CN116096730A - 细胞因子结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含与延伸重组多肽(XTEN)连接的生物活性蛋白质(诸如细胞因子)的组合物，编码所述组合物的分离核酸以及含有所述核酸的载体和宿主细胞，以及使用此类组合物治疗相关病症和病况的方法。

Description

细胞因子结合物
序列表
序列表的计算机可读形式随此申请以电子方式提交申请且以全文引用的方式并入本申请中。序列表包含在2021年6月14日创建的文件中，其文件名为“776-601_20-1836-WO_ST25_FINAL.txt”且大小为988kb。
参考陈述
本申请要求于2020年6月25日提交的美国临时专利申请第63/044,335号，标题为“细胞因子结合物(CYTOKINE CONJUGATES)”；于2021年6月7日提交的美国临时专利申请第63/197,875号，标题为“细胞因子结合物(CYTOKINE CONJUGATES)”；及于2021年6月7日提交的美国临时专利申请第63/197,944号，标题为“细胞因子结合物(CYTOKINE CONJUGATES)”的优先权，以上所有美国临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
背景技术
细胞因子可用于治疗多种疾病或病况，诸如癌症、发炎性病况、自体免疫性病况、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、全身性红斑狼疮、阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease)、精神分裂症、病毒感染(例如，慢性C型肝炎、AIDS)、过敏性哮喘、视网膜神经退化性过程、代谢病症、胰岛素抗性及糖尿病性心肌症。然而，细胞因子的治疗效用可能由于细胞毒性、短半衰期、需要重复或频繁给药及引起患者的非所需免疫反应的潜在性而受到限制。
临床环境中的大部分细胞因子产品极其有效。诸如IL-2及IL-12及IFN-a的白介素为细胞因子，其主要由免疫系统细胞产生以信号传导及组织免疫反应。在癌症中，细胞因子促进免疫系统将肿瘤细胞识别为异常及对宿主有害的能力。细胞因子进一步增加TME增殖，增强其存活且引导多种免疫细胞类型来浸润TME且促进有效抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤细胞杀死及肿瘤清除。此限制细胞因子在治疗环境中，尤其在抗癌适应症中的实际应用。
尤其白介素-12(IL12)已公认为具有作为用于肿瘤免疫疗法的理想有效负载的潜能。其可活化免疫系统的先天性及适应性组分。IL12刺激IFN-γ的产生且活化NK细胞以及CD8+及CD4+T细胞。另外，此细胞因子亦诱导抗血管生成趋化因子、肿瘤细胞外基质的重塑及MHC I类分子表达的刺激，使其成为极具吸引力的抗癌候选物。然而，虽然研究人员已展示令人鼓舞的临床前资料，但此细胞因子的严重毒性概况已阻止了剂量递增，且显著抑制了作为抗癌剂的临床潜力。尽管自1996年首次进行人类IL12临床试验以来，多个临床试验一直在进行，但FDA批准的IL12产品仍然遥遥无期。
此对可克服治疗指数挑战以使用细胞因子作为抗癌剂的新策略提出了相当大的未满足需求。若如IL12的细胞因子的效力可被安全地利用且可控制毒性挑战，则这些药剂可充当针对广泛范围的癌症的潜在用途的强大治疗剂。
发明内容
本申请包括可解决一个或多个缺点或可提供一个或多个优点的细胞因子相关组合物及相关方法。在一个方面中，本文公开一种融合蛋白，其包含：
(a)延伸重组多肽(extended recombinant polypeptide，XTEN)，其特征在于：
i.其包含至少12个氨基酸；
ii.XTEN序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)；及
iii.其具有4至6个选自G、A、S、T、E及P的不同氨基酸；及
(b)与该XTEN连接的细胞因子。
在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含释放区段，其中该释放区段(RS)与选自表6至表7中所阐述的序列的序列具有至少88％、至少94％或100％序列一致性。在一些实施方案中，融合蛋白具有XTEN-RS-细胞因子或细胞因子-RS-XTEN的自N端至C端的结构排列。
在一些实施方案中，细胞因子选自由白介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子、群落刺激因子或TGF-β超家族成员组成的群。在一些实施方案中，细胞因子为选自由以下组成的群的白介素：IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16及IL17。在一些实施方案中，细胞因子与选自表3或表A的序列具有至少90％序列一致性。在一些实施方案中，细胞因子为IL-12或IL-12变体。在一些实施方案中，细胞因子包含第一细胞因子片段(Cy1)和第二细胞因子片段(Cy2)。在一些实施方案中，Cy1及Cy2中之一者包含与白介素-12次单元β具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cy1及Cy2中的另一者包含与白介素-12次单元α具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一细胞因子片段(Cy1)包含与序列SEQ ID NO.5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二细胞因子片段(Cy2)包含与序列SEQ ID NO.6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞因子包含位于第一细胞因子片段(Cy1)和第二细胞因子片段(Cy2)之间的接头。在一些实施方案中，细胞因子为包含与SEQID NO.7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列的IL-12变体。
在一些实施方案中，XTEN序列由多个非重叠序列模体组成，其中所述序列模体选自表2a至表2b的序列模体。在一些实施方案中，XTEN具有40至3000个氨基酸，或100至3000个氨基酸。在一些实施方案中，XTEN与表2a至表2b中所阐述的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％序列一致性。
在一些实施方案中，其中当连接至融合蛋白中的XTEN时，细胞因子与相应细胞因子受体的结合活性的特征在于半最大有效浓度(EC50)比当未与XTEN连接时在体外结合分析中测定的表征细胞因子的相应结合活性的EC50大至少1.2倍、大至少1.4倍、大至少1.6倍、大至少1.8倍、大至少2.0倍、大至少3.0倍、大至少4.0倍、大至少5.0倍、大至少6.0倍、大至少7.0倍、大至少8.0倍、大至少9.0倍或大至少10.0倍。在一些实施方案中，细胞因子可为白介素12(IL-12)且相应细胞因子受体可为白介素12受体(IL-12R)。在一些实施方案中，体外结合分析可利用基因工程改造的报导基因细胞株，该细胞株经构型成以报导蛋白的成比例表达对该细胞因子与该相应细胞因子受体的结合作出反应。在一些实施方案中，体外结合分析可为报导基因活性分析。
在另一方面中，本申请提供一种组合物，其包含本文所公开的融合蛋白以及至少一种药学上可接受的载剂。
在另一方面中，本申请提供一种本发明组合物的用途，其用于制备用于治疗有需要的受试者的疾病的药剂。
在一相关方面中，本申请提供一种治疗或预防受试者的疾病或病况的方法，该方法包含向受试者施用治疗有效量的融合蛋白或包含该融合蛋白的组合物，以上所有均公开于本文中。在一些实施方案中，疾病或病况可为癌症或癌症相关疾病或病况或发炎性或自体免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病或病况可为癌症或癌症相关疾病或病况。可用本发明融合物及组合物治疗的疾病或病况包括(但不限于)癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、全身性红斑狼疮、阿尔茨海默氏症、精神分裂症、病毒感染、过敏性哮喘、视网膜神经退化性过程、代谢病症、胰岛素抗性及糖尿病性心肌症。在一些实施方案中，疾病或病况可为癌症或癌症相关疾病或病况。必要时，本发明融合物及组合物可与治疗有效量的至少一种免疫检查点抑制剂结合使用。必要时，施用模式可为经静脉内、皮下或经口递送。
以引用的方式并入
本说明书中所提及的所有公开物、专利及专利申请均以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同特定地且单独地指示各个单独公开物、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图说明
本发明的特征及优点可参考阐述说明性实施方案的以下实施方式和附图进一步解释。
图1A-图1G展示例示性BPXTEN融合蛋白的示意性图示(图1A-G)，所有均以N端至C端定向描绘。图1A展示两种不同构型的BPXTEN融合蛋白(100)，其各自包含单一生物活性蛋白(BP)及XTEN，其中的第一者具有连接至BP(103)的C端的XTEN分子(102)，且其中的第二者具有连接至BP(103)的N端的XTEN分子。图1B展示两种不同构型的BPXTEN融合蛋白(100)，其各自包含单一BP、间隔子序列及XTEN，其中的第一者具有连接至间隔子序列(104)的C端的XTEN分子(102)及连接至BP(103)的C端之间隔子序列，且其中的第二者具有连接至间隔子序列(104)的N端的XTEN分子及连接至BP(103)的N端之间隔子序列。图1C展示两种不同构型的BPXTEN融合蛋白(101)，其各者包含单一BP的两个分子及XTEN的一个分子，其中的第一者具有连接至第一BP的C端的XTEN且该BP连接至第二BP的C端，且其中的第二者呈相对定向，其中XTEN连接至第一BP的N端且该BP连接至第二BP的N端。图1D展示两种不同构型的BPXTEN融合蛋白(101)，其各者包含单一BP的两个分子、间隔子序列及XTEN的一个分子，其中的第一者具有连接至间隔子序列的C端的XTEN及连接至第一BP的C端之间隔子序列且该BP连接至第二BP的C端，且其中的第二者呈相对定向，其中XTEN连接至间隔子序列的N端且间隔子序列连接至第一BP的N端且该BP连接至第二BP的N端。图1E展示两种不同构型的BPXTEN融合蛋白(101)，其各者包含单一BP的两个分子、间隔子序列及XTEN的一个分子，其中的第一者具有连接至第一BP的C端的XTEN及连接至间隔子序列的C端的第一BP且该间隔子序列连接至第二BP分子的C端，且其中的第二者呈连接至第一BP(其连接至间隔子序列的N端，该间隔子序列转而连接至BP的第二分子的N端)的N端的XTEN的相对构型。图1F展示两种不同构型的BPXTEN融合蛋白(105)，其各者包含单一BP的两个分子及XTEN的两个分子，其中的第一者具有连接至第一BP(其连接至第二XTEN的C端)的C端的第一XTEN且该第二XTEN连接至BP的第二分子的C端，且其中的第二者呈连接至第一BP(其连接至第二XTEN的N端，该第二XTEN连接至第二BP的N端)的N端的XTEN的相对构型。图1G展示在BP的N端和C端处连接至两个XTEN的单一BP的构型(106)。
图2A-图2G为编码图1A-图1G的对应BPXTEN多肽的BPXTEN基因的例示性聚核苷酸构建体的示意图；所有均以5'至3'定向描绘。在这些说明性实施例中，基因编码具有以下的BPXTEN融合蛋白：一个BP及XTEN(100)；或两个BP、一个间隔子序列及一个XTEN(201)；两个BP及两个XTEN(205)；或一个BP及两个XTEN(206)。在这些绘图中，聚核苷酸编码以下组分：XTEN(202)、BP(203)及可包括裂解序列之间隔子氨基酸(204)，其中所有序列框内连接。
图3A-图3E为由内源性可用蛋白酶作用的例示性单体BPXTEN的示意性图解，以及单体融合蛋白或反应产物结合至细胞表面上的目标受体的能力，以及随后的细胞信号传导的示意图。图3A展示BPXTEN融合蛋白(101)，其中BP(103)及XTEN(102)通过含有可裂解序列之间隔子序列(104)连接，后者对MMP-13蛋白酶(105)敏感。图3B展示游离BP、间隔子序列及XTEN的反应产物。图3C展示游离BP(103)或BPXTEN融合蛋白(101)与目标受体(106)对细胞表面(107)上的BP的相互作用。在此情况下，当BP具有游离C端时展现与受体的所需结合，如游离BP(103)与受体的结合所证明，而未裂解融合蛋白不与受体紧密结合。图3D展示具有高结合亲和力的游离BP(103)保持与受体(106)结合，而完整BPXTEN(101)自受体释放。图3E展示结合的BP已内化至细胞(107)内的核内体(108)中，说明受体介导的结合的BP的清除及触发细胞信号传导(109)，描绘为点状细胞质。
图4为XTEN组装、产生及评估中的代表性步骤的示意性流程图。
图5为编码融合蛋白的BP-XTEN聚核苷酸构建体的组装中代表性步骤的示意性流程图。将单独寡核苷酸501退火成序列模体502，诸如12个氨基酸模体(“12聚体”)，其随后与含有BbsI及KpnI限制性位点的寡核苷酸503接合。使来自库的额外序列模体退火成12聚体，直至达成XTEN基因504的所需长度。将XTEN基因克隆至填充(stuffer)载体中。载体编码Flag序列506，随后为由BsaI、BbsI及KpnI位点侧接的终止序列507及细胞因子基因508，产生编码用于并入至BPXTEN组合中的BP-XTEN融合物的基因500。
图6为编码融合蛋白的基因的组装中代表性步骤的示意性流程图，该融合蛋白包含生物活性蛋白(BP)及XTEN，其作为融合蛋白的表达及回收，以及其作为候选BPXTEN产物的评估。
图7示出具有氨基酸序列SEQ ID NO:2(参见表B)的例示性XTEN化细胞因子(亦即“XTEN化IL12”构建体)的结构构型。例示性“XTEN化IL12”构建体包含能够由哺乳动物蛋白酶裂解的裂解序列。在例示性“XTEN化IL12”构建体的蛋白酶裂解后，释放相应的“去XTEN化IL12”片段及“XTEN片段”。亦示出含有相同IL12部分的参考细胞因子构建体(亦即参考IL12”构建体)，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4(参见表B)。
图8示出由于XTEN化而降低的细胞因子活性。举例而言，相对于相应蛋白质活化、去XTEN化(未掩蔽)IL-12组合物，XTEN化(掩蔽)白介素-12(IL12)组合物(SEQ ID NO:2)在293HEKIL-12报导细胞中诱导信号转导及转录活化子4(STAT-4)的活性至少低2倍。对XTEN化细胞因子组合物进行去XTEN化的蛋白酶处理于图7中示出。XTEN化IL12的EC50(具有167.0的值)大于相应去XTEN化IL12的EC50(具有79.4的值)，指示XTEN对IL12蛋白质且更一般而言对细胞因子的掩蔽能力。
图9A-图9B示出细胞因子结合中的XTEN化介导的减少。举例而言，图9A示出“XTEN化IL12”组合物(SEQ ID NO:2)及无XTEN化的“参考IL12”组合物(SEQ ID NO:4)与293HEK-IL12报导细胞(HEK-BlueTM IL-12细胞(Invivogen,San Diego,CA))的结合。“XTEN化IL12”的EC50(具有约11.8的值)大于“参考IL12”的EC50(具有约4.5的值)，指示XTEN干扰IL12与相应IL12受体之间的结合的能力(亦即掩蔽效应)。图9B示出“XTEN化IL12”及“参考IL12”组合物与IL12受体阴性293HEK细胞(对照)之间缺乏结合。作为另一对照，未观测到相应XTEN片段(参见图7)与IL12报导细胞或IL12阴性对照细胞的结合。
图10A-图10C。IL12-XPAC-4X结构及活性分析。图10A展示例示性IL12-XPAC-4X的示意性结构，其中IL-12次单元上存在4个XTEN链。图10B展示图10A中所示的IL12-XPAC-4X的示意图，其中添加转谷氨酰胺酶标签(TG)标签。TG标签由箭头展示。图10C展示来自图10A及图10B中两个构建体的PAC及XPAC的HEK Blue活性分析。
图11A-图11C。所有XTEN掩蔽活性。图11A展示含有四个XTEN部分(AP2446)的例示性构建体的活性。图11B展示含有三个XTEN部分(AP2447)的例示性构建体的活性。图11C展示含有一个XTEN部分(AP2450)的例示性构建体的活性。
图12A-图12C。三个例示性IL12-XPAC-4X构建体的设计。图12A为AC2582/AC2585的设计，图12B为AC3244/AC3247的设计。图12C为AC3245/AC3246的设计。
图13展示进一步包含肿瘤结合域的例示性XPAC的示意图。
图14展示来自在携带MC38肿瘤的C57/Blk6小鼠中进行的体内功效研究的肿瘤消退结果。一旦确立，肿瘤用稀释剂、三种不同浓度的rIL-12或两种不同浓度的IL-12-XPAC治疗。所展示数据支持IL-12XPAC在产生肿瘤消退方面的功效。
图15A展示自图14中所示的携带肿瘤的小鼠研究获得的毒性/体重资料。图15B展示rIL12及IL12 XPAC对非肿瘤携带小鼠的体重的影响。这些数据表明XPAC安全性。
具体实施方式
虽然细胞因子仍可能为强力治疗剂，但即使在低浓度下，这些药剂亦产生限制其在临床环境中的实际应用的副作用。本申请利用细胞因子学相关组合物及相关方法的治疗潜力，同时控制那些强力化合物的有害影响。更特别是，本申请涉及称为Xten化蛋白酶活化细胞因子(XPAC)的特定BPXTEN分子，其在存在于肿瘤微环境中的蛋白酶存在下条件性活化。本申请涉及用于制备XPAC的方法及组合物。虽然本申请提供具有IL12的某些实施例，但应理解，本申请广泛适用于任何细胞因子，其活性应优选减弱直至其在作用部位处提供的时为止。XPAC提供一种可由IL12在T细胞及NK细胞介导的发炎反应中的作用而产生的有效克服肿瘤诱导的免疫抑制的方法。
如上文所指出，细胞因子为强效免疫激动剂，然而，此强力类别化合物的相对狭窄治疗窗限制了其在治疗环境中的应用前景。其具有短半衰期，极其强效，且产生显著不合需要的全身性效应及毒性。另外，通过需要施用大量细胞因子进一步窄化治疗窗，以便在肿瘤或肿瘤微环境中在细胞因子作用的预期部位处达成细胞因子的所需水平。因此，细胞因子迄今为止未能在临床环境中达到其用于治疗肿瘤的潜力。
本发明妨碍细胞因子在肿瘤学中的临床用途的克服毒性及短半衰期缺点。本发明的XPAC含有具有受体激动剂活性的细胞因子多肽。但在XPAC的上下文中，细胞因子受体激动剂活性减弱且循环半衰期延长。XPAC包括蛋白酶裂解位点，其通过与细胞因子活性的所需位点(例如肿瘤)相关的蛋白酶裂解，且通常富集或选择性存在于所需活性位点处。因此，XPAC优先(或选择性地)且在所要作用部位处有效地裂解。此将细胞因子活性实质上限制至所需活性位点，诸如肿瘤微环境。在所需活性位点，诸如在肿瘤微环境中的蛋白酶裂解自XPAC释放细胞因子形式，其作为细胞因子受体激动剂的活性比连接有XTEN分子的XPAC高得多。自XPAC裂解XTEN后释放的细胞因子形式典型地具有短半衰期，其通常实质上类似于天然存在的细胞因子的半衰期。此有利地限制细胞因子对肿瘤微环境的活性。尽管XPAC的半衰期延长，但毒性显著降低或消除，因为循环XPAC减弱且活性细胞因子靶向肿瘤微环境。本文所描述的XPAC首次能够施用有效治疗剂量的细胞因子来治疗具有基本上限于肿瘤微环境的细胞因子活性的肿瘤，且显著减少或消除细胞因子的非所需全身效应及毒性。
在描述本发明的实施方案之前，应理解，此类实施方案仅借助于实施例提供，且本文所描述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。本领域技术人员可在不背离本发明的情况下想到许多变化形式、改变及替换。
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语具有与本领域技术人员通常所理解相同的意义。尽管类似或等效于本文所描述的那些方法及材料可用于实践或测试本发明，但合适的方法及材料描述如下。在冲突的情况下，将以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法及实施例仅为说明性的，且不意欲为限制性的。本领域技术人员可在不背离本发明的情况下想到许多变化形式、改变及取代。
定义
如本文所使用，除非另外规定，否则以下术语具有归属于其的意义。
除非上下文另外明确指示，否则如本说明书及权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”及“该”包括复数个参考物。举例而言，术语“一个细胞”包括复数个细胞，包括其混合物。
术语“细胞因子”为本领域技术人员所熟知，且是指由尤其免疫系统的细胞分泌且为免疫调节剂之一类免疫调节蛋白中的任一者。可用于本文中所公开的XPAC中的细胞因子多肽包括但不限于：白介素，诸如IL-1、IL-1.α.、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21及IL-25；转型生长因子，诸如TGF-.α.及TGF-.β.(例如TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)；干扰素，诸如干扰素-.α.、干扰素-.β.、干扰素-.γ.、干扰素-κ及干扰素-ω；肿瘤坏死因子，诸如肿瘤坏死因子α及淋巴毒素；趋化因子(例如C--X--C模体趋化因子10(CXCL10)、CCL19、CCL20、CCL21)；及颗粒球群落刺激因子(GM-CS)；以及其保留受体激动剂活性的功能片段。“趋化因子”为本领域的术语，其是指具有在邻近反应性细胞中诱导定向趋化性的能力的一个小细胞因子家族中的任一者。
如本文所用，术语“可活化”、“活化”、“诱导”及“可诱导”是指作为XPAC的一部分的蛋白质(亦即细胞因子)结合其受体且在XTEN自XPAC裂解后实现活性的能力。
本领域技术人员应理解术语“半衰期延长”用以是指与作为XPAC的一部分的细胞因子相比，XPAC通过例如改变其大小(例如高于肾脏过滤截止值)、形状、流体动力学半径、电荷或吸收、生物分布、代谢及消除的参数来增加血清半衰期且改善pK。
术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为直链或分支链，其可包含经修饰的氨基酸，且其可间杂有非氨基酸。术语亦涵盖已经修饰的氨基酸聚合物，例如通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵，诸如与标记组分结合。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于甘氨酸及D或L光学异构物两者，及氨基酸类似物及肽模拟物。标准单字母或三字母编码用于指示氨基酸。
术语“天然L-氨基酸”是指甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)及苏氨酸(T)的L光学异构物形式。
应用于序列且如本文所用的术语“非天然存在的”是指不具有针对哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列的对应物、不与其互补或不与其具有较高程度的同源性的多肽或聚核苷酸序列。举例而言，当适当地比对时，非天然存在的多肽可相比于天然序列共有不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更少氨基酸序列一致性。
术语“亲水性”及“疏水性”是指物质与水具有的亲和力的程度。亲水性物质对于水具有强亲和力，倾向于溶解于水中、与水混合或通过水润湿，而疏水性物质对于水基本上不具有亲和力，倾向于排斥水且不吸收水且倾向于不溶解于水中或与水混合或通过水润湿。氨基酸可基于其疏水性来表征。已开发出多种标度。实施例为由Levitt,M等人,J Mol Biol(1976)104:59开发的标度，其列举于Hopp,TP等人,Proc Natl Acad Sci U S A(1981)78:3824中。“亲水性氨基酸”的实施例为精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。备受关注的为亲水性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸及丝氨酸及甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实施例为色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸。
“片段”为天然生物活性蛋白的截断形式，其保留治疗活性和/或生物活性的至少一部分。“变体”为与天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质，其保留生物活性蛋白的至少一部分治疗活性和/或生物活性。举例而言，变体蛋白可与参考生物活性蛋白共有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。如本文所用，术语“生物活性蛋白部分”包括经过故意修饰的蛋白质，如例如通过定点诱变、插入或偶然经由突变来进行修饰。
“宿主细胞”包括可为或已为本发明载体的受体的单独细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞之后代。由于自然、偶然或目的性突变，后代可能未必与原始母细胞完全相同(在形态或总DNA互补序列的基因组方面)。宿主细胞包括经本发明的载体体内转染的细胞。
当用于描述本文所公开的不同多肽时，“经分离”是指已识别及分离和/或自其天然环境的组分回收的多肽。其天然环境的污染组分为将通常干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。如本领域技术人员所显而易知，非天然存在的聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将其与其天然存在的对应体区分开。另外，“浓缩”、“分离”或“稀释”的聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应体区分开，因为每体积的浓度或分子数一般大于其天然存在的对应体的浓度或分子数。一般而言，将通过重组方式制得且表达于宿主细胞中的多肽视为“经分离”。
“经分离”聚核苷酸或多肽编码核酸或其他多肽编码核酸为经鉴别且与在多肽编码核酸的天然来源中通常与其相关联的至少一种杂质核酸分子分离的核酸分子。经分离的多肽编码核酸分子不呈其于自然界中所发现的形式或设定。经分离的多肽编码核酸分子因此与其存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子区分开。然而，经分离的多肽编码核酸分子包括细胞中所含的多肽编码核酸分子，所述细胞通常在例如核酸分子所处的染色体或染色体外位置不同于天然细胞的情况下表达多肽。
“嵌合”蛋白质含有至少一种融合多肽，其在与天然存在不同的序列位置包含至少一个区。区可通常存在于独立蛋白质中且在融合多肽中结合在一起；或其可通常存在于相同蛋白质中，但在融合多肽中以新排列形式置放。嵌合蛋白可例如通过化学合成，或通过产生及翻译肽区以所需关系编码的聚核苷酸而产生。
在本文中，“结合(Conjugated)”、“连接(linked)”、“融合(fused)”及“融合(fusion)”可互换地使用。这些术语是指通过包括化学结合或重组手段的任何手段使多于两种化学元素或组分接合在一起。举例而言，若启动子或强化子影响序列的转录，则启动子或强化子可操作地连接于编码序列。一般而言，“可操作地连接”是指连接的DNA序列为连续的，且在阅读相内或框内。“框内融合”是指两个或更多个开放阅读框架(ORF)以维持原始ORF的适当阅读框架的方式接合以形成连续较长ORF。因此，所得重组融合蛋白为单一蛋白质，其含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的区段(所述区段在自然界中通常不如此接合)。术语“连接(link/linked/linking)”以最广泛意义使用，且特别是意欲以直接或间接方式包括治疗剂的部分与治疗剂的另一部分的共价及非共价连接。如本文在治疗剂的上下文中所用的术语“直接连接”一般是指其中部分与另一部分连接或附接而无介入为链的结构。如本文在治疗剂的上下文中所用的术语“间接连结”一般是指其中治疗剂的部分经由介入为链与治疗剂的另一部分连接或附接的结构。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”为呈至羧基末端方向的多肽中的氨基酸次序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽之一级结构中为连续的。“部分序列”为已知沿一个或两个方向包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。
“异源”是指衍生自与其所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实体。举例而言，自其天然编码序列移除且以可操作地连接至除天然序列以外的编码序列的甘氨酸富集序列为异源甘氨酸富集序列。应用于聚核苷酸、多肽的术语“异源”是指聚核苷酸或多肽衍生自与其所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实体。
术语“聚核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”及“寡核苷酸”可互换使用。其指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物形式，或其类似物。聚核苷酸可具有任何三维结构，且可执行任何已知或未知的功能。以下为聚核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段的编码或非编码区、根据连接分析所定义的基因座(loci/locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖核酸酶、cDNA、重组聚核苷酸、分支聚核苷酸、质体、载体、经分离的任何序列DNA、经分离的任何序列RNA、核酸探针及引物。聚核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。若存在，可在聚合物组装之前或之后赋予核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可能间杂有非核苷酸组分。可在聚合之后，诸如通过与标记组分结合而进一步修饰聚核苷酸。
术语“聚核苷酸的补体”指示与参考序列相比具有互补碱基序列及相反定向的聚核苷酸分子，使得其可与参考序列以完整保真度杂交。
应用于聚核苷酸的“重组”是指聚核苷酸为可包括体外克隆、限制和/或接合步骤的各种组合，及引起可潜在地在宿主细胞中表达的构建体的其他程序的产物。
术语“基因”或“基因片段”在本文中可互换使用。其是指含有至少一个能够在经转录及翻译之后编码特定蛋白质的开放阅读框架的聚核苷酸。基因或基因片段可为基因组或cDNA，只要聚核苷酸含有至少一个可覆盖整个编码区或其区段的开放阅读框架即可。“融合基因”为由至少两种连接在一起的异源聚核苷酸构成的基因。
“同源”或“同源性”是指两个或更多个聚核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的序列类似性或互换性。当使用诸如BestFit的程序来测定两种不同氨基酸序列之间的序列一致性、类似性或同源性时，可使用预设设定，或可选择适当计分矩阵，诸如blosum45或blosum80以使一致性、类似性或同源性评分优化。优选地，同源聚核苷酸为在如本文所定义的严格条件下杂交且与那些序列相比，具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更优选地95％、更优选地97％、更优选地98％且甚至更优选地99％序列一致性的那些聚核苷酸。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指聚核苷酸将在相比于其他序列可检测地更大的程度上杂交至其靶序列(例如超过背景至少2倍)的条件。一般而言，杂交的严格程度在某种程度上表达为与进行洗涤步骤的温度及盐浓度有关。通常，严格条件将为，在pH7.0至8.3且温度至少约为30℃下，盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约为0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)。对于短聚核苷酸(例如，10至50个核苷酸)，至少约为60℃。对于长聚核苷酸(例如，大于50个核苷酸)，例如，“严格条件”可包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中杂交，以及在60至65℃下在0.1×SSC/1％ SDS中洗涤三次，各15分钟。替代地，可使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可在约0.1至2×SSC之间变化，其中SDS以约0.1％存在。此类洗涤温度通常对于特定序列在界定离子强度及pH下选择为低于热熔点
Figure BDA0004014658270000081
约5℃至20℃。Tm为50％的目标序列杂交至完全匹配探针的温度(在界定离子强度及pH下)。计算Tm的方程式及用于核酸杂交的条件为熟知的且可见于Sambrook,J.等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷，Cold Spring Harbor Press,Plainview N.Y.；特别参见第2卷及第9章。通常，阻断试剂用于阻断非特异性杂交。此类阻断试剂包括例如约100-200μg/ml的经剪切及变性的鲑鱼精子DNA。亦可在特定环境下使用有机溶剂，诸如浓度为约35-50％v/v的甲酰胺，诸如用于RNA:DNA杂交。这些洗涤条件的有用变化形式将为一般本领域技术人员显而易知。
应用于聚核苷酸序列的术语“一致性百分比”及“一致性％”是指使用标准化算法比对的至少两个聚核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。此类算法可以标准化及可再现方式在进行比较的序列中插入间隙以使两个序列之间的比对优化，且因此达成两个序列的更有意义的比较。一致性百分比可在整个界定聚核苷酸序列的长度上量测，例如如由特定SEQID编号所定义，或可在较短长度上量测，例如在获自较大界定聚核苷酸序列的片段，例如至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段的长度上量测。此类长度仅为例示性的，且应理解，由本文在表格、图式或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可用于描述可量测百分比一致性的长度。
相对于本文中所鉴别的多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”定义为在对比序列且必要时引入间隙以实现最大序列一致性百分比之后，与第二参考多肽序列或其部分的氨基酸残基一致的查询序列中的氨基酸残基的百分比，且不考虑任何保守取代作为序列一致性的一部分。出于判定氨基酸序列一致性百分比的目的，可以在此项技术内的各种方式达成比对，例如使用公开可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可测定用于量测比对的适当参数，包括用于达成所比较序列的全长内的最大比对所需的任何算法。一致性百分比可在整个界定多肽序列的长度上量测，例如如由特定SEQ ID编号所定义，或可在较短长度上量测，例如在获自较大界定多肽序列的片段，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段的长度上量测。此类长度仅为例示性的，且应理解，由本文在表格、图式或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可用于描述可量测百分比一致性的长度。
