JP2023531771A - ヒトｉｌ２３受容体結合ポリペプチド - Google Patents

ヒトｉｌ２３受容体結合ポリペプチド Download PDF

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Abstract

本開示は、ヒトＩＬ－２３Ｒ（ＷＬ－２３Ｒ）結合ポリペプチド、条件的に最大限に活性のあるＳｉＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、その多量体、並びに治療で使用するための該ポリペプチド及び結合タンパク質の使用方法を提供する。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年６月２９日出願の米国仮特許出願第６３／０４５３８１号に対する優先権を主張する。
配列表の説明：
配列表のコンピュータ可読形式は、電子提出によって本出願と共に提出され、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。配列表は、２０２１年６月２３日に作成され、ファイル名「２０－８１４－ＷＯ－ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイルに含まれており、サイズは１５５ｋｂである。
背景
ＩＬ－２３サイトカインは、適応免疫と自然免疫の両方において重要な役割を果たす。ＩＬ－２３は、いくつかのリンパ球サブセット、最も特にはＴヘルパータイプ１７（Ｔｈ１７）、並びに自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）及びγＴ細胞において炎症性サイトカインの発現を誘導する。ＩＬ－２３を介したシグナル伝達の破壊は、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のための遺伝的及び臨床的に検証された治療戦略である。抗体治療薬にはいくつかの制限がある。抗体は製造コストが高く、一般的に安定性が中程度から不良であり、製造、保管、輸送及び投与にコールドチェーンが必要である。抗体療法は注入又は注射する必要があり、これは患者にとって不便でストレスがかかる可能性がある。自己免疫疾患の治療に一般的なものなどの免疫抑制抗体療法への全身曝露は、患者を結核の再活性化及び他の重篤な感染症のさらなるリスクにさらす。そのため、安全対策として、潜在性結核又はＢ型肝炎の検査で陽性となった場合、患者は抗ＴＮＦ又は抗ＩＬ－２３療法から失格となり、特に人口の比較的高い割合がＨＢＶ又は潜在性ＴＢについて陽性である発展途上国では、これらの治療法へのアクセスが制限される可能性がある。典型的には、循環中の半減期が長い抗体療法への全身曝露も、時間の経過とともに抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成を促進し、薬物を中和して有効性を低下させ得る。抗ＴＮＦ抗体の間欠投与は、ＡＤＡ発症の可能性を大幅に高め、患者が保険の適用範囲の失効などにより投与を逃した場合、薬の有効性を失うリスクが高くなる。
概要
第１の態様において、本開示は、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５のポリペプチドを含むヒトＩＬ－２３Ｒ（ｈＩＬ－２３Ｒ）結合ポリペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４が任意選択であり、Ｘ５が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ５が、配列番号１又は２の残基４０～４７のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２３Ｒ（ｈＩＬ－２３Ｒ）結合ポリペプチドを提供する。様々な実施形態において、Ｘ５が、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列を含み;Ｘ３が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、その際、Ｘ４が存在しないか、又はアミノ酸リンカーを含み;Ｘ４が存在し、アミノ酸リンカーを含み;Ｘ３が存在し、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み;Ｘ５が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列を含み;Ｘ３が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含み;Ｘ４が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３６～３８のアミノ酸配列を含み;Ｘ１が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み;Ｘ１が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含み;Ｘ２が存在し、Ｘ２はアミノ酸リンカーを含み;かつ／又はＸ２が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～２０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の各々が存在する。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１０～７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号６９及び７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
第２の態様において、本開示は、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５のポリペプチドを含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドであって、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が任意選択であり、Ｘ１が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ１が、配列番号１０１又は１０２中の残基１～１０のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドを提供する。様々な実施形態において、Ｘ１が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列を含み;Ｘ３が存在し、Ｘ３が１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ２が存在しないか、又はアミノ酸リンカーを含み;Ｘ３が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み;Ｘ１が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含み;Ｘ３が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含み;Ｘ２が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～１８のアミノ酸配列を含み;Ｘ５が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み;Ｘ５が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３７～５３のアミノ酸配列を含み;Ｘ４が存在し、Ｘ４がアミノ酸リンカーを含み；かつ／又はＸ４が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３５～３６のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が各々存在する。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１１０～１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
第３の態様において、本開示は、本明細書に開示される特定のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドを提供する。一実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号６９、７４、及び１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
第４の態様において、本開示は、配列番号８４～８７又は１８１～２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドを提供する。一実施形態において、該ポリペプチドは、該ポリペプチド中の２つのシステイン残基間にジスルフィド結合を含む。
第５の態様において、本開示は、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質であって、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分が融合タンパク質中に存在せず、
（ａ）第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分全体が、本開示の第１の態様の任意の実施形態で定義されるドメインＸ３及びＸ５を含み;
（ｂ）Ｘ３ドメインが第１のポリペプチド成分に存在し、Ｘ５ドメインが第２のポリペプチド成分に存在し；
第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、個々に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質ではなく、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチドは相互作用して、最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を形成する、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を提供する。
第６の態様において、本開示は、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質であって、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は融合タンパク質中に存在せず、
（ａ）第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分全体が、本開示の第２の態様の任意の実施形態で定義されるドメインＸ１及びＸ３を含み；
（ｂ）Ｘ１ドメインが第１のポリペプチド成分に存在し、Ｘ３ドメインが第２のポリペプチド成分に存在し；
第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、個々に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質ではなく、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は非共有結合で相互作用して、最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を形成する、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を提供する。
第７の態様において、本開示は、本開示の第１の態様の任意の実施形態について本明細書で定義されるＸ３ドメインを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、本開示の第１の態様の任意の実施形態において定義されるＸ５ドメインを含まないポリペプチドを提供する。
第８の態様において、本開示は、本開示の第２の態様の任意の実施形態について本明細書で定義されるＸ３ドメインを含むポリペプチドであって、本開示の第２の態様の任意の実施形態について本明細書で定義されるＸ１ドメインを含まないポリペプチドを提供する。
様々な他の態様において、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれか若しくは実施形態の組み合わせのｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、ポリペプチド、又はポリペプチド成分の２以上のコピーを含む多量体；本明細書の任意の実施形態のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードする核酸、適切な制御エレメントに作動可能に連結された本開示の核酸を含む発現ベクター、本明細書の任意の実施形態のポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２Ｒ結合タンパク質、多量体、核酸、又は発現ベクターを含む細胞、（ａ）本明細書の任意の実施形態若しくは実施形態の組み合わせのポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、核酸、発現ベクター、又は細胞；並びに（ｂ）医薬として許容される担体を含む医薬組成物；並びに炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない）、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、体軸性及び末梢性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、付着部炎、及び腱炎からなる群から選択される障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に該障害を治療するのに有効な量の本明細書の任意の実施形態若しくは実施形態の組み合わせのポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、核酸、発現ベクター、細胞、又は医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
図１（Ａ～Ｃ）．計算デザイン戦略。出発点としてＩＬ－２３ｐ１９:ＩＬ－２３Ｒ複合体（Ａ）の結晶構造を用いて、ｐ１９残基Ｗ１５６をホットスポットとし、追加の新規生成ホットスポット（Ｂ）をシードデザインに採用した。何千もの足場タンパク質をＩＬ－２３Ｒ界面にドッキングし、Ｗ１５６と少なくとも１つの追加の新規ホットスポット（Ｃ）を組み込んだ。ＩＬ－２３Ｒの８Ａ以内の足場残基を、ＩＬ－２３Ｒとの高親和性相互作用を促進するようにデザインした。 図２（Ａ～Ｅ）．最良の計算デザイン、親和性成熟コンビナトリアル変異体、及びジスルフィド安定化変異体の特性評価。（Ａ）計算デザイン２３Ｒ＿Ａの結合滴定。（Ｂ）最良の２つの計算デザインの温度と化学変性剤溶融物。（Ｃ）コンビナトリアル変異体Ｂ０８（２３Ｒ＿Ｂに基づく）の結合滴定。（Ｄ）最高の親和性のコンビナトリアル変異体の温度と化学変性剤溶融物。（Ｅ）デザインしたタンパク質の平衡結合定数（ＫＤ）、結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）並びに天然リガンド（ＩＬ－２３サイトカイン）及び競合分子（ＰＴＧ化合物Ｃ）。 図３．代表的な親和性成熟コンビナトリアル変異体であるＢ０８と代表的なジスルフィド安定化変異体であるＢ０４ｄｓｌｆ０２の安定性解析。（Ａ）デザインタンパク質を模擬胃液又は模擬腸液中でインキュベートし、５、１５、３０及び６０分、４時間及び２４時間の時点で分解をＳＤＳ ＰＡＧＥによって評価した。（Ｂ）温度及び化学変性剤（ＧｕＨＣｌ）に対する耐性を、示した条件でヘリックスシグネチャ（２２２ｎｍでのシグナル）を測定し、ベースライン（２５℃及び０ＭのＧｕＨＣｌ）に正規化する円二色性によって評価した。 図４（Ａ～Ｂ）．ＩＢＤの治療薬としてのＴＮＦａを標的とする臨床段階の経口腸制限ナノボディであるＶ５６５－３８Ｆと比較したデザインタンパク質のタンパク質分解安定性。（ａ）Ｖ５６５－３８Ｆは、１×ＳＩＦで最小限分解しているように見える。（ｂ）トリプシン及びキモトリプシンの濃度を３倍に増加させた（３×ＳＩＦ）後、Ｖ５６５－３８Ｆは、２４時間のＳＩＦ消化後に顕著な分解を示す。報告されたデータと一致して、Ｖ５６５－３８ＦはＳＧＦで効率的に分解される。ヒト／ラットＩＬ－２３Ｒ結合剤のｒＡ１１ｄｓｌｆ０２－Ｍ１Ｐ－Ｒ８Ｑ－Ｋ３５Ｗは、同様にＳＩＦ中で安定であり、Ｖ５６５－３８ＦよりもＳＧＦ中ではるかにより安定している。マウスＩＬ－２３Ｒ結合剤のｍＢ０９ｄｓｌｆ０１－Ｔ４８Ｉは、Ｂ５６５－３８ＦよりもＳＩＦ及びＳＧＦ中でより安定である。 図５（Ａ～Ｂ）．Ｂ０４ｄｓｌｆ０２ＩＢのアミノ末端対カルボキシ末端での親和性タグの配置は、タンパク質分解の安定性に影響を与えるが、効力には影響しない。（ａ）Ｎ末端に６ヒスチジンタグを有するＢ０４ｄｓｌｆ０２ＩＢ（６Ｈ－Ｂ０４ｄｓｆｌ０２）又はＣ末端に６ヒスチジンタグを有するＢ０４ｄｓｌｆ０２ＩＢ（Ｂ０４ｄｓｌｆ０２－６Ｈ）をＳＧＦ又はＳＩＦ中で最大２４時間インキュベートし、分解をＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価した。（Ｂ）ＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達の阻害をＩＬ－２３レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。 図６．より良好な組織浸透性を有するより小さなＩＬ－２３Ｒ阻害剤を作製するためのデザイン戦略。 図７．デザインしたＩＬ－２３Ｒ阻害剤は、インビトロでＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達をブロックする。ＩＬ－２３Ｒの下流でルシフェラーゼを発現するように操作された細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各阻害剤の滴定で３０分間プレインキュベートし、次いで、８ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２３サイトカインで６時間刺激した。ルシフェラーゼ基質を添加し、発光を読み取り、阻害剤を添加していないウェルと比較してシグナル伝達の阻害率（％）を計算した。線形回帰を用いてＩＣ５０を計算し、用量反応に適合させた。値は、競合分子ＰＴＧ化合物Ｃに対する効力の倍数増加と共に上に示す。 図８（Ａ～Ｂ）．２３Ｒ＿Ａ（Ａ）と２３Ｒ＿Ｂ（Ｂ）のディープ変異スキャンデータを表す配列適応度ランドスケープ。各デザインに基づくＳＳＭライブラリーを、ｈＩＬ－２３Ｒへの高親和性結合について一度選別した。選別したプール内の各変異の濃縮比を未処理プールと比較して計算し、ヒートマップとしてプロットした。示した値はｌｏｇ２（濃縮比率）である。 図９（Ａ～Ｆ）．Ａ０６ｄｓｌｆ０３（Ａ及びＢ）、Ｂ０４ｄｓｌｆ０２（Ｃ及びＤ）、及びＢ１１ｄｓｌｆ０１（Ｅ及びＦ）のディープ変異スキャンデータを表す配列適応度ランドスケープ。各デザインに基づくＳＳＭライブラリーを、ｈＩＬ－２３Ｒへの高親和性結合について一度選別する（左列、図９Ａ、Ｃ、及びＥ）か、又は細胞をＳＩＦでプレインキュベートし、次いで、ｈＩＬ－２３Ｒに対する中程度の親和性について選別した（右列、図９Ｂ、Ｄ、及びＦ）。選別したプール内の各変異の濃縮比を未処理プールと比較して計算し、ヒートマップとしてプロットした。示した値はｌｏｇ２（濃縮率）である。 図１０（Ａ～Ｈ）．ｒＡ１１ｄｓｌｆ０２対ｈＩＬ－２３Ｒ（Ａ及びＢ）、ｒＡ１１ｄｓｌｆ０２対ｒＩＬ－２３Ｒ（Ｃ及びＤ）、ｍＡ０３ｄｓｌｆ０３対ｍＩＬ－２３Ｒ（Ｅ及びＦ）、並びにｍＢ０９ｄｓｌｆ０１対ｍＩＬ－２３Ｒ（Ｇ及びＨ）のディープ変異スキャンデータを表す配列適応度ランドスケープ。各デザインに基づくＳＳＭライブラリーを、示されているようにラット又はマウスＩＬ－２３Ｒへの高親和性結合について一度選別する（左列、図１０Ａ、Ｃ、Ｅ、及びＧ）か、又は細胞をＳＩＦでプレインキュベートし、次いでラット又はマウスＩＬ－２３Ｒに対する中程度の親和性について選別した（右列、図１０Ｂ、Ｄ、Ｆ、及びＨ）。選別したプール内の各変異の濃縮比を未処理プールと比較して計算し、ヒートマップとしてプロットした。示した値はｌｏｇ２（濃縮率）である。 図１１（Ａ～Ｄ）．２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１４（Ａ及びＢ）並びに２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１７（Ｃ及びＤ）のディープ変異スキャンデータを表す配列適応度ランドスケープ。各デザインに基づくＳＳＭライブラリーを、示されているようにｈＩＬ－２３Ｒへの高親和性結合について一度選別するか（左列、図１１Ａ及びＣ）、又は細胞をＳＩＦでプレインキュベートし、次いで、ｈＩＬ－２３Ｒに対する高親和性について選別した（右列、図１１Ｂ及びＤ）。選別したプール内の各変異の濃縮比を親配列と比較して計算し、ヒートマップとしてプロットした。示した値はｌｏｇ２（濃縮率）である。
