CN115485301A - 治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及嵌合结合剂和包含所述嵌合结合剂的组合物。本发明还涉及编码嵌合结合剂的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及使用嵌合结合剂介导上皮癌细胞的抗体依赖性细胞毒性的方法和治疗上皮细胞癌的方法。

Description

治疗癌症的组合物和方法

优先权声明

本申请要求2020年4月23日提交的美国临时申请第63/014,550号的权益，其全部内容通过引用并入本文中。

技术领域

本发明涉及嵌合结合剂和包含所述嵌合结合剂的组合物。本发明还涉及编码嵌合结合剂的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及使用嵌合结合剂介导上皮癌细胞的抗体依赖性细胞毒性的方法和治疗上皮细胞癌的方法。

背景技术

抗体是与特定抗原结合的蛋白质。被批准用于癌症治疗的单克隆抗体(mAb)和基于mAb的试剂包括针对以下的一些：恶性B细胞和浆细胞(CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD52、CD79B、SLAMF7)、上皮癌细胞(EpCAM、EGFR、HER2、VEGFR2、结合素-4)、急性骨髓性白血病(CD33)、皮肤T细胞淋巴瘤(CCR4)、神经母细胞瘤(GD2)和肉瘤(PDGFRA)上表达的抗原，以及免疫检查点靶标(PD-1、PD-L1、CTLA-4)(Gasser,2016；Carter,2018)。目前共有42种基于抗体的癌症疗法获得FDA批准并上市。治疗性抗体对癌症的疗效可能受到多种机制的综合影响(Chiavenna,2017)。与癌细胞上选择性表达的抗原结合的抗体可以通过直接阻断促进肿瘤细胞生长或生存途径的抗原的功能而产生抗肿瘤效应。抗体还可以充当桥梁，将肿瘤细胞与可间接诱导肿瘤细胞破坏的免疫效应细胞结合在一起。

可以使用不断增长的糖工程和Fc工程方法或通过创建双特异性或三特异性抗体来修饰治疗性抗体的特性，以增强或抑制与某些类型的免疫效应细胞的接合(Saxena,2016；Rader,2020)。这些工具可用于合理设计“抗原-效应物匹配”，为癌症治疗创造个性化的药物途径。

专注于改善单核细胞或自然杀伤(NK)细胞接合的抗体工程策略包括大量糖工程和Fc工程变体，这些变体可促进治疗性抗体的Fc部分与FcγRIIIA(CD16A)的结合，后者是唯一在NK细胞上表达的Fc受体(Lazar,2006)。尽管不太常见，但几种策略已经产生了与巨噬细胞结合增强的抗体变体，包括促进与FcγRIIA(CD32A)结合的G236AFc突变体(Richards,2008)或通过FcαRI(CD89)募集巨噬细胞的双特异性抗体(Li,2017)。

选择用于抗体治疗的抗原需要解决随时间演变的癌症表型。针对表达高水平标志物(如EpCAM、EGFR、HER2或VEGFR2)的上皮癌已开发出一类抗体治疗剂。虽然靶向此类抗原的抗体可能对早期肿瘤有效，但已知上皮癌会经历上皮至间充质转化(EMT)，这不仅涉及上皮标志物的丢失和间充质标志物的增加(Karacosta,2019)，而且还会发生肿瘤微环境与免疫细胞浸润的变化(Dongre,2019)。因此，靶向转化为间充质状态的上皮肿瘤可能需要不同的抗原效应细胞组合。

EMT是一个动态过程，它描述了与肿瘤基质成分串扰的肿瘤细胞表型(Dongre,2019)。癌症相关的成纤维细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞分泌多种细胞因子和因子，这些细胞因子和因子与肿瘤细胞接合以激活诱导EMT的转录因子的表达。间充质样癌细胞也将肿瘤的免疫成分转化为免疫功能低下的状态，这会排除抗肿瘤免疫细胞类型并招募促肿瘤巨噬细胞。

因此，用抗体治疗剂靶向通常“免疫冷”的间充质肿瘤可能需要与针对通常“免疫热”的上皮肿瘤开发的抗原效应细胞组合不同的抗原效应细胞组合。已经开发和优化了识别上皮标志物如EpCAM、EGFR、HER2或VEGFR2的抗体，以接合外周血单核细胞(PBMC)或NK细胞上的受体。对于上皮样肿瘤，许多已批准的治疗性抗体为此类抗原效应组合提供了很好的匹配。相比之下，识别在间充质样肿瘤细胞表面上表达的抗原且能够将巨噬细胞作为效应细胞的抗体代表了实体瘤的治疗性抗体开发领域未满足的需求。经历过EMT的癌症往往更具侵袭性、转移性和耐药性。因此，拥有一种攻击经历过EMT的肿瘤细胞的药物可能会降低肿瘤进展和耐药性。

因此，需要新的组合物和使用此类组合物的方法来治疗癌症，尤其包括已经经历EMT的晚期上皮癌。

发明内容

本发明部分基于对上皮癌细胞和EMT过程的理解，包括肿瘤微环境中免疫细胞群的变化。这一转化过程的核心是上皮肿瘤细胞在其细胞表面获得avβ3整合素的表达，变得耐药，表型更类似于干细胞，并且对缺氧或其他环境压力不敏感。上皮癌细胞上avβ3的表达是由微环境内各种形式的细胞应激或应用广泛的抗癌药物引发的。因此，在标准护理治疗上取得进展并因此表达avβ3的患者是靶向avβ3抗原的治疗的候选者。鉴于avβ3对于耐药性是必要和充分的，通过选择性靶向avβ3阳性肿瘤细胞，可能预防或逆转癌症获得性耐药性。

本发明提供了用于接合合适的免疫效应细胞以有效介导针对已经经历EMT并获得细胞表面标志物avβ3的上皮癌细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的组合物和方法。

发明人已经确定ADCC是由巨噬细胞而不是NK细胞介导的，这会导致抗体靶向的癌细胞的死亡。此外，细胞死亡不涉及抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或仅通过抗体的直接杀伤。以前人们认为，巨噬细胞作为效应细胞的抗体接合通常会促进ADCP。发明人惊奇地确定本发明的嵌合结合剂不诱导ADCP，而是仅促进人细胞靶标的巨噬细胞依赖性ADCC。这一出乎意料的发现，除其他好处外，还有利地允许治疗通常对吞噬作用或ADCP具有抗性的CD47阳性肿瘤细胞。仅促进ADCC的结合剂会杀伤它遇到的每个细胞，而促进ADCP的结合剂将无法杀伤CD47阳性细胞。因此，本发明的嵌合结合剂有望更有效。不受理论束缚，认为本发明的优点是基于嵌合结合剂(例如，IgG4结构域)和/或被识别的抗原(例如，整合素αvβ3)的结构使表达该抗原的细胞对ADCC而不是ADCP特别敏感。

间充质肿瘤通过抑制上皮标志物(包括E-钙粘蛋白、EpCAM、occludin、claudin和细胞角蛋白)并促进间充质标志物(包括细胞粘附-相关蛋白N-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、β1和β3整合素以及MMP)的表达的转录因子(ZEB、SNAIL、SLUG和TWIST1)的表达而被鉴别(Dongre，2019)。用于间充质样肿瘤的理想肿瘤细胞抗原将是在肿瘤细胞上高水平表达但在所有其他正常细胞类型上低水平表达的细胞表面标志物。由于EMT与癌症干细胞表型(Marie-Egyptienne,2013；Singh,2010；Ye,2015)和耐药性密切相关，因此癌症干细胞标志物可能代表另一种类型的靶向间充质肿瘤的抗原，尽管这些通常因肿瘤类型而异。

在潜在的细胞表面间充质标志物中，N-钙粘蛋白和β1整合素在许多正常细胞类型上表达，因此可能导致毒性问题或与肿瘤细胞竞争抗体结合。相比之下，整合素avβ3是间充质肿瘤细胞抗原的更具选择性的候选者，这是因为它在正常成人组织中表达较低，而且随着上皮肿瘤变得更具侵袭性、晚期和耐药性，它在上皮肿瘤上也更富集。

本发明基于可以通过接合间充质肿瘤中发现的髓源性细胞并将它们靶向至已经经历EMT的上皮癌细胞上表达的抗原来介导ADCC的药剂的开发。

因此，本发明的一方面涉及一种嵌合结合剂，其包含与表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞上的抗原特异性结合的第一结构域和通过接合间充质肿瘤中积累的髓源性细胞来介导ADCC的第二结构域，和包含所述嵌合结合剂的组合物或药物组合物。

本发明的另一方面涉及一种编码本发明的嵌合结合剂的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。

本发明的另一方面涉及一种将在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞靶向表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞和所述髓源性细胞与有效量的本发明的嵌合结合剂接触。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的嵌合结合剂或药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。特别是，avβ3在耐药性癌症上的表达量增加，从而可以预防或逆转耐药性。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括以下步骤：

a)选择受试者，所述受试者具有富含由本发明的嵌合结合剂特异性结合的抗原并且富含在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞的上皮癌细胞；和

b)向所述受试者施用治疗有效量的本发明的嵌合结合剂或药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。变得耐药的癌症患者获得了avβ3的表达，从而成为针对该标志物的此类疗法的候选者。

本发明的另一方面涉及肿瘤的抗原-效应细胞匹配，使得抗原特异性地存在于肿瘤细胞上(例如，肿瘤细胞抗原)，并且治疗性抗体含有对肿瘤中发现的那些效应细胞(例如，中性粒细胞、树突细胞、NK细胞等)具有特异性的效应细胞结合区。

本发明的这些及其他方面在以下本发明的描述中更详细地阐述。

附图说明

图1显示抗αvβ3小鼠单克隆抗体LM609使肿瘤异种移植物对厄洛替尼敏感。LM609使耐药肿瘤对厄洛替尼重新敏感。注射如Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)(其全部内容通过引用并入本文中)中所报道的产生的HCC827-R18和PC9-R4L厄洛替尼耐药性肿瘤细胞以在nu/nu受体小鼠中形成皮下侧腹肿瘤。一旦肿瘤达到100mm³的体积，小鼠被随机分配接受单独的厄洛替尼(6.25mg/kg)或厄洛替尼和LM609的组合(10mg/kg)。肿瘤尺寸每两周测量一次，并且体积计算为V＝1/2(长度×宽度²)。图表显示平均值±SE。*，使用ANOVA，对于厄洛替尼与厄洛替尼/LM609，P<0.05。

图2显示mAb LM609-mIgG1-κ重链(SEQ ID NO:11)和轻链(SEQ IDNO:12)的氨基酸序列。

图3显示hLM609-hIgG1-WT(人源化LM609)重链(SEQ ID NO:9)和轻链(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。

图4显示两种不同形式的shLM609-hIgG1-WT(超人源化LM609)的氨基酸序列：重链的LM609_7Fab结构域(SEQ ID NO:5)和轻链(SEQ ID NO:6)以及重链的JC7U Fab结构域(SEQ ID NO:7)和轻链(SEQ ID NO:8)。

图5显示hLM609-hIgG4-S228P(人源化LM609)重链(SEQ ID NO:1)和轻链(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列。

图6显示hLM609-hIgG1-WT重链(SEQ ID NO:9)与hLM609-hIgG4-S228P重链(SEQID NO:1)的氨基酸序列比对。序列比对使用来自ncbi.nih.gov的Align SequencesProtein BLAST工具进行。“Query”序列为hLM609-hIgG1-WT，并且“Sbjct”序列为hLM609-hIgG4-S228P。序列差异以粗体显示。

图7显示hLM609-IgG4-S228P在基于细胞的ADCC报告基因生物测定中接合并激活FcγRI。使用Promega ADCC Reporter Bioassay将表达整合素αvβ3的人胰腺癌细胞用作“靶细胞”以评估抗αvβ3抗体引发效应细胞激活的能力，其中使用稳定表达人FcγR I或III的Raji细胞系和NFAT诱导的荧光素酶评估“效应细胞”激活。每种抗体测试了六种抗体稀释度，FcγR激活显示为相对于使用不含抗体的测定缓冲液处理的倍数变化。

图8显示了hLM609 IgG1和IgG4-S228P变体对αvβ3介导的粘附的等效阻断。使用体外细胞粘附测定评估抗体亲和力。对48孔组织培养板涂布整合素αvβ3配体纤维蛋白原或整合素β1配体I型胶原蛋白，并在每种抗体存在的情况下，加入2000-10000个细胞，它们是从5μg/mL开始的一系列2倍稀释液，一式两份。在终点洗涤板并使用结晶紫检测附着在底物上的细胞。

图9A-9C显示NK细胞(NK-ADCC)和巨噬细胞(Mac-ADCC)的体外ADCC。(A)体外NK-ADCC比较hLM609的hIgG4-S228P与hIgG1-WT同种型。基于发光的细胞杀伤试验，其中CD16-V176.NK92细胞被接合以杀伤HCC827+β3靶细胞。图表显示了增加效应物与靶标的比率(E:T)的影响。靶细胞：HCC827+β3人肺癌；效应细胞：CD16-V176.NK92。(B)体外巨噬细胞-ADCC比较hLM609的hIgG4-S228P与hIgG1-WT同种型。从来自两个不同健康供体的血液中分离出原代人巨噬细胞，并将其在用于具有内源性β3表达的H1975靶细胞的杀伤试验中用作效应细胞。靶细胞：H1975人肺癌(内源性β3)；效应细胞：从正常供体血液中分离的原代人巨噬细胞；供体980-A具有CD32高亲和力变体(H131)和CD16低亲和力变体(F158)；未确定供体980-B的变异基因型。(C)hLM609-hIgG4-S228P使用从多个供体分离的巨噬细胞诱导的体外巨噬细胞-ADCC。从来自三个不同健康供体的血液中分离出原代人巨噬细胞，并将其在用于HCC827+β3靶细胞的杀伤试验中用作效应细胞。靶细胞：HCC827+β3人肺癌；效应细胞：从正常供体血液中分离的原代人巨噬细胞。

