JP2023531496A - サイトカインコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に連結した生物活性タンパク質、例えばサイトカインを含む組成物、組成物をコードする単離された核酸、ならびにそれらを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびに関連する障害および状態の処置においてそのような組成物を使用する方法に関する。本開示は、サイトカイン関連組成物、および１つもしくは複数の欠点に対処し得る、または１つもしくは複数の利点を提供し得る関連する方法を含む。

Description

配列表
コンピューター可読形式の配列表は、電子申請によって本願と共に提出され、その全体が参照により本願に組み込まれる。配列表は、ファイル名「７７６－６０１＿２０－１８３６－ＷＯ＿ＳＴ２５＿ＦＩＮＡＬ．ｔｘｔ」を有する、２０２１年６月１４日に作成されたファイルに含まれ、サイズは９８８ｋｂである。
参考文献の記載
本願は、そのすべてのその全体が本明細書に組み込まれる、「ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ」という表題の２０２０年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／０４４，３３５号；「ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ」という表題の２０２１年６月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７，８７５号；および「ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ」という表題の２０２１年６月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７，９４４号の優先権を主張する。
背景
サイトカインは、多様な疾患または状態、例えばがん、炎症状態、自己免疫状態、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、ウイルス感染症（例えば、慢性Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ）、アレルギー性喘息、網膜神経変性プロセス、代謝障害、インスリン抵抗性、および糖尿病性心筋症を処置するために使用することができる。しかし、サイトカインの治療有用性は、その細胞毒性、短い半減期、反復するまたは頻繁な投与の必要性、および患者における望ましくない免疫応答を誘発する潜在性により限定的であり得る。
ほとんどのサイトカイン産物は、臨床の状況で極めて強力である。インターロイキン、例えばＩＬ－２およびＩＬ－１２、およびＩＦＮ－ａは、免疫系の細胞によって主に産生され、免疫応答をシグナル伝達および構築するサイトカインである。がんでは、サイトカインは、免疫系が腫瘍細胞を異常で宿主に対して有害であると認識する能力を容易にする。サイトカインはさらに、多様な免疫細胞タイプの増殖を増加させ、その生存を増強し、およびＴＭＥを浸潤するように方向付け、ならびに強力な抗腫瘍免疫応答を促進し、腫瘍細胞死滅および腫瘍クリアランスをもたらす。このことは、治療の状況、特に抗がん適応におけるサイトカインの実際の応用を制限する。
インターロイキン－１２（ＩＬ１２）は、特に腫瘍免疫療法の理想的なペイロードとなる潜在性を有することが認識されている。これは、免疫系の自然免疫および適応免疫構成要素の両方を活性化することができる。ＩＬ１２は、ＩＦＮ－γの産生を刺激し、ＮＫ細胞ならびにＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化する。加えて、このサイトカインはまた、抗血管新生ケモカイン、腫瘍細胞外基質のリモデリング、およびＭＨＣクラスＩ分子発現の刺激も誘導し、極めて魅力的な抗がん候補体である。しかし、研究者らは、有望な前臨床データを示しているものの、このサイトカインの重度の毒性プロファイルにより、用量漸増が防止され、抗がん剤としての臨床での有望性が有意に抑制された。１９９６年にＩＬ１２の最初のヒト臨床試験が行われて以降、複数の臨床試験が現在進行中であるが、ＦＤＡが承認したＩＬ１２産物はなおもとらえどころがない。
これは、抗がん剤としてサイトカインを使用するための治療指数の問題を克服することができる新規戦略に関する有意なアンメットニーズを表す。ＩＬ１２のようなサイトカインの効力を安全に利用することができ、毒性の問題を制御することができれば、これらの作用剤は、広いスペクトルのがんに対する潜在的使用のための強力な治療として役立ち得る。
概要
本開示は、サイトカイン関連組成物、および１つもしくは複数の欠点に対処し得る、または１つもしくは複数の利点を提供し得る関連する方法を含む。一態様では、本明細書において、
（ａ）ｉ．少なくとも１２アミノ酸を含むこと；
ｉｉ．ＸＴＥＮ配列のアミノ酸残基の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択されること；ならびに
ｉｉｉ．Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、およびＰから選択される４～６個の異なるアミノ酸を有すること
を特徴とする伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）；ならびに
（ｂ）ＸＴＥＮに連結したサイトカイン
を含む融合タンパク質を開示する。
一部の実施形態では、融合タンパク質はさらに、放出セグメントを含み、放出セグメント（ＲＳ）は、表６～７に記載される配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＸＴＥＮ－ＲＳ－サイトカインまたはサイトカイン－ＲＳ－ＸＴＥＮの構造配置を有する。
一部の実施形態では、サイトカインは、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、またはＴＧＦ－ベータスーパーファミリーメンバーからなる群から選択される。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、およびＩＬ１７からなる群から選択されるインターロイキンである。一部の実施形態では、サイトカインは、表３または表Ａから選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２バリアントである。一部の実施形態では、サイトカインは、第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）および第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）を含む。一部の実施形態では、Ｃｙ１およびＣｙ２の一方は、インターロイキン－１２サブユニットベータに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃｙ１およびＣｙ２の他方は、インターロイキン－１２サブユニットアルファに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）は、配列番号５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）は、配列番号６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、サイトカインは、第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）と第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）との間に位置するリンカーを含む。一部の実施形態では、サイトカインは、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－１２バリアントである。
一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、複数の非オーバーラップ配列モチーフからなり、配列モチーフは表２ａ～２ｂの配列モチーフから選択される。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、４０～３０００アミノ酸、または１００～３０００アミノ酸を有する。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、表２ａ～２ｂに記載される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、融合タンパク質中のＸＴＥＮに連結した場合に、サイトカインの対応するサイトカイン受容体に対する結合活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定した場合に、ＸＴＥＮに連結していない場合のサイトカインの対応する結合活性を特徴付ける半数効果濃度（ＥＣ５０）より少なくとも１．２倍高い、少なくとも１．４倍高い、少なくとも１．６倍高い、少なくとも１．８倍高い、少なくとも２．０倍高い、少なくとも３．０倍高い、少なくとも４．０倍高い、少なくとも５．０倍高い、少なくとも６．０倍高い、少なくとも７．０倍高い、少なくとも８．０倍高い、少なくとも９．０倍高い、または少なくとも１０．０倍高いＥＣ５０によって特徴付けられ得る。一部の実施形態では、サイトカインは、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）であり得て、対応するサイトカイン受容体は、インターロイキン１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）であり得る。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、レポータータンパク質の比例的発現を伴って、サイトカインが対応するサイトカイン受容体に対する結合に応答するように構成された、遺伝子操作されたレポーター遺伝子細胞系を利用することができる。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、レポーター遺伝子活性アッセイであり得る。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。なお別の態様では、本開示は、疾患を処置することを必要とする対象における疾患を処置するための医薬の調製における本発明の組成物の使用を提供する。
関連する態様では、本開示は、対象における疾患または状態を処置または防止する方法であって、そのすべてが本明細書に開示される融合タンパク質または融合タンパク質を含む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんまたはがん関連疾患もしくは状態、または炎症疾患または自己免疫疾患であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、またはがん関連疾患もしくは状態であり得る。本発明の融合体および組成物によって処置することができる疾患または状態としては、がん、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、ウイルス感染症、アレルギー性喘息、網膜神経変性プロセス、代謝障害、インスリン抵抗性、および糖尿病性心筋症が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんまたはがん関連疾患もしくは状態であり得る。望ましければ、本発明の融合体および組成物は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の治療有効量と共に使用することができる。望ましければ、投与様式を、静脈内、皮下、または経口送達することができる。
参照による組み入れ
本明細書で言及したすべての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書において、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的におよび個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の特徴および利点は、例証的な実施形態を示す下記の詳細な説明および添付の図面を参照することによりさらに説明され得る。
図１Ａ～図１Ｇは、例示的なＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（図１Ａ～Ｇ）の模式図を示し、すべてＮ末端からＣ末端への方向で描示されている。図１Ａは、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）の２つの異なる立体配置を示し、各々が、単一の生物活性タンパク質（ＢＰ）とＸＴＥＮとを含み、第１の融合タンパク質は、ＢＰ（１０３）のＣ末端に結合されているＸＴＥＮ分子（１０２）を有し、第２の融合タンパク質は、ＢＰ（１０３）のＮ末端に結合されているＸＴＥＮ分子を有する。図１Ｂは、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）の２つの異なる立体配置を示し、各々が、単一のＢＰと、スペーサー配列と、ＸＴＥＮとを含み、第１の融合タンパク質は、スペーサー（１０４）のＣ末端に結合されているＸＴＥＮ分子（１０２）、およびＢＰ（１０３）のＣ末端に結合されているスペーサー配列を有し、第２の融合タンパク質は、スペーサー（１０４）のＮ末端に結合されているＸＴＥＮ分子、およびＢＰ（１０３）のＮ末端に結合されているスペーサー配列を有する。図１Ｃは、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる立体配置を示し、各々が、単一のＢＰの２つの分子と、ＸＴＥＮの１つの分子とを含み、第１の融合タンパク質は、第１のＢＰのＣ末端に連結されているＸＴＥＮを有し、そのＢＰが第２のＢＰのＣ末端に連結されており、第２の融合タンパク質は、反対方向のものであり、ＸＴＥＮが第１のＢＰのＮ末端に連結されており、そのＢＰが、第２のＢＰのＮ末端に連結されている。図１Ｄは、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる立体配置を示し、各々が、単一のＢＰの２つの分子と、スペーサー配列と、ＸＴＥＮの１つの分子とを含み、第１の融合タンパク質は、スペーサー配列のＣ末端に連結されているＸＴＥＮと、第１のＢＰのＣ末端に結合されているスペーサー配列とを有し、第１のＢＰが第２のＢＰのＣ末端に連結されており、第２の融合タンパク質は、反対方向のものであり、ＸＴＥＮがスペーサー配列のＮ末端に連結されており、スペーサー配列が第１のＢＰのＮ末端に連結されており、そのＢＰが第２のＢＰのＮ末端に連結されている。図１Ｅは、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる立体配置を示し、各々が、単一のＢＰの２つの分子と、スペーサー配列と、ＸＴＥＮの１つの分子とを含み、第１の融合タンパク質は、第１のＢＰのＣ末端に連結されているＸＴＥＮと、スペーサー配列のＣ末端に連結されている第１のＢＰとを有し、スペーサー配列が第２のＢＰ分子のＣ末端に連結されており、第２の融合タンパク質は、ＸＴＥＮの反対の立体配置のものであり、このＸＴＥＮは、第１のＢＰのＮ末端に連結されており、第１のＢＰがスペーサー配列のＮ末端に連結されており、そしてこのスペーサー配列がＢＰの第２の分子のＮ末端に連結されている。図１Ｆは、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）の２つの異なる立体配置を示し、各々が、単一のＢＰの２つの分子と、ＸＴＥＮの２つの分子とを含み、第１の融合タンパク質は、第１のＢＰのＣ末端に連結されている第１のＸＴＥＮを有し、第１のＢＰが第２のＸＴＥＮのＣ末端に連結されており、第２のＸＴＥＮがＢＰの第２の分子のＣ末端に連結されおり、第２の融合タンパク質は、ＸＴＥＮの反対の立体配置のものであり、このＸＴＥＮは、第１のＢＰのＮ末端に連結されており、この第１のＢＰが第２のＸＴＥＮのＮ末端に連結されており、この第２のＸＴＥＮが第２のＢＰのＮ末端に連結されている。図１Ｇは、Ｎ末端およびＣ末端で２つのＸＴＥＮに連結されている単一のＢＰの立体配置（１０６）を示す。
図２Ａ～図２Ｇは、図１Ａ～図１Ｇの対応するＢＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＢＰＸＴＥＮ遺伝子の例示的なポリヌクレオチド構築物の概略説明図であり、すべて、５’から３’への方向で描示されている。これらの例証的な例では、遺伝子は、１つのＢＰとＸＴＥＮとを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）；または２つのＢＰと、１つのスペーサー配列と、１つのＸＴＥＮとを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（２０１）；２つのＢＰと２つのＸＴＥＮとを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（２０５）；または１つのＢＰと２つのＸＴＥＮとを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（２０６）をコードする。これらの描示では、ポリヌクレオチドは、次の成分：ＸＴＥＮ（２０２）と、ＢＰ（２０３）と、切断配列（２０４）を含み得るスペーサーアミノ酸とをコードし、これらの配列のすべてが、インフレームで連結されている。
図３Ａ～図３Ｅは、内因的に利用可能なプロテアーゼによる作用を受ける例示的な単量体ＢＰＸＴＥＮ、およびこの単量体融合タンパク質または反応生成物の、細胞表面の標的受容体への結合能力、これに伴うその後の細胞シグナル伝達の概略説明図である。図３Ａは、ＢＰ（１０３）とＸＴＥＮ（１０２）がスペーサー配列により連結されているＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）であって、スペーサー配列が切断配列（１０４）を含有し、この切断配列がＭＭＰ－１３プロテアーゼ（１０５）の影響を受けやすいものである、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を示す。図３Ｂは、遊離ＢＰ、スペーサー配列およびＸＴＥＮである、反応生成物を示す。図３Ｃは、反応生成物遊離ＢＰ（１０３）またはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）と、細胞表面（１０７）のＢＰに対する標的受容体（１０６）との相互作用を示す。この場合、遊離ＢＰ（１０３）の受容体への結合により証明されるように、受容体への所望の結合が、ＢＰが遊離Ｃ末端を有するときに示される一方で、未切断の融合タンパク質は受容体に強く結合しない。図３Ｄは、遊離ＢＰ（１０３）は高い結合親和性で受容体（１０６）に結合したままであるが、無傷のＢＰＸＴＥＮ（１０１）は受容体から放出されることを示す。図３Ｅは、結合したＢＰが細胞（１０７）内のエンドソーム（１０８）に内在化されていることを示し、結合したＢＰの受容体媒介クリアランスおよび細胞シグナル伝達の誘発（１０９）を説明するものであり、点画で描かれた細胞質として描かれている。 同上。
図４は、ＸＴＥＮのアセンブリー、産生および評価における代表ステップの概略フローチャートである。
図５は、融合タンパク質をコードするＢＰ－ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物のアセンブリーにおける代表ステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１は、配列モチーフ５０２、例えば１２アミノ酸モチーフ（「１２－ｍｅｒ」）にアニールされ、その後、その配列モチーフが、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含有するオリゴ５０３とライゲーションされる。ライブラリーからの追加の配列モチーフが１２－ｍｅｒに、所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が得られるまで、アニールされる。ＸＴＥＮ遺伝子が、スタッファーベクターにクローニングされる。ベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６をコードし、続いて、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ部位に隣接しているストッパー配列５０７、ならびにサイトカイン遺伝子５０８をコードし、その結果、ＢＰＸＴＥＮの組合せへの組込みのためのＢＰ－ＸＴＥＮ融合をコードする遺伝子５００が得られる。
図６は、生物活性タンパク質（ＢＰ）とＸＴＥＮとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子のアセンブリー、融合タンパク質としてのその発現および回収、ならびに候補ＢＰＸＴＥＮ産物としてのその評価における代表ステップの概略フローチャートである。
図７は、配列番号２のアミノ酸配列（表Ｂを参照されたい）を有する例示ＸＴＥＮ化サイトカイン（すなわち、「ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」構築物）の構造の立体配置を示す。例示「ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」構築物は、哺乳動物プロテアーゼにより切断され得る切断配列を含む。例示「ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」構築物のプロテアーゼ切断時に、対応する「脱ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」断片および「ＸＴＥＮ断片」が放出される。同じＩＬ１２部分を含有する配列番号４のアミノ酸配列（表Ｂを参照されたい）を有する参照サイトカイン構築物（すなわち、「参照ＩＬ１２」構築物）も、示されている。
図８は、ＸＴＥＮ化に起因するサイトカイン活性の低減を示す。例えば、ＸＴＥＮ化（マスキング）インターロイキン－１２（ＩＬ１２）組成物（配列番号２）は、２９３ＨＥＫ ＩＬ－１２レポーター細胞においてシグナル伝達兼転写活性化因子４（ＳＴＡＴ－４）を誘導する点での活性が、対応するプロテアーゼ活性化、脱ＸＴＥＮ化（脱マスキング）ＩＬ－１２組成物と比べて２分の１以下である。ＸＴＥＮ化サイトカイン組成物を脱ＸＴＥＮ化するためのプロテアーゼの処理は、図７に示されている。ＸＴＥＮ化ＩＬ１２のＥＣ５０（１６７．０の値を有する）は、対応する脱ＸＴＥＮ化ＩＬ１２のＥＣ５０（７９．４の値を有する）より大きく、これは、ＩＬ１２タンパク質に対する、より一般的にはサイトカインに対する、ＸＴＥＮのマスキング能力を示す。
図９Ａ～図９Ｂは、サイトカイン結合の、ＸＴＥＮ化により媒介される低減を示す。例えば、図９Ａは、「ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」組成物（配列番号２）、およびＸＴＥＮ化されていない「参照ＩＬ１２」組成物（配列番号４）の、２９３ＨＥＫ－ＩＬ－１２レポーター細胞（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））への結合を示す。「ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」のＥＣ５０（約１１．８の値を有する）は、「参照ＩＬ１２」のＥＣ５０（約４．５の値を有する）より大きく、これは、ＩＬ１２と対応するＩＬ１２受容体との結合に干渉するＸＴＥＮの能力（すなわち、マスキング効果）を示す。図９Ｂは、「ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」および「参照ＩＬ１２」組成物とＩＬ１２受容体陰性２９３ＨＥＫ細胞（対照）との結合の欠如を示す。さらなる対照として、対応するＸＴＥＮ断片（図７を参照されたい）について、ＩＬ１２レポーター細胞との結合も、ＩＬ１２陰性対照細胞との結合も観察されなかった。 同上。
図１０Ａ～１０Ｃ。ＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ構造および活性アッセイ。図１０Ａは、ＩＬ－１２サブユニット上に４つのＸＴＥＮ鎖がある、例示的なＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘの概略構造を示す。図１０Ｂは、トランスグルタミナーゼタグ（ＴＧ）タグが付加されている、図１０Ａに示されているＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘの概略図を示す。ＴＧタグは、矢印により示されている。図１０Ｃ：図１０Ａおよび図１０Ｂからの２つの構築物のＰＡＣおよびＸＰＡＣについてのＨＥＫ Ｂｌｕｅ活性アッセイ。 同上。
図１１Ａ～１１Ｃ。すべてのＸＴＥＮマスク活性。図１１Ａは、４つのＸＴＥＮ部分を含有する例示的な構築物（ＡＰ２４４６）での活性を示す。図１１Ｂは、３つのＸＴＥＮ部分を含有する例示的な構築物（ＡＰ２４４７）での活性を示す。図１１Ｃは、１つのＸＴＥＮ部分を含有する例示的な構築物（ＡＰ２４５０）での活性を示す。 同上。
図１２Ａ～１２Ｃ。３つの例示的なＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ構築物の設計。図１２Ａ：ＡＣ２５８２／ＡＣ２５８５の設計。図１２Ｂ：ＡＣ３２４４／ＡＣ３２４７の設計。図１２Ｃ：ＡＣ３２４５／ＡＣ３２４６の設計。 同上。 同上。
図１３は、腫瘍結合ドメインをさらに含む例示的なＸＰＡＣの概略図を示す。
図１４は、ＭＣ３８腫瘍を担持しているＣ５７／Ｂｌｋ６マウスで行ったｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究からの腫瘍退縮結果を示す。定着したら、腫瘍を、希釈剤、３つの異なる濃度のｒＩＬ－１２、または２つの異なる濃度のＩＬ－１２－ＸＰＡＣのいずれかで処置した。示されているデータは、腫瘍退縮を生じさせる点でのＩＬ－１２ ＸＰＡＣの有効性を支持する。
図１５Ａは、図１４に示されている担腫瘍マウス研究から得られた毒性／体重データを示す。図１５Ｂは、非担腫瘍マウスの体重に対するｒＩＬ１２およびＩＬ１２ ＸＰＡＣの効果を示す。これらのデータは、ＸＰＡＣの安全性を実証する。 同上。
詳細な説明
サイトカインは、強力な治療薬となる潜在性を有するが、これらの作用剤は、低濃度であっても臨床の状況下でその実際の応用を限定する副作用を生じる。本開示は、それらの強力な化合物の有害な効果を制御しながら、サイトカイン関連組成物の治療潜在性および関連する方法を利用する。より具体的には、本開示は、腫瘍の微小環境に存在するプロテアーゼの存在下で条件的に活性化されるＸｔｅｎ化プロテアーゼ活性化サイトカイン（ＸＰＡＣ）として公知の特異的ＢＰＸＴＥＮ分子に関する。本願は、ＸＰＡＣの調製のための方法および組成物を対象とする。本開示は、ＩＬ１２によるある特定の例を提示するが、本開示は、作用部位でそれが提示される時間までその活性が好ましくは減弱されるべき任意のサイトカインに広く応用可能であることを理解すべきである。ＸＰＡＣは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞媒介炎症応答におけるＩＬ１２の役割に起因し得る腫瘍誘導性免疫抑制を克服する有効な方法を提供する。
上記のように、サイトカインは強力な免疫アゴニストであるが、この強力なクラスの化合物の治療域が比較的狭いために、治療の状況でのその有望性は限定されている。それらは、短い半減期を有し、極めて強力であり、有意な望ましくない全身性の作用および毒性を生じる。加えて、腫瘍または腫瘍微小環境におけるサイトカイン作用の意図される部位でサイトカインの望ましいレベルを達成するために大量のサイトカインを投与する必要があることから、治療域はさらに狭くなった。そのため、サイトカインはこれまで、腫瘍の処置のために臨床の状況でその潜在性に到達することができていない。
本発明は、腫瘍学におけるサイトカインの臨床での使用を妨害する毒性および短い半減期という短所を克服する。本発明のＸＰＡＣは、受容体アゴニスト活性を有するサイトカインポリペプチドを含有する。しかし、ＸＰＡＣの状況では、サイトカイン受容体アゴニスト活性は減弱され、循環中の半減期は延長される。ＸＰＡＣはプロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼ切断部位は、サイトカイン活性の所望の部位（例えば、腫瘍）に関連するプロテアーゼによって切断され、典型的に所望の活性部位で濃縮されるかまたは選択的に存在する。このように、ＸＰＡＣは、所望の作用部位で優先的に（または選択的に）および効率的に切断される。これによって、サイトカイン活性は、実質的に所望の活性部位、例えば腫瘍微小環境に限定される。所望の活性部位、例えば腫瘍微小環境でのプロテアーゼによる切断により、ＸＴＥＮ分子が結合しているＸＰＡＣよりもサイトカイン受容体アゴニストとしてかなり活性であるサイトカインの形態がＸＰＡＣから放出される。ＸＰＡＣからのＸＴＥＮの切断によって放出されるサイトカインの形態は、典型的に短い半減期を有し、これはしばしば天然に存在するサイトカインの半減期と実質的に類似である。これにより、サイトカイン活性は腫瘍微小環境に有利に限定される。ＸＰＡＣの半減期がたとえ延長しても、循環するＸＰＡＣが減弱され、活性なサイトカインが腫瘍微小環境に標的化されることから、毒性は劇的に低減されるかまたは除去される。本明細書に記載のＸＰＡＣは、サイトカインの有効な治療用量の投与によって、腫瘍微小環境に実質的に限定されるサイトカインの活性によって腫瘍を処置することを初めて可能にし、サイトカインの望ましくない全身性の作用および毒性を劇的に低減または除去する。
本発明の実施形態を記載する前に、そのような実施形態は単なる例として提供されること、および本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替を、本発明の実践において使用してもよいことが理解される。複数の変形形態、変化、および置換が本発明から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。
それ以外であると定義されている場合を除き、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価である方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は単に例証的であり、限定しないと意図される。複数の変形形態、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、それ以外であることが指定されていない限り、それらに帰属する意味を有する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、文脈が明らかにそれ以外を示していない限り、複数形を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
「サイトカイン」という用語は、当業者に周知であり、特に免疫系の細胞によって分泌され、免疫調節剤である任意のクラスの免疫調節タンパク質を指す。本明細書に開示されるＸＰＡＣにおいて使用することができるサイトカインポリペプチドとしては、インターロイキン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２５、トランスフォーミング増殖因子、例えばＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦ－ベータ（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）；インターフェロン、例えばインターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－カッパ、およびインターフェロン－オメガ；腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子アルファおよびリンフォトキシン；ケモカイン（例えば、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）、ならびに受容体アゴニスト活性を保持するその機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない。「ケモカイン」は、付近の応答性細胞において方向性の走化性を誘導する能力を有する低分子サイトカインファミリーのいずれかを指す当技術分野の用語である。
本明細書で使用される場合、「活性化可能」、「活性化する」、「誘導する」、および「誘導可能」という用語は、ＸＰＡＣの一部であるタンパク質、すなわちサイトカインがその受容体に結合して、ＸＰＡＣからＸＴＥＮが切断されると活性を生じさせる能力を指す。
当業者は、「半減期の延長」という用語が、ＸＰＡＣの一部であるサイトカインと比較して、ＸＰＡＣが、例えばそのサイズ（例えば、腎臓の濾過カットオフより上）、形状、流体力学的半径、電荷、または吸収、生体分布、代謝、および排泄のパラメーターを変更することによって血清中半減期を増加させ、ｐＫを改善することを意味するために使用されることを理解する。
「ポリペプチド」「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状または分枝状であってもよく、改変されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。用語はまた、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによって改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含むがこれらに限定されない、天然および／または非天然、または合成アミノ酸のいずれかを指す。標準的な一文字表記または三文字表記を使用して、アミノ酸を指定する。
「天然のＬ－アミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）のＬ光学異性体形態を意味する。
配列に適用される場合および本明細書で使用される場合の「天然に存在しない」という用語は、哺乳動物において見出される野生型または天然に存在する配列の相対物を有しない、それと相補的ではない、またはそれと高い程度の相同性を有しないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、天然に存在しないポリペプチドは、好適に整列させた場合に、天然の配列と比較して９９％以下の、９８％以下の、９５％以下の、９０％以下の、８０％以下の、７０％以下の、６０％以下の、５０％以下の、またはさらに低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。
「親水性の」および「疎水性の」という用語は、物質が水に対して有する親和性の程度を指す。親水性物質は水に対して強い親和性を有し、水に溶解する、水と混合する、または水に濡れる傾向があるが、疎水性物質は水に対する親和性を実質的に欠如し、水と反発するおよび水を吸収しない傾向があり、水に溶解しないまたは水と混合しない、または水に濡れない傾向がある。アミノ酸は、その疎水性に基づいて特徴付けることができる。複数の尺度が開発されている。一例は、Ｌｅｖｉｔｔ， Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （１９７６） １０４：５９によって開発された尺度であり、これは、Ｈｏｐｐ， ＴＰ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ （１９８１） ７８：３８２４に記載されている。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンである。親水性アミノ酸のアルパルテート、グルタメート、およびセリン、およびグリシンは、特に重要である。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
「断片」は、治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する天然の生物活性タンパク質の切断型である。「バリアント」は、生物活性タンパク質の治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する天然の生物活性タンパク質と配列相同性を有するタンパク質である。例えば、バリアントタンパク質は、参照生物活性タンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を共有し得る。本明細書で使用される場合、「生物活性タンパク質部分」という用語は、例えば部位特異的突然変異誘発、挿入、または偶発的な突然変異を通して故意に改変されたタンパク質を含む。
「宿主細胞」は、本発明のベクターのレシピエントであり得る、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含む。子孫は、天然の、偶発的、または故意の突然変異により元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学的に、または総ＤＮＡ相補体のゲノムにおいて）でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のベクターをｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトした細胞を含む。
「単離された」は、本明細書に開示される様々なポリペプチドを記載するために使用する場合、その天然の環境の構成要素から同定されて分離されている、および／または回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑物構成要素は、典型的にポリペプチドの診断的または治療的使用を妨害する材料であり、これらは酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を含み得る。当業者に明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それを天然に存在する相対物と識別するために「単離」を必要としない。加えて、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、濃度または体積当たりの分子数が、一般的にその天然に存在する相対物より大きいという点において、その天然に存在する相対物から識別可能である。一般的に、組換え手段によって作製され、宿主細胞において発現させたポリペプチドは、「単離された」と考えられる。
「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドコード核酸または他のポリペプチドコード核酸は、それがポリペプチドコード核酸の天然起源に通常会合している少なくとも１つの夾雑物核酸分子から同定および分離されている核酸分子である。単離されたポリペプチドコード核酸分子は、天然に見出される形態または状況以外である。したがって、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、天然の細胞に存在する特定のポリペプチドコード核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、ポリペプチドを通常発現する細胞に含有されるポリペプチドコード核酸分子を含み、この場合、例えば核酸分子は、天然の細胞とは異なる染色体または染色体外位置に存在する。
「キメラ」タンパク質は、天然に存在するものとは異なる配列中の位置で領域を含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。領域は通常、個別のタンパク質に存在し得るが、融合ポリペプチドでは共に結合され、または領域は通常、同じタンパク質に存在し得るが、融合ポリペプチドでは新しい配置に置かれる。キメラタンパク質は、例えば化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製および翻訳することによって作製され得る。
「コンジュゲートされた」、「連結した」、「融合された」、および「融合体」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、化学コンジュゲーションまたは組換え手段を含むどのような手段によっても、２つまたはそれより多くの化学エレメントまたは構成要素を共に結合することを指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結した」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、読み取り相またはインフレームにあることを意味する。「インフレーム融合」は、２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合して、元のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持するように、連続するより長いＯＲＦを形成することを指す。このように、得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つまたはそれより多くのセグメント（セグメントは通常、天然ではそのように結合していない）を含有する単一のタンパク質である。「連結する」、「連結した」、および「連結している」という用語は最も広い意味で使用され、具体的には、治療剤のある部分の、治療剤の別の部分に対する直接または間接的な共有結合および非共有結合による結合を含むと意図される。「直接連結した」という用語は、本明細書で治療剤の文脈で使用される場合、一般的にテザーが介在することなく、ある部分が別の部分に接続されているまたは結合している構造を指す。「間接的に連結した」という用語は、本明細書で治療剤の文脈で使用される場合、一般的に治療剤のある部分が、介在するテザーを介して治療剤の別の部分に接続されているまたは結合している構造を指す。
ポリペプチドの文脈において、「線状配列」または「配列」は、配列において互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続する、アミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチド中のアミノ酸の順序である。「部分的配列」は、１つまたは両方の方向にさらなる残基を含むことが既知であるポリペプチドの部分の線状配列である。
「異種」は、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを指す。例えば、その天然のコード配列から除去され、天然の配列以外のコード配列に作動可能に連結したグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー型、またはそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、既知または未知の任意の機能を行ってもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域；連鎖分析から定義される座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって、重合化後にさらに改変され得る。
「ポリヌクレオチドの相補体」という用語は、完全な忠実度で参照配列とハイブリダイズすることができるように、相補的な塩基配列を有し、参照配列と比較して逆方向であるポリヌクレオチド分子を示す。
「組換え」とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング、制限および／またはライゲーションステップ、ならびに宿主細胞において潜在的に発現させることができる構築物をもたらす他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。
「遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能である少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが、コード領域全体またはそのセグメントを範囲に含み得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限り、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。「融合遺伝子」は、共に連結される少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドで構成される遺伝子である。
「相同性」または「相同な」は、２つもしくはそれより多くのポリヌクレオチド配列または２つもしくはそれより多くのポリペプチド配列の間の配列類似性または互換性を指す。ＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを使用して、２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性、または相同性を決定する場合、デフォルト設定を使用してもよく、または適切なスコア行列、例えばｂｌｏｓｕｍ４５もしくはｂｌｏｓｕｍ８０を、同一性、類似性、もしくは相同性スコアを最適にするように選択してもよい。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、本明細書に定義されるストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、それらの配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、およびさらにより好ましくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌクレオチドがその標的配列に、他の配列より検出可能により高い程度に（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件に対する言及を含む。一般的に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的に洗浄ステップが実施される温度および塩濃度を参照して表記される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１～１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いポリヌクレオチド（例えば、１０～５０ヌクレオチド）に関して少なくとも約３０℃、長いポリヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）に関して少なくとも約６０℃である条件であり、例えば「ストリンジェントな条件」は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中、６０～６５℃で各１５分間の３回の洗浄を含み得る。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度を使用してもよい。ＳＳＣ濃度は、約０．１～２×ＳＳＣまで変化してもよいが、ＳＤＳは約０．１％で存在する。そのような洗浄温度は典型的に、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列に関する熱融解点Ｔｍより約５℃～２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨ下）である。Ｔｍを計算するための等式および核酸ハイブリダイゼーションの条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， ｖｏｌ． １－３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．に見出すことができる；特に第２巻および第９章を参照されたい。典型的には、ブロッキング試薬を使用して、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。そのようなブロッキング試薬は、例えば剪断および変性サケ精子ＤＮＡの約１００～２００μｇ／ｍｌを含む。有機溶媒、例えば約３５～５０％ ｖ／ｖの濃度のホルムアミドもまた、特定の状況下、例えばＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのために使用してもよい。これらの洗浄条件の有用な変形形態は、当業者に容易に明らかとなるであろう。
「パーセント同一性」および「％同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準化アルゴリズムを使用して整列させた少なくとも２つのポリヌクレオチド配列の間の残基一致のパーセンテージを指す。そのようなアルゴリズムは、標準化された再現可能な方法で、２つの配列間のアライメントを最適にするために、したがって２つの配列のより意味のある比較を達成するために、比較される配列にギャップを挿入し得る。パーセント同一性は、例えば特定の配列番号によって定義されるように、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定してもよく、またはより短い長さにわたって、例えばより大きい定義されたポリヌクレオチド配列から得た断片、例えば少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０、もしくは少なくとも４５０連続残基の断片の長さにわたって測定してもよい。そのような長さは、単なる例に過ぎず、本明細書で表、図面、または配列表において示される配列によって裏付けられる任意の断片の長さを使用して、パーセンテージ同一性が測定され得る長さを記載してもよいと理解される。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書中で同定されるポリペプチド配列に関して、必要に応じて最大パーセント配列同一性を達成するために、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、配列を整列させてギャップを導入した後に、第２の参照ポリペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基と同一である、クエリ配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当技術分野の範囲内である様々な方法で、例えば公開されているコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。パーセント同一性は、例えば特定の配列番号によって定義されるように、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたって測定してもよく、またはより短い配列にわたって、例えばより大きい定義されたポリペプチド配列から得た断片、例えば少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１５０連続残基の断片の長さにわたって測定してもよい。そのような長さは、単なる例に過ぎず、本明細書で表、図面、または配列表において示される配列によって裏付けられる任意の断片の長さを使用して、パーセンテージ同一性が測定される長さを記載してもよいと理解される。
