで放射性標識し、その後、診断用途のためにインビトロ及びインビボで特徴付けた。
ＶＨＨは、セラノスティックな目的のために１３１Ｉで放射性標識され、これは、同じ放射性標識されたＶＨＨが診断目的及び治療目的の両方に使用され得ることを意味する。これは、診断目的（例えば、ガンマ線）及び治療目的（例えば、ベータ線）に使用することができる、異なる種類の放射線を放出する放射性同位体を適用することによって達成することができる。そのような放射性同位体の１つはヨウ素－１３１（１３１Ｉ）であり、これは、約３６４ｋｅＶのガンマ線及び６０６ｋｅＶの最大エネルギーを有するベータマイナス粒子の両方を放出する。手短に言えば、［１３１Ｉ］ＳＧＭＩＢは、Ｄ’Ｈｕｙｖｅｔｔｅｒ Ｍら「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」（２０１７年１１月１日）；第２３巻（第２１号）：第６６１６～６６２８頁から適合させた手順に従って合成及び精製した。ヨウ化ナトリウム［１３１Ｉ］をそのトリメチルスタンニル前駆体とアセトニトリル中において室温で２０分間反応させ、その後、ビスＢｏｃ－［１３１Ｉ］ＳＧＭＩＢを、トリフルオロ酢酸の添加によって脱保護し、続いて逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。精製した［１３１Ｉ］ＳＧＭＩＢを、ＶＨＨと共に１５０μｇの０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中において室温で２０分間インキュベートし、求核置換を介してリジン側鎖アミン反応性基にコンジュゲートさせ、その後、［１３１Ｉ］ＳＧＭＩＢ－ＶＨＨを、ＰＢＳで予め平衡化した使い捨てサイズ排除カラムを用いて精製して未反応の［１３１Ｉ］ＳＧＭＩＢを除去し、更なる使用前に０．２２μｍフィルタを通過させた。品質管理（ＱＣ）を即時薄層クロマトグラフィによって行った。
以下に記載される実施例において、以下のＦＡＰターゲティングＶＨＨは、セラノスティック放射性同位体１３１Ｉで放射性標識され、続いてセラノスティック用途（Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（配列番号２１～２４）並びに非タグ付けＶＨＨ Ｂ１（配列番号４））のためにインビトロ及びインビボで特徴付けられている。
ＶＨＨは、診断目的のために１１１Ｉｎでも放射性標識される。インジウム－１１１は、約１７２及び２４６ｋｅＶのガンマ線を放出する。手短に言えば、二官能性キレート剤ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡを、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中のＶＨＨのリジン側鎖アミン反応基にコンジュゲートした。サイズ排除精製後、得られたＶＨＨ－ＤＯＴＡを０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．０中で再構成した。必要量の１１１Ｉｎを、金属を含まない０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．０を含有する試験バイアルに添加した。次いで、２５～１００μｇのＶＨＨ－ＤＯＴＡを添加し、５５℃で３０分間インキュベートした。１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡ－ＶＨＨをサイズ排除精製によって精製し、更に使用する前に０．２２μｍフィルタに通した。品質管理（ＱＣ）を即時薄層クロマトグラフィによって行った。以下の実施例において、ＦＡＰターゲティング非タグ付けＶＨＨ Ｂ１（配列番号４）は、診断のための放射性同位体１１１Ｉｎで放射性標識され、続いて診断用途のためにインビトロ及びインビボで特徴付けられている。
ＶＨＨは、セラノスティックな目的のために１７７Ｌｕでも放射性標識される（Ｄ’Ｈｕｙｖｅｔｔｅｒら（２０１２年）「Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ」第７巻（第２号）：第２５４～２６４頁）。ルテチウム－１７７は、約１１３及び２１０ｋｅＶのガンマ線と、４９７ｋｅＶの最大エネルギーを有するベータマイナス粒子との両方を放出する。手短に言えば、二官能性キレート剤ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡを、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中のＶＨＨのリジン側鎖アミン反応基にコンジュゲートした。サイズ排除精製後、得られたＶＨＨ－ＤＴＰＡを０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．０中で再構成した。必要量の１７７Ｌｕを、金属を含まない０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．０を含有する試験バイアルに添加した。次いで、２５～１００μｇのＶＨＨ－ＤＴＰＡを添加し、５５℃で３０分間インキュベートした。１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡ－ＶＨＨをサイズ排除精製によって精製し、更に使用する前に０．２２μｍフィルタに通した。品質管理（ＱＣ）を即時薄層クロマトグラフィによって行った。
以下の実施例において、ＦＡＰターゲティング非タグ付けＶＨＨ Ｂ１（配列番号４）を、セラノスティック放射性同位体１７７Ｌｕで放射性標識し、続いてセラノスティック用途のためにインビトロで特徴付けた。
最後に、ＶＨＨは、治療目的のために２２５Ａｃでも放射性標識される（Ｐｒｕｓｚｙｎｓｋｉら（２０１８年）「Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ」第１５巻（第４号）：第１４５７～１４６６頁）。アクチニウム－２２５は５．８ＭｅＶのアルファ粒子を放出する。手短に言えば、二官能性キレート剤ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＤＯＴＡを、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中のＶＨＨのリジン側鎖アミン反応基にコンジュゲートした。サイズ排除精製後、得られたＶＨＨ－ＤＯＴＡを０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．０中で再構成した。２２５Ａｃの所望の活性を、０．８Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）を含有する試験バイアルに添加し、続いてＶＨＨ－ＤＯＴＡ（２５～１００μｇ）と共に５５℃で９０分間インキュベートした。混合物を室温まで冷却し、任意の遊離２２５Ａｃを錯体化するために、５０ｍＭ ＤＴＰＡ（０．８Ｍ酢酸アンモニウム中）及びＣｈｅｌｅｘ １００でクエンチした。２２５Ａｃ－ＤＯＴＡ－ＶＨＨをサイズ排除精製によって精製し、更に使用する前に０．２２μｍフィルタに通した。品質管理（ＱＣ）を即時薄層クロマトグラフィによって行った。
以下の実施例において、ＦＡＰターゲティング非タグ付けＶＨＨ Ｂ１（配列番号４）を治療のための放射性同位体２２５Ａｃで放射性標識し、続いて治療的適用のためにインビトロで特徴付けた。
実施例４：ＶＨＨ又はＶＨＨを含む標識化合物の結合活性
実施例４ａ：組換えタンパク質の生成
ＶＨＨ結合活性試験のために、ヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰ組換えタンパク質を、Ｂａｌｄｉら（２００５年）「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．」第２１巻（第１号）：第１４８～５３頁におけるプロトコルなどの標準的なプロトコルに従って、エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－Ｅ細胞において生成した。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（アミノ酸Ｌ２６～Ｄ７６０、ＵｎｉｐｒｏｔエントリＱ１２８８４、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４４５１．２）及びマウスＦＡＰの細胞外ドメイン（アミノ酸Ｌ２６～Ｄ７６１、ＵｎｉｐｒｏｔエントリＰ９７３２１、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０３２０１２．１）を、培地中での分泌のためにヒトサイスタチン－Ｓシグナルペプチド（配列番号３１）を用いて、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（それぞれ配列番号２８～２９）により生成した。分泌されると、シグナルペプチドはタンパク質分解的に組換えＦＡＰタンパク質から除去される。トランスフェクションの６日後、組換えタンパク質を含有する馴化培地を遠心分離によって採取した。ＦＡＰ組換えタンパク質を、採取した培地から、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｅｘｃｅｌ親和性培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とのバッチインキュベーションによってＩＭＡＣを介して精製した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．２で洗浄した後、タンパク質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．２で溶出させた。続いて、ＳＥＣは、ＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。
組換えＦＡＰタンパク質は、実施例４ｄにおいて測定されるように、これがその酵素活性（Ａｅｒｔｇｅｅｒｔｓ Ｋら（２００５年）「Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ」第２８０巻（第２０号）：第１９４４１～４頁）のための必要条件であるため、溶液中でホモ二量体を形成した。
実施例４ｂ：ＥＬＩＳＡ：特異的結合：ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰ、ＤＰＰ ＩＶ
実施例のこの部分は、ＥＬＩＳＡにおいて試験されるような、ヒト及び／又はマウスＦＡＰの細胞外ドメイン（それぞれＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４４５１．２及びＮＰ＿０３２０１２．１）に対するＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４の特異的結合並びにヒトＤＰＰ ＩＶの細胞外ドメイン（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１９２６．２）に対する結合の非存在を記載する。ＤＰＰＩＶ及びＦＡＰは、いずれもジペプチジルペプチダーゼのファミリーに属する一方、ＤＰＰ ＩＶは、ＦＡＰの最も近いホモログであり、そのアミノ酸配列において約５０％の相同性を共有する（Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ－Ｊｅａｎｎｅｒｅｔ Ｌら（２０１７年）「｛ｊ｝Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ」第２１巻（第１０号）：第９７７～９９１頁）。
測定の前日に１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２中１μｇ／ｍＬの濃度の０．１μｇの組換えタンパク質を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）でコーティングした。ＶＨＨクローンごとに、ブランクコーティングウェルも予測された（緩衝液のみ）。ウェルを、タンパク質非含有Ｔ２０（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）でオーバーコーティングした。ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ＶＨＨ含有細菌凍結融解抽出物を各ウェルに添加した。ＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨの結合を、マウス抗ＨＡ．１１エピトープタグ（クローン１６Ｂ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を一次Ａｂとして用いて、ヤギ抗マウスＩｇＧ（全分子）アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を二次Ａｂとして用いて、その間にＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎで充分に洗浄することによって検出した。ＡＰブロット緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５）中のホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてシグナルを発生させた。吸光度を、吸光度マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４０５ｎｍで決定した。クローンごとに、抗原コーティングウェルと抗原非含有ウェルとの吸光度比を決定した。
