JP2023522957A - 二機能性分子およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、一般的には、標的リボ核酸に特異的に結合する第１のドメイン、および標的タンパク質に特異的に結合する第２のドメインを含む合成二機能性分子の組成物、ならびにその使用に関する。【選択図】図１

Description

ＲＮＡ翻訳の調節は、細胞ならびに組織レベルで、生物内の細胞的事象の緩和および疾患状態に対する応答において基本的な役割を果たす。一部の疾患状態は、１つまたは複数のタンパク質の発現が増加されると緩和され、それはＲＮＡ翻訳の増加によって達成され得る。
標的ＲＮＡとタンパク質の間の結合特異性は、分子を効率的に送達し、特定の標的のｍＲＮＡ翻訳を増加させるための手段を提供し得る。
一態様では、本開示は、細胞中の標的リボ核酸（ＲＮＡ）の翻訳を増加させる方法であって、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または第１の小分子を含む第１のドメインであって、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合する、第１のドメイン、および第２の小分子またはアプタマーを含む第２のドメインであって、標的ポリペプチドに特異的に結合する、第２のドメインを含む合成二機能性分子を細胞に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、合成二機能性分子は、第１のドメインおよび第２のドメインをコンジュゲートするリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、細胞中の標的ＲＮＡの翻訳を直接または間接的に促進、ブースト、または増加させる。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは標的タンパク質である。
一部の実施形態では、第１のドメインは、ＡＳＯを含む。一部の実施形態では、第１のドメインは、ＡＳＯである。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１つまたは複数のロックドヌクレオチド、１つまたは複数の修飾核酸塩基、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’ロックド末端ヌクレオチド、３’ロックド末端ヌクレオチド、または５’および３’ロックド末端ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯにおける内部位置にロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３０％～６０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、８～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２５ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１４～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）ＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ＡＳＯの５’末端または３’末端にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ウイルスに感染している。一部の実施形態では、ヒト細胞は、がん細胞である。一部の実施形態では、細胞は、細菌細胞である。
一部の実施形態では、第１のドメインは、小分子を含む。一部の実施形態では、小分子は、表２からなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のドメインは小分子を含む。一部の実施形態では、小分子は、９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物である。一部の実施形態では、第２の小分子は、イブルチニブまたはイブルチニブ－ＭＰＥＡを含む。
一部の実施形態では、第２のドメインは、アプタマーである。一部の実施形態では、リンカーは、
Figure 2023522957000002
を含む。
一部の実施形態では、標的リボ核酸配列は、核内ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡである。一部の実施形態では、核内ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、転写されたＲＮＡ、新生ＲＮＡ、染色体富化ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、膜富化ＲＮＡ、またはミトコンドリアＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの細胞内局在は、核、ゴルジ、小胞体、空胞、リソソーム、およびミトコンドリアからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡのイントロン、エクソン、５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲに位置する。
一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、ＥＩＦ４Ｅを含む。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、ＹＴＨＤＦ１を含む。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、内因性である。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、細胞内である。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、酵素、足場タンパク質、または制御タンパク質である。一部の実施形態では、リボ核酸は、疾患または障害に関連する。
一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、外因性である。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、融合タンパク質または組換えタンパク質である。
一部の実施形態では、第２のドメインは、標的ポリペプチド上の活性部位またはアロステリック部位と特異的に結合する。一部の実施形態では、第２のドメインの標的ポリペプチドへの結合は、非共有的または共有的である。一部の実施形態では、第２のドメインの標的ポリペプチドへの結合は、共有的であり、可逆性であるか、または共有的であり、不可逆性である。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表３または表４から選択される遺伝子の転写物中である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、疾患または障害と関連する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、表４からの疾患と関連する。一部の実施形態では、疾患は、生物によって引き起こされる任意の障害である。一部の実施形態では、生物は、プリオン、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫である。一部の実施形態では、疾患または障害は、がん、代謝疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、感染症、遺伝的疾患、または神経疾患である。一部の実施形態では、疾患はがんであり、標的遺伝子はがん遺伝子である。一部の実施形態では、第２のドメインは、タンパク－ＲＮＡ相互作用ドメインに特異的に結合し、タンパク－ＲＮＡ相互作用のＲＮＡは、表３または表４から選択される遺伝子と関連する。一部の実施形態では、タンパク－ＲＮＡ相互作用は、エフェクタータンパク質の、ＲＮＡ配列への結合をブロックする。一部の実施形態では、タンパク－ＲＮＡ相互作用は、疾患または障害と関連する。一部の実施形態では、疾患は、生物によって引き起こされる任意の障害である。一部の実施形態では、生物は、プリオン、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫である。一部の実施形態では、疾患または障害は、がん、代謝疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、感染症、遺伝的疾患、または神経疾患である。一部の実施形態では、疾患はがんであり、標的遺伝子はがん遺伝子である。
一部の態様では、本開示は、細胞中の標的リボ核酸（ＲＮＡ）の翻訳を増加させるための合成二機能性分子であって、第１の小分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む第１のドメインであって、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合する、第１のドメイン、および第２の小分子またはアプタマーを含む第２のドメインであって、標的ポリペプチドに特異的に結合する、第２のドメインを含む、合成二機能性分子も提供する。一部の実施形態では、第１のドメインおよび第２のドメインは、上記のものである。一部の実施形態では、合成二機能性分子は、第１のドメインを第２のドメインにコンジュゲートするリンカーを含む。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、細胞中の標的ＲＮＡの翻訳を直接または間接的に促進、ブースト、または増加させる。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、標的タンパク質である。一部の実施形態では、リンカーは：
Figure 2023522957000003
を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、位置異性体の混合体を含む。一部の実施形態では、位置異性体の混合体は、本明細書において記載されるリンカー２である。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、ＥＩＦ４Ｅを含む。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、ＹＴＨＤＦ１を含む。
本開示の実施形態の以下の詳細な記載は、添付される図面と関連させて読むときに、より深く理解できる。本開示の図示を目的として、本発明における例示的な実施形態を図面に示す。しかしながら、本開示は、図面において図示される実施形態に記載されたままの配置および手段に限られないことを理解すべきである。
図１は、遊離のオリゴヌクレオチドおよび小分子にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを含有する画分を同定するマススペクトロメトリーデータを示す。 図２Ａは、例示的な三元複合体を形成する概略図を示す。インビトロでの三元複合体形成（標的ＲＮＡ－二機能性分子－エフェクタータンパク質）の証拠として、図２Ｂは、ゲルにおけるシフトにより、三元複合体の形成を検出するゲル解析の結果を示す。 図３は、イブルチニブおよびＡＳＯのコンジュゲート（本明細書において提供される二機能性分子の例示的な実施形態）が、それぞれ、イブルチニブを介してＢｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）と、およびＡＳＯを介してＣｙ５標識されたＩＶＴ ＲＮＡと、三元複合体を形成することを示す画像である。 図４は、二機能性分子およびＢＴＫ－ＹＴＨＤＦ１エフェクタータンパク質による、ＲＮＡの翻訳の増強を示す。 図５は、二機能性分子およびＢＴＫ－ＥＩＦ４Ｅエフェクタータンパク質による、ＲＮＡの翻訳の増強を示す。
本開示は、一般に、二機能性分子に関する。一般には、二機能性分子は、２つ以上の独特の標的に結合するように設計および合成される。第１の標的は、核酸配列、例えば、ＲＮＡであり得る。第２の標的は、タンパク質、ペプチド、または他のエフェクター分子であり得る。本明細書において記載される二機能性分子は、標的核酸配列または構造（例えば、標的ＲＮＡ配列）に特異的に結合する第１のドメインおよび標的ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する第２のドメインを含む。二機能性分子組成物、その組成物の調製およびその使用も記載される。
本開示は、特定の実施形態に関して、およびある特定の図面を参照して記載されるが、本開示は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書の以後記載される用語は一般に、別途指摘されない限り、その一般的な意味で理解されるべきである。
本明細書において記載される、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合する第１のドメインおよび標的ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する第２のドメインを含む合成二機能性分子、そのような二機能性分子を含む組成物、そのような二機能性分子を使用する方法などは、異なる成分、例えば、ユニークな配列、異なる長さ、および修飾ヌクレオチド（例えばロックドヌクレオチド）を含む二機能性分子を使用して、異なる技術的効果（例えば、細胞中の標的ＲＮＡの翻訳増加）を達成する方法を示す例に一部基づくものである。それは特に、本明細書の以後の記載が特定の知見の種々の変化および例において考えられる組合せを企図するこれらの例に基づくものである。
二機能性分子
一部の態様では、本開示は、標的核酸配列（例えば、ＲＮＡ配列）に結合する第１のドメインおよび標的ポリペプチドまたはタンパク質に結合する第２のドメインを含む二機能性分子に関する。本明細書に記載の二機能性分子は、第１のドメインが第２のドメインにコンジュゲートされるように設計および合成される。
第１のドメイン
本明細書に記載の二機能性分子は、標的核酸配列または構造（例えば、ＲＮＡ配列）に特異的に結合する第１のドメインを含む。一部の実施形態では、第１のドメインは、小分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
一部の実施形態では、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合する、本明細書に記載の二機能性分子の第１のドメインは、ＡＳＯである。
規定通りの方法を使用して、十分な特異性で標的配列に結合する核酸を設計することができる。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、互換的に使用される。一部の実施形態では、方法は、当業界で公知のバイオインフォマティクス法を使用して、二次構造の領域を同定することを含む。本明細書で使用される場合、用語「二次構造」とは、単一の核酸ポリマー内または２つのポリマー間の塩基対相互作用を指す。例えば、ＲＮＡの二次構造としては、限定されるものではないが、二本鎖セグメント、突出部、内部ループ、ステムループ構造（ヘアピン）、２ステム結合（同軸スタック）、シュードノット、グアニン四重鎖、疑似らせん構造、およびキッシングヘアピンが挙げられる。例えば、「遺伝子ウォーク」法を使用して、核酸の活性を最適化することができる；例えば、標的ＲＮＡまたは遺伝子の長さに広がる１０～３０ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを調製した後、活性について試験することができる。必要に応じて、例えば、標的配列間に５～１０ヌクレオチド以上のギャップを残して、合成および試験されるオリゴヌクレオチドの数を減少させることができる。
例えば、目的の配列内で、１つまたは複数の標的領域、セグメントまたは部位が同定されたら、標的と十分に相補的である、すなわち、十分な特異性で十分によくハイブリダイズして（すなわち、他の非標的ＲＮＡには実質的に結合しない）、所望の効果、例えば、ＲＮＡへの結合を得るヌクレオチド配列が選択される。
本明細書で記載される場合、ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であってよい水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成によって対形成する相補的核酸塩基である。本明細書で使用される場合、相補的とは、２つのヌクレオチド間で正確に対形成する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドのある特定の位置にあるヌクレオチドが、ＲＮＡ分子の同じ位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、ＡＳＯおよびＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考えられる。ＡＳＯとＲＮＡとは、それぞれの分子中の十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドによって占有される場合、互いに相補的である。かくして、「特異的にハイブリダイズする」および「相補的」は、ＡＳＯとＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される用語である。例えば、ＡＳＯのある位置にある塩基がＲＮＡの対応する位置にある塩基と水素結合することができる場合、その塩基は、その位置で互いに相補的であると考えられる。１００％の相補性は必要ではない。
相補的核酸配列が、特異的にハイブリダイズし得るその標的核酸のものと１００％相補的である必要はないことは当技術分野において理解される。本発明の方法の目的のための相補的核酸配列は、配列の、標的ＲＮＡ分子または標的遺伝子への結合が、本明細書に記載の所望の効果を惹起し、特異的結合が望ましい条件下、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合、生理的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが好適なストリンジェンシーの条件下で行われる条件下での、配列の非標的ＲＮＡ配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
一般に、本明細書に記載の方法において有用なＡＳＯは、標的核酸内の標的領域に対する少なくとも８０％の配列相補性、例えば、ＲＮＡ内の標的領域に対する９０％、９５％または１００％の配列相補性を有する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２０個の核酸塩基のうちの１８個が、標的領域と相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を示すであろう。ＡＳＯと、標的核酸の領域との相補性パーセントを、基本的な部分アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Altschul et al, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）を使用して規定通りに決定することができる。ＲＮＡにハイブリダイズするＡＳＯを、規定通りの実験により同定することができる。一般に、ＡＳＯは、その標的に対する特異性を保持しなければならない、すなわち、意図される標的以外に直接結合してはならない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、規定のパターンまたはモチーフでオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って配置された修飾および／または非修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、それぞれの核酸塩基は修飾されている。ある特定の実施形態では、核酸塩基はいずれも修飾されていない。ある特定の実施形態では、それぞれのプリンまたはそれぞれのピリミジンは修飾されている。ある特定の実施形態では、それぞれのアデニンは修飾されている。ある特定の実施形態では、それぞれのグアニンは修飾されている。ある特定の実施形態では、それぞれのチミンは修飾されている。ある特定の実施形態では、それぞれのウラシルは修飾されている。ある特定の実施形態では、それぞれのシトシンは修飾されている。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド中のシトシン核酸塩基の一部または全部が、５－メチルシトシンである。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基のブロックを含む。ある特定のそのような実施形態では、ブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端にある。ある特定の実施形態では、ブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端の３ヌクレオシド以内にある。ある特定の実施形態では、ブロックは、オリゴヌクレオチドの５’末端にある。ある特定の実施形態では、ブロックは、オリゴヌクレオチドの５’末端の３ヌクレオシド以内にある。
ある特定の実施形態では、修飾核酸塩基を含む１つのヌクレオシドは、修飾オリゴヌクレオチドの中央領域にある。ある特定のそのような実施形態では、前記ヌクレオシドの糖部分は、２’－β－Ｄ－デオキシリボシル部分である。ある特定のそのような実施形態では、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシン、２－チオピリミジン、２－チオチミン、６－メチルアデニン、イノシン、シュードウラシル、または５－プロピネピリミジンから選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、規定のパターンまたはモチーフでオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って配置された修飾および／または非修飾ヌクレオシド間連結を含む。ある特定の実施形態では、それぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結（Ｐ＝Ｏ）である。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結（Ｐ＝Ｓ）である。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結およびホスホジエステルヌクレオシド間連結から独立に選択される。ある特定の実施形態では、それぞれのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、立体ランダムホスホロチオエート、（Ｓｐ）ホスホロチオエート、および（Ｒｐ）ホスホロチオエートから独立に選択される。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの中央領域内のヌクレオシド間連結は、全て修飾されている。ある特定のそのような実施形態では、５’領域および３’領域中のヌクレオシド間連結の一部または全部は、非修飾ホスフェート連結である。ある特定の実施形態では、末端ヌクレオシド間連結は、修飾されている。ある特定の実施形態では、ヌクレオシド間連結モチーフは、５’領域および３’領域の少なくとも一方において少なくとも１個のホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、少なくとも１個のホスホジエステル連結は、末端ヌクレオシド間連結ではなく、残りのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ある特定のそのような実施形態では、全てのホスホロチオエート連結が立体ランダムである。ある特定の実施形態では、５’領域および３’領域中の全てのホスホロチオエート連結は（Ｓｐ）ホスホロチオエートであり、中央領域は少なくとも１つのＳｐ、Ｓｐ、Ｒｐモチーフを含む。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、そのようなヌクレオシド間連結モチーフを含む修飾オリゴヌクレオチドについて富化される。
ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、交互のヌクレオシド間連結モチーフを有する領域を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、均一に修飾されたヌクレオシド間連結の領域を含む。ある特定のそのような実施形態では、ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルまたはホスフェートおよびホスホロチオエートから選択される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルまたはホスフェートおよびホスホロチオエートから選択され、少なくとも１個のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートである。
ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも６個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１つのブロックを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１つのブロックを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１つのブロックを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１つのブロックを含む。ある特定のそのような実施形態では、少なくとも１つのそのようなブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。ある特定のそのような実施形態では、少なくとも１つのそのようなブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端の３ヌクレオシド以内に位置する。
ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、１個以上のメチルホスホネート連結を含む。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１つまたは２つのメチルホスホネート連結を除く全てのホスホロチオエート連結を含む連結モチーフを含む。ある特定の実施形態では、１個のメチルホスホネート連結は、オリゴヌクレオチドの中央領域にある。
ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結およびホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を配置して、ヌクレアーゼ耐性を維持することが望ましい。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数および位置ならびにホスホジエステルヌクレオシド間連結の数および位置を配置して、ヌクレアーゼ耐性を維持することが望ましい。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減少させ、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増加させてもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を依然として維持しながら、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減少させ、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増加させてもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を保持しながら、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減少させることが望ましい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を保持しながら、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増加させることが望ましい。
本明細書に記載のＡＳＯは、短くても、長くてもよい。ＡＳＯは、８～２００ヌクレオチド長、一部の例では、１０～１００、一部の例では、１２～５０ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、ＡＳＯは、８～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、９～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１０～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１１～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１３～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１４～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１５～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１７～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１８～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１９～３０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、２０～３０ヌクレオチドの長さを含む。
一部の実施形態では、ＡＳＯは、８～２９ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、９～２９ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１０～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１１～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１３～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１４～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１５～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１７～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１８～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１９～２８ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、２０～２８ヌクレオチドの長さを含む。
一部の実施形態では、ＡＳＯは、８～２７ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、９～２７ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１０～２６ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１０～２５ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１０～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１１～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１３～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１４～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１５～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１７～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１８～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１９～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、２０～２４ヌクレオチドの長さを含む。
一部の実施形態では、ＡＳＯは、１０～２７ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１１～２６ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２５ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２３ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２２ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２１ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１２～２０ヌクレオチドの長さを含む。
一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２７ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２６ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２５ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２４ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２３ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２２ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２１ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１６～２０ヌクレオチドの長さを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９ヌクレオチド以上の長さ、かつ３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９ヌクレオチド以下の長さを含む。
本明細書で使用される場合、用語「ＧＣ含量」または「グアニン－シトシン含量」とは、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかである、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中の窒素含有塩基のパーセンテージを指す。この尺度は、ＤＮＡ中ではアデニンおよびチミンならびにＲＮＡ中ではアデニンおよびウラシルをも含む、含まれる４種の全塩基のうちのＧおよびＣ塩基の割合を示す。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３０％～６０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３５％～６０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、４０％～６０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、４５％～６０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５０％～６０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３０％～５５％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３０％～５０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３０％～４５％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３０％～４０％のＧＣ含量を含む配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９％以上かつ６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１％以下のＧＣ含量を含む配列を含む。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチドの長さ、３０％～６０％のＧＣ含量を含む配列、および少なくとも１つのロックドヌクレオチドのうちの少なくとも１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチドの長さ、３０％～６０％のＧＣ含量を含む配列、および少なくとも１つのロックドヌクレオチドのうちの少なくとも２つ以上を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長、３０％～６０％のＧＣ含量を含む配列、および少なくとも１つのロックドヌクレオチドを含む。
ＡＳＯは、任意の連続する一続きの核酸であってもよい。一部の実施形態では、ＡＳＯは、任意の連続する一続きのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＲＮＡ、非天然、人工核酸、修飾核酸またはその任意の組合せであってもよい。ＡＳＯは、線状ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ＡＳＯは、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＡＳＯは、一本鎖ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、シュード二本鎖である（例えば、一本鎖ポリヌクレオチドの一部が自己ハイブリダイズする）。
一部の実施形態では、ＡＳＯは、非修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＡＳＯは、修飾ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」とは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間連結に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを指す。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、一本鎖であり、化学的に修飾され、合成的に生産される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯを、高親和性ＲＮＡ結合剤（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ））ならびに化学的修飾を含むように修飾することができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ヌクレアーゼ耐性を増加させる、および／または標的配列に対するＡＳＯの親和性を増加させるように修飾された１つまたは複数の残基を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ヌクレオチドアナログを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯを、ウイルス（例えば、レンチウイルス、ＡＡＶ、もしくはアデノウイルス）または非ウイルスベクターなどによって送達される、核酸配列から、神経細胞などの標的細胞の内部で発現させることができる。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるＡＳＯは、標的リボヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするよう設計された相補的核酸配列である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的に十分に相補的であるもの、すなわち、十分にハイブリダイズし、十分に特異性を有し、所期の効果を得られるものが選択される。
一部の実施形態では、ＡＳＯは、Ｒｌｕｃ ＲＮＡを標的とする。一部の実施形態では、ＲｌｕｃターゲティングＡＳＯは、配列番号２または３に対する少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または、９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２または３を含み、任意に１つまたは複数の置換を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２または３からなり、任意に１つまたは複数の置換を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯは、下記の表１Ａまたは表１Ｂに示される、ＡＳＯ２およびＡＳＯ３からなる群から選択される。
Figure 2023522957000004
一部の実施形態では、本明細書において記載されるＡＳＯは、化学修飾されていてもよい。一部の実施形態では、例えば、本明細書において記載されるＡＳＯの１つまたは複数のヌクレオチドは、内部２’－メトキシエトキシ（ｉ２ＭＯＥｒ）および／または３’－ヒドロキシ－２’－メトキシエトキシ（３２ＭＯＥｒ）によって化学修飾されていてもよく、その結果として、下記の表１Ｂに示されるようになる。
Figure 2023522957000005
表１Ａは、ＡＳＯ配列およびヒトゲノム中のそれらの座標を示す。表１Ｂは、各ＡＳＯのための例示的な化学修飾を示す。Ｍｏｄ Ｃｏｄｅは、ＩＤＴ Ｍｏｄ Ｃｏｄｅに従う：＋＝ＬＮＡ、＊＝ホスホロチオエート連結、ｉ２ＭＯＥｒＡ＝内部２’－メトキシエトキシＡ、ｉ２ＭＯＥｒＣ＝内部２’－メトキシエトキシＭｅＣ、３２ＭＯＥｒＡ＝３’－ヒドロキシ－２’－メトキシエトキシＡなど。