「非反復性」という用語は、本明細書でポリペプチドの文脈で使用される場合、ペプチドまたはポリペプチド配列における内部相同性がないことまたはその程度が限定的であることを指す。「実質的に非反復性」という用語は、例えば、同一のアミノ酸タイプである配列中の４つの連続するアミノ酸の例がほとんどもしくは全くないこと、またはポリペプチドが１０もしくはそれ未満の部分配列スコア（以下に定義する）を有すること、またはＮ末端からＣ末端の順にポリペプチド配列を構成する配列モチーフのパターンが存在しないことを意味し得る。「反復性」という用語は、本明細書でポリペプチドの文脈で使用される場合、ペプチドまたはポリペプチド配列における内部相同性の程度を指す。これに対し、「反復」配列は、短いアミノ酸配列の複数の同一のコピーを含有し得る。例えば、目的のポリペプチド配列を、ｎ－ｍｅｒの配列に分割してもよく、同一の配列の数を計数することができる。高度の反復配列は、同一の配列の大きい分画を含有するが、非反復配列は、同一の配列をほとんど含有しない。ポリペプチドの文脈では、配列は、定義されたもしくは可変の長さのより短い配列の複数のコピー、またはモチーフそのものが非反復配列を有し、全長のポリペプチドを実質的に非反復性にするモチーフを含有し得る。その中で非反復性を測定するポリペプチドの長さは、３アミノ酸から約２００アミノ酸まで、約６から約５０アミノ酸まで、または約９から約１４アミノ酸まで変化し得る。「反復性」は、ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される場合、配列における内部相同性の程度、例えば所定の長さの同一のヌクレオチド配列の頻度を指す。反復性は、例えば同一の配列の頻度を分析することによって測定することができる。
「ベクター」は、好ましくは適切な宿主において自己複製し、挿入された核酸分子を宿主細胞内におよび／または宿主細胞間で移動させる核酸分子である。この用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上記の機能の１つより多くを提供するベクターもまた含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入された場合に、転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターからなる好適な宿主細胞を暗示する。
「血清分解抵抗性」は、ポリペプチドに適用される場合、ポリペプチドが、典型的に血清または血漿中のプロテアーゼを含む血液またはその構成要素中で分解に耐える能力を指す。血清分解抵抗性は、タンパク質を、ヒト（またはマウス、ラット、サル、必要に応じて）血清または血漿と、典型的にある範囲の日数（例えば、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日）、典型的に約３７℃で組み合わせることによって測定することができる。これらの時点での試料を、ウェスタンブロットアッセイにおいて実施することができ、タンパク質を抗体によって検出する。抗体は、タンパク質におけるタグであり得る。タンパク質が、ウェスタンにおいて単一のバンドを示す場合、タンパク質のサイズは、注入されたタンパク質のサイズと同一であり、分解は起こっていない。この例示的な方法では、ウェスタンブロットまたは等価の技術によって判断した場合に、タンパク質の５０％が分解される時点が、タンパク質の血清分解半減期または「血清中半減期」である。
「ｔ１／２」という用語は、本明細書で使用される場合、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして計算される終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、対数濃度対時間曲線の終末相線状部分の線形回帰によって計算される終末相排泄速度定数である。半減期は典型的に、生きている生物に蓄積した投与された物質の量の半分が、正常な生物プロセスによって代謝されるまたは除去されるために要する時間を指す。「ｔ１／２」、「終末相半減期」、「消失半減期」、および「循環中半減期」は、本明細書において互換的に使用される。
「見かけの分子量係数」または「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列によって示される見かけの分子量の相対的増加または減少の測定を指す関連する用語である。見かけの分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および球状タンパク質標準物質と比較する類似の方法を使用して決定され、「見かけのｋＤ」単位として測定される。見かけの分子量係数は、見かけの分子量と実際の分子量との間の比であり、実際の分子量は、アミノ酸組成に基づいて、組成物中のアミノ酸の各々のタイプの計算された分子量を加算することによって予測される。
「流体力学的半径」または「ストークス半径」は、それが溶液の中を移動し、溶液の粘度に抵抗する物体であると仮定して測定された溶液中の分子の有効半径（ｎｍでのＲｈ）である。本発明の実施形態では、ＸＴＥＮ融合タンパク質の流体力学的半径の測定は、より直感的な測定である「見かけの分子量係数」と相関する。タンパク質の「流体力学的半径」は、水溶液中でのその拡散速度ならびに高分子のゲル中を移動するその能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量ならびに形状および圧縮性を含むその構造によって決定される。流体力学的半径を決定する方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第６，４０６，６３２号および第７，２９４，５１３号に記載されるようにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などを使用することによって行われる。ほとんどのタンパク質は、最も圧縮された三次元構造である球状構造を有し、タンパク質は、最小の流体力学的半径を有し得る。一部のタンパク質は、ランダムおよびオープン、非構造化、または「線状」立体配置をとり、その結果、類似の分子量の典型的な球状タンパク質と比較してかなり大きい流体力学的半径を有する。
「生理的条件」は、生きている宿主における条件、ならびに生きている対象のそれらの条件を模倣する温度、塩濃度、ｐＨを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ条件の組を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用するための生理的に関連する条件の宿主が確立されている。一般的に、生理的緩衝液は、生理的濃度の塩を含有し、約６．５～約７．８、および好ましくは約７．０～約７．５の範囲の中性ｐＨとなるように調整される。多様な生理的緩衝液が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９）に記載されている。生理的に関連する温度は、約２５℃～約３８℃、好ましくは約３５℃～約３７℃の範囲である。
「反応基」は、第２の反応基にカップリングすることができる化学構造である。反応基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基が挙げられる。一部の反応基を活性化して、第２の反応基とのカップリングを容易にすることができる。活性化の例は、カルボキシル基とカルボジイミドの反応、カルボキシル基の活性化エステルへの変換、またはカルボキル基のアジド官能基への変換である。
「制御放出剤」、「徐放剤」、「デポー製剤」または「持続放出剤」は、互換的に使用され、ポリペプチドが作用剤の非存在下で投与される場合の放出期間と比較して、本発明のポリペプチドの放出期間を延長させることが可能である作用剤を指す。本発明の異なる実施形態は、異なる放出速度を有し、異なる治療量をもたらし得る。
「抗原」、「標的抗原」、または「免疫原」という用語は、本明細書において互換的に使用され、抗体断片または抗体断片に基づく治療剤が結合するまたはそれに対して特異性を有する構造または結合決定基を指す。
「ペイロード」という用語は、本明細書で使用される場合、生物活性または治療活性を有するタンパク質またはペプチド配列を指し、低分子のファーマコフォアに対する相対物を指す。ペイロードの例としては、サイトカイン、酵素、ホルモン、ならびに血液および増殖因子が挙げられるがこれらに限定されない。ペイロードは、遺伝子融合されたまたは化学コンジュゲートされた部分、例えば化学療法剤、抗ウイルス化合物、毒素、または造影剤をさらに含み得る。これらのコンジュゲートされた部分を、切断可能または切断不能であり得るリンカーを介してポリペプチドの残りに結合させることができる。
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に開示される天然のポリペプチドの生物活性を部分的または完全に遮断する、阻害する、または中和する任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、天然のポリペプチドに候補アンタゴニスト分子を接触させること、および天然のポリペプチドに通常関連する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。本発明の文脈では、アンタゴニストは、生物活性タンパク質の効果を減少させるタンパク質、核酸、糖質、抗体、または任意の他の分子を含み得る。
「アゴニスト」という用語は、その最も広い意味で使用され、本明細書に開示の天然のポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子は具体的に、アゴニスト抗体または抗体断片、天然のポリペプチド、ペプチド、有機低分子等の断片またはアミノ酸配列バリアントを含む。天然のポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、天然のポリペプチドに候補アゴニスト分子を接触させること、天然のポリペプチドに通常会合する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
「活性」は、本明細書の目的に関して、対応する天然の生物活性タンパク質のそれと一貫する融合タンパク質の構成要素の作用または効果を指し、「生物活性」は、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、または細胞もしくは生理的応答を含むがこれらに限定されないｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの生物機能または作用を指す。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」、または「緩和する」、または「改善する」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、治療利益および／または予防利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療利益は、処置される基礎となる障害の根治または改善を意味する。このため、例えば処置は、疾患もしくは状態の作用、または疾患もしくは状態の症状を低減する方法を指す。このため、本開示の方法では、処置は、確立された疾患もしくは状態の重症度、または疾患もしくは状態の症状の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％低減、または実質的に完全な低減を指し得る。例えば、疾患を処置する方法は、対照と比較して対象における疾患の１つまたは複数の症状が１０％低減する場合、処置であると考えられる。このように、低減は、天然または対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％から１００％の間の任意のパーセント低減であり得る。同様に、治療利益は、対象が基礎となる障害にまだ罹患していることがあるにもかかわらず、改善が対象において観察されるように、基礎となる病態に関連する生理的症状の１つまたは複数の根絶または改善によって達成される。予防利益の場合、組成物は、特定の疾患もしくは状態を発症するリスクがある対象に、またはこの疾患の診断がまだなされていない場合であっても疾患の生理的症状の１つまたは複数を報告する対象に投与され得る。処置は必ずしも、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去を指すのではないと理解される。
「治療効果」は、本明細書で使用される場合、生物活性タンパク質が保有する抗原性エピトープに対する抗体の産生の誘導能以外の、本発明の融合ポリペプチドによって引き起こされる、ヒトまたは他の動物における疾患または状態の治癒、軽減、改善、または防止、またはそれ以外の方法でヒトもしくは動物の身体的または精神的幸福を増強することを含むがこれらに限定されない生理的効果を指す。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力範囲内である。
「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、本明細書で使用される場合、対象に１回または反復用量で投与した場合に、病状または状態の任意の症状、態様、測定されるパラメーター、または特徴に対して何らかの検出可能な有益な効果を有することが可能である、単独でまたは融合タンパク質組成物の一部としての生物活性タンパク質の量を指す。そのような効果は、絶対的に有益である必要はない。疾患または状態は、障害または疾患を指し得る。
「治療有効用量レジメン」という用語は、本明細書で使用される場合、用量が、病状または状態の任意の症状、態様、測定されるパラメーター、または特徴に対して持続的な有益な効果をもたらすために治療有効量で与えられる、単独でのまたは融合タンパク質組成物の一部としての生物活性タンパク質の連続して投与される用量のスケジュールを指す。
本明細書で使用される場合、疾患または障害を「防止する」、「防止している」、および「防止」という用語は、疾患または障害の開始またはその１つもしくは複数の症状の悪化を阻害するまたは遅らせる作用、例えば対象が疾患または障害の１つまたは複数の症状を示し始める前にまたはそれとほぼ同時に起こる、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与を指す。
本明細書で使用される場合、「減少させる」、「低減する」、または「阻害する」という言及は、好適な対照レベルと比較して、少なくとも約１０％の、少なくとも約２０％の、少なくとも約３０％の、少なくとも約４０％の、少なくとも約５０％の、少なくとも約６０％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約９０％の、またはそれより大きい変化を含む。そのような用語は、機能または特性、例えばアゴニスト活性の完全な除去を含み得るが必ずしも含む必要はない。
「減弱されたサイトカイン受容体アゴニスト」は、サイトカイン受容体の天然に存在するアゴニストと比較して減少した受容体アゴニスト活性を有するサイトカイン受容体アゴニストである。減弱されたサイトカインアゴニストは、受容体の天然に存在するアゴニストと比較して少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、またはそれより低いアゴニスト活性を有し得る。本明細書に記載されるサイトカインポリペプチドを含有するＸＰＡＣが「減弱された」または「減弱された活性」を有すると記載される場合、ＸＰＡＣが減弱されたサイトカイン受容体アゴニストであることを意味する。
全般的技術
本発明の実践は、特に示していない限り、当技術分野の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの従来技術を使用する。その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１； “Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，１９８７； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．； “ＰＣＲ ２： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５； “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ” Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ． ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８； “Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” １１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， ２００５；およびＦｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， “Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，” ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｓｏｍｅｒｓｅｔ， ＮＪ， ２０００を参照されたい。
ＸＰＡＣにおける使用のためのサイトカイン
一般的に、サイトカインの治療的使用は、その全身毒性によって強く限定される。例えばＴＮＦは当初、一部の腫瘍の出血性壊死を誘導するその能力および異なる腫瘍系に対するそのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害効果に関して発見されたが、その後過剰産生条件の場合には、ヒトの体に対して危険な影響を及ぼし得る強い炎症促進活性を有することが証明された。全身毒性は、ヒトにおけるサイトカインの薬理学的活性量の使用に伴う根本的な問題であることから、その治療有効性を維持しながらこのクラスの生物学的エフェクターの毒性効果を低減することをねらいとする新規誘導体および治療戦略が現在評価中である。
ＸＰＡＣの産生に使用するための好ましいサイトカインは、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）である。ＩＬ－１２は、２つの個別にコードされるサブユニット（ｐ３５およびｐ４０）がジスルフィド結合により連結したヘテロ二量体であり、これらは共有結合により連結されていわゆる生物活性ヘテロ二量体（ｐ７０）分子を生じる。ヘテロ二量体（ＩＬ－１２およびＩＬ－２３）を形成することとは別に、ｐ４０サブユニットはまた、単量体（ｐ４０）およびホモ二量体（ｐ４０２）としても分泌される。ｐ３５をｐ４０サブユニットに接続するリンカーによる一本鎖としてのヘテロ二量体の合成が、ヘテロ二量体の完全な生物活性を保存することは当技術分野で公知である。ＩＬ－１２は、感染症に対する初期の炎症応答において、および細胞性免疫にとって都合がよいＴｈ１細胞の生成において極めて重要な役割を果たす。ＩＬ－１２の過剰発現は、それが多くの自己免疫性炎症疾患（例えば、ＭＳ、関節炎、１型糖尿病）の発病に関係していることから、宿主にとって危険であり得ることが見出されている。
ＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）は、活性化Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の表面上に発現されるＩＬ－１２Ｒβ１およびＩＬ－１２Ｒβ２鎖からなるヘテロ二量体複合体である。ＩＬ－１２Ｒβ１鎖は、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットに結合するが、ＩＬ－１２Ｒβ２に会合したＩＬ－１２ｐ３５は、細胞内シグナル伝達能を付与する。ＩＬ－１２Ｒを通してのシグナル伝達は、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ２）およびチロシンキナーゼ（Ｔｙｋ２）のリン酸化を誘導し、これはシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、およびＳＴＡＴＳをリン酸化して活性化する。ＩＬ－１２の特異的細胞効果は主にＳＴＡＴ４の活性化による。ＩＬ－１２は、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞を、Ｔｈ１表現型へのＣＤ４＋ Ｔ細胞の分化を含む、ＩＬ－１２の炎症促進性活性の多くを媒介するサイトカイン、特にインターフェロン（ＩＦＮ）γを産生するように誘導する。
ＩＬ－２は、免疫系において刺激性および調節性機能の両方を発揮し、共通γ鎖サイトカインファミリーの他のメンバーと共に免疫恒常性の中心である。ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、およびＩＬ－２Ｒ－γ（γ－ｃ、ＣＤ１３２）鎖で構成される三量体受容体、または二量体βγＩＬ－２ＲのいずれかからなるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することによってその作用を媒介する。両方のＩＬ－２ＲバリアントがＩＬ－２結合によりシグナルを伝達することができる。しかし、三量体αβγＩＬ－２Ｒは、二量体βγＩＬ－２Ｒ（３）よりＩＬ－２に対してほぼ１０～１００倍高い親和性を有し、ＣＤ２５が、ＩＬ－２のその受容体に対する高い親和性結合を付与するが、シグナル伝達にとって必須ではないことを暗示している。三量体ＩＬ－２Ｒは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２に対して感受性である活性化Ｔ細胞およびＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上で見出される。逆に、抗原経験（メモリー）ＣＤ８＋、ＣＤ４４高メモリー表現型（ＭＰ）ＣＤ８＋、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に、高レベルの二量体βγＩＬ－２Ｒを与えると、これらの細胞はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２に激しく応答する。
高親和性ＩＬ－２Ｒの発現は、Ｔ細胞にｉｎ ｖｉｖｏで一過性に利用可能であるＩＬ－２の低濃度に応答する能力を与えるために極めて重要である。ＩＬ－２Ｒα発現は、ナイーブおよびメモリーＴ細胞では存在しないが、抗原活性化後に誘導される。ＩＬ－２Ｒβは、ＮＫ、ＮＫＴ、およびメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞によって構成的に発現されるが、抗原活性化後にナイーブＴ細胞においても誘導される。γ鎖は、あまり厳密に調節されず、すべてのリンパ系細胞によって構成的に発現される。高親和性ＩＬ－２Ｒが抗原によって誘導されると、ＩＬ－２Ｒシグナル伝達は、部分的にＩｌ２ｒａ転写のＳｔａｔ５－依存的調節を通してＩＬ－２Ｒαの発現を上方調節する。このプロセスは、高親和性ＩＬ－２Ｒの発現を維持し、ＩＬ－２の起源を維持しながらＩＬ－２シグナル伝達を持続させるメカニズムを表す。
４－アルファヘリックスバンドルファミリーサイトカインの別のメンバーであるインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）もまた、がんの処置のための免疫調節剤として出現している。ＩＬ－１５は最初に、抗原提示樹状細胞、単球、およびマクロファージにおいて発現されるＩＬ－１５Ｒαを介して捕捉される。ＩＬ－１５は、広い活性を示し、ＩＬ－１５／ＩＬ－２－Ｒ－β（ＣＤ１２２）および共通γ鎖（ＣＤ１３２）を通してのシグナル伝達を介して、Ｔ、Ｂ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の分化および増殖を誘導する。これはまた、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞溶解活性も増強し、長時間持続する抗原経験ＣＤ８＋ＣＤ４４メモリーＴ細胞を誘導する。ＩＬ－１５は、Ｂ細胞による分化および免疫グロブリン合成を刺激し、樹状細胞の成熟を誘導する。これは、免疫抑制性の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激しない。このように、腫瘍微小環境においてＩＬ－１５活性を選択的にブーストすることは、自然免疫および特異的免疫を増強し、腫瘍と闘う。
ＩＬ－２／ＩＬ－１５ファミリーでもあるインターロイキン－７（ＩＬ－７）は、十分に特徴付けられた多面発現性サイトカインであり、間質細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、およびケラチノサイトによって発現され、活性化後、樹状細胞によって発現される（Ａｌｐｄｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。これは当初、前駆体Ｂリンパ球の成長および分化因子であると記載されたが、その後の研究により、ＩＬ－７が、Ｔリンパ球の発達および分化に極めて重要に関係していることが示されている。インターロイキン－７シグナル伝達は、最適なＣＤ８ Ｔ細胞機能、恒常性、およびメモリーの確立にとって必須であり（Ｓｃｈｌｕｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００）；これは、ほとんどのＴ細胞サブセットの生存にとって必要であり、その発現は、Ｔ細胞数の調節にとって重要であることが提唱されている。
ＩＬ－７は、細胞傷害性化学療法後のがん患者における免疫再構成の増強において潜在的役割を有する。ＩＬ－７療法は、免疫再構成を増強し、新規胸腺移出物がたとえ少数であっても末梢での増大を容易にすることによって、さらに限定された胸腺機能を増強することができる。したがって、ＩＬ－７治療は、細胞傷害性化学療法によって枯渇されている患者の免疫系を潜在的に修復することができ、ＸＰＡＣ産生にとっての魅力的な候補となり得る。
調節性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病的な自己反応性およびその結果としての自己免疫疾患を防止する。自己免疫疾患の処置のために、調節性Ｔ細胞を選択的に活性化する薬物および方法を開発することは、集中的な研究の主題であり、炎症部位に活性なインターロイキンを選択的に送達することができる本発明の開発までは、ほとんど成功していなかった。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、他の免疫細胞の活性を抑制するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞のクラスである。Ｔｒｅｇは、免疫系の恒常性にとって中心であり、自己抗原に対する寛容を維持するために、および外来抗原に対する免疫応答をモジュレートするために主要な役割を果たす。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む複数の自己免疫および炎症疾患が、Ｔｒｅｇ細胞数またはＴｒｅｇ機能の欠乏を有することが示されている。
そのため、Ｔｒｅｇ細胞の数および／または機能を強化する治療を開発することに重大な関心がある。１つのアプローチは、低用量インターロイキン－２（ＩＬ－２）による処置である。Ｔｒｅｇ細胞は、高親和性ＩＬ－２受容体、すなわちサブユニットＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ２Ｒβ（ＣＤ１２２）、およびＩＬ２Ｒγ（ＣＤ１３２）で構成されるＩＬ２Ｒαβγの高い構成的レベルを特徴的に発現し、Ｔｒｅｇ細胞の成長は、ＩＬ－２に依存することが示されている。逆に、免疫活性化はまた、ＩＬ－２を使用しても達成されており、組換えＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））は、ある特定のがんを処置するために承認されている。高用量ＩＬ－２は、転移性黒色腫および転移性腎細胞癌を有する患者の処置のために使用されており、全生存に対して長期間の影響を有する。
慢性ＧＶＨＤおよびＨＣＶ関連自己免疫性血管炎患者の低用量ＩＬ－２処置の臨床試験は、Ｔｒｅｇレベルの増加および臨床有効性の兆候を実証した。いわゆる低用量ＩＬ－２を使用する根拠は、不活化状態で高親和性受容体を発現しない他のＴ細胞を残しながら、Ｔｒｅｇ上で構成的に発現される三量体ＩＬ－２受容体の高いＩＬ－２親和性を利用することであった。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）は、これらの臨床試験において使用される組換え型ＩＬ－２であり、高い毒性に関連する。アルデスロイキンは、高用量で、転移性黒色腫および転移性腎臓がんの処置のために承認されているが、その副作用は非常に重度であり、その使用は、集中治療を受けることができる入院の状況に限って推奨される。
Ｔｒｅｇ細胞はＩＬ２Ｒアルファのその発現により多くの他の免疫細胞タイプより低い濃度のＩＬ－２に応答することから、自己免疫疾患におけるＩＬ－２の臨床試験は、Ｔｒｅｇ細胞を標的とするためにより低用量のＩＬ－２を使用した。しかし、これらの低用量であっても安全性および認容性の問題をもたらし、使用される処置は、毎日の皮下注射を、長期的にまたは間欠的な５日間処置コースのいずれかで使用している。したがって、ＩＬ－２より特異的にＴｒｅｇ細胞を標的とし、安全かつより認容性があり、より少ない回数投与される、Ｔｒｅｇ細胞の数および機能を強化する自己免疫疾患の治療が必要である。ＩＬ－２のこの低い治療域は、他のサイトカイン治療と比較すると役に立たない。
自己免疫疾患のサイトカインに基づく治療の治療指数を改善する１つのアプローチは、他の免疫細胞と比較してＴｒｅｇ細胞に関して選択的であるＩＬ－２のバリアントを使用することであった。ＩＬ－２受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、および単球を含む多様な異なる免疫細胞タイプにおいて発現され、この広い発現パターンはおそらく、免疫系に及ぼす多面発現効果および高い全身毒性に寄与する。特に、活性化エフェクターＴ細胞は、肺上皮細胞と同様にＩＬ２Ｒαβγを発現する。しかし、エフェクターＴ細胞を活性化することは、免疫応答を下方調節および制御するという目標にまさに逆行し、肺上皮細胞を活性化することは、肺浮腫を含むＩＬ－２の公知の用量制限副作用をもたらす。実際、高用量ＩＬ－２免疫療法の主要な副作用は、その後の肺浮腫および肝細胞傷害を伴う肺および肝臓などの臓器における血管内液の蓄積をもたらす血管漏出症候群（ＶＬＳ）である。ＩＬ－２の除去以外のＶＬＳの処置はない。低用量ＩＬ－２レジメンは、ＶＬＳを回避するために患者において試験されているが、これは準最適な治療結果を犠牲にしている。
ＩＬ－２以外のインターロイキンサイトカインによる処置はさらにより限定的であった。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２の活性と類似の免疫細胞刺激活性を示すが、同じ阻害効果は示さず、このように有望な免疫治療候補となる。転移性悪性黒色腫または腎細胞がんの処置のための組換えヒトＩＬ－１５の臨床試験は、免疫細胞の分布、増殖および活性化が認識可能に変化したことを実証し、潜在的な抗腫瘍活性を示唆した。ＩＬ－１５治療は、望ましくない効果および毒性効果、例えば悪化するある特定の白血病、移植片対宿主病、低血圧、血小板減少症、および肝傷害に関連することが公知である。
ＩＬ－７は、胸腺におけるリンパ球の発達を促進し、末梢におけるナイーブおよびメモリーＴ細胞恒常性の生存を維持する。その上ＩＬ－７は、リンパ節（ＬＮ）の器官形成にとっておよび二次リンパ系臓器（ＳＬＯ）に動員された活性化Ｔ細胞の維持にとって重要である。ＩＬ－７の臨床試験では、ＩＬ－７を投与されている患者は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方の増加を示したが、ＦｏｘＰ３発現によってモニターした場合、調節性Ｔ細胞数の有意な増加は認められなかった。２００６、２００８、および２０１０年に報告された臨床試験では、異なる種類のがん、例えば転移性黒色腫または肉腫を有する患者に、異なる用量のＩＬ－７を皮下注射した。一過性の発熱および軽度の紅斑を除き、ほとんど毒性は認められなかった。循環するＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方のレベルは、有意に増加し、Ｔｒｅｇ数は低減した。ＴＣＲレパートリーの多様性は、ＩＬ－７療法後に増加した。しかし、ＩＬ－７の抗腫瘍活性は十分に評価されなかった。結果は、ＩＬ－７療法が免疫応答を増強し、拡大することができることを示唆する。
ＩＬ－１２は、自然免疫および適応免疫の間を相互接続する多面発現性サイトカインである。ＩＬ－１２は当初、ＰＭＡ誘導ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系から分泌される因子として記載された。その作用に基づき、ＩＬ－１２は、細胞傷害性リンパ球成熟因子およびナチュラルキラー細胞刺激因子と呼ばれている。自然免疫および適応免疫を結びつけること、ならびに天然の抗がん防御機構を協調するサイトカインであるＩＦＮガンマの産生を強力に刺激することにより、ＩＬ－１２は、ヒトにおける腫瘍免疫療法の理想的な候補であると思われた。しかし、臨床試験におけるＩＬ－１２の全身投与に関連する重度の副作用およびこのサイトカインの非常に狭い治療指数により、このサイトカインをがん患者に使用することができないことは明白であった。ＩＬ－１２療法による以前の問題のいくつかを減少し得る、サイトカインの送達が腫瘍に標的化されるＩＬ－１２療法に対するアプローチは現在、がんの臨床試験中である。
ＩＬ－２Ｒに結合するおよび免疫応答を治療的にモジュレートするアゴニストとしてのＩＬ－２の直接使用は、その十分に報告された治療リスク、例えばその短い血清中半減期および高い毒性により問題となっている。これらのリスクにより、他のサイトカインの治療的開発および使用もまた制限されている。これらのリスクを低減させるサイトカインの新規形態が必要である。本明細書において、従来のサイトカイン療法に関連するリスクに対処し、さらに必要な免疫調節治療を提供するように設計された、条件的に活性なＩＬ－１２および他のサイトカインを含む組成物および方法が開示される。
インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、およびＩＦＮガンマを含むＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンフォトキシン）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦベータ１ｌ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）を含むサイトカインは、患者に投与した場合に非常に強力である。これらの分子と共にＸＰＡＣを形成することにより、治療の状況でそれらをより容易に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「ケモカイン」は、付近の応答性細胞において方向性の走化性を誘導する能力を有する低分子サイトカインファミリーを意味する。サイトカインは、強力な治療を提供することができるが、望ましくない作用を伴い、これらは臨床的に制御することが難しく、これによってサイトカインの臨床での使用が制限される。本開示は、望ましくない効果が低減または除去された、患者において使用することができるサイトカインの新規形態に関する。特に、本開示は、キメラポリペプチド（ＸＰＡＣ）、ＸＰＡＣをコードする核酸を含む医薬組成物、およびサイトカインまたは対応するサイトカインと比較して減少したサイトカイン受容体活性化活性を有するサイトカインの活性な断片もしくは突然変異タンパク質を含有する前述の医薬製剤に関する。しかし、選択された条件下、または選択された生物環境下では、キメラポリペプチドは、しばしば対応する天然に存在するサイトカインと同じまたはそれより高い効力で、その同族の受容体を活性化する。本明細書で記載される場合、これは典型的に、全般的な条件でサイトカイン、その活性断片またはその突然変異タンパク質の受容体活性化機能を遮断または阻害するサイトカイン遮断部分を使用して達成されるが、選択された条件、例えばサイトカイン活性の所望の部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に存在する条件では達成されない。
本願は、例示的なサイトカインとしてＩＬ－１２を使用して例示しているが、当業者は、本明細書に提供される教示が、他のサイトカイン、断片、および突然変異タンパク質、例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンフォトキシン、ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、および前述のいずれかの機能的断片または突然変異タンパク質から形成されたＸＰＡＣの使用に容易に適合し、その使用を記載し、およびその使用を可能にし得ることを理解する。
様々なエレメントが、優先的に所望のサイトカイン活性の部位での本発明のＸＰＡＣにおけるサイトカインの送達および活性、ならびに目的のサイトカインの血清中半減期の延長を可能にするＸＴＥＮ化を介してサイトカインに対する全身の暴露を重度に制限することを保証する。この血清中半減期延長戦略では、ＸＰＡＣは、延長された期間（優先的に１～２またはそれより多い週間）循環し得るが、ＸＴＥＮ配列が切断されている活性化型は、サイトカインの典型的な血清中半減期を有する。
ＸＰＡＣと比較すると、静脈内投与される基礎となるサイトカインの血清中半減期は、全身の細胞外腔への分布によりわずか約１０分である。その後、サイトカインは、２．５時間の半減期で腎臓によって代謝される。
本発明の一部の実施形態では、ＸＰＡＣは、作用部位で切断される放出セグメントを含み（例えば、炎症特異的または腫瘍特異的プロテアーゼによって）、それによってサイトカインの完全な活性を所望の部位で放出し、同様にそれを半減期延長型の非切断（ＸＰＡＣ）型から分離する。そのような実施形態では、十分に活性で遊離のサイトカインは、非常に異なる薬物動態（ｐＫ）特性、すなわち週単位ではなくて時間単位の半減期を有する。加えて、活性なサイトカインに対する曝露は、所望のサイトカイン活性部位（例えば、炎症部位または腫瘍微小環境）に限定され、活性なサイトカインに対する全身性の曝露、関連する毒性、および副作用は低減される。
サイトカインからＸＰＡＣを作製することは、それによって例えばがんを処置するための免疫刺激剤としてのサイトカインの使用を改善する洗練された機構である。例えば、この態様では、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータおよびＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンフォトキシン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、およびＣＣＬ２１）の薬物動態および／または薬力学を、所望の活性部位、例えば腫瘍または腫瘍微小環境でエフェクター細胞（例えば、エフェクター（ｅｆｆｅｃｔ）Ｔ細胞、ＮＫ細胞）および／または細胞毒性免疫応答促進細胞（例えば、樹状細胞成熟を誘導する）を最大に活性化するように、しかし好ましくは全身では活性化しないように調整することができる。
このように、本明細書において、少なくとも１つのサイトカインポリペプチド、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、およびＩＦＮガンマを含むＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンフォトキシン）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）、または前述のいずれかの機能的断片もしくは突然変異タンパク質からなるＸＰＡｃを含む医薬組成物が提供される。
好ましくは、本明細書に開示されるＸＰＡＣに含まれるサイトカインポリペプチド（機能的断片を含む）は、受容体結合親和性および特異性または血清中半減期を含む、天然に存在するサイトカインの特性を変更するように突然変異していないまたは操作されていない。しかし、天然に存在する（野生型を含む）サイトカインからのアミノ酸配列の変化は、クローニングを容易にするために、および所望の発現レベルを達成するために許容可能である。
伸長組換えポリペプチド
本発明は、伸長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」または「ＸＴＥＮｓ」）を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、一般的に主に小さい親水性アミノ酸で構成され、配列が生理的条件下で低い程度の二次もしくは三次構造を有するかまたは二次もしくは三次構造を有しない、天然に存在しない実質的に非反復性の配列を有する長さが伸長したポリペプチドである。
本発明の一態様では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（例えば、単量体融合体）をもたらす生物活性タンパク質（「ＢＰ」）に連結され得る融合パートナーとして有用であるＸＴＥＮポリペプチド組成物を開示する。ＸＴＥＮは、それらが生物活性タンパク質と連結して融合タンパク質を作製した場合にある特定の化学および薬学的特性を付与することができるという点で、融合タンパク質パートナーとして有用性を有し得る。そのような所望の特性としては、以下に記載される他の特性の中でも、増強された薬物動態パラメーターおよび溶解度特徴が挙げられるがこれらに限定されない。そのような融合タンパク質組成物は、本明細書に記載されるある特定の疾患、障害、または状態を処置するために有用性を有し得る。本明細書で使用される場合、「ＸＴＥＮ」は、具体的に抗体または抗体断片、例えば一本鎖抗体、軽鎖または重鎖のＦｃ断片を除外する。
一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、約１００より多い～約３０００アミノ酸残基を有する、好ましくは単一の配列として使用する場合は４００より多い～約３０００残基を有する、および１つより多くのＸＴＥＮ単位を単一の融合タンパク質またはコンジュゲートにおいて使用する場合には、累積的に約４００より多い～約３０００アミノ酸残基を有する長いポリペプチドである。他の場合では、融合タンパク質の半減期の増加が必要ではないが、生物活性タンパク質融合パートナーの溶解度または他の物理／化学特性の増加が望ましい場合、１００アミノ酸残基より短い、例えば約９６、または約８４、または約７２、または約６０、または約４８、または約３６アミノ酸残基のＸＴＥＮ配列を、ＢＰが特性を発揮するように融合タンパク質組成物に組み込まれてもよい。
ＸＴＥＮが生物活性タンパク質に連結されて本発明の融合タンパク質を作製するための選択基準は一般的に、ＸＴＥＮの物理／化学特性および立体構造的構造の属性に関連し、これを次に使用して、増強された薬学的および薬物動態特性を融合タンパク質に付与することができる。本発明のＸＴＥＮは、以下の有利な特性：立体構造上の可動性、増強された水溶解度、高い程度のプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳動物受容体に対する低い結合、および増加した流体力学的（またはストークス）半径；それらを融合タンパク質パートナーとして特に有用にすることができる特性の１つまたは複数を示し得る。ＸＴＥＮによって増強され得るＢＰを含む融合タンパク質の特性の非限定的な例としては、全溶解度および／または代謝安定性の増加、タンパク質溶解に対する低減された感受性、低減された免疫原性、皮下または筋肉内に投与した場合の低減された吸収速度、および増強された薬物動態特性、例えば終末相半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘがより低くなるように皮下または筋肉内注射後のより遅い吸収（ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して）が挙げられ、これらはＢＰの有害作用の低減をもたらし得て、集合的に、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰ構成要素と比較して、対象に投与されたＢＰＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質が治療域内に留まっている期間の増加をもたらし得る。
本発明のＸＴＥＮを含む融合タンパク質組成物などのタンパク質の物理／化学特性、すなわち二次または三次構造、溶解度、タンパク質凝集、融解特性、夾雑物、および水分含有量などの特性を決定するために多様な方法およびアッセイが当技術分野で公知である。そのような方法としては、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＨＰＬＣ－逆相、光散乱、毛細管電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光光度計、屈折率測定、およびＵＶ／可視光測定が挙げられる。追加の方法は、Ａｒｎａｕ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ （２００６） ４８， １－１３に開示されている。これらの方法の本発明への応用は、当業者の能力範囲内であろう。
典型的に、融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素は、ポリマーの長さが伸長したにもかかわらず、生理的条件下で変性したペプチド配列のように挙動するように設計される。変性したとは、ペプチド骨格の大きい立体構造自由度によって特徴付けられる溶液中のペプチドの状態を記載する。ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下または上昇した温度で変性した立体構造をとる。変性した立体構造のペプチドは、例えば、特徴的な円二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲによって決定した場合にロングレンジ相互作用がないことによって特徴付けられる。「変性した立体構造」および「非構造化立体構造」は、本明細書において同義に使用される。一部の場合では、本発明は、生理的条件下で二次構造をほとんど欠如する変性した配列に類似し得るＸＴＥＮ配列を提供する。他の場合、ＸＴＥＮ配列は、生理的条件下で二次構造を実質的に欠如し得る。「ほとんど欠如する」とは、本文脈で使用される場合、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の５０％未満が、本明細書に記載される手段によって測定または決定した場合に、二次構造に寄与することを意味する。「実質的に欠如する」とは、本文脈で使用される場合、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または少なくとも約９９％が本明細書に記載される手段によって測定または決定した場合に、二次構造に寄与しないことを意味する。
所定のポリペプチドの二次構造および三次構造の存在または非存在を区別するために多様な方法が、当技術分野で確立されている。特に、二次構造を分光光度計によって、例えば「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０～２５０ｎｍ）での円二色性分光法によって測定することができる。二次構造の要素、例えばアルファヘリックスおよびベータシートは、各々が特徴的な形状および程度のＣＤスペクトルを生じる。二次構造はまた、特定のコンピュータープログラムまたはアルゴリズム、例えば周知のＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ， Ｐ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ．（１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３： ２２２－４５）および米国特許出願公開第２００３０２２８３０９Ａ１号に記載されているＧａｒｎｉｅｒ－Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ－Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ， Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ， Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６）， ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０－５５３）を介して、ポリペプチド配列に関して予測することもできる。所定の配列に関して、アルゴリズムは、二次構造が一部存在するかまたは全く存在しないかを予測することができ、例えばアルファヘリックスもしくはベータシートを形成する配列の残基の総数および／もしくはパーセンテージ、またはランダムコイル形成（二次構造を欠如する）をもたらすと予測される配列の残基のパーセンテージとして表記される。
一部の場合では、本発明の融合タンパク質組成物において使用されるＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定した場合に０％～約５％未満の範囲のアルファヘリックスパーセンテージを有し得る。他の場合では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定した場合に０％～約５％未満の範囲のベータシートパーセンテージを有し得る。一部の場合では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定した場合に０％～約５％未満の範囲のアルファヘリックスパーセンテージおよび０％～約５％未満の範囲のベータシートパーセンテージを有し得る。好ましい実施形態では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のアルファヘリックスパーセンテージおよび約２％未満のベータシートパーセンテージを有する。他の場合では、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定した場合に、高い程度のランダムコイルパーセンテージを有し得る。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定した場合に、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、および最も好ましくは少なくとも約９９％のランダムコイルを有し得る。
非反復配列
本発明の組成物のＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性であり得る。一般的に、反復性のアミノ酸配列は、凝集する傾向を有するか、またはコラーゲンおよびロイシンジッパーなどの天然の反復配列によって例証されるように高次構造を形成する傾向を有するか、または結晶もしくは疑似結晶構造をもたらす接触を形成する傾向がある。これに対し、非反復性配列が凝集する傾向が低いことにより、配列がそうでなければ反復性である場合に凝集する可能性がある荷電アミノ酸の頻度が比較的低い長い配列ＸＴＥＮを設計することが可能である。典型的に、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、約１００より多い～約３０００アミノ酸残基、配列が実質的に非反復性である場合には、好ましくは４００より多い～約３０００残基のＸＴＥＮ配列を含む。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、約１００より多い～約３０００アミノ酸残基、好ましくは４００より多い～約３０００アミノ酸残基を含み得るが、この場合配列中の３つの連続するアミノ酸は、アミノ酸がセリンである場合を除き同一のアミノ酸タイプではなく、セリンの場合３つ以下の連続するアミノ酸がセリン残基である。前述の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性であろう。