図２に示されるように、ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２及びＢ３（配列番号１７～１９）は、ヒトＦＡＰ組換えタンパク質（配列番号２８）によりコーティングされるウェルについては２５を超えるシグナル対バックグラウンド比を示し、このことから、ヒトＦＡＰに対する特異的結合が確認された。ＶＨＨ Ｂ１及びＢ２は、マウスＦＡＰ組換えタンパク質（配列番号２９）にも特異的に結合できることを示したが、これは、ＶＨＨ Ｂ３については当てはまらなかった。その結果、ＶＨＨ Ｂ４（配列番号２０）は、マウスＦＡＰ組換えタンパク質によりコーティングされるウェルについては３０を超えるシグナル対バックグラウンド比を示し、このことから、マウスＦＡＰに対する特異的結合が確認された一方、ヒトＦＡＰには結合しなかった。これらの実験は、ＶＨＨ Ｂ１及びＢ２がマウスＦＡＰ／ヒトＦＡＰ交差反応性であり、ＶＨＨ Ｂ３がヒトＦＡＰ特異的であり、ＶＨＨ Ｂ４がマウスＦＡＰ特異的であることを実証する。
全てのヒトＦＡＰ結合ＶＨＨがヒトＤＰＰＩＶ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対する結合の非存在を示し、シグナル対バックグラウンド比は、およそ１であった。
実施例４ｃ：フローサイトメトリ：ＧＭ０５３８９及びＨＥＫ－マウスＦＡＰ
実施例のこの部分は、ヒトＦＡＰ発現線維芽細胞株ＧＭ０５３８９（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈのＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手）及びマウスＦＡＰトランスフェクト細胞株ＨＥＫ２９３（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｄ．Ｃｈｅｎｇ、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡから入手；Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｄ．ら（２００２年）「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第６２巻（第１６号）：第４７６７～４７７２頁に記載）上の天然に発現される受容体を標的とするＶＨＨの能力について記載する。
細胞結合をフローサイトメトリ実験によって試験した。試験条件ごとに、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡで洗浄した１×１０５～２×１０５個の細胞を、９６ウェルＵ底プレートのウェルにペレット化した。細胞ペレットを再懸濁し、ＶＨＨ含有細菌凍結融解抽出物（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡで希釈）と共にインキュベートした。ＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨの結合を、マウス抗ＨＡ．１１エピトープタグ（クローン１６Ｂ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を一次検出抗体として用いて、ＰＥコンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１（クローンＡ８５－１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を二次検出抗体として使用いて、その間に０．５％ＢＳＡのＰＢＳで洗浄し、最後に０．５％ＢＳＡのＰＢＳに再懸濁して検出した。
フローサイトメトリをＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてデータを分析した。前方散乱－側方散乱プロットに基づいて、単一細胞ゲートを描写した。蛍光強度の中央値を、単一細胞のフィコエリトリンシグナルについてのヒストグラムで決定した。蛍光強度中央値（Δｍｆｉ）の差を、ＶＨＨのインキュベーションなしの試験条件（細胞＋一次Ａｂ＋二次Ａｂ）と比較して計算し、図３に示す。
組換えタンパク質を用いた実施例４ｂにおけるＥＬＩＳＡの結果によれば、ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２及びＢ３（配列番号１７～１９）は、ヒトＦＡＰ発現細胞株ＧＭ０５３８９に結合することができる一方、ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２及びＢ４（配列番号２０）は、マウスＦＡＰトランスフェクト細胞株ＨＥＫ２９３に結合することができた。
実施例４ｄ：酵素活性
実施例のこの部分は、ＶＨＨ結合の際のヒトＦＡＰジペプチジルペプチダーゼ酵素活性に対する非阻害効果について記載する。
ヒトＦＡＰ酵素活性は、蛍光発生基質であるベンジルオキシカルボニル－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－７－アミド－４－メチルクマリン（Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ；Ｂａｃｈｅｍ）を用いて測定された。
ヒトＦＡＰ組換えタンパク質（配列番号２８）を、１μＭのＨＡ－Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨの非存在下又は存在下、黒色の９６ウェル平底プレートにおいてアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５）で２００ｎｇ／ｍＬに希釈した。阻害剤対照として、ＶＨＨの代わりに１μＭのメシル酸タラボスタット（ＡｐｅｘＢｉｏ）を加えた。結合平衡に達するまで１時間インキュベートした後、Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ基質を５０μＭの最終濃度で添加した。蛍光マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、３８０ｎｍで励起し、４６０ｎｍで発光検出して、基質のＺ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ及び７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）への酵素的変換を追跡した。蛍光を１分毎に１時間測定した。図４に示される曲線の傾きは、酵素活性の速度に対応する。
ヒトＦＡＰ結合ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２及びＢ３（配列番号１７～１９）は、ヒトＦＡＰジペプチジルペプチダーゼ酵素活性に対する影響を何ら示さず、Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣをＺ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ及びＡＭＣに変換した。ＶＨＨの存在下における酵素活性の速度は、ＶＨＨのない状態（陽性対照）に対応した一方、メシル酸タラボスタット（阻害剤対照）との共インキュベーションは、より低い蛍光レベルをもたらす基質加水分解速度の低下を示した。
実施例４ｅ：抗原結合速度論
実施例のこの部分は、抗原結合速度論の決定について記載する。
この程度まで、ヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰ組換えタンパク質（配列番号２８～２９）を、５倍モル過剰のスルホ－ＮＨＳ－ＳＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＢＳ緩衝液においてビオチン化した。過剰ビオチンを、ＰＢＳ中で平衡化したＺｅｂａｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて除去した。
精製されたＶＨＨによる抗原結合の速度論パラメータを、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いたバイオレイヤー干渉法によって決定した。アッセイは１０００ｒｐｍで振盪しながら２５℃で行った。ストレプトアビジンコーティングＳＡセンサを、アッセイ緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎを補充したＨＢＳ）中で平衡化した後、ビオチン化ＦＡＰ組換えタンパク質を５μｇ／ｍＬの濃度で５分間ロードした。アッセイ緩衝液中３０ｎＭ～０．４ｎＭの三倍段階希釈で、Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨを分析した（ただし、ＶＨＨ Ｂ３結合マウスＦＡＰ組換えタンパク質を除き、１０００ｎＭ～１．６ｎＭの５倍段階希釈物が採用された）。最初にアッセイ緩衝液中でベースラインを１８０秒間測定し、続いて濃度の昇順に１８０秒間のＶＨＨ調製物との５回のその後の会合段階を測定し、その間にアッセイ緩衝液中の７５秒間の中間解離段階を行い、アッセイ緩衝液中で３０分間の最終解離段階を行った。全てのアッセイにおいて、これは、会合段階中にアッセイ緩衝液中でインキュベートされた、ＦＡＰ組換えタンパク質をロードした参照センサが含まれた。
結合曲線を出力し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ分析ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。最初に、異なる曲線のｙ軸を、ベースライン測定の最後の５秒間の中央値に整列させた。その後、基準センサのセンサグラムを他の全てのセンサグラムから差し引いた。得られた結合曲線は、Ｒｍａｘをグローバルに、ＲＩをローカルに、ドリフトを０に設定した「ドリフトによる速度論的滴定」結合（１：１ 抗原：分析物）モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ら（２００６年）「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第３４９巻：第１３６～１４７頁）による一般的な適合を用いて適合させた。
表７は、センサに負荷されたビオチン化ヒトＦＡＰ組換えタンパク質又はビオチン化マウスＦＡＰ組換えタンパク質を用いたバイオレイヤー干渉法によって決定されるような、Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（配列番号２１～２４）についての抗原結合の速度論的パラメータの概要を示す。
ＶＨＨ（Ｂ１、Ｂ２及びＢ３）は、１ｎＭよりも小さい平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＦＡＰに結合するための少なくともサブナノモル濃度の親和性を示した。特に、最良の結合特性は、ＫＤ値＜５０ｐＭ及び解離反応速度定数（ｋｄ）＜５ １０－５秒－１を有するＶＨＨ Ｂ１について観察された。
ＶＨＨ Ｂ１及びＢ４は１ｎＭ未満のＫＤ値でマウスＦＡＰに結合することができた。ＶＨＨ Ｂ２はマウスＦＡＰについて２４ｎＭの中程度の親和性（ＫＤ）を有した。
Figure 2023541601000009
実施例４ｆ．ＦＡＰに対する放射性標識されたＶＨＨのインビトロ及びインビボでの結合活性
次に、本発明者らは、診断用放射性同位体９９ｍＴｃによる放射性標識後の種々のＶＨＨのインビトロ及びインビボでのヒトＦＡＰ及びマウスＦＡＰ結合能を記載する。異なる９９ｍＴｃ標識ＶＨＨのＥＣ５０値を、ヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３細胞及びＧＭ０５３８９細胞並びにまたマウスＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３細胞（ＧＭ０５３８９は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈのＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手した；及びＦＡＰトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞株は、Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｄ．Ｃｈｅｎｇ、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡから得た；Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｄ．ら（２００２年）「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第６２巻（第１６号）：第４７６７～４７７２頁）に記載）について決定した。Ｈｉｓ６タグ付けヒト／マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨを、実施例３に記載される放射化学的手順に従って、診断用放射性同位体９９ｍＴｃで放射性標識した。
