JP2023523016A

JP2023523016A - がんを処置するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2023523016A
Application number: JP2022564548A
Authority: JP
Inventors: ケレシュ，デイヴィッド; ヴァイス，サラ; マコーマック，スティーヴン; レイダー，クリストフ; ウェッターステン，ヒロミ
Original assignee: Alpha Beta Holdings LLC
Current assignee: Alpha Beta Holdings LLC
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2023-06-01
Also published as: EP4110822A1; US20230140868A1; IL296576A; KR20230019424A; CN115485301A; AU2021261003A1; MX2022013207A; BR112022019939A2; EP4110822A4; WO2021216956A1; CA3172092A1

Abstract

本発明は、キメラ結合性物質、およびそれを含む組成物に関する。本発明はさらに、キメラ結合性物質をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、キメラ結合性物質を用いて、上皮細胞がんの抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する方法、および上皮細胞がんを処置する方法に関する。

Description

［優先権の言明］
この出願は、２０２０年４月２３日に出願された米国仮出願第６３／０１４，５５０号の利益を主張し、その仮出願の全内容は参照により本明細書に組み入れられている。

本発明は、キメラ結合性物質およびそれを含む組成物に関する。本発明はさらに、キメラ結合性物質をコードするポリヌクレオチドならびにそれを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、キメラ結合性物質を用いて、上皮がん細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する方法、および上皮細胞がんを処置する方法に関する。

抗体は、特定の抗原と結合するタンパク質である。がん治療に承認されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびｍＡｂに基づいた試薬には、悪性Ｂ細胞およびプラズマ細胞（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７９Ｂ、ＳＬＡＭＦ７）、上皮がん細胞（ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ２、ネクチン－４）、急性骨髄性白血病（ＣＤ３３）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＣＲ４）、神経芽細胞腫（ＧＤ２）、および肉腫（ＰＤＧＦＲＡ）上に発現した抗原に方向づけられているものだけでなく、免疫チェックポイント標的（ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４）に方向づけられているいくつかが挙げられる（Ｇａｓｓｅｒ，２０１６；Ｃａｒｔｅｒ，２０１８）。合計４２個の抗体に基づいたがん治療が現在、ＦＤＡに承認され、市場に出ている。治療用抗体のがんに対する効力は、機構の組合せによって影響され得る（Ｃｈｉａｖｅｎｎａ，２０１７）。がん細胞上に選択的に発現した抗原との抗体の結合は、腫瘍細胞成長または生存経路を促進する抗原の機能を直接的に遮断することにより抗腫瘍効果を生じ得る。抗体はまた、腫瘍細胞破壊を間接的に誘導できる免疫エフェクター細胞と腫瘍細胞を引き合わせる橋として働き得る。

治療用抗体の性質は、糖鎖エンジニアリングおよびＦｃエンジニアリングアプローチの発展中の武器を使用して、または二重特異性もしくは三重特異性抗体の作製を通して、免疫エフェクター細胞のある特定の型との係合を増強または抑制するために改変することができる（Ｓａｘｅｎａ，２０１６；Ｒａｄｅｒ，２０２０）。これらのツールは、がん治療のための個別化医療アプローチを生み出す「抗原－エフェクターマッチング」の合理的デザインのために利用することができる。

単球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の係合を向上させることに焦点をおいた抗体エンジニアリング戦略には、ＮＫ細胞上に発現した唯一のＦｃ受容体である治療用抗体のＦｃ部のＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）との結合を促進する、糖鎖エンジニアリングおよびＦｃエンジニアリングされたバリアントの膨大なコレクションが挙げられる（Ｌａｚａｒ，２００６）。あまり一般的ではないが、いくつかの戦略は、マクロファージとの結合が増強した抗体バリアントを作製しており、そのバリアントには、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）との結合を促進するＧ２３６ＡＦｃ変異体（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，２００８）またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を介してマクロファージをリクルートする二重特異性抗体（Ｌｉ，２０１７）が挙げられる。

抗体治療のために抗原を選択することは、時間と共に進化するがん表現型に対処する必要がある。抗体治療用物質の類は、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＶＥＧＦＲ２などの高レベルのマーカーを発現する上皮がんについて開発されてきた。そのような抗原を標的化する抗体は、初期腫瘍について効果的であり得るが、上皮がんは、上皮マーカーの喪失および間葉系マーカーの獲得だけでなく（Ｋａｒａｃｏｓｔａ，２０１９）、腫瘍微小環境および免疫細胞浸潤における変化（Ｄｏｎｇｒｅ，２０１９）も含む上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こすことが知られている。そのようなものとして、間葉系状態へ変換する上皮腫瘍を標的化することは、異なる抗原－エフェクター細胞の組合せを必要とし得る。

ＥＭＴは、腫瘍のストローマ成分とのクロストークにおいて腫瘍細胞表現型を描写する動的過程である（Ｄｏｎｇｒｅ，２０１９）。がん関連線維芽細胞、マクロファージ、および他の免疫細胞は、腫瘍細胞と係合して、ＥＭＴを誘導する転写因子の発現を活性化する様々なサイトカインおよび因子を分泌する。間葉系様癌腫細胞はまた、抗腫瘍免疫細胞型を排除して、腫瘍促進性マクロファージをリクルートする免疫不全状態へ腫瘍の免疫コンポーネントをシフトする。

そのようなものとして、「免疫的にコールド（ｉｍｍｕｎｅ－ｃｏｌｄ）」であることが多い間葉系腫瘍の抗体治療用物質による標的化には、「免疫的にホット（ｉｍｍｕｎｅ－ｈｏｔ）」であることが多い上皮腫瘍について開発されたものとは異なる抗原－エフェクター細胞の組合せを必要とし得る。ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＶＥＧＦＲ２などの上皮マーカーを認識する抗体が開発され、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＮＫ細胞上の受容体と係合するように最適化されてきた。上皮様腫瘍について、いくつかの承認された治療用抗体は、そのような抗原－エフェクターの組合せについて良いマッチングを提供する。対照的に、エフェクター細胞としてのマクロファージと係合する能力がある、間葉系様腫瘍細胞の表面上に発現した抗原を認識する抗体は、固形腫瘍についての治療用抗体開発の分野においては要求を満たしていない。ＥＭＴを起こしているがんは、侵襲性、転移性、および薬剤抵抗性がより高い傾向がある。したがって、ＥＭＴを起こしている腫瘍細胞を攻撃する薬物を有することは、腫瘍進行および薬剤抵抗性を減少させる可能性が高い。

したがって、特にＥＭＴを起こしている後期上皮がんを含むがんを処置するための、新しい組成物、およびそのような組成物を用いる方法の必要性が存在する。

本発明は、上皮がん細胞、および、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の変化を含むＥＭＴ過程の理解に一部基づいている。この転換過程の中核をなすこととして、上皮腫瘍細胞が、それらの細胞表面上のαｖβ３インテグリンの発現を獲得し、薬剤抵抗性で、表現型においてより幹様になり、加えて、低酸素または他の環境ストレスに対して非感受性になる。上皮がん細胞上のαｖβ３の発現は、微小環境内の様々な形の細胞ストレスによっても、または広範囲な抗がん薬の適用によっても、引き起こされる。したがって、標準治療の療法で進行しており、それによりαｖβ３を発現する患者は、αｖβ３抗原を標的化する治療の候補である。αｖβ３が薬剤抵抗性に必要かつ十分であるとすれば、αｖβ３陽性腫瘍細胞を選択的に標的化することにより、がん獲得薬剤抵抗性を阻止または逆転させることが可能であろうことはあり得る。

本発明は、ＥＭＴを起こしており、かつ、細胞表面マーカーαｖβ３を獲得している上皮がん細胞に対して、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を効果的に媒介するために、適切な免疫エフェクター細胞を係合させる組成物および方法を提供する。

本発明者らは、抗体により標的化されるがん細胞の死をもたらすＡＤＣＣが、マクロファージにより媒介されるが、ＮＫ細胞によっては媒介されないことを特定している。さらに、その細胞死には、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）も抗体単独による直接的致死も含まれない。エフェクター細胞としてのマクロファージの抗体係合は、典型的にはＡＤＣＰを促進すると以前、理解されていた。驚くべきことに、本発明者らは、本発明のキメラ結合性物質が、ヒト細胞標的のＡＤＣＰを誘導せず、代わりに、もっぱらマクロファージ依存性ＡＤＣＣだけを促進することを特定した。この予想外の所見は、いくつかある利益の中でも特に、有利には、食作用またはＡＤＣＰに対して通常は抵抗性であるＣＤ４７陽性腫瘍細胞の処置を可能にする。もっぱらＡＤＣＣだけを促進する結合性物質は、それが遭遇するあらゆる細胞を致死させるであろうが、ＡＤＣＰを促進する結合性物質は、ＣＤ４７陽性細胞を致死させることができないであろう。したがって、本発明のキメラ結合性物質は、より効率的であると予想される。理論に縛られるつもりはないが、本発明の優位性は、キメラ結合性物質（例えば、ＩｇＧ４ドメイン）および／または抗原を発現する細胞をＡＤＣＰよりむしろＡＤＣＣに対して特に感受性が高いようにさせる、認識されることになっている抗原（例えば、インテグリンαｖβ３）の構造に基づいていると考えられる。

間葉系腫瘍は、上皮マーカー（例えば、Ｅ－カドヘリン、ＥｐＣＡＭ、オクルディン、クローディン、およびサイトケラチン）を抑圧し、間葉系マーカー（例えば、細胞接着関連タンパク質Ｎ－カドヘリン、ビメンチン、フィブロネクチン、β１およびβ３インテグリン、ならびにＭＭＰ）の発現を促進する転写因子（ＺＥＢ、ＳＮＡＩＬ、ＳＬＵＧ、およびＴＷＩＳＴ１）の発現により同定される（Ｄｏｎｇｒｅ，２０１９）。間葉系様腫瘍についての理想的な腫瘍細胞抗原は、腫瘍細胞上での発現が高く、しかしそれ以外の全ての正常細胞型上での発現は低い細胞表面マーカーである。ＥＭＴは、がん幹表現型および薬剤抵抗性と密接に結びつけられているため（Ｍａｒｉｅ－Ｅｇｙｐｔｉｅｎｎｅ，２０１３；Ｓｉｎｇｈ，２０１０；Ｙｅ，２０１５）、がん幹細胞マーカーは、これらは腫瘍型間で異なる場合が多いとはいえ、間葉系腫瘍を標的化するための抗原のもう一つの型を表し得る。

可能性のある細胞表面間葉系マーカーの中で、Ｎ－カドヘリンおよびβ１インテグリンは、多くの正常細胞型に発現し、したがって、毒性に関する問題に寄与し得、または抗体結合において腫瘍細胞と競合し得る。対照的に、インテグリンαｖβ３は、正常成体組織におけるそれの低い発現、およびそれらがより侵襲性に、より後期に、より薬剤抵抗性になるにつれての上皮腫瘍上におけるその濃縮に基づいて、間葉系腫瘍細胞抗原としてより精選された候補である。

本発明は、間葉系腫瘍に見出された骨髄由来細胞と係合し、それらを、ＥＭＴを起こしている上皮がん細胞上に発現する抗原へ標的化することにより、ＡＤＣＣを媒介できる作用物質の開発に基づいている。

したがって、本発明の一態様は、少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞上の抗原と特異的に結合する第１のドメインと、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞と係合することによりＡＤＣＣを媒介する第２のドメインとを含むキメラ結合性物質、ならびに前記キメラ結合性物質を含む組成物または薬学的組成物に関する。

本発明の別の態様は、本発明のキメラ結合性物質をコードするポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。

本発明の追加の態様は、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞を、少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞へ標的化する方法であって、前記がん細胞および前記骨髄由来細胞を、有効量の本発明のキメラ結合性物質と接触させるステップを含む、方法に関する。

本発明のさらなる態様は、処置を必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、治療有効量の本発明のキメラ結合性物質または薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより前記上皮細胞がんを処置する方法に関する。特に、αｖβ３は、薬剤抵抗性がんに、増加した量で発現しており、薬剤抵抗性を阻止しまたは逆転させることを可能にする。

本発明の別の態様は、必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、
ａ）本発明のキメラ結合性物質によって特異的に結合される抗原について濃縮され、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞について濃縮されている上皮がん細胞を有する対象を選択するステップ、および
ｂ）治療有効量の本発明のキメラ結合性物質または薬学的組成物を前記対象に投与するステップであって、それにより、前記上皮細胞がんを処置する
を含む、方法に関する。薬剤抵抗性になるがん患者は、αｖβ３の発現を獲得しており、それにより、このマーカーを標的化するそのような治療の候補となる。

この発明の別の態様は、抗原が腫瘍細胞上に特異的に存在し（例えば、腫瘍細胞抗原）、治療用抗体が、腫瘍に見出されるエフェクター細胞（例えば、好中球、樹状細胞、ＮＫ細胞など）に対して特異的であるエフェクター細胞結合性領域を含有するような、腫瘍の抗原－エフェクター細胞マッチングに関する。