图10A-10B显示LM609和hLM609-hIgG4-S228P诱导由分离自健康血液供体的巨噬细胞而不是NK细胞介导的ADCC。(A)以原代人单核细胞衍生的巨噬细胞作为效应细胞的体外ADCC。(B)以人NK细胞作为效应细胞的体外ADCC。图表显示了增加效应物与靶标的比率(E:T)对表达αvβ3的人肺癌细胞的死亡的影响。

图11显示小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的体外ADCC。小鼠原代巨噬细胞效应细胞的体外ADCC。从小鼠骨髓中分离出原代小鼠巨噬细胞并用作效应细胞以杀伤HCC827+β3靶细胞。

图12显示hLM609-hIgG4-S228P抑制小鼠中表达αvβ3的肿瘤的生长，在两周的治疗中体重没有减轻。将表达αvβ3的人胰腺癌细胞皮下注射到nu/nu小鼠的侧腹区域。使用卡尺每周两次测量肿瘤尺寸。一旦可触及肿瘤(约150mm³)，将小鼠随机分组。在第0、4、7和11天，用PBS(载体，n＝8)、LM609(10mg/kg，n＝8)或hLM609-IgG4-S228P(10mg/kg，n＝9)处理小鼠。在第0、7和14天测量体重。使用单向方差分析，与PBS相比，误差条显示标准误差，*P<0.05，**P<0.01。

图13显示hLM609-hIgG4-S228P对小鼠中的异种移植物的抗肿瘤活性优于hLM609-hIgG1。将人αvβ3+胰腺癌细胞皮下注射到nu/nu小鼠。使用卡尺每周两次测量肿瘤尺寸。一旦可触及肿瘤(约100mm³)，每周两次给小鼠给药：PBS(载体，n＝13)、hLM609-hIgG1(10mg/kg，n＝8)或hLM609-hIgG4-S228P(10mg/kg，n＝9)。使用单向方差分析，与PBS相比，*P<0.05。

图14显示对于小鼠中的异种移植物，hLM609-hIgG1对hLM609-hIgG4-S228P的肿瘤积累优于hLM609-hIgG1。注射了FG-β3细胞(表达αvβ3的人胰腺癌细胞)的裸小鼠被随机分成3组。用PBS、hLM609-hIgG4-S228P(10mg/kg，腹腔注射)或hLM609-hIgG1(10mg/kg，腹腔注射)每周两次以10mg/kg处理小鼠，持续14天。最后一次给药后30分钟，处死动物，收集肿瘤组织并储存在-80℃直至进一步分析。肿瘤组织在6.4μL/mg的RPMI中裂解。使用人IgGELISA试剂盒(Thermo)测量裂解物中hLM609-hIgG4-S228P和hLM609-hIgG1的浓度。使用Bonferroni和Tukey检验，与PBS相比，*P<0.001。

具体实施方式

下面更详细地解释本发明。该描述不旨在成为可以实施本发明的所有不同方式或可以添加到本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可以结合到其他实施方案中，并且关于特定实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。此外，在不脱离本发明的情况下，根据本公开，对本文提出的各种实施方案的许多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，以下说明旨在说明本发明的一些特定实施方案，而不是详尽地指定其所有排列、组合和变体。

除非上下文另有说明，否则本文所述的本发明的各种特征特别旨在以任何组合使用。此外，本发明还预期在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略在此阐述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书规定复合物包含组分A、B和C，则特别意指A、B或C中的任一个或其组合可以被单独地或以任何组合省略和放弃。

除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常所了解的含义相同。本文中在本发明的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明。

除非另有说明，本领域技术人员已知的标准方法可用于生产重组和合成多肽、抗体或其抗原结合片段、操纵核酸序列和生产转化细胞。这类技术是本领域技术人员已知的。参见例如SAMBROOK等人，《分子克隆：一份实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL)》第4版(纽约冷泉港，2012年)；F.M.AUSUBEL等人，《分子生物学的当前协议(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)》(格林出版联合公司和约翰威利公司，纽约)。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列及其他参考文献以全文引用的方式并入本文中。

定义

如本发明的描述和所附权利要求书中所用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。

如本文所用，“和/或”是指并涵盖相关所列项目中的一者或多者的任何和所有可能的组合，以及在替代方案(“或”)中解释时组合的缺失。

此外，本发明还预期在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略在此阐述的任何特征或特征的组合。

此外，如本文所用的术语“约”当指可测量的值例如本发明的化合物或药剂的量、剂量、时间、温度等时，意在涵盖指定量的±10％、±5％、±1％、±0.5％、或甚至±0.1％的变化。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分的量、性质如反应条件等的数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据当前公开的主题寻求获得的期望特性而变化。

如本文所用，范围可以表示为从“大约”一个特定值，和/或至“大约”另一个特定值。还应当理解，本文中公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“大约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“大约10”。还应当理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。

过渡短语“基本上由……组成”意指权利要求的范围被解释为涵盖权利要求中叙述的指定材料或步骤，以及那些不会对要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。

适用于本发明的多核苷酸或多肽序列的术语“基本上由......组成”(和语法变体)是指多核苷酸或多肽由所述序列(例如SEQ ID NO)和位于所述序列的5′和/或3′或N端和/或C端或两端之间(例如结构域之间)的总共十个或更少(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个额外的核苷酸或氨基酸组成，从而使该多核苷酸或多肽的功能没有实质性改变。十个或更少的额外核苷酸或氨基酸的总数包括加在一起的额外核苷酸或氨基酸的总数。

如本文所用，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质，除非另有说明。

术语“嵌合”是指具有两个或更多个部分的分子，这些部分在同一分子中并不是天然存在的。

“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂交序列(包括天然存在和非天然存在的核苷酸)，但优选是单链或双链DNA序列。

如本文所用，术语“分离的”是指分子(例如蛋白质、多核苷酸或细胞)与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他成分分离或基本上不含这些成分，例如通常发现的与该分子相关的细胞结构成分或其他多肽或核酸。该术语还涵盖以合成方法制备的分子。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment of)”(或语法上等同的术语)意味着受试者病症的严重程度被减轻或至少部分改善或改善，和/或至少一种临床症状的某种缓解、减轻或减少得到实现，和/或病症进展的延迟。

如本文所使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(prevents)”或“预防(prevention)”和“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibits)”或“抑制(inhibition)”(及其语法等同词)并不意味着疾病的完全消除，并且涵盖任何类型的预防性治疗，其减少病症的发生率、延迟病症的发作和/或减少发作后与病症相关联的症状。

如本文所用的“有效”、“预防有效”或“治疗有效”量是足以为受试者提供某种改善或益处的量。另一种说法是，“有效”、“预防有效”或“治疗有效”量是将在受试者的至少一种临床症状中提供某种延迟、缓解、减轻或减少的量。本领域技术人员将理解，效果不必是完全的或治愈的，只要为受试者提供一些益处即可。

如本文所用，提及本发明的嵌合结合剂时，术语“特异结合”或“特异性结合”意味着该药剂将与靶标的表位(包括一个或多个表位)结合，但基本上不与其他无关的表位或分子结合。在某些实施方案中，该术语是指相对于与其他无关的表位或分子的结合，显示至少约60％的与靶标表位的结合(例如至少约70％、80％、90％或95％结合)的药剂。

嵌合结合剂

本发明的第一方面涉及一种嵌合结合剂，其包含与表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞上的抗原特异性结合的第一结构域和通过接合间充质肿瘤中积累的髓源性细胞来介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的第二结构域。

在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞是在上皮细胞肿瘤中富集的细胞类型，因为它们经历了上皮到间充质的转化。在一些实施方案中，肿瘤中髓源性细胞的水平相对于转化前的水平增加2倍、5倍、10倍或更多。在一些实施方案中，髓源性细胞是巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞，例如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。在一些实施方案中，髓源性细胞是巨噬细胞。

上皮癌可能是任何已知类型的癌。上皮癌的实例包括但不限于胃肠道癌、乳腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结肠癌、前列腺癌或膀胱癌。在一些实施方案中，上皮癌细胞是晚期上皮癌细胞。如本文所用的晚期或后期是指基于TNM分期系统的III期或IV期癌症。在一些实施方案中，上皮癌细胞至少部分转化为间充质细胞，例如表达一种或多种间充质抗原。在某些实施方案中，上皮癌细胞是化疗耐药性或难治性的，这可能是由于上皮向间充质的转化。

嵌合结合剂可以是能够结合上皮癌细胞上的抗原并接合髓源性细胞以介导ADCC的任何结构。在一些实施方案中，嵌合结合剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，嵌合结合剂的一个或多个部分由抗体片段组成。在一些实施方案中，嵌合结合剂的一个或两个结构域是非免疫球蛋白支架、适体、小分子(例如，受体配体)或其他结合部分。

在某些实施方案中，嵌合结合剂的第一结构域是抗体结构域。在某些实施方案中，嵌合结合剂的第二结构域是抗体结构域。在一些实施方案中，两个结构域都是抗体结构域。在一些实施方案中，第一结构域是人源化或人类抗体结构域。在一些实施方案中，第二结构域是人源化或人类抗体结构域。在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域是人源化或人类抗体结构域。

在一些实施方案中，第一结构域特异性地结合上皮癌细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，抗原是在上皮样肿瘤细胞的表面发现的受体，例如但不限于EGFR、HER2、EpCAM、E-钙粘蛋白、ZO-1或整合素α6β4。在一些实施方案中，抗原是在间充质样肿瘤细胞的表面发现的受体，例如但不限于整合素αvβ3、整合素β1、整合素αvβ6、N-钙粘蛋白、OB-钙粘蛋白或syndecan-1。

在一些实施方案中，抗原可以是在正常上皮细胞的表面不存在或低水平存在的抗原。在一些实施方案中，抗原可以是在上皮癌细胞的表面不存在或低水平存在的抗原。在一些实施方案中，抗原可以是仅在上皮癌细胞开始向间充质细胞转化之后才存在或以增加的水平存在的抗原。在一些实施方案中，抗原是在上皮癌细胞开始转化为间充质细胞之前不存在或仅低水平存在于上皮癌细胞上的间充质细胞抗原。在一些实施方案中，抗原是先前未被免疫系统识别的新抗原。

在某些实施方案中，第一结构域特异性结合整合素。整合素可以是但不限于整合素αv、整合素β3或整合素αvβ3。

在某些实施方案中，第一结构域包含抗体的Fab结构域、基本上由其组成或由其组成。Fab结构域可以来自任何抗体同种型。在一些实施方案中，第一结构域包含IgG抗体例如IgG1或IgG4抗体的Fab结构域。在一些实施方案中，第一结构域包含hLM609-hIgG4-S228P的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和hLM609-hIgG4-S228P的重链的Fab部分(也称为Fd片段)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。在一些实施方案中，第一结构域包含shLM609-hIgG1-WT的超人源化变体的氨基酸序列，例如，重链LM609_7Fab结构域(SEQ IDNO:5)和轻链的LM609_7Fab结构域(SEQ ID NO:6)，或重链(SEQ ID NO:7)和轻链(SEQ IDNO:8)的JC7U Fab结构域，或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。在一些实施方案中，第一结构域包含hLM609-hIgG1-WT的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和hLM609-hIgG1-WT的重链的Fab部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。

在某些实施方案中，除了上皮癌细胞表面上的抗原之外，第一结构域还可以特异性地结合第二抗原。在一些实施方案中，第一结构域可以是双特异性抗体结构域、三特异性抗体结构域或可以特异性结合一种以上抗原的其他结构。第二抗原可以是例如用于治疗癌症的抗体的结合靶标，例如，免疫检查点分子，如PD-1、PD-L1或CTLA-4。在一些实施方案中，第二抗原是癌症干细胞标志物(例如，CD133、CD44、CD90、CD117、CD166、CD105)。在一些实施方案中，第二抗原是与第二结构域靶向的效应细胞不同的效应细胞上的抗原。在一些实施方案中，不同的效应细胞是髓源性细胞，例如巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞，例如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。在这方面，嵌合结合剂能够将两类或更多类效应细胞定位到肿瘤细胞，例如，巨噬细胞和树突状细胞或巨噬细胞和中性粒细胞。

嵌合结合剂的第二结构域优选接合一种或多种类型的髓源性细胞。在一些实施方案中，第二结构域主要接合一种类型的髓源性细胞，例如巨噬细胞或树突状细胞或粒细胞，例如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。在一些实施方案中，第二结构域主要接合巨噬细胞。本文所用的“主要接合”是指相对于其他细胞类型接合至少80％的靶细胞类型，例如巨噬细胞，例如至少85％、90％或95％。

在某些实施方案中，第二结构域不显著接合自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方案中，第二结构域不显著接合一种或多种类型的淋巴细胞，例如NK细胞、B细胞或T细胞。本文所用的“不显著接合”是指总接合细胞中小于30％是所指示的细胞类型，例如小于25％、20％、15％、10％或5％。