次に、異なる細胞株を、０ｎＭ～３００ｎＭの範囲にわたる、異なる９９ｍＴｃ標識Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨの濃度の段階希釈物と共にインキュベートした。非特異的結合を評価するために、１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを並行して加えて、ヒトＦＡＰタンパク質又はマウスＦＡＰタンパク質を癌細胞表面において飽和させた。各ＶＨＨについて得られたＥＣ５０値を表８に示す。これらのデータから、ＶＨＨ Ｂ１及びＢ２の両方は、９９ｍＴｃによる放射性標識後にヒトＦＡＰ細胞表面タンパク質及びマウスＦＡＰ細胞表面タンパク質の両方に結合するそれらの能力を維持することが示される。非ターゲティング対照ＶＨＨ Ｒ３Ｂ２３（配列番号３２；Ｌｅｍａｉｒｅら（２０１４年）「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」第２８巻（第２号）：第４４４～４４７頁）は、評価した３つの細胞株のいずれに対しても関連する結合を明らかにしなかった。本発明者らは、９９ｍＴｃ標識ＶＨＨ Ｂ４はマウスＦＡＰ細胞表面タンパク質にのみ結合する一方、ＶＨＨ Ｂ３はインビトロでヒトＦＡＰ細胞表面分子にのみ結合することを確認した。
Figure 2023541601000010
異なる９９ｍＴｃ標識ヒトのみ、マウスのみ又はヒト／マウス交差反応性ＦＡＰターゲティングＶＨＨを、解剖研究を介して正常雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてインビボで評価した。マウス（ＶＨＨ当たりｎ＝３）に約１ｍＣｉ（±４μｇ）の９９ｍＴｃ標識ＶＨＨを静脈内注射した。次に、心臓穿刺によって血液を採取し、その後、注射の１時間後に頸椎脱臼によってマウスを安楽死させた。マウスを解剖し、異なる器官及び組織を収集した。目的の器官及び組織を秤量し、ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
これらのデータから、ＶＨＨ Ｂ１、Ｂ２及び（Ｂ４）は、９９ｍＴｃによる放射性標識後にマウスＦＡＰと結合するそれらの能力を維持し、循環ＦＡＰを発現及び／又は含有するいくつかの器官及び組織、例えば血液、リンパ節、骨、子宮、膵臓、皮膚及び筋肉などにおける放射能の高い保持が示される（Ｋｅａｎｅら（２０１４年）「ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ」第４巻第４３～５４頁）。（マウスＦＡＰを結合させるための尺度としての）保持の程度は、マウスＦＡＰに対するそれらの対応する結合親和性と一致する（Ｂ４＞Ｂ１＞Ｂ２）。非ターゲティング対照のＶＨＨ Ｒ３Ｂ２３は、マウスＦＡＰのいかなる関連するターゲティングも明らかにしなかった。９９ｍＴｃ標識Ｈｉｓ６タグ付けヒトＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ３は、非ターゲティング放射性標識Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨに典型的であるマウスにおける体内分布を明らかにした（表９）。腎臓を除く全ての器官及び組織において、低放射性シグナルを測定した。
Figure 2023541601000011
いくつかの器官及び組織で観察された取り込み上昇が特異的ターゲティングに起因するものであるかどうかを評価するために、９９ｍＴｃ標識ＶＨＨ Ｂ１を単独で且つ１００倍モル過剰の非標識ＶＨＨＢ１と組み合わせて、健康な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、その後、その体内分布を解剖研究によって評価した。マウス（条件当たりｎ＝３）に約１ｍＣｉ（±４μｇ）の９９ｍＴｃ標識ＶＨＨを静脈内注射した。トレーサ投与の３０分前に、非標識ＶＨＨ又は等量のビヒクル溶液を投与した。次に、心臓穿刺によって血液を採取し、その後、注射の１時間後に頸椎脱臼によってマウスを安楽死させた。マウスを解剖し、単離した目的の器官及び組織を秤量し、ガンマカウンタを注射標準と共に用いて放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。結果は、血液、リンパ節、骨、子宮、膵臓、皮膚及び筋肉における取込みの上昇が非標識ＶＨＨ Ｂ１との同時投与によって完全に減少することを示し（表１０）、これは、取込みの上昇が、非特異的保持ではなく、ＶＨＨ Ｂ１の特異的ターゲティング能に起因するものであることを示す。
Figure 2023541601000012
実施例５：
この実施例において、本発明者らは、正常なＣ５７ＢＬ／６マウス及びホモ接合ヒトＦＡＰノックインマウスの両方並びに創傷治癒を受けるマウスにおいて、診断用放射性同位体９９ｍＴｃ（実施例３に記載されるような）による放射性標識後、関連するヒトＦＡＰ発現又はマウスＦＡＰ発現を測定するためのヒトのみ又はヒト／マウス交差反応性ＦＡＰターゲティングＶＨＨの可能性を記載する。
実施例５ａ．
この実施例の最初の部分において、ヒト／マウス交差反応性ＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１、マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ４及び非ターゲティング対照ＶＨＨ Ｒ３Ｂ２３の体内分布を、正常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びホモ接合型ヒトＦＡＰノックインマウスの両方において評価した。全てのマウスに、約１ｍＣｉ（±４μｇ）の９９ｍＴｃ標識ＶＨＨを尾静脈内注射した。次に、マウスを１．５時間後に頸椎脱臼によって安楽死させ、解剖し、その後、異なる器官及び組織を収集した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
結果は、マウスＦＡＰを両方とも標的とする、９９ｍＴｃ標識Ｂ１及びＢ４のｉ．ｖ．投与後の、正常マウスの血液、リンパ節、骨、子宮、膵臓、皮膚及び筋肉における取込みの上昇を示す（表１１）。９９ｍＴｃ－Ｒ３Ｂ２３の場合、取込みの上昇はない。この観察結果は、正常なマウスでは、マウスＦＡＰが血流中に活発に排出され、それにより、血中並びに高度に灌流された器官及び組織における高いトレーサ取込みがもたらされるという事実によって説明され得る（Ｋｅａｎｅら（２０１４年）「ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ」第４巻第４３～５４頁）。ヒト／マウス交差反応性ＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１がホモ接合体ヒトＦＡＰノックインマウスにｉ．ｖ．投与される場合、この上昇した取り込みが存在せず、ヒトＦＡＰがその程度まで排出されないことを示し、これは、ヒトの状況を正確に表す。
Figure 2023541601000013
実施例５ｂ．
第２に、線維芽細胞が創傷治癒のプロセスに関与することが知られている（Ｇｉｅｓｅｌら（２０１９年）「Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ」第６０巻（第３号）：第３８６～３９２頁；Ｄｉｅｎｕｓ Ｋら、「Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ．」（２０１０年１２月）；第３０２巻（第１０号）：第７２５～３１頁；Ｇａｏ Ｙら、「Ｆａ Ｙｉ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉ．」（２００９年１２月）；第２５巻（第６号）：第４０５～８頁）。本発明者らは、この現象を利用して、ＦＡＰ発現線維芽細胞を可視化するための９９ｍＴｃ標識ＶＨＨの診断能を更に支持した。これに対して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びホモ接合型ヒトＦＡＰノックインマウスの両方は、腰背部に小さい切開を受け、これを直ちに縫合した。１日後、全てのマウスに、約１ｍＣｉ（±４μｇ）の９９ｍＴｃ標識ＶＨＨを尾静脈内注射した。次に、Ｖｅｃｔｏｒ＋／ＣＴＭＩＬａｂｓシステムを用いてトレーサ投与の１時間後にＳＰＥＣＴ／ＣＴを行い、続いて１．５時間後に剖検研究を行った。ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングは、ＳＰＥＣＴコリメータ及び６つのベッド位置のスパイラルスキャンモードを用いて行った（位置当たり２．５分）。ＣＴについては、１つの位置のみの通常スキャンモードを使用した。得られたＳＰＥＣＴデータは、０．４ボクセルサイズ、２サブセット及び４反復で再構成され、その後、画像は統合され、ＣＴスキャンに基づいて減衰のために補正される。医用画像データ分析ツール（アミド）を用いて画像を分析する。器官及び組織の選択における取込み値を分析し、ｃｍ３当たりの％注入活性（％ＩＡ／ｃｃ）として表した。
次に、マウスを１．５時間後に頸椎脱臼によって安楽死させ、解剖し、その後、異なる器官及び組織を収集した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
以下の表７及び表８に記載される結果は、ヒト／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ１が野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるインビボでのマウスＦＡＰ発現線維芽細胞及びホモ接合型ヒトＦＡＰノックインマウスにおけるヒトＦＡＰ発現線維芽細胞の治癒創傷で特異的に結合することを示す。解剖を介して得られた取り込み値は、ホモ接合型ヒトＦＡＰノックインマウスの治癒創傷において、マウスＦＡＰ特異的ＶＨＨ Ｂ４（ｐ＝０．００４４）及び非ターゲティング対照ＶＨＨ Ｒ３Ｂ２３（ｐ＝０．００５５）について測定されたものと比較して有意に高かった。ノックインマウス及び野生型マウスにおける治癒創傷におけるヒト／マウスＦＡＰ交差反応性Ｂ１の取込みは、それぞれ対応のないｔ検定によって決定されるように、有意に異ならなかった（ｐ＝０．１７５６）。
Figure 2023541601000014
Figure 2023541601000015
実施例６：放射性標識ＶＨＨの診断的使用
この実施例において、本発明者らは、診断用放射性同位体９９ｍＴｃ及び１１１Ｉｎによる放射性標識後、関連するヒトＦＡＰ発現又はマウスＦＡＰ発現を可視化するそれらの能力を調べることにより、ヒトのみ又はヒト／マウス交差反応性ＦＡＰターゲティングＶＨＨの診断能を記載する（実施例３に記載されるように）。診断能は、マウスＦＡＰを発現する天然浸潤癌関連線維芽細胞を有するヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍を保有する無胸腺ヌードマウス及びヒトＦＡＰ受容体を発現するＨＥＫ－２９３腫瘍を保有する無胸腺ヌードマウスにおいて確認される。
実施例６ａ．
この実施例の最初の部分において、９９ｍＴｃ標識されたヒト／マウス交差反応性ＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１及びＢ２の診断能を、マウスＦＡＰ特異的ＶＨＨ Ｂ４、非ターゲティング対照ＶＨＨ Ｒ３Ｂ２３及びヒトＦＡＰターゲティングＶＨＨＢ３と共に、自然浸潤癌関連線維芽細胞がマウスＦＡＰを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにおいて評価した。
これを行うために、無胸腺ヌードマウス（ＶＨＨ当たりｎ＝３）に、Ｍａｔｒｉｇｅｌにおいて１０×１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を接種した。腫瘍成長の検証（約２００ｍｍ３の平均サイズ）後、マウスに約１ｍＣｉ（±４μｇ）の９９ｍＴｃ標識ＶＨＨを尾静脈内注射した。次に、上記のように、Ｖｅｃｔｏｒ＋／ＣＴＭＩＬａｂｓシステムを用いてトレーサ投与の１時間後にＳＰＥＣＴ／ＣＴを行い、続いて１．５時間後に剖検研究を行った。