ポリペプチドまたは遺伝子の反復性の程度は、コンピュータープログラムもしくはアルゴリズム、または当技術分野で公知の他の手段によって測定することができる。ポリペプチド配列における反復性は、例えば所定の長さのより短い配列がポリペプチド内で起こる回数を決定することによって評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、１９２個のオーバーラップする９アミノ酸の配列（または９ｍｅｒ「フレーム」）および１９８個の３ｍｅｒフレームを有するが、ユニーク９ｍｅｒまたは３ｍｅｒ配列の数は、配列内の反復性の量に依存する。全体的なポリペプチド配列中の部分配列の反復性の程度の反映であるスコア（本明細書において以降、「部分配列スコア」）を生成することができる。本発明の文脈では、「部分配列スコア」は、ポリペプチドの２００連続アミノ酸配列にわたる各々のユニーク３ｍｅｒフレームの発生の合計を、２００アミノ酸配列内のユニーク３ｍｅｒ部分配列の絶対数によって除算したものを意味する。一部の実施形態では、本発明は、各々が１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、および最も好ましくは５未満の部分配列スコアを有し得るＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮを提供する。この段落の以下に記載する実施形態では、約１０未満（例えば、９、８、７等）の部分配列スコアを有するＸＴＥＮは「実質的に非反復性」であろう。
ＸＴＥＮの非反復性特徴は、ＢＰ（複数可）との融合タンパク質に、反復配列を有するポリペプチドと比較してより大きい程度の溶解度および低い凝集傾向を付与することができる。これらの特性は、極めて高い薬物濃度、一部の場合では１００ｍｇ／ｍｌを超える濃度を含有するＸＴＥＮを含む医薬調製物の製剤を容易にし得る。
さらに、本実施形態のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳動物に投与した場合に免疫原性を低減するまたは実質的に除去するために低い程度の内部反復性を有するように設計される。主に３つのアミノ酸、例えばグリシン、セリン、およびグルタメートに限定される短い反復モチーフで構成されるポリペプチド配列は、これらの配列中に予測されるＴ細胞エピトープが存在しないにもかかわらず、哺乳動物に投与した場合に比較的高い抗体力価をもたらし得る。これは、タンパク質凝集体、架橋した免疫原、および反復性の糖質を含む反復エピトープを有する免疫原が高度に免疫原性であり、例えばＢ細胞活性化を引き起こすＢ細胞受容体の架橋をもたらし得ることが示されていることから、ポリペプチドの反復性の性質によって引き起こされ得る（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｖａｃｃｉｎｅ， ２５ ：１６７６－８２ ； Ｙａｎｋａｉ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ３４５ ：１３６５－７１ ； Ｈｓｕ， Ｃ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６０：３７０１－５）； Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９５） ２５（１２）：３４４５－３４５１）。
例示的な配列モチーフ
本発明は、より短い配列の複数の単位、またはモチーフのアミノ酸配列が非反復性であるモチーフを含み得るＸＴＥＮを包含する。ＸＴＥＮ配列の設計では、ＸＴＥＮ配列を作製するために多重化される配列モチーフのライブラリを使用する「構築ブロック」アプローチを使用するにもかかわらず、非反復性の基準が満たされ得ることが発見された。このように、ＸＴＥＮ配列は、４つもの少ない異なるタイプの配列モチーフの複数の単位からなり得るが、モチーフそのものが一般的に、非反復性のアミノ酸配列からなることから、全体的なＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性となる。
一実施形態では、ＸＴＥＮは、約１００より多い～約３０００アミノ酸残基、好ましくは４００より多い～約３０００残基の非反復配列を有し得て、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は、非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフの各々は約９～３６アミノ酸残基を有する。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は、非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフの各々は９～１４アミノ酸残基を有する。なお他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列構成要素の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は、非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフの各々は１２アミノ酸残基を有する。これらの実施形態では、配列モチーフは、配列全体が非構造化の可動性の特徴を有するように、主に小さい親水性アミノ酸からなることが好ましい。ＸＴＥＮに含めることができるアミノ酸の例は、例えばアルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパルテート、グルタメート、セリン、およびグリシンである。コドン最適化、配列モチーフをコードするポリヌクレオチドのアセンブリ、タンパク質の発現、発現されたタンパク質の電荷分布および溶解度、ならびに二次および三次構造などの変数を試験した結果として、増強された特徴を有するＸＴＥＮ組成物は、主にグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基を含み、配列は実質的に非反復性であるように設計されることが発見された。好ましい実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、またはプロリン（Ｐ）から選択されるアミノ酸の主に４～６タイプを有し、これらは約１００より多い～約３０００アミノ酸残基、好ましくは４００より多い～約３０００残基の長さである実質的に非反復性の配列で配置される。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、約１００より多い～約３０００アミノ酸残基、好ましくは４００より多い～約３０００残基の配列を有し得て、配列の少なくとも約８０％が非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフの各々は９～３６アミノ酸残基を有し、モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６タイプのアミノ酸からなり、全長ＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸タイプの含有量は３０％を超えない。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は、非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフの各々は９～３６アミノ酸残基を有し、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６タイプのアミノ酸からなり、全長ＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸タイプの含有量は３０％を超えない。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は、非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６タイプのアミノ酸からなる１２アミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸タイプの含有量は３０％を超えない。なお他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％～約１００％は、非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる１２アミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸タイプの含有量は３０％を超えない。
さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮは、約１００より多い～約３０００アミノ酸残基、好ましくは４００より多い～約３０００アミノ酸残基の非反復性配列を含み、配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は、９～１４アミノ酸残基の非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６タイプのアミノ酸からなり、任意の１つのモチーフ中の任意の２つの連続するアミノ酸残基の配列は、配列モチーフにおいて２回より多く反復されない。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は、１２アミノ酸残基の非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６タイプのアミノ酸からなり、任意の１つの配列モチーフ中の任意の２つの連続するアミノ酸残基の配列は、配列モチーフにおいて２回より多く反復されない。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％は、１２アミノ酸残基の非オーバーラップ配列モチーフからなり、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなり、任意の１つの配列モチーフ中の任意の２つの連続するアミノ酸残基の配列は、配列モチーフにおいて２回より多く反復されない。なお他の実施形態では、ＸＴＥＮは１２アミノ酸配列モチーフからなり、アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択され、任意の１つの配列モチーフ中の任意の２つの連続するアミノ酸残基の配列は、配列モチーフにおいて２回より多く反復されず、全長ＸＴＥＮにおける任意の１つのアミノ酸タイプの含有量は３０％を超えない。この段落で記載される本明細書上記の前述の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性であろう。
一部の場合では、本発明は、約１００より多い～約３０００アミノ酸残基、好ましくは４００より多い～約３０００残基の非反復性のＸＴＥＮ配列を含む組成物であって、配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％～約１００％が、表１のアミノ酸配列から選択される２つまたはそれより多くの非オーバーラップ配列モチーフの複数の単位からなる組成物を提供する。一部の場合では、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％～約１００％が、表１の単一のモチーフファミリーから選択される２つまたはそれより多くの非オーバーラップ配列からなり、配列全体が、実質的に非反復のままである「ファミリー」配列をもたらす、非オーバーラップ配列モチーフを含む。したがって、これらの実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、表１の配列のＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの非オーバーラップ配列モチーフの複数の単位を含み得る。他の場合では、ＸＴＥＮは、表１のモチーフファミリーの２つまたはそれより多くのモチーフ配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、融合タンパク質）が、伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む場合、ＸＴＥＮは、（ｉ）少なくとも１２アミノ酸を含むこと；（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列のアミノ酸残基の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択されること；ならびに（ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、およびＰから選択される４～６個の異なるアミノ酸を有することを特徴とし得る。一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、複数の非オーバーラップ配列モチーフからなり得て、配列モチーフは、（例えば、各々独立して）表２ａ～２ｂの配列モチーフから選択される。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、４０～３，０００アミノ酸、または１００～３，０００アミノ酸を有し得る。ＸＴＥＮは、（例えば、各々独立して）、少なくとも（約）４０、少なくとも（約）５０、少なくとも（約）１００、少なくとも（約）１５０、少なくとも（約）２００、少なくとも（約）３００、少なくとも（約）４００、少なくとも（約）５００、少なくとも（約）６００、少なくとも（約）７００、少なくとも（約）８００、少なくとも（約）９００、少なくとも（約）１，０００アミノ酸、少なくとも（約）１，５００アミノ酸、少なくとも（約）２，０００アミノ酸、少なくとも（約）２，５００アミノ酸、少なくとも（約）３，０００アミノ酸、または前述のいずれかの間の範囲を有し得る。一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、表２ａ～２ｂに記載される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
表１： １２アミノ酸のＸＴＥＮ配列モチーフおよびモチーフファミリー
＊は、様々な順列で共に使用した場合に、「ファミリー配列」をもたらす個々のモチーフ配列を示す。
Figure 2023531496000001
Figure 2023531496000002
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６個のアミノ酸からなるそのアミノ酸の１００％未満、または表１の配列モチーフからなる配列の１００％未満、または表２ａ～２ｂからのＸＴＥＮと１００％未満の配列同一性を有するそれらの実施形態では、他のアミノ酸残基を、任意の他の１４個の天然のＬ－アミノ酸から選択することができる。他のアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体を通して介在してもよく、配列モチーフ内もしくは配列モチーフ間に位置してもよく、またはＸＴＥＮ配列の１つもしくは複数の短いストレッチに濃縮されてもよい。ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸を含むそのような場合では、アミノ酸が疎水性残基ではないこと、およびＸＴＥＮ構成要素の二次構造を実質的に付与すべきではないことが好ましい。このように、前述の好ましい実施形態では、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）に加えて他のアミノ酸を含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって測定した場合に残基の５％未満がアルファヘリックスおよびベータシートに寄与する配列を有し、ＧＯＲアルゴリズムによって測定した場合に少なくとも９０％のランダムコイル形成を有するであろう。
配列の長さ
特定の特色では、本発明は、伸長した長さの配列を有するＸＴＥＮポリペプチドを含むＢＰＸＴＥＮ組成物を包含する。本発明は、非反復性の非構造化ポリペプチドの長さを増加させることが、ＸＴＥＮの非構造化性質、ならびにＸＴＥＮを含む融合タンパク質の生物学的特性および薬物動態特性を増強するという発見を利用する。実施例により詳しく記載されるように、ＸＴＥＮの長さを比例的に増加させると、たとえ単一のファミリー配列モチーフ（例えば、表１の４つのＡＥモチーフ）の固定された反復順序によって作製される場合であっても、ＧＯＲアルゴリズムによって決定した場合に、より短いＸＴＥＮ長さと比較して、高いパーセンテージのランダムコイル形成を有する配列をもたらし得る。加えて、非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さを増加させると、実施例に記載されるように、より短い配列長さを有する非構造化ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質と比較して、終末相半減期の不釣り合いな増加を有する融合タンパク質をもたらすことが発見された。
本発明のＢＰＸＴＥＮに含めることが企図されるＸＴＥＮの非限定的な例を、表２ａ～２ｂに表す。したがって、本発明は、ＢＰＸＴＥＮ組成物であって、融合タンパク質（複数可）のＸＴＥＮ配列の長さが約１００より多い～約３０００アミノ酸残基であり、一部の場合では４００より多い～約３０００アミノ酸残基であり、ＸＴＥＮが、ＸＴＥＮに連結されていないペイロードと比較してＢＰＸＴＥＮに対して増強された薬物動態特性を付与する組成物を提供する。一部の場合では、本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮ配列は、約１００、または約１４４、または約２８８、または約４０１、または約５００、または約６００、または約７００、または約８００、または約９００、または約１０００、または約１５００、または約２０００、または約２５００、または最大約３０００アミノ酸残基の長さであり得る。他の場合では、ＸＴＥＮ配列は、約１００～１５０、約１５０～２５０、約２５０～４００、４０１～約５００、約５００～９００、約９００～１５００、約１５００～２０００、または約２０００～約３０００アミノ酸残基の長さであり得る。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列を含み得て、配列は、表２ａ～２ｂから選択されるＸＴＥＮに対して少なくとも約８０％の配列同一性、またはあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す。一部の場合では、ＸＴＥＮ配列は、ＢＰＸＴＥＮのＮ末端構成要素としての発現が最適化されるように設計される。前述の一実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ９１２またはＡＭ９２３の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。前述の別の実施形態では、ＸＴＥＮは、実施例１４～１７に記載されるＮ末端残基を有する。
他の場合では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、第１および第２のＸＴＥＮ配列を含み得て、ＸＴＥＮ配列中の残基の累積総数は、約４００より多い～約３０００アミノ酸残基である。前述の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、第１および第２のＸＴＥＮ配列を含み得て、配列は各々、表２ａ～２ｂから選択される少なくとも第１のまたはさらに第２のＸＴＥＮに対して少なくとも約８０％の配列同一性、またはあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す。１つより多くのＸＴＥＮがＢＰＸＴＥＮ組成物に使用される例としては、ＸＴＥＮが少なくとも１つのＢＰのＮ末端およびＣ末端の両方に連結した構築物が挙げられるがこれらに限定されない。
以下により詳しく記載されるように、本発明は、対象に投与された融合タンパク質に標的半減期を付与するようにＸＴＥＮの長さを選択することによって、ＢＰＸＴＥＮが設計される方法を提供する。一部の場合では、ＢＰＸＴＥＮは、対象に投与するための生物学的ポリペプチドに対して標的マスキング効果を付与するようにＸＴＥＮの長さを選択することによって設計することができる。一般的に、ＢＰＸＴＥＮ組成物に組み込まれるＸＴＥＮの長さが長ければ、より短いＸＴＥＮと比較してより長い半減期をもたらす。しかし、別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、対象に皮下または筋肉内投与後により遅い全身吸収速度を付与するように選択されるより長い配列の長さを有するＸＴＥＮを含むように設計することができる。そのような場合、Ｃｍａｘは、ＸＴＥＮに連結していないＢＰの同等の用量と比較して低減され、それによってＢＰＸＴＥＮを組成物の治療域内で維持する能力に寄与する。このように、ＸＴＥＮは、本明細書に記載される他の物理／化学特性に加えて、投与されたＢＰＸＴＥＮにデポーの特性を付与する。
表２Ａ： 例示的なＸＴＥＮポリペプチド
Figure 2023531496000003
Figure 2023531496000004
Figure 2023531496000005
Figure 2023531496000006
Figure 2023531496000007
 表２Ｂ． 例示的なＸＴＥＮポリペプチド
Figure 2023531496000008
Figure 2023531496000009
Figure 2023531496000010
Figure 2023531496000011
Figure 2023531496000012
Figure 2023531496000013
正味電荷
他の場合では、ＸＴＥＮポリペプチドは、正味電荷を有するアミノ酸残基を組み込むことによって、および／またはＸＴＥＮ配列中の疎水性アミノ酸の割合を低減することによって付与される非構造化特徴を有し得る。総正味電荷および正味電荷密度は、ＸＴＥＮ配列中の荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御され得る。一部の場合では、組成物のＸＴＥＮの正味電荷密度は、＋０．１上または－０．１下の電荷／残基であり得る。他の場合では、ＸＴＥＮの正味電荷は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％、またはそれより多くであり得る。
ヒトまたは動物におけるほとんどの組織および表面は、負の正味電荷を有することから、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮ含有組成物と様々な表面、例えば血管、健康な組織、または様々な受容体との間の非特異的相互作用を最小限にするために負の正味電荷を有するように設計することができる。特定の理論に拘束されないが、ＸＴＥＮは、個々に高い負の正味電荷を有するＸＴＥＮポリペプチドの個々のアミノ酸と、ＸＴＥＮポリペプチドの配列間で分布する個々のアミノ酸との間の静電気反発力により、オープン立体構造をとることができる。ＸＴＥＮの伸長した配列の長さにおける負の正味電荷のそのような分布は、非構造化立体構造をもたらし、次に流体力学的半径の有効な増加をもたらし得る。したがって、一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ配列が、約８、１０、１５、２０、２５、またはさらには約３０％グルタミン酸を含有するＸＴＥＮを提供する。本発明の組成物のＸＴＥＮは、一般的に正電荷を有するアミノ酸を含有しないかまたは低い含有量を有する。一部の場合では、ＸＴＥＮは、正電荷を有する約１０％未満のアミノ酸残基、または正電荷を有する約７％未満、または約５％未満、または約２％未満のアミノ酸残基を有し得る。しかし、本発明は、リシンなどの正電荷を有するアミノ酸の限定的な数がＸＴＥＮに組み込まれて、リシンのイプシロンアミンとペプチド上の反応基、リンカー架橋、またはＸＴＥＮ骨格にコンジュゲートされる薬物もしくは低分子上の反応基との間のコンジュゲーションを可能にし得る構築物を企図する。前述において、ＸＴＥＮ、生物活性タンパク質、プラス疾患または障害の処置において有用である化学療法剤を含む融合タンパク質を構築することができ、ＸＴＥＮ構成要素に組み込まれる作用剤の分子の最大数は、リシンまたはＸＴＥＮに組み込まれる反応性側鎖（例えば、システイン）を有する他のアミノ酸の数によって決定される。
一部の場合では、ＸＴＥＮ配列は、他の残基、例えばセリンまたはグリシンによって隔てられた電荷を有する残基を含み得て、これによってより良好な発現または精製挙動がもたらされ得る。正味電荷に基づき、本発明の組成物のＸＴＥＮは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、またはさらには６．５の等電点（ｐＩ）を有し得る。好ましい実施形態では、ＸＴＥＮは、１．５～４．５の間の等電点を有する。これらの実施形態では、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物に組み込まれるＸＴＥＮは、非構造化立体構造ならびにＸＴＥＮ構成要素の哺乳動物タンパク質および組織に対する結合の低減に寄与し得る生理的条件下で負の正味電荷を有するであろう。
疎水性アミノ酸は、ポリペプチドに構造を付与することができることから、本発明は、ＸＴＥＮにおける疎水性アミノ酸の含有量が典型的に、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有量であることを提供する。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素中のメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含有量は、典型的に５％未満、または２％未満、および最も好ましくは１％未満である。別の実施形態では、ＸＴＥＮは、正電荷を有する１０％未満のアミノ酸残基、または正電荷を有する約７％未満、または約５％未満、または約２％未満のアミノ酸残基を有する配列を有し、メチオニンおよびトリプトファン残基の合計は、総ＸＴＥＮ配列の２％未満であり、アスパラギンおよびグルタミン残基の合計は、総ＸＴＥＮ配列の１０％未満である。
低い免疫原性
別の態様では、本発明は、ＸＴＥＮ配列が低い程度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの要因が、ＸＴＥＮの低い免疫原性、例えば非反復配列、非構造化立体構造、高い程度の溶解度、自己凝集の低い程度または欠如、配列内のタンパク質分解部位の低い程度または欠如、およびＸＴＥＮ配列中の立体構造エピトープの低い程度または欠如に寄与し得る。
立体構造エピトープは、タンパク質抗原の複数の不連続なアミノ酸配列で構成されるタンパク質表面の領域によって形成される。タンパク質の正確なフォールディングにより、これらの配列は、宿主の液性免疫系によって「異物」であると認識され得て、それによってタンパク質に対する抗体の産生、または細胞媒介性免疫応答を誘発する、良好に定義された安定な空間的立体配置またはエピトープとなる。後者の場合、個体におけるタンパク質に対する免疫応答は、その個体のＨＬＡ－ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の関数であるＴ細胞エピトープ認識によって大きく影響を受ける。Ｔ細胞の表面上の同族のＴ細胞受容体によってＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体が係合すると、ある特定の他の共受容体、例えばＣＤ４分子の交差結合と共にＴ細胞内の活性化状態を誘導することができる。活性化は、他のリンパ球、例えばＢ細胞をさらに活性化して抗体を産生する、または完全な細胞性免疫応答としてキラーＴ細胞を活性化するサイトカインの放出をもたらす。
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面上で提示するためにペプチドが所定のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力は、複数の要因、最も特にその一次配列に依存する。一実施形態では、免疫原性の低い程度は、抗原提示細胞における抗原のプロセシングに抵抗するＸＴＥＮ配列を設計すること、および／またはＭＨＣ受容体に十分に結合しない配列を選択することによって達成され得る。本発明は、ＭＨＣ ＩＩ受容体との結合を低減するように、ならびにＴ細胞受容体に関するエピトープの形成または抗原結合を回避し、それによって低い程度の免疫原性をもたらすように設計された実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドとのＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、部分的に、ＸＴＥＮ配列の立体構造上の可動性の直接の結果、例えばアミノ酸残基の選択および順序による二次構造の欠如である。例えば、立体構造エピトープをもたらし得る、水溶液中または生理的条件下で圧縮型でフォールディングされた立体構造をとる傾向が低い配列が、特に重要である。従来の治療の実践および投与を使用する、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与は、一般的にＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成をもたらさず、同様にＢＰＸＴＥＮ組成物におけるＢＰ融合パートナーの免疫原性も低減し得る。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質において利用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まなくてもよい。より免疫原性が低いタンパク質を生成する目的でのそのようなエピトープの除去は、以前に開示されている；例えば参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９８／５２９７６号、ＷＯ０２／０７９２３２号、およびＷＯ００／３３１７号を参照されたい。ヒトＴ細胞エピトープのアッセイが記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８１： ９５－１０８）。Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列を生成することなく、オリゴマー化することができるペプチド配列は、特に重要である。これは、Ｔ細胞エピトープの存在に関して、および６～１５ｍｅｒの出現に関して、特にヒトではない９ｍｅｒの配列の出現に関してこれらの配列のダイレクトリピートを試験することによって、および次にエピトープ配列を除去または破壊するためにＸＴＥＮ配列の設計を変更することによって達成することができる。一部の場合では、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合すると予測されるＸＴＥＮのエピトープの数の制限によって実質的に非免疫原性である。ＭＨＣ受容体に結合することが可能であるエピトープの数の低減によって、Ｔ細胞活性化ならびにＴ細胞ヘルパー機能の潜在性の低減、Ｂ細胞活性化または上方調節の低減、および抗体産生の低減が同時に起こる。予測されるＴ細胞エピトープが低い程度であることは、エピトープ予測アルゴリズム、例えばＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １７： ５５５－６１）によって決定することができる。タンパク質内の所定のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５５５）に開示されるように、最も一般的な複数のヒトＭＨＣ対立遺伝子に対するそのペプチドフレームの結合のＫｄ（解離定数、親和性、オフレート）の対数である。スコアは、約１０から約－１０（１０ｅ１０Ｋｄから１０ｅ－１０Ｋｄの結合拘束に対応する）までの少なくとも２０対数の範囲であり、ＭＨＣにおけるペプチドディスプレイの間のアンカー残基として役立ち得る疎水性アミノ酸、例えばＭ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆを回避することによって低減させることができる。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮに組み込まれるＸＴＥＮ構成要素は、約－５もしくはそれより大きい、または－６もしくはそれより大きい、または－７もしくはそれより大きい、または－８もしくはそれより大きいＴＥＰＩＴＯＰＥスコア、または－９もしくはそれより大きいＴＥＰＩＴＯＰＥスコアで、予測されるＴ細胞エピトープを有しない。本明細書で使用される場合、「－９もしくはそれより大きい」スコアは、１０および－９を含めて、１０～－９のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを包含するが、－１０は－９より小さいことから、－１０のスコアは包含しない。
別の実施形態では、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれる配列を含む本発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮの配列からの既知のタンパク質分解部位の制限によって、ＸＴＥＮの、ＭＨＣ ＩＩ受容体に結合することができる小さいペプチドへのプロセシングを低減することによって、実質的に非免疫原性にすることができる。別の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、多くのプロテアーゼに対する抵抗性を付与する二次構造を実質的に欠如する配列を使用することによって、構造の高いエントロピーにより、実質的に非免疫原性にすることができる。したがって、低減されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアおよびＸＴＥＮからの公知のタンパク質分解部位の除去により、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ組成物に、免疫系の受容体を含む哺乳動物受容体が実質的に結合することができなくなり得る。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、哺乳動物受容体に対して＞１００ｎＭのＫｄの結合、または哺乳動物細胞表面もしくは循環するポリペプチド受容体に対して５００ｎＭより高いＫｄ、もしくは１μＭより高いＫｄを有することができる。
加えて、非反復配列およびＸＴＥＮのエピトープの対応する欠如は、Ｂ細胞がＸＴＥＮに結合するまたはそれによって活性化される能力を制限し得る。反復配列は認識され、たとえ少ないＢ細胞であっても多価接触を形成することができ、複数のＴ細胞独立受容体の架橋の結果として、Ｂ細胞増殖および抗体産生を刺激することができる。これに対し、ＸＴＥＮは、その伸長した配列にわたって多くの異なるＢ細胞と接触することができ、各々の個々のＢ細胞は、配列の反復性の欠如により、個々のＸＴＥＮとの１つまたは少数の接触を形成するに過ぎない。その結果、ＸＴＥＮは、典型的にＢ細胞の増殖、およびこのように免疫応答を刺激するかなり低い傾向を有し得る。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、融合されていない対応するＢＰと比較した場合に低減された免疫原性を有し得る。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの最大３回の非経口用量を哺乳動物に投与すると、検出可能な抗ＢＰＸＴＥＮ ＩｇＧを１：１００の血清希釈でもたらし得るが、１：１０００の希釈ではもたらさない。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの最大３回の非経口用量を哺乳動物に投与すると、検出可能な抗ＢＰ ＩｇＧを１：１００の血清希釈でもたらし得るが、１：１０００の希釈ではもたらさない。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの最大３回の非経口用量を哺乳動物に投与すると、検出可能な抗ＸＴＥＮ ＩｇＧを１：１００の血清希釈でもたらし得るが、１：１０００の希釈ではもたらさない。前述の実施形態では、哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、またはカニクイザルであり得る。
高い程度の反復性を有する配列と比較して非反復性の配列を有するＸＴＥＮの追加の特色は、非反復性のＸＴＥＮが抗体とより弱い接触を形成することであり得る。抗体は多価分子である。例えば、ＩｇＧは、２つの同一の結合部位を有し、ＩｇＭは、１０個の同一の結合部位を有する。このように、反復配列に対する抗体は、そのような反復配列の効力および／または除去に影響を及ぼし得る、高いアビディティを有するそのような反復配列との多価接触を形成することができる。これに対し、非反復性のＸＴＥＮに対する抗体は、一価の相互作用を生じ、ＢＰＸＴＥＮ組成物が増加した期間、循環中に留まり得るように、免疫クリアランスのより低い可能性をもたらし得る。
増加した流体力学的半径
別の態様では、本発明は、ＸＴＥＮポリペプチドが、ＸＴＥＮを組み込むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に、対応する増加した見かけの分子量を付与する高い流体力学的半径を有し得るＸＴＥＮを提供する。ＸＴＥＮをＢＰ配列に連結させると、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、増加した流体力学的半径、増加した見かけの分子量、および増加した見かけの分子量係数を有し得るＢＰＸＴＥＮ組成物をもたらし得る。例えば、延長した半減期が望ましい治療応用では、高い流体力学的半径を有するＸＴＥＮが１つまたは複数のＢＰを含む融合タンパク質に組み込まれる組成物は、組成物の流体力学的半径を、およそ３～５ｎｍ（見かけの分子量約７０ｋＤＡに対応する）の糸球体孔径を超えて有効に拡大することができ（Ｃａｌｉｃｅｔｉ． ２００３． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５：１２６１－１２７７）、循環するタンパク質の低減された腎クリアランスをもたらす。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量ならびに形状および圧縮性を含むその構造によって決定される。特定の理論に拘束されないが、ＸＴＥＮは、ペプチドの個々の電荷の間の静電気的反発または二次構造を付与する潜在性を欠如する配列中の特定のアミノ酸によって付与される固有の可動性によりオープン立体構造をとることができる。ＸＴＥＮポリペプチドのオープンの伸長した非構造化立体構造は、二次および／または三次構造、例えば典型的な球状タンパク質を有する同等の配列の長さおよび／または分子量のポリペプチドと比較してより大きい比例的な流体力学的半径を有し得る。流体力学的半径を決定する方法は、例えば米国特許第６，４０６，６３２号および第７，２９４，５１３号に記載されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用などによって当技術分野で周知である。ＸＴＥＮの増加する長さを加えると、それに比例して流体力学的半径、見かけの分子量および見かけの分子量係数のパラメーターが増加し、ＢＰＸＴＥＮを所望の特徴的なカットオフの見かけの分子量または流体力学的半径へと調整することを可能にする。したがって、ある特定の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質が、少なくとも約５ｎｍ、または少なくとも約８ｎｍ、または少なくとも約１０ｎｍ、または１２ｎｍ、または少なくとも約１５ｎｍの流体力学的半径を有し得るように、ＸＴＥＮと共に構成することができる。前述の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質中のＸＴＥＮによって付与される大きい流体力学的半径は、得られた融合タンパク質の低減された腎クリアランスをもたらし、これに対応した終末相半減期の増加、平均滞留時間の増加、および／または腎クリアランス速度の減少をもたらし得る。
別の実施形態では、選択した長さおよび配列のＸＴＥＮは、ＢＰＸＴＥＮに選択的に組み込まれ、生理的条件下で少なくとも約１００ｋＤａ、少なくとも約１５０ｋＤａ、または少なくとも約３００ｋＤａ、または少なくとも約４００ｋＤａ、または少なくとも約５００ｋＤＡ、または少なくとも約６００ｋＤａ、または少なくとも約７００ｋＤＡ、または少なくとも約８００ｋＤａ、または少なくとも約９００ｋＤａ、または少なくとも約１０００ｋＤａ、または少なくとも約１２００ｋＤａ、または少なくとも約１５００ｋＤａ、または少なくとも約１８００ｋＤａ、または少なくとも約２０００ｋＤａ、または少なくとも約２３００ｋＤａ、またはそれより大きい見かけの分子量を有する融合タンパク質を作製することができる。別の実施形態では、選択された長さおよび配列のＸＴＥＮは、ＢＰに選択的に連結され、生理的条件下で、少なくとも３、あるいは少なくとも４、あるいは少なくとも５、あるいは少なくとも６、あるいは少なくとも８、あるいは少なくとも１０、あるいは少なくとも１５の見かけの分子量係数、または少なくとも２０もしくはそれより大きい見かけの分子量係数を有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をもたらすことができる。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、生理的条件下で、融合タンパク質の実際の分子量と比較して約４～約２０、または約６～約１５である、または約８～約１２である、または約９～約１０である見かけの分子量係数を有する。
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の生物活性タンパク質
本発明は部分的に、生物活性タンパク質およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質、ならびに対象の疾患、障害、または状態を処置するためのその使用に関する。
一態様では、本発明は、１つまたは複数の伸長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）を含む融合タンパク質に共有結合され、ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物（本明細書において以降、「ＢＰＸＴＥＮ」）をもたらす、少なくとも第１の生物活性タンパク質（本明細書において以降「ＢＰ」）を提供する。以下により詳しく記載するように、融合タンパク質は、必要に応じて、プロテアーゼの作用を受けると融合タンパク質からＢＰを放出する切断配列をさらに含み得るスペーサー配列を含み得る。
「ＢＰＸＴＥＮ」という用語は、本明細書で使用される場合、各々が、１つまたは複数の生物活性または治療活性を媒介する生物活性タンパク質および少なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドを含む少なくとも１つの他の領域を含む、１つまたは２つのペイロード領域を含む融合ポリペプチドを包含することを意味する。
本発明の組成物のＢＰ、特に表６に開示される組成物のＢＰは、その対応する核酸およびアミノ酸配列と共に当技術分野で周知であり、説明および配列は、公共のデータベース、例えばＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）、およびサブスクリプションによって提供されるデータベース、例えばＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）において入手可能である。ポリヌクレオチド配列は、所定のＢＰ（例えば、全長または成熟のいずれか）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であり得るか、または一部の例では配列は、野生型ポリヌクレオチド配列のバリアント、例えばポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、例えば特定の種における発現に関して最適化されている野生型生物活性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または野生型タンパク質のバリアント、例えば部位特異的突然変異体もしくは対立遺伝子バリアントをコードするポリヌクレオチドであり得る。野生型またはコンセンサスｃＤＮＡ配列またはＢＰのコドン最適化バリアントを使用して、当技術分野で公知の方法を使用して、ならびに／または本明細書に提供され、および実施例により詳しく記載されるガイダンスおよび方法と共に、本発明によって企図されるＢＰＸＴＥＮ構築物を作製することは、当業者の十分に能力範囲内である。
本発明のＢＰＸＴＥＮに含めるためのＢＰは、生物学的、治療的、予防的、もしくは診断的重要性もしくは機能を有する任意のタンパク質、または対象に投与した場合に生物活性を媒介する、または疾患、障害、もしくは状態を防止もしくは改善するために有用である任意のタンパク質を含み得る。薬物動態パラメーターの増加、増加した溶解度、増加した安定性、もしくは一部の他の増強された薬学的特性が求められるＢＰ、または終末相半減期を増加させることにより、有効性、安全性を改善する、もしくは低減された投与頻度をもたらす、および／または患者の服薬遵守を改善するそれらのＢＰは、特に重要である。このように、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、例えば対象に投与した場合に、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較してｉｎ ｖｉｖｏでの曝露またはＢＰＸＴＥＮが治療域内に留まっている期間を増加させることによって生物活性化合物の治療有効性を改善することを含む、様々な目的を念頭に置いて調製される。
本発明のＢＰは、天然の全長タンパク質であり得るか、または天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持する生物活性タンパク質の断片もしくは配列バリアントであり得る。
一実施形態では、本発明の組成物に組み込まれるＢＰは、天然で見出されるタンパク質に対応する配列を有する組換えポリペプチドであり得る。別の実施形態では、ＢＰは、天然のＢＰの生物活性の少なくとも一部を保持する天然の配列の配列バリアント、断片、ホモログ、および模倣体であり得る。非限定的な例では、ＢＰは、表６から選択されるタンパク質配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、またはあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す配列であり得る。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結した単一のＢＰ分子を含み得る（以下により詳しく記載されるように）。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、同じＢＰの第１のＢＰおよび第２の分子を含み得て、１つまたは複数のＸＴＥＮ（例えば、ＩＬ－１ｒａの２分子、またはＩＬ－１０の２分子）に連結した２つのＢＰを含む融合タンパク質をもたらし得る。治療剤としてそれらを含む生物活性タンパク質は、特に水溶液中で製剤化された場合、短い貯蔵寿命を示す典型的に不安定な分子である。加えて、多くの生物活性ペプチドおよびタンパク質は、限定的な溶解度を有するか、または組換えによる産生の間に凝集するようになり、複雑な溶解および再フォールディング手順を必要とする。様々な化学的ポリマーをそのようなタンパク質に結合させて、その特性を改変することができる。可動性の立体構造を有し、水溶液中で良好に水和される親水性ポリマーは、特に重要である。頻繁に使用されるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。これらのポリマーは、その分子量と比較して大きい流体力学的半径を有する傾向があり（Ｋｕｂｅｔｚｋｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ６８： １４３９－５４）、増強された薬物動態特性をもたらし得る。結合点に応じて、ポリマーは、ポリマー改変タンパク質がその関連する機能を保持するようにそれらが結合されているタンパク質と限定的な相互作用を有する傾向がある。しかし、ポリマーとタンパク質との化学コンジュゲーションは、複雑なマルチステッププロセスを必要とする。典型的に、タンパク質構成要素は、化学コンジュゲーションステップの前に産生および精製される必要がある。加えて、コンジュゲーションステップは、不均一な産物混合物の形成をもたらし、これは分離する必要があり、有意な産物の喪失をもたらし得る。あるいは、そのような混合物は、最終的な薬学的産物として使用することができるが、標準化することが難しい。一部の例は、混合物として使用される現在市販のＰＥＧ化インターフェロンアルファ製品である（Ｗａｎｇ， Ｂ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ Ｃｙｔｏｌ Ｐａｔｈｏｌ， ３０： ５０３－９； Ｄｈａｌｌｕｉｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ， １６： ５０４－１７）。そのような混合物は、治療活性が低減されたまたは治療活性がない異性体をそれらが含有することから、再現よく製造するおよび特徴付けることが難しい。
一般的に、ＢＰは、ｉｎ ｖｉｖｏで使用される場合、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで利用される場合に所定の標的に対する結合特異性または別の所望の生物学的特徴を示す。例えば、ＢＰは、アゴニスト、受容体、リガンド、アンタゴニスト、酵素、またはホルモンであり得る。疾患もしくは障害のために使用される、または疾患もしくは障害にとって有用であることが公知であるＢＰは特に重要であり、天然のＢＰは、比較的短い終末相半減期を有し、薬物動態パラメーターの増強（必要に応じて、スペーサー配列の切断により融合タンパク質から放出され得る）によって、より少ない回数の投与または増強された薬理学効果が可能となる。最小有効用量または血中濃度（Ｃｍｉｎ）と、最大認容量または血中濃度（Ｃｍａｘ）の間の治療域が狭いＢＰもまた重要である。そのような場合、ＢＰを、選択されたＸＴＥＮ配列（複数可）を含む融合タンパク質に連結すると、これらの特性の改善をもたらし、それらはＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、治療剤または防止剤としてより有用となり得る。