本明細書中で使用する場合、「ＲＬｕｃ」または「Ｒｌｕｃ」という用語は、ウミシイタケルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼ２モノオキシゲナーゼを指す。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から精製したウミシイタケルシフェラーゼ酵素／タンパク質は、機械刺激に応じて青緑の生物発光を示す、生物発光軟質サンゴである。それは、腔腸動物、魚、イカ、およびエビ間にも広く分布している。それをクローニングおよびシークエンスし、細菌、酵母、植物および哺乳動物細胞における遺伝子発現のマーカーとして使用した。酵素ＲＬは、セレンテラジンの酸化を触媒し、生物発光をもたらす。
ＡＳＯ修飾
一部の実施形態では、ＡＳＯは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも１つのロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも２つのロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも３個のロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも４個のロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも５個のロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも６個のロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも７個のロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも８個のロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’ロックド末端ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３’ロックド末端ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’および３’ロックド末端ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’末端の近くにロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３’末端の近くにロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’末端および３’末端の近くにロックドヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’ロックド末端ヌクレオチド、５’末端から２番目の位置にロックドヌクレオチド、５’末端から３番目の位置にロックドヌクレオチド、５’末端から４番目の位置にロックドヌクレオチド、５’末端から５番目の位置にロックドヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３’ロックド末端ヌクレオチド、３’末端から２番目の位置にロックドヌクレオチド、３’末端から３番目の位置にロックドヌクレオチド、３’末端から４番目の位置にロックドヌクレオチド、３’末端から５番目の位置にロックドヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、ＡＳＯは、参照配列に関して１つまたは複数の置換、挿入および／または付加、欠失、ならびに共有修飾を含んでもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、１つまたは複数の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リシンおよびアルギニン残基のメチル化、アセチル化、ならびにチオール基およびチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つまたは複数の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定された１００を超える異なるヌクレオシド修飾のいずれかなどの、任意の転写後修飾であってもよい（Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197）。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間連結など（例えば、連結ホスフェート／ホスホジエステル連結／ホスホジエステル骨格）への任意の有用な修飾を含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、修飾核酸塩基、修飾ヌクレオシド、またはその組合せを含んでもよい。
一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、およびＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンから選択される。一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、２－アミノプロピルアデニン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－Ｎ－メチルグアニン、６－Ｎ－メチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－リボシルウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、８－アザおよび他の８－置換プリン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、５－ハロウラシル、および５－ハロシトシン、７－メチルグアニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、６－Ｎ－ベンゾイルアデニン、２－Ｎ－イソブチリルグアニン、４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、雑多な塩基、サイズ拡大塩基、およびフッ素化塩基から選択される。さらなる修飾核酸塩基としては、１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン、１，３－ジアザフェノチアジン－２－オンおよび９－（２－アミノエトキシ）－１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン（Ｇクランプ）などの三環式ピリミジンが挙げられる。修飾核酸塩基としては、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジンおよび２－ピリドンで置き換えられたものも挙げられる。
一部のさらなる実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、および４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチドは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。
さらなる核酸塩基としては、Ｍｅｒｉｇａｎらの米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859；Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613；Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications , Crooke, S.T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288に開示されたもの；ならびにChapters 6 and 15, Antisense Drug Technology, Crooke S.T., Ed., CRC Press, 2008, 163-166 and 442-443に開示されたものが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２個の核酸塩基を有する双頭ヌクレオシドを含む。そのような化合物は、Sorinas et al, J. Org. Chem, 2014 79: 8020-8030に詳細に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるＡＳＯは、１つまたは複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸に相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。一部の実施形態では、それぞれのシトシンは、５－メチルシトシンである。
一部の実施形態では、ＡＳＯのピリミジン核酸塩基の１つまたは複数の原子を、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいチオール、置換されていてもよいアルキル（例えば、メチルもしくはエチル）、またはハロ（例えば、クロロもしくはフルオロ）で置き換えるか、または置換してもよい。一部の実施形態では、修飾（例えば、１つまたは複数の修飾）は、糖およびヌクレオシド間連結のそれぞれに存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドへの修飾であってもよい。さらなる修飾は、本明細書に記載される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。一部の実施形態では、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、本明細書に記載のヌクレオチドの免疫原性を低減させることができる。
一部の実施形態では、修飾は、化学的または細胞誘導性修飾を含んでもよい。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾の一部の非限定例は、Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18:202-210からのLewis and Panの「RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions」によって記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチドに対する化学的修飾は、免疫回避を増強し得る。本明細書に記載のＡＳＯを、参照により本明細書に組み込まれる「Current protocols in nucleic acid chemistry」、 Beaucage, S.L., et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のものなどの、当業界でよく確立された方法によって合成および／または修飾することができる。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化（モノ－、ジ－およびトリ－）、コンジュゲーション、逆方向連結など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆方向連結など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、脱安定化塩基、もしくはパートナーの拡大レパートリーと塩基対形成する塩基との置き換え）、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲート化塩基が挙げられる。修飾ヌクレオチド塩基としては、５－メチルシチジンおよびシュードウリジンも挙げられる。一部の実施形態では、塩基修飾は、いくつかの機能的効果の例を挙げると、本明細書に記載のヌクレオチドの発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化をモジュレートし得る。一部の実施形態では、修飾は、双直交ヌクレオチド、例えば、非天然塩基を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれるKimoto et al, Chem Commun (Camb), 2017, 53:12309, DOI: 10.1039/c7cc06661aを参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書において記載される糖修飾（例えば、２’位置または４’位置での）または１つもしくは複数のヌクレオチドの糖の置換、ならびに骨格修飾は、ホスホジエステル連結の修飾または置換を含み得る。本明細書において記載されるヌクレオチドの特定の例としては、限定されるものではないが、修飾骨格またはホスホジエステル連結の修飾もしくは置換を含む、ヌクレオシド間修飾など、非天然のヌクレオシド間連結を含む、本明細書において記載されるヌクレオチドを含む。修飾骨格を有するＡＳＯは、中でも、骨格にリン原子を持たないものを含む。本出願の目的として、および当技術分野で時々参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格においてリン原子を持たない修飾ヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施形態では、ＡＳＯは、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有するヌクレオチドを含むであろう。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＳＯは、１つまたは複数の、（Ａ）修飾ヌクレオシドおよび（Ｂ）修飾ヌクレオシド間連結を含んでもよい。
（Ａ）修飾ヌクレオシド
修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分、修飾核酸塩基、または修飾糖部分と修飾核酸塩基との両方を含む。
１．ある特定の修飾糖部分
ある特定の実施形態では、糖部分は、非二環式修飾フラノシル糖部分である。一部の実施形態では、修飾糖部分は、二環式または三環式フラノシル糖部分である。一部の実施形態では、修飾糖部分は、糖代用物である。そのような糖代用物は、他の型の修飾糖部分のものと対応する１つまたは複数の置換を含んでもよい。
例えば、一部の実施形態では、修飾糖部分は、限定されるものではないが、２’、３’、４’、および／または５’位置での置換基を含む、１つまたは複数の非環式置換基を含む非二環式修飾フラノシル糖部分である。一部の実施形態では、フラノシル糖部分は、リボシル糖部分である。一部の実施形態では、フラノシル糖部分は、β－Ｄ－リボフラノシル糖部分である。一部の実施形態では、非二環式修飾糖部分の１つまたは複数の非環式置換基は分枝状である。
非二環式修飾糖部分にとって好適な２’－置換基の例としては、限定されるものではないが、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３（「２’－ＯＭｅ」または「２’－Ｏ－メチル」）、および２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３（「２’－ＭＯＥ」）が挙げられる。ある特定の実施形態では、２’－置換基は、ハロ、アリル、アミノ、アジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０置換アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０置換アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ（Ｒｍ）－アルキル、Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ（Ｒｍ）－アルケニル、Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ（Ｒｍ）－アルキニル、Ｏ－アルキレニル－Ｏ－アルキル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、Ｏ－アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）またはＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（式中、ＲｍおよびＲｎはそれぞれ独立に、Ｈ、アミノ保護基、または置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、ならびにＣｏｏｋらの米国特許第６，５３１，５８４号、Ｃｏｏｋらの米国特許第５，８５９，２２１号およびＣｏｏｋらの米国特許第６，００５，０８７号に記載された２’－置換基である）から選択される。これらの２’－置換基のある特定の実施形態を、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２）、チオール、チオアルコキシ、チオアルキル、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから独立に選択される１つまたは複数の置換基でさらに置換することができる。３’－置換基の例としては、３’－メチルが挙げられる（Frier, et al., The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA:RNA duplexes. Nucleic Acids Res., 25, 4429-4443, 1997を参照されたい）。非二環式修飾糖部分にとって好適な４’－置換基の例としては、限定されるものではないが、アルコキシ（例えば、メトキシ）、アルキル、およびＭａｎｏｈａｒａｎらのＷＯ２０１５／１０６１２８に記載されたものが挙げられる。非二環式修飾糖部分にとって好適な５’－置換基の例としては、限定されるものではないが、５’－メチル（ＲまたはＳ）、５’－アリル、５’－エチル、５’－ビニル、および５’－メトキシが挙げられる。ある特定の実施形態では、非二環式修飾糖は、１より多い非架橋性糖置換基、例えば、２’－Ｆ－５’－メチル糖部分ならびにＭｉｇａｗａらのＷＯ２００８／１０１１５７およびＲａｊｅｅｖらのＵＳ２０１３／０２０３８３６に記載された修飾糖部分および修飾ヌクレオシドを含む。２’，４’－ジフルオロ修飾糖部分は、Martinez-Montero, et al., Rigid 2', 4'-difluororibonucleosides: synthesis, conformational analysis, and incorporation into nascent RNA by HCV polymerase. J. Org. Chem., 2014, 79:5627-5635に記載されている。２’－修飾（ＯＭｅまたはＦ）および４’－修飾（ＯＭｅまたはＦ）を含む修飾糖部分は、Malek-Adamian, et al., J. Org. Chem, 2018, 83: 9839-9849にも記載されている。
ある特定の実施形態では、２’－置換ヌクレオシドまたは非二環式２’－修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、およびＮ－置換アセタミド（ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ））（式中、ＲｍおよびＲｎはそれぞれ独立に、Ｈ、アミノ保護基、または置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルである）から選択される非架橋性２’－置換基を含む糖部分を含む。
ある特定の実施形態では、２’－置換ヌクレオシドまたは非二環式２’－修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、およびＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｈ）ＣＨ３（「ＮＭＡ」）から選択される非架橋性２’－置換基を含む糖部分を含む。
ある特定の実施形態では、２’－置換ヌクレオシドまたは非二環式２’－修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＨ３、およびＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択される非架橋性２’－置換基を含む糖部分を含む。
ある特定の実施形態では、２’－デオキシリボースの４’Ｏを、Ｓで置換して、４’－チオＤＮＡを生成することができる（Takahashi, et al., Nucleic Acids Research 2009, 37: 1353-1362を参照されたい）。この修飾を、本明細書に詳述される他の修飾と組み合わせることができる。ある特定のそのような実施形態では、糖部分は、２’位置でさらに修飾される。ある特定の実施形態では、糖部分は、２’－フルオロを含む。この糖部分を有するチミジンは、Watts, et al., J. Org. Chem. 2006, 71(3): 921-925に記載されている（４’－Ｓ－フルオロ５－メチルアラウリジンまたはＦＡＭＵ）。
ある特定の修飾糖部分は、二環式糖部分をもたらす第２の環を形成する架橋性糖置換基を含む。例えば、一部の実施形態では、二環式糖部分は、４’と２’のフラノース環原子の間に架橋を含む。一部の実施形態では、フラノース環は、リボース環である。そのような４’から２’への架橋性糖置換基を含む糖部分の例としては、限定されるものではないが、４’－ＣＨ２－２’、４’－（ＣＨ２）２－２’、４’－（ＣＨ２）３－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’（「ＬＮＡ」）、４’－ＣＨ２－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（「ＥＮＡ」）、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（Ｓ立体配置にある場合、「拘束エチル」または「ｃＥｔ」と称される）、４’－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’、４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束ＭＯＥ」もしくは「ｃＭＯＥ」）およびそのアナログ（例えば、Ｓｅｔｈらの米国特許第７，３９９，８４５号、Ｂｈａｔらの米国特許第７，５６９，６８６号、Ｓｗａｙｚｅらの米国特許第７，７４１，４５７号、およびＳｗａｙｚｅらの米国特許第８，０２２，１９３号を参照されたい）、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’およびそのアナログ（例えば、Ｓｅｔｈら、米国特許第８，２７８，２８３号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’およびそのアナログ（例えば、Ｐｒａｋａｓｈらの米国特許第８，２７８，４２５号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、Ａｌｌｅｒｓｏｎら、米国特許第７，６９６，３４５号およびＡｌｌｅｒｓｏｎら、米国特許第８，１２４，７４５号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Zhou, et al, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照されたい）、および４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’およびそのアナログ（例えば、Ｓｅｔｈらの米国特許第８，２７８，４２６号を参照されたい）、４’－Ｃ（ＲａＲｂ）－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’、４’－Ｃ（ＲａＲｂ）－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’、および４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（Ｒ、Ｒａ、およびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、保護基、またはＣ１～Ｃ１２アルキルである）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）、４’－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（ＣＨ３）２－２’、４’－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ）２－２’、４’－Ｃ（＝Ｓ）－Ｎ（Ｒ）２－２’およびそのアナログ（例えば、Ｏｂｉｋａら、ＷＯ２０１１０５２４３６Ａ１、ＹｕｓｕｋｅのＷＯ２０１７０１８３６０Ａ１を参照されたい）を含む二環式糖が挙げられる。
ある特定の実施形態では、そのような４’から２’への架橋は独立に、－［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ－、－［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ－Ｏ－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ－、－Ｃ（＝ＮＲａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒａ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）ｘ－、および－Ｎ（Ｒａ）－（式中、ｘは０、１、または２であり、ｎは１、２、３、または４であり、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２～Ｃ１２アルケニル、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２～Ｃ１２アルキニル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、置換Ｃ５～Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５～Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５～Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）－Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ＝（Ｏ）２－Ｊ１）、またはスルホニル（Ｓ＝（Ｏ）－Ｊ１）であり、Ｊ１およびＪ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２～Ｃ１２アルケニル、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２～Ｃ１２アルキニル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、置換Ｃ５～Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）－Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１～Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アミノアルキル、または保護基である）から独立に選択される１から４へ連結された基を含む。
さらなる二環式糖部分は、当業界で公知であり、例えば、Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443、Albaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740、Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2017, 129, 8362-8379；Elayadi et al.,; Christiansen, et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 5458-5463；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第７，０５３，２０７号；Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第６，２６８，４９０号；Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第６，７７０，７４８号；Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第ＲＥ４４，７７９号；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第６，７９４，４９９号；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第６，６７０，４６１号；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第７，０３４，１３３号；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第８，０８０，６４４号；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第８，０３４，９０９号；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第８，１５３，３６５号；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第７，５７２，５８２号；およびＲａｍａｓａｍｙらの米国特許第６，５２５，１９１号；ＴｏｒｓｔｅｎらのＷＯ２００４／１０６３５６；ＷｅｎｇｅｌらのＷＯ１９９９／０１４２２６；ＳｅｔｈらのＷＯ２００７／１３４１８１；Ｓｅｔｈらの米国特許第７，５４７，６８４号；Ｓｅｔｈらの米国特許第７，６６６，８５４号；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，０８８，７４６号；Ｓｅｔｈらの米国特許第７，７５０，１３１号；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，０３０，４６７号；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，２６８，９８０号；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，５４６，５５６号；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，５３０，６４０号；Ｍｉｇａｗａらの米国特許第９，０１２，４２１号；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，５０１，８０５号；ならびにＡｌｌｅｒｓｏｎらの米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号およびＭｉｇａｗａらの米国特許出願公開第２０１５／０１９１７２７号を参照されたい。
一部の実施形態では、二環式糖部分およびそのような二環式糖部分を含むヌクレオシドは、異性体立体配置によってさらに定義される。例えば、ＵＮＡヌクレオシド（本明細書に記載される）は、以下のようなα－Ｕ立体配置またはβ－Ｄ立体配置にある：
Figure 2023522957000006
α－Ｕ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）またはα－Ｕ－ＵＮＡ二環式ヌクレオシドを、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド中に組み込んだ（Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372）。ここで、二環式ヌクレオシドの一般的記載は、両方の異性体立体配置を含む。特定の二環式ヌクレオシド（例えば、ＦＮＡ）の位置が本明細書における例示された実施形態において同定される場合、それらは、別途特定しない限り、β－Ｄ立体配置にある。
一部の実施形態では、修飾糖部分は、１つまたは複数の非架橋性糖置換基および１つまたは複数の架橋性糖置換基（例えば、５’－置換された、および４’－２’架橋された糖）を含む。
修飾フラノシル糖部分を含むヌクレオシドおよび修飾フラノシル糖部分を、ヌクレオシドの糖部分上の置換の位置によって言及することができる。「２’－修飾」などのフラノシル環の位置の後の用語「修飾」は、糖部分が２’位置に示された修飾を含み、さらなる修飾および／または置換基を含んでもよいことを示す。４’－２’架橋された糖部分は、２’－修飾および４’－修飾であるか、または、「２’，４’－修飾」であってもよい。「２’－置換」または「２’－４’－置換」などの、フラノシル環の位置の後の用語「置換」は、それがオリゴヌクレオチド中の非修飾糖部分に見出されるもの以外の置換基を有する位置のみであることを示す。したがって、以下の糖部分は、以下の式によって表される。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、非二環式の、修飾されたフラノシル糖部分を、式Ｉによって表す：
Figure 2023522957000007
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。Ｒ基の中で、少なくとも一つのＲ３－７は、Ｈではなく、および／または、少なくとも一つのＲ１およびＲ２は、ＨまたはＯＨではない。２’修飾されたフラノシル糖部分において、少なくとも一つのＲ１およびＲ２は、ＨまたはＯＨではなく、各Ｒ３－７は独立して、ＨまたはＨ以外の置換基から選択される。４’修飾フラノシル糖部分において、Ｒ５は、Ｈではなく、各Ｒ１－４、６、７は独立して、ＨおよびＨ以外の置換基から選択され、またその他のフラノシル環上の各位置も同様である。立体化学は、特に明記しない限り定義されない。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、非二環式の、修飾された、置換フラノシル糖部分は、式Ｉによって表され、式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は、独立して、各々ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。Ｒ基の中で、Ｒ３－７のいずれか一つ（そして、１つだけ）は、Ｈ以外の置換基であるか、または、Ｒ１またはＲ２のうちの１つはＨまたはＯＨ以外の置換基である。立体化学は、特に明記しない限り定義されない。非二環式の、修飾された、置換フラノシル糖部分の例としては、２’－置換リボシル、４’－置換リボシルおよび５’－置換リボシル糖部分、ならびに置換２’－デオキシフラノシル糖部分（例えば４’－置換２’－デオキシリボシルおよび５’－置換２’－デオキシリボシル糖部分）が挙げられる。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、２’－置換リボシル糖部分を、式ＩＩによって表す：
Figure 2023522957000008
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。Ｒ１は、ＨまたはＯＨ以外の置換基である。立体化学は、示すように定義される。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、４’－置換リボシル糖部分を、式ＩＩＩによって表す：
Figure 2023522957000009
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。Ｒ５は、Ｈ以外の置換基である。立体化学は、示すように定義される。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、５’－置換リボシル糖部分を、式ＩＶによって表す：
Figure 2023522957000010
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。Ｒ６またはＲ７は、Ｈ以外の置換基である。立体化学は、示すように定義される。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、２’－デオキシフラノシル糖部分を、式Ｖによって表す：
Figure 2023522957000011
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。各Ｒ１－５は、ＨおよびＨでない置換基から独立して選択される。Ｒ１－５の全てが各Ｈである場合、糖部分は、非置換２’－デオキシフラノシル糖部分である。立体化学は、特に明記しない限り定義されない。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、４’－置換２’－デオキシリボシル糖部分を、式ＶＩによって表す：
Figure 2023522957000012
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。Ｒ３は、Ｈ以外の置換基である。立体化学は、示すように定義される。
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、５’－置換２’－デオキシリボシル糖部分を、式ＶＩＩによって表す：
Figure 2023522957000013
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。Ｒ４またはＲ５は、Ｈ以外の置換基である。立体化学は、示すように定義される。
非置換の２’－デオキシフラノシル糖部分は、非修飾でもよく（β－Ｄ－２’－デオキシリボシル）または修飾されていてもよい。修飾された、非置換の２’－デオキシフラノシル糖部分の例としては、β－Ｅ－２’－デオキシリボシル、α－Ｌ－２’－デオキシリボシル、α－Ｄ－２’－デオキシリボシルおよびβ－Ｄ－キシロシル糖部分が挙げられる。例えば、ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、β－Ｌ－２’－デオキシリボシル糖部分を、式ＶＩＩＩによって表す：
Figure 2023522957000014
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１およびＬ２は各々、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基である。立体化学は、示すように定義される。α－Ｌ－リボシルヌクレオチドおよびβ－Ｄ－キシロシルヌクレオチドの合成は、Ｇａｕｂｅｒｔら、Ｔｅｔｅｈｅｄｒｏｎ ２００６，６２： ２２７８－２２９４によって記載されている。ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドのさらなる異性体は、Ｖｅｓｔｅｒら、”Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮａｓｅ Ｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ” Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００８，１８： ２２９６－２３００によって記載されている。
一部の実施形態では、修飾された糖部分は、糖代用物である。一部の実施形態では、糖部分の酸素原子は、例えば、硫黄、炭素または窒素原子で置換されている。一部の実施形態では、そのような修飾された糖部分はまた、本明細書において記載される架橋および／または非架橋の置換基を含む。例えば、ある特定の糖代用物は、４’－硫黄原子、並びに２’－位置（Ｂｈａｔら、ＵＳ７，８７５，７３３およびＢｈａｔら、ＵＳ７，９３９，６７７を参照）および／または５’－位置に置換を含む。一部の実施形態では、糖代用物は、５個以外の原子数を有する環を含む。一部の実施形態では、例えば、糖代用物は、６員のテトラヒドロピラン（「ＴＨＰ」）を含む。そのようなテトラヒドロピランは、さらに修飾されてもよく、または置換されてもよい。修飾されたテトラヒドロピランを含むヌクレオシドとしては、限定されないが、ヘキシトール核酸（「ＨＮＡ」）、アルトリトール核酸（「ＡＮＡ」）、マンニトール核酸（「ＭＮＡ」）（例えばＬｅｕｍａｎｎ，ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，１０，８４１－８５４を参照）、フルオロＨＮＡ（「Ｆ－ＨＮＡ」、例えばＳｗａｙｚｅら、ＵＳ８，０８８，９０４、Ｓｗａｙｚｅら、ＵＳ８，４４０，８０３、Ｓｗａｙｚｅら、ＵＳ８，７９６，４３７、およびＳｗａｙｚｅら、ＵＳ９，００５，９０６、Ｆ－ＨＮＡは、Ｆ－ＴＨＰまたは３’－フルオロテトラヒドロピランとも称される）、Ｆ－ＣｅＮＡおよび３’－ａｒａ－ＨＮＡ（以下の式を有し、式中、Ｌ１およびＬ２は、各々独立して、修飾されたＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残りに連結しているヌクレオシド間連結であるか、または、Ｌ１およびＬ２の１つが、修飾されたＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残りに連結しているヌクレオシド間連結であって、Ｌ１およびＬ２のもう一方が、Ｈ、ヒドロキシ保護基、連結されたコンジュゲート基、または５’もしくは３’末端基である）が挙げられる。
Figure 2023522957000015
さらなる糖代用物は、以下の式を有するＴＨＰ化合物を含み：
Figure 2023522957000016
式中、独立して、該修飾されたＴＨＰヌクレオシドの各々について、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、Ｔ３およびＴ４は、各々独立して、修飾されたＴＨＰヌクレオシドを残りのオリゴヌクレオチドに連結しているヌクレオシド間連結であるか、または、Ｔ３およびＴ４の１つが、修飾されたＴＨＰヌクレオシドを残りのオリゴヌクレオチドに連結しているヌクレオシド間連結であって、Ｔ３およびＴ４のもう一方が、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、または５’もしくは３’末端基であり、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、置換Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２－Ｃ６アルキニルであり、Ｒ１およびＲ２は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、およびＣＮから各々独立して選択され、式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２およびＪ３は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルである。