結果は、マウスＦＡＰ特異的ＶＨＨ Ｂ４及びヒト／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ１の両方がＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍に特異的に蓄積したが、この組織における取込みの上昇は、ヒト／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ２についてはより低く、９９ｍＴｃ標識非ターゲティング対照ＶＨＨ Ｒ３Ｂ２３及びヒトＦＡＰ特異的ＶＨＨ Ｂ３については存在せず、これは、マウスＦＡＰに対するこれらのＶＨＨの対応する親和性と一致することを示す。一元配置分散分析多重比較（ｐ＜０．０５）によって示されるように、マウスＦＡＰ特異的ＶＨＨ Ｂ４及びヒト／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ１の両方の特異的蓄積は、追加的な評価されたＶＨＨと比較して有意に高かった（表＃９及び表＃＃１０）。これは、ＶＨＨが、マウスＦＡＰ受容体をターゲティングすることにより、正常マウスにおける癌関連線維芽細胞を可視化できることを示す。本発明者らは、ＶＨＨ Ｂ１も高い結合親和性でヒトＦＡＰに結合することを知っているため、これは、重要な知見である。したがって、交差反応性のヒト／マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１は、ヒトの状況においてヒトＦＡＰ発現腫瘍関連線維芽細胞もターゲティングするであろうと仮定することが好適である。
Figure 2023541601000016
Figure 2023541601000017
実施例６ｂ．
第２に、非タグ付けのヒト／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ１を１１１Ｉｎで放射性標識し、その後、そのインビトロ及びインビボ診断能を評価した。得られた放射性コンジュゲートの結合能を評価して、これがＶＨＨのアミノ酸配列への１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡのコンジュゲーションによって影響されないことを確認した。これを行うために、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞を、０ｎＭ～３３ｎＭの範囲にわたる１１１Ｉｎ標識ＶＨＨの濃度を有する段階希釈物によりインキュベーションした。非特異的結合を評価するために、１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを並行して加えて、癌細胞上に発現されるヒトＦＡＰ受容体を飽和させた。０．６±０．０８ｎＭのＥＣ５０が得られたため、ヒトＦＡＰ受容体への結合は妨げられなかった。
１１１Ｉｎで放射性標識された非タグ付けヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ１のインビボ診断能を、ヒトＦＡＰ受容体を発現するＨＥＫ－２９３腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにおいて評価した。これに対して、無胸腺ヌードマウス（時点当たりｎ＝４）の首にヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長（約１００～２００ｍｍ３のサイズ）の検証後、全てのマウスに約４５０μＣｉ（±７μｇ）の１１１Ｉｎ標識ＶＨＨを尾静脈内注射した。マイクロＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングを、ＭＩＬａｂｓ ＶＥＣＴｏｒ＋／ＣＴシステムを用いてトレーサ注入の１時間、４時間及び２４時間後に行った。手短に言えば、ラットＳＰＥＣＴコリメータ及び６つのベッド位置（位置当たり３分）のスパイラルスキャンモードを用いてイメージングを行った。ＣＴについては、１つの位置のみの通常スキャンモードを使用した。得られたＭｉｃｒｏ－ＳＰＥＣＴ／ＣＴデータは、０．４ボクセルサイズ、２サブセット及び４反復で再構成され、その後、画像は統合され、ＣＴスキャンに基づいて減衰のために補正される。医用画像データ分析ツール（アミド）を用いて画像を分析する。器官及び組織における取込み値を分析し、ｃｍ３当たりの％注入活性（％ＩＡ／ｃｃ）として表した。最後に、各スキャン後にマウスを屠殺し、上記のように処理した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
結果は、１１１Ｉｎ標識されたＶＨＨ Ｂ１が、ヒトＦＡＰを発現する腫瘍に特異的に蓄積することを示した。腫瘍における取込みは経時的に一貫しており、１時間後に約２．５２±０．１６％ＩＡ／ｇ及び１．０１±０．１８％ＩＡ／ｃｃ並びに２４時間後に約１．９０±０．６５％ＩＡ／ｇ及び０．７４±０．５８％ＩＡ／ｃｃの値を示した（表１６及び表１７）。
ＶＨＨ Ｂ１は、１１１Ｉｎによる放射性標識後にマウスＦＡＰと結合するその能力を維持し、循環するマウスＦＡＰを発現及び／又は含有するいくつかの器官及び組織（例えば、血液、リンパ節、骨、子宮、膵臓、皮膚及び筋肉など）における放射能の高い保持を伴った（実施例４ｆに合致）。上述の器官及び組織におけるこの取り込みは経時的に減少し、注射２４時間後のバックグラウンド値に近かった。
Figure 2023541601000018
Figure 2023541601000019
実施例７：１３１Ｉで標識されたＶＨＨのセラノスティック使用
セラノスティック使用とは、１つの同じ標識化合物が診断用途と治療用途との両方に適用可能である能力を指す。この実施例では、本発明者らは、ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ１（そのＨｉｓ６タグ付けバージョン及びその非タグ付けバージョンの両方）、ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰ交差反応性ＶＨＨ Ｂ２及びマウスＦＡＰ特異的ＶＨＨ Ｂ４のセラノスティック能を、（実施例３に記載されるように）セラノスティック放射性核種１３１Ｉによる放射性標識後のそれらのターゲティング能を調べることによって記載する。セラノスティック能を、ヒトＦＡＰ発現細胞に結合するそれらの能力（飽和結合及び細胞保持）によってインビトロで及び関連するマウスモデルにおけるそれらの体内分布を評価することによってインビボで評価する。
実施例７ａ．
第１の部分では、インビトロ挙動を、それらの細胞結合及び保持を経時的に調べることによって評価した。得られた放射性コンジュゲートの結合能を評価して、これがＶＨＨのアミノ酸配列への１３１Ｉ－ＳＧＭＩＢの導入によって影響されないことを確認した。これに向けて、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９（Ｈｉｓ６タグ付け及び非タグ付けＶＨＨ Ｂ１）及びヒトＦＡＰトランスフェクトＨＥＫ－２９３細胞（Ｈｉｓ６タグ付け及び非タグ付けＶＨＨ Ｂ１；Ｈｉｓ６タグ付けＶＨＨ Ｂ２）を、０ｎＭ～３３ｎＭの範囲にわたる様々な１３１Ｉ標識ＶＨＨの濃度を有する段階希釈物と共にインキュベートした。非特異的結合を評価するために、１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを並行して加えて、癌細胞上に発現されるヒトＦＡＰ受容体を飽和させた。
全ての１３１Ｉ標識化ＶＨＨがヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞及びＨＥＫ－２９３細胞に対する細胞結合実験において匹敵する用量応答曲線を示し、これは、１３１Ｉ標識化が結合能に影響を及ぼさなかったことを示す。ＧＭ０５３８９細胞の場合、Ｈｉｓ６タグ付けＢ１及び非タグ付けＢ１について、それぞれ０．６±０．１及び２．７±０．１ｎＭのＥＣ５０値が得られた一方、ＨＥＫ－２９３では、Ｈｉｓ６タグ付けＢ１、非タグ付けＢ１及びＨｉｓ６タグ付けＢ２について、それぞれ１．４±０．５、２．８±０．７及び３．８±３．３ｎＭのＥＣ５０値が観察された。
１３１Ｉ標識Ｈｉｓ６タグ付けＢ１及び非タグ付けＢ１のインビトロ細胞保持を、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞で評価した。この特定の場合、細胞を１０ｎＭの１３１Ｉ標識ＶＨＨと共に４℃で１時間インキュベートし、その後、未結合画分を収集した。１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを添加して、非特異的結合を評価した。次に、細胞を新鮮な培地と共に３７℃で最大２４時間インキュベートし、その後、解離した画分を収集した。その後、細胞を０．０５ＭグリシンｐＨ２．８で洗浄して、膜結合画分を収集した。最後に、細胞を室温で１Ｍ ＮａＯＨで可溶化して、内在化した画分を収集した。膜結合画分及び内在化画分の合計は、全細胞随伴性画分に対応する。
Ｈｉｓ６タグ付けＢ１及び非タグ付けＢ１の両方は、ヒトＦＡＰ受容体に結合すると、非常に高いレベルの細胞随伴性活性を経時的に明らかにする。２４時間のインキュベーション後、初期結合活性（それぞれ非タグ付け及びＨｉｓ６タグ付けＢ１について）の約８０％及び７０％が依然として腫瘍細胞上に保持され、交差反応性ヒト／マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１の広範で維持されたターゲティング能力を反映した（図５）。この特徴は、標的細胞をその細胞傷害性ペイロードに長時間曝露することを可能にするため、ＶＨＨを用いる治療用途にとって非常に重要である。
実施例７ｂ．
次に、１３１Ｉ標識されたＢ１、Ｂ２及びＢ４のセラノスティック能を、ヒトＦＡＰを発現するＨＥＫ－２９３腫瘍を有するマウスにおいて評価した。これに対して、無胸腺ヌードマウス（時点当たりｎ＝３）の首にヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長（約１００～２００ｍｍ３のサイズ）の検証後、全てのマウスに約４００μＣｉ（±２５μｇ）の１３１Ｉ標識ＶＨＨを尾静脈内注射した。マイクロＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングを、ＭＩＬａｂｓ ＶＥＣＴｏｒ＋／ＣＴシステムを用いて、Ｄ’Ｈｕｙｖｅｔｔｅｒら、「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」（２０１７年１１月１日）；第２３巻（第２１号）：第６６１６～６６２８頁に記載される手順に従って、トレーサ注入の２時間後に行った。手短に言えば、マウスＰＥＴコリメータ及び９４ベッド位置（位置当たり１９秒）のスパイラルスキャンモードを用いてイメージングを行った。ＣＴについては、１つの位置のみの通常スキャンモードを使用した。得られたＭｉｃｒｏ－ＳＰＥＣＴ／ＣＴデータは、０．６ボクセルサイズ、２サブセット及び７反復で再構成され、その後、画像は、統合され、ＣＴスキャンに基づいて減衰のために補正される。医用画像データ分析ツール（アミド）を用いて画像を分析する。器官及び組織における取込み値を分析し、ｃｍ３当たりの％注入活性（％ＩＡ／ｃｃ）として表した。最後に、マウスを２．５時間後に屠殺し、上記のように処理した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
結果は、ヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍における１３１Ｉ標識されたＢ２及びＢ１の特異的な蓄積を明らかにした一方、Ｂ４についてはるかに低い取込みが観察された（表１８及び表１９）。腫瘍取込みは、Ｂ２、Ｂ１及びＢ４について、それぞれ２．９６±０．４７、３．４７±０．２４、１．１５±０．４４％ＩＡ／ｇと測定された。リンパ節、子宮及び骨などの全ての追加の器官及び組織における１３１Ｉ標識Ｂ１の取込みは一致していたが、その１１１Ｉｎ標識バリアント（実施例６ｂ）について見られたものよりも絶対数が少なく、且つＢ４について観察されたものよりも低かった。２．５時間後の腎臓での保持は全ての放射性コンジュゲートについて低く、Ｂ２、Ｂ１及びＢ４について、それぞれわずか７．９５±１．６２、４．７７±１．０１、１８．３５±３．０７％ＩＡ／ｇであった。画像定量化は同様の結果を生じた。これは治療指数（腫瘍／腎臓比）０．４５±０．０８と計算される；剖検で得られたＢ２、Ｂ１及びＢ４については、それぞれ０．６５±０．２１、０．０６±０．０２、イメージング定量では、それぞれ０．６±０．０３、０．９±０．２８及び０．１３±０．０４の比あった。Ｂ２及びＢ１の治療指数は、一元配置分散分析によって示されるように、Ｂ４について得られたものと比較して有意に高かった（ｐ＜０．０５）。１３１Ｉ標識Ｂ１の治療指数は、１３１Ｉ標識Ｂ２について得られた治療指数と比較して、有意ではないが高かった。
Figure 2023541601000020
Figure 2023541601000021
実施例７ｃ．