詳細な説明
引用する全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願において、別段の記載がない限り、利用される技術は、分子クローニング:実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１８５巻，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）、１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）の中の「タンパク質精製ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ（編），（１９９０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：方法と応用のガイド（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓら １９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、動物細胞の培養:基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７.Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、遺伝子導入及び発現プロトコル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、ページ１０９－１２８、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（編）、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、及びＡｍｂｉｏｎ １９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）などのいくつかの周知の参考文献のいずれかに見出すことができる。
本明細書で使用する場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用する場合、アミノ酸残基は以下のように略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
本明細書に開示されるポリペプチドの全ての実施形態において、任意のＮ末端メチオニン残基は任意選択である（すなわち、Ｎ末端メチオニン残基は存在してもよいし、存在しなくてもよい）。
本開示の任意の態様の全ての実施形態は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、組み合わせて使用することができる。
文脈が明確に別段の要求をしない限り、明細書及び特許請求の範囲全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、排他的又は網羅的な意味ではなく、包括的な意味で、すなわち、「含むが、これに限定されない」という意味で解釈されるべきである。単数又は複数を使用する単語には、それぞれ複数及び単数も含まれる。さらに、単語「本明細書」、「上記」、及び「下記」並びに同様の意味の単語は、本願で使用される場合に、本願全体を指すものとし、本願の特定の部分を指すものではない。
本開示は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない）、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、体軸性及び末梢性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、付着部炎、及び腱炎を治療することを含むがこれらに限定されない任意の適切な目的に使用することができるヒトＩＬ－２３受容体（ｈＩＬ－２３Ｒ）結合ポリペプチドを提供する。
第１の態様において、本開示は、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５のポリペプチドを含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドであって、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４が任意選択的であり、Ｘ５が１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ５が配列番号１又は２の残基４０～４７のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドを提供する（表１参照）。残基４０～４７は、１２～２０個のアミノ酸のポリペプチドに存在する。Ｘ５ドメイン内のさらなる残基は、任意の適切なアミノ酸であり得る。
表１ 全ての２３ＲＡ属
Figure 2023531771000001
Figure 2023531771000002
この実施形態のポリペプチドは、本明細書に記載されるように、この実施形態のポリペプチドのｈＩＬ－２３Ｒのための主要結合界面を含む（図８～１０参照）。
表１～７の各々は、２つの列を含み、各々は配列番号によって本開示の異なるポリペプチドを表す。各表について、左側の列は、模擬腸液（ＳＩＦ）での前処理なしのｈＩＬ－２３Ｒへの高親和性結合の変異分析に基づいて本開示のポリペプチドに許容される残基残基を提供し、一方、右側の列は、ＳＩＦで前処理したｈＩＬ－２３Ｒに対する安定性及び高親和性結合の変異分析に基づいて本開示のポリペプチドに許容される残基を提供する。許容残基を広範な変異分析に基づいて決定した。図８～１０を参照されたい。一実施形態において、Ｘ５が、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列を含む（表２～３参照）。
表２ ２３ＲＡ属ヒトのみ
Figure 2023531771000003
Figure 2023531771000004
表３ ｒＡ１１ｄｓｌｆ０２
Figure 2023531771000005
Figure 2023531771000006
別の実施形態において、Ｘ３が存在し、Ｘ３が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ４が、存在しないか、又はアミノ酸リンカーを含む。本開示のポリペプチドの全ての態様及び実施形態におけるＸ２及びＸ４のアミノ酸リンカーは、存在しても、存在しなくてもよい。存在する場合、アミノ酸リンカーは、意図された使用に適切と思われる任意の長さ又はアミノ酸組成のものであり得る。いくつかの実施形態において、Ｘ２及び／又はＸ４が存在し、ポリペプチドの全体的な安定性に寄与するのを助けることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、アルブミン（血清半減期を改善するため）、受容体結合ドメイン、又は蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない意図された目的に適した任意の機能ドメイン（複数可）を含み得る。
様々な実施形態において、Ｘ３が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。これらの実施形態において、Ｘ３ドメインは存在し、本開示のポリペプチドとｈＩＬ－２３Ｒとの間のさらなる結合接触を提供する（図８～１０参照）。これらのさらなる結合接触は、ｈＩＬ－２３Ｒとの結合には必要ないが、相互作用表面を拡大して、結合におけるより高い親和性と特異性を付与する。この実施形態において、Ｘ３とＸ５が、直接隣接していてもよいし、又はアミノ酸リンカーＸ４を介して連結されていてもよい。リンカーは、任意の適切な長さ及びアミノ酸組成のものであり得る。
さらなる実施形態において、Ｘ５が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｘ３が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｘ４が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３６～３８のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、Ｘ１が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含む。この実施形態において、Ｘ１が、ポリペプチドを結合可能な立体構造で安定化するのを助け、それによってｈＩＬ－２３Ｒと直接相互作用しないが結合を増強する働きをし得る。
一実施形態において、Ｘ１とＸ３が両方とも該ポリペプチドに存在する。この実施形態において、Ｘ１及びＸ３は、直接隣接していてもよいし、又はアミノ酸リンカーＸ２を介して連結されていてもよい。リンカーは、任意の適切な長さ及びアミノ酸組成のものであり得る。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ４は全て、該ポリペプチドに存在する。さらなる実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は全て、該ポリペプチドに存在する。
一実施形態において、Ｘ１が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｘ２が存在し、アミノ酸リンカーを含む。一実施形態において、Ｘ２が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～２０のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、Ｘ３が存在し、
（ａ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列を含み（表３参照）；かつ
（ｂ）Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を含む（表３参照）。
さらなる実施形態において、Ｘ３が存在し、
（ａ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列を含み（表３参照）；かつ
（ｂ）Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む（表３参照）。
別の実施形態において、Ｘ１が存在し、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の各々は、該ポリペプチド中に存在する。
一実施形態において、Ｘ５がアルファヘリックスを含む。別の実施形態において、Ｘ１が、存在する場合、アルファヘリックスを含む。さらなる実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５が全て存在し、各々がアルファヘリックスを含む。
本明細書の任意の実施形態の一実施形態において、Ｘ２及びＸ４が存在し、Ｘ２が４アミノ酸長であり、Ｘ４が３アミノ酸長である。
さらなる実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の各々は存在し、
Ｘ１が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ２が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、７５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
Ｘ３が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
Ｘ４が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも３３％、６６％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、かつ
Ｘ５が、配列番号１０～７４４のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５の各々は、配列番号１０～７４のいずれかに存在する参照ドメインのアミノ酸配列と各々少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５の各々は、配列番号１０～７４からなる群から選択される同じアミノ酸配列中に存在する参照ドメインのアミノ酸配列と各々少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。
なおさらなる実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１０～７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｘ２及びＸ４ドメインは下線と太字で示され；Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５ドメインは、Ｘ２及びＸ４によって分離される（すなわち、式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５）。全ての実施形態において、Ｎ末端アミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上は、該ポリペプチドから欠失していてもよく、そのため、パーセント同一性を考慮する場合、配列番号１０～７４のいずれか１つの参照ポリペプチドから欠失していてもよい。様々な他の実施形態において、該ポリペプチドは、
・配列番号１０～７４からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列；
・配列番号１０～７４からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ４－Ｘ５ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；
・配列番号１０～７４からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ３－Ｘ４－Ｘ５ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；
・配列番号１０～７４からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５ドメインの組み合わせのアミノ酸配列
と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023531771000007
Figure 2023531771000008
Figure 2023531771000009
一実施形態において、配列番号１０～７４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する例示的な置換を表１～３に提供する。
一実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号６９及び７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号６９又は配列番号７４のアミノ酸配列を含む。
第２の態様において、本開示は、一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５のポリペプチドを含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドであって、式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が任意選択であり、Ｘ１が１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ１が配列番号１０１又は１０２中の残基１～１０のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドを提供する（表４参照）。
表４ ２３ＲＢの許容残基（全て）
Figure 2023531771000010
Figure 2023531771000011
Figure 2023531771000012
この実施形態のポリペプチドは、本明細書に記載されるように、この実施形態のポリペプチドのｈＩＬ－２３Ｒのための主要結合界面を含む（図８～１０参照）。そのため、この実施形態のポリペプチドは、本明細書に記載の方法のいずれかに使用することができる。残基１～１０は、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメイン内に存在する。Ｘ１ドメインにおけるさらなる残基は、任意の適切なアミノ酸であり得る。
一実施形態において、Ｘ１が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列を含む（表５～７参照）。
表５：２３ＲＢヒトのみ
Figure 2023531771000013
Figure 2023531771000014
Figure 2023531771000015
表６ Ｂ０４ｄｓｌｆ０２
Figure 2023531771000016
Figure 2023531771000017
表７ ｍＢ０９ｄｓｌｆｏｌ
Figure 2023531771000018
Figure 2023531771000019
別の実施形態において、Ｘ３が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含む。この実施形態において、Ｘ２が、存在しなくてもよいか、又はアミノ酸リンカーを含むことができる。さらなる実施形態において、Ｘ３が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。これらの実施形態において、Ｘ３ドメインは存在し、本開示のポリペプチドとｈＩＬ－２３Ｒとの間のさらなる結合接触を提供する（図８～１０参照）。これらのさらなる結合接触は、ｈＩＬ－２３Ｒへの結合には必要ないが、相互作用表面を拡大して、結合におけるより高い親和性と特異性を付与する。これらの実施形態において、Ｘ３及びＸ５が、直接隣接していてもよいし、又はアミノ酸リンカーＸ４を介して連結されていてもよい。リンカーは、任意の適切な長さ及びアミノ酸組成のものであり得る。
一実施形態において、Ｘ１が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、Ｘ３が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、Ｘ２が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～１８のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、Ｘ５が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含む。この実施形態において、Ｘ５が、ポリペプチドを結合可能な立体構造で安定化するのを助け、それによってｈＩＬ－２３Ｒと直接相互作用しないが結合を増強する働きをし得る。
一実施形態において、Ｘ３とＸ５が両方とも該ポリペプチドに存在する。この実施形態において、Ｘ３及びＸ５が、直接隣接していてもよいし、アミノ酸リンカーＸ４を介して連結されていてもよい。リンカーは、任意の適切な長さ及びアミノ酸組成のものであり得る。別の実施形態において、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５は全て該ポリペプチドに存在する。さらなる実施形態において、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５は全て該ポリペプチドに存在する。
別の実施形態において、Ｘ５が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３７～５３のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｘ４が、存在し、アミノ酸リンカーを含む。さらなる実施形態において、Ｘ４が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３５～３６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｘ３が存在し、かつ：
（ａ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列を含み（表６～７）
（ｂ）Ｘ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、Ｘ３が存在し、かつ：
（ａ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含み（表６～７）