本発明のこれらを始めとする態様は、下記の本発明の説明においてより詳細に示されている。

抗αｖβ３マウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９が、腫瘍異種移植片をエルロチニブに対して感作させることを示す図である。ＬＭ６０９は、エルロチニブに対して抵抗性腫瘍を再感作させる。全体として参照により本明細書に組み入れられたＷｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）に報告されているように作製されたＨＣＣ８２７－Ｒ１８およびＰＣ９－Ｒ４Ｌエルロチニブ抵抗性腫瘍細胞を、ｎｕ／ｎｕレシピエントマウスにおいて皮下の側腹部腫瘍を形成するように注射した。腫瘍が１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、マウスを、エルロチニブを単独で（６．２５ｍｇ／ｋｇ）またはエルロチニブとＬＭ６０９の組合せ（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けるようにランダム化した。腫瘍寸法を隔週に測定し、体積をＶ＝１／２×（長さ×幅^２）として計算した。グラフは、平均±ＳＥを示す。ＡＮＯＶＡを用いた、エルロチニブ対エルロチニブ／ＬＭ６０９について、^＊Ｐ＜０．０５。ｍＡｂＬＭ６０９－ｍＩｇＧ１－カッパの重鎖（配列番号１１）および軽鎖（配列番号１２）についてのアミノ酸配列を示す図である。ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴ（ヒト化ＬＭ６０９）の重鎖（配列番号９）および軽鎖（配列番号１０）についてのアミノ酸配列を示す図である。ｓｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴ（スーパーヒト化ＬＭ６０９）の２つの異なる型である、ＬＭ６０９＿７重鎖のＦａｂドメイン（配列番号５）および軽鎖（配列番号６）と、ＪＣ７Ｕ重鎖のＦａｂドメイン（配列番号７）および軽鎖（配列番号８）についてのアミノ酸配列を示す図である。ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ（ヒト化ＬＭ６０９）の重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号２）についてのアミノ酸配列を示す図である。ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴの重鎖（配列番号９）対ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖（配列番号１）についてのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。配列アラインメントを、ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖからのＡｌｉｇｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓＰｒｏｔｅｉｎＢＬＡＳＴツールを用いて実施した。「Ｑｕｅｒｙ」配列はｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴであり、「Ｓｂｊｃｔ」配列はｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐである。配列差はボールド体で示されている。細胞に基づいたＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいて、ｈＬＭ６０９－ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐが、ＦｃγＲＩと係合し、活性化することを示す図である。インテグリンαｖβ３発現ヒト膵臓がん細胞を、ＰｒｏｍｅｇａＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（「エフェクター細胞」活性化が、ヒトＦｃγＲＩまたはＩＩＩおよびＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼを安定的に発現するＲａｊｉ細胞株を用いて評価される）を用いて、エフェクター細胞活性化を誘発する抗αｖβ３抗体の能力を評価するための「標的細胞」として利用した。６つの抗体希釈物を、抗体ごとに試験し、ＦｃγＲ活性化は、抗体を含有しないアッセイバッファーでの処理に対する倍数変化として示されている。ｈＬＭ６０９ＩｇＧ１およびＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐバリアントによる、αｖβ３媒介性接着の等価の遮断を示す図である。抗体親和性は、インビトロ細胞接着アッセイを用いて評価されている。４８ウェル組織培養プレートをインテグリンαｖβ３リガンドのフィブリノーゲンまたはインテグリンβ１リガンドのＩ型コラーゲンでコーティングし、２０００～１００００個の細胞を、二連で、５μｇ／ｍＬから始まる一連の２倍希釈についての各抗体の存在下で加えた。終了点で、プレートを洗浄し、基質に接着した細胞を、クリスタルバイオレットを用いて検出した。ＮＫ細胞によるインビトロＡＤＣＣ（ＮＫ－ＡＤＣＣ）を示す図である。ｈＬＭ６０９のｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐアイソタイプ対ｈＩｇＧ１－ＷＴアイソタイプを比較するためのインビトロＮＫ－ＡＤＣＣ。ＣＤ１６－Ｖ１７６．ＮＫ９２細胞がＨＣＣ８２７＋β３標的細胞と係合し、ＨＣＣ８２７＋β３標的細胞を致死させる、発光に基づいた細胞致死アッセイ。グラフは、標的に対するエフェクターの比率（Ｅ：Ｔ）の増加の効果を示す。標的細胞：ＨＣＣ８２７＋β３ヒト肺がん；エフェクター細胞：ＣＤ１６－Ｖ１７６．ＮＫ９２。マクロファージによるインビトロＡＤＣＣ（Ｍａｃ－ＡＤＣＣ）を示す図である。ｈＬＭ６０９のｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐアイソタイプ対ｈＩｇＧ１－ＷＴアイソタイプを比較するためのインビトロマクロファージ－ＡＤＣＣ。一次ヒトマクロファージを、２人の異なる健康なドナー由来の血液から単離し、内因性β３発現を有するＨ１９７５標的細胞についての致死アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた。標的細胞：Ｈ１９７５ヒト肺がん（内因性β３）；エフェクター細胞：正常なドナー血液から単離された一次ヒトマクロファージ；ドナー９８０－Ａは、ＣＤ３２高親和性バリアント（Ｈ１３１）およびＣＤ１６低親和性バリアント（Ｆ１５８）を有する；バリアント遺伝子型は、ドナー９８０－Ｂについては決定されなかった。マクロファージによるインビトロＡＤＣＣ（Ｍａｃ－ＡＤＣＣ）を示す図である。複数のドナーから単離されたマクロファージを用いた、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐにより誘導されるインビトロでのマクロファージ－ＡＤＣＣ。一次ヒトマクロファージを、３人の異なる健康なドナー由来の血液から単離し、ＨＣＣ８２７＋β３標的細胞についての致死アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた。標的細胞：ＨＣＣ８２７＋β３ヒト肺がん；エフェクター細胞：正常なドナー血液から単離された一次ヒトマクロファージ。ＬＭ６０９およびｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐが、健康な血液ドナーから単離された、マクロファージにより媒介されるＡＤＣＣを誘導するが、ＮＫ細胞によるそれを誘導しないことを示す図である。（Ａ）エフェクター細胞としての一次ヒト単球由来マクロファージについてのインビトロＡＤＣＣ。（Ｂ）エフェクター細胞としてのヒトＮＫ細胞についてのインビトロＡＤＣＣ。グラフは、αｖβ３発現ヒト肺がん細胞の死への、標的に対するエフェクターの比率（Ｅ：Ｔ）の増加の効果を示す。マウス骨髄由来マクロファージによるインビトロＡＤＣＣを示す図である。マウス一次マクロファージエフェクター細胞についてのインビトロＡＤＣＣ。一次マウスマクロファージを、マウス骨髄から単離し、ＨＣＣ８２７＋β３標的細胞を致死させるためのエフェクター細胞として用いた。マウスにおいて、２週間の処置にわたって、体重減少なしに、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐがαｖβ３発現腫瘍の成長を阻害することを示す図である。αｖβ３を発現するヒト膵臓がん細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部領域へ皮下注射した。腫瘍寸法を、ノギスを用いて週２回、測定した。腫瘍が触知できた（およそ１５０ｍｍ^３）時点で、マウスを、群へランダムに割り当てた。マウスを、０日目、４日目、７日目、および１１日目に、ＰＢＳ（媒体、ｎ＝８）、ＬＭ６０９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）、またはｈＬＭ６０９－ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９）のいずれかで処置した。体重を、０日目、７日目、および１４日目に測定した。誤差バーは、標準誤差を示す。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた、ＰＢＳと比較して^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。マウスにおける異種移植片に対するｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの抗腫瘍活性が、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１より優れていることを示す図である。ヒトαｖβ３＋膵臓がん細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスへ皮下注射した。腫瘍寸法を、ノギスを用いて週２回、測定した。腫瘍が触知できた（およそ１００ｍｍ^３）時点で、マウスに、ＰＢＳ（媒体、ｎ＝１３）、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）、またはｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９）を、週２回、投与した。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた、ＰＢＳと比較して^＊Ｐ＜０．０５。マウスにおける異種移植片について、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの腫瘍蓄積が、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１より優れていることを示す図である。ＦＧ－β３細胞（αｖβ３を発現するヒト膵臓がん細胞）を注射されたヌードマウスを、３つの群へランダムに分けた。マウスを、１０ｍｇ／ｋｇにおけるＰＢＳ、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、またはｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で、週２回、１４日間、処置した。最後の投薬から３０分後、動物を屠殺し、腫瘍組織を収集し、さらなる分析まで－８０℃で保存した。腫瘍組織を、ＲＰＭＩ中、６．４μＬ／ｍｇで溶解した。可溶化液におけるｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８ＰおよびｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１の濃度を、ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて測定した。ボンフェローニおよびテューキーの検定を用いた、ＰＢＳと比較して^＊Ｐ＜０．００１。

本発明は、下記でより詳細に説明される。この説明は、本発明が実行され得る全ての異なる様式または本発明に加えられ得る全ての特徴の詳細な一覧であることを意図するものではない。例えば、一実施形態に関して例示された特徴は、他の実施形態へ組み入れられ得、特定の実施形態に関して例示された特徴は、その実施形態から削除され得る。加えて、本発明から逸脱しない、本明細書で示唆された様々な実施形態への多数のバリエーションおよび追加は、本開示を鑑みれば当業者に明らかであろう。したがって、以下の明細書は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例証することを意図され、それらの全ての順列、組合せ、およびバリエーションを徹底的に特定することを意図するものではない。

文脈が他に指示しない限り、本明細書に記載された本発明の様々な特徴は、任意の組合せで用いられ得ることは、具体的に意図される。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に示された任意の特徴または特徴の組合せが排除または省略され得ることも企図する。例として、本明細書が、複合体がコンポーネントＡ、Ｂ、およびＣを含むと述べているならば、Ａ、Ｂ、もしくはＣ、またはそれらの組合せのいずれかが、単独でまたは任意の組合せで、省略および放棄され得ることが具体的に意図される。

他に定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、この発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書で本発明の記載に用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。

他に指示されている場合を除き、当業者に知られた標準方法が、組換えおよび合成のポリペプチド、抗体またはその抗原結合性断片の作製、核酸配列の操作、ならびに形質転換細胞の作製に用いられ得る。そのような技術は、当業者に知られている。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫｅｔａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ４ｔｈＥｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２）、Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬｅｔａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）参照。

本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、および他の参考文献は、全体として参照により本明細書の一部をなすものとする。

［定義］
本発明の説明および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指示しない限り、複数形も含むことを意図される。

本明細書で用いられる場合、「および／または」は、その関連の挙げられた項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せを指し、それらを包含し、加えて、選択肢において解釈される場合（「または」）、組合せは含まれない。

さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に示された任意の特徴または特徴の組合せが排除または省略され得ることも企図する。

さらに、この発明の化合物または作用物質の量、用量、時間、温度、およびその他同種類のものなどの測定可能な値に言及する時の、本明細書で用いられる場合の用語「約」は、特定された量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意図される。

他に指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲に用いられた成分の量、反応条件などの性質、およびその他を表現する全ての数は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、それとは反対の指示がない限り、この明細書および特許請求の範囲に示された数値パラメーターは、その現在開示された主題によって得られるように求められる所望の性質に依存して、変動し得る近似である。

本明細書で用いられる場合、範囲は、「約」の１つの特定の値から、および／または「約」の別の特定の値までとして表現することができる。本明細書で開示されたいくつかの値があること、および各値がまた、その値自体に加えて、「約」のその特定の値としても本明細書に開示されることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示されているならば、「約１０」もまた、開示されている。２つの特定のユニットの間の各ユニットもまた開示されているとも理解される。例えば、１０と１５が開示されているならば、１１、１２、１３、および１４もまた開示されている。

移行句「から本質的になること」は、請求の範囲が、その請求に列挙されている特定化された材料またはステップ、およびその請求された発明の基本的かつ新規な特性に実質的には影響しないそれらを包含すると解釈されるべきであることを意味する。

この発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される場合の用語「から本質的になる」（および文法的変形）は、列挙された配列（例えば、配列番号）と、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的には変化しないような、その列挙された配列の５’および／もしくは３’またはＮ末端および／もしくはＣ末端、またはその２つの末端の間（例えば、ドメインとドメインの間）に合計１０個以下（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸との両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。その合計１０個以下の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸は、一緒に付加されたその合計数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を含む。

本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、他に指示がない限り、ペプチドとタンパク質の両方を包含する。

用語「キメラ」は、天然では同じ分子内に一緒に見出されない２つまたはそれ以上の部分を有する分子を指す。

「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、好ましくは、一本鎖かまたは二本鎖のいずれかのＤＮＡ配列である。

本明細書で用いられる場合、用語「単離された」は、天然に存在する生物体またはウイルスの他のコンポーネント、例えば、細胞構造のコンポーネントまたは一般的にその分子と付随して見出される他のポリペプチドもしくは核酸、の少なくとも一部から分離されまたは実質的にそれを含まない分子、例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞を意味する。その用語はまた、合成的に調製されている分子を包含する。

用語「処置（治療）する」、「処置（治療）すること」、または「の処置（治療）」（または文法的に等価の用語）とは、対象の状態の重症度が低下しまたは少なくとも部分的に改善されもしくは寛解すること、ならびに／あるいは、少なくとも１つの臨床症状におけるいくらかの軽減、緩和、もしくは減少が達成されおよび／またはその状態の進行の遅延があることを意味する。

本明細書で用いられる場合、用語「防止（予防）する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止（予防）する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」、または「防止（予防）（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、および「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｓ）」、または「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」（およびその文法的等価物）は、疾患の完全な消滅を暗示することを意図されず、その状態の発生率を低下させ、その状態の発症を遅らせ、および／または発症後その状態に関連した症状を低下させる任意の型の予防的処置を包含する。

本明細書で用いられる場合、「有効」、「予防有効」、または「治療有効」量は、その対象にいくらかの向上または利益を提供するのに十分である量である。言い換えれば、「有効」、「予防有効」、または「治療有効」量は、その対象における少なくとも１つの臨床症状のいくらかの遅延、軽減、緩和、または減少を提供するであろう量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、その効果は完全または治癒的である必要はないことを当業者は認識しているであろう。

本明細書で用いられる場合、本発明のキメラ結合性物質に関しての用語「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｉｎｄｓ）」は、その作用物質が、標的のエピトープ（１つまたは複数のエピトープを含む）と結合するが、他の無関係のエピトープまたは分子と実質的には結合しないことを意味する。ある特定の実施形態において、その用語は、他の無関係のエピトープまたは分子との結合に比べて、標的エピトープとの、少なくとも約６０％結合、例えば、少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％結合を示す作用物質を指す。

＜キメラ結合性物質＞
本発明の第１の態様は、少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞上の抗原と特異的に結合する第１のドメインと、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞と係合することにより抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する第２のドメインとを含むキメラ結合性物質に関する。

間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞は、上皮細胞腫瘍において、それらが上皮間葉転換を起こしたゆえに濃縮されている細胞型である。いくつかの実施形態において、腫瘍における骨髄由来細胞のレベルは、転換前のレベルに対して２倍、５倍、１０倍またはそれ以上、増加する。いくつかの実施形態において、骨髄由来細胞は、マクロファージ、樹状細胞、または好中球、好塩基球、好酸球、もしくはマスト細胞などの顆粒球である。いくつかの実施形態において、骨髄由来細胞はマクロファージである。

上皮がんは、任意の公知の型の癌腫であり得る。上皮がんの例には、非限定的に、胃腸管、乳房、肺（例えば、非小細胞肺がん）、結腸、前立腺、または膀胱のがんが挙げられる。いくつかの実施形態において、上皮がん細胞は、後期上皮がん細胞である。本明細書で用いられる場合、後期または進行期とは、ＴＮＭ病期分類システムに基づいたステージＩＩＩまたはステージＩＶのがんを指す。いくつかの実施形態において、上皮がん細胞は、間葉系細胞へ少なくとも部分的に転換しており、例えば、１つまたは複数の間葉系抗原を発現する。ある特定の実施形態において、上皮がん細胞は、化学療法抵抗性または不応性であり、それは、上皮間葉転換による可能性がある。

キメラ結合性物質は、上皮がん細胞上の抗原と結合し、骨髄由来細胞と係合してＡＤＣＣを媒介する能力がある任意の構造であり得る。いくつかの実施形態において、キメラ結合性物質は、抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態において、キメラ結合性物質の１つまたは複数の部分は、抗体断片で構成される。いくつかの実施形態において、キメラ結合性物質の一方または両方のドメインは、非免疫グロブリンスキャフォールド、アプタマー、小分子（例えば、受容体リガンド）、または他の結合性部分である。

ある特定の実施形態において、キメラ結合性物質の第１のドメインは、抗体ドメインである。ある特定の実施形態において、キメラ結合性物質の第２のドメインは、抗体ドメインである。いくつかの実施形態において、両方のドメインは、抗体ドメインである。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ヒト化またはヒト抗体ドメインである。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ヒト化またはヒト抗体ドメインである。いくつかの実施形態において、第１のドメインおよび第２のドメインは、ヒト化またはヒト抗体ドメインである。

いくつかの実施形態において、第１のドメインは、上皮がん細胞の表面上の抗原と特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗原は、非限定的にＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、ＺＯ－１、またはインテグリンα６β４などの、上皮様腫瘍細胞の表面上に見出される受容体である。いくつかの実施形態において、抗原は、以下に限定されないが、インテグリンαｖβ３、インテグリンβ１、インテグリンαｖβ６、Ｎ－カドヘリン、ＯＢ－カドヘリン、またはシンデカン－１などの、間葉系様腫瘍細胞の表面上に見出される受容体である。

いくつかの実施形態において、抗原は、正常な上皮細胞の表面上に存在せず、または低レベルで存在する抗原であり得る。いくつかの実施形態において、抗原は、上皮がん細胞の表面上に存在しない、または低レベルでしか存在しない抗原であり得る。いくつかの実施形態において、抗原は、上皮がん細胞が間葉系細胞へ転換を開始した後にのみ存在する、または増加したレベルで存在する抗原であり得る。いくつかの実施形態において、抗原は、上皮がん細胞上に、それが間葉系細胞への転換を開始するまで存在せず、または低レベルでのみ存在する、間葉系細胞抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、免疫系により以前、認識されたことがないネオ抗原である。

ある特定の実施形態において、第１のドメインは、インテグリンと特異的に結合する。インテグリンは、非限定的に、インテグリンαｖ、インテグリンβ３、またはインテグリンαｖβ３であり得る。

ある特定の実施形態において、第１のドメインは、抗体のＦａｂドメインを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。Ｆａｂドメインは、任意の抗体アイソタイプに由来し得る。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体のＦａｂドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの軽鎖（配列番号２）およびｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖のＦａｂ部分（Ｆｄ断片としても知られている）（配列番号３）のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ｓｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴのスーパーヒト化バリアントのアミノ酸配列、例えば、ＬＭ６０９＿７重鎖のＦａｂドメイン（配列番号５）および軽鎖（配列番号６）、またはＪＣ７Ｕ重鎖のＦａｂドメイン（配列番号７）および軽鎖（配列番号８）、またはそれらと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴの軽鎖（配列番号９）およびｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴの重鎖のＦａｂ部分（配列番号１０）のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。

