JP2023511908A - タウ発現抑制のためのジンクフィンガータンパク質転写因子 - Google Patents
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Abstract
本開示は、神経系におけるタウの発現を阻害するジンクフィンガー融合タンパク質、およびアルツハイマー病、前頭側頭型認知症、および別のタウオパチーなどの神経変性疾患を処置するために該タンパク質を使用する方法を提供する。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２２日に出願された米国仮出願６２／９６４，５０１の優先権を主張する。
本出願は、２０２０年１月２２日に出願された米国仮出願６２／９６４，５０１の優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１月１９日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、０２５２９７＿ＷＯ０１６＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは３０４，３３７バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１月１９日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、０２５２９７＿ＷＯ０１６＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは３０４，３３７バイトである。
発明の背景
タウとしても既知である微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）は、特定の脳の病状において重要な役割を果たしている。ミスフォールドされたタウの神経原線維変化（ＮＦＴ）および他の病理学的タウ封入体への凝集は、まとめてタウオパチーと呼ばれる多くの神経変性状態に関与している。これらは、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、難治性遺伝性てんかん（例えば、ドラベ症候群）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、および慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）を含む。例えば、Benussi et al., Front Aging Neurosci. (2015) 7:171; Gheyara et al., Ann Neurol. (2014) 76:443－56; Scholz and Bras, Int J Mol Sci. (2015) 16(10):24629－55; and McKee et al., Brain Pathol. (2015) 25(3):350－64を参照のこと。
タウとしても既知である微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）は、特定の脳の病状において重要な役割を果たしている。ミスフォールドされたタウの神経原線維変化（ＮＦＴ）および他の病理学的タウ封入体への凝集は、まとめてタウオパチーと呼ばれる多くの神経変性状態に関与している。これらは、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、難治性遺伝性てんかん（例えば、ドラベ症候群）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、および慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）を含む。例えば、Benussi et al., Front Aging Neurosci. (2015) 7:171; Gheyara et al., Ann Neurol. (2014) 76:443－56; Scholz and Bras, Int J Mol Sci. (2015) 16(10):24629－55; and McKee et al., Brain Pathol. (2015) 25(3):350－64を参照のこと。
タウはプリオン様の特性を有することが示唆されている。いくつかの研究は、タウの過剰リン酸化がタウのミスフォールディングを引き起こす可能性があることを示す。ミスフォールドされたタウ凝集体は、脳全体に広がることができる(Takeda et al., Nat Comm. (2015) 6:8490; Hyman, Neuron (2014) 82:1189; de Calignon et al., Neuron (2012) 73:685－97)。これらの凝集体は、タウオパチーにおいて見いだされるＮＦＴの形成における最初の工程であってもよい。ＮＦＴは、ＡＤの初期段階において嗅内皮質および内側側頭葉に限定されているが、重度の臨床症状が現れる頃までに、ＮＦＴは脳全体に広がる。ＮＦＴおよびアミロイドベータプラークの両方がＡＤを有する患者において見出だされ、アミロイド沈着はタウの病状および脳遠位領域の沈着を増加させることが示されている(Bennett et al., Am J Pathol. (2017) 187(7):1601－12)。局所的なタウの蓄積および拡散は、げっ歯類モデルおよびヒト疾患における神経細胞の喪失と密接に関連している(Pooler et al., Acta Neuropathol Commun. (2015) 3:14; La Joie et al., Sci Transl Med. (2020) 12:524）。凝集したタウの蓄積によって発揮される神経毒性に加えて、タウの可溶性オリゴマー形態も同様に毒性があるようである(Guerrero－Munoz et al., Front Cell Neurosci. (2015) 9:464)。可溶性のミスフォールドされた内因性タウは、種々の神経ストレス状態において神経毒性のメディエーターとしての役割を果たしているようである。
内因性タウの減少は、異なる遺伝的マウスモデルにおけるＡＤ様の病理に有益であることが示されている (Roberson et al., Science (2007) 316:750－4; DeVos et al., Sci Transl Med. (2017) 9(374):eaag0481; Wegmann et al., EMBO J. (2015) 1－14)。脳中のタウレベルの低下は、ストレス誘導性および発作誘導性のニューロン損傷、および外傷性脳損傷に起因する学習および記憶障害からも保護するようである (Lopes et al., PNAS (2016) 113:e3755－63; Gheyara, supra; DeVos et al., J Neurosci. (2013) 33(31):12887－97; Cheng et al., PLoS One (2014) 9(12):e115765)。しかしながら、タウオパチーに対する効果的な治療法はない。インビボでのタウノックダウンは、タウｍＲＮＡに結合してその翻訳を妨げるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の投与によって（DeVos (2017) ibid; DeVos et al., Neurotherapeutics (2013) 10(3):486－97）、または抗タウ抗体の静脈注射によって (Asuni et al., J Neurosci. (2007) 27:9115－29; Ittner et al., J Neurochem. (2015) 132:135－45; Herrmann et al., J Neurochem. (2015) 132:1－4; Yanamandra et al., Neuron (2013) 80(2):402－14)、達成されている。どちらのアプローチも脳内のタウタンパク質の減少を促進してもよいが、患者の生涯にわたって慢性的な投与が必要である。抗体は、血液脳関門および細胞膜透過性が乏しく、このことは中枢神経系内での拡散および神経内タウとの結合能力の両方を制限することができる。さらに、病原性タウ種の正体および数は現在不明であり、タウオパチー間で異なってもよいため、抗タウ抗体治療法の開発は困難である。
脳の病状におけるタウの重要な役割および有効な治療法の欠如を考えると、ＡＤを含むタウオパチーの予防および処置のためにこのタンパク質を標的とする治療法を開発する緊急の必要性がある。
本開示は、ヒトＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの部位を標的とするジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を提供する。本開示のＺＦＰは、ＤＮＡレベルで微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の発現を特異的に阻害するために、転写因子に融合されてもよい。これらの融合タンパク質は、（ｉ）ＭＡＰＴ遺伝子の標的領域に特異的に結合するＺＦＰドメインおよび、（ｉｉ）遺伝子の転写を低下させる少なくとも１つの転写抑制ドメインを含有する。
一態様において、本開示は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写抑制ドメインを含む融合タンパク質を提供し、ここでＺＦＰドメインは、ヒトＭＡＰＴ遺伝子の標的領域に結合する。いくつかの実施形態において、標的領域は、ＭＡＰＴ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の１．５ｋｂ以内、例えば、ＴＳＳの上流１０００ｂｐｓ以内、および／またはＭＡＰＴ遺伝子のＴＳＳの下流５００ｂｐｓ以内にある。
いくつかの実施形態において、ＺＦＰドメインは、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上）のジンクフィンガーを含み、所望により融合タンパク質は、所望により周知の方法によって検出可能なないかまたは最小限のオフターゲット結合または活性（例えば、ＭＡＰＴ遺伝子ではない遺伝子への結合）とともに、ＭＡＰＴ遺伝子の発現を少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％抑制する。本ＺＦＰのＤＮＡ結合認識ヘリックスアミノ酸配列の非限定的な例を、図１４または１６に示す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、図１４または１６に示される１つ以上の認識ヘリックス配列を含む。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、図１６に示される示されたバックボーン変異ありまたはなしで、図１４または１６における単一行に示される認識ヘリックス配列の一部または全部を含む。特定の実施形態において、融合タンパク質は、図１５または１７に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本融合タンパク質の転写抑制因子ドメインはＫＲＡＢドメインを含み、ここで所望によりＫＲＡＢドメインは、ヒトＫＯＸ１タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、ＺＦＰドメインは、ペプチドリンカーを通して転写リプレッサーに連結されている。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は核局在化シグナルを含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＺＦＰドメインは、図１４または１６の単一行に示される４、５、または６個のジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含み；図１４または１６に示される標的配列に結合し；図１５または１７に示されるＺＦＰ転写因子のジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含み（例えば、ＦＰ－ＴＦ７１３７７、７１３８５、７３０３４、７３１２２、７３１３１、または７３１３３）；および／または図１４、１５、１６または１７に示されるように連結されるジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含む（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ７１３７７、７１３８５、７３０３４、７３１２２、７３１３１、または７３１３３）。
特定の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号８９～１９６、１９７～２４８および２６７～３０７から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本開示は、本融合タンパク質のコード配列を含む核酸構築物を提供し、ここでコード配列は、転写調節エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、転写調節エレメントは、脳細胞において構成的に活性または誘導可能である哺乳動物プロモーターである。特定の実施形態において、構築物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物などの組換えウイルス構築物である。
別の態様において、本開示は、本核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ヒト脳細胞または多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞または誘導可能多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））などのヒト細胞であってもよい。
さらに別の局面において、本開示は、所望により本明細書の核酸構築物の導入を通して、本明細書の融合タンパク質を細胞中に導入すること、それにより細胞中のタウの発現を阻害することを含む、ヒト脳細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、神経上皮細胞、内皮細胞、または希突起膠細胞）におけるタウの発現を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、発作性疾患、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、または別のタウオパチーを患っているかまたは発症するリスクがある患者の脳中にある。特定の実施形態において、この方法は、融合タンパク質を発現する組換えウイルス（例えば、神経栄養血清型またはＡＡＶ９などのシュードタイプの組換えＡＡＶ）を細胞中に導入することを含む。
関連する態様において、本開示は、本明細書の融合タンパク質をコードする組換えＡＡＶを患者に投与することを含む、患者のタウオパチーを処置する（例えば、その進行を遅らせる）方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、静脈内、鞘内、大脳内、脳室内、大槽内、海馬内、視床内、または実質内経路を介して患者に導入される。いくつかの実施形態において、タウオパチーは、アルツハイマー病、または前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、発作性疾患、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）である。
また、本明細書において、本明細書に記載の処置方法において使用するための融合タンパク質、および該処置方法における医薬の製造のための本明細書での融合タンパク質の使用も提供される。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定ではなく例示としてのみ与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内での種々の変更および修正は、詳細な説明から当業者に明らかになる。
図１は、遺伝子中の１８塩基対を認識する操作された６フィンガージンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）によるＭＡＰＴ遺伝子の特異的標的化を実証する図である。ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子に結合すると、ＭＡＰＴ転写が減少し、このことはＭＡＰＴｍＲＮＡおよびタウタンパク質レベルを減少させる。該図は、配列番号３０８を開示する。
図２は、抗タウＺＦＰ－ＴＦによるＭＡＰＴ遺伝子の標的化を実証する図である。初代ＭＡＰＴｍＲＮＡは上部のバーに表示され、エクソン１は太い矢印で表される。遺伝子およびｍＲＮＡの下のクラスター内の小さな五角形（３７０；オレンジおよび青）は、本明細書に例示されている代表的なＺＦＰ－ＴＦによって標的とされるＭＡＰＴ遺伝子内の領域を示す。青色の五角形は、ヒトＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的とするＺＦＰ－ＴＦを表し、オレンジ色の五角形はヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＭＡＰＴ遺伝子の両方を標的とする。右向きの五角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のセンス鎖に結合することを示す。左向きの五角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のアンチセンス鎖に結合することを示す。
図３は、３７０個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーから選択される４８個のＺＦＰ－ＴＦのタウ抑制活性を示す一群のグラフである（図１４）。各グラフのｙ軸は、２つのハウスキーピング遺伝子（Ａｔｐ５ｂおよびＥｉｆ４ａ２）の幾何平均に対して正規化されたタウｍＲＮＡ発現であり、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞における異なるＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしてから２０時間後に評価された。ｍＲＮＡ用量は、左から右に増加する（３、１０、３０、１００、３００、および１，０００ｎｇ）。バーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。グラフの下の数字は、ＺＦＰ－ＴＦの内部参照番号である。滴定スケールの拡大版は、図の右下に示される。
図４は、親ＺＦＰ－ＴＦの標的特異性を改良するための最適化戦略を実証する図である。これは、親ＺＦＰ－ＴＦの最大３つのジンクフィンガーモジュールの位置（－４）、（－５）、（－９）、および／または（－１４）で、アルギニン（Ｒ）残基をグルタミン（Ｑ）に変異させることを含む。突然変異は、ジンクフィンガーおよび標的ＤＮＡのリン酸骨格の間の保存された非特異的接触に影響を与える。