特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７がＨである、修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７の少なくとも一つが、Ｈ以外である。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７の少なくとも一つがメチルである。特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの一つがＦである、修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、Ｒ１がＦであり、Ｒ２がＨであり、また特定の実施形態では、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がＨであり、また特定の実施形態では、Ｒ１がメトキシエトキシであり、Ｒ２がＨである。
特定の実施形態では、糖代用物は、ヘテロ原子を有さない環を含む。例えば、ビシクロ［３．１．０］－ヘキサンを含むヌクレオシドが記載されている（例えば、Ｍａｒｑｕｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９：３７３９－３７４９を参照）。
一部の実施形態では、糖代用物は、ヘテロ原子を持たない環を含む。一部の実施形態では、糖代用物は、５個を超える原子および１個を超えるヘテロ原子を有する環を含む。例えば、モルホリノ糖部分を含むヌクレオシド、およびオリゴヌクレオチドでのそれらの使用は、報告されている（Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３－４５１０、およびＳｕｍｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．５，６９８，６８５、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．５，１６６，３１５、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．５，１８５，４４４、およびＳｕｍｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．５，０３４，５０６を参照）。本明細書で用いられる用語「モルホリノ」は以下の構造を含む糖代用物を意味する：
Figure 2023522957000017
一部の実施形態では、モルホリノは、例えば上記のモルホリノ構造において各種の置換基を付加または置換することによって修飾され得る。そのような糖代用物は、本明細書において、「修飾モルホリノ」と称される。特定の実施形態では、モルホリノ残基は、ヌクレオシド間連結を含む、完全なヌクレオチドを置き換え、以下で示される構造を有し、式中、Ｂｘは複素環塩基部分である。
Figure 2023522957000018
一部の実施形態では、糖代用物は、非環状部分を含む。そのような非環状糖代用物を含むヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、非環状ブチル核酸（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，１１，５８５３－５８６５を参照）、グリコール核酸（「ＧＮＡ」、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９：８５３７－８５４６を参照）、そして、Ｍａｎｏｈａｒａｎ他（ＷＯ２０１１／１３３８７６）に記載されるヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド。
修飾ヌクレオシドにおいて用いることができる多くの他の二環式および三環式の糖および糖代用物の環構造は、当技術分野において公知である。特定のそのような環構造は、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，７８： ９０５１－９０６３に記載されており、ｂｃＤＮＡおよびｔｃＤＮＡが含まれる。ｂｃＤＮＡおよびｔｃＤＮＡに対する修飾（例えば６’－フルオロ）も、記載されている（Ｄｏｇｏｖｉｃ ａｎｄ Ｕｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，７９： １２７１－１２７９）。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ模倣物である。「ＤＮＡ模倣物」または「ＲＮＡ模倣物」は、ＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシド以外のヌクレオシドを意味し、それは、核酸塩基が、環の範囲内の第２の炭素原子に結合する環の炭素原子に直接結合し、第２の炭素原子が、少なくとも１つの水素原子との結合を含み、核酸塩基および少なくとも１つの水素原子が、２つの炭素原子間の結合について、互いにトランスの関係である。
特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、下記の式によって表される構造を含み：
Figure 2023522957000019
式中、Ｂｘは、複素環塩基部分を表す。
特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、下記の式によって表される構造のうちの一つを含み：
Figure 2023522957000020
式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｂｘは複素環塩基部分を表す。
特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、糖代用物である。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、シクロヘキセニルまたはヘキシトール核酸である。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、本明細書において参照により組み込まれるＶｅｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮａｓｅ Ｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，” Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００８，１８： ２２９６－２３００の図１に記載されるものである。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣ヌクレオシドは、以下から選択される式を有する：
Figure 2023522957000021
式中Ｂｘは、複素環塩基部分であり、Ｌ１およびＬ２は、各々独立して、修飾されたＴＨＰヌクレオシドを残りのオリゴヌクレオチドに連結しているヌクレオシド間連結であるか、または、Ｌ１およびＬ２の１つが、修飾されたヌクレオシドを残りのオリゴヌクレオチドに連結しているヌクレオシド間連結であって、Ｌ１およびＬ２のもう一方が、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、または５’もしくは３’末端基である。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、α，β－拘束された核酸（ＣＡＮ）、２’，４’－炭素環式－ＬＮＡ、または２’，４’－炭素環式－ＥＮＡである。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、以下から選択される糖部分を有する：４’－Ｃ－ヒドロキシメチル－２’－デオキシリボシル、３’－Ｃ－ヒドロキシメチル－２’－デオキシリボシル、３’－Ｃ－ヒドロキシメチル－アラビノシル、３’－Ｃ－２’－Ｏ－アラビノシル、３’－Ｃ－メチレン－伸張－キシロシル、３’－Ｃ－２’－Ｏ－ピペラジノ－アラビノシル。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、以下から選択される糖部分を有する：２’－メチルリボシル、２’－Ｓ－メチルリボシル、２’－アミノリボシル、２’－ＮＨ（ＣＨ２）－リボシル、２’－ＮＨ（ＣＨ２）２－リボシル、２’－ＣＨ２－Ｆ－リボシル、２’－ＣＨＦ２－リボシル、２’－ＣＦ３－リボシル、２’＝ＣＦ２リボシル、２’－エチルリボシル、２’－アルケニルリボシル、２’－アルキニルリボシル、２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレンリボシル、２’－シアノアラビノシル、２’－クロロアラビノシル、２’－フルオロアラビノシル、２’－ブロモアラビノシル、２’－アジドアラビノシル、２’－メトキシアラビノシルおよび２’－アラビノシル。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、４’－メチル修飾デオキシフラノシル、４’－Ｆ－デオキシフラノシル、４’－ＯＭｅ－デオキシフラノシルから選択される糖部分を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、以下から選択される糖部分を有する：５’－メチル－２’－β－Ｄ－デオキシリボシル、５’－エチル－２’－β－Ｄ－デオキシリボシル、５’－アリル－２’－β－Ｄ－デオキシリボシル、２－フルオロ－β－Ｄ－アラビノフラノシル。特定の実施形態では、ＤＮＡ模倣物は、Ｂ型構造ヌクレオチドとしてＰＣＴ／ＵＳ００／２６７９２９の３２～３３ページに列挙され、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
２．修飾された核酸塩基
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、以下から選択される：５置換ピリミジン、６－アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、およびＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリン。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、以下から選択される：２－アミノプロピルアデニン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－Ｎ－メチルグアニン、６－Ｎ－メチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－リボシルウラシル（疑似ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロゲン、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、８－アザおよび他の８置換プリン、５－ハロゲン、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２Ｆアデニン、２－アミノアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、６－Ｎ－ベンゾイルアデニン、２－Ｎ－イソブチリルグアニン、４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、５－メチル－４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、５－メチル－４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、汎用塩基、疎水性塩基、無差別塩基、サイズ拡張した塩基、およびフッ化塩基。さらに修飾された核酸塩基には、三環系ピリミジン、例えば１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン、１，３－ジアザフェノチアジン－２ーオンおよび９－（２－アミノエトキシ）－１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン（Ｇ－ｃｌａｍｐ）が含まれる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他のヘテロ環、例えば７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジンおよび２－ピリドンで置換されたものも含まれ得る。さらなる核酸塩基としては、Ｍｅｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．３，６８７，８０８に記載されたもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８－８５９、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，２７３－２８８に記載されたもの、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｒｏｏｋｅ Ｓ．Ｔ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００８，１６３－１６６および４４２－４４３に記載されたものが含まれる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２つの核酸塩基を有する二頭型のヌクレオシドを含む。そのような化合物は、Ｓｏｒｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，２０１４ ７９： ８０２０－８０３０において詳述されている。
上記の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基のいずれかの調製を教示する刊行物としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：
ＭａｎｏｈａｒａｎらのＵＳ２００３／０１５８４０３、ＭａｎｏｈａｒａｎらのＵＳ２００３／０１７５９０６、ＤｉｎｈらのＵ．Ｓ．４，８４５，２０５、ＳｐｉｅｌｖｏｇｅｌらのＵ．Ｓ．５，１３０，３０２、ＲｏｇｅｒｓらのＵ．Ｓ．５，１３４，０６６、ＢｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒらのＵ．Ｓ．５，１７５，２７３、ＵｒｄｅａらのＵ．Ｓ．５，３６７，０６６、ＢｅｎｎｅｒらのＵ．Ｓ．５，４３２，２７２、ＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．５，４３４，２５７、ＧｍｅｉｎｅｒらのＵ．Ｓ．５，４５７，１８７、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，４５９，２５５、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，４８４，９０８、ＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．５，５０２，１７７、ＨａｗｋｉｎｓらのＵ．Ｓ．５，５２５，７１１、ＨａｒａｌａｍｂｉｄｉｓらのＵ．Ｓ．５，５５２，５４０、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，５８７，４６９、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，５９４，１２１、ＳｗｉｔｚｅｒらのＵ．Ｓ．５，５９６，０９１、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，６１４，６１７、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，６４５，９８５、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，６８１，９４１、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，８１１，５３４、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，７５０，６９２、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，９４８，９０３、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，５８７，４７０、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，４５７，１９１、ＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．５，７６３，５８８、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，８３０，６５３、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，８０８，０２７、Ｃｏｏｋらの６，１６６，１９９、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．６，００５，０９６。
ある特定の実施形態では、化合物は、１つまたは複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸に相補的な、修飾オリゴヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各シトシンは、５－メチルシトシンである。
本明細書において記載される修飾ヌクレオチドの骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルならびに３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートなどの他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートなどのホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’の連結である、反転した極性を有するものを含み得る。様々な塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、負または正荷電であり得る。
（Ｂ）修飾ヌクレオシド間連結
ある特定の実施形態では、ＡＳＯに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間連結（例えば、リン酸骨格）上で修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格の文脈では、語句「リン酸」および「ホスホジエステル」は、交換可能に使用される。骨格リン酸基は、１つまたは複数の酸素原子を、異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、本明細書において記載される別のヌクレオシド間連結による非修飾リン酸部分の大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホン酸アルキルまたはアリール、およびリン酸トリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、硫黄によって置換された両方の非連結酸素を有する。リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレン－リン酸）による連結酸素の置換によっても修飾され得る。ａ－チオ置換リン酸部分が提供され、非天然のホスホロチオエート骨格連結により、ＲＮＡおよびＤＮＡポリマーに安定性を与える。ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が増加し、続いて細胞環境における半減期が長い。本明細書において記載されるヌクレオチドに連結したホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子の弱い結合／活性化により、自然免疫応答を減少させると予測される。例えば、一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、アルファ－チオ－ヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－ウリジン、または５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－シュードウリジン）を含む。
本開示に従って用いられ得る他のヌクレオシド間連結は、リン原子を含有しないヌクレオシド間連結を含む。
一部の実施形態では、例えば細胞の取り込みを増強し、標的核酸に対する親和性を増強し、ヌクレアーゼが存在する場合には安定性を増加させるなどの望ましい特性を得るため、ホスホジエステルヌクレオシド間連結のみを有する化合物よりも、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド間連結を有するＡＳＯを選択する。
一部の実施形態では、化合物は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシド間連結を含む標的核酸に相補的な、修飾オリゴヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート結合である。一部の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
一部の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、いかなるヌクレオシド間連結を使用して、一緒に連結されてもよい。ヌクレオシド間連結の２つの主要なクラスは、リン原子の存在または不在によって規定される。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結には、非修飾ホスホジエステルヌクレオシド間連結、ＴＨＰリン酸トリエステルのような修飾リン酸トリエステルおよびイソプロピルリン酸トリエステル、例えばメチルホスホン酸エステル、イソプロピルホスホン酸エステル、イソブチルホスホン酸エステルおよびリン酸アセテートのようなホスホン酸エステル、ホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよびリンジチオエート（「ＨＳ－Ｐ＝Ｓ」））が含まれる。代表的な非リン含有ヌクレオシド間連結には、限定されないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２）、チオジエステル、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ）、シロキサン（－Ｏ－ＳｉＨ２－Ｏ）、ホルムアセタール、チオアセトアミド（ＴＡＮＡ）、ａｌｔ－チオホルムアセタール、グリシンアミド、およびＮ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３））が含まれる。修飾ヌクレオシド間連結を用いることで、天然に生じるホスフェート連結と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗を変化させ、典型的には増加させることができる。リン含有および非リン含有ヌクレオシド間連結の調製法は、当業者に周知である。
キラル中心を有する代表的なヌクレオシド間連結には、限定されないが、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートが含まれる。立体化学配置のランダムなヌクレオシド間連結を含む修飾ヌクレオチドの集団として、または特定の立体化学配置のホスホロチオエート連結を含む修飾ヌクレオチドの集団として、キラル中心を有するヌクレオシド間連結を含む修飾ヌクレオチドを調製することができる。一部の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の全てが立体化学的にランダムであるホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、結果として各ホスホロチオエート連結の立体化学配置のランダムな選択になる合成法を使用して、生じさせることができる。本明細書において記載されるすべてのホスホロチオエート連結は、特に明記しない限り、立体化学配置がランダムである。それにもかかわらず、当業者によって十分理解されるように、個々のオリゴヌクレオチド分子の個々のホスホロチオエートは、所定の立体配置を有する。
一部の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、特定の、独立して選択された立体化学配置の１つまたは複数の特定のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む修飾オリゴヌクレオチドについて富化される。一部の実施形態では、特定のホスホロチオエート連結の特定の立体配置は、集団の分子の少なくとも６５％で存在する。一部の実施形態では、特定のホスホロチオエート連結の特定の立体配置は、集団の分子の少なくとも７０％で存在する。一部の実施形態では、特定のホスホロチオエート連結の特定の立体配置は、集団の分子の少なくとも８０％で存在する。一部の実施形態では、特定のホスホロチオエート連結の特定の立体配置は、集団の分子の少なくとも９０％で存在する。一部の実施形態では、特定のホスホロチオエート連結の特定の立体配置は、集団の分子の少なくとも９９％で存在する。例えば、Ｏｋａ ｅｔ ａｌ，ＪＡＣＳ １２５，８３０７ （２００３），Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．４２，１３４５６ （２０１４）およびＷＯ ２０１７／０１５５５５に記載されている方法などの、公知技術の合成法を使用して、修飾オリゴヌクレオチドのそのようなキラル富化された集団を生じさせることができる。
一部の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、（Ｓｐ）立体配置の少なくとも一つの示されたホスホロチオエートを有する修飾ヌクレオチドが富化される。一部の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、（Ｒｐ）立体配置の少なくとも一つのホスホロチオエートを有する修飾オリゴヌクレオチドが富化される。ある特定の実施形態では、（Ｒｐ）および／または（Ｓｐ）ホスホロチオエートを含む修飾オリゴヌクレオチドは、それぞれ、以下の式の１つまたは複数を含み、式中、「Ｂ」は核酸塩基を示す：
Figure 2023522957000022
特に明記しない限り、本明細書において記載される修飾オリゴヌクレオチドのキラルヌクレオシド間連結は、ステレオランダムであり得、または特定の立体化学配置であり得る。
ある特定の実施形態では、核酸は、標準的な３’から５’への連結よりも、むしろ２’から５’への連結とすることができる。そのような連結は、本明細書において例示される：
Figure 2023522957000023
ヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの文脈において、非二環式の２’－連結修飾フラノシル糖部分を、式ＩＸによって表す：
Figure 2023522957000024
式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｌ１はヌクレオシド間連結、末端基、コンジュゲート基またはヒドロキシル基であり、Ｌ２はヌクレオシド間連結である。立体化学は、特に明記しない限り定義されない。
ある特定の実施形態では、ヌクレオシドは、近接する２’，３’－ホスホジエステル結合によって連結することができる。そのようなある特定の実施形態では、ヌクレオシドは、セロフラノシル（ｔｈｒｅｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ヌクレオシドである（ＴＮＡ；Ｂａｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１７，８２：５９１０－５９１６を参照）。ＴＮＡ連結を以下に示す：
Figure 2023522957000025
中性のヌクレオシド間連結としては、リン酸トリエステル、ホスホン酸エステル、ＭＭＩ （３’－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－５’）、アミド－３（３’－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－５’）、アミド－４（３’－ＣＨ２－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（＝Ｏ）－５’）、ホルムアセタール（３’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－５’）、メトキシプロピル、およびチオホルムアセタール（３’－Ｓ－ＣＨ２－Ｏ－５’）が挙げられるが、これに限定されない。さらに中性のヌクレオシド間連結には、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボネートエステル、カルボキサミド、スルフィド、スルホネートエステルおよびアミドを含む非イオン性連結が含まれる（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ； Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０； Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３ ａｎｄ ４，４０－６５を参照）。さらに中性のヌクレオシド間連結には、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合した構成部分を含む非イオン性連結が含まれる。さらなる修飾連結にはα，β－Ｄ－ＣＮＡタイプの連結および関連する高次構造的に拘束された連結が含まれ、以下に示す。そのような分子の合成は、過去に報告されている（Ｄｕｐｏｕｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２０１４，４５： ３６２３－３６２７、Ｂｏｒｓｔｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔａｈｅｄｒｏｎ，２００４，６０： １０９５５－１０９６６、Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，９： １９７５－１９７９、Ｄｕｐｏｕｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００８，１２８５－１２９４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１，６：ｅ２５５１０、Ｄｕｐｏｕｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００７，５２５６－５２６４、Ｂｏｉｓｓｏｎｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，３５： １５２８－１５３３を参照）。
Figure 2023522957000026
一部の実施形態では、ＡＳＯは、１つまたは複数の細胞障害性ヌクレオシドを含み得る。例えば、細胞障害性ヌクレオシドは、本明細書において記載される阻害ヌクレオチド、例えば二機能性修飾に組み込まれ得る。細胞障害性ヌクレオシドとしては、限定されるものではないが、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフールとウラシルの組合せ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、および６－メルカプトプリンが挙げられ得る。さらなる例としては、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、およびＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。
ＡＳＯは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、１つもしくは複数または全ての型のヌクレオチド（例えば、自然発生のヌクレオチド、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのいずれか１つもしくは複数または全て）は、本明細書において記載されるヌクレオチドにおいて、またはそれらの与えられた所定の配列領域において、均一に修飾されてもされなくてもよい。一部の実施形態では、ＡＳＯは、シュードウリジンを含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イノシンを含み、それは、免疫系において、ＡＳＯをウイルスＲＮＡに対する内因性として特徴付けることを助け得る。イノシンの組み込みは、ＡＳＯ安定性の改善／分解の減少も媒介し得る。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Yu, Z. et al. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as “self”. Cell Res. 25, 1283-1284を参照されたい。
一部の実施形態では、ＡＳＯ（またはその所与の配列領域）の全てのヌクレオチドが修飾される。一部の実施形態では、修飾は、発現を増加させ得るｍ６Ａ；免疫応答を弱め得るイノシン；ＲＮＡの安定性を増加させ得るシュードウリジン、安定性を増加させ得るｍ５Ｃ；および細胞内移行（例えば、核局在）を補助する２，２，７－トリメチルグアノシンを含み得る。
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間連結（例えば、骨格構造）は、本明細書において記載されるヌクレオチドの様々な位置に存在し得る。当業者は、ヌクレオチド類似体または他の修飾が、本明細書において記載されるヌクレオチドの機能が実質的に減少されないように、本明細書において記載されるヌクレオチドの任意の位置に局在し得ることを理解するであろう。修飾は、非コード領域修飾であってもよい。本明細書において記載されるヌクレオチドは、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含量に関してか、または１つもしくは複数の型のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、ＵまたはＣのいずれか１つまたは複数に関して）または任意の間のパーセンテージの修飾ヌクレオチド（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、および９５％～１００％）を含み得る。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾糖を含む、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含む、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオシド連結を含む。そのような実施形態では、修飾、非修飾、および異なる修飾糖部分、核酸塩基、および／または修飾ヌクレオチドのヌクレオシド間連結は、パターンまたはモチーフを規定する。一部の実施形態では、糖部分、核酸塩基、およびヌクレオシド間連結のパターンまたはモチーフは、それぞれ互いに独立している。したがって、修飾ヌクレオチドは、その糖モチーフ、核酸塩基モチーフおよび／またはヌクレオシド間連結モチーフによって記載され得る（本明細書において使用される場合、核酸塩基モチーフは、核酸塩基の配列によらない核酸塩基への修飾を記載する）。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、規定のパターンまたはモチーフでオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って配置された修飾および／または非修飾核酸塩基を含む。一部の実施形態では、それぞれの核酸塩基は修飾されている。一部の実施形態では、核酸塩基はいずれも修飾されていない。一部の実施形態では、それぞれのプリンまたはそれぞれのピリミジンは修飾されている。一部の実施形態では、それぞれのアデニンは修飾されている。一部の実施形態では、それぞれのグアニンは修飾されている。一部の実施形態では、それぞれのチミンは修飾されている。一部の実施形態では、それぞれのウラシルは修飾されている。一部の実施形態では、それぞれのシトシンは修飾されている。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチド中のシトシン核酸塩基の一部または全部が、５－メチルシトシンである。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基のブロックを含む。一部の実施形態では、ブロックは、ヌクレオチドの３’末端にある。一部の実施形態では、ブロックは、ヌクレオチドの３’末端の３ヌクレオシド以内にある。一部の実施形態では、ブロックは、ヌクレオチドの５’末端にある。一部の実施形態では、ブロックは、ヌクレオチドの５’末端の３ヌクレオシド以内にある。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、規定のパターンまたはモチーフでヌクレオチドまたはその領域に沿って配置された修飾および／または非修飾ヌクレオシド間連結を含む。一部の実施形態では、それぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結（Ｐ＝Ｏ）である。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結（Ｐ＝Ｓ）である。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結およびホスホジエステルヌクレオシド間連結から独立に選択される。一部の実施形態では、それぞれのホスホチオエートヌクレオシド間連結は、立体ランダムホスホロチオエート、（Ｓｐ）ホスホロチオエート、および（Ｒｐ）ホスホロチオエートから独立に選択される。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドの中央領域内のヌクレオシド間連結は、全て修飾されている。一部の実施形態では、５’領域および３’領域中のヌクレオシド間連結の一部または全部は、非修飾ホスフェート連結である。一部の実施形態では、末端ヌクレオシド間連結は、修飾されている。一部の実施形態では、ヌクレオシド間連結モチーフは、５’領域および３’領域の少なくとも一方において少なくとも１個ホスホジエステルヌクレオシド間連結を含み、少なくとも１個のホスホジエステル連結は、末端ヌクレオシド間連結ではなく、残りのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、全てのホスホロチオエート連結が立体ランダムである。一部の実施形態では、５’領域および３’領域中の全てのホスホロチオエート連結は（Ｓｐ）ホスホロチオエートであり、中央領域は少なくとも１つのＳｐ．Ｓｐ、Ｒｐモチーフを含む。一部の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、そのようなヌクレオシド間連結モチーフを含む修飾オリゴヌクレオチドについて富化される。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、交互のヌクレオシド間連結モチーフを有する領域を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、均一に修飾されたヌクレオシド間連結の領域を含む。一部の実施形態では、ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、ヌクレオチドの全てのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、ヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルまたはホスフェートおよびホスホロチオエートから選択される。一部の実施形態では、ヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルまたはホスフェートおよびホスホロチオエートから選択され、少なくとも１個のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートである。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、１個以上のメチルホスホネート連結を含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、１つまたは２つのメチルホスホネート連結を除く全てのホスホロチオエート連結を含む連結モチーフを含む。一部の実施形態では、１個のメチルホスホネート連結は、ヌクレオチドの中央領域にある。
一部の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結およびホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を配置して、ヌクレアーゼ耐性を維持することが望ましい。一部の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数および位置ならびにホスホジエステルヌクレオシド間連結の数および位置を配置して、ヌクレアーゼ耐性を維持することが望ましい。一部の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減少させ、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増加させてもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を依然として維持しながら、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減少させ、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増加させてもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を保持しながら、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減少させることが望ましい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を保持しながら、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増加させることが望ましい。