ＢＰは、サイトカインであり得る。本発明の組成物に包含されるサイトカインは、がん、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、ウイルス感染症（例えば、慢性Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ）、アレルギー性喘息、網膜神経変性プロセス、代謝障害、インスリン抵抗性、および糖尿病性心筋症を含むがこれらに限定されない様々な治療または疾患カテゴリーの処置において有用性を有し得る。サイトカインは、炎症状態および自己免疫状態の処置において特に有用であり得る。
ＢＰは、１つまたは複数のサイトカインであり得る。サイトカインは、細胞の挙動に影響を及ぼし得る、細胞によって放出されるタンパク質（例えば、ケモカイン、インターフェロン、リンフォカイン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子）を指す。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ミクログリア細胞、および肥満細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および様々な間質細胞を含むがこれらに限定されない広範囲の細胞によって産生され得る。所定のサイトカインは、１つより多くのタイプの細胞によって産生され得る。サイトカインは、全身性または局所免疫調節効果を生じることに関与し得る。
ある特定のサイトカインは、炎症促進性サイトカインとして機能することができる。炎症促進性サイトカインは、炎症反応の誘導または増幅に関係するサイトカインを指す。炎症促進性サイトカインは、免疫系の様々な細胞、例えば好中球および白血球に作用して、免疫応答を生成することができる。ある特定のサイトカインは、抗炎症性サイトカインとして機能することができる。抗炎症性サイトカインは、炎症反応の低減に関与するサイトカインを指す。一部の場合では、抗炎症性サイトカインは、炎症促進性サイトカイン応答を調節することができる。そのようなサイトカインは、炎症促進性および抗炎症性サイトカインの両方として機能することができる。
本開示の系および組成物によって調節可能であるサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、およびヒト成長ホルモンを除く従来のポリペプチドホルモンが挙げられるがこれらに限定されない。サイトカインとしては、副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子－アルファ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えばＮＧＦ－アルファ；血小板由来増殖因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、およびＴＧＦ－ベータ３；インスリン様成長因子－ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；Ｆｌｔ－３Ｌ；幹細胞因子（ＳＣＦ）；骨誘導性因子；インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）；顆粒球単球－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）；マクロファージ刺激因子（ＭＳＰ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－１、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｂ、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－２０；腫瘍壊死因子、例えばＣＤ１５４、ＬＴ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ；ならびにＬＩＦ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）およびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。サイトカイン受容体は、サイトカインに結合する受容体タンパク質を指す。サイトカイン受容体は、膜結合型および溶解型の両方であり得る。
標的ポリヌクレオチドはサイトカインをコードし得る。サイトカインの非限定的な例としては、４－１ＢＢＬ、アクチビンβＡ、アクチビンβＢ、アクチビンβＣ、アクチビンβＥ、アルテミン（ＡＲＴＮ）、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、骨形成タンパク質１（ＢＭＰ１）、ＣＣＬ１／ＴＣＡ３、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ－５，ＣＣＬ１３／ＭＣＰ－４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ－１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＤ１５３／ＣＤ３０Ｌ／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０、ＣＤ７０／ＣＤ２７Ｌ／ＴＮＦＳＦ７、ＣＬＣＦ１、ｃ－ＭＰＬ／ＣＤ１１０／ＴＰＯＲ、ＣＮＴＦ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２／ＭＩＰ－２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７／Ｐｐｂｐ、ＣＸＣＬ９、ＥＤＡ－Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ２、ＦＡＭ１９Ａ３、ＦＡＭ１９Ａ４、ＦＡＭ１９Ａ５、Ｆａｓリガンド／ＦＡＳＬＧ／ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ１７８、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ４、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、成長分化因子１（ＧＤＦ１）、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５／ＩＦＮａＧ、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＺ、ＩＦＮω／ＩＦＮＷ１、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ３／ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ３１、ＩＬ３３、ＩＬ６、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８、インヒビン－Ａ、インヒビン－Ｂ、レプチン、ＬＩＦ、ＬＴＡ／ＴＮＦＢ／ＴＮＦＳＦ１、ＬＴＢ／ＴＮＦＣ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ＯＳＭ、ＯＸ－４０Ｌ／ＴＮＦＳＦ４／ＣＤ２５２、ペルセフィン（ＰＳＰＮ）、ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧＬ／ＴＮＦＳＦ１１（ＣＤ２５４）、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＡ、ＴＮＦ－アルファ／ＴＮＦＡ、ＴＮＦＳＦ１０／ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ－２Ｌ（ＣＤ２５３）、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２５８、ＸＣＬ１、およびＸＣＬ２が挙げられる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。そのような免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、およびＶＩＳＴＡが挙げられる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖をコードする。
一部の場合では、サイトカインはケモカインであり得る。ケモカインは、ＡＲＭＣＸ２、ＢＣＡ－１／ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ－５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ－４、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ－５／ＭＩＰ－１デルタ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ－４／ＮＣＣ４、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ／ＭＩＰ－４、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ－３ｂ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ－３アルファ／ＭＩＰ３Ａ、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＩＰ３、ＣＣＬ２４／エオタキシン－２／ＭＰＩＦ－２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン－３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３／Ｍｉｐ１ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ１Ｂ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ－１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ８／ＭＣＰ－２、ＣＣＬ９、ＣＭＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０／Ｃｒｇ－２、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ－１ベータ、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＣＸＣＬ１５／ラングカイン、ＣＸＣＬ１６／ＳＲ－ＰＳＯＸ、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２／ＭＩＰ－２、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯガンマ、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ－２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＦＡＭ１９Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ２、ＦＡＭ１９Ａ３、ＦＡＭ１９Ａ４／ＴＡＦＡ４、ＦＡＭ１９Ａ５、フラクタルカイン／ＣＸ３ＣＬ１、Ｉ－３０９／ＣＣＬ１／ＴＣＡ－３、ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８、ＭＣＰ－３／ＣＣＬ７、ＮＡＰ－２／ＰＰＢＰ／ＣＸＣＬ７、ＸＣＬ２、およびＡｒｍｏＩＬ１０を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。
表３は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質によって包含されるＢＰのそのような配列の非限定的なリストを提供する。本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物の代謝タンパク質は、表３から選択されるタンパク質配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、またはあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すタンパク質であり得る。
表３： コンジュゲーションのためのサイトカイン
Figure 2023531496000014
 表Ａ． 例示的なインターロイキン－１２ （ＩＬ－１２）またはその断片のアミノ酸配列
Figure 2023531496000015
表Ａは、インターロイキン－１２配列（またはその断片）の非限定的なリストを提供する。本開示の本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物は、表Ａから選択されるタンパク質配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、またはあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有し得る。
一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、融合タンパク質）がサイトカインを含む場合、サイトカインは、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）スーパーファミリーメンバーからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、およびＩＬ１７からなる群から選択されるインターロイキンであり得る。一部の実施形態では、サイトカインは、表３または表Ａから選択される配列に対して少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）８１％、少なくとも（約）８２％、少なくとも（約）８３％、少なくとも（約）８４％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）８６％、少なくとも（約）８７％、少なくとも（約）８８％、少なくとも（約）８９％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、サイトカインは、表３から選択される配列に対して少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）８１％、少なくとも（約）８２％、少なくとも（約）８３％、少なくとも（約）８４％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）８６％、少なくとも（約）８７％、少なくとも（約）８８％、少なくとも（約）８９％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、サイトカインは、表Ａから選択される配列に対して少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）８１％、少なくとも（約）８２％、少なくとも（約）８３％、少なくとも（約）８４％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）８６％、少なくとも（約）８７％、少なくとも（約）８８％、少なくとも（約）８９％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、サイトカインはＩＬ－１２またはＩＬ－１２バリアントであり得る。一部の実施形態では、サイトカインは、第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）および第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）を含み得る。一部の実施形態では、Ｃｙ１およびＣｙ２の一方は、インターロイキン１２サブユニットベータに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、Ｃｙ１およびＣｙ２の他方は、インターロイキン１２サブユニットアルファに対して少なくとも（約）７０％、少なくとも（約）７５％、少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）は、配列番号５の配列に対して少なくとも（約）７０％、少なくとも（約）７５％、少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）は、配列番号６の配列に対して少なくとも（約）７０％、少なくとも（約）７５％、少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、サイトカインは、第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）および第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）との間に位置するリンカーを含み得る。一部の実施形態では、サイトカインは、配列番号７に対して少なくとも（約）７０％、少なくとも（約）７５％、少なくとも（約）８０％、少なくとも（約）８５％、少なくとも（約）９０％、少なくとも（約）９１％、少なくとも（約）９２％、少なくとも（約）９３％、少なくとも（約）９４％、少なくとも（約）９５％、少なくとも（約）９６％、少なくとも（約）９７％、少なくとも（約）９８％、少なくとも（約）９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－１２バリアントであり得る。リンカーは、ＧＳリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）１（配列番号２７３）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２７３）、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２７３）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２７３）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号２７３）等）であり得る。
「ＩＬ－１ｒａ」は、ヒトＩＬ－１受容体アンタゴニストタンパク質、ならびに成熟ＩＬ－１ｒａの生物活性の少なくとも一部を有する配列バリアントアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））を含むその種および配列バリアントを意味する。ヒトＩＬ－１ｒａは、１５２アミノ酸残基の成熟糖タンパク質である。ＩＬ－１ｒａの阻害作用は、そのＩ型ＩＬ－１受容体に対する結合に起因する。タンパク質は、２５ｋＤａの天然の分子量を有し、分子は、ＩＬ－１α（１９％）およびＩＬ－１β（２６％）と限定的な配列相同性を示す。アナキンラは、非グリコシル化組換えヒトＩＬ－１ｒａであり、Ｎ末端メチオニンの付加によって内因性のヒトＩＬ－１ｒａとは異なる。アナキンラの市販型は、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）として販売されている。これは、天然のＩＬ－１ｒａおよびＩＬ－１ｂと同じアビディティでＩＬ－１受容体に結合するが、受容体の活性化（シグナル伝達）をもたらさず、この作用は、ＩＬ－１ｒａでは受容体結合モチーフが１つのみ存在するのに対し、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１βではそのようなモチーフが２つ存在することによる。アナキンラは、１５３アミノ酸を有し、サイズは１７．３ｋＤであり、およそ４～６時間の報告された半減期を有する。
ＩＬ－１産生の増加は、様々なウイルス、細菌、真菌、および寄生虫感染症；血管内凝固；高用量ＩＬ－２治療；固形腫瘍；白血病；アルツハイマー病；ＨＩＶ－１感染症；自己免疫障害；外傷（手術）；血液透析；虚血疾患（心筋梗塞）；非感染性肝炎；喘息；ＵＶ照射；閉鎖性頭部傷害；膵炎；腹膜炎；移植片対宿主病；移植片拒絶を有する患者；ならびに激しい運動後の健康な対象において報告されている。アルツハイマー病を有する患者におけるＩＬ－１ｂ産生の増加、およびアミロイド前駆体タンパク質の放出におけるＩＬ－１の可能性がある役割には関連がある。ＩＬ－１はまた、２型糖尿病、肥満、高血糖症、高インスリン血症、１型糖尿病、インスリン抵抗性、網膜神経変性プロセス、インスリン抵抗性によって特徴付けられる病状および病態、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症障害、関節リウマチ、椎間板変性疾患、サルコイドーシス、クローン病、潰瘍性大腸炎、妊娠性糖尿病、過剰な食欲、不十分な満足度、代謝障害、グルカゴン産生腫瘍、気道の分泌障害、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺浮腫、高血圧症、食物摂取の低減が望ましい障害、刺激性腸症候群、心筋梗塞、卒中、術後の異化の変化、仮死状態の心筋、糖尿病性心筋症、不十分な尿中ナトリウム排泄、過剰な尿中カリウム濃度、毒性の循環血液量増加に関連する状態または障害、多膿疱性卵巣症候群、呼吸窮迫、慢性皮膚潰瘍、腎症、左室収縮機能障害、消化管下痢、術後ダンピング症候群、刺激性腸症候群、重症疾患多発ニューロパチー（ＣＩＰＮ）、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、脂質異常症、虚血後再灌流傷害、および冠動脈心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群などの疾患にも関連している。本発明のＩＬ－１ｒａ含有融合タンパク質は、前述の疾患および状態のいずれかの処置において特に有用であり得る。ＩＬ－１ｒａは、米国特許第５，０７５，２２２号および第６，８５８，４０９号に記載されているようにクローニングされている。
一部の場合では、ＢＰはＩＬ－１０であり得る。ＩＬ－１０は、炎症促進性サイトカインおよびケモカインの産生を抑制する有効な抗炎症性サイトカインであり得る。ＩＬ－１０は、液性免疫応答を増加させ、細胞媒介性免疫反応を低下させる主要なＴＨ２型サイトカインの１つである。ＩＬ－１０は、自己免疫疾患および炎症疾患、例えば関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、アレルギー性喘息、網膜神経変性プロセス、および糖尿病の処置にとって有用であり得る。
一部の場合では、ＩＬ－１０を、安定性を改善し、熱分解（ｐｒｏｌｙｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を減少させるように改変することができる。改変は、１つまたは複数のアミド結合置換であり得る。一部の場合では、ＩＬ－１０の骨格内の１つまたは複数のアミド結合は、上記の効果を達成するために置換することができる。ＩＬ－１０における１つまたは複数のアミド連結（－ＣＯ－ＮＨ－）を、アミド結合のアイソステアである連結、例えば－ＣＨ２ＮＨ－、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シスおよびトランス）、－ＣＯＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＳＯ－に交換することができる。さらに、ＩＬ－１０におけるアミド連結を、低減されたアイソステアシュードペプチド結合に交換することもできる。例えば、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４１：１８１－１８４を参照されたい。
アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸を含む１つまたは複数の酸性アミノ酸、チロシン、２，４－ジアミノプロピオン酸のアルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールスルホンアミド、オルニチンまたはリシン、およびテトラゾール置換アルキルアミノ酸；ならびに側鎖アミド残基、例えばアスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンまたはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体；ならびにセリン、トレオニン、ホモセリンを含むヒドロキシル含有アミノ酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、ならびにセリンまたはトレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を置換することができる。
ＩＬ－１０における１つまたは複数の疎水性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）－２－アミノ酪酸、（Ｓ）－シクロヘキシルアラニン、または他の単純なアルファアミノ酸を、分枝、環状、直鎖のアルキル、アルケニル、またはアルキニル置換を含むＣ１～Ｃ１０炭素の脂肪族側鎖を含むがこれらに限定されないアミノ酸に置換することができる。
一部の場合では、ＩＬ－１０における１つまたは複数の疎水性アミノ酸を、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１－ナフチルアラニン、２－ナフチルアラニン、２－ベンゾチエニルアラニン、３－ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含む芳香族置換疎水性アミノ酸、上記の芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、またはアルコキシ（Ｃ１～Ｃ４）置換型を含むアミノ酸の置換によって置換することができ、その例証的な例は、２－、３－、または４－アミノフェニルアラニン、２－、３－、または４－クロロフェニルアラニン、２－、３－、または４－メチルフェニルアラニン、２－、３－、または４－メトキシフェニルアラニン、５－アミノ－、５－クロロ－、５－メチル－、または５－メトキシトリプトファン、２’－、３’－、または４’－アミノ－、２’－、３’－、または４’－クロロ－、２、３、または４－ビフェニルアラニン、２’－、３’－、または４’－メチル－、２－、３－、または４－ビフェニルアラニン、および２－または３－ピリジルアラニンである。
ＩＬ－１０における１つまたは複数の疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１－ナフチルアラニン、２－ナフチルアラニン、２－ベンゾチエニルアラニン、３－ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、またはアルコキシ（ａｌｋｏｘ）を含むアミノ酸を、２－、３－、または４－アミノフェニルアラニン、２－、３－、または４－クロロフェニルアラニン、２－、３－、または４－メチルフェニルアラニン、２－、３－、または４－メトキシフェニルアラニン、５－アミノ－、５－クロロ－、５－メチル－、または５－メトキシトリプトファン、２’－、３’－、または４’－アミノ－、２’－、３’－、または４’－クロロ－、２、３、または４－ビフェニルアラニン、２’－、３’－、または４’－メチル－、２－、３－、または４－ビフェニルアラニン、および２－、または３－ピリジルアラニンを含む芳香族アミノ酸に置換することができる。
アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、２，３－ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含む塩基性側鎖を含むアミノ酸、前述のアミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換誘導体を含むアミノ酸を置換することができる。例は、Ｎ－イプシロン－イソプロピル－リシン、３－（４－テトラヒドロピリジル）－グリシン、３－（４－テトラヒドロピリジル）－アラニン、Ｎ，Ｎ－ガンマ、ガンマ’－ジエチル－ホモアルギニン、アルファ－メチル－アルギニン、アルファ－メチル－２，３－ジアミノプロピオン酸、アルファ－メチル－ヒスチジン、およびアルファ－メチル－オルニチンであり、ここでアルキル基は、アルファ炭素のプロＲ位置を占有する。改変されたＩＬ－１０は、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族、オルニチン、または２，３－ジアミノプロピオン酸、カルボン酸、または多くの周知の活性化誘導体のいずれか、例えば酸塩化物、活性化エステル、活性なアゾリド、ならびに関連する誘導体、リシン、およびオルニチンのいずれかの組合せから形成されるアミドを含み得る。
一部の場合では、ＩＬ－１０は、１つまたは複数の天然に存在するＬ－アミノ酸、合成Ｌ－アミノ酸、および／またはアミノ酸のＤ－エナンチオマーを含み得る。ＩＬ－１０ポリペプチドは、以下のアミノ酸：ω－アミノデカン酸、ω－アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、δ－アミノ吉草酸、ｔ－ブチルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、オルニチン、シトルリン、４－クロロフェニルアラニン、２－フルオロフェニルアラニン、ピリジルアラニン、３－ベンゾチエニルアラニン、ヒドロキシプロリン、β－アラニン、ｏ－アミノ安息香酸、ｍ－アミノ安息香酸、ｐ－アミノ安息香酸、ｍ－アミノメチル安息香酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン（サルコシン）、３－フルオロフェニルアラニン、４－フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、β－２－チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ－アセチルリシン、２，４－ジアミノ酪酸、ｒｈｏ－アミノフェニルアラニン、Ｎ－メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε－アミノヘキサン酸、ω－アミノヘキサン酸、ω－アミノヘプタン酸、ω－アミノオクタン酸、および２，３－ジアミノ酪酸の１つまたは複数を含み得る。
ＩＬ－１０は、ジスルフィド連結を介して別のペプチドに対するリンカーとして作用することができる、またはＩＬ－１０ポリペプチドの環化を提供するように作用することができるシステイン残基またはシステインを含み得る。システインまたはシステインアナログを導入する方法は、当技術分野で公知である；例えば米国特許第８，０６７，５３２号を参照されたい。ＩＬ－１０ポリペプチドを環化することができる。他の環化手段は、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入を含む；例えば、米国特許第８，０４４，１７５号を参照されたい。環化結合を形成することができるアミノ酸（または非アミノ酸部分）の任意の組合せを、使用および／または導入することができる。環化結合は、アミノ酸（またはアミノ酸および－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－、または－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ６Ｈ４－ＣＯ－）と、架橋の導入を可能にする官能基との任意の組合せによって生成することができる。一部の例は、ジスルフィド、ジスルフィド模倣体、例えば－（ＣＨ２）ｎ－カルバ架橋、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン）ならびにエステルおよびエーテルを含有する架橋である。
ＩＬ－１０を、Ｎ－アルキル、アリール、または骨格の架橋によって置換して、ラクタムおよび他の環状構造、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、ｏ改変誘導体、置換アミド、例えばアルキルアミドおよびヒドラジドを含むＮ末端改変誘導体を構築することができる。一部の場合では、ＩＬ－１０ポリペプチドは、レトロインベルソアナログである。
ＩＬ－１０は、天然タンパク質、ペプチド断片ＩＬ－１０、または天然ＩＬ－１０の生物活性の少なくとも一部を有する改変ペプチドであり得る。ＩＬ－１０は、細胞内取り込みを改善するように改変することができる。１つのそのような改変は、タンパク質形質導入ドメインの結合であり得る。タンパク質形質導入ドメインを、ＩＬ－１０のＣ末端に結合することができる。あるいは、タンパク質形質導入ドメインを、ＩＬ－１０のＮ末端に結合することができる。タンパク質形質導入ドメインを、共有結合を介してＩＬ－１０に結合させることができる。タンパク質形質導入ドメインは、表９に記載される配列のいずれかから選択することができる。
表９． 例示的なタンパク質形質導入ドメイン
Figure 2023531496000016
ＢＰＸＴＥＮ構造の立体配置および特性
本発明の組成物のＢＰは、天然の全長ポリペプチドに限定されず、同様に組換え型ならびにその生物活性および／または薬理活性バリアントまたは断片も含む。例えば、様々なアミノ酸置換をＧＰに行って、ＢＰの生物活性または薬理学的特性に関して本発明の精神から逸脱することなくバリアントを作製することができると認識される。ポリペプチド配列中のアミノ酸の保存的置換の例を表４に示す。しかし、ＢＰの配列同一性が本明細書に開示される特定の配列と比較して１００％未満であるＢＰＸＴＥＮの実施形態では、本発明は、所定のＢＰの所定のアミノ酸残基の代わりに他の１９個の天然のＬ－アミノ酸のいずれかの置換を企図し、これは隣接するアミノ酸残基を含むＢＰの配列内の任意の位置であり得る。任意の１つの置換が生物活性の望ましくない変化をもたらす場合、代替のアミノ酸の１つを使用することができ、構築物を、本明細書に記載される方法によって、または例えばその内容のその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３６４，９３４号に記載される保存的および非保存的突然変異の技術およびガイドラインのいずれかを使用して、または当業者に一般的に公知の方法を使用して評価することができる。加えて、バリアントはまた、例えば１つまたは複数のアミノ酸残基が、天然のペプチドの生物活性の少なくとも一部を保持するＢＰの全長の天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端で付加または欠失されているポリペプチドを含み得る。
表４： 例示的な保存的アミノ酸置換
Figure 2023531496000017
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の立体配置
本発明は、グルコース恒常性、インスリン抵抗性、または肥満に関連する疾患、障害、または状態を防止する、処置する、媒介する、または改善するために有用な１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドに連結したＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。一部の場合では、ＢＰＸＴＥＮは、ＢＰが１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドに連結した単量体融合タンパク質である。他の場合では、ＢＰＸＴＥＮ組成物は、１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドに連結した２つのＢＰ分子を含み得る。本発明は、表３または表Ａから選択されるＢＰ（またはその断片もしくは配列バリアント）、および表２ａ～２ｂから選択されるＸＴＥＮ、またはその配列バリアントを含むがこれらに限定されないＢＰＸＴＥＮを企図する。一部の場合では、それぞれのＢＰの生物活性の少なくとも一部は、インタクトＢＰＸＴＥＮによって保持される。他の場合では、ＢＰ構成要素は、以下により詳しく記載されるように、スペーサー配列内に組み込まれた必要に応じた切断配列がＢＰＸＴＥＮに切断されることによってＸＴＥＮから放出されると、生物活性となるかまたは活性の増加を有する。
一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、（ａ）ＸＴＥＮ（例えば、本明細書に開示されるもの）および（ｂ）ＸＴＥＮに連結したサイトカインを含む。
ＢＰＸＴＥＮ組成物の一実施形態では、本発明は、式Ｉの融合タンパク質を提供する：
（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＸＴＥＮ） Ｉ
式中、各出現に関して独立して、ＢＰは、本明細書において上記の生物活性タンパク質であり；Ｓは、必要に応じて切断配列を含み得る１～約５０アミノ酸残基の間を有するスペーサー配列（以下により詳しく記載されるように）であり；ｘは０または１のいずれかであり；ならびにＸＴＥＮは、本明細書で上記の伸長組換えポリペプチドである。実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離のＮ末端を必要とする場合、またはＢＰのＣ末端を融合タンパク質に連結すると生物活性が低減する場合、および投与されたＢＰＸＴＥＮの生物活性および／または副作用を低減させることが望ましい場合、特に有用性を有する。
ＢＰＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、式ＩＩの融合タンパク質（上記の構成要素）を提供する：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ） ＩＩ
式中、各出現に関して独立して、ＢＰは、本明細書において上記の生物活性タンパク質であり；Ｓは、必要に応じて切断配列を含み得る１～約５０アミノ酸残基の間を有するスペーサー配列（以下により詳しく記載されるように）であり；ｘは０または１のいずれかであり；ならびにＸＴＥＮは、本明細書で上記の伸長組換えポリペプチドである。実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離のＣ末端を必要とする場合、またはＢＰのＮ末端を融合タンパク質に連結すると生物活性が低減する場合、および投与されたＢＰＸＴＥＮの生物活性および／または副作用を低減させることが望ましい場合、特に有用性を有する。
このように、単一のＢＰおよび単一のＸＴＥＮを有するＢＰＸＴＥＮは、各々がＮ末端からＣ末端方向に記載される立体配置の少なくとも以下の順列を有し得る：ＢＰ－ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ－ＢＰ；ＢＰ－Ｓ－ＸＴＥＮ；またはＸＴＥＮ－Ｓ－ＢＰ。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩである単離された融合タンパク質を提供する：
（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｚ－（ＸＴＥＮ）ｚ ＩＩＩ
式中、各出現に関して独立して、ＢＰは、本明細書において上記の生物活性タンパク質であり；Ｓは、必要に応じて切断配列を含み得る１～約５０アミノ酸残基の間を有するスペーサー配列（以下により詳しく記載されるように）であり；ｘは０または１のいずれかであり；ｙは０または１のいずれかであり、ｚは０または１のいずれかであり；ならびにＸＴＥＮは、本明細書で上記の伸長組換えポリペプチドである。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＶ（上記の構成要素）である単離された融合タンパク質を提供する：
（ＸＴＥＮ）ｘ－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｚ－（ＸＴＥＮ）－（ＢＰ） ＩＶ
別の実施形態では、本発明は、式Ｖ（上記の構成要素）である単離された融合タンパク質を提供する：
（ＢＰ）ｘ－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＸＴＥＮ） Ｖ
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩ（上記の構成要素）である単離された融合タンパク質を提供する：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ） ＶＩ
別の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩ（上記の構成要素）である単離された融合タンパク質を提供する：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ）－（ＸＴＥＮ） ＶＩＩ
一部の場合では、ＢＰは、第１の断片および第２のサイトカイン断片を含み得て、ＸＴＥＮは、第１の断片と第２の断片の間に位置する。望ましければ、ＢＰはサイトカインであり得る。一部の例では、サイトカインはＩＬ－１０であり得る。
式Ｉ～ＶＩＩの融合タンパク質の前述の実施形態では、実施形態の融合タンパク質の治療有効量の投与を必要とする対象への、実施形態の融合タンパク質の治療有効量の投与は、同等の用量で対象に投与される、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰと比較して、融合タンパク質が治療域内で留まる時間の少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、またはそれより多くの増加をもたらし得る。
いかなるスペーサー配列基も、本発明によって包含される融合タンパク質において必要に応じてである。スペーサーは、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を増強するために、またはＢＰ構成要素が、その所望の三次構造をとり得るおよび／またはその標的分子と適切に相互作用し得るように立体妨害を減少させるために提供され得る。スペーサーおよび所望のスペーサーを同定する方法に関しては、例えば具体的に参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｏｒｇｅ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１－８７９を参照されたい。一実施形態では、スペーサーは、１～５０アミノ酸残基の間の長さ、または約１～２５残基の間、または約１～１０残基の間の長さである１つまたは複数のペプチド配列を含む。切断部位を除くスペーサー配列は、２０個の天然のＬアミノ酸のいずれかを含み得て、好ましくはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）を含み得るがこれらに限定されない立体妨害されていない親水性アミノ酸を含む。一部の場合では、スペーサーは、ポリグリシンもしくはポリアラニンであり得るか、または主にグリシンおよびアラニン残基の組合せの混合物である。切断配列を除くスペーサーポリペプチドは、ほとんどが二次構造を実質的に欠如している。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物中の１つまたは両方のスペーサー配列は、同一であり得るかまたは異なり得る切断配列をさらに含有してもよく、切断配列は、プロテアーゼの作用を受けて、融合タンパク質からＢＰを放出し得る。
一部の場合では、切断配列をＢＰＸＴＥＮに組み込むことは、ＸＴＥＮから放出されると活性またはより活性となるＢＰの放出を可能にするように設計される。切断配列は、切断後にＢＰに結合したいかなる残存残基も、ＢＰの活性（例えば、受容体に対する結合）を認識可能に妨害しないが、切断配列の切断を行うことができるために十分なプロテアーゼに対するアクセスを提供するように、ＢＰ配列に十分に近い位置に、一般的にＢＰ配列末端の１８アミノ酸以内、または１２アミノ酸以内、または６アミノ酸以内、または２アミノ酸以内に位置する。一部の実施形態では、切断部位は、ＢＰＸＴＥＮが対象への投与後に切断され得るように、哺乳動物対象に対して内因性であるプロテアーゼによって切断することができる配列である。そのような場合、ＢＰＸＴＥＮは、プロドラッグまたはＢＰの循環するデポーとして役立ち得る。本発明によって企図される切断部位の例としては、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ－２、グランザイムＢ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７、もしくはＭＭＰ－２０から選択される哺乳動物の内因性プロテアーゼ、または非哺乳動物プロテアーゼ、例えばＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）、およびソルターゼＡによって切断可能であるポリペプチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。前述のプロテアーゼによって切断されることが公知である配列は、当技術分野で公知である。例示的な切断配列および配列内の切断部位を、配列バリアントと共に表５に表す。例えば、トロンビン（活性化凝固因子ＩＩ）は、配列ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２３０）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３６： Ｄ３２０］に作用し、配列は配列の４位のアルギニン後で切断される。同様に、内因性のプロテアーゼの作用を受ける他の配列をＢＰＸＴＥＮに組み込むと、ＢＰの持続的放出を提供し、これはある特定の場合では、ＢＰＸＴＥＮの「プロドラッグ」形態からＢＰの高い程度の活性を提供し得る。
一部の場合では、切断部位の両側に隣接する２つまたは３つのアミノ酸のみ（全体で４～６個のアミノ酸）が切断配列に組み込まれるであろう。他の場合では、公知の切断配列は、１つもしくは複数の欠失もしくは挿入、または既知の配列中のいずれか１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸の、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸への置換を有し得るが、ここで欠失、挿入、または置換は、プロテアーゼに対する感受性の低減または増強をもたらすがプロテアーゼに対する感受性の消失はもたらさず、ＸＴＥＮからのＢＰの放出速度を調整する能力をもたらす。例示的な置換を表５に示す。
表５： プロテアーゼ切断配列
Figure 2023531496000018
Figure 2023531496000019
 ↓は、切断部位を示す
ＮＡ： 該当しない
＊ スラッシュの前、間、または後の複数のアミノ酸の記載は、その位置で置換することができる代替アミノ酸を示し；「－」は、任意のアミノ酸が、中央の縦列に示される対応するアミノ酸の代わりに置換され得ることを示す。
別の態様では、本開示は、複数の放出セグメント（ＲＳ）を含む融合タンパク質であって、各々のＲＳ配列が、表６に記載される配列の群から選択され、ＲＳが、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される１～６個のアミノ酸によって互いに連結される融合タンパク質を提供する。一実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＳおよび第１のＲＳとは異なる第２のＲＳを含み、各々のＲＳ配列は、表６に記載される配列の群から選択され、ＲＳは、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される１～６個のアミノ酸によって互いに連結される。別の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＳ、第１のＲＳとは異なる第２のＲＳ、および第１のＲＳおよび第２のＲＳとは異なる第３のＲＳを含み、各々の配列は、表６に記載される配列の群から選択され、第１および第２および第３のＲＳは、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される１～６個のアミノ酸によって互いに連結される。融合タンパク質の複数のＲＳを鎖状につないで、異なる切断速度または切断効率で複数のプロテアーゼによって切断され得る配列を形成することができることが具体的に企図される。別の実施形態では、本開示は、表６および７に記載される配列の群から選択されるＲＳ１およびＲＳ２、ならびに本開示から選択されるＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２を含む融合タンパク質であって、ＲＳ１はＸＴＥＮ１と結合部分との間に融合され、ＲＳ２はＸＴＥＮ２と結合部分との間に融合される融合タンパク質を提供する。そのような組成物は、健康な組織、または正常な循環にある場合と比較して複数のプロテアアーゼを発現する疾患を有する標的組織によってより容易に切断され、その結果、結合部分を有する得られた断片が、標的組織、例えば腫瘍により容易に侵入し、標的組織およびエフェクター細胞（または単一の結合部分を有するように設計される融合タンパク質の場合には標的細胞のみ）に結合および連結する増強された能力を有することが企図される。一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、融合タンパク質）が放出セグメントを含む場合、放出セグメント（ＲＳ）は、表６～７に記載される配列から選択される配列に対して少なくとも８２％、少なくとも８８％、少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、融合タンパク質）は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＸＴＥＮ－ＲＳ－サイトカイン、またはサイトカイン－ＲＳ－ＸＴＥＮの構造配置を有し得る。
表６． 放出セグメントの配列
Figure 2023531496000020
Figure 2023531496000021
Figure 2023531496000022
 表７． 放出セグメントの配列
Figure 2023531496000023
Figure 2023531496000024
Figure 2023531496000025
Figure 2023531496000026
Figure 2023531496000027
Figure 2023531496000028
Figure 2023531496000029
Figure 2023531496000030
Figure 2023531496000031
Figure 2023531496000032
本開示のＲＳは、がん、自己免疫疾患、炎症疾患、および組換えポリペプチドの局所的活性化が望ましい他の状態の処置のための治療薬として組換えポリペプチドに含めるために有用である。本発明の組成物は、アンメットニーズに対処し、注射時に活性である従来の抗体治療薬または二特異性抗体治療薬と比較して、増強された終末相半減期、標的化送達、および健康な組織に対して低減された毒性を有する改善された治療比を含む１つまたは複数の態様において優れている。