図５Ａおよび５Ｂは、ＭＡＰＴ遺伝子における変異抗タウＺＦＰ－ＴＦの標的領域を実証する図である。ＭＡＰＴｍＲＮＡは赤いバーとして表示される。図５Ａにおいて、遺伝子の下の第一のクラスター内の小さな五角形（赤および白）は、親ＺＦＰ－ＴＦによって標的とされるＭＡＰＴ遺伝子内の領域を表す。遺伝子の下にある第二のクラスターの小さな五角形（赤）は、親ＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体が標的とするＭＡＰＴ遺伝子の領域を示す。図５Ｂは、ＭＡＰＴ遺伝子における代表的な親および突然変異ＺＦＰ－ＴＦの標的領域の拡大図を示す。オレンジ色の五角形は親ＺＦＰ－ＴＦを表し、赤い五角形はそれらのＲ→Ｑ変異体を表す。右向きの五角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のセンス鎖に結合することを示す。左向きの五角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のアンチセンス鎖に結合することを示す。親ＺＦＰ－ＴＦには７１＃＃＃の番号が付けられ、突然変異ＺＦＰ－ＴＦには７３＃＃＃の番号が付けられる。図５Ｂは、出現順に配列番号３０９～３１１をそれぞれ開示する。
図６は、～３４０個の変異体のライブラリーからの代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦ（図１６）のタウ抑制活性を示す一群のグラフである。各グラフのｙ軸は、２つのハウスキーピング遺伝子（Ａｔｐ５ｂおよびＥｉｆ４ａ２）の幾何平均に対して正規化されたタウｍＲＮＡ発現であり、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞における異なるＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしてから２０時間後に評価された。ｍＲＮＡの量は左から右に増加する（３、１０、３０、１００、３００、および１，０００ｎｇ）。親ＺＦＰ－ＴＦごとに最大７つのＲ→Ｑ変異体が表示される。バーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。グラフの下の数字は、ＺＦＰ－ＴＦの内部参照番号である。滴定スケールの拡大版は、図の右下に示される。
図７Ａは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおける代表的なＺＦＰ－ＴＦのタウ抑制活性を示す一群のグラフである。ｙ軸は、３つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化されたタウｍＲＮＡ発現であり、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおける異なるＺＦＰ－ＴＦについて、ＡＡＶ６による形質導入の３２日後に評価された。使用したＡＡＶ６の量は、左から右に増加するＡＡＶ６の用量（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５のＭＯＩ）とともに、右下の凡例に示される。製剤緩衝液（Ｍｏｃｋ）で処置されるニューロンが、陰性対照として使用された。バーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
図７Ｂは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン、ヒトＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞、および初代マウスニューロンにおける代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦのヒトタウ抑制活性を比較する一群のグラフである。ｙ軸は、ハウスキーピング遺伝子ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、および所望によりＧＡＰＤＨの幾何平均に対して正規化されたタウｍＲＮＡ発現であり、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウスニューロンにおける異なるＺＦＰ－ＴＦそれぞれについて、ＡＡＶ６による形質導入の３２日後および７日後に評価されるかまたは、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞における異なるＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡでのトランスフェクションの２０時間後に評価される。使用されるＡＡＶ６またはｍＲＮＡの量は、左から右に増加するＡＡＶ６（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５のＭＯＩ）およびｍＲＮＡ（３、１０、３０、１００、３００、および１，０００ｎｇ）用量とともに、ｘ軸の下に示される。バーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。滴定スケールの拡大版は、図の下に示される。ヒトＭＡＰＴの標的配列およびマウスＭａｐｔのオーソロガス標的部位の間の不一致の数は、初代マウスニューロンにおいてテストされる各ＺＦＰのバーの上に示される。
図８は、代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦでの処置後、それぞれ１９日後または７日後のヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウスニューロンのトランスクリプトーム中の変化を示すＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／マイクロアレイデータのボルケーノ／散布図のパネルである。青い長方形は、ニューロンにおいてテストされる最高用量で各代表的なＺＦＰ－ＴＦを用いて達成されるヒトタウ抑制のレベルを示す。赤および緑で示される数字は、それぞれダウンレギュレートおよびアップレギュレートされたオフターゲット遺伝子の数を示し；黄色の円は、タウ遺伝子座内の異なる転写物を表し；赤い円は、ダウンレギュレートされたオフターゲット遺伝子を表し；および緑の円は、アップレギュレートされたオフターゲット遺伝子を表す。ヒトおよびマウスのマイクロアレイデータは、少なくとも２回の独立した実験および、実験ごとの５～８回の生物学的反復から得られた。ＣＰＮＥ６は参照ＺＦＰのアーティファクトであると示されたため、オフターゲットカウントから除外された。
図９は、タウ遺伝子座（ヒトタウおよびＳＴＨ）およびオフターゲット遺伝子（ＣＰＮＥ６およびＩＧＦ２）内の転写物の発現レベルに対する代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦの効果を示す一群のグラフである。モック処置およびタウ遺伝子座に結合しないＺＦＰ－ＴＦをネガティブコントロールとして使用した。ｙ軸は、３つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化されたｍＲＮＡ発現であり、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおける異なるＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡでのトランスフェクションの３２日後に評価された。使用されるＡＡＶ６の量は右下の凡例に示され、ＡＡＶ６の用量は左から右に増加する（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５のＭＯＩ）。青い長方形は、ニューロンにおいてテストされる最大用量で各代表的なＺＦＰ－ＴＦを用いて達成されるヒトタウ抑制のレベルを示す。バーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
図１０は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ９の実質内（ＩＰａ）送達後のＺＦＰ－ＴＦ、マウスＭａｐｔ、ＮｅｕＮ、および神経炎症マーカーｍＲＮＡ発現レベルを示す一群のグラフである。各グラフにおけるｙ軸は、ヒトシナプシン１プロモーター下でＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ９（用量－半球あたり３Ｅ１０ＶＧ）で処置してから４週間後の成体マウスの脳の右半球から得られた海馬組織中のＺＦＰ－ＴＦ、Ｍａｐｔ、Ｇｆａｐ、Ｉｂａ１、およびＮｅｕＮの絶対または正規化されたｍＲＮＡ発現レベルである。ビヒクル処置（ＶＥＨ）およびＧＦＰをコードするＺＦＰ－ＴＦでの処置は、ネガティブコントロールとして使用された。使用されるＺＦＰ－ＴＦは、ｘ軸に示される。色付きのバーは４匹のマウスの値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。各図の矢印は、他の群の値が正規化される群を示す。
図１１は、ｈｔａｕマウスにおける代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦまたはポジティブコントロールＺＦＰ－ＴＦ構築物（５７８９０－Ｔ２Ａ－６５９１８）をコードするＡＡＶ９の実質内（ＩＰａ）送達後のＺＦＰ－ＴＦ、ヒトＭＡＰＴ、マウスＭａｐｔ、ヒトＳＴＨ、ＧＦＰ、ＮｅｕＮ、および神経炎症マーカーｍＲＮＡ発現レベルを示す一群のグラフである。各グラフにおけるｙ軸は、ヒトシナプシン１プロモーターの下でＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ９（用量－半球あたり３Ｅ９、１Ｅ１０、または３Ｅ１０ＶＧ）を用いた処置の３または６か月後の成体マウスの脳の右半球から得られる海馬組織中のＺＦＰ－ＴＦ、ヒトＭＡＰＴ、マウスＭａｐｔ、ヒトＳＴＨ、ＧＦＰ、ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１、およびＮｅｕＮの絶対または正規化されたｍＲＮＡ発現レベルである。ビヒクル処置（ＶＥＨ）をネガティブコントロールとして使用した。評価されたＺＦＰ－ＴＦ、用量、および時点は、ｘ軸に示される。色付きのバーは、１群あたり５～８匹のマウスの値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
図１２は、ｈｔａｕマウスにおける代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦまたはポジティブコントロールＺＦＰ－ＴＦ構築物（５７８９０－Ｔ２Ａ－６５９１８）をコードするＡＡＶ９の実質内（ＩＰａ）送達後のヒトタウタンパク質レベルを示すグラフである。各グラフにおけるｙ軸は、ヒトシナプシン１プロモーターの下でＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ９（用量－３Ｅ９、１Ｅ１０、または３Ｅ１０ＶＧ／半球）を用いた処置の３または６か月後の成体マウスの脳の右半球から得られる海馬組織中の絶対または正規化された総タウタンパク質レベルである。ビヒクル処置（ＶＥＨ）をネガティブコントロールとして使用した。評価されるＺＦＰ－ＴＦ、用量、および時点は、ｘ軸に示される。色付きのバーは、１群あたり５～８匹のマウスの値の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
図１３は、ｈｔａｕマウスにおける代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ９の実質内（ＩＰａ）送達後のヒトＭＡＰＴ転写物、ＮｅｕＮタンパク質、およびＤＡＰＩを示す、多重インサイチューハイブリダイゼーション／免疫蛍光染色からの画像のパネルである。代表的な画像は、ヒトシナプシン１プロモーターの下でＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ９（用量-半球あたり３Ｅ９ＶＧ）を用いた処置の３か月後の成体マウスの脳の左半球からの海馬領域について示される。ビヒクル処置（ＶＥＨ）をネガティブコントロールとして使用した。
図１４は、本開示の例示的なＺＦＰを示す表である。各４、５、または６本のフィンガーＺＦＰ（すなわち、Ｆ１－Ｆ４、Ｆ１－Ｆ５、またはＦ１－Ｆ６）について単一行で示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列のゲノム標的配列（つまり、結合された配列）が大文字で示される。この図は、表１に示される各ＺＦＰのジンクフィンガー間およびＺＦＰドメインおよびリプレッサードメイン（すなわち、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、またはＬ６）間の例示的なペプチドリンカー配列も示す。各配列についての配列番号を括弧内に示す。
図１５は、図１４に示されるＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦについての例示的な全タンパク質配列を示す表である。ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列は太字で示される。ジンクフィンガーリンカーには下線が引かれる一方、ドメイン間リンカーには二重下線が引かれる。各配列の配列番号を括弧内に示す。
図１６は、本開示の例示的なＲ→ＱＺＦＰを示す表である。示される各４、５、または６本のフィンガーＺＦＰ（すなわち、Ｆ１－Ｆ４、Ｆ１－Ｆ５、またはＦ１－Ｆ６）について単一行で示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列のゲノム標的配列（つまり、結合された配列）が、大文字で示される。この図は、表１に示される各ＺＦＰのジンクフィンガー間およびＺＦＰドメインおよびリプレッサードメイン（すなわち、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、またはＬ６）間の例示的なペプチドリンカー配列も示す。記号「＾」は、示されたフィンガーにおける１番目のアミノ酸から４番目の上流のアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変更されることを示す。各配列についての配列番号を括弧内に示す。
図１７は、図１６に示されるＺＦＰを含むＲ→ＱＺＦＰ－ＴＦの例示的な完全なタンパク質配列を示す表である。ＤＮＡ 結合認識ヘリックス配列は太字で示される。ジンクフィンガーリンカーには下線が引かれる一方、ドメイン間リンカーには二重下線が引かれる。各配列についての配列番号を括弧内に示す。
発明の詳細な説明
本開示は、ヒトＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの部位を標的とする（すなわち、ＤＮＡ配列に結合する）ＺＦＰドメインを提供する。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の機能分子またはドメインに結合または融合されてもよい。本開示のＺＦＰドメインは、ヒトＭＡＰＴ遺伝子のｍＲＮＡへの転写を抑制する転写因子に融合されてもよい。融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）と呼ばれ、ヒトＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的とし、そのＲＮＡへの転写を抑制する。これらのＺＦＰ－ＴＦは、ＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび、遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含む。ＺＦＰ－ＴＦを患者の脳に導入することによってニューロンにおけるタウのレベルを低下させることは、凝集体およびＮＦＴへのタウの集合を阻害する（例えば、低下または停止させる）ことが期待される。タウ凝集体の細胞から細胞への伝播が、減少または防止される。本ＺＦＰ－ＴＦは、タウオパチーの予防および／または処置に使用することができる。
本開示は、ヒトＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの部位を標的とする（すなわち、ＤＮＡ配列に結合する）ＺＦＰドメインを提供する。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の機能分子またはドメインに結合または融合されてもよい。本開示のＺＦＰドメインは、ヒトＭＡＰＴ遺伝子のｍＲＮＡへの転写を抑制する転写因子に融合されてもよい。融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）と呼ばれ、ヒトＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的とし、そのＲＮＡへの転写を抑制する。これらのＺＦＰ－ＴＦは、ＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび、遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含む。ＺＦＰ－ＴＦを患者の脳に導入することによってニューロンにおけるタウのレベルを低下させることは、凝集体およびＮＦＴへのタウの集合を阻害する（例えば、低下または停止させる）ことが期待される。タウ凝集体の細胞から細胞への伝播が、減少または防止される。本ＺＦＰ－ＴＦは、タウオパチーの予防および／または処置に使用することができる。
タウ阻害に対する本ＺＦＰ－ＴＦアプローチは、（ｉ）タウｍＲＮＡに結合してその翻訳を防止するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）および（ｉｉ）免疫療法抗－タウ抗体の投与を含む、他のものによってテストされている現在のアプローチを超えるいくつかの利点を有する。ＺＦＰ－ＴＦは（ＺＦＰ－ＴＦ発現構築物を患者に導入することにより）１回のみ投与する必要があってもよい一方、ＡＳＯは繰り返し投与する必要がある。さらに、ＺＦＰ－ＴＦアプローチは、各細胞のゲノム中でＭＡＰＴ遺伝子の２つの対立遺伝子を使用することのみ必要とする。対照的に、ＡＳＯは、各細胞中でＭＡＰＴｍＲＮＡの多数のコピーに関与する必要がある。さらに、ＡＳＯの分布および向性は固定されている一方、ＺＦＰ－ＴＦアプローチは、プロモーター、血清型、および投与経路を変更することにより、異なる細胞型および脳領域を標的にすることができる。