一部の実施形態では、本明細書において記載される修飾（糖、核酸塩基、ヌクレオシド間連結）は、修飾ヌクレオチドに組み込まれる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、それらの修飾、モチーフ、および全長によって特徴付けられる。一部の実施形態では、そのようなパラメーターは、それぞれ互いに独立している。したがって、他に指定しない限り、修飾ヌクレオチドのそれぞれのヌクレオシド間連結は、修飾または非修飾であってもよく、糖部分の修飾パターンに続いても続かなくてもよい。同様に、そのような修飾ヌクレオチドは、糖修飾のパターンによらず、１つまたは複数の修飾核酸塩基を含み得る。さらに、ある特定の例では、修飾ヌクレオチドは、全長または範囲によって、および２つ以上の領域（例えば、特定の糖修飾を有するヌクレオシドの領域）の長さまたは長さ範囲によって記載され、そのような状況において、特定の範囲外にある全長を有するヌクレオチドをもたらすそれぞれの範囲について数を選択することができる。そのような状況では、両要素が満たされなければならない。
一部の実施形態では、本明細書に記載のオリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチド（修飾または非修飾）を含むか、またはそれらからなり、また任意に１つまたは複数のコンジュゲート基および／または末端基を含んでもよい。コンジュゲート基は、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに連結する、１つまたは複数のコンジュゲート部分およびコンジュゲートリンカーからなる。コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドの一方または両端部に、および／またはいかなる内部の位置に、付着され得る。一部の実施形態では、コンジュゲート基は、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドの２’－位置に付着される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの一方または両端部に付着されるコンジュゲート基は、末端基である。ある特定のそのような実施形態では、コンジュゲート基または末端基は、オリゴヌクレオチドの３’－および／または５’末端に付着される。特定のそのような実施形態では、コンジュゲート基（または末端基）は、オリゴヌクレオチドの３’末端で付着される。一部の実施形態では、コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドの３’末端の近くに付着される。一部の実施形態では、コンジュゲート基（または末端基）は、オリゴヌクレオチドの５’末端で付着される。一部の実施形態では、コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドの５’末端の近くに付着される。
末端基の例には、コンジュゲート基、キャッピング基、ホスフェート部分、保護基、修飾または非修飾ヌクレオシド、および独立して修飾されるかまたは非修飾の２以上のヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、１つまたは複数のコンジュゲート基に共有結合している。一部の実施形態では、コンジュゲート基は、付着されているヌクレオチドの１つまたは複数の特性、例えば限定されないが薬動力学、薬物動態、安定性、結合、吸収、生体内分布、細胞の分布、細胞の取り込み、電荷およびクリアランスを修飾する。一部の実施形態では、コンジュゲート基は、付着されているヌクレオチドに新規な特性、例えばオリゴヌクレオチドの検出を可能にするフルオロフォアまたはレポーター基を付与する。
コンジュゲート部分としては、インターカレーター、リポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、ビタミン部分、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸部分、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、フルオロフォアおよび色素が挙げられるが、これらに限定されない。
コンジュゲート部分は、コンジュゲートリンカーを介してヌクレオチドに付着される。特定のオリゴマー化合物において、コンジュゲートリンカーは、単一の化学結合である（すなわち、コンジュゲート部分は、単結合によるコンジュゲートリンカーを介してオリゴヌクレオチドに付着される）。一部の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、鎖状構造（例えばヒドロカルビル鎖）、または反復単位（例えばエチレングリコール、ヌクレオシドまたはアミノ酸単位）のオリゴマーを含む。
一部の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシルアミノから選択される１つまたは複数の基を含む。特定のそのような実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミドおよびエーテル基から選択される基を含む。一部の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキルおよびアミド基から選択される基を含む。一部の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含む。一部の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、少なくとも１つのリン部分を含む。一部の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、少なくとも１つのホスフェート基を含む。一部の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、少なくとも１つの中性連結基を含む。
一部の実施形態では、上記したコンジュゲートリンカーなどのコンジュゲートリンカーは二官能性連結部分であり、例えば、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物に付着しているコンジュゲート基に有用であることが、従来技術において公知であるものである。一般に、二官能性連結部分は、少なくとも２つの官能性基を含む。官能性基の１つは、オリゴマー化合物上の特定の部位に結合するために選択され、その他はコンジュゲート基と結合するために選択される。二官能性連結部分において使用する官能性基の例には、限定されないが、求核基と反応するための求電子試薬、および求電子基と反応するための求核試薬が含まれる。一部の実施形態では、二官能性連結部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択される１つまたは複数の基を含む。
第１のドメイン小分子
一部の実施形態では、本明細書において記載されている二機能性分子の第１のドメインは、標的ＲＮＡに特異的に結合する小分子である。一部の実施形態では、小分子は、表２からなる群から選択される。
一部の実施形態では、小分子は、１０００ダルトン以下の有機化合物である。一部の実施形態では、小分子は、９００ダルトン以下の有機化合物である。一部の実施形態では、小分子は、８００ダルトン以下の有機化合物である。一部の実施形態では、小分子は、７００ダルトン以下の有機化合物である。一部の実施形態では、小分子は、６００ダルトン以下の有機化合物である。一部の実施形態では、小分子は、５００ダルトン以下の有機化合物である。一部の実施形態では、小分子は、４００ダルトン以下の有機化合物である。
本明細書中で使用する場合、「小分子」という用語は、生物学的プロセスを制御し得る低分子量（＜９００ダルトン）の有機化合物を意味する。一部の実施形態では、小分子は、ヌクレオチド配列または構造に結合する。一部の実施形態では、小分子は、ＲＮＡ配列または構造に結合する一部の実施形態では、小分子は修飾核酸と結合する。一部の実施形態では、小分子は内因性核酸配列または構造と結合する。一部の実施形態では、小分子は外因性核酸配列または構造と結合する。一部の実施形態では、小分子は人工核酸配列と結合する。一部の実施形態では、小分子は、共有結合によって生体高分子と結合する。一部の実施形態では、小分子は、非共有結合によって生体高分子と結合する。一部の実施形態では、小分子は、不可逆的結合によって生体高分子と結合する。一部の実施形態では、小分子は、可逆的結合によって生体高分子と結合する。一部の実施形態では、小分子は直接に生体高分子と結合する。一部の実施形態では、小分子は間接的に生体高分子と結合する。
充分な特異性で標的配列に結合する小分子を設計および同定するために、ルーチン的な方法を用いることができる。一部の実施形態では、方法は、従来技術において公知のバイオインフォマティックス法を使用して、二次構造（例えば、１、２またはそれ以上のステムループ構造およびシュードノット）の領域を同定し、小分子によって標的とする領域を選択することを含む。
一部の実施形態では、本発明の方法を目的とした小分子は、標的ＲＮＡまたはＲＮＡ構造に特異的に結合でき、そして、特異的な結合が要求される条件下で、例えば、インビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理学的条件下、またインビトロアッセイの場合、適当なストリンジェンシーのアッセイ条件下で、標的外のＲＮＡ配列への配列または構造の非特異的結合を回避するだけの充分な程度の特異性を有する。
一般に、小分子は、それらの標的への特異性を保持しなければならず、すなわち、標的以外の転写物に直接結合してはならず、または、直接著しく発現レベルに影響してはならない。
一部の実施形態では、小分子はヌクレオチドと結合する。一部の実施形態では、小分子はＲＮＡと結合する。一部の実施形態では、小分子は修飾核酸と結合する。一部の実施形態では、小分子は内因性核酸配列または構造と結合する。一部の実施形態では、小分子は外因性核酸配列または構造と結合する。一部の実施形態では、小分子は人工核酸配列と結合する。
一部の実施形態では、小分子は、共有結合によって標的ＲＮＡと特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、非共有結合によって標的ＲＮＡと特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、不可逆的な結合によって標的ＲＮＡ配列または構造と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、可逆的な結合によって標的ＲＮＡ配列または構造と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的ＲＮＡと特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、間接的に標的ＲＮＡ配列または構造と特異的に結合する。
一部の実施形態では、小分子は、核内ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡと特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、遺伝子のコード、デコード、調節および発現に関係するＲＮＡと特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、タンパク質合成、転写後修飾、ＤＮＡ複製、または細胞生理のいずれかの態様において役割を果たすＲＮＡと特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、制御ＲＮＡと特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、非コードＲＮＡと特異的に結合する。
一部の実施形態では、小分子は、ＲＮＡ配列または構造の特異的な領域と特異的に結合する。例えば、公知のＲＮＡ局在化モチーフ（すなわち、ＲＮＡが作用する標的核酸に対する相補的領域）を含む領域などの、特異的な機能性領域を標的とすることができる。代わりに、またはそれに加えて、例えば、異種の種（例えば霊長類（例えば、ヒト）および齧歯動物（例えば、マウス））からの配列をアラインメントし、同一性の程度が高い領域を探索することによって同定される領域などの高度に保全された領域を標的とすることができる。
Figure 2023522957000027
Figure 2023522957000028
Figure 2023522957000029
Figure 2023522957000030
標的ＲＮＡ
一部の実施形態では、標的リボ核酸配列または構造を含む標的リボヌクレオチドは、核内ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡである。一部の実施形態では、核内ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、転写されたＲＮＡ、新生ＲＮＡ、染色体富化ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、膜富化ＲＮＡまたはミトコンドリアＲＮＡである。一部の実施形態では、標的リボ核酸領域はイントロンである。一部の実施形態では、標的リボ核酸領域はエキソンである。一部の実施形態では、標的リボ核酸領域は非翻訳領域である。一部の実施形態では、標的リボ核酸は、タンパク質に翻訳される領域である。一部の実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ上の翻訳または非翻訳領域である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ分子の細胞内局在は、核、ゴルジ、小胞体、空胞、リソソーム、およびミトコンドリアからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ配列または構造は、標的ＲＮＡ分子のイントロン、エクソン、５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲに位置する。
一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドは、遺伝子のコード、非コード、調節および発現に関係するＲＮＡである。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドは、遺伝子のタンパク質合成、転写後修飾またはＤＮＡ複製において役割を果たすＲＮＡである。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドは制御ＲＮＡである。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドは非コードＲＮＡである。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、すべてのイントロンおよびエキソンを含む、標的リボヌクレオチドの全長ＲＮＡ配列から選択される。
ＡＳＯまたは小分子に結合する領域は、標的リボヌクレオチドの領域とすることができる。標的リボヌクレオチドの領域は、各種の特徴を含むことができる。ＡＳＯまたは小分子はその次に、この標的リボヌクレオチドの領域に結合することができる。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下の基準に基づいて選択される：（ｉ）ＳＮＰ頻度、（ｉｉ）長さ、（ｉｉｉ）隣接するシトシンの欠如、（ｉｖ）隣接する同一のヌクレオチドの欠如、（ｖ）ＧＣ含量、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、（ｖｉｉ）タンパク質結合能力の無さ、および（ｖｉｉｉ）二次構造スコア。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域は、上記の基準の少なくとも２つ以上を含む。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域は、上記の基準の少なくとも３つ以上を含む。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域は、上記の基準の少なくとも４つ以上を含む。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域は、上記の基準の少なくとも５つ以上を含む。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域は、上記の基準の少なくとも６つ以上を含む。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域は、上記の基準の少なくとも７つ以上を含む。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域は、上記の基準の少なくとも８つ以上を含む。本明細書中で使用する場合、「トランスクリプトーム」という用語は、特異的な細胞のすべてのＲＮＡ分子（転写物）のセットまたは細胞の特異的な集団を意味する。一部の実施形態では、それはすべてのＲＮＡを指す。一部の実施形態では、それはｍＲＮＡだけを指す。一部の実施形態では、それは分子同一性に加えて各ＲＮＡ分子の含量または濃度を含む。
一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、５％未満のＳＮＰ頻度を有する。本明細書において、用語「単一ヌクレオチド多型性」または「ＳＮＰ」は、ゲノムの特異的な位置で発生する単一のヌクレオチドの置換を指し、各変異は、集団の１％超のレベルで存在するものである。一部の実施形態では、ＳＮＰは、遺伝子（遺伝子の非コード領域）のまたは遺伝子間領域のコーディング配列に入る。一部の実施形態では、翻訳領域のＳＮＰはシノニムＳＮＰまたは非シノニムＳＮＰであり、シノニムＳＮＰはタンパク質配列に影響を及ぼさない一方で、非シノニムＳＮＰはタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。一部の実施形態では、非シノニムＳＮＰは、ミスセンスまたはナンセンスである。一部の実施形態では、タンパク質コード領域内ではないＳＮＰはＲＮＡ翻訳に影響する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、４％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、３％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、２％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．９％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．８％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．７％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．６％未満のＳＮＰ頻度を有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．５％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．４％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．３％未満のＳＮＰ頻度を有し、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．２％未満のＳＮＰ頻度を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、０．１％未満のＳＮＰ頻度を有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、４０％～７０％のＧＣ含量を含む配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、３０％～６０％のＧＣ含量を含む配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、４０％～６０％のＧＣ含量を含む配列を有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、９～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１０～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１１～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１３～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１４～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１５～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１６～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１７～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１８～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１９～３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、２０～３０ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、９～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１０～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１１～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１３～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１４～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１５～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１６～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１７～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１８～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１９～２９ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、２０～２９ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２８ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２７ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２６ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２５ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２４ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２３ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２２ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２１ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、８～２０ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１０～２８ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１１～２８ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２８ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１３～２８ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１４～２８ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１５～２８ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２７ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２６ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２５ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２４ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２３ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２２ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２１ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、１２～２０ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、ヒトトランスクリプトームと比較して標的リボヌクレオチドに独特の配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、少なくとも３つの隣接するシトシンを欠いている配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、少なくとも４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、４つの隣接する同一のグアニンを欠いている配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、４つの隣接する同一のアデニンを欠いている配列を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、４つの隣接する同一のウラシルを欠いている配列を有する。
一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、タンパク質と結合するか、または結合しない。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、ＲＮＡ結合タンパク質のＲＮＡ認識のモチーフ、二重鎖ＲＮＡ結合のモチーフ、ＫホモロジードメインまたはＺｎフィンガーとの結合に適している配列のモチーフまたは構造のモチーフを含むか、または含まない。非限定的な例として、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、各々の全内容を参照によって本明細書に組み込むＰａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９，５１１ （２０１８）およびＤｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ７０，８５４－８６７ （２０１８）に列挙される配列モチーフまたは構造モチーフを有するか、または有さない。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、タンパク質結合部位を含むかまたは含まない。タンパク質結合部位の例としては、限定されないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、および他のあらゆるＲＮＡ結合タンパク質、などのタンパク質結合部位が挙げられる。
一部の実施形態では、小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、二次構造を有する。一部の実施形態では、ＡＳＯが特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、限られた二次構造を有する。一部の実施形態では、小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、ユニークな二次構造を有する。一部の実施形態では、標的リボヌクレオチドの領域の二次構造は、ＲＮＡ構造予測ソフトウェア、例えばＣｅｎｔｒｏｉｄＦｏｌｄ、ＣｅｎｔｒｏｉｄＨｏｍｆｏｌｄ、背景Ｆｏｌｄ、ＣＯＮＴＲＡｆｏｌｄ、Ｃｒｕｍｐｌｅ、ＣｙｌｏＦｏｌｄ、ＧＴＦｏｌｄ、ＩＰｋｎｏｔ、ＫｉｎｅＦｏｌｄ、Ｍｆｏｌｄ、ｐＫｉｓｓ、Ｐｋｎｏｔｓ、ＰｋｎｏｔｓＲＧ、ＲＮＡ１２３、ＲＮＡｆｏｌｄ、ＲＮＡｓｈａｐｅｓ、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＳＡＲＮＡ－Ｐｒｅｄｉｃｔ、Ｓｆｏｌｄ、Ｓｌｉｄｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ＆Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ＳＰＯＴ－ＲＮＡ、ＳｗｉＳｐｏｔ、ＵＮＡＦｏｌｄ、およびｖｓｆｏｌｄ／ｖｓ ｓｕｂｏｐｔなどによって予測される。
一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下の少なくとも２つ以上を有する：
（ｉ）５％未満のＳＮＰ頻度、（ｉｉ）８～３０ヌクレオチド長、（ｉｉｉ）３つの隣接するシトシンを欠いている配列、（ｉｖ）４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列、（ｖ）３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、および（ｖｉｉ）タンパク質結合なし。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下の少なくとも３つ以上を有する：
（ｉ）５％未満のＳＮＰ頻度、（ｉｉ）８～３０ヌクレオチド長、（ｉｉｉ）３つの隣接するシトシンを欠いている配列、（ｉｖ）４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列、（ｖ）３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、および（ｖｉｉ）タンパク質結合なし。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下の少なくとも４つ以上を有する：
（ｉ）５％未満のＳＮＰ頻度、（ｉｉ）８～３０ヌクレオチド長、（ｉｉｉ）３つの隣接するシトシンを欠いている配列、（ｉｖ）４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列、（ｖ）３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、および（ｖｉｉ）タンパク質結合なし。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下の少なくとも５つ以上を有する：
（ｉ）５％未満のＳＮＰ頻度、（ｉｉ）８～３０ヌクレオチド長、（ｉｉｉ）３つの隣接するシトシンを欠いている配列、（ｉｖ）４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列、（ｖ）３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、および（ｖｉｉ）タンパク質結合なし。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下の少なくとも６つ以上を有する：
（ｉ）５％未満のＳＮＰ頻度、（ｉｉ）８～３０ヌクレオチド長、（ｉｉｉ）３つの隣接するシトシンを欠いている配列、（ｉｖ）４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列、（ｖ）３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、および（ｖｉｉ）タンパク質結合なし。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下の少なくとも７つ以上を有する：
（ｉ）５％未満のＳＮＰ頻度、（ｉｉ）８～３０ヌクレオチド長、（ｉｉｉ）３つの隣接するシトシンを欠いている配列、（ｉｖ）４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列、（ｖ）３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、および（ｖｉｉ）タンパク質結合なし。一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子が特異的に結合する標的リボヌクレオチドの領域は、以下を有する：
（ｉ）５％未満のＳＮＰ頻度、（ｉｉ）８～３０ヌクレオチド長、（ｉｉｉ）３つの隣接するシトシンを欠いている配列、（ｉｖ）４つの隣接する同一のヌクレオチドを欠いている配列、（ｖ）３０％～７０％のＧＣ含量を含む配列、（ｖｉ）ヒトトランスクリプトームと比較した標的リボヌクレオチドに独特の配列、および（ｖｉｉ）タンパク質結合なし。
一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子は、ＲＮＡ配列の特異的な領域を標的とするよう設計することができる。例えば、公知のＲＮＡ局在化モチーフ（すなわち、ＲＮＡが作用する標的核酸に対する相補的領域）を含む領域などの、特異的な機能性領域を標的とすることができる。代わりに、またはそれに加えて、例えば、異種の種（例えば霊長類（例えば、ヒト）および齧歯動物（例えば、マウス））からの配列をアラインメントし、同一性の程度が高い領域を探索することによって同定される領域などの高度に保全された領域を標的とすることができる。例えば、パーセント同一性は、基本的なローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）を、デフォルトパラメータで用いて、ルーチン的に決定することができる。
一部の実施形態では、二機能性分子は、本明細書において記載される標的ＲＮＡと結合し、第２のドメインで標的ポリペプチドまたはタンパク質と結合することによって、標的ポリペプチドまたは標的タンパク質（例えば、エフェクター）を動員する。あるいは、一部の実施形態では、ＡＳＯまたは小分子は、二機能性分子の第２のドメイン（例えば、エフェクターリクルーター）と標的ポリペプチドまたは標的タンパク質（例えば、エフェクター）との間の相互作用によって標的部位に動員される標的ポリペプチドまたはタンパク質を経由して、標的ＲＮＡに対する結合を行うことによって、リボ核酸配列の翻訳を増加させる。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡまたはコードＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡまたは遺伝子は、Ｒｌｕｃ ＲＮＡを含む。
第２のドメイン
一部の実施形態では、本明細書において記載されている二機能性分子の第２のドメインは、標的タンパク質（例えば、エフェクター）と特異的に結合し、小分子またはアプタマーを含む。一部の実施形態では、第２のドメインは、標的ポリペプチドまたはタンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、第２のドメインは、標的タンパク質上の活性部位、アロステリック部位、または不活性部位と結合する。一部の実施形態では、標的ポリペプチドまたはタンパク質は、内因性である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、外因的に導入されたタンパク質または融合タンパク質である。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは外因性である。一部の実施形態では、標的ポリペプチドは、融合タンパク質または組換えタンパク質である。
第２のドメイン小分子
一部の実施形態では、第２のドメインは小分子である。
充分な特異性で標的タンパク質に結合する小分子を設計するために、ルーチン的な方法を用いることができる。一部の実施形態では、本発明の方法を目的とした小分子は、配列を標的タンパク質に特異的に結合して所望の効果を生じさせる（例えば、リボ核酸配列の翻訳を増加させる）ことができ、そして、特異的な結合が要求される条件下で、例えば、インビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理学的条件下、またインビトロアッセイの場合、適当なストリンジェンシーのアッセイ条件下で、標的外のタンパク質への配列の非特異的結合を回避するだけの充分な程度の特異性を有する。
一部の実施形態では、小分子はエフェクターと結合する。一部の実施形態では、小分子はタンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、小分子は内因性タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、小分子は外因性タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、小分子は組換えタンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、小分子は人工タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、小分子は融合タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、小分子は酵素と結合する。一部の実施形態では、小分子は足場タンパク質と結合する。一部の実施形態では、小分子は制御タンパク質と結合する。一部の実施形態では、小分子は受容体と結合する。一部の実施形態では、小分子はシグナル伝達タンパク質またはペプチドと結合する。一部の実施形態では、小分子は、翻訳因子と結合する。一部の実施形態では、小分子は、翻訳制御因子またはメディエーターと結合する。一部の実施形態では、小分子は、翻訳因子、翻訳制御因子、または翻訳メディエーターを動員するタンパク質と結合する。
一部の実施形態では、小分子は、共有結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、非共有結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、不可逆的な結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、可逆的な結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的タンパク質の側鎖との相互作用により、標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的タンパク質のＮ末端との相互作用により、標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的タンパク質のＣ末端との相互作用により、標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的タンパク質またはポリペプチド上の活性部位、アロステリック部位、または不活性部位に特異的に結合する。
一部の実施形態では、小分子は、標的タンパク質配列の特異的な領域と特異的に結合する。例えば、特異的な機能領域を標的とすることができ、そのような領域としては、触媒ドメイン、キナーゼドメイン、タンパク－タンパク相互作用ドメイン、タンパク－ＤＮＡ相互作用ドメイン、タンパク－ＲＮＡ相互作用ドメイン、制御ドメイン、シグナルドメイン、核移行ドメイン、核外移行ドメイン、膜貫通ドメイン、グリコシル化部位、修飾部位またはリン酸化部位が挙げられる。代わりに、またはそれに加えて、例えば、異種の種（例えば霊長類（例えば、ヒト）および齧歯動物（例えば、マウス））からの配列をアラインメントし、同一性の程度が高い領域を探索することによって同定される領域などの高度に保全された領域を標的とすることができる。
本明細書において、用語「イブルチニブ」または「イムブルビカ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ）」は、Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）に永久に結合する、より具体的には、Ｂ細胞において重要であるＢＴＫタンパク質のＡＴＰ結合ポケットに結合する小分子薬剤を指す。一部の実施形態では、イブルチニブは、Ｂ細胞がん様のマントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病およびＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍのマクログロブリン血症の治療に用いられる。一部の実施形態では、第２のドメイン小分子は、イブルチニブの誘導体を含む。一部の実施形態では、第２のドメイン小分子は、イブルチニブ－ＭＰＥＡを含む、イブルチニブの誘導体を含む。
一部の実施形態では、第２のドメイン小分子は、ビオチンを含む。
アプタマー
一部の実施形態では、本明細書において記載されている二機能性分子の第２のドメインは、標的ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合するアプタマーである。
本明細書中で使用する場合、「アプタマー」という用語は、特異的な標的分子と結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子を意味する。一部の実施形態では、アプタマーは、標的タンパク質と結合する。
充分な特異性で標的タンパク質に結合するアプタマーを設計および選択するために、ルーチン的な方法を用いることができる。一部の実施形態では、本発明の方法を目的としたアプタマーは、標的タンパク質に結合して、該タンパク質（例えば、エフェクター）を動員する。動員されると、該タンパク質は、所望の効果を生じさせるか、または該タンパク質は別のタンパク質またはタンパク質複合体を動員して所望の効果を生じさせ（例えば、リボ核酸配列を翻訳させ）、そして、特異的な結合が要求される条件下で、例えば、インビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理学的条件下、またインビトロアッセイの場合、適当なストリンジェンシーのアッセイ条件下で、標的外のタンパク質への配列の非特異的結合を回避するだけの充分な程度の特異性を有する。