ある特定の実施形態において、第１のドメインは、上皮がん細胞の表面上の抗原に加えて、第２の抗原と特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、二重特異性抗体ドメイン、三重特異性抗体ドメイン、または１つより多い抗原と特異的に結合する他の構造であり得る。第２の抗原は、例えば、がんを処置するために用いられる抗体の結合する標的、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント分子であり得る。いくつかの実施形態において、第２の抗原は、がん幹細胞マーカー（例えば、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５）である。いくつかの実施形態において、第２の抗原は、第２のドメインにより標的化されるエフェクター細胞とは異なるエフェクター細胞上の抗原である。いくつかの実施形態において、前記異なるエフェクター細胞は、骨髄由来細胞、例えば、マクロファージ、樹状細胞、または好中球、好塩基球、好酸球、もしくはマスト細胞などの顆粒球である。この態様において、キメラ結合性物質は、２つ以上のクラスのエフェクター細胞、例えばマクロファージと樹状細胞、またはマクロファージと好中球を、腫瘍細胞へ局在化させる能力がある。

キメラ結合性物質の第２のドメインは、好ましくは、１つまたは複数の型の骨髄由来細胞と係合する。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、１つの型の骨髄由来細胞、例えば、マクロファージまたは樹状細胞、または好中球、好塩基球、好酸球、もしくはマスト細胞などの顆粒球に優勢的に係合する。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、マクロファージに優勢的に係合する。本明細書で用いられる場合、「優勢的に係合する」とは、他の細胞型に対して、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のその標的細胞型、例えばマクロファージと係合することを指す。

ある特定の実施形態において、第２のドメインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とは有意には係合しない。ある特定の実施形態において、第２のドメインは、１つまたは複数の型のリンパ球、例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞とは有意には係合しない。本明細書で用いられる場合、「有意には係合しない」とは、全部の係合された細胞の３０％未満、例えば、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が、その示された細胞型であることを指す。

いくつかの実施形態において、第２のドメインは、骨髄由来細胞の表面上のタンパク質と特異的に結合する。前記タンパク質は、係合されたとき、ＡＤＣＣを媒介できるものである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、他の細胞型、例えば、ナチュラルキラー細胞に存在せず、または低レベルでのみ存在する。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、Ｆｃガンマ受容体と特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲＩ、ＣＤ６４）と特異的に結合する。

ある特定の実施形態において、第２のドメインは、抗体のＦｃドメインを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。そのＦｃドメインは、任意の抗体アイソタイプ由来であり得る。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ＩｇＡまたはＩｇＥ抗体のＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態において、第２のドメインは、抗体のヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖Ｆｃドメインおよびヒンジドメインのアミノ酸配列（配列番号４）、またはそれらと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴの重鎖Ｆｃドメインおよびヒンジドメインのアミノ酸配列（配列番号９）、またはそれと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。

ある特定の実施形態において、キメラ結合性物質は、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号２）のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態において、キメラ結合性物質は、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴの重鎖（配列番号９）および軽鎖（配列番号１０）のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。

キメラ結合性物質は、抗体の特性、例えば安定性を増強し、または抗体のＦｃガンマ受容体との結合を変化させることが知られている配列改変を含み得る。いくつかの実施形態において、キメラ結合性物質のアミノ酸配列は、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ（Ｅｕナンバリングシステム）変異を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、Ｓ２２８変異と共にまたはそれを含まずに、
ａ）Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；
ｂ）Ｉ３３２Ｅ；
ｃ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；
ｄ）Ｇ２３６Ａ；
ｅ）Ｎ２９７Ａ／Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ；
ｆ）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ｇ）Ｑ２９５Ｒ／Ｌ３２８Ｗ／Ａ３３０Ｖ／Ｐ３３１Ａ／Ｉ３３２Ｙ／Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ；
ｈ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ；
ｉ）Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；
ｊ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３３１Ｓ；
ｋ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ｌ）Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４／Ａ；
ｍ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；
ｎ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；
ｏ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ；
ｐ）Ｌ２３４Ｙ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２９８Ａ；
ｑ）Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ；
ｒ）Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ；
ｓ）Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；
ｔ）Ｋ３２６Ｍ／Ｅ３３３Ｓ；
ｕ）Ｃ２２１Ｄ／Ｄ２２２Ｃ；
ｖ）Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｗ；
ｗ）Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｗ；
ｘ）Ｅ３４５Ｒ
ｙ）Ｒ４３５Ｈ；
ｚ）Ｎ４３４Ａ；
ａａ）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ａｂ）Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；
ａｃ）Ｔ２５２Ｌ／Ｔ／２５３Ｓ／Ｔ２５４Ｆ；
ａｄ）Ｅ２９４ｄｅｌｔａ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ；
ａｅ）Ｔ２５６Ｎ／Ａ３７８Ｖ／Ｓ３８３Ｎ／Ｎ４３４Ｙ；
ａｆ）Ｅ２９４ｄｅｌｔａ
ａｇ）Ｌ２３５Ｅ；
ａｈ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；
ａｉ）Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ；
ａｊ）Ｐ３３１Ｓ／Ｌ２３４Ｅ／Ｌ２２５Ｆ；
ａｋ）Ｄ２６５Ａ；
ａｌ）Ｇ２３７Ａ；
ａｍ）Ｅ３１８Ａ；
ａｎ）Ｅ２３３Ｐ；
ａｏ）Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ；
ａｐ）Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；
ａｑ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；
ａｒ）Ａ３３０Ｌ；
ａｓ）Ｄ２７０Ａ；
ａｔ）Ｋ３２２Ａ；
ａｕ）Ｐ３２９Ａ；
ａｖ）Ｐ３３１Ａ；
ａｗＶ２６４Ａ；
ａｘ）Ｆ２４１Ａ；
ａｙ）Ｎ２９７ＡもしくはＧもしくはＮ
ａｚ）Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；または
ｂａ）ａ）～ａｚ）の任意の組合せ；
（Ｅｕナンバリングシステム）から選択される変異を含む。

以下の議論は、抗体の作製に利用できる技術の総括として提示されるが、以下の方法に関する多くのバリエーションが知られていることを当業者は認識しているであろう。

本明細書で用いられる場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む全ての型の免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナル、オリゴクローナル、またはポリクローナルであり得、（例えば）マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、サル、もしくはヒトを含む、任意の種起源に属するものであってもよく、またはキメラもしくはヒト化抗体であり得る。例えば、Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４０３（１９８９）参照。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号または米国特許第４，８１６，５６７号に開示された方法に従って作製された組換えモノクローナル抗体であり得る。抗体はまた、米国特許第４，６７６，９８０号に開示された方法に従って化学的に構築することができる。

本発明の範囲内に含まれる抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、およびＦｖ断片；ドメイン抗体、ダイアボディ；ワクチボディ（ｖａｃｃｉｂｏｄｉｅｓ）、直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。そのような断片は、公知の技術により作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、抗体分子のペプシン消化により作製することができ、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）_２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成され得る。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる（Ｈｕｓｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１２７５（１９８９））。いくつかの実施形態において、本明細書で用いられる場合、用語「抗体断片」はまた、標的抗原と結合する能力がある任意のタンパク質構築物を含み得る。

本発明の抗体は、抗体が産生された種以外の種との適合性のために変化または変異され得る。例えば、抗体は、ヒト化またはラクダ化され得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリンに由来した最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖もしくは断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または抗体の他の抗原結合性部分配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域（すなわち、ＣＤＲ領域間の配列）の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体は、２つのＣＤＲのみが非ヒトであるスーパーヒト化抗体であり得る（米国特許第７，０８７，４０９号）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ、の少なくとも一部分を含む（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（１９８８）；ａｎｄＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３（１９９２））。

非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野においてよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれへ導入された、１個または複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と呼ばれる場合が多く、それらは、典型的には、「インポート」可変ドメインから取り出される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４（１９８８））に従って、げっ歯類ＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に代わって用いることにより、実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、ＣＤＲの全部またはその一部分）、および場合により、いくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されている、ヒト抗体である。

ヒト抗体はまた、当技術分野において知られた様々な技術を用いて作製することができ、その技術には、ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））が挙げられる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（Ｃｏｌｅｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）ａｎｄＢｏｅｒｎｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスへ、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製することができる。抗原曝露により、ヒト抗体産生が観察され、それは、遺伝子再編成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む全ての点においてヒトで見られるのとよく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８１２（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５（１９９５）の科学的刊行物に記載されている。

免疫原（抗原）は、標的ポリペプチドと特異的反応性の抗体を産生するために用いられる。例えば少なくとも５（例えば、少なくとも７または１０）アミノ酸長またはそれ以上の、組換えまたは合成ポリペプチドおよびペプチドが、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のための好ましい免疫原である。一実施形態において、免疫原性ポリペプチドコンジュゲートもまた、免疫原として含まれる。ペプチドは、純粋な形か、部分的純粋な形か、または不純な形のいずれかで用いられる。標的病原体および精子についての適切なポリペプチドおよびエピトープは、当技術分野においてよく知られている。ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）／ＧＥＮＰＥＰＴ（登録商標）などの公開配列データベースで入手できる。標的がん細胞抗原と特異的に結合する多数の抗体が当技術分野において記載されており、本発明の抗体を調製するための出発材料として用いることができる。あるいは、新しい抗体が、本明細書に記載された技術および当技術分野においてよく知られた技術を用いて、標的抗原に対して産生され得る。

組換えポリペプチドは、標準技術を用いて、真核細胞または原核細胞において発現され、精製される。その後、前記ポリペプチドまたはその合成バージョンが、抗体を産生する能力がある動物に注射される。そのポリペプチドの存在および量を測定するためのイムノアッセイにおけるその後の使用のために、モノクローナルかまたはポリクローナルのいずれかの抗体が作製され得る。

ポリクローナル抗体を産生する方法は当業者に知られている。簡単に述べれば、免疫原、例えば、精製されたまたは合成のペプチド、適切な担体（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、キーホールリンペット・ヘモシアニンなど）と連結されたペプチド、または組換えワクシニアウイルスなどの免疫化ベクターへ組み込まれたペプチドが、適宜、アジュバントと混合され、その混合物で動物が免疫される。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験採血を行い、目的のペプチドに対する反応性の力価を決定することにより、モニターされる。免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られた時、血液が動物から収集され、抗血清が調製される。望まれる場合、ペプチドに対して反応性の抗体について濃縮するための抗血清のさらなる分画が実施される。その結合性断片および一本鎖組換えバージョンを含むポリペプチドに対する抗体は、例えば上記のような担体タンパク質と共有結合性に付着した（コンジュゲートされた）ポリペプチドを含む免疫原性コンジュゲートを用いて、動物を免疫することにより産生される。典型的には、目的の免疫原は、少なくとも約１０アミノ酸のポリペプチドであり、別の実施形態では、そのポリペプチドは少なくとも約２０アミノ酸長であり、別の実施形態では、その断片は、少なくとも約３０アミノ酸長である。免疫原性コンジュゲートは、典型的には、ポリペプチドを担体タンパク質と連結する（例えば、融合タンパク質として）ことにより調製され、または代替として、それらは、免疫化ベクター内で組換え的に発現する。

モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常もしくは改変型のペプチドとの結合についてスクリーニングされ、またはアゴニスト活性もしくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングされる。特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、通常、少なくとも約５０ｍＭ、例えば少なくとも約１ｍＭ、例えば少なくとも約０．１ｍＭまたはそれより良いＫ_Ｄで、結合する。場合によっては、げっ歯類、ウサギ目の動物、霊長類、ヒトなどの様々な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。そのようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ１９７５Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５－４９７に見出される。簡単に要約すれば、この方法は、免疫原、例えば、単独かまたは適宜、担体タンパク質と連結されたかのいずれかの免疫原性ペプチドを動物に注射することにより、進行する。その後、動物は、屠殺され、細胞がそれの脾臓から採取され、その細胞が骨髄腫細胞と融合される。その結果が、インビトロで繁殖する能力があるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」である。その後、ハイブリドーマの集団は、それぞれが免疫原に対する単一抗体種を分泌する、個々のクローンを単離するようにスクリーニングされる。このように、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質上で認識される特定の部位に応答して生成された、免疫動物由来の不死化およびクローン化された単一Ｂ細胞の産物である。

不死化の代替方法には、エプスタイン・バーウイルス、がん遺伝子、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当技術分野において知られた他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じたコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そのような細胞により産生されたモノクローナル抗体の収量が、様々な技術により増強され、その技術には、脊椎動物（好ましくは哺乳動物）宿主の腹膜腔への注射が挙げられる。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変有りまたは無しで用いられ、ヒト化マウス抗体などのキメラ抗体を含む。他の適切な技術は、ファージまたは類似したベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択を含む。Ｈｕｓｅｅｔａｌ．１９８９Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５－１２８１；およびＷａｒｄｅｔａｌ．１９８９Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６参照。

標的ポリペプチドに特異的な抗体はまた、当技術分野において知られたファージディスプレイ技術により得ることができる。

本発明は、さらに、この発明のキメラ結合性物質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、配列番号１３の重鎖をコードするヌクレオチド配列および配列番号１４の軽鎖をコードする配列、またはそれと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、配列番号１５の重鎖をコードするヌクレオチド配列および配列番号１４の軽鎖をコードする配列、またはそれと少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％同一の配列を含む。

本明細書でさらに提供されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。ベクターには、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、またはコスミドベクターが挙げられるが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明は、この発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、真核細胞または原核細胞であり得、キメラ結合性物質を発現するために、または他の目的のために用いられ得る。

本発明のさらなる態様は、本発明のキメラ結合性物質および担体を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、本組成物は、薬学的組成物であり、担体は、薬学的に許容される担体である。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、追加の治療剤、例えば化学療法剤をさらに含み得る。がんを処置するのに有用な作用物質には、非限定的に、１）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）；２）エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；３）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ））；４）酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）；５）生物学的応答調節物質（例えば、インターフェロンアルファ）；６）白金錯体（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；７）アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）；８）置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）；９）メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ－メチルヒドラジン；ＭＩＨ））；１０）副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド）；１１）副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）；１２）プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）；１３）エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）；１４）抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；１５）アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）；１６）抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）：および１７）生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体（例えば、ロイプロリド）が挙げられる。別の実施形態において、本発明の作用物質は、抗血管新生薬と共に投与され、その抗血管新生薬は、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ））および血管新生の他の促進因子（例えば、ｂＦＧＦ、アンギオポエチン－１）に対する抗体、アルファ－ｖ／ベータ－３血管インテグリンに対する抗体（例えば、ＶＩＴＡＸＩＮ）、アンギオスタチン、エンドスタチン、ダルテパリン、ＡＢＴ－５１０、ＣＮＧＲＣペプチドＴＮＦアルファコンジュゲート、シクロホスファミド、コンブレタスタチンＡ４リン酸塩、ジメチルキサンテノン酢酸、ドセタキセル、レナリドミド、エンザスタウリン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化小粒子製剤（Ａｂｒａｘａｎｅ）、ダイズイソフラボン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、タモキシフェンクエン酸塩、サリドマイド、ＡＤＨ－１（ＥＸＨＥＲＩＮ）、ＡＧ－０１３７３６、ＡＭＧ－７０６、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブトシル酸塩、ＢＭＳ－５８２６６４、ＣＨＩＲ－２６５、パゾパニブ、ＰＩ－８８、バタラニブ、エベロリムス、スラミン、スニチニブリンゴ酸塩、ＸＬ１８４、ＺＤ６４７４、ＡＴＮ－１６１、シレンジタイド、およびセレコキシブ、またはそれらの任意の組合せなどである。他の実施形態において、本発明の作用物質は、１つまたは複数の治療用抗体、例えば、抗がん抗体または免疫チェックポイントに対する抗体と共に投与される。他の実施形態において、本発明の作用物質は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤と共に投与される。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントを阻害する任意の分子であり得る。免疫チェックポイントは当技術分野においてよく知られており、それには、非限定的に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＴＩＭ－３、およびＶＩＳＴＡが挙げられる。いくつかの実施形態において、その阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体である。ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤、例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、デュルバルマブ、またはアテゾリズマブである。いくつかの実施形態において、キメラ結合性物質は、追加の治療剤と直接的または間接的に連結されて、抗体薬コンジュゲートを形成し得る。

本発明のさらなる態様は、本発明のキメラ結合性物質、または本発明のキメラ結合性物質を産生するための細胞を含むキットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、複数のキメラ結合性物質および／またはそのような作用物質を含有する組成物を含み得る。いくつかの実施形態において、そのようなキットにおいて提供される複数のキメラ結合性物質のそれぞれは、異なる抗原と特異的に結合しおよび／または異なる骨髄由来細胞と係合することができる。いくつかの実施形態において、キットは、追加の活性物質、例えば、当業者に知られているような化学療法剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、追加の試薬、バッファー、容器などをさらに含み得る。