抗体はタウタンパク質種またはコンフォメーションのサブセットにしか結合できないため、本ＺＦＰ－ＴＦアプローチは、抗体アプローチよりも有利である。これは、強力な治療効果については十分ではなくてもよい。対照的に、ＺＦＰ－ＴＦはＤＮＡレベルでタウ発現を抑制し、タウオパチー全体で見出される異なるタウ配座異性体および翻訳後修飾型を含む、全ての形態のタウのレベルを低下させる。したがって、ＺＦＰ－ＴＦは、抗体とは異なり、毒性種の形態にとらわれない。さらに、抗体は主に細胞外タウに作用すると考えられるが、ＺＦＰ－ＴＦは細胞内の総タウレベルを直接低下させることができるため、細胞外タウレベルを間接的に低下させることができる。したがって、本ＺＦＰ－ＴＦアプローチは、タウが細胞内でその病理を発揮し、病原種が不明であるため、より効果的であると予想される。さらに、抗体は、典型的には末梢に、繰り返し投与する必要があり、その結果、血液脳関門を通過する効率が低下し、一方で、ＺＦＰ－ＴＦは、発現構築物の一度のみの送達を必要とし、脳実質へ直接、ＣＳＦ中へ、または静脈内を含む、複数の経路を介して投与できる。
Ｉ．ＺＦＰドメインの標的
本融合タンパク質のＺＦＰドメインは、ヒトＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合する。図１は、ＭＡＰＴ遺伝子のＤＮＡ配列へのＺＦＰドメインの結合を実証する。該図におけるＺＦＰドメインは６つのジンクフィンガーを有する。しかし、以下でさらに説明するように、より少ないかまたはより多いジンクフィンガーを有するＺＦＰドメインも使用できる。
本融合タンパク質のＺＦＰドメインは、ヒトＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合する。図１は、ＭＡＰＴ遺伝子のＤＮＡ配列へのＺＦＰドメインの結合を実証する。該図におけるＺＦＰドメインは６つのジンクフィンガーを有する。しかし、以下でさらに説明するように、より少ないかまたはより多いジンクフィンガーを有するＺＦＰドメインも使用できる。
ヒトＭＡＰＴ遺伝子は、約１３４ｋｂに及び、およびｃｈｒ１７ｑ２１．３１：４５，８９４，３８２～４６，０２８，３３４（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）にマッピングされている。そのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１８６８６８で入手できる。ＭＡＰＴ遺伝子は１３～１６個のエクソンを含む。エクソン１、４、５、７、９、１１、および１２は構成的に発現されるが、エクソン２、３、および１０は、かわりにスプライシングされた変異体に由来するタウタンパク質種中に存在することができ、これは大人の脳における６つの異なるタウタンパク質アイソフォームの存在につながる。完全長のヒトタウタンパク質は、次の配列を有する：
ＺＦＰ－ＴＦのＤＮＡ結合ＺＦＰドメインは、融合タンパク質をＭＡＰＴ遺伝子の標的領域に向かわせ、融合タンパク質の転写抑制ドメインを標的領域にもたらす。抑制ドメインは転写コリプレッサー複合体を動員して、クロマチンをＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を許容しない状態に変更する。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、遺伝子発現の抑制を可能にするＭＡＰＴ遺伝子内またはその近くの任意の適切な部位であることができる。例として、標的領域は、ＭＡＰＴ転写開始部位（ＴＳＳ）またはＭＡＰＴ転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ＲＮＡポリメラーゼ休止部位など）を含むか、またはそれらに隣接する（下流または上流のいずれか）。
いくつかの実施形態において、ゲノム標的領域は少なくとも８ｂｐｓの長さである。例えば、標的領域は、長さが１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ｂｐｓなど、長さが８ｂｐｓから４０ｂｐｓであってもよい。標的配列は、遺伝子のセンス鎖または遺伝子のアンチセンス鎖上にあってもよい。標的化の精度を確保し、ＺＦＰ－ＴＦによるオフターゲット結合または活性を低減するために、好ましくは、選択されたＭＡＰＴ標的領域の配列は、他の遺伝子における配列に、７５％未満の相同性（例えば、７０％未満、６５％未満、６０％未満、または５０％未満）を有する。特定の実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、長さが１２～２０（例えば、１２～１８、１５～１９、１５、１８、または１９）ｂｐｓであり、ＴＳＳの１５００ｂｐｓ上流から１０００ｂｐｓ下流（例えば、－１０００ｂｐｓから＋１０００ｂｐｓ、＋７５０、または＋５００ｂｐｓ）以内にある。
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、図１４または１６の単一行に示されるような標的部位（すなわち、標的配列）に結合し、好ましくは、オフターゲット結合または活性が検出されないかまたはほとんど検出されず、これらの標的部位内の連続または非連続配列を含む。いくつかの実施形態において、標的部位は、配列番号３７～８８および２４９のいずれか１つを含むおよび／またはその中にある。
標的セグメントをさらに評価するための他の基準は、かかるセグメントまたは関連セグメントに結合するＺＦＰの以前の入手可能性、所与の標的セグメントに結合するための新しいＺＦＰの設計の容易さ、および標的外結合リスクを含む。
ＩＩ．ジンクフィンガータンパク質ドメイン
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を指す。ＺＦＰは配列特異的にＤＮＡに結合する。ＺＦＰの個々のＤＮＡ結合単位は「ジンクフィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、通常７つのアミノ酸残基で構成され、ＤＮＡ結合の特異性を決定するＤＮＡ結合「認識ヘリックス」を含有する。ＺＦＰドメインは少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは２～４塩基対のヌクレオチド、通常は３～４塩基対のＤＮＡ（連続または非連続）に結合する。各ジンクフィンガーは通常、約３０のアミノ酸を含み、亜鉛をキレート化する。操作されたＺＦＰは、天然に存在するＺＦＰと比較して、新しい結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的な設計やおよび種々のタイプの選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、ここで各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連している。例えば、米国特許５，７８９，５３８；５，９２５，５２３；６，００７，９８８；６，０１３，４５３；６，１４０，０８１；６，２００，７５９；６，４５３，２４２；６，５３４，２６１；６，９７９，５３９；および８，５８６，５２６；および国際特許出願ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０１６５３６；ＷＯ０２／０９９０８４；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されるＺＦＰ設計法を参照のこと。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の分子（例えば、ドメイン）、例えばタンパク質に結合または融合されてもよい。かかるＺＦＰ融合は、遺伝子活性化（例えば、活性化ドメイン）、遺伝子抑制（例えば、抑制ドメイン）、リガンド結合（例えば、リガンド結合ドメイン）、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンド結合ドメイン）、局在超変異（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン）、クロマチン修飾（例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン）、組換え（例えば、リコンビナーゼドメイン）、標的統合（例えば、インテグラーゼドメイン）、ＤＮＡ修飾（例えば、ＤＮＡメチル－トランスフェラーゼドメイン）、塩基編集（例えば、ベースエディタードメイン）、または標的ＤＮＡ切断（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を可能にするドメインを含んでもよい。操作されたＺＦＰドメインの例を図１４および１６に示す。
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を指す。ＺＦＰは配列特異的にＤＮＡに結合する。ＺＦＰの個々のＤＮＡ結合単位は「ジンクフィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、通常７つのアミノ酸残基で構成され、ＤＮＡ結合の特異性を決定するＤＮＡ結合「認識ヘリックス」を含有する。ＺＦＰドメインは少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは２～４塩基対のヌクレオチド、通常は３～４塩基対のＤＮＡ（連続または非連続）に結合する。各ジンクフィンガーは通常、約３０のアミノ酸を含み、亜鉛をキレート化する。操作されたＺＦＰは、天然に存在するＺＦＰと比較して、新しい結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的な設計やおよび種々のタイプの選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、ここで各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連している。例えば、米国特許５，７８９，５３８；５，９２５，５２３；６，００７，９８８；６，０１３，４５３；６，１４０，０８１；６，２００，７５９；６，４５３，２４２；６，５３４，２６１；６，９７９，５３９；および８，５８６，５２６；および国際特許出願ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０１６５３６；ＷＯ０２／０９９０８４；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されるＺＦＰ設計法を参照のこと。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の分子（例えば、ドメイン）、例えばタンパク質に結合または融合されてもよい。かかるＺＦＰ融合は、遺伝子活性化（例えば、活性化ドメイン）、遺伝子抑制（例えば、抑制ドメイン）、リガンド結合（例えば、リガンド結合ドメイン）、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンド結合ドメイン）、局在超変異（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン）、クロマチン修飾（例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン）、組換え（例えば、リコンビナーゼドメイン）、標的統合（例えば、インテグラーゼドメイン）、ＤＮＡ修飾（例えば、ＤＮＡメチル－トランスフェラーゼドメイン）、塩基編集（例えば、ベースエディタードメイン）、または標的ＤＮＡ切断（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を可能にするドメインを含んでもよい。操作されたＺＦＰドメインの例を図１４および１６に示す。
本操作されたＺＦＰ融合物のＺＦＰドメインは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、またはそれ以上）のジンクフィンガーを含んでもよい。１本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、３または４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。２本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、６または８ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。３本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、９または１２ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。４本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、１２から１５個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。５本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、１５～１８ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。６本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識できる。
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、図１４または１６に示されるように、任意の認識ヘリックスのアミノ酸の少なくとも４つを有するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。他の実施形態において、本操作されたＺＦＰは、図１４または１６に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図１４または１６に示されるように、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、またはＦ６の配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、図４または１６の単一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図１４または１６の単一行に示されるように、Ｆ１－Ｆ２、Ｆ２－Ｆ３、Ｆ３－Ｆ４、Ｆ４－Ｆ５、またはＦ５－Ｆ６（例えば、Ｆ１－Ｆ４、Ｆ１－Ｆ５、またはＦ１－Ｆ６）の配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、図４または１６の単一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図１４または１６の単一行に示されるように、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６（例えば、Ｆ１－Ｆ４、Ｆ１－Ｆ５、またはＦ１－Ｆ６）の配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、図１５の単一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。いくつかの実施形態において、図１５の単一行に示される配列は翻訳後修飾後に現れるため、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、該配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。例えば、翻訳後修飾は、図１５に示されるように配列からイニシエーターメチオニン残基を除去することができる。
ＺＦＰドメインの標的特異性は、例えば、米国特許公開２０１８／００８７０７２に記載されるように、ＺＦＰ骨格配列への突然変異によって改良されてもよい。突然変異は、ＤＮＡバックボーン上のリン酸と非特異的に相互作用できるが、ヌクレオチド標的特異性には関与しないＺＦＰバックボーンの残基に加えられたものを含む。いくつかの実施形態において、これらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。いくつかの実施形態において、これらの突然変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。さらなる実施形態において、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）で作製される。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーは、位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）に１つ以上の変異を含んでもよい。さらなる実施形態において、マルチフィンガーＺＦＰドメイン中の１つ以上のジンクフィンガーは、位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）に変異を含んでもよい。いくつかの実施形態において、位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、チロシン（Ｙ）、および／またはグルタミン（Ｑ）に変異される。いくつかの実施形態において、位置（－５）のＲ残基はＱに変異している。図１６における記号「＾」は、示された認識ヘリックスの１番目のアミノ酸の４番目の上流のアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化していることを示す。各認識ヘリックス配列において、７つのＤＮＡ結合アミノ酸の位置に－１、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、および＋６の番号が付けられる。したがって、ＲからＱへの置換についての位置は（－５）として番号が付けられる。
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、図１６に示されるように、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、図１６の単一行に示されるように、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、図１７の単一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。いくつかの実施形態において、図１７の単一行に示される配列は翻訳後修飾後に現れるため、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、該配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。例えば、翻訳後修飾は、図１７に示されるように配列からイニシエーターメチオニン残基を除去してもよい。
ＩＩＩ．ジンクフィンガータンパク質転写因子