在一些实施方案中，第二结构域特异性结合髓源性细胞表面上的蛋白质。该蛋白质是一种在接合时可以介导ADCC的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质在其他细胞类型例如自然杀伤细胞上不存在或仅低水平存在。在一些实施方案中，第二结构域特异性结合Fc-γ受体。在一些实施方案中，第二结构域特异性结合Fc-γ受体I(FcγRI，CD64)。

在某些实施方案中，第二结构域包含抗体的Fc结构域、基本上由其组成或由其组成。Fc结构域可以来自任何抗体同种型。在一些实施方案中，第二结构域包含IgG抗体例如IgG4抗体的Fc结构域。在一些实施方案中，第二结构域包含IgA或IgE抗体的Fc结构域。在某些实施方案中，第二结构域还包含抗体的铰链结构域。在一些实施方案中，第二结构域包含hLM609-hIgG4-S228P的重链Fc结构域和铰链结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。在一些实施方案中，第二结构域包含hLM609-hIgG1-WT的重链Fc结构域和铰链结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。

在某些实施方案中，嵌合结合剂包含hLM609-hIgG4-S228P重链的氨基酸序列(SEQID NO:1)和轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。在某些实施方案中，嵌合结合剂包含hLM609-hIgG1-WT重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和轻链的氨基酸序列(SEQ IDNO:10)或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。

嵌合结合剂可以包括已知可以增强抗体特性例如稳定性或者改变抗体与Fc-γ受体的结合的序列修饰。在一些实施方案中，嵌合结合剂的氨基酸序列在铰链区包含S228P(Eu编号系统)突变。在一些实施方案中，氨基酸序列包含选自以下的突变：

a)S239D/A330L/I332E；

b)I332E；

c)G236A/S239D/I332E；

d)G236A；

e)N297A/E382V/M428I；

f)M252Y/S254T/T256E；

g)Q295R/L328W/A330V/P331A/I332Y/E382V/M428I；

h)L234A/L235A/P329G；

i)M428L/N434S；

j)L234A/L235A/P331S；

k)L234A/L235A/P329G/M252Y/S254T/T256E；

l)S298A/E333A/K334/A；

m)S239D/I332E；

n)G236A/S239D/A330L/I332E；

o)S239D/I332E/G236A；

p)L234Y/G236W/S298A；

q)F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；

r)K326W/E333S；

s)K326A/E333A；

t)K326M/E333S；

u)C221D/D222C；

v)S267E/H268F/S324W；

w)H268F/S324W；

x)E345R

y)R435H；

z)N434A；

aa)M252Y/S254T/T256E；

ab)M428L/N434S；

ac)T252L/T/253S/T254F；

ad)E294delta/T307P/N434Y；

ae)T256N/A378V/S383N/N434Y；

af)E294delta

ag)L235E；

ah)L234A/L235A；

ai)S228P/L235E；

aj)P331S/L234E/L225F；

ak)D265A；

al)G237A；

am)E318A；

an)E233P；

ao)G236R/L328R；

ap)H268Q/V309L/A330S/P331S；

aq)L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S；

ar)A330L；

as)D270A；

at)K322A；

au)P329A；

av)P331A；

aw V264A；

ax)F241A；

ay)N297A或G或N

az)S228P/F234A/L235A；或

ba)a)至az)的任何组合；

(Eu编号系统)有或无S228P突变。

以下讨论是对抗体生产可用技术的概述；然而，本领域技术人员将认识到，以下方法的许多变体是已知的。

本文使用的术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是单克隆的、寡克隆的或多克隆的，并且可以属于任何来源的物种，包括(例如)小鼠、大鼠、仓鼠、兔、马、牛、山羊、绵羊、猪、骆驼、猴子或人，或者可以是嵌合的或人源化的抗体。参见例如Walker等人,Molec.Immunol.26:403(1989)。抗体可以是根据美国专利号4,474,893或美国专利号4,816,567中公开的方法生产的重组单克隆抗体。抗体也可以根据美国专利号4676980中公开的方法化学构建。

包括在本发明范围内的抗体片段包括例如Fab、Fab′、F(ab)₂和Fv片段；结构域抗体；双特异性抗体；vaccibodies；线性抗体；单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。此类片段可以通过已知技术产生。例如，通过胃蛋白酶消化抗体分子可以产生F(ab′)₂片段，以及通过还原F(ab′)₂片段的二硫桥可以产生Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库以允许快速和容易地鉴定具有期望特异性的单克隆Fab片段(Huse等人,Science 254:1275(1989))。在一些实施方案中，本文使用的术语“抗体片段”还可以包括能够结合靶抗原的任何蛋白质构建体。

本发明的抗体可以被改变或突变以与产生抗体的物种以外的物种相容。例如，抗体可能是人源化或骆驼化的。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂，或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔子)的CDR的残基所取代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基取代。人源化抗体还可以包含在受体抗体中或在输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。一般来说，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有的框架(FR)区(即，CDR区之间的序列)是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体可以是仅有两个CDR是非人的超人源化抗体(美国专利号7,087,409)。人源化抗体最好还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分(Jones等人,Nature 321:522(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593(1992))。

用于对非人类抗体进行人源化的方法在所属领域中是众所周知的。通常，人源化抗体具有从非人的来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。人源化基本上可以遵循Winter及其合作者(Jones等人,Nature 321:522(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988))的方法，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人类可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人类抗体，其中一些CDR残基(例如，所有CDR或其一部分)和可能的一些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代。

人类抗体也可以使用本领域已知的各种技术生产，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991))。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)和Boerner等人,J.Immunol.147:86(1991))。类似地，通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，可以制备人类抗体。在激发时，观察到人类抗体的产生，这在所有方面都与人类相似，包括基因重排、组装和抗体库。这种方法描述在例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和以下科学出版物中：Marks等人,Bio/Technology 10:779(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856(1994)；Morrison,Nature 368:812(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65(1995)。

免疫原(抗原)用于生产与靶多肽具有特异性反应性的抗体。重组或合成多肽和肽，例如长度至少5(例如至少7或10)个氨基酸或更长，是用于生产单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。在一个实施方案中，还包括免疫原性多肽缀合物作为免疫原。肽以纯、部分纯或不纯形式使用。用于靶标病原体和精子的合适多肽和表位在本领域是众所周知的。多核苷酸和多肽序列可在公共序列数据库，如

获得。本领域中已经描述了大量与靶标癌细胞抗原特异性结合的抗体，并且其可以用作制备本发明抗体的起始材料。或者，使用本文所述和本领域众所周知的技术可以针对靶抗原产生新的抗体。

重组多肽在真核或原核细胞中表达，并使用标准技术纯化。然后将多肽或其合成版本注射到能够产生抗体的动物体内。可以生成单克隆或多克隆抗体，随后用于免疫测定中，以测量多肽的存在和数量。

产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。简单地说，免疫原(例如纯化或合成肽、偶联到适当载体(例如谷胱甘肽-S-转移酶、钥孔贝血蓝蛋白等)的肽、或掺入到免疫载体例如重组牛痘病毒中的肽)任选地与佐剂混合，并用该混合物免疫动物。动物对免疫原制剂的免疫反应可通过采集试验血和测定对目的肽的反应性滴度来监测。当获得适当高滴度的针对免疫原的抗体时，从动物中采集血液并制备抗血清。在需要的地方进一步分离抗血清以富集对肽有反应性的抗体。针对多肽的抗体，包括结合片段及其单链重组版本，是通过免疫动物来产生的，例如使用包含与上述载体蛋白共价连接(缀合)的多肽的免疫原性缀合物。通常，目的免疫原是至少约10个氨基酸的多肽，在另一个实施方案中，该多肽长度为至少约20个氨基酸，并且在另一个实施方案中，该片段长度为至少约30个氨基酸。免疫原性缀合物通常通过将多肽偶联到载体蛋白(例如，作为融合蛋白)来制备，或者它们在免疫载体中重组表达。

单克隆抗体是由分泌期望抗体的细胞制备的。这些抗体被筛选为与正常或修饰的肽结合，或被筛选为激动性或拮抗性活性。特异性单克隆和多克隆抗体通常以至少约50mM，例如至少约1mM，例如至少约0.1mM或更好的K_D结合。在某些情况下，希望从各种哺乳动物宿主制备单克隆抗体，例如啮齿动物、兔类动物、灵长类动物、人类等。制备此类单克隆抗体的技术的描述见于Kohler and Milstein 1975Nature 256:495-497。简而言之，该方法通过向动物注射免疫原，例如，单独的或任选地连接到载体蛋白的免疫原性肽来进行。然后处死动物，并从其脾脏中取出细胞，细胞与骨髓瘤细胞融合。其结果是一种能够在体外繁殖的杂交细胞或“杂交瘤”。然后筛选杂交瘤群体以分离单个克隆，每个克隆分泌针对免疫原的单个抗体种类。通过这种方式，获得的单独抗体种类是免疫动物对免疫原性物质上识别的特异性位点作出反应而产生的永生化和克隆的单个B细胞的产物。

永生的替代方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因或逆转录病毒转化，或本领域已知的其他方法。筛选来自单一永生化细胞的菌落，以产生对抗原具有期望特异性和亲和力的抗体，并通过各种技术，包括注射到脊椎动物(优选哺乳动物)宿主的腹膜腔中，提高由这些细胞产生的单克隆抗体的产量。本发明的多肽和抗体在修饰或不修饰的情况下使用，并包括嵌合抗体，如人源化鼠类抗体。其他合适的技术包括在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库。参见Huse等人1989Science 246:1275-1281；和Ward等人1989Nature 341:544-546。

还可以通过本领域已知的噬菌体展示技术获得针对靶多肽的特异性抗体。

本发明还提供编码本发明的嵌合结合剂的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包括重链编码核苷酸序列SEQ ID NO:13和轻链编码序列SEQ IDNO:14或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。在一些实施方案中，多核苷酸包括重链编码核苷酸序列SEQ ID NO:15和轻链编码序列SEQ IDNO:14或与其至少90％相同的序列，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。

本文还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或粘粒载体。

在一些实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的多核苷酸和/或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核或原核细胞，并可用于表达嵌合结合剂或其他目的。

本发明的另一个方面涉及一种包含本发明的嵌合结合剂和载体的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物，并且载体是药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，药物组合物可进一步包含额外治疗剂，例如化疗剂。用于治疗癌症的药物包括但不限于：1)长春花生物碱(如长春碱、长春新碱)；2)表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)；3)抗生素(如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C))；4)酶(如L-天冬酰胺酶)；5)生物反应调节剂(如干扰素-α)；6)铂配位错合物(如顺铂和卡铂)；7)蒽二酮(如米托蒽醌)；8)取代脲(如羟基脲)；9)甲肼衍生物(如丙卡巴肼(N-甲肼；MIH))；10)肾上腺皮质激素抑制剂(如米托坦(o,p′-DDD)和氨鲁米特)；11)肾上腺皮质激素(如强的松)；12)孕酮(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)；13)雌激素(如己烯雌酚和炔雌醇)；14)抗雌激素(如他莫昔芬)；15)雄激素(如丙酸睾酮和氟甲睾酮)；16)抗雄激素(如氟他胺)：和17)促性腺激素释放激素类似物(如亮丙瑞林)。在另一实施方案中，本发明的药物与抗血管生成剂结合施用，如针对VEGF的抗体(如贝伐单抗(AVASTIN)、雷珠单抗(LUCENTIS)及其他血管生成促进剂(如bFGF、血管生成素-1)、针对α-v/β-3血管整合素的抗体(如VITAXIN)、血管抑素、内皮抑素、达肝素、ABT-510、CNGRC肽TNFα缀合物、环磷酰胺、康普瑞汀A4磷酸盐、二甲基呫吨酮乙酸、多西他赛、来那度胺、恩扎妥林、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂(Abraxane)、大豆异黄酮(Genistein)、枸橼酸他莫昔芬、沙利度胺、ADH-1(EXHERIN)、AG-013736、AMG-706、AZD2171、甲苯磺酸索拉非尼、BMS-582664、CHIR-265、帕唑帕尼、PI-88、瓦他拉尼、依维莫司、苏拉明、苹果酸舒尼替尼、XL184、ZD6474、ATN-161、西仑吉肽(cilenigtide)和塞来昔布，或其任何组合。在其他实施方案中，本发明的药剂与一种或多种治疗性抗体，例如抗癌抗体或针对免疫检查点的抗体一起施用。在其他实施方案中，本发明的药剂与一种或多种免疫检查点抑制剂结合施用。免疫检查点抑制剂可以是抑制免疫检查点的任何分子。免疫检查点在本领域是众所周知的，并且包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、A2AR、TIM-3和VISTA。在一些实施方案中，抑制剂是针对免疫检查点蛋白的抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1或PD-L1的抑制剂，例如特异性结合PD-1或PD-L1的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、德瓦鲁单抗或阿特珠单抗。在一些实施方案中，嵌合结合剂可以直接或间接地与额外治疗剂连接以形成抗体药物缀合物。

本发明的另一个方面涉及一种试剂盒，其包括本发明的嵌合结合剂或用于生产本发明的嵌合结合剂的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包括多种嵌合结合剂和/或包含这些药剂的组合物。在一些实施方案中，在此种试剂盒中提供的多种嵌合结合剂中的每一种都可以特异性地结合到不同的抗原和/或接合不同的髓源性细胞。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括额外的活性剂，例如，本领域技术人员已知的化疗剂。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括额外的试剂、缓冲液、容器等。