如本文在多肽的上下文中所用的术语“非重复性”是指肽或多肽序列中缺乏或具有有限程度的内部同源性。术语“基本上非重复”可是指例如序列中存在少数或不存在四个连续氨基酸的实施例，所述氨基酸为一致氨基酸类型或多肽具有10或更小的子序列分值(下文所定义)或不存在构成多肽序列的序列模体的N端至C端的次序的模式。如本文在多肽的上下文中所用的术语“重复性”是指肽或多肽序列中内部同源性的程度。相比之下，“重复”序列可以含有短氨基酸序列的多个一致复本。举例而言，相关多肽序列可分成n聚体序列且可计数一致序列的数目。高度重复序列含有大部分一致序列，而非重复序列含有少数一致序列。在多肽的上下文中，序列可含有具有规定或可变长度或模体的较短序列的多个复本，其中模体本身具有非重复序列，使得全长多肽基本上非重复。量测非重复性的多肽长度可在3个氨基酸至约200个氨基酸、约6至约50个氨基酸或约9至约14个氨基酸之间变化。用于聚核苷酸序列的上下文中的“重复性”是指序列的内部同源性程度，诸如给定长度之一致核苷酸序列的频率。重复性可例如通过分析相同序列的频率来量测。
“载体”为优选在适当宿主中自主复制的核酸分子，其将插入的核酸分子传递至宿主细胞中和/或之间。术语包括主要用于将DNA或RNA插入至细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体的复制品及用于DNA或RNA转录和/或翻译的表达载体。亦包括提供超过一种以上功能的载体。“表达载体”为当引入至适当宿主细胞中时，可经转录及翻译成多肽的聚核苷酸。“表达系统”通常是指由可用以产生所需表达产物的表达载体构成的适合的宿主细胞。
应用于多肽的“血清降解抗性”是指多肽耐受血液或其组分中的降解的能力，其通常涉及血清或血浆中的蛋白酶。可通过组合蛋白质与人类(或视需要未小鼠、大鼠、猴)血清或血浆，通常在数天(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)范围内，通常在约37℃下量测血清降解抗性。这些时间点的样品可在西方墨点分析上运行且蛋白质用抗体检测。抗体可为蛋白质中的标签。若蛋白质在西方墨点分析上显示单一谱带，其中蛋白质的大小与注射的蛋白质相同，则未发生降解。在此例示性方法中，如由西方墨点法或等效技术判定的50％蛋白质降解的时间点为蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
如本文中所使用的术语“t1/2”意指被计算为ln(2)/Kel的终末半衰期。Kel为通过对数浓度对比时间曲线的终端线性部分的线性回归所计算的终端消除速率常数。半衰期通常是指活有机体中沉积的施用物质之一半数量通过正常生物过程代谢或消除所需的时间。术语“t1/2”、“终末半衰期”、“消除半衰期”及“循环半衰期”在本文中可互换使用。
“表观分子量因子”或“表观分子量”是指由特定氨基酸序列展现的表观分子量相对增加或减小的量度的相关术语。使用尺寸排阻色谱法(SEC)及类似方法(与球状蛋白质标准物相比)测定表观分子量且以“表观kD”单元量测。表观分子量因子为表观分子量与实际分子量之间的比率；后者为通过基于氨基酸组合物，相加组合物中的每种类型的氨基酸的分子量来计算。
“流体动力学半径”或“斯托克斯半径(Stokes radius)”为溶液中的分子的有效半径(以nm为单位的Rh)，通过假设其为在溶液中移动且受溶液的黏度抵抗的物体来量测。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径量测与“表观分子量因子”相关，其为更直观的量测。蛋白质的“流体动力学半径”影响其于水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径为通过其分子量以及其结构(包括形状及紧密性)来测定。测定流体动力学半径的方法为本领域熟知，诸如通过使用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利第6,406,632号及第7,294,513号中所描述。大多数蛋白质具有球状结构，其为最紧密三维结构，蛋白质可具有最小流体动力学半径。一些蛋白质采用无规及开放、非结构化或“线性”构象且因此具有与类似分子量的典型球状蛋白相比大得多的流体动力学半径。
“生理条件”是指活宿主中的条件集合以及体外条件，包括模拟活受试者的那些条件的温度、盐浓度、pH。已建立用于体外分析的生理学相关条件的宿主。一般而言，生理缓冲液含有生理浓度的盐且经调节至约6.5至约7.8，且优选地约7.0至约7.5范围内的中性pH。多种生理缓冲液在Sambrook等人中列出。(1989年)。生理学相关温度在约25℃至约38℃范围内，且优选在约35℃至约37℃范围内。
“反应性基团”为可耦合至第二反应性基团的化学结构。反应性基团的实施例为氨基、羧基、硫氢基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应性基团可经活化以促进与第二反应性基团偶合。活化的实施例为羧基与碳化二亚胺的反应、羧基转化为活化酯或羧基转化为叠氮化物官能基。
“控释剂”、“缓释剂”、“储库型长效制剂(depot formulation)”或“持续释放剂”可互换地使用，是指能够使本发明的多肽释放持续时间相对于当在无药剂存在下施用多肽时释放持续时间延长的药剂。本发明的不同实施方案可具有不同释放速率，产生不同治疗量。
术语“抗原”、“目标抗原”或“免疫原”在本文中可互换使用，是指抗体片段或基于抗体片段的治疗剂结合至或具有结合特异性的结构或结合决定子。
如本文所用的术语“有效负载”是指具有生物或治疗活性的蛋白质或肽序列；小分子的药效团的对应物。有效负载的实施例包括但不限于细胞因子、酶、激素及血液及生长因子。有效负载可进一步包含遗传融合或化学结合部分，诸如化学治疗剂、抗病毒化合物、毒素或造影剂。这些结合部分可经由可能为可裂解或不可裂解的接头接合至多肽的其余部分。
如本文所用，术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文所公开的天然多肽的生物活性的任何分子。鉴定多肽的拮抗剂的方法可包含使天然多肽与候选拮抗剂分子接触及量测通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。在本发明的上下文中，拮抗剂可包括蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或任何其他降低生物活性蛋白的效应的分子。
术语“激动剂”以最广泛意义使用且包括任何模拟本文所公开的天然多肽的生物活性的分子。适合的激动剂分子特别包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、有机小分子等。鉴别天然多肽的激动剂的方法可包含使天然多肽与候选激动剂分子接触及量测通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
出于本文中的目的，“活性”是指与相应天然生物活性蛋白的组分一致的融合蛋白的组分的作用或效应，其中“生物活性”是指体外或体内生物功能或效应，包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性或细胞或生理学反应。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”或“缓解”或“改善”在本文中可互换使用。这些术语是指获得有益或所希望的结果的方法，所述结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。“治疗益处”是指根除或减轻所治疗的潜在病症。因此，举例而言，治疗是指减轻疾病或病况或疾病或病况的症状的影响的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可指至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或实质上完全降低已建立的疾病或病况或疾病或病况的症状的严重程度。举例而言，若受试者的疾病的一种或多种症状相较于对照组减少10％，则将用于治疗疾病的方法视为治疗。因此，与天然或对照水平相比，降低可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或10％与100％之间的任何降低百分比。此外，治疗益处为通过与潜在疾病病况相关的一种或多种生理症状的根除或改善，使得在受试者中观测到改良来达成，尽管如此，受试者仍可能罹患潜在病症。出于预防益处，组合物可向处于罹患特定疾病或病况的风险下的受试者施用，或向报导疾病的一种或多种生理症状但可能尚未作出此疾病的诊断的受试者施用。应理解，治疗未必是指疾病、病况或疾病或病况的症状的治愈或完全去除。
如本文所用，“治疗效应”是指生理效应，包括但不限于治愈、缓解、改善或预防人类或其他动物的疾病或病况，或以其他方式增强人类或动物的物理或精神健康，其除诱导产生针对生物活性蛋白质所具有的抗原决定基的抗体的能力以外，由本发明的融合多肽引起。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其根据本文所提供的详细公开内容来确定。
如本文中所用，术语“治疗有效量”及“治疗有效剂量”是指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的量，当以一个或重复剂量向受试者施用时能够对疾病状态或病况的任何症状、方面、量测参数或特征具有任何可检测的有益作用。此类作用不必绝对有益。疾病或病况可指病症或疾病。
如本文所用，术语“治疗有效剂量方案”是指单独或作为融合蛋白组合物的一部分连续施用剂量的生物活性蛋白的排程，其中剂量以治疗有效量给予以对疾病状态或病况的任何症状、方面、量测参数或特征产生持续有益作用。
如本文所用，疾病或病症的术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指例如施用嵌合多肽或编码嵌合多肽的核酸序列的操作，该操作发生在受试者开始展示一种或多种疾病或病症的症状之前或大约相同的时间，其抑制或延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或恶化。
如本文所用，提及“减少”、“降低”或“抑制”包括与适合对照水平相比,改变至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或以上。此类术语可包括(但未必包括)功能或特性(诸如激动剂活性)的完全消除。
“减弱的细胞因子受体激动剂”为一种细胞因子受体激动剂，其与细胞因子受体的天然存在激动剂相比，具有降低的受体激动剂活性。与受体的天然存在激动剂相比，减弱的细胞因子激动剂可具有至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍、至少约1000倍或更低的激动剂活性。当含有如本文所描述的细胞因子多肽的XPAC描述为“减弱”或具有“减弱的活性”时，其是指XPAC为减弱的细胞因子受体激动剂。
一般技术
除非另外指明，否则本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学及重组DNA的常规技术，所述技术在此项技术的技能内。参见Sambrook,J.等人.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001；“Current protocols in molecular biology”,F.M.Ausubel,等人编.,1987；“Methods in Enzymology”系列,Academic Press,SanDiego,CA.；“PCR 2:a practical approach”,M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor编.,Oxford University Press,1995；“Antibodies,a laboratory manual”Harlow,E.及Lane,D.编.,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；“Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics”,第11版,McGraw-Hill,2005；及Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique”,第4版,John Wiley&Sons,Somerset,NJ,2000，其内容以引用方式全文并入本文。
用于XPAC的细胞因子
一般而言，细胞因子的治疗用途很大程度上受到其全身毒性限制。例如，TNF最初由于其诱导一些肿瘤出血性坏死的能力及其对不同肿瘤株为的体外细胞毒素作用而被发现，但其随后被证明具有强促炎性活性，其可在过度产生条件的情况下危险地影响人体。由于全身毒性为在人类中使用药理学活性量的细胞因子的基本问题，因此现在评估新颖衍生物及治疗策略，旨在降低此类生物效应子的毒性效应同时保持其治疗功效。
用于产生XPAC的优选细胞因子为白介素-12(IL-12)。IL-12为两个独立编码次单元(p35及p40)的二硫键连接的异二聚体，其共价连接以产生所谓的生物活性异二聚体(p70)分子。除形成异二聚体(IL-12及IL-23)之外，p40次单元亦作为单体(p40)及同二聚体(p402)分泌。本领域已知，用连接p35与p40次单元的接头合成呈单链的异二聚体保持异二聚体的完整生物活性。IL-12在对感染的早期发炎反应及Th1细胞产生中起关键作用，其促进细胞介导的免疫性。已发现IL-12的过度产生可能对宿主有害，因为其涉及多种自体免疫性发炎疾病(例如MS、关节炎、1型糖尿病)的发病机制。
IL-12受体(IL-12R)为异二聚错合物，其由在活化T细胞及自然杀伤细胞表面上表达的IL-12Rβ1及IL-12Rβ2链组成。IL-12Rβ1链结合至IL-12p40次单元，而IL-12p35结合IL-12Rβ2赋予胞内信号传导能力。经由IL-12R的信号转导诱发詹纳斯激酶(Janus kinase，Jak2)及酪氨酸激酶(Tyk2)磷酸化，磷酸化且活化信号转导与转录活化因子(STAT)1、STAT3、STAT4及STATS。IL-12的特异性细胞效应主要为由于STAT4的活化。IL-12诱导自然杀手及T细胞产生细胞因子，特别为干扰素(IFN)γ，其介导IL-12的许多促炎性活性，包括CD4+T细胞向Th1表型的分化。
IL-2在免疫系统中发挥刺激及调节功能两者，且与共同γ链细胞因子家族的其他成员一起，为免疫稳态的核心。IL-2通过结合至IL-2受体(IL-2R)来介导其作用，所述受体由任一由IL-2Rα(CD25)、IL-2Rβ(CD122)及IL-2R-γ(γ-c，CD132链或二聚体βγIL-2R构成的三聚体受体组成。IL-2R变体均能够在IL-2结合时传输信号。然而，与二聚体βγIL-2R(3)相比，三聚体αβγIL-2R对IL-2的亲和力高约10至100倍，暗示CD25赋予IL2与其受体的结合高亲和力但对于信号转导并不至关重要。在活化T细胞及CD4+叉头框P3(FoxP3)+T调节细胞(Treg)上发现三聚体IL-2R，其在体外及体内对IL-2敏感。反之，抗原经历的(记忆)CD8+、CD44高记忆表型(MP)CD8+及自然杀手(NK)细胞具有高水平的二聚体βγIL-2R，且这些细胞亦体外及体内对IL-2产生剧烈反应。
高亲和力IL-2R的表达对于赋予T细胞以对体内短暂可用的低浓度IL-2起反应为至关重要的。IL-2Rα表达在初始及记忆T细胞上不存在，但在抗原活化之后经诱导。IL-2Rβ组成性地由NK、NKT及记忆CD8+T细胞表达，但在抗原活化之后亦在初始T细胞上诱导。γ-链受严格调控的程度低得多且由所有淋巴细胞组成性表达。一旦高亲和力IL-2R由抗原诱导，则IL-2R信号传导在某种程度上经由Il2ra转录的Stat5依赖性调节来上调IL-2Rα的表达。此过程表示维持高亲和力IL-2R表达及维持IL-2信号传导同时仍保持IL-2来源之一种机制。
白介素-15(IL-15)(细胞因子4-α-螺旋束家族的另一成员)亦已显现为用于治疗癌症的免疫调节剂。IL-15起初经由IL-15Rα捕获，其表达于抗原呈现树突状细胞、单核球及巨噬细胞上。IL-15展现较宽泛活性且经由IL-15/IL-2-R-β(CD122)及共同γ链(CD132)经由信号传导来诱导T、B及自然杀手(NK)细胞的分化及增殖。其亦增强CD8+T细胞的溶胞活性且诱导持久的抗原经历的CD8+CD44记忆T细胞。IL-15刺激B细胞分化及免疫球蛋白合成且诱导树突状细胞成熟。其并不刺激免疫抑制性T调节细胞(Treg)。因此，在肿瘤微环境中选择性增强IL-15活性可增强先天性及特异性免疫性且对抗肿瘤。
白介素-7(IL-7)亦属于IL-2/IL-15家族，为充分表征的多效性细胞因子，且由基质细胞、上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞及角质细胞表达，且在活化后由树突状细胞表达(Alpdogan等人,2005)。尽管其最初描述为前驱体B淋巴球的生长及分化因子，但后续研究已展示IL-7极其涉及T淋巴球发育及分化。白介素-7信号传导对最佳CD8 T细胞功能、稳态及记忆建立至关重要(Schluns等人,2000)；其为大部分T细胞亚群的存活期所需的，且其表达已经提议对于调节T细胞数目至关重要。
IL-7在细胞毒性化疗后在癌症患者中增强免疫复原方面具有潜在作用。IL-7疗法增强免疫复原且可通过促进较少数目的近期胸腺迁移细胞之外周扩张来增强甚至有限胸腺功能。因此，IL-7疗法可潜在地修复已由细胞毒性化疗耗尽的患者的免疫系统且可为XPAC生产的有吸引力的候选物。
调节性T细胞主动抑制免疫系统活化且预防病理性自身反应性及随的而来的自体免疫性疾病。研发选择性地活化调节性T细胞以用于治疗自体免疫性疾病的药物及方法为大量研究的主题，且直至本发明研发出可在发炎部位处选择性地传递活性白介素之前，已在很大程度上失败。调节性T细胞(Treg)为抑制其他免疫细胞的活性之一类CD4+CD25+T细胞。Treg对免疫系统稳态为的核芯，且在维持自体抗原耐受性及调节针对外来抗原的免疫反应中起主要作用。多种自体免疫性及发炎性疾病，包括1型糖尿病(T1D)、全身性红斑性狼疮症(SLE)及移植物抗宿主病(GVHD)已展示出在Treg细胞数目或Treg功能上的不足。
因此，对提高Treg细胞的数目和/或功能的疗法的研发存在极大关注。一种方法为使用低剂量白介素-2(IL-2)治疗。Treg细胞特征性地表达高亲和力IL-2受体的高构成性水平，IL2Rαβγ由次单元IL2Rα(CD25)、IL2Rβ(CD122)及IL2Rγ(CD132)组成，且Treg细胞生长已被显示依赖于IL-2。反之，使用IL-2亦实现免疫活化，且已审批通过重组IL-2
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来治疗某些癌症。高剂量IL-2用于治疗患有转移性黑色素瘤及转移性肾细胞癌的患者，对总存活率具有长期影响。
低剂量IL-2治疗慢性GVHD及HCV相关的自体免疫性血管炎患者的临床试验证明Treg水平及临床功效的征象增加。使用所谓低剂量IL-2的基本原理为利用高IL-2亲和力的三聚体IL-2受体，该三聚体IL-2受体组成性表达于Treg上，而留下不表达处于不活化状态下的高亲和力受体的其他T细胞。在这些试验中所用的IL-2的重组形式的
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(Prometheus Laboratories,San Diego,Calif.)与高毒性相关。高剂量下的阿地白介素(aldesleukin)经批准用于治疗转移性黑色素瘤及转移性肾癌，但其副作用极严重以至于其仅在能够获得重症监护的医院环境中推荐其使用。
自体免疫性疾病中IL-2的临床试验已采用较低剂量的IL-2以靶向Treg细胞，因为Treg细胞由于其IL2Rα的表达而对比许多其他免疫细胞类型更低浓度的IL-2起反应。然而，即使这些较低剂量亦会产生安全性及耐受性问题，且所用治疗已长期或在间歇性5天治疗过程中采用每日皮下注射。因此，需要增强Treg细胞数目及功能的自体免疫性疾病疗法，该自体免疫性疾病疗法比IL-2更特定地靶向Treg细胞，其为安全且更可耐受的，且以更低频率施用。IL-2的此低治疗窗在整个其他细胞因子疗法中发挥作用。
改良针对自体免疫性疾病的基于细胞因子的疗法的治疗指数之一种方法为使用相对于其他免疫细胞对Treg细胞具有选择性的IL-2变体。IL-2受体表达于多种不同免疫细胞类型，包括T细胞、NK细胞、嗜伊红血球及单核球上，且此广泛表达模式可能有助于其对免疫系统的多效性作用及高全身毒性。特别是，活化T效应细胞表达IL2Rαβγ，肺部上皮细胞亦如此。但活化T效应细胞直接与下调及控制免疫反应的目标背道而驰，且活化肺上皮细胞导致IL-2的已知剂量限制性副作用，包括肺水肿。实际上，高剂量IL-2免疫疗法的主要副作用为血管渗漏综合征(VLS)，其导致血管内流体在诸如肺及肝的器官中积累，随后出现肺水肿及肝细胞损伤。除停服IL-2之外，不存在VLS的疗法。为了避免VLS，已在患者中测试低剂量IL-2方案，然而以次最佳的治疗结果为代价。
利用除IL-2以外的白介素细胞因子进行治疗的情况甚至有限。IL-15呈现类似于IL-2的免疫细胞刺激活性但无相同抑制作用，因此使得其为一种有前景的免疫治疗候选物。重组人类IL-15用于治疗转移性恶性黑色素瘤或肾细胞癌的临床试验表明免疫细胞分布、增殖及活化发生显著变化且表明潜在的抗肿瘤活性。已知IL-15疗法与非所要及毒性效应相关联，诸如恶化某些白血病、移植物抗宿主病、低血压、血小板减少症及肝损伤。
IL-7促进胸腺中的淋巴球发育且维持初始及记忆T细胞稳态在外周中的存活。此外，其对淋巴结(LN)的器官发生及用于维持募集至次级淋巴器官(SLO)中的经活化T细胞至关重要。在IL-7的临床试验中，接受IL-7的患者展示CD4+及CD8+T细胞两者的增加，调节性T细胞数目无显著增加，如FoxP3表达所监测。在2006、2008及2010年报导的临床试验中，向患有不同种类的癌症(诸如转移性黑色素瘤或肉瘤)的患者皮下注射不同剂量的IL-7。除短暂发热及轻度红斑外，几乎未见毒性。CD4+及CD8+T细胞两者的循环水平显著增加且Treg数目减少。IL-7疗法后TCR基因谱多样性增加。然而，未充分评估IL-7的抗肿瘤活性。结果表明IL-7疗法可增强及拓宽免疫反应。
IL-12为多效性细胞因子，其在先天性及适应性免疫性之间产生互连。IL-12首先描述为由PMA诱导的EBV转化的B细胞株分泌的因子。基于其作用，IL-12已被指定为细胞毒性淋巴球成熟因子及自然杀伤细胞刺激因子。由于弥合了先天性及适应性免疫，且有效刺激了IFNγ(一种协调抗癌防御自然机制的细胞因子)的产生，IL-12似乎为人类肿瘤免疫疗法的理想候选物。然而，在临床研究中与IL-12全身施用相关的严重副作用以及此细胞因子的非常狭窄的治疗指数显著地阻碍了此细胞因子在癌症患者的使用。IL-12疗法(其中细胞因子的递送为肿瘤靶向的，其可能会减少IL-12疗法的一些先前问题)的方法目前正在癌症的临床试验中。
IL-2作为激动剂直接使用以结合IL-2R且调节免疫反应在治疗学上存在问题，因为其充分记载的治疗风险，例如其短血清半衰期及高毒性。这些风险亦限制了其他细胞因子的治疗性开发及使用。需要降低这些风险的新型细胞因子。本文所公开的包含条件性活性IL-12及其他细胞因子的组合物及方法，所述细胞因子经设计以解决与常规细胞因子疗法相关的风险且提供许多所需免疫调节疗法。
细胞因子，包括白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23)、干扰素(IFNS，包括IFNα、IFNβ及IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα、淋巴毒素)、转型生长因子(例如TNFβ1l、TGFβ2、TGFβ3)、趋化因子(C-X-C模体趋化因子10(CXCL10)、CCL19、CCL20、CCL21)及颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(GM-CS)在向患者施用时具有极强的效力。用这些分子形成XPAC可使其更容易用于治疗环境。
如本文所用，“趋化因子”是指在邻近反应性细胞细胞因子中诱导定向趋化性的能力的小细胞因子家族，可提供强有力疗法，但伴随有难以在临床上控制且已限制细胞因子的临床用途的非所需效应。本申请涉及可用于具有减少或消除不合需要的效应的患者中的细胞因子的新颖形式。特别是，本申请涉及药物组合物，其包括嵌合多肽(XPAC)、编码XPAC的核酸及前述的药物调配物，改药物调配物含有细胞因子或细胞因子的活性片段或突变蛋白，所述细胞因子与相应细胞因子相比具有降低的细胞因子受体活化活性。然而，在所选条件下或在所选生物环境中，嵌合多肽活化其同源受体，通常具有与相应天然存在的细胞因子相同或更高的效力。如本文所描述，此通常使用细胞因子阻断部分来实现，该部分在一般条件下而非在所选条件下阻断或抑制细胞因子、其活性片段或突变蛋白的受体活化功能，诸如存在于细胞因子活性的所需位点(例如，炎症部位或肿瘤)的那些。
虽然本申请使用IL-12作为例示性细胞因子进行例示，但本领域技术人员应了解本文所提供的教示内容可容易地适于且描述且能够使用由其他细胞因子、片段及突变蛋白形成的XPAC，诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、淋巴毒素、TGF-β1、TGFβ2、TGFβ3、GM-CSF、CXCL10、CCL19、CCL20、CCL21及前述任一者的功能片段或突变蛋白。
各种元素确保本发明的XPAC中的细胞因子的递送及活性优先在所需细胞因子活性位点，且经由XTEN化严重限制细胞因子的全身性曝露，此允许相关细胞因子的血清半衰期延长。在此血清半衰期延长策略中，XPAC可循环延长时间(优先1至2周或更多周)，但已裂解XTEN序列的活化版本具有细胞因子的典型血清半衰期。
通过与XPAC比较，由于分布至全身细胞外空间，静脉内施用的潜在细胞因子的血清半衰期仅为约10分钟。随后，细胞因子通过肾代谢，半衰期为2.5小时。
在本发明的一些实施方案中，XPAC包含释放区段，其在作用部位处裂解(例如通过发炎特异性或肿瘤特异性蛋白酶)，由此在所需部位释放细胞因子的全部活性，且亦将其与未裂解(XPAC)版本的半衰期延长分离。在此类实施方案中，完全活性及游离细胞因子将具有极不同的药物动力学(pK)特性--半衰期系数小时而不系数周。另外，对活性细胞因子的暴露限于所需细胞因子活性的部位(例如发炎性部位或肿瘤微环境)，且全身性暴露于活性细胞因子以及相关毒性及副作用降低。
自细胞因子产生XPAC为一种优雅机制，通过其改良细胞因子作为免疫刺激剂(例如用于治疗癌症)的用途。举例而言，在此方面中，细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IFNα、IFNβ及IFNγ、TNFα、淋巴毒素、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、GM-CSF、CXCL10、CCL19、CCL20及CCL21)的药物动力学和/或药效动力学可调整以最大限度地活化效应细胞(例如效应T细胞、NK细胞)和/或细胞毒性免疫反应促进细胞(例如诱导树突状细胞成熟)在所要活性部位，诸如在肿瘤或肿瘤微环境中，但优选不为全身性的。
因此，本文提供包含XPAc的药物组合物，该XPAc由至少一种细胞因子多肽构成，诸如白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23)、干扰素(IFNS，包括IFNα、IFNβ及IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα、淋巴毒素)、转型生长因子(例如TNFβ1、TGFβ2、TGFβ3)、趋化因子(例如CXCL10、CCL19、CCL20、CCL21)及颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(GM-CS)及前述任一者的功能片段或突变蛋白。
优选地，包括于本文中所公开的XPAC中的细胞因子多肽(包括功能片段)不经突变或经工程改造以改变天然存在的细胞因子的特性，包括受体结合亲和力及特异性或血清半衰期。然而，可接受氨基酸序列自天然存在(包括野生型)细胞因子的变化以促进克隆及达成所需表达量。
延伸重组多肽
本发明提供包含延伸重组多肽(“XTEN”或“XTENs”)的组合物。在一些实施方案中，XTEN一般为延伸长度的多肽，其具有主要由小亲水性氨基酸构成的非天然存在的实质上非重复序列，其中该序列在生理条件下具有较低程度或无二级或三级结构。
在本发明的一个方面中，公开适用作融合搭配物的XTEN多肽组合物，其可连接至生物活性蛋白(“BP”)，产生BPXTEN融合蛋白(例如单体融合物)。XTEN可具有作为融合蛋白搭配物的效用，因为当连接至生物活性蛋白以产生融合蛋白时，其可赋予某些化学及药物特性。此类所需特性包括但不限于增强的药物动力学参数及溶解度特征，以及下文所描述的其他特性。此类融合蛋白组合物可具有治疗某些疾病、病症或病况的效用，如本文所描述。如本文所用，“XTEN”特异性排除抗体或抗体片段，诸如单链抗体、轻链或重链的Fc片段。
在一些实施方案中，XTEN为以单一序列形式使用时具有大于约100至约3000个氨基酸残基、优选大于400至约3000个残基的长多肽，且当超过一个XTEN单元用于单一融合蛋白或结合物中时累积地具有大于约400至约3000个氨基酸残基。在其他情况下，在不需要增加融合蛋白的半衰期但其中需要增加生物活性蛋白质融合搭配物的溶解度或其他物理/化学特性的情况下，可将短于100个氨基酸残基，诸如约96个、或约84个、或约72个、或约60个、或约48个、或约36个氨基酸残基的XTEN序列并入至具有BP的融合蛋白组合物中以实现特性。
XTEN与生物活性蛋白连接以产生本发明融合蛋白的选择准则一般涉及XTEN的物理/化学特性及构象结构的属性，所述属性又可用于赋予融合蛋白增强的药学及药物动力学特性。本发明的XTEN可呈现以下有利特性中之一或多者：构象可挠性、增的水溶性、高程度的蛋白酶抗性、较低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合及增加的流体动力(或斯托克(Stokes))半径；可使其特别适用作融合蛋白搭配物的特性。包含可通过XTEN增强的BP的融合蛋白的特性的非限制性实施例包括增加的总体溶解度和/或代谢稳定性、降低的蛋白水解敏感性、降低的免疫原性、皮下或肌肉内施用时降低的吸收速率及增强的药物动力学特性(诸如终末半衰期及曲线下面积(AUC))，在皮下或肌肉内注射之后较慢的吸收(相比于不连接至XTEN的BP)，使得Cmax较低，此转而可引起BP的副作用的减少，总体而言，相较于不连接至XTEN的对应的BP组分，此可引起向受试者施用的BPXTEN组合物的融合蛋白保持在治疗窗内的时间段增加。
本领域已知多种用于测定蛋白质(诸如包含本发明XTEN的融合蛋白组合物)的物理/化学特性的方法及分析；特性，诸如二级或三级结构、溶解度、蛋白质聚集、熔融特性、污染及水含量。此类方法包括分析型离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻色谱法、反相HPLC、光散射、毛细电泳法、圆二色性、差示扫描热量测定、荧光、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光谱法(Raman spectroscopy)、折射法及UV/可见光谱法。其他方法公开于Arnau等人,Prot Expr and Purif(2006)48,1-13中。在本发明中应用这些方法将在本领域技术人员的掌握范围内。
典型地，融合蛋白的XTEN组分经设计以在生理条件下表达得类似变性肽序列，尽管聚合物长度延伸。变性描述由肽主链的较大构象自由表征的肽在溶液中的状态。大部分肽及蛋白质在高浓度的变性剂存在下或在高温下采用变性构象。呈变性构象的肽具有例如特征性圆二色性(CD)谱且特征在于不具有长程相互作用(如由NMR所测定)。“变性构象”及“非结构化构象”在本文中同义地使用。在一些情况下，本发明提供XTEN序列，其在生理条件下可类似于基本上不含二级结构的变性序列。在其他情况下，XTEN序列在生理条件下可基本上不含二级结构。如在此上下文中所用，“基本上不含”是指XTEN序列的小于50％的XTEN氨基酸残基有助于促成二级结构，如通过本文所描述的手段量测或测定。如在此上下文中所使用的“基本上不含”是指XTEN序列的至少约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％或至少约99％的XTEN氨基酸残基不促成二级结构，如通过本文所描述的手段量测或测定。
本领域已建立多种方法来辨别给定多肽中二级及三级结构的存在或不存在。特别是，二级结构可以分光亮度法，例如通过“远UV”光谱区(190-250nm)中的圆二色性光谱法来量测。二级结构组件，诸如α-螺旋及β-折叠，各自产生CD光谱的特征性形状及量值。二级结构亦可经由某些计算机程序或算法针对多肽序列预测，诸如熟知的Chou-Fasman算法(Chou,P.Y.,等人(1974)Biochemistry,13:222-45)及Garnier-Osguthorpe-Robson(“GOR”)算法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996),GOR method for predictingprotein secondary structure from amino acid sequence.Methods Enzymol 266:540-553)，如美国专利申请公开案第20030228309A1号中所描述。对于给定序列，算法可预测存在一些二级结构或根本不存在，表示为形成例如α-螺旋或β-折叠的序列的残基的总数和/或百分比或预测导致无规卷曲形成的序列(其不具有二级结构)的残基的百分比。
在一些情况下，本发明融合蛋白组合物中使用的XTEN序列可具有在0％至小于约5％范围内的α-螺旋百分比，如通过Chou-Fasman算法所测定。在其他情况下，融合蛋白组合物的XTEN序列可具有在0％至小于约5％范围内的β-折叠百分比，如通过Chou-Fasman算法所测定。在一些情况下，融合蛋白组合物的XTEN序列可具有在0％至小于约5％范围内的α-螺旋百分比及在0％至小于约5％范围内的β-折叠百分比，如通过Chou-Fasman算法所测定。在优选实施方案中，融合蛋白组合物的XTEN序列将具有小于约2％的α-螺旋百分比及小于约2％的β-折叠百分比。在其他情况下，融合蛋白组合物的XTEN序列可具有高程度的无规卷曲百分比，如通过GOR算法所测定。在一些实施方案中，XTEN序列可具有至少约80％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、且最佳至少约99％无规卷曲，如通过GOR算法所测定。
非重复序列
本发明组合物的XTEN序列可为基本上非重复的。一般而言，重复氨基酸序列具有聚集或形成高阶结构的趋势，如通过天然重复序列(诸如胶原蛋白及亮氨酸拉链)所例示，或形成接触，从而产生晶体或假晶结构。相比之下，非重复序列聚集的低趋势使得能够设计具有相对较低带电氨基酸频率的长序列XTEN，若序列以其他方式重复，则所述带电氨基酸将可能聚集。典型地，BPXTEN融合蛋白包含大于约100至约3000个氨基酸残基，优选大于400至约3000个残基的XTEN序列，其中序列为基本上非重复的。在一个实施方案中，XTEN序列可具有大于约100至约3000个氨基酸残基，优选大于400至约3000个氨基酸残基，其中除非氨基酸为丝氨酸，否则序列中不存在三个相邻氨基酸为相同氨基酸类型，在此情况下不超过三个相邻氨基酸为丝氨酸残基。在前述实施方案中，XTEN序列将基本上为非重复的。