次に、１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の長期体内分布及び腫瘍ターゲティング能を、ヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍を有するマウスにおいてｉ．ｖ．注射後５日間にわたって評価した。これに対して、無胸腺ヌードマウス（時点当たりｎ＝３）の首にヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長（３１５．９８±３４６．８０ｍｍ３のサイズ）の検証後、全てのマウスに、約２５μＣｉ（±５μｇ）の１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１を尾静脈内注射した。次に、注射の１２０時間後まで頸椎脱臼によってマウスを安楽死させ、解剖し、その後、異なる器官及び組織を収集した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の静脈内注射は、リンパ節、子宮、骨及び皮膚などの器官並びに組織における、わずかに上昇するが一過性の取込み（約２～３％ＩＡ／ｇであるが、経時的に減少する）を明らかにする（表２０）。腎臓の活性の量は、１３．１４±３．３８％ＩＡ／ｇの値で２時間後に関連したが、２４時間後に０．５％ＩＡ／ｇ未満に急速に減少した。腫瘍における取込みは、有意であり、２時間後の値は、２．７９±１．３７％ＩＡ／ｇであり、２４時間後の腎臓における取込みを上回り、腫瘍における値は、０．９７±０．４１％ＩＡ／ｇであった。全ての他の器官及び組織における取込みは、全ての時点で低かった。
Figure 2023541601000022
まとめると、この実施例は、細胞におけるインビトロ及び腫瘍におけるインビボでのヒトＦＡＰ発現のターゲティングが、１３１Ｉ標識交差反応性ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１により、そのＨｉｓ６タグ付けフォーマット（配列番号２１）及び非タグ付けフォーマット（配列番号４）の両方で実行可能であることを示す。インビボ腫瘍ターゲティング能は、追加の器官及び組織における放射能の低い保持と相まって、その治療適用を支持する。
実施例８：１７７Ｌｕで標識されたＶＨＨのセラノスティック使用
セラノスティック使用とは、１つの同じ標識化合物が診断用途と治療用途との両方に適用可能である能力を指す。この実施例において、本発明者らは、（実施例３に記載されるように）セラノスティック放射性核種１７７Ｌｕによる放射性標識後のそのターゲティング能を調べることにより、交差反応性ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰターゲティング非タグ付けＶＨＨ Ｂ１のセラノスティック能について記載する。セラノスティック能を、ヒトＦＡＰ発現細胞に結合するその能力（飽和結合及び細胞保持）によってインビトロで及び関連するマウスモデルにおけるその体内分布を評価することによってインビボで評価する。
第１の部分では、そのインビトロ挙動を、その細胞結合及び保持を経時的に調べることによって評価した。得られた放射性コンジュゲートの結合能を評価して、これがＶＨＨのアミノ酸配列への１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡの導入によって影響されないことを確認した。これに対して、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞及びＨＥＫ－２９３細胞を、０ｎＭ～３３ｎＭの範囲にわたる１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の濃度を有する段階希釈物とインキュベートした。非特異的結合を評価するために、１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを並行して加えて、癌細胞上に発現されるヒトＦＡＰ受容体を飽和させた。
両方の細胞株において、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の結合は、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞及びＨＥＫ－２９３細胞における匹敵する用量応答曲線を明らかにし、これは、１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡの導入が結合能に影響を及ぼさなかったことを示す。ＧＭ０５３８９細胞の場合、０．５±０．１ｎＭのＥＣ５０値が得られた一方、ＨＥＫ－２９３では、０．８±０．１ｎＭのＥＣ５０値が観察された。
ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９及びＨＥＫ－２９３細胞について、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１のインビトロ細胞保持を評価した。この特定の場合、細胞を１０ｎＭの１７７Ｌｕ標識非タグ付けＢ１と共に１時間４℃でインキュベートし、その後、未結合画分を収集した。１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを使用して、非特異的結合を評価した。次に、細胞を新鮮な培地と共に３７℃で最大２４時間インキュベートし、その後、解離した画分を収集した。その後、細胞を０．０５ＭグリシンｐＨ２．８で洗浄して、膜結合画分を収集した。最後に、細胞を室温で１Ｍ ＮａＯＨで可溶化して、内在化した画分を収集した。膜結合画分及び内在化画分の合計は、全細胞随伴性画分に対応する。
両方の場合、非タグ付けＶＨＨ Ｂ１は、ヒトＦＡＰ受容体に結合する際、経時的に非常に高いレベルの細胞随伴性活性を明らかにする。２４時間のインキュベーション後、初期結合活性の約８０％及び６５％が依然としてＨＥＫ－２９３細胞及びＧＭ０５３８９細胞においてそれぞれ保持され、交差反応性ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１の広範且つ維持されたターゲティング能力を反映した（図６）。この特徴は、標的細胞をその細胞傷害性ペイロードに長時間曝露することを可能にするため、ＶＨＨを用いる治療用途にとって非常に重要である。
次に、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の長期体内分布及び腫瘍ターゲティング能を、ヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍を有するマウスにおいてｉ．ｖ．注射後５日間にわたって評価した。これに対して、無胸腺ヌードマウス（時点当たりｎ＝３）の首にヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長（４３．６７±２６．６１ｍｍ３のサイズ）の検証後、全てのマウスに約８０μＣｉ（±５μｇ）の１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１を尾静脈内注射した。次に、注射の１２０時間後まで頸椎脱臼によってマウスを安楽死させ、解剖し、その後、異なる器官及び組織を収集した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の静脈内注射は、副腎、子宮、骨及び皮膚などの器官及び組織における、わずかに上昇するが一過性の取込み（約２～３％ＩＡ／ｇであるが、経時的に減少する）を明らかにする（表１６及び表１７）。腎臓での活性の量は、９４．０５±９．５８％ＩＡ／ｇの値で２時間後に関連しており、１３１Ｉ標識ＶＨＨ Ｂ１で観察されたものとは対照的に、経時的に急速に減少しなかった。実際、腎臓での取込みは、２４時間後も依然として３１．７２±１．６８％ＩＡ／ｇであった。腫瘍への取り込みは有意であり、２時間後に３．９０±０．３５％ＩＡ／ｇの値であり、経時的に高いままであり、２４時間後も依然として２．１５±０．９８％ＩＡ／ｇであった。これは、１３１Ｉ標識ＶＨＨ Ｂ１で観察されるものと比較して高い。全ての他の器官及び組織における取込みは、全ての時点で低かった。
Figure 2023541601000023
Figure 2023541601000024
１５０ｍｇ／ｋｇのゲルフシンとの同時投与は、１時間後に既に得られた１５．５８±１．４６％ＩＡ／ｇの腎臓取り込み値に対して、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の腎臓保持を有意に減少させることができた（表２３）。１７７Ｌｕ標識非ターゲティング対照ＶＨＨＲ３Ｂ２３の取り込みは、同じ時点で０．２８±０．２４％ＩＡ／ｇのみが測定されたため、腫瘍蓄積は、非常に特異的なままであった。
Figure 2023541601000025
まとめると、この実施例は、細胞におけるインビトロでのヒトＦＡＰ発現のターゲティング及び腫瘍におけるインビボでのヒトＦＡＰ発現のターゲティングが１７７Ｌｕ標識交差反応性ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１により実行可能であることを示す。腎臓での取込みがその１３１Ｉ－ＳＧＭＩＢ標識バリアントについて観察されるレベルに匹敵するレベルまで有意に（ゲロフシンとの同時注射によって）低下し得るという事実と組み合わされたインビボ腫瘍ターゲティング能は、その治療適用を支持する。
実施例９：２２５Ａｃで標識したＶＨＨの治療的使用
この実施例において、本発明者らは、治療用放射性核種２２５Ａｃによる放射性標識後のそのターゲティング能力を調べることにより、交差反応性ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰターゲティング非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の治療的可能性を記載する（実施例３に記載の通り）。治療能を、ヒトＦＡＰ発現細胞に結合するその能力（飽和結合及び細胞保持）によってインビトロで及び関連するマウスモデルにおけるその体内分布を評価することによってインビボで評価する。
第１の部分では、そのインビトロ挙動を、その細胞結合及び保持を経時的に調べることによって評価した。得られた放射性コンジュゲートの結合能を評価して、これがＶＨＨのアミノ酸配列への２２５Ａｃ－ＤＯＴＡの導入によって影響されないことを確認した。これに対して、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞を、０ｎＭ～３３ｎＭの範囲にわたる２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の濃度を有する段階希釈物とインキュベートした。非特異的結合を評価するために、１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを並行して加えて、癌細胞上に発現されるヒトＦＡＰ受容体を飽和させた。
２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の結合により、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞に対する用量応答曲線が、その１３１Ｉ－ＳＧＭＩＢ及び１７７Ｌｕ－ＤＴＰＡバリアントについて得られた用量応答曲線に匹敵することが明らかにされ、これは、２２５Ａｃ－ＤＯＴＡの導入が結合能に影響を及ぼさなかったことを示した。０．４±０．１ｎＭのＥＣ５０値が得られた。
２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１のインビトロ細胞保持を、ヒトＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞で評価した。この特定の場合、細胞を１０ｎＭの２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１と共に１時間４℃でインキュベートし、その後、未結合画分を収集した。１００倍過剰の対応する非標識ＶＨＨを使用して、非特異的結合を評価した。次に、細胞を新鮮な培地と共に３７℃で最大２４時間インキュベートし、その後、解離した画分を収集した。その後、細胞を０．０５ＭグリシンｐＨ２．８で洗浄して、膜結合画分を収集した。最後に、細胞を室温で１Ｍ ＮａＯＨで可溶化して、内在化した画分を収集した。膜結合画分及び内在化画分の合計は、全細胞随伴性画分に対応する。
２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１は、ヒトＦＡＰ受容体に結合する際、経時的に非常に高いレベルの細胞随伴性活性を明らかにする。２４時間のインキュベーション後、初期結合活性の約８０％が依然としてＧＭ０５３８９細胞において保持され、交差反応性ヒトＦＡＰ／マウスＦＡＰターゲティングＶＨＨ Ｂ１の広範且つ維持されたターゲティング能力を反映した（図７）。この特徴は、標的細胞をその細胞傷害性ペイロードに長時間曝露することを可能にするため、ＶＨＨを用いる治療用途にとって非常に重要である。