本明細書に記載のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、本融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写因子ドメイン（すなわち、ＺＦＰ－ＴＦ）を含有する。いくつかの実施形態において、転写因子は転写リプレッサードメインであってもよく、ここでＺＦＰおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合もしくはペプチドリンカーによって、または二量体化によって（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を通して）互いに結合してもよい。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、共有結合したドメインを有するポリペプチド、ならびに非共有結合を介して互いに結合したポリペプチドの複合体を指す。転写抑制ドメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含む任意の適切な位置でＺＦＰドメインと結合することができる。
本明細書に記載のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、本融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写因子ドメイン（すなわち、ＺＦＰ－ＴＦ）を含有する。いくつかの実施形態において、転写因子は転写リプレッサードメインであってもよく、ここでＺＦＰおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合もしくはペプチドリンカーによって、または二量体化によって（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を通して）互いに結合してもよい。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、共有結合したドメインを有するポリペプチド、ならびに非共有結合を介して互いに結合したポリペプチドの複合体を指す。転写抑制ドメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含む任意の適切な位置でＺＦＰドメインと結合することができる。
いくつかの実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦは、約２５ｎＭ未満のＫＤでそれらの標的に結合し、ヒトＭＡＰＴ遺伝子の転写を２０％以上（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）抑制する。いくつかの実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦの２つ以上が細胞内で発現され、細胞内のＭＡＰＴ発現を相乗的に調節する（例えば、米国特許出願公開第２０２０／０１０１１３３号および第２０２０／０１０９４０６号を参照）。かかる相乗的ＺＦＰは、２Ａリンカーペプチド、例えば、Ｔ２Ａ ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）によって連結されてもよい。したがって、ＭＡＰＴ発現の最適な抑制を達成するために、ＺＦＰ－ＴＦがＭＡＰＴ遺伝子の異なる標的領域に結合する場合、本ＺＦＰ－ＴＦの２つ以上を患者において同時に使用してもよい。
いくつかの実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦは、１つ以上のジンクフィンガードメインを含む。ドメインは、例えば、１つのドメインが１つ以上（例えば、４、５、または６）のジンクフィンガーを含み、別のドメインが追加の１つ以上（例えば、４、５、または６）のジンクフィンガーを含むように、伸長可能な柔軟なリンカーを介して一緒に連結され得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、フィンガーアレイが８、９、１０、１１または１２個以上のフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むように、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、柔軟なリンカーなどの非定型リンカーである。例えば、２つのＺＦＰドメインは、構成（Ｎ末端からＣ末端まで）ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＦ－ＺＦＰ－ＺＦＰ、ＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ、またはＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ－ＴＦ（２つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質がリンカーを介して融合されている）において転写リプレッサーＴＦに連結されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＺＦＰ－ＴＦは「２つの手を有する（ｔｗｏ－ｈａｎｄｅｄ）」である、すなわち、２つのＺＦＰドメインが２つの不連続な標的部位に結合するように、介在するアミノ酸によって分離された２つのジンクフィンガークラスター（２つのＺＦＰドメイン）を含む。ジンクフィンガー結合タンパク質の２つの手を有するタイプの例はＳＩＰ１であり、ここで４つのジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置する(Remacle et al., EMBO J. (1999) 18(18):5073－84を参照）。これらのタンパク質のジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、２つの標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態において、好ましくはないかまたはほとんどない検出可能なオフターゲット結合または活性とともに、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図１４または１６の単一行に示されるように標的部位に結合する。オフターゲット結合は、例えば、オフターゲット遺伝子におけるＺＦＰ－ＴＦの活性を測定することによって決定されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図１４または１６に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図１４または１６の単一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図１４または１６の単一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。
Ａ．転写リプレッサードメイン
本ＺＦＰ－ＴＦは、本明細書に記載の操作されたＺＦＰドメインおよび、ＭＡＰＴ遺伝子の転写活性を弱める１つ以上の転写抑制ドメインを含む。１つ以上の操作されたＺＦＰドメインおよび１つ以上の転写リプレッサードメインは、柔軟なリンカーによって結合されてもよい。転写抑制ドメインの非限定的な例は、ＫＯＸ１またはＺＩＭ３のＫＲＡＢドメイン（または任意の他のＫＲＡＢドメイン含有タンパク質である。例えば、Alerasool et al., Nature Methods (2020) 17:1093－6を参照）、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－ベータ誘導可能初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＴＲａ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、核ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体）、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂなど）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２である。例えば、Bird et al., Cell (1999) 99:451－4; Tyler et al., Cell (1999) 99:443－6; Knoepfler et al., Cell (1999) 99:447－50; and Robertson et al., Nature Genet. (2000) 25:338－42を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインは、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａを含むが、これらに限定されない。例えば、Chem et al., Plant Cell (1996) 8:305－21; and Wu et al., Plant J. (2000) 22:19－27を参照のこと。
本ＺＦＰ－ＴＦは、本明細書に記載の操作されたＺＦＰドメインおよび、ＭＡＰＴ遺伝子の転写活性を弱める１つ以上の転写抑制ドメインを含む。１つ以上の操作されたＺＦＰドメインおよび１つ以上の転写リプレッサードメインは、柔軟なリンカーによって結合されてもよい。転写抑制ドメインの非限定的な例は、ＫＯＸ１またはＺＩＭ３のＫＲＡＢドメイン（または任意の他のＫＲＡＢドメイン含有タンパク質である。例えば、Alerasool et al., Nature Methods (2020) 17:1093－6を参照）、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－ベータ誘導可能初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＴＲａ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、核ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体）、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂなど）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２である。例えば、Bird et al., Cell (1999) 99:451－4; Tyler et al., Cell (1999) 99:443－6; Knoepfler et al., Cell (1999) 99:447－50; and Robertson et al., Nature Genet. (2000) 25:338－42を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインは、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａを含むが、これらに限定されない。例えば、Chem et al., Plant Cell (1996) 8:305－21; and Wu et al., Plant J. (2000) 22:19－27を参照のこと。
いくつかの実施形態において、転写リプレッサードメインは、ヒトジンクフィンガータンパク質１０／ＫＯＸ１（ＺＮＦ１０／ＫＯＸ１）のクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインからの配列を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０１５３９４．４）。例示的なＫＲＡＢドメイン配列は、次のとおりである：
このＫＲＡＢ配列の変異体も、それらが同一または類似の転写抑制機能を有する限り、使用されてもよい。
Ｂ．ペプチドリンカー
ＺＦＰドメインおよび本ＺＦＰ－ＴＦの転写抑制ドメインおよび／またはＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば約５～２００アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のアミノ酸）の切断不可能なペプチドリンカーを通して連結されてもよい。典型的に、好ましいリンカーは、組換え融合タンパク質として合成される柔軟なアミノ酸部分配列である。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーは、標的核酸分子内の連結されたモジュール標的サブ部位間にギャップがないように連結される。他の実施形態において、ジンクフィンガーは、連結されたモジュールが、標的核酸分子内の連結されたモジュール標的サブ部位間に１、２または３塩基対のギャップを有する標的部位に結合することを可能にするように設計されたリンカーによって連結される。例えば、米国特許番号８，７７２，４５３を参照のこと。
ＺＦＰドメインおよび本ＺＦＰ－ＴＦの転写抑制ドメインおよび／またはＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば約５～２００アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のアミノ酸）の切断不可能なペプチドリンカーを通して連結されてもよい。典型的に、好ましいリンカーは、組換え融合タンパク質として合成される柔軟なアミノ酸部分配列である。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーは、標的核酸分子内の連結されたモジュール標的サブ部位間にギャップがないように連結される。他の実施形態において、ジンクフィンガーは、連結されたモジュールが、標的核酸分子内の連結されたモジュール標的サブ部位間に１、２または３塩基対のギャップを有する標的部位に結合することを可能にするように設計されたリンカーによって連結される。例えば、米国特許番号８，７７２，４５３を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、長さが３～２０個のアミノ酸残基であり、Ｇおよび／またはＳが豊富である。かかるリンカーの非限定的な例は、Ｇ４Ｓ型リンカー（配列番号１８）、すなわち、１つ以上（例えば、２、３、または４）のＧＧＧＧＳ（配列番号１５）モチーフを含有するリンカー、またはモチーフのバリエーション（モチーフからの１、２、または３個のアミノ酸の挿入、欠失、および置き換えを有するものなど）である。
ＺＦＰドメインおよび、本ＺＦＰ－ＴＦの転写リプレッサードメインおよび／またはＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーを連結するために使用されてもよいリンカー設計方法および例示的なリンカーは、米国特許番号６，４７９，６２６；７，８５１，２１６；８，７７２，４５３；９，３９４，５３１；９，５６７，６０９；および１０，７２４，０２０；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９９／０４５１３２；ＷＯ２００１／０５３４８０；ＷＯ２００９／１５４６８６；ＷＯ２０１１／１３９３４９；ＷＯ２０１５／０３１６１９；およびＷＯ２０１７／１３６０４９に記載されている。本明細書に記載のタンパク質は、適切なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。
リンカーの非限定的な例は、ＤＧＧＧＳ（配列番号：３）、ＴＧＥＫＰ（配列番号：４）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号：５）、ＧＧＲＲ（配列番号：６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号：７）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号：８）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号：９）、ＬＲＱＫＤ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号：１０）、ＴＧＳＱＫＰ（配列番号：１１）、ＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳ（配列番号：１３）、ＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳＧＧ（配列番号：１４）である。ジンクフィンガーを連結するための、および／またはドメインを連結するための追加の例示的なリンカーを表１に列挙する。表１に列挙されるフィンガーフィンガーリンカーは、骨格配列の一部、例えば、ＦＱまたはＦＡを含む。
表１は、ジンクフィンガーアミノ酸配列および／またはＺＦＰおよび、図１４または１６に示される機能ドメイン配列を連結するために使用されてもよい例示的な代替ペプチドリンカーを実証する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の本操作されたＺＦＰは、図１４または１６の単一行に示されるように連結される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図１４または１６の単一行に示されるように、Ｆ１～Ｆ２、Ｆ２～Ｆ３、Ｆ３～Ｆ４、Ｆ４～Ｆ５、またはＦ５～Ｆ６の配列を含んでもよい。他の実施形態において、同じリンカーカテゴリーからの異なるリンカーを使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の本改変ＺＦＰは、図１４または１６の単一行に示されるように連結されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図１４または１６の単一行に示されるように、Ｆ１～Ｆ４、Ｆ１～Ｆ５、またはＦ１～Ｆ６の連結配列を含んでもよい。他の実施形態において、同じリンカーカテゴリーから１つ以上の異なるリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図１５または１７の単一行に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、図１５または１７の単一行に示される配列は翻訳後修飾後に現れるため、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、該配列の認識ヘリックス、骨格、およびリンカー部分を含む。いくつかの実施形態において、図１５または１７の単一行に示されるアミノ酸配列は翻訳後修飾後に現れるため、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、該配列を含む。例えば、翻訳後修飾は、図１５または１７に示されるように配列からイニシエーターメチオニン残基を除去してもよい。
ＩＶ．ＺＦＰ－ＴＦの発現