多肽或基因的重复性程度可通过计算机程序或算法或通过本领域已知的其他方式量测。多肽序列中的重复性可例如通过测定在多肽内出现的给定长度的较短序列的次数来评估。举例而言，200个氨基酸残基的多肽具有192个重叠9-氨基酸序列(或9聚体“框架”)及198个3聚体框架，但唯一9聚体或3聚体序列的数目将视序列内的重复量而定。可生成评分(下文中称为“子序列评分”)，其反映整个多肽序列中的子序列的重复程度。在本发明的上下文中，“子序列评分”意指多肽的200个连续氨基酸序列中各唯一3聚体框架发生次数的和除以200个氨基酸序列中唯一3聚体子序列的绝对数。在一些实施方案中，本发明提供各自包含XTEN的BPXTEN，其中XTEN可具有小于12、更优选小于10、更优选小于9、更优选小于8、更优选小于7、更优选小于6且最佳小于5的子序列评分。在此段落中所描述的上文实施方案中，具有小于约10(例如9、8、7等)的子序列分数的XTEN将为“基本上非重复的”。
XTEN的非重复特征可赋予具有BP的融合蛋白与具有重复序列的多肽相比更大程度的溶解度及更少的聚集趋势。这些特性可以促进包含XTEN的药物制剂的调配，所述药物制剂含有极高的药物浓度，在一些情况下超过100mg/ml。
此外，实施方案的XTEN多肽序列经设计以具有较低程度的内部重复性，以便在向哺乳动物施用时降低或基本上消除免疫原性。由很大程度上限于三个氨基酸(诸如甘氨酸、丝氨酸及谷氨酸)的短重复模体构成的多肽序列在向哺乳动物施用时可引起相对较高的抗体效价，尽管这些序列中不存在所预测的T细胞抗原决定基。此可以由多肽的重复性质引起，因为已显示，具有重复抗原决定基(包括蛋白质聚集物、交联免疫原及重复碳水化合物)的免疫原具有高度免疫原性且可以引起例如B细胞受体的交联，从而引起B细胞活化。(Johansson,J.,等人(2007)Vaccine,25:1676-82；Yankai,Z.,等人(2006)BiochemBiophys Res Commun,345:1365-71；Hsu,C.T.,等人(2000)Cancer Res,60:3701-5)；Bachmann MF,等人Eur J Immunol.(1995)25(12):3445-3451)。
例示性序列模体
本发明涵盖XTEN，其可包含多个较短序列的单元或模体，其中模体的氨基酸序列为非重复的。在设计XTEN序列时，发现尽管使用“建构组元(building block)”方法使用多聚化以创建XTEN序列的序列模体库，但非重复准则可能被满足。因此，虽然XTEN序列可由少至四种不同类型的序列模体的多个单元组成，因为模体本身一般由非重复氨基酸序列组成，但整个XTEN序列呈现基本上非重复。
在一个实施方案中，XTEN可具有大于约100至约3000个氨基酸残基、优选大于400至约3000个残基的非重复序列，其中XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％由非重叠序列模体组成，其中所述模体中的每一者具有约9至36个氨基酸残基。在其他实施方案中，XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％由非重叠序列模体组成，其中所述模体中的每一者具有9至14个氨基酸残基。在另其他实施方案中，XTEN序列组分的至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％由非重叠序列模体组成，其中所述模体中的每一者具有12个氨基酸残基。在这些实施方案中，优选地，序列模体主要由小亲水性氨基酸构成，使得整个序列具有非结构化可挠性特征。XTEN中可包括的氨基酸的实施例为例如精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸及甘氨酸。由于密码子优化、编码序列模体的组装聚核苷酸、蛋白质表达、表达蛋白质的电荷分布及溶解度以及二级及三级结构等变量的测试，发现具有增强特征的XTEN组合物主要包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)残基，其中序列经设计为基本上非重复的。在一优选实施方案中，XTEN序列主要具有四至六种类型的氨基酸，所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)，其以基本上非重复序列排列，该序列长度大于约100至约3000个氨基酸残基，优选大于400至约3000个残基。在一些实施方案中，XTEN可具有大于约100至约3000个氨基酸残基，优选大于400至约3000个残基的序列，其中至少约80％的序列由非重叠序列模体组成，其中所述模体中的每一者具有9至36个氨基酸残基，其中所述模体中的每一者由4至6种类型的氨基酸组成，所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)，且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其他实施方案中，XTEN序列的至少约90％由非重叠序列模体组成，其中所述模体中的每一者具有9至36个氨基酸残基，其中所述模体中的每一者由4至6种类型的氨基酸组成，所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)，且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其他实施方案中，XTEN序列的至少约90％由非重叠序列模体组成，其中所述模体中的每一者具有12个由4至6种类型的氨基酸组成的氨基酸残基，所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)，且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在又其他实施方案中，XTEN序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由非重叠序列模体组成，其中所述模体中的每一者具有12个氨基酸残基，所述残基由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)组成，且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。
在另其他实施方案中，XTEN包含超过约100至约3000个氨基酸残基、优选超过400至约3000个氨基酸残基的非重复序列，其中序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％由具有9至14个氨基酸残基的非重叠序列模体组成，其中所述模体由4至6种类型的氨基酸组成，所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)，且其中任何一个模体中的任何两个连续氨基酸残基的序列在序列模体中重复不超过两次。在其他实施方案中，XTEN序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％由具有12个氨基酸残基的非重叠序列模体组成，其中所述模体由4至6种类型的氨基酸组成，所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)，且其中任何一个序列模体中的任何两个连续氨基酸残基的序列在序列模体中重复不超过两次。在其他实施方案中，XTEN序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％由具有12个氨基酸残基的非重叠序列模体组成，其中所述模体由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)组成，且其中任何一个序列模体中的任何两个连续氨基酸残基的序列在序列模体中重复不超过两次。在又其他实施方案中，XTEN由12个氨基酸序列模体组成，其中所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)，且其中任何一个序列模体中的任何两个连续氨基酸残基的序列在序列模体中重复不超过两次，且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在此段落中所描述的上文前述实施方案中，XTEN序列将为基本上非重复的。
在一些情况下，本发明提供包含大于约100至约3000个氨基酸残基、优选大于400至约3000个残基的非重复XTEN序列的组合物，其中序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表1的氨基酸序列的两个或更多个非重叠序列模体的多个单元组成。在一些情况下，XTEN包含非重叠序列模体，其中序列的约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表1的单一模体家族的两个或更多个非重叠序列组成，使得产生“家族”序列，其中整个序列保持基本上非重复的。因此，在这些实施方案中，XTEN序列包含多个单元的非重叠序列模体，所述非重叠序列模体为表1的序列的AD模体家族、或AE模体家族、或AF模体家族、或AG模体家族、或AM模体家族、或AQ模体家族、或BC家族、或BD家族。在其他情况下，XTEN包含来自表1的模体家族中的两个或更多个的模体序列。
在一些实施方案中，在本发明的组合物(例如融合蛋白)包含延伸重组多肽(XTEN)时，XTEN的特征可在于：(i)包含至少12个氨基酸；(ii)XTEN序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)；及(iii)其具有选自G、A、S、T、E及P的4至6种不同氨基酸。在一些实施方案中，XTEN序列可由多种非重叠序列模体组成，其中所述序列模体(例如各自独立地)选自表2a-2b的序列模体。在一些实施方案中，XTEN可具有40至3,000个氨基酸，或100至3,000个氨基酸。XTEN可(例如各自独立地)具有至少(约)40个、至少(约)50个、至少(约)100个、至少(约)150个、至少(约)200个、至少(约)300个、至少(约)400个、至少(约)500个、至少(约)600个、至少(约)700个、至少(约)800个、至少(约)900个、至少(约)1,000个氨基酸、至少(约)1,500个氨基酸、至少(约)2,000个氨基酸、至少(约)2,500个氨基酸、至少(约)3,000个氨基酸或前述任一者的范围之间。在一些实施方案中，XTEN可与表2a-2b中阐述的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％序列一致性。
表1：12个氨基酸的XTEN序列模体以及模体家族
*表示单独模体序列，其在以各种排列在一起使用时产生“家族序列”
模体家族* SEQ ID NO: 模体序列
AD 182 GESPGGSSGSES
AD 183 GSEGSSGPGESS
AD 184 GSSESGSSEGGP
AD 185 GSGGEPSESGSS
AE,AM 186 GSPAGSPTSTEE
AE,AM,AQ 187 GSEPATSGSETP
AE,AM,AQ 188 GTSESATPESGP
AE,AM,AQ 189 GTSTEPSEGSAP
AF,AM 190 GSTSESPSGTAP
AF,AM 191 GTSTPESGSASP
AF,AM 192 GTSPSGESSTAP
AF,AM 193 GSTSSTAESPGP
AG,AM 194 GTPGSGTASSSP
AG,AM 195 GSSTPSGATGSP
AG,AM 196 GSSPSASTGTGP
AG,AM 197 GASPGTSSTGSP
AQ 198 GEPAGSPTSTSE
AQ 199 GTGEPSSTPASE
AQ 200 GSGPSTESAPTE
AQ 201 GSETPSGPSETA
AQ 202 GPSETSTSEPGA
AQ 203 GSPSEPTEGTSA
BC 881 GSGASEPTSTEP
BC 882 GSEPATSGTEPS
BC 883 GTSEPSTSEPGA
BC 884 GTSTEPSEPGSA
BD 885 GSTAGSETSTEA
BD 886 GSETATSGSETA
BD 887 GTSESATSESGA
BD 888 GTSTEASEGSAS
在那些实施方案中，其中BPXTEN融合蛋白的XTEN组分具有小于100％的氨基酸，所述氨基酸由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)的四至六种氨基酸组成，或具有小于100％的由表1的序列模体组成的序列，或与来自表2a-2b的XTEN具有小于100％序列一致性，其他氨基酸残基可选自14种天然L-氨基酸中的任何其他一种。其他氨基酸可散布在整个XTEN序列中，可位于序列模体内或之间，或可集中在XTEN序列的一个或多个短片段中。在其中BPXTEN的XTEN组分包含除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)以外的氨基酸的此类情况下，优选地，氨基酸不为疏水性残基且不应实质上赋予XTEN组分的二级结构。因此，在前述之一优选实施方案中，除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)以外，包含其他氨基酸的BPXTEN融合蛋白的XTEN组分将具有序列，该序列如通过Chou-Fasman算法所量测具有小于5％的促成α-螺旋及β-折叠的残基且如通过GOR算法所量测具有将具有至少90％的无规卷曲形成。
序列长度
在特定特征中，本发明涵盖包含具有延伸长度序列的XTEN多肽的BPXTEN组合物。本发明利用增加非重复非结构化多肽的长度增强XTEN的非结构化性质以及包含XTEN的融合蛋白的生物及药物动力学特性的发现。如实施例中更充分地描述，XTEN的长度的成比例增加，即使通过单一家族序列模体(例如表1的四个AE模体)的固定重复次序产生，与较短XTEN长度相比可产生具有更高无规卷曲形成百分比(如通过GOR算法测定)的序列。另外，发现如实施例中所描述，与具有较短序列长度的非结构化多肽搭配物的融合蛋白相比，增加非结构化多肽融合搭配物的长度可使得融合蛋白的终末半衰期不成比例地增加。
预期包括于本发明的BPXTEN中的XTEN的非限制性实施例呈现于表2a-2b中。因此，本发明提供BPXTEN组合物，其中融合蛋白的XTEN序列长度大于约100至约3000个氨基酸残基，且在一些情况下大于400至约3000个氨基酸残基，其中相比于不连接至XTEN的有效负载，XTEN赋予BPXTEN增强的药物动力学特性。在一些情况下，本发明的BPXTEN组合物的XTEN序列的长度可为约100个、或约144个、或约288个、或约401个、或约500个、或约600个、或约700个、或约800个、或约900个、或约1000个、或约1500个、或约2000个、或约2500个或至多约3000个氨基酸残基。在其他情况下，XTEN序列的长度可为约100至150个、约150至250个、约250至400个、401至约500个、约500至900个、约900至1500个、约1500至2000个或约2000至约3000个氨基酸残基。在一个实施方案中，BPXTEN可包含XTEN序列，其中该序列与选自表2a-2b的XTEN相比呈现至少约80％序列一致性，或替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些情况下，XTEN序列经设计以作为BPXTEN的N端组分用于优化表达。在前述的一个实施方案中，XTEN序列与AE912或AM923的序列具有至少90％序列一致性。在前述的另一实施方案中，XTEN具有实施例14至17中所描述的N端残基。
在其他情况下，BPXTEN融合蛋白可包含第一及第二XTEN序列，其中XTEN序列中的残基的累积总计大于约400至约3000个氨基酸残基。在前述的实施方案中，BPXTEN融合蛋白可包含第一及第二XTEN序列，其中所述序列各自展现与选自表2a-2b的至少第一或额外第二XTEN至少约80％序列一致性，或替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。BPXTEN组合物中使用超过一个XTEN的实施例包括但不限于具有连接至至少一个BP的N端及C端两者的XTEN的构建体。
如下文更充分地描述，本发明提供如下方法，其中通过选择XTEN的长度以赋予施用受试者的融合蛋白的目标半衰期来设计BPXTEN。在一些情况下，可通过选择XTEN的长度以赋予施用受试者的生物多肽的目标掩蔽效应来设计BPXTEN。一般而言，相比于较短XTEN，并入至BPXTEN组合物中的较长XTEN长度产生较长半衰期。然而，在另一实施方案中，BPXTEN融合蛋白可经设计以包含具有较长序列长度的XTEN，其经选择以在向受试者皮下或肌肉内施用之后赋予较慢全身性吸收率。在此类情况下，与不连接至XTEN的BP的可比剂量相比，Cmax降低，由此促成将BPXTEN保持在组合物的治疗窗内的能力。因此，除本文所描述的其他物理/化学特性以外，XTEN赋予所施用的BPXTEN的储库型特性。
表2A：例示性XTEN多肽
Figure BDA0004014658270000221
Figure BDA0004014658270000231
Figure BDA0004014658270000241
Figure BDA0004014658270000251
Figure BDA0004014658270000261
Figure BDA0004014658270000271
表2B.例示性XTEN多肽
Figure BDA0004014658270000272
Figure BDA0004014658270000281
Figure BDA0004014658270000291
Figure BDA0004014658270000301
Figure BDA0004014658270000311
Figure BDA0004014658270000321
Figure BDA0004014658270000331
净电荷
在其他情况下，XTEN多肽可具有通过并入具有净电荷的氨基酸残基和/或减少XTEN序列中的疏水性氨基酸的比例赋予的非结构化特征。总体净电荷及净电荷密度可通过调节XTEN序列中带电荷氨基酸的含量来控制。在一些情况下，组合物的XTEN的净电荷密度可高于+0.1或低于-0.1个电荷/残基。在其他情况下，XTEN的净电荷可为约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％或更多。
由于人类或动物中的大部分组织及表面具有净负电荷，因此XTEN序列可经设计以具有净负电荷以使含有XTEN的组合物与各种表面(诸如血管、健康组织或各种受体)之间的非特异性相互作用最小化。不受特定理论束缚，XTEN可由于XTEN多肽的单独氨基酸之间的静电推斥而采用开放构象，所述单独氨基酸分别地携带高净负电荷且分布在整个XTEN多肽序列中。XTEN的延伸序列长度中的净负电荷的此类分布可产生非结构化构象，其转而可引起流体动力学半径的有效增加。因此，在一个实施方案中，本发明提供XTEN，其中XTEN序列含有约8、10、15、20、25或甚至约30％谷氨酸。本发明的组合物的XTEN一般不具有带正电荷的氨基酸或具有低含量的带正电荷的氨基酸。在一些情况下，XTEN可具有小于约10％的带正电荷的氨基酸残基，或小于约7％、或小于约5％、或小于约2％的带正电荷的氨基酸残基。然而，本发明涵盖如下构建体，其中可将有限数目的具有正电荷的氨基酸(诸如赖氨酸)并入XTEN中以允许赖氨酸的ε胺与肽上的反应性基团、接头桥或药物或小分子上的反应性基团之间的结合，以结合至XTEN主链。在前述内容中，可构建融合蛋白，其包含XTEN、生物活性蛋白、外加适用于治疗疾病或病症的化学治疗剂，其中并入至XTEN组分中的药剂的分子的最大数目通过赖氨酸或具有并入至XTEN中的反应侧链的其他氨基酸(例如半胱氨酸)的数目测定。
在一些情况下，XTEN序列可包含由诸如丝氨酸或甘氨酸的其他残基分离的带电荷残基，其可引起优选的表达或纯化行为。基于净电荷，本发明组合物的XTEN可具有1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或甚至6.5的等电点(pI)。在优选实施方案中，XTEN将具有1.5与4.5之间的等电点。在这些实施方案中，并入至本发明的BPXTEN融合蛋白组合物中的XTEN将在生理条件下携带净负电荷，其可促成非结构化构象及XTEN组分与哺乳动物蛋白质及组织的结合减少。
因为疏水性氨基酸可赋予多肽结构，所以本发明提供XTEN中的疏水性氨基酸的含量通常将小于5％、或小于2％、或小于1％疏水性氨基酸含量。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白的XTEN组分中甲硫氨酸及色氨酸的氨基酸含量通常小于5％，或小于2％，且最佳小于1％。在另一实施方案中，XTEN将具有一序列，该序列具有小于10％带正电荷的氨基酸残基，或小于约7％、或小于约5％、或小于约2％带正电荷的氨基酸残基，甲硫氨酸及色氨酸残基的总和将小于2％，且天冬酰胺及谷氨酰胺残基的总和将小于总XTEN序列的10％。
低免疫原性
在另一方面中，本发明提供XTEN序列具有较低程度的免疫原性或基本上为非免疫原性的组合物。若干因素可促成XTEN的低免疫原性，例如非重复序列、非结构化构象、高程度的溶解度、低程度或缺乏自体聚集、低程度或缺乏序列内的蛋白水解位点，及低程度或缺乏XTEN序列中的构象抗原决定基。
构象抗原决定基由蛋白质表面的区域形成，该表面由蛋白质抗原的多个非连续氨基酸序列构成。蛋白质的精确折叠使这些序列带入定义明确的稳定空间构型或抗原决定基，可通过宿主体液免疫系统将其识别为“外来”，使得产生针对蛋白质的抗体或触发细胞介导的免疫反应。在后一情况中，个体对蛋白质的免疫反应很大程度上受T细胞抗原决定基识别影响，该T细胞抗原决定基识别为个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性的功能。MHCII类肽错合物通过T细胞表面上的同源T细胞受体与某些其他共受体(诸如CD4分子)的交叉结合的接合可在T细胞内诱导活化状态。活化引起细胞因子释放，进一步活化诸如B细胞的其他淋巴球以产生抗体或活化T杀伤细胞作为完整细胞免疫反应。
肽结合给定MHC II类分子在APC(抗原呈现细胞)的表面上呈现的能力视多种因素而定；最值得注意的为其主要序列。在一个实施方案中，可通过设计抵抗在抗原呈现细胞中的抗原加工的XTEN序列和/或选择不能很好地结合MHC受体的序列来达成较低程度的免疫原性。本发明提供具有基本上非重复XTEN多肽的BPXTEN融合蛋白，其经设计以减少与MHCII受体的结合以及避免形成针对T细胞受体或抗体结合的抗原决定基，从而产生较低程度的免疫原性。免疫原性的避免在某种程度上为XTEN序列的构象可挠性的直接结果；例如由于氨基酸残基的选择及次序而缺乏二级结构。举例而言，备受关注的为在水溶液中或在可产生构象抗原决定基的生理条件下具有适应紧密折叠的构象的低趋势的序列。使用常规治疗实践及给药施用包含XTEN的融合蛋白通常不会导致形成针对XTEN序列的中和抗体，且亦可降低BPXTEN组合物中BP融合搭配物的免疫原性。
在一个实施方案中，本发明融合蛋白中使用的XTEN序列可基本上不含由人类T细胞识别的抗原决定基。先前已公开出于产生较少免疫原性蛋白质的目的的此类抗原决定基的消除；参见例如以引用的方式并入本文中的WO 98/52976、WO 02/079232及WO 00/3317。已描述人类T细胞抗原决定基的分析(Stickler,M.,等人(2003)J Immunol Methods,281:95-108)。备受关注的为可在不产生T细胞抗原决定基或非人类序列下进行寡聚的肽序列。此可以通过测试这些序列的直接重复来检测T细胞抗原决定基的存在以及6至15聚体的发生，且特别为非人类的9聚体序列的发生，且随后改变XTEN序列的设计以消除或破坏抗原决定基序列。在一些情况下，XTEN序列通过经预测以结合MHC受体的XTEN的抗原决定基的数目的限制而基本上为非免疫原性的。随着能够结合至MHC受体的抗原决定基的数目减少，T细胞活化的潜力以及T细胞辅助功能亦随的减少，B细胞活化或上调减少，及抗体产生减少。较低程度的所预测的T细胞抗原决定基可通过抗原决定基预测算法，诸如TEPITOPE(Sturniolo,T.,等人(1999)Nat Biotechnol,17:555-61)来确定。蛋白质内指定肽框架的TEPITOPE评分为彼肽框架与多个最常见人类MHC等位基因的结合的Kd(解离常数、亲和力、解离速率)的对数，如Sturniolo,T.等人(1999)Nature Biotechnology 17:555)中所公开。评分范围至少为20个对数，从约10到约-10(对应于10e10 Kd至10e-10Kd的结合约束)，且可通过避免疏水性氨基酸来降低，所述氨基酸可以在MHC上的肽显示期间用作锚定残基，诸如M、I、L、V、F。在一些实施方案中，并入至BPXTEN中的XTEN组分在TEPITOPE评分下不具有所预测的T细胞抗原决定基，该TEPITOPE评分为约-5或更大、或-6或更大、或-7或更大、或-8或更大、或TEPITOPE评分为-9或更大。如本文所用，“-9或更大”的评分将涵盖10至-9(包括端点)的TEPITOPE得分，但将不涵盖-10的得分，因为-10小于-9。
在另一实施方案中，本发明XTEN序列(包括并入至本发明BPXTEN融合蛋白中的那些XTEN序列)可通过限制来自XTEN的序列的已知蛋白水解位点，减少XTEN至可结合至MHCII受体的小肽中的加工而呈现基本上非免疫原性。在另一实施方案中，XTEN序列可通过使用基本上不含二级结构的序列而呈现为基本上非免疫原性的，该序列由于结构的高熵而赋予针对多种蛋白酶的抗性。因此，减少的TEPITOPE评分及自XTEN消除已知蛋白水解位点可使XTEN组合物(包括BPXTEN融合蛋白组合物的XTEN)基本上不能结合于哺乳动物受体，包括免疫系统的那些受体。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白的XTEN可具有>100nM Kd的与哺乳动物受体的结合，或大于500nM Kd，或大于1μM Kd的与哺乳动物细胞表面或循环多肽受体的结合。
另外，XTEN的非重复序列及相应抗原决定基的缺乏可限制B细胞结合至XTEN或由XTEN活化的能力。重复序列经识别且可甚至与少数B细胞形成多价接触，且由于多个T细胞非依赖性受体的交联，可刺激B细胞增殖及抗体产生。相比之下，虽然XTEN可在其延伸序列上与许多不同B细胞接触，但由于序列缺乏重复性，各个单独B细胞可仅与单独XTEN进行一次或少数接触。因此，XTEN通常可具有低得多的刺激B细胞增殖的趋势，且因此具有免疫反应。在一个实施方案中，相比于未融合的对应BP，BPXTEN可具有降低的免疫原性。在一个实施方案中，向哺乳动物施用至多三个非经肠剂量的BPXTEN可产生血清稀释度为1:100而非稀释度为1:1000的可检测的抗BPXTEN IgG。在另一实施方案中，向哺乳动物施用至多三个非经肠剂量的BPXTEN可产生血清稀释度为1:100而非稀释度为1:1000的可检测的抗BPIgG。在另一实施方案中，向哺乳动物施用至多三个非经肠剂量的BPXTEN可产生血清稀释度为1:100而非稀释度为1:1000的可检测的抗XTEN IgG。在前述实施方案中，哺乳动物可为小鼠、大鼠、兔或食蟹猕猴。
相对于具有高度重复性的序列，具有非重复序列的XTEN的额外特征可为非重复XTEN与抗体形成较弱接触。抗体为多价分子。举例而言，IgG具有两个相同结合位点且IgMs含有10个相同结合位点。因此，针对重复序列的抗体可以与此类具有高亲合力的重复序列形成多价接触，其可以影响此类重复序列的效能和/或消除。相比之下，针对非重复XTEN的抗体可产生单价相互作用，导致免疫清除的可能性降低，使得BPXTEN组合物可在循环中保持增加的时间段。
增加的流体动力学半径
在另一方面中，本发明提供XTEN，其中XTEN多肽可具有高流体动力学半径，该高流体动力学半径赋予并入XTEN的BPXTEN融合蛋白的对应增加的表观分子量。相比于不连接至XTEN的BP，XTEN连接至BP序列可产生可具有增加的流体动力学半径、增加的表观分子量及增加的表观分子量因子的BPXTEN组合物。举例而言，在其中需要延长半衰期的治疗应用中，组合物(其中具有高流体动力学半径的XTEN并入至包含一种或多种BP的融合蛋白中)可有效地扩大超过约3-5nm的肾小球孔径(对应于约70kDA的表观分子量)的组合物的流体动力学半径(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev55:1261-1277)，使得循环蛋白质的肾清除率降低。蛋白质的流体动力学半径为通过其分子量以及其结构(包括形状及紧密性)来测定。不受特定理论束缚，XTEN可由于肽的单独电荷之间的静电推斥或序列中特定氨基酸赋予的固有可挠性而采用开放构象，所述氨基酸缺乏赋予二级结构的潜力。与具有二级和/或三级结构的具有可比序列长度和/或分子量的多肽(诸如典型的球状蛋白)相比，XTEN多肽的开放、延伸及非结构化构象可具有更大的成比例流体动力学半径。测定流体动力学半径的方法为本领域熟知，诸如通过使用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利第6,406,632号及第7,294,513号中所描述。增加XTEN的长度会导致流体动力学半径、表观分子量及表观分子量因子的参数成比例增加，从而允许将BPXTEN调适为表观分子量或流体动力学半径的所需特征性截止值。因此，在某些实施方案中，BPXTEN融合蛋白可经构型具有XTEN，使得融合蛋白可具有至少约5nm、或至少约8nm、或至少约10nm、或12nm、或至少约15nm的流体动力学半径。在前述实施方案中，XTEN在BPXTEN融合蛋白中赋予的大流体动力学半径可导致所得融合蛋白的肾清除率降低，导致终末半衰期相应增加、平均保留时间增加和/或肾清除率降低。
在另一实施方案中，所选择长度及序列的XTEN可选择性地并入至BPXTEN中以产生在生理条件下将具有至少约100kDa、至少约150kDa、或至少约300kDa、或至少约400kDa、或至少约500kDA、或至少约600kDa、或至少约700kDA、或至少约800kDa、或至少约900kDa、或至少约1000kDa、或至少约1200kDa、或至少约1500kDa、或至少约1800kDa、或至少约2000kDa、或至少约2300kDa或更多的表观分子量的融合蛋白。在另一实施方案中，所选择长度及序列的XTEN可选择性地连接至BP以产生在生理条件下BPXTEN融合蛋白具有至少三个、或者至少四个、或者至少五个、或者至少六个、或者至少八个、或者至少10个、或者至少15个、或至少20个表观分子量因子或更多的表观分子量因子。在另一实施方案中，在生理条件下，相对于融合蛋白的实际分子量，BPXTEN融合蛋白具有约4至约20、或为约6至约15、或为约8至约12、或为约9至约10的表观分子量因子。
BPXTEN融合蛋白组合物的生物活性蛋白
本发明部分地涉及包含生物活性蛋白质及XTEN的融合蛋白组合物及其用于治疗受试者的疾病、病症或病况的用途。
在一个方面中，本发明提供至少一种共价连接至包含一个或多个延伸重组多肽(“XTEN”)的融合蛋白的第一生物活性蛋白(下文中称为“BP”)，产生XTEN融合蛋白组合物(下文中称为“BPXTEN”)。如下文更充分地描述，融合蛋白可任选包括间隔子序列，所述间隔子序列可进一步包含裂解序列以在受到蛋白酶作用时自融合蛋白释放BP。
如本文所用，术语“BPXTEN”意欲涵盖包含一或两个有效负载区的融合多肽，所述有效负载区各自包含介导一个或多个生物或治疗活性的生物活性蛋白及至少一个包含至少一个XTEN多肽的其他区。
本发明组合物的BP，特别是公开于表6中的那些BP以及其对应核酸及氨基酸序列在本领域已熟知，且描述及序列可在公共数据库中获得，所述公共数据库诸如化学文摘服务数据库(例如CAS登记)、GenBank、通用蛋白质资源(UniProt)及订阅提供的数据库，诸如GenSeq(例如Derwent)。聚核苷酸序列可为编码给定BP的野生型聚核苷酸序列(例如，全长或成熟)，或在一些情况下，该序列可为野生型聚核苷酸序列的变体(例如，编码野生型生物活性蛋白的聚核苷酸)，其中聚核苷酸的DNA序列已经优化，例如以用于在特定物种中表达；或编码野生型蛋白质的变体的聚核苷酸，诸如定点突变体或等位基因变体。本领域技术人员完全有能力使用野生型或共识cDNA序列或BP的密码子优化变体，使用本领域已知的方法和/或结合本文提供的指导及方法，创建本发明所涵盖的BPXTEN构建体，且在实施例中更充分地描述。
用于包括在本发明的BPXTEN中的BP可包括任何具有生物学、治疗性、预防性或诊断相关或功能的蛋白质，或适用于在向受试者施用时介导生物活性或预防或改善疾病、病症或病况。备受关注的为寻求增加药物动力学参数、增加溶解度、增加稳定性或某种其他增强的药物特性的BP，或增加终末半衰期的那些BP将改良疗效、安全性或引起降低给药频率和/或改良患者顺应性。因此，考虑到各种目标制备BPXTEN融合蛋白组合物，包括例如相较于不连接至XTEN的BP，通过增加体内暴露或当向受试者施用时增加将BPXTEN保持在治疗窗内的时长来改良生物活性化合物的治疗功效。
本发明的BP可为天然的全长蛋白，或可为保留天然蛋白的生物活性的至少一部分的生物活性蛋白的片段或序列变体。
在一个实施方案中，并入至本发明组合物中的BP可为具有与自然界中发现的蛋白质对应的序列的重组多肽。在另一实施方案中，BP可为保留天然BP的生物活性的至少一部分的天然序列的序列变体、片段、同源物及模拟物。在非限制性实施例中，BP可为展现出与选自表6的蛋白质序列至少约80％序列一致性，或替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的序列。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白可包含连接至XTEN的单一BP分子(如下文更充分地描述)。在另一实施方案中，BPXTEN可包含第一BP及相同BP的第二分子，产生包含连接至一个或多个XTEN的两个BP(例如两个IL-1ra分子或两个IL-10分子)的融合蛋白。生物活性蛋白(包括作为治疗剂的那些)通常为展现短储存期限的不稳定分子，尤其当在水溶液中调配时。另外，多种生物活性肽及蛋白质溶解度有限，或在重组产生期间变得聚集，需要复杂的溶解及再折叠程序。各种化学聚合物可连接至此类蛋白质以改变其特性。备受关注的为具有可挠性构象且在水溶液中充分水合的亲水性聚合物。经常使用的聚合物为聚乙二醇(PEG)。这些聚合物倾向于具有相对于其分子量的较大流体动力学半径(Kubetzko,S.,等人(2005)Mol Pharmacol,68:1439-54)，且可产生增强的药物动力学特性。视连接点而定，聚合物倾向于与其连接的蛋白质具有有限相互作用，使得聚合物修饰的蛋白质保留其相关功能。然而，聚合物与蛋白质的化学结合需要复杂的多步骤过程。通常，蛋白质组分需要在化学结合步骤之前产生及纯化。另外，结合步骤可引起需要分离的异质产品混合物的形成，引起显著的产品损失。或者，此类混合物可用作最终药物产品，但难以标准化。一些实施例为当前市售用作混合物的聚乙二醇化干扰素-α产品(Wang,B.L.,等人(1998)J Submicrosc Cytol Pathol,30:503-9；Dhalluin,C.,等人(2005)BioconjugChem,16:504-17)。此类混合物难以可再现地制造及表征，因为其含有具有降低的或无治疗活性的异构物。
一般而言，当用于体内时或当用于体外分析中时，BP将对给定目标或另一所需生物特征展现结合特异性。举例而言，BP可为激动剂、受体、配位体、拮抗剂、酶或激素。备受关注的为所使用或已知适用于疾病或病症的BP，其中天然BP具有相对短的终末半衰期且其药物动力学参数的增强(其任选可通过裂解间隔子序列自融合蛋白质释放)将允许不太频繁的给药或增强的药理学效应。亦关注在最小有效剂量或血液浓度(Cmin)与最大耐受剂量或血液浓度(Cmax)之间具有窄治疗窗的BP。在此类情况下，BP与包含选择XTEN序列的融合蛋白的连接可引起这些特性的改良，使得相比于不连接至XTEN的BP，其更适用作治疗剂或预防剂。