（ｂ）Ｘ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、Ｘ５が存在し、Ｘ５が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２７～５３のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｘ１がアルファヘリックスを含む。別の実施形態において、Ｘ３が、存在する場合、アルファヘリックスを含む。さらなる実施形態において、Ｘ５が、存在する場合、アルファヘリックスを含む。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５は全て存在し、各々がアルファヘリックスを含む。
別の実施形態において、Ｘ２及びＸ４が存在し、各々は２アミノ酸長である。さらなる実施形態において、Ｘ２及びＸ４における第２のアミノ酸はＤである。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の各々が存在し、その中の
Ｘ１が、配列番号１１０～１８０のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ２が、配列番号１１０～１８０のいずれかに存在するＸ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
Ｘ３が、配列番号１１０～１６４及び１６６～１８０のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
Ｘ４が、配列番号１１０～１６４、及び１７２～１８０のいずれかに存在するＸ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、かつ
Ｘ５が、配列番号１１０～１６４、及び１７３～１８０のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５の各々は、配列番号１１０～１８０の１つに存在する参照ドメインのアミノ酸配列と各々少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５の各々は、配列番号１１０～１８０からなる群から選択される同じアミノ酸配列中に存在する参照ドメインのアミノ酸配列と各々少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。
別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１１０～１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｘ２及びＸ４ドメインは下線と太字で示され；Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５ドメインは、Ｘ２及びＸ４によって分離される（すなわち、式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５）。全ての実施形態において、Ｃ末端アミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上は、該ポリペプチドから欠失していてもよく、そのため、パーセント同一性を考慮する場合、配列番号１１０～１８０のいずれか１つの参照ポリペプチドから欠失していてもよい。様々な他の実施形態において、該ポリペプチドは、
・配列番号１１０～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列；
・配列番号１１０～１６４、及び１６６～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１－Ｘ２ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；
・配列番号１１０～１６４、及び１６６～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１－Ｘ２－Ｘ３ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；又は
・配列番号１１０～１６４、及び１７３～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４ドメインの組み合わせのアミノ酸配列
と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023531771000020
Figure 2023531771000021
Figure 2023531771000022
Figure 2023531771000023
一実施形態において、配列番号１１０～１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する例示的な置換を表４～７に提供する。
一実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列を含む。
第３の態様において、本開示は、本明細書に開示される特異的ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドを提供する。一実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号６９、７４、及び１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号６９、７４、及び１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列を含む。
第４の態様において、本開示は、配列番号１８１～２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドを提供する。全ての実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端アミノ酸のうちの１、２、３、又はそれ以上は、該ポリペプチドから欠失していてもよく、そのため、パーセント同一性を考慮する場合、配列番号１８１～２２８のいずれか１つの参照ポリペプチドから欠失していてもよい。
Figure 2023531771000024
Figure 2023531771000025
以下の実施例に記載されるように、この第４の態様のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドは、２つのシステイン残基が分子内ジスルフィド結合を形成するのに適切な形状で相対的に位置づけることができるような三次元構造エレメントを保有する。そのため、一実施形態において、この第４の態様のポリペプチドは、該ポリペプチド内の２つのシステイン残基の間にジスルフィド結合を含む。
一実施形態において、配列番号１９４及び１９９～２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して許容される置換を表８に提供し、配列番号１９７及び２１７～２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して許容される置換を表９に提供する。表８～９の各々は２つの列を含む。各表について、左側の列は、（模擬腸液[ＳＩＦ]による前処理なしで）ｈＩＬ－２３Ｒへの高親和性結合の変異分析に基づいて本開示のポリペプチドに許容される残基を提供し、一方、右側の列は、（ＳＩＦで前処理を行った）ｈＩＬ－２３Ｒへの安定性及び高親和性結合の変異分析に基づいて本開示のポリペプチドに許容される残基を提供する。許容残基を広範な変異分析に基づいて決定した。以下の例を参照されたい。
Figure 2023531771000026
Figure 2023531771000027

Figure 2023531771000028
Figure 2023531771000029
別の実施形態において、ｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドは、配列番号８４～８７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
上記の各態様の一実施形態において、参照ペプチドドメインに対するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、所与のアミノ酸を、類似の生理化学的特徴を有する残基で置換すること、例えば、ある脂肪族残基を別の脂肪族残基と置換すること（互いに対してＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａなど）、又はある極性残基を別の極性残基と置換すること（ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；又はＧｌｎとＡｓｎ間など）ができることを意味する。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換が知られている。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、所望の活性、例えば、天然ポリペプチド又は参照ポリペプチドの抗原結合活性及び特異性が保持されていることを確認するために、本明細書に記載のアッセイのいずれか１つで試験することができる。アミノ酸は、それらの側鎖の性質の類似性に従って分類することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ページ７３－７５、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））の中）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づいてグループに分類することができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保守的な置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換する必要がある。特定の保存的置換には、例えば；ＡｌａからＧｌｙ又はＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａ又はＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；及び／又はＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕが含まれる。
上記の態様のいずれかの別の実施形態において、該ポリペプチドは、該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加された１以上の追加の機能ドメインをさらに含む。アルブミン（血清半減期を改善するため）、受容体ターゲティングドメイン、蛍光タンパク質などの分子プローブ、タグ（ポリヒスチジンタグを含むがこれに限定されない）などを含むがこれらに限定されない任意の適切な機能ドメイン（複数可）は、意図された目的に適するものとして付加され得る。一実施形態において、該ポリペプチドは、該ポリペプチドのＣ末端に付加された１以上のさらなる機能ドメインをさらに含む。
本明細書の任意の実施形態の別の実施形態において、該ポリペプチドは、ターゲティングドメインをさらに含み得る。ターゲティングドメインは、存在する場合、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び／若しくはポリペプチドに共有結合又は非共有結合で結合され得る。ターゲティングドメインが非共有結合している実施形態において、ストレプトアビジン－ビオチンリンカーを含むがこれらに限定されない、そのような非共有結合に適する任意の手段が使用され得る。別の実施形態において、ターゲティングドメインは、存在する場合、該ポリペプチドとの翻訳融合物である。この実施形態において、該ポリペプチドとターゲティングドメインは、翻訳融合物において互いに直接隣接し得るか、又は意図する目的に適するポリペプチドリンカーによって連結され得る。
ターゲティングドメインは、目的のターゲットに結合するポリペプチドドメイン又は小分子である。１つの非限定な実施形態において、ターゲティングドメインは、細胞表面タンパク質に結合する；この実施形態において、細胞は、適切なターゲティングドメインによって結合され得る表面タンパク質を含む目的の任意の細胞型であり得る。一実施形態において、細胞表面タンパク質は、腸上皮細胞、軟骨細胞、又はケラチノサイトからなる群から選択される細胞の表面に存在する。別の実施形態において、ターゲティングドメインは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分に結合する；この実施形態において、ＥＣＭ成分は、コラーゲン、エラスチン、又はヒアルロン酸からなり得る。
さらなる実施形態において、該ポリペプチドはｈＩＬ－２３Ｒアンタゴニストである。一実施形態において、該ポリペプチドは、ＩＬ－１２に検出可能に結合しないか、又は極めて低い親和性でＩＬ－１２に結合する。
第５の態様において、本開示は、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質であって、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は融合タンパク質中に存在せず、
（ａ）第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分全体が、本開示の第１の態様の任意の実施形態で定義されるドメインＸ３及びＸ５を含み；
（ｂ）Ｘ３ドメインが第１のポリペプチド成分に存在し、Ｘ５ドメインが第２のポリペプチド成分に存在し；
第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、個々に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質ではなく、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチドが相互作用して、最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を形成する、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を提供する。
本明細書で論じるように、これらの実施形態におけるＸ５ドメインは、ｈＩＬ－２３Ｒ結合に十分であり、主要結合界面を含み、一方、Ｘ３ドメインは、ｈＩＬ－２３Ｒへの結合に必要ではないが、相互作用表面を拡大して、結合におけるより高い親和性及び特異性を付与するさらなる結合接触を提供する。本開示の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質は、そのため、最大ｈＩＬ－２３Ｒ結合活性の条件付き生成を提供する。
本開示の第１の態様の全ての実施形態及び実施形態の組み合わせは、この第５の態様において使用され得る。一実施形態において、Ｘ５が、１２～２０アミノ酸長のαヘリックスポリペプチドドメインを含み、Ｘ５が、
配列番号１又は２内の残基４０～４７のアミノ酸配列（表１参照）；
配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列（表２～３参照）；又は
配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列
を含む。
別の実施形態において、Ｘ３が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ３が、
配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列；又は
配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列
を含む。
さらなる実施形態において：
（Ａ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列を含み（表３参照）；かつＸ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を含む（表３参照）か；又は
（Ｂ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列を含み（表３参照）；かつ
（ｂ）Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む（表３参照）。
別の実施形態において、第１のポリペプチド成分は、本開示の第１の態様の任意の実施形態のＸ１及びＸ２ドメインを含む。
さらなる実施形態において、Ｘ１が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ１が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含むか、又はＸ１が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｘ２が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～２０のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、Ｘ５、Ｘ３、及びＸ１が、存在する場合、各々アルファヘリックスドメインである。条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質のさらなる実施形態において：
Ｘ１が、存在する場合、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ２が、存在する場合、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ３が、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９４％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、かつ
Ｘ５が、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９４％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、非共有結合で会合している。別の実施形態において、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、受容体を介して間接的に互いに結合している。
第６の態様において、本開示は、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質であって、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分が融合タンパク質中に存在せず、
（ａ）第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分全体が、本開示の第２の態様の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせで定義されるドメインＸ１及びＸ３を含み；
（ｂ）Ｘ１ドメインは第１のポリペプチド成分に存在し、Ｘ３ドメインは第２のポリペプチド成分に存在し；
第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、個々に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質ではなく、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチドが非共有結合で相互作用して、最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を形成する、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を提供する。
本明細書で論じるように、これらの実施形態におけるＸ１ドメインは、ｈＩＬ－２３Ｒ結合に十分であり、主要結合界面を含み、一方、Ｘ３ドメインは、ｈＩＬ－２３Ｒへの結合に必要ではないが、相互作用表面を拡大して、結合におけるより高い親和性及び特異性を付与するさらなる結合接触を提供する。本開示の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質は、そのため、最大ｈＩＬ－２３Ｒ結合活性の条件付き生成を提供する。
一実施形態において、Ｘ１が、１２～２０アミノ酸長のαヘリックスポリペプチドドメインを含み、Ｘ１が、
配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列（表５～７参照）；又は
配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列
を含む。
別の実施形態において、Ｘ３が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ３が、
配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列；又は
配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列
を含む。
さらなる実施形態において、
（Ａ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列を含み（表６～７）、かつＸ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を含むか；又は