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子を通して患者に導入されてもよい。核酸分子は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子であってもよい。核酸は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射によって患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されてもよい。発現ベクターは、神経系の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコード配列の発現を可能にするプロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などの発現制御配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在し続ける。他の実施形態において、発現ベクターは細胞のゲノムに組み込まれる。
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子を通して患者に導入されてもよい。核酸分子は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子であってもよい。核酸は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射によって患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されてもよい。発現ベクターは、神経系の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコード配列の発現を可能にするプロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などの発現制御配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在し続ける。他の実施形態において、発現ベクターは細胞のゲノムに組み込まれる。
いくつかの実施形態において、脳におけるＺＦＰ－ＴＦ発現を指示するためのベクター上のプロモーターは、構成的活性プロモーターまたは誘導可能プロモーターである。適切なプロモーターは、これに限定されないが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター（所望によりＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（所望によりＣＭＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶ前初期プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦｌαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲ、クレアチンキナーゼベース（ＣＫ６）プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２因子（Ｅ２Ｆ）プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター; Niwa et al., Gene (1991) 108(2):193－9）、およびＲＵ－４８６応答性プロモーターを含む。シナプシンＩプロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーター、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーター、カルビンジン（Ｃａｌｂ）プロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＰｒＰプロモーター、ＧＦＡＰプロモーターなどのニューロン特異的プロモーター、、またはニューロンおよびグリア細胞への発現を制限する操作されたまたは天然のプロモーターも、使用されてもよい。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＬ１（Ａｌｄｈ１Ｌ１）プロモーターなどの星状細胞特異的プロモーターも使用されてもよい。Ｏｌｉｇ２プロモーターなどの希突起膠細胞特異的プロモーターも使用されてもよい。さらに、プロモーターは、ＺＦＰ－ＴＦが結合し、それ自体の発現レベルを予め設定された閾値まで抑制することができる、１つ以上の自己調節エレメントを含んでもよい。米国特許９，６２４，４９８を参照のこと。
これに限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、陽イオン性または陰イオン性リポソーム、核局在シグナルと組み合わせたリポソーム、天然リポソーム（例えば、エクソソーム)、またはウイルス形質導入を含む、ヌクレオチド配列を細胞中に導入する任意の方法を使用することができる。
発現ベクターのインビボ送達のために、ウイルス形質導入を使用してもよい。当技術分野で既知の様々なウイルスベクター、例えば、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポキシウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクターは、本開示における使用のために当業者により適合されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるウイルスベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。 ＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し、長期発現のための安定したエピソーム構造として存在し、免疫原性が非常に低いため、ＣＮＳ遺伝子送達に特に適している（Hadaczek et al., Mol Ther. (2010) 18:1458－61; Zaiss, et al., Gene Ther. (2008) 15:808－16)。任意の適切なＡＡＶ血清型を使用してもよい。例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９、またはＡＡＶ２／６／９などの血清型または偽型、または本明細書に列挙されたＡＡＶ血清型のうちの１つの変異体または誘導体である血清型（すなわち、複数の血清型に由来するＡＡＶ；たとえば、該ｒＡＡＶは、ゲノム中にＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびＡＡＶ８、５、６、または９キャプシドを含む）。いくつかの実施形態において、発現ベクターはＡＡＶウイルスベクターであり、昆虫細胞／バキュロウイルス生産系または哺乳動物細胞生産系などの生産システムにおいてＡＡＶビリオンの生産を可能にするために両端にＩＴＲ配列を有することを含む、ゲノムが構築物を含む組換えＡＡＶビリオンによって標的ヒト細胞中に導入される。ＡＡＶは、キャプシドタンパク質が免疫原性を低下させるか、またはヒトまたは非ヒト霊長類における形質導入能力を増強するように操作されてもよい。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９が使用される。本明細書に記載のウイルスベクターは、当技術分野で既知の方法を使用して生成されてもよい。ウイルス粒子を産生するために、任意の適切な許容細胞型またはパッケージング細胞型を使用してもよい。例えば、哺乳動物（例えば、２９３）または昆虫（例えば、ｓｆ９）細胞をパッケージング細胞株として使用してもよい。
Ｖ．薬学的適用
本ＺＦＰ－ＴＦは、タウ発現のダウンレギュレーションを必要とする患者を処置するために使用することができる。患者は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、外傷性脳損傷、発作性疾患、皮質基底核変性症、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）および／または別のタウオパチーなどの神経変性疾患を患っているかまたは発症するリスクがある。危険にさらされている患者は、遺伝的に素因がある人、脳震盪などの脳損傷を繰り返し受けた人、環境神経毒にさらされた人を含む、本開示は、対象の神経系に治療有効量（例えば、ＭＡＰＴ発現の十分な抑制を可能にする量）のＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）を導入することを含む、処置を必要とするヒト患者などの対象において神経疾患（例えば、神経変性疾患などのタウオパチー）を処置する方法を提供する。「処置する」なる語は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患の進行の遅延、生活の質の改善、および生存率の向上を包含する。
本ＺＦＰ－ＴＦは、タウ発現のダウンレギュレーションを必要とする患者を処置するために使用することができる。患者は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、外傷性脳損傷、発作性疾患、皮質基底核変性症、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）および／または別のタウオパチーなどの神経変性疾患を患っているかまたは発症するリスクがある。危険にさらされている患者は、遺伝的に素因がある人、脳震盪などの脳損傷を繰り返し受けた人、環境神経毒にさらされた人を含む、本開示は、対象の神経系に治療有効量（例えば、ＭＡＰＴ発現の十分な抑制を可能にする量）のＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）を導入することを含む、処置を必要とするヒト患者などの対象において神経疾患（例えば、神経変性疾患などのタウオパチー）を処置する方法を提供する。「処置する」なる語は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患の進行の遅延、生活の質の改善、および生存率の向上を包含する。
本開示は、組換えゲノムがＺＦＰ－ＴＦについての発現カセットを含むｒＡＡＶなどのウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物（例えば、人工脳脊髄液またはａＣＳＦ）は、水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、グリセロール、スクロース、ラクトース、ゼラチン、デキストラン、アルブミン、またはペクチンなどの薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。さらに、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または医薬組成物の有効性を高める他の試薬などの補助物質を含んでもよい。医薬組成物は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、およびベシクルなどの送達ビヒクルを含んでもよい。
本開示の治療薬によって標的とされる細胞は、これに限定されないが、神経細胞（例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、またはセロトニン作動性ニューロン）；グリア細胞（例えば、希突起膠細胞、星状細胞、周皮細胞、シュワン細胞、またはミクログリア細胞）；上衣細胞；または神経上皮細胞を含む、脳における細胞である。
治療によって標的とされる脳領域は、特定の皮質領域、嗅内皮質、海馬、小脳、淡蒼球、視床、中脳、尾状核、被殻、黒質、橋、延髄など、タウオパチーにおいて最も顕著に影響を受けるものであってもよい。これらの領域は、海馬内注射、脳内注射、大槽内（ＩＣＭ）注射、またはより一般的には実質内注射、視床内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、髄腔内注射、または静脈内注射によって直接到達できる。他の投与経路は、脳内、脳室内、鼻腔内、または眼内投与を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、例えば、髄腔内および／または脳内注射、または大槽内注射または脳室内注射を通した、脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接投与後に、ＣＮＳ組織全体に広がる。他の実施形態において、ウイルスベクターは血液脳関門を通過し、静脈内投与後に対象のＣＮＳ組織全体に広範囲に分布する。他の実施形態において、ウイルスベクターは、実質内注射を介して標的領域に直接送達される。場合により、ウイルスベクターは、実質内送達に続いて、他の脳領域への逆行性または順行性輸送を受けてもよい。いくつかの局面において、ウイルスベクターは、高効率で安定かつ非毒性の遺伝子導入を達成する、明確なＣＮＳ組織標的化能力（例えば、ＣＮＳ組織向性）を有する。
例として、医薬組成物は、脳室内投与を通して、例えば患者の前脳の脳室領域、例えば右側脳室、左側脳室、第三脳室、または第四脳室中に、患者に提供されてもよい。医薬組成物は、脳内投与、例えば、大脳、髄質、橋、小脳、視床、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、尾状核、被殻、嗅球、青斑核、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜、または脳の軟膜へのまたはその近くへの組成物の注射によって患者に提供されてもよい。脳内投与は、場合によって、脳を取り囲むくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）への薬剤の投与を含んでもよい。
場合によっては、脳内投与は、定位手術を用いた注射を含む。定位固定手順は、当技術分野で周知であり、典型的に、特定の脳内領域、例えば心室領域への注入を誘導するために一緒に使用されるコンピュータおよび三次元走査装置の使用を含む。マイクロインジェクションポンプ (例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 製）も使用されてもよい。場合により、ウイルスベクターを含む組成物を送達するためにマイクロインジェクションポンプが使用される。場合により、組成物の注入速度は、０．１μｌ／分～１００μｌ／分の範囲である。当業者に理解されるように、注入速度は、例えば対象の種、対象の年齢、対象の体重／サイズ、ＡＡＶの血清型、必要な投与量、および標的とされる脳内領域を含む様々な要因に依存する。したがって、他の注入速度は、特定の状況において適切であると当業者によってみなされてもよい。
対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、静脈内投与によって達成されてもよい。特定の例において、ｒＡＡＶ（例えば、１０１０～１０１５Ｖｇ）を、脳組織、脊髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、神経細胞、グリア細胞、髄膜、星状細胞、希突起膠細胞、ミクログリア、間隙などに局所的に送達することが望ましくてもよい。場合により、組換えＡＡＶは、海馬、大脳皮質、小脳小葉、小脳、大脳、髄質、橋、視床、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、尾状核、被殻、嗅球、青斑核、脳幹、淡蒼球、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜、または脳の軟膜、または他の脳領域に加えて、脳室領域またはその近くに注射することによってＣＮＳに直接送達されてもよい。ＡＡＶは、針、カテーテル、または関連機器を用いて、定位注射などの当技術分野で既知の神経外科技術を使用して送達されてもよい（例えば、Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424－9; Davidson et al., PNAS (2000) 97:3428－32; Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219－223; および Alisky and Davidson, Hum Gene Ther. (2000) 11:2315－29を参照)。
本明細書で特に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することもできる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載される神経学、医学、医用および薬学化学、ならびに細胞生物学に関連して使用される命名法および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造元の仕様書に従って実施される。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態を通じて、「有する(have)」および「含む(comprising)」という言葉、または「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(comprises)」、または「含む(comprising)」などの変形は、記載された整数または整数の群を含むことを意味すると理解されるが、任意の他の整数または整数の群を除外するものではない。本明細書で言及されたすべての刊行物および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書では多くの文書が引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で使用される用語「およそ」または「約」は、１つ以上の目的の値に適用される場合、記載された参照値に類似する値を指す。特定の実施形態において、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、この用語は、記載された参照値のいずれかの方向で（より大きいまたは小さい）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内に入る値の範囲を指す。
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明のみを目的としており、本発明の範囲を決して限定するものと解釈されるべきではない。
ＶＩ．例示的な実施形態
本開示の非限定的な例示的実施形態を以下に説明する。