＜キメラ結合性物質を用いた方法＞
本発明の一態様は、本発明のキメラ結合性物質により認識される抗原（例えば、インテグリンαｖβ３）を発現するがん細胞へ骨髄由来細胞（例えば、マクロファージ）を標的化する方法であって、前記がん細胞および前記骨髄由来細胞を有効量の本発明のキメラ結合性物質と接触させるステップを含む、方法に関する。

本発明の別の態様は、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞を、少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞へ標的化する方法であって、前記がん細胞および前記骨髄由来細胞を有効量の本発明のキメラ結合性物質と接触させるステップを含む、方法に関する。

本発明のさらなる態様は、必要とする対象において本発明のキメラ結合性物質により認識される抗原（例えば、インテグリンαｖβ３）を発現するがんを処置する方法であって、治療有効量の、本発明のキメラ結合性物質または薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記がんを処置する、方法に関する。

本発明の追加の態様は、必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、治療有効量の、本発明のキメラ結合性物質または薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより、上皮細胞がんを処置する、方法に関する。

本発明の別の態様は、必要とする対象においてがんを処置する方法であって、
ａ）本発明のキメラ結合性物質により特異的に結合される抗原（例えば、インテグリンαｖβ３）について濃縮され、骨髄由来細胞について濃縮されているがん細胞を有する対象を選択するステップと、
ｂ）治療有効量の、本発明のキメラ結合性物質または薬学的組成物を前記対象に投与するステップと、それにより、前記がんを処置する、
を含む、方法に関する。

本発明のさらなる態様は、必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、
ａ）本発明のキメラ結合性物質により特異的に結合される抗原について濃縮され、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞について濃縮されている上皮がん細胞を有する対象を選択するステップと、
ｂ）治療有効量の、本発明のキメラ結合性物質または薬学的組成物を前記対象に投与するステップと、それにより、前記がんを処置する、
を含む、方法に関する。

本明細書で用いられる場合、用語「濃縮された」は、より早い時点（例えば、ＥＭＴの開始前）におけるがん細胞もしくは腫瘍に見出されるレベルより高く、または一般的な集団における類似したステージにおける類似したがん細胞もしくは腫瘍に見出される平均レベルより高い、がん細胞上の抗原のレベルまたは腫瘍における骨髄由来細胞のレベルを指す。

選択ステップは、抗原および細胞を測定することが知られた任意の方法により行われ得る。いくつかの実施形態において、ステップａ）は、対象からがんの試料を取得し、前記試料において抗原および骨髄由来細胞のレベルを測定することを含む。抗原のレベルは、例えば、イムノアッセイ、タンパク質分析、ＲＮＡ分析、または免疫組織化学法により測定され得る。骨髄由来細胞のレベルは、例えば、イムノアッセイ、タンパク質分析、ＲＮＡ分析、またはフローサイトメトリーにより測定され得る。

この発明の別の態様は、抗原が腫瘍細胞に特異的に存在する（例えば、腫瘍細胞抗原）、治療用抗体が、腫瘍に見出されるエフェクター細胞（例えば、好中球、樹状細胞、ＮＫ細胞など）に対して特異的であるエフェクター細胞結合性領域を含有するような、腫瘍の抗原－エフェクター細胞マッチングに関する。

本発明の方法の一実施形態のように、本発明者らは、αｖβ３インテグリンが、薬剤抵抗性を獲得しているがん細胞の表面上に現れることを決定している。これは、αｖβ３インテグリンに対して方向づけられている治療用モノクローナル抗体アプローチで効果的に処置される可能性が最も高い患者を同定するのを助ける。これは、αｖβ３インテグリンを標的化する他の治療用モノクローナル抗体を含むことを許容する、正しい患者集団への精度の高い医薬アプローチを提供する。がん患者は、標準治療の療法に対して抵抗性になっているため、彼らの腫瘍はαｖβ３発現を獲得しており、それにより、αｖβ３発現腫瘍細胞の免疫細胞媒介性ＡＤＣＣを促進する能力があるαｖβ３標的化抗体での処置の候補になる。

本発明の方法において、骨髄由来細胞は、マクロファージ、樹状細胞、または好中球、好塩基球、好酸球、もしくはマスト細胞などの顆粒球である。いくつかの実施形態において、骨髄由来細胞はマクロファージである。

上皮がんは、任意の既知の型の癌腫であり得る。上皮がんの例には、非限定的に、胃腸管、乳房、肺（例えば、非小細胞肺がん）、結腸、前立腺、または膀胱のがんが挙げられる。いくつかの実施形態において、上皮がん細胞は、後期上皮がん細胞である。いくつかの実施形態において、上皮がん細胞は、間葉系細胞へ少なくとも部分的に転換しており、例えば、１つまたは複数の間葉系抗原を発現する。ある特定の実施形態において、上皮がん細胞は、化学療法抵抗性または不応性であり、それは、上皮間葉転換による可能性がある。

いくつかの実施形態において、本方法は、対象から骨髄由来細胞を単離するステップ、前記骨髄由来細胞を本キメラ結合性物質または薬学的組成物と接触させるステップ、および前記接触した骨髄由来細胞を前記対象に投与するステップをさらに含み得る。

いくつかの実施形態において、１つより多いキメラ結合性物質が、対象へ送達され得る。例えば、がん試料が、１つより多い標的化可能な抗原または１つより多い型の骨髄由来細胞ががんにおいて濃縮されていることを示す場合には、抗原および／または骨髄由来細胞のそれぞれを標的化する作用物質が投与され得る。いくつかの実施形態において、本キメラ結合性物質は、複数の標的化可能な抗原および／または１つより多い型の骨髄由来細胞と係合するために、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）であり得る。

本発明の方法は、追加のがん治療剤または処置（例えば、手術、放射線照射）を対象に投与するステップをさらに含み得る。がん治療剤には、非限定的に、１）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）；２）エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；３）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ））；４）酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）；５）生物学的応答調節物質（例えば、インターフェロンアルファ）；６）白金錯体（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；７）アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）；８）置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）；９）メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ－メチルヒドラジン；ＭＩＨ））；１０）副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド）；１１）副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）；１２）プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）；１３）エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）；１４）抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；１５）アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）；１６）抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）：および１７）生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体（例えば、ロイプロリド）が挙げられる。他のがん治療剤には、非限定的に、抗血管新生薬、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ））および血管新生の他の促進因子（例えば、ｂＦＧＦ、アンギオポエチン－１）に対する抗体、アンギオスタチン、エンドスタチン、ダルテパリン、ＡＢＴ－５１０、ＣＮＧＲＣペプチドＴＮＦアルファコンジュゲート、シクロホスファミド、コンブレタスタチンＡ４リン酸塩、ジメチルキサンテノン酢酸、ドセタキセル、レナリドミド、エンザスタウリン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化小粒子製剤（Ａｂｒａｘａｎｅ）、ダイズイソフラボン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、タモキシフェンクエン酸塩、サリドマイド、ＡＤＨ－１（ＥＸＨＥＲＩＮ）、ＡＧ－０１３７３６、ＡＭＧ－７０６、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブトシル酸塩、ＢＭＳ－５８２６６４、ＣＨＩＲ－２６５、パゾパニブ、ＰＩ－８８、バタラニブ、エベロリムス、スラミン、スニチニブリンゴ酸塩、ＸＬ１８４、ＺＤ６４７４、ＡＴＮ－１６１、シレンジタイド、およびセレコキシブが挙げられる。

いくつかの実施形態において、本方法は、がん細胞の食作用を増強するためにＣＤ４７遮断剤を投与するステップをさらに含む。そのような作用物質には、ＣＤ４７遮断性モノクローナル抗体（Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４、ＣＣ－９０００２、Ｔｉ－０６１、またはＳＲＦ２３１）またはＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質（ＴＴＩ－６２１、ＴＴＩ－６２２、ＡＬＸ１４８）が挙げられる。しかしながら、本発明の利点の一つは、がん細胞がＣＤ４７を発現しようがしまいが、本方法はがんに対して有効であることである。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ４７を発現するがんを処置するために用いられる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ４７を発現するがんを処置するために用いられる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ４７遮断剤を対象に投与するステップを含まない。

いくつかの実施形態において、本方法は、免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与するステップをさらに含む。免疫チェックポイントは、当技術分野においてよく知られており、それには、非限定的に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＴＩＭ－３、およびＶＩＳＴＡが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体である。ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、間葉系腫瘍において濃縮されているＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４の阻害剤、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４と特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、デュルバルマブ、またはアテゾリズマブである。

いくつかの実施形態において、本方法は、ＥＧＦＲ阻害剤を対象に投与するステップをさらに含む。そのような作用物質には、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ、ネラチニブ）およびモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ、ネシツムマブ、パニツムマブ）が挙げられる。

ある特定の実施形態において、本発明の方法に用いられるキメラ結合性物質は、対象へ直接的に投与される。いくつかの実施形態において、キメラ結合性物質は、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）中に懸濁され、経口もしくは点滴静注により、または皮下に、筋肉内に、くも膜下腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内もしくは肺内に投与される。別の実施形態において、気管内または肺内送達は、標準ネブライザー、ジェットネブライザー、ワイヤーメッシュネブライザー、ドライパウダー吸入器、または定量噴霧式吸入器を用いて達成することができる。本作用物質は、肺、腎臓、または腸などの疾患または障害の部位へ直接的に送達する、例えば、インサイチュで腫瘍の中へまたは近くに注射することができる。必要とされる投薬量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の病気の性質；対象のサイズ、体重、表面積、年齢、および性別；投与されることになっている他の薬剤；ならびに主治医の判断に依存する。各作用物質についての適切な投薬量は、０．０１～１００μｇ／ｋｇの範囲内である。利用可能な作用物質の多様さおよび様々な投与経路の異なる効率を考慮すれば、必要とされる投薬量における幅広いバリエーションは当然である。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与より高い投薬量を必要とすることが予想される。これらの投薬量レベルにおけるバリエーションは、当技術分野においてよく知られているように、最適化のための標準経験的ルーチンを用いて調整することができる。投与は、単回または複数回（例えば、２回、３回、４回、６回、８回、１０回；２０回、５０回、１００回、１５０回、またはそれ以上の回）であり得る。化合物の適切な送達媒体（例えば、ポリマーマイクロ粒子もしくはナノ粒子、または植え込み型デバイス）内へのカプセル化は、送達、特に経口送達についての効率を増加させ得る。

「薬学的に許容される」とは、生物学的に、またはその他の理由で有害ではない材料を意味し、すなわち、その材料が、毒性などのいかなる有害な生物学的効果も引き起こすことなく対象に投与できることを意味する。

本発明の製剤は、医学的物質、薬学的物質、担体、アジュバント、分散剤、希釈剤、およびその他同種類のものを適宜、含むことができる。

本発明のキメラ結合性物質は、公知の技術に従って、薬学的担体中での投与のために製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ（２１^ｓｔＥｄ．２００６）参照。本発明による薬学的製剤の製造において、本作用物質は、典型的には、とりわけ、許容される担体と混合される。担体は、固体もしくは液体、または両方であり得、本作用物質の０．０１％重量または０．５％重量から、９５％重量または９９％重量までを含有し得る単位用量製剤、例えば、カプセルまたはバイアルとして、本作用物質と製剤化され得る。１つまたは複数の作用物質を本発明の製剤中に組み入れることができ、それは、薬学の周知の技術のいずれかによって調製することができる。

本発明の製剤には、経口、直腸、局所的、頬側（例えば、舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、骨格筋、心筋、横隔膜筋、および平滑筋を含む筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内）、局所的（すなわち、気道表面を含む皮膚表面と粘膜表面の両方）、鼻腔内、経皮、関節内、くも膜下腔内、および吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、加えて直接的な器官注射（例えば、肝臓への、中枢神経系への送達のための脳への、または膵臓への）または体腔への注射に適したものが挙げられる。任意の所定の場合における最も適切な経路は、処置されることになっている状態の性質および重症度、ならびに用いられることになっている特定の作用物質の性質に依存する。

注射について、担体は、典型的には、無菌のパイロジェンフリーの水、パイロジェンフリーのリン酸緩衝食塩水、静菌水、またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）などの液体である。他の投与方法について、担体は、固体または液体であり得る。

経口投与について、本作用物質は、カプセル、錠剤、および粉末などの固体剤形で、またはエリキシル剤、シロップ、および懸濁液などの液体剤形で投与することができる。作用物質は、不活性成分および粉末化担体、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルカム、炭酸マグネシウム、およびその他同種類のものと一緒にゼラチンカプセル内にカプセル化することができる。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の望ましい特徴を提供するために加えることができる追加の不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク、およびその他同種類のものである。同様の希釈剤が、圧縮錠を作製するために用いることができる。錠剤とカプセルの両方は、徐放性製剤として製造して、数時間にわたって薬物の持続的放出を提供することができる。圧縮錠は、任意の不快な味を遮蔽し、錠剤を大気から保護するために糖コーティングもしくはフィルムコーティングされ、または胃腸管における選択的崩壊のために腸溶コーティングされ得る。経口投与のための液体剤形は、患者の受け入れを増加させるために着色料および香味料を含有し得る。

頬側（舌下）投与に適した製剤には、香味づけられた基剤、通常、スクロースおよびアカシアゴムまたはトラガント中に本作用物質を含むロゼンジ；ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアゴムなどの不活性基剤中に本作用物質を含むトローチが挙げられる。

非経口投与に適した本発明の製剤は、本作用物質の無菌の水性および非水性注射用溶液を含み、その調製物は、好ましくは、意図されるレシピエントの血液と等張性である。これらの調製物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を、意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る。水性および非水性無菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含み得る。製剤は、単位／用量または複数用量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中で提供され得、使用直前に無菌液体担体、例えば、食塩水または注射用蒸留水の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。

即席の注射用溶液および懸濁液は、前に記載された種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。例えば、本発明の一態様において、密封された容器において、単位剤形として、本発明の作用物質を含む注射可能で、安定な、無菌組成物が提供される。本作用物質は、適切な薬学的に許容される担体で再構成されて、対象へのそれの注射に適した液体組成物を形成することができる凍結乾燥物の形をとって提供される。単位剤形は、典型的には、本作用物質の約１ｍｇから約１０グラムまでを含む。本作用物質が実質的に不水溶性である場合、薬学的に許容される十分な量の乳化剤を、本作用物質を水性担体中で乳化するのに十分な量で用いることができる。一つのそのような有用な乳化剤は、ホスファチジルコリンである。

直腸投与に適した製剤は、好ましくは、単位用量坐剤として供給される。これらは、本作用物質を１つまたは複数の通常の固体担体、例えば、カカオバターと混合し、その後、その生じた混合物を形作ることにより調製することができる。

皮膚への局所適用に適した製剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形をとる。用いることができる担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮促進剤、およびそれらのうちの２つまたはそれ以上の組合せが挙げられる。

経皮投与に適した製剤は、長期間、レシピエントの表皮と密着した状態であり続けるのに適応した個々のパッチとして供給することができる。経皮投与に適した製剤はまた、イオン泳動（例えば、Ｔｙｌｅ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）参照）により送達することができ、典型的には、化合物の適宜、緩衝された水溶液の形をとる。適切な製剤は、クエン酸バッファーもしくはビス／トリスバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、化合物の０．１Ｍから０．２Ｍまでを含有する。

本作用物質は、代替として、鼻腔投与またはそれ以外の方法で、任意の適切な手段による対象の肺への投与、例えば、対象が吸引する、本作用物質を含む呼吸用粒子のエアロゾル懸濁による投与のために製剤化することができる。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。用語「エアロゾル」は、気管支梢または鼻腔へ吸引され得る、任意の気体中の浮遊相を含む。具体的には、エアロゾルには、定量噴霧式吸入器もしくはネブライザーにおいて、またはミスト噴霧器において、生成され得るような、液滴の気体中浮遊物が挙げられる。エアロゾルにはまた、空気または他のキャリアガス中に浮遊した乾燥粉末組成物が挙げられ、それは、例えば、吸入器デバイスからのガス注入により送達され得る。Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ＆Ｊｏｎｅｓ，ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙｔｏｔｈｅＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＴｒａｃｔ，ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏｄ（１９８７）；Ｇｏｎｄａ（１９９０）ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ６：２７３－３１３；およびＲａｅｂｕｒｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２７：１４３（１９９２）参照。本作用物質を含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に知られているように、任意の適切な手段により、例えば、圧力駆動型エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーを用いて、生成され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照。本作用物質を含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、製薬分野において知られた技術により、任意の固体微粒子状薬物発生器を用いて生成され得る。