一部の実施形態では、アプタマーはタンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは内因性タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは外因性タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは組換えタンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは人工タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは融合タンパク質またはポリペプチドと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは酵素と結合する。一部の実施形態では、アプタマーは足場タンパク質と結合する。一部の実施形態では、アプタマーは制御タンパク質と結合する。一部の実施形態では、アプタマーは受容体と結合する。一部の実施形態では、アプタマーはシグナル伝達タンパク質またはペプチドと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは翻訳因子と結合する。一部の実施形態では、アプタマーは翻訳制御因子またはメディエーターと結合する。一部の実施形態では、アプタマーは翻訳因子、翻訳制御因子または翻訳メディエーターを動員するタンパク質と結合する。
一部の実施形態では、アプタマーは、共有結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、非共有結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、不可逆的な結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、可逆的な結合によって標的タンパク質と特異的に結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、標的ポリペプチドまたはタンパク質上の活性部位、アロステリック部位、または不活性部位と特異的に結合する。
一部の実施形態では、アプタマーは、標的タンパク質配列の特異的な領域と特異的に結合する。例えば、特異的な機能領域を標的とすることができ、そのような領域としては、触媒ドメイン、キナーゼドメイン、タンパク－タンパク相互作用ドメイン、タンパク－ＤＮＡ相互作用ドメイン、タンパク－ＲＮＡ相互作用ドメイン、制御ドメイン、シグナルドメイン、核移行ドメイン、核外移行ドメイン、膜貫通ドメイン、グリコシル化部位、修飾部位またはリン酸化部位が挙げられる。代わりに、またはそれに加えて、例えば、異種の種（例えば霊長類（例えば、ヒト）および齧歯動物（例えば、マウス））からの配列をアラインメントし、同一性の程度が高い領域を探索することによって同定される領域などの高度に保全された領域を標的とすることができる。
一部の実施形態では、アプタマーは、標的部位に動員された後の標的タンパク質と、本明細書において記載される二機能性分子の第１のドメインとの間の相互作用によって結合することによって、タンパク質の活性または機能（例えばリボ核酸配列の翻訳）を増加させる。あるいは、アプタマーは、標的タンパク質と結合し、本明細書において記載される二機能性分子を動員し、それによって、第１のドメインが標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合することを可能にする。
一部の実施形態では、第２のドメインは、ＢＴＫに結合するアプタマーを含む。一部の実施形態では、第２のドメインは、ＢＴＫに対して阻害するアプタマーを含む。
特定のコンジュゲートされた化合物
Ａ．特定のコンジュゲート基
ある特定の実施形態では、小分子またはオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のコンジュゲート基に共有結合している。ある特定の実施形態では、コンジュゲート基は、付着されている小分子またはオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の特性、例えば限定されないが薬動力学、薬物動態、安定性、結合、吸収、生体内分布、細胞の分布、細胞の取り込み、電荷およびクリアランス、を修飾する。ある特定の実施形態では、コンジュゲート基は、付着されている小分子またはオリゴヌクレオチドに新規な特性（例えば、小分子またはオリゴヌクレオチドの検出を可能にするフルオロフォアまたはレポーター基）を付与する。
特定のコンジュゲート基およびコンジュゲート部分は、例えば以下のとおり記載されている：
コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３－１０６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシルＳ－トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６－３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９３，３，２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３－５３８）、例えば、脂肪族鎖のドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１－１１１８； Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３ ，７５，４９－５４）、リン脂質（例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセリンまたはトリエチルアンモニウム－１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７－３７８３）、ポリアミン、または、ポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ他、ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓおよびＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９－２３７）、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９６、ｉ、９２３－９３７）トコフェロール基（Ｎｉｓｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１５，４，ｅ２２０； ｄｏｉ： ｌ０．ｌ０３８／ｍｔｎａ．２０ｌ４．７２およびＮｉｓｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８，１６，７３４－７４０）または、ＧａｌＮＡｃクラスター（例えば、ＷＯ２０１４／１７９６２０）。
１．コンジュゲート部分
コンジュゲート部分としては、インターカレーター、リポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、ビタミン部分、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸部分、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、フルオロフォアおよび色素が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）－（＋）－プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５－トリヨード安息香酸、フィンゴリモド、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌薬または抗生物質などの活性薬剤物質を含む。
２．コンジュゲートリンカー
コンジュゲート部分は、コンジュゲートリンカーを介して小分子またはオリゴヌクレオチドに付着される。特定の小分子またはオリゴマー化合物において、コンジュゲートリンカーは、単一の化学結合である（すなわち、コンジュゲート部分は、単結合によるコンジュゲートリンカーを介して小分子またはオリゴヌクレオチドに付着される）。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、鎖状構造（例えばヒドロカルビル鎖）、または反復単位（例えばエチレングリコール、ヌクレオシドまたはアミノ酸単位）のオリゴマーを含む。
特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシルアミノから選択される１つまたは複数の基を含む。特定のそのような実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミドおよびエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキルおよびアミド基から選択される基を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、少なくとも一つのリン部分を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、少なくとも一つのホスフェート基を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、少なくとも一つの中性連結基を含む。
特定の実施形態では、上記したコンジュゲートリンカーなどのコンジュゲートリンカーは二官能性連結部分であり、例えば、小分子またはオリゴマー化合物（例えば本明細書において提供されるオリゴヌクレオチド）に付着しているコンジュゲート基に有用であることが、従来技術において公知であるものである。一般に、二官能性連結部分は、少なくとも２つの官能性基を含む。官能性基の１つは、オリゴマー化合物上の特定の部位に結合するために選択され、その他は、コンジュゲート基と結合するために選択される。二官能性連結部分において使用する官能性基の例には、限定されないが、求核基と反応するための求電子試薬、および求電子基と反応するための求核試薬が含まれる。特定の実施形態では、二官能性連結部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択される１つまたは複数の基を含む。
コンジュゲートリンカーの例としては、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）および６－アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）が含まれるが、これらに限定されない。他のコンジュゲートリンカーとしては、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ１０アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ１０アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ１０アルキニルが含まれるが、これらに限定されるものではなく、好適な置換基の非限定的なリストとしては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。
特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、１～１０個のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、そのようなリンカーヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、そのようなリンカーヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。特定の実施形態では、リンカーヌクレオシドは、非修飾である。特定の実施形態では、リンカーヌクレオシドは、プリン、置換プリン、ピリミジンまたは置換ピリミジンから選択される、任意に保護される複素環塩基を含む。特定の実施形態では、切断可能部分は、ウラシル、チミン、シトシン、４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、５－メチルシトシン、４－Ｎ－ベンゾイル－５－メチルシトシン、アデニン、６－Ｎ－ベンゾイルアデニン、グアニンおよび２－Ｎ－イソブチリルグアニンから選択されるヌクレオシドである。リンカーヌクレオシドは、それが標的組織に達した後、オリゴマー化合物から分離されることが典型的に望ましい。したがって、リンカーヌクレオシドは典型的には、互いに連結され、また切断可能結合を介してオリゴマー化合物の残りに連結される。特定の実施形態では、そのような切断可能結合はホスホジエステル結合である。
本明細書において、リンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの部分であるとは考慮されない。したがって、オリゴマー化合物が、指定された数または範囲の連結されたヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドを含む、および／または、参照核酸およびオリゴマー化合物に対する指定のパーセント相補性が、リンカーヌクレオシドを含むコンジュゲートリンカーを含むコンジュゲート基をも含む、実施形態においては、それらのリンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの長さとしてはカウントされず、参照核酸のオリゴヌクレオチドのパーセント相補性を測定する際には使われない。例えば、オリゴマー化合物は、（１）８～３０ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドと、（２）修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドに隣接する１～１０個のリンカーヌクレオシドを含むコンジュゲート基と、を含み得る。そのような化合物中の隣接する連結されたヌクレオシドの総数は、３０超である。あるいは、オリゴマー化合物は、８～３０ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、コンジュゲート基を含まなくてもよい。そのような化合物中の隣接する連結されたヌクレオシドの総数は、３０以下である。特に明記しない限り、コンジュゲートリンカーは、１０個以下のリンカーヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、５個以下のリンカーヌクレオシドを含む。
ある特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、３個以下のリンカーヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、２個以下のリンカーヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、１個以下のリンカーヌクレオシドを含む。
ある特定の実施形態では、コンジュゲート基は、小分子またはオリゴヌクレオチドから隔離されていることが望ましい。例えば、特定の状況では、特定のコンジュゲート部分を含む小分子またはオリゴマー化合物は、特定のタイプの細胞によってよりよく取り込まれるが、化合物が取り込まれた後に、コンジュゲート基が切断されて、非コンジュゲート型の小分子またはオリゴヌクレオチドが放出されるのが望ましい。したがって、特定のコンジュゲートは、典型的には、コンジュゲートリンカー内に、１つまたは複数の切断可能部分を含み得る。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、切断可能な結合である。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、少なくとも一つの切断可能結合を含む原子団である。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、１、２、３、４または４つ超の切断可能結合を有する原子団を含む。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、細胞または細胞内区画（例えばリソソーム）内で選択的に切断される。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、内因性酵素（例えばヌクレアーゼ）によって、選択的に切断される。
ある特定の実施形態では、切断可能結合は、以下から選択される：アミド、エステル、エーテル、リン酸ジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメートまたはジスルフィド。ある特定の実施形態では、切断可能結合は、リン酸ジエステルのエステルの一方または両方である。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、ホスフェートまたはリン酸ジエステルを含む。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分またはコンジュゲート基との間のホスフェートまたはホスホジエステル連結である。
ある特定の実施形態では、切断可能部分は、１つまたは複数のリンカーヌクレオシドを含むかまたはそれからなる。特定のそのような実施形態では、１つまたは複数のリンカーヌクレオシドは、互いに連結され、および／または、切断可能結合を介してオリゴマー化合物の残りに連結される。ある特定の実施形態では、そのような切断可能結合は、非修飾ホスホジエステル結合である。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結によってオリゴヌクレオチドの３’または５’末端ヌクレオシドに付着され、かつ、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結によってコンジュゲートリンカーまたはコンジュゲート部分の残りに共有結合で付着している、２’－デオキシフラノシルを含むヌクレオシドである。特定のそのような実施形態では、切断可能部分は、２’－β－Ｄ－デオキシリボシル糖部分を含むヌクレオシドである。特定のそのような実施形態では、切断可能部分は２’デオキシアデノシンである。
３．特定の細胞ターゲティングコンジュゲート部分
ある特定の実施形態では、コンジュゲート基は、細胞ターゲティングコンジュゲート部分を含む。ある特定の実施形態では、コンジュゲート基は、以下の一般式を有する：ある特定の実施形態では、コンジュゲート基は、以下の一般式を有する：
Figure 2023522957000031
式中、ｎは１～約３であり、ｎが１であるときｍは０であり、ｎが２以上であるときｍは１であり、ｊは１または０であり、ｋは１または０である。
ある特定の実施形態では、ｎは１であり、ｊは１であり、ｋは０である。ある特定の実施形態では、ｎは１であり、ｊは０であり、ｋは１である。ある特定の実施形態では、ｎは１であり、ｊは１であり、ｋは１である。ある特定の実施形態では、ｎは２であり、ｊは１であり、ｋは０である。ある特定の実施形態では、ｎは２であり、ｊは０であり、ｋは１である。ある特定の実施形態では、ｎは２であり、ｊは１であり、ｋは１である。ある特定の実施形態では、ｎは３であり、ｊは１であり、ｋは０である。ある特定の実施形態では、ｎは３であり、ｊは０であり、ｋは１である。ある特定の実施形態では、ｎは３であり、ｊは１であり、ｋは１である。
ある特定の実施形態では、コンジュゲート基は、少なくとも一つのテザーリガンド（ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｌｉｇａｎｄ）を有する細胞ターゲティング部分を含む。ある特定の実施形態では、細胞ターゲティング部分は、分岐基に共有結合する２つのテザーリガンドを含む。ある特定の実施形態では、細胞ターゲティング部分は、分岐基に共有結合する３つのテザーリガンドを含む。
特定の実施形態では、細胞ターゲティング部分は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシルアミノ基から選択される１つまたは複数の基を含む分岐基を含む。特定の実施形態では、分岐基は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシルアミノ基から選択される分岐状の脂肪族基を含む。特定のそのような実施形態では、分岐状の脂肪族基は、アルキル、アミノ、オキソ、アミドおよびエーテル基から選択される基を含む。特定のそのような実施形態では、分岐状の脂肪族基は、アルキル、アミノ、およびエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態では、分岐状の脂肪族基は、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態では、分岐基は、単環式または多環式である。
ある特定の実施形態では、細胞ターゲティング部分の各テザー（ｔｅｔｈｅｒ）は、アルキル、置換アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミノ、オキソ、アミド、リン酸ジエステルおよびポリエチレングリコールから選択される１つまたは複数の基を、いずれかの組合せで含む。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミノ、オキソ、アミドおよびポリエチレングリコールから選択される１つまたは複数の基を、いずれかの組合せで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、リン酸ジエステル、エーテル、アミノ、オキソおよびアミドから選択される１つまたは複数の基を、いずれかの組合せで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、エーテル、アミノ、オキソおよびアミドから選択される１つまたは複数の基を、いずれかの組合せで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、アミノおよびオキソから選択される１つまたは複数の基を、いずれかの組合せで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキルおよびオキソから選択される１つまたは複数の基を、いずれかの組合せで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキルおよびリン酸ジエステルから選択される１つまたは複数の基を、いずれかの組合せで含む直鎖状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、少なくとも一つのリン連結基または中性連結基を含む。ある特定の実施形態では、各テザーは、約６～約２０原子長の鎖を含む。ある特定の実施形態では、各テザーは、約１０～約１８原子長の鎖を含む。ある特定の実施形態では、各テザーは、約１０の原子長の鎖を含む。
ある特定の実施形態では、細胞ターゲティング部分の各リガンドは、標的細胞上の少なくとも一つのタイプの受容体への親和性を有する。ある特定の実施形態では、各リガンドは、哺乳類の肺細胞の表面上の少なくとも一つのタイプの受容体への親和性を有する。
ある特定の実施形態では、細胞ターゲティング部分の各リガンドは、炭水化物、炭水化物誘導体、修飾された炭水化物、多糖、修飾された多糖または多糖誘導体である。特定のそのような実施形態では、コンジュゲート基は、炭水化物のクラスターを含む（全内容を参照により本明細書に組み込む、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ａ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１４，１８－２９、またはＲｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，” Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，５７９８－５８０８を参照）。特定のそのような実施形態では、各リガンドは、アミノ糖またはチオ糖である。例えば、アミノ糖は、周知のいかなる数の化合物から選択されてもよく、例えば、シアリン酸、α－Ｄ－ガラクトサミン、β－ムラミン酸、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジデオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デオキシ－２－スルホアミノグルコースおよびＮ－スルホ－Ｄ－グルコサミンおよびＮ－グリコリル－α－ノイラミン酸が挙げられる。例えば、チオ糖は、５－チオ－β－グルコース、メチル２，３，４－トリ－Ｏ－アセチル－１－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノースおよびエチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコ－ヘプトピラノシドから選択され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるオリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチドは、以下の参照文献のいずれかに記載のコンジュゲート基を含む：Ｌｅｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ，１９７８，６７，５０９－５１４、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９８２，２５７，９３９－９４５、Ｐａｖｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，１９８３，２２，５３９－５４８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８４，２３，４２５５－４２６１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ，１９８７，４，３１７－３２８、Ｔｏｙｏｋｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９０，３１，２６７３－２６７６、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１５３８－１５４６、Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９７，５３，７５９－７７０、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９７，３８，３４８７－３４９０、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，７６２－７６５、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ，２００１，１１，８２１－８２９、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６，３７５７７－３７５８４、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２００３，３６２，３８－４３、Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ，２００４，２１，２２７－２４１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００６，１６（１９），５１３２－５１３５、Ｍａｉｅｒｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００７，１５，７６６１－７６７６、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００８，１６，５２１６－５２３１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１１，１９，２４９４－２５００、Ｋｏｒｎｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１２，４２５，４３－４６、Ｐｕｊｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，２０１２，５１，７４４５－７４４８、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１８４６－１８５２、Ｓｌｉｅｄｒｅｇｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９９，４２，６０９－６１８、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００４，４７，５７９８－５８０８、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ，２００６，２６，１６９－１７５、ｖａｎ Ｒｏｓｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，１１，４５７－４６４、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００４，１２６，１４０１３－１４０２２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，２０１２，７７，７５６４－７５７１、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２０００，１４，１７８４－１７９２、Ｒａｊｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，９３５－９４０、Ｄｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００，３１３，２９７－３２１、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２００３，１４，１８－２９、Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ，２０１０，１２，５４１０－５４１３、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ，２００２，１２，１０３－１２８、Ｍｅｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９４，５，６１２－６２０、Ｔｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１３，２１，５２７５－５２８１、国際公開ＷＯ１９９８／０１３３８１、ＷＯ２０１１／０３８３５６、ＷＯ １９９７／０４６０９８、ＷＯ２００８／０９８７８８、ＷＯ２００４／１０１６１９、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２０１１／１２００５３、ＷＯ２０１１／１００１３１、ＷＯ２０１１／１６３１２１、ＷＯ２０１２／１７７９４７、ＷＯ２０１３／０３３２３０、ＷＯ２０１３／０７５０３５、ＷＯ２０１２／０８３１８５、ＷＯ２０１２／０８３０４６、ＷＯ２００９／０８２６０７、ＷＯ２００９／１３４４８７、ＷＯ２０１０／１４４７４０、ＷＯ２０１０／１４８０１３、ＷＯ１９９７／０２０５６３、ＷＯ２０１０／０８８５３７、ＷＯ２００２／０４３７７１、ＷＯ２０１０／１２９７０９、ＷＯ２０１２／０６８１８７、ＷＯ２００９／１２６９３３、ＷＯ２００４／０２４７５７、ＷＯ２０１０／０５４４０６、ＷＯ２０１２／０８９３５２、ＷＯ２０１２／０８９６０２、ＷＯ２０１３／１６６１２１、ＷＯ２０１３／１６５８１６号パンフレット、米国特許第４，７５１，２１９、８，５５２，１６３、６，９０８，９０３、７，２６２，１７７、５，９９４，５１７、６，３００，３１９、８，１０６，０２２、７，４９１，８０５、７，４９１，８０５、７，５８２，７４４、８，１３７，６９５、６，３８３，８１２、６，５２５，０３１、６，６６０，７２０、７，７２３，５０９、８，５４１，５４８、８，３４４，１２５、８，３１３，７７２、８，３４９，３０８、８，４５０，４６７、８，５０１，９３０、８，１５８，６０１、７，２６２，１７７、６，９０６，１８２、６，６２０，９１６、８，４３５，４９１、８，４０４，８６２、７，８５１，６１５号明細書、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００９７２６４、ＵＳ２０１１／００９７２６５、ＵＳ２０１３／０００４４２７、ＵＳ２００５／０１６４２３５、ＵＳ２００６／０１４８７４０、ＵＳ２００８／０２８１０４４、ＵＳ２０１０／０２４０７３０、ＵＳ２００３／０１１９７２４、ＵＳ２００６／０１８３８８６、ＵＳ２００８／０２０６８６９、ＵＳ２０１１／０２６９８１４、ＵＳ２００９／０２８６９７３、ＵＳ２０１１／０２０７７９９、ＵＳ２０１２／０１３６０４２、ＵＳ２０１２／０１６５３９３、ＵＳ２００８／０２８１０４１、ＵＳ２００９／０２０３１３５、ＵＳ２０１２／００３５１１５、ＵＳ２０１２／００９５０７５、ＵＳ２０１２／０１０１１４８、ＵＳ２０１２／０１２８７６０、ＵＳ２０１２／０１５７５０９、ＵＳ２０１２／０２３０９３８、ＵＳ２０１３／０１０９８１７、ＵＳ２０１３／０１２１９５４、ＵＳ２０１３／０１７８５１２、ＵＳ２０１３／０２３６９６８、ＵＳ２０１１／０１２３５２０、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００８／０１０８８０１、およびＵＳ２００９／０２０３１３２号明細書。
標的ポリペプチドまたはタンパク質
一部の実施形態では、標的タンパク質は、エフェクターであり得る。他の実施形態では、標的タンパク質は、内因性タンパク質またはポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、外因性タンパク質またはポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、組換えタンパク質またはポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、人工タンパク質またはポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、融合タンパク質またはポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、酵素であり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、足場タンパク質であり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、受容体であり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、シグナル伝達タンパク質またはペプチドであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳因子であり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳制御因子またはメディエーターであり得る。
一部の実施形態では、標的タンパク質の活性または機能、例えばリボ核酸配列の翻訳は、本明細書において記載される二機能性分子の第２のドメインに結合することにより増強され得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインに結合することにより、本明細書において記載される二機能性分子を動員し、それにより、第１のドメインが、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合することを可能にする。一部の実施形態では、標的タンパク質は、さらなる機能性ドメインまたはタンパク質をさらに動員する。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、チロシンキナーゼを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮＡ翻訳の増加を媒介するタンパク質を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮＡ翻訳を増加させるタンパク質を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮＡ翻訳を増加させるタンパク質を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳制御因子を含む。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、チロシンキナーゼである。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＢＴＫ（Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ）を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、核局在シグナルを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、核輸送シグナルを含む。
本明細書で使用する場合、「ＢＴＫ」または「Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ」という用語は、チロシンタンパク質キナーゼＢＴＫとしても公知であり、ヒトにおいてＢＴＫ遺伝子によってコードされるチロシンキナーゼを指す。ＢＴＫは、Ｂ細胞発生に重要な役割を果たす。一部の実施形態では、ＢＴＫは、免疫グロブリン重鎖再構成の成功後に形成するプレＢ細胞受容体からシグナルを伝達するのに必要とされるため、Ｂ細胞発生に重要な役割を果たす。一部の実施形態では、ＢＴＫは、高親和性ＩｇＥ受容体によるマスト細胞活性化にも役割を有する。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＥＩＦ４Ｆを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＥＩＦ４Ｆである。本明細書で使用する場合、「ＥＩＦ４」という用語は、そのコアが、キャップ結合タンパク質（ｅＩＦ４Ｅ）、大足場サブユニット（ｅＩＦ４Ｇ）、およびＲＮＡヘリカーゼ（ｅＩＦ４Ａ）から構成される、細胞ポリペプチドの複合体を指す。この複合体の異常な活性は、多くのがんで観察され、腫瘍増殖および転移に関与するタンパク質の選択的な合成をもたらす。この複合体によって調節される細胞ｍＲＮＡの選択的翻訳は、がん処置に対する耐性、およびＥＩＦ４Ｆ複合体成分の下方制御にも寄与し、様々ながん治療に対する感受性を回復させ得る。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、エピトランスクリプトームリーダータンパク質を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、エピトランスクリプトームリーダータンパク質である。エピトランスクリプトームリーダータンパク質は、ｍ６Ａリーダータンパク質、例えばＹＴＨＤＦ１を含み得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＹＴＨＤＦ１を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＹＴＨＤＦ１である。本明細書で使用する場合、用語「ＹＴＨＤＦ１」は「ＹＴＨドメイン含有ファミリータンパク質１」または「Ｃ２０ｏｒｆ２１」を指す。サイトゾルでは、ＹＴＨＤＦ１は、ｍ６Ａ－修飾ｍＲＮＡの「リーダー」として機能し、翻訳開始を促進する開始因子と相互作用する。
リンカー
一部の実施形態では、合成二機能性分子は、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合する第１のドメインと、標的ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する第２のドメインと、を含み、第１のドメインは、リンカー分子によって第２のドメインにコンジュゲートする。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載されている二機能性分子の第１のドメインおよび第２のドメインは、化学リンカー（Ｌ）を介して化学的に連結されることができ、または連結されることができる。ある特定の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数の共有結合的に被連結された構造単位を含む基である。ある特定の実施形態では、リンカーは、第１のドメインを第２のドメインに直接連結する。他の実施形態では、リンカーは、第１のドメインを第２のドメインに間接的に連結する。一部の実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、第１のドメインおよび第２のドメインを連結するために用いることができる。
ある特定の実施形態では、リンカーは結合、ＣＲＬ１ＲＬ２、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＮＲＬ３、ＳＯ２ＮＲＬ３、ＳＯＮＲＬ３、ＣＯＮＲＬ３、ＮＲＬ３ＣＯＮＲｗ、ＮＲＬ３ＳＯ２ＮＲｗ、ＣＯ、ＣＲＬ＝ＣＲＬ２、Ｃ≡Ｃ、ＳｉＲＬ１ＲＬ２、Ｐ（０）ＲＬ１、Ｐ（０）ＯＲＬ１、ＮＲＬ３Ｃ（＝ＮＣＮ）ＮＲＬ４、ＮＲＬ３Ｃ（＝ＮＣＮ）、ＮＲＬ３Ｃ（＝ＣＮＯ２）ＮＲＬ４、０～６個のＲＬ１および／またはＲＬ２基によって任意に置換されていてもよいＣ３－１１シクロアルキル、０～６個のＲＬ１および／またはＲＬ２基によって任意に置換されていてもよいＣ３－１１ヘテロシクリル、０～６個のＲＬ１および／またはＲＬ２基によって任意に置換されていてもよいアリール、０～６個のＲＬ１および／またはＲＬ２基によって任意に置換されていてもよいヘテロアリールであり、ＲＬ１またはＲＬ２は、各々独立して、他の基と連結して、０～４個のＲ基によってさらに置換されることができるシクロアルキルおよび／またはヘテロシクリル部分を形成することができ、ＲＬ１、ＲＬ２、ＲＬ３、Ｒ４およびＲＬ５は、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１～８アルキル、ＯＣ１～８アルキル、ＳＣ１～８アルキル、ＮＨＣ１～８アルキル、Ｎ（Ｃ１～８アルキル）２、Ｃ３～１１シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３～１１ヘテロシクリル、ＯＣ１～８シクロアルキル、ＳＣ１～８シクロアルキル、ＮＨＣ１～８シクロアルキル、Ｎ（Ｃ１～８シクロアルキル）２、Ｎ（Ｃ１～８シクロアルキル）（Ｃ１～８アルキル）、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＳＯ２Ｃ１～８アルキル、Ｐ（Ｏ）（ＯＣ１～８アルキル）（Ｃ１～８アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＣ１～８アルキル）２、ＣＣ－Ｃ１～８アルキル、ＣＣＨ、ＣＨ＝ＣＨ（Ｃ１～８アルキル）、Ｃ（Ｃ１～８アルキル）＝ＣＨ（Ｃ１～８アルキル）、Ｃ（Ｃ１～８アルキル）＝Ｃ（Ｃ１～８アルキル）２、Ｓｉ（ＯＨ）３、Ｓｉ（Ｃ１～８アルキル）３、Ｓｉ（ＯＨ）（Ｃ１～８アルキル）２、ＣＯＣ１～８アルキル、ＣＯ２Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２Ｆ、ＮＯ２、ＳＦ５、ＳＯ２ＮＨＣ１～８アルキル、ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～８アルキル）２、ＳＯＮＨＣ１～８アルキル、ＳＯＮ（Ｃ１～８アルキル）２、ＣＯＮＨＣ１～８アルキル、ＣＯＮ（Ｃ１～８アルキル）２、Ｎ（Ｃ１～８アルキル）ＣＯＮＨ（Ｃ１～８アルキル）、Ｎ（Ｃ１～８アルキル）ＣＯＮ（Ｃ１～８アルキル）２、ＮＨＣＯＮＨ（Ｃ１～８アルキル）、ＮＨＣＯＮ（Ｃ１～８アルキル）２、ＮＨＣＯＮＨ２、Ｎ（Ｃ１～８アルキル）ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～８アルキル）、Ｎ（Ｃ１～８アルキル）ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～８アルキル）２、ＮＨＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～８アルキル）、ＮＨＳＯ２Ｎ（Ｃ１～８アルキル）２、ＮＨＳＯ２ＮＨ２である。