一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれるＢＰは、表３または表Ａからの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは表３または表Ａからの配列と比較して少なくとも約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％の配列同一性を示す配列を有し得る。前述の実施形態のＢＰを、アッセイ、または本明細書に記載される測定もしくは決定されたパラメーターを使用して活性に関して評価することができ、対応する天然のＢＰ配列と比較して少なくとも約４０％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、またはそれより高い活性を保持する配列は、本発明のＢＰＸＴＥＮに含めるために好適であると考えられる。好適なレベルの活性を保持することが見出されたＢＰを、本明細書で上記の１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドに連結することができる。一実施形態では、好適なレベルの活性を保持することが見出されたＢＰを、表２ａ～２ｂからの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する、あるいは表２ａ～２ｂの配列と比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチドに連結して、キメラ融合タンパク質をもたらすことができる。
本開示は、表２ａ～２ｂから選択される同じまたは異なり得る１つまたは２つのＸＴＥＮに連結した表３または表Ａから選択される他のＢＰの置換を企図する。この段落に記載される上記の前述の融合タンパク質では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、表５からの切断配列をさらに含み得て；切断配列は、ＢＰとＸＴＥＮとの間、または隣接するＢＰ間に位置する。一部の場合では、切断配列を含むＢＰＸＴＥＮはまた、プロテアーゼのアクセスを容易にするためにＢＰと切断配列の間、またはＸＴＥＮと切断配列の間に１つまたは複数のスペーサー配列アミノ酸を有し、スペーサーアミノ酸は、好ましいアミノ酸としてグリシンおよびアラニンを含む任意の天然アミノ酸を含む。
標的化部分
ある特定の実施形態では、本発明のＸＰＡＣは、ＸＰＡＣを腫瘍上に発現される抗原に結合させる腫瘍標的化部分をさらに含み得ることが企図される。これは、体内でのその動きに影響を及ぼすためにキメラポリペプチド（ＸＰＡＣ）に１つのさらなるドメインを含めることによって達成することができる。例えば、キメラ核酸は、体における位置、例えば腫瘍細胞または炎症部位にポリペプチドを方向付けるドメインをコードすることができる。例示的なおよび好適な標的化部分ドメインは、炎症組織において過剰発現される同族のリガンド、例えばＩＬ－１受容体またはＩＬ－６受容体を有するドメインを含む。他の実施形態では、好適な標的化部分は、腫瘍組織において過剰発現される同族のリガンド、例えばＥｐｃａｍ、ＣＥＡ、または、メソテリンを有する部分を含む。一部の実施形態では、標的化ドメインは、作用部位で切断されて（例えば、炎症またはがん特異的プロテアーゼによって）、所望の部位でサイトカインの完全な活性を放出するリンカーを介してサイトカインに連結される。一部の実施形態では、標的化および／または保持ドメインは、作用部位で切断されない（例えば、炎症またはがん特異的プロテアーゼによって）リンカーを介してインターロイキンに連結され、サイトカインを所望の部位で留まらせる。
特に好ましい標的化部分は、疾患を有する細胞または組織、例えば腫瘍またはがん細胞の表面上に発現される抗原を標的とする。腫瘍の標的化および保持のために有用な抗原としては、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、およびＣＥＡが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に開示される医薬組成物はまた、疾患を有する細胞または組織上に発現されることが公知である２つの異なる標的抗原に結合する２つの標的化および／または保持ドメインを含むタンパク質も含む。例示的な抗原結合ドメイン対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、およびＨＥＲ－２／ＨＥＲ－３が挙げられるがこれらに限定されない。
好適な標的化部分としては、抗原結合ドメイン、例えばポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えばγ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、およびラクダ型ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｄＡｂ等を含む抗体およびその断片が挙げられる。他の好適な抗原結合ドメインとしては、抗体結合および／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えばアンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、および他の操作された足場構造に基づく結合ドメイン、例えばＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン、およびＣＴＬＡ４足場構造が挙げられる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例としては、所望の受容体のリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、および１つまたは複数の標的抗原に結合または会合するペプチドが挙げられる。
一部の実施形態では、標的化部分は、細胞表面分子に特異的に結合する。一部の実施形態では、標的化および／または保持ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、標的化ポリペプチドは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、トロホブラスト糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ、米国特許出願公開第２０２００３９７９１５号を参照されたい）、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＣＧＳ－２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、およびＦＯＬＲ１の少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的におよび独立して結合する。一部の実施形態では、標的化ポリペプチドは、２つの異なる抗原に特異的におよび独立して結合し、抗原の少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、およびＦＯＬＲ１から選択される腫瘍抗原である。
標的化抗原は、腫瘍細胞上に発現される腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原は、当技術分野で周知であり、例えばＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、およびＣＥＡ．５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、ＷＴ１が挙げられる。
標的化抗原は、免疫チェックポイントタンパク質であり得る。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ－１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、またはＶＩＳＴＡが挙げられるがこれらに限定されない。
標的化抗原は、細胞表面分子、例えばタンパク質、脂質、または多糖であり得る。一部の実施形態では、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、傷害を受けた赤血球、動脈プラーク細胞、炎症または線維組織細胞上のそのような抗原。そのような抗原は、例えば、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３、またはＧＩＴＲを含むがこれらに限定されない免疫応答調節因子を含み得る。
ＢＰＸＴＥＮの薬物動態特性
本発明は、本明細書に記載される方法によって組成物に関して決定された用量で使用した場合に、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰの同等用量と比較して、薬理効果をもたらす循環中濃度を達成することができるが、なおも長期間にわたって組成物の生物活性構成要素が安全性範囲内にある、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して増強された薬物動態を有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。そのような場合、ＢＰＸＴＥＮは、長期間にわたって融合タンパク質組成物の治療域内に留まる。本明細書で使用される場合、「同等用量」は、比較可能な様式で対象に投与される活性なＢＰファーマコフォアに関する同等モル／ｋｇでの用量を意味する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の「同等投与量」は、作用剤のより大きい重量を表すが、融合タンパク質の用量中のＢＰの本質的に同じモル当量を有する、および／またはＢＰと比較して同じ概算モル濃度を有すると理解される。
所定のＸＴＥＮをＢＰに連結することによって増強され得るＢＰの薬物動態特性としては、終末相半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ、分布容積、および生物学的利用能が挙げられる。
ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態特徴に関する実施例により詳しく記載されるように、ＸＴＥＮ配列の長さを増加させることが、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の終末相半減期の不釣り合いな増加を付与し得ることが意外にも発見された。したがって、本発明は、ＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質であって、ＸＴＥＮが、対象に投与されるＢＰＸＴＥＮ組成物の標的半減期を提供するように選択することができる融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮを含む単量体融合タンパク質であって、ＸＴＥＮが、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して投与されたＢＰＸＴＥＮの終末相半減期の少なくとも約２倍長い、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１５倍、または融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して少なくとも２０倍もしくはそれより長い終末相半減期の増加を付与するように選択される融合タンパク質を提供する。同様に、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較してＡＵＣの少なくとも約５０％の増加、またはＡＵＣの少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％の増加を有し得る。ＢＰＸＴＥＮの薬物動態パラメーターは、投与、一定時間に血液試料を採取すること、およびＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ラジオアッセイ、または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される他の方法を使用するタンパク質のアッセイの後に、データの標準的な計算によって半減期および他のＰＫパラメーターを誘導することを含む標準的な方法によって決定することができる。
本発明は、必要に応じて切断配列をさらに含み得るスペーサー配列によって隔てられた、または第２のＸＴＥＮ配列によって隔てられた、第１および第２のＢＰ分子を含むＢＰＸＴＥＮをさらに提供する。一実施形態では、ＢＰは、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、融合タンパク質に連結した場合により低い活性を有する。そのような場合、ＢＰＸＴＥＮは、対象に投与した場合に、ＢＰ構成要素が切断配列（複数可）の切断によって徐々に放出され、そこでそれが活性を再度獲得するか、またはその標的受容体もしくはリガンドの結合能を再度獲得するように設計することができる。したがって、前述のＢＰＸＴＥＮは、プロドラッグまたは循環するデポーとして役立ち、融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較してより長い終末相半減期をもたらす。
本明細書で記載されるように、例示的な実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、ＢＰがサイトカインであるＸＰＡＣである。好ましい実施形態では、ＸＰＡＣの状況でのサイトカインポリペプチドの活性は減弱されており、所望の活性部位、例えば腫瘍微小環境でのプロテアーゼによる切断により、ＸＰＡＣよりサイトカイン受容体アゴニストとしてさらに活性であるサイトカインの形態がＸＰＡＣから放出される。例えば、融合ポリペプチドのサイトカイン－受容体活性化（アゴニスト）活性は、個別の分子実体としてのサイトカインポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性より少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍低い活性であり得る。ＸＰＡＣの一部であるサイトカインポリペプチドは、サイトカインポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸を含有する場合に個別の分子実体として存在し、追加のアミノ酸を実質的に含まず、他の分子と会合しない（共有結合または非共有結合によって）。必要であれば、個別の分子実体としてのサイトカインポリペプチドは、一部の追加のアミノ酸配列、例えば発現および／または精製を助けるためのタグまたは短い配列を含み得る。
他の例では、融合ポリペプチドのサイトカイン－受容体活性化（アゴニスト）活性は、ＸＰＡＣ中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって産生されるサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性より少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または約１０００倍低い。言い換えれば、ＸＰＡＣ中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって産生されるサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、ＸＰＡＣのサイトカイン受容体活性化活性より少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍高い。
ＢＰＸＴＥＮの薬理学および薬学的特性
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して増強された特性を有し得る、ＸＴＥＮに共有結合で連結されているＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ組成物、ならびに組成物のそれぞれ２つのＢＰ成分の治療および／もしくは生物活性または治療および／もしくは生物学的効果を増強するための方法を提供する。加えて、本発明は、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短い長さのポリペプチド、および／または反復配列を有するポリペプチドパートナーを含有する、当技術分野において公知の融合タンパク質と比較して、増強された特性を有するＢＰＸＴＥＮ組成物を提供する。加えて、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＰＥＧ化構築物などの化学的コンジュゲートに勝る有意な利点を提供し、この利点は、特に、組換えＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を細菌細胞発現系において作製することができること、これにより製品の研究および開発段階と製造段階の両方における時間を短縮することおよびコストを削減することができ、ならびにＢＰＸＴＥＮの産物と代謝物の両方の毒性がＰＥＧ化コンジュゲートと比較して低い、より均一な、定義された製品をもたらすことができることである。
治療剤として、ＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮを含まない治療薬に勝るいくつかの利点を有することができ、この利点には、例えば、溶解度の上昇、熱安定性の増大、免疫原性の低下、見掛けの分子量の増加、腎クリアランスの低減、タンパク質分解の低減、代謝の低減、治療効率の向上、より少ない有効治療用量、バイオアベイラビリティの増加、ＢＰの治療域内に血液レベルを維持するための投与間の時間の増加、「調整された」吸収速度、増強された凍結乾燥安定性、増強された血清／血漿安定性、終末期半減期の増加、血流への溶解度の増加、中和抗体による結合の減少、受容体媒介クリアランスの減少、副作用の低減、受容体／リガンド結合親和性または受容体／リガンド活性化の保持、分解安定性、凍結融解安定性、プロテアーゼ安定性、ユビキチン化安定性、投与の容易さ、他の薬学的賦形剤または担体との適合性、対象における残留性、貯蔵安定性の増大（例えば、半減期の増加）、生物または環境における毒性の低減などが含まれる。これらの強化された特性の正味の効果は、ＢＰＸＴＥＮが、代謝性疾患または障害に罹患している対象に投与されたとき、増強された治療効果および／または生物学的効果をもたらすことができることである。
ＢＰの薬学的または物理化学的特性（例えば、水溶解度または安定度）の増強が望ましい、他の場合、第１および第２の融合タンパク質の第１および第２のＸＴＥＮ配列の長さおよび／またはモチーフファミリー組成物を、ＢＰＸＴＥＮ組成物の全体的な薬学的特性を強化するためにそれぞれの融合タンパク質に異なる溶解度および／または安定度をそれぞれ付与するように選択することができる。本明細書に記載される方法を使用して、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を構築し、アッセイして、物理化学的特性を確認することができ、ＸＴＥＮを、必要に応じて、所望の特性が得られるように調整することができる。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質が、融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して少なくとも約２５％高い範囲内である水溶解度、または融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰより少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約１００％％、もしくは少なくとも約２００％、もしくは少なくとも約３００％、もしくは少なくとも約４００％、もしくは少なくとも約５００％、もしくは少なくとも約１０００％高い水溶解度を有するように選択される。この段落の上文に記載の実施形態では、融合タンパク質のＸＴＥＮは、表２ａ～２ｂから選択されるＸＴＥＮに対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または約９０％、もしくは約９１％、もしくは約９２％、もしくは約９３％、もしくは約９４％、もしくは約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％～約１００％の配列同一性を有し得る。
一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰの同等投与量と比較してより長期間、治療域内にＢＰ成分を維持することができる、ＢＰＸＴＥＮ組成物を提供する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の「同等投与量」が、薬剤のより大きい重量を表すことになるが、融合タンパク質の用量中のＢＰと同じ近似的モル当量を有することになり、および／またはＢＰに対して同じ近似的モル濃度を有することになることは、当技術分野において理解されるであろう。
本発明は、用量の選択とマッチさせたときに、ＢＰの循環濃度を、拡張された期間、治療域内に維持することによって投与された組成物の増強された有効性を可能にする所望の薬物動態特性を提供するためのコンジュゲーションに適しているＸＴＥＮを選択するための方法も提供する。本明細書で使用される場合、「治療域」は、許容できない毒性を伴うことなく疾患または状態に対する有効性または所望の薬理効果を経時的にもたらす血液または血漿濃度範囲；いずれかの好ましい治療効果を実現する最小量と、対象への（より高い用量または濃度で）毒性直前の応答である応答をもたらす最大量との間の循環血液濃度の範囲としての、薬物または生物製剤の量を意味する。加えて、治療域は、時間の態様；許容できない毒性も有害事象ももたらさない所望の薬理効果を経時的にもたらす最大および最小濃度を、一般に包含する。治療域内に留まる、対象に投与される組成物を、「安全性範囲」内にあると言うこともできるだろう。
用量最適化は、すべての薬物にとって、特に、狭い治療域を有する薬物にとって重要である。例えば、グルコース恒常性に関与する多くのペプチドは、狭い治療域を有する。狭い治療域を有するＢＰ、例えば、グルカゴンまたはグルカゴンアナログの場合、様々な症状を提示するすべての患者のための標準化された単一用量が必ずしも有効であるとは限らないことがある。異なるグルコース調節ペプチドが、多くの場合、糖尿病対象の処置に併用されるので、それらを組み合わせて一緒に投与することにより達成される各々の効果および相互作用の効果の作用強度も考慮にいれなければならない。許容できない毒性をもたらすことになる量およびＢＰＸＴＥＮを安全性範囲外のものにすることになる量に対して、ＢＰＸＴＥＮの治療有効量または薬理学的有効量を決定する目的でこれらの因子を考慮することは、十分に一般的な熟練臨床医の専門内である。
多くの場合、対象組成物のＢＰ成分の治療域は、確立されており、公開文献で入手可能であるか、またはＢＰを含有する承認された製品の医薬品表示に記述されている。他の場合には、治療域を確立することができる。所与の組成物の治療域を確立するための方法は、当業者には公知である（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ （２００５）を参照されたい）。例えば、標的疾患または障害に罹患している対象における用量漸増研究を使用して、有効性または望ましい薬理効果、有害事象の出現を決定すること、および循環血液レベルの決定により、所与の対象または対象の集団のための治療域を、所与の薬物もしくは生物製剤、または生物製剤もしくは薬物の組合せについて決定することができる。用量漸増研究は、代謝性疾患もしくは障害に関連する１つもしくは複数のパラメーターまたは特定の適応症についての有益な転帰に関連する臨床パラメーターについて当技術分野において公知のまたは本明細書に記載されるような生理学的または生化学的パラメーターを、決定または導出された循環血中レベルを確立する薬理学的パラメーターの測定値と一緒に、非有効用量、有害事象、最大耐用用量などを決定するための観察および／または測定パラメーターと一緒にモニターする、対象または対象の群における代謝研究によって、ＢＰＸＴＥＮの活性を評価することができる。次いで、結果を、治療薬の投与される用量、および前述の決定されたパラメーターまたは効果レベルと一致する治療薬の血中濃度と、相関させることができる。これらの方法により、用量および血中濃度の範囲を、最小有効用量ならびに最大用量および血中濃度（所望の効果が生じ、それより高いと毒性が生じる用量および濃度）と相関させることによって、投与治療薬の治療域を確立することができる。この最大値より高い融合タンパク質の（またはＢＰ成分により測定されるような）血中濃度は、治療域外または安全性範囲外と見なされることになる。したがって、前述の方法により、それより低いとＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質が所望の薬理効果を発揮しないＣｍｉｎ血中レベルが確立されることになり、ＢＰＸＴＥＮを安全性範囲外のものにする許容できない副作用、毒性または有害事象を惹起する濃度に達する前の最高循環濃度を意味するＣｍａｘ血中レベルが確立されることになる。確立されたそのような濃度を用いて、投与の頻度および投与量をＣｍａｘおよびＣｍｉｎの測定値によってさらに洗練して、融合タンパク質を治療域内に保つための適切な用量および投与頻度を得ることができる。当業者は、本明細書で開示される手段により、または当技術分野において公知の他の方法により、投与されたＢＰＸＴＥＮが、所望の間隔にわたって治療域内に留まっていること、またはＸＴＥＮの用量もしくは長さもしくは配列の調整を必要とすることを確認することができる。さらに、ＢＰＸＴＥＮを治療域内に保つための適切な用量および投与頻度の決定は、治療有効用量レジメン；治療域内に留まっている連続するＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフを生じさせる結果となる、融合タンパク質の治療有効用量を使用する、複数の連続用量を投与することを必要とする対象への複数の連続用量の投与のためのスケジュールを確立し、その結果、標的疾患、障害または状態に関連する少なくとも１つの測定パラメーターの改善をもたらす。一部の場合には、対象に適切な用量で投与されたＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていない、同等用量で投与された対応するＢＰと比較して、少なくとも約２倍長い期間か、代替的にＸＴＥＮに連結されていない、同等用量で投与された対応するＢＰと比較して、少なくとも約３倍長い、代替的に少なくとも約４倍長い、代替的に少なくとも約５倍長い、代替的に少なくとも約６倍長い、代替的に少なくとも約７倍長い、代替的に少なくとも約８倍長い、代替的に少なくとも約９倍長い、または少なくとも約１０倍長い、またはそれを超える期間、治療域内に留まるＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度をもたらし得る。本明細書で使用される場合、「適切な用量」は、対象に投与されたとき、望ましい治療または予防効果および治療域内の血中濃度を生じさせる結果となる、薬物または生物製剤の用量を意味する。
一実施形態では、治療有効用量レジメンで投与されたＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質の血中レベルの少なくとも２つの連続するＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間の、融合タンパク質に連結されていない、同等用量レジメンで対象に投与された融合タンパク質の対応する生物活性タンパク質と比較して、少なくとも約３倍長い、代替的に少なくとも約４倍長い、代替的に少なくとも約５倍長い、代替的に少なくとも約６倍長い、代替的に少なくとも約７倍長い、代替的に少なくとも約８倍長い、代替的に少なくとも約９倍長い、または少なくとも約１０倍長い時間内に増加を生じさせる結果となる。別の実施形態では、治療有効用量レジメンで投与されたＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されていない、ＢＰについての治療有効用量レジメンを使用して対象に投与された対応する生物活性タンパク質成分と比較して、医薬組成物の融合タンパク質のモルでのより低頻度の投与またはより少ない総投与量を使用して、１つ、または２つ、または３つ、またはそれより多くの測定パラメーターの同等の改善を生じさせる結果となる。測定パラメーターは、本明細書で開示される臨床的、生化学的もしくは生理的パラメーターのいずれか、またはグルコースもしくはインスリン関連障害、代謝性疾患もしくは障害、凝固もしくは出血障害、または成長ホルモン関連障害に罹患している対象を評価するための当技術分野において公知の他のパラメーターを含み得る。
結果として得られる機能的特徴または生物および薬理活性ならびに生物学的および薬理学的パラメーターを含む、本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物の活性は、所望の特徴を測定するための当技術分野において公知の任意の好適なスクリーニングアッセイにより決定することができる。ＢＰ成分を含むＢＰＸＴＥＮポリペプチドの活性および構造を、本明細書に記載されるアッセイにより、または当技術分野において公知の方法により測定して、溶解度、構造、および生物活性の保持を確認することができる。結合定数（Ｋｄ）、ＥＣ５０値、およびリガンド－受容体複合体の解離についてのそれらの半減期（Ｔ１／２）をはじめとするＢＰ受容体またはリガンドに対するＢＰＸＴＥＮの結合特徴の決定を可能にする、アッセイを行うことができる。結合親和性は、例えば、受容体またはリガンドに特異的に結合する能力の変化を検出する競合型結合アッセイにより、測定することができる。加えて、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴などの技法を使用して、結合事象を検出することができる。アッセイは、可溶性受容体分子を含むこともあり、または細胞により発現される受容体への結合を判定することもある。そのようなアッセイは、増殖、細胞死、アポトーシスおよび細胞遊走についてのアッセイを含む、細胞に基づくアッセイを含み得る。他の可能なアッセイは、発現されたポリペプチドの受容体結合を判定することができ、このアッセイは、可溶性受容体分子を含むこともあり、または細胞により発現される受容体への結合を判定することもある。対応するＢＰの標的受容体またはリガンドに対するＢＰＸＴＥＮの結合親和性は、結合もしくは競合的結合アッセイ、例えば、米国特許第５，５３４，６１７号に記載されているような、チップに結合した受容体もしくは結合タンパク質を用いるＢｉａｃｏｒｅアッセイ、またはＥＬＩＳＡアッセイ；本明細書の実施例に記載されるアッセイ；放射性受容体アッセイ；あるいは当技術分野において公知の他のアッセイを使用して、アッセイすることができる。加えて、ＢＰ配列バリアント（単一の成分としてまたはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）を、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して天然ＢＰと比較して、それらが、天然ＢＰと、またはそれらをＢＰＸＴＥＮに含めるのに好適であるその何らかの画分と、同じ結合特異性および親和性を有するかどうかを、判定することができる。
本発明は、ＢＰＸＴＥＮによるＢＰ標的受容体またはリガンドに対する結合親和性が、ＸＴＥＮに結合されていない天然ＢＰの、標的受容体またはリガンドに対する親和性の少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％、またはそれより高い％であり得る、単離されたＢＰＸＴＥＮを提供する。一部の場合には、対象ＢＰＸＴＥＮと、ＢＰＸＴＥＮの天然受容体またはリガンドとの結合親和性Ｋｄは、ＢＰＸＴＥＮと天然受容体またはリガンドとの結合親和性の少なくとも約１０－４Ｍ、代替的に少なくとも約１０－５Ｍ、代替的に少なくとも約１０－６Ｍ、または少なくとも約１０－７Ｍである。
本開示の組成物（例えば、融合タンパク質）がサイトカインを含む一部の実施形態では、サイトカイン（融合タンパク質中でＸＴＥＮに連結されている場合）の、対応するサイトカイン受容体への結合活性は、サイトカイン（ＸＴＥＮに連結されていない場合）の対応する結合活性を特徴付けるＥＣ５０より少なくとも（約）１．１倍高い、少なくとも（約）１．２倍高い、少なくとも（約）１．３倍高い、少なくとも（約）１．４倍高い、少なくとも（約）１．５倍高い、少なくとも（約）１．６倍高い、少なくとも（約）１．７倍高い、少なくとも（約）１．８倍高い、少なくとも（約）１．９倍高い、または少なくとも（約）２．０倍高い半数効果濃度（ＥＣ５０）によって特徴付けられ得る。一部の実施形態では、サイトカイン（融合タンパク質中でＸＴＥＮに連結されている場合）の、対応するサイトカイン受容体への結合活性は、サイトカイン（ＸＴＥＮに連結されていない場合）の対応する結合活性を特徴付けるＥＣ５０より（約）１．１倍高い、（約）１．２倍高い、（約）１．３倍高い、（約）１．４倍高い、（約）１．５倍高い、（約）１．６倍高い、（約）１．７倍高い、（約）１．８倍高い、（約）１．９倍高い、もしくは（約）２．０倍高い、または前述のいずれか２つの間の範囲の、半数効果濃度（ＥＣ５０）により特徴付けられ得る。一部の実施形態では、ＥＣ５０値をｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイで決定することができる。一部の実施形態では、サイトカインは、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）であり得、対応するサイトカイン受容体は、インターロイキン１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）であり得る。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、遺伝子操作されたレポーター遺伝子細胞系であって、レポータータンパク質の比例的発現を伴って、サイトカインが対応するサイトカイン受容体への結合に応答するように構成された細胞系を利用することができる。用語「ＥＣ５０」は、一般に、活性物質の最大の生物学的応答の半分を達成するために必要な濃度を指し、一般に、本明細書に記載される実施例の方法を含む、ＥＬＩＳＡまたは細胞に基づくアッセイによって決定され得る。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、レポーター遺伝子活性アッセイ（例えば、実施例８で開示されるもの）であり得る。例えば、例示的なレポーター遺伝子活性アッセイは、目的の受容体および目的のシグナル伝達経路に適切な遺伝子を安定的に導入することにより、操作された受容体への結合が、操作された遺伝子経路の活性化、それに伴うその後のシグネチャーポリペプチド（例えば、酵素）の産生につながる、シグナル伝達カスケードを誘発するように生成された、遺伝子操作された細胞に基づき得る。
他の場合、本発明は、融合タンパク質が、標的受容体に高い親和性で結合することによって天然リガンドに対する拮抗活性が生じる結果となるように設計されている、単離されたＢＰＸＴＥＮを提供する。そのようなＢＰＸＴＥＮの非限定的な例は、ＩＬ－１受容体に結合するように構成されており、したがって、結合組成物がＩＬ－１αおよび／またはＩＬ－１βのＩＬ－１受容体への結合に実質的に干渉する、ＩＬ－１ｒａＸＴＥＮである。ある特定の場合には、標的受容体への天然リガンドの結合を伴うアンタゴニストＢＰＸＴＥＮ（例えば、これに限定されるものではないが、ＩＬ－１ｒａＸＴＥＮ）による干渉は、少なくとも約１％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９９％、または約１００％であり得る。他の実施形態では、本発明は、細胞受容体への単離された融合タンパク質の結合が、ＢＰＸＴＥＮアンタゴニストが結合した細胞のシグナル伝達経路の活性化を、天然リガンドにより惹起される活性化と比較して２０％未満、または１０％未満、または５％未満惹起する、単離されたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（例えば、これに限定されるものではないが、ＩＬ－１ｒａＸＴＥＮ）を提供する。他の場合には、拮抗ＢＰＸＴＥＮ組成物は、標的受容体に、約１０ｎＭもしくはそれ未満、約５ｎＭもしくはそれ未満、約１ｎＭもしくはそれ未満、約５００ｐＭもしくはそれ未満、約２５０ｐＭもしくはそれ未満、約１００ｐＭもしくはそれ未満、約５０ｐＭもしくはそれ未満、または約２５ｐＭもしくはそれ未満の解離定数で結合する。拮抗ＢＰＸＴＥＮの具体的な構築物の非限定的な例としては、ＩＬ－１ｒａ－ＡＭ８７５、ＩＬ－１ｒａ－ＡＥ８６４、またはＩＬ－１ｒａ－ＡＭ１２９６を挙げることができる。
一部の場合には、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、代謝性状態および障害の処置および予防における天然ＢＰの使用に伴う公知のまたは使用に関連するｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性または薬理効果に関して、融合タンパク質に連結されていない、対応するＢＰの生物活性の少なくとも約１０％、または約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％を保持する。前述の実施形態の一部の場合には、ＢＰ成分の活性は、無傷のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質により実現され得るが、他の場合には、ＢＰ成分の活性は、主として、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれた切断配列に対して作用するプロテアーゼの作用による融合タンパク質からのＢＰの切断および放出時に実現されることになる。前述の場合、図３Ａ～図３Ｅに示されているように、上記でさらに十分に説明されたように、ＸＴＥＮに結合されているときには受容体またはリガンドに対するＢＰ成分の結合親和性を低減させるが、ＢＰＸＴＥＮ配列に組み込まれた切断配列の切断によってＸＴＥＮから放出されたときには親和性の増大を有するように、ＢＰＸＴＥＮを設計することができる。
他の場合には、ＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されているときにＢＰ成分の結合親和性を低減させて、例えば、対象に投与されたＢＰＸＴＥＮの終末相半減期を、受容体媒介クリアランスを低減することにより、増加させるように、または投与された組成物に起因する毒性もしくは副作用を低減するように、設計される。ＸＴＥＮに連結されていないＢＰの毒物学的に効果のない用量または血中濃度の場合（天然ペプチドは副作用をもたらす可能性が高いことを意味する）、本発明は、融合タンパク質が、ＢＰ成分の生物学的作用強度または生物活性を低減するように構成されている、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
一部の場合には、ＢＰＸＴＥＮを、その立体配置が対応するＢＰ成分の結合親和性の低減をもたらさないＢＰＸＴＥＮの活性と比較して、実質的に低減された結合親和性（Ｋｄとして表される）および対応する低減された生物活性を有するように構成することができること、およびそのような立体配置が、長い終末相半減期も提示し、十分な生物活性度も保持する組成物を有する点で有利であることが、判明した。ＢＰ（例えば、ＩＬ－１０）のＣ末端への単一のＸＴＥＮの連結は、その標的受容体への有意な結合親和性の保持をもたらすことができ、Ｎ末端へのＸＴＥＮの連結は、その結合親和性および対応する生物活性を、ＸＴＥＮがＣ末端に結合されている構築物と比較して減少させる。別の例では、実施例で説明されるように、ＸＴＥＮ分子のＣ末端へのＢＰの連結は、ＢＰ受容体への結合に実質的に干渉しないが、同じ分子のＣ末端への第２のＸＴＥＮの付加（ｈＧＨのＣ末端への第２のＸＴＥＮの配置）は、ＢＰ受容体へのその分子の親和性を低減し、ＸＴＥＮ－ＢＰ立体配置と比較して、ＸＴＥＮ－ＢＰ－ＸＴＥＮ立体配置の終末相半減期の増加ももたらすことが判明した。ＢＰのその標的受容体への結合親和性を低減する能力は、特定のＢＰに遊離Ｎ末端またはＣ末端を有するための要件に依存し得る。従って、本発明は、少なくとも第１の生物活性タンパク質と１つまたは複数のＸＴＥＮとを含む成分の特定のＮ末端からＣ末端への立体配置を有する一本鎖融合タンパク質構築物を産生することにより、ＢＰＸＴＥＮの終末相半減期を増加させるための方法であって、生物活性タンパク質およびＸＴＥＮ成分の第１のＮ末端からＣ末端への立体配置の融合タンパク質が、第２のＮ末端からＣ末端への立体配置と比較して、低減された受容体媒介クリアランス（ＲＭＣ）および終末相半減期の対応する増加を有する、方法を提供する。前述の方法の一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、Ｎ末端からＣ末端へＢＰ－ＸＴＥＮとして構成される。上述の方法の別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、構成ＸＴＥＮ－ＢＰである。上述の方法の別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、構成ＸＴＥＮ－ＢＰ－ＸＴＥＮである。後述の実施形態では、２つのＸＴＥＮ分子は同一であり得、またはそれらは、異なる配列組成もしくは長さのものであり得る。単一のＢＰに連結された２つのＸＴＥＮを有する、前述の実施形態の非限定的な例。１つのＸＴＥＮに連結された１つのＢＰを有する上述の実施形態の非限定的な例としては、ＡＭ８７５－ＩＬ－１ｒａ、ＡＥ８６４－ＩＬ－１ｒａ、ＡＭ８７５－ＩＬ１０、またはＡＥ８６４－ＩＬ１０が挙げられる。本発明は、表３または表ＡからのＢＰ、および表２ａ～２ｂからのＸＴＥＮが上述の例のそれぞれの成分の代わりに用いられている、他のそのような構築物であって、それぞれの成分の代替立体配置と比較して、低減された受容体媒介クリアランスを有するように構成された構築物を企図している。
一部の場合には、方法は、低減された受容体媒介クリアランスが、ＲＭＣが低減されない第２の立体配置のＢＰＸＴＥＮの半減期と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍の終末相半減期の増加をもたらすことができる、構成ＢＰＸＴＥＮを提供する。本発明は、ＢＰリガンドを活用し、オンレートの減少またはオフレートの増加のどちらかの結果としての受容体への結合親和性の低減を、Ｎ末端またはＣ末端のどちらかを妨害すること、およびその末端を、別のＢＰであるか、ＸＴＥＮであるか、またはスペーサー配列であるかを問わず、組成物の別のポリペプチドへの連結部として使用することにより、生じさせることができる。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の特定の立体配置の選択は、受容体への結合親和性度を低下させることができ、その結果、受容体媒介クリアランス率の低下を達成することができる。一般に、受容体の活性化は、ＲＭＣに連動しており、したがって、活性化を伴わないポリペプチドのその受容体への結合はＲＭＣに至らないが、受容体の活性化はＲＭＣに至る。しかし、一部の場合には、特に、リガンドがオフレートの増加を有する場合、それにもかかわらず、リガンドは、受容体媒介クリアランスを誘発することなく細胞シグナル伝達を開始させるのに十分なほど結合することができ、その結果、ＢＰＸＴＥＮは、生体利用可能な状態を保持する。そのような場合、構成ＢＰＸＴＥＮは、より高いＲＭＣ度をもたらす立体配置と比較して、増加された半減期を有する。
結合親和性の低減が、受容体媒介クリアランスを低減するために所望されるが、生物活性の少なくとも一部分の保持が所望される場合、それでもやはり、所望の受容体活性化を達成するために十分な結合親和性を維持しなければならないことは明らかである。それ故、一実施形態では、本発明は、ＢＰＸＴＥＮの標的受容体に対する結合親和性が、結合親和性が低減されていない立体配置の対応するＢＰＸＴＥＮと比較して、約０．０１％～４０％、または０．１％～３０％、または約１％～２０％の範囲である、ＢＰＸＴＥＮを提供する。したがって、構成ＢＸＴＥＮの結合親和性は、同等の条件下で判定される、ＢＰ成分の標的受容体への結合親和性が低減されていない立体配置の対応するＢＰＸＴＥＮの結合親和性と比較して、または融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して、好ましくは、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％低減される。別の言い方をすれば、構成ＢＰＸＴＥＮのＢＰ成分は、ＢＰ成分の結合親和性が低減されていない立体配置のＢＰＸＴＥＮの対応するＢＰ成分の結合親和性のわずか約０．０１％であるか、または少なくとも約０．１％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約４％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％である、結合親和性を有し得る。この段落の上文に記載の上述の実施形態では、構成ＢＰＸＴＥＮの標的受容体に対する結合親和性は、対応する天然ＢＰと比較して、または対応するＢＰ成分の結合親和性が低減されていない立体配置を有するＢＰＸＴＥＮと比較して、「実質的に低減」されることになる。したがって、本発明は、ＲＭＣが低減された組成物、および所望のｉｎ ｖｉｖｏ生物学的応答を得るために十分な数の受容体に結合でき、それらを活性化できるが、そのような応答を得るために必要なものより多くの受容体の活性化を回避できるようにＢＰＸＴＥＮを構成することにより、そのような組成物を産生する方法を提供する。一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、対象ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＮ末端にあるように構成され、この場合、投与されるＢＰＸＴＥＮのＲＭＣは、ＸＴＥＮのＣ末端に連結された対象ＢＰを用いて構成されるＢＰＸＴＥＮと比較して低減され、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部分は保持される。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、対象ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＣ末端にあるように構成され、この場合、投与されるＢＰＸＴＥＮのＲＭＣは、ＢＰＸＴＥＮのＮ末端にある対象ＢＰを用いてＢＰＸＴＥＮと比較して低減され、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部分は保持される。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ－ＢＰ－ＸＴＥＮとして構成され、この場合、投与されるＢＰＸＴＥＮのＲＭＣは、１つのＸＴＥＮを用いて構成されるＢＰＸＴＥＮと比較して低減され、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部分は保持される。当業者には、この特性を達成するための他の立体配置、例えば、ＢＰの第２の分子またはスペーサー配列の付加が本発明により企図されることが明らかであろう。この段落の上文に記載の上述の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの半減期は、ＢＰ成分の結合親和性およびＲＭＣが低減されていない構成されるＢＰＸＴＥＮと比較して、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％増加され得る。この段落の上文に記載の上述の実施形態では、半減期の増加は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、またはＢＰ成分が、天然ＢＰと同等の受容体に対する結合親和性を保持するＢＰＸＴＥＮ立体配置と比較して、多い投与量および低減された投与頻度を可能にし得る。
特定のｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ生物学的アッセイを使用して、各々の構成ＢＰＸＴＥＮの、および／またはＢＰＸＴＥＮに組み込まれるＢＰ成分の、生物活性を評価することもできる。例えば、膵ベータ細胞からのインスリン分泌および／または転写の増加を、当技術分野において公知の方法により測定することができる。組織によるグルコース取込みも、グルコースクランプアッセイなどのような方法により評価することができる。代謝性疾患および障害の処置において投与されるＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の活性の評価に好適な他のｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏパラメーターとしては、空腹時グルコースレベル、ピーク食後グルコースレベル、グルコース恒常性、経口グルコース負荷試験に対する応答、インスリンチャレンジに対する応答、ＨＡ１ｃ、カロリー摂取量、満腹、胃排出速度、膵液分泌、インスリン分泌、末梢組織インスリン感受性、ベータ細胞量、ベータ細胞崩壊、血中脂質レベルもしくはプロファイル、ボディーマスインデックス、または体重が挙げられる。これらのアッセイまたは当技術分野において公知の他のアッセイの結果に基づいて、ＢＰＸＴＥＮ立体配置もしくは組成を確認することができ、または必要に応じて、調整し、再アッセイして標的結合親和性もしくは生物活性を確認することができる。
発現されたタンパク質の物理的特性および構造特性を測定するための特定のアッセイおよび方法は、当技術分野において公知であり、タンパク質凝集、溶解度、二次および三次構造、融解特性、夾雑および含水量などの、特性を決定するための方法を含む。そのような方法としては、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＨＰＬＣ－逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、およびＵＶ／可視分光法が挙げられる。さらなる方法は、Ａｒｎａｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ （２００６） ４８， １－１３に開示されている。これらの方法の本発明への適用は、当業者にとって実現可能な範囲内であろう。
本発明の組成物の使用
別の態様では、本発明は、ＢＰにより媒介される疾患、障害または状態において有益な効果を達成するための方法を提供する。本発明は、比較的短い終末相半減期、および／または最小有効用量と最大耐用用量との間の狭い治療域を有する、ＢＰの欠点および／または制限に対処する。
一実施形態では、本発明は、対象において有益な効果を達成するための方法であって、ＢＰＸＴＥＮの治療または予防有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。有効量は、疾患または障害の処置に役立つ点で有益な効果を生じさせることができる。一部の場合には、有益な効果を達成するための方法は、対象を処置するためにＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の治療有効量を投与するステップを含み得る。
一実施形態では、方法は、ＸＴＥＮ配列に連結されているＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物と少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の治療有効量を、投与することを必要とする対象に投与するステップであって、ＢＰ成分により媒介される少なくとも１つのパラメーター、生理的状態または臨床転帰が、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰを含み、同等用量で投与される医薬組成物の投与により媒介される効果と比較して大きく改善される結果となる、ステップを含む。一実施形態では、医薬組成物は、治療有効用量で投与される。別の実施形態では、医薬組成物は、投与期間長にわたって治療有効用量レジメン（本明細書で定義される通り）を使用して、複数の連続用量を使用して投与される。