（Ｂ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含み（表６～７）；かつＸ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、第１のポリペプチド成分は、本開示の第２の態様の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせのＸ４及びＸ５ドメインを含む。
別の実施形態において、Ｘ５が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ５が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２７～５３のアミノ酸配列、又は配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３７～５３のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｘ４が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３５～３６のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５が、存在する場合、各々アルファヘリックスドメインである。
様々なさらなる実施形態において、
Ｘ１が、配列番号１１０～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ３が、配列番号１１０～１６４及び１６６～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ４が、存在する場合、配列番号１１０～１６４及び１７２～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；かつ
Ｘ５が、配列番号１１０～１６４及び１７３～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、非共有結合で会合している。別の実施形態において、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分は、受容体を介して間接的に互いに結合している。
第７の態様において、本開示は、本開示の第１の態様の任意の実施形態について本明細書で定義されるＸ３ドメインを含むポリペプチドであって、本開示の第１の態様の任意の実施形態において定義されるＸ５ドメインを含まないポリペプチドを提供する。
この実施形態のポリペプチドは、例えば、本開示の第５の態様の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を生成するために使用され得る。様々な実施形態において、Ｘ３ドメインは、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を含むか；又は配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を含むか（表３参照）；又はＸ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、該ポリペプチドは、本開示の第１の態様の任意の実施形態のＸ１及びＸ２ドメインを含む。一実施形態において、Ｘ１が１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、かつＸ１が配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含むか、又はＸ１が配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｘ２が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～２０のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｘ３及びＸ１（存在する場合）は、各々アルファヘリックスドメインである。
一実施形態において、
Ｘ１が、存在する場合、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ２が、存在する場合、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ３が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
第８の態様において、本開示は、本開示の第２の態様の任意の実施形態について本明細書で定義されるＸ３ドメインを含むポリペプチドであって、本開示の第２の態様の任意の実施形態において定義されるＸ１ドメインを含まないポリペプチドを提供する。この実施形態のポリペプチドは、例えば、本開示の第６の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を生成するために使用され得る。一実施形態において、Ｘ３ドメインは、１２～２０アミノ酸長であり、
Ｘ３が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列；又は
配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基数１９～３４のアミノ酸配列
を含む。
別の実施形態において、Ｘ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を含むか；又は配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、該ポリペプチドは、本開示の第２の態様の任意の実施形態のＸ４及びＸ５ドメインを含む。様々な実施形態において、Ｘ５が１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、かつＸ５が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２７～５３のアミノ酸配列、又は配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３７～５３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｘ４が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３５～３６のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、Ｘ３及びＸ５（存在する場合）は、各々アルファヘリックスドメインである。
一実施形態において：
Ｘ５が、存在する場合、配列番号１１０～１８０のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
Ｘ４が、存在する場合、配列番号１１０～１８０のいずれかに存在するＸ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；かつ
Ｘ３が、配列番号１１０～１８０のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、第７又は第８の態様のポリペプチドは、該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加された１以上の追加の機能ドメインをさらに含み得る。アルブミン（血清半減期を改善するため）、ターゲティングドメイン、受容体ターゲティングドメイン、蛍光タンパク質などの分子プローブ、検出又は精製を補助するポリペプチド配列（ポリヒスチジンタグを含むがこれに限定されない）、様々な生物における分泌又は発現増強を可能にするＮ末端ポリペプチド配列（大腸菌、枯草菌、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス、スピルリナ、又は哺乳類系を含むがこれらに限定されない）などを含むが、これらに限定されない任意の適切な機能ドメイン（複数可）は、意図された目的に適するものとして付加され得る。一実施形態において、該ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端に付加された１以上のさらなる機能ドメインをさらに含む。
さらなる実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び本明細書の任意の実施形態又は態様のポリペプチドは、ターゲティングドメインをさらに含み得る。この実施形態において、ポリペプチドは、目的の標的に向けることができる。ターゲティングドメインは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドは、及び／又はポリペプチドに共有結合又は非共有結合で結合することができる。ターゲティングドメインが非共有結合している実施形態において、ストレプトアビジン－ビオチンリンカーを含むがこれらに限定されない、そのような非共有結合のための任意の適切な手段が使用され得る。
別の実施形態において、ターゲティングドメインは、存在する場合、ポリペプチド、第１のポリペプチド、及び／又は第２のポリペプチドとの翻訳融合物である。この実施形態において、該ポリペプチド及びターゲティングドメインは、翻訳融合物において互いに直接隣接し得るか、又は意図する目的に適するポリペプチドリンカーによって連結され得る。
ターゲティングドメインは、目的のターゲットに結合するポリペプチドドメイン又は小分子である。１つの非限定な実施形態において、ターゲティングドメインは、細胞表面タンパク質に結合する；この実施形態において、細胞は、適切なターゲティングドメインによって結合され得る表面タンパク質を含む目的の任意の細胞型であり得る。一実施形態において、細胞表面タンパク質は、腸上皮細胞、軟骨細胞、又はケラチノサイトからなる群から選択される細胞の表面に存在する。
別の実施形態において、ターゲティングドメインは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分に結合する；この実施形態において、ＥＣＭ成分は、コラーゲン、エラスチン、又はヒアルロン酸からなり得る。
本明細書の全ての実施形態において、ターゲティングドメインは、目的の標的に結合する任意の適切なポリペプチドであることができ、本開示のポリペプチドに組み込むことができる。非限定的な実施形態において、ターゲティングドメインには、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、モノボディ、ナノボディ、ダイアボディ、抗体（単一特異性又は二重特異性抗体を含む）；ＲＧＤインテグリン結合ペプチド、新規デザインの結合剤、アプタマー、２環（ｂｉｃｙｃｌｅ）ペプチド、コノトキシン、葉酸などの小分子、及び細胞表面に結合するウイルスを含むがこれらに限定されない細胞ターゲティングオリゴペプチドが含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書の第５及び第６の態様の任意の実施形態の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質の一実施形態において、第１のポリペプチド成分は、第１のターゲティングドメインをさらに含み、かつ／又は第２のポリペプチド成分は、第２のターゲティングドメインをさらに含む。第１のターゲティングドメイン及び第２のターゲティングドメインは、意図された用途に適切とみなされるように、同一であってもよく、異なっていてもよい。
一実施形態において、第１のポリペプチド成分は、第１のターゲティングドメインをさらに含み、第２のポリペプチド成分は、第２のターゲティングドメインをさらに含む。別の実施形態において、第１のターゲティングドメインは、存在する場合、第１のポリペプチドとの翻訳融合物であり、第２のターゲティングドメインは、存在する場合、第２のポリペプチドとの翻訳融合物である。一実施形態において、第１のターゲティングドメイン及び／又は第２のターゲティングドメインは、各々細胞表面タンパク質に結合する。
一実施形態において、本明細書に開示される態様、実施形態、又は実施形態の組み合わせのいずれかのｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド又は条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質は、バイオレイヤー干渉法表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、５０ｎｍ、２５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．７５ｎｍ、０．５ｎｍ、０．２５ｎｍ、０．１ｎｍ、又はそれ以下の結合親和性でｈＩＬ－２３Ｒに結合する。一実施形態において、測定条件は、以下の実施例で詳述したとおりである。
第９の態様において、本開示は、本明細書に開示される実施形態又は実施形態の組み合わせのいずれかのｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、ポリペプチド、又はポリペプチド成分の２以上のコピーを含む多量体を提供する。本開示の多量体は、列挙した成分の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態において、多量体は、列挙した同じ成分の２以上のコピーの翻訳融合物を含んでよく、これらは、汎用の可撓性リンカーなどの任意のアミノ酸リンカーによって分離され得る。他の実施形態において、多量体は、２以上の異なる列挙した成分の翻訳融合物を含み得る。他の実施形態において、２以上の列挙した成分は、その表面に列挙した成分を提示する足場上に存在し得る。ウイルス様粒子又は合成ナノケージを含む２以上の相互作用サブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む合成ポリマー、ビーズなどを有する天然又は合成の多量体ポリペプチド足場を含むがこれらに限定されない任意の適切な足場が使用され得る。
さらなる態様において、本開示は、単離された核酸を含み、遺伝的にコードされ得る本開示のポリペプチド及びポリペプチド成分をコードする核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。このような単離された核酸配列は、ポリＡ配列、改変コザック配列、及びエピトープタグをコードする配列、エクスポートシグナル、及び分泌シグナル、核局在シグナル、及び原形質膜局在シグナルを含むがこれらに限定されない、コードされたタンパク質の発現及び／又は精製を促進するのに有用な追加配列を含み得る。当業者には、本明細書の教示に基づいて、どの核酸配列が本発明のポリペプチドをコードするかは明らかであろう。
別の態様において、本開示は、適切な制御配列に作用可能に連結された本発明の任意の態様の核酸を含む発現ベクターを提供する。「発現ベクター」は、核酸コード領域又は遺伝子を、遺伝子産物の発現をもたらすことができる任意の制御配列に作用可能に連結するベクターを含む。本発明の核酸配列に作用可能に連結された「制御配列」は、核酸分子の発現をもたらすことができる核酸配列である。制御配列は、その発現を指示するように機能する限り、核酸配列と連続している必要はない。そのため、例えば、介在するまだ未翻訳の転写配列は、プロモーター配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモーター配列は依然としてコード配列に「作用可能に連結されている」と見なすことができる。他のこのような制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、及びリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。そのような発現ベクターには、プラスミド及びウイルスベースの発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。開示される核酸配列の哺乳動物系での発現を促進するために使用される制御配列は、構成的（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含むが、これらに限定されない様々なプロモーターのいずれかによって促進される）又は誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むが、これらに限定されない多数の誘導性プロモーターのいずれかによって促進される）であり得る。発現ベクターは、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡへの組み込みのいずれかによって、宿主生物で複製可能でなければならない。様々な実施形態において、発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベースのベクター（レトロウイルスベクター又は腫瘍溶解性ウイルスを含むがこれらに限定されない）、又は任意の他の適切な発現ベクターを含み得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、治療上の利益のためにポリペプチドをインビボで発現するように本開示の方法で投与することができる。非限定的な実施形態において、発現ベクターは、本明細書に開示される治療方法を実施するために、細胞治療標的（ＣＡＲ－Ｔ細胞又は腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない）を形質転換又は形質導入するために使用することができる。
さらなる態様において、本開示は、本明細書に開示される発現ベクター、ポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、多量体、及び／又は核酸を含む宿主細胞であって、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る宿主細胞を提供する。該細胞を一過的又は安定的に操作して、細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、又はリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチオン媒介、又はウイルス媒介トランスフェクションを含むが、これらに限定されない技術を用いて本発明の発現ベクターを組み込むことができる（例えば、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）;動物細胞の培養：基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）,第２版（Ｒ.Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７.Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）参照）。本発明によるポリペプチドを生成する方法は、本発明の追加の部分である。本方法は、（ａ）ポリペプチドの発現を助長する条件下で本発明のこの態様による宿主を培養する工程、及び（ｂ）任意選択で、発現したポリペプチドを回収する工程を含む。発現したポリペプチドは、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは、それらは培養から回収される。
別の態様において、本開示は、本明細書の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせのポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、核酸、発現ベクター、又は細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、例えば、本明細書に記載の開示の方法において使用することができる。該医薬組成物は、（ａ）凍結防止剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）張度調整剤；（Ｅ）安定剤；（f）防腐剤及び／又は（ｇ）緩衝剤をさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、該医薬組成物中の緩衝液は、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液又は酢酸緩衝液である。該医薬組成物には、凍結保護剤、例えば、スクロース、ソルビトール又はトレハロースも含まれ得る。特定の実施形態において、該医薬組成物には、防腐剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、及びこれらの様々な混合物が含まれる。他の実施形態において、該医薬組成物には、グリシンのような増量剤が含まれる。さらに他の実施形態において、該医薬組成物には、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロクサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、又はこれらの組み合わせが含まれる。該医薬組成物には、張度調整剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張又は等浸透圧にする化合物も含まれ得る。例示的な張度調整剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン及び塩酸アルギニンが含まれる。他の実施形態において、該医薬組成物にはさらに、安定剤、例えば、目的のタンパク質と組み合わされた場合に、凍結乾燥又は液体形態における目的のタンパク質の化学的及び／若しくは物理的不安定性を実質的に防止又は低減する分子が含まれる。例示的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、及び塩酸アルギニンが含まれる。