特定の実施形態では、リンカー（Ｌ）は、以下からなる群から選択される：
－（ＣＨ２）ｎ－（低級アルキル）－、－（ＣＨ２）ｎ－（低級アルコキシル）－、－（ＣＨ２）ｎ－（低級アルコキシル） －ＯＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－（低級アルコキシル）－（低級アルキル）－ＯＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－（シクロアルキル）－（低級アルキル）－ＯＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－（ヘテロシクロアルキル）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（低級アルキル）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、
－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（ヘテロシクロアルキル）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－アリール－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（ヘテロアリール）－０－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－（シクロアルキル）－Ｏ－（ヘテロアリール）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（シクロアルキル）－Ｏ－アリール－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（低級アルキル）－ＮＨ－アリール－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（０）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（低級アルキル）－Ｏ－アリール－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－シクロアルキル－Ｏ－アリール－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－シクロアルキル－Ｏ－（ヘテロアリール）－Ｃ（Ｏ）－、
（ｎは、０～１０であることができる）
Figure 2023522957000032
さらなる実施形態では、リンカー基は、任意に置換されていてもよい、１～約１００のエチレングリコール単位、約１～約５０のエチレングリコール単位、１～約２５のエチレングリコール単位、約１～１０のエチレングリコール単位、１～約８のエチレングリコール単位、および１～６のエチレングリコール単位、２～４のエチレングリコール単位を有する（ポリ）エチレングリコールであるか、または、任意に置換されていてもよいＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＳｉ原子が散在する任意に置換されていてもよいアルキル基である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アリール、フェニル、ベンジル、アルキル、アルキレンまたはヘテロ環基によって置換されている。ある特定の実施形態では、リンカーは、非対称でもよく、または対称形でもよい。
本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、リンカー基は、本明細書において記載されるいかなる適切な部分でもあってもよい。一実施形態では、リンカーは、約１～約１２のエチレングリコール単位、１～約１０のエチレングリコール単位、約２～約６エチレングリコール単位、約２～５のエチレングリコール単位、約２～４のエチレングリコール単位、でサイズの変化する置換もしくは非置換のポリエチレングリコール基である。
第１のドメインおよび第２のドメインは、リンカーの化学作用に適切および安定であるいかなる基によって、リンカー基に共有結合されていてもよいが、いくつかの態様では、リンカーは、独立して、アミド、エステル、チオエステル、ケト基、カルバミン酸エステル（ウレタン）、炭素またはエーテルによって第１のドメインおよび第２のドメインと共有結合し、各々の基は、最大結合量を提供するために、第１のドメインおよび第２のドメインの適切な位置に挿入され得る。特定の好適な態様において、リンカーは、第１のドメインおよび／または第２のドメイン上の、任意に置換されていてもよいアルキル、アルキレン、アルケンまたはアルキン基、アリール基または複素環基に連結されていてもよい。
ある特定の実施形態では、リンカーは、４～２４の直鎖原子を有する直鎖状鎖であってもよく、直鎖状鎖の炭素原子は、酸素、窒素、アミド、フッ化炭素などによって置換されていてもよい（例えば以下）：
Figure 2023522957000033
一部の実施形態では、リンカーは、ＴＥＧリンカー：
Figure 2023522957000034
を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、位置異性体の混合体を含む。一部の実施形態では、位置異性体の混合体は、リンカー１～５からなる群から選択される：
Figure 2023522957000035
Figure 2023522957000036
一部の実施形態では、リンカーは、モジュラーリンカーを含む。一部の実施形態では、モジュラーリンカーは、リンカーモジュールで置換されてもよい１つまたは複数のモジュラー領域を含む。一部の実施形態では、リンカーモジュールで置換されていてもよいモジュラー領域を有するモジュラーリンカーに、以下が含まれる：
Figure 2023522957000037
ある特定の実施形態では、リンカーは、非直鎖状の鎖であることができ、また脂肪族または芳香族またはヘテロ芳香族の環式部分であることもできる。リンカーのいくつかの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
Figure 2023522957000038
式中、「Ｘ」は、原子数２～１４の範囲の直鎖状鎖であることができ、および酸素のようなヘテロ原子を含むことができる、また「Ｙ」は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）ｎ（ｎ＝０、１または２）であることができる。
他のリンカーの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：アリル（４－メトキシフェニル）ジメチルシラン、６－（アリルオキシカルボニルアミノ）－１－ヘキサノール、３－（アリルオキシカルボニルアミノ）－１－プロパノール、４－アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール、（Ｅ）－Ｎ－（２－アミノエチル）－４－｛２－［４－（３－アジドプロポキシ）フェニル］ジアゼニル｝ベンズアミド塩酸、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセタト塩、アミノ－ＰＥＧ４－アルキン、アミノ－ＰＥＧ４－ｔ－ブチルエステル、アミノ－ＰＥＧ５－ｔ－ブチルエステル、アミノ－ＰＥＧ６－ｔ－ブチルエステル、２０－アジド－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサイソサン酸、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン酸、ベンジルＮ－（３－ヒドロキシプロピル）カルバメート、４－（Ｂｏｃ－アミノ）－１－ブタノール、４－（Ｂｏｃ－アミノ）ブチルブロミド、２－（Ｂｏｃ－アミノ）エタンチオール、２－［２－（Ｂｏｃ－アミノ）エトキシ］エトキシ酢酸（ジシクロヘキシルアンモニウム）塩、２－（Ｂｏｃ－アミノ）エチルブロミド、６－（Ｂｏｃ－アミノ）－１－ヘキサノール、２１－（Ｂｏｃ－アミノ）－４，７，１０，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘンエイコサンイコサン酸ｐｕｒｕｍ、６－（Ｂｏｃ－アミノ）ヘキシルブロミド、３－（Ｂｏｃ－アミノ）－１－プロパノール、３－（Ｂｏｃ－アミノ）プロピルブロミド、１５－（Ｂｏｃ－アミノ）－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカン酸ｐｕｒｕｍ、Ｎ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－カダベリン、Ｎ－Ｂｏｃ－エタノールアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－２，２’－（エチレンジオキシ）ジエチルアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－へキサンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキサンジアミンヒドロクロリド、Ｎ－Ｂｏｃ－４－イソチオシアナトアニリン、Ｎ－Ｂｏｃ－３－イソチオシアナトプロピルアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｎ－メチルエチレンジアミン、ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ４－酸、ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ５－酸、Ｎ－Ｂｏｃ－ｍ－フェニレンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－ｐ－フェニレンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，３－プロパンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，３－プロパンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｎ’－サクシニル－４，７，１０－トリオキサ－１，１３－トリデカンジアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－４，７，１０－トリオキサ－１，１３－トリデカンジアミン、Ｎ－（４－ブロモブチル）フタリミド、４－ブロモブタン酸、４－ブロモブチリルクロリド、Ｎ－（２－ブロモエチル）フタリミド、６－ブロモ－１－ヘキサノール、８－ブロモオクタン酸、８－ブロモ－１－オクタノール、３－（４－ブロモフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリン、Ｎ－（３－ブロモプロピル）フタリミド、４－（ｔｅｒｔ－ブトキシメチル）安息香酸、ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－｛［４－（３－アジドプロポキシ）フェニル］アゾ｝ベンズアミド）エチルカルバメート、２－［２－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ）エトキシ］エタンアミン、ｔｅｒｔ－ブチル４－ヒドロキシブチレート、クロラールヒドレート、４－（２－クロロプロピオニル）フェニル酸、１，１１－Ｄｉアミノ－３，６，９－トリオキサウンデカン、ｄｉ－Ｂｏｃ－シスタミン、ジエチレングリコールモノアリルエーテル、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－メタノール、４－［（２，４－ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ－アミノ）メチル］フェノキシ酢酸、４－（ジフェニルヒドロキシメチル）、安息香酸、４－（Ｆｍｏｃ－アミノ）－１－ブタノール、２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エタノール、２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エチルブロミド、６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）－１－ヘキサノール、５－（Ｆｍｏｃ－アミノ）－１－ペンタノール、３－（Ｆｍｏｃ－アミノ）－１－プロパノール、３－（Ｆｍｏｃ－アミノ）プロピルブロミド、Ｎ－Ｆｍｏｃ－２－ブロモエチルアミン、Ｎ－Ｆｍｏｃ－１，４－ブタンジアミンヒドロブロミド、Ｎ－Ｆｍｏｃ－カダベリンヒドロブロミド、Ｎ－Ｆｍｏｃ－エチレンジアミン ヒドロブロミド、Ｎ－Ｆｍｏｃ－１，６－ヘキサンジアミンヒドロブロミド、Ｎ－Ｆｍｏｃ－１，３－プロパンジアミン ヒドロブロミド、Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｎ’’－サクシニル－４，７，１０－トリオキサ－１，１３－トリデカンジアミン、（３－ホルミル－１－インドリル）酢酸、４－ヒドロキシベンジルアルコール、Ｎ－（４－ヒドロキシブチル）トリフルオロアセタミド、４’－ヒドロキシ－２，４－ジメトキシベンゾフェノン、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）マレイミド、４－［４－（１－ヒドロキシエチル）－２－メトキシ－５－ニトロフェノキシ］酪酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）トリフルオロアセタミド、Ｎ－（６－ヒドロキシヘキシル）トリフルオロアセタミド、４－ヒドロキシ－２－メトキシベンズアルデヒド、４－ヒドロキシ－３－メトキシベンジルアルコール、４－（ヒドロキシメチル）安息香酸、４－（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸、ヒドロキシ－ＰＥＧ４－ｔ－ブチルエステル、ヒドロキシ－ＰＥＧ５－ｔ－ブチルエステル、ヒドロキシ－ＰＥＧ６－ｔ－ブチルエステル、Ｎ－（５－ヒドロキシペンチル）トリフルオロアセタミド、４－（４’－ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、２－マレイミドエチルメシレート、６－メルカプト－１－ヘキサノール、フェナシル４－（ブロモメチル）フェニル酢酸、プロパルギル－ＰＥＧ６－酸、４－スルファモイル安息香酸、４－スルファモイルブタン酸、４－（Ｚ－アミノ）－１－ブタノール、６－（Ｚ－アミノ）－１－ヘキサノール、５－（Ｚ－アミノ）－１－ペンタノール、Ｎ－Ｚ－１，４－ブタンジアミンヒドロクロリド、Ｎ－Ｚ－エタノールアミン、Ｎ－Ｚ－エチレンジアミン ヒドロクロリド、Ｎ－Ｚ－１，６－ヘンキサンジアミン ヒドロクロリド、Ｎ－Ｚ－１，５－ペンタンジアミンヒドロクロリド、およびＮ－Ｚ－１，３－プロパンジ塩酸塩。
一部の実施形態では、リンカーは、ＡＳＯの５’末端または３’末端でコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、５’末端でまたは３’末端でないＡＳＯの位置でコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、リンカーは、１～１０個のリンカーヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、そのようなリンカーヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、そのようなリンカーヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。一部の実施形態では、リンカーヌクレオシドは、非修飾である。一部の実施形態では、リンカーヌクレオシドは、プリン、置換プリン、ピリミジンまたは置換ピリミジンから選択される、任意に保護される複素環塩基を含む。一部の実施形態では、切断可能部分は、ウラシル、チミン、シトシン、４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、５－メチルシトシン、４－Ｎ－ベンゾイル－５－メチルシトシン、アデニン、６－Ｎ－ベンゾイルアデニン、グアニンおよび２－Ｎ－イソブチリルグアニンから選択されるヌクレオシドである。リンカーヌクレオシドは、それが標的組織に達した後、オリゴマー化合物から分離されることが典型的に望ましい。
一部の実施形態では、リンカーヌクレオシドは、互いに連結され、また切断可能結合を介してオリゴマー化合物の残りに連結される。一部の実施形態では、そのような切断可能結合はホスホジエステル結合である。
本明細書において、リンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの部分であるとは考慮されない。したがって、オリゴマー化合物が、指定された数または範囲の連結されたヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドを含む、および／または、参照核酸およびオリゴマー化合物に対する指定のパーセント相補性が、リンカーヌクレオシドを含むコンジュゲートリンカーを含むコンジュゲート基をも含む、実施形態においては、それらのリンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの長さとしてはカウントされず、参照核酸のオリゴヌクレオチドのパーセント相補性を測定する際には使われない。
一部の実施形態では、リンカーは、非核酸リンカーでもよい。非核酸リンカーは、化学結合（例えば、１つまたは複数の共有結合または非共有結合）でもよい。一部の実施形態では、非核酸リンカーは、ペプチドまたはタンパク質リンカーである。そのようなリンカーは、２～３０アミノ酸、またはそれ以上であってもよい。リンカーには、本明細書において記載される可撓性、剛性または切断可能リンカーが含まれる。
一部の実施形態では、リンカーは、単一の化学結合である（すなわち、コンジュゲート部分は、単結合によるコンジュゲートリンカーを介して、オリゴヌクレオチドに付着する）。一部の実施形態では、リンカーは、鎖状構造（例えばヒドロカルビル鎖）、または反復単位（例えばエチレングリコール、ヌクレオシドまたはアミノ酸単位）のオリゴマーを含む。
リンカーの例としては、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）および６－アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）が含まれるが、これらに限定されない。他のリンカーとしては、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ１０アルキル、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ１０アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ１０アルキニルが含まれるが、これらに限定されるものではなく、好適な置換基の非限定的なリストとしては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。
最も一般的に用いられる可撓性リンカーは、主にＧｌｙおよびＳｅｒ残基（「ＧＳ」リンカー）のストレッチからなる配列を有する。可撓性リンカーは、ある程度の移動または相互作用の程度を要するドメインを連結するために有用であり得、小さい無極性の（例えば、Ｇｌｙ）、または極性の（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）アミノ酸を含んでもよい。ＳｅｒまたはＴｈｒの含有により、水素結合を水分子と形成することによって、水溶液中でのリンカーの安定性を維持することもでき、それにより、リンカーとタンパク部分との間の好適でない相互作用を減らすこともできる。
ドメインの間の固定された距離を保持し、それらの独立した機能を維持するために、剛性リンカーは有用である。また融合体の１つまたは複数の成分の安定性または生理活性を保存するためにドメインの空間的分離が重要であるときも、剛性リンカーは有用であり得る。剛性リンカーは、αヘリックス構造またはＰｒｏリッチ配列（（ＸＰ）ｎ）を有してもよく、式中、Ｘはアミノ酸（好ましくはＡｌａ、ＬｙｓまたはＧｌｕ）を示す。
切断可能なリンカーは、インビボで遊離の機能性ドメインを放出し得る。一部の実施形態では、リンカーは、特異的な条件（例えば還元剤またはプロテアーゼの存在）下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆的性質を利用してもよい。１つの例は、２つのＣｙｓ残基の間にトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）を含む。ＣＰＲＳＣのインビトロでのトロンビン処理は結果としてトロンビン感受性配列の切断をもたらす一方で、可逆的ジスルフィド連結は完全なままである。そのようなリンカーは公知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）： １３５７－１３６９に記載されている。特異的な細胞または組織において、病態（例えばがんまたは炎症）下でインビボで発現されるか、または特定の細胞区画内に拘束されるプロテアーゼによって、融合体のリンカーのインビボ切断が行われ得る。多くのプロテアーゼの特異性は、拘束される区画におけるリンカーの切断を遅延させる。
連結分子の例としては、疎水性リンカー（例えば負に荷電するスルホネート基）、脂質（例えばポリ（－ＣＨ２－）炭化水素鎖、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和誘導体、そのヒドロキシル化誘導体、そのアミド化若しくはその他のＮ含有誘導体、非炭素リンカー）、炭水化物リンカー、ホスホジエステルリンカー、または２以上のポリペプチドを共有結合することができる他の分子、が挙げられる。非共有のリンカーも含まれ、例えば、ポリペプチドの疎水性部分またはポリペプチドの疎水性伸張などによってポリペプチドが連結される疎水性脂質小球であり、そのようなポリペプチドは、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、あるいはアラニン、フェニルアラニンもしくはチロシン、メチオニン、グリシンまたは他の疎水性残基がリッチな一連の残基であり得る。ポリペプチドは電荷ベースの化学結合を使用して連結されてもよく、例えば、ポリペプチドの正荷電部分が他のポリペプチドまたは核酸の負荷電部分に連結される。
一部の実施形態では、リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシルアミノから選択される１つまたは複数の基を含む。特定のそのような実施形態では、リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミドおよびエーテル基から選択される基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、アルキルおよびアミド基から選択される基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも一つのリン部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも一つのホスフェート基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも一つの中性連結基を含む。
一部の実施形態では、例えば、リンカーは二官能性連結部分であり、例えば、オリゴマー化合物、例えば本明細書において提供されるＡＳＯに付着しているコンジュゲート基に有用であることが、従来技術において公知であるものである。一般に、二官能性連結部分は、少なくとも２つの官能性基を含む。官能性基の１つは、オリゴマー化合物上の特定の部位に結合するために選択され、その他は、コンジュゲート基と結合するために選択される。二官能性連結部分において使用する官能性基の例には、限定されないが、求核基と反応するための求電子試薬、および求電子基と反応するための求核試薬が含まれる。一部の実施形態では、二官能性連結部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択される１つまたは複数の基を含む。
標的タンパク質（エフェクター）の機能
一部の実施形態では、二機能性分子は、標的タンパク質に特異的に結合する第２のドメインを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、エフェクターである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、内因性タンパク質である。他の実施形態では、標的タンパク質は、細胞内タンパク質である。別の実施形態では、標的タンパク質は、内因性および細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、標的内因性タンパク質は、酵素、足場タンパク質または制御タンパク質である。一部の実施形態では、第２のドメインは、標的ポリペプチドまたはタンパク質上の活性部位、アロステリック部位、または不活性部位と特異的に結合する。
ＲＮＡ翻訳の増加
一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインは、表３の遺伝子の転写物において、リボ核酸配列の翻訳の増加に関与するタンパク質を標的とする。一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインは、表３の遺伝子の転写物において、リボ核酸の翻訳を増加させるタンパク質を標的とする。一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子の第１のドメインは、表３の遺伝子の転写物のリボ核酸配列を標的とし、それにより標的リボ核酸配列の翻訳を増加させる。一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子の第１のドメインは、表３の遺伝子のリボ核酸分子の翻訳の増加を媒介する配列に近位のまたは近い１つもしくは複数のリボ核酸配列に結合する。一部の実施形態では、リボ核酸分子は、腫瘍抑制遺伝子と関連する。一部の実施形態では、リボ核酸分子は、ハプロ不全と関連する。
Figure 2023522957000039
一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮＡ翻訳を促進する、ブーストする、増加することに関与するエフェクターである。例えば、そのようなブースターとしては、翻訳開始因子：Ｃａｐ結合タンパク質（ＣＢＰ）；ＤＥＡＤヘリカーゼ；ＵＢＸ；およびＭＡＰキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳開始因子である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＣＢＰである。
例示的なブースターとしては、ＥＩＦ４Ａ；ＥＩＦ４Ｇ；ＥＩＦ４Ｅ；ＤＤＸ１；ＳＬＢＰ；ＩＤＨ１；Ｇ３ＢＰ２；ＲＰＬＰ０；ＹＷＨＡＥ；ＹＴＨＤＦ１；ＬＡＲＰ１；ＢＯＬＬ；ＰＡＩＰ；ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ；ＣＬＫ２；ＲＰＵＳＤ３；ＰＴＰＢ１；ＮＵＳＡＰ１；ＴＨＯＣ１；ＭＴＤＨ；ＰＥＧ１０；ＰＲＰＦ３；ＤＡＺ４；ＺＲＡＮＢ２；ＳＲＳＦ８；ＰＡＢＰ；ＹＴＨＤＦ３；ＭＥＴＴＬ３；ＡＢＣＦ１；Ｐ９７；Ｐ８６；ＥＩＦ３Ａ；ＥＩＦ３Ｂ；ＥＩＦ３Ｃ；ＥＩＦ３Ｄ；ＥＩＦ３Ｅ；ＥＩＦ３Ｆ；ＥＩＦ３Ｇ；ＥＩＦ３Ｈ；ＥＩＦ３Ｉ；ＥＩＦ３Ｊ；ＥＩＦ３Ｋ；ＥＩＦ３Ｌ；ＥＩＦ３Ｍ；ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ；ＣＬＫ２；ＵＢＡＰ２Ｌ；ＺＣＣＨ６；ＣＬＫ３；ＨＳＰＢ１；ＳＲＳＦ８；およびＺＲＡＮＢ２も挙げられ得る。さらなる実施形態では、ブースターは、ＥＩＦ４Ａ；ＥＩＦ４Ｇ；ＥＩＦ４Ｅ；ＤＤＸ１；ＳＬＢＰ；ＩＤＨ１；Ｇ３ＢＰ２；ＲＰＬＰ０；ＹＷＨＡＥ；ＹＴＨＤＦ１；およびＬＡＲＰ１からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ブースターはＥＩＦ４Ａである。さらなる実施形態では、ブースターはＥＩＦ４Ｇである。さらなる実施形態では、ブースターはＤＤＸ１である。さらなる実施形態では、ブースターはＳＬＢＰである。さらなる実施形態では、ブースターはＩＤＨ１である。さらなる実施形態では、ブースターはＧ３ＢＰ２である。さらなる実施形態では、ブースターはＲＰＬＰ０である。さらなる実施形態では、ブースターは、ＹＷＨＡＥである。さらなる実施形態では、ブースターはＬＡＲＰ１である。
一部の実施形態では、ＲＮＡ翻訳に関与する標的タンパク質、例えばｅＩＦ４Ｅは、本明細書において提供される二機能性分子に結合した標的タンパク質との相互作用によって標的ＲＮＡに動員され、標的ＲＮＡ翻訳の促進を媒介する。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、酵素であり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、受容体であり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、シグナル伝達タンパク質またはペプチドであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳因子であり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳制御因子またはメディエーターであり得る。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳因子、翻訳制御因子または翻訳メディエーターを動員し得る。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳制御因子を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、翻訳プロモーターを含む。
一部の実施形態では、第１のドメインは、標的ＲＮＡへの結合によって本明細書において記載されている二機能性分子を標的部位に動員し、その際、第２のドメインは、標的タンパク質と相互作用してＲＮＡ翻訳を促進する。一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインと相互作用した後の標的タンパク質はさらに、タンパク質またはペプチドとの相互作用によるＲＮＡ翻訳に関係しているタンパク質またはペプチドをさらに動員する。
一部の実施形態では、リボ核酸配列の翻訳が上方制御または増加される。一部の実施形態では、リボ核酸配列の翻訳が増加される。
一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、タンパク質を動員し、リボ核酸配列の翻訳を促進する。酵素またはタンパク質を標的ＲＮＡに動員することにより、転写物付近の酵素またはタンパク質の局所的な濃度が上昇し、それによりＲＮＡ転写物の翻訳を増加させる（例えば、転写物の翻訳を活性化させる）。
一部の実施形態では、第１のドメインは、標的ＲＮＡまたは遺伝子配列への結合によって本明細書において記載されている二機能性分子を標的部位に動員し、その際、第２のドメインは、標的タンパク質と相互作用して標的ＲＮＡの翻訳を増加させる。一部の実施形態では、標的タンパク質は、本明細書において提供される二機能分子の第２のドメインとの結合によって、本明細書において記載される二機能性分子を動員し、その際、第１のドメインは、標的ＲＮＡまたは別の遺伝子配列へ特異的に結合して標的ＲＮＡの翻訳を増加させる。一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインと相互作用した後の標的タンパク質はさらに、タンパク質またはペプチドとの相互作用によるＲＮＡ翻訳の増加に関係しているタンパク質またはペプチドをさらに動員する。
医薬組成物
一部の態様では、本明細書において記載される二機能性分子は、医薬組成物を含むか、または、該組成物は、本明細書において記載される二機能性分子を含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。医薬組成物は、無菌でもよく、および／または、パイロジェンフリーでもよい。製剤化の一般的な考慮点および／または医薬品の製造は、例えば、（本明細書に参照により組み込まれる）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５において見出し得る。
本明細書において提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適している医薬組成物に向けられているが、そのような組成物が、他のいかなる動物（例えば、ヒト以外の動物、例えば、ヒト以外の哺乳動物）に対する投与にも一般に適していることは、当業者によって理解される。ヒトに対する投与に適している医薬組成物の修飾は、各種の動物に対する組成物の投与に適するようにするためであることが理解され、また獣医学薬理学者であれば、単に通常の必要に応じた実験のみをもってそのような修飾をデザインおよび／または実施できる。医薬組成物の投与が意図される対象は、限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類を包含し、哺乳動物には、例えば、商業的に重要な哺乳動物、例えば、ペットおよび家畜動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／またはラット）が含まれ、および／または商業的に重要な鳥類（例えば家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウおよび／またはシチメンチョウ）などが含まれる。
公知であるか、または今後薬学の技術分野において開発されるいかなる方法によっても、本明細書において記載される医薬組成物の製剤は調製され得る。一般に、そのような調製方法は、賦形剤および／または１つもしくは複数の他のアクセサリー成分と活性成分とを会合させ、次に必要に応じて、および／または望ましい場合には、製品を分割し、成形し、および／または包装するステップを含む。
また、用語「医薬組成物」とは、医薬組成物の範囲内で含まれ本明細書において記載される二機能性分子が療法によってヒトまたは動物の体の処置のために用いることができることを開示することを意図するものである。したがって、それは、「処置に用いられる、本明細書において記載される二機能性分子」と同義であることを意味する。
送達
例えば、本明細書において記載される医薬組成物は、医薬賦形剤を含むものとして調製することができる。薬剤担体は、膜、脂質二重層および／または高分子担体（例えば、ナノ粒子（例えば、リピドナノ粒子）のようなリポソームまたは粒子）でもよく、それを必要とする対象（例えば、ヒトまたはヒト以外の農業用動物または家畜（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽））に対し公知の方法によって送達される。そのような方法は、限定されないが、トランスフェクション（例えば、脂質を介するもの、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーションまたは膜破壊（例えば、ヌクレオフェクション）、融合およびウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）などの他の方法が挙げられる。
一部の態様において、方法は、本明細書において記載される二機能性分子、本明細書において記載されている二機能性分子を含む組成物、または本明細書において記載される二機能性分子を含む医薬組成物をそれを必要とする対象に送達することを含む。
送達の方法
本明細書において記載される二機能性分子、本明細書において記載される二機能性分子を含む組成物、または、本明細書において記載される二機能性分子を含む医薬組成物を、細胞、組織または対象に送達する方法は、本明細書において記載される二機能性分子、本明細書において記載される二機能性分子を含む組成物、または、本明細書において記載される二機能性分子を含む医薬品組成物を、細胞、組織または対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、本明細書において記載される二機能性分子、本明細書において記載される二機能性分子を含む組成物、または本明細書において記載される二機能性分子を含む医薬組成物は、非経口的に投与される。一部の実施形態では、本明細書において記載される二機能性分子、本明細書において記載される二機能性分子を含む組成物、または本明細書において記載される二機能性分子を含む医薬組成物は、注入によって投与される。投与は、全身性投与または局所投与とすることができる。一部の実施形態では、本明細書において記載される二機能性分子、本明細書において記載される二機能性分子を含む組成物、または本明細書において記載される二機能性分子を含む医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹膜内、皮内、頭蓋内、クモ膜下腔内、内部リンパ、皮下または筋肉内に投与される。
一部の実施形態では、細胞は真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は動物の細胞である。
二機能性分子を用いる方法
リボ核酸配列を翻訳する方法
一部の実施形態では、標的ポリペプチドまたはタンパク質はＲＮＡ翻訳をモジュレートする。
一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインは、表３の遺伝子の転写物においてリボ核酸配列を翻訳するタンパク質を標的とする。
一部の実施形態では、遺伝子転写物の翻訳は、上方制御または増加される。一部の実施形態では、遺伝子転写物の翻訳は上方制御される。一部の実施形態では、遺伝子転写物の翻訳は増加される。
一部の態様では、細胞中のリボ核酸配列の翻訳の方法は、標的リボ核酸配列または構造に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小分子を含む第１のドメイン、標的ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する第２のドメイン、および第１のドメインを第２のドメインにコンジュゲートするリンカーを含む合成二機能性分子を細胞に投与することを含み、標的ポリペプチドまたはタンパク質は、細胞中のリボ核酸配列を翻訳する。
一態様では、細胞中のリボ核酸配列を翻訳する方法は、本明細書において提供される合成二機能性分子を細胞に投与することを含む。
一部の実施形態では、第２のドメインは、小分子またはアプタマーを含む。
一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞はウイルスによって感染している。一部の実施形態では、細胞はがん細胞である。一部の実施形態では、細胞は細菌細胞である。
一部の実施形態では、第１のドメインは、リンカー分子によって第２のドメインにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、第１のドメインはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、第１のドメインは小分子である。一部の実施形態では、小分子は、表２からなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のドメインは小分子である。
一部の実施形態では、第２のドメインはアプタマーである。
一部の実施形態では、標的ポリペプチドまたはタンパク質は、細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、標的ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素、足場タンパク質、または制御タンパク質である。一部の実施形態では、第２のドメインは、標的ポリペプチドまたはタンパク質上の活性部位、アロステリック部位、または不活性部位に特異的に結合する。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮＡ翻訳の促進、ブースト、増加に関与するエフェクターである。例えば、そのようなブースターとしては、ＥＩＦ４Ａ；ＥＩＦ４Ｇ；ＥＩＦ４Ｅ；ＤＤＸ１；ＳＬＢＰ；ＩＤＨ１；Ｇ３ＢＰ２；ＲＰＬＰ０；ＹＷＨＡＥ；ＹＴＨＤＦ１；ＬＡＲＰ１；ＢＯＬＬ；ＰＡＩＰ；ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ；ＣＬＫ２；ＲＰＵＳＤ３；ＰＴＰＢ１；ＮＵＳＡＰ１；ＴＨＯＣ１；ＭＴＤＨ；ＰＥＧ１０；ＰＲＰＦ３；ＤＡＺ４；ＺＲＡＮＢ２；ＳＲＳＦ８；ＰＡＢＰ；ＹＴＨＤＦ３；ＭＥＴＴＬ３；ＡＢＣＦ１；Ｐ９７；Ｐ８６；ＥＩＦ３Ａ；ＥＩＦ３Ｂ；ＥＩＦ３Ｃ；ＥＩＦ３Ｄ；ＥＩＦ３Ｅ；ＥＩＦ３Ｆ；ＥＩＦ３Ｇ；ＥＩＦ３Ｈ；ＥＩＦ３Ｉ；ＥＩＦ３Ｊ；ＥＩＦ３Ｋ；ＥＩＦ３Ｌ；ＥＩＦ３Ｍ；ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ；ＣＬＫ２；ＵＢＡＰ２Ｌ；ＺＣＣＨ６；ＣＬＫ３；ＨＳＰＢ１；ＳＲＳＦ８；およびＺＲＡＮＢ２が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、ブースターはＥＩＦ４Ｅである。さらなる実施形態では、ブースターはＥＩＦ４Ａである。さらなる実施形態では、ブースターはＥＩＦ４Ｇである。さらなる実施形態では、ブースターはＹＴＨＤＦ１である。