１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５２２８８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５２３８９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５２３６４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５７８９０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２１４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２１８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２２５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２２７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２４９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３０４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここで、ＺＦＰ ＩＤは７１３０９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３１０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３１２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３５１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３５２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３５７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３６４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３６６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３８５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３８９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここで、ＺＦＰ ＩＤは７１４００である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４０１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４０２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４１４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４２０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４２４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４３７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４４７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４４８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４５３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４６７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４６８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４７０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４７２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４８５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１５０３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは６５９１８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰＩ５Ｄは７３０１７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０２０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０２９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列およびＺＦＰ ＩＤに対応する骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７３．標的配列に結合し、図７２の一列に示されるＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列およびＺＦＰ ＩＤに対応する骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列およびＺＦＰ ＩＤに対応する骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１３０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１３１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１３３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２００である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２０１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２０２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２０３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９４．ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質が転写リプレッサードメインを含む、実施形態１～９３のいずれか１つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９５．転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインを含む、実施形態９４のＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９６．転写抑制ドメインが配列番号２を含む、実施形態９４のＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９７．実施形態１～９６のいずれか１つの融合タンパク質を細胞中に導入することを含む、ヒト脳細胞におけるタウの発現を阻害する方法。
９８．実施形態１～９６のいずれか１つの２つ以上の異なる融合タンパク質を細胞中に導入することを含む、ヒト脳細胞におけるタウの発現を阻害する方法。
９９．実施形態４（ＺＦＰ ＩＤ５７８９０）および実施形態５３（ＺＦＰ ＩＤ６５９１８）の融合タンパク質を細胞中に導入することを含む、ヒト脳細胞におけるタウの発現を阻害する方法。
１００．融合タンパク質のそれぞれが転写リプレッサードメインを含み、所望により転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインである、実施形態９８または９９の方法。
１０１．融合タンパク質が共送達される、実施形態９８～１００のいずれか１つの方法。
１０２．融合タンパク質が２Ａ自己切断ペプチドによって連結されている、実施形態９８～１００のいずれか１つの方法。
本開示の非限定的な例示的実施形態を以下に説明する。
１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５２２８８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５２３８９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５２３６４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは５７８９０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２１４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２１８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２２５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２２７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１２４９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３０４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここで、ＺＦＰ ＩＤは７１３０９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３１０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３１２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３４７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３５１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
１９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３５２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３５７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３６４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３６６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３７８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３８５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３８９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１３９９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここで、ＺＦＰ ＩＤは７１４００である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４０１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４０２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４１４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４２０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４２４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４３．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４３７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４４．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４４７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４５．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４４８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４６．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４５３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４７．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４６７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４８．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４６８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
４９．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４７０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５０．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４７２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５１．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１４８５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５２．標的配列に結合し、図１４の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７１５０３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは６５９１８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰＩ５Ｄは７３０１７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０１９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
５９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０２０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０２９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列およびＺＦＰ ＩＤに対応する骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３０３５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
６９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７３．標的配列に結合し、図７２の一列に示されるＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列およびＺＦＰ ＩＤに対応する骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列およびＺＦＰ ＩＤに対応する骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１２９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１３０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１３１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
７９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１３３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９０である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるようなＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８４．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８５．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８６．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８７．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８８．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
８９．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３１９９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９０．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２００である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９１．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２０１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９２．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２０２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９３．標的配列に結合し、図１６の単一行に示されるＺＦＰ ＩＤに対応するＤＮＡ結合ジンクフィンガー認識ヘリックス配列および骨格変異を含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ここでＺＦＰ ＩＤは７３２０３である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９４．ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質が転写リプレッサードメインを含む、実施形態１～９３のいずれか１つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９５．転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインを含む、実施形態９４のＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９６．転写抑制ドメインが配列番号２を含む、実施形態９４のＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