あるいは、本化合物を、全身的というよりむしろ局所的様式で、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与することができる。

さらに、本発明は、本明細書に開示された作用物質およびその塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成するためのテクノロジーは、当技術分野においてよく知られている。本化合物またはその塩は、水溶性塩である場合、通常のリポソームテクノロジーを用いて、それを、脂質ベシクルへ組み入れることができる。そのような場合、本作用物質の水溶性により、本作用物質は、リポソームの親水性中央またはコア内に実質的に取り込まれる。用いられる脂質層は、任意の通常の組成を有していてもよく、コレステロールを含有し得るか、またはコレステロール非含有であり得るかのいずれかである。目的の化合物または塩が水不溶性である場合、この場合もやはり、通常のリポソーム形成テクノロジーを用いて、塩は、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に実質的に取り込まれ得る。いずれの場合においても、作製されるリポソームは、標準超音波処理およびホモジナイゼ－ション技術の使用を通してなど、サイズを低下させることができる。

本作用物質を含有するリポソーム製剤は、凍結乾燥物を生じるように凍結乾燥することができ、その凍結乾燥物は、水などの薬学的に許容される担体で再構成されて、リポソーム懸濁液を再生することができる。

水不溶性作用物質の場合、例えば水性基剤乳濁液において、水不溶性作用物質を含有する、薬学的組成物を調製することができる。そのような場合、その組成物は、所望の量の本作用物質を乳化するための十分な量の薬学的に許容される乳化剤を含有する。特に有用な乳化剤には、ホスファチジルコリンおよびレシチンが挙げられる。

特定の実施形態において、本化合物は、治療有効量で、対象に投与され、治療有効量という用語は上記で定義した通りである。薬学的活性物質の投薬量は、当技術分野において知られた方法により決定することができ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）参照。任意の特定の作用物質の治療有効量は、作用物質間、および患者間で幾分、異なり、患者の状態および送達経路に依存する。一般的な提案として、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの投薬量が治療効果を生じ、ただし、全ての重量は本作用物質の重量に基づいて計算されている。より高いレベルにおける毒性懸念により、静脈内投薬量は、最高約１０ｍｇ／ｋｇまでなど、より低いレベルへ制限され得、ただし、全ての重量は本作用物質の重量に基づいて計算されている。約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの投薬量を経口投与に用いることができる。典型的には、約０．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでの投薬量を筋肉内注射に用いることができる。特定の投薬量は約１μｍｏｌ／ｋｇから５０μｍｏｌ／ｋｇまでであり、より特に、静脈内または経口投与、それぞれについて、本作用物質の約２２μｍｏｌ／ｋｇまで、および３３μｍｏｌ／ｋｇまでである。

本発明の特定の実施形態において、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれ以上の投与）を、治療効果を達成するために様々な時間間隔（例えば、毎時、毎日、毎週、毎月など）にわたって用いることができる。

本発明は、獣医学的および医学的適用に用いられる。適切な対象には、トリと哺乳動物の両方が挙げられ、哺乳動物が好ましい。本明細書で用いられる場合、用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含むが、それらに限定されない。ヒト対象には、新生児、乳幼児、若年、および成人が挙げられる。対象は、本発明の方法を必要とするもの、例えば、がんを有しまたは有するのではないかと疑われる対象であり得る。対象は、実験動物、例えば、疾患の動物モデルであり得る。

本発明の非限定的実施形態は以下を含む。

実施形態１．少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞上の抗原と特異的に結合する第１のドメイン、および間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞と係合することにより抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する第２のドメインを含むキメラ結合性物質。

実施形態２．骨髄由来細胞が、マクロファージ、樹状細胞、または好中球、好塩基球、好酸球もしくはマスト細胞などの顆粒球である、実施形態１に記載のキメラ結合性物質。

実施形態３．上皮がん細胞が後期上皮がん細胞である、実施形態１または２に記載のキメラ結合性物質。

実施形態４．上皮がん細胞が少なくとも部分的に間葉系細胞へ転換している、実施形態３に記載のキメラ結合性物質。

実施形態５．上皮がん細胞が化学療法抵抗性または不応性である、実施形態１～４のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態６．第１のドメインが抗体ドメインである、実施形態１～５のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態７．第２のドメインが抗体ドメインである、実施形態１～６のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態８．第１のドメインがヒト化またはヒト抗体ドメインである、実施形態１～７のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態９．第２のドメインがヒト化またはヒト抗体ドメインである、実施形態１～８のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態１０．キメラ抗体またはその抗原結合性断片である、実施形態１～９のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態１１．第１のドメインがインテグリンと特異的に結合する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態１２．インテグリンがインテグリンαｖである、実施形態１１に記載のキメラ結合性物質。

実施形態１３．インテグリンがインテグリンβ３である、実施形態１１に記載のキメラ結合性物質。

実施形態１４．インテグリンがインテグリンαｖβ３である、実施形態１１に記載のキメラ結合性物質。

実施形態１５．第１のドメインが、上皮様腫瘍細胞（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－カドヘリン、ＺＯ－１、インテグリンα６β４）または間葉系様腫瘍細胞（例えば、インテグリンαｖβ３、インテグリンβ１、インテグリンαｖβ６、Ｎ－カドヘリン、ＯＢ－カドヘリン、シンデカン－１）の表面上の受容体を含む、がん細胞の表面上の抗原と特異的に結合する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態１６．第１のドメインが、以前には免疫系により認識されたことがないネオ抗原と特異的に結合する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態１７．第１のドメインが抗体のＦａｂドメインを含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態１８．第１のドメインがＩｇＧ抗体のＦａｂドメインを含む、実施形態１７に記載のキメラ結合性物質。

実施形態１９．第１のドメインがＩｇＧ４抗体のＦａｂドメインを含む、実施形態１８に記載のキメラ結合性物質。

実施形態２０．第１のドメインが、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）またはそれと少なくとも９０％同一の配列、およびｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖のＦａｂ部分のアミノ酸配列（配列番号３）またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１９に記載のキメラ結合性物質。

実施形態２１．第１のドメインが、ＬＭ６０９＿７の重鎖のＦａｂ部分のアミノ酸配列（配列番号５）またはそれと少なくとも９０％同一の配列およびＬＭ６０９＿７の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）またはそれと少なくとも９０％同一の配列、ＪＣ７Ｕの重鎖のＦａｂ部分のアミノ酸配列（配列番号７）またはそれと少なくとも９０％同一の配列およびＪＣ７Ｕの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１９に記載のキメラ結合性物質。

実施形態２２．第１のドメインがさらに第２の抗原と特異的に結合する、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態２３．第１のドメインが二重特異性抗体ドメインである、実施形態２２に記載のキメラ結合性物質。

実施形態２４．第２の抗原が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント分子である、実施形態２２または２３に記載のキメラ結合性物質。

実施形態２５．第２の抗原が、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、もしくはＣＤ１０５などのがん幹細胞マーカー、またはエフェクター細胞抗原である、実施形態２２または２３に記載のキメラ結合性物質。

実施形態２６．第２の抗原がエフェクター細胞抗原である、実施形態２２または２３に記載のキメラ結合性物質。

実施形態２７．第２のドメインがマクロファージと係合する、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態２８．第２のドメインがナチュラルキラー細胞とは有意には係合しない、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態２９．第２のドメインがリンパ球とは有意には係合しない、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態３０．第２のドメインが骨髄由来細胞の表面上のタンパク質と特異的に結合する、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態３１．第２のドメインがＦｃガンマ受容体と特異的に結合する、実施形態３０に記載のキメラ結合性物質。

実施形態３２．第２のドメインがＦｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲＩ、ＣＤ６４）と特異的に結合する、実施形態３０に記載のキメラ結合性物質。

実施形態３３．第２のドメインが抗体のＦｃドメインを含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態３４．第２のドメインがＩｇＧ抗体のＦｃドメインを含む、実施形態３３に記載のキメラ結合性物質。

実施形態３５．第２のドメインがＩｇＧ４抗体のＦｃドメインを含む、実施形態３４に記載のキメラ結合性物質。

実施形態３６．第２のドメインがＩｇＡまたはＩｇＥ抗体のＦｃドメインを含む、実施形態３３に記載のキメラ結合性物質。

実施形態３７．第２のドメインが抗体のヒンジドメインをさらに含む、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態３８．第２のドメインが、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖Ｆｃドメインおよびヒンジドメインのアミノ酸配列（配列番号４）またはそれらと少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態３７に記載のキメラ結合性物質。

実施形態３９．アミノ酸配列が、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異（Ｅｕナンバリングシステム）を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質。

実施形態４０．ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号２）のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態３９に記載のキメラ結合性物質。

実施形態４１．アミノ酸配列が
ａ）Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；
ｂ）Ｉ３３２Ｅ；
ｃ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；
ｄ）Ｇ２３６Ａ；
ｅ）Ｎ２９７Ａ／Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ；
ｆ）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ｇ）Ｑ２９５Ｒ／Ｌ３２８Ｗ／Ａ３３０Ｖ／Ｐ３３１Ａ／Ｉ３３２Ｙ／Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ；
ｈ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ；
ｉ）Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；
ｊ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３３１Ｓ；
ｋ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ｌ）Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４／Ａ；
ｍ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；
ｎ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；
ｏ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ；
ｐ）Ｌ２３４Ｙ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２９８Ａ；
ｑ）Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ；
ｒ）Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ；
ｓ）Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；
ｔ）Ｋ３２６Ｍ／Ｅ３３３Ｓ；
ｕ）Ｃ２２１Ｄ／Ｄ２２２Ｃ；
ｖ）Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｗ；
ｗ）Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｗ；
ｘ）Ｅ３４５Ｒ
ｙ）Ｒ４３５Ｈ；
ｚ）Ｎ４３４Ａ；
ａａ）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ａｂ）Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；
ａｃ）Ｔ２５２Ｌ／Ｔ／２５３Ｓ／Ｔ２５４Ｆ；
ａｄ）Ｅ２９４ｄｅｌｔａ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ；
ａｅ）Ｔ２５６Ｎ／Ａ３７８Ｖ／Ｓ３８３Ｎ／Ｎ４３４Ｙ；
ａｆ）Ｅ２９４ｄｅｌｔａ
ａｇ）Ｌ２３５Ｅ；
ａｈ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；
ａｉ）Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ；
ａｊ）Ｐ３３１Ｓ／Ｌ２３４Ｅ／Ｌ２２５Ｆ；
ａｋ）Ｄ２６５Ａ；
ａｌ）Ｇ２３７Ａ；
ａｍ）Ｅ３１８Ａ；
ａｎ）Ｅ２３３Ｐ；
ａｏ）Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ；
ａｐ）Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；
ａｑ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；
ａｒ）Ａ３３０Ｌ；
ａｓ）Ｄ２７０Ａ；
ａｔ）Ｋ３２２Ａ；
ａｕ）Ｐ３２９Ａ；
ａｖ）Ｐ３３１Ａ；
ａｗＶ２６４Ａ；
ａｘ）Ｆ２４１Ａ；
ａｙ）Ｎ２９７ＡもしくはＧもしくはＮ
ａｚ）Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；または
ｂａ）ａ）～ａｚ）の任意の組合せ
から選択される変異を含む、実施形態３９または４０に記載のキメラ結合性物質。

実施形態４２．実施形態１～４０のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質をコードするポリヌクレオチド。

実施形態４３．実施形態４２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

実施形態４４．実施形態４２に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態４３に記載のベクターを含む宿主細胞。

実施形態４５．実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質および担体を含む組成物。

実施形態４６．実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。

実施形態４７．追加の治療剤をさらに含む、実施形態４６に記載の薬学的組成物。

実施形態４８．追加の治療剤が化学療法剤である、実施形態４７に記載の薬学的組成物。

実施形態４９．実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質を含むキット。

実施形態５０．腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞を、少なくとも１つの細胞マーカーを発現するがん細胞へ標的化する方法であって、前記がん細胞および前記骨髄由来細胞を有効量の実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質と接触させるステップを含む、方法。

実施形態５１．がん細胞が細胞ストレスにより少なくとも１つの細胞マーカーを発現する、実施形態５０に記載の方法。

実施形態５２．がん細胞が、上皮間葉転換を起こすことにより少なくとも１つの細胞マーカーを発現する、実施形態５０に記載の方法。

実施形態５３．間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞を、少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞へ標的化する方法であって、前記がん細胞および前記骨髄由来細胞を有効量の実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質と接触させるステップを含む、方法。

実施形態５４．骨髄由来細胞が、マクロファージ、樹状細胞、または好中球、好塩基球、好酸球もしくはマスト細胞などの顆粒球である、実施形態５３に記載の方法。

実施形態５５．必要とする対象において少なくとも１つの細胞マーカーを発現するがんを処置する方法であって、治療有効量の、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質または実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記がんを処置する、方法。

実施形態５６．必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、治療有効量の、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質または実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記がんを処置する、方法。

実施形態５７．必要とする対象においてがんを処置する方法であって、
ａ）実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質により特異的に結合される抗原について濃縮され、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞について濃縮されているがん細胞を有する対象を選択するステップ；および
ｂ）治療有効量の、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質または実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップであって、それにより、前記がんを処置する、ステップ
を含む、方法。

実施形態５８．必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、
ａ）実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質により特異的に結合される抗原について濃縮され、間葉系腫瘍に蓄積する骨髄由来細胞について濃縮されている上皮がん細胞を有する対象を選択するステップ；および
ｂ）治療有効量の、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラ結合性物質または実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップであって、それにより、前記がんを処置する、ステップ
を含む、方法。

実施形態５９．ステップａ）が、対象からがんの試料を取得し、前記試料において抗原および骨髄由来細胞のレベルを測定することを含む、実施形態５８に記載の方法。

実施形態６０．骨髄由来細胞が、マクロファージ、樹状細胞、または好中球、好塩基球、好酸球、もしくはマスト細胞などの顆粒球である、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６１．上皮細胞がんが後期上皮細胞がんである、実施形態６０に記載の方法。

実施形態６２．がんにおける上皮細胞の１個または複数が、間葉系細胞へ少なくとも部分的に転換している、実施形態６１に記載の方法。

実施形態６３．上皮細胞がんが、化学療法抵抗性もしくは不応性である、またはそうなりつつある、実施形態５８～６２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６４．がんが、胃腸管、乳房、肺（例えば、非小細胞肺がん）、結腸、前立腺、または膀胱のがんなどの癌腫である、実施形態５５～６３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６５．ＣＤ４７遮断剤および／または免疫チェックポイント阻害剤および／またはＥＧＦＲ阻害剤を対象に投与するステップをさらに含む、実施形態５５～６４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６６．ＣＤ４７遮断剤を対象に投与するステップを含まない、実施形態５５～６４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６７．上皮細胞がんがＣＤ４７を発現する、実施形態５８～６６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６８．上皮細胞がんがＣＤ４７を発現しない、実施形態５８～６６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６９．追加のがん治療剤または処置を対象に投与するステップをさらに含む、実施形態５５～６８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７０．キメラ結合性物質または薬学的組成物が、対象へと、静脈内に、皮下に、もしくは筋肉内に投与される、またはインサイチュでがんの中へもしくは近くに注射される、実施形態５５～６９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７１．対象から骨髄由来細胞を単離するステップ、前記骨髄由来細胞をキメラ結合性物質または薬学的組成物と接触させるステップ、および前記接触した骨髄由来細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、実施形態５５～７０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７２．対象がヒトである、実施形態５５～７１のいずれか１つに記載の方法。

本発明は、以下の実施例においてより具体的に記載され、その実施例は、それにおける多数の改変およびバリエーションが当業者に明らかであろうため、例証としてのみ意図される。