BP可为细胞因子。本发明组合物所涵盖的细胞因子可在治疗各种治疗性或疾病类别中具有效用，包括(但不限于)癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、全身性红斑狼疮、阿尔茨海默氏症、精神分裂症、病毒感染(例如，慢性C型肝炎、AIDS)、过敏性哮喘、视网膜神经退化性过程、代谢病症、胰岛素抗性及糖尿病性心肌症。细胞因子可尤其适用于治疗发炎性病况及自体免疫性病况。
BP可为一种或多种细胞因子。细胞因子是指可影响细胞行为的由细胞释放的蛋白质(例如趋化因子、干扰素、淋巴介质、白介素及肿瘤坏死因子)。细胞因子可由广泛范围的细胞产生，包括(但不限于)免疫细胞，诸如巨噬细胞、B淋巴球、T淋巴球、微神经胶质细胞及肥大细胞，以及内皮细胞、纤维母细胞及各种基质细胞。给定细胞因子可由超过一种类型的细胞产生。细胞因子可涉及产生全身或局部免疫调节效应。
某些细胞因子可充当促炎性细胞因子。促炎性细胞因子是指参与诱导或放大发炎反应的细胞因子。促炎性细胞因子可与免疫系统的各种细胞(诸如嗜中性球及白血球)起作用以产生免疫反应。某些细胞因子可充当抗炎细胞因子。抗炎细胞因子是指涉及减少发炎性反应的细胞因子。在一些情况下，抗炎细胞因子可调节促炎性细胞因子反应。一些细胞因子可充当促炎性细胞因子及抗炎细胞因子两者。
可通过本发明的系统及组合物调节的细胞因子的实施例包括但不限于淋巴介质、单核因子及除了人类生长激素之外的传统多肽激素。细胞因子尤其包括副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)及促黄体生成激素(LH)；肝生长因子；纤维母细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α；苗勒氏管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转型生长因子(TGF)，诸如TGF-α、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3；类胰岛素生长因子-I及类胰岛素生长因子-II；红血球生成素(EPO)；Flt-3L；干细胞因子(SCF)；骨性诱导因子；干扰素(IFN)，诸如IFN-α、IFN-β及IFN-γ；群落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；颗粒球-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；颗粒球-CSF(G-CSF)；巨噬细胞刺激因子(MSP)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1a、IL-1b、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12b、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-20；肿瘤坏死因子，诸如CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE；及其他多肽因子，包括LIF、抑瘤素M(OSM)及kit配位体(kit ligand，KL)。细胞因子受体是指结合细胞因子的受体蛋白。细胞因子受体可为膜结合的及可溶的。
目标聚核苷酸可编码细胞因子。细胞因子的非限制性实施例包括4-1BBL、活化素βA、活化素βB、活化素βC、活化素βE、青蒿素(ARTN)、BAFF/BLyS/TNFSF138、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、骨形态生成蛋白1(BMP1)、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40L/CD154/TNFSF5、CD40LG、CD70、CD70/CD27L/TNFSF7、CLCF1、c-MPL/CD110/TPOR、CNTF、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、EDA-A1、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Fas配位体/FASLG/CD95L/CD178、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、胶质细胞株为源性神经营养因子(GDNF)、生长分化因子1(GDF1)、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNω/IFNW1、IL11、IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1RL2、IL31、IL33、IL6、IL8/CXCL8、抑制素-A、抑制素-B、瘦素、LIF、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、神经营养素(NRTN)、OSM、OX-40L/TNFSF4/CD252、珀瑟芬(persephin，PSPN)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TL1A/TNFSF15、TNFA、TNF-α/TNFA、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14/LIGHT/CD258、XCL1及XCL2。在一些实施方案中，目标基因编码免疫检查点抑制剂。此类免疫检查点抑制剂的非限制性实施例包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR及VISTA。在一些实施方案中，目标基因编码T细胞受体(TCR)α、β、γ和/或δ链。
在一些情况下，细胞因子可为趋化因子。趋化因子可选自以下的群，其包括但不限于：ARMCX2、BCA-1/CXCL13、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL15/MIP-5/MIP-1δ、CCL16/HCC-4/NCC4、CCL17/TARC、CCL18/PARC/MIP-4、CCL19/MIP-3b、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3α/MIP3A、CCL21/6Ckine、CCL22/MDC、CCL23/MIP 3、CCL24/嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)-2/MPIF-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸性粒细胞趋化因子-3、CCL27/CTACK、CCL28、CCL3/Mip1a、CCL4/MIP1B、CCL4L1/LAG-1、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL8/MCP-2、CCL9、CML5、CXCL1、CXCL10/Crg-2、CXCL12/SDF-1β、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine、CXCL16/SR-PSOX、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3/GROγ、CXCL4/PF4、CXCL5、CXCL6/GCP-2、CXCL9/MIG、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4/TAFA4、FAM19A5、Fractalkine/CX3CL1、I-309/CCL1/TCA-3、IL-8/CXCL8、MCP-3/CCL7、NAP-2/PPBP/CXCL7、XCL2及Armo IL10。
表3提供本发明的BPXTEN融合蛋白所涵盖的此类BRP序列的非限制性清单。本发明BPXTEN组合物的代谢蛋白质可为展现出与选自表3的蛋白质序列至少约80％序列一致性，或替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的蛋白质。
表3：用于结合的细胞因子
Figure BDA0004014658270000391
Figure BDA0004014658270000401
表A.例示性白介素-12(IL-12)或其片段的氨基酸序列
Figure BDA0004014658270000402
Figure BDA0004014658270000411
表A提供白介素-12序列(或其片段)的非限制性清单。本发明的本发明的BPXTEN组合物可含有氨基酸序列，其展现出与选自表A的蛋白质序列至少约80％序列一致性，或替代地81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。
在一些实施方案中，在本发明的组合物(诸如融合蛋白)包含细胞因子时，细胞因子可选自由以下组成的群：白介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子、群落刺激因子或转型生长因子β(TGF-β)超家族成员。在一些实施方案中，细胞因子为可为选自由以下组成的群的白介素：IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16及IL17。在一些实施方案中，细胞因子可具有与选自表3或表A的序列至少(约)80％、至少(约)81％、至少(约)82％、至少(约)83％、至少(约)84％、至少(约)85％、至少(约)86％、至少(约)87％、至少(约)88％、至少(约)89％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或100％序列一致性。在一些实施方案中，细胞因子可具有与选自表3的序列至少(约)80％、至少(约)81％、至少(约)82％、至少(约)83％、至少(约)84％、至少(约)85％、至少(约)86％、至少(约)87％、至少(约)88％、至少(约)89％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或100％序列一致性。在一些实施方案中，细胞因子可具有与选自表A的序列至少(约)80％、至少(约)81％、至少(约)82％、至少(约)83％、至少(约)84％、至少(约)85％、至少(约)86％、至少(约)87％、至少(约)88％、至少(约)89％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或100％序列一致性。在一些实施方案中，细胞因子可为IL-12或IL-12变体。在一些实施方案中，细胞因子可包含第一细胞因子片段(Cy1)和第二细胞因子片段(Cy2)。在一些实施方案中，Cy1及Cy2中之一者可包含与白介素-12次单元β具有至少70％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cy1及Cy2中的另一者可包含与白介素-12次单元α具有至少(约)70％、至少(约)75％、至少(约)80％、至少(约)85％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一细胞因子片段(Cy1)可包含与序列SEQ ID NO.5具有至少(约)70％、至少(约)75％、至少(约)80％、至少(约)85％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二细胞因子片段(Cy2)可包含与序列SEQ ID NO.6具有至少(约)70％、至少(约)75％、至少(约)80％、至少(约)85％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或100％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞因子可包含位于第一细胞因子片段(Cy1)和第二细胞因子片段(Cy2)之间的接头。在一些实施方案中，细胞因子可为包含与SEQ ID NO.7具有至少(约)70％、至少(约)75％、至少(约)80％、至少(约)85％、至少(约)90％、至少(约)91％、至少(约)92％、至少(约)93％、至少(约)94％、至少(约)95％、至少(约)96％、至少(约)97％、至少(约)98％、至少(约)99％或100％序列一致性的氨基酸序列的IL-12变体。接头可为GS接头(诸如GGGGS)1(SEQ ID NO:273)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:273)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:273)、(GGGGS)4(SEQID NO:273)、(GGGGS)5(SEQ ID NO:273)等)。
“IL-1ra”是指人类IL-1受体拮抗剂蛋白质及其物种及序列变体，包括序列变体阿那白滞素
Figure BDA0004014658270000421
其具有成熟IL-1ra的生物活性的至少一部分。人类IL-1ra为152个氨基酸残基的成熟糖蛋白。IL-1ra的抑制作用由其与I型IL-1受体的结合而产生。蛋白质的天然分子量为25kDa，且分子显示与IL-1α(19％)及IL-1β(26％)的有限序列同源性。阿那白滞素为非糖化重组人类IL-1ra且通过添加N端甲硫氨酸而不同于内源性人类IL-1ra。阿那白滞素的商业化版本以
Figure BDA0004014658270000422
出售。其以与天然IL-1ra及IL-1b相同亲合力与IL-1受体结合，但并不导致受体活化(信号转导)，该效应归因于IL-1ra上仅存在一个受体结合模体，而IL-1α及IL-1β上存在两个此类模体。阿那白滞素具有153个氨基酸且大小为17.3kD，且报导半衰期为大致4至6小时。
IL-1产量增加已报导于具有各种病毒、细菌、真菌及寄生虫感染；血管内凝血；高剂量IL-2疗法；实体肿瘤；白血病；阿尔茨海默氏症；HIV-1感染；自体免疫疾病；外伤(手术)；血液透析；缺血性疾病(心肌梗塞)；非感染性肝炎；哮喘；UV辐射；闭合性颅脑损伤；胰脏炎；腹膜炎；移植物抗宿主病；移植排斥的患者；以及费劲运动之后的健康受试者中。患有阿尔茨海默氏症的患者中IL-1b产量增加与IL 1在淀粉样蛋白前驱蛋白释放中的作用之间存在关联。IL-1亦与疾病相关，所述疾病诸如2型糖尿病、肥胖症、高血糖、高胰岛素血症、1型糖尿病、胰岛素抗性、视网膜神经退化性过程、以胰岛素抗性为特征的疾病状态及病况、急性心肌梗塞(AMI)、急性冠状动脉综合征(ACS)、动脉粥样硬化、慢性发炎性病症、类风湿性关节炎、退化性椎间盘疾病、类肉瘤病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、妊娠期糖尿病、食欲亢进、饱腹感不足、代谢障碍、胰高血糖素瘤、气道分泌病症、骨质疏松症、中枢神经系统疾病、再狭窄、神经退化性疾病、肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肿、高血压、需要减少食物摄入量的病症、肠激躁综合征、心肌梗塞、中风、手术后代谢变化、休眠心肌、糖尿病心肌病、尿钠排泄不足、尿钾浓度过高、与中毒性高血容量相关的病况或病症、多囊性卵巢综合征、呼吸窘迫、慢性皮肤溃疡、肾病、左心室收缩功能障碍、胃肠道腹泻、手术后倾倒综合征、肠激躁综合征、危重病多发性神经病(CIPN)、全身性发炎反应综合征(SIRS)、血脂异常、局部缺血后再灌注损伤及冠心病风险因素(CHDRF)综合征。本发明的含IL-1ra融合蛋白可在治疗前述疾病及病症中的任一者中发现特定用途。IL-1ra已经克隆，如美国专利第5,075,222号及第6,858,409号中所描述。
在一些情况下，BP可为IL-10。IL-10可是有效的抗炎细胞因子，其抑制促炎性细胞因子及趋化因子的产生。IL-10为主要的TH2型细胞因子中之一者，其增加体液免疫反应且减少细胞介导的免疫反应。IL-10可适用于治疗自体免疫性疾病及发炎性疾病，诸如类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、全身性红斑狼疮、阿尔茨海默氏症、精神分裂症、过敏性哮喘、视网膜神经退化性过程及糖尿病。
在一些情况下，IL-10可经修饰以改良稳定性且减少质子迁移降解。修饰可为一个或多个酰胺键取代。在一些情况下，IL-10主链内的一个或多个酰胺键可经取代以实现上述效应。IL-10中的一个或多个酰胺键(—CO—NH—)可经酰胺键的同电子排列体键取代，诸如—CH2NH—、—CH2S—、—CH2CH2-、—CH═CH-(顺式及反式)、—COCH2-、—CH(OH)CH2—或—CH2SO—。此外，IL-10中的酰胺键亦可经减少的同电子排列体假肽键置换。参见Couder等人(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184，其以全文引用的方式并入本文中。
一种或多种酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸、烷基、芳基、芳基烷基及2,4-二氨基丙二酸的杂芳基磺酰胺、鸟氨酸或赖氨酸及经四唑取代的烷基氨基酸；及侧链酰胺残基，诸如天冬酰胺、谷氨酰胺及天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳族取代衍生物；以及含羟基氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸、以及丝氨酸或苏氨酸的烷基或芳族取代衍生物。
IL-10中的一个或多个疏水性氨基酸(诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或其他简单α-氨基酸)可经氨基酸取代，所述氨基酸包括但不限于来自C1-C10碳的脂族侧链，包括分支链、环状及直链烷基、烯基或炔基取代。
在一些情况下，IL-10的一个或多个疏水性氨基酸，诸如可经芳族取代的疏水性氨基酸的取代，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、联苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸、包括氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤化(氟、氯、溴或碘)或烷氧基(来自C1-C4)取代的以上所列的芳族氨基酸形式，其说明性实施例有：2-、3-或4-氨基苯丙氨酸、2-、3-或4-氯苯丙氨酸、2-、3-或4-甲基苯丙氨酸、2-、3-或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基-、5-氯-、5-甲基-或5-甲氧基色胺、2'-、3'-或4'-氨基-、2'-、3'-或4'-氯-、2、3或4-联苯丙氨酸、2'-、3'-或4'-甲基-、2-、3-或4-联苯丙氨酸及2-或3-吡啶丙氨酸。
IL-10中的一个或多个疏水性氨基酸(诸如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、联苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸、包括氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤化(氟、氯、溴或碘)或烷氧基可取代的芳族氨基酸包括：2-、3-或4-氨基苯丙氨酸、2-、3-或4-氯苯丙氨酸、2-、3-或4-甲基苯丙氨酸、2-、3-或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基-、5-氯-、5-甲基-或5-甲氧基色胺、2'-、3'-或4'-氨基-、2'-、3'-或4'-氯-、2、3或4-联苯丙氨酸、2'-、3'-或4'-甲基-、2-、3-或4-联苯丙氨酸及2-或3-吡啶丙氨酸。
包含碱性侧链的氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括先前氨基酸的烷基、烯基或芳基取代衍生物，可经取代。实施例为N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ,γ'-二乙基-高精氨酸、α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸及α-甲基-鸟氨酸，其中烷基占据α-碳的前R位置。经修饰的IL-10可包含由烷基、芳族、杂芳族、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸、羧酸或许多熟知活化衍生物中的任一者的任何组合形成的酰胺，所述衍生物诸如酸氯化物、活性酯、活性氮杂内酯及相关衍生物、赖氨酸及鸟氨酸。
在一些情况下，IL-10可包含一种或多种天然存在的L-氨基酸、合成的L-氨基酸和/或氨基酸的D-镜像异构物。IL-10多肽可包含以下氨基酸中之一或多者：ω-氨基癸酸、ω-氨基十四酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、羟脯氨酸、β-丙氨酸、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、间氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-2-噻吩丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、rho-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸及2,3-二氨基丁酸。
IL-10可包含半胱氨酸残基或半胱氨酸，其可经由二硫键充当另一肽的接头或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法为本领域已知；参见例如美国专利第8,067,532号。IL-10多肽可环化。其他环化方式包括引入肟接头或羊毛硫氨酸接头；参见例如美国专利第8,044,175号。可使用和/或引入可形成环化键的氨基酸(或非氨基酸部分)的任何组合。环化键可以由氨基酸(或氨基酸及—(CH2)n-CO—或—(CH2)n-C6H4—CO—)与允许引入桥的官能基的任何组合生成。一些实施例为二硫化物、二硫化物模拟物，诸如—(CH2)n-脲桥、硫缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)及含有酯及醚的桥。
IL-10可经N-烷基、芳基或主链交联取代以构建内酰胺及其他环状结构、C端羟甲基衍生物、o-修饰衍生物、N端修改衍生物，包括经取代的酰胺，诸如烷基酰胺及酰肼。在一些情况下，IL-10多肽为逆转录类似物。
IL-10可为一种IL-10，其可为天然蛋白质、肽片段IL-10或经修饰的肽，其具有天然IL-10的至少一部分生物活性。IL-10可经修饰以改良细胞内摄取。一个此类修饰可为蛋白质转导域的连接。蛋白质转导域可连接至IL-10的C端。或者，蛋白质转导域可连接至IL-10的N端。蛋白质转导域可经由共价键连接至IL-10。蛋白质转导域可选自表9中所列的序列中的任一者。
表9.例示性蛋白转导域
Figure BDA0004014658270000441
Figure BDA0004014658270000451
BPXTEN结构构型和特性
本发明组合物的BP不限于天然、全长多肽，且亦包括重组型式以及生物学和/或药理学活性变体或其片段。举例而言，应了解，在GP中可进行各种氨基酸取代以在不背离本发明的精神的情况下产生关于BP的生物活性或药理学特性的变体。多肽序列中氨基酸的保守取代的实施例展示于表4中。然而，在与本文所公开的特定序列相比BP的序列一致性小于100％的BPXTEN的实施方案中，本发明涵盖其他19种天然L-氨基酸中的任一者取代给定BP的给定氨基酸残基，其可在BP的序列内的任何位置处，包括相邻氨基酸残基。若任何一个取代引起生物活性发生不合需要的变化，则可采用替代性氨基酸中之一者且通过本文所描述的方法或使用例如于美国专利第5,364,934号中所阐述保守及非保守突变的任何技术及指南(其内容以全文引用的方式并入)，或使用本领域技术人员通常已知的方法评估构建体。另外，变体亦可包括例如多肽，其中在BP的全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或删除一个或多个氨基酸残基，其保留了天然肽的至少一部分生物活性。
表4：例示性保守氨基酸取代
初始残基 例示性取代
Ala(A) val；leu；ile
Arg(R) lys；gin；asn
Asn(N) gin；his；Iys；arg
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gln(Q) asn
Glu(E) asp
Gly(G) pro
His(H) asn：gin:Iys：arg
xIle(I) leu；val；met；ala；phe：正亮氨酸
Leu(L) 正亮氨酸：ile：val；met；ala：phe
Lys(K) arg：gin：asn
Met(M) leu；phe；ile
Phe(F) leu：val：ile；ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp：phe：thr：ser
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸
BPXTEN融合蛋白构型
本发明提供包含连接至一种或多种XTEN多肽的BP的BPXTEN融合蛋白组合物，该一个或多个XTEN多肽适用于预防、治疗、介导或改善与葡萄糖稳态、胰岛素抗性或肥胖症相关的疾病、病症或病况。在一些情况下，BPXTEN为具有连接至一个或多个XTEN多肽的BP的单体融合蛋白。在其他情况下，BPXTEN组合物可包括连接至一个或多个XTEN多肽的两个BP分子。本发明涵盖BPXTEN，其包含(但不限于)选自表3或表A(或其片段或序列变体)的BP及选自表2a-2b的XTEN或其序列变体。在一些情况下，对应BP的生物活性的至少一部分通过完整的BPXTEN保持。在其他情况下，BP组分通过并入间隔子序列内的可选裂解序列裂解至BPXTEN中而变得具有生物活性或在其自XTEN释放后具有活性增加，下文更充分描述。
在一些实施方案中，BPXTEN融合蛋白组合物包含(a)XTEN(诸如本文所公开的XTEN)及(b)连接至XTEN的细胞因子。
在BPXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供一种式I的融合蛋白：
(BP)-(S)x-(XTEN)I
其中在每次出现时，BP独立地为如上文所描述的生物活性蛋白；S为可任选包括裂解序列的具有1至约50个氨基酸残基之间之间隔子序列(如下文更充分地描述)；x为0或1；且XTEN为如上文所描述的延伸重组多肽。当BP针对所需生物活性需要游离N端时，或当其中BP的C端连接至融合蛋白降低生物活性时且当需要降低所施用的BPXTEN的生物活性和/或副作用时，实施方案具有特定效用。
在BPXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供式II的融合蛋白(如上文所描述的组分)：
(XTEN)-(S)x-(BP)II
其中在每次出现时，BP独立地为如上文所描述的生物活性蛋白；S为可任选包括裂解序列的具有1至约50个氨基酸残基之间之间隔子序列(如下文更充分地描述)；x为0或1；且XTEN为如上文所描述的延伸重组多肽。当BP针对所需生物活性需要游离C端时，或当其中BP的N端连接至融合蛋白降低生物活性时且当需要降低所施用的BPXTEN的生物活性和/或副作用时，实施方案具有特定效用。
因此，具有单一BP及单一XTEN的BPXTEN可至少具有以下构型排列，各排列以N端至C端定向列出：BP-XTEN；XTEN-BP；BP-S-XTEN；或XTEN-S-BP。
在另一实施方案中，本发明提供一种经分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式III的融合蛋白：
(BP)-(S)x-(XTEN)-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN)z III
其中在每次出现时，BP独立地为如上文所描述的生物活性蛋白；S为可任选包括裂解序列的具有1至约50个氨基酸残基之间之间隔子序列(如下文更充分地描述)；x为0或1；y为0或1；z为0或1；且XTEN为如上文所描述的延伸重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供一种经分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式IV的融合蛋白(如上文所描述的组分)：
(XTEN)x-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN)-(BP)IV
在另一实施方案中，本发明提供一种经分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式V的融合蛋白(如上文所描述的组分)：
(BP)x-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN)V
在另一实施方案中，本发明提供一种经分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式VI的融合蛋白(如上文所描述的组分)：
(XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(BP)VI
在另一实施方案中，本发明提供一种经分离的融合蛋白，其中该融合蛋白为式VII的融合蛋白(如上文所描述的组分)：
(XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(BP)-(XTEN)VII
在一些情况下，BP可包含第一片段及第二细胞因子片段，且XTEN定位于第一片段与第二片段之间。必要时，BP可为细胞因子。在一些情况下，细胞因子可为IL-10。
在式I-VII的融合蛋白之前述实施方案中，与不连接至XTEN的对应BP且以可比剂量向受试者施用相比，向有需要的受试者施用治疗有效剂量的实施方案的融合蛋白可产生，在融合蛋白的治疗窗内花费的至少两倍或至少三倍或至少四倍或至少五倍或更多倍的时间增益。
本发明涵盖的融合蛋白中任何间隔子序列组任选存在。可提供间隔子以增强融合蛋白自宿主细胞的表达或以降低位阻，使得BP组分可假定其所需三级结构和/或与其目标分子适当地相互作用。关于间隔子及识别所需间隔子的方法，参见例如George,等人.(2003)Protein Engineering 15:871-879，特定地以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，间隔子包含一个或多个长度在1至50个氨基酸残基之间，或长度在约1至25个残基，或长度在约1至10个残基之间的肽序列。不包括裂解位点之间隔子序列可包含20种天然L氨基酸中的任一者，且将优选包含空间上不受阻的亲水性氨基酸，其可包括(但不限于)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)。在一些情况下，间隔子可为聚甘氨酸或聚丙氨酸，或主要为甘氨酸及丙氨酸残基的组合的混合物。不包括裂解序列之间隔子多肽基本上不含二级结构。在一个实施方案中，BPXTEN融合蛋白组合物中的一个或两个间隔子序列可各自进一步含有可相同或可不同的裂解序列，其中裂解序列可由蛋白酶作用以自融合蛋白释放BP。
在一些情况下，将裂解序列并入至BPXTEN中经设计以准许释放在自XTEN释放后变得活性或更具活性的BP。裂解序列足够接近BP序列进行定位，通常在BP序列末端的18个氨基酸内，或12个氨基酸内，或6个氨基酸内，或2个氨基酸内定位，使得裂解之后连接至BP的任何残留残基不会明显地干扰BP的活性(例如结合至受体)，但提供足够的蛋白酶以能够实现裂解序列的裂解。在一些实施方案中，裂解位点为序列，其可通过对于哺乳动物受试者而言为内源性的蛋白酶裂解以使得BPXTEN可在施用受试者之后裂解。在此类情况下，BPXTEN可充当BP之前药或循环储存物。本发明涵盖的裂解位点的实施例包括(但不限于)可通过哺乳动物内源性蛋白酶裂解的多肽序列，该哺乳动物内源性蛋白酶选自FXIa、FXIIa、激肽释放素、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、颗粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20，或通过非哺乳动物蛋白酶裂解的多肽序列，所述非哺乳动物蛋白酶诸如TEV、肠激酶、PreScissionTM蛋白酶(鼻病毒3C蛋白酶)及分选酶A。已知由前述蛋白酶裂解的序列为本领域已知的。例示性裂解序列及序列内的切割位点以及序列变体提供于表5中。举例而言，凝血酶(活化凝血因子II)作用于序列LTPRSLLV(SEQ ID NO:230)[Rawlings N.D.,等人(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]，其将在序列中的位置4处的精氨酸之后进行切割。类似地，其他序列并入至由内源性蛋白酶起作用的BPXTEN中将提供BP的持续释放，在某些情况下，BP可能自BPXTEN的“前药”形式为BP提供更高程度的活性。
在一些情况下，仅切割位点的两侧侧接的两个或三个氨基酸(总共四个至六个氨基酸)将并入裂解序列中。在其他情况下，已知裂解序列对于已知序列中的任一个或两个或三个氨基酸可具有一个或多个缺失或插入或一个或两个或三个氨基酸取代，其中缺失、插入或取代导致对蛋白酶的敏感性降低或增强，但缺乏敏感性，从而得到调适自XTEN释放BP的速率的能力。例示性取代展示于表5中。
表5：蛋白酶裂解序列
Figure BDA0004014658270000471
Figure BDA0004014658270000481
↓表示裂解位点
NA：不适用
*斜线之前、之间或之后的多个氨基酸的列表指示可在该位置经取代的替代性氨基酸；“-”指示任何氨基酸可经中间栏中指示的相应氨基酸取代。
在另一方面中，本发明提供包含多个释放区段(RS)的融合蛋白，其中各RS序列选自表6中所阐述的序列组，且RS通过选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸及苏氨酸的1至6个氨基酸彼此连接。在一个实施方案中，融合蛋白包含第一RS及不同于第一RS的第二RS，其中各RS序列选自表6中所阐述的序列组，且RS通过选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸及苏氨酸的1至6个氨基酸彼此连接。在另一实施方案中，融合蛋白包含第一RS、不同于第一RS的第二RS及不同于第一RS及第二RS的第三RS，其中各RS序列选自表6中所阐述的序列组，且第一及第二及第三RS通过选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸及苏氨酸的1至6个氨基酸彼此连接。特定预期融合蛋白的多个RS可串接以形成序列，其可通过不同裂解速率或劈裂效率的多个蛋白酶裂解。在另一实施方案中，本申请提供融合蛋白，其包含选自表6及7中所阐述的序列组的RS1及RS2以及选自本申请的XTEN1及XTEN2，其中RS1融合于XTEN1与结合部分之间且RS2融合于XTEN2与结合部分之间。经考虑与健康组织或当在正常循环中时相比，此类组合物将更易于由表达多种蛋白酶的患病目标组织裂解，其结果为携带结合部分的所得片段将更易于穿透目标组织(例如肿瘤)，且具有增强的结合及连接靶细胞及效应细胞(或仅在融合蛋白经设计为具有单一结合部分的情况下为靶细胞)的能力。在一些实施方案中，在本申请的组合物(诸如融合蛋白)包含释放区段的情况下，释放区段(RS)可与选自表6-7中阐述的序列的序列具有至少82％、至少88％、至少94％或100％序列一致性。在一些实施方案中，本申请的组合物(诸如融合蛋白)可具有自XTEN-RS-细胞因子或细胞因子-RS-XTEN的N端至C端的结构排列。
表6.释放区段序列.