本明細書の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせのポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、核酸、発現ベクター、又は細胞は、該医薬組成物における唯一の活性剤であり得るか、又は該組成物は、意図された使用に適する１以上の他の活性剤をさらに含み得る。
さらなる態様において、本開示は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない）、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、体軸性及び末梢性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、付着部炎、及び腱炎からなる群から選択される障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に該障害を治療するのに有効な量の本明細書の任意の実施形態若しくは実施形態の組み合わせのポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、核酸、発現ベクター、細胞、又は医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。本明細書で使用する「治療する」又は「治療すること」は、以下のこと：（ａ）障害の重症度を低減すること；（ｂ）治療されている障害（複数可）に特徴的な症状の発症を制限又は予防すること；（ｃ）治療されている障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）以前に障害（複数可）を患ったことのある患者において障害（複数可）の再発を制限又は防止すること；並びに（ｅ）以前に障害（複数可）に特徴的な症状の患者における再発を制限又は防止することのうちの１以上を達成することを意味する。
対象は、関連する障害を有する任意の対象であり得る。一実施形態において、対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物である。
実施例
発明者らは、ＩＢＤの新しい経口腸制限治療モードを表す、ＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）を標的とする計算でデザインした超安定ペプチドを開発した。
本発明で、ＩＬ－２３Ｒアンタゴニストをデザインするために、ＩＬ－２３サイトカインからの天然ホットスポットと計算で決定した追加のホットスポットを、安定性の高い新規デザインミニタンパク質足場に組み込んだ。酵母表面ディスプレイ（ＹＳＤ）による指向性進化を用いて、腸液を模倣した条件で親和性とタンパク質分解安定性をさらに高めた。ＩＬ－２３Ｒに対する最高の安定性と親和性を有する阻害剤をインビトロで試験し、ＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達の阻害を確認した。
結果
計算デザインにより、低ナノモルのＩＬ－２３Ｒ阻害剤が得られる
ＩＬ－２３は、ＩＬ－２３に特有のｐ１９サブユニットとＩＬ－１２と共有されるｐ４０サブユニットで構成されたヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ－２３受容体は、同様に、特有のサブユニットであるＩＬ－２３Ｒ、及び共有サブユニットであるＩＬ－１２ＲＢ１を含むヘテロ二量体である。ＩＬ－１２及びＩＬ－２３はサイトカインと受容体のサブユニットを共有しているが、炎症と免疫において特有の役割を果たしている。ＩＬ－１２はＴｈ１細胞の分化を促進し、ＩＦＮｇの産生を刺激するが、ＩＬ－２３はＴｈ１７細胞の分化と維持を促進し、ＩＬ－１７の産生を刺激する。最近の研究では、ＩＬ－１２ではなくＩＬ－２３が病原性自己炎症を促進することが判明しており、ＩＬ－２３特有のｐ１９サブユニットを標的とする抗体は、実際、ＩＬ－１２／２３共有ｐ４０サブユニットを標的とするＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）よりも自己炎症性疾患の治療において優れた有効性と安全性を示している。
ＩＬ－２３Ｒとの複合体におけるＩＬ－２３ヘテロダイマー（ＰＤＢ ５ＭＺＶ）の結晶構造は、ＩＬ－２３Ｒの疎水性表面と相互作用する４ヘリックスバンドルｐ１９サブユニットの部位ＩＩＩを示す。ｐ１９と競合するＩＬ－２３Ｒ阻害剤をデザインする最初の工程として、シードデザインのホットスポットとしてｐ１９の残基Ｗ１５６を選択した（図１Ａ）。典型的なタンパク質間相互作用の埋没表面積は１,０００Ａ２超であるので、本発明者らは、回転異性体相互作用場（ＲＩＦ）、すなわちＩＬ－２３Ｒ表面残基と有利に相互作用する分離された残基を計算で生成して、天然ホットスポットを補完し、相互作用表面を拡大した（図１Ｂ）。次に、多様なトポロジーと実験的に検証された安定性を備えた数千の新規デザインミニタンパク質をＩＬ－２３Ｒ表面でドッキングすることで、天然Ｔｒｐホットスポットと追加の新規ホットスポットを組み込んだ（図１Ｃ）。次いで、ドッキングされた各構造を入力として、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）分子モデリングスイートを用いて、ＩＬ－２３Ｒ界面で足場残基を、高親和性結合を支持する側鎖に変異させた（図１Ｄ）。天然及び新規ホットスポット、足場疎水性コア中の足場残基、及びＩＬ－２３Ｒ界面から遠く離れた足場残基は変異できなかった。結果として得られたデザインした阻害剤候補は、高い結合親和性と阻害剤モノマーの安定性を予測すると考えられる計算測定基準でフィルタリングし、最高の１５,０００をコードする遺伝子を商業的に合成し、表面ディスプレイ用の酵母に形質転換した。酵母を、複数回連続ラウンドの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって標識された組換えヒトＩＬ－２３Ｒ（ｈＩＬ－２３Ｒ）への結合について選択した。未処理プールと選別プールを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって分析し、デザインをそれらの相対的濃縮又は減少によってランク付けした。最も豊富なデザイン配列を表１０で見出すことができる。
Figure 2023531771000030
２３Ｒ＿Ａ（配列番号１０）と２３Ｒ＿Ｂ（配列番号１１０）の２つのデザインは、最終選択プールで高度に濃縮され、さらなる生化学的特性評価について選択した。どちらのデザインも３ヘリックスバンドル（それぞれ５４残基と５３残基）であり、ＩＬ－２３Ｒ残基Ｄ１１８がｐ１９のαＤヘリックスと類似したＴｒｐホットスポットの遊離骨格アミンとヘリックスキャッピング水素結合を形成するように、ヘリックスのＮ末端に天然Ｔｒｐホットスポットが組み込まれている（図１Ｄ）。どちらのデザインでも、この中心結合ヘリックスは、追加の新規ホットスポットによって媒介されるｈＩＬ－２３Ｒとの相互作用面がｐ１９よりも大きい。２つの追加のヘリックスは、中央の結合ヘリックスを安定化させ、ｈＩＬ－２３Ｒとさらに接触する。デザインを大腸菌で発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーで（６－ヒスチジンタグにより）精製し、さらにサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。バイオレイヤー干渉法結合滴定は、２３Ｒ＿Ａ及び２３Ｒ＿Ｂがそれぞれ２６±１ｎＭ及び７０±５０ｎＭの親和性でｈＩＬ－２３Ｒに結合することを示した（図２Ａ、Ｅ）。どちらのデザインも、高温及び高濃度の化学変性剤での円二色性（ＣＤ）によって高い安定性を実証した（図２Ｂ）。
インビトロ進化の最初のラウンドは親和性を低ｐＭに対して１０００倍高める
計算デザインのみを用いて低ナノモル親和性を達成することに成功したが、親和性が高いと、受容体に１．７ｎＭで結合するＩＬ－２３サイトカインとの競合が改善される。ｈＩＬ－２３Ｒに対する親和性を高めるために２３Ｒ＿Ａと２３Ｒ＿Ｂを進化させるために、ディープ変異スキャンを実施した。元のデザインに基づいて可能性のある各単一位置変異を表す部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーを表面ディスプレイ用の酵母に形質転換し、ＦＡＣＳによるｈＩＬ－２３Ｒとの結合について２ラウンドの選択を実施した。ＳＳＭ未処理プールと選別プールのＮＧＳ分析により、各変異体の結合に対する適合性を計算することができた。配列適応度ランドスケープは、図８Ａ（２３Ｒ＿Ａ）と８Ｂ（２３Ｒ＿Ｂ）に見出すことができる。デザインモデル内のＩＬ－２３Ｒと相互作用する位置が非相互作用位置よりも高いエントロピーを有し、天然Ｔｒｐホットスポット（２３Ｒ＿ＡのＷ４０、２３Ｒ＿ＢのＷ３）が高度に保存されているため、配列適合度ランドスケープによりデザインした結合モードが確認される。
親和性をさらに高めるために、結合を増強することが以前に示された変異をコンビナトリアルライブラリーに組み込み、次いで、ｈＩＬ－２３Ｒとの結合について６ラウンドで収束するように選別した。最終選択プールを固体培地上にプレーティングし、個々のクローンを配列決定した。最終選択プールに現れる２６個の特有のコンビナトリアル変異体（配列番号１１～２４及び１１１～１２２）を、大腸菌での発現及びさらなる生物物理学的特徴付けのために選択した。
変異体を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いてｈＩＬ－２３Ｒへの相対結合について最初にスクリーニングした。ｈＩＬ－２３ＲをＢＬＩセンサーチップに固定化し、一定濃度（５０ｎＭ）の溶液中の各変異体への結合を測定して、変異体の相対的な性能を定性的に決定した。最も性能の高い変異体について、結合定数（ＫＤ、Ｋｏｎ及びＫ０ffを含む）を３連でＢＬＩ滴定実験により定量的に決定した。最良のコンビナトリアル変異体はＩＬ－２３Ｒと５０～４００ｐＭの親和性で結合し、計算デザインから約５００倍改善され（図２Ｃ）、熱及び化学変性剤に対する高い耐性を維持した（図２Ｄ）。
高熱に対する耐性は製造及び保管にとって重要であり、化学変性剤に対する耐性は全体的な安定性の優れた代用であるが、いずれの経口腸制限ＩＬ－２３Ｒ阻害剤も、好ましくは、高酸性及び生理学的プロテアーゼを含む胃腸管の過酷な条件に耐え、無傷で作用部位に到達する。したがって、経口投与の実現可能性を判断するために、本発明者らがデザインしたＩＬ－２３Ｒ阻害剤の安定性を、ｐＨ２のプロテアーゼペプシンを含む模擬胃液（ＳＧＦ）、及びｐＨ６．５のプロテアーゼトリプシン及びキモトリプズムを含む模擬腸液（ＳＩＦ）においてより直接的に評価した。タンパク質分解を、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって最大２４時間の時点で定性的に評価した。最も高い親和性のコンビナトリアル変異体は、ＳＧＦを約４５分のｔ１／２、ＳＩＦを１５分未満のｔ１／２で耐える（図３）。
計算でデザインしたジスルフィド架橋とインビトロ進化により、タンパク質分解性と熱安定性が高まる
タンパク質分解安定性を向上させるために、分子内ジスルフィド（複数可）と架橋した阻害剤変異体（配列番号２５～３２及び１２３～１２９）を計算でデザインした。最終プールから配列決定した全てのコンビナトリアル変異体は、最大２つのジスルフィドでモデル化され、ジスルフィド構造によりフィルタリングした。最良のデザインを大腸菌で発現させ、ＢＬＩによる結合及びＳＧＦとＳＩＦ消化による安定性及びＣＤについてスクリーニングした。ジスルフィド架橋変異体は、１３０～４６０ｐＭのＫＤでｈＩＬ－２３Ｒに対して高い親和性をほとんど保持していたが、安定性の大幅な向上が見られ、最も安定したものは、ＳＧＦ ｔ１／２が２４時間超で、ＳＩＦ ｔ１／２が約１時間であり、熱及び化学変性に対する耐性が向上した（図３）。
ＳＩＦにおける安定性のために阻害剤配列をさらに最適化するために、ＹＳＤを用いてインビトロ進化を行った。ＳＳＭライブラリーを、最も安定なジスルフィド架橋変異体に基づいて作製した。酵母ライブラリーを最初に３０ＣのＳＩＦ中でインキュベートし、次いで、しっかり洗浄し、標識したｈＩＬ－２３Ｒとインキュベートし、最も高い結合シグナルを保持する細胞（上位１～５％）をＦＡＣＳによって回収した。各ライブラリーに対して２ラウンドの選択を実施し、ＳＩＦインキュベーション時間及び／又はプロテアーゼの濃度を１ラウンドから２ラウンドに増加させた。以前の研究とは異なり、Ｍｙｃタグを切断して、酵母表面に結合能力のある阻害剤を残すことができる可能性があるため、Ｃ末端Ｍｙｃタグにより評価する阻害剤発現で選別しなかった。実際、いくつかのライブラリーで、Ｍｙｃ陰性、結合陽性細胞の大規模な集団が見られた。並行して、ＳＩＦ中でのプレインキュベーションをしないで、ｈＩＬ－２３Ｒのみへの結合について２ラウンドの選択を実施した。ＮＧＳ解析から、親和性と安定性の両方を増強する変異を同定し（図９及び１０）、いくつかの選択した変異体を大腸菌で発現させ、特徴付けた（配列番号６３～６９及び１３０～１３４）。ＮＧＳ分析により、Ｂ０４ｄｓｌｆ０２が最初のヘリックスを過ぎた多くの異なる場所で切断され、ｈＩＬ－２３Ｒと結合する能力を維持することができることも実証された（配列番号１６５～１８０）。最良の変異はコンビナトリアルライブラリーに含まれ、上記のように５～７ラウンドの選別を行った後、個々のクローンの配列を決定した。最終選別に存在する変異体を大腸菌で発現させ、特徴付けた（配列番号７０～７４及び１５３～１６４）。
指向性進化により、親デザインのｒＡ１１ｄｓｌｆ０２及びＢ０４ｄｓｌｆ０２のＳＩＦ耐性が大幅に向上した（図４）。模擬腸液のいくつかの報告された製剤は、可変タンパク質分解活性を示し、ヒト腸液のプロテアーゼ活性は十分に研究されていない。したがって、ＳＩＦ安定性のベンチマークとして、現在のクローン病の第２相臨床試験でＴＮＦａの経口腸制限ナノボディ阻害剤であるＶ５６５－３８Ｆを、この分子を２４時間にわたって分解するのに十分な酵素濃度のＳＩＦ中で発明者らのデザインと直接比較した。Ｖ５６５－３８Ｆ以上のタンパク質分解安定性を有するデザイン変異体は、経口療法を可能にするのに十分安定である可能性が高い。ＳＩＦの安定性を高めるために選択した変異は、実際、ｒＡ１１ｄｓｌｆ０２のＳＩＦ ｔ１／２を６０分から４～２４時間に改善し（変異体ｒＡ１１ｄｓｌｆ０２＿Ｍ１Ｐ＿Ｒ８Ｑ＿Ｋ３５Ｗ［配列番号６９］）、Ｂ０４ｄｓｌｆ０２のＳＩＦ ｔ１／２を５～１５分から３０～６０分に改善した（変異体Ｂ０４ｄｓｌｆ０２ＩＢ［配列番号１６１］）。経口ナノボディＶ５６５－３８Ｆと比較して、ｒＡ１１ｄｓｌｆ０２＿Ｍ１Ｐ＿Ｒ８Ｑ＿Ｋ３５ＷはＳＩＦ中でも同様に安定しており、ＳＧＦ中でははるかにより安定していた。この結果は、Ｖ５６５－３８Ｆの報告されたＳＧＦ及びＳＩＦの安定性と一致している。進化した両方の変異体は、４～２４時間のｔ１／２でＳＧＦに対して高い耐性を維持した。ｈＩＬ－２３Ｒへの結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した。ｒＡ１１ｄｓｌｆ０２＿Ｍ１Ｐ＿Ｒ８Ｑ＿Ｋ３５ＷのＫＤは７５ｐＭであり、Ｂ０４ｄｓｌｆ０２ＩＢのＫＤは１ｐＭ未満であった（解離速度が遅すぎて機器で正確に測定できなかった）。
並行して、ラット及びマウスのＩＬ－２３Ｒに対する結合親和性を高めた阻害剤（ｒＩＬ－２３Ｒ、ｍＩＬ－２３Ｒ）を作製した。最良のヒトＩＬ－２３Ｒ阻害剤は、インビトロでヒトとラットの両方のＩＬ－２３Ｒに同様の親和性で結合するが、マウスホモログへの結合はごくわずかである。これは、同様にヒト及びラットに結合するが、マウスＩＬ－２３Ｒ（ｍＩＬ－２３Ｒ）には結合しないＰＴＧ化合物Ｃと一致する。経口投与したＩＬ－２３Ｒ阻害剤が大腸炎を治療できるという概念実証として、ラットとマウスの両方の大腸炎モデルにおいて、デザインした阻害剤を関連対照と比較する予定である。残念ながら、化学的に誘発される大腸炎モデル（ＴＮＢＳ、ＤＳＳ）しかラットでは容易に入手可能できない。これらのモデルは、実験内及び実験間で高い変動性を示す傾向がある。マウスＩＬ－２３Ｒを強力にブロックする阻害剤を作製することで、自己反応性Ｔ細胞導入などの、ＩＬ－２３への依存が実証されているより一貫性があり生理学的に関連性のある疾患モデル、及びラットではなくマウスでのみ容易に利用可能なＭｄｒ１ａ ＫＯモデルの入手が可能になる。そのため、ラット及びマウスでの実験のための最も強力な分子を作製するために、ｒＩＬ－２３Ｒ及びｍＩＬ－２３Ｒへの結合が増強した変異体について、既存のｈＩＬ－２３Ｒターゲティングライブラリーをスクリーニングした。最良のコンビナトリアル変異体（配列番号３３～４６、１３５～１４９）を、細胞内ジスルフィド結合（複数可）を組み込むように計算により改変した（配列番号４７～６２、１５０～１５２）。ヒットを、上記のようにｒＩＬ－２３Ｒ、ｈＩＬ－２３Ｒ、又はｍＩＬ－２３Ｒに対する安定性及び親和性について指向性進化によってさらに最適化した（図１０）。安定性とｍＩＬ－２３Ｒ親和性を最適化した後の最良のｍＩＬ－２３Ｒ阻害剤であるｍＢ０９ｄｓｌｆ０１－Ｔ４８Ｉは、２４時間を超えるｔ１／２値でＳＧＦと３×ＳＩＦの両方で安定している（図４）。
Ｃ末端親和性タグはＢ０４ｄｓｌｆ０２ＩＢのタンパク質分解安定性を増強する
慢性疾患を治療する経口投与療法には、低コストの商品が重要である。したがって、デザインしたＩＬ－２３Ｒ阻害剤のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方の様々なペプチドタグを含む、大腸菌での発現力価の改善について様々な遺伝子及びタンパク質配列を試験した。Ｎ末端６－ヒスチジンタグではなく、Ｃ末端６－ヒスチジンタグの付加は、Ｂ０４ｄｓｌｆ０２ＩＢのタンパク質分解安定性を大幅に増強するが、効力には影響を及ぼさない（図５）。
５３残基の阻害剤は、組織浸透性を高めるために計算により最小限に抑えることができる
複数の生物物理学的特性は、その中でも腸透過性、分子量に影響を与える。阻害剤のサイズをさらに縮小すると、炎症を起こした腸組織及びおそらく健康な腸組織でさえより良好な組織浸透率を達成できる可能性がある。この目標に向けて、分子量０．８～４ｋＤａに対応する７～３２残基のｈＩＬ－２３Ｒ阻害剤を計算によりデザインした。ガイドとして５３残基の高親和性コンビナトリアル変異体のモデルから始めて、デザインのためにいくつかの手法を使用した（図６）：（ｉ）天然Ｔｒｐと少なくとも１つの新規ホットスポットを含む主要結合ヘリックスから６～１４残基のモチーフを単離し、次いでＭｏｔｉｆＧｒａｆｔ（商標）プロトコルを用いて、構造的に検証した２６～３２残基の足場上の任意の収容位置にそのモチーフを配置した、（ｉｉ）（ｉ）のモチーフと同様に１１残基のヘリックスモチーフから始めて、モチーフに逆平行な第２の新規ヘリックスを構築し、２つのヘリックスをＮ末端とＣ末端のシステイン間でジスルフィドによって架橋した、（ｉｉｉ）天然のＴｒｐホットスポットと指向性進化中に保存された新規ホットスポットを単離し、さらに新しい新規ホットスポットを作製し、次いで、計算により作製した７～１３残基のペプチドをＮ末端とＣ末端のシステイン間でジスルフィドによって架橋してドッキングした。前述のように結合界面をデザインし、阻害剤候補をフィルタリングし、最良の候補の遺伝子を合成して、酵母に形質転換し、ＦＡＣＳによるｈＩＬ－２３Ｒ結合についてスクリーニングした。最終的なＦＡＣＳ選別で最も濃縮されたデザインを配列番号１８１～１９８に列挙する。最終的なＦＡＣＳ選別（２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１４及び２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１７）で最も濃縮したデザインに基づいて、ＳＳＭライブラリーを作製し、ＳＩＦでの連続インキュベーションによって安定性と親和性についてスクリーニングし、上記のようにｈＩＬ－２３Ｒを標識した（図１１）。コンビナトリアルライブラリーを上記のように作製し、同様に選別した。ｈＩＬ－２３Ｒに対する安定性及び親和性について最も濃縮された最良の２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１４及び２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１７に基づくコンビナトリアル変異体を、配列番号１９９～２２８として列挙する。コンストラクト２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１４及び２３Ｒ＿ｍｉｎｉ＿１７の位置当たりの許容残基は、ｈＩＬ－２３Ｒとの結合に対する単一変異体の適合性に基づいて、指向性進化中に（１）模擬腸液で前処理を行わない場合又は（２）模擬腸液で前処理を行った場合で決定した（ＳＩＦ；それぞれ図１１Ａ及び１１Ｂ参照）。最初の選択で未処理プールに対して少なくとも２倍濃縮された変異体は全て許容されるとみなし、それぞれ表８及び表９に提供する。