［実施例１：インテグリンβ３の発現は複数のがんにわたってマクロファージマーカーと正に相関する］
がん進行中、腫瘍微小環境は、腫瘍の悪性挙動に影響する様々な間質細胞および免疫細胞が出現して、劇的に変化する（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，２００２；Ｒｕｆｆｅｌｌ，２０１５）。したがって、治療用抗体で腫瘍を標的化する場合、何の免疫細胞が利用できるかを考慮することは重要である。腫瘍細胞におけるインテグリンαｖβ３の濃縮は、侵襲性で、薬剤抵抗性の腫瘍表現型の駆動因子であるが（Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ，２００９；Ｓｅｇｕｉｎ，２０１４ａ）、腫瘍免疫微小環境へのαｖβ３陽性腫瘍細胞の影響は、十分定義されていない。Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図１Ａに報告されているように、β３発現腫瘍が、抗体媒介性致死に寄与し得るある特定の免疫エフェクター細胞型について濃縮され得るかどうかを同定するために、複数のＴＣＧＡデータセットにクエリーを実行した。この分析により、ＩＴＧＢ３のｍＲＮＡ発現が、ある特定の型の固形腫瘍に関して、マクロファージ（ＭΦ）、樹状細胞（ＤＣ）、および好中球（ＮΦ）についてのマーカーセットと正に相関するが（ｒｈｏ≧０．３）、ＮＫ細胞（ＮＫ）と相関しないことが明らかにされている。例えば、ＩＴＧＢ３のｍＲＮＡの発現は、腎臓、乳房、ＧＢＭ、肺、胃、前立腺、膵臓、食道、および結腸直腸のがんについてマクロファージマーカーと正に相関するが、腎乳頭、肉腫、甲状腺、黒色腫、および卵巣のがんについては、相関は観察されなかった。また、ＩＴＧＢ３は、マスト細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞などの他の免疫細胞型と正に相関するが、この関係は、限られた数の腫瘍型について観察される。興味深いことに、ＩＴＧＢ３と免疫細胞マーカーとの間の相関は、甲状腺、黒色腫、腎乳頭、および肉腫について観察されず、これらのがんが、ＴＣＧＡ汎がんデータセットの中でＩＴＧＢ３の発現の最も高い中央値を有するにも関わらず、である。

Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図１Ｂに報告されているように、インテグリンβ３と免疫細胞型マーカーとの正の相関が、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを用いて分析された１０個の凍結肺腺がん生検の独立した腫瘍試料について確認された。この中程度の試料サイズについてさえも、中央値より上のＩＴＧＢ３発現を有する腫瘍は、中央値より下のＩＴＧＢ３発現を有する腫瘍と比較して、マクロファージ、樹状細胞、および好中球を特徴づけるマーカーについて濃縮されていた（しかし、ＮＫ細胞については濃縮されていなかった）。ＴＣＧＡデータセットの分析と一致して、ＩＴＧＢ３とこれらのマーカーセットの間の強い正相関がある。総合すると、これらのデータは、β３陽性上皮がんが、抗体媒介性治療のためのエフェクター細胞として働き得る複数の細胞型について濃縮され得ることを示唆している。

Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図１Ｃに報告されているように、様々な遺伝的および組織学的に異なる固形腫瘍型について、タンパク質レベルにおける腫瘍細胞上のβ３発現とのマクロファージの濃縮の正相関をさらに確証するために、本発明者らは、一連の市販の腫瘍マイクロアレイスライドについて免疫組織化学的染色を実施した。この分析により、肺、前立腺、結腸直腸、腎臓、および神経膠芽腫腫瘍について、腫瘍細胞上のインテグリンβ３タンパク質発現が、マクロファージマーカーＣＤ６８およびＣＤ１６３の存在と正に相関することが明らかにされている。高倍率の画像により、腫瘍細胞上のインテグリンβ３染色を有する個々のエリアが、マクロファージマーカーが陽性に染色する細胞について濃縮されていることが確認される。とりわけ、β３の陽性腫瘍細胞発現を有する腫瘍のパーセントは、調べられたアレイスライドの中で２９～５４％の範囲であり、腫瘍の型、グレード、およびステージの多様な集団にわたってβ３＋腫瘍のかなりの部分があることを示している。総合すると、これらの所見は、インテグリンβ３の高い腫瘍細胞発現を有する腫瘍が、腫瘍進行に寄与する腫瘍微小環境のコンポーネントである（Ｐａｔｈｒｉａ，２０１９）、ＴＡＭについて特に濃縮されていること、およびこれらの細胞が、ある特定の治療用抗体で腫瘍を標的化する場合、重要と判明し得ることを示している。

［実施例２：インテグリンβ３の腫瘍細胞発現は、腫瘍がインビボでＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブに対する抵抗性を獲得した後、濃縮される］
ＴＡＭの濃縮は、ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブを含むがん治療後に観察されており（Ｃｈｕｎｇ，２０１２）、本発明者らは、マウスにおける肺がんにおいて、およびヒトにおけるＢＡＴＴＬＥ治験について、エルロチニブ抵抗性の獲得中にインテグリンαｖβ３が上方制御されることを以前、報告した（Ｓｅｇｕｉｎ，２０１４ｂ）。したがって、Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図２Ｂにおいて、本発明者らは、インビボでエルロチニブに対する抵抗性を獲得しているαｖβ３陰性ＨＣＣ８２７ヒトＥＧＦＲ変異体肺腫瘍が、それらが薬剤抵抗性になるにつれて、αｖβ３を獲得するだけでなく、それらはまたＴＡＭについても濃縮されることを示した。

［実施例３：抗αｖβ３モノクローナル抗体は、マクロファージ媒介性腫瘍細胞致死を引き起こす］
ＴＡＭおよびインテグリンαｖβ３発現腫瘍細胞の同時濃縮を考慮すれば、本発明者らは、この関係が、αｖβ３＋のがんを処置するための治療戦略についての基盤を提供すると推論した。本発明者らはさらに、インテグリンαｖβ３を治療的に標的化することは、ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブの効果を逃れるための手段としてαｖβ３の発現を獲得する腫瘍を、処置する新しい機会を提供し得ると推論した。この仮説を試験するために、本発明者らは、本発明者らが以前開発した、ヒト細胞上のインテグリンαｖβ３を認識するがマウス細胞上のを認識しない機能遮断性モノクローナル抗体ＬＭ６０９（Ｃｈｅｒｅｓｈ，１９８７）を用い、完全ヒト化バージョンＶｉｔａｘｉｎ／エタラシズマブ（Ｄｅｌｂａｌｄｏ，２００８；Ｇｕｔｈｅｉｌ，２０００）のための親抗体として利用した。

ＬＭ６０９を、インテグリンαｖβ３の発現の増加によってエルロチニブ抵抗性を獲得する腫瘍の成長を遮断するそれの能力について、試験した。第１に、エルロチニブ抵抗性の発生を遅らせるＬＭ６０９の能力を試験した。簡単に述べれば、ＨＣＣ８２７（１００μｌのＰＢＳ中５×１０^６個の腫瘍細胞）αｖβ３陰性ヒトＥＧＦＲ変異体肺がん細胞を、雌ｎｕ／ｎｕマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、０８８、週齢８～１０週間）の右側腹部へ皮下注射した。腫瘍を、週２回、ノギスで測定した。２５０～７００ｍｍ^３の腫瘍体積を有する動物を、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（経口、６回／週）、ＰＢＳ（ｉ．ｐ．、２回／週）、ＬＭ６０９（ｉ．ｐ．、１０ｍｇ／ｋｇ、２回／週）、またはエルロチニブ（経口、６．２５ｍｇ／ｋｇ、６回／週）の組合せで処置する群へランダムに割り当てた。媒体処置マウスを、大きな腫瘍サイズにより１５日目に屠殺し、エルロチニブ群を５０日目に屠殺した。腫瘍を、液体窒素、ＯＣＴコンパウンド、または１０％ホルマリン中へ置いた。Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図２Ｃに報告されているように、ＬＭ６０９単独では、αｖβ３抗原の欠如による薬剤抵抗性の発生前、ＨＣＣ８２７異種移植腫瘍の成長に影響しない。エルロチニブ単独で処置されたマウスは腫瘍サイズの初期の低下を示したが、これの後に、最終的な腫瘍再成長およびαｖβ３発現の獲得が続く。対照的に、エルロチニブ＋ＬＭ６０９の組合せは、薬剤感受性を延長し、腫瘍細胞上のインテグリンβ３の出現を防止した。

次に、ＬＭ６０９を、エルロチニブの効果に対して抵抗性腫瘍を再感作するそれの能力について試験した。インビトロでエルロチニブ抵抗性腫瘍を生成させるために、ＨＣＣ８２７またはＰＣ９ヒト肺がん細胞（１００μｌのＰＢＳ中５×１０^６個の腫瘍細胞）を、雌ｎｕ／ｎｕマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、０８８、週齢８～１０週間）の右側腹部へ皮下注射し、腫瘍を、週２回、ノギスで測定した。１００～２００ｍｍ^３の腫瘍体積を有する動物を、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（経口、６回／週）またはエルロチニブ（経口、６．２５ｍｇ／ｋｇ、６回／週）の組合せで処置する群へランダムに割り当てた。Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図Ｓ３に示された個々の腫瘍のそれぞれについて、媒体処置されたエルロチニブ感受性（ＨＣＣ８２７－ＰおよびＰＣ９－Ｐ）およびエルロチニブ抵抗性（ＨＣＣ８２７－Ｒ１８およびＰＣ９－Ｒ４Ｌ）細胞を単離した。エルロチニブ抵抗性腫瘍細胞の細胞表面上のαｖβ３発現の獲得を、フローサイトメトリーにより確認した。ＨＣＣ８２７－Ｒ１８およびＰＣ９－Ｒ４Ｌエルロチニブ抵抗性細胞株をレシピエントマウスへ皮下注射した場合、ＬＭ６０９（ｉ．ｐ．、１０ｍｇ／ｋｇ、２回／週）での全身的処置は、エルロチニブの成長阻害効果に対して抵抗性腫瘍を再感作することができた（図１）。

最後に、本発明者らは、ＬＭ６０９の抗腫瘍活性がＴＡＭおよびインテグリンαｖβ３発現腫瘍細胞の同時濃縮に関係し得るかどうかを検討した。Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図２Ａに報告されているように、本発明者らは、ヌードマウスにおいて成長するαｖβ３発現ヒト肺および膵臓異種移植腫瘍が、ＬＭ６０９に対して非常に感受性が高いこと、ならびに、この効果が、クロドロネートリポソームを用いるマクロファージ枯渇により完全に遮断され得ることを見出し、ＴＡＭが、この腫瘍標的化抗体の抗腫瘍効力において重要な役割を果たすことを実証している。クロドロネート処置によるマクロファージの枯渇の成功は、マウスマクロファージマーカーＦ４／８０について腫瘍切片を染色することにより確認された。したがって、マクロファージは、ＬＭ６０９の抗腫瘍活性に必要とされる。

［実施例４：ＬＭ６０９は、マクロファージ媒介性抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する］
ＬＭ６０９についての作用機構がマクロファージ依存性であることを確認するために、本発明者らは、ＬＭ６０９が、マウス腫瘍もしくは骨髄またはヒト血液から単離されたマクロファージを用いて、インビトロで腫瘍細胞を致死できるかどうかを問うた。

ＴＡＭを、過去に記載されたように（Ｋａｎｅｄａ，２０１６）、腫瘍組織から単離した。腫瘍を、コラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ５１３８）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ２６５４）、ディスパーゼｌｌ（Ｒｏｃｈｅ、０４９４２０７８００１）、およびＤＮアーゼＩＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄ５０２５）を含有するＨＢＳＳ中、３７℃で１５分間、解離させた。細胞懸濁液を７０μｍ細胞ストレーナーに通して濾過し、ＰＢＳで洗浄した。単一細胞懸濁液（ＰＢＳ中５％ＢＳＡにおける１０^６個の細胞／１００μＬ）を、ＭｏｕｓｅＢＤＦｃＢｌｏｃｋ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５３１４２、１：５０）と４℃で１０分間、および蛍光標識された抗体、ＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１７－０１１２－８１、１：１００）、およびＬｙ－６Ｇ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５－５９３１－８１、１：１００）と４℃で１時間、インキュベートした。ＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ陽性、Ｌｙ－６Ｇ陰性）をソートした。

安楽死させた週齢８～１０週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて、下肢骨をＲＰＭＩで洗い流し、７０μｍ細胞ストレーナーを通して濾過し、赤血球溶解バッファーＨｙｂｒｉ－Ｍａｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｒ７７５７）中でインキュベートすることにより、マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を無菌的に収集した。細胞を、ＡＤＣＣアッセイ前の７日間、マウスＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３１５－０２）とインキュベートした。

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびマクロファージを、ＳａｎＤｉｅｇｏＢｌｏｏｄＢａｎｋから購入された白血球除去システムチャンバー（ＬＲＳＣ）を用いて単離した。ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０８３（Ｓｉｇｍａ，１０８３１）を用いて、製造会社のプロトコールに従い、ＬＲＳＣから単離した。マクロファージを取得するために、ＰＢＭＣを、ヒトＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，３００－２５）を含む組織培養プレートにおいて５日間、インキュベートした。

本発明者らは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおけるエフェクター細胞として、単離されたマクロファージを用いた。簡単に述べれば、ＣＦＳＥ細胞分裂ＴｒａｃｋｅｒＫｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２３８０１）で染色された標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）を、エフェクター細胞（すなわち、ＴＡＭ）と、アイソタイプＩｇＧまたはＬＭ６０９と共にまたは無しで、３７℃で５～１６時間、共培養し、ＰＩで染色し、フローサイトメトリーを、ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）において実施した。総標的細胞集団（ＣＦＳＥ陽性）に対する死んだ標的細胞（ＰＩ陽性）の比率を、記載されているように（Ｂｒａｃｈｅｒ、２００７）、計算した。

Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図３Ａ～３Ｂに報告されているように、ＬＭ６０９は、免疫適格性Ｃ５７ＢＬ６マウスまたは免疫不全胸腺欠損ヌードマウスにおいて成長したマウスルイス肺がん（ＬＬＣ）腫瘍から単離されたＴＡＭを用いて、頑強なＡＤＣＣ活性を示した。その抗体はまた、健康なマウスから単離された骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）、および健康なドナー血液から単離されたヒト単球由来マクロファージを用いて、腫瘍細胞を致死させることができた。

驚くべきことに、抗体との最適な結合のために一般的に操作された免疫エフェクター細胞型である、マウスＮＫ細胞でも、ヒト血液から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でも（Ｌｉｓｔｉｎｓｋｙ，２０１３；Ｙｕ，２０１７）、ＬＭ６０９媒介性ＡＤＣＣは達成されなかった。実際、ＮＫ細胞は、腫瘍におけるβ３発現と相関していない。これらの所見は、Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図３Ｅに報告された。

抗体のマクロファージ上のＦｃ受容体との結合は、それの致死能力にとって重要な意味をもち、これはなぜなら、Ｆｃ受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２、およびＣＤ６４の抗体遮断の存在下でマクロファージ媒介性致死は存在せず、Ｆｃ部分を欠損するＬＭ６０９の形態（ＦａｂＬＭ６０９）はマクロファージ媒介性致死を引き起こすことができなかったためである。これらの所見は、Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図３Ｃ～３Ｄに報告された。

モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）として知られた過程である、２つの主要な機構を通して腫瘍細胞致死を誘導するようにマクロファージを方向づけることができる。Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図３Ｆにおいて、本発明者らは、ＬＭ６０９がマクロファージＡＤＣＣを誘導したが、ＡＤＣＰまたは直接的致死を誘導せず、これはインテグリンβ３発現を必要としたことを示している。ＡＤＣＰ応答の欠如は、ＣＤ４７の高い腫瘍細胞発現、腫瘍細胞が食作用を逃れるために利用することが多い、「ドントイートミー（ｄｏｎ’ｔｅａｔｍｅ）」シグナル（Ｃｈａｏ，２０１２）と一致する。また、ＡＤＣＰも直接的致死でもなく、マクロファージ媒介性ＡＤＣＣが、Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）の図３Ｇに報告されているように、そのＩＴＧＢ３発現がマクロファージ濃縮に関連する、肺、膵臓、脳、および腎臓のがんを含む腫瘍型を代表する追加のαｖβ３発現腫瘍細胞株で観察された。

総合すると、これらの所見は、ＬＭ６０９の抗腫瘍活性が、そのモノクローナル抗体でのαｖβ３発現腫瘍細胞のオプソニン化、その後、マクロファージＦｃ受容体と係合して、致死を誘導することを含むことを示唆している。