使用嵌合结合剂的方法

本发明的一个方面涉及一种将髓源性细胞(例如巨噬细胞)靶向表达由本发明的嵌合结合剂识别的抗原(例如整合素αvβ3)的癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞和所述髓源性细胞与有效量的本发明的嵌合结合剂接触。

本发明的另一方面涉及一种将在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞靶向表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞和所述髓源性细胞与有效量的本发明的嵌合结合剂接触。

本发明的另一个方面涉及一种在需要的受试者中治疗表达由本发明的嵌合结合剂识别的抗原(例如整合素αvβ3)的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的嵌合结合剂或药物组合物，从而治疗所述癌症。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的嵌合结合剂或药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

a)选择受试者，所述受试者具有富含由本发明的嵌合结合剂特异性结合的抗原(例如整合素αvβ3)并且富含髓源性细胞的癌细胞；和

b)向所述受试者施用治疗有效量的本发明的嵌合结合剂或药物组合物，从而治疗所述癌症。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括以下步骤：

c)选择受试者，所述受试者具有富含由本发明的嵌合结合剂特异性结合的抗原并且富含在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞的上皮癌细胞；和

d)向所述受试者施用治疗有效量的本发明的嵌合结合剂或药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。

如本文所用，术语“富含”是指癌细胞上的抗原水平或肿瘤中髓源性细胞的水平大于在较早时间点(例如，在EMT开始之前)在癌细胞或肿瘤中发现的水平或大于在普通人群中类似阶段的类似癌细胞或肿瘤中发现的平均水平。

选择步骤可以通过任何已知的测量抗原和细胞的方法进行。在一些实施方案中，步骤a)包括从受试者获得癌症样品，并测量样品中抗原和髓源性细胞的水平。抗原的水平可以通过例如免疫测定、蛋白质分析、RNA分析或免疫组织化学来测量。髓源性细胞的水平可以通过例如免疫测定、蛋白质分析、RNA分析或流式细胞术来测量。

本发明的另一方面涉及肿瘤的抗原-效应细胞匹配，使得抗原特异性地存在于肿瘤细胞上(例如，肿瘤细胞抗原)，并且治疗性抗体含有对肿瘤中发现的那些效应细胞(例如，中性粒细胞、树突细胞、NK细胞等)具有特异性的效应细胞结合区。

作为本发明方法的一个实施方案，发明人已经确定αvβ3整合素出现在获得耐药性的癌细胞的表面。这有助于鉴定那些最有可能用针对αvβ3整合素的治疗性单克隆抗体方法有效治疗的患者。这为正确的患者群体提供了一种精确的医学方法，允许包括靶向αvβ3整合素的其他治疗性单克隆抗体。随着癌症患者对标准护理疗法产生耐药性，他们的肿瘤获得αvβ3表达，从而成为用于αvβ3靶向抗体治疗的候选药物，所述αvβ3靶向抗体能够促进表达αvβ3的肿瘤细胞的免疫细胞介导的ADCC。

在本发明的方法中，髓源性细胞是巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞，例如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。在一些实施方案中，髓源性细胞是巨噬细胞。

上皮癌可能是任何已知类型的癌。上皮癌的实例包括但不限于胃肠道癌、乳腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结肠癌、前列腺癌或膀胱癌。在一些实施方案中，上皮癌细胞是晚期上皮癌细胞。在一些实施方案中，上皮癌细胞至少部分转化为间充质细胞，例如表达一种或多种间充质抗原。在某些实施方案中，上皮癌细胞是化疗耐药性或难治性的，这可能是由于上皮向间充质的转化。

在一些实施方案中，所述方法还可以包括从受试者分离髓源性细胞、使髓源性细胞与嵌合结合剂或药物组合物接触并将接触后的髓源性细胞施用于受试者的步骤。

在一些实施方案中，可以向受试者递送一种以上的嵌合结合剂。例如，如果癌症样品显示一种以上可靶向抗原的表达或一种以上类型的髓源性细胞在癌症中富集，则可以施用靶向每种抗原和/或髓源性细胞的药剂。在一些实施方案中，嵌合结合剂可以是多特异性的(例如，双特异性或三特异性)，以便接合多个可靶向抗原和/或一种以上类型的髓源性细胞。

本发明的方法还可以包括向受试者施用额外的癌症治疗剂或治疗(例如，手术、放疗)。癌症治疗剂包括但不限于1)长春花生物碱(如长春碱、长春新碱)；2)表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)；3)抗生素(如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C))；4)酶(如L-天冬酰胺酶)；5)生物反应调节剂(如干扰素-α)；6)铂配位错合物(如顺铂和卡铂)；7)蒽二酮(如米托蒽醌)；8)取代脲(如羟基脲)；9)甲肼衍生物(如丙卡巴肼(N-甲肼；MIH))；10)肾上腺皮质激素抑制剂(如米托坦(o,p′-DDD)和氨鲁米特)；11)肾上腺皮质激素(如强的松)；12)孕酮(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)；13)雌激素(如己烯雌酚和炔雌醇)；14)抗雌激素(如他莫昔芬)；15)雄激素(如丙酸睾酮和氟甲睾酮)；16)抗雄激素(如氟他胺)：和17)促性腺激素释放激素类似物(如亮丙瑞林)。其他癌症治疗剂包括但不限于抗血管生成剂，如针对VEGF的抗体(如贝伐单抗(AVASTIN)、雷珠单抗(LUCENTIS)及其他血管生成促进剂(如bFGF、血管生成素-1)、血管抑素、内皮抑素、达肝素、ABT-510、CNGRC肽TNFα缀合物、环磷酰胺、康普瑞汀A4磷酸盐、二甲基呫吨酮乙酸、多西他赛、来那度胺、恩扎妥林、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂(Abraxane)、大豆异黄酮(Genistein)、枸橼酸他莫昔芬、沙利度胺、ADH-1(EXHERIN)、AG-013736、AMG-706、AZD2171、甲苯磺酸索拉非尼、BMS-582664、CHIR-265、帕唑帕尼、PI-88、瓦他拉尼、依维莫司、苏拉明、苹果酸舒尼替尼、XL184、ZD6474、ATN-161、西仑吉肽(cilenigtide)和塞来昔布。

在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用CD47阻断剂以增强癌细胞的吞噬作用。这些药剂包括CD47阻断单克隆抗体(Hu5F9-G4、CC-90002、Ti-061或SRF231)或SIRPα-Fc融合蛋白(TTI-621、TTI-622、ALX148)。然而，本发明的优点之一是，无论癌细胞是否表达CD47，所述方法针对癌症都是有效的。因此，在一些实施方案中，本发明的方法用于治疗表达CD47的癌症。在一些实施方案中，本发明的方法用于治疗表达CD47的癌症。在一些实施方案中，本发明的方法不包括给受试者施用CD47阻断剂。

在一些实施方案中，所述方法还包括给受试者施用免疫检查点抑制剂。免疫检查点在本领域是众所周知的，并且包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、A2AR、TIM-3和VISTA。在一些实施方案中，抑制剂是针对免疫检查点蛋白的抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在间充质肿瘤中富集的PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂，例如特异性结合PD-1、PD-L1或CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、德瓦鲁单抗或阿特珠单抗。

在一些实施方案中，所述方法还包括给受试者施用EGFR抑制剂。这类药物包括酪氨酸激酶抑制剂(如厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、奥希替尼、奈拉替尼)和单克隆抗体(如西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗、帕尼单抗)。

在某些实施方案中，本发明方法中使用的嵌合结合剂直接施用给受试者。在一些实施方案中，嵌合结合剂将悬浮在药学上可接受的载体(例如，生理盐水)中并口服或通过静脉输注给药，或皮下、肌肉内、鞘内、腹腔内、直肠内、阴道内、鼻腔内、胃内、气管内或腹腔内给药。在另一实施方案中，可以使用标准雾化器、喷射雾化器、金属丝网雾化器、干粉吸入器或计量剂量吸入器来完成气管内或肺内递送。药剂可以直接递送到疾病或病症的部位，如肺、肾或肠，例如原位注射到肿瘤中或肿瘤附近。所需剂量取决于给药途径的选择；制剂的性质；患者疾病的性质；受试者的大小、体重、表面积、年龄和性别；正在给药的其他药物；以及主治医师的判断。每种药剂的适宜剂量在0.01-100μg/kg的范围内。鉴于可用药剂的多样性和不同给药途径的不同效率，预计所需剂量会有很大的变化。例如，口服给药预计需要比通过静脉注射的给药更高的剂量。这些剂量水平的变化可以使用标准的经验程序来调整以进行优化，如本领域所熟知的。给药可以是单次或多次(例如，2、3、4、6、8、10、20、50、100、150或更多次)。将化合物封装在合适的递送载体(例如，聚合物微粒或纳米颗粒或可植入装置)中可提高递送效率，特别是对于口服递送来说。

“药学上可接受的”是指在生物学上或其他方面不是不希望的材料，即，该材料可以被施用给受试者而不会引起任何不希望的生物学效应，如毒性。

本发明的制剂可任选地包括药剂、药物、载体、佐剂、分散剂、稀释剂等。

本发明的嵌合结合剂可以根据已知的技术配制以用于在药物载体中给药。参见例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy(第21版2006)。在根据本发明的药物制剂的制造中，药剂典型地尤其与可接受的载体混合。载体可以是固体或液体或两者，并且可以和药剂一起配制成单位剂量制剂，例如胶囊或小瓶，其可含有0.01重量％或0.5重量％至95重量％或99重量％的药剂。一种或多种药剂可以纳入本发明的制剂中，其可以通过任何众所周知的药学技术制备。

本发明的制剂包括适用于口服、直肠、局部、颊部(例如舌下)、阴道、胃肠外(例如皮下、肌肉内(包括骨骼肌、心肌、膈肌和平滑肌)、皮内、静脉内、腹腔内)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气道表面)、鼻内、经皮、关节内、鞘内和吸入给药、通过肝门内递送给药到肝脏，以及直接器官注射(例如进入肝脏、进入大脑以递送到中枢神经系统、或进入胰腺)或注射到体腔中的制剂。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗的病症的性质和严重程度，以及正在使用的特定药剂的性质。

对于注射，载体通常是液体，例如无菌无热原水、无热原磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水或Cremophor EL[R](BASF,Parsippany,N.J.)。对于其他给药方法，载体可以是固体或液体。

对于口服给药，药剂可以以固体剂型给药，如胶囊、片剂和粉剂，或以液体剂型给药，如酏剂、糖浆和悬浮液。药剂可以与非活性成分和粉末状载体一起封装在明胶胶囊中，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等。可添加以提供期望的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其他已知的期望特征的额外非活性成分的实例为红氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、可食用白色油墨等。类似的稀释剂可以用来制造压缩片剂。片剂和胶囊都可以作为缓释产品制造，以提供药物在数小时周期内的连续释放。压缩片剂可以包被糖衣或薄膜以掩盖任何不愉快的味道并保护片剂免受大气的影响，或包被肠溶包衣以选择性地在胃肠道内崩解。口服给药的液体剂型可以含有着色剂和调味剂，以增加患者的接受度。

适合于颊部(舌下)给药的制剂包括将药剂包含在调味基质中的含片，所述调味基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；以及将药剂包含在惰性基质中的糖锭，所述惰性基质是例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶。

适合于胃肠外给药的本发明制剂包含药剂的无菌含水和非含水注射溶液，所述制剂优选与预期接受者的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。含水和非含水无菌悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以在例如密封安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量容器中提供，并且可以在仅需要在即将使用前才添加无菌液体载体(例如盐水或注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。

临时注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，在本发明的一个方面，提供了一种在密封容器中的采取单位剂型的包含本发明的药剂的可注射的、稳定的、无菌的组合物。药剂以冻干物的形式提供，所述冻干物能够用合适的药学上可接受的载体重组，以形成适于将其注射到受试者体内的液体组合物。单位剂型通常包括约1毫克至约10克的药剂。当药剂基本上不溶于水时，可以使用足够量的药学上可接受的乳化剂，以在水性载体中乳化所述药剂。其中一种有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。

适合直肠给药的制剂优选以单位剂量栓剂的形式呈现。它们可以通过将药剂与一种或多种常规固体载体例如可可脂混合，然后成型得到的混合物来制备。

适合局部应用于皮肤的制剂优选采取软膏、乳膏、乳液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油的形式。可使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、经皮促进剂以及它们的两种或更多种的组合。

适合经皮给药的制剂可以以离散贴片的形式呈现，适合与接受者的表皮保持长时间的亲密接触。适合经皮给药的制剂也可以通过离子电渗疗法递送(例如参见Tyle,Pharm.Res.3:318(1986))，并且通常采取化合物的任选缓冲的水溶液的形式。合适的制剂包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水，并含有0.1至0.2M的化合物。

药剂也可以配制成鼻腔给药，或以任何合适的方式向受试者的肺部给药，例如，通过包含所述药剂的可吸入颗粒的气溶胶悬浮液给药，受试者吸入所述气溶胶悬浮液。可吸入颗粒可以是液体或固体。术语“气溶胶”包括任何能够被吸入细支气管或鼻道的气载悬浮相。具体地说，气溶胶包括液滴的气载悬浮液，其可以在计量剂量吸入器或雾化器中产生，也可以在雾化喷雾器中产生。气溶胶还包括悬浮在空气或其他载气中的干粉组合物，其可以通过例如从吸入器装置吹气来递送。参见Ganderton&Jones,Drug Delivery to theRespiratory Tract,Ellis Horwood(1987)；Gonda(1990)Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313；和Raeburn等人,J.Pharmacol.Toxicol.Meth.27:143(1992)。包含药剂的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方法产生，例如使用本领域技术人员已知的压力驱动气溶胶雾化器或超声波雾化器。参见例如美国专利号4,501,729。包含药剂的固体颗粒的气溶胶同样可以用任何固体颗粒药物气溶胶发生器通过制药领域中已知的技术产生。