９７．実施形態１～９６のいずれか１つの融合タンパク質を細胞中に導入することを含む、ヒト脳細胞におけるタウの発現を阻害する方法。
９８．実施形態１～９６のいずれか１つの２つ以上の異なる融合タンパク質を細胞中に導入することを含む、ヒト脳細胞におけるタウの発現を阻害する方法。
９９．実施形態４（ＺＦＰ ＩＤ５７８９０）および実施形態５３（ＺＦＰ ＩＤ６５９１８）の融合タンパク質を細胞中に導入することを含む、ヒト脳細胞におけるタウの発現を阻害する方法。
１００．融合タンパク質のそれぞれが転写リプレッサードメインを含み、所望により転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインである、実施形態９８または９９の方法。
１０１．融合タンパク質が共送達される、実施形態９８～１００のいずれか１つの方法。
１０２．融合タンパク質が２Ａ自己切断ペプチドによって連結されている、実施形態９８～１００のいずれか１つの方法。
実施例
実施例１：抗タウＺＦＰ－ＴＦのスクリーニング
タウの発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定するために、ＴＳＳの１０００ｂｐ上流から５００ｂｐ下流に及ぶヒトＭＡＰＴ遺伝子の領域の１５、１８、または１９ｂｐ配列に結合すると予測される３７０個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを、タウ抑制活性について設計し、スクリーニングした。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、図２において五角形で示されている。五角形の方向は、ＺＦＰ－ＴＦが結合するＤＮＡ鎖を示す（５’から３’）。この研究において、ＫＲＡＢドメイン配列（配列番号２）を転写リプレッサーとして使用し、ＺＦＰドメインのＣ末端に融合させた。代表的な５２個のＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の図１４に示す。インビトロ転写用の鋳型を、ＰＣＲ（フォワードプライマーＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１６）；リバースプライマーＴ（１８０）ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１７））を使用して、ｐＶＡＸ－ＺＦＰまたはｐＶＡＸ－ＧＦＰプラスミドから生成した。製造元の指示に従って、メッセンジャーＲＮＡをｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成し、ＲＮｅａｓｙ９６カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、各ＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡを９６ウェルプレートに６回希釈で分注した。
実施例１：抗タウＺＦＰ－ＴＦのスクリーニング
タウの発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定するために、ＴＳＳの１０００ｂｐ上流から５００ｂｐ下流に及ぶヒトＭＡＰＴ遺伝子の領域の１５、１８、または１９ｂｐ配列に結合すると予測される３７０個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを、タウ抑制活性について設計し、スクリーニングした。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、図２において五角形で示されている。五角形の方向は、ＺＦＰ－ＴＦが結合するＤＮＡ鎖を示す（５’から３’）。この研究において、ＫＲＡＢドメイン配列（配列番号２）を転写リプレッサーとして使用し、ＺＦＰドメインのＣ末端に融合させた。代表的な５２個のＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の図１４に示す。インビトロ転写用の鋳型を、ＰＣＲ（フォワードプライマーＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１６）；リバースプライマーＴ（１８０）ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１７））を使用して、ｐＶＡＸ－ＺＦＰまたはｐＶＡＸ－ＧＦＰプラスミドから生成した。製造元の指示に従って、メッセンジャーＲＮＡをｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成し、ＲＮｅａｓｙ９６カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、各ＺＦＰ－ＴＦをコードするｍＲＮＡを９６ウェルプレートに６回希釈で分注した。
スクリーニングを、ＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経上皮細胞株で実施した。ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞はヒトタウを高レベルで発現するため、タウ発現を低下させるＺＦＰ－ＴＦの試験に適している。ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞を、コンフルエントになるまで組織培養フラスコで培養した。細胞を１５０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、Ａｍａｘａ（登録商標）ＳＦ溶液に再懸濁した。次いで、細胞をＺＦＰ－ＴＦｍＲＮＡ（６用量：３、１０、３０、１００、３００、および１０００ｎｇ）と混合し、Ａｍａｘａ（登録商標）シャトルプレートウェルに移した。細胞を、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）機器（Ｌｏｎｚａ；プログラムＣＭ－１３７）を使用してトランスフェクトした。イーグルのＭＥＭ細胞培地をプレートの各ウェルに加えた。細胞を９６ウェル組織培養プレートに移し、３７℃で２０時間インキュベートした。
次いで、細胞を溶解し、製造者の指示に従ってＣ２ＣＴキットを使用して逆転写を行った。ＴａｑＭａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、ハウスキーピング遺伝子Ａｔｐ５ｂおよびＥｉｆ４ａ２の発現レベルの幾何平均に正規化されたＭＡＰＴの発現レベルを測定した。ＭＡＰＴを標的としないことが既知であるモックトランスフェクションおよびＺＦＰ－ＴＦを用いたトランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
試験したＺＦＰ－ＴＦの～２９％でタウの５０％以上の用量依存的抑制が見出された。達成された最大抑制は１００％であったが、タウをより低い程度に抑制したＺＦＰ－ＴＦも特定した（例えば、最高用量で約９０％、約７５％、または約５０％）。図３Ａ～Ｄはスクリーニングデータを示す。また、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて５２の代表的なＺＦＰ－ＴＦをテストした（データは示さず）。
実施例２：抗タウＺＦＰ－ＴＦの標的特異性の最適化
ＺＦＰ－ＴＦの標的特異性を最適化するために、ジンクフィンガーのうち３つまでのアルギニン（Ｒ）残基をグルタミン（Ｑ）に変異させた。このアルギニン残基は、ＤＮＡ結合ヘリックスの１番目のアミノ酸の上流の４番目のアミノ酸に位置し、各ジンクフィンガーのβシート中にある（図４、５Ａおよび５Ｂ）。この残基は、標的ＤＮＡのリン酸骨格との保存された非特異的接触に関与している。各親ＺＦＰ－ＴＦを、示されたヘリックスの１番目のアミノ酸の４番目の位置上流で変異させ、最大７つの異なるＲ→Ｑ変異体を生成させた。４１個の代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の図１６に示す。Miller et al., Nat Biotechnol. (2019) 37:945-52も参照のこと。
ＺＦＰ－ＴＦの標的特異性を最適化するために、ジンクフィンガーのうち３つまでのアルギニン（Ｒ）残基をグルタミン（Ｑ）に変異させた。このアルギニン残基は、ＤＮＡ結合ヘリックスの１番目のアミノ酸の上流の４番目のアミノ酸に位置し、各ジンクフィンガーのβシート中にある（図４、５Ａおよび５Ｂ）。この残基は、標的ＤＮＡのリン酸骨格との保存された非特異的接触に関与している。各親ＺＦＰ－ＴＦを、示されたヘリックスの１番目のアミノ酸の４番目の位置上流で変異させ、最大７つの異なるＲ→Ｑ変異体を生成させた。４１個の代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の図１６に示す。Miller et al., Nat Biotechnol. (2019) 37:945-52も参照のこと。
実施例３：親の抗タウＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体のスクリーニング
ヒトタウの発現を最もよく抑制する親ＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体を同定するために、約３４０の変異体ＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを実施例１に記載のようにスクリーニングした。→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦを、それぞれのＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで形質導入されたヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンでもテストした。
ヒトタウの発現を最もよく抑制する親ＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体を同定するために、約３４０の変異体ＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを実施例１に記載のようにスクリーニングした。→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦを、それぞれのＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで形質導入されたヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンでもテストした。
ＡＡＶ生産
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を、トリプルトランスフェクション法によって生成させた。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３細胞を１０層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）に播種し、３日間８０％の密度まで増殖させた。３つのプラスミド-（ｉ）ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶヘルパープラスミド、（ｉｉ）アデノウイルスヘルパー遺伝子を含むアデノウイルスヘルパープラスミド、および（ｉｉｉ）ＡＡＶ２逆方向末端反復が隣接するパッケージングされる配列を含むトランスジーンプラスミドを、リン酸カルシウムを使用して細胞中にトランスフェクトした。３日後、細胞を回収した。次いで、細胞を３回の凍結／融解によって溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去した。ｒＡＡＶを、ポリエチレングリコールを使用して沈殿させた。再懸濁後、塩化セシウム勾配で一晩超遠心分離することによりウイルスを精製した。ウイルスを透析によって処方し、次いでフィルター滅菌した。ＰＢＳ＋０．００１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８で希釈してすべてのＡＡＶバッチの力価（ウイルスゲノム／ｍｌ）を調整した後、ＡＡＶを１回使用量に分注し、使用するまで－８０℃で保存した。解凍後、再凍結はしなかった。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を、トリプルトランスフェクション法によって生成させた。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３細胞を１０層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）に播種し、３日間８０％の密度まで増殖させた。３つのプラスミド-（ｉ）ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶヘルパープラスミド、（ｉｉ）アデノウイルスヘルパー遺伝子を含むアデノウイルスヘルパープラスミド、および（ｉｉｉ）ＡＡＶ２逆方向末端反復が隣接するパッケージングされる配列を含むトランスジーンプラスミドを、リン酸カルシウムを使用して細胞中にトランスフェクトした。３日後、細胞を回収した。次いで、細胞を３回の凍結／融解によって溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去した。ｒＡＡＶを、ポリエチレングリコールを使用して沈殿させた。再懸濁後、塩化セシウム勾配で一晩超遠心分離することによりウイルスを精製した。ウイルスを透析によって処方し、次いでフィルター滅菌した。ＰＢＳ＋０．００１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８で希釈してすべてのＡＡＶバッチの力価（ウイルスゲノム／ｍｌ）を調整した後、ＡＡＶを１回使用量に分注し、使用するまで－８０℃で保存した。解凍後、再凍結はしなかった。
ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンをＣｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入し、ポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニンでコーティングした９６ウェルプレートに１ウェルあたり４０，０００細胞の密度で播種し、製造元の指示に従って維持した。細胞を、プレーティングの４８時間後に示されたＭＯＩで所望のＺＦＰ－ＴＦを発現するＡＡＶに感染させ、最大３２日間維持した（３～５日ごとに５０～７５％の培地交換を行った）。実験期間の終了時に細胞を回収し、ＲＮＡを分離し、遺伝子発現解析のためにＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。マイクロアレイ分析のために、細胞を播種の４８時間後に１Ｅ５ＶＧ／細胞でトランスフェクトし、ウイルストランスフェクションの１９日後に回収した。
初代マウスニューロン培養およびＺＦＰ－ＴＦＡＡＶ感染
初代マウス皮質ニューロン（ＭＣＮ）を、Ｇｉｂｃｏから購入した。細胞を、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングした９６ウェルまたは２４ウェルプレートに、それぞれ５０，０００または２００，０００細胞／ウェルで播種し、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）Ｉサプリメント、Ｂ２７サプリメント、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＧｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを使用して、製造元の仕様書に従って維持した。播種の４８時間後（ＤＩＶ２で）、９６ウェルプレートの５０，０００細胞／ウェルを指定されたＭＯＩでＡＡＶ－ＺＦＰに感染させ、７日後に採取し（ＤＩＶ９で、３～４日ごとに５０％の培地交換を行った）、その後ＲＴ－ｑＰＣＲによるＲＮＡ分離および遺伝子発現解析を行った。あるいは、２４ウェルプレートの２００，０００ニューロン／ウェルを１Ｅ５ＶＧ／細胞で処置して、１００％の形質導入率を確保し、ＤＩＶ９でのマイクロアレイ解析のために同様の方法で処置した。
初代マウス皮質ニューロン（ＭＣＮ）を、Ｇｉｂｃｏから購入した。細胞を、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングした９６ウェルまたは２４ウェルプレートに、それぞれ５０，０００または２００，０００細胞／ウェルで播種し、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）Ｉサプリメント、Ｂ２７サプリメント、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＧｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを使用して、製造元の仕様書に従って維持した。播種の４８時間後（ＤＩＶ２で）、９６ウェルプレートの５０，０００細胞／ウェルを指定されたＭＯＩでＡＡＶ－ＺＦＰに感染させ、７日後に採取し（ＤＩＶ９で、３～４日ごとに５０％の培地交換を行った）、その後ＲＴ－ｑＰＣＲによるＲＮＡ分離および遺伝子発現解析を行った。あるいは、２４ウェルプレートの２００，０００ニューロン／ウェルを１Ｅ５ＶＧ／細胞で処置して、１００％の形質導入率を確保し、ＤＩＶ９でのマイクロアレイ解析のために同様の方法で処置した。
図６は、代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦのスクリーニングデータを示す。図７Ａおよび７Ｂは、それぞれのＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで形質導入されたヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよびマウス一次ニューロンにおける、代表的なＺＦＰ－ＴＦおよびそれらのＲ→Ｑ変異体の用量依存的活性を示す。