［実施例５：マクロファージの優先的係合のためにデザインされた、ＬＭ６０９の新しいヒト化型］
インビトロＡＤＣＣアッセイによれば、マウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９は、マクロファージと選択的に係合してＡＤＣＣを媒介することができるが、ＮＫ細胞と係合することができず、本発明者らは、この機能差異を保持するＬＭ６０９のヒト化型が作製され得ると推論した。

ＡＤＣＣを引き起こすことを目的としてＮＫ細胞との結合を増強するための抗体Ｆｃエンジニアリングおよび糖鎖エンジニアリング戦略は、ＮＫ細胞上に発現するＦｃ受容体、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）のみとのＦｃ結合を促進するための変化を含む。しかしながら、本発明者らの所見は、間葉系で、幹様で、薬剤抵抗性であるαｖβ３発現腫瘍が、Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）に報告されているように、高レベルのマクロファージ、樹状細胞、および好中球を含有する（しかし、高レベルのＮＫ細胞を含有しない）ことを示唆している。それゆえに、ＮＫ細胞係合を必要とするＡＤＣＣを誘導するように抗αｖβ３抗体をデザインすることは、抗原（αｖβ３）と、αｖβ３発現腫瘍内に存在するその型のエフェクター細胞との間のミスマッチを示す。したがって、本発明者らは、抗αｖβ３がマクロファージをリクルートするように操作することができたならば、この新しい抗体は、ＡＤＣＣをより強く引き起こすことにより抗腫瘍効力の向上を示し得ると推論した。

本発明者らのデザインの目標は、他の免疫エフェクター細胞型よりも多くマクロファージと優先的に係合する、ＬＭ６０９の新しいヒト化型を作製することであった。ＬＭ６０９は、ヒトインテグリンαｖβ３を認識するマウスモノクローナルＩｇＧ１κ抗体である（図２）。ＬＭ６０９のいくつかのヒト化型が、ｈＩｇＧ１アイソタイプとして以前に作製されている（図３および図４）。ｈＩｇＧ４はＦｃγＲＩ／ＣＤ６４とのみ結合し、他のＦｃ受容体と結合しないため、本発明者らは、エタラシズマブ／ＶｉｔａｘｉｎのアイソタイプをｈＩｇＧ１アイソタイプ（図３）からｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐアイソタイプ（図５）へスイッチすることを含む、ＬＭ６０９の新しいヒト化型を作製した。その抗体ヒンジ領域におけるＳ２２８Ｐ（Ｅｕナンバリングシステム）変異は、以前報告されているように（Ｒｅｄｄｙ，２０００）、Ｆａｂアーム交換を防止するために含まれた。図６は、ヒト化ＬＭ６０９ｈＩｇＧ１型対ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ型を比較するアミノ酸配列アラインメントを示す。

ｈＩｇＧ４へのアイソタイプスイッチは、がん治療用物質の作製に以前、利用されていたが、この変化の理論的根拠は、ＡＤＣＣエフェクター細胞、中でも特にＮＫ細胞および単球の係合を欠損する抗体を作製することである。対照的に、マクロファージは、ＡＤＣＣのメディエーターであることを広くは認められていない。マウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９がマクロファージをリクルートして、食作用ではなく、ＡＤＣＣを誘導し得ることを考慮すれば、ｈＩｇＧ４へのアイソタイプスイッチの本発明者らの利用は、ＡＤＣＣのためにマクロファージと係合する、慣例にとらわれない予想外の戦略を表している。

ＮＫ細胞は、抗体Ｆｃ領域と係合するのにＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６のみを利用するが、マクロファージは、ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４を利用することができる。細胞に基づいたＡＤＣＣレポーターバイオアッセイを用いて、本発明者らは、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐがエフェクター細胞上のＦｃγＲＩを強く活性化することができ、一方、ｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ１－Ｉ３３２Ｅアイソタイプは、より低いレベルの係合を示すことを示している（図７）。対照的に、ｈＩｇＧ１アイソタイプは、ＦｃγＲＩＩＩを強く活性化することができ、ｈＩｇＧ１－Ｉ３３２Ｅ変異は、予想通り、これを増強する（図７）。特に、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４は、エフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩの活性化を生じず、ｈＩｇＧ４アイソタイプが主にＦｃγＲＩと相互作用することを確認している。従来の考えは、ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐへのアイソタイプスイッチが、全てのエフェクター細胞係合を除去するであろうと示唆し得るが、本発明者らは、本明細書で、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐが、マクロファージ上で発現するＦｃ受容体ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４と選択的に係合し、活性化することができることを示している。

次に、本発明者らは、ｈＩｇＧ４へのアイソタイプスイッチが、ヒト化ＬＭ６０９のインテグリンαｖβ３媒介性細胞接着を遮断する能力を変化させないことを確認した。インテグリンαｖβ３発現腫瘍細胞の接着である、フィブリノーゲンへのαｖβ３媒介性接着、加えてＩ型コラーゲンへのβ１インテグリン媒介性接着を阻止する能力について、各抗体を試験した。図８は、ヒト化ＬＭ６０９のＩｇＧ１型とＩｇＧ４型の両方が、コラーゲンへのβ１媒介性接着を破壊することなしに、フィブリノーゲンへの接着を遮断したことを示す。

次に、本発明者らは、ＩｇＧ４が、ＮＫ細胞により発現した唯一のＦｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６と結合できないことにより予想されるように、ヒト化ＬＭ６０９のｈＩｇＧ４型が、ＮＫ細胞と係合することができないことを確認した。ＣＤ１６発現ヒトＮＫ細胞を用いるインビトロＡＤＣＣアッセイについて、本発明者らは、ヒト化ＬＭ６０９のｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ型が、ＮＫ細胞と係合できず、ＡＤＣＣを媒介することができないことを確認した（図９Ａ）。対照的に、ヒト化ＬＭ６０９のｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ型は、β３の内因性発現を有するＨ１９７５ヒト肺がん細胞について、一次ヒトマクロファージと係合し、ＡＤＣＣを誘導した（しかし、ｈＩｇＧ１－ＷＴ型は係合しなかった）（図９Ｂ）。ヒト化ＬＭ６０９のｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ型についてのマクロファージ媒介性致死活性は、示されているようなＣＤ１６／ＣＤ３２における多型バリアントを有する３人の個々の健康な血液ドナーから単離されたマクロファージを用いて、さらに確認された（図９Ｃ）。さらに、ＬＭ６０９とｈＬＭ６０９－ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの両方は、エフェクター細胞としてヒトマクロファージを利用するＡＤＣＣを誘導することができる（図１０Ａ）。ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１とは異なって、ｈＬＭ６０９－ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐアイソタイプは、腫瘍細胞致死にＮＫ細胞を利用することができない（図１０Ｂ）。この差異は、抗原（インテグリンαｖβ３）と、マクロファージなど、αｖβ３発現細胞において特に濃縮されているエフェクター細胞の型との間のマッチングを達成することによる治療的優位性を生じ得る。

ＬＭ６０９について観察されたように、ヒト化ＬＭ６０９のｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ型は、インビトロで、マウス骨髄由来マクロファージと係合することができ、ＡＤＣＣを誘導することができた（図１１）。マウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９が、ＡＤＣＣのためにマクロファージをリクルートすることにより、αｖβ３発現腫瘍細胞を致死させることを確立したため、次に、本発明者らは、マウスにおいてＬＭ６０９とｈＬＭ６０９－ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの抗腫瘍活性を比較した。実際、両方の抗体は、等価の抗腫瘍活性を生じ（図１２）、ヒト化型およびマクロファージ係合を可能にするアイソタイプスイッチが、マウスモノクローナル抗体の活性を模倣するのに十分であったことを示唆している。次に、本発明者らは、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１（ＮＫ細胞と係合するアイソタイプ）の抗腫瘍活性をｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ（マクロファージと係合するアイソタイプ）と比較した。重要なことには、これらのアイソタイプバリアントについての抗体親和性は、αｖβ３依存性細胞接着を遮断するそれらの能力により示されているように、等価である（図８）。マウスにおける急激に成長するヒト腫瘍異種移植片について、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐについての抗腫瘍活性は、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１のそれより優れており（図１３）、マクロファージと選択的に係合する能力が、ＮＫ細胞ではなく、大量のマクロファージを有するαｖβ３発現腫瘍について治療的優位性を提供することを示唆している。

次に、本発明者らは、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１の腫瘍蓄積をｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐと比較した。ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐは、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１より高い程度で、腫瘍に局在することができた（図１４）。理論によって縛られるつもりはないが、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐは、それらが全体としてより少数のエフェクター細胞としか係合しないため、主にマクロファージが局在している腫瘍へより局在することができると考えられる。対照的に、より幅広い種類の免疫細胞と係合するｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１は、血液、リンパ節、脾臓などにおけるエフェクター細胞と係合し得、したがって、腫瘍へ局在化させるのに容易には利用でき得ない。

総合すると、これらの所見は、ヒト化ＬＭ６０９のｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ型が、マウスモノクローナルＬＭ６０９の機能活性を模倣することを示している。具体的には、これらの抗体は、マクロファージと優先的に係合して、インテグリンαｖβ３発現腫瘍細胞の致死を誘導することができる。この抗体デザイン戦略は、腫瘍細胞抗原（αｖβ３）を適切なＡＤＣＣ誘導性エフェクター細胞（マクロファージ）とマッチングさせるという目標を反映している。その抗体を、腫瘍微小環境内で濃縮されていない免疫エフェクター細胞型と広く係合することから防ぐことにより、本発明者らは、腫瘍細胞上のαｖβ３および／またはマクロファージ上のＣＤ６４／ＦｃγＲＩとの結合によって腫瘍に蓄積することがより良くできることを提案する。

いくつかの治療用抗体は、ＡＤＣＣによる腫瘍細胞致死を誘導する。これは、抗体Ｆｃ領域が免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体と係合して、腫瘍細胞致死を誘導する細胞傷害性顆粒の放出を引き起こすときに起こる。このシナリオは典型的には、抗体のＮＫ細胞上のＣＤ１６との結合を含むため、多くの抗体糖鎖エンジニアリングおよびＦｃエンジニアリング戦略は、この相互作用を促進するようにデザインされている。ＩｇＧ４はＣＤ６４に対して高い親和性を有するが、全ての他の受容体に対して弱い親和性を有するため、ＩｇＧ４は、一般的に、Ｆｃ媒介性エフェクター機能の弱いインデューサーであると考えられている。したがって、ＩｇＧ４へのアイソタイプスイッチは、腫瘍細胞のエフェクター細胞媒介性致死を増強するための予想外のアプローチである。

例えば、ＦＤＡは、３つのｈＩｇＧ４腫瘍治療用抗体、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ）、およびセミプリマブ（ＬＩＢＴＡＹＯ）を承認しており、それらの全ては、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞上に主に発現している免疫チェックポイント分子ＰＤ－１を標的化する。これらの抗体は、Ｔ細胞阻害を中和すること、すなわち、ＰＤ－１（Ｔ細胞およびＮＫ細胞上）がＰＤ－Ｌ１（腫瘍細胞上）と結合した時の免疫抑制結果を防止することにより働く。ＩｇＧ４サブクラスは、抗体が、追加の免疫エフェクター細胞と係合することなく、ＰＤ－１の機能を遮断することを可能にする。ｈＩｇＧ４抗体について普通であるように、全ての３つの抗ＰＤ－１抗体は、ヒンジ領域におけるｈＩｇＧ４抗体構造を安定化させるためにＳ２２８Ｐ変異を含有する。当技術分野における知識に基づいて、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ抗体は、いかなるエフェクター細胞の係合もなしに、標的抗原の機能を遮断することが予想される。

本発明者らは、Ｗｅｔｔｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９：５０４８（２０１９）において、マクロファージ係合が、インテグリンαｖβ３を認識するマウスモノクローナル抗体であるＬＭ６０９の抗腫瘍活性に必要とされることを報告した。機構的に、本発明者らは、インビトロにおいて、全てのＦｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、およびＣＤ６４）を遮断することによりＡＤＣＣを誘導するＬＭ６０９の能力を阻止できることを決定した。しかしながら、ＬＭ６０９（およびマウスＩｇＧ１抗体）はＣＤ６４と結合することができないため、ＬＭ６０９誘導性マクロファージ－ＡＤＣＣは、ＣＤ６４に非依存的である。ＬＭ６０９が、マクロファージと選択的に係合することにより強力な抗腫瘍活性を引き起こしたが、ＬＭ６０９がＣＤ６４を結合できないことは、ＣＤ６４係合が重要な意味をもたないことを示唆した。

貪食細胞であるマクロファージは、ＡＤＣＰを誘導することが広く知られており、これは、一般的に、ＣＤ１６およびＣＤ３２係合を含むと理解されている。そのようなものとして、ＡＤＣＰは、マクロファージにおいて主に発現しているＣＤ３２に対する高い親和性を有するＩｇＧ２へのアイソタイプスイッチにより増強することができた。しかしながら、そのような抗体の効力は、腫瘍細胞上のＣＤ４７の発現、「ドントイートミー」シグナルによって制限される。マクロファージがまたＡＤＣＣを誘導できることはあまり頻繁には報告されておらず、この活性はＣＤ１６と結びつけられている。それゆえに、マクロファージＡＤＣＣが、ＩｇＧ４－ＣＤ６４相互作用により引き起こされることは予想することができなかった。

がん治療のための抗体には、上皮様腫瘍細胞抗原ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、およびＥｐＣＡＭを認識するいくつかの抗体が挙げられる。そのような抗体のエンジニアリングは、ＮＫ細胞のＣＤ１６の抗体Ｆｃとの結合を介する係合を促進することによりＡＤＣＣを増強することができる。しかしながら、がん治療および進行は、最終的に、上皮マーカーの喪失だけでなく、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の排除もしくは不活性化も含む、ＥＭＴまたはがん幹細胞の濃縮を誘導し得る。このように、後期の、間葉系様の、幹様腫瘍は、腫瘍致死のためにＮＫ細胞を利用する上皮標的化モノクローナル抗体に対して不応性になる。

がんにおけるＥＭＴの１つのホールマークは、免疫的にホットであることから免疫的にコールドであることへの腫瘍免疫内容物のスイッチである。それらがＥＭＴの原因または効果であるかどうか不明であるが、腫瘍随伴マクロファージは、高度に免疫抑制性であり、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を排除するように働き、免疫的にコールドである腫瘍微小環境を生み出す。本発明の優位性は、１）腫瘍細胞表面上の幹／間葉系マーカー（インテグリンαｖβ３）を認識すること、および２）腫瘍随伴マクロファージと係合して、ＡＤＣＣを誘導することにより、腫瘍細胞致死を誘導するための「抗原－エフェクター細胞マッチング」を達成する能力である。

前述は、本発明の例証であり、それの限定として解釈されるべきではない。本発明は、含まれ得る特許請求の範囲の等価物と共に、以下の特許請求の範囲により、定義される。
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［配列］
ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ（ヒト化ＬＭ６０９）
重鎖（配列番号１）
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYDMSWVRQA PGKGLEWVAK VSSGGGSTYY 60
LDTVQGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHL HGSFASWGQG TTVTVSSAST 120
KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY 180
SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF 240
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV 300
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV 360
SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF 420
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK 444
軽鎖（配列番号２）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCQASQSIS NFLHWYQQRP GQAPRLLIRY RSQSISGIPA 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SGSWPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214
重鎖のＦａｂドメイン（配列番号３）
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYDMSWVRQA PGKGLEWVAK VSSGGGSTYY 60
LDTVQGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHL HGSFASWGQG TTVTVSSAST 120
KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY 180
SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRV 215
重鎖のＦｃおよびヒンジドメイン（配列番号４）
ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY 60
VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK 120
AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 180
DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK 229

ｓｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴ（スーパーヒト化ＬＭ６０９＿７）
重鎖のＦａｂドメイン（配列番号５）
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGASIS RGGYYWSWIR QYPGKGLEWI GYIHSHSGST 60
YYNPSLKSRV TIAIDTSKNQ LSLRLTSVTA ADTAVYYCAR HNYGSFAYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG 180
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKV 217
軽鎖（配列番号６）
ELVMTQSPEF QSVTPKETVT ITCRASQDIG NSLHWYQQKP GQSPKLLIKY ASQPVFGVPS 60
RFRGSGSGTD FTLTISRLEP EDFAVYYCQQ SNSWPHTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214

ｓｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴ（スーパーヒト化ＪＣ７Ｕ）
重鎖のＦａｂドメイン（配列番号７）
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGASIS RGGYRWSWIR QYPGKGLEWI GYIHSHSGST 60
YYNPSLKSRV TIAIDTSKNQ LSLRLTSVTA ADTAVYYCAR QNLGSFAYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG 180
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKV 217
軽鎖（配列番号８）
ELVMTQSPEF QSVTPKETVT ITCRASQDIG NSLHWYQQKP GQSPKLLIKY ASQPVFGVPS 60
RFRGSGSGTD FTLTISRLEP EDFAVYYCQQ SQFWPHTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214

ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴ（ヒト化ＬＭ６０９）
重鎖（配列番号９）
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYDMSWVRQA PGKGLEWVAKVSSGGGSTYY 60
LDTVQGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHL HGSFASWGQG TTVTVSSAST 120
KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY 180
SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV 240
FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY 300
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 360
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG 420
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 447
軽鎖（配列番号１０）
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCQASQSIS NFLHWYQQRP GQAPRLLIRY RSQSISGIPA 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SGSWPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214

ｍＡｂＬＭ６０９－ｍＩｇＧ１－カッパ
重鎖（配列番号１１）
MNFGLRLIFL VLTLKGVKCE VQLVESGGGL VKPGGSLKLS CAASGFAFSS YDMSWVRQIP 60
EKRLEWVAKV SSGGGSTYYL DTVQGRFTIS RDNAKNTLYL QMSSLNSEDT AMYYCARHNY 120
GSFAYWGQGT LVTVSAAKTT PPSVYPLAPG SAAQTNSMVT LGCLVKGYFP EPVTVTWNSG 180
SLSSGVHTFP AVLQSDLYTL SSSVTVPSST WPSETVTCNV AHPASSTKVD KKIVPRDCGC 240
KPCICTVPEV SSVFIFPPKP KDVLTITLTP KVTCVVVDIS KDDPEVQFSW FVDDVEVHTA 300
QTQPREEQFN STFRSVSELP IMHQDWLNGK EFKCRVNSAA FPAPIEKTIS KTKGRPKAPQ 360
VYTIPPPKEQ MAKDKVSLTC MITDFFPEDI TVEWQWNGQP AENYKNTQPI MDTDGSYFVY 420
SKLNVQKSNW EAGNTFTCSV LHEGLHNHHT EKSLSHSPGK 460
軽鎖（配列番号１２）
MVFTPQILGL MLFWISASRG DIVLTQSPAT LSVTPGDSVS LSCRASQSIS NHLHWYQQKS 60
HESPRLLIKY ASQSISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVET EDFGMYFCQQ SNSWPHTFGG 120
GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL 180
NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC 234

ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ（ヒト化ＬＭ６０９）
重鎖コード配列（配列番号１３）
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtcaggtccaactggtcgaatcgggggggggagttgtccaacctgggagaagcctgcggctatcatgcgctgcatcgggatttacatttagctcgtatgatatgagctgggtcaggcaagcccccggaaagggactggaatgggtcgcgaaagtcagctctgggggagggagcacctactatctggacacggtccaaggacgattcacaattagcagagacaattcgaaaaatacactatacctgcaaatgaatagcctccgggccgaggatacggcggtctactactgcgctcgccacttgcacggatcatttgcatcatgggggcagggtaccactgtcacggtctcgagcgctagcaccaagggcccctccgtgttccccctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgcctggtgaaagactacttccccgagcctgtgaccgtgagctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcaatcctccggcctgtactccctgtcctccgtggtgacagtgccctcctccagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaaatacggccctccctgccccccctgccctgcccctgaatttctgggcggaccttccgtgtttctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatccagaggtgcagttcaactggtatgttgacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctccagcatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactctcggctgacagtggataagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactatacccagaagtccctgtccctgagcctgggcaagtgatgaaagctt
軽鎖コード配列（配列番号１４）
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtgagatcgtcctcacccaatcgccggcgacgctgagcctctctcccggagagcgggcgaccttgagctgccaagcgagccaatcaatctccaatttcttgcactggtatcaacaaaggcccggacaagcaccgaggctgctgataagatataggagccaatcgatctccgggatacccgcacgatttagcggaagcggatcgggcaccgattttacgctaacgatttcgagcctggagccggaggactttgcggtctattactgccaacaatcgggaagctggccgctgacatttggaggaggtaccaaggtcgagatcaagcgtacggtcgcggcgccttctgtgttcattttccccccatctgatgaacagctgaaatctggcactgcttctgtggtctgtctgctgaacaacttctaccctagagaggccaaagtccagtggaaagtggacaatgctctgcagagtgggaattcccaggaatctgtcactgagcaggactctaaggatagcacatactccctgtcctctactctgacactgagcaaggctgattacgagaaacacaaagtgtacgcctgtgaagtcacacatcaggggctgtctagtcctgtgaccaaatccttcaataggggagagtgctgatagtaaaagctt

ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ１－ＷＴ（ヒト化ＬＭ６０９）
重鎖コード配列（配列番号１５）
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtcaggtccaactggtcgaatcgggggggggagttgtccaacctgggagaagcctgcggctatcatgcgctgcatcgggatttacatttagctcgtatgatatgagctgggtcaggcaagcccccggaaagggactggaatgggtcgcgaaagtcagctctgggggagggagcacctactatctggacacggtccaaggacgattcacaattagcagagacaattcgaaaaatacactatacctgcaaatgaatagcctccgggccgaggatacggcggtctactactgcgctcgccacttgcacggatcatttgcatcatgggggcagggtaccactgtcacggtctcgagcgctagcacaaagggccctagtgtgtttcctctggctccctcttccaaatccacttctggtggcactgctgctctgggatgcctggtgaaggattactttcctgaacctgtgactgtctcatggaactctggtgctctgacttctggtgtccacactttccctgctgtgctgcagtctagtggactgtactctctgtcatctgtggtcactgtgccctcttcatctctgggaacccagacctacatttgtaatgtgaaccacaaaccatccaacactaaagtggacaaaagagtggaacccaaatcctgtgacaaaacccacacctgcccaccttgtcctgcccctgaactgctgggaggaccttctgtgtttctgttcccccccaaaccaaaggataccctgatgatctctagaacccctgaggtgacatgtgtggtggtggatgtgtctcatgaggaccctgaggtcaaattcaactggtacgtggatggagtggaagtccacaatgccaaaaccaagcctagagaggaacagtacaattcaacctacagagtggtcagtgtgctgactgtgctgcatcaggattggctgaatggcaaggaatacaagtgtaaagtctcaaacaaggccctgcctgctccaattgagaaaacaatctcaaaggccaagggacagcctagggaaccccaggtctacaccctgccaccttcaagagaggaaatgaccaaaaaccaggtgtccctgacatgcctggtcaaaggcttctacccttctgacattgctgtggagtgggagtcaaatggacagcctgagaacaactacaaaacaaccccccctgtgctggattctgatggctctttctttctgtactccaaactgactgtggacaagtctagatggcagcaggggaatgtcttttcttgctctgtcatgcatgaggctctgcataaccactacactcagaaatccctgtctctgtctcccgggaaatgatagtaaaagctt

Claims

少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞上のインテグリンαｖβ３と特異的に結合する第１のドメインと、間葉系腫瘍に蓄積するマクロファージと係合することにより抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する第２のドメインとを含むキメラ結合性物質。
前記上皮がん細胞が、後期上皮がん細胞である、請求項１に記載のキメラ結合性物質。
前記上皮がん細胞が、少なくとも部分的に間葉系細胞へ転換している、請求項２に記載のキメラ結合性物質。
前記上皮がん細胞が、化学療法抵抗性または不応性である、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、抗体ドメインである、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、抗体ドメインである、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、ヒト化またはヒト抗体ドメインである、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、ヒト化またはヒト抗体ドメインである、請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
キメラ抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１～８のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、抗体のＦａｂドメインを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、ＩｇＧ抗体のＦａｂドメインを含む、請求項１０に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、ＩｇＧ４抗体のＦａｂドメインを含む、請求項１１に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）またはそれと少なくとも９０％同一の配列、およびｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖のＦａｂ部分のアミノ酸配列（配列番号３）またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１２に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、ＬＭ６０９＿７の重鎖のＦａｂ部分のアミノ酸配列（配列番号５）またはそれと少なくとも９０％同一の配列およびＬＭ６０９＿７の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）またはそれと少なくとも９０％同一の配列、ＪＣ７Ｕの重鎖のＦａｂ部分のアミノ酸配列（配列番号７）またはそれと少なくとも９０％同一の配列およびＪＣ７Ｕの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１３に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、さらに第２の抗原と特異的に結合する、請求項１～１２のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第１のドメインが、二重特異性抗体ドメインである、請求項１５に記載のキメラ結合性物質。
前記第２の抗原が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント分子である、請求項１５または１６に記載のキメラ結合性物質。
前記第２の抗原が、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６もしくはＣＤ１０５などのがん幹細胞マーカー、またはエフェクター細胞抗原である、請求項１５または１６に記載のキメラ結合性物質。
前記第２の抗原が、エフェクター細胞抗原である、請求項１５または１６に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、ナチュラルキラー細胞とは有意には係合しない、請求項１～１９のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、リンパ球とは有意には係合しない、請求項１～２０のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、骨髄由来細胞の表面上のタンパク質と特異的に結合する、請求項１～２１のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、Ｆｃガンマ受容体と特異的に結合する、請求項２２に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲＩ、ＣＤ６４）と特異的に結合する、請求項２２に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、抗体のＦｃドメインを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、ＩｇＧ抗体のＦｃドメインを含む、請求項２５に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、ＩｇＧ４抗体のＦｃドメインを含む、請求項２６に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、ＩｇＡまたはＩｇＥ抗体のＦｃドメインを含む、請求項２６に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、抗体のヒンジドメインをさらに含む、請求項２５～２８のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
前記第２のドメインが、ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖Ｆｃドメインおよびヒンジドメインのアミノ酸配列（配列番号４）またはそれらと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２９に記載のキメラ結合性物質。
前記アミノ酸配列が、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異（Ｅｕナンバリングシステム）を含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質。
ｈＬＭ６０９－ｈＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐの重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号２）のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３１に記載のキメラ結合性物質。
前記アミノ酸配列が
ａ）Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；
ｂ）Ｉ３３２Ｅ；
ｃ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；
ｄ）Ｇ２３６Ａ；
ｅ）Ｎ２９７Ａ／Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ；
ｆ）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ｇ）Ｑ２９５Ｒ／Ｌ３２８Ｗ／Ａ３３０Ｖ／Ｐ３３１Ａ／Ｉ３３２Ｙ／Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ；
ｈ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ；
ｉ）Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；
ｊ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３３１Ｓ；
ｋ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ｌ）Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４／Ａ；
ｍ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；
ｎ）Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；
ｏ）Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ；
ｐ）Ｌ２３４Ｙ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２９８Ａ；
ｑ）Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ；
ｒ）Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ；
ｓ）Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；
ｔ）Ｋ３２６Ｍ／Ｅ３３３Ｓ；
ｕ）Ｃ２２１Ｄ／Ｄ２２２Ｃ；
ｖ）Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｗ；
ｗ）Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｗ；
ｘ）Ｅ３４５Ｒ
ｙ）Ｒ４３５Ｈ；
ｚ）Ｎ４３４Ａ；
ａａ）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；
ａｂ）Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；
ａｃ）Ｔ２５２Ｌ／Ｔ／２５３Ｓ／Ｔ２５４Ｆ；
ａｄ）Ｅ２９４ｄｅｌｔａ／Ｔ３０７Ｐ／Ｎ４３４Ｙ；
ａｅ）Ｔ２５６Ｎ／Ａ３７８Ｖ／Ｓ３８３Ｎ／Ｎ４３４Ｙ；
ａｆ）Ｅ２９４ｄｅｌｔａ
ａｇ）Ｌ２３５Ｅ；
ａｈ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；
ａｉ）Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ；
ａｊ）Ｐ３３１Ｓ／Ｌ２３４Ｅ／Ｌ２２５Ｆ；
ａｋ）Ｄ２６５Ａ；
ａｌ）Ｇ２３７Ａ；
ａｍ）Ｅ３１８Ａ；
ａｎ）Ｅ２３３Ｐ；
ａｏ）Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ；
ａｐ）Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；
ａｑ）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；
ａｒ）Ａ３３０Ｌ；
ａｓ）Ｄ２７０Ａ；
ａｔ）Ｋ３２２Ａ；
ａｕ）Ｐ３２９Ａ；
ａｖ）Ｐ３３１Ａ；
ａｗＶ２６４Ａ；
ａｘ）Ｆ２４１Ａ；
ａｙ）Ｎ２９７ＡもしくはＧもしくはＮ
ａｚ）Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；または
ｂａ）ａ）～ａｚ）の任意の組合せ
から選択される変異を含む、請求項３１または３２に記載のキメラ結合性物質。
請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質をコードするポリヌクレオチド。
請求項３４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３５に記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質および担体を含む組成物。
請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
追加の治療剤をさらに含む、請求項３８に記載の薬学的組成物。
前記追加の治療剤が化学療法剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質を含むキット。
マクロファージを、インテグリンαｖβ３を発現するがん細胞へ標的化する方法であって、前記がん細胞および前記マクロファージを有効量の請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質と接触させるステップを含む、方法。
前記がん細胞が、細胞ストレスによりインテグリンαｖβ３を発現する、請求項４２に記載の方法。
前記がん細胞が、上皮間葉転換を起こすことによりインテグリンαｖβ３を発現する、請求項４２に記載の方法。
間葉系腫瘍に蓄積するマクロファージを、少なくとも１つの間葉系細胞マーカーを発現する上皮がん細胞へ標的化する方法であって、前記がん細胞および前記マクロファージを有効量の請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質と接触させるステップを含む、方法。
処置を必要とする対象においてインテグリンαｖβ３を発現するがんを処置する方法であって、治療有効量の、請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質または請求項３８～４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記がんを処置する、方法。
処置を必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、治療有効量の、請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質または請求項３８～４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記がんを処置する、方法。
処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、
ａ）インテグリンαｖβ３について濃縮され、かつ、マクロファージについて濃縮されているがん細胞を有する対象を選択するステップと、
ｂ）治療有効量の、請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質または請求項３８～４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップと、それにより、前記がんを処置する
を含む、方法。
処置を必要とする対象において上皮細胞がんを処置する方法であって、
ａ）インテグリンαｖβ３について濃縮され、かつ、間葉系腫瘍に蓄積するマクロファージについて濃縮されている上皮がん細胞を有する対象を選択するステップと、
ｂ）治療有効量の、請求項１～３３のいずれか１項に記載のキメラ結合性物質または請求項３８～４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップと、それにより、前記がんを処置する
を含む、方法。
ステップａ）が、前記対象からがんの試料を取得するステップと、前記試料においてインテグリンαｖβ３およびマクロファージのレベルを測定するステップとを含む、請求項４８または４９に記載の方法。
前記上皮細胞がんが、後期上皮細胞がんである、請求項４９に記載の方法。
前記がんにおける前記上皮細胞の１個または複数が、少なくとも部分的に間葉系細胞へ転換している、請求項４９に記載の方法。
前記上皮細胞がんが、化学療法抵抗性または不応性であるか、なりつつある、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の方法。
前記がんが、胃腸管、乳房、肺（例えば、非小細胞肺がん）、結腸、前立腺または膀胱のがんなどの癌腫である、請求項４６～５３のいずれか１項に記載の方法。
ＣＤ４７遮断剤および／または免疫チェックポイント阻害剤および／またはＥＧＦＲ阻害剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の方法。
ＣＤ４７遮断剤を前記対象に投与することを含まない、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の方法。
前記上皮細胞がんがＣＤ４７を発現する、請求項４６～５６のいずれか１項に記載の方法。
前記上皮細胞がんがＣＤ４７を発現しない、請求項４６～５６のいずれか１項に記載の方法。
追加のがん治療剤または処置を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項４２～５８のいずれか１項に記載の方法。
前記キメラ結合性物質または薬学的組成物が、前記対象へ、静脈内、皮下もしくは筋肉内に投与される、またはインサイチュでがんの中へもしくは近くに注射される、請求項４２～５９のいずれか１項に記載の方法。
前記対象からマクロファージを単離するステップと、前記マクロファージをキメラ結合性物質または薬学的組成物と接触させるステップと、前記接触したマクロファージを前記対象に投与するステップとをさらに含む、請求項４２～６０のいずれか１項に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項４２～６１のいずれか１項に記載の方法。