或者，化合物可以局部给药而不是全身给药，例如，在贮存物或缓释制剂中给药。

此外，本发明提供本文公开的药剂及其盐的脂质体制剂。形成脂质体悬浮液的技术在本领域是众所周知的。当化合物或其盐是水溶性盐时，使用常规脂质体技术，可以将其掺入脂质囊泡中。在这种情况下，由于药剂的水溶性，药剂将基本上夹带在脂质体的亲水中心或核心内。所使用的脂质层可以具有任何常规组成，并且可以含有胆固醇或者可以不含胆固醇。当目的化合物或盐不溶于水时，同样使用常规脂质体形成技术，盐可以基本上夹带在形成脂质体结构的疏水脂质双层内。在任何一种情况下，所产生的脂质体都可以通过使用标准的超声和均质技术来减小尺寸。

含有药剂的脂质体制剂可以被冻干以产生冻干物，所述冻干物可以用药学上可接受的载体如水重组以再生脂质体悬浮液。

如果是水不溶性药剂，可以制备例如在水基乳液中含有水不溶性药剂的药物组合物。在这种情况下，所述组合物将含有足够量的药学上可接受的乳化剂，以乳化期望量的所述药剂。特别有用的乳化剂包括磷脂酰胆碱和卵磷脂。

在特定的实施方案中，所述化合物以治疗有效量(如上文所定义的术语)施用于受试者。药物活性剂的剂量可以通过本领域已知的方法确定，例如参见Remington′sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.,Easton,Pa)。任何特定药剂的治疗有效剂量会因药剂而异，因患者而异，并取决于患者的病情和递送途径。作为一般建议，从约0.1到约50mg/kg的剂量将具有治疗功效，所有的重量都是根据药剂的重量计算的。较高水平的毒性问题可能会将静脉内剂量限制在较低水平，例如最多约10mg/kg，所有重量都是根据药剂的重量计算的。约10mg/kg至约50mg/kg的剂量可以用于口服给药。通常，约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量可以用于肌肉内注射。特定剂量为约1μmol/kg至50μmol/kg，更具体地说，对于静脉内或口服给药，分别为至约22μmol/kg和至33μmol/kg的药剂。

在本发明的特定实施方案中，可以在各种时间间隔(例如，每小时、每天、每周、每月等)上使用一次以上的给药(例如，两次、三次、四次或更多次的给药)以实现治疗效果。

本发明可用于兽医和医学应用。合适的受试者包括鸟类和哺乳动物，哺乳动物是优选的。本文使用的术语“哺乳动物”包括但不限于人类、灵长类、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬、兔等。人类受试者包括新生儿、婴儿、少年和成人。受试者可以是需要本发明方法的人，例如患有或怀疑患有癌症的受试者。受试者可以是实验动物，例如疾病的动物模型。

本发明的非限制性实施方案包括以下内容。

实施方案1.一种嵌合结合剂，其包含与表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞上的抗原特异性结合的第一结构域和通过接合间充质肿瘤中积累的髓源性细胞来介导抗体导向的细胞毒性(ADCC)的第二结构域。

实施方案2.实施方案1的嵌合结合剂，其中所述髓源性细胞是巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞，例如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。

实施方案3.实施方案1或2的嵌合结合剂，其中所述上皮癌细胞是晚期上皮癌细胞。

实施方案4实施方案3的嵌合结合剂，其中所述上皮癌细胞已至少部分转化为间充质细胞。

实施方案5.实施方案1至4中任一项的嵌合结合剂，其中所述上皮癌细胞是化疗耐药性或难治性的。

实施方案6.实施方案1至5中任一项的嵌合结合剂，其中所述第一结构域是抗体结构域。

实施方案7.实施方案1至6中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域是抗体结构域。

实施方案8.实施方案1至7中任一项的嵌合结合剂，其中所述第一结构域是人源化或人类抗体结构域。

实施方案9.实施方案1至8中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域是人源化或人类抗体结构域。

实施方案10.实施方案1至9中任一项的嵌合结合剂，其为嵌合抗体或其抗原结合片段。

实施方案11.实施方案1至10中任一项的嵌合结合剂，其中所述第一结构域特异性结合整合素。

实施方案12.实施方案11的嵌合结合剂，其中所述整合素是整合素αv。

实施方案13.实施方案11的嵌合结合剂，其中所述整合素是整合素β3。

实施方案14.实施方案11的嵌合结合剂，其中所述整合素是整合素αvβ3。

实施方案15.实施方案1至14中任一项的嵌合结合剂，其中所述第一结构域特异性结合癌细胞表面上的抗原，包括上皮样肿瘤细胞的表面上的受体(例如EGFR、HER2、EpCAM、E-钙粘蛋白、ZO-1、整合素α6β4)或间充质样肿瘤细胞的表面上的受体(例如整合素αvβ3、整合素β1、整合素αvβ6、N-钙粘蛋白、OB-钙粘蛋白、syndecan-1)。

实施方案16.实施方案1至14中任一项的嵌合结合剂，其中所述第一结构域特异性结合先前未被免疫系统识别的新抗原。

实施方案17.实施方案1至16中任一项的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含抗体的Fab结构域。

实施方案18.实施方案17的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含IgG抗体的Fab结构域。

实施方案19.实施方案18的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含IgG4抗体的Fab结构域。

实施方案20.实施方案19的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含hLM609-hIgG4-S228P的轻链(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列以及hLM609-hIgG4-S228P的重链的Fab部分(SEQ ID NO:3)或与其至少90％相同的序列。

实施方案21.实施方案19的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含LM609_7的重链的Fab部分(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列以及LM609_7的轻链(SEQ ID NO:6)或与其至少90％相同的序列、JC7U的重链的Fab部分(SEQ ID NO:7)或与其至少90％相同的序列以及JC7U的轻链(SEQ ID NO:8)或与其至少90％相同的序列。

实施方案22.实施方案1至19中任一项的嵌合结合剂，其中所述第一结构域进一步特异性结合第二抗原。

实施方案23.实施方案22的嵌合结合剂，其中所述第一结构域是双特异性抗体结构域。

实施方案24.实施方案22或23的嵌合结合剂，其中所述第二抗原是免疫检查点分子，例如PD-1、PD-L1或CTLA-4。

实施方案25.实施方案22或23的嵌合结合剂，其中所述第二抗原是癌症干细胞标志物，例如CD133、CD44、CD90、CD117、CD166或CD105，或效应细胞抗原。

实施方案26.实施方案22或23的嵌合结合剂，其中所述第二抗原是效应细胞抗原。

实施方案27.实施方案1至26中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域接合巨噬细胞。

实施方案28.实施方案1至27中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域不显著接合自然杀伤细胞。

实施方案29.实施方案1至28中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域不显著接合淋巴细胞。

实施方案30.实施方案1至29中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域特异性地结合髓源性细胞的表面上的蛋白质。

实施方案31.实施方案30的嵌合结合剂，其中所述第二结构域特异性结合Fc-γ受体。

实施方案32.实施方案30的嵌合结合剂，其中所述第二结构域特异性结合Fc-γ受体I(FcγRI，CD64)。

实施方案33.实施方案1至32中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含抗体的Fc结构域。

实施方案34.实施方案33的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含IgG抗体的Fc结构域。

实施方案35.实施方案34的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含IgG4抗体的Fc结构域。

实施方案36.实施方案33的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含IgA或IgE抗体的Fc结构域。

实施方案37.实施方案33至36中任一项的嵌合结合剂，其中所述第二结构域还包含抗体的铰链结构域。

实施方案38.实施方案37的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含hLM609-hIgG4-S228P的重链Fc结构域和铰链结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)或与其至少90％相同的序列。

实施方案39.实施方案1至38中任一项的嵌合结合剂，其中所述氨基酸序列在铰链区包含S228P突变(Eu编号系统)。

实施方案40.实施方案39的嵌合结合剂，其包含hLM609-hIgG4-S228P重链氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:2)或与其至少90％相同的序列。

实施方案41.实施方案39或40的嵌合结合剂，其中所述氨基酸序列包含选自以下的突变：

a)S239D/A330L/I332E；

b)I332E；

c)G236A/S239D/I332E；

d)G236A；

e)N297A/E382V/M428I；

f)M252Y/S254T/T256E；

g)Q295R/L328W/A330V/P331A/I332Y/E382V/M428I；

h)L234A/L235A/P329G；

i)M428L/N434S；

j)L234A/L235A/P331S；

k)L234A/L235A/P329G/M252Y/S254T/T256E；

l)S298A/E333A/K334/A；

m)S239D/I332E；

n)G236A/S239D/A330L/I332E；

o)S239D/I332E/G236A；

p)L234Y/G236W/S298A；

q)F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；

r)K326W/E333S；

s)K326A/E333A；

t)K326M/E333S；

u)C221D/D222C；

v)S267E/H268F/S324W；

w)H268F/S324W；

x)E345R

y)R435H；

z)N434A；

aa)M252Y/S254T/T256E；

ab)M428L/N434S；

ac)T252L/T/253S/T254F；

ad)E294delta/T307P/N434Y；

ae)T256N/A378V/S383N/N434Y；

af)E294delta

ag)L235E；

ah)L234A/L235A；

ai)S228P/L235E；

aj)P331S/L234E/L225F；

ak)D265A；

al)G237A；

am)E318A；

an)E233P；

ao)G236R/L328R；

ap)H268Q/V309L/A330S/P331S；

aq)L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S；

ar)A330L；

as)D270A；

at)K322A；

au)P329A；

av)P331A；

aw V264A；

ax)F241A；

ay)N297A或G或N

az)S228P/F234A/L235A；或

ba)a)至az)的任何组合。

实施方案42.一种编码实施方案1至40中任一项的嵌合结合剂的多核苷酸。

实施方案43.一种载体，其包含实施方案42的多核苷酸。

实施方案44.一种宿主细胞，其包含实施方案42的多核苷酸或实施方案43的载体。

实施方案45.一种组合物，其包含实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂和载体。

实施方案46.一种药物组合物，其包含实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂和药学上可接受的载体。

实施方案47.实施方案46的药物组合物，其还包含额外的治疗剂。

实施方案48.实施方案47的药物组合物，其中所述额外的治疗剂是化疗剂。

实施方案49.一种试剂盒，其包含实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂。

实施方案50.一种将在肿瘤中积累的髓源性细胞靶向表达至少一种细胞标志物的癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞和所述髓源性细胞与有效量的实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂接触。

实施方案51.实施方案50的方法，其中所述癌细胞由于细胞应激而表达所述至少一种细胞标志物。

实施方案52.实施方案50的方法，其中所述癌细胞由于经历上皮向间充质转化而表达所述至少一种细胞标志物。

实施方案53.一种将在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞靶向表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞和所述髓源性细胞与有效量的实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂接触。

实施方案54.实施方案53的方法，其中所述髓源性细胞是巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞，例如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。

实施方案55.一种在有需要的受试者中治疗表达至少一种细胞标志物的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂或实施方案46至48中任一项的药物组合物，从而治疗所述癌症。

实施方案56.一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂或实施方案46至48中任一项的药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。

实施方案57.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

a)选择受试者，所述受试者具有富含由实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂特异性结合的抗原并且富含在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞的癌细胞；和

b)向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂或实施方案46至48中任一项的药物组合物，从而治疗所述癌症。

实施方案58.一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括以下步骤：

a)选择受试者，所述受试者具有富含由实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂特异性结合的抗原并且富含在间充质肿瘤中积累的髓源性细胞的上皮癌细胞；和

b)向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1至41中任一项的嵌合结合剂或实施方案46至48中任一项的药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。

实施方案59.实施方案58的方法，其中步骤a)包括从所述受试者获得所述癌症的样品，并测量所述样品中抗原和髓源性细胞的水平。

实施方案60.实施方案55至59中任一项的方法，其中所述髓源性细胞是巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞，例如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。

实施方案61.实施方案60的方法，其中所述上皮细胞癌是晚期上皮细胞癌。

实施方案62.实施方案61的方法，其中所述癌症中的所述上皮细胞中的一者或多者已至少部分地转化为间充质细胞。

实施方案63.实施方案58至62中任一项的方法，其中所述上皮细胞癌是或已经成为化疗耐药性或难治性的。

实施方案64.实施方案55至63中任一项的方法，其中所述癌症是癌，例如胃肠道癌、乳腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结肠癌、前列腺癌或膀胱癌。

实施方案65.实施方案55至64中任一项的方法，其还包括向所述受试者施用CD47阻断剂和/或免疫检查点抑制剂和/或EGFR抑制剂。

实施方案66.实施方案55至64中任一项的方法，其中所述方法不包括向所述受试者施用CD47阻断剂。

实施方案67.实施方案58至66中任一项的方法，其中所述上皮细胞癌表达CD47。

实施方案68.实施方案58至66中任一项的方法，其中所述上皮细胞癌不表达CD47。

实施方案69.实施方案55至68中任一项的方法，其还包括向所述受试者施用额外的癌症治疗剂或治疗。

实施方案70.实施方案55至69中任一项的方法，其中所述嵌合结合剂或药物组合物通过静脉内、皮下或肌内施用于所述受试者，或原位注射到所述癌症中或所述癌症附近。

实施方案71.实施方案55至70中任一项的方法，其还包括从所述受试者分离髓源性细胞、使所述髓源性细胞与所述嵌合结合剂或药物组合物接触并将接触后的髓源性细胞施用于所述受试者的步骤。