本明細書に記載されるような、ＢＰＸＴＥＮのＰＫパラメーターの増強の結果として、ＢＰは、代謝性疾患、障害もしくは状態の症状もしくは臨床的異常を予防する、処置する、和らげる、反転させるもしくは改善するために、または処置されている対象の生存期間を延長するために、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰと比較して長い用量間の間隔を使用して投与され得る。
本発明の方法は、所望のパラメーターまたは臨床効果を達成および／または維持するのに十分な期間にわたってＢＰＸＴＥＮの治療有効量の連続用量の投与を含むことができ、治療有効量のそのような連続用量によって、ＢＰＸＴＥＮの治療有効用量レジメン、例えば、用量が、本明細書に記載されるものを含むがそれらに限定されない、代謝性の病状または病態についての任意の臨床徴候もしくは症状、態様、測定パラメーターまたは特徴に対して持続的な有益な効果をもたらすような治療有効量で与えられる、融合タンパク質組成物の連続投与用量のスケジュールが確立される。
ＢＰＸＴＥＮの治療有効量は、個体の病状、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起する抗体または抗体部分の能力などの、因子によって変わり得る。治療有効量は、ＢＰＸＴＥＮのいかなる毒性または有害効果よりも、治療に有益な効果のほうが上回る量でもある。予防有効量は、所望の予防結果を達成するために必要な期間にわたって必要とされるＢＰＸＴＥＮの量を指す。
本発明の方法には、患者の利便性を改善するために、用量間の間隔を延長するために、および持続効果を達成するために必要な薬物の量を低減させるために、より長く作用するＢＰＸＴＥＮ組成物が好ましい。一実施形態では、処置の方法は、融合タンパク質に連結されていない、同等用量で対象に投与される対応するＢＰ成分と比較して、組成物の融合タンパク質について確立される治療域内で費やされる時間が増加する結果となる、ＢＰＸＴＥＮの治療有効用量の投与を必要とする対象へのその投与を含む。一部の場合には、治療域内で費やされる時間の増加は、融合タンパク質に連結されていない、同等用量で対象に投与される対応するＢＰ成分と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍である。方法により、さらに、治療有効用量レジメンを使用して投与されるＢＰＸＴＥＮの複数の連続用量の投与を必要とする対象へのその投与は、融合タンパク質に連結されていない、そのＢＰについて確立された用量レジメンを使用して投与される対応するＢＰと比較して、融合タンパク質の血中レベルについて連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間の増加をもたらすことができることとなる。上述の実施形態では、連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間で費やされる時間の増加は、融合タンパク質に連結されていない、そのＢＰについて確立された用量レジメンを使用して投与される対応するＢＰ成分と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍であり得る。この段落の上文に記載の実施形態では、融合タンパク質の投与は、融合タンパク質に連結されていない、同等単位用量または用量レジメンで対象に投与される対応するＢＰ成分と比較して、融合タンパク質のモルでより低い単位用量を使用してパラメーター（対象疾患、状態または障害の評価に有用であると本明細書で開示されるもの）のうちの少なくとも１つの改善をもたらすことができる。
一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、同じアッセイを使用して判定して、または測定された臨床パラメーターに基づいて、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰ成分の活性より大きい、臨床的、生化学的または生理的パラメーターのうちの１つの改善をもたらす活性を有し得る。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、同じアッセイを使用して判定して、または測定された臨床パラメーターに基づいて、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰ成分と比較して増強された効果を共同でもたらす異なるＢＰのうちの１つにより各々が媒介される、２つまたはそれより多くの臨床または代謝関連パラメーター（例えば、糖尿病の対象におけるグルコース恒常性および体重コントロール、または血友病の対象におけるプロトロンビンまたは出血時間の低減、または成長ホルモン欠損症の対象における筋肉量および骨密度の増加）における活性を有し得る。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの投与は、同じアッセイを使用して判定して、または測定された臨床パラメーターに基づいて、ＸＴＥＮに連結されていない単一ＢＰ成分の１つについての活性より継続期間が長い活性である、臨床的、生化学的または生理的パラメーターのうちの１つまたは複数における活性をもたらし得る。
一部の実施形態では、本開示は、対象における疾患または状態を処置または予防する方法であって、融合タンパク質、または融合タンパク質を含む組成物（これらのすべてが本明細書で開示される）の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、またはがん関連疾患もしくは状態、または炎症性疾患、または自己免疫疾患であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、またはがん関連疾患もしくは状態であり得る。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、またはがん関連疾患もしくは状態であり得る。所望される場合には、対象融合体および組成物を、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の治療有効量と組み合わせて使用することができる。
本発明は、本明細書で提供される方法に従って使用されるＢＰＸＴＥＮが、がん、関節リウマチ、多発性硬化症、重力筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、ウイルス感染症（例えば、慢性Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ）、アレルギー性喘息、網膜神経変性プロセス、代謝性障害、インスリン抵抗性、および糖尿病性心筋症、炎症状態、および自己免疫状態の処置に有用な他の処置方法および医薬組成物と併用で投与され得ることを、さらに企図している。
一部の場合には、ＢＰＸＴＥＮの投与は、対象における疾患、障害または状態について同等の臨床効果または測定パラメーターを達成するために同時投与される医薬組成物のより少ない投与量の使用を可能にし得る。
上述のことにもかかわらず、ある特定の実施形態では、本発明の方法に従って使用されるＢＰＸＴＥＮは、グルコース関連疾患、代謝性疾患もしくは障害、凝固障害、または成長ホルモン欠損症もしくは成長障害に罹患している対象における追加の処置方法または薬物もしくは他の医薬組成物の使用の必要性を未然に防ぐことができ、またはその必要性を遅らせることができる。他の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、基礎疾患、障害または状態を処置するために必要とされる追加の処置方法または薬物もしくは他の医薬組成物の量、頻度または継続期間を低減することができる。
別の態様では、本発明は、所望の薬理学的または薬学的特性を有するＢＰＸＴＥＮ組成物を設計する方法を提供する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、代謝性疾患または障害の処置のための治療有効性を改善すること、ＢＰと比較して融合タンパク質の薬物動態の特徴を強化すること、薬理効果を達成するために必要な用量または投与頻度を低下させること、薬学的特性を増強すること、および長期間にわたって治療域内に留まるＢＰ成分の能力を増強することを含む、様々な目的を念頭に置いて（融合タンパク質に連結されていないＢＰ成分と比較して）設計および調製される。
一般に、融合タンパク質および本発明の組成物の設計および産生におけるステップは、図４～６に示されているように、（１）特定の疾患、障害または状態を処置するためのＢＰ（例えば、天然タンパク質、ペプチドホルモン、活性を有するペプチドアナログまたは誘導体、ペプチド断片など）の選択ステップ；（２）結果として生じるＢＰＸＴＥＮに所望のＰＫおよび物理化学的特徴を付与することになるＸＴＥＮを選択するステップ（例えば、対象への組成物の投与は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して長期間、治療域内に維持される融合タンパク質をもたらす）；（３）所望の有効性またはＰＫパラメーターを達成するために望ましいＮ末端からＣ末端へのＢＰＸＴＥＮ立体配置を確立するステップ；（４）構成ＢＰＸＴＥＮをコードする発現ベクターの設計を確立するステップ；（５）発現ベクターで好適な宿主を形質転換するステップ；および（６）得られた融合タンパク質の発現および回収ステップを含む。半減期の増加（１６時間より長い）または治療域内で費やされる時間の延長が所望されるＢＰＸＴＥＮのために、組込みに選択されるＸＴＥＮは、単一のＸＴＥＮがＢＰＸＴＥＮに組み込まれることになる場合、一般に、少なくとも約５００、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１３、または約９２４アミノ酸残基を有することになる。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、前述の長さの第１のＸＴＥＮ、および約１４４、または約２８８、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１３、または約９２４アミノ酸残基の第２のＸＴＥＮを含み得る。
他の場合には、半減期の増加は必要とされないが、薬学的特性（例えば、溶解度）の増加が所望される場合、ＢＰＸＴＥＮは、より短い長さのＸＴＥＮを含むように設計され得る。前述のものの一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、少なくとも約２４、または約３６、または約４８、または約６０、または約７２、または約８４、または約９６アミノ酸残基を有するＸＴＥＮに連結されているＢＰを含み得、この場合、生理条件下での融合タンパク質の溶解度は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰより少なくとも３倍大きく、または代替的に、ＸＴＥＮに連結されていないグルカゴンより少なくとも４倍、もしくは５倍、もしくは６倍、もしくは７倍、もしくは８倍、もしくは９倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも３０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも６０倍、もしくはそれより大きい。さらに他の場合、グルカゴン含有ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２～６時間の半減期が（例えば、夜間低血糖の処置において）所望される場合、融合タンパク質は、グルカゴン含有ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ成分中のアミノ酸約１００、またはアミノ酸約１４４、またはアミノ酸約１５６、またはアミノ酸約１６８、またはアミノ酸約１８０、またはアミノ酸約１９６などの、中間長のＸＴＥＮを有するように設計され得る。
別の態様では、本発明は、製造の容易さを改善し、天然ＢＰと比較して、安定性の増大、水溶性の増加、および／または製剤化の容易さをもたらす、ＢＰＸＴＥＮ組成物の作製方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＢＰの水溶性を増加させる方法であって、非融合状態のＢＰと比較して、結果として生じるＢＰＸＴＥＮの可溶性形態のより高い濃度を生理条件下で達成することができるように、ＢＰを１つまたは複数のＸＴＥＮに連結させるステップを含む、方法を含む。融合タンパク質に組み込まれたとき、ＢＰの水溶性の増加を付与するためにＸＴＥＮの特性に寄与する因子としては、ＸＴＥＮ融合パートナーの高い溶解度、および溶液中のＸＴＥＮの分子間の低い自己凝集度が挙げられる。一部の実施形態では、方法は、水溶性が生理条件下で、非融合ＢＰと比較して、少なくとも約５０％大きい、または少なくとも約６０％大きい、または少なくとも約７０％大きい、または少なくとも約８０％大きい、または少なくとも約９０％大きい、または少なくとも約１００％大きい、または少なくとも約１５０％大きい、または少なくとも約２００％大きい、または少なくとも約４００％大きい、または少なくとも約６００％大きい、または少なくとも約８００％大きい、または少なくとも約１０００％大きい、または少なくとも約２０００％大きい、または少なくとも約４０００％大きい、または少なくとも約６０００％大きい、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をもたらす。
別の実施形態では、本発明は、ＢＰの貯蔵寿命を拡張する方法であって、結果として得られるＢＰＸＴＥＮの貯蔵寿命が非融合状態のＢＰと比較して延長されるように選択された１つまたは複数のＸＴＥＮとＢＰを連結させるステップを含む方法を含む。本明細書で使用される場合、貯蔵寿命は、溶液中または何らかの他の貯蔵製剤中のＢＰまたはＢＰＸＴＥＮの機能活性が、活性を過度に損失することなく安定したままの期間を指す。本明細書で使用される場合、「機能活性」は、薬理効果または生物活性、例えば、受容体もしくはリガンドに結合する能力、または酵素活性、または当技術分野において公知であるような、ＢＰに関連する１つもしくは複数の公知の機能活性を表すことを指す。分解または凝集するＢＰは、一般に、溶解状態のままのものと比較して、低減された機能活性または低減されたバイオアベイラビリティを有する。融合タンパク質に組み込まれたときにＢＰの貯蔵寿命を延長する方法の能力に寄与する因子としては、水溶性の増加、溶液中での自己凝集の低減、およびＸＴＥＮ融合パートナーの熱安定性増大が挙げられる。特に、ＸＴＥＮの低い凝集傾向は、より高い薬物濃度のＢＰを含有する医薬調製物を製剤化する方法を助長し、ＸＴＥＮの熱安定性は、長期間にわたって可溶性および機能活性のままでいるＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の特性に寄与する。一実施形態では、方法は、同じ貯蔵および取扱い条件に付された標準物質と比べて大きい活性を提示する「長期に及ぶ」または「長期の」貯蔵寿命を有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をもたらす。標準物質は、非融合全長ＢＰであり得る。一実施形態では、方法は、ＸＴＥＮのその非構造化立体構造を保持する能力を増強し、およびＢＰＸＴＥＮが、対応する非融合ＢＰの時間より長い時間にわたって製剤に可溶性のままでいるための、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を用いて、単離されたＢＰＸＴＥＮを製剤化するステップを含む。一実施形態では、方法は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を作出するためのＸＴＥＮへのＢＰの連結が、所与の時点で比較されたとき、ならびに標準物質と同じ貯蔵および取扱い条件に付されたとき、標準物質の機能活性の約１００％より大きい機能活性、または約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％もしくは２００％より大きい機能活性を保持する溶液をもたらすことによって、その貯蔵寿命を拡張することを包含する。
貯蔵寿命は、貯蔵開始時の機能活性に正規化された、貯蔵後に残存する機能活性の点でも評価され得る。長期に及ぶまたは長期の機能活性により提示されるような長期に及ぶまたは長期の貯蔵寿命を有する本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、同じ期間、同じ条件に付されたとき、ＸＴＥＮに連結されていない等価のＢＰの機能活性の約５０％より大きい機能活性、または約６０％、７０％、８０％もしくは９０％より大きい機能活性を保持し得る。例えば、ＸＴＥＮ配列に融合されているエクセンディン－４またはグルカゴンを含む本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、様々な温度条件下で最大で５週間またはそれを超える期間、溶液中でその元の活性の約８０％またはそれより大きい活性を保持し得る。一部の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、８０℃で１０分間、加熱されたとき、溶液中でその元の活性の少なくとも約５０％、または約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれより大きい活性を保持する。他の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮは、３７℃で７日間、加熱または維持されたとき、溶液中でその元の活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または代替的に少なくとも約９０％またはそれより大きい活性を保持する。別の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、約１時間～約１８時間の期間にわたって約３０℃～約７０℃の温度に曝露された後、その機能活性の少なくとも約８０％またはそれより大きい機能活性を保持する。この段落の上文に記載の上述の実施形態では、ＢＰＸＴＥＮの保持される活性は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰの活性より、所与の時点で少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍大きいことになる。
本発明のＤＮＡ配列
本発明は、ＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドをコードする単離されたポリ核酸、および相同バリアントを含む、ＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドをコードするポリ核酸分子に相補的な配列を提供する。別の態様では、本発明は、ＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドをコードするポリ核酸、および相同バリアントを含む、ＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドをコードするポリ核酸分子に相補的な配列を生成する方法を包含する。一般に、および図４～６に示されているように、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を産生する方法、および結果として生じた遺伝子産物を発現させる方法は、ＢＰおよびＸＴＥＮをコードするヌクレオチドをアセンブルするステップ、組成物をインフレームで連結させるステップ、コード遺伝子を適切な発現ベクターに組み込むステップ、適切な宿主細胞を発現ベクターで形質転換するステップ、および融合タンパク質を形質転換宿主細胞に発現させることによって、生物活性ＢＰＸＴＥＮポリペプチドを産生するステップを含む。分子生物学における標準的な組換え手法を、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製するために使用することができる。
本発明に従って、ＢＰＸＴＥＮをコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞におけるＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生成することができる。いくつかのクローニング戦略が本発明の実施に好適であると考えられ、これらの多くを、本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質またはその相補配列をコードする遺伝子を含む構築物を生成するために使用することができる。一実施形態では、クローニング戦略は、少なくとも第１のＢＰと少なくとも第１のＸＴＥＮポリペプチド、またはその相補配列とを含む、単量体ＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子を作出するために使用されることになる。別の実施形態では、クローニング戦略は、ＢＰＸＴＥＮ組成物を製剤化するために使用される融合タンパク質の発現のための宿主細胞を形質転換するために使用されることになる、１つのＢＰの第１および第２の分子と少なくとも第１のＸＴＥＮ（またはその相補配列）とを含む単量体ＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子を作出するために使用されることになる。この段落の上文に記載の上述の実施形態では、遺伝子は、切断配列もコードし得る、スペーサー配列をコードするヌクレオチドをさらに含み得る。
所望のＸＴＥＮ配列を設計する際に、ＸＴＥＮコード配列の作出に「基本単位」分子アプローチを使用するにもかかわらず、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性の性質を得ることができることを発見した。これは、配列モチーフをコードするポリヌクレオチドライブラリーの使用により達成されたもので、その際、配列モチーフが多量体化されて、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子が作出される（図４および５を参照されたい）。したがって、発現されるＸＴＥＮは、わずか４つの異なる配列モチーフを有する複数の単位からなり得るが、モチーフ自体が非反復アミノ酸配列からなるため、全ＸＴＥＮ配列が非反復性にされる。したがって、一実施形態では、ＸＴＥＮコードポリヌクレオチドは、インフレームで作動可能に連結される非反復配列またはモチーフをコードする、複数のポリヌクレオチドを含み、この場合、結果として生じる発現ＸＴＥＮアミノ酸配列が非反復性である。
１つのアプローチでは、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含有する構築物が、まず調製される。組成物のＢＰをコードするＤＮＡは、ＢＰ ｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられている組織または単離された細胞から標準的な方法を使用して調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。必要に応じて、コード配列を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．、上掲に記載されているような従来のプライマー伸長手順を使用して前駆体を検出し、ｃＤＮＡに逆転写されていない可能性があるｍＲＮＡの中間体を処理して得ることができる。それに基づいて、そのような供給源から調製されたｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡを適便に得ることができる。ＢＰコード遺伝子も、ゲノムラブラリーから得ることができるか、または一般に入手可能なデータベース、特許もしくは参考文献から得られるＤＮＡ配列を使用して当技術分野において公知の標準合成手順（例えば、自動核酸合成）により作出することができる。そのような手順は、当技術分野において周知であり、科学および特許文献に十分に記載されている。例えば、配列は、ケミカルアブストラクトサービス（ＣＡＳ）レジストリー番号（アメリカ化学会により公開されている）および／あるいはＢＡＰの、またはＢＡＰの断片もしくはバリアントのアミノ酸配列を収載しているＣＡＳレジストリーまたはＧｅｎＢａｎｋデータベースの入力情報に対応する、ワールドワイドウェブにおいてｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能な、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブページ経由で入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号（例えば、遺伝子座ＩＤ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ、およびＸＰ＿ＸＸＸＸＸ）モデルタンパク質識別子から得ることができる。本明細書で提供されるそのような配列識別子について、これらのＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑ受託番号それぞれに関連する要約ページ、ならびに引用ジャーナル刊行物（例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ番号（ＰＭＩＤ））は各々、それら全体が、特に、そこに記載されているアミノ酸配列に関して、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、ＢＰコード遺伝子は、表３もしくは表Ａのいずれか１つからのタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする。
対象ＢＰＸＴＥＮタンパク質のＢＰ部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドは、単一のＢＰを含むことになる発現融合タンパク質の場合には、生物システムにおける高レベルのタンパク質発現のために、適切な転写および翻訳配列の制御下にあるプラスミドまたは他のベクターであり得る構築物にクローニングすることができる。後のステップでは、ＸＴＥＮをコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチドを、ＢＰをコードする遺伝子に隣接してまたはその（それらの）遺伝子とインフレームで構築物にクローニングすることにより、ＢＰ遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子融合させる。この第２のステップは、ライゲーションまたは多量体化ステップによって行われ得る。この段落の上文に記載の上述の実施形態では、作出される遺伝子構築物が、代替的に、それぞれの融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の補体であり得ることを理解されたい。
ＸＴＥＮをコードする遺伝子を、完全に合成的に、または制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲおよびオーバーラップ伸長などの、酵素的プロセスと組み合わせられた合成のどちらかにより、１ステップまたは複数のステップで作製することができる。ＸＴＥＮコード遺伝子は低い反復性を有するが、コードされたアミノ産配列は、ある程度の反復性を有するように、ＸＴＥＮポリペプチドを構築することができる。非反復配列を有するＸＴＥＮをコードする遺伝子は、標準的な遺伝子合成技法を使用してオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得る。遺伝子設計は、コドン使用頻度およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して行うことができる。本発明の１つの方法では、図４および５に示されているように、比較的短いＸＴＥＮコードポリヌクレオチド構築物のライブラリーが作出され、次いで、アセンブルされる。これは、純粋なコドンライブラリーであり得、したがって、各ライブラリーメンバーは、同じアミノ酸配列を有するが、多くの異なるコード配列が可能である。そのようなライブラリーを部分的に無作為化されたオリゴヌクレオチドからアセンブルし、使用して、配列モチーフを含むＸＴＥＮセグメントの大きいライブラリーを生成することができる。無作為化スキームを、各位置はもちろんコドン使用頻度についてもアミノ酸選択を制御するために最適化することができる。
ポリヌクレオチドライブラリー
別の態様では、本発明は、所望の長さおよび配列のＸＴＥＮをコードする遺伝子をアセンブルするために使用することができるＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮコードライブラリー構築物は、固定長のポリペプチドセグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。最初のステップとして、９～１４アミノ酸残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーをアセンブルすることができる。好ましい実施形態では、１２アミノ酸のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーをアセンブルする。
ＸＴＥＮコード配列セグメントを二量体化または多量体化して、より長いコード配列にすることができる。二量体化または多量体化は、ライゲーション、オーバーラップ伸長、ＰＣＲアセンブリー、または当技術分野において公知の同様のクローニング技法により行うことができる。このプロセスを、結果として生じるＸＴＥＮコード配列が配列の組織化を達成し、所望の長さを獲得するまで何度も反復し、それによってＸＴＥＮコード遺伝子が得られる。理解される通り、１２アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを二量体化して、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーにすることができる。同様に、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを連続して二量体化して、ＸＴＥＮ配列をコードする、連続した、より長い長さのポリヌクレオチドを含有するライブラリーにすることができる。一部の実施形態では、特定配列のＸＴＥＮファミリー、例えば、表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、またはＡＱ配列に限定されるアミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーをアセンブルすることができる。他の実施形態では、ライブラリーは、表１からのモチーフファミリー配列の２つまたはそれより多くをコードする配列を含み得る。ライブラリーを、同様に、連続した二量体化またはライゲーションに使用して、例えば、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、９１２、９２３、１２９６アミノ酸、または約３０００アミノ酸以下の全長、および中間長のＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列ライブラリーを得ることができる。一部の場合には、ポリヌクレオチドライブラリー配列は、下記でさらに十分に説明される「シークエンシングアイランド」として使用される追加の塩基も含み得る。
図５は、本発明の実施形態におけるＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物およびＢＰＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物のアセンブリーにおける代表的な、非限定的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１を、配列モチーフ５０２、例えば、１２アミノ酸モチーフ（「１２－ｍｅｒ」）にアニールすることができ、その後、その配列モチーフが、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含有するオリゴ５０３とライゲーションされる。ライブラリーからの追加の配列モチーフが１２－ｍｅｒに、ＸＴＥＮ遺伝子５０４の所望の長さが得られるまで、アニールされる。ＸＴＥＮ遺伝子が、スタッファーベクターにクローニングされる。ベクターは、必要に応じて、Ｆｌａｇ配列５０６、続いて、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ部位に隣接するスタッファー配列５０７、およびこの場合は、単一のＢＰ遺伝子（この例ではエクセンディン－４をコードする）５０８をコードすることができ、その結果、単一のＢＰを含むＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子５００が得られる。ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドおよび前駆体配列のＸＴＥＮ名および配列番号の非網羅的リストが、表８に提供される。
表８： ＸＴＥＮのＤＮＡ配列および前駆体配列
Figure 2023531496000033
Figure 2023531496000034
Figure 2023531496000035
Figure 2023531496000036
Figure 2023531496000037
Figure 2023531496000038
Figure 2023531496000039
Figure 2023531496000040
Figure 2023531496000041
Figure 2023531496000042
Figure 2023531496000043
ＸＴＥＮコード遺伝子のライブラリーを当技術分野において公知の１つまたは複数の発現ベクターにクローニングすることができる。よく発現するライブラリーメンバーの同定を助長するために、レポータータンパク質との融合体としてライブラリーを構築することができる。好適なレポーター遺伝子の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼである。スクリーニングにより、選ばれた宿主生物において高濃度で発現され得る短いＸＴＥＮ配列を同定することができる。その後、無作為ＸＴＥＮ二量体のライブラリーを生成し、高い発現レベルについてのスクリーニングを繰り返すことができる。その後、結果として生じた構築物を、発現レベル、プロテアーゼ安定性、または抗血清への結合などのいくつかの特性についてスクリーニングすることができる。
本発明の一態様は、融合タンパク質の成分をコードするポリヌクレオチド配列であって、配列の産生がコドン最適化を経たものである、配列を提供することである。ポリペプチド組成物の発現を改善することを目的としたコドン最適化、および産生宿主におけるコード遺伝子の遺伝子安定性を向上させるためのコドン最適化は、特に興味深い。例えば、コドン最適化は、グリシンを多く含むＸＴＥＮ配列、または反復性が非常に高いアミノ酸配列を有するＸＴＥＮ配列には、特に重要である。コドン最適化を、コンピュータプログラムを使用して行うことができ（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２２： ３４６－５３）、それらのプログラムの一部は、リボソーム休止を最小限に抑えることができる（Ｃｏｄａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）。一実施形態では、ライブラリーのすべてのメンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、コドン使用頻度が異なる、コドンライブラリーを構築することにより、コドン最適化を行うことができる。そのようなライブラリーを、ＸＴＥＮ含有産物の大規模産生に特に好適である、高度に発現する遺伝的に安定したメンバーについてスクリーニングすることができる。ＸＴＥＮ配列を設計する際、いくつかの特性を考慮することができる。コードＤＮＡ配列中の反復性を最小限に抑えることができる。加えて、産生宿主によってほとんど使用されないコドン（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡＧＧおよびＡＧＡアルギニンコドンならびに１つのロイシンコドン）の使用を回避することまたは最小限に抑えることができる。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、２つのグリシンコドン、ＧＧＡおよびＧＧＧは、高度に発現されるタンパク質でほとんど使用されない。したがって、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子のコドン最適化は、非常に望ましい場合がある。高レベルのグリシンを有するＤＮＡ配列は、不安定性または低い発現レベルにつながり得る、高いＧＣ含量を有する傾向がある。それ故、可能な場合には、ＸＴＥＮコード配列のＧＣ含量が、ＸＴＥＮを製造するために使用されることになる産生生物にとって好適であるような、コドンを選択することが好ましい。
必要に応じて、全長ＸＴＥＮコード遺伝子は、１つまたは複数のシークエンシングアイランドを含み得る。これに関連して、シークエンシングアイランドは、ＸＴＥＮライブラリー構築物配列とは明確に異なる、短いストレッチ配列であって、全長ＸＴＥＮコード遺伝子に存在しないまたは存在すると予想される制限部位を含むストレッチ配列である。一実施形態では、シークエンシングアイランドは、配列５’－ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ－３’（配列番号２６１）である。別の実施形態では、シークエンシングアイランドは、配列５’－ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ－３’（配列番号２６２）である。
代替案として、ライブラリーのすべてのメンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、コドン使用頻度が様々である、コドンライブラリーを構築することができる。そのようなライブラリーを、ＸＴＥＮ含有産物の大規模産生に特に好適である、高度に発現する遺伝的に安定したメンバーについてスクリーニングすることができる。
必要に応じて、ライブラリー中のクローンをシークエンシングして、望ましくない配列を含有する単離物を排除することができる。短いＸＴＥＮ配列の最初のライブラリーは、アミノ酸配列のバリエーションを許容することができる。例えば、いくつかの親水性アミノ酸が特定の位置に存在し得るような一部のコドンを無作為化することができる。
反復多量体化の過程で、結果として得られたライブラリーメンバーを、高レベル発現についてのスクリーニングに加えて、溶解度またはプロテアーゼ耐性のような他の特徴についてスクリーニングすることができる。
所望の長さおよび特性のＸＴＥＮをコードする遺伝子を選択したら、それを、ＢＰをコードする遺伝子に隣接する、およびその遺伝子とインフレームの、またはスペーサー配列に隣接する構築物にクローニングすることにより、ＢＰ遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子融合させる。本発明は、コードされるＢＰＸＴＥＮに依存して、上述の様々な順列を提供する。例えば、上に描示されているような式ＩＩＩまたはＩＶにより具現化されるものなどの、２つのＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子は、２つのＢＰ、少なくとも第１のＸＴＥＮ、ならびに必要に応じて第２のＸＴＥＮおよび／またはスペーサー配列をコードする、ポリヌクレオチドを有することになる。ＢＰ遺伝子をＸＴＥＮ構築物にクローニングするステップは、ライゲーションまたは多量体化ステップを通して行われ得る。図２Ａ～図２Ｇに示されているように、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする構築物を、成分ＸＴＥＮ２０２、ＢＰ２０３、およびスペーサー配列２０４の異なる立体配置で設計することができる。一実施形態では、図２Ａに示されているように、構築物は、次の順序の成分（５’から３’へ）ＢＰ２０３そしてＸＴＥＮ２０２の、または逆の順序の成分の、単量体ポリペプチドに相補的なポリヌクレオチド配列、またはその単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、図２Ｂに示されているように、構築物は、次の順序の成分（５’から３’へ）ＢＰ２０３、スペーサー２０４、そしてＸＴＥＮ２０２の、または逆の順序の成分の、単量体ポリペプチドに相補的なポリヌクレオチド配列、またはその単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、図２Ｃに示されているように、構築物２０１は、次の順序で（５’から３’へ）成分：ＢＰ２０３の２つの分子、そしてＸＴＥＮ２０２に、または逆の順序で相補的なポリヌクレオチド配列、またはそれらの成分をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単量体ＢＰＸＴＥＮをコードする。別の実施形態では、図２Ｄに示されているように、構築物は、次の順序の成分（５’から３’へ）：ＢＰ２０３の２つの分子、スペーサー配列２０４、そしてＸＴＥＮ２０２の、または逆の配列の成分の、単量体ポリペプチドに相補的なポリヌクレオチド配列、またはその単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、図２Ｅに示されているように、構築物は、次の順序の成分（５’から３’へ）：ＢＰ２０３、スペーサー２０４、ＢＰ２０３の第２の分子、そしてＸＴＥＮ２０２の、または逆の順序の成分の、単量体ポリペプチドに相補的なポリヌクレオチド配列、またはその単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、図２Ｆに示されているように、構築物は、次の順序の成分（５’から３’へ）：ＢＰ２０３、ＸＴＥＮ２０２、ＢＰ２０３、そして第２のＸＴＥＮ２０２の、または逆の配列の、単量体ポリペプチドに相補的なポリヌクレオチド配列、またはその単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。スペーサーポリヌクレオチドは、必要に応じて、切断配列をコードする配列を含み得る。当業者には明らかであろうが、上述のものの他の順列が可能である。
本発明は、（ａ）表８からのポリヌクレオチド配列に対して、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的である配列に対して、高いパーセンテージの配列同一性を有するＸＴＥＮコードポリヌクレオチドバリアントを含むポリヌクレオチドも包含する。高いパーセンテージの配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述の（ａ）もしくは（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、代替的に少なくとも約８１％、代替的に少なくとも約８２％、代替的に少なくとも約８３％、代替的に少なくとも約８４％、代替的に少なくとも約８５％、代替的に少なくとも約８６％、代替的に少なくとも約８７％、代替的に少なくとも約８８％、代替的に少なくとも約８９％、代替的に少なくとも約９０％、代替的に少なくとも約９１％、代替的に少なくとも約９２％、代替的に少なくとも約９３％、代替的に少なくとも約９４％、代替的に少なくとも約９５％、代替的に少なくとも約９６％、代替的に少なくとも約９７％、代替的に少なくとも約９８％、および代替的に少なくとも約９９の核酸配列同一性を有するものであるか、またはストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドもしくはその相補配列とハイブリダイズすることができるものである。
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性も、公知のソフトウェアまたはコンピュータプログラム、例えば、ＢｅｓｔＦｉｔ、またはＧａｐペアアワイズ比較プログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）を使用することにより、適便に決定することができる。ＢｅｓｔＦｉｔは、２配列間の同一性または類似性の最高セグメントを見つけるためにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ． １９８１． ２： ４８２－４８９）を使用する。Ｇａｐは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９７０． ４８：４４３－４５３）を使用して、大域的アラインメント：１つの配列のすべてと別の類似の配列のすべてのアラインメント、を実行する。配列相同性、類似性または同一性の程度を判定するためにＢｅｓｔＦｉｔなどの配列アラインメントプログラムを使用するとき、デフォルト設定を使用することができ、または適切なスコア行列を選択して、同一性、類似性もしくは相同性スコアを最適化することができる。
「相補的」である核酸配列は、標準的なＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋの相補性の規則に従って塩基対合できるものである。本明細書で使用される場合、用語「相補配列」は、上記の同じヌクレオチド比較により評価され得るような、または本明細書に記載のものなどのストリンジェントな条件下で、ＢＰＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズできると定義されるような、実質的に相補的な核酸配列を意味する。
次いで、ＢＰＸＴＥＮキメラ組成物をコードする、結果として生じたポリヌクレオチドを、個々に発現ベクターにクローニングすることができる。核酸配列を様々な手順によりベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡは、当技術分野において公知の技法を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分は、一般に、これらに限定されないが、シグナル配列、複製機転、１つもしくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を含む。これらの成分のうちの１つまたは複数を含有する好適なベクターの構築は、当業者に公知である標準的なライゲーション手法を利用する。そのような手法は、当技術分野において周知であり、科学および特許文献に十分に記載されている。
様々なベクターが、公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。発現ベクターも、クローニングベクターも、１つまたは複数の選択された宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。そのようなベクター配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスについて周知である。使用することができる有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含む。好適なベクターとしては、これらに限定されないが、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡならびにＳｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５７：３１－４０ （１９８８）により記載されたようなｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ－Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸなどの公知の細菌プラスミドの誘導体、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ファージＤＮＡ、例えば、ＮＭ９８ ９などのファージＩの非常に多数の誘導体、ならびに他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、２ミクロンプラスミド、または２ｍプラスミドの誘導体、ならびにセントロメアおよび組み込み酵母シャトルベクター；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは発現制御配列を利用するように修飾されたプラスミドなどが挙げられる。必要条件は、ベクターが、選ばれた宿主細胞において複製可能であり、生存可能であることである。低または高コピー数ベクターを所望に応じて使用することができる。
原核生物宿主に関して発現ベクターでの使用に好適なプロモーターとしては、β－ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）；欧州特許第３６，７７６号］、およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１－２５ （１９８３）］が挙げられる。細菌系での使用のためのプロモーターは、ＢＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有することができる。
例えば、バキュロウイルス発現系では、非融合移入ベクター、例えば、これらに限定されるものではないが、ｐＶＬ９４１（Ｓｕｍｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０－４０２ （１９７８）から入手可能なＢａｍＨＩクローニング部位）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｌ、Ｘｂａｌ、ＥｃｏＲＩ、ＩＶｏｔｌ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇＩＩＩおよびＰｓｔｌクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂａｌｌ、ＳｍａｌおよびＢａｍＨＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０－ ４０２ （１９７８）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、ＮｃｏｌおよびＨｉｎｄｉ ＩＩクローニング部位、ブルー／ホワイト組換えスクリーニングを伴う、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、融合移入ベクター、例えば、これらに限定されるものではないが、ｐＡｃ７ ００（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎｌクローニング部位、このＢａｍＨＩ認識部位は開始コドンで始まる；Ｓｕｍｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０－４０２ （１９７８））、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０－２（ｐＡｃ７００と同じものだがリーディングフレームが異なる）、ｐＡｃ３６０［ポリへドリン開始コドンの３６塩基対下流のＢａｍＨＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９９５）］およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨＩ、ＢｇＩ ＩＩ、Ｐｓｔｌ、Ｎｃｏ ｌおよびＨｉｎｄ ＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製のためのＮ末端ペプチド、およびプラークのブルー／ホワイト組換えスクリーニングを伴う、３つの異なるリーディングフレーム；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０））との両方を、使用することができる。