次に、２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の長期体内分布及び腫瘍ターゲティング能を、ヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍を有するマウスにおいてｉ．ｖ．注射後４日間にわたって評価した。これに対して、無胸腺ヌードマウス（時点当たりｎ＝３）の首にヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長（６０．７１±３９．１０ｍｍ３のサイズ）の検証後、全てのマウスに、約１．６μＣｉ（±５μｇ）の２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１を尾静脈内注射し、１５０ｍｇ／ｋｇのゲルフシンと同時注射した。次に、注射の９６時間後まで頸椎脱臼によってマウスを安楽死させ、解剖し、その後、異なる器官及び組織を収集した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の静脈内注射は、腸、子宮及び皮膚などの器官及び組織における、わずかに上昇するが一過性である取込み（約２～４％ＩＡ／ｇであるが、経時的に減少する）を明らかにする。骨への取込みは、全ての時点で約５％ＩＡ／ｇの範囲であった（表２４）。腎臓における活性の量は、１時間後に１３．４８±１．５８％ＩＡ／ｇの値で関連し、９６時間後に約６．３５±１．３０％ＩＡ／ｇに減少した。腫瘍への取込みは、有意であり、１時間後に３．８３±０．５３％ＩＡ／ｇの値であり、経時的に高いままであり、２４時間後には依然として３．１２±０．６２％ＩＡ／ｇ、９６時間後には２．５４±２．０７％ＩＡ／ｇであった。これは、１３１Ｉ標識及び１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１で観察されるものと比較して高い。全ての他の器官及び組織における取込みは、全ての時点で低かった。
Figure 2023541601000026
実施例１０：非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の放射性標識バリアントの体内分布
実施例７、実施例８及び実施例９に記載された結果に加えて、１３１Ｉ標識；２２５Ａｃ標識ＶＨＨ Ｂ１及び１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の長期体内分布及び腫瘍ターゲティング能を、ヒトＦＡＰを天然に発現するヒト神経膠芽腫瘍（Ｕ８７ ＭＧ）を有するマウスにおいて、ｉ．ｖ．注射後４日にわたって評価した。これに対して、無胸腺ヌードマウス（時点当たりｎ＝３）の首にヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長の検証後（１５０～２５０ｍｍ３）、マウスに、約８０μＣｉ（±５μｇ）の１３１Ｉ標識；０．５μＣｉ（±５μｇ）２２５Ａｃ標識又は１００μＣｉ（±５μｇ）１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１を尾静脈内注射した。次に、注射の９６時間後まで頸椎脱臼によってマウスを安楽死させ、解剖し、その後、異なる器官及び組織を収集した。目的の器官及び組織を秤量し、自動ガンマカウンタを用いて、注射標準と共に放射能を測定した。結果は％注入活性（ＩＡ）／ｇ組織として表した。
１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の静脈内注射は、リンパ節、子宮、骨及び皮膚などの器官並びに組織における、わずかに上昇するが一過性の取込み（約２～３％ＩＡ／ｇであるが、経時的に減少する）を明らかにする（表１）。腎臓における活性の量は、８．６４±０．５６％ＩＡ／ｇの値で３時間後に関連していたが、２４時間後に１％ＩＡ／ｇ未満に急速に減少した。腫瘍における取込みは、有意であり、３時間後の値は、１０．８９±３．８１％ＩＡ／ｇであり、３時間後に既に腎臓における取込みを上回った。全ての他の器官及び組織における取込みは、全ての時点で低かった。
２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の投与は、リンパ節、子宮、骨及び皮膚などの器官並びに組織における、わずかに上昇するが一過性の取込み（約２～３％ＩＡ／ｇであるが、経時的に減少する）を明らかにする（表２）。腎臓における活性の量は、３時間後に関連しており、１２．３０±０．５３％ＩＡ／ｇの値であり、２４時間後に８．０７±１．３９％ＩＡ／ｇ及び９６時間後に２．４７±０．１８％ＩＡ／ｇにゆっくりと減少した。腫瘍における取込みは、有意であり、３時間後の値は、５．０３±１．７４％ＩＡ／ｇであったが、腎臓における取込みを上回ることはなかった。全ての他の器官及び組織における取込みは、全ての時点で低かった。
１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の投与は、リンパ節、子宮、骨及び皮膚などの器官並びに組織における、わずかに上昇するが一過性の取込み（約２～３％ＩＡ／ｇであるが、経時的に減少する）を明らかにする（表３）。腎臓における活性の量は、４時間後に関連しており、４２．２７±１．５８％ＩＡ／ｇの値であり、２４時間後に２８．３８±２．０２％ＩＡ／ｇ及び９６時間後に５．０２±０．５３％ＩＡ／ｇにゆっくりと減少した。腫瘍における取込みは、有意であり、４時間後の値は、１０．５２±２．２５％ＩＡ／ｇであったが、腎臓における取り込みを上回ることはなかった。全ての他の器官及び組織における取込みは、全ての時点で低かった。重要なことに、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の腎臓での取込みは、調査した全ての時点で２２５Ａｃ標識バリアントについて得られた値よりも有意に高かった。
取込み値から、非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の放射性標識バリアントの各々について、対応する経時的な腫瘍対腎臓（Ｔ／Ｋ）比を計算した。非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の１３１Ｉ標識バリアントでは、Ｔ／Ｋ＞１が投与後３時間以降に得られ、ピーク値は注射後４８時間で１１．１３±３．０２であった。２２５Ａｃ標識ＶＨＨ Ｂ１及び１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の両方では、Ｔ／Ｋ比＞１は得られなかったが、２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１については、４８時間で０．７９±０．１９のピークＴ／Ｋ比が計算された一方、１７７Ｌｕ標識バリアントについては、ピークＴ／Ｋは７２時間後に０．３７±０．０５のみ測定された。
Figure 2023541601000027
Figure 2023541601000028
Figure 2023541601000029
まとめると、この実施例は、ヒト神経膠芽腫瘍（Ｕ８７ ＭＧ）に対する天然のヒトＦＡＰ発現のターゲティングが１３１Ｉ標識、２２５Ａｃ標識ＶＨＨ Ｂ１及び１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１により実行可能であることを示す。インビボ腫瘍ターゲティング能は、追加の器官及び組織における放射能の限られた保持と相まって、それらの治療適用を支持する。最適な体内分布は、非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の１３１Ｉ標識バリアントについて得られ、腎臓からの迅速な洗い流しによる高い持続的な腫瘍ターゲティングを伴った。２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１は、腎臓からのより遅いクリアランスと組み合わせて、高い持続的な腫瘍ターゲティングを明らかにした。最後に、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１は、ｈＦＡＰ発現ヒト神経膠芽腫瘍を効率的に標的とするが、非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の２つの他の放射性標識バリアントと比較して、経時的に有意により多く腎臓に保持される。
実施例１１：非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の放射性標識バリアントの治療有効性
この実施例では、本発明者らは、ヒトＦＡＰ発現腫瘍を有するマウスにおいて評価される、１３１Ｉ標識；２２５Ａｃで標識及び１７７Ｌｕで標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の治療的可能性について記載する。３つ全ての場合において、小さい確立された腫瘍を有するマウスを、（ｉ）高用量の若しくは（ｉｉ）低用量の放射性標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１、（ｉｉｉ）高用量の放射性標識Ｒ３Ｂ２３又は最後に（ｉｖ）ビヒクル溶液のいずれかで、６回連続して処置した。腫瘍体積及び動物の体重を繰り返し測定した。以下のエンドポイントの１つに達した場合、ドロップアウトを考慮した：皮下腫瘍については、（ｉ）１５００ｍｍ３超の腫瘍サイズ、（ｉｉ）２０％超の体重減少、又は（ｉｉｉ）壊死腫瘍組織の存在。
１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の場合、無胸腺ヌードマウス（群当たりｎ＝１０）に、ヒトＦＡＰを天然に発現するヒト神経膠芽腫瘍（Ｕ８７ ＭＧ）を皮下接種した。小さい腫瘍が確立された場合、マウスに、約６０００μＣｉ（±５μｇ）若しくは３０００μＣｉ（±２．５μｇ）の１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１；６０００μＣｉ（±５μｇ）の１３１Ｉ標識Ｒ３Ｂ２３又はビヒクル溶液を尾静脈内注射した。図１Ａに示すように、１３１Ｉ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１で処置したマウスは、１３１Ｉ標識Ｒ３Ｂ２３又はビヒクル溶液（ｐ＜０．０００１、ログランク・マンテル・コックス検定）で処置したマウスと比較して、有意に長く生存した。
次に、２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の治療有効性を、ヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ－２９３腫瘍を保有する無胸腺ヌードマウス（群当たりｎ＝１０）において評価した。小さい腫瘍が確立された場合、マウスに、約６．５μＣｉ（±５μｇ）若しくは３．２５μＣｉ（±２．５μｇ）の２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１；６．５μＣｉ（±５μｇ）の２２５Ａｃ標識Ｒ３Ｂ２３又はビヒクル溶液を、尾静脈内注射した。図１Ｂに示すように、２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１で処置したマウスは、２２５Ａｃ標識Ｒ３Ｂ２３又はビヒクル溶液（ｐ＜０．０００１、ログランク・マンテル・コックス検定）で処置したマウスと比較して、有意に長く生存した。更に、高放射性２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１による処置は、低放射性２２５Ａｃ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１と比較して、より効果的であった（ｐ＜０．００５、ログランク・マンテル・コックス検定）。
最後に、ヒトＦＡＰを天然に発現するヒト神経膠芽腫瘍（Ｕ８７ ＭＧ）を保有する無胸腺ヌードマウス（群当たりｎ＝１０）において、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の治療有効性を評価した。小さい腫瘍が確立された場合、マウスに、約３０００μＣｉ（±５μｇ）若しくは１５００μＣｉ（±２．５μｇ）の１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１；３０００μＣｉ（±５μｇ）の１７７Ｌｕ標識Ｒ３Ｂ２３又はビヒクル溶液を、尾静脈内注射した。図１Ｃに示すように、１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１で処置したマウスは、１７７Ｌｕ標識Ｒ３Ｂ２３又はビヒクル溶液（ｐ＜０．０００１、ログランク・マンテル・コックス検定）で処置したマウスと比較して、有意に長く生存した。更に、高放射性１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１による処置は、低放射性１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１と比較して、より効果的であった（ｐ＜０．０５、ログランク・マンテル・コックス検定）。
結論として、１３１Ｉ標識ＶＨＨ Ｂ１、２２５Ａｃ標識ＶＨＨ Ｂ１及び１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１は、ｈＦＡＰ発現腫瘍異種移植マウスモデルにおいて有効であることが明らかにされた。実施例１０に記載される１３１Ｉ標識バリアントの最適なＴ／Ｋ比は、その良好な治療的可能性と組み合わせて、非タグ付けＶＨＨ Ｂ１のこの放射性標識変異体をセラノスティック使用のための好ましい化合物にする。重要なことに、２２５Ａｃ標識ＶＨＨ Ｂ１及び１７７Ｌｕ標識非タグ付けＶＨＨ Ｂ１の両方がマウスでも有効であることを示すが、実施例１０に記載されるように、Ｔ／Ｋ比は、最適ではない。

Claims (25)