Figure BDA0004014658270000482
Figure BDA0004014658270000491
Figure BDA0004014658270000501
Figure BDA0004014658270000511
表7.释放区段序列
Figure BDA0004014658270000521
Figure BDA0004014658270000531
Figure BDA0004014658270000541
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本申请的RS适用于包括于重组多肽中作为治疗剂，用于治疗癌症、自体免疫性疾病、发炎性疾病及其他需要重组多肽的局部活化的病况。本发明组合物解决未满足的需求且相比于注射后具活性的常规抗体治疗剂或双特异性抗体治疗剂，在一个或多个方面中优良，包括增强的终末半衰期、靶向递送及改良的治疗比与减少的健康组织毒性。
在一个实施方案中，并入至BPXTEN融合蛋白的BP可具有序列，其展现与表3或表A的序列至少约80％序列一致性，或替代地与表3或表A的序列相比至少约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％或约100％序列一致性。可使用如本文所描述的分析或经量测或经测定的参数评估前述实施方案的BP，且相比于对应天然BP序列保持至少约40％、或约50％、或约55％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％或更大活性的那些序列将视为适合于包涵于本发明BPXTEN中。发现保留适合活性水平的BP可连接至上文所描述的一个或多个XTEN多肽。在一个实施方案中，发现保留适合水平的活性的BP可连接至一个或多个XTEN多肽，该XTEN多肽具有与表2a-2b的序列至少约80％序列一致性，或替代地与表2a-2b的序列相比至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列一致性，得到嵌合融合蛋白。
本申请涵盖选自表3或表A且连接至一个或两个XTEN的其他BP的取代，所述XTEN可相同或不同，选自表2a-2b。在此段落中上文所描述之前述融合蛋白中，BPXTEN融合蛋白可进一步包含来自表5的裂解序列；裂解序列位于BP与XTEN之间或相邻BP之间。在一些情况下，包含裂解序列的BPXTEN亦将在BP与裂解序列或XTEN与裂解序列之间具有一个或多个间隔子序列氨基酸以促进蛋白酶的获取；所述间隔子氨基酸包含任何天然氨基酸，包括甘氨酸及丙氨酸作为优选氨基酸。
靶向部分
在某些实施方案中，经考虑本发明的XPAC亦可进一步包含允许XPAC结合至在肿瘤上表达的抗原的肿瘤靶向部分。此可通过包括嵌合多肽(XPAC)中的另一域以影响其在体内的移动来达成。举例而言，嵌合核酸可以编码将多肽引导至体内的位置(例如肿瘤细胞或发炎部位)的域。例示性及适合的靶向部分域包含具有在发炎组织中过度表达的同源配位体的那些靶向部分域，例如IL-1受体或IL-6受体。在其他实施方案中，适合的靶向部分包含具有在肿瘤组织中过度表达的同源配位体的那些靶向部分，例如Epcam、CEA或间皮素。在一些实施方案中，靶向域经由接头连接至细胞因子，该接头在作用部位(例如通过发炎或癌症特异性蛋白酶)裂解，使得在所需位点处释放细胞因子的完全活性。在一些实施方案中，靶向和/或保留域经由未在作用部位裂解(例如通过炎症或癌症特异性蛋白酶)的接头连接至白介素，使得细胞因子保留在所需位点。
尤其优选的靶向部分靶抗原表达在病变细胞或组织(例如肿瘤或癌细胞)的表面上。适用于肿瘤靶向及保留的抗原包括(但不限于)EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、c-Met、FOLR1及CEA。本文所公开的药物组合物亦包括包含两个靶向和/或保留域的蛋白质，所述靶向和/或保留域结合至已知在病变细胞或组织上表达的两种不同靶抗原。例示性抗原结合域对包括(但不限于)EGFR/CEA、EpCAM/CEA及HER-2/HER-3。
适合的靶向部分包括抗原结合域，诸如抗体及其片段，包括多克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体、单链可变片段(scFv)、单域抗体(诸如重γ链可变域(VH)、轻链可变域(VL)及骆驼型纳米抗体的可变域(VHH))、dAb及其类似物。其他适合的抗原结合域包括模拟抗体结合和/或结构的非免疫球蛋白蛋白质，诸如抗运载蛋白、人类泛素(affilin)、亲和抗体分子、亲和体、亲和素(affitin)、α体(alphabody)、(avimer)、DARPin、fynomer、kunitz域肽、单功能抗体及基于其他经工程改造的骨架(诸如SpA、GroEL、纤维结合蛋白、脂质运载蛋白及CTLA4骨架)的结合域。抗原结合多肽的其他实施例包括所需受体的配位体、受体的配体结合部分、凝集素及结合于一种或多种靶抗原或与一种或多种靶抗原缔合的肽。
在一些实施方案中，靶向部分特异性结合至细胞表面分子。在一些实施方案中，靶向和/或保留域特异性结合至肿瘤抗原。在一些实施方案中，靶向多肽特异性且独立地结合于选自以下中的至少一者的肿瘤抗原：纤维母细胞活化蛋白α(FAPa)、滋胚层糖蛋白(5T4)、肿瘤相关钙信号转导子2(Trop2)、纤维结合蛋白EDB(EDB-FN，参见美国公开案20200397915)、纤维结合蛋白EIIIB域、CGS-2、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、CEA及FOLR1。在一些实施方案中，靶向多肽特异性且独立地结合至两种不同抗原，其中所述抗原中的至少一者为选自EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、CEA及FOLR1的肿瘤抗原。
靶向抗原可为表达于肿瘤细胞上的肿瘤抗原。肿瘤抗原为本领域所熟知且包括例如EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、c-Met、FOLR1、PSMA、CD38、BCMA及CEA。5T4、AFP、B7-H3、钙黏素-6、CAIX、CD117、CD123、CD138、CD166、CD19、CD20、CD205、CD22、CD30、CD33、CD352、CD37、CD44、CD52、CD56、CD70、CD71、CD74、CD79b、DLL3、EphA2、FAP、FGFR2、FGFR3、GPC3、gpA33、FLT-3、gpNMB、HPV-16E6、HPV-16E7、ITGA2、ITGA3、SLC39A6、MAGE、间皮素、Mucl、Muc16、NaPi2b、黏附分子-4、P-钙黏素、NY-ESO-1、PRLR、PSCA、PTK7、ROR1、SLC44A4、SLTRK5、SLTRK6、STEAP1、TIM1、Trop2、WT1。
靶向抗原可为免疫检查点蛋白。免疫检查点蛋白质的实施例包括(但不限于)CD27、CD137、2B4、TIGIT、CD155、ICOS、HVEM、CD40L、LIGHT、TIM-1、OX40、DNAM-1、PD-L1、PD1、PD-L2、CTLA-4、CD8、CD40、CEACAM1、CD48、CD70、A2AR、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAG-3、TIM-3或VISTA。
靶向抗原可为细胞表面分子，诸如蛋白质、脂质或多糖。在一些实施方案中，此类抗原为肿瘤细胞、病毒感染细胞、细菌感染细胞、受损红血球、动脉斑块细胞、发炎或纤维化组织细胞。此类抗原可包含免疫反应调节剂，诸如包括(但不限于)颗粒球-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)、颗粒球群落刺激因子(G-CSF)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GITRL、CD3或GITR。
BPXTEN的药物动力学特性
本发明提供相比于不连接至XTEN的BP具有增强的药物动力学的BPXTEN融合蛋白，当通过本文所描述的方法测定以组合物的剂量使用时，可达成产生药理学效应的循环浓度，相比于不连接至XTEN的BP的可比剂量，该组合物的生物活性组分在安全范围内保持延长时段。在此类情况下，BPXTEN保持在融合蛋白组合物的治疗窗内持续延长时段。如本文所使用，“可比剂量”是指以可比方式向受试者施用的活性BP药效团的等效摩尔/公斤剂量。在本领域应理解，BPXTEN融合蛋白的“可比剂量”将表示更大重量的试剂，但在融合蛋白的剂量中将具有基本上相同的BP摩尔当量和/或相对于BP将具有相同的近似摩尔浓度。
可通过将给定XTEN连接至BP来增强的BP的药物动力学特性，包括终末半衰期、曲线下面积(AUC)、Cmax分布体积及生物可用性。
如关于包含XTEN的融合蛋白的药物动力学特征的实施例中更充分地描述，出人意料地发现，增加XTEN序列的长度可赋予包含XTEN的融合蛋白的终末半衰期的不成比例增加。因此，本发明提供包含XTEN的BPXTEN融合蛋白，其中XTEN可经选择以提供向受试者施用的BPXTEN组合物的靶向半衰期。在一些实施方案中，本发明提供包含XTEN的单体融合蛋白，其中相比于不连接至融合蛋白的相应BP，XTEN经选择以赋予施用的BPXTEN的终末半衰期增加，且与不连接至融合蛋白的BP相比，终末半衰期增加至少约两倍、或至少约三倍、或至少约四倍、或至少约五倍、或至少约六倍、或至少约七倍、或至少约八倍、或至少约九倍、或至少约十倍、或至少约15倍、或至少20倍或以上。类似地，BPXTEN融合蛋白可具有AUC增加，且与不连接至融合蛋白的相应BP相比，AUC增加至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约150％、或至少约200％、或至少约300％。BPXTEN的药物动力学参数可通过标准方法测定，所述标准方法包括给药、在时间间隔获取血液样品及使用ELISA、HPLC、放射性分析或本领域已知或如本文所描述的其他方法分析蛋白质，接着对数据进行标准计算以导出半衰期及其他PK参数。
本发明进一步提供包含第一及第二BP分子的BPXTEN，其任选通过可进一步包含裂解序列之间隔子序列分离或通过第二XTEN序列分离。在一个实施方案中，与不连接至融合蛋白的相应BP相比，当连接至融合蛋白时BP具有较小活性。在此类情况下，BPXTEN可经设计以使得在向受试者施用时，BP组分通过裂解序列的裂解逐渐释放，因此其恢复活性或结合至其目标受体或配位体的能力。因此，相比于不连接至融合蛋白的BP，前述BPXTEN充当前药或循环储存物，产生更长的终末半衰期。
如本文所描述，在例示性实施方案中，BPXTEN为XPAC，其中BP为细胞因子。在优选实施方案中，在XPAC的上下文中，细胞因子多肽的活性减弱，且在所需活性位点处(诸如在肿瘤微环境中)的蛋白酶裂解自XPAC释放出一种细胞因子形式，其作为细胞因子受体激动剂比XPAC更具活性。举例而言，融合多肽的细胞因子受体活化(激动剂)活性可比作为单独分子实体的细胞因子多肽的细胞因子受体活化活性小至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍或至少约1000倍。作为XPAC的一部分的细胞因子多肽在含有与细胞因子多肽基本相同的氨基酸且基本上不包括额外氨基酸且不与其他分子(通过共价或非共价键)相关时，作为单独的分子实体存在。必要时，作为单独分子实体的细胞因子多肽可包括一些额外氨基酸序列(诸如标签或短序列)以辅助表达和/或纯化。
在其他实施例中，融合多肽的细胞因子受体活化(激动剂)活性比含有由XPAC中的蛋白酶可裂解接头裂解产生的细胞因子多肽的多肽的细胞因子受体活化活性小至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍或约1000倍。换言之，含有由XPAC中蛋白酶可裂解接头的裂解产生的细胞因子多肽的多肽的细胞因子受体活化(激动剂)活性比XPAC的细胞因子受体活化活性大至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍或至少约1000倍。
BPXTEN的药理学和药物特性
本发明提供包含共价连接至XTEN的BP的BPXTEN组合物，与不连接至XTEN的BP相比，可具有增强的特性，以及增强组合物的相应两种BP组分的治疗和/或生物活性或效应的方法。此外，本发明提供BPXTEN组合物，其相比于含有免疫球蛋白多肽搭配物、具有较短长度的多肽和/或具有重复序列的多肽搭配物的那些本领域已知的融合蛋白具有增强的特性。另外，BPXTEN融合蛋白提供优于化学结合物(诸如聚乙二醇化构建体)的显著优势，尤其重组BPXTEN融合蛋白可在细菌细胞表达系统中制备的事实，其可在产品的研究及研发及制造阶段两者处减少时间及成本，且与聚乙二醇化结合物相比，产生更均质更明确的产品，且BPXTEN的产物及代谢物具有较小毒性。
作为治疗剂，BPXTEN可能与不包含XTEN的治疗剂相比具有许多优势，包括例如，溶解度增加、热稳定性增加、免疫原性降低、表观分子量增加、肾清除率降低、蛋白分解降低、代谢降低、治疗效率提高、有效治疗剂量降低、生物可用性增加、以将血液水平维持在BP的治疗窗内的剂量之间的时间增加、吸收速度“调适”、冻干稳定性提高、血清/血浆稳定性增强、终末半衰期增加、在血流中的溶解度增加、中和抗体的结合减少、受体介导的清除率降低、副作用减少、保留受体/配位体结合亲和力或受体/配位体活化、降解稳定性、冻融稳定性、蛋白酶稳定性、泛素化稳定性、易于施用、与其他药物赋形剂或载剂的兼容性、在受试者中的持久性、储存稳定性增加(例如储存期限增加)、在生物体或环境中的毒性减少等。增强的特性的净效应为当向患有代谢疾病或病症的受试者施用时，BPXTEN可引起增强的治疗和/或生物效应。
在其中需要增强BP的药物或物理化学特性(诸如水溶性或稳定性程度)的其他情况下，第一及第二融合蛋白的第一XTEN序列及第二XTEN序列的长度和/或模体家族组合物可各自经选择以赋予相应融合蛋白不同程度的溶解度和/或稳定性以使得BPXTEN组合物的总体药物特性增强。可使用本文所描述的方法构建及分析BPXTEN融合蛋白以确认物理化学特性且视需要调节XTEN以产生所需特性。在一个实施方案中，BPXTEN的XTEN序列经选择以使得融合蛋白相比于不连接至融合蛋白的BP具有大至少约25％内的水溶性，比不连接至融合蛋白的相应BP大或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约100％、或至少约200％、或至少约300％、或至少约400％、或至少约500％或至少约1000％。在此段落中所描述的上文实施方案中，融合蛋白的XTEN可与选自表2a-2b的XTEN具有至少约80％序列一致性，或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％序列一致性。
在一个实施方案中，本发明提供BPXTEN组合物，其与不连接至XTEN的可比剂量的相应BP相比，可在治疗窗内维持BP组分持续较长时段。在本领域应理解，BPXTEN融合蛋白的“可比剂量”将表示更大重量的试剂，但在融合蛋白的剂量中将具有相同的BP摩尔当量和/或相对于BP将具有相同的近似摩尔浓度。
本发明还提供选择适合于结合的XTEN以提供所需药物动力学特性的方法，当与剂量选择匹配时，所述方法通过在治疗窗内维持BP的循环浓度用以增强的时间段来实现所施用组合物的增加的功效。如本文所用，“治疗窗”是指血液或血浆浓度范围的药物或生物制剂的量，其随时间推移向疾病或病况提供功效或所需药理学作用且无不可接受的毒性；介于在达成任何积极治疗作用的最小量以及导致反应的最大量之间的循环血液浓度的范围，该反应为受试者即将具有毒性之前的反应(以较高剂量或浓度)。另外，治疗窗一般涵盖时间方面；随时间推移产生所需药理学作用的最大及最小浓度，其不产生不可接受的毒性或不良事件。保持在受试者的治疗窗内的给药组合物亦可称为在“安全范围”内。
剂量优化对于所有药物而言为重要的，尤其对于具有狭窄治疗窗的药物而言。举例而言，涉及葡萄糖稳态的许多肽具有狭窄治疗窗。对于具有狭窄治疗窗的BP，诸如升糖素或升糖素类似物，所有呈现多种症状的患者的标准化单次剂量可能未必总是有效的。由于不同葡萄糖调节肽通常一起用于治疗糖尿病受试者，故必须亦考虑通过组合及将其一起给药来达成的各者及互动作用的效能。这些因素的考虑完全在一般熟练临床医师的范围内，以测定BPXTEN的治疗或药理学有效量，而非导致不可接受的毒性且将其置于安全范围外的量。
在多数情况下，已建立用于本发明组合物的BP组分的治疗窗且其可用于公开文献中或陈述于含有BP的经批准产品的药物标签上。在其他情况下，可建立治疗窗。建立给定组合物的治疗窗的方法已为本领域技术人员所知(参见例如，Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,第11版,McGraw-Hill(2005))。举例而言，通过在患有目标疾病或病症的受试者中使用剂量递增研究确定功效或所需药理学效应、不良事件的出现及循环血液水平的确定，可确定给定受试者或受试者群体的治疗窗用于给定药物或生物制剂或生物制剂的组合。剂量递增研究可经由受试者或受试者群组中的代谢研究评估BPXTEN的活性，所述受试者或受试者群组监视如本领域已知或如本文所描述的生理或生物化学参数以获得与代谢疾病或病症相关的一个或多个参数，或与特定适应症的有益结果相关的临床参数，以及观测和/或所量测以测定无效剂量、不良事件、最大耐受剂量等的参数，以及建立确定或衍生的循环血液水平的药物动力学参数的量测。结果可随后与所施用的剂量及治疗剂的与前述所测定的参数或作用水平一致的血液浓度相关。通过这些方法，一系列剂量及血液浓度可与最小有效剂量以及出现所需作用的最大剂量及血液浓度及超过以上则产生毒性相关，由这是所给药的治疗剂建立治疗窗。大于最大值的融合蛋白的血液浓度(或如通过BP组分所量测)将视为在治疗窗或安全范围外。因此，通过前述方法，将确立Cmin血液水平，低于该水平则BPXTEN融合蛋白将不具有所需药理学作用，且将确立Cmax血液水平，其在达到将引发不可接受的副作用、毒性或不良事件的浓度之前将表示最高循环浓度，使其置于BPXTEN的安全范围外。在确立此类浓度下，给药的频率及剂量可通过量测Cmax及Cmin来进一步优化，以提供适当剂量及给药频率以使融合蛋白保持在治疗窗内。本领域技术人员可通过本文所公开的手段或通过本领域已知的其他方法证实所施用的BPXTEN在治疗窗中保持所需间隔、或需要调节XTEN的剂量或长度或序列。此外，确定治疗窗内的保持BPXTEN的适当剂量及给药频率会建立治疗有效剂量方案；使用治疗有效剂量的融合蛋白向有需要的受试者施用多个连续剂量的排程会产生保持在治疗窗内的连续Cmax峰值和/或Cmin谷值，且引起与目标疾病、病症或病况相关的至少一种量测参数的改良。在一些情况下，与不连接至XTEN且以可比剂量施用的相应BP相比，以适当剂量向受试者施用的BPXTEN可使BPXTEN融合蛋白的血液浓度在治疗窗内维持至少约两倍长的时间；与不连接至XTEN且以可比剂量施用的相应BP相比，维持或者至少约三倍长、或者至少约四倍长、或者至少约五倍长、或者至少约六倍长、或者至少约七倍长、或者至少约八倍长、或者至少约九倍长、或至少约十倍长或更长的时间。如本文所用，“适当剂量”是指在向受试者施用时将在治疗窗内产生所需治疗或药理学效应及血液浓度的药物或生物制剂的剂量。
在一个实施方案中，与不连接至融合蛋白且以可比剂量方案向受试者施用的相应融合蛋白的生物活性蛋白相比，以治疗有效剂量方案施用的BPXTEN在融合蛋白的血液水平的至少两个连续Cmax峰值和/或Cmin谷值之间产生至少约三倍长、或者至少约四倍长、或者至少约五倍长、或者至少约六倍长、或者至少约七倍长、或者至少约八倍长、或者至少约九倍长、或至少约十倍长的时间增益。在另一实施方案中，与不连接至融合蛋白且使用BP的治疗有效剂量方案向受试者施用的相应生物活性蛋白组分相比，使用较不频繁给药或较低摩尔总剂量的药物组合物的融合蛋白以治疗有效剂量方案中施用的BPXTEN使一个、或两个、或三个或更多个量测参数产生可比的改良。所量测的参数可包括本文所公开的临床、生化或生理参数中的任一者，或本领域已知用于评定患有葡萄糖或胰岛素相关病症、代谢疾病或病症、凝血或出血病症或生长激素相关病症的受试者的其他参数。
本发明的BPXTEN组合物的活性，包括功能特征或生物及药理学活性及结果参数，可通过本领域已知用于量测所需特征的任何适合的筛选分析测定。包含BP组分的BPXTEN多肽的活性及结构可通过本文所描述的分析或通过本领域已知的方法量测以确定溶解度、结构及生物活性的保持程度。可进行分析以允许测定BPXTEN对BP受体或配位体的结合特征，包括结合常数(Kd)、EC50值以及配位体-受体错合物解离的半衰期(T1/2)。结合亲和力可例如通过竞争型结合分析量测，该竞争型结合分析检测特异性结合至受体或配位体的能力的变化。另外，诸如流式细胞量测术或表面等离子共振的技术可用于检测结合事件。分析可包含可溶受体分子，或可测定与细胞表达受体的结合。此类分析可包括基于细胞的分析，包括关于增殖、细胞死亡、细胞凋亡及细胞迁移的分析。其他可能的分析可测定所表达的多肽的受体结合，其中该分析可包含可溶性受体分子，或可测定与细胞表达的受体的结合。BPXTEN对于相应BP的目标受体或配位体的结合亲和力可使用结合或竞争性结合分析进行分析，诸如通过芯片结合受体或结合蛋白的Biacore分析或如美国专利5,534,617中所描述的ELISA分析、本文实施例中所描述的分析、放射性受体分析或本领域已知的其他分析。另外，可使用竞争性ELISA结合分析比较BP序列变体(以单一组分或以BPXTEN融合蛋白形式分析)与天然BP以测定其与天然BP或其某一部分是否具有相同结合特异性及亲和力，使得其适用于包括于BPXTEN中。
本发明提供经分离的BPXTEN，其中BPXTEN对于BP目标受体或配位体的结合亲和力可为未结合于XTEN的天然BP对目标受体或配位体的亲和力的至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％、或至少约100％或更多。在一些情况下，本发明BPXTEN与该BPXTEN的天然受体或配位体之间的结合亲和力Kd为BPXTEN与天然受体或配位体之间的亲和力的至少约10-4M、或者至少约10-5M、或者至少约10-6M、或至少约10-7M。
在一些实施方案中，在本申请的组合物(诸如融合蛋白)包含细胞因子的情况下，细胞因子(当连接至融合蛋白中的XTEN时)与相应细胞因子受体的结合活性可通过半最大有效浓度(EC50)表征，该半最大有效浓度比表征细胞因子(当不连接至XTEN时)的相应结合活性的EC50大至少(约)1.1倍、大至少(约)1.2倍、大至少(约)1.3倍、大至少(约)1.4倍、大至少(约)1.5倍、大至少(约)1.6倍、大至少(约)1.7倍、大至少(约)1.8倍、大至少(约)1.9倍或大至少(约)2.0倍。在一些实施方案中，细胞因子(当连接至融合蛋白中的XTEN时)与相应细胞因子受体的结合活性可通过半最大有效浓度(EC50)表征，该半最大有效浓度比表征细胞因子(当不连接至XTEN时)的相应结合活性的EC50大(约)1.1倍、大(约)1.2倍、大(约)1.3倍、大(约)1.4倍、大(约)1.5倍、大(约)1.6倍、大(约)1.7倍、大(约)1.8倍、大(约)1.9倍或大(约)2.0倍，或介于上述两者之间的范围。在一些实施方案中，可在体外结合分析中测定EC50值。在一些实施方案中，细胞因子可为白介素12(IL-12)，且相应细胞因子受体可为白介素12受体(IL-12R)。在一些实施方案中，体外结合分析可利用基因工程改造的报导基因细胞株，该细胞株经构型成以报导蛋白的成比例表达对该细胞因子与该相应细胞因子受体的结合作出反应。术语“EC50”一般是指实现活性物质最大生物反应之一半所需的浓度，且可一般通过ELISA或基于细胞的分析测定，包括本文所描述的实施例的方法。在一些实施方案中，体外结合分析可为报导基因活性分析(诸如实施例8中所公开的分析)。举例而言，例示性报导基因活性分析可基于经基因工程改造的细胞，其通过稳定地引入所关注受体及所关注信号传导路径的相关基因，使得与经工程改造的受体结合触发引起经工程化基因路径的活化的信号级联产生以及后续产生标签多肽(诸如酶)。
在其他情况下，本发明提供经分离的BPXTEN，其中融合蛋白经设计而以高亲和力结合至目标受体，由此产生对天然配位体的拮抗活性。此类BPXTEN的非限制性实施例为IL-1raXTEN，其经构型以结合至IL-1受体，使得结合的组合物实质上干扰IL-1α和/或IL-1β与IL-1受体的结合。在某些情况下，拮抗剂BPXTEN(诸如但不限于IL-1raXTEN)对天然配体与目标受体的结合的干扰可为至少约1％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约99％、或约100％。在其他实施方案中，本发明提供经分离的BPXTEN融合蛋白(诸如但不限于IL-1raXTEN)，其中相比于通过天然配位体诱发的那些，经分离的融合蛋白与细胞受体的结合引发小于20％、或小于10％、或小于5％的具有结合的BPXTEN拮抗剂的细胞的信号传导路径的活化。在其他情况下，拮抗性BPXTEN组合物以约10nM或更小、约5nM或更小、约1nM或更小、约500pM或更小、约250pM或更小、约100pM或更小、约50pM或更小或约25pM或更小的解离常数结合至目标受体。拮抗性BPXTEN的特定构建体的非限制性实施例可包括IL-1ra-AM875、IL-1ra-AE864或IL-1ra-AM1296。
在一些情况下，本发明的BPXTEN融合蛋白在已知的或与使用天然BP治疗及预防代谢病况及病症有关的体外生物活性或药理学效应方面，保留未与融合蛋白连接的相应BP的生物活性的至少约10％、或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在前述实施方案的一些情况下，BP组分的活性可由完整的BPXTEN融合蛋白显现，而在其他情况下，BP组分的活性将主要通过作用于并入至BPXTEN融合蛋白中的裂解序列的蛋白酶的作用下，自融合蛋白中裂解及释放时显现。在前述内容中，如图3A-图3E中所说明，BPXTEN可经设计以在当连接至XTEN时降低BP组分对受体或配位体的结合亲和力，但当经由并入至BPXTEN序列中的裂解序列的裂解自XTEN释放时具有增加的亲和力，如上文所更充分描述。
在其他情况下，BPXTEN经设计以在连接至XTEN时降低BP组分的结合亲和力，以例如通过降低受体介导的清除率或降低归因于所施用的组合物的毒性或副作用来增加向受试者施用的BPXTEN的终末半衰期。在不连接至XTEN的BP的毒理学无效剂量或血液浓度较低(是指天然肽具有导致副作用的高可能性)的情况下，本发明提供其中融合蛋白经构型以降低BP组分的生物效能或活性的BPXTEN融合蛋白。
在一些情况下，已发现相比于BPXTEN的活性，BPXTEN可经构型以具有基本上降低的结合亲和力(以Kd表示)及相应降低的生物活性，其中构型不引起相应BP组分的结合亲和力降低，且此类构型就具有显示长终末半衰期且保留足够程度的生物活性的组合物而言是有利的。与XTEN结合至C端的构建体相比，将单一XTEN连接至BP(例如IL-10)的C端可产生针对其目标受体的显著结合亲和力的保留，将XTEN连接至N端降低其结合亲和力及相应生物活性。在另一实施例中，如实施例中所描述，已发现，虽然BP连接至XTEN分子的C端并不实质上干扰与BP受体的结合，但将第二XTEN添加至相同分子的C端(将第二XTEN置放至hGH的C端)降低分子与BP受体的亲和力，且亦使得相比于XTEN-BP构型，XTEN-BP-XTEN构型的终末半衰期增加。降低BP与其目标受体的结合亲和力的能力可视对于特定BP具有游离N端或C端的要求而定。因此，本发明提供一种通过产生具有包含至少第一生物活性蛋白及一个或多个XTEN的组分的特定N端至C端构型的单链融合蛋白构建体来增加BPXTEN的终末半衰期的方法，其中生物活性蛋白及XTEN组分的第一N端至C端构型中的融合蛋白与第二N端至C端构型中的BPXTEN相比具有减少的受体介导的清除率(RMC)及相应的终末半衰期增加。在以上的一个实施方案中，BPXTEN经N端至C端构型成BP-XTEN。在以上另一实施方案中，BPXTEN经构型成XTEN-BP。在以上另一实施方案中，BPXTEN经构型成XTEN-BP-XTEN。在后一实施方案中，两个XTEN分子可相同或其可具有不同序列组成或长度。具有两个连接至单一BP的XTEN之前述实施方案的非限制性实施例。具有一个连接至一个XTEN的BP之前述实施方案的非限制性实施例包括AM875-IL-1ra、AE864-IL-1ra、AM875-IL10或AE864-IL10。本发明涵盖其他此类构建体，其中来自表3或表A的BP及来自表2a-2b的XTEN取代前述实施例的相应组分，且经构型以使得构建体与相应组分的替代构型相比，具有降低的受体介导的清除率。
在一些情况下，该方法提供经构型的BPXTEN，其中经减少的受体介导的清除率可使得终末半衰期与第二构型(其中RMC不减少)中的BPXTEN的半衰期相比增加至少两倍、或至少三倍、或至少四倍、或至少五倍。本发明利用BP配位体，其中由于降低的缔合速率或增加的解离速率而降低对受体的结合亲和力可通过阻碍N端或C端且使用彼末端作为与组合物的另一多肽的键联(无论另一BP、XTEN或间隔子序列)来实现。BPXTEN融合蛋白的特定构型的选择可降低与受体的结合亲和力的程度，使得可达成受体介导的清除率的降低。一般而言，受体活化与RMC耦合以使得多肽与其受体在无活化的情况下的结合不产生RMC，而受体活化产生RMC。然而，在一些情况下，尤其在配位体具有增加的解离速率时，配位体可仍然能够充分结合以起始细胞信号传导而不触发受体介导的清除率，其中最终结果为BPXTEN保持生物可用。在此类情况下，经构型的BPXTEN与产生较高程度的RMC的那些构型相比具有增加的半衰期。
在需要降低结合亲和力以便降低受体介导的清除率但需要保持至少一部分生物活性的情况下，应清楚，仍然必须维持足以获得所需受体活化的结合亲和力。因此，在一个实施方案中，本发明提供经构型BPXTEN，以使得与其中结合亲和力不降低的构型中的相应BPXTEN相比，经构型BPXTEN对于目标受体的结合亲和力为结合亲和力的约0.01％至40％，或约0.1％至30％，或约1％至20％范围内。与其中BP组分与目标受体的结合亲和力不降低的构型中的相应BPXTEN的结合亲和力相比，或与不连接至融合蛋白的BP相比，在可比条件下测定，经构型的BXTEN的结合亲和力因此优选降低至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％、或至少约99.9％、或至少约99.99％。以不同方式表达，经构型的BPXTEN的BP组分可具有结合亲和力，该结合亲和力小至其中BP组分的结合亲和力不降低的构型中的BPXTEN的相应BP组分的结合亲和力的约0.01％、或至少约0.1％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约3％、或至少约4％、或至少约5％、或至少约10％、或至少约20％。在此段落中所描述的上文前述实施方案中，与对应天然BP或具有其中相应BP组分的结合亲和力不降低的构型的BPXTEN相比，经构型的BPXTEN对目标受体的结合亲和力将“基本上降低”。因此，本发明提供组合物及通过构型BPXTEN以产生RMC降低的组合物的方法，以便能够结合及活化足够数目的受体以获得所需体内生物反应，同时避免活化更多获得此类反应所需数目的受体。在一个实施方案中，BPXTEN经构型以使得本发明BP在BPXTEN的N端处，其中与经构型有连接至XTEN的C端的本发明BP且天然BP的生物活性的至少一部分保留的BPXTEN相比，所施用的BPXTEN的RMC降低。在另一实施方案中，BPXTEN经构型以使得本发明BP在BPXTEN的C端处，其中与经构型有本发明BP位于BPXTEN的N端处且天然BP的生物活性的至少一部分保留的BPXTEN相比，所施用的BPXTEN的RMC降低。在另一实施方案中，BPXTEN经N端至C端构型为XTEN-BP-XTEN，其中与经构型有一个XTEN且天然BP的生物活性的至少一部分保留的BPXTEN相比，所施用的BPXTEN的RMC降低。本领域技术人员将显而易见，本发明涵盖实现此特性的其他构型；例如添加BP的第二分子或间隔子序列。在此段落中所描述的上文前述实施方案中，与其中BP组分的结合亲和力及RMC不降低的经构型的BPXTEN相比，BPXTEN的半衰期可为增加至少约50％、或至少约75、或至少约100％、或至少约150％、或至少约200％、或至少约300％。在此段落中所描述的上文前述实施方案中，与不连接至XTEN的BP相比或与其中BP组分对受体保持与天然BP相当的结合亲和力的BPXTEN构型相比，增加的半衰期可准许较高剂量及降低的给药频率。
特定体内及离体生物分析亦可用于评估待并入至BPXTEN中的各经构型的BPXTEN和/或BP组分的生物活性。举例而言，胰脏β细胞的胰岛素分泌和/或转录的增加可通过本领域已知的方法量测。组织的葡萄糖摄取亦可通过诸如葡萄糖夹钳检定及其类似者的方法评估。适合于评估所施用的BPXTEN融合蛋白在治疗代谢疾病及病症中的活性的其他体内及离体参数包括空腹葡萄糖含量、餐后葡萄糖含量、葡萄糖稳态、对口服葡萄糖耐受性测试的反应、胰岛素攻击的反应、HA1c、热量摄入、饱腹感、胃排空速率、胰脏分泌、胰岛素分泌、外周组织胰岛素敏感度、β细胞质量、β细胞破坏、血脂含量或曲线、身体质量指数或体重。基于这些分析或本领域已知的其他分析的结果，可确认或调节(若需要)及再分析BPXTEN构型或组合物以确认目标结合亲和力或生物活性。
用于量测所表达蛋白质的物理及结构特性的特定分析及方法为本领域已知的，包括用于测定特性，诸如蛋白质聚集、溶解度、二级及三级结构、熔融特性、污染及水含量等的方法。此类方法包括分析型离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻色谱法、反相HPLC、光散射、毛细电泳法、圆二色性、差示扫描热量测定、荧光、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光谱法(Raman spectroscopy)、折射法及UV/可见光谱法。其他方法公开于Arnau等人,Prot Expr and Purif(2006)48,1-13中。在本发明中应用这些方法将在本领域技术人员的掌握范围内。
本发明的组合物的用途
在另一方面中，本发明提供一种用于在由BP介导的疾病、病症或病况中达成有益效应的方法。本发明解决BP的缺点和/或局限性，其在最小有效剂量与最大耐受剂量之间具有相对短的终末半衰期和/或狭窄治疗窗。
在一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中达成有益效应的方法，其包含向受试者施用治疗或预防有效量的BPXTEN的步骤。有效量可在帮助治疗疾病或病症方面产生有益效应。在一些情况下，实现有益效应的方法可包括施用治疗有效量的BPXTEN融合蛋白组合物以治疗患病的受试者。
在一个实施方案中，该方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含BPXTEN融合蛋白组合物，该组合物包含连接至XTEN序列的BP以及至少一种药学上可接受的载剂，与由施用包含与不连接至XTEN且以可比剂量施用的BP的药物组合物介导的效应相比，使得由BP组分介导的至少一个参数，生理条件或临床结果的改善更大。在一个实施方案中，药物组合物以治疗有效剂量施用。在另一实施方案中，药物组合物使用多个连续剂量在给药期时长内使用治疗有效剂量方案(如本文所定义)施用。
由于如本文所描述的BPXTEN的增强PK参数，与不连接至XTEN的相应BP相比，可使用更长的剂量之间之间隔来施用BP以预防、治疗、缓解、逆转或改善代谢疾病、病症或病况的症状或临床异常或延长所治疗受试者的存活期。
本发明的方法可包括施用连续剂量的治疗有效量的BPXTEN持续足以达成和/或维持所需参数或临床效应的时间段，且治疗有效量的此类连续剂量建立针对BPXTEN的治疗有效剂量方案；例如融合蛋白组合物的连续施用剂量的排程，其中所述剂量为以治疗有效量给与以对任何临床征象或症状、方面、所量测的代谢疾病状态或病况的参数或特征(包括但不限于本文所描述的那些)产生持久有益效应。