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を含み得る。ＳＶ４０スプライス部位およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要非転写遺伝子エレメントを得ることができる。本発明における使用が企図される哺乳動物発現ベクターとしては、誘導性プロモーター、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターを有するベクター、ＤＨＦＲ発現カセットを有する発現ベクター、またはＤＨＦＲ／メトトレキサート共増幅ベクター、例えば、ｐＥＤ（Ｐｓｔｌ、Ｓａｉｌ、Ｓｂａｌ、ＳｍａｌおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、このベクターは、クローニングされた遺伝子とＤＨＦＲの両方を発現する；Ｒａｎｄａｌ Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ， １９９１， Ｒａｎｄａｌ Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６，１２ （１９９１））が挙げられる。あるいは、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、例えば、ｐＥＥ１４（Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｘｂａｌｌ、Ｓｍａｌ、Ｓｂａｌ、ＥｃｏＲＩおよびＳｅｌｌクローニング部位、このベクターは、グルタミンシンテターゼおよびクローニングされた遺伝子を発現する；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）。エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）または核抗原（ＥＢＮＡ）の制御下でエピソーム発現を指示するベクター、例えば、ｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ ｒ ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｉ ＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎｌクローニング部位、構成的ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｎｈｅｌ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎｌクローニング部位、構成的ｈＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（．Ｋｐｎｌ、Ｐｖｕｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓｆｉｌ、ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導性メタロチオネインＨ ａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｈｅｌおよびＫｐｎｌクローニング部位、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｋｐｎｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄ ｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏ ｌ， Ｓｆｉ ｌ、ＢａｍＨ Ｉクローニング部位、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー、Ｎ末端ペプチドがＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によって精製可能であり、エンテロキナーゼにより切断される；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することができる。
本発明における使用のための選択可能な哺乳動物発現ベクターとしては、これらに限定されないが、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｈｉｎｄ ｌｌｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａｌおよびＡｐａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｓｐｅｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、Ｘｂａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。本発明において使用され得るワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（例えば、Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６．１２ （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｗｉｌｅｙ １９９１を参照されたい）としては、これらに限定されないが、ｐＳＣ１１（Ｓｍａｌクローニング部位、ＴＫ－およびベータ－ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（Ｓａｌ ｌ、Ｓｍａ ｌ、Ａ ｆｌＩ、Ｎａｒｌ、ＢｓｐＭｌＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｐａｌ、Ｎｈｅｌ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎｌおよびＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位；ＴＫ－および－ｇａｌ選択）、ｐＴＫｇｐｔＦｌＳ（ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、ＳａＩＩＩ、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｄＩＩ、Ｓｂａｌ、ＢａｍＨＩおよびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）などが挙げられる。
本発明で同じく使用され得る酵母発現系としては、これらに限定されないが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸＪｂａｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、ＫｐｎｌおよびＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｘｂａｌｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、ＫｐｎｌおよびＨｉｎｄｉ ＩＩクローニング部位、Ｎ末端ペプチドがＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によって精製されており、エンテロキナーゼにより切断される；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどが挙げられる。
加えて、キメラＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質コードポリヌクレオチド分子を含有する発現ベクターとしては、薬物選択マーカーを挙げることができる。そのようなマーカーは、キメラＤＮＡ分子を含有するベクターのクローニングおよび選択または同定に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）阻害剤、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、選択可能なマーカーとして有用である。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素を利用することができる。免疫学的マーカーも利用することができる。いずれの公知の選択可能なマーカーも、それが、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、利用することができる。選択可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知であり、レポーター、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む。
一実施形態では、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をコードするポリヌクレオチドを、発現宿主系に適しているＮ末端シグナル配列のＣ末端側に融合させることができる。シグナル配列は、典型的には、転座および分泌プロセス中にタンパク質からタンパク質分解により除去され、その結果、定義されたＮ末端が生成される。多種多様はシグナル配列が、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物系を含む、ほとんどの発現系について記載されている。各々の発現系についての好ましい例の非限定的なリストが本明細書において次に続く。好ましいシグナル配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためのＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、およびＤｓｂＡである。酵母発現に好ましいシグナルペプチドは、ｐｐＬ－アルファ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグナルペプチド、酸性ホスファターゼシグナルペプチド、ＣＰＹ、またはＩＮＵ１である。昆虫細胞発現のために、好ましいシグナル配列は、ｓｅｘｔａ脂質動員ホルモン前駆体、ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＰ３、ＣＰ４、ＴＰＡ、ＰＡＰ、またはｇｐ６７である。哺乳動物発現のために、好ましいシグナル配列は、ＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、ＩｇＧカッパおよびＩｇＧラムダである。
別の実施形態では、よく発現される、独立したタンパク質ドメインを含む可能性があるリーダー配列を、プロテアーゼ切断部位により隔てられたＢＰＸＴＥＮ配列のＮ末端側に融合させることができる。設計されたタンパク質分解部位での切断を阻害しない任意のリーダーペプチド配列を使用することができるが、好ましい実施形態での配列は、安定した、よく発現される配列を含むことになり、したがって、組成物全体の発現およびフォールディングが有意な悪影響を受けず、好ましくは、発現、溶解度、および／またはフォールディング効率が有意に改善される。多種多様な好適なリーダー配列が文献に記載されている。好適な配列の非限定的なリストには、マルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、６ｘＨｉｓタグ（配列番号２６３）、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、および緑色蛍光タンパク質が含まれる。リーダー配列も、文献および上文に十分に十分に記載されている方法による、特に、ＡＴＧ開始コドンに続く第２のコドン位置における、コドン最適化によって、さらに改善することができる。
特定の部位でタンパク質を切断するための様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素的方法が公知である。そのような方法は、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＫ（配列番号２６４））、第Ｘａ因子（ＩＤＧＲ（配列番号２６５））、トロンビン（ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２６６））、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号２６７））、ＴＥＶプロテアーゼ（ＥＱＬＹＦＱＧ（配列番号２６８））、３Ｃプロテアーゼ（ＥＴＬＦＱＧＰ（配列番号２６９））、ソルターゼＡ（ＬＰＥＴＧ 配列番号９０９）、グランザイムＢ（Ｄ／Ｘ、Ｎ／Ｘ、Ｍ／ＮまたはＳ／Ｘ）、インテイン、ＳＵＭＯ、ＤＡＰａｓｅ（ＴＡＧＺｙｍｅ（商標））、Ａｅｒｏｍｏｎａｓアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、ならびにカルボキシペプチダーゼＡおよびＢの使用を含む。追加の方法は、Ａｒｎａｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４８： １－１３ （２００６）に開示されている。
他の実施形態では、少なくとも約２０～約６０アミノ酸とＸＴＥＮの特徴部をコードする最適化ポリヌクレオチド配列をＸＴＥＮ配列のＮ末端に含めて翻訳の開始を促進して、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端でのＸＴＥＮ融合体の発現を可能にすることができる。前述のことの利点で、配列は、その後の切断を必要とせず、それによってＸＴＥＮ含有組成物の製造ステップの数が低減される。実施例でより詳細に説明されるように、最適化Ｎ末端配列は、非構造化タンパク質の特質を有するが、翻訳および増強された発現の開始を促進するそれらの能力のために選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基を含み得る。前述のことの一実施形態では、最適化ポリヌクレオチドは、ＡＥ９１２（配列番号２１７）に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。上述のことの別の実施形態では、最適化ポリヌクレオチドは、ＡＭ９２３（配列番号２１８）に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。
別の実施形態では、リーダー配列構築物のプロテアーゼ部位は、ｉｎ ｖｉｖｏプロテアーゼにより認識されるように選択される。この実施形態では、タンパク質は、適切なプロテアーゼとの接触を回避することによりリーダーを保持しながら発現系から精製される。次いで、全長構築物が患者に注射される。注射されると、構築物は、切断部位に特異的なプロテアーゼと接触し、プロテアーゼにより切断される。非切断タンパク質の活性が切断形態より実質的に低い場合、この方法には、活性形態がｉｎ ｖｉｖｏで緩徐に生成されるので、毒性を回避しながらより多くの初期用量を可能にするという有益な効果がある。この応用に有益であるｉｎ ｖｉｖｏプロテアーゼの一部の非限定的な例としては、組織カリクレイン、血漿カリクレイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、トロンビン、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、または表５のプロテアーゼが挙げられる。
このようにして、単量体ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子は、構築物内に生成される。必要に応じて、このキメラＤＮＡ分子を、より適切な発現ベクターである別の構築物に移入またはクローニングすることができる。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現できる宿主細胞にキメラＤＮＡ分子を導入して形質転換を生じさせることができる。目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターを、細胞宿主のタイプに依存して、周知の方法により宿主細胞に移入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に用いられる一方で、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処置、リポフェクション、または電気穿孔が使用され得る。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、およびマイクロインジェクションの使用が挙げられる。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．、上掲を参照されたい。
形質転換は、発現ベクターなどの担体を利用して、または利用せずに行われ得る。次いで、形質転換された宿主細胞は、ＢＰＸＴＥＮをコードするキメラＤＮＡ分子の発現に好適な条件下で培養される。
本発明は、本明細書で開示される単量体融合タンパク質組成物を発現させるための宿主細胞も提供する。好適な真核生物宿主細胞の例としては、これらに限定されないが、哺乳動物細胞、例えば、ＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２、ＣＨＯ細胞系、ＣＯＳ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞およびＣｖＩ細胞が挙げられる。好適な非哺乳動物真核細胞の例としては、真核微小生物、例えば、糸状真菌または酵母が挙げられ、これらは、ベクターのコード化に好適なクローニングまたは発現ベクターである。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に使用される下等真核生物宿主微生物である。他の生物としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ ［１９８１］；１９８５年５月２日に公開された欧州特許第１３９，３８３号）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９：９６８－９７５ （１９９１））、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８－８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ７３７ ［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８：１３５ （１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号：Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８：２６５－２７８ ［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：５２５９－５２６３ ［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日に公開された欧州特許第３９４，５３８号）；ならびに糸状真菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ９１／００３５７）、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２：２８４－２８９ ［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ２６：２０５－２２１ ［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０－１４７４ ［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４：４７５－４７９ ［１９８５］）などが挙げられる。メタノール資化性酵母（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ ｙｅａｓｔ）は、ここでは好適であり、これらに限定されないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属から選択されるメタノールを用いて成長できる酵母を含む。酵母のこのクラスの典型例である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）において見つけることができる。
本発明において使用され得る他の好適な細胞としては、これらに限定されないが、原核生物宿主株、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、ＤＨ５－α株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの属の株が挙げられる。好適な原核生物の非限定的な例としては、次の属からのものが挙げられる：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ；Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ；およびＶｉｂｒｉｏ。特定の株の非限定的な例としては、次の者が挙げられる：Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ；Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；およびＶｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ。
目的のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅のために必要に応じて修正された従来の栄養培地（例えば、ハム栄養混合物）で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に関して以前に使用されたものであり、当業者には明らかであるだろう。細胞は、典型的には遠心分離により収集され、物理的または化学的手段により破壊され、得られた粗抽出物がさらなる精製のために保持される。宿主細胞により分泌された組成物については、遠心分離からの上清が分離され、さらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に利用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用をはじめとする任意の従来の方法により破壊され得、これらの方法のすべてが当業者に周知である。細胞溶解を含む実施形態は、キメラＤＮＡ分子の発現後の分解を制限するプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝剤の使用を必然的に伴い得る。好適なプロテアーゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンが挙げられる。次いで、飽和硫酸アンモニウムの濃度を徐々に上昇させて上清を沈殿させることができる。
試料における遺伝子発現を、直接、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法（［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：５２０１－５２０５ （１９８０）］）、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、または本明細書で提供される配列に基づく、適切な標識プローブを使用する、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ－タンパク質二重鎖をはじめとする、特定の二重鎖を認識することができる抗体を利用することができる。そしてまた、二重鎖が表面に形成されると、二重鎖に結合している抗体の存在を検出することができるように、抗体を標識することができ、二重鎖が表面のどこに結合しているのかについてアッセイを行うことができる。
あるいは、免疫学的蛍光法、例えば、細胞もしくは組織切片の免疫組織化学染色、および細胞培養液もしくは体液のアッセイ、または選択可能なマーカーの検出により、遺伝子発現を測定して、遺伝子産物の発現を直接定量することができる。試料流体の免疫組織化学染色および／またはアッセイに有用な抗体は、モノクローナルあることもあり、またはポリクローナルであることもあり、任意の哺乳動物でそれを調製することができる。適便には、天然配列ＢＰポリペプチドに対する抗体、または本明細書で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対する抗体、またはＢＰに融合されており、特定の抗体エピトープをコードしている、外因性配列に対する抗体を、調製することができる。選択可能なマーカーの例は、当業者に周知であり、レポーター、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む。
発現ＢＰＸＴＥＮポリペプチド産物を、当技術分野において公知の方法によって、または本明細書に記載される方法により、精製することができる。ゲル濾過、親和性精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などの手順を、それぞれの宿主細胞により産生される融合タンパク質を回収および精製に合わせて各々を調整して、使用することができる。一部の発現ＢＰＸＴＥＮは、単離および精製中にリフォールディングする必要があり得る。精製方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ． Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ． Ｃａｓｔｏｒ （ｅｄ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ １９９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．、上掲に記載されている。多段階精製分離も、Ｂａｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０： １７９－９０ （１９９０）およびＢｅｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ６７９：６７－８３ （１９９４）に記載されている。
医薬組成物
サイトカインには、がん、関節リウマチ、多発性硬化症、重力筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、ウイルス感染症（例えば、慢性Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ）、アレルギー性喘息、網膜神経変性プロセス、代謝性障害、インスリン抵抗性、および糖尿病性心筋症を含むがこれらに限定されない、様々な治療または疾患カテゴリーの処置において有用性があり得る。
しかし、サイトカインの治療有用性は、サイトカインの一部、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ１５、Ｉ型インターフェロン（アルファおよびベータ）、およびＩＦＮ－ガンマが全身送達されたときに宿主細胞にとって毒性であり得るため、一部の状況では制限され得る。循環サイトカインの半減期を延ばすことは、細胞内取込みを緩徐化することにより細胞毒性を低減する１つの方法であり得る。
本開示のＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮへのサイトカインの結合によりサイトカインの半減期を延ばす方法および組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。本発明のＢＰＸＴＥＮポリペプチドを、ポリペプチドが薬学的に許容される担体ビヒクル、例えば、水溶液または緩衝液、薬学的に許容される懸濁液およびエマルジョンとの混合物に添合される、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って、製剤化することができる。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチエレングリコールおよび植物油が挙げられる。治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に記載されているような、必要に応じた生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、貯蔵用に調製される。
医薬組成物を経口投与、鼻腔内投与、非経口投与、または吸入療法により投与することができ、それらは、錠剤、トローチ剤、顆粒、カプセル、丸剤、アンプル、坐薬またはエアロゾル形態の形態を取り得る。それらは、水性もしくは非水性希釈剤中の活性成分の懸濁液、溶液およびエマルジョン、シロップ、顆粒または粉末の形態を取ることもある。加えて、医薬組成物はまた、他の薬学的に活性な化合物、または本発明の複数の化合物を含有し得る。医薬組成物を経口、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、くも膜下腔内、または筋肉内投与用に製剤化することができる。医薬組成物は、液体形態であり得る。医薬組成物は、単回注射用の充填済み注射器内にあり得る。医薬組成物を、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化することができる。
より詳細には、本医薬組成物を、経口、直腸、鼻腔、局所（経皮、エアロゾル、頬側および舌下を含む）、経膣、非経口（皮下、輸液ポンプによる皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）、硝子体内、および経肺をはじめとする、任意の好適な経路により、治療のために投与することができる。好ましい経路が、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変わることも、理解されるであろう。
一実施形態では、医薬組成物は、皮下投与される。この実施形態では、組成物を、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として適用することができる。組成物を、患者に直接投与することができる液体形態で供給することもできる。一実施形態では、組成物は、患者が組成物を容易に自己投与することができるように、充填済み注射器内の液体として供給される。
本発明において有用な持続放出性製剤は、マトリックスおよびコーティング組成物を含む、経口製剤であり得る。好適なマトリックス材料としては、蝋（例えば、カルナウバ（ｃａｍａｕｂａ）、蜜蝋、パラフィン蝋、セレシン、セラック蝋、脂肪酸、および脂肪アルコール）、油、硬化油または脂肪（例えば、硬化ナタネ油、ヒマシ油、牛脂、パーム油、およびダイズ油）、およびポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリエチエレングリコール）を挙げることができる。他の好適なマトリックス錠形成材料は、他の担体および充填剤を伴う、微結晶性セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースである。錠剤は、細粒、被覆粉末、またはペレットも含有し得る。錠剤は、多層であることもある。多層錠剤は、活性成分が著しく異なる薬物動態プロファイルを有する場合に特に好ましい。必要に応じて、完成錠剤は、コーティングされていることあり、未コーティングであることもある。
コーティング組成物は、不溶性マトリックスポリマーおよび／または水溶性材料を含み得る。水溶性材料は、ポリマー、例えば、ポリエチエレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、または単量体材料、例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、フルクトース、マンニトールなど）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）、有機酸（例えば、フマル酸、コハク酸、乳酸、および酒石酸）、およびこれらの混合物であり得る。必要に応じて、腸溶性ポリマーをコーティング組成物に組み込むことができる。好適な腸溶性ポリマーとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸エステル、ポリビニルアセテートフタレート、酢酸フタル酸セルロース、酢酸トリメリット酸セルロース、セラック、ゼイン、およびカルボキシル基を含有するポリメタクリレートが挙げられる。コーティング組成物を、好適な可塑剤、例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸エステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセチル化クエン酸エステル、セバシン酸ジブチル、およびヒマシ油などを添加することにより、可塑化することができる。コーティング組成物は、充填剤も含み得、充填剤は、不溶性材料、例えば、二酸化ケイ素、二酸化チタン、タルク、カオリン、アルミナ、デンプン、粉末セルロース、ＭＣＣ、またはポラクリリンカリウムであり得る。コーティング組成物を、有機溶媒もしくは水性溶媒、またはこれらの混合物中の溶液またはラテックスとして適用することができる。溶媒、例えば、水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン、またはこれらの混合物を使用することができる。
本発明の組成物を、様々な賦形剤を使用して製剤化することができる。好適な賦形剤としては、微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１）、ポリメタクリレート、ポリ（エチルアクリレート、メチルメタクリレート、トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド）（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＲＳ－３０Ｄ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲ Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、水性エチルセルロース分散液（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））、および硫酸プロタミンが挙げられる。徐放性薬剤は、担体も含み得、担体は、例えば、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤を含み得る。薬学的に許容される塩、例えば、無機塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅｓ）、マロン酸塩または安息香酸塩も、これらの徐放性薬剤中で使用することができる。組成物は、液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール、ならびに物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。リポソームを担体として使用することもできる。
別の実施形態では、本発明の組成物は、有益な活性薬剤を制御された方式で長期間にわたって送達する点での有用性が実証されているリポソームにカプセル化される。リポソームは、閉じ込められた水性成分の体積を含有する閉じた二重層膜である。リポソームはまた、単一の膜二重層を有する単層小胞であってもよく、または各々が水性層により隣と離れている複数の膜二重層を有する多層小胞であてもよい。結果として生じる膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）尾部が二重層の中央の方を向いており、その一方で親水性（極性）頭部が水性相の方を向いているような構造である。一実施形態では、リポソームは、単核食細胞系の臓器、主として肝臓および脾臓による取込みを回避するために柔軟な水溶性ポリマーでコーティングされ得る。リポソームを包囲するために好適な親水性ポリマーとしては、これらに限定されないが、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３１６，０２４号、同第６，１２６，９６６号、同第６，０５６，９７３号、同第６，０４３，０９４号に記載されている、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド、親水性ペプチド配列が挙げられる。
リポソームは、当技術分野において公知の任意の脂質または脂質の組合せから構成され得る。例えば、小胞形成性脂質は、天然に存在する脂質であってもよく、または合成脂質であってもよく、これらには、米国特許第６，０５６，９７３号および同第５，８７４，１０４号で開示されているような、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンが含まれる。小胞形成性脂質は、同じく米国特許第６，０５６，９７３号で開示されているような、糖脂質、セレブロシド、またはカチオン性脂質、例えば、１，２－ジオレイルオキシ－３－（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジテトラデシルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシメチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ－［１［（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル（ｃａｒｂａｍｏｌｙ）］コレステロール（Ｄｃ－Ｃｈｏｌ）；またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）であってもよい。コレステロールは、米国特許第５，９１６，５８８号および同第５，８７４，１０４号でも開示されているように、小胞に安定性を付与するために適切な範囲で存在し得る。
さらなるリポソーム技術は、米国特許第６，７５９，０５７号、同第６，４０６，７１３号、同第６，３５２，７１６号、同第６，３１６，０２４号、同第６，２９４，１９１号、同第６，１２６，９６６号、同第６，０５６，９７３号、同第６，０４３，０９４号、同第５，９６５，１５６号、同第５，９１６，５８８号、同第５，８７４，１０４号、同第５，２１５，６８０号および同第４，６８４，４７９号に記載されており、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。これらには、リポソームおよび脂質被覆マイクロバブル、ならびにそれらの製造方法が記載されている。したがって、当業者は、本発明の開示とこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本発明のポリペプチドの持続放出用のリポソームを生成することができよう。
液体製剤として、望ましい特性は、製剤が静脈内、筋肉内、関節内または皮下投与用の２５、２８、３０、３１、３２ゲージ針を通過することができる形態で供給されることである。
経皮製剤による投与は、例えば、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８６，９３８号および同第６，１８３，７７０号、同第４，８６１，８００号、同第６，７４３，２１１号、同第６，９４５，９５２号、同第４，２８４，４４４号ならびにＷＯ８９／０９０５１に、一般に記載されているものを含む、当技術分野においても公知の方法を使用して行うことができる。経皮パッチは、吸収に問題があるポリペプチドに関して特に有用な実施形態である。パッチは、皮膚浸透性活性成分の放出を１２時間、２４時間、３日間、および７日間の期間にわたって制御するように作製することができる。一例では、毎日２倍過剰の本発明のポリペプチドが、不揮発性流体中に配置される。本発明の組成物は、粘稠な不揮発性液体の形態で提供される。特定の製剤の皮膚の透過は、当技術分野における標準的な方法（例えば、Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍ． ６４：１９４－１９５ （１９７５））によって測定することができる。好適なパッチの例は、受動伝達皮膚パッチ、イオントフォレシス皮膚パッチ、またはＮｉｃｏｄｅｒｍなどのマイクロニードル付きのパッチである。
他の実施形態では、組成物を鼻腔内、頬側または舌下経路によって脳に送達して、嗅覚路経由での活性薬剤のＣＮＳへの移入および全身投与の低減を可能にすることができる。この投与経路に通常使用されるデバイスは、米国特許第６，７１５，４８５号に含まれている。この経路によって送達される組成物は、ＣＮＳ投与の増加または全身負荷の低減を可能にし、その結果、ある特定の薬物に関連する全身性毒性リスクを低下させることができる。皮下植込み型デバイスでの送達用の医薬組成物の調製は、例えば、米国特許第３，９９２，５１８号、同第５，６６０，８４８号、および同第５，７５６，１１５号に記載されているものなど、当技術分野において公知の方法を使用して行うことができる。
浸透圧ポンプは、錠剤、丸剤、カプセルまたは植込み型デバイスの形態で徐放性薬剤として使用することができる。浸透圧ポンプは、当技術分野において周知であり、当業者は、浸透圧ポンプを、持続放出性薬物送達用の浸透圧ポンプの提供の経験がある企業から容易に入手できる。例としては、ＡＬＺＡのＤＵＲＯＳ（商標）、ＡＬＺＡのＯＲＯＳ（商標）、Ｏｓｍｏｔｉｃａ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム、Ｓｈｉｒｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム、およびＡｌｚｅｔ（商標）がある。浸透圧ポンプ技術が記載されている特許は、米国特許第６，８９０，９１８号、同第６，８３８，０９３号、同第６，８１４，９７９号、同第６，７１３，０８６号、同第６，５３４，０９０号、同第６，５１４，５３２号、同第６，３６１，７９６号、同第６，３５２，７２１号、同第６，２９４，２０１号、同第６，２８４，２７６号、同第６，１１０，４９８号、同第５，５７３，７７６号、同第４，２００，０９８４号、および同第４，０８８，８６４号であり、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、本発明の開示とこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本発明のポリペプチドの持続放出用の浸透圧ポンプを製造することができよう。
シリンジポンプも、徐放性薬剤として使用することができる。そのようなデバイスは、米国特許第４，９７６，６９６号、同第４，９３３，１８５号、同第５，０１７，３７８号、同第６，３０９，３７０号、同第６，２５４，５７３号、同第４，４３５，１７３号、同第４，３９８，９０８号、同第６，５７２，５８５号、同第５，２９８，０２２号、同第５，１７６，５０２号、同第５，４９２，５３４号、同第５，３１８，５４０号、および同第４，９８８，３３７号に記載されており、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、本発明の開示とこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本発明の組成物の持続放出用のシリンジポンプを製造することができよう。
医薬品キット
別の態様では、本発明は、ＢＰＸＴＥＮポリペプチドの使用を助長するキットを提供する。一実施形態では、キットは、少なくとも第１の容器内に、（ａ）疾患、状態または障害を処置することを必要とする対象への投与の際に疾患、状態または障害を処置するのに十分な量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物と、（ｂ）ある量の薬学的に許容される担体とを、一緒に、すぐに注射できるかまたはすぐに滅菌水、緩衝液もしくはデキストロースでの再構成できる製剤中に含み、これらに加えて、ＢＰＸＴＥＮ薬物ならびに貯蔵および取扱い条件を特定するラベル、ならびに薬物について認可された適応症に関するシート、認可された適応症の予防および／または処置に使用するためのＢＰＸＴＥＮ薬物の再構成および／または投与、適切な薬用量および安全情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を特定する情報についての使用説明書を含む。前述のものの別の実施形態では、キットは、ＢＰＸＴＥＮ組成物に好適な希釈剤を保持することができる第２の容器を含み得、この希釈剤によって、ユーザーは、対象に送達すべき適切な濃度のＢＰＸＴＥＮを得られることになる。
（実施例１）
ＸＴＥＮの構築
ＸＴＥＮおよび様々な成分を、ＷＯ２０１０／０９１１２２に記載されているように作製し、アセンブルすることができ、これはその全体が、特に、ＸＴＥＮ配列ならびにそれらの製造およびアセンブリーに関するその教示に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
（実施例２）
ＢＰＸＴＥＮの、例としてＸＴＥＮサイトカインの、産生および評価方法
ＢＰＸＴＥＮ組成物を産生および評価するための一般スキームを図６に提示し、このスキームが、本実施例の一般的な説明の基礎を成す。開示する方法および当業者に公知の方法を、例証的な例で提供するガイダンスと一緒に使用することにより、当業者は、ＸＴＥＮ、ＢＰ、および当技術分野において公知のＢＰのバリアントを含む、様々なＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を作出し、評価することができる。したがって、本実施例を、単に例証的なものと見なすべきであり、いかなる点においても何があっても本方法を限定するものと見なすべきではなく、非常に多くの変形形態が当業者に明らかになる。この予測的実施例では、ＡＥモチーフファミリーのＸＴＥＮに連結したＩＬ１０のＢＰＸＴＥＮを作出することになる。
ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを産生するための一般スキームを図４および５に提示する。図５は、本発明の実施形態の１つでのＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物のアセンブリーにおける代表的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１を、配列モチーフ５０２、例えば、１２アミノ酸モチーフ（「１２－ｍｅｒ」）にアニールし、その後、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含有するオリゴ５０３とライゲーションする。モチーフライブラリーを特定の配列のＸＴＥＮファミリー、例えば、表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭまたはＡＱ配列に限定することができる。この場合、ＡＥファミリーのモチーフ（配列番号１８６～１８９）をモチーフライブラリーとして使用することになり、これらを１２－ｍｅｒにアニールして「基本単位」長、例えば、３６アミノ酸をコードするセグメントを作出する。ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を、ＸＴＥＮ遺伝子５０４の所望の長さが得られるまで、「基本単位」のライゲーションおよび多量体化によりアセンブルすることができる。図５に示されているように、この場合のＸＴＥＮ長は、４８アミノ酸残基であるが、より長い長さをこのプロセスにより得ることができる。例えば、多量体化を、ライゲーション、オーバーラップ伸長、ＰＣＲアセンブリー、または当技術分野において公知の同様のクローニング技法により行うことができる。ＸＴＥＮ遺伝子をスタッファーベクターにクローニングすることができる。図５に示されている例では、このベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６をコードすることができ、続いて、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ部位に隣接しているスタッファー配列５０７、そしてＢＰ遺伝子（例えば、エクセンディン－４）５０８をコードすることができ、その結果、ＢＰＸＴＥＮ５００をコードする遺伝子が得られ、これがは、この場合、Ｎ末端からＣ末端へ、ＸＴＥＮ－ＩＬ１０である立体配置の融合タンパク質をコードする。
ＩＬ１０（または別の候補ＢＰ）をコードするＤＮＡ配列を、適切な細胞源から調製されたｃＤＮＡライブラリーから、ゲノムライブラリーから、当技術分野において公知の標準手順により適便に得ることができ、または一般的に入手可能なデータベース、特許、もしくは参考文献から得たＤＮＡ配列を使用して合成的に作出（例えば、自動核酸合成）することができる。次いで、タンパク質のＩＬ１０部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドを、生物システムにおける高レベルタンパク質発現のために、適切な転写および翻訳配列の制御下にあるプラスミドまたは他のベクターであり得る、本明細書に記載するものなどの、構築物にクローニングすることができる。ＸＴＥＮ部分をコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチド（図５の場合、４８アミノ酸残基を有するＡＥとして示されている）を、ライゲーションまたは多量体化ステップによって、ＩＬ１０をコードする遺伝子に隣接してまたはその遺伝子とインフレームで構築物にクローニングすることにより、ＩＬ１０遺伝子のＮ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子融合させることができる。このようにして、ＸＴＥＮ－ＩＬ１０ ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする（またはそれに相補的な）キメラＤＮＡ分子を構築物の中に生成することになる。構築物を、単量体ポリペプチドとしての融合パートナーの様々な順列をコードするように、様々な立体配置で設計することができる。例えば、遺伝子は、融合タンパク質を（Ｎ末端からＣ末端へ）ＩＬ１０－ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ－ＩＬ１０；ＩＬ１０－ＸＴＥＮ－ＩＬ１０；ＸＴＥＮ－ＩＬ１０－ＸＴＥＮの順序でコードする、および前述のものの多量体をコードするように、作出することができる。必要に応じて、このキメラＤＮＡ分子を、より適切な発現ベクターである別の構築物に移入またはクローニングすることができる。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現できる宿主細胞にキメラＤＮＡ分子を導入して形質転換を生じさせることになる。目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターを、上で説明したように、細胞宿主のタイプに依存して、周知の方法により適切な宿主細胞に移入することができる。