分子の調節は、限定されないが、例えばイムノブロットによるタンパク質レベルの測定など、当技術分野の当業者に公知の従来のアッセイで測定し得る。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮＡ翻訳に関与するタンパク質、例えばｅＩＦ４Ｅであり、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインとの相互作用により、標的ＲＮＡに動員されると、標的ＲＮＡの翻訳を媒介する。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮＡ翻訳を増加させるタンパク質であり、本明細書において提供される二機能性分子の第２のドメインとの相互作用により、標的ＲＮＡに動員されると、ＲＮＡ翻訳を増加させる。一部の実施形態では、ＲＮＡ翻訳に関与するタンパク質、例えばｅＩＦ４Ｅは、本明細書において提供される標的ＲＮＡに動員され、標的ＲＮＡの翻訳を媒介する。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ翻訳が増加される。
一部の実施形態では、ＲＮＡ翻訳は、任意の標準的な技術によって測定した場合、未処置の対照細胞、組織もしくは対象と比較して、またはモジュレーターによる処置前の同じ型の細胞、組織もしくは対象における相当する活性と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも３０００％、少なくとも４０００％、少なくとも５０００％、少なくとも６０００％、少なくとも７０００％、少なくとも８０００％、少なくとも９０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％、少なくとも３００００％、少なくとも４００００％、少なくとも５００００％、少なくとも６００００％、少なくとも７００００％、少なくとも８００００％、少なくとも９００００％、または少なくとも１０００００％増加される。一部の実施形態では、ＲＮＡ翻訳は、任意の標準的な技術によって測定した場合、未処置の対照細胞、組織もしくは対象と比較して、またはモジュレーターによる処置前の同じ型の細胞、組織もしくは対象における相当する活性と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、少なくとも４０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも６０００倍、少なくとも７０００倍、少なくとも８０００倍、少なくとも９０００倍、または少なくとも１００００倍増加される。
一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、第２のドメインに結合するタンパク質ドメインの融合タンパク質とＲＮＡ翻訳に関与するタンパク質、例えばｅＩＦ４Ｅの組合せで使用され得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子によるｅＩＦ４Ｅの動員は、標的ＲＮＡ翻訳を促進し得る。
処置方法
本明細書において記載される二機能性分子は、処置を必要とする対象の処置ための方法で用いることができる。対象は、例えば、疾患または症状を有し、その処置を必要とする。一部の実施形態では、疾患は、がん、代謝性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、感染性疾患、遺伝子疾患、ハプロ不全疾患、または神経疾患である。一部の実施形態では、疾患はがんであり、標的遺伝子はがん遺伝子である。一部の実施形態では、その翻訳が、本明細書において提供される二機能性分子または本明細書において提供される二機能性分子を含む組成物によって増加される遺伝子は、表４の疾患と関連する。
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一部の態様では、処置を必要とする対象の処置方法は、対象に対し、本明細書において提供される二機能性分子、または本明細書において提供される二機能性分子を含む組成物、または本明細書において提供される二機能性分子を含む医薬組成物を投与することを含み、該投与は、対象を処置するのに効果的である。
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、二機能性分子と組み合わせて第２の治療薬または第２の治療法を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書において提供される二機能性分子を含む第１の組成物と、第２の治療薬または第２の治療法を含む第２の組成物とを投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書において提供される二機能性分子を含む第１の医薬組成物と、第２の治療薬または第２の治療法を含む第２の医薬組成物と、を投与することを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子を含む第１の組成物または第１の医薬組成物と、第２の治療薬または第２の治療法を含む第２の組成物または第２の医薬組成物は、それを必要とする対象に対し、同時に、別個に、または連続的に投与される。
本明細書において用いられる用語「処置する」、「処置すること」および「処置」等は、一般に、所望の薬学的および／または生理的効果を得ることを意味するものとして用いられる。効果は、疾患、兆候またはその症状を予防するまたは部分的に予防する観点から予防的であってもよく、および／または、疾患、症状、兆候または疾患に起因する悪影響の部分的または完全な解消という意味で治療的であってもよい。本明細書で用いられる「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患のいかなる処置も網羅するものであり、以下のものが含まれる：（ａ）疾患の体質を有するが、それを有するとまだ診断されていない対象で起こり得る疾患を予防すること、（ｂ）疾患を抑制し、すなわち、その進行を抑えること、または、（ｃ）疾患を楽にする（すなわち、疾患および／またはその兆候もしくは症状を緩和もしくは改善すること）。本明細書においては、疾患または症状の予防または部分的な予防のためにとられる手段を指すものとして、用語「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」が、用いられる。
「疾患または症状を処置するまたは予防する」とは、症状、または、それの前か後で発生する障害と関連する徴候または兆候のいずれかを改善することを意味する。そのような減少または予防の程度は、対応する未処置対照と比較して、いずれかの標準技術によって測定したとき、少なくとも３％、５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。疾患または症状を処置されている患者は、開業医がそのような疾患または症状を有すると診断した人物である。診断は、いかなる適当な手段で行ってもよい。疾患の進行している、または症状の予防を行っている患者は、そのような診断を受けた人物でもよく、またはそうでない人物でもよい。当技術分野の当業者であれば、これらの患者は、上記の通りに同じ標準的な試験を受けていてもよく、または、１つまたは複数の危険因子（例えば、家族歴または遺伝子の素因）の存在によるハイリスクを有する人物として、検査なしで同定されてもよいことを理解するであろう。
疾患および障害
一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子、本明細書において提供される二機能性分子を含む組成物または医薬組成物によって処置される対象の例示的な疾患としては、がん、代謝病、炎症性疾患、心血管疾患、感染症、遺伝病、ハプロ不全疾患または神経系疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、がんの例としては、悪性の、準悪性または良性のがんが含まれるが、これらに限定されるものではない。開示される方法を用いて処置されるがんには、例えば、固形腫瘍、リンパ腫または白血病が含まれる。一実施形態では、がんとしては、例えば以下のものが挙げられる：
脳腫瘍（例えば、悪性、準悪性または良性脳腫瘍（例えばグリア芽細胞腫）、星細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫または末梢神経外胚様性腫瘍）、癌腫（例えば、胆嚢癌腫、気管支癌腫、基底細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌腫、大細胞未分化癌腫、アデノーマ、嚢腺腫など）、細胞癌、テラトーマ、網膜芽細胞腫、脈絡膜黒色腫、セミノーマ、肉腫（例えば、Ｅｗｉｎｇ肉腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、平滑筋肉腫、Ａｓｋｉｎ腫瘍、リンパ肉腫、神経肉腫、カポシ肉腫、皮膚線維肉腫、血管肉腫など）、プラズマ細胞腫、頭頚部腫瘍（例えば、経口、喉頭、鼻咽頭、食道の、等。）、肝腫瘍、腎臓腫瘍、腎細胞腫瘍、扁平上皮癌、子宮腫瘍、骨腫瘍、前立腺腫瘍、Ｈｅｒ２および／またはＥＲ－および／またはＰＲ－である乳房腫瘍を含むがこれに限られない乳房腫瘍、膀胱腫瘍、膵腫瘍、子宮内膜腫瘍、扁平上皮癌、胃腫瘍、膠腫、結腸直腸腫瘍、睾丸腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、卵巣腫瘍、頸部腫瘍、目腫瘍、中枢神経系腫瘍（例えば、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫など）、甲状腺腫瘍、肺腫瘍（例えば、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺がん）、白血病またはリンパ腫（例えば、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、非皮膚末梢Ｔ細胞リンパ腫、ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ）（例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ））と関連しているリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ホジキンリンパ腫、バーキット－リンパ種、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または肝細胞癌等）、多発性骨髄腫、皮膚腫瘍（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫（例えば悪性黒色腫）、皮膚黒色腫または眼内黒色腫（隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌腫またはカポシ肉腫））、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫など）、ホジキン病、小腸がん、内分泌系のがん（例えば、甲状腺、副甲状腺または副腎などのがん）、中皮腫、尿道のがん、陰茎がん、ゴーリン症候群に関連した腫瘍（例えば、髄芽細胞腫、髄膜腫など）、原因不明の腫瘍、またはそれらのいずれかの転移。一部の実施形態では、がんは、肺腫瘍、乳房腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、頭頸部腫瘍、肝腫瘍、前立腺腫瘍、膠腫、未分化星状細胞腫、卵巣腫瘍または甲状腺腫瘍であるか、またはそのいずれかの転移である。一部の他の実施形態では、がんは、子宮内膜腫瘍、膀胱腫瘍、多発性骨髄腫、黒色腫、腎臓腫瘍、肉腫、頸部腫瘍、白血病および神経芽腫である。
他の例として、代謝疾患の例としては、糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、高脂血症、高コレステロール、動脈硬化、高血圧、非アルコール性脂肪肝炎、非アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝臓病、肝臓の脂肪変性およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
例えば、炎症性障害は、肥満、メタボリックシンドローム、免疫異常症、新生物、伝染性障害、化合物、炎症性腸障害、再灌流損傷、壊死またはそれらの組合せから部分的にまたは完全に生じる。一部の実施形態では、炎症性障害は、自己免疫不全、アレルギー、白血球欠損、対宿主性移植片病、組織移植拒否またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、炎症性障害は、細菌感染症、原生動物感染症、原生動物感染症、ウイルス感染症、真菌感染症またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、炎症性障害は、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗燐酸脂質抗体症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫内耳疾患、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、腹腔疾患、皮膚筋炎、糖尿病１型、糖尿病２型、子宮内膜症、グッドパスチュア症候群、グレーブズ病、ギランバレー症候群、リンパ腫性甲状腺腫、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、メタボリック症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、ナルコレプシー、肥満、尋常天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変症、慢性関節リウマチ、統合失調症、硬皮症、シェーグレン症候群、脈管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、アレルギー性鼻炎、前立腺がん、非小細胞肺癌腫、卵巣がん、乳がん、黒色腫、胃がん、結腸直腸がん、脳がん、転移性骨疾患、膵がん、リンパ腫、鼻ポリープ、胃腸管系がん、潰瘍性大腸炎、クローン障害、膠原大腸炎、リンパ性大腸炎、虚血性大腸炎、転換大腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎、不確定の大腸炎、炎症性肝臓疾患、内毒素ショック、リウマチ様脊椎炎、強直性脊椎炎、痛風関節炎、リウマチ性多発性筋痛、アルツハイマー障害、パーキンソン障害、癲癇、エイズ、認知症、喘息、急性呼吸不全症候群、気管支炎、嚢胞性線維形成、急性白血球を媒介された肺損傷、遠位性直腸炎、ウェゲナー肉芽腫症、線維筋痛、気管支炎、嚢胞性線維形成、ブドウ膜炎、結膜炎、乾癬、湿疹（皮膚炎）歯根膜の平滑筋増殖障害、髄膜炎、帯状疱疹、脳炎、腎炎、結核、網膜炎、過敏性皮膚炎、膵臓炎、歯肉炎（凝固壊死）、液化壊死、フィブリノイド壊死、超急性移植拒絶反応、急性移植拒絶反応、慢性移植拒絶反応、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）、またはそれらの組み合わせである。
他の例として、神経系疾患の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：
Ａａｒｓｋｏｇ症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）、失語症、Ｂｅｌｌ麻痺、クロイツフェルト－ヤコブ病、脳血管障害、コルネリアドランゲ症候群、癲癇およびその他重症発作疾患、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮、脆弱性Ｘ染色体症候群、Ｉｔｏメラニン減少症、Ｊｏｕｂｅｒｔ症候群、Ｋｅｎｎｅｄｙ疾患、Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ疾患、片頭痛、Ｍｏｅｂｉｕｓ症候群、筋強直性ジストロフィー、神経筋障害、ギラン－バレー、筋ジストロフィー、神経腫瘍学障害、神経線維腫症、神経免疫学的障害、多発性硬化症、痛み、小児科学的神経症、自閉症、失読症、神経耳科学障害、Ｍｅｎｉｅｒｅ病、パーキンソン病および移動障害、フェニルケトン尿症、ルービンスタイン－テービ症候群、睡眠障害、脊髄小脳失調Ｉ、スミス－レムリ－オピッツ症候群、Ｓｏｔｏｓ症候群、脊髄延髄萎縮、１型ドミナント小脳性運動失調、トゥレット症候群、結節性硬化症およびＷｉｌｌｉａｍ症候群。
本明細書で使用される用語「循環器病」は、心臓および血管の障害を指し、動脈、静脈、細動脈、小静脈および毛細管の障害が含まれる。循環器病の非限定的な例には、冠状動脈疾患、脳卒中（脳血管障害）、末梢血管疾患、心筋梗塞およびアンギナ、脳梗塞、脳溢血、心肥大、動脈硬化および心不全が含まれる。
本明細書で用いられる「感染症」という用語は、生物（例えばプリオン、細菌、ウイルス、菌類および寄生虫）によって生じるあらゆる障害を指す。感染症の例には、敗血性咽頭炎、細菌によって生じる尿路感染症または結核、一般的な寒気、嚢尾虫、水痘、またはウイルスによって生じるＡＩＤＳ、皮膚病（例えば白癬および足白癬）、菌類によって生じる肺感染または神経系感染症、および寄生虫によって生じるマラリア、が含まれるが、これらに限定されるものではない。感染症を生じさせ得るウイルスの例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：
アデノ随伴ウイルス、Ａｉｃｈｉウイルス、オーストラリアバットリッサウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バンナウイルス、バーマンフォレストウイルス、ブニヤンベラウイルス、ブンヤウイルス ラ クロッセ、ブンヤウイルス カンジキウサギ、セルコピテシンヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクンングニャウイルス、コロナウイルス、コサウイルスＡ、カウポックスウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア－コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、ドーリウイルス、ジュグベウイルス、デュベンヘイジウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、エボラウイルス、エコウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタイン－バーウイルス、欧州バットリッサウイルス、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス、ハンターンウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、ウマポックスウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス６８、７０、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト乳頭しゅウイルス１、ヒト乳頭しゅウイルス２、ヒト乳頭しゅウイルス１６，１８、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスＢ１９、ヒト呼吸系発疹ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス、ヒトＴ－リンホトロピックウイルス、ヒトトロウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、イスファハンウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、ジュニンアレナウイルス、キロサイクルポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスバットウイルス、ビクトリヤ湖マーバーグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、ロードスダーレウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、はしかウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、おたふくかぜウイルス、マレー谷脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパーウイルス、ノルウォークウイルス、ノロウイルス、オニョン－ニョンウイルス、オルフウイルス、口嚢ウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトーロ静脈ウイルス、プウマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロサウイルスＡ、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスＡ、パパタシ熱シシリアンウイルス、サッポロウイルス、セムリキフォレストウイルス、ソウルウイルス、重症急性呼吸症候群コロナウイルス２、サルフォーミーウイルス、シミアンウイルス５、シンドビスウイルス、サウスハンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介ポワサンウイルス、トルクテノウイルス、トスカナウイルス、ウウクニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘－帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、小胞性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ウーポリオーマウイルス、西ナイルウイルス、ヤーバサル腫瘍ウイルス、ヤーバ様疾患ウイルス、黄熱ウイルスおよびジカウイルス。
寄生虫によって生じる感染症の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
棘アメーバ感染症、棘アメーバ角膜炎感染症、アフリカ眠り病（アフリカトリパノソーマ症）、肺胞包虫症（包虫症、包虫症）、アメーバ症（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ感染症）、アメリカトリパノソーマ症（ｃｈａｇａｓ疾患）、鉤虫症（十二指腸虫）、広東住血線虫症（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ 感染症）、アニサキス症（アニサキス感染症、Ｐｓｅｕｄｏｔｅｒｒａｎｏｖａ感染症）、蛔虫症（蛔虫感染症、腸の回虫）、バベシア症（バベシア感染症）、バランチジウム症（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ感染症）、バラムチア、アライグマ回虫症（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ感染症、アライグマ回虫）、ダニ、Ｂｉｌｈａｒｚｉａ（住血吸虫症）、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ感染症、体シラミ侵襲（シラミ寄生症）、毛頭虫症（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ感染症）、セルカリア皮膚炎（水泳皮膚炎）、Ｃｈａｇａｓ疾患（アメリカトリパノソーマ症）、Ｃｈｉｌｏｍａｓｔｉｘ ｍｅｓｎｉｌｉ感染症（非病原性［無害］腸内原生動物）、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉａｓｉｓ（肝ジストマ感染症）、ＣＬＭ（皮膚幼虫移行症、鉤虫症、十二指腸虫）、「Ｃｒａｂｓ」（ケジラミ）、クリプトスポリジウム症（クリプトスポリジウム感染症）、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ、鉤虫症、十二指腸虫）、シクロスポリア症（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ感染症）、嚢虫症（神経嚢虫症）、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ 感染症（膀胱イソスポラ症、以前はＩｓｏｓｐｏｒａ感染症）、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ感染症、裂頭条虫症（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ感染症）、Ｄｉｐｙｌｉｄｉｕｍ ｃａｎｉｎｕｍ感染症（犬またはネコ条虫感染症）、ディロフィラリア症（イヌ糸状虫感染症）、ＤＰＤｘ、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｉａｓｉｓ（糸状虫疾患）、イヌ条虫（Ｄｉｐｙｌｉｄｉｕｍ ｃａｎｉｎｕｍ感染症）、包虫症（嚢胞性、肺胞包虫症）、象皮（フィラリア症、リンパフィラリア症）、Ｅｎｄｏｌｉｍａｘ ｎａｎａ感染症（非病原性［無害な］腸内原生動物）、体内寄生性アメーバ大腸菌の感染症（非病原性［無害な］腸内原生動物）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｄｉｓｐａｒ感染症（非病原性［無害な］腸内原生動物）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈａｒｔｍａｎｎｉ感染症（非病原性［無害な］腸内原生動物）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ感染症（アメーバ症）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｐｏｌｅｃｋｉ、蟯虫症（ギョウチュウ感染症）、肝蛭症（小束感染症）、肥大吸虫症（肥大吸虫属感染症）、フィラリア症（リンパフィラリア症、象皮）、ジアルジア症（ジアルジア感染症）、顎口虫症（顎ストーマ感染症）、糸状虫疾患（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｉａｓｉｓ）、アタマジラミ侵襲（シラミ寄生症）、異形吸虫症（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ感染症）、十二指腸虫感染症、ヒト、十二指腸虫感染症、人畜共通（鉤虫症、皮膚幼虫移行症［ＣＬＭ］）、包虫症（嚢胞性、肺胞包虫症）、膜様条虫症（膜様条虫感染症）、腸の回虫（蛔虫症、蛔虫感染症）、Ｉｏｄａｍｏｅｂａ ｂｕｅｔｓｃｈｌｉｉ感染症（非病原性［無害な］腸内原生動物）、Ｉｓｏｓｐｏｒａ感染症（Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ感染症を参照）、カラアザール（リーシュマニア症、レーシュマニア感染症）、角膜炎（棘アメーバ感染症）、リーシュマニア症（カラアザール、レーシュマニア感染症）、シラミ侵襲（体、頭、または陰部シラミ、シラミ寄生症、Ｐｔｈｉｒｉａｓｉｓ）、カンテツ（肝吸虫症、オピストルキス症、肝蛭症）、ロア糸状虫症（Ｌｏａ ｌｏａ感染症）、リンパフィラリア症（フィラリア症、象皮）、マラリア（プラスモディウム感染症）、微胞子虫症（微胞子虫感染症）、ダニ侵襲（疥癬）、ハエ蛆症、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ感染症、神経嚢虫症（嚢虫症）、眼幼虫移行症（トキソカラ症、Ｔｏｘｏｃａｒａ感染症、内臓幼虫移行症）、回旋糸状虫症（糸状虫症）、オピストルキス症（オピストルキス感染症）、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｉａｓｉｓ（肺吸虫感染症）、シラミ寄生症（頭部または本体シラミ侵襲）、Ｐｔｈｉｒｉａｓｉｓ（ケジラミ侵襲）、ギョウチュウ感染症（蟯虫症）、プラスモディウム感染症（マラリア）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ肺炎、Ｐｓｅｕｄｏｔｅｒｒａｎｏｖａ感染症（アニサキス症、アニサキス感染症）、陰部シラミ侵襲（「Ｃｒａｂｓ」、Ｐｔｈｉｒｉａｓｉｓ）、アライグマ回虫感染症（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉａｓｉｓ、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ感染症）、糸状虫症（回旋糸状虫症）、サッピニア（Ｓａｐｐｉｎｉａ）、サルコシスチス症（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｏｓｉｓ感染症）、疥癬、住血吸虫症（ビルハルツ住吸血虫）、眠り病（トリパノソーマ症、アフリカ眠り病）、土壌伝播蠕虫、糞線虫症（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ感染症）、水泳皮膚炎（セルカリア皮膚炎）、テニア症（ヒモ感染症、条虫感染症）、条虫感染症（テニア症、ヒモ感染症）、トキソカラ症（Ｔｏｘｏｃａｒａ感染症、眼幼虫移行症、内臓幼虫移行症）、トキソプラズマ症（トキソプラズマ感染症）、旋毛虫症（旋毛虫症）、Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ（旋毛虫症）、トリコモナス症（毛単一感染症）、鞭虫症（ベンチュウ感染症、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ感染症）、トリパノソーマ症、アフリカ（アフリカ眠り病、眠り病）、トリパノソーマ症、アメリカ（Ｃｈａｇａｓ疾患）、内臓幼虫移行症（トキソカラ症、Ｔｏｘｏｃａｒａ感染症、眼幼虫移行症）、ベンチュウ感染症（鞭虫症、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ感染症）、人畜共通疾患（動物からヒトへ蔓延する疾患）および人畜共通十二指腸虫感染症（鉤虫症、皮膚幼虫移行症［ＣＬＭ］）。菌類によって生じる感染症の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：
アスペルギルス症、バルソマイコ症、キャンディダ症、キャンディダオーリス、コクシジオイデス症、クリプトコッカスネオフォルマンス感染症、Ｃ．ｇａｔｔｉｉ感染症、菌類眼感染症、菌類爪感染症、ヒストプラスマ症、ムコール症、菌腫、ニューモシスチス肺炎、白癬、スポロトリクム症、クリプトコッカス症、およびタラモマイシス症。
感染症を生じさせる細菌の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．（例えばＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ））、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（例えばＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ ｂｉｏｖａｒ ｓｏｂｒｉａ （Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｏｂｒｉａ）、およびＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ））、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｍａｒｇｉｎａｌｅ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．（例えばＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ））、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（例えばＢａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．（例えばＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ））、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐ．（例えばＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．（例えばＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｎｔｅｎｓｉｓおよびＢｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ））、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．（例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ））、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉおよびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ））、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｕｍおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．（例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ））、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えばＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、（日和見主義的なものを含み、例えば腸内毒素原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、腸管組織侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸病原Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸侵襲的Ｅ．ｃｏｌｉ、および尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えばＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．（例えばＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｅｅｎｓｉａおよびＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ））、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．（例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｎｎｅｌｌｉａｅ））、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．（例えばＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ））、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ ｓｐ．（例えばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．（例えばＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｙｒｉａｃｉｇｅｏｒｇｉｃａおよびＮｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．（例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ．Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．（例えばＰｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓおよびＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．（例えばＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉおよびＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．（例えばＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉおよびＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ（以前Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）およびＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．（例えばＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ およびＳｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．（例えばＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えばクロラムフェニコール耐性血清型４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、スペクチノマイシン耐性血清型６Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ストレプトマイシン耐性血清型９Ｖ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、エリスロマイシン耐性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、オプトシン耐性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、リファムピシン耐性血清型１８Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、テトラサイクリン耐性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ペニシリン耐性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびトリメトプリム耐性血清型２３Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、クロラムフェニコール耐性血清型４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ストレプトマイシン耐性血清型６Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ストレプトマイシン耐性血清型９Ｖ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、オプチシン耐性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、リファマイシン耐性血清型１８Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ペニシリン耐性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはトリメトプリム耐性血清型２３Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、グループＡ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、グループＢ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、グループＣ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｍｉｌｉｓ、グループＤ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、グループＦ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ グループＧ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．（例えばＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｔｅｎｕｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｅｎｄｅｍｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈ

ｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．（例えばＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈｏｌｌｉｓａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａおよびＶｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｉｉ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．（例えばＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ。
本明細書中で使用する「遺伝子病」なる用語は、ゲノムの１つまたは複数の異常によって生じる健康問題を意味する。それは、単一の遺伝子（一遺伝子）または同義遺伝子（ポリジーン）の変異によって、または染色体異常によって生じ得る。単一遺伝子病は、常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖優性、Ｘ連鎖劣性、Ｙ連鎖またはミトコンドリア変異に関連し得る。遺伝病の例としては、以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：