BPXTEN的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别及体重以及抗体或抗体部分在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦为BPXTEN的治疗有益效应超过其任何毒性或有害效应的量。预防有效量是指达成所需预防结果必需的时间段所需的BPXTEN的量。
对于本发明方法，较长效的BPXTEN组合物优选，以改良患者便利性，以增加剂量之间的时间间隔及减少达成持续效应所需的药物的量。在一个实施方案中，治疗方法包含向有需要的受试者施用治疗有效剂量的BPXTEN，与不连接至融合蛋白且以可比剂量向受试者施用的相应BP组分相比，其产生在针对组合物的融合蛋白建立的治疗窗内花费的时间增益。在一些情况下，治疗窗内花费的时间增益与不连接至融合蛋白且以可比剂量向受试者施用的相应BP组分相比为至少约三倍、或至少约四倍、或至少约五倍、或至少约六倍、或至少约八倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍。所述方法进一步提供使用治疗有效剂量方案向有需要的受试者施用多个连续剂量的BPXTEN，与不连接至融合蛋白且使用针对BP建立的剂量方案施用的相应BP组分相比，可在融合蛋白的血液水平的连续Cmax峰值和/或Cmin谷值之间产生时间增益。在前述实施方案中，与不连接至融合蛋白且使用针对BP建立的剂量方案施用的相应BP组分相比，连续Cmax峰值和/或Cmin谷值之间的花费的时间增益可为至少约三倍、或至少约四倍、或至少约五倍、或至少约六倍、或至少约八倍、或至少约10倍、或至少约20倍或至少约40倍。在此段落中所描述的上文所描述的实施方案中，与不连接至融合蛋白且以可比单位剂量或剂量方案向受试者施用的相应BP组分相比，使用较低摩尔单位剂量的融合蛋白施用融合蛋白可使得参数(本文中公开为适用于评估本发明疾病、病况或病症)中的至少一者得到改善。
在一个实施方案中，BPXTEN可具有使得临床、生物化学或生理参数中之一者得到改善的活性，该活性大于不连接至XTEN的BP组分的活性，使用相同分析或基于所量测临床参数来测定。在另一实施方案中，BPXTEN可在两个或更多个临床或代谢相关参数(例如糖尿病受试者中的葡萄糖稳态及体重控制，或血友病受试者中的凝血酶原及出血时间减少，或生长激素缺乏受试者中的肌肉质量及骨密度增加)中具有活性，各自由不同BP中之一者介导，所述BP共同地产生与不连接至XTEN的BP组分相比增强的效应，使用相同分析或基于所量测临床参数来测定。在另一实施方案中，施用BPXTEN可使得临床或生化或生理参数中之一或多者中的活性的持续时间比不连接至XTEN的单一BP组分中之一者的活性的持续时间要长，使用相同分析或基于所量测临床参数来测定。
在一些实施方案中，本申请提供一种治疗或预防受试者的疾病或病况的方法，该方法包含向受试者施用治疗有效量的融合蛋白或包含该融合蛋白的组合物，以上所有均公开于本文中。在一些实施方案中，疾病或病况可为癌症或癌症相关疾病或病况或发炎性或自体免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病或病况可为癌症或癌症相关疾病或病况。在一些实施方案中，疾病或病况可为癌症或癌症相关疾病或病况。必要时，本发明融合物及组合物可与治疗有效量的至少一种免疫检查点抑制剂结合使用。
本发明进一步涵盖根据本文所提供的方法使用的BPXTEN可与适用于治疗以下的其他治疗方法及药物组合物一起施用：癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、全身性红斑狼疮、阿尔茨海默氏症、精神分裂症、病毒感染(例如，慢性C型肝炎、AIDS)、过敏性哮喘、视网膜神经退化性过程、代谢病症、胰岛素抗性及糖尿病性心肌症、发炎性病况及自体免疫性病况。
在一些情况下，施用BPXTEN可准许使用较低剂量的共施用的药物组合物来实现受试者中的疾病、病症或病况的相当临床效应或量测参数。
尽管有前述规定，但在某些实施方案中，根据本发明的方法使用的BPXTEN可预防或延迟在患有葡萄糖相关疾病、代谢疾病或病症、凝血病症或生长激素缺乏或生长病症的受试者中对额外治疗方法或使用药物或其他药物组合物的需要。在其他实施方案中，BPXTEN可减少治疗潜在疾病、病症或病况所需的额外治疗方法或药物或其他药物组合物的量、频率或持续时间。
在另一方面中，本发明提供一种设计具有所需药理学或药物特性的BPXTEN组合物的方法。设计及制备BPXTEN融合蛋白考虑到各种目标(相比于不连接至融合蛋白的BP组分)，包括改良用于治疗代谢疾病或病症的治疗功效，增强与BP相比融合蛋白的药物动力学特征，降低达成药理学效应所需的剂量或给药频率，增强药物特性，且增强BP组分保持在治疗窗内延长时段的能力。
一般而言，设计及生产融合蛋白及本发明组合物中的步骤可如图4至6中所示，包括：(1)选择BP(例如天然蛋白质、肽激素、具有活性的肽类似物或衍生物、肽片段等)以治疗特定疾病、病症或病况；(2)选择将赋予所得BPXTEN所需PK及物理化学特征的XTEN(例如向受试者施用组合物使得融合蛋白与不连接至XTEN的BP相比具有维持在治疗窗内持续较大时段)；(3)建立BPXTEN的所需N端至C端构型以达成所需功效或PK参数；(4)建立编码经构型的BPXTEN的表达载体的设计；(5)用表达载体转化适合的宿主；及(6)表达及回收所得融合蛋白。对于需要增加半衰期(大于16小时)或增加在治疗窗内花费的时间段的那些BPXTEN，经选择用于并入的XTEN将一般具有至少约500个、或约576个、或约864个、或约875个、或约913个、或约924个氨基酸残基，其中单一XTEN将并入至BPXTEN中。在另一实施方案中，BPXTEN可包含前述长度的第一XTEN，及约144个、或约288个、或约576个、或约864个、或约875个、或约913个、或约924个氨基酸残基的第二XTEN。
在其他情况下，在不需要增加半衰期但需要增加药物特性(例如溶解度)的情况下，BPXTEN可经设计以包括较短长度的XTEN。在前述的一些实施方案中，BPXTEN可包含连接至XTEN的BP，该XTEN具有至少约24个、或约36个、或约48个、或约60个、或约72个、或约84个、或约96个氨基酸残基，其中在生理条件下融合蛋白的溶解度比与连接至XTEN的相应BP的溶解度大至少三倍，或者比连接至XTEN的升糖素大至少四倍、或五倍、或六倍、或七倍、或八倍、或九倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少50倍、或至少60倍。在另其他情况下，其中需要含葡萄糖的BPXTEN融合蛋白的半衰期为2至6小时(例如在治疗夜间低血糖中)，融合蛋白可设计成具有中等长度的XTEN，所述中等长度诸如含升糖素的BPXTEN组分中约100个氨基酸、或约144个氨基酸、或约156个氨基酸、或约168个氨基酸、或约180个氨基酸、或约196个氨基酸。
在另一方面中，本发明提供制备BPXTEN组合物以与天然BP相比改良制造简易性、产生增加的稳定性、增加的水溶解度和/或调配简易性的方法。在一个实施方案中，本发明包括增加BP的水溶解度的方法，其包含以下步骤：将BP连接至一个或多个XTEN，使得与未融合状态下的BP相比，可在生理条件下达成呈可溶形式的所得BPXTEN的较高浓度。当并入至融合蛋白中时，促成XTEN的特性以赋予BP增加的水溶解度的因素包括XTEN融合搭配物的高溶解度及XTEN在溶液中的分子之间的低程度的自身聚集。在一些实施方案中，本方法产生BPXTEN融合蛋白，其中与未稠合的BP相比，水溶解度为至少约50％、或至少约60％大、或至少约70％大、或至少约80％大、或至少约90％大、或至少约100％大、或至少约150％大、或至少约200％大、或至少约400％大、或至少约600％大、或至少约800％大、或至少约1000％大、或至少约2000％大、或至少约4000％大、或至少约6000％大。
在另一实施方案中，本发明包括一种增加BP的储存期限的方法，其包含以下步骤：将BP与经选择的一个或多个XTEN连接以使得所得BPXTEN的储存期限与呈未融合状态的BP相比延长。如本文所用，储存期限是指在溶液中或在一些其他储存调配物中的BP或BPXTEN的功能活性保持稳定而无不当活性损失的时间段。如本文所使用，“功能活性”是指药理学效应或生物活性，诸如结合受体或配位体的、或酶活性、或显示与BP相关的一种或多种已知功能活性的能力，如本领域已知。降解或聚集的BP与保留在溶液中的BP相比通常具有降低的功能活性或降低的生物可用性。当并入至融合蛋白中时，促成延长BP的储存期限的方法的能力的因素包括增加的水溶解度、减少的溶液中的自身聚集及增加的XTEN融合搭配物的热稳定性。特别是，XTEN聚集物的低趋向促进调配含有较高药物浓度的BP的药物制剂的方法，且XTEN的热稳定性促成BPXTEN融合蛋白的特性以长时间保持可溶及功能活性。在一个实施方案中，该方法产生具有“长期”或“延长”储存期限的BPXTEN融合蛋白，其相对于已经受相同储存及处理条件的标准物展现出更大的活性。标准物可为未稠合的全长BP。在一个实施方案中，该方法包括用一种或多种药学上可接受的赋形剂调配经分离的BPXTEN的步骤，该一种或多种药学上可接受的赋形剂增强XTEN保留其非结构化构象的能力，且使得BPXTEN在调配物中保持可溶的时间大于相应未融合的BP的时间。在一个实施方案中，该方法涵盖连接BP与XTEN以产生BPXTEN融合蛋白，使得溶液在给定时间点且当经历与标准物相同的储存及处理条件时，保持大于约100％的标准物的功能活性，或大于约105％、110％、120％、130％、150％或200％的标准物的功能活性，由此增强其储存期限。
还可就储存之后剩余的功能活性而言评估储存期限，标准化为储存开始时的功能活性。具有如通过长期或延长的功能活性展现的长期或延长的储存期限的本发明的BPXTEN融合蛋白当经历相同条件持续相同时间段时，可保留不连接至XTEN的等效BP的约50％的功能活性、或约60％、70％、80％或90％更多的功能活性。举例而言，包含融合至XTEN序列的肠促胰岛素类似物-4(exendin-4)或升糖素的本发明的BPXTEN融合蛋白可在各种温度条件下在溶液中保持其初始活性的约80％或更多，持续多达5周或更多的时段。在一些实施方案中，当在80℃下加热10分钟时，BPXTEN在溶液中保留其初始活性的至少约50％、或约60％、或至少约70％、或至少约80％、且最佳至少约90％或更多。在其他实施方案中，当在37℃下加热或维持约7天时，BPXTEN在溶液中保留其初始活性的至少约50％、优选至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或者至少约90％或更多。在另一实施方案中，BPXTEN融合蛋白在约30℃至约70℃的温度下暴露约一小时至约18小时的时段之后，保留其功能活性的至少约80％或更多。在此段落中所描述的上文前述实施方案中，BPXTEN的保留活性在给定时间点与不连接至融合蛋白的相应BP的保留活性相比大至少约两倍、或至少约三倍、或至少约四倍、或至少约五倍、或至少约六倍。
本发明的DNA序列
本发明提供编码BPXTEN嵌合多肽的经分离聚核酸及与编码BPXTEN嵌合多肽的聚核酸分子互补的序列，包括同源变体。在另一方面中，本发明涵盖方法，该方法产生编码BPXTEN嵌合多肽的聚核酸及与编码BPXTEN嵌合多肽的聚核酸分子互补的序列，包括同源变体。一般而言，且如图4至6中所示，产生编码BPXTEN融合蛋白的聚核苷酸序列且表达所得基因产物的方法包括组装编码BP及XTEN的核苷酸；将所述组分连接于框架中；将该编码基因并入至适当表达载体中；用表达载体转化适当宿主细胞；及使融合蛋白表达于经转化的宿主细胞中，由此产生生物活性BPXTEN多肽。分子生物学中的标准重组技术可用于制造本发明的聚核苷酸及表达载体。
根据本发明，编码BPXTEN的核酸序列可用于产生导引适当宿主细胞中的BPXTEN融合蛋白的表达的重组DNA分子。设想若干克隆策略适用于执行本发明，其中多者可用于产生构建体，该构建体包含编码本发明的BPXTEN组合物的融合蛋白的基因或其互补序列。在一个实施方案中，克隆策略将用于产生编码单体BPXTEN的基因，该单体BPXTEN包含至少第一BP及至少第一XTEN多肽或其互补序列。在另一实施方案中，克隆策略将用于产生编码单体BPXTEN的基因，该单体BPXTEN包含一个BP的第一及第二分子及至少一个第一XTEN(或其互补序列)，该第一XTEN将用于转化宿主细胞以表达用于调配BPXTEN组合物的融合蛋白。在此段落中所描述的上文前述实施方案中，基因可进一步包含编码间隔子序列的核苷酸，所述间隔子序列亦可编码裂解序列。
在设计所需XTEN序列时，发现尽管在创建XTEN编码序列中使用“建构组元”分子方法，但仍可实现本发明组合物的XTEN的非重复性质。此通过使用聚核苷酸编码序列模体的库来达成，所述聚核苷酸随后多聚化以产生编码XTEN序列的基因(参见图4及5)。因此，虽然表达XTEN可由少至四种不同的序列模体的多个单元组成，因为模体本身由非重复氨基酸序列组成，但整个XTEN序列呈现非重复。因此，在一个实施方案中，XTEN编码聚核苷酸包含编码非重复序列或模体的多个聚核苷酸，其可操作地连接于框架中且所得表达XTEN氨基酸序列非重复。
在一种方法中，首先制备含有对应于BPXTEN融合蛋白的DNA序列的构建体。编码组合物BP的DNA可获自使用标准方法自咸信具有BP mRNA且以可检测水平表达的组织或分离细胞制备的cDNA库。必要时，编码序列可使用如Sambrook,等人,前述中所描述的常规引物延伸程序获得，以检测尚未反转录成cDNA的mRNA之前驱体及加工中间体。因此，DNA可方便地自制备自此类来源的cDNA库获得。BP编码基因亦可获自基因组或通过本领域已知的标准合成程序(例如，自动化核酸合成)使用获自公开可获得的数据库、专利或文献参考文献的DNA序列产生。此类程序为本领域熟知且详尽描述于科学及专利文献中。举例而言，序列可获自化学文摘服务(CAS)登记号(由美国化学协会公开)和/或Genbank寄存编号(例如，基因座ID、NP_XXXXX及XP_XXXXX)模型蛋白质标识符，其可经由国家生物技术信息中心(NCBI)网站获得，于全球信息网ncbi.nlm.nih.gov获得，其对应于CAS登记或GenBank数据库中含有BAP或BAP片段或变体的氨基酸序列的条目。对于本文提供的此类序列标识符，与这些CAS及Genbank及GenSeq寄存编号中的每一者相关的概述页面以及所引用的杂志出版物(例如，PubMed ID编号(PMID))各自以全文引用的方式并入，尤其相对于其中所描述的氨基酸序列。在一个实施方案中，BP编码基因编码来自表3或表A中的任一者的蛋白质或其片段或变体。
编码本发明BPXTEN蛋白质的BP部分的基因或聚核苷酸，在表达的融合蛋白的情况下，将包含单一BP，可接着克隆至构建体中，该构建体可为质体或其他载体，在适当的转录及翻译序列的控制下，用于生物系统中的高水平蛋白质表达。在后续步骤中，编码XTEN的第二基因或聚核苷酸通过将其克隆至与编码BP的基因相邻且同框的构建体中而基因融合至编码BP基因的N端和/或C端的核苷酸。此第二步骤可经由接合或多聚化步骤进行。在此段落中所描述的上文前述实施方案中，应理解，所产生的基因构建体可替代地为编码相应融合蛋白的相应基因的补体。
编码XTEN的基因可在一个或多个步骤中完全以合成方式或通过与酶促过程(诸如限制酶介导的克隆、PCR及重叠延伸)组合的合成来制得。XTEN多肽可经构建使得XTEN编码基因具有低重复性，同时所编码的氨基酸序列具有一定程度的重复性。编码具有非重复序列的XTEN的基因可使用基因合成的标准技术自寡核苷酸组装。基因设计可使用使密码子使用及氨基酸组成优化的算法进行。在本发明的一个方法中，产生相对短的XTEN编码聚核苷酸构建体的库且接着进行组装，如图4及5。此可为纯密码子库，使得各库成员具有相同氨基酸序列，但许多不同编码序列为可能的。此类库可自部分随机化寡核苷酸组装且用于产生包含序列模体的XTEN区段的大型库。随机化方案可经优化以针对各位置以及密码子使用来控制氨基酸选择。
聚核苷酸库
在另一方面中，本发明提供编码XTEN序列的聚核苷酸库，所述XTEN序列可用于组装编码所需长度及序列的XTEN的基因。
在某些实施方案中，XTEN编码库构建体包含编码固定长度的多肽区段的聚核苷酸。作为初始步骤，可组装编码9至14个氨基酸残基的模体的寡核苷酸库。在一优选实施方案中，组装编码12个氨基酸基的模体的寡核苷酸库。
XTEN编码序列区段可二聚或多聚化为较长编码序列。二聚或多聚化可通过接合、重叠延伸、PCR组装或本领域已知的类似克隆技术进行。此过程可重复多次，直至所得XTEN编码序列已达到序列组构及所需长度，提供XTEN编码基因。如将了解，编码12个氨基酸的聚核苷酸库可二聚为编码36个氨基酸的聚核苷酸库。转而，编码36个氨基酸的聚核苷酸库可连续二聚为含有编码XTEN序列的连续较长长度的聚核苷酸的库。在一些实施方案中，可以组装编码仅限于特定序列XTEN家族的氨基酸的聚核苷酸库；例如表1的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。在其他实施方案中，库可包含编码来自表1的模体家族序列中的两者或更多者的序列。库又可用于连续二聚化或接合以获得编码XTEN序列，例如72、144、288、576、864、912、923、1296个氨基酸或多达约3000个氨基酸的总长度以及中等长度的聚核苷酸序列库。在一些情况下，聚核苷酸库序列亦可包括用作“定序岛”的额外碱基，如下文更充分描述。
图5为本发明的实施方案中XTEN聚核苷酸构建体及BPXTEN聚核苷酸构建体的组装中的代表性非限制性步骤的示意性流程图。将单独寡核苷酸501可退火成序列模体502，诸如12个氨基酸模体(“12聚体”)，其随后与含有BbsI及KpnI限制性位点的寡核苷酸503接合。使来自库的额外序列模体退火成12聚体，直至达成XTEN基因504的所需长度。将XTEN基因克隆至填充(stuffer)载体中。载体可任选编码Flag序列506，随后为由BsaI、BbsI及KpnI位点侧接的填充序列507及在该种状况下单一BP基因(在此实施例中编码肠促胰岛素类似物-4)508，产生编码包含单一BP的BPXTEN的基因500。用于编码XTEN及前驱体序列的聚核苷酸的XTEN名称及SEQ ID NO的非详尽清单提供于表8中。
表8：XTEN和前驱体序列的DNA序列
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可将XTEN编码基因库克隆至本领域已知的一种或多种表达载体中。为了促进表达良好的库成员的鉴别，可以将库构建作为与报导蛋白的融合物。适合报导基因的非限制性实施例为绿色荧光蛋白、荧光素酶、碱性磷酸酶及β-半乳糖苷酶。通过筛检，可鉴别可在所选宿主生物体中以高浓度表达的短XTEN序列。随后，可产生随机XTEN二聚体的库且针对高表达量重复筛选。随后，可针对多种特性，诸如表达量、蛋白酶稳定性或与抗血清的结合来筛选所得构建体。
本发明的一个方面为提供编码融合蛋白的组分的聚核苷酸序列，其中序列的产生已进行密码子优化。备受关注的为密码子优化，其以改良多肽组合物的表达及改良编码基因在生产宿主中的基因稳定性为目标。举例而言，密码子优化对于富含甘氨酸或具有极重复氨基酸序列的XTEN序列尤其重要。可使用计算机程序执行密码子优化(Gustafsson,C.等人,(2004)Trends Biotechnol,22:346-53)，其中一些使核糖体暂停最小化(Coda基因组学公司)。在一个实施方案中，可通过构建密码子库来进行密码子优化，其中库的所有成员编码相同氨基酸序列，但密码子使用不同。此类库可经筛选为高度表达及遗传稳定的成员，尤其为适合于大规模生产含XTEN的产品。当设计XTEN序列时，可考虑多种特性。可将编码DNA序列中的重复性最小化。此外，可避免或最小化生产宿主很少使用的密码子(例如大肠杆菌中的AGG及AGA精氨酸密码子及一种亮氨酸密码子)的使用。在大肠杆菌的情况下，两种甘氨酸密码子GGA及GGG很少用于高度表达的蛋白质中。因此，编码XTEN序列的基因的密码子优化可为极其合乎需要的。具有高水平甘氨酸的DNA序列往往会具有高GC含量，其可能导致不稳定性或低表达量。因此，当可能时，优选选择密码子以使XTEN编码序列的GC含量适合于生产将用于制造XTEN的生物体。
任选地全长XTEN编码基因可包含一个或多个定序岛。在此情形下，定序岛为矮拉伸序列，其与XTEN库构建体序列不同且包括全长XTEN编码基因中不存在或预期存在的限制位点。在一个实施方案中，定序岛为序列
5'-AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGT-3'(SEQ ID NO:261)。在另一实施方案中，定序岛为序列
5'-AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGT-3'(SEQ ID NO:262)。
作为替代方案，可构建密码子库，其中库的所有成员编码相同氨基酸序列，但其中密码子使用不同。此类库可经筛选为高度表达及遗传稳定的成员，尤其为适合于大规模生产含XTEN的产品。
任选地可在库中对克隆进行定序以消除含有不合需要的序列的分离株。短XTEN序列的初始库可允许氨基酸序列发生一些变化。举例而言，可将一些密码子随机化以使得多个亲水性氨基酸可出现在特定位置。
在叠代多聚化过程期间，除筛选高水平表达以外，可筛选所得库成员的其他特征，如溶解性或蛋白酶抗性。
一旦选择编码具有所需长度及特性的XTEN的基因，则通过将其克隆至与编码BP或邻接于间隔子序列的基因相邻且同框的构建体中而基因融合至编码BP基因的N端和/或C端的核苷酸。本发明提供前述的各种排列，视待编码的BPXTEN而定。举例而言，如上文所描绘的编码包含诸如通过式III或IV体现的两种BP的BPXTEN融合蛋白的基因，该基因将具有编码两种BP的聚核苷酸、至少第一XTEN及任选存在的第二XTEN和/或间隔子序列。BP基因克隆至XTEN构建体中的步骤可经由接合或多聚化步骤进行。如图2A-图2G中所示，编码BPXTEN融合蛋白的构建体可经设计成组分202、BP203及间隔子序列204的不同构型。在一个实施方案中，如图2A中所示，构建体包含与以下次序(5'至3')BP203及XTEN202或反向次序的组分的单体多肽互补的聚核苷酸序列或编码所述组分的单体多肽的聚核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2B中所示，构建体包含与以下次序(5'至3')BP203、间隔子序列204及XTEN202或反向次序的组分的单体多肽互补的聚核苷酸序列或编码所述组分的单体多肽的聚核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2C中所示，构建体201编码单体BPXTEN，该单体BPXTEN包含与以下次序(5'至3')：两个BP分子203及XTEN202或反向次序的组分互补的聚核苷酸序列或编码所述组分的聚核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2D中所示，构建体包含与以下次序(5'至3')：两个BP分子203、间隔子序列204及XTEN202或反向次序的组分的单体多肽互补的聚核苷酸序列或编码所述组分的单体多肽的聚核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2E中所示，构建体包含与以下次序(5'至3')：BP203、间隔子序列204、BP203的第二分子及XTEN202或反向次序的组分的单体多肽互补的聚核苷酸序列或编码所述组分的单体多肽的聚核苷酸序列。在另一实施方案中，如图2F中所示，构建体包含与以下次序(5'至3')：BP203、XTEN202、BP203及第二XTEN202或反向次序的组分的单体多肽互补的聚核苷酸序列或编码所述组分的单体多肽的聚核苷酸序列。间隔子聚核苷酸可任选包含编码裂解序列的序列。如本领域技术人员将显而易见，前述内容的其他排列为可能的。
本发明亦涵盖包含XTEN编码聚核苷酸变体的聚核苷酸，所述聚核苷酸变体与(a)来自表8的聚核苷酸序列或(b)与(a)的聚核苷酸互补的序列具有高百分比的序列一致性。具有高百分比序列一致性的聚核苷酸是指与前述(a)或(b)具有至少约为80％核酸序列一致性，或者至少约81％、或者至少约82％、或者至少约83％、或者至少约84％、或者至少约85％、或者至少约86％、或者至少约87％、或者至少约88％、或者至少约89％、或者至少约90％、或者至少约91％、或者至少约92％、或者至少约93％、或者至少约94％、或者至少约95％、或者至少约96％、或者至少约97％、或者至少约98％及或者至少约99％核酸序列一致性的聚核苷酸，或在严格条件下能与目标聚核苷酸或其补体进行杂交。
核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列相似性或序列一致性亦可常规地通过使用已知软件或计算机程序，诸如BestFit或Gap成对比较程序(GCG Wisconsin Package,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.53711)来确定。BestFit使用Smith及Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics.1981.2:482-489)，以发现两个序列之间之一致性或相似性的最佳区段。Gap进行全局比对：使用Needleman及Wunsch的方法，将一个序列与另一个相似序列进行比对(Journal ofMolecular Biology.1970.48:443-453)。当使用诸如BestFit的序列比对程序以确定序列同源性、相似性或一致性的程度时，可以使用预设设置，或可以选择适当的计分矩阵以使一致性、相似性或同源性分数优化。
“互补”的核酸序列为能够根据标准沃森-克里克(Watson-Crick)互补规则进行碱基配对的那些核酸序列。如本文所用，术语“互补序列”意指实质上互补的核酸序列，如上文所描述，可通过相同的上述核苷酸进行比较评估，或如定义为能够在严格条件下与编码BPXTEN序列的聚核苷酸杂交，诸如本文所描述的那些物。
编码BPXTEN嵌合组合物的所得聚核苷酸可随后单独地克隆至表达载体中。核酸序列可通过多种程序插入至载体中。一般而言，DNA为使用本领域已知的技术插入至适当限制性核酸内切酶位点中。载体组分一般包括但不限于以下中之一或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、强化子组件、启动子及转录终止序列。含有这些组分中之一或多者的适合的载体的构建采用本领域技术人员已知的标准连接技术。此类程序为本领域熟知且详尽描述于科学及专利文献中。
各种载体为公开可用的。载体可例如呈质体、黏质体、病毒粒子或噬菌体形式。表达载体及克隆载体均含有使得载体能够在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。此类载体序列对于各种细菌、酵母菌及病毒而言为熟知的。可用的适用表达载体包括例如染色体、非染色体及合成DNA序列的区段。适合的载体包括但不限于SV40及pcDNA的衍生物及已知细菌质体，诸如col EI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(如由Smith等人,Gene 57:31-40(1988)所描述)、pMB9及其衍生物；质体，诸如RP4；噬菌体DNA，诸如噬菌体I的诸多衍生物，诸如NM98 9，以及其他噬菌体DNA，诸如M13及丝状单股噬菌体DNA；酵母菌质体，诸如2微米质体或2m质体的衍生物，以及着丝粒及整合酵母菌穿梭载体；适用于真核细胞的载体，诸如适用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；衍生自质体及噬菌体DNA的组合的载体，诸如经修饰以采用噬菌体DNA或表达控制序列的质体；及其类似物。要求为载体在所选宿主细胞中为可重复及可存活的。可按需要使用低复本数或高复本数载体。
适合用于原核宿主表达载体的启动子包括β-内酰胺酶及乳糖启动子系统[Chang等人,Nature,275:615(1978)；Goeddel等人,Nature,281:544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)；EP 36,776]及杂交启动子，诸如tac启动子[deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]。用于细菌系统的启动子亦可含有可操作地连接于编码BPXTEN多肽的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
例如，在杆状病毒表达系统中，可以使用两种非融合转移载体，诸如但不限于pVL941(BamHI克隆位点，获自Summers等人,Virology 84:390-402(1978))、pVL1393(BamHI、Smal、Xbal、EcoRI、IVotl、Xmalll、BgIII及Pstl克隆位点；Invitrogen)、pVL1392(BgIII、Pstl、NotI、XmaIII、EcoRI、Xball、Smal及BamHI克隆位点；Summers等人,Virology84:390-402(1978)及Invitrogen)及pBlueBacIII(BamHI、BgIII、Pstl、Ncol及Hindi II克隆位点，带有蓝/白重组筛选，Invitrogen)，以及融合转移载体，诸如但不限于：pAc7 00(BamHI及Kpnl克隆位点，其中BamHI识别位点以起始密码子开始；Summers等人,Virology84:390-402(1978))、pAc701及pAc70-2(与pAc700相同，具有不同阅读框)、pAc360[BamHI克隆位点，多角体蛋白起始密码子下游的36个碱基对；Invitrogen(1995))及pBlueBacHisA、B、C(三个不同的阅读框，带有BamH I、BgI II、Pstl、Nco l及Hind III克隆位点，用于ProBond纯化及蓝/白重组筛选斑块的N端肽；Invitrogen(220))。
哺乳动物表达载体可包含复制起点、适合的启动子及强化子以及任何所需核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体及受体位点、转录终止序列及5'侧接非转录序列。来源于SV40剪接及聚腺苷酸化位点的DNA序列可用于提供所需非转录遗传组件。预期用于本发明中的哺乳动物表达载体包括具有可诱导型启动子的载体，诸如二氢叶酸还原酶启动子、任何带有DHFR表达卡匣或DHFR/甲胺喋呤共扩增载体的表达载体，诸如pED(Pstl、Sail、Sbal、Smal及EcoRI克隆位点，其中载体表达克隆基因及DHFR两者，Randal J.Kaufman,1991,Randal J.Kaufman,Current Protocols in Molecular Biology,16,12(1991))。或者，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸亚砜亚胺共扩增载体，诸如pEE14(Hindlll、Xball、Smal、Sbal、EcoRI及Sell克隆位点，其中载体表达谷氨酰胺合成酶及克隆基因；Celltech)。可以使用在埃-巴二氏病毒(EBV)或核抗原(EBNA)控制下指导游离体表达的载体，诸如pREP4(BamHI r SfH、Xhol、NotI、Nhel、Hindi II、NheI、PvuII及Kpnl克隆位点，构成性RSV-LTR启动子，潮霉素可选标记；Invitrogen)pCEP4、(BamHI、SfH、Xhol、NotI、Nhel、Hindlll、Nhel、PvuII及Kpnl克隆位点，构成性hCMV即刻早期基因启动子，潮霉素可选标记；Invitrogen)pMEP4(.Kpnl、Pvul、Nhel、Hindlll、NotI、Xhol、Sfil、BamHI克隆位点，可诱导型甲硫蛋白Ha基因启动子，潮霉素可选标记，Invitrogen)、pREP8(BamHI、Xhol、NotI、Hindlll、Nhel及Kpnl克隆位点，RSV-LTR启动子，组胺醇可选标记；Invitrogen)、pREP9(Kpnl、Nhel、Hindlll、NotI、Xho l、Sfi l、BamH I克隆位点，RSV-LTR启动子，G418可选标记；Invitrogen)及pEBVHis(RSV-LTR启动子，潮霉素可选标记，可经由ProBond树脂纯化以及由肠激酶裂解的N端肽；Invitrogen)。
用于本发明的可选哺乳动物表达载体包括(但不限于)pRc/CMV(Hind lll、BstXI、NotI、Sbal及Apal克隆位点，G418选择，Invitrogen)、pRc/RSV(Hind II、Spel、BstXI、NotI、Xbal克隆位点，G418选择，Invitrogen)及其类似物。可用于本发明中的痘疮病毒哺乳动物表达载体(参见，例如Randall J.Kaufman,Current Protocols in Molecular Biology16.12(Frederick M.Ausubel,等人,编.Wiley 1991)包括(但不限于)pSC11(Smal克隆位点，TK-及β-gal选择)、pMJ601(Sal l、Sma l、A flI、Narl、BspMlI、BamHI、Apal、Nhel、SacII、Kpnl及Hindlll克隆位点；TK-及-gal选择)、pTKgptFlS(EcoRI、Pstl、SaIII、Accl、HindII、Sbal、BamHI及Hpa克隆位点，TK或XPRT选择)等。
亦可用于本发明中的酵母表达系统包括(但不限于)非融合pYES2载体(XJbal、Sphl、Shol、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamHI、Sad、Kpnl及Hindlll克隆位点，Invitrogen)、融合pYESHisA、B、C(Xball、Sphl、Shol、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、Sad、Kpnl及Hindi II克隆位点，经树脂纯化以及经肠激酶裂解的N端肽，英杰)、pRS载体等。
另外，含有嵌合BPXTEN融合蛋白编码聚核苷酸分子的表达载体可包括药物选择标记。此类标记有助于克隆及选择或鉴别含有嵌合DNA分子的载体。举例而言，赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制剂、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT)、吉欧霉素(zeocin)及组胺醇的抗性的基因是有用的可选标记。替代地，可采用酶，诸如疱疹单纯型病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。亦可采用免疫标记。可采用任何已知可选标记，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。可选标记的其他实施例为本领域技术人员所熟知且包括报导子，诸如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。
在一个实施方案中，编码BPXTEN融合蛋白组合物的聚核苷酸可以C端融合至N端信号序列，其适用于表达宿主系统。信号序列通常在易位及分泌过程期间以蛋白分解方式自蛋白质移除，产生所定义的N端。已描述广泛多种信号序列用于大部分表达系统，包括细菌、酵母菌、昆虫及哺乳动物系统。各表达系统的优选实施例的非限制性列表在本文中之后。对于大肠杆菌表达，优选信号序列为OmpA、PhoA及DsbA。对于酵母菌表达,优选的信号肽为ppL-α、DEX4、转化酶信号肽、酸性磷酸酶信号肽、CPY或INU1。对于昆虫细胞表达，优选信号序列为sexta激脂激素前驱体、CP1、CP2、CP3、CP4、TPA、PAP或gp67。对于哺乳动物表达，优选信号序列为IL2L、SV40、IgGκ及IgGλ。
在另一实施方案中，潜在地包含表达良好的独立蛋白质域之前导序列可融合至由蛋白酶裂解位点分离的BPXTEN序列的N端。虽然可使用在所设计蛋白水解位点处不抑制裂解的任何前导肽序列，但在优选实施方案中，序列将包含稳定、表达良好的序列，使得整个组合物的表达及折叠不受显著不利影响，且优选使表达、溶解性和/或折叠效率得到显著改良。已在文献中描述广泛多种适合之前导序列。适合序列的非限制性清单包括麦芽糖结合蛋白、纤维素结合域、麸胱甘肽S转氨酶、6xHis标签(SEQ ID NO:263)、Flag标签、血球凝集素标签及绿色荧光蛋白。前导序列亦可通过密码子优化，尤其在ATG起始密码子后的第二密码子位置中，通过文献及上文充分描述的方法进一步改良。