デザインした阻害剤はインビトロでＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達をブロックする
次に、ＩＬ－２３Ｒ阻害剤がＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達をブロックする能力を評価した。下流のルシフェラーゼ発現と関連するＩＬ－２３Ｒ発現レポーター細胞を、阻害剤又は対照で前処理し、次いで一定濃度のヒトＩＬ－２３サイトカインで刺激した。ＩＣ５０値を、用量反応に適合するように線形回帰を用いて決定した。このアッセイで本発明者らの阻害剤をＰＴＧ化合物Ｃと直接比較したところ、１６～４８０倍高い効力が実証された（図７）。
考察
本明細書に、ＩＢＤの経口腸制限療法としてのＩＬ－２３Ｒの超強力な阻害剤の新規デザインとインビトロ最適化について報告する。本発明者らの阻害剤は、ピコモル親和性でｈＩＬ－２３Ｒと結合し、ＰＴＧ化合物Ｃよりも優れたＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達を強力に阻害する。本発明者らの阻害剤は、高熱、化学変性剤、酸、及び生理学的プロテアーゼに耐性があり、経口投与後の炎症を起こした腸への無傷の移行が標準的な薬物処方で達成できることが示唆される。
材料と方法
ｈＩＬ－２３Ｒを標的とする阻害剤の計算デザイン
ＩＬ－２３ｐ１９及びＩＬ－２３ｐ４０（ＰＤＢ ５ＭＺＶ）との複合体におけるヒトＩＬ－２３Ｒの結晶構造をデザインの出発点として用いた。ＩＬ－２３特異的受容体サブユニットであるＩＬ－２３Ｒに結合し、ＩＬ－２３特異的サイトカインサブユニットであるＩＬ－２３ｐ１９との相互作用を阻害することを目的とした。結晶構造から、まずＩＬ－２３Ｒとｐ１９天然ホットスポットのＬ５６、Ｗ１５６、Ｌ１６０、及びＬ１６１を単離した。天然ホットスポットを補完するために、新規ホットスポットの回転異性体相互作用場（ＲＩＦ）を、Ｇ２４、Ｉ２５、Ｔ２６、Ｎ２７、Ｉ２８、Ｎ２９、Ｃ３０、Ｓ３１、Ｇ３２、Ｈ３３、Ｉ３４、Ｖ３６、Ｔ４０、Ｉ５０、Ａ５４、Ａ５５、Ｉ５６、Ｋ５７、Ｎ５８、Ｃ５９、Ｑ６０、Ｐ６１、Ｋ６３、Ｌ６４、Ｈ６５、Ｆ６６、Ｙ６７、Ｋ６８、Ｎ６９、Ｇ７０、Ｉ７１、Ｋ７２、Ｐ９５、Ｈ９６、Ａ９７、ｓ９８、Ｍ９９、Ｙ１００、Ｃ１０１、Ｔ１０２、Ａ１０３、Ｅ１０４、Ｃ１０５、Ｐ１０６、Ｋ１０７、Ｈ１０８、Ｆ１０９、Ｑ１１０、Ｅ１１１、Ｔ１１２、Ｌ１１３、Ｉ１１４、Ｃ１１５、Ｇ１１６、Ｋ１１７、Ｄ１１８、Ｉ１１９、Ｓ１２０を含む、目的の表面近くの選択したＩＬ－２３Ｒ残基の周囲に作製した。
ＲＩＦ残基（切り離したアミノ酸側鎖）を、側鎖原子が所与のＩＬ－２３Ｒ表面残基と好ましい極性及び無極性相互作用を形成するように作製する。
並行して、１２，３４５個の足場タンパク質（実験的に検証した安定性を有する不活性新規デザインタンパク質）を、ＰａｔｃｈＤｏｃｋを用いて所望のＩＬ－２３Ｒ相互作用表面に大まかに配置した。ＲＩＦ作製及び最初の足場配置後に、天然ホットスポット（優先順：Ｗ１５６、Ｌ１６１、Ｌ５６、Ｌ１６０）及び新規ホットスポットの骨格原子が各足場タンパク質の適切な骨格原子と一致し、以前にその足場位置にあったアミノ酸を置き換えるように、足場をＩＬ－２３Ｒ相互作用表面により高い解像度でドッキングした。前もって計算により最小モノマーの自由エネルギーに最適化した他の全ての足場残基は保持した。この工程により１３０，３４３個のドッキング構造を作製した。
ドッキングした各構造を、高親和性結合のためにＩＬ－２３Ｒ界面の追加の足場残基を最適化するためにＲｏｓｅｔｔａ（商標）デザインプロトコルに入力した。ＩＬ－２３Ｒ表面の８Ａ以内の足場側鎖のみを変異させた。８Ａ超離れている表面位置の足場側鎖は変異できなかったが、回転異性体の構造を最適化することができた。足場の８Ａ以内のＩＬ－２３Ｒ残基は、回転異性体の構造を最適化できた。足場から８Ａ超離れている全てのＩＬ－２３Ｒ及び足場骨格原子、全ての足場モノマーコア側鎖、及びＩＬ－２３Ｒ側鎖は移動できなかった。
デザインしたＩＬ－２３Ｒ：阻害剤複合体を、阻害剤モノマーの自由エネルギー、結合エネルギー、ＩＬ－２３Ｒ表面への阻害剤の形状補完、界面での埋もれた無極性表面積、及び満たされていない埋もれた極性原子を含むがこれらに限定されない、高親和性結合を予測すると考えられる測定基準でフィルタリングした。最良の測定基準を有するデザインを実験試験用に選択した。
酵母ライブラリーの調製、選択及び分析
ＤＮＡ調製
初期デザインライブラリーをコードするＤＮＡを商業的に合成した（Ａｇｉｌｅｎｔ）。部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーについて、ある場合には、全長遺伝子を商業的に合成し（Ａｇｉｌｅｎｔ）、他の場合では、以前に記載されたように、ライブラリーをカスタムプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるオーバーラップＰＣＲを用いて調製した２５。コンビナトリアルライブラリーを、カスタムオリゴからの遺伝子アセンブリによって調製した。含まれる全ての変異が個別に、又は２以上の所望の変異をコードする縮重コドンとして表されるようにオリゴをデザインした。オリゴオーバーラップ領域は、最小１２ｂｐ長で、最低融解温度４０℃で、効率的な遺伝子アセンブリを可能にした。
初期デザインライブラリー、ＳＳＭライブラリー、及びコンビナトリアルライブラリーを含む全ての酵母ライブラリーを、Ａｇａ２ｐへの融合を介した酵母発現及び表面ディスプレイ用のプラスミド骨格（ｐＥＴＣＯＮ）との相同組換えを可能にするために、２０ｂｐ超のオーバーハングで調製した２６。親和性成熟のための初期ＳＳＭ及びコンビナトリアルライブラリーには、報告されたｐＥＴＣＯＮ３ベクターを使用した。模擬腸液（ＳＩＦ）の安定性を高めることを目的として構築したＳＳＭ及びコンビナトリアルライブラリーには、Ａｇａ２ｐ及びＭｙｃ－ｔａｇのタンパク質分解安定性を高めるために最適化したｐＥＴＣＯＮ変異体を使用した。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
酵母株ＥＢＹ１００をエレクトロポレーションにより各ライブラリー及びベクターで形質転換し、酵母株（－ｕｒａ）及び形質転換プラスミド（－Ｔｒｐ）について選択的な最小培地で増殖させた２７。発現を２％ガラクトースで誘導した。表面発現を抗Ｍｙｃ－ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）コンジュゲートで検出し、ビオチン化ＩＬ－２３Ｒへの結合をストレプトアビジン－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。
初期デザインライブラリー、及びＳＳＭ及び親和性成熟のみのために作られたコンビナトリアルライブラリー（安定性増強前）を以下のように選択用に調製した：１６～２４時間の誘導後、酵母をスピンダウンし、１％ＦＢＳを有するＰＢＳ（ＰＢＳＦ）で洗浄し、所定の濃度のビオチン化標的と３０～６０分間インキュベートした。次いで、酵母をＰＢＳＦで洗浄し、染色溶液（１：１００ それぞれ抗Ｍｙｃ－ＦＩＴＣとストレプトアビジン－ＰＥ）と２～５分間インキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳによる分析及び選択のために再懸濁した。ＦＡＣＳ連続ゲーティングを以下のとおりに設定した：（１）細胞の粒度とサイズ、酵母細胞の選択（ＢＳＣ対ＦＳＣ）；（２）細胞形態、シングレットの選択（ＦＳＣ高さ対ＦＳＣ幅）；（３）発現、Ｍｙｃタグによって発現した細胞の選択（ＦＩＴＣ蛍光ヒストグラム）；及び（４）結合シグナル、全集団に対して上位１～５％の選択（ＰＥ対ＦＩＴＣ）。
ＳＩＦ ＳＳＭ及びコンビナトリアルライブラリーを以下のように調製した：記載のように、１６～２４時間の誘導後、酵母をスピンダウンし、ＰＢＳＦで洗浄し、ＯＤ２．０でＳＩＦ（以下に説明するレシピ）に再懸濁し、３０℃で振盪しながら３０～９０分間インキュベートした。ＳＩＦ消化後、細胞をスピンダウンし、８００μＬのＰＢＳＦで４回洗浄し、毎回上清を手動で吸引して完全な洗浄を確実にし、プロテアーゼを除去した。次いで、ＳＩＦ処理した細胞を、上記のように標的タンパク質で処理した。ＦＡＣＳゲーティングを同様に設定したが、プールの大部分がＭｙｃ陰性、結合（ＰＥ）陽性細胞の集団を示し、これはＭｙｃタグが切断されて、細胞表面上に提示された結合能のあるデザイン変異体が残ることを示すので、ゲーティング３（発現細胞）を除外した。
一般に、デザインライブラリーとコンビナトリアルライブラリーを４～６回の連続ラウンドで収束するように選別し、ＳＳＭライブラリーを連続２ラウンドで選別し、ディープシーケンシングを行った。最も親和性の高い変異体を効率的に分離するために、選別ラウンドが進むにつれて、標的タンパク質（ヒト、ラット、又はマウスＩＬ－２３Ｒ）の濃度を減少させた。ＳＩＦ ＳＳＭ及びコンビナトリアルライブラリーの場合には、ＳＩＦ中のプロテアーゼ濃度及び消化期間は、標的の濃度の減少に加えて、連続ラウンドと共に増加した。
ディープ変異スキャン
ＳＳＭの未処理プール及び選別プールから、以下のようにＤＮＡを調製し、配列決定した：酵母を１２５Ｕ／ｍｌのザイモラーゼにより３７℃で５時間溶解し、ＤＮＡを回収した（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＺｙｍｏｐｒｅｐ（商標）キット）。ゲノムＤＮＡを２Ｕ／μｌのエキソヌクレアーゼＩ及び０．２５Ｕ／μｌのラムダエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３０℃で９０分間消化し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＤＮＡをＭｉＳｅｑ商標）シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりディープシーケンシングした：プラスミド内の外部領域にアニーリングしたプライマーを用いて遺伝子をＰＣＲ増幅し、続いて２回目のＰＣＲを行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルオリゴヌクレオチドへのアニーリングのための隣接配列、６ｂｐの試料識別配列、又はバーコードを追加した。ＰＣＲラウンドは、ハイフィデリティＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼを用いて各々１２サイクル行った。バーコードは、３００サイクル又は６００サイクルの試薬キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＭｉＳｅｑ（商標）シーケンサーで読み取り、配列をＥｎｒｉｃｈ（Ｆｏｗｌｅｒら,２０１１）からの適合スクリプトで分析した。
タンパク質の発現と精製
デザインした全てのタンパク質及びＶ５６５－３８Ｆを、Ｔ７プロモーターからの発現用で、下流のアフィニティークロマトグラフィー用のＣ末端６－ヒスチジンタグを組み込んだｐＥＴ２９ｂプラスミドのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ切断部位の間にクローニングして、発現させた。得られたプラスミドで大腸菌を形質転換した：（初期計算デザイン及びアフィニティー成熟コンビナトリアル変異体用には株ＢＬ２１＊（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はジスルフィドを含む全てのコンストラクトには株Ｓｈｕｆｆｌｅ Ｔ７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。大腸菌を３７℃（ＢＬ２１）又は３０℃（Ｓｈｕｆｆｌｅ Ｔ７）でＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ＩＩ培地（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）中でＯＤ６００まで増殖させ、次いで、増殖温度又は１８℃で一晩、０．５ｍＭまで添加したＩＰＴＧで発現を誘導した。細胞を収集し、超音波処理により溶解し、遠心分離により溶解物を除去した。清澄化した溶解物をＮｉＮＴＡレジンと３０分間振盪しながらインキュベートし、６－ヒスチジンタグを介した組換えタンパク質の結合を可能にし、次いで、重力カラム（Ｂｉｏｒａｄ）にアプライし、洗浄及び溶出して、濃縮し、さらに、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ，Ｃｙｔｉｖａ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ｉｎｃｒｅａｓｅとＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標） Ｓ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅカラム，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により精製した。
Ｃ末端ａｖｉ及びｈｉｓタグ（それぞれ酵素的ビオチン化及びアフィニティークロマトグラフィー用）を有するカスタムヒトＩＬ－２３Ｒコンストラクトを商業的に生成し、安定な昆虫細胞株から発現させた。ｈＩＬ－２３Ｒを、組換えＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ）を用いてａｖｉ－ｔａｇを介して酵素的にビオチン化した。同様のラットＩＬ－２３Ｒコンストラクトを、Ｅｘｐｉ２９３細胞における一過性発現によって生成し、酵素的にビオチン化した。市販のマウスＩＬ－２３Ｒ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ（Ｒ＆Ｄ）を、遊離アミンを介してＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で化学的にビオチン化した。
円二色性
ＣＤスペクトルを、Ｊ－１５００円二色性分光計（ＪＡＳＣＯ）で記録した。タンパク質を、０～６Ｍの塩酸グアニジンを含み、ＭｇＣｌ２及びＮａＣｌを含まない４０μＭのＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でアッセイし、２５℃でデータを収集した。加温溶解の場合、４０μＭのタンパク質を約１．５時間かけて２５℃から９５℃に加熱した。
バイオレイヤー干渉法
結合親和性の定性的及び定量的評価を、バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（商標）ＲＥＤ９６及び分析用関連ソフトウェア）を用いて実施した。酵素的にビオチン化した標的タンパク質（３０ｎＭ）をストレプトアビジンコーティングセンサーチップ上に固定し、次いで、緩衝液のみを有するウェル（ベースライン）、溶液中に阻害剤を有するウェル（会合）、及び緩衝液のみを有するウェル（解離）に順番に浸漬した。反応速度定数を１：１結合モデルの数学的適合から決定した。
タンパク質分解安定性評価
模擬腸液（ＳＩＦ）を、Ｊａｎｔｒａｔｉｄら（ＦａＳＳＩＦｖ２と呼ばれる）の推奨に従って、プロテアーゼトリプシン及びキモトリプシンを各々３０μｇ／ｍＬで添加して調製した１８。この組成を本文では「１×ＳＩＦ」と表す。場合によっては、デザインタンパク質（純粋な組換えタンパク質、若しくは上記の酵母ライブラリー）又はコンパレータＶ５６５－３８Ｆが非常に安定していたため、最小分解を最大期間（ＳＤＳ ＰＡＧＥ実験では２４時間、サイトメトリー実験では９０分）で検出できた。したがって、消化速度を高めるために、トリプシンとキモトリプシンの両方の濃度を上昇させた。これらの溶液を「＃×ＳＩＦ」と表し、例えば「２×ＳＩＦ」は、トリプシンとキモトルプシンの両方の濃度が２倍（６０μｇ／ｍＬまで）増加したものを表す。模擬胃液を以下のように調製した：水中６００μｇ／ｍＬのペプシンと３４．２ｍＭのＮａＣｌにＨＣｌを加えて、ｐＨを２に調整した。
タンパク質分解安定性の定性的評価のために、純粋な組換えタンパク質を３７℃で２４時間消化し、タンパク質分解切断をＳＤＳ ＰＡＧＥによって評価した。濃縮ストック溶液から、組換えタンパク質をストックのＳＧＦ及びＳＩＦ溶液に最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬまで添加した。タイムポイントを０分、５分、１５分、３０分、６０分、４時間と２４時間に取った。各タイムポイントで、試料を除去し、直ちにローディング色素と混合し、９５℃で５分間煮沸して、プロテアーゼ活性を停止させた。タイムポイントあたり５μｇのタンパク質（初期消化濃度０．１ｍｇ／ｍＬに基づく）を１６％トリス－トリシンポリアクリルアミドゲルで泳動させた。
ＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達アッセイ
ＩＬ－２３Ｒの下流でルシフェラーゼを発現する市販のＩＬ－２３レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ ＩＬ－２３バイオアッセイ）を用いて、ＩＬ－２３媒介細胞シグナル伝達の阻害を評価した。発光の読み取りに適する９６ウェル組織培養処理した白色プレートの内側ウェルに細胞を播種した。細胞を各阻害剤の希釈系列で３０分間プレインキュベートし、次いで、先行実験で決定した組換えヒトＩＬ－２３サイトカインのＥＣ８０刺激濃度（８ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ １２９０－ＩＬ）で処理した。ヒトＩＬ－２３と６時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ基質を添加し、発光を読み取った。阻害剤応答を、阻害剤濃度に対する最大ＩＬ－２３刺激（阻害剤なし）の割合としてプロットし、用量反応を非線形回帰に適合させることによってＩＣ５０値を決定した。
参考文献
Figure 2023531771000031
Figure 2023531771000032
Figure 2023531771000033

Claims (118)

  1. 一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５のポリペプチドを含むヒトＩＬ－２３Ｒ（ｈＩＬ－２３Ｒ）結合ポリペプチドであって、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４が任意選択であり、Ｘ５が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ５が、配列番号１又は２の残基４０～４７のアミノ酸配列を含む、ヒトＩＬ－２３Ｒ（ｈＩＬ－２３Ｒ）結合ポリペプチド。
  2. Ｘ５が、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  3. Ｘ３が存在し、Ｘ３が１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ４が存在しないか、又はアミノ酸リンカーを含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  4. Ｘ４がアミノ酸リンカーを含む、請求項３に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  5. Ｘ３が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３又は４に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  6. Ｘ５が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  7. Ｘ３が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  8. Ｘ４が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３６～３８のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  9. Ｘ１が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  10. Ｘ１が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  11. Ｘ２が存在し、Ｘ２がアミノ酸リンカーを含む、請求項１０に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  12. Ｘ２が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～２０のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  13. Ｘ３が存在し、