实施方案72.实施方案55至71中任一项的方法，其中所述受试者是人。

在以下实施例中更具体地描述了本发明，这些实施例仅作为说明，因为其中的许多修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。

实施例

实施例1

整合素β3的表达与多种癌症中的巨噬细胞标志物呈正相关

在癌症的发展过程中，随着影响肿瘤恶性行为的各种基质细胞和免疫细胞的出现，肿瘤的微环境发生了巨大的变化(Coussens,2002；Ruffell,2015)。因此，当用治疗性抗体靶向肿瘤时，考虑哪些免疫细胞是可用的是很重要的。虽然整合素αvβ3在肿瘤细胞中的富集是侵袭性、耐药的肿瘤表型的驱动因素(Desgrosellier,2009；Seguin,2014a)，但αvβ3阳性的肿瘤细胞对肿瘤免疫微环境的影响尚未明确。正如Wettersten等人,CancerRes.79:5048(2019)的图1A所报道的，我们查询了多个TCGA数据集，以确定表达β3的肿瘤是否可能富含某些可能有助于抗体介导的杀伤的免疫效应细胞类型。该分析表明，在某些类型的实体瘤中，ITGB3的mRNA表达与巨噬细胞(MΦ)、树突状细胞(DC)和中性粒细胞(NΦ)的标志物集呈正相关(rho≥0.3)，而与NK细胞(NK)无关。例如，ITGB3 mRNA的表达与肾癌、乳腺癌、GBM癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌和结肠直肠癌的巨噬细胞标志物呈正相关，而对肾乳头状癌、肉瘤、甲状腺癌、黑色素瘤和卵巢癌没有观察到相关性。此外，ITGB3与其他免疫细胞类型如肥大细胞、T细胞和B细胞呈正相关，但这种关系仅在少数肿瘤类型中被观察到。有趣的是，在甲状腺瘤、黑色素瘤、肾乳头状瘤和肉瘤中，ITGB3与免疫细胞标志物之间没有相关性，尽管这些癌症在TCGA泛癌数据集中具有最高的ITGB3中值表达。

正如Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图1B所报道的，使用NanoString nCounter平台分析的10个冷冻肺腺癌活检的独立肿瘤样品集验证了整合素β3与免疫细胞类型标志物的正相关性。即使对于这种适度的样品量，与ITGB3表达低于中位的肿瘤相比，ITGB3表达高于中位的肿瘤也富含表征巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞(但不是NK细胞)的标志物。与TCGA数据集的分析一致，ITGB3与这些标志物集之间存在较强的正相关。总之，这些数据表明β3阳性上皮癌可能富含可以作为抗体介导治疗的效应细胞的多种细胞类型。

正如Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图1C所报道的，为了进一步验证在各种遗传和组织学上不同的实体瘤类型中，巨噬细胞富集与肿瘤细胞上的β3表达在蛋白质水平上的正相关性，我们对一系列市售肿瘤微阵列载玻片进行了免疫组织化学染色。该分析表明，在肺、前列腺、结直肠、肾脏和胶质母细胞瘤肿瘤中，肿瘤细胞上整合素β3蛋白的表达与巨噬细胞标志物CD68和CD163的存在呈正相关。高放大倍率图像证实，肿瘤细胞上具有整合素β3染色的单独区域富含对巨噬细胞标志物呈染色阳性的细胞。值得注意的是，在检查的阵列载玻片中，β3的肿瘤细胞表达呈阳性的肿瘤百分比范围为29-54％，表明在这种不同的肿瘤类型、等级和分期的群体中，有很大一部分β3+肿瘤。总之，这些发现表明，肿瘤细胞高度表达整合素β3的肿瘤特别富含TAM，TAM是肿瘤微环境的一个组成部分，有助于肿瘤的发展(Pathria,2019)，并且这些细胞可能证明在用某些治疗性抗体靶向肿瘤时是重要的。

实施例2

在肿瘤于体内获得对EGFR抑制剂厄洛替尼的耐药性后，肿瘤细胞富含整合素β3的表达

在包括EGFR抑制剂厄洛替尼在内的癌症治疗后，观察到TAM的富集(Chung,2012)，并且我们之前报道过，在小鼠肺癌中和人类的BATTLE试验中获得厄洛替尼耐药性期间，整合素αvβ3被上调(Seguin,2014b)。因此，在Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图2B中，我们发现，在体内获得对厄洛替尼的耐药性的αvβ3阴性HCC827人EGFR突变型肺肿瘤不仅在产生耐药性时获得αvβ3，而且也变得富含TAM。

实施例3

抗αvβ3单克隆抗体触发巨噬细胞介导的肿瘤细胞杀伤

考虑到TAM和表达整合素αvβ3的肿瘤细胞的共同富集，我们推断，利用这种关系可以为治疗αvβ3+癌症的治疗策略提供一个基础。我们进一步推断，治疗性地靶向整合素αvβ3可能为治疗获得αvβ3表达以作为逃避EGFR抑制剂厄洛替尼影响的一种手段的肿瘤提供新的机会。为了验证这一假设，我们使用了我们之前开发的功能阻断单克隆抗体LM609，它能识别人类细胞上但不能识别小鼠细胞的整合素αvβ3(Cheresh,1987)，并作为完全人源化版本Vitaxin/埃达组单抗(etaracizumab)的母体抗体(Delbaldo,2008；Gutheil,2000)。

测试了LM609阻断肿瘤生长的能力，这些肿瘤通过增加整合素αvβ3的表达而获得了厄洛替尼耐药性。首先，测试了LM609延迟厄洛替尼耐药性发生的能力。简而言之，将HCC827(在100μl PBS中的5×10⁶个肿瘤细胞)αvβ3阴性的人类EGFR突变肺癌细胞皮下注射到雌性nu/nu小鼠(Charles River，088，8-10周大)的右腹。每周两次用卡尺测量肿瘤。肿瘤体积为250-700mm³的动物被随机分配到用Captisol(口服，六次/周)、PBS(腹腔注射，两次/周)、LM609(腹腔注射，10mg/kg，两次/周)或厄洛替尼(口服，6.25mg/kg，六次/周)的组合治疗的组。媒介物治疗的小鼠由于肿瘤尺寸很大而在第15天被处死，而厄洛替尼组在第50天被处死。将肿瘤置于液氮、OCT化合物或10％福尔马林中。正如Wettersten等人,CancerRes.79:5048(2019)的图2C所报道的，由于缺乏αvβ3抗原，在出现耐药性之前，单独的LM609对HCC827异种移植肿瘤的生长没有影响。虽然单用厄洛替尼治疗的小鼠显示出最初的肿瘤尺寸减小，但随之而来的是最终肿瘤的重新生长和αvβ3的表达增加。相反，厄洛替尼加LM609的组合延长了药物敏感性，并阻止了肿瘤细胞上整合素β3的出现。

接下来，测试了LM609使耐药肿瘤对厄洛替尼的作用重新敏感的能力。为了在体外产生厄洛替尼耐药肿瘤，将HCC827或PC9人肺癌细胞(在100μl PBS中的5×10⁶个肿瘤细胞)皮下注射到雌性nu/nu小鼠(Charles River，088，8-10周大)的右腹，并且每周两次用卡尺测量肿瘤。肿瘤体积为100-200mm³的动物被随机分配到用Captisol(口服，六次/周)或厄洛替尼(口服，6.25mg/kg，六次/周)的组合治疗的组。对于Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图S3所示的每一个单独的肿瘤，分离出用载体治疗的厄洛替尼敏感性(HCC827-P和PC9-P)和厄洛替尼耐药性(HCC827-R18和PC9-R4L)细胞。流式细胞术证实了厄洛替尼耐药肿瘤细胞的细胞表面上的αvβ3表达增加。当HCC827-R18和PC9-R4L厄洛替尼耐药细胞系被皮下注射到受体小鼠体内时，使用LM609的全身治疗(腹腔注射，10mg/kg，两次/周)能够使耐药肿瘤对厄洛替尼的生长抑制作用重新敏感(图1)。

最后，我们考虑LM609的抗肿瘤活性是否与TAM和表达整合素αvβ3的肿瘤细胞的共同富集有关。正如Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图2A所报道的，我们发现在裸鼠体内生长的表达αvβ3的人肺和胰腺异种移植肿瘤对LM609高度敏感，并且这种作用可以通过使用氯膦酸盐脂质体的巨噬细胞耗竭而被完全阻断，证明TAM在这种肿瘤靶向抗体的抗肿瘤功效中发挥关键作用。通过对肿瘤切片进行小鼠巨噬细胞标志物F4/80的染色，证实了氯膦酸盐治疗成功地耗尽了巨噬细胞。因此，LM609的抗肿瘤活性需要巨噬细胞。

实施例4

LM609诱导巨噬细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)

为了证实LM609的作用机制是依赖于巨噬细胞的，我们用从小鼠肿瘤或骨髓或人类血液中分离出的巨噬细胞测试LM609是否能在体外杀伤肿瘤细胞。

按照所述，从肿瘤组织中分离出TAM(Kaneda,2016)。肿瘤在含有胶原酶IV(Sigma，C5138)、透明质酸酶(Sigma，H2654)、分散酶II(Roche，04942078001)和DNase IV(Millipore，D5025)的HBSS中37℃下解离15分钟。细胞悬浮液通过70μm细胞过滤网过滤，并用PBS清洗。将单细胞悬浮液(10⁶个细胞/100μL，在5％ BSA的PBS中)与Mouse BD FcBlock^TM(BD Biosciences，553142，1:50)在4℃下孵育10分钟，并将荧光标记的抗体CD11b(eBioscience，17-0112-81，1:100)和Ly-6G(eBioscience，25-5931-81，1:100)在4℃下孵育1小时。对TAM(CD11b阳性，Ly-6G阴性)进行分类。

从安乐死的8-10周龄雌性C57BL/6小鼠无菌采集小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，方法是用RPMI冲洗腿骨，通过70μm细胞过滤器过滤，并在Red Blood Cell Lysing BufferHybri-Max^TM(Sigma，R7757)中孵育。在ADCC测定之前，细胞与小鼠M-CSF(Peprotech，315-02)一起孵育7天。

使用从圣地亚哥血库购买的白细胞去除术系统室(LRSC)分离人类外周血单核细胞(PBMC)和巨噬细胞。使用Histopaque-1083(Sigma，10831)按照制造商的方案从LRSC中分离出PBMC。为了获得巨噬细胞，将PBMC与人类M-CSF(Peprotech，300-25)在组织培养板中一起孵育5天。

我们将分离的巨噬细胞用作抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定中的效应细胞。简而言之，用CFSE Cell Division Tracker Kit(BioLegend，423801)染色的靶细胞(即肿瘤细胞)与效应细胞(即TAM)在有或无同种型IgG或LM609的情况下在37℃下共同培养5-16小时，用PI染色，并在BD LSRFortessa^TM上进行流式细胞仪检测。死亡的靶细胞(PI阳性)与总的靶细胞群(CFSE阳性)的比率是按照Bracher,2007所述计算的。

正如Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图3A-3B所报道的，使用从免疫功能正常的C57BL6小鼠或免疫受损的无胸腺裸鼠中生长的小鼠Lewis肺癌(LLC)肿瘤中分离出的TAM，LM609显示了强大的ADCC活性。使用从健康小鼠分离出的骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，以及从健康供体血液中分离出的人类单核细胞源性巨噬细胞，该抗体也能杀伤肿瘤细胞。

令我们惊讶的是，LM609介导的ADCC并没有在小鼠NK细胞或从人类血液中分离出来的外周血单核细胞(PBMC)中实现，这两种细胞是抗体通常被设计为与其最佳结合的免疫效应细胞类型(Listinsky,2013；Yu,2017)。事实上，NK细胞与肿瘤中的β3表达并无相关性。这些发现报道在Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图3E中。

抗体与巨噬细胞上Fc受体的结合是其杀伤能力的关键，因为在存在Fc受体CD16、CD32和CD64的抗体阻断的情况下不存在巨噬细胞介导的杀伤，并且缺乏Fc部分的LM609形式(Fab LM609)不能触发巨噬细胞介导的杀伤。这些发现报道在Wettersten等人,CancerRes.79:5048(2019)的图3C-3D中。

单克隆抗体可以引导巨噬细胞通过两种主要机制诱导肿瘤细胞杀伤，这两种机制是被称为抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的过程。在Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图3F中，我们发现LM609诱导巨噬细胞ADCC而不是ADCP或直接杀伤，并且这需要整合素β3的表达。缺乏ADCP反应与肿瘤细胞高度表达CD47是一致的，所述高度表达是肿瘤细胞经常利用的用来逃避吞噬作用的“不要吃我”信号(Chao,2012)。对于其他表达αvβ3的肿瘤细胞系，也观察到了巨噬细胞介导的ADCC而不是ADCP或直接杀伤，所述肿瘤细胞系代表了ITGB3表达与巨噬细胞富集有关的肿瘤类型，包括肺癌、胰腺癌、脑癌和肾癌，如Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)的图3G中所报道的。