已知用于在特定位点裂解蛋白质的各种体外酶方法。此类方法包括使用肠激酶(DDDK(SEQ ID NO:264))、因子Xa(IDGR(SEQ ID NO:265))、凝血酶(LVPRGS(SEQ ID NO:266))、PreScissionTM(LEVLFQGP(SEQ ID NO:267))、TEV蛋白酶(EQLYFQG(SEQ ID NO:268))、3C蛋白酶(ETLFQGP(SEQ ID NO:269))、分选酶A(LPETGSEQ ID NO:909)、颗粒酶B(D/X、N/X、M/N或S/X)、内含肽、SUMO、DAPase、(TAGZymeTM)、气单胞菌属氨基肽酶、氨基肽酶M及羧基肽酶A及B。额外方法公开于Arnau等人,Protein Expression and Purification 48:1-13(2006)。
在其他实施方案中，编码具有XTEN特征的至少约20至约60个氨基酸的优化聚核苷酸序列可包括在XTEN序列的N端处以促进翻译的起始以允许在不存在辅助域的情况下在蛋白质的N端处表达XTEN融合物。在前述的优势中，序列不需要后续裂解，由此减少制造含XTEN组合物的步骤的数目。如实施例中更详细地描述，优化N端序列具有非结构化蛋白质的属性，但可包括编码氨基酸的核苷酸碱基，所述氨基酸经选择以促进翻译起始及增强表达的能力。在前述一个实施方案中，优化聚核苷酸编码与AE912(SEQ ID NO:217)具有至少约90％序列一致性的XTEN序列。在以上另一实施方案中，优化聚核苷酸编码与AM923(SEQ IDNO:218)具有至少约90％序列一致性的XTEN序列。
在另一个实施方案中，选择前导序列构建体的蛋白酶位点以使得其由体内蛋白酶识别。在此实施方案中，蛋白质自表达系统纯化，同时通过避免与适当蛋白酶接触而保留前导序列。接着将全长构建体注射至患者体内。注射后，构建体与对裂解位点具有特异性的蛋白酶接触且由蛋白酶裂解。在未裂解蛋白质的活性实质上小于裂解形式的情况下，此方法具有允许更高初始剂量同时避免毒性的有益作用，因为活性形式在体内缓慢产生。适用于本申请的体内蛋白酶的一些非限制性实施例包括组织激肽释放酶、血浆激肽释放酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶及基质金属蛋白酶，或表5的蛋白酶。
以此方式，编码单体BPXTEN融合蛋白的嵌合DNA分子在构建体内产生。任选地此嵌合DNA分子可转移或克隆至为更适合表达载体的另一构建体中。此时，能够表达嵌合DNA分子的宿主细胞可经嵌合DNA分子转化。含有相关DNA区段的载体可通过视细胞生产宿主的类型而定的熟知方法转移至宿主细胞中。举例而言，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、脂质体转染或电穿孔可用于其他细胞宿主。用于转型哺乳动物细胞的其他方法包括使用凝聚胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔及显微注射。一般而言，参见，Sambrook等人,前述。
转化可在利用或不利用载剂(诸如表达载体)的情况下发生。随后，经转化的宿主细胞在适合于表达编码BPXTEN的嵌合DNA分子的条件下培养。
本发明亦提供用于表达本文所公开的单体融合蛋白组合物的宿主细胞。适合的真核宿主细胞的实施例包括(但不限于)哺乳动物细胞，诸如VERO细胞、诸如ATCC No.CCL2的HELA细胞、CHO细胞株、COS细胞、WI38细胞、BHK细胞、HepG2细胞、3T3细胞、A549细胞、PC12细胞、K562细胞、293细胞、Sf9细胞及CvI细胞。适合的非哺乳动物真核细胞的实施例包括真核微生物，诸如丝状真菌或酵母，为适合用于编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母为常用的低级真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach andNurse,Nature,290:140[1981]；于1985年五月2日公开的EP 139,383)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主(美国专利第4,943,529号；Fleer等人,Bio/Technology,9:968-975(1991))，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt等人,J.Bacteriol.,737[1983])、脆壁酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃尔第酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van denBerg等人,Bio/Technology,8:135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等人,J.Basic Microbiol.,28:265-278[1988])；念珠菌属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263[1979])；施氏酵母(Schwanniomyces)，诸如西方施氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)(于1990年十月31日公开的EP 394,538)；及丝状真菌，诸如红霉菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(于1991年一月10日公开的WO 91/00357)及曲霉菌属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲菌(A.nidulans)(Ballance等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,112:284-289[1983]；Tilburn等人,Gene,26:205-221[1983]；Yelton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474[1984])及黑曲菌(A.niger)(Kelly及Hynes,EMBO J.,4:475-479[1985])。甲基营养型酵母在本文中为适合的且包括(但不限于)能够在选自由汉森酵母属(Hansenula)、念珠菌属、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属、酵母菌属、球拟酵母属(Torulopsis)及红酵母属(Rhodotorula)组成的属的甲醇上生长的酵母菌。作为此类别的酵母菌的示例的特定物种的清单可发现于C.Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs,269(1982)中。
可用于本发明中的其他适合细胞包括(但不限于)原核宿主细胞菌株，诸如大肠杆菌(例如菌株DH5-α)、枯草杆菌、嗜沙门氏菌属或假单胞菌属、链霉菌及葡萄球菌属菌株。适合原核生物的非限制性实施例包括来自以下属的那些：游动放线菌属(Actinoplanes)；古生球菌属(Archaeoglobus)；蛭弧菌属(Bdellovibrio)；螺旋体属(Borrelia)；绿屈挠菌属(Chloroflexus)；肠球菌属(Enterococcus)；埃希氏菌属(Escherichia)；乳杆菌属(Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)；副球菌属(Paracoccus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；葡萄球菌属(Staphylococcus)；链霉菌属(Streptococcus)；链霉菌属(Streptomyces)；热原体属(Thermoplasma)及弧菌属(Vibrio)。特定菌株的非限制性实施例包括：闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)；食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)；伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)；约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；无害李斯特氏菌(Listeria innocua)；产单核球李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；伊平屋海岭海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)；产玉米黄素副球菌(Paracoccuszeaxanthinifaciens)；甲轻戊酸假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；灰色孢链霉菌(Streptomyces griseolosporeus)；变形链球菌(Streptococcus mutans)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)；嗜酸热原体菌(Thermoplasma acidophilum)；火山热原体菌(Thermoplasma volcanium)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)及创伤弧菌(Vibriovulnificus)。
含有相关聚核苷酸的宿主细胞可在适于活化启动子、选择转化体或扩增基因的经改造的常规养分培养基(例如Ham氏营养物混合物)中培养。培养条件(诸如温度、pH值及其类似条件)为先前用于经选择用于表达的宿主细胞的培养条件，且对于一般本领域技术人员而言将显而易见。细胞通常通过离心采集、通过物理或化学手段破坏且所得粗制提取物经保留以供进一步纯化。对于宿主细胞分泌的组合物而言，分离来自离心的上清液且保留用于进一步纯化。蛋白质表达中所用的微生物细胞可通过任何便利方法破坏，包括冻融循环、音波处理、机械破坏或使用细胞溶解剂，其皆为本领域技术人员所熟知。涉及细胞溶解的实施方案可能需要使用含有限制在嵌合DNA分子表达之后降解的蛋白酶抑制剂的缓冲剂。适合的蛋白酶抑制剂包括(但不限于)亮抑酶肽、胃酶抑素或抑肽酶。上清液接着可在连续增加浓度的饱和硫酸铵中沉淀。
可在样品中直接量测基因表达，例如通过用以定量mRNA的转录的常规南方墨点法、北方墨点法([Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980))、斑点杂交(dotblotting)(DNA分析)或原位杂交，使用经适当标记地探针，基于本文所提供的序列。或者，可采用能识别特定双螺旋体，包括DNA双螺旋体、RNA双螺旋体及DNA-RNA混合双螺旋体或DNA-蛋白质双螺旋体的抗体。抗体又可经标记且可进行分析，其中双螺旋体结合至表面，以使得在表面上形成双螺旋体时，可检测到结合至双螺旋体的抗体的存在。
或者，基因表达可通过荧光方法，诸如细胞或组织切片的免疫组织化学染色及细胞培养物或体液的分析或可选择标记的检测来量测，以直接定量基因产物的表达。适用于免疫组织化学染色和/或样品流体分析的抗体可为单克隆或多克隆的，且可在任何哺乳动物中制备。适宜地，可基于本文所提供的DNA序列或针对融合至BP且编码特异性抗体抗原决定基之外源性序列，针对天然序列BP多肽或针对合成肽来制备抗体。可选标记的实施例为本领域技术人员所熟知且包括报导子，诸如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。
表达的BPXTEN多肽产物可经由本领域已知的方法或通过本文所公开的方法纯化。可使用诸如凝胶过滤、亲和纯化、盐分馏、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、羟基磷灰石吸附色谱法、疏水性相互作用色谱法及凝胶电泳的程序；每一者经调适以回收及纯化由相应宿主细胞产生的融合蛋白。一些表达的BPXTEN在分离及纯化期间可能需要再折叠。纯化方法描述于Robert K.Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,CharlesR.Castor(编),Springer-Verlag 1994，及Sambrook等人,前述。多步骤纯化分离亦描述于Baron,等人,Crit.Rev.Biotechnol.10:179-90(1990)及Below,等人,J.Chromatogr.A.679:67-83(1994)。
药物组合物
细胞因子可在治疗各种治疗性或疾病类别中具有效用，包括(但不限于)癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、全身性红斑狼疮、阿尔茨海默氏症、精神分裂症、病毒感染(例如，慢性C型肝炎、AIDS)、过敏性哮喘、视网膜神经退化性过程、代谢病症、胰岛素抗性及糖尿病性心肌症。
然而，细胞因子的治疗效用在一些情况下可能受到限制，因为一些细胞因子，诸如IL-2、IL-12、IL15、I型干扰素(α及β)及IFN-γ在全身性递送时可能对宿主细胞有毒。延长循环细胞因子的半衰期可为通过减缓细胞内吸收来降低细胞毒性的方式。
本发明中的BPXTEN提供通过细胞因子连接至XTEN而延长细胞因子的半衰期的方法及组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含BPXTEN融合蛋白以及至少一种药学上可接受的载剂。本发明的BPXTEN多肽可根据已知制备药学上适用的组合物的方法进行调配，其中多肽以与药学上可接受的载剂媒剂，诸如水溶液或缓冲剂、药学上可接受的悬浮液及乳液的掺合物形式组合。非水溶剂的实施例包括丙基乙二醇、聚乙二醇及植物油。制备治疗性调配物以用于储存，其通过将具有所需纯度的活性成分与任选选用的生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来进行(如中Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)所描述)，呈冻干调配物或水溶液形式。
药物组合物可经口、鼻内、非经肠或通过吸入疗法施用，且可呈片剂、口含片、颗粒剂、胶囊、丸剂、安瓿、栓剂或气雾剂形式。其亦可呈含活性成分的水性或非水性稀释剂、糖浆剂、颗粒剂或粉剂的悬浮液、溶液及乳液形式。另外，药物组合物亦可含有其他药学活性化合物或复数种本发明化合物。药物组合物经调配用于经口、真皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹内、腹膜内、鞘内或肌肉内施用。药物组合物可呈液体形式。药物组合物可在用于单次注射的预填充注射器中。药物组合物可经调配为在待施用之前复原的冻干粉末。
更特别是，本发明药物组合物可通过任何适合途径施用用于疗法，包括经口、经直肠、经鼻、局部(包括经皮、气雾剂、经颊及舌下)、经阴道、非经肠(包括皮下、通过注射泵的皮下、肌内、静脉内及真皮内)、玻璃体内及经肺。亦应了解，优选途径随接受者的病况及年龄以及所治疗的疾病而变化。
在一个实施方案中，药物组合物经皮下施用。在此实施方案中，组合物可呈在施用之前复原的冻干粉末形式供应。组合物亦可呈液体形式供应，其可直接向患者施用。在一个实施方案中，在预填充注射器中以液体形式供应组合物，使得患者可容易地自行施用组合物。
适用于本发明的延长释放调配物可为包含基质及包衣组合物的经口调配物。适合基质材料可包括蜡(例如，巴西棕榈蜡(camauba)、蜡、石蜡、白地蜡(ceresine)、虫胶蜡、脂肪酸及脂肪醇)、油、硬化油或脂肪(例如，硬化菜籽油、蓖麻油、牛油、棕榈油及豆油)及聚合物(例如，羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素及聚乙二醇)。其他适合基质压片材料为微晶纤维素、粉末纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素与其他载剂及填充剂。片剂亦可含有颗粒、包衣粉末或集结粒。片剂亦可为多层的。当活性成分具有显著不同的药物动力学概况时，多层片剂尤其优选。任选地成品片剂可经包覆或未经包覆。
包衣组合物可包含不可溶基质聚合物和/或水溶性材料。水溶性材料可为聚合物，诸如聚乙二醇、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或单体材料，诸如糖(例如乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇及其类似物)、盐(例如氯化钠、氯化钾及其类似物)、有机酸(例如反丁烯二酸、丁二酸、乳酸及酒石酸)及其混合物。任选地肠溶聚合物可并入至包衣组合物中。适合的肠溶聚合物包括羟丙基甲基纤维素、乙酸酯丁二酸酯、羟丙基甲基纤维素、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三甲酸乙酸纤维素、虫胶、玉米蛋白及含有羧基的聚甲基丙烯酸酯。可通过添加适合的塑化剂来塑化包衣组合物，该塑化剂诸如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸酯、聚乙二醇、丙三醇、乙酰化甘油酯、乙酰化柠檬酸酯、癸二酸二丁酯以及蓖麻油。包衣组合物亦可包括填充剂，该填充剂可为不溶性材料，诸如二氧化硅、二氧化钛、滑石、高岭土、氧化铝、淀粉、粉末纤维素、MCC或波拉克林钾。可将包衣组合物作为溶液或乳胶在有机溶剂或水溶剂或其混合物中施加。可使用溶剂，诸如水、低级醇、低级氯化烃、酮或其混合物。
本发明的组合物可使用多种赋形剂调配。适合的赋形剂包括微晶纤维素(例如Avicel PH102、Avicel PH101)、聚甲基丙烯酸酯、聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸三甲基铵乙酯氯化物)(诸如Eudragit RS-30D)、羟丙基甲基纤维素(甲基纤维素K100M、Premium CR甲基纤维素K100M、甲基纤维素E5、
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)、硬脂酸镁、滑石、柠檬酸三乙酯、水性乙基纤维素分散液
Figure BDA0004014658270001022
及硫酸鱼精蛋白。缓释剂亦可包含载剂，该载剂可包含例如溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂。药学上可接受的盐亦可用于这些缓释剂，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。组合物亦可含有液体，诸如水、盐水、丙三醇及乙醇，以及物质，诸如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。脂质体亦可作为载剂使用。
在另一实施方案中，本发明的组合物囊封于脂质体中，其在长时间内以受控方式递送有益活性剂方面具有效用。脂质体为封闭的双层膜，含有包覆的水体积。脂质体亦可为具有单个膜双层的单层囊泡或具有多个膜双层的多层囊泡，各膜双层通过水层与下一个膜双层分离。所得膜双层的结构使得脂质的疏水性(非极性)尾部朝向双层的中心定向，而亲水性(极性)头部朝向水相定向。在一个实施方案中，脂质体可包覆有可挠性水溶性聚合物，避免由单核吞噬细胞系统的器官(主要为肝脏及脾脏)吸收。用于包围脂质体的适合亲水性聚合物包括(但不限于)PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基
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唑啉、聚乙基
Figure BDA0004014658270001024
唑啉、聚羟丙基
Figure BDA0004014658270001025
唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟基丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺及亲水性肽序列，如美国专利第6,316,024号；第6,126,966号；第6,056,973号；第6,043,094号中所描述，所述专利的内容以全文引用的方式并入。
脂质体可由本领域已知的任何脂质或脂质组合构成。举例而言，囊泡形成脂质可为天然存在的脂质或合成脂质，包括磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇及鞘磷脂，如美国专利第6,056,973号及第5,874,104号中所公开。囊泡形成脂质亦可为糖脂、脑苷脂或阳离子脂质，诸如1,2-二油酰氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-[1-(2,3,-二(十四烷基)氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；N-[1[(2,3,-二油酰氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)；N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；3[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)胺甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；或二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)，亦如美国专利第6,056,973号中所公开。胆固醇亦可以适当范围存在，以赋予囊泡稳定性，如美国专利第5,916,588号及第5,874,104号中所公开。
其他脂质体技术描述于美国专利第6,759,057号；第6,406,713号；第6,352,716号；第6,316,024号；第6,294,191号；第6,126,966号；第6,056,973号；第6,043,094号；第5,965,156号；第5,916,588号；第5,874,104号；第5,215,680号；及第4,684,479号中，所述专利的内容以全文引用的方式并入。这些描述经脂质体及经脂质包覆的微泡，及其制造方法。因此，本领域技术人员考虑到本发明的公开内容及这些其他专利的公开内容均可产生用于本发明多肽的延长释放的脂质体。
对于液体调配物，所需特性为调配物的形式供应可以通过25、28、30、31、32号标准规格针以用于静脉内、肌肉内、关节内或皮下施用。
经由经皮调配物的施用可使用本领域亦已知的方法进行，包括一般描述于例如美国专利第5,186,938号及6,183,770号、第4,861,800号、第6,743,211号、第6,945,952号、第4,284,444号及WO 89/09051的那些，以全文引用的方式并入本文中。经皮贴片为具有吸收问题的多肽的尤其适用的实施方案。可制造贴片以控制皮肤可渗透活性成分在12小时、24小时、3天及7天时间段内的释放。在一个实施例中，将每天2倍过量的本发明的多肽置放于非挥发性流体中。本发明的组合物为以黏稠、非挥发性液体形式提供。特定调配物经由皮肤的渗透性可通过本领域的标准方法量测(例如Franz等人,J.Invest.Derm.64:194-195(1975))。适合的贴片的实施例为被动转移皮肤贴片、离子导入皮肤贴片或具有微针的贴片(诸如Nicoderm)。
在其他实施方案中，组合物可经由鼻内、颊内或舌下途径递送至脑部以使得活性剂能够经由嗅觉通道转移至CNS中且减少全身性施用。常用于此施用途径的装置包括在美国专利第6,715,485号中。经由此途径递送的组合物可实现增加CNS给药或降低整体全身负担，从而降低与某些药物相关的全身毒性风险。可使用本领域已知的方法进行用于在皮下可植入装置中递送的药物组合物的制备，诸如于美国专利第3,992,518号；第5,660,848号；及第5,756,115号中所描述的那些方法。
渗透泵可用作呈片剂、丸剂、胶囊或可植入装置形式的缓释剂。渗透泵为本领域熟知且一般本领域技术人员可自提供用于延长释放药物递送的渗透泵经验丰富的公司容易获得。实施例为ALZA的DUROSTM；ALZA的OROSTM；Osmotica Pharmaceutical的OsmodexTM系统；ShireLaboratories的EnSoTrolTM系统；及；AlzetTM。描述渗透泵技术的专利为美国专利第6,890,918号；第6,838,093号；第6,814,979号；第6,713,086号；第6,534,090号；第6,514,532号；第6,361,796号；第6,352,721号；第6,294,201号；第6,284,276号；第6,110,498号；第5,573,776号；第4,200,0984号；及第4,088,864号，所述专利的内容以全文引用的方式并入。本领域技术人员考虑到本发明的公开内容及这些其他专利的公开内容均可产生用于本发明多肽的延长释放的渗透泵。
注射泵亦可用作缓释试剂。此类装置描述于美国专利第4,976,696号；第4,933,185号；第5,017,378号；第6,309,370号；第6,254,573号；第4,435,173号；第4,398,908号；第6,572,585号；第5,298,022号；第5,176,502号；第5,492,534号；第5,318,540号；及第4,988,337号中，所述专利的内容以全文引用的方式并入。本领域技术人员考虑到本发明的公开内容及这些其他专利的公开内容均可产生用于本发明组合物的延长释放的注射泵。
药物试剂盒
在另一方面中，本发明提供一种有助于使用BPXTEN多肽的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒至少在第一容器中包含：(a)一定量的BPXTEN融合蛋白组合物，其足以在向有需要的受试者施用时治疗疾病、病况或病症；及(b)一定量的药学上可接受的载剂；一起组成可供注射或用无菌水、缓冲剂或右旋糖重组的调配物；连同标识BPXTEN药物、储存及处理条件的标签，以及该药物的批准适应症表、用于预防和/或治疗批准适应症的BPXTEN药物重组和/或施用说明、适当剂量及安全信息，以及识别药物批次及有效期的信息。在前述另一实施方案中，试剂盒可包含可携载适用于BPXTEN组合物的稀释剂的第二容器，其将向使用者提供待递送至受试者的适当浓度的BPXTEN。
实施例
实施例1：XTEN的构建
XTEN及各种组分可如WO 2010/091122中所描述制造及组装，其以全文引用的方式并入本文中，且尤其参考其关于XTEN序列及其制造及组装的教示内容。
实施例2：产生和评估BPXTEN的方法；作为实施例的XTEN-细胞因子
产生及评估BPXTEN组合物的一般概要呈现于图6中，且形成本实施例的一般描述的基础。使用所公开的方法及一般本领域技术人员已知的方法连同提供于说明性实施例中的指南，本领域技术人员可产生及评估包含本领域已知的XTEN、BP及BP变体的BPXTEN融合蛋白的范围。因此，实施例应理解为仅为说明性的，且无论如何不以任何方式限制方法；许多变化形式对于一般本领域技术人员而言将为显而易见的。在此预示性实施例中，将产生与AE家族模体的XTEN连接的IL10的BPXTEN。
用于产生编码XTEN的聚核苷酸的一般概要呈现于图4及5中。图5为本发明的一个实施方案中XTEN聚核苷酸构建体的组装中代表性步骤的示意性流程图。将单独寡核苷酸501退火成序列模体502，诸如12个氨基酸模体(“12聚体”)，其随后与含有BbsI及KpnI限制性位点的寡核苷酸503接合。模体库可限于特定序列XTEN家族；例如表1的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列。在此情况下，AE家族的模体(SEQ ID NO:186-189)将用作模体库，将该模体库退火成12聚体以产生“建构组元”长度；例如编码36个氨基酸的区段。编码XTEN序列的基因可通过接合及多聚化“建构组元”进行组装，直至达成XTEN基因504的所需长度。如图5中所示，在此情况下XTEN长度为48个氨基酸残基，但可通过此方法获得较长长度。例如，多聚化可通过接合、重叠延伸、PCR组装或本领域已知的类似克隆技术进行。可将XTEN基因克隆至填充载体中。在图5中所示的实施方案中，载体可编码Flag序列506，随后为由BsaI、BbsI及KpnI位点侧接的填充序列507及BP基因(例如肠促胰岛素类似物-4)508，产生编码BPXTEN500的基因，在该种状况下其编码N端至C端XTEN-IL10构型的融合蛋白。
编码IL10(或另一候选物BP)的DNA序列可方便地通过本领域已知的标准程序自适当细胞来源制备的cDNA库，自基因组库获得，或可使用获自公开可用的数据库、专利或文献参考的DNA序列以合成方式(例如自动化核酸合成)产生。接着可以将编码蛋白质的IL10部分的基因或聚核苷酸克隆至构建体中，诸如本文所描述的构建体中，该构建体可为质体或其他载体，在适当转录及翻译序列控制下用于在生物系统中进行高水平蛋白质表达。编码XTEN部分的第二基因或聚核苷酸(在图5所示为具有48个氨基酸残基的AE的情况下)可通过经由接合或多聚化步骤将其克隆至与编码IL10的基因相邻且同框的构建体中而基因融合于编码IL10基因的N端的核苷酸。以此方式，编码(或与其互补)XTEN-IL10 BPXTEN融合蛋白的嵌合DNA分子将在构建体内产生。构建体可以不同构型设计以将融合搭配物的各种排列编码为单体多肽。举例而言，基因可经创建以按顺序(N端至C端)编码融合蛋白：IL10-XTEN；XTEN-IL10；IL10-XTEN-IL10；XTEN-IL10-XTEN；以及前述多聚体。任选地此嵌合DNA分子可转移或克隆至为更适合表达载体的另一构建体中。此时，能够表达嵌合DNA分子的宿主细胞将经嵌合DNA分子转化。含有相关DNA区段的载体可通过熟知方法转移至适当宿主细胞中，视细胞宿主的类型而定，如上文所描述。
含有XTEN-IL10表达载体的宿主细胞将在经修饰以适于活化启动子的常规营养物培养基中培养。培养条件(诸如温度、pH值及其类似条件)为先前用于经选择用于表达的宿主细胞的培养条件，且对于一般本领域技术人员而言将显而易见。在表达融合蛋白之后，细胞将通过离心收集，通过物理或化学手段破坏，且所得粗制提取物经保留以供融合蛋白纯化，如下文所描述。对于宿主细胞分泌的BPXTEN组合物而言，将分离来自离心的上清液且保留用于进一步纯化。
基因表达可在样品中直接量测，例如通过用以定量mRNA的转录的常规南方墨点法、北方墨点法(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980))、斑点杂交(DNA分析)或原位杂交，使用经适当标记地探针，基于本文所提供的序列。或者，基因表达可通过荧光方法，诸如细胞的免疫组织化学染色来量测，以直接定量基因产物的表达。适用于免疫组织化学染色和/或样品流体分析的抗体可以为单克隆或多克隆的，且可在任何哺乳动物中制备。适宜地，可基于本文所提供的序列或针对融合至IL10且编码特异性抗体抗原决定基之外源性序列，针对IL10序列多肽来制备抗体。可选标记的实施例为本领域技术人员所熟知且包括报导子，诸如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。
XTEN-IL10多肽产物将经由本领域已知的方法纯化。诸如凝胶过滤、亲和纯化、盐分馏、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、羟基磷灰石吸附色谱法、疏水性相互作用色谱法及凝胶电泳的程序皆为可用于纯化的技术。纯化的特定方法描述于Robert K.Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Charles R.Castor编,Springer-Verlag1994，及Sambrook,等人,前述。多步骤纯化分离亦描述于Baron,等人,Crit.Rev.Biotechnol.10:179-90(1990)及Below,等人,J.Chromatogr.A.679:67-83(1994)。
如图6中所示，接着将经分离的XTEN-IL10融合蛋白针对其化学及活性特性进行表征。使用本领域已知的标准方法，将经分离的融合蛋白例如对于序列、纯度、表观分子量、溶解度及稳定性进行表征。随后将评估符合预期标准的融合蛋白的活性，其可使用本文所公开的一种或多种分析体外或体内量测。
另外，将XTEN-IL10融合蛋白施用一种或多种动物物种以测定标准药物动力学参数，如实施例25中所描述。
通过产生、表达及回收XTEN-IL10构建体的叠代过程，随后使用本文所公开的方法或本领域已知的其他方法进行表征，可产生包含IL10及XTEN的BPXTEN组合物，且由一般本领域技术人员评估以证实预期特性(诸如增强的溶解度、增强的稳定性、改良的药物动力学及降低的免疫原性)产生与相应未融合IL10相比整体增强的治疗活性。对于不具有所需特性的那些融合蛋白，不同序列可通过这些方法构建、表达、分离及评估以便获得具有此类特性的组合物。
实施例3：XTEN融合蛋白的分析尺寸排阻色谱法
对含有各种治疗蛋白及增加长度的非结构化重组蛋白的融合蛋白进行尺寸排阻色谱法分析。例示性分析使用TSKGel-G4000 SWXL(7.8mm×30cm)柱，其中浓度为1mg/ml的40μg经纯化的升糖素融合蛋白在20mM磷酸盐pH 6.8、114mM NaCl中以0.6ml/min的流动速率分离。使用OD214nm及OD280nm监测色谱图概况。所有分析的柱校准使用来自BioRad的尺寸排阻校准标准进行。认为包含IL10及XTEN的融合蛋白可降低肾清除率，从而促成增加终末半衰期且相对于相应未融合生物活性蛋白改良了治疗或生物效应。
实施例4：C端XTEN的释放速率优化
可产生融合蛋白的变体，其中C端XTEN的释放速率改变。由于XTEN释放蛋白酶的XTEN释放速率视XTEN释放位点的序列而定，通过改变XTEN释放位点中的氨基酸序列，可控制XTEN释放速率。多种蛋白酶的序列特异性为本领域所熟知，且记录于若干数据库中。在此情况下，蛋白酶的氨基酸特异性将使用底物的组合库[Harris,J.L.等人,(2000)Proc NatlAcad Sci U S A,97:7754]或通过裂解底物混合物，如[Schellenberger,V.等人,(1993)Biochemistry,32:4344]中所说明来进行映射。替代方案为通过噬菌体展示来识别所需蛋白酶裂解序列[Matthews,D.等人,(1993)Science,260:1113]。构建体将用变体序列制成且使用用于检测XTEN多肽的标准分析来分析XTEN释放。
实施例5：通过预测算法分析二级结构的序列
氨基酸序列可经由某些计算机程序或算法来评估二级结构，诸如熟知的Chou-Fasman算法(Chou,P.Y.,等人(1974)Biochemistry,13:222-45)及Garnier-Osguthorpe-Robson或(“GOR”)方法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996).GOR method forpredicting protein secondary structure from amino acid sequence.MethodsEnzymol 266:540-553)。对于给定序列，算法可预测存在一些二级结构或根本不存在，表示为形成例如α-螺旋或β-折叠的序列的残基的总数和/或百分比或预测导致无规卷曲形成的序列的残基的百分比。