  1. ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号４、１、２若しくは３の少なくとも１つとの少なくとも８０％の配列同一性又は前記配列番号の長さの５０％を超える少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって表される抗体フラグメント。
  2. 配列番号４、１、２又は３のいずれかを含む、請求項１に記載の抗体フラグメント。
  3. 配列番号４の正確な長さ又は配列番号４の正確な長さよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０アミノ酸だけ長い範囲にわたる長さを有する、請求項１又は２に記載の抗体フラグメント。
  4. ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合し、前記抗体のエピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び／若しくは１０１～１４０内に含まれる、好ましくは請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
  5. ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合し、前記抗体の構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれる、好ましくは請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
  6. 配列番号２６の以下のアミノ酸：
    １）Ｉ６２、Ｓ６３、Ｇ６４、Ｑ６５、Ｅ６６から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
    ２）Ｉ７６、Ｖ７７、Ｌ７８、Ｙ７９、Ｎ８０、Ｉ８１、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｇ８４、Ｑ８５、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｔ８８、Ｉ８９、Ｌ９０、Ｓ９１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
    ３）Ｌ１０５、Ｓ１０６、Ｐ１０７、Ｄ１０８、Ｒ１０９、Ｑ１１０、Ｆ１１１から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
    ４）Ｄ１３４、Ｌ１３５、Ｓ１３６、Ｎ１３７から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸、及び／又は
    ５）Ｖ１５８及び／又はＧ１５９、及び／又は
    ６）Ｒ１７５、及び／又は
    ７）Ｄ４５７及び／又はＹ４５８
    に特異的に結合する、請求項４又は５に記載の抗体フラグメント。
  7. 重鎖抗体（ＶＨＨ）由来の重鎖可変ドメイン又はそのフラグメントである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
  8. ヒトＦＡＰ（配列番号２６）に特異的に結合し、且つマウスＦＡＰ（配列番号３０）に特異的に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
  9. ヒト及び／又はマウスＦＡＰのモジュレータではなく、好ましくはＦＡＰジペプチジルペプチダーゼ活性を実質的に阻害しない、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
  10. 好ましくはバイオレイヤー干渉法を用いて評価される、１０－９～１０－１２モル／リットルの範囲にわたるＫＤ及び／又は１０－２～１０－５秒－１の範囲にわたるｋｏｆｆでヒトＦＡＰに特異的に結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
  11. 部分構造などのエンティティに連結されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体フラグメントを含む化合物。
  12. 前記部分構造は、標識、好ましくは放射性核種である、請求項１１に記載の化合物。
  13. 前記放射性核種は、α線放出放射性核種及びβ－線放出放射性核種からなる群から選択され、好ましくは、前記放射性核種は、アクチニウム－２２５、アスタチン－２１１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、セシウム－１３７、クロム－５１、コバルト－６０、銅－６７、ジスプロシウム－１６５、エルビウム－１６９、フェルミウム－２５５、金－１９８、ホルミウム－１６６、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、イリジウム－１９２、鉄－５９、鉛－２１２、ルテチウム－１７７、モリブデン－９９、パラジウム－１０３、リン－３２、カリウム－４２、レニウム－１８６、レニウム－１８８、サマリウム－１５３、ラジウム－２２３、ラジウム－２２４、ルテニウム－１０６、スカンジウム－４７、ナトリウム－２４、ストロンチウム－８９、テルビウム－１４９、テルビウム－１６１、テルビウム－１４９、トリウム－２２７、キセノン－１３３、イッテルビウム－１６９、イッテルビウム－１７７及びイットリウム－９０からなる群から選択される、請求項１２に記載の化合物。
  14. 前記放射性核種は、ヨウ素－１３１、イットリウム－９０、ヨウ素－１２５、ルテチウム－１７７、レニウム－１８６、レニウム－１８８、スカンジウム－４３、スカンジウム－４４、テクネチウム－９９ｍ、テルビウム－１６１、インジウム－１１１、キセノン－１３３、タリウム－２０１、フッ素－１８、ガリウム－６８、ガリウム－６７、銅－６７、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２４、ジルコニウム－８９及び銅－６４からなる群から選択されるものを含む、陽電子放出放射性同位体（ＰＥＴ）又はγ線放出放射性同位体（ＳＰＥＣＴ）からなる群から選択される、請求項１２に記載の化合物。
  15. 前記放射性核種は、ヨウ素－１３１である、請求項１３又は１４に記載の化合物。
  16. 前記抗体フラグメント及び前記放射性核種は、リンカー、好ましくはベンゾエートリンカーによって分離されており、より好ましくは、前記リンカーは、Ｎ－スクシンイミジル－４－グアニジノメチル－３－［Ｉ－１３１］ヨードベンゾエート又はその好適な誘導体を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の化合物。
  17. － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、前記構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、前記抗体フラグメントは、ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている、抗体フラグメント、
    － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、前記構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、前記抗体フラグメントは、ＤＯＴＡ又はＤＴＰＡを介してルテチウム－１７７に連結されている、抗体フラグメント、
    － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、前記構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、前記抗体フラグメントは、ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている、抗体フラグメント、又は
    － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、前記構造的エピトープは、配列番号２６のアミノ酸ストレッチ又は領域６５～９０及び１０１～１４０の組合せ内に含まれ、前記抗体フラグメントは、テクネチウム－９９ｍに連結されている、抗体フラグメント
    を含むか又はそれである、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
  18. － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列によって表され、ＳＧＭＩＢを介してヨウ素－１３１に連結されている抗体フラグメント、
    － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列によって表され、ＤＯＴＡ又はＤＴＰＡを介してルテチウム－１７７に連結されている抗体フラグメント、
    － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列によって表され、ＤＯＴＡを介してアクチニウム－２２５に連結されている抗体フラグメント、又は
    － ヒト及び／又はマウスＦＡＰに特異的に結合する抗体フラグメントであって、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性（又は類似性）を有するアミノ酸配列によって表され、テクネチウム－９９ｍに連結されている抗体フラグメント
    を含むか又はそれである、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
  19. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント又は請求項１１～１８のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
  20. 医薬品として使用するためのものであり、好ましくは、前記医薬品は、癌細胞上及び／又はＣＡＦ上でのヒトＦＡＰの発現と関連する癌を処置するためのものである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント、請求項１１～１３、１５若しくは１６～１８のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１９に記載の組成物。
  21. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント又は請求項１１、１２、１４～１８のいずれか一項に記載の化合物を含む診断用組成物。
  22. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント、請求項１１～１３、１５若しくは１６～１８のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１９若しくは２０に記載の組成物を含む併用療法であって、前記医薬品は、癌細胞上及び／又はＣＡＦ上でのヒトＦＡＰの発現に関連する癌を処置するためのものであり、追加の化合物が使用される、併用療法。
  23. 前記追加の化合物は、抗体又は抗体フラグメントであるか、或いは腎臓保持を最適化することができる分子、例えば血漿若しくは代用血液又は正に荷電されたアミノ酸である、請求項２２に記載の併用療法。
  24. 方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント、又は請求項１１、１２、１４～１８のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項２１に記載の組成物は、対象におけるＦＡＰ、好ましくはヒトＦＡＰの発現を評価するために使用される、方法。
  25. ヒトＦＡＰの発現を可能にする核酸構築物を含む非ヒト動物。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023203135A1 (en) * 2022-04-22 2023-10-26 Precirix N.V. Improved radiolabelled antibody

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1682537E (pt) 2003-11-05 2012-06-20 Sarcode Bioscience Inc Moduladores de adesão celular
TWI363759B (en) 2004-04-27 2012-05-11 Glaxo Group Ltd Muscarinic acetylcholine receptor antagonists
AR072297A1 (es) 2008-06-27 2010-08-18 Novartis Ag Derivados de indol-2-il-piridin-3-ilo, composicion farmaceutica que los comprende y su uso en medicamentos para el tratamiento de enfermedades mediadas por la sintasa aldosterona.