总的来说，这些研究结果表明，LM609的抗肿瘤活性涉及到用单克隆抗体对表达αvβ3的肿瘤细胞进行调理作用，然后再与巨噬细胞Fc受体接合以诱发杀伤。

实施例5

一种被设计用于优先接合巨噬细胞的新的人源化形式的LM609

根据体外ADCC测定，小鼠单克隆抗体LM609能够选择性地接合巨噬细胞而不是NK细胞以介导ADCC，并且我们推断可能会创造出一种保留这种功能区别的人源化形式的LM609。

为触发ADCC而加强与NK细胞结合的抗体Fc工程和糖工程策略包括用于促进Fc与NK细胞上唯一表达的Fc受体CD16(FcγRIII)的结合的改变。然而，我们的研究结果表明，表达αvβ3的肿瘤是间充质性的、干细胞样的和耐药性的，含有高水平的巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞(但不是NK细胞)，正如Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)中所报道的。因此，设计一种抗αvβ3抗体来诱导需要NK细胞接合的ADCC代表了抗原(αvβ3)与表达αvβ3的肿瘤内存在的效应细胞类型之间的不匹配。因此我们推断，如果抗αvβ3可以被工程改造成招募巨噬细胞，这种新的抗体可以通过更强烈地触发ADCC而显示出提高的抗肿瘤功效。

我们的设计目标是创造一种新的人源化形式的LM609，它相比其他免疫效应细胞类型更倾向于接合巨噬细胞。LM609是一种小鼠单克隆IgG1κ抗体，其识别人类整合素αvβ3(图2)。此前，几种人源化形式的LM609已被生成为hIgG1同种型(图3和图4)。由于hIgG4只与FcγRI/CD64结合而不与其他Fc受体结合，因此我们创造了一种新的人源化形式的LM609，其参与将埃达组单抗/Vitaxin的同种型从hIgG1同种型(图3)转换为hIgG4-S228P同种型(图5)。在抗体铰链区中的S228P(Eu编号系统)突变被包括在内，以防止Fab臂的交换，如以前所报道的(Reddy,2000)。图6显示了比较人源化LM609 hIgG1与hIgG4-S228P形式的氨基酸序列比对。

同种型转换为hIgG4以前已被用于产生癌症治疗剂，尽管这种改变的理由是创造一种缺乏ADCC效应细胞(最突出的是NK细胞和单核细胞)接合的抗体。相比之下，巨噬细胞并不被广泛认为是ADCC的介导物。考虑到小鼠单克隆抗体LM609能够招募巨噬细胞以诱导ADCC，但不能诱导吞噬作用，我们利用同种型转换为hIgG4代表了一种非常规的、意想不到的策略，使巨噬细胞参与ADCC。

NK细胞只利用FcγRIII/CD16来接合抗体Fc区域，而巨噬细胞可以利用FcγRI/CD64。使用基于细胞的ADCC报告基因生物测定，我们显示hLM609-hIgG4-S228P能够强烈激活效应细胞上的FcγRI，而hIgG1和hIgG1-I332E同种型则显示较低的接合水平(图7)。相反，hIgG1同种型可以强烈地激活FcγRIII，并且hIgG1-I332E突变如预期的那样加强了这一点(图7)。值得注意的是，hLM609-hIgG4在效应细胞上没有产生FcγRIII的激活，这证实了hIgG4同种型主要与FcγRI发生相互作用。虽然传统的想法可能表明，同种型转换为hIgG4-S228P会消除所有效应细胞的接合，但我们在此显示，hLM609-hIgG4-S228P能够选择性地接合并激活巨噬细胞上表达的Fc受体FcγRI/CD64。

我们接下来证实，同种型转换为hIgG4并不改变人源化LM609阻断整合素αvβ3介导的细胞粘附的能力。测试了每种抗体阻止表达整合素αvβ3的肿瘤细胞与αvβ3介导的对纤维蛋白原的粘附以及β1-整合素介导的对I型胶原蛋白的粘附的能力。图8显示IgG1和IgG4形式的人源化LM609都能阻断对纤维蛋白原的粘附，而不破坏β1介导的对胶原蛋白的粘附。

接下来，我们确认hIgG4形式的人源化LM609无法与NK细胞接合，这是由IgG4无法与NK细胞所表达的唯一Fc受体FcγRIIIA/CD16结合所预测的。在使用表达CD16的人类NK细胞的体外ADCC测定中，我们证实hIgG4-S228P形式的人源化LM609不能接合NK细胞来介导ADCC(图9A)。相比之下，hIgG4-S228P形式的人源化LM609(而不是hIgG1-WT形式)接合原生人类巨噬细胞以诱导对具有β3内源性表达的H1975人类肺癌细胞的ADCC(图9B)。使用从三个具有CD16/CD32多态性变体的单独健康血液供体身上分离出的巨噬细胞，进一步证实了hIgG4-S228P形式的人源化LM609的由巨噬细胞介导的杀伤活性，如图所示(图9C)。此外，LM609和hLM609-IgG4-S228P都能够利用人类巨噬细胞作为效应细胞诱导ADCC(图10A)。与hLM609-hIgG1不同，hLM609-IgG4-S228P同种型不能利用NK细胞杀伤肿瘤细胞(图10B)。这种区别可以通过实现抗原(整合素αvβ3)和在表达αvβ3的肿瘤中特别富集的效应细胞类型(如巨噬细胞)之间的匹配来产生治疗优势。

如同对LM609的观察，hIgG4-S228P形式的人源化LM609能够接合小鼠骨髓来源的巨噬细胞，以在体外诱导ADCC(图11)。在确定小鼠单克隆抗体LM609通过招募巨噬细胞进行ADCC来杀伤表达αvβ3的肿瘤细胞后，我们接下来比较了LM609和hLM609-hIgG4-S228P在小鼠中的抗肿瘤活性。事实上，两种抗体都产生了同等的抗肿瘤活性(图12)，这表明人源化形式和同种型转换使巨噬细胞接合足以模拟小鼠单克隆抗体的活性。我们接下来比较了hLM609-hIgG1(接合NK细胞的同种型)和hLM609-hIgG4-S228P(接合巨噬细胞的同种型)的抗肿瘤活性。重要的是，这些同种型变体的抗体亲和力是相等的，正如它们阻断αvβ3依赖的细胞粘附的能力所显示的那样(图8)。对于在小鼠中快速生长的人类肿瘤异种移植物，hLM609-hIgG4-S228P的抗肿瘤活性优于hLM609-hIgG1(图13)，表明选择性地接合巨噬细胞的能力为具有丰富的巨噬细胞而非NK细胞的表达αvβ3的肿瘤提供了治疗优势。

我们接下来比较了hLM609-hIgG1和hLM609-hIgG4-S228P的肿瘤积累。hLM609-hIgG4-S228P能够比hLM609-hIgG1更大程度地定位在肿瘤中(图14)。在不受理论约束的情况下，我们认为hLM609-hIgG4-S228P因为总体上接合的效应细胞较少，所以能够更好地定位到主要是巨噬细胞所在的肿瘤。相比之下，hLM609-hIgG1与更多种类的免疫细胞接合，可能会与血液、淋巴结、脾脏等中的效应细胞接合，因此可能不容易被定位到肿瘤。

总之，这些研究结果表明，hIgG4-S228P形式的人源化LM609可以模拟小鼠单克隆LM609的功能活性。具体而言，这些抗体能够优先接合巨噬细胞，以诱导杀伤表达整合素αvβ3的肿瘤细胞。这种抗体设计策略反映了将肿瘤细胞抗原(αvβ3)与适当的ADCC诱导性效应细胞(巨噬细胞)匹配的目标。通过防止抗体广泛地接合肿瘤微环境中不富集的免疫效应细胞类型，我们提出抗体在与肿瘤细胞上的αvβ3和/或巨噬细胞上的CD64/FcγRI结合后能更好地在肿瘤中积累。

一些治疗性抗体通过ADCC诱导肿瘤细胞杀伤。当抗体Fc区接合免疫效应细胞上的Fc受体，触发细胞毒性颗粒的释放，诱导肿瘤细胞被杀伤时，这就发生了。由于这种情况通常涉及到抗体与NK细胞上的CD16结合，因此许多抗体糖工程和Fc工程策略被设计用来促进这种相互作用。由于IgG4对CD64有很高的亲和力，但对所有其他受体的亲和力很弱，所以IgG4一般被认为是Fc介导的效应物功能的不良诱导剂。因此，同种型转换为IgG4是一种意想不到的方法，可以增强效应细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤。

例如，FDA已经批准了三种hIgG4肿瘤治疗抗体派姆单抗(KEYTRUDA)、纳武单抗(OPDIVO)和西米普利单抗(LIBTAYO)，它们都靶向主要在激活的T和NK细胞上表达的免疫检查点分子PD-1。这些抗体通过中和T细胞抑制而发挥作用，也就是说，当PD-1(在T和NK细胞上)与PD-L1(在肿瘤细胞上)结合时，防止免疫抑制后果。IgG4亚类允许该抗体阻断PD-1的功能，而不接合额外的免疫效应细胞。正如hIgG4抗体所常见的那样，所有三个抗PD-1抗体都含有S228P突变以稳定铰链区处的hIgG4抗体结构。根据本领域的知识，预测IgG4-S228P抗体会阻断靶抗原的功能，而没有任何效应细胞的接合。

我们在Wettersten等人,Cancer Res.79:5048(2019)中报道，巨噬细胞接合是识别整合素αvβ3的小鼠单克隆抗体LM609的抗肿瘤活性的必要条件。在机制上，我们确定阻断所有的Fc受体(CD16、CD32和CD64)可以阻止LM609在体外诱导ADCC的能力。然而，LM609诱导的巨噬细胞-ADCC是独立于CD64的，因为LM609(和小鼠IgG1抗体)不能与CD64结合。虽然LM609通过选择性地接合巨噬细胞而引发了强大的抗肿瘤活性，但LM609不能与CD64结合表明CD64接合并不关键。

作为吞噬细胞，巨噬细胞被广泛认为可以诱导ADCP，并且这被普遍理解为涉及CD16和CD32的接合。因此，ADCP可以通过同种型转换为IgG2来增强，IgG2对主要在巨噬细胞中表达的CD32具有高亲和力。然而，这种抗体的功效将受到肿瘤细胞上的CD47“不要吃我”信号表达的限制。较少有报道说巨噬细胞也能诱导ADCC，这种活动与CD16有关。因此，不可能预测巨噬细胞ADCC会被IgG4-CD64的相互作用所触发。

用于癌症治疗的抗体包括一些识别上皮样肿瘤细胞抗原EGFR、Her2和EpCAM的抗体。这类抗体的工程改造可以通过CD16与抗体Fc的结合促进NK细胞的接合来增强ADCC。然而，癌症治疗和进展最终会诱发EMT或癌症干细胞的富集，这不仅涉及上皮标志物的丧失，还涉及NK细胞和CD8+T细胞的排斥或失活。因此，晚期的、间充质样的、干细胞样的肿瘤对利用NK细胞杀伤肿瘤的上皮靶向单克隆抗体变得难以治疗。

癌症中EMT的一个标志是肿瘤免疫内容从免疫热转换成免疫冷。虽然目前还不清楚它们是EMT的原因还是效果，但肿瘤相关巨噬细胞具有高度的免疫抑制性，并起到排斥T细胞和NK细胞的作用，从而创造免疫冷的肿瘤微环境。本发明的优点是，通过1)识别肿瘤细胞表面的干/间充质标志物(整合素αvβ3)，和2)接合肿瘤相关的巨噬细胞以诱导ADCC，能够实现“抗原-效应细胞匹配”以诱导肿瘤细胞杀伤。

上述内容是对本发明的说明，不应解释为对本发明的限制。本发明由以下权利要求书定义，其中包括权利要求书的等同物。

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序列

hLM609-hIgG4-S228P(人源化LM609)

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hLM609-hIgG1-WT(人源化LM609)

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hLM609-hIgG4-S228P(人源化LM609)

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轻链编码序列(SEQ ID NO:14)

hLM609-hIgG1-WT(人源化LM609)

重链编码序列(SEQ ID NO:15)

序列表

<110> 阿尔法贝塔控股有限责任公司

D·切列什

S·维斯

S·麦考马克

C·雷德

H·韦特斯坦

<120> 治疗癌症的组合物和方法

<130> 1548.2.WO

<150> US 63/014,550

<151> 2020-04-23

<160> 15

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hLM609-hIgG4-S228P (人源化LM609)重链

<400> 1

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe

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Arg Tyr Arg Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

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180 185 190

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210

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130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hLM609-hIgG1-WT (人源化LM609)轻链

<400> 10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Arg Tyr Arg Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> mAb LM609-mIgG1-κ重链

<400> 11

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Asp Thr Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

130 135 140

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

210 215 220

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys

225 230 235 240

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe

275 280 285

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

305 310 315 320

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val

325 330 335

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

340 345 350

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys

355 360 365

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp

370 375 380

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser

405 410 415

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala

420 425 430

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

435 440 445

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 12

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> mAb LM609-mIgG1-κ轻链

<400> 12

Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser

1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Ser Asn His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn

85 90 95

Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn

100 105 110

Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

165 170 175

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

195 200 205

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

210 215 220

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 13

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> hLM609-hIgG4-S228P (人源化LM609)重链编码序列