    （ａ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列を含み；かつ
    （ｂ）Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を含む、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  14. Ｘ３が存在し、
    （ａ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列を含み；
    （ｂ）Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  15. Ｘ１が存在し、Ｘ１が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む、請求項１３～１４のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  16. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の各々が存在する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  17. 配列番号１０～７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択でＮ末端アミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上が前記ポリペプチドから欠失していてもよく、そのため、パーセント同一性を考慮する場合に、参照ポリペプチドから欠失していてもよい、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  18. Ｘ５がアルファヘリックスを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  19. 存在する場合、Ｘ３がアルファヘリックスを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  20. 存在する場合、Ｘ１がアルファヘリックスを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  21. Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５が全て存在し、各々がアルファヘリックスを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  22. 前記ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、好ましくは、Ｃ末端に付加された１以上の追加の機能ドメインをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  23. Ｘ２及びＸ４が存在し、Ｘ２が４アミノ酸長であり、Ｘ４が３アミノ酸長である、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  24. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の各々が存在し、
    Ｘ１が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
    Ｘ２が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、７５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
    Ｘ３が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
    Ｘ４が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも３３％、６６％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、かつ
    Ｘ５が、配列番号１０～７４のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、
    請求項１～１６及び１８～２３のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  25. 配列番号６９及び７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択でＮ末端アミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上が前記ポリペプチドから欠失していてもよく、そのため、パーセント同一性を考慮する場合に、参照ポリペプチドから欠失していてもよい、請求項１～２４のいずれかに記載のポリペプチド。
  26. 配列番号１０～７４からなる群から選択されるか、又は配列番号６９及び７４から選択されるポリペプチドに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列；
    配列番号１０～７４からなる群から選択されるか、又は配列番号６９及び７４から選択されるポリペプチドに存在するＸ４－Ｘ５ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；
    配列番号１０～７４からなる群から選択されるか、又は配列番号６９及び７４から選択されるポリペプチドに存在するＸ３－Ｘ４－Ｘ５ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；又は
    配列番号１０～７４からなる群から選択されるか、又は配列番号６９及び７４から選択されるポリペプチドに存在するＸ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５ドメインの組み合わせのアミノ酸配列
    と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. ターゲティングドメインをさらに含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  28. 前記ポリペプチドがｈＩＬ－２３Ｒアンタゴニストである、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  29. 一般式Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５のポリペプチドを含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドであって、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が任意選択であり、Ｘ１が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ１が、配列番号１０１又は１０２中の残基１～１０のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  30. Ｘ１が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  31. Ｘ３が存在し、Ｘ３が１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ２が存在しないか、又はアミノ酸リンカーを含む、請求項２９～３０のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  32. Ｘ２がアミノ酸リンカーを含む、請求項３１に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  33. Ｘ３が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３１又は３２に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  34. Ｘ１が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  35. Ｘ３が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  36. Ｘ２が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～１８のアミノ酸配列を含む、請求項２９～３５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  37. Ｘ５が存在し、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  38. Ｘ５が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３７～５３のアミノ酸配列を含む、請求項２９～３７のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  39. Ｘ４が存在し、Ｘ４がアミノ酸リンカーを含む、請求項３８に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  40. Ｘ４が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３５～３６のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  41. Ｘ３が存在し、
    （ａ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列を含み（表６～７）、
    （ｂ）Ｘ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を含む、
    請求項２９～４０のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  42. Ｘ３が存在し、
    （ａ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含み（表６～７）、
    （ｂ）Ｘ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む、
    請求項２９～４０のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  43. Ｘ５が存在し、Ｘ５が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２７～５３のアミノ酸配列を含む、請求項４１又は４２のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  44. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が各々存在する、請求項２９～４３のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  45. 配列番号１１０～１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、前記Ｃ末端アミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上が、前記ポリペプチドから欠失していてもよく、そのため、パーセント同一性を考慮する場合、参照ポリペプチドから欠失していてもよい、請求項２９～４４のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  46. Ｘ１がアルファヘリックスを含む、請求項２９～４５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  47. 存在する場合、Ｘ３がアルファヘリックスを含む、請求項２９～４６のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  48. 存在する場合、Ｘ５がアルファヘリックスを含む、請求項２９～４７のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  49. Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５が全て存在し、各々がアルファヘリックスを含む、請求項２９～４８のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  50. 前記ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、好ましくは、Ｃ末端に付加された１以上の追加の機能ドメインをさらに含む、請求項２９～４９のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  51. Ｘ２及びＸ４が存在し、各々が２アミノ酸長である、請求項２９～５０のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  52. Ｘ２及びＸ４中の第２のアミノ酸がＤである、請求項５１に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  53. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の各々が存在し、
    Ｘ１が、配列番号１１０～１８０のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
    Ｘ２が、配列番号１１０～１６４、１１６～１８０のいずれかに存在するＸ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
    Ｘ３が、配列番号１１０～１６４、１７２～１８０のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、
    Ｘ４が、配列番号１１０～１６４、１７２～１８０のいずれかに存在するＸ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、かつ
    Ｘ５が、配列番号１１０～１６４、１７３～１８０のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、
    請求項２９～４４及び４６～５３のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  54. 配列番号１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９～５３のいずれかに記載のポリペプチド。
  55. 前記ポリペプチドが、
    配列番号１１０～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列；
    配列番号１１０～１６４、及び１６６～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１－Ｘ２ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；
    配列番号１１０～１６４、及び１６６～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１－Ｘ２－Ｘ３ドメインの組み合わせのアミノ酸配列；又は
    配列番号１１０～１６４、及び１７３～１８０からなる群から選択されるポリペプチドに存在するＸ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４ドメインの組み合わせのアミノ酸配列
    と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、
    請求項２９～５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  56. ターゲティングドメインをさらに含む、請求項２９～５５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  57. 前記ポリペプチドがｈＩＬ－２３Ｒアンタゴニストである、請求項２９～５６のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  58. 本明細書に開示されるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  59. 配列番号６９、７４、及び１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載のポリペプチド。
  60. 配列番号６９、７４、及び１６０～１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５８又は５９に記載のポリペプチド。
  61. 配列番号８４～８７及び１８１～２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチドであって、Ｎ末端アミノ酸及び／又はＣ末端アミノ酸の１、２、３、又はそれ以上が、前記ポリペプチドから欠失していてもよく、そのため、パーセント同一性を考慮する場合、参照ポリペプチドから欠失していてもよいｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  62. 前記ポリペプチド中の２つのシステイン残基間にジスルフィド結合を含む、請求項６１に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  63. 前記参照ポリペプチドからのアミノ酸の変更が保存的置換である、請求項１７、４５、及び６１～６２のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  64. ターゲティングドメインをさらに含む、請求項６１～６３のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  65. 前記ポリペプチドがｈＩＬ－２３Ｒアンタゴニストである、請求項６１～６４のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド。
  66. 第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質であって、前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が融合タンパク質中に存在せず、
    （ａ）前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分全体が、請求項１～２８のいずれか一項に記載のドメインＸ３及びＸ５を含み;
    （ｂ）前記Ｘ３ドメインが前記第１のポリペプチド成分に存在し、前記Ｘ５ドメインが前記第２のポリペプチド成分に存在し；
    前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が、個々に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質ではなく、前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチドが相互作用して、最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を形成する、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  67. Ｘ５が、１２～２０アミノ酸長のアルファヘリックスポリペプチドドメインを含み、
    Ｘ５が、
    配列番号１又は２の中の残基４０～４７のアミノ酸配列；
    配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列；又は
    配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列
    を含む、
    請求項６６に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  68. Ｘ３が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、
    Ｘ３が、
    配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列；又は
    配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列
    を含む、
    請求項６６又は６７に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  69. （Ａ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基４０～４７のアミノ酸配列を含み；かつＸ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を含むか；又は