UA103918C2 (en) 2009-03-02 2013-12-10 Айерем Элелси N-(hetero)aryl, 2-(hetero)aryl-substituted acetamides for use as wnt signaling modulators
ME02900B (me) 2009-04-30 2018-04-20 Glaxo Group Ltd Indazoli supstituisani oksazolom kao inhibitori pi3-kinaze
US8247436B2 (en) 2010-03-19 2012-08-21 Novartis Ag Pyridine and pyrazine derivative for the treatment of CF
US8372845B2 (en) 2010-09-17 2013-02-12 Novartis Ag Pyrazine derivatives as enac blockers
JP6117104B2 (ja) 2010-11-15 2017-04-19 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｎａｍｐｔおよびｒｏｃｋ阻害薬
CU24152B1 (es) 2010-12-20 2016-02-29 Irm Llc 1,2 oxazol-8-azabiciclo[3,2,1]octano 8 il como moduladores de fxr
US8987307B2 (en) 2011-03-03 2015-03-24 Hoffmann-La Roche Inc. 3-amino-pyridines as GPBAR1 agonists
US9321727B2 (en) 2011-06-10 2016-04-26 Hoffmann-La Roche Inc. Pyridine derivatives as agonists of the CB2 receptor
US20130059866A1 (en) 2011-08-24 2013-03-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel piperidino-dihydrothienopyrimidine sulfoxides and their use for treating copd and asthma
LT2773633T (lt) 2011-11-02 2017-11-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterocikliniai junginiai, vaistai, turintys minėtus junginius, jų panaudojimas ir jų gavimo būdai
JOP20190001B1 (ar) 2011-11-03 2022-03-14 Bayer Pharma AG عقار أولي معتمد على جليكول عديد إثيلين من أدرينومدالين واستخدامه
US20130303554A1 (en) 2012-05-14 2013-11-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of a dpp-4 inhibitor in sirs and/or sepsis
EP2854812A1 (en) 2012-05-24 2015-04-08 Boehringer Ingelheim International GmbH A xanthine derivative as dpp -4 inhibitor for use in the treatment of autoimmune diabetes, particularly lada
KR101916443B1 (ko) 2012-07-26 2018-11-08 글락소 그룹 리미티드 Pad4 억제제로서의 2-(아자인돌-2-일) 벤즈이미다졸
PT2766048E (pt) 2012-10-12 2015-02-25 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
US9296733B2 (en) 2012-11-12 2016-03-29 Novartis Ag Oxazolidin-2-one-pyrimidine derivative and use thereof for the treatment of conditions, diseases and disorders dependent upon PI3 kinases
EP2928881B1 (en) 2012-12-07 2018-03-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Novel pyridine derivatives
ES2709034T3 (es) 2012-12-13 2019-04-12 Novartis Ag Pirimido[4,5-b]quinolina-4,5 (3h,10h)-dionas como supresores de mutaciones sin sentido
MX2015007936A (es) 2012-12-19 2016-03-11 Novartis Ag Inhibidores de autotaxina.
PE20151666A1 (es) 2013-02-14 2015-11-19 Novartis Ag Derivados sustituidos del acido bisfenil butanoico fosfonico como inhibidores de la nep
ES2629751T3 (es) 2013-03-07 2017-08-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivados de pirazol novedosos
CN105209077B (zh) 2013-03-13 2019-06-11 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓以及其结合物
KR20160002857A (ko) 2013-05-02 2016-01-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 CB2 수용체 작용제로서의 피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체
EP3011339A4 (en) 2013-06-18 2017-01-25 Aminomedix Inc. Compositions and methods for the preparation of kidney protective agents comprising amifostine and amino acids
RU2687143C2 (ru) 2013-10-06 2019-05-07 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Модифицированный экзотоксин а псевдомонад
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2015205756A1 (en) 2014-01-10 2016-07-21 Birdie Biopharmaceuticals Inc. Compounds and compositions for treating EGFR expressing tumors
CA2935012A1 (en) 2014-01-10 2015-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Aryl sultam derivatives as rorc modulators
GB201402006D0 (en) 2014-02-06 2014-03-26 Oncomatryx Biopharma S L Antibody-drug conjugates and immunotoxins
BR112016024363A2 (pt) 2014-04-25 2017-10-10 Pf Medicament conjugado de anticorpo-fármaco e seu uso para tratamento de câncer
AU2015260905A1 (en) 2014-05-14 2016-12-01 Pfizer Inc. Pyrazolopyridines and pyrazolopyrimidines
TWI714528B (zh) 2014-05-14 2021-01-01 瑞士商諾華公司 甲醯胺衍生物
WO2016016242A1 (en) 2014-08-01 2016-02-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Substituted oxetanes and their use as inhibitors of cathepsin c
NO2721710T3 (ja) 2014-08-21 2018-03-31
CA2960324A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Substituted n,2-diarylquinoline-4-carboxamides and the use thereof as anti-inflammatory agents
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EA031766B1 (ru) 2014-10-15 2019-02-28 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Ингибиторы альдостеронсинтазы
SG11201703416WA (en) 2014-11-07 2017-05-30 Hoffmann La Roche Triazolo[4,5-d]pyrimidines as agonists of the cannabinoid receptor 2
EP3233866B1 (en) 2014-12-19 2021-04-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Pyrazolopyridinamines as mknk1 and mknk2 inhibitors
CN107530384A (zh) * 2015-03-18 2018-01-02 干细胞免疫有限公司 利用抗体组合的病毒疗法
UY36586A (es) 2015-03-26 2016-10-31 Bayer Pharma AG Heterociclilmetiltienouracilos y uso de los mismos
EA201792346A1 (ru) 2015-05-06 2018-05-31 Байер Фарма Акциенгезельшафт ПРИМЕНЕНИЕ sGC СТИМУЛЯТОРОВ, sGC АКТИВАТОРОВ, ОТДЕЛЬНО И В КОМБИНАЦИЯХ С PDE5 ИНГИБИТОРАМИ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЛЬЦЕВИДНЫХ ЯЗВ (DU), СОПУТСТВУЮЩИХ СИСТЕМНОМУ СКЛЕРОЗУ (SSc)
PL3298022T3 (pl) 2015-08-20 2019-12-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nowe skondensowane fenoksyacetamidy
EP3337483B1 (en) 2015-08-20 2019-10-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Novel annelated benzamides
JP2018529707A (ja) 2015-10-09 2018-10-11 アッヴィ・エス・ア・エール・エル 嚢胞性線維症の処置のための新規な化合物
CA3003969A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
DK3397631T3 (da) 2015-12-29 2021-05-25 Pfizer Substituerede 3-azabicyclo[3.1.0]hexaner som ketohexokinase-inhibitorer
CN106928365B (zh) * 2015-12-30 2020-09-29 广西医科大学 一种FAP纳米抗体Nb36
EP3411397A1 (en) 2016-02-05 2018-12-12 Orionis Biosciences NV Cd8 binding agents
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CA3023881A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Therapeutic targeting of non-cellular structures
CN109689087B (zh) 2016-05-13 2023-04-04 奥里尼斯生物科学私人有限公司 靶向性突变干扰素-β及其用途
KR20190016544A (ko) 2016-06-10 2019-02-18 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 방사성-제약 복합체
KR20190019171A (ko) 2016-06-22 2019-02-26 노파르티스 아게 섬유증 치료에서 사용하기 위한 wnt 억제제
EP3475281A1 (en) 2016-06-23 2019-05-01 H. Hoffnabb-La Roche Ag Novel [1,2,31triazolo[4,5-d]pyrimidine derivatives
CA3040802A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-gamma and uses thereof
EA037318B1 (ru) 2016-12-16 2021-03-11 Пфайзер Инк. Агонисты рецептора glp-1 и их применение
CN110382479A (zh) 2017-01-20 2019-10-25 辉瑞大药厂 作为magl抑制剂的氨基甲酸1,1,1-三氟-3-羟基丙-2-基酯衍生物
AU2018216032B2 (en) 2017-02-06 2022-04-07 Orionis Biosciences BV Targeted chimeric proteins and uses thereof
EP3576765A4 (en) 2017-02-06 2020-12-02 Orionis Biosciences, Inc. TARGETED ENGINEERING INTERFERON AND USES OF IT
WO2018192944A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
MX2020001513A (es) 2017-08-09 2020-08-20 Orionis Biosciences Inc Agentes de union a clec9a y su uso.
JP7423511B2 (ja) 2017-08-09 2024-01-29 オリオンズ バイオサイエンス インコーポレイテッド Ｐｄ－１およびｐｄ－ｌ１結合物質
US11566072B2 (en) 2017-08-09 2023-01-31 Orionis Biosciences, Inc. CD8 binding agents
WO2019148089A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Orionis Biosciences Inc. Xcr1 binding agents and uses thereof
EP3749295A4 (en) * 2018-02-05 2022-04-27 Orionis Biosciences, Inc. FIBROBLAST BINDING AGENTS AND USES THEREOF
CN112512551A (zh) 2018-03-28 2021-03-16 奥里尼斯生物科学公司股份有限公司 双功能蛋白及其构建
CA3108795A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Orionis Biosciences, Inc. Sirp1a targeted chimeric proteins and uses thereof

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