１ｐ３６ 欠失症候群、１８ｐ欠失症候群、２１－ヒドロキシラーゼ欠損、４７、ＸＸＸ（３重Ｘ症候群）、ＡＡＡ症候群（ａｃｈａｌａｓｉａ－ａｄｄｉｓｏｎｉａｎｉｓｍ－ａｌａｃｒｉｍａ症候群）、Ａａｒｓｋｏｇ－Ｓｃｏｔｔ症候群、ＡＢＣＤ症候群、無セルロプラスミン血症、無手足症、軟骨無形成ＩＩ型、軟骨発育不全症、急性間欠性ポルフィリン症、アデノコハク酸リアーゼ欠損、アドレノロイコジストロフィー、成人症候群、Ａｉｃａｒｄｉ－Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ症候群、Ａｌａｇｉｌｌｅ症候群、白化、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ疾患、アルカプトン尿症、α１－抗トリプシン欠損、アルポート症候群、Ａｌｓｔｒｏｍ症候群、幼年期の交代性半側麻痺、アルツハイマー病、エナメル質形成不全、アミノレブリン酸デヒドラターゼ欠損ポルフィリア、筋萎縮性側索硬化症－前頭側頭型認知症、Ａｎｄｒｏｇｅｎ不感症候群、アンゲルマン症候群、アペール症候群、関節拘縮－腎障害－胆汁うっ滞症候群、毛細管拡張性運動失調、Ａｘｅｎｆｅｌｄ症候群、Ｂｅａｒｅ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｃｕｔｉｓ ｇｙｒａｔａ症候群、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ－ Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、Ｂｅｎｊａｍｉｎ症候群、ビオチニダーゼ欠損、Ｂｉｒｔ－Ｈｏｇｇ－Ｄｕｂｅ症候群、Ｂｊｏｒｎｓｔａｄ症候群、ブルーム症候群、Ｂｒｏｄｙミオパシー、Ｂｒｕｎｎｅｒ症候群、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、Ｃａｍｐｏｍｅｌｉｃ異形成、Ｃａｎａｖａｎ疾患、ＣＡＲＡＳＩＬ症候群、大工症候群、脳形成異常－ニューロパシー－魚りん癬－角皮症候群（ＳＥＤ人）、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ病、電荷症候群、Ｃｈｅｄｉａｋ－Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、慢性的な肉芽腫性障害、鎖骨頭蓋骨形成不全、コケイン症候群、コフィン－ローリー症候群、Ｃｏｈｅｎ症候群、コラーゲン異常症、タイプＩＩおよびＸＩ、無汗症（ＣＩＰＡ）を有する痛みに対する先天性無感覚、先天性筋ジストロフィー、コルネリアドランゲ症候群（ＣＤＬ）、Ｃｏｗｄｅｎ症候群、ＣＰＯ欠損（コプロポルフィリン症）、Ｃｒａｎｉｏ－ｌｅｎｔｉｃｕｌｏ－ｓｕｔｕｒａｌ異形成、Ｃｒｉ ｄｕ ｃｈａｔ、クローン病、Ｃｒｏｕｚｏｎ症候群、Ｃｒｏｕｚｏｎｏｄｅｒｍｏｓｋｅｌｅｔａｌ症候群（黒色表皮腫を有するＣｒｏｕｚｏｎ症候群）、嚢胞性線維症、ダリエ病、Ｄｅ Ｇｒｏｕｃｈｙ症候群、Ｄｅｎｔ’ｓ疾患（遺伝子のカルシウム過剰尿）、Ｄｅｎｙｓ－Ｄｒａｓｈ症候群、Ｄｉ Ｇｅｏｒｇｅ症候群、遠位性遺伝運動神経障害、多型、末梢型筋ジストロフィー、ダウン症候群、Ｄｒａｖｅｔ症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィー、Ｅｄｗａｒｄｓ症候群、エーラース－ダンロス症候群、エメリー－Ｄｒｅｉｆｕｓｓ症候群、表皮水疱症、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症、Ｆａｂｒｙ病、因子Ｖ Ｌｅｉｄｅｎ血栓形成傾向、家族性腺腫様ポリープ症、家族性Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄ－Ｊａｋｏｂ疾患、家族性自律神経失調症、ファンコニ貧血（ＦＡ）、致死性家族性不眠症、Ｆｅｉｎｇｏｌｄ症候群、ＦＧ症候群、脆弱性Ｘ染色体症候群、Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ運動失調、Ｇ６ＰＤ欠損、ガラクトース血症、ゴーチェ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ症候群、Ｇｌｕｔａｒｉｃ酸尿症、Ｉ型およびＩＩ型、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ症候群、Ｈａｉｌｅｙ－Ｈａｉｌｅｙ疾患、ハーレクイン型魚りん癬、遺伝性、ヘモクロマトーシス血友病、肝性骨髄性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性出血性毛細管拡張（Ｏｓｌｅｒ－Ｗｅｂｅｒ－Ｒｅｎｄｕ症候群）、遺伝封入体本体ミオパシー、遺伝性多発性外骨症、遺伝性圧迫性麻痺ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、遺伝性痙性対麻痺（幼児発症遺伝痙攣性麻痺）、ヘルマンスキー－パドラック症候群、内臓逆位、ホモシスチン尿症、Ｈｕｎｔｅｒ症候群、ハンチントン舞踏病、投手症候群、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ－Ｇｉｌｆｏｒｄ早老症候群、高リシン血症、高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、低αリポタンパク血症（タンジール病）、軟骨低発生症、低軟骨形成症、免疫不全動原体性不安定性顔面の異常症候群（ＩＣＦ症候群）、色素失調症、坐骨膝蓋骨異形成、Ｉｓｏｄｉｃｅｎｔｒｉｃ １５、Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｗｅｉｓｓ症候群、Ｊｏｕｂｅｒｔ症候群、若年性原発性側索硬化（ＪＰＬＳ）、ケロイド障害、Ｋｎｉｅｓｔ異形成、Ｋｏｓａｋｉ過成長症候群、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｋｕｆｏｒ－Ｒａｋｅｂ症候群、ＬＣＡＴ欠損症、レッシューナイハン症候群、Ｌｉ－Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群、肢帯筋ジストロフィー、リポタンパク質リパーゼ欠損、Ｌｙｎｃｈ症候群、悪性高熱症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、マロトー－ラミー症候群、ＭｃＣｕｎｅ－アルブライト症候群、ＭｃＬｅｏｄ症候群、ブルセラ症、家族性、ＭＥＤＮＩＫ症候群、メンケス疾患、メトヘモグロビン血症、Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ酸血症、ミクロ症候群、小頭症，Ｍｏｒｑｕｉｏ症候群、Ｍｏｗａｔ－Ｗｉｌｓｏｎ症候群、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、多内分泌腺腫１型（ウェルマー症候群）、複合内分泌腺新生物２型、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー、ＤｕｃｈｅｎｎｅおよびＢｅｃｋｅｒ型、ミオスタチン関連の筋肥大、筋強直性ジストロフィー、Ｎａｔｏｗｉｃｚ症候群、Ｉ型神経線維腫症、神経線維腫症ＩＩ型、ニーマン－ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、無症候性聴覚障害、Ｎｏｏｎａｎ症候群、Ｎｏｒｍａｎ－Ｒｏｂｅｒｔｓ症候群、Ｏｇｄｅｎ症候群、Ｏｍｅｎｎ 症候群、骨形成不全症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、Ｐａｔａｕ症候群（トリソミー１３）、ＰＣＣ欠損（プロピオン酸の酸血症）、Ｐｅｎｄｒｅｄ症候群、Ｐｅｕｔｚ－Ｊｅｇｈｅｒｓ症候群、プファイファー症候群、フェニルケトン尿症、Ｐｉｐｅｃｏｌｉｃ酸血症、Ｐｉｔｔ－Ｈｏｐｋｉｎｓ症候群、多発性嚢胞腎、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、ポルフィリア、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、プラーダー－ビリ症候群、原発性毛様体ジスキネジア（ＰＣＤ）、原発性肺高血圧、プロテインＣ欠損、タンパク質Ｓ欠損、疑似Ｇａｕｃｈｅｒ病、弾性線維偽黄色腫、色素性網膜炎、Ｒｅｔｔ症候群、Ｒｏｂｅｒｔｓ症候群、ルービンスタイン－テービ症候群（ＲＳＴＳ）、Ｓａｎｄｈｏｆｆ疾患、Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ症候群、Ｓｃｈｗａｒｔｚ－Ｊａｍｐｅｌ症候群、Ｓｈｐｒｉｎｔｚｅｎ－Ｇｏｌｄｂｅｒｇ症候群、鎌状赤血球貧血、Ｓｉｄｅｒｉｕｓ Ｘ連鎖の精神障害症候群、担鉄芽球性貧血、シェーグレンラルソン症候群、狡猾症候群、スミス－レムリ－オピッツ症候群、Ｓｍｉｔｈ－Ｍａｇｅｎｉｓ 症候群、Ｓｎｙｄｅｒ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ症候群、脊髄筋萎縮、脊髄小脳失調（タイプ１～２９）、脊椎骨端異形成ｃｏｎｇｅｎｉｔａ（ＳＥＤ）、ＳＳＢ症候群（ＳＡＤＤＡＮ）、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ疾患（黄斑部変性）、Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群（多形）、Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ症候群（脊椎骨端骨幹端異形成、Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋタイプ）、テイ－サックス病、テトラヒドロビオプテリン欠損、死に至る異形成、Ｔｒｅａｃｈｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ症候群、結節性硬化症（ＴＳＣ）、ターナー症候群、Ｕｓｈｅｒ症候群、異型ポルフィリン症、フォンヒッペル－リンダウ病、ワールデンブルヒ症候群、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ－Ｚｗｅｙｍｕｌｌｅｒ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、オオカミ－Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群、Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ－Ｓａｋａｔｉ症候群、Ｘ連鎖の知的障害およびマクロラン症状（脆弱性Ｘ染色体症候群）、Ｘ－連鎖重症複合免疫欠損症（Ｘ－ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖担鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、Ｘ連鎖脊髄延髄性筋萎縮（脊髄および延髄筋萎縮）、色素性乾皮症、Ｘｐ１１．２重複症候群、ＸＸＸＸ症候群（４８、ＸＸＸＸ）、ＸＸＸＸＸ症候群（４９、ＸＸＸＸＸ）、ＸＹＹ症候群（４７，ＸＹＹ）、ツェルヴェーガー症候群。
本明細書に記載のすべての参照、刊行物、特許および特許出願は、それらを参照することにより、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的および個々に引用されたかのように、本明細書に組み込まれる。
上記の実施形態は、前述の機能的特性を達成するために組み合わせることができる。これはまた、例示的な組合せおよび機能的特性が達成されることを記載する下記の実施例においても例示される。
以下の例は、さらに本開示の一部の実施形態を例示するために提供されるが、本開示の範囲を制限することを目的とするものではなく、当業者に知られている他の手順、方法論または技術を用いてもよいことは、それらの例示的な性質によって十分に理解されるところであろう。
実施例１：ＲＮＡ標的に結合するＡＳＯの生成
ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）をコードするＲＮＡ転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインする方法を開発および試験した。
Ｒｌｕｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＦ０２５８４６）の配列について、一般公開されているプログラム（//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAxs/RNAxs.cgi）にアクセスし、典型的に、－８ｋｃａｌ未満、配列長として２０ヌクレオチドを有する、高い結合エネルギーのＡＳＯに適している領域を同定した。連続する３つを超えるＧのヌクレオチドを有するＡＳＯを除外した。最も高い結合エネルギーを有するＡＳＯは、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）でその次に処理し、ヌクレオチド配列に基づくそれらの潜在的な結合選択性を検討し、他の配列に対する少なくとも２つのミスマッチを有するそれらを保持した。選択されたＡＳＯは、次に以下の通りに合成した。
５’－アミノＡＳＯの合成
製造業者のプロトコールに従って、５’－アミノＡＳＯは、Ｄｒ．Ｏｌｉｇｏ ４８（Ｂｉｏｌｙｔｉｃ Ｌａｂ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｃ．）シンセサイザーを用いた典型的な階段的固相オリゴヌクレオチド合成法によって合成した。１０００ｎｍｏｌスケールの汎用ＣＰＧカラム（Ｂｉｏｌｙｔｉｃ Ｌａｂ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｃ．ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ １６８－１０８４４２－５００）を固体担体として利用した。モノマーは、保護基を有する修飾ＲＮＡホスホロアミダイト（５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－Ｎ６－ベンゾイルアデノシン－３’－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチル－Ｎ４－ベンゾイル－シチジン－３’－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－Ｎ２－イソブチリル－グアノシン－３’－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト、５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチル－ウリジン－３’－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）であり、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から購入した。５’－アミノ修飾は、合成の最終工程のＴＦＡ－アミノＣ６－ＣＥＤホスホロアミダイト（６－（トリフルオロアセチルアミノ）－ヘキシル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホロアミダイト）の使用を必要とした。すべてのモノマーは、シンセサイザーで使用する前に、無水アセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１１７０）で０．１Ｍまで希釈した。
オリゴヌクレオチドシンセサイザー上での合成のために使用する、ジクロロメタン中の３％のトリクロロ酢酸（ＤＭＴ除去試薬、ＲＮ－１４６２）、アセトニトリル中の０．３ Ｍのベンジルチオテトラゾール（活性化試薬、ＲＮ－１４５２）、９：１のピリジン／アセトニトリル（硫化試薬、ＲＮ－１６８９）中の０．１Ｍの（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾールイン－３－チオン、０．２ Ｍのヨウ素／ピリジン／水／テトラヒドロフラン（酸化溶液、ＲＮ－１４５５）、無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフラン（ＣＡＰ Ａ溶液、ＲＮ－１４５８）、テトラヒドロフラン中の１０％のＮ－メチルイミダゾール（ＣＡＰ Ｂ溶液、ＲＮ－１４８１）、を含む市販の試薬は、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から購入した。シンセサイザー上での使用のための無水アセトニトリル（洗浄試薬、ＢＰ１１７０）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。すべての溶液および試薬は、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した乾燥用のトラップ（ＤＭＴ－１９７５、ＤＭＴ－１９７４、ＤＭＴ－１９７３、ＤＭＴ－１９７２）を用いて無水状態を維持した。
シアノエチル保護基の除去
第一級アミン上のアクリロニトリル付加体の形成を防止するために、２’－シアノエチル保護基を、アミンの脱保護の前に除去した。５分間のカラムとの接触を維持するために、必要に応じて、カラムにアセトニトリルの中１０％ジエチルアミン溶液を添加した。カラムを次に、アセトニトリル５００μＬで５回洗浄した。
脱保護および切断
オリゴヌクレオチドは、他の保護基の同時の脱保護と共に担体から切断した。カラムを、圧力除去キャップを有するねじ口バイアル（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＧ－４９１２－０１）へ移した。１ｍＬの水酸化アンモニウムをバイアルに添加し、バイアルを１６時間５５℃に加熱した。バイアルを室温に冷却し、アンモニア溶液を１．５ｍＬのマイクロチューブへ移した。ＣＰＧ担体をＲＮＡｓｅフリーの分子生物学グレード水２００μＬによって洗浄し、水をアンモニア溶液に添加した。得られた溶液を、遠心蒸発器（ＳｐｅｅｄＶａｃ ＳＰＤ１０３０）において濃縮した。
沈殿
残余物をＲＮＡｓｅフリーの分子生物学グレード水の３６０μＬに溶解させ３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液４０μＬを添加した。不純物を除去するために、マイクロチューブを１０分間高速（１４０００ｇ）で遠心分離した。上清を２ｍＬの包装したマイクロチューブへ移した。１．５ｍＬのエタノールを透明な溶液に添加し、チューブをボルテックスし、次に１時間－２０℃で保存した。マイクロチューブを次に、１５分間、５℃、高速（１４０００ｇ）で遠心分離した。ペレットを破壊せずに上清を慎重に除去し、ペレットをＳｐｅｅｄＶａｃにおいて乾燥させた。オリゴヌクレオチド収率を質量計算によって推定し、ペレットをＲＮＡｓｅフリーの分子生物学グレード水において再懸濁し８ｍＭの溶液を得、次のステップで用いた。
表１Ａおよび１Ｂに示される特異的なＲＮＡ標的を標的とするＡＳＯを設計し、適切に合成したことが実証された。
実施例２：二機能性分子の設計および合成
小分子にＲｕｌｃを標的とするＡＳＯをコンジュゲートする方法を開発および試験した。Ｒｌｕｃを標的とするため、二機能性モダリティーを用いた。そのモダリティーは、特定のＲＮＡ分子を標的とする第１のドメイン（このドメインはＲＮＡ結合タンパク質、ＡＳＯ、または小分子とすることができる）と、標的とするＲＮＡの翻訳をモジュレートするタンパク質と相互作用する第２のドメイン（例えば、タンパク質、アプタマー、小分子／阻害剤）、の２つのドメインを用い、リンカーによって２つのドメインを連結することを含む。モダリティーは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）を標的とするＡＳＯを、Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）タンパク質のＡＴＰ結合ポケットを結合／動員する小分子、イブルチニブまたはイブルチニブ－ＭＰＥＡに連結させたものとした（／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２４／ｍｏｌ．１１６．１０７０３７）。
Figure 2023522957000043
実施例１から合成した５’－アミノＡＳＯを用い、下記のスキーム１に従い、ＡＳＯ－小分子コンジュゲートを製造した。
Figure 2023522957000044
５’－アジド－ＡＳＯは、５’－アミノ－ＡＳＯから生成した。
５’－アミノＡＳＯの溶液（２ｍＭ、１５μＬ、３０ｎｍｏｌｅ）を、ホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５、７５μＬ）と混合した。Ｎ３－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルの溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、３０μＬ、３００ｎｍｏｌ）を次に添加し、混合物を１６時間、室温でオービタル振とうした。溶液を、ＳｐｅｅｄＶａｃによって一晩乾燥させた。得られた残余物を、水（２０μＬ）中に再び溶解させ、ＲＰ－ＨＰＬＣ逆相によって精製し、５’－アジドＡＳＯ（ナノドロップＵＶ－ＶＩＳの定量化により１２～２１ｎｍｏｌ）を得た。この５’－アジドＡＳＯの水溶液（水中の２ｍＭ、７μＬ）を、ＰＣＲチューブ中でイブルチニブ－ＭＰＥＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳおよびイブルチニブ－ＭＰＥＡから合成され、逆相ＨＰＬＣ、ＤＭＳＯ中２ｍＭ、２１μＬによって精製）と混合し、１６時間、室温でオービタル振とうした。反応混合物を、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて６～１６時間、室温で乾燥させた。得られた残余物を水（２０μＬ）に再び溶解させ、遠心分離して清澄な上清を得、それを移し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、１，３－位置異性体の混合物としてＡＳＯ－Ｌｉｎｋｅｒ－イブルチニブ－ＭＰＥＡコンジュゲートを得た（ナノドロップＵＶ－ＶＩＳ定量化により４．０～７．８ｎｍｏｌ）。一部の場合では、反応混合物は、精製のため、ＨＰＬＣに直接注入した。コンジュゲートを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）またはエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって特徴づけおよび確認した。例示的な結果は図１に示す。
実施例３：インビトロでのＲＮＡ－二機能性－タンパク質三元複合体の形成
ＲＮＡ－二機能性－タンパク質三元複合体を形成する方法を開発および試験した。
実施例３ａ：二機能性のデザイン
二機能性分子は、ＡＳＯ、リンカー、およびイブルチニブ－ＭＰＥＡから構成される。ＡＳＯは、二機能性分子のＲＮＡ結合剤部分である。イブルチニブ－ＭＰＥＡは、エフェクター／タンパク質リクルーターである。ＡＳＯおよびイブルチニブ－ＭＰＥＡは、スキーム１に示すようにリンカーによって共に繋がれる。Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）タンパク質（／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２４／ｍｏｌ．１１６．１０７０３７）のＡＴＰ結合ポケットと共有結合する阻害剤イブルチニブは、ＡＳＯにコンジュゲートされた。コンジュゲートを得るため、実施例１および２のプロトコールに従った。
三元複合体は、一緒に結合された３つの異なる分子を含む複合体である。二機能性分子の複合体は、それぞれ、ＡＳＯによってその標的ＲＮＡと、および小分子ドメインによってその標的タンパク質と相互作用することが示された。阻害剤のコンジュゲートしたアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、ＡＳＯｉと記載する）（すなわち、イブルチニブ－ＭＰＥＡにコンジュゲートしたＲｌｕｃ ＡＳＯ）を、阻害剤（すなわち、ＢＴＫ）のタンパク質標的およびＡＳＯ（すなわち、Ｒｌｕｃ ＲＮＡ）のＲＮＡ標的と共に混合し、タンパク質と反応させ、ＲＮＡ標的とハイブリダイズさせ、全３つの分子を含む三元複合体を形成させた。同様に、図２Ａに示すように、５’端にイブルチニブ（ＢＴＫ阻害剤；ＢＴＫｉ）およびＡＳＯのＲＮＡ標的（すなわち、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ）をコンジュゲートした、配列５’ＣＧＵＵＡＡＣＵＡＧＧＣＵＵＵＡ３’（配列番号４）を有するＭＡＬＴ１ターゲティングＡＳＯによっても実施した。図２Ｂは、三元複合体の形成を検出するゲル解析の結果を示し、標的タンパク質に対するＡＳＯｉの結合は、タンパク質を、その分子量増加のため、ポリアクリルアミドゲルの高い位置に移動（上へシフト）する。ＡＳＯｉ－タンパク質複合体に対する標的ＲＮＡのさらなるハイブリダイゼーションは、ゲル上でさらに高い位置のタンパク質のバンドを「スーパーシフト」し、すなわち全３つの成分が複合体において安定して会合したことを示すものであった。さらにまた、蛍光色素による標的ＲＮＡの標識は、スーパーシフトしたタンパク質複合体の標的ＲＮＡの直接の視覚化を可能にした。
実施例３ｂ：インビトロ三元複合体形成アッセイ
１つの反応（＃１）において、１０ｐｍｏｌのイブルチニブと５’末端でコンジュゲートしたＭＡＬＡＴ１ターゲティングＡＳＯ（以下Ｎ３３－ＡＳＯｉと称する）を、２ｐｍｏｌの精製されたＢＴＫタンパク質、２００ｐｍｏｌの酵母ｒＲＮＡ（非特異的ブロッカーとして）、および２０ｐｍｏｌのＣｙ５標識された以下の配列：
５’ＣＣＵＵＧＡＡＡＵＣＣＡＵＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＧＡＡＵＵＧＣＧＵＣＡＵＵＵＡＡＡＧＣＣＵＡＧＵＵＡＡＣＧＣＡＵＵＵＡＣＵＡＡＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＡＡＵＧＧＡＡＡＧＡＵＵＡＡＵＵＧＧＧＡＧＵＧＧＵＡＧＧＡＵＧＡＡＡＣＡＡＵＵＵＧＧＡＧＡＡＧＡＵＡＧＡＡＧＵＵＵＧＡＡＧＵＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＵＡＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ３’（配列番号５）
のＩＶＴ ＲＮＡと共にＰＢＳ中で混合した。
対照として、以下の反応において、２００ｐｍｏｌの酵母ｔＲＮＡおよび以下の成分をＰＢＳ中で混合した：
（＃２）２ｐｍｏｌの精製ＢＴＫタンパク質のみ（非複合タンパク質のゲル上のバンドサイズを同定するため）；
（＃３）２ｐｍｏｌの精製ＢＴＫタンパク質および１０ｐｍｏｌのＮ３３－ＡＳＯｉ（２成分シフトしたバンドのサイズを同定するため）；
（＃４）２ｐｍｏｌの精製ＢＴＫタンパク質および２０ｐｍｏｌのＣｙ５－ＩＶＴ ＲＮＡ（標的ＲＮＡが直接Ｃｙ５－ＩＶＴ ＲＮＡと相互作用するか否かを試験するため）；
（＃５）１０ｐｍｏｌのイブルチニブと５’末端でコンジュゲートした配列５’ＡＧＡＧＧＵＧＧＣＧＵＧＧＵＡＧ３’の非相補的ＲＮＡオリゴ（以下ＳＣＲ－ＡＳＯｉと称する配列番号６）、および２ｐｍｏｌの精製ＢＴＫタンパク質（三元複合体の形成が相補的なＡＳＯ配列を必要とするか否かを試験するため）；
（＃６）２ｐｍｏｌの精製ＢＴＫタンパク質および１０ｐｍｏｌのＳＣＲ－ＡＳＯｉ（イブルチニブ修飾されたスクランブルされたＡＳＯがＢＴＫタンパク質バンドをサイズシフトすることができることを示すため）。
すべての反応は、光から保護して９０分間室温でインキュベートし、最終的に０．５％のＳＤＳおよび１０％のグリセリンを含むようローディング緩衝液を混合し、ＩＲＤｙｅ７００プレステインドタンパク質分子量マーカー（ＬｉＣｏｒ）を含むＢｉｓ－トリス４～１２％ゲルでのＰＡＧＥによって複合体を分離した。泳動の直後、７００ｎｍのチャネルを有するＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを使用してゲルをイメージングし、Ｃｙ５－ＩＶＴ－ＲＮＡのバンドおよびＭＷマーカーの位置を同定した。次に、ゲルのタンパク質を、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅコロイドクマシー染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を用いて染色し、透射光を用いて再イメージングした。サイズマーカーおよびレーン位置を使用して、２つのイメージを整列させ、ＢＴＫタンパク質バンドおよびＣｙ５－ＩＶＴ標的ＲＮＡの相対位置を同定した。（図３）
Ｎ３３－ＡＳＯｉを反応させたときの、ＢＴＫタンパク質バンドのＭＷの増加は（サンプル１および３対２）、二元複合体形成を示し、また、Ｃｙ５－ＩＶＴ ＲＮＡの存在下、さらなるスーパーシフトが、Ｎ３３－ＡＳＯｉによって観察されたが（サンプル１対サンプル３）、ＳＣＲ－ＡＳＯｉでは観察されず、全３つの成分は複合体に存在し、その形成は相補的配列をハイブリダイズさせる程に特異的である。この複合体は、スーパーシフトしたＢＴＫタンパク質バンドに重なっているＣｙ５－ＩＶＴ－ＲＮＡ蛍光シグナルによって、さらに確認された。
二機能性分子が、ＡＳＯを介して標的ＲＮＡと、また小分子によって標的タンパク質と相互作用することが観察された。
実施例４：二機能性分子およびＢＴＫ融合エフェクターによるＲＮＡ翻訳の増加
エフェクタータンパク質および二機能性分子により標的ＲＮＡの翻訳を増強させる方法を開発および試験した。
実施例４ａ：二機能性のデザイン
ウミシイタケルシフェラーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする、それぞれＡＳＯ２およびＡＳＯ３は、実施例２ａに記載されるようにイブルチニブ－ＭＰＥＡと５’末端でコンジュゲートされた。非ターゲティング対照ＡＳＯ１もまた、実施例３ａに記載されるようにイブルチニブ－ＭＰＥＡと５’末端でコンジュゲートされた。
実施例４ｂ：標的ベクターデザイン
ウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡをコードする標的転写物およびタンパク質は、ｐＲＬ－ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＦ０２５８４６）から発現された。
実施例４ｃ：エフェクターベクターデザイン
哺乳動物発現プラスミドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーおよびプロモーターおよびポリアデニル化シグナル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって合成したＤＮＡ断片）を合成しクローニングすることにより生成した。エフェクターをコードするＤＮＡ配列を合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、その後、ＣＭＶプロモーターとポリＡシグナルの間にクローニングした。エフェクターは、Ｎ末端からＣ末端の順で、以下の部分から作製された。
以下のアミノ酸配列：
KNAPSTAGLGYGSWEIDPKDLTFLKELGTGQFGVVKYGKWRGQYDVAIKMIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGCLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVNDQGVVKVSDFGLSRYVLDDEYTSSVGSKFPVRWSPPEVLMYSKFSSKSDIWAFGVLMWEIYSLGKMPYERFTNSETAEHIAQGLRLYRPHLASEKVYTIMYSCWHEKADERPTFKILLSNILDVMDEES（配列番号７）
を有する、ＢＴＫタンパク質をコードする配列
以下のアミノ酸配列：MATVEPETTPTPNPPTTEEEKTESNQEVANPEHYIKHPLQNRWALWFFKNDKSKTWQANLRLISKFDTVEDFWALYNHIQLSSNLMPGCDYSLFKDGIEPMWEDEKNKRGGRWLITLNKQQRRSDLDRFWLETLLCLIGESFDDYSDDVCGAVVNVRAKGDKIAIWTTECENREAVTHIGRVYKERLGLPPKIVIGYQSHADTATKSGSTTKNRFVV（配列番号８）を有する、ＥＩＦ４Ｅタンパク質をコードする配列
以下のアミノ酸配列：
MSATSVDTQRTKGQDNKVQNGSLHQKDTVHDNDFEPYLTGQSNQSNSYPSMSDPYLSSYYPPSIGFPYSLNEAPWSTAGDPPIPYLTTYGQLSNGDHHFMHDAVFGQPGGLGNNIYQHRFNFFPENPAFSAWGTSGSQGQQTQSSAYGSSYTYPPSSLGGTVVDGQPGFHSDTLSKAPGMNSLEQGMVGLKIGDVSSSAVKTVGSVVSSVALTGVLSGNGGTNVNMPVSKPTSWAAIASKPAKPQPKMKTKSGPVMGGGLPPPPIKHNMDIGTWDNKGPVPKAPVPQQAPSPQAAPQPQQVAQPLPAQPPALAQPQYQSPQQPPQTRWVAPRNRNAAFGQSGGAGSDSNSPGNVQPNSAPSVESHPVLEKLKAAHSYNPKEFEWNLKSGRVFIIKSYSEDDIHRSIKYSIWCSTEHGNKRLDSAFRCMSSKGPVYLLFSVNGSGHFCGVAEMKSPVDYGTSAGVWSQDKWKGKFDVQWIFVKDVPNNQLRHIRLENNDNKPVTNSRDTQEVPLEKAKQVLKIISSYKHTTSIFDDFAHYEKRQEEEEVVRKERQSRNKQ（配列番号９）
を有する、ＹＴＨＤＦ１タンパク質をコードする配列
以下のアミノ酸配列：ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１０）を有する、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列
以下のアミノ酸配列：
VSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK（配列番号１１）
を有する、単量体高感度蛍光タンパク質（ｍＥＧＦＰ）タンパク質をコードする配列
実施例４ｄ：二機能性分子のトランスフェクション
実施例４ａに記載のイブルチニブコンジュゲートＡＳＯ（以下の表５に示す）を、実施例４ｂに記載の標的ウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミド、ならびに実施例４ｃに記載のＢＴＫ－ＹＴＨＤＦ１エフェクタータンパク質を発現するプラスミドと共に、ヒト細胞へとコトランスフェクションした。
９６ウェル細胞培養プレートの７０％コンフルエントのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、５０ナノグラムの標的ルシフェラーゼプラスミドおよび１００ナノグラムのＢＴＫ－ＹＴＨＤＦ１エフェクターを発現するプラスミドをトランスフェクションした。２４時間後、製造業者の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮａｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、最終濃度１００ｎＭで、ターゲティング（試験）および非ターゲティング（対照）ＡＳＯｉを細胞に別々にトランスフェクションした。各条件について、細胞をリカバーさせ、次いでＡＳＯｉｓのトランスフェクションの４８時間後に解析した。
実施例４ｅ：ルシフェラーゼ活性によるタンパク質発現の測定
製造業者の指示に従い、各条件でのタンパク質発現に相当するルシフェラーゼ活性を測定するため、Ｐｉｅｒｃｅ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。発光は、製造業者の指示に従い、ＧｌｏＭａｘプレートリーダーおよびその統合ソフトウェア（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）によって測定および定量した（図４）。類似の結果が、ＹＴＨＤＦ１を別のエフェクター、ＥＩＦ４Ｅによって置き換えた場合に見出された（図５）。
Figure 2023522957000045

Claims (32)

  1. 細胞中の標的リボ核酸（ＲＮＡ）の翻訳を増加させる方法であって、
    アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または第１の小分子を含む第１のドメインであって、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合する、第１のドメイン、
    第２の小分子またはアプタマーを含む第２のドメインであって、標的ポリペプチドに特異的に結合する、第２のドメイン、および
    第１のドメインを第２のドメインにコンジュゲートするリンカー
    を含む合成二機能性分子を細胞に投与することを含み、
    標的ポリペプチドが、細胞中の標的ＲＮＡの翻訳を促進、ブースト、または増加させる、方法。
  2. 標的ポリペプチドが標的タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 第１のドメインがＡＳＯを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 第１のドメインがＡＳＯを含み、ＡＳＯが１つもしくは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）、１つもしくは複数の修飾核酸塩基、またはその組合せを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 第１のドメインがＡＳＯを含み、ＡＳＯが５’ロックド末端ヌクレオチド、３’ロックド末端ヌクレオチド、または５’および３’ロックド末端ヌクレオチドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 第１のドメインがＡＳＯを含み、ＡＳＯがＡＳＯにおける内部位置にロックドヌクレオチドを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 第１のドメインがＡＳＯを含み、ＡＳＯが３０％～６０％のＧＣ含量を含む配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 第１のドメインがＡＳＯを含み、ＡＳＯが８～３０ヌクレオチドの長さを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 第１のドメインがＡＳＯを含み、ＡＳＯがウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）ＲＮＡに結合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 第１のドメインがＡＳＯを含み、リンカーがＡＳＯの５’末端または３’末端でコンジュゲートされる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 細胞がヒト細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 第１のドメインが第１の小分子を含む、請求項１または２に記載の方法。
  13. 第２のドメインが第２の小分子を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 小分子が、９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物である、請求項１３に記載の方法。
  15. 第２の小分子がイブルチニブまたはイブルチニブ－ＭＰＥＡを含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 第２の小分子がアプタマーを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  17. リンカーが、
    Figure 2023522957000046
    を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 標的リボ核酸が、核内ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 核内ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡが、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、転写されたＲＮＡ、新生ＲＮＡ、染色体富化ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、膜富化ＲＮＡ、またはミトコンドリアＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
  20. 標的ＲＮＡの細胞内局在が、核、細胞質、ゴルジ、小胞体、空胞、リソソーム、およびミトコンドリアからなる群から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 標的ＲＮＡが、標的ＲＮＡのイントロン、エクソン、５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲに位置する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 標的ポリペプチドがＥＩＦ４Ｅを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 標的ポリペプチドが、ＹＴＨＤＦ１を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 標的ポリペプチドが内因性ポリペプチドである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 標的ポリペプチドが細胞内ポリペプチドである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 標的ポリペプチドが酵素または制御タンパク質である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ＲＮＡが疾患または障害と関連する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. ＲＮＡが腫瘍抑制遺伝子またはハプロ不全遺伝子と関連する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 細胞中の標的リボ核酸（ＲＮＡ）の翻訳を増加させる合成二機能性分子であって、
    第１の小分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む第１のドメインであって、標的ＲＮＡのＲＮＡ配列に特異的に結合する、第１のドメイン、
    第２の小分子またはアプタマーを含む第２のドメインであって、標的ポリペプチドに特異的に結合する、第２のドメイン、および
    第１のドメインを第２のドメインにコンジュゲートするリンカー
    を含み、
    標的ポリペプチドが、細胞中の標的ＲＮＡの翻訳を促進、ブースト、または増加させる、合成二機能性分子。
  30. 標的ポリペプチドが標的タンパク質である、請求項２９に記載の方法。
  31. リンカーが
    Figure 2023522957000047
    を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 標的ポリペプチドが、ＹＴＨＤＦ１またはＥＩＦ４Ｅである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
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