已使用两个用于Chou-Fasman及GOR方法的算法工具评估来自XTEN“家族”的若干代表性序列以评估这些序列中二级结构的程度。Chou-Fasman工具由William R.Pearson及弗吉尼亚大学的“生物支持(Biosupport)”因特网站点提供，网址为全球信息网.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝misc1，因其存在于2009年6月19日。GOR工具由Pole Informatique Lyonnais在网络蛋白质序列分析因特网站点提供，网址为全球信息网.npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl，因其存在于2008年6月19日。
作为分析中的第一步骤，单一XTEN序列通过两种算法进行分析。AE864组合物为具有864个氨基酸残基的XTEN，所述氨基酸残基由四个12个氨基酸序列模体的多个复本产生，所述氨基酸序列模体由氨基酸G、S、T、E、P及A组成。序列模体的特征在于在模体内及在整个序列内存在限制的重复量，因为任何两个连续氨基酸的序列任一个12个氨基酸模体中的重复不超过两次，且全长XTEN没有三个连续氨基酸为相同的。通过Chou-Fasman及GOR算法分析AF 864序列自N端的连续较长部分(后者需要最小长度为17个氨基酸)。通过将FASTA格式序列输入预测工具且进行分析来分析序列。分析的结果呈现于表10中。
结果指示，通过周-Fasman计算，AE家族的四个模体((表1)不具有α-螺旋或β折叠。类似地发现具有至多288个残基的序列不具有α-螺旋或β折叠。预测432个残基序列具有少量二级结构，其中仅2个氨基酸促成α-螺旋，总百分比为0.5％。全长AF864多肽具有促成α-螺旋的相同的两个氨基酸，总百分比为0.2％。针对无规卷曲形成的计算揭露，随着长度增加，无规卷曲形成的百分比亦增加。序列之前24个氨基酸具有91％无规卷曲形成，其随着长度增加，全长序列的无规卷曲形成值增加至多达99.77％。
亦分析来自其他模体家族的500个氨基酸或更长的许多XTEN序列，且显示大部分具有大于95％无规卷曲形成。例外为具有三个连续丝氨酸残基的一个或多个实施例的那些序列，其导致预测至β折叠形成。然而，即使这些序列仍具有约99％无规卷曲形成。
相比之下，受限于A、S及P氨基酸的84个残基的多肽序列由Chou-Fasman算法评估，该算法预测了高度预测的α-螺旋。该序列具有多个重复“AA”及“AAA”序列，其α-螺旋结构的总体预测的百分比为69％。GOR算法预测78.57％随机卷曲形成；远小于本发明实施例分析的由氨基酸G、S、T、E、P组成的任何由12个氨基酸序列模体组成的序列。
结论：该分析支持以下结论：1)由对连续氨基酸具有有限重复性的G、S、T、E、P及A的多个序列模体产生的XTEN经预测为具有极低量的α-螺旋及β-折叠；2)增加XTEN的长度不会明显地增加α-螺旋或β-折叠形成的机率；及3)通过添加由氨基酸G、S、T、E、P及A组成的非重复12聚体逐渐增加XTEN序列的长度，使得随机卷曲形成的百分比增加。相比之下，由受限于A、S及P的氨基酸产生的具有高度内部重复性的多肽经预测为具有高百分比的α-螺旋以及随机卷曲形成，如通过-Fasman算法所测定。基于通过这些方法评估的许多序列，一般由具有受限重复性(定义为任何一个模体中不超过两个相同连续氨基酸)且长度大于约400个氨基酸残基的G、S、T、E、P及A的序列模体产生的XTEN预期具有极有限的二级结构。除含有三个连续丝氨酸的模体之外，咸信来自表1的序列模体的任何次序或组合可用于产生长度大于约400个残基的XTEN多肽，该多肽将产生实质上不含二级结构的XTEN序列。预期此类序列具有本文所公开的本发明的BPXTEN实施方案中所描述的特征。
表10：多肽序列的CHOU-FASMAN和GOR预测计算
Figure BDA0004014658270001071
Figure BDA0004014658270001081
Figure BDA0004014658270001091
Figure BDA0004014658270001101
Figure BDA0004014658270001111
Figure BDA0004014658270001121
Figure BDA0004014658270001131
Figure BDA0004014658270001141
Figure BDA0004014658270001151
Figure BDA0004014658270001161
Figure BDA0004014658270001171
Figure BDA0004014658270001181
Figure BDA0004014658270001191
*H：α-螺旋E：β-折叠
实施例6：多肽序列重复性的分析
多肽氨基酸序列可通过量化整个多肽内所出现的较短子序列的次数而评估重复性。举例而言，200个氨基酸残基的多肽具有192个重叠9-氨基酸子序列(或9聚体“框架”)，但独特9聚体序列的数目将视序列内的重复量而定。在本发明分析中，通过对聚合物部分之前200个氨基酸中各3-氨基酸框架的所有唯一3聚体子序列的出现除以200个氨基酸序列内唯一3聚体子序列的绝对数进行求和来评估不同序列的重复量。所得子序列评分为多肽内的重复量程度的反映。
表11中所示的结果指示，由2或3种氨基酸类型组成的非结构化多肽具有高子序列评分，而由内部重复性程度较低的六种氨基酸G、S、T、E、P及A的12个氨基酸模体组成的那些非结构化多肽具有小于10，且在一些情况下，小于5的子序列评分。举例而言，L288序列具有两种氨基酸类型且具有短的高度重复序列，产生50.0的子序列评分。多肽J288具有三种氨基酸类型，但亦具有短重复序列，产生33.3的子序列评分。Y576亦具有三个氨基酸类型，但不由内部重复序列构成，反映在前200个氨基酸的子序列评分为15.7。W576由四种类型的氨基酸组成，但具有较高程度的内部重复量，例如“GGSG”(SEQ ID NO:270)，产生23.4的子序列评分。AD576由四种类型的12个氨基酸模体组成，所述模体各自由四种类型的氨基酸组成。因为单独模体的内部重复性程度较低，所以前200个氨基酸内的总子序列评分为13.6。相比之下，由四个模体组成的XTEN含有六种类型的氨基酸，每种氨基酸各自具有较低程度的内部重复性，具有较低子序列评分；例如AE864(6.1)、AF864(7.5)及AM875(4.5)。
结论：结果指示，12个氨基酸子序列模体(各自由四种至六种基本上非重复的氨基酸类型组成)组合成较长XTEN多肽，使得整体序列非重复。尽管每个子序列模体可能在整个序列中被多次使用，但依旧出现此情况。相比之下，由较小数目的氨基酸类型产生的聚合物产生较高子序列评分，但可定制实际序列以降低产生较低子序列评分的重复程度。
表11：多肽序列的子序列评分计算
Figure BDA0004014658270001201
Figure BDA0004014658270001211
Figure BDA0004014658270001221
Figure BDA0004014658270001231
Figure BDA0004014658270001241
Figure BDA0004014658270001251
实施例7：TEPITOPE评分计算
9聚体肽序列的TEPITOPE评分可通过添加口袋电势来计算，如通过Sturniolo描述[Sturniolo,T.,等人(1999)Nat Biotechnol,17:555]。在本实施例中，计算单独HLA等位基因的单独Tepitope评分。为了计算具有序列P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9的肽的TEPITOPE评分，添加表12中的相应单独口袋电势。具有序列FDKLPRTSG(SEQ ID NO:271)的9聚体肽的HLA*0101B评分将为0、-1.3、0、0.9、0、-1.8、0.09、0、0的总和。
为评定较长肽的TEPITOPE评分，可针对所有9聚体序列来重复该过程。可针对由其他HLA等位基因编码的蛋白质重复此过程。表13至表16给出高加索人群体中高频率出现的HLA等位基因的蛋白质产物的口袋电势。
通过此方法计算的TEPITOPE评分在约-10至+10范围内。然而，P1位置缺乏疏水性氨基酸(FKLMVWY(SEQ ID NO:272))的9聚体肽已计算出的TEPITOPE评分在-1009至-989范围内。此值在生物学上无意义，且反映以下事实：疏水性氨基酸充当HLA结合的锚定残基，且P1中缺乏疏水性残基的肽视为HLA的非结合物。因为大部分XTEN序列缺乏疏水性残基，所以9聚体子序列的所有组合将具有在-1009至-989范围内的TEPITOPE。此方法证实XTEN多肽可具有极少或不具有预测的T细胞抗原决定基。
表12：HLA*0101B等位基因的口袋电势.
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 -2.4 - -2.7 -2 - -1.9
E -999 0.1 -1.2 -0.4 - -2.4 -0.6 - -1.9
F 0 0.8 0.8 0.08 - -2.1 0.3 - -0.4
G -999 0.5 0.2 -0.7 - -0.3 -1.1 - -0.8
H -999 0.8 0.2 -0.7 - -2.2 0.1 - -1.1
I -1 1.1 1.5 0.5 - -1.9 0.6 - 0.7
K -999 1.1 0 -2.1 - -2 -0.2 - -1.7
L -1 1 1 0.9 - -2 0.3 - 0.5
M -1 1.1 1.4 0.8 - -1.8 0.09 - 0.08
N -999 0.8 0.5 0.04 - -1.1 0.1 - -1.2
P -999 -0.5 0.3 -1.9 - -0.2 0.07 - -1.1
Q -999 1.2 0 0.1 - -1.8 0.2 - -1.6
R -999 2.2 0.7 -2.1 - -1.8 0.09 - -1
S -999 -0.3 0.2 -0.7 - -0.6 -0.2 - -0.3
T -999 0 0 -1 - -1.2 0.09 - -0.2
V -1 2.1 0.5 -0.1 - -1.1 0.7 - 0.3
W 0 -0.1 0 -1.8 - -2.4 -0.1 - -1.4
Y 0 0.9 0.8 -1.1 - -2 0.5 - -0.9
表13：HLA*0301B等位基因的口袋电势.
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 2.3 - -2.4 -0.6 - -0.6
E -999 0.1 -1.2 -1 - -1.4 -0.2 - -0.3
F -1 0.8 0.8 -1 - -1.4 0.5 - 0.9
G -999 0.5 0.2 0.5 - -0.7 0.1 - 0.4
H -999 0.8 0.2 0 - -0.1 -0.8 - -0.5
I 0 1.1 1.5 0.5 - 0.7 0.4 - 0.6
K -999 1.1 0 -1 - 1.3 -0.9 - -0.2
L 0 1 1 0 - 0.2 0.2 - -0
M 0 1.1 1.4 0 - -0.9 1.1 - 1.1
N -999 0.8 0.5 0.2 - -0.6 -0.1 - -0.6
P -999 -0.5 0.3 -1 - 0.5 0.7 - -0.3
Q -999 1.2 0 0 - -0.3 -0.1 - -0.2
R -999 2.2 0.7 -1 - 1 -0.9 - 0.5
S -999 -0.3 0.2 0.7 - -0.1 0.07 - 1.1
T -999 0 0 -1 - 0.8 -0.1 - -0.5
V 0 2.1 0.5 0 - 1.2 0.2 - 0.3
W -1 -0.1 0 -1 - -1.4 -0.6 - -1
Y -1 0.9 0.8 -1 - -1.4 -0.1 - 0.3
表14：HLA*0401B等位基因的口袋电势.
Figure BDA0004014658270001261
Figure BDA0004014658270001271
表15：HLA*0701B等位基因的口袋电势.
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 -1.6 - -2.5 -1.3 - -1.2
E -999 0.1 -1.2 -1.4 - -2.5 0.9 - -0.3
F 0 0.8 0.8 0.2 - -0.8 2.1 - 2.1
G -999 0.5 0.2 -1.1 - -0.6 0 - -0.6
H -999 0.8 0.2 0.1 - -0.8 0.9 - -0.2
I -1 1.1 1.5 1.1 - -0.5 2.4 - 3.4
K -999 1.1 0 -1.3 - -1.1 0.5 - -1.1
L -1 1 1 -0.8 - -0.9 2.2 - 3.4
M -1 1.1 1.4 -0.4 - -0.8 1.8 - 2
N -999 0.8 0.5 -1.1 - -0.6 1.4 - -0.5
P -999 -0.5 0.3 -1.2 - -0.5 -0.2 - -0.6
Q -999 1.2 0 -1.5 - -1.1 1.1 - -0.9
R -999 2.2 0.7 -1.1 - -1.1 0.7 - -0.8
S -999 -0.3 0.2 1.5 - 0.6 0.4 - -0.3
T -999 0 0 1.4 - -0.1 0.9 - 0.4
V -1 2.1 0.5 0.9 - 0.1 1.6 - 2
W 0 -0.1 0 -1.1 - -0.9 1.4 - 0.8
Y 0 0.9 0.8 -0.9 - -1 1.7 - 1.1
表16：HLA*1501B等位基因的口袋电势.
Figure BDA0004014658270001272
Figure BDA0004014658270001281
表17：BP的例示性生物活性、例示性分析及优选适应症
Figure BDA0004014658270001282
表18：连接至XTEN的例示性BPXTEN
Figure BDA0004014658270001283
Figure BDA0004014658270001291
Figure BDA0004014658270001301
*序列名称反映BP和XTEN组分的N端至C端构型
表B.例示的XTEN化IL-12构建体和参考构建体的DNA和氨基酸序列.
Figure BDA0004014658270001311
Figure BDA0004014658270001321
Figure BDA0004014658270001331
Figure BDA0004014658270001341
如上文在表B中所示，位于各例示的融合蛋白的C端或N端处的聚组氨酸标签(His标签)为任选存在的。
实施例8：IL12活性分析
HEK-Blue IL12报导细胞购自InvivoGen且在37℃、5％ CO2下在由DMEM、4.5g/l葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml Normocin、1×HEK-Blue Selection组成的培养基中培养。对于IL12活性分析，如按照前一句所描述制备测试培养基，但不含Normocin及Selection抗生素。使测试培养基及1×PBS在水浴中升温至37℃。通过用预温热的PBS洗涤烧瓶，然后将细胞自烧瓶移走，接着在室温下以300×g(1200rpm)离心5分钟，测定细胞存活率及将测试培养基中的细胞集结粒再悬浮至0.833×10e6个细胞/毫升。将九十微升(90μL)细胞等分至96孔平透明底板(Costar，cat#3595)的各孔中。IL12测试物品在测试培养基中以10X浓度制备，其中17nM为最高浓度，接着连续10倍稀释至1.7pM。随后，将10uL 10×溶液添加至90μL细胞中，且将板24小时培育。次日，通过在室温MilliQ水中将QB试剂及QB缓冲剂各自稀释至1％(v/v)浓度来制备QuantiBlue溶液，其为分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的检测试剂。将混合物在室温下培育10分钟。随后，将180μL等分至96孔平底组织培养板的各孔中，且添加20μL上清液至各孔中。在37℃、5％ CO2下培育板6小时。在不同培育时间间隔(15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时)下，使用微量盘读取器量测650nm处的光密度(O.D.)。通过Excel软件分析结果且在此自3小时时间点呈现。
如图8中所示，回应于IL-12诱导的STAT4活化而产生分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的IL-12报导细胞用增加浓度的IL-12测试物品处理24小时。使用QuantiBlue溶液量测上清液中的SEAP水平，且在650nm的光学密度下读取板。XTEN化IL12(SEQ ID NO:2)组合物曲线(三角形)相对于相应去XTEN化IL12组合物曲线(菱形)偏移至少2倍，指示XTEN的掩蔽效应降低了细胞因子活性。
实施例9：IL12受体结合分析
表达人类IL-12受体的HEK-Blue IL-12报导细胞(Invivogen，如实施例8中所描述)用于评估IL-12构建体与IL-12受体的结合。将含有具有N端his标签外加XTEN序列继的以释放区段序列的重组单链小鼠IL12的例示“XTEN化IL12”构建体(SEQ ID NO:2)(1μM)的浓度增加，将其与随后洗涤的50,000个293HEK-IL-12报导细胞一起培育，且通过流式细胞测量术使用用于检测的抗His标签抗体荧光标记的荧光测量术监测表面结合的IL12。比较通过XTEN化IL12的结合与含有重组单链小鼠IL-12及C端His标签的参考IL-12构建体(SEQID NO:4)的结合。由于在用人类基质金属肽酶9(MMP9)活化之后来自XTEN化IL-12释放出His标签，不能评估IL-12在此分析中其活化形式的结合。通过MMP9裂解释放的XTEN片段保留His标签，且用作结合的特异性对照。如图9A至图9B中所示，XTEN当存在于融合蛋白中时掩蔽细胞因子与其相应IL12受体的结合。当不连接至XTEN时，XTEN化IL-12展现出相比于IL12的相应结合活性降低的结合亲和力，如通过半最大有效浓度(EC50)中的增加所表征。
实施例10：例示性Xten化IL12构建体
在某些例示性实施方案中，使用已XTEN化四次的IL12次单元产生XTEN化IL12构建体。下表提供已XTEN化的例示性IL12 p35次单元及已XTEN化的IL12 p40次单元的核酸及氨基酸序列。
图10A及10B展示以上两种构建体的示意图。HEK Blue IL12活性分析实质上如以上实施例9中所描述进行。来自所述分析的资料在图10C中整理且呈现于下表19中：
表19：使用HEK Blue分析报告的IL12活性
EC50 掩蔽
muIL12 25 n/a
(AP2551XPAC) 7117 430
(AP2551PAC) 17 -
(具有TG标签的AP2552XPAC) 2746 95
(具有TG标签的AP2552PAC) 29 -
这些数据清楚地表明，产生的PAC具有与重组muIL12等效的活性，正如异二聚体制剂的预期，且当不与XTEN连接时，IL12的XTEN化导致结合亲和力与IL12的相应结合活性相比有所降低，如通过半最大有效浓度(EC50)中的增加所表征。因此，此数据展示IL12-XPAC-4X构建体展现与裸IL12相当的充分掩蔽及活性。此外，转谷氨酰胺酶标签的存在不影响IL12活性。
在另一分析中，比较1(AP2450)、3(AP2447)及4(AP2446)XTEN对IL12的效应(图11A-C及表20)。
Figure BDA0004014658270001361
关于所产生的数据，可见所有XTEN促进掩蔽，且在单一位点增加XTEN不会提供额外益处，但使用双质体形式进行表达可提供额外XTEN添加益处。最佳构建体：选择AP2446、AP2450、AP2407用于进一步研究。
在下一个叠代中，IL12-XPAC-4X构建体经重新设计以探究IL12异二聚体的纯化及分析中的每一者的设计。三个构建体的设计展示于下表中，且构建体的示意图展示于图12A(由表22中所示的XP5/XP13序列构成的IL12-XPAC-4X.1)、12B(由表22中所示的XP4/XP10序列构成的IL12-XPAC-4X.2)及12C(下表22中所示的XP3/XP9序列构成的IL12-XPAC-4X.3)中作为示意图，且如下表21所描述：
表21：各自包含4个XTEN序列的三个例示性IL12-XPAC的特征
Figure BDA0004014658270001362
表22：表21中所示的XPAC的例示性XTEN化次单元的序列
Figure BDA0004014658270001363
Figure BDA0004014658270001371
Figure BDA0004014658270001381
Figure BDA0004014658270001391
Figure BDA0004014658270001401
Figure BDA0004014658270001411
Figure BDA0004014658270001421
Figure BDA0004014658270001431
Figure BDA0004014658270001441
Figure BDA0004014658270001451
Figure BDA0004014658270001461
Figure BDA0004014658270001471
Figure BDA0004014658270001481
Figure BDA0004014658270001491
Figure BDA0004014658270001501
Figure BDA0004014658270001511
Figure BDA0004014658270001521
Figure BDA0004014658270001531
Figure BDA0004014658270001541
Figure BDA0004014658270001551
Figure BDA0004014658270001561
Figure BDA0004014658270001571
Figure BDA0004014658270001581
Figure BDA0004014658270001591
Figure BDA0004014658270001601
Figure BDA0004014658270001611
Figure BDA0004014658270001621
Figure BDA0004014658270001631
Figure BDA0004014658270001641
Figure BDA0004014658270001651
Figure BDA0004014658270001661
Figure BDA0004014658270001671
Figure BDA0004014658270001681
Figure BDA0004014658270001691
实施例11：IL12-XPAC-4X测试化合物对小鼠模型的体内效应
在携带MC38肿瘤的C27/Blk6小鼠模型中监测IL-12-XPAC-4X的毒性。使用此鼠类模型比较测试化合物对muIL12的毒性作用。测试物品在非肿瘤携带小鼠(D03、D13、D16及D19)中每3天进行施用。在此模型中在施用的剂量下未看到显著毒性(如通过体重减轻所量测)。这些资料展示于图15B中，其展示在这些非肿瘤携带小鼠中，用XPAC处理的小鼠中不存在毒性的迹象，如根据体重变化所量测。然而，在用IL12处理的小鼠中，如通过体重减轻百分比证明，存在剂量依赖性毒性。
下表展示测试rIL-12和IL-12XPAC功效的体内研究设计：
Figure BDA0004014658270001692
图14展示自上述研究产生的肿瘤消退资料。相比于对照组(第1组)中的小鼠，用IL-12XPAC(第5组及第6组)处理的小鼠中的肿瘤体积显著降低。相比较地，用rIL-12(第2组、第3组及第4组)处理的小鼠中几乎无肿瘤消退。图15A展示前述组的毒性/体重资料，且展示由于施用测试物品而体重无变化。
实施例12：包含肿瘤靶向域的XTEN化IL12构建体.
图13展示本发明的额外例示性实施方案，其中XPAC进一步包含肿瘤靶向域。尽管此图展示一个链上的肿瘤靶向域，但应理解，肿瘤靶向域可存在于多于一个链上且可存在于其他XTEN链中之一者上。肿瘤靶向域的位置应使得其不干扰细胞因子的掩蔽且亦使得其能够识别靶向肿瘤靶向域的抗原。
在例示性实施方案中，肿瘤靶向域亦可经XTEN化。理想地，肿瘤靶向域为表达于肿瘤细胞上但不存在于健康组织中的肿瘤靶向域。举例而言，在肿瘤中及在慢性发炎病况中，组织重塑及新血管生成过程暴露抗原，否则所述抗原在健康器官中几乎不可检测。一个实施例为由纤维结合蛋白的剪接变体表示的，糖蛋白为细胞外基质(ECM)的糖蛋白。纤维结合蛋白之外域A及B(EDA及EDB)在肿瘤中、在组织重塑的部位及在胚胎发育期间强烈表达，但原本在正常组织中未发现，雌性生殖系统除外。类似地，在通过细胞内pH值调节的方法中，肌腱蛋白-C的剪接变体尤其发现于经历新生血管生成的组织及肿瘤中。因此，肌腱蛋白-C的EDA、EDB及剪接变体代表传递生物活性有效负载(如细胞因子)的适合目标。
在致癌恶性肿瘤中，分子标靶可包括纤维母细胞活化蛋白(FAP)、细胞抗原(例如CEA及PSMA)或蛋白质，其在坏死病灶(诸如组蛋白)中变得可接近。在细胞因子融合物的情况下已广泛表征的抗体包括F8(靶向EDA-纤维结合蛋白；关于例示性EDA靶向抗体参见美国公开案20210163579)、L19(靶向EDB-纤维结合蛋白；美国公开案20200397915)、F16(靶向肌腱蛋白-C的A1域)、scFv36(靶向FAP)、hu14.18(靶向GD2神经节苷脂)、chCLL-1(靶向CD20)及抗HER2/neu。
简言之，本领域技术人员将引用美国公开案20200397915，其提供经设计以靶向纤维结合蛋白EDB的IL-12构建体的详细描述。美国公开案20210163579显示靶向纤维结合蛋白的ED-A的例示性构建体。纤维结合蛋白的ED-A已显示为肿瘤血管生成的标记，且F8抗体已单独用于肿瘤靶向(WO2008/12001、WO2009/0136619、WO2011/015333)或与TNF或IL2或两者融合(Villa等人(2008)Int.J.Cancer 122,2405-2413；Hemmerle等人(2013)Br.J.Cancer 109,1206-1213；Frey等人(2008)J.Urol.184,2540-2548、WO2010/078945、WO2008/120101、WO2016/180715)与IL4融合(WO2014/173570)、或与IL12融合(WO2013/014149)。
用于本发明的XPAC的尤其优选肿瘤靶向域为US公开案20200397915中所描述的L19抗体或其功能变体。下表23显示L19的可变重链及轻链的序列以及来自那些链的CDR序列。
表23：在XPAC中用作肿瘤结合域的例示性L19抗体序列
Figure BDA0004014658270001701
Figure BDA0004014658270001711
尽管本文已展示及描述本发明的优选实施方案，但本领域技术人员将明白，此类实施方案仅借助于实施例提供。不希望本发明受本说明书中所提供的具体实施例的限制。尽管已参考前述说明书描述本发明，但本文实施方案的描述及说明并不意欲以限制性意义来解释。本领域技术人员可在不背离本发明的情况下想到许多变化形式、改变及取代。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的取决于各种条件及变量的具体描绘、构型或相对比例。应了解，本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。因此，预期本发明亦应涵盖任何此类替代方案、修改、变化或等效物。希望以下权利要求书限定本发明的范围，且从而涵盖此权利要求书及其等效物的范围内的方法及结构。

Claims (34)

1.一种融合蛋白，其包含：
(a)延伸重组多肽(XTEN)，其特征在于：
i.其包含至少12个氨基酸；
ii.XTEN序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)及脯氨酸(P)；及
iii.其具有4至6个选自G、A、S、T、E及P的不同氨基酸；及
(b)与至少一个XTEN连接的细胞因子。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含1、2、3、4或更多个XTEN。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含肿瘤靶向域。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其进一步包含释放区段，其中该释放区段(RS)与选自表6至表7中所述序列的序列具有至少88％、至少94％或100％序列一致性。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中该肿瘤靶向域连接至与该细胞因子连接的所述XTEN中之一者。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中该肿瘤靶向域的C端连接至另一XTEN。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其进一步包含该肿瘤靶向域的C端与所述其他XTEN的N端之间的释放位点。
8.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中该融合蛋白具有XTEN-RS-细胞因子或细胞因子-RS-XTEN的自N端至C端的结构排列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白，其中该细胞因子选自由白介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子、群落刺激因子或TGF-β超家族成员组成的群。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中该细胞因子为选自由以下组成的群的白介素：IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16及IL17。
11.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中该细胞因子与选自表3或表A的序列具有至少90％序列一致性。
12.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中该细胞因子为IL-12或IL-12变体。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中该细胞因子包含第一细胞因子片段(Cy1)和第二细胞因子片段(Cy2)。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中该Cy1和该Cy2中之一者包含与白介素-12次单元β具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中该Cy1和该Cy2中的另一者包含与白介素-12次单元α具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
16.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中该第一细胞因子片段(Cy1)包含与序列SEQID NO.5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
17.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中该第二细胞因子片段(Cy2)包含与序列SEQID NO.6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的融合蛋白，其中该细胞因子包含位于该第一细胞因子片段(Cy1)与该第二细胞因子片段(Cy2)之间的接头。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中该融合蛋白包含Cy1片段，该片段包含N端处的XTEN和C端处的XTEN。
20.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中该融合蛋白包含Cy2片段，该片段包含N端处的XTEN和C端处的XTEN。
21.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中该细胞因子为包含与SEQ ID NO.7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列的IL-12变体。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中该XTEN序列由多个非重叠序列模体组成，其中所述序列模体选自表2a至表2b的序列模体。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的融合蛋白，其中该XTEN具有40至3000个氨基酸，或100至3000个氨基酸。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白，其中该XTEN与表2a至表2b中所述的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％序列一致性。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的融合蛋白，其中当连接至该融合蛋白中的该XTEN时，该细胞因子与相应细胞因子受体的结合活性的特征在于半最大有效浓度(EC50)比当未与该XTEN连接时在体外结合分析中测定的表征该细胞因子的相应结合活性的EC50大至少1.2倍、大至少1.4倍、大至少1.6倍、大至少1.8倍、大至少2.0倍、大至少3.0倍、大至少4.0倍、大至少5.0倍、大至少6.0倍、大至少7.0倍、大至少8.0倍、大至少9.0倍或大至少10.0倍。
26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述细胞因子为白介素12(IL-12)且所述相应细胞因子受体为白介素12受体(IL-12R)。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的融合蛋白，其中该体外结合分析利用基因工程改造的报导基因细胞株，该细胞株经构型成以报导蛋白的成比例表达对该细胞因子与该相应细胞因子受体的结合作出反应。
28.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的融合蛋白以及至少一种药学上可接受的载剂。
29.根据权利要求28所述的组合物在用于制备用于治疗有需要的受试者的疾病或病况的药剂中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中该疾病或病况选自癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、全身性红斑狼疮、阿尔茨海默氏症、精神分裂症、病毒感染、过敏性哮喘、视网膜神经退化性过程、代谢病症、胰岛素抗性及糖尿病性心肌症。
31.一种治疗或预防受试者的疾病或病况的方法，该方法包含向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求28所述的组合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中该疾病或病况为癌症或癌症相关疾病或病况。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其进一步包含向该受试者施用治疗有效量的至少一种免疫检查点抑制剂。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中该融合蛋白经静脉内、皮下或经口递送。
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