    （Ｂ）Ｘ５が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３９～５４のアミノ酸配列を含み；かつ
    （ｂ）Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む、
    請求項６６～６８のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  70. 前記第１のポリペプチド成分が、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＸ１及びＸ２ドメインを含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  71. Ｘ１が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ１が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含むか、又はＸ１が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む、
    請求項７０に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  72. Ｘ２が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～２０のアミノ酸配列を含む、請求項７０又は７１に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  73. Ｘ５、Ｘ３、及びＸ１が、存在する場合、各々アルファヘリックスドメインである、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  74. Ｘ１が、存在する場合、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
    Ｘ２が、存在する場合、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
    Ｘ３が、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９４％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；かつ
    Ｘ５が、配列番号１０～７４、特に配列番号６９又は７４のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９４％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、
    請求項６６～７３のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  75. 前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が、共有結合していない、請求項６６～７４のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  76. 前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が、受容体を介して互いに間接的に結合している、請求項６６～７４のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  77. 第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含み、前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が、融合タンパク質中に存在せず、
    （ａ）前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分全体が、請求項２９～５７のいずれか一項に記載のドメインＸ１及びＸ３を含み;
    （ｂ）前記Ｘ１ドメインが前記第１のポリペプチド成分に存在し、前記Ｘ３ドメインが前記第２のポリペプチド成分に存在し；
    前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が、個々に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質ではなく、前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチドが非共有結合で相互作用して、最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質を形成する、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  78. Ｘ１が、１２～２０アミノ酸長のアルファヘリックスポリペプチドドメインを含み、
    Ｘ１が、
    配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列（表５～７参照）；又は
    配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列
    を含む、
    請求項７７に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  79. Ｘ３が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、
    Ｘ３が、
    配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列；又は
    配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列
    を含む、
    請求項７７又は７８に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  80. （Ａ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１０のアミノ酸配列を含み（表６～７）、かつＸ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列を含むか；又は
    （Ｂ）Ｘ１が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含み（表６～７）；かつＸ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む、
    請求項７７～７９のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  81. 前記第１のポリペプチド成分が、請求項２９～５７のいずれか一項に記載のＸ４及びＸ５ドメインを含む、請求項７７～８０のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  82. Ｘ５が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ５が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２７～５３のアミノ酸配列、又は配列番号０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３７～５３のアミノ酸配列を含む、請求項８１に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  83. Ｘ４が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３５～３６のアミノ酸配列を含む、請求項８１又は８２に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  84. Ｘ１、Ｘ３、及びＸ５が、存在する場合、各々アルファヘリックスドメインである、請求項７７～８３のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  85. Ｘ１が、配列番号１１０～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
    Ｘ３が、配列番号１１０～１６４及び１６６～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；
    Ｘ４が、存在する場合、配列番号１１０～１６４及び１７２～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み；かつ
    Ｘ５が、配列番号１１０～１６４及び１７３～１８０、特に配列番号１６０～１６３のいずれかに存在するＸ５ドメインのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、
    請求項７７～８４のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  86. 前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が、共有結合していない、請求項７７～８５のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  87. 前記第１のポリペプチド成分及び前記第２のポリペプチド成分が、受容体を介して互いに間接的に結合している、請求項７７～８５のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  88. 請求項１～２８のいずれか一項に記載のＸ３ドメインを含むポリペプチドであって、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＸ５ドメインを含まないポリペプチド。
  89. 前記Ｘ３ドメインが、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列；又は配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む、請求項８８に記載のポリペプチド。
  90. Ｘ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２２～３３のアミノ酸配列を含むか；又はＸ３が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２１～３５のアミノ酸配列を含む、請求項８８～８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  91. 前記ポリペプチドが、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＸ１及びＸ２ドメインを含む、請求項８８～９０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  92. Ｘ１が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ１が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含むか、又はＸ１が、配列番号５～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１～１６のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のポリペプチド。
  93. Ｘ２が、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１７～２０のアミノ酸配列を含む、請求項９１又は９２に記載のポリペプチド。
  94. Ｘ３及びＸ１（存在する場合）が、各々アルファヘリックスドメインである、請求項８８～９３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  95. Ｘ１が、存在する場合、請求項１７の記載の注釈付き配列中のＸ１ドメインのアミノ酸配列を含み；
    Ｘ２が、存在する場合、請求項１７の記載の注釈付き配列中のＸ２ドメインのアミノ酸配列を含み；
    Ｘ３が、存在する場合、請求項１７の記載の注釈付き配列中のＸ３ドメインのアミノ酸配列を含む、
    請求項８８～９４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  96. 請求項２９～５７のいずれか一項に記載のＸ３ドメインを含むポリペプチドであって、請求項２９～５７のいずれか一項に記載のＸ１ドメインを含まないポリペプチド。
  97. 前記Ｘ３ドメインが１２～２０アミノ酸長であり、Ｘ３ドメインが、
    配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３のアミノ酸配列；又は
    配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む、請求項９６に記載のポリペプチド。
  98. Ｘ３が、配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２５～３３；又は配列番号１０３～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基１９～３４のアミノ酸配列を含む、請求項９６～９７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  99. 前記ポリペプチドが、請求項２９～５７のいずれか一項に記載のＸ４及びＸ５ドメインを含む、請求項９６～９８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  100. Ｘ５が、１２～２０アミノ酸長のポリペプチドドメインを含み、Ｘ５が、配列番号１０５～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基２７～５３のアミノ酸配列、又は配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３７～５３のアミノ酸配列を含む、請求項２９９に記載のポリペプチド。
  101. Ｘ４が、配列番号１０１～１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列中の残基３５～３６のアミノ酸配列を含む、請求項９９又は１００に記載のポリペプチド。
  102. Ｘ３及びＸ５（存在する場合）が、各々アルファヘリックスドメインである、請求項９６～１０１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  103. Ｘ５が、存在する場合、請求項１１７の記載の注釈付き配列中のＸ５ドメインのアミノ酸配列を含み；
    Ｘ４が、存在する場合、請求項１１７の記載の注釈付き配列中のＸ４ドメインのアミノ酸配列を含み；
    Ｘ３が、請求項１１７の記載の注釈付き配列中のＸ３ドメインのアミノ酸配列を含む、
    請求項９６～１０２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  104. 前記ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加された１以上の追加の機能ドメインをさらに含む、請求項７７～１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  105. ターゲティングドメインをさらに含む、請求項７７～１０４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  106. 前記第１のポリペプチド成分が第１のターゲティングドメインをさらに含むか、又は前記第２のポリペプチド成分が第２のターゲティングドメインをさらに含む、請求項６６～８７のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  107. 前記第１のポリペプチド成分が第１のターゲティングドメインをさらに含み、前記第２のポリペプチド成分が第２のターゲティングドメインをさらに含む、請求項６６～８７のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  108. 前記第１のターゲティングドメインが、存在する場合、前記第１のポリペプチドとの翻訳融合物であり、前記第２のターゲティングドメインが、存在する場合、前記第２のポリペプチドとの翻訳融合物である、請求項１０６～１０７のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  109. 前記第１のターゲティングドメインと前記第２のターゲティングドメインが両方とも存在し、前記第１のターゲティングドメイン及び前記第２のターゲティングドメインが同じである、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  110. 前記第１のターゲティングドメインと前記第２のターゲティングドメインが両方とも存在し、前記第１のターゲティングドメイン及び前記第２のターゲティングドメインが異なる、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  111. 前記第１のターゲティングドメイン及び／又は前記第２のターゲティングドメインの各々が、細胞表面タンパク質に結合する、請求項１０６～１１０のいずれか一項に記載の条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  112. 本明細書に開示される実施形態又は実施形態の組み合わせのいずれかのｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド又は条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質であって、バイオレイヤー干渉法又は表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、５０ナノモーラー（ｎＭ）、２５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．７５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１ｎＭ、又はそれ以下の結合親和性でｈＩＬ－２３Ｒに結合するｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド又は条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質。
  113. 本明細書に開示される実施形態又は実施形態の組み合わせのいずれかのｈＩＬ－２３Ｒ結合ポリペプチド、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、ポリペプチド、又はポリペプチド成分の２以上のコピーを含む多量体。
  114. 本明細書のいずれかの請求項に記載のポリペプチド及びポリペプチド成分をコードする核酸。
  115. 適切な制御エレメントに作用可能に連結される、請求項１１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
  116. 本明細書のいずれかの請求項に記載のポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、多量体、核酸、又は発現ベクターを含む細胞。
  117. （ａ）本明細書の任意の実施形態若しくは実施形態の組み合わせのポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、核酸、発現ベクター、又は細胞；並びに
    （ｂ）医薬として許容される担体
    を含む医薬組成物。
  118. 炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない）、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、体軸性及び末梢性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、付着部炎、及び腱炎からなる群から選択される障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に前記障害を治療するのに有効な量の本明細書の任意の実施形態若しくは実施形態の組み合わせのポリペプチド、ポリペプチド成分、条件的に最大限に活性のあるｈＩＬ－２３Ｒ結合タンパク質、核酸、発現ベクター、細胞、又は医薬組成物を投与することを含む方法。
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