ＸＴＥＮ－ＩＬ１０発現ベクターを含有する宿主細胞を、プロモーターを活性化するために必要に応じて修正した従来の栄養培地で培養することになる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に関して以前に使用されたものであり、当業者には明らかであるだろう。融合タンパク質の発現後、細胞を遠心分離により収集し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を、下で説明するような融合タンパク質の精製のために保持することになる。宿主細胞により分泌されたＢＰＸＴＥＮ組成物のために、遠心分離からの上清を分離し、さらなる精製のために保持することになる。
試料における遺伝子発現を、直接、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：５２０１－５２０５ （１９８０））、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、または本明細書で提供される配列に基づく、適切な標識プローブを使用する、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、測定することができる。あるいは、免疫学的蛍光法、例えば、細胞の免疫組織化学染色により、遺伝子発現を測定して、遺伝子産物の発現を直接定量することができる。試料流体の免疫組織化学染色および／またはアッセイに有用な抗体は、モノクローナルであることもあり、またはポリクローナルであることもあり、任意の哺乳動物でそれを調製することができる。適便には、本明細書で提供される配列に基づく合成ペプチドを使用してＩＬ１０配列ポリペプチドに対する抗体を、またはＩＬ１０に融合されており、特定の抗体エピトープをコードしている、外因性配列に対する抗体を、調製することができる。選択可能なマーカーの例は、当業者に周知であり、レポーター、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む。
ＸＴＥＮ－ＩＬ１０ポリペプチド産物を当技術分野において公知の方法によって精製することになる。ゲル濾過、親和性精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動などの手順は、すべて、精製に使用することができる技法である。特定の精製方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ． Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ． Ｃａｓｔｏｒ， ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ １９９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．、上掲に記載されている。多段階精製分離も、Ｂａｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０： １７９－９０ （１９９０）およびＢｅｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ６７９：６７－８３ （１９９４）に記載されている。
図６に示されているように、次いで、単離されたＸＴＥＮ－ＩＬ１０融合タンパク質をそれらの化学的特性および活性特性について特徴付けることになる。単離された融合タンパク質を、例えば、配列、純度、見掛けの分子量、溶解度および安定性について、当技術分野において公知の標準的な方法を使用して特徴付けることになる。次いで、目標水準を満たす融合タンパク質を活性について評価することになり、活性は、本明細書で開示される１つまたは複数のアッセイを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測定することができる。
加えて、実施例２５で説明されるように、ＸＴＥＮ－ＩＬ１０融合タンパク質を１つまたは複数の動物種に投与して、標準薬物動態パラメーターを決定することになる。
ＸＴＥＮ－ＩＬ１０構築物の産生、発現および回収の反復プロセス、続いて、本明細書で開示する方法または当技術分野において公知の他の方法を使用するそれらの特徴付けによって、当業者は、ＩＬ１０およびＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮ組成物を産生し、評価して、対応する非融合ＩＬ１０と比較して治療活性の全体的な向上につながる、予想された特性、例えば、溶解度の向上、安定性の向上、薬物動態の改善および免疫原性の低下を確認することができる。所望の特性を有さない融合タンパク質については、異なる配列をこれらの方法により構築し、発現させ、単離し、評価して、そのような特性を有する組成物を得ることができる。
（実施例３）
ＸＴＥＮ融合タンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー分析を、漸増長の様々な治療用タンパク質および非構造化組換えタンパク質を含有する融合タンパク質において行う。例示的なアッセイは、ＴＳＫＧｅｌ－Ｇ４０００ ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを使用し、このカラムで、１ｍｇ／ｍｌの濃度の４０μｇの精製グルカゴン融合タンパク質を、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．８、１１４ｍＭ ＮａＣｌ中、０．６ｍｌ／分の流速で分離する。クロマトグラムプロファイルを、ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを使用してモニターする。すべてのアッセイについてのカラム較正を、ＢｉｏＲａｄからのサイズ排除較正標準物質を使用して行う。ＩＬ１０およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質は、腎クリアランスを低減することができ、その結果、非融合生物活性タンパク質と比べて、終末相半減期の増加に寄与することおよび治療効果または生物学的効果を改善することができると考えられる。
（実施例４）
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度の最適化
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度が変更される、融合タンパク質のバリアントを、作出することができる。ＸＴＥＮ放出プロテアーゼによるＸＴＥＮ放出速度は、ＸＴＥＮ放出部位の配列に依存するので、ＸＴＥＮ放出部位のアミノ酸配列を変えることにより、ＸＴＥＮ放出速度を制御することができる。多くのプロテアーゼの配列特異性が、当技術分野において周知であり、いくつかのデータベースに文書で記録されている。この場合は、プロテアーゼのアミノ酸特異性を、基質のコンビナトリアルライブラリー［Ｈａｒｒｉｓ， Ｊ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９７： ７７５４］を使用して、または［Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３２： ４３４４］で例証されているように基質混合物の切断を追跡することにより、マッピングすることになる。代替案は、ファージディスプレイによる所望のプロテアーゼ切断配列の同定である［Ｍａｔｔｈｅｗｓ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０： １１１３］。バリアント配列を用いて構築物を作製し、ＸＴＥＮポリペプチドの検出用の標準的なアッセイを使用してＸＴＥＮの放出についてアッセイすることになる。
（実施例５）
予測アルゴリズムによる二次構造についての配列の解析
アミノ酸配列を、二次構造について、ある特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、例えば、周知のＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ， Ｐ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ． （１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３： ２２２－４５）およびＧａｒｎｉｅｒ－Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ－Ｒｏｂｓｏｎ、または「ＧＯＲ」法（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ， Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ， Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ． （１９９６）． ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０－５５３）によって、評価することができる。所与の配列について、アルゴリズムは、二次構造がある程度存在するのか、または全く存在しないのかを予測し、例えばアルファ－ヘリックスもしくはベータ－シートを形成する配列の残基の総数および／もしくはパーセンテージとして、またはランダムコイルを形成する結果となると予測される配列の残基のパーセンテージとして表すことができる。
ＸＴＥＮ「ファミリー」からのいくつかの代表配列を、これらの配列中の二次構造の程度を評価するためにＣｈｏｕ－ＦａｓｍａｎおよびＧＯＲ法について、２つのアルゴリズムツールを使用して評価した。Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎツールは、２００９年６月１９日に存在したＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂの．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ １にあったＵＲＬのインターネットサイト「Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」において、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎおよびバージニア大学により提供されたものである。ＧＯＲツールは、２００８年６月１９に存在したＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂの．ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌにあったＵＲＬのインターネットサイトＮｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＡｎａｌｙｓｉｓにおいてＰｏｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ Ｌｙｏｎｎａｉｓにより提供されたものである。
解析の第１ステップとして、単一のＸＴＥＮ配列を２つのアルゴリズムにより解析した。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＰおよびＡからなる４つの１２アミノ酸配列モチーフの複数のコピーから作出した８６４アミノ酸残基を有するＸＴＥＮである。配列モチーフは、いずれの２連続アミノ酸の配列も１つの１２アミノ酸モチーフ内に２回より多く繰り返されない点、およびＸＴＥＮの全長に同一である３つの連続したアミノ酸がない点から、モチーフ内およびその配列内の配列全体の中の反復性が制限されることを特徴とする。Ｎ末端からのＡＦ８６４配列の連続して、より長い長さの部分を、Ｃｈｏｕ－ＦａｓｍａｎおよびＧＯＲアルゴリズムにより解析した（後者は、最低１７アミノ酸長を必要とする）。ＦＡＳＴＡ形式配列を予測ツールに入力し、解析を実行することにより、配列を解析した。解析からの結果を表１０に提示する。
結果は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ計算により、ＡＥファミリーの４つのモチーフ（表１）がアルファヘリックスもベータシートも有さないことを示す。２８８残基以下の配列は、同様に、アルファヘリックスもベータシートも有さないことが判明した。４３２残基配列は、少量の二次構造を有することが予測され、アルファ－ヘリックスに寄与するのは全パーセンテージに対して０．５％であるアミノ酸２つのみである。全長ＡＦ８６４ポリペプチドは、全パーセンテージに対して０．２％である、アルファ－ヘリックスに寄与する同じ２つのアミノ酸を有する。ランダムコイル形成についての計算により、長さの増加に伴ってランダムコイル形成パーセンテージが増加することが明らかになった。配列の最初の２４アミノ酸には、９１％のランダムコイル形成があり、この形成が、全長配列については長さの増加に伴って９９．７７％の値まで増加した。
他のモチーフファミリーからの５００アミノ酸またはそれより長い非常に多くのＸＴＥＮ配列も解析し、大部分に９５％を超えるランダムコイル形成があることを明らかにした。例外は、３つの連続したセリン残基の１例またはそれより多くの事例を伴う配列であり、結果としてベータ－シート形成が予測された。しかし、これらの配列にも、おおよそ９９％のランダムコイル形成があった。
その一方で、Ａ、ＳおよびＰのアミノ酸に限定した８４残基のポリペプチド配列をＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって評価し、それによって高いアルファ－ヘリックス予測度が予測された。「ＡＡ」および「ＡＡＡ」配列が何度も繰り返された配列は、６９％のアルファ－ヘリックス構造の全予測パーセンテージを有した。ＧＯＲアルゴリズムでは、７８．５７％のランダムコイル形成が予測され、これは、本実施例で解析したアミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐからなる１２アミノ酸配列モチーフからなるいずれの配列よりもはるかに低かった。
結論：本解析は、以下の結論を支持する：１）連続したアミノ酸に関して反復性が制限されたＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの複数の配列モチーフから作出されるＸＴＥＮは、非常に少量のアルファ－ヘリックスおよびベータ－シートを有すると予測される；２）ＸＴＥＮの長さを増加させることで、アルファ－ヘリックスの形成確率もベータシートの形成確率もさほど上昇しない；ならびに３）アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる非反復１２－ｍｅｒの付加によるＸＴＥＮ配列長の漸増によって、ランダムコイル形成パーセンテージが上昇することになる。その一方で、内部反復度がより高いＡ、Ｓ、およびＰに限定されたアミノ酸から作出されるポリペプチドは、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムおよびランダムコイル形成により判定して、アルファ－ヘリックスのパーセンテージが高いと予測される。これらの方法により評価した非常に多くの配列に基づいて、長さ約４００のアミノ酸残基より大きい、限定された反復性（いずれか１つのモチーフ内に同一の連続したアミノ酸が最大２つと定義される）を有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの配列モチーフから作出されるＸＴＥＮは、非常に限定された二次構造を有すると予想されるのが一般的である。３つの連続したセリンを含有するモチーフを除いて、表１からの配列モチーフの任意の順序または組合せを使用して、二次構造が実質的にないＸＴＥＮ配列を生じさせる結果となる約４００残基を超える長さのＸＴＥＮポリペプチドを作出することができる。そのような配列は、本明細書で開示する本発明のＢＰＸＴＥＮ実施形態に記載する特徴を有すると予想される。
表１０： ポリペプチド配列のＣＨＯＵ－ＦＡＳＭＡＮおよびＧＯＲ予測計算
Figure 2023531496000044
Figure 2023531496000045
Figure 2023531496000046
Figure 2023531496000047
Figure 2023531496000048
Figure 2023531496000049
Figure 2023531496000050
Figure 2023531496000051
Figure 2023531496000052
 ＊ Ｈ： アルファヘリックス Ｅ： ベータシート
（実施例６）
反復性についてのポリペプチド配列の解析
ポリペプチドアミノ酸配列を、より短い部分配列がポリペプチド全体の中に出現する回数を定量化することにより、反復性について評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、１９２のオーバーラップする９アミノ酸部分配列（または９－ｍｅｒ「フレーム」）を有するが、固有の９－ｍｅｒ部分配列の数は、配列内の反復性の量に依存することになる。本分析では、ポリマー部分の最初の２００アミノ酸にわたって３アミノ酸フレーム各々についての固有の３－ｍｅｒ部分配列すべての存在を合計し、それを２００アミノ酸配列内の固有の３－ｍｅｒ部分配列の絶対数で割ることによって、異なる配列を反復性について評価した。結果として得られる部分配列スコアは、ポリペプチド内の反復度を示すものである。
表１１に示す結果は、２または３アミノ酸タイプからなる非構造化ポリペプチドが、高い部分配列スコアを有し、その一方で、内部反復度の低い６つのアミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＰおよびＡの１２アミノ酸モチーフからなるものは、１０未満、一部の場合には５未満の部分配列スコアを有することを示す。例えば、Ｌ２８８配列は、２アミノ酸タイプを有し、短い、反復性の高い配列を有し、その結果、部分配列スコアが５０．０となる。ポリペプチドＪ２８８は、３アミノ酸タイプを有するが、短い反復配列も有し、その結果、部分配列スコアが３３．３となる。Ｙ５７６も、３アミノ酸タイプを有するが、内部リピートで構成されておらず、このことが、最初の２００アミノ酸にわたっての１５．７という部分配列スコアに反映されている。Ｗ５７６は、４タイプのアミノ酸からなるが、より高い内部反復度、例えば「ＧＧＳＧ」（配列番号２７０）を有し、その結果、部分配列スコアが２３．４となる。ＡＤ５７６は、４タイプの１２アミノ酸モチーフからなり、これらのモチーフ各々が、４タイプのアミノ酸からなる。個々のモチーフの低い内部反復度のため、最初の２００アミノ酸にわたっての全体的な部分配列スコアは、１３．６である。対照的に、４モチーフからなるＸＴＥＮは、６タイプのアミノ酸を含有し、内部反復度が低い各々が、より低い部分配列スコア、例えば、ＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、およびＡＭ８７５（４．５）を有する。
結論：本結果は、本質的に非反復性である４～６アミノ酸タイプから各々がなる、１２のアミノ酸部分配列モチーフを組み合わせて、より長いＸＴＥＮポリペプチドにすることによって、配列全体が非反復性となることを示す。このことは、各部分配列モチーフが、配列にわたって複数回使用され得るという事実にもかかわらず、である。対照的に、より少数のアミノ酸種タイプから作出されるポリマーは、より高い部分配列スコアを生じる結果となったが、実際の配列は、より低い部分配列スコアを得るために反復度を低下させるように調整することができる。
表１１： ポリペプチド配列の部分配列スコア計算
Figure 2023531496000053
Figure 2023531496000054
Figure 2023531496000055
Figure 2023531496000056
（実施例７）
ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの計算
９ｍｅｒペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏによって記載されるように［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １７： ５５５］、ポケットポテンシャルを加えることによって、計算することができる。本実施例では、別々のＴｅｐｉｔｏｐｅスコアを、個々のＨＬＡ対立遺伝子について計算した。配列Ｐ１－Ｐ２－Ｐ３－Ｐ４－Ｐ５－Ｐ６－Ｐ７－Ｐ８－Ｐ９を有するペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを計算するために、表１２中の対応する個々のポケットポテンシャルを加えた。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧ（配列番号２７１）を有する９ｍｅｒペプチドのＨＬＡ＊０１０１Ｂスコアは、０、－１．３、０、０．９、０、－１．８、０．０９、０、０の合計となる。
長いペプチドについてのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価するために、配列の９ｍｅｒ部分配列すべてについてこのプロセスを繰り返すことができる。このプロセスを、他のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるタンパク質について繰り返すことができる。表１３～表１６は、白人集団に高い頻度で存在するＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質産物についてポケットポテンシャルを与える。
この方法によって計算したＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、おおよそ－１０～＋１０の範囲である。しかし、位置Ｐ１に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ（配列番号２７２））を欠いている９ｍｅｒペプチドは、－１００９～－９８９の範囲の算出ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを有した。この値は、生物学的に意味がなく、疎水性アミノ酸が、ＨＬＡ結合のためのアンカー残基として機能するという事実を示しており、Ｐ１に疎水性残基を欠いているペプチドにはＨＬＡへの結合因子がないと考えられる。ほとんどのＸＴＥＮ配列は疎水性残基を欠いているので、９ｍｅｒ部分配列のすべての組合せが、－１００９～－９８９の範囲内のＴＥＰＩＴＯＰＥを有する。本方法によって、ＸＴＥＮポリペプチドは、予測Ｔ細胞エピトープをほとんどまたは全く有し得ないことが確証される。
表１２： ＨＬＡ＊０１０１Ｂ対立遺伝子のポケットポテンシャル。
Figure 2023531496000057
Figure 2023531496000058
 表１３： ＨＬＡ＊０３０１Ｂ対立遺伝子のポケットポテンシャル。
Figure 2023531496000059
 表１４： ＨＬＡ＊０４０１Ｂ対立遺伝子のポケットポテンシャル。
Figure 2023531496000060
Figure 2023531496000061
 表１５： ＨＬＡ＊０７０１Ｂ対立遺伝子のポケットポテンシャル。
Figure 2023531496000062
 表１６： ＨＬＡ＊１５０１Ｂ対立遺伝子のポケットポテンシャル。
Figure 2023531496000063
Figure 2023531496000064
 表１７： ＢＰについての例示的な生物活性、例示的なアッセイおよび好ましい適応症
表１８： ＸＴＥＮに連結される例示的なＢＰＸＴＥＮ
Figure 2023531496000066
Figure 2023531496000067
Figure 2023531496000068
 ＊ 配列名は、ＢＰおよびＸＴＥＮ成分のＮ末端からＣ末端への立体配置を反映する
表Ｂ． 例示ＸＴＥＮ化ＩＬ－１２構築物および参照構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列。
Figure 2023531496000069
Figure 2023531496000070
Figure 2023531496000071
上文の表Ｂに示したように、各々の例示融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端に位置するポリ－ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－タグ）は、必要に応じる。
（実施例８）
ＩＬ１２活性アッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２レポーター細胞をＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入し、ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎孔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ、１Ｘ ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎからなる、培養培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＩＬ１２活性アッセイのために、直ぐ前の文で説明したように、しかし抗生物質ＮｏｒｍｏｃｉｎおよびＳｅｌｅｃｔｉｏｎなしで、試験培地を調製した。試験培地および１Ｘ ＰＢＳを水浴中３７℃に加温した。予温したＰＢＳが入っているフラスコを洗浄することによりフラスコから細胞を取り除き、続いて、３００ｘｇ（１２００ｒｐｍ）で５分間、室温で遠心分離し、細胞生存率を決定し、細胞ペレットを試験培地に再懸濁させて細胞０．８３３×１０ｅ６個／ｍＬにした。９０マイクロリットル（９０μＬ）の細胞を９６ウェル透明平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５９５）の各ウェルに分取した。ＩＬ１２試験物品を、最高濃度を１７ｎＭにして試験培地中１０倍濃度で調製し、続いて、１．７ｐＭまで１０倍連続希釈した。次いで、１０ｕＬの１０倍溶液を９０μＬの細胞に添加し、プレートを２４時間インキュベートした。翌日、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の検出試薬であるＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ溶液を、ＱＢ試薬およびＱＢ緩衝剤を室温のＭｉｌｌｉＱ水で各々１％（ｖ／ｖ）濃度に希釈することにより調製した。混合物を室温で１０分間インキュベートした。その後、１８０μＬを９６ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに分取し、各ウェルに２０μＬの上清を添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。異なるインキュベーション時間間隔（１５分、３０分、１時間、２時間、３時間）で、マイクロプレートリーダを使用して光学密度（Ｏ．Ｄ．）を６５０ｎｍで測定した。結果をエクセルソフトウェアにより分析し、３時間の時点からのものをここに提示した。
図８に示されているように、ＩＬ－１２誘発ＳＴＡＴ４活性化に応答して分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を産生するＩＬ－１２レポーター細胞を、漸増濃度のＩＬ－１２試験物品で２４時間処理した。上清中のＳＥＡＰのレベルを、ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅｅ溶液を使用して測定し、プレートを６５０ｎｍの光学密度で読み取った。ＸＴＥＮ化ＩＬ１２（配列番号２）組成物曲線（三角）は、対応する脱ＸＴＥＮ化ＩＬ１２組成物曲線（菱形）と比べて少なくとも２倍シフトしたが、これは、サイトカイン活性を低減するＸＴＥＮのマスキング効果を示す。
（実施例９）
ＩＬ１２レポーター結合アッセイ
ヒトＩＬ－１２レポーターを発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、実施例８に記載の通り）を使用して、ＩＬ－１２レポーターへのＩＬ１２構築物の結合を評価した。ＸＴＥＮ配列、続いての放出セグメント配列に加えてＮ末端ｈｉｓ－タグを有する組換え一本鎖マウスＩＬ１２を含有する、漸増濃度の例示「ＸＴＥＮ化ＩＬ１２」構築物（配列番号２）（１μＭ）を、５０，０００個の２９３ＨＥＫ－ＩＬ－１２レポーター細胞とともにインキュベートし、その後、洗浄し、表面に結合したＩＬ１２を、検出用の蛍光標識抗Ｈｉｓタグ抗体を使用してフローサイトメトリーによりモニターした。ＸＴＥＮ化ＩＬ１２による結合を、組換え一本鎖マウスＩＬ－１２とＣ末端Ｈｉｓタグとを含有する参照ＩＬ－１２構築物（配列番号４）の結合と比較した。ヒトマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）でのその活性化後のＸＴＥＮ化ＩＬ－１２からのＨｉｓタグの放出に起因して、本発明者らは、その活性化形態のＩＬ－１２結合をこのアッセイでは評価することができなかった。ＭＭＰ９切断により放出されたＸＴＥＮ断片は、Ｈｉｓタグを保持しており、それを結合特異性対照として使用した。図９Ａ～９Ｂに示されているように、ＸＴＥＮは、融合タンパク質中に存在するとき、サイトカインのその対応するＩＬ１２受容体への結合をマスキングした。ＸＴＥＮ化ＩＬ－１２は、半数効果濃度（ＥＣ５０）の増加により特徴付けられる、ＸＴＥＮに連結されていない場合のＩＬ１２の対応する結合活性と比較して低減される結合親和性を示した。
（実施例１０）
例示的なＸｔｅｎ化ＩＬ１２構築物
ある特定の例示的な実施形態では、４倍Ｘｔｅｎ化されたＩＬ１２サブユニットを使用してＸＴＥＮ化ＩＬ１２構築物を作出した。下の表は、Ｘｔｅｎ化されている例示的なＩＬ１２ ｐ３５サブユニットおよびＸｔｅｎ化されているＩＬ１２ ｐ４０サブユニットの核酸およびアミノ酸配列を提供する。
図１０Ａおよび１０Ｂは、上の２つの構築物の模式図を示す。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１２活性アッセイを、実質的に、上の実施例９で説明したように行った。これらのアッセイからのデータを図１０Ｃで照合し、下の表１９に提示する。
表１９： ＨＥＫ Ｂｌｕｅ アッセイを使用して報告されたＩＬ１２活性
Figure 2023531496000072
これらのデータは、生成されたＰＡＣが、ヘテロ二量体調製について予想された通りの組換えｍｕＩＬ１２に対して等価の活性を有すること、およびＩＬ１２のＸＴＥＮ化が、半数効果濃度（ＥＣ５０）の増加により特徴付けられる、ＸＴＥＮに連結されていない場合のＩＬ１２の対応する結合活性と比較して低減される結合親和性をもたらすことを、明らかに示す。しかるが故に、このデータは、ＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ構築物が、裸のＩＬ１２のものと同等になるほど十分なマスキングおよび活性を呈することを示す。その上、トランスグルタミナーゼタグの存在は、ＩＬ１２活性に影響を与えない。
さらなる分析で、ＩＬ１２に対する１（ＡＰ２４５０）、３（ＡＰ２４４７）および４（ＡＰ２４４６）ＸＴＥＮの効果（図１１Ａ～Ｃおよび表２０）を比較した。
Figure 2023531496000073
Figure 2023531496000074
収集したデータに、すべてのＸＴＥＮは、マスキングに寄与すること、および単一部位でＸＴＥＮを増加させても付加的な利益をもたらさないが、発現に二重プラスミド形式を使用することによって付加的なＸＴＥＮ付加利益が得られることが見られた。最も好ましい構築物：ＡＰ２４４６、ＡＰ２４５０、ＡＰ２４０７を、さらなる研究に選択した。
次の反復で、ＩＬ１２ヘテロ二量体の精製および分析の各々についての設計を探究するために、ＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ構築物を設計しなおした。３つの構築物の設計を以下の表に示し、構築物の概略図を図１２Ａ（表２２に示すＸＰ５／ＸＰ１３配列から構成されるＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ．１）、１２Ｂ（表２２に示すＸＰ４／ＸＰ１０配列から構成されるＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ．２）、および１２Ｃ（表２２に示すＸＰ３／ＸＰ９配列から構成されるＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ．３）に概略図として示し、下の表２１に記載する：
表２１： ４つのＸＴＥＮ配列を各々が含む３つの例示的なＩＬ１２－ＸＰＡＣの特色
Figure 2023531496000075
 表２２： 表２１に示したＸＰＡＣの例示的なｘｔｅｎ化サブユニットの配列
Figure 2023531496000076
Figure 2023531496000077
Figure 2023531496000078
Figure 2023531496000079
Figure 2023531496000080
Figure 2023531496000081
Figure 2023531496000082
Figure 2023531496000083
Figure 2023531496000084
Figure 2023531496000085
Figure 2023531496000086
Figure 2023531496000087
Figure 2023531496000088
Figure 2023531496000089
Figure 2023531496000090
Figure 2023531496000091
Figure 2023531496000092
Figure 2023531496000093
Figure 2023531496000094
Figure 2023531496000095
Figure 2023531496000096
Figure 2023531496000097
Figure 2023531496000098
Figure 2023531496000099
Figure 2023531496000100
Figure 2023531496000101
Figure 2023531496000102
Figure 2023531496000103
Figure 2023531496000104
Figure 2023531496000105
Figure 2023531496000106
Figure 2023531496000107
Figure 2023531496000108
Figure 2023531496000109
（実施例１１）
ＩＬ１２－ＸＰＡＣ－４Ｘ試験化合物のマウスモデルに対するｉｎ ｖｉｖｏ効果
ＩＬ－１２－ＸＰＡＣ－４Ｘの毒性を、ＭＣ３８腫瘍を担持しているＣ２７／Ｂｌｋ６マウスモデルでモニターした。このマウスモデルを使用して、試験化合物とｍｕＩＬ１２の毒性効果を比較した。試験物品を非担腫瘍マウスに３日に１回（Ｄ０３、Ｄ１３、Ｄ１６、およびＤ１９）に投与した。有意な毒性（体重減少により測定して）は、このモデルにおいて投与した用量で見られなかった。これらの非担腫瘍マウスには体重の変化により測定してＸＰＡＣで処置したマウスには毒性の徴候がなかったことを示す、これらのデータを、図１５Ｂに示す。しかし、ＩＬ１２で処置したマウスには、体重減少パーセンテージからも明らかなように、用量依存性の毒性があった。
以下の表は、ｒＩＬ－１２およびＩＬ－１２ＸＰＡＣの有効性を試験するためのｉｎ ｖｉｖｏ研究設計を示す：
Figure 2023531496000110
図１４は、上に概要を示した研究から生成された腫瘍退縮データを示す。対照群（群１）のマウスと比較して、ＩＬ－１２ＸＰＡＣで処置したマウス（群５および６）には腫瘍体積の有意な減少があった。それに比べて、ｒＩＬ－１２で処置したマウス（群２、３および４）には腫瘍退縮がほとんどまたは全くなかった。図１５Ａは、上述の群についての毒性／体重データであって、試験物品の投与の結果として体重の変化がなかったことを示したデータを示す。
（実施例１２）
腫瘍標的化ドメインを含むＸｔｅｎ化ＩＬ１２構築物
図１３は、ＸＰＡＣが腫瘍標的化ドメインをさらに含む本開示の追加の例示的な実施形態を示す。この図は、１本の鎖上の腫瘍標的化ドメインを示しているが、腫瘍標的化ドメインが１本より多くの鎖上に存在し得ること、および他のＸＴＥＮ鎖のうちの１鎖上に存在し得ることを理解されたい。腫瘍標的化ドメインの位置は、それがサイトカインのマスキングに干渉しないような位置であるべきであり、かつ腫瘍標的化ドメインが標的となる抗原を認識することができるような位置でもあるべきである。
腫瘍標的化ドメインは、例示的な実施形態ではＸｔｅｎ化もされ得る。理想的には、腫瘍標的化ドメインは、腫瘍細胞に発現されるが健康な細胞には非存在であるものである。例えば、腫瘍では、および慢性炎症状態では、組織再構築および新血管形成プロセスは、そうでなければ健康な臓器では事実上検出できない抗原を露出する。一例は、細胞外基質（ＥＣＭ）の糖タンパク質である、フィブロネクチンのスプライスバリアントにより代表される。フィブロネクチンのエクストラドメインＡおよびＢ（ＥＤＡおよびＥＤＢ）は、腫瘍において組織再構築部位におよび胎児発達中に強く発現されるが、そうでなければ、女性生殖器系を例外として、正常な組織には見られない。同様に、テネイシン－Ｃのスプライスバリアントは、新血管形成中の、細胞内ｐＨにより調節される過程で、組織および腫瘍に特異的に見られる。それ故、ＥＤＡ、ＥＤＢ、およびテネイシン－Ｃのスプライスバリアントは、サイトカインのような生物活性ペイロードの送達の好適な標的に相当する。
腫瘍悪性病変における分子標的は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、細胞性抗原（例えば、ＣＥＡおよびＰＳＭＡ）、または壊死性病変部で到達可能になるタンパク質、例えばヒストンを含み得る。サイトカイン融合に関して広範囲に特徴付けられている抗体としては、Ｆ８（ＥＤＡ－フィブロネクチンを標的とする；例示的なＥＤＡ標的化抗体については米国特許出願公開第２０２１０１６３５７９号を参照されたい）、Ｌ１９（ＥＤＢ－フィブロネクチンを標的とする；米国特許出願公開第２０２００３９７９１５号）、Ｆ１６（テネイシン－ＣのＡ１ドメインを標的とする）、ｓｃＦｖ３６（ＦＡＰを標的とする）、ｈｕ１４．１８（ＧＤ２ガングリオシドを標的とする）、ｃｈＣＬＬ－Ｉ（ＣＤ２０を標的とする）および抗ＨＥＲ２／ｎｅｕが挙げられる。
単に例として、当業者に、フィブロネクチンＥＤＢを標的とするように設計されたＩＬ－１２構築物の詳細な説明を提供している、米国特許出願公開第２０２００３９７９１５号を紹介する。米国特許出願公開第２０２１０１６３５７９号は、フィブロネクチンのＥＤ－Ａを標的とする例示的な構築物を示す。フィブロネクチンのＥＤ－Ａは、腫瘍血管新生のマーカーであることが示されており、腫瘍標的化のために、単独でＦ８抗体（ＷＯ２００８／１２００１、ＷＯ２００９／０１３６６１９、ＷＯ２０１１／０１５３３３）、あるいはＴＮＦもしくはＩＬ２または両方に融合されたＦ８抗体（Ｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １２２， ２４０５－２４１３；Ｈｅｍｍｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ， （２０１３） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １０９， １２０６－１２１３；Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ． Ｕｒｏｌ． １８４， ２５４０－２５４８；ＷＯ２０１０／０７８９４５、ＷＯ２００８／１２０１０１、ＷＯ２０１６／１８０７１５）、ＩＬ４に融合されたＦ８抗体（ＷＯ２０１４／１７３５７０）、あるいはＩＬ１２に融合されたＦ８抗体（ＷＯ２０１３／０１４１４９）が使用されている。
本発明のＸＰＡＣにおける使用に特に好ましい腫瘍標的化ドメインは、米国特許出願公開第２０２００３９７９１５号に記載されているＬ１９抗体またはその機能的バリアントである。以下の表２３は、Ｌ１９の可変重鎖および軽鎖の配列ならびにこれらの鎖のＣＤＲ配列を示す。
表２３： ＸＰＡＣ中の腫瘍結合ドメインとして使用するための例示的なＬ１９抗体配列
Figure 2023531496000111
本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し、説明したが、このような実施形態を単なる例として提供することは当業者には明らかであろう。本明細書で提供する特定の実施例によって本発明を限定することを意図していない。本発明を上記の明細書に関して説明したが、本明細書における実施形態の説明および例証は、限定する意味に解釈されるように意図したものではない。本発明から逸脱することなく、非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態が、今や当業者の心に浮かぶことであろう。さらに、本発明のすべての態様が、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載の特定の描示にも、立体配置にも、相対的割合にも限定されないことを理解されたい。本明細書に記載する本発明の実施形態の様々な代替形態を、本発明を実施する際に利用することができることは、理解されるはずである。したがって、本発明が、そのような代替形態、修飾形態、変更形態または均等物もカバーすることが企図される。下記の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、およびこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることを意図している。

Claims (34)

  1. （ａ）伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）であって、
    ｉ．少なくとも１２アミノ酸を含むこと；
    ｉｉ．前記ＸＴＥＮ配列のアミノ酸残基の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択されること；ならびに
    ｉｉｉ．Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、およびＰから選択される４～６個の異なるアミノ酸を有すること
    を特徴とするＸＴＥＮ；ならびに
    （ｂ）少なくとも１つのＸＴＥＮに連結したサイトカイン
    を含む融合タンパク質。
  2. １、２、３、４個、またはそれより多くのＸＴＥＮを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 腫瘍標的化ドメインをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 放出セグメントをさらに含み、前記放出セグメント（ＲＳ）が表６～７に記載される配列から選択される配列に対して少なくとも８８％、少なくとも９４％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 前記腫瘍標的化ドメインが、前記サイトカインに連結した前記ＸＴＥＮの１つに連結される、請求項３に記載の融合タンパク質。
  6. 前記腫瘍標的化ドメインのＣ末端がさらなるＸＴＥＮに連結される、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記腫瘍標的化ドメインのＣ末端と、前記さらなるＸＴＥＮのＮ末端の間に放出部位をさらに含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. Ｎ末端からＣ末端へと、ＸＴＥＮ－ＲＳ－サイトカイン、またはサイトカイン－ＲＳ－ＸＴＥＮの構造配置を有する、請求項４に記載の融合タンパク質。
  9. 前記サイトカインが、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、またはＴＧＦ－ベータスーパーファミリーメンバーからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  10. 前記サイトカインが、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、およびＩＬ１７からなる群から選択されるインターロイキンである、請求項９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記サイトカインが、表３または表Ａから選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９に記載の融合タンパク質。
  12. 前記サイトカインがＩＬ－１２またはＩＬ－１２バリアントである、請求項９に記載の融合タンパク質。
  13. 前記サイトカインが、第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）および第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 前記Ｃｙ１および前記Ｃｙ２の一方が、インターロイキン－１２サブユニットベータに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記Ｃｙ１および前記Ｃｙ２の他方が、インターロイキン－１２サブユニットアルファに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
  16. 前記第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）が、配列番号５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  17. 前記第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）が、配列番号６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  18. 前記サイトカインが、前記第１のサイトカイン断片（Ｃｙ１）と前記第２のサイトカイン断片（Ｃｙ２）との間に位置するリンカーを含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  19. 前記Ｎ末端でＸＴＥＮを含み、前記Ｃ末端でＸＴＥＮを含むＣｙ１断片を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. 前記Ｎ末端でＸＴＥＮを含み、前記Ｃ末端でＸＴＥＮを含むＣｙ２断片を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  21. 前記サイトカインが、配列番号７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－１２バリアントである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  22. 前記ＸＴＥＮ配列が、複数の非オーバーラップ配列モチーフからなり、前記配列モチーフが表２ａ～２ｂの配列モチーフから選択される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  23. 前記ＸＴＥＮが、４０～３０００アミノ酸、または１００～３０００アミノ酸を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  24. 前記ＸＴＥＮが、表２ａ～２ｂに記載される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  25. 前記融合タンパク質中の前記ＸＴＥＮに連結した場合に、前記サイトカインの対応するサイトカイン受容体に対する結合活性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定した場合に、前記ＸＴＥＮに連結されていない場合の前記サイトカインの対応する結合活性を特徴付ける半数効果濃度（ＥＣ５０）より少なくとも１．２倍高い、少なくとも１．４倍高い、少なくとも１．６倍高い、少なくとも１．８倍高い、少なくとも２．０倍高い、少なくとも３．０倍高い、少なくとも４．０倍高い、少なくとも５．０倍高い、少なくとも６．０倍高い、少なくとも７．０倍高い、少なくとも８．０倍高い、少なくとも９．０倍高い、または少なくとも１０．０倍高いＥＣ５０によって特徴付けられる、請求項１から２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  26. 前記サイトカインが、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）であり、前記対応するサイトカイン受容体がインターロイキン１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）である、請求項２５に記載の融合タンパク質。
  27. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイが、レポータータンパク質の比例的発現を伴って、前記サイトカインが前記対応するサイトカイン受容体に対する結合に応答するように構成された、遺伝子操作されたレポーター遺伝子細胞系を利用する、請求項２５または請求項２６に記載の融合タンパク質。
  28. 請求項１から２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  29. 疾患または状態を処置することを必要とする対象における疾患または状態を処置するための医薬の調製における、請求項２８に記載の組成物の使用。
  30. 前記疾患または状態が、がん、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、ウイルス感染症、アレルギー性喘息、網膜神経変性プロセス、代謝障害、インスリン抵抗性、および糖尿病性心筋症から選択される、請求項２９に記載の使用。
  31. 対象における疾患または状態を処置または防止する方法であって、請求項１から２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項２８に記載の組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法。
  32. 前記疾患または状態が、がん、またはがん関連疾患もしくは状態である、請求項３１に記載の方法。
  33. 少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の治療有効量を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
  34. 前記融合タンパク質が、静脈内、皮下、または経口送達される、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
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