<400> 13

gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60

cagtgtcagg tccaactggt cgaatcgggg gggggagttg tccaacctgg gagaagcctg 120

cggctatcat gcgctgcatc gggatttaca tttagctcgt atgatatgag ctgggtcagg 180

caagcccccg gaaagggact ggaatgggtc gcgaaagtca gctctggggg agggagcacc 240

tactatctgg acacggtcca aggacgattc acaattagca gagacaattc gaaaaataca 300

ctatacctgc aaatgaatag cctccgggcc gaggatacgg cggtctacta ctgcgctcgc 360

cacttgcacg gatcatttgc atcatggggg cagggtacca ctgtcacggt ctcgagcgct 420

agcaccaagg gcccctccgt gttccccctg gccccttgct cccggtccac ctccgagtct 480

accgccgctc tgggctgcct ggtgaaagac tacttccccg agcctgtgac cgtgagctgg 540

aactctggcg ccctgacctc cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca atcctccggc 600

ctgtactccc tgtcctccgt ggtgacagtg ccctcctcca gcctgggcac caagacctac 660

acctgtaacg tggaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagcgggt ggaatctaaa 720

tacggccctc cctgcccccc ctgccctgcc cctgaatttc tgggcggacc ttccgtgttt 780

ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc 840

gtggtggtgg acgtgtccca ggaagatcca gaggtgcagt tcaactggta tgttgacggc 900

gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggaac agttcaactc cacctaccgg 960

gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1020

aaggtgtcca acaagggcct gccctccagc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 1080

cagccccgcg agccccaggt gtacaccctg ccccctagcc aggaagagat gaccaagaac 1140

caggtgtccc tgacctgtct ggtgaaaggc ttctacccct ccgacattgc cgtggaatgg 1200

gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctgtactc tcggctgaca gtggataagt cccggtggca ggaaggcaac 1320

gtgttctcct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actataccca gaagtccctg 1380

tccctgagcc tgggcaagtg atgaaagctt 1410

<210> 14

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> hLM609-hIgG4-S228P (人源化LM609)轻链编码序列

<400> 14

gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60

cagtgtgaga tcgtcctcac ccaatcgccg gcgacgctga gcctctctcc cggagagcgg 120

gcgaccttga gctgccaagc gagccaatca atctccaatt tcttgcactg gtatcaacaa 180

aggcccggac aagcaccgag gctgctgata agatatagga gccaatcgat ctccgggata 240

cccgcacgat ttagcggaag cggatcgggc accgatttta cgctaacgat ttcgagcctg 300

gagccggagg actttgcggt ctattactgc caacaatcgg gaagctggcc gctgacattt 360

ggaggaggta ccaaggtcga gatcaagcgt acggtcgcgg cgccttctgt gttcattttc 420

cccccatctg atgaacagct gaaatctggc actgcttctg tggtctgtct gctgaacaac 480

ttctacccta gagaggccaa agtccagtgg aaagtggaca atgctctgca gagtgggaat 540

tcccaggaat ctgtcactga gcaggactct aaggatagca catactccct gtcctctact 600

ctgacactga gcaaggctga ttacgagaaa cacaaagtgt acgcctgtga agtcacacat 660

caggggctgt ctagtcctgt gaccaaatcc ttcaataggg gagagtgctg atagtaaaag 720

ctt 723

<210> 15

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> hLM609-hIgG1-WT (人源化LM609)重链编码序列

<400> 15

gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60

cagtgtcagg tccaactggt cgaatcgggg gggggagttg tccaacctgg gagaagcctg 120

cggctatcat gcgctgcatc gggatttaca tttagctcgt atgatatgag ctgggtcagg 180

caagcccccg gaaagggact ggaatgggtc gcgaaagtca gctctggggg agggagcacc 240

tactatctgg acacggtcca aggacgattc acaattagca gagacaattc gaaaaataca 300

ctatacctgc aaatgaatag cctccgggcc gaggatacgg cggtctacta ctgcgctcgc 360

cacttgcacg gatcatttgc atcatggggg cagggtacca ctgtcacggt ctcgagcgct 420

agcacaaagg gccctagtgt gtttcctctg gctccctctt ccaaatccac ttctggtggc 480

actgctgctc tgggatgcct ggtgaaggat tactttcctg aacctgtgac tgtctcatgg 540

aactctggtg ctctgacttc tggtgtccac actttccctg ctgtgctgca gtctagtgga 600

ctgtactctc tgtcatctgt ggtcactgtg ccctcttcat ctctgggaac ccagacctac 660

atttgtaatg tgaaccacaa accatccaac actaaagtgg acaaaagagt ggaacccaaa 720

tcctgtgaca aaacccacac ctgcccacct tgtcctgccc ctgaactgct gggaggacct 780

tctgtgtttc tgttcccccc caaaccaaag gataccctga tgatctctag aacccctgag 840

gtgacatgtg tggtggtgga tgtgtctcat gaggaccctg aggtcaaatt caactggtac 900

gtggatggag tggaagtcca caatgccaaa accaagccta gagaggaaca gtacaattca 960

acctacagag tggtcagtgt gctgactgtg ctgcatcagg attggctgaa tggcaaggaa 1020

tacaagtgta aagtctcaaa caaggccctg cctgctccaa ttgagaaaac aatctcaaag 1080

gccaagggac agcctaggga accccaggtc tacaccctgc caccttcaag agaggaaatg 1140

accaaaaacc aggtgtccct gacatgcctg gtcaaaggct tctacccttc tgacattgct 1200

gtggagtggg agtcaaatgg acagcctgag aacaactaca aaacaacccc ccctgtgctg 1260

gattctgatg gctctttctt tctgtactcc aaactgactg tggacaagtc tagatggcag 1320

caggggaatg tcttttcttg ctctgtcatg catgaggctc tgcataacca ctacactcag 1380

aaatccctgt ctctgtctcc cgggaaatga tagtaaaagc tt 1422

Claims (62)

1.一种嵌合结合剂，其包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域与表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞上的整合素αvβ3特异性结合，所述第二结构域通过接合间充质肿瘤中积累的巨噬细胞来介导抗体导向的细胞毒性(ADCC)。

2.根据权利要求1所述的嵌合结合剂，其中所述上皮癌细胞是晚期上皮癌细胞。

3.根据权利要求2所述的嵌合结合剂，其中所述上皮癌细胞已至少部分转化为间充质细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述上皮癌细胞是化疗耐药性或难治性的。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域是抗体结构域。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域是抗体结构域。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域是人源化抗体结构域或人类抗体结构域。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域是人源化抗体结构域或人类抗体结构域。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合结合剂，其为嵌合抗体或其抗原结合片段。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含抗体的Fab结构域。

11.根据权利要求10所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含IgG抗体的Fab结构域。

12.根据权利要求11所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含IgG4抗体的Fab结构域。

13.根据权利要求12所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含hLM609-hIgG4-S228P的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)或与其至少90％相同的序列以及hLM609-hIgG4-S228P的重链的Fab部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)或与其至少90％相同的序列。

14.根据权利要求13所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域包含LM609_7的重链的Fab部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)或与其至少90％相同的序列以及LM609_7的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)或与其至少90％相同的序列、JC7U的重链的Fab部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)或与其至少90％相同的序列以及JC7U的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)或与其至少90％相同的序列。

15.根据权利要求1至12中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域进一步特异性结合第二抗原。

16.根据权利要求15所述的嵌合结合剂，其中所述第一结构域是双特异性抗体结构域。

17.根据权利要求15或16所述的嵌合结合剂，其中所述第二抗原是免疫检查点分子，例如PD-1、PD-L1或CTLA-4。

18.根据权利要求15或16所述的嵌合结合剂，其中所述第二抗原是癌症干细胞标志物，例如CD133、CD44、CD90、CD117、CD166或CD105，或效应细胞抗原。

19.根据权利要求15或16所述的嵌合结合剂，其中所述第二抗原是效应细胞抗原。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域不显著接合自然杀伤细胞。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域不显著接合淋巴细胞。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域特异性地结合髓源性细胞的表面上的蛋白质。

23.根据权利要求22所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域特异性结合Fc-γ受体。

24.根据权利要求22所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域特异性结合Fc-γ受体I(FcγRI，CD64)。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含抗体的Fc结构域。

26.根据权利要求25所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含IgG抗体的Fc结构域。

27.根据权利要求26所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含IgG4抗体的Fc结构域。

28.根据权利要求26所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含IgA或IgE抗体的Fc结构域。

29.根据权利要求25至28中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域进一步包含抗体的铰链结构域。

30.根据权利要求29所述的嵌合结合剂，其中所述第二结构域包含hLM609-hIgG4-S228P的重链Fc结构域和铰链结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)或与其至少90％相同的序列。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的嵌合结合剂，其中所述氨基酸序列在铰链区包含S228P突变(Eu编号系统)。

32.根据权利要求31所述的嵌合结合剂，其包含hLM609-hIgG4-S228P重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)或与其至少90％相同的序列。

33.根据权利要求31或32所述的嵌合结合剂，其中所述氨基酸序列包含选自以下的突变：

a)S239D/A330L/I332E；

b)I332E；

c)G236A/S239D/I332E；

d)G236A；

e)N297A/E382V/M428I；

f)M252Y/S254T/T256E；

g)Q295R/L328W/A330V/P331A/I332Y/E382V/M428I；

h)L234A/L235A/P329G；

i)M428L/N434S；

j)L234A/L235A/P331S；

k)L234A/L235A/P329G/M252Y/S254T/T256E；

l)S298A/E333A/K334/A；

m)S239D/I332E；

n)G236A/S239D/A330L/I332E；

o)S239D/I332E/G236A；

p)L234Y/G236W/S298A；

q)F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；

r)K326W/E333S；

s)K326A/E333A；

t)K326M/E333S；

u)C221D/D222C；

v)S267E/H268F/S324W；

w)H268F/S324W；

x)E345R

y)R435H；

z)N434A；

aa)M252Y/S254T/T256E；

ab)M428L/N434S；

ac)T252L/T/253S/T254F；

ad)E294delta/T307P/N434Y；

ae)T256N/A378V/S383N/N434Y；

af)E294delta

ag)L235E；

ah)L234A/L235A；

ai)S228P/L235E；

aj)P331S/L234E/L225F；

ak)D265A；

al)G237A；

am)E318A；

an)E233P；

ao)G236R/L328R；

ap)H268Q/V309L/A330S/P331S；

aq)L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S；

ar)A330L；

as)D270A；

at)K322A；

au)P329A；

av)P331A；

aw V264A；

ax)F241A；

ay)N297A或G或N

az)S228P/F234A/L235A；或

ba)a)至az)的任何组合。

34.一种编码根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂的多核苷酸。

35.一种载体，其包含根据权利要求34所述的多核苷酸。

36.一种宿主细胞，其包含根据权利要求34所述的多核苷酸或根据权利要求35所述的载体。

37.一种组合物，其包含根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂和载体。

38.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂和药学上可接受的载体。

39.根据权利要求38所述的药物组合物，其进一步包含额外的治疗剂。

40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述额外的治疗剂是化疗剂。

41.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂。

42.一种将巨噬细胞靶向表达整合素αvβ3的癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞和所述巨噬细胞与有效量的根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂接触。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述癌细胞由于细胞应激而表达整合素αvβ3。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述癌细胞由于经历上皮向间充质转化而表达整合素αvβ3。

45.一种将在间充质肿瘤中积累的巨噬细胞靶向表达至少一种间充质细胞标志物的上皮癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞和所述巨噬细胞与有效量的根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂接触。

46.一种在有需要的受试者中治疗表达整合素αvβ3的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂或根据权利要求38至40中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述癌症。

47.一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂或根据权利要求38至40中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。

48.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

a)选择受试者，所述受试者具有富含整合素αvβ3并富含巨噬细胞的癌细胞；和

b)向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂或根据权利要求38至40中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述癌症。

49.一种在有需要的受试者中治疗上皮细胞癌的方法，其包括以下步骤：

a)选择受试者，所述受试者具有富含整合素αvβ3并富含在间充质肿瘤中积累的巨噬细胞的上皮癌细胞；和

b)向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合结合剂或根据权利要求38至40中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述上皮细胞癌。

50.根据权利要求48或49所述的方法，其中步骤a)包括从所述受试者获得所述癌症的样品，并测量所述样品中整合素αvβ3和巨噬细胞的水平。

51.根据权利要求49所述的方法，其中所述上皮细胞癌是晚期上皮细胞癌。

52.根据权利要求49所述的方法，其中所述癌症中的所述上皮细胞中的一个或多个已至少部分地转化为间充质细胞。

53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞癌是或已经成为化疗耐药性或难治性的。

54.根据权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述癌症是癌，例如胃肠道癌、乳腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结肠癌、前列腺癌或膀胱癌。

55.根据权利要求42至54中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用CD47阻断剂和/或免疫检查点抑制剂和/或EGFR抑制剂。

56.根据权利要求42至54中任一项所述的方法，其中所述方法不包括向所述受试者施用CD47阻断剂。

57.根据权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞癌表达CD47。

58.根据权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞癌不表达CD47。

59.根据权利要求42至58中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用额外的癌症治疗剂或治疗。

60.根据权利要求42至59中任一项所述的方法，其中所述嵌合结合剂或药物组合物通过静脉内、皮下或肌内施用于所述受试者，或原位注射到所述癌症中或所述癌症附近。

61.根据权利要求42至60中任一项所述的方法，其进一步包括步骤：从所述受试者分离巨噬细胞、使所述巨噬细胞与所述嵌合结合剂或药物组合物接触，并将接触后的巨噬细胞施用于所述受试者。

62.根据权利要求42至61中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

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