これらの図におけるデータは、Ｒ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦが広範囲のタウ抑制活性プロファイルを示し、試験した最高用量でのヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるヒトタウｍＲＮＡ抑制は約４５％から１００％の範囲にあった。初代皮質マウスニューロンにおける代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦの発現は、７日後に全マウスＭａｐｔの用量依存的抑制をもたらさなかったため、試験されたＺＦＰ－ＴＦはヒトＭＡＰＴを特異的に標的とすることも明らかである。
実施例４：抗タウＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性
親ＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体が全体的な遺伝子発現に及ぼすオフターゲットの影響を評価するために、代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで処置されたヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンから分離された全ＲＮＡに対してマイクロアレイ（Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓ ＡｒｒａｙおよびＣｌａｒｉｏｍ Ｄ Ａｒｒａｙ）実験を実施した。また、定量的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を実行して、これらのＺＦＰ－ＴＦがタウ遺伝子座（ヒトタウおよびＳＴＨ）内の転写産物の発現レベルおよびマイクロアレイ研究で特定された明らかなオフターゲット遺伝子（ＣＰＮＥ６およびＩＧＦ２）の発現レベルに及ぼす影響を比較した。
親ＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体が全体的な遺伝子発現に及ぼすオフターゲットの影響を評価するために、代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで処置されたヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンから分離された全ＲＮＡに対してマイクロアレイ（Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓ ＡｒｒａｙおよびＣｌａｒｉｏｍ Ｄ Ａｒｒａｙ）実験を実施した。また、定量的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を実行して、これらのＺＦＰ－ＴＦがタウ遺伝子座（ヒトタウおよびＳＴＨ）内の転写産物の発現レベルおよびマイクロアレイ研究で特定された明らかなオフターゲット遺伝子（ＣＰＮＥ６およびＩＧＦ２）の発現レベルに及ぼす影響を比較した。
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を製造元のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って行い、アッセイ結果をＴＡＣ４ソフトウェアを使用して分析した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を使用して、ＦＤＲ補正ｐ値≦０．０５の明らかなオフターゲットをさらに調査した。
マイクロアレイ分析を製造元のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って行い、アッセイ結果をＴＡＣ４ソフトウェアを使用して分析した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を使用して、ＦＤＲ補正ｐ値≦０．０５の明らかなオフターゲットをさらに調査した。
ＲＴ－ｑＰＣＲを用いた遺伝子発現解析
製造者の指示に従ってＣ２ＣＴキットを用いて逆転写を行った。ＴａｑＭａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、Ｍａｐｔ、Ｓｔｈ、Ｃｐｎｅ６、およびＩｇｆ２の転写レベルを測定した。遺伝子発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子Ａｔｐ５ｂ、Ｅｉｆ４ａ２、およびＧａｐｄｈの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。ＭＡＰＴ、ＳＴＨ、ＣＰＮＥ６、およびＩＧＦ２を標的としないことが既知であるモックトランスフェクションおよびＺＦＰ－ＴＦを用いたトランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
製造者の指示に従ってＣ２ＣＴキットを用いて逆転写を行った。ＴａｑＭａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、Ｍａｐｔ、Ｓｔｈ、Ｃｐｎｅ６、およびＩｇｆ２の転写レベルを測定した。遺伝子発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子Ａｔｐ５ｂ、Ｅｉｆ４ａ２、およびＧａｐｄｈの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。ＭＡＰＴ、ＳＴＨ、ＣＰＮＥ６、およびＩＧＦ２を標的としないことが既知であるモックトランスフェクションおよびＺＦＰ－ＴＦを用いたトランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
図８は、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンにおける６つの代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦのマイクロアレイ結果を示す。図９は、代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦで形質導入されたヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＭａｐｔ、Ｓｔｈ、Ｃｐｎｅ６、およびＩｇｆ２遺伝子発現についてのＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。
Ｒ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦは低いかまたはない検出可能なオフターゲット活性を示すことを見出した。
実施例５：抗タウＺＦＰ－ＴＦの代表的なＲ→Ｑ変異体のインビボ耐性
海馬内定位固定ＡＡＶ９投与後のＺＦＰ－ＴＦ媒介タウ抑制の潜在的な有害作用を評価するために、さまざまなヒトタウ抑制活性を有する親ＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体をコードするＡＡＶで処置してから４週間後の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳から分離された海馬組織におけるＺＦＰ－ＴＦ、タウ、Ｇｆａｐ、Ｉｂａ１、およびＮｅｕＮ発現の定量的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を通して導入遺伝子発現および神経炎症マーカーの発現レベルを評価した。
海馬内定位固定ＡＡＶ９投与後のＺＦＰ－ＴＦ媒介タウ抑制の潜在的な有害作用を評価するために、さまざまなヒトタウ抑制活性を有する親ＺＦＰ－ＴＦのＲ→Ｑ変異体をコードするＡＡＶで処置してから４週間後の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳から分離された海馬組織におけるＺＦＰ－ＴＦ、タウ、Ｇｆａｐ、Ｉｂａ１、およびＮｅｕＮ発現の定量的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を通して導入遺伝子発現および神経炎症マーカーの発現レベルを評価した。
その後の分析のために海馬組織を採取するために、マウスをＰＢＳで灌流し、脳を摘出し、氷上で解剖した。海馬をかみそりの刃またはメスで切り刻み、切り刻んだ組織をＲＮＡおよびＤＮＡ分析用に指定された２つの部分に分割した。次いで、細かく刻んだ組織を液体窒素で急速冷凍し、分析まで－８０℃で維持した。
逆転写は、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを製造元の指示に従って使用して実施した。ＴａｑＭａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、ＺＦＰ－ＴＦ、Ｍａｐｔ、Ｇｆａｐ、Ｉｂａ１、およびＮｅｕＮの発現レベルを測定した。遺伝子発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子Ａｔｐ５ｂ、Ｅｉｆ４ａ２、およびＧａｐｄｈの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。ビヒクル処置およびＡＡＶ発現緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）による処置を、ネガティブコントロールとして使用した。
試験したＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦのほとんどが、最大投与量でインビボで良好に許容されることを見出した。いくつかの候補では、神経炎症マーカーの発現レベルに有意な変化はなかった。さらに、いくつかの候補はマウスのタウに対して交差反応性を示さず、高度の特異性を示す。代表的なＲ→Ｑ変異体ＺＦＰ－ＴＦで処置した成体マウスは、安定したマウスＭａｐｔ発現を示し、これらのＺＦＰ－ＴＦがヒトＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的としていることを示す。しかし、１つの融合タンパク質はＺＦＰ－ＴＦの発現低下を示し、別の融合タンパク質は神経炎症マーカーＧｆａｐおよびＩｂａ１の発現レベルの上昇をもたらした。テストされたＺＦＰ－ＴＦのいずれも、ニューロンマーカーＮｅｕＮの発現レベルの低下をもたらさなかった。これらの所見は、この研究で試験されたタウＺＦＰ－ＴＦ候補がマウスにおいてインビボで望ましいプロファイルを有し、マウス脳における発現に続く神経炎症マーカーの上昇および神経細胞の喪失の証拠が最小限に抑えられていることを示す（図１０）。
実施例６：抗タウＺＦＰ－ＴＦの代表的なＲ→Ｑ変異体によるヒトタウｍＲＮＡおよびタンパク質のインビボ還元
インビボでのヒトタウｍＲＮＡおよびタンパク質の減少を評価するために、本明細書に記載されるように、抗タウＺＦＰ－ＴＦをｈｔａｕマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｍａｐｔｔｍ１（ＥＧＦＰ）ＫｌｔＴｇ（ＭＡＰＴ）８ｃＰｄａｖ／Ｊ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ）に投与した。ｈｔａｕマウスは、ＧＦＰ発現構築物をマウスＭａｐｔの最初のコーディングエクソンに挿入することによって機能的にノックアウトされた内因性（マウス）Ｍａｐｔをバックグラウンドに、野生型のヒトＭＡＰＴ遺伝子を発現する。マウスは、ビヒクル、７３１３３、７３０３４、７３１２２、または６５９１８．Ｔ２Ａ．５７８９０（マウスＭａｐｔ遺伝子の部位を標的とするように設計された２つのＺＦＰを共発現する構築物）のいずれかをコードするＡＡＶ９ベクターの背側および腹側海馬への定位二重、両側注射を受けた。ＺＦＰ－ＴＦ７３１３３、７３０３４、および７３１２２を、半球あたり３Ｅ９、１Ｅ０、および３Ｅ１０ＶＧの用量でテストした一方、ＺＦＰ－ＴＦ６５９１８．Ｔ２Ａ．５７８９０を、半球あたり３Ｅ９ＶＧのみでテストした。マウスの別の群を、分子、生化学的、および免疫組織学的エンドポイントの注射後３ヶ月または６ヶ月で犠牲にした。
インビボでのヒトタウｍＲＮＡおよびタンパク質の減少を評価するために、本明細書に記載されるように、抗タウＺＦＰ－ＴＦをｈｔａｕマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｍａｐｔｔｍ１（ＥＧＦＰ）ＫｌｔＴｇ（ＭＡＰＴ）８ｃＰｄａｖ／Ｊ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ）に投与した。ｈｔａｕマウスは、ＧＦＰ発現構築物をマウスＭａｐｔの最初のコーディングエクソンに挿入することによって機能的にノックアウトされた内因性（マウス）Ｍａｐｔをバックグラウンドに、野生型のヒトＭＡＰＴ遺伝子を発現する。マウスは、ビヒクル、７３１３３、７３０３４、７３１２２、または６５９１８．Ｔ２Ａ．５７８９０（マウスＭａｐｔ遺伝子の部位を標的とするように設計された２つのＺＦＰを共発現する構築物）のいずれかをコードするＡＡＶ９ベクターの背側および腹側海馬への定位二重、両側注射を受けた。ＺＦＰ－ＴＦ７３１３３、７３０３４、および７３１２２を、半球あたり３Ｅ９、１Ｅ０、および３Ｅ１０ＶＧの用量でテストした一方、ＺＦＰ－ＴＦ６５９１８．Ｔ２Ａ．５７８９０を、半球あたり３Ｅ９ＶＧのみでテストした。マウスの別の群を、分子、生化学的、および免疫組織学的エンドポイントの注射後３ヶ月または６ヶ月で犠牲にした。
ｈｔａｕマウスの脳から単離された海馬組織において、ＺＦＰ導入遺伝子、ヒトＭＡＰＴ、内因性マウスＭａｐｔ、および内因性Ｍａｐｔ翻訳を妨害するＧＦＰカセットの発現レベルを定量的ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。Ｇｆａｐ、Ｉｂａ１、ＮｅｕＮなどの神経炎症マーカーおよび神経細胞マーカーも評価した。さらに、サイトヒン（ＳＴＨ）なる名前のヒトＭＡＰＴ内の未知の機能のイントロン転写産物のレベルを評価した。
その後の分析のために海馬組織を採取するために、マウスをＰＢＳで灌流し、脳を摘出し、氷上で解剖した。右半球については、海馬をかみそりの刃またはメスで切り刻み、切り刻んだ組織をＲＮＡおよびタンパク質分析用に指定された２つの部分に分割した。次いで、細かく刻んだ組織を液体窒素で急速冷凍し、分析まで－８０℃で維持した。左半球について、海馬を１０％ＮＢＦで２４時間落下固定し、７０％エタノールに移し、次いでｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）分析のためにパラフィンブロックに包埋した。
ｍＲＮＡ分析のために、マイクロアレイＲＮＡ抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）用のＭａｇＭａｘを使用して全ＲＮＡを抽出し、メーカーの指示に従って、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを使用して逆転写を行った。ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、標的遺伝子の発現レベルを測定した。ＺＦＰ導入遺伝子の発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応の入力として使用される総ＲＮＡの量に正規化した。他のすべての標的遺伝子の発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子Ａｔｐ５ｂ、Ｅｉｆ４ａ２、およびＧａｐｄｈの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。すべての処置群を、ビヒクル群について観察された正規化されたレベルの平均にスケーリングした。
タンパク質分析のために、全ヒトタウＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを使用して、製造業者のプロトコルに従ってヒトタウタンパク質のレベルを定量化した。総タウレベルを、ＢＣＡタンパク質アッセイによって決定された総タンパク質に対して正規化した。すべての処置群を、ビヒクル群について観察された正規化されたレベルの平均にスケーリングした。
ＩＳＨ分析のために、製造業者のプロトコル（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従って、パラフィン包埋ブロックを切断し、多重ＲＮＡｓｃｏｐｅ／免疫蛍光染色のために処置した。切片の核をＤＡＰＩで染色し、ヒトＭＡＰＴ転写物をＲＮＡｓｃｏｐｅで染色し、ＮｅｕＮタンパク質を免疫蛍光法で染色した。
ＺＦＰ－ＴＦの各々を、３ヶ月および６ヶ月の両方の時点で、対応する用量ごとに試験されたすべての構築物にわたって、持続的で用量依存的に、同様のレベルで発現させた。ヒトを標的とした抗タウＺＦＰ－ＴＦは、両方の時点で試験した最高用量で、ヒトタウｍＲＮＡを最大９３％（７３１３３）、または５４～６１％（７３０３４および７３１２２）まで特異的に減少させることができた。ＺＦＰ－ＴＦ７３１３３および７３０３４は、タウｍＲＮＡの用量依存的な減少をもたらしたが、７３１２２は、テストされた用量の範囲全体で横ばい効果をもたらした（約４６～６８％の減少）。同様の結果を、テストされたすべてのＺＦＰ－ＴＦおよびタイムポイントについてのイントロンＭＡＰＴトランスクリプトＳＴＨについて観察した。７３１３３、７３０３４、および７３０３４について、内因性マウスＭａｐｔまたはＧＦＰ発現の有意な減少はなかった。６５９１８．Ｔ２Ａ．５７８９０を標的とする異種間では、テストされた単回投与（半球あたり３Ｅ９ＶＧ）で、両方の時点でヒトおよびマウスの両方のタウが５０％を超えて減少した。ＺＦＰ処置群において、神経炎症およびニューロンマーカーＧｆａｐ、Ｉｂａ１、またはＮｅｕｎの発現レベルの変化は観察されないか、または最小限の有意な変化が観察された（図１１）。
ヒト標的化抗タウＺＦＰ－ＴＦは、同様に、両方の時点で試験した最高用量でヒトタウタンパク質レベルを９７％（７３１３３）から＞６４～８０％（７３０３４および７３１２２）まで減少させた。ＺＦＰ－ＴＦ７３１３３および７３０３４は、タウタンパク質の用量依存的な減少をもたらしたのに対し、７３１２２は、試験された用量の範囲にわたって横ばい効果をもたらした（約５４～８０％の減少；図１２）。
ＲＮＡｓｃｏｐｅ分析は、処置ｈｔａｕマウスの海馬におけるＺＦＰ依存性の程度のヒトＭＡＰＴ転写物の減少を示した。ビヒクルで処置したマウスと比較して、ＺＦＰ－ＴＦ７３１３３で処置した海馬のＮｅｕＮ陽性ニューロンは、３ｅ９試験用量で３か月後に検出可能なＭＡＰＴ転写産物が最小限しか残っていなかった。対照的に、７３１２２は中間レベルの検出可能なＭＡＰＴ転写物が残っており、バルクＭＡＰＴｍＲＮＡおよびタウタンパク質分析と一致して、このＺＦＰ－ＴＦについての総抑制が少ないことを示している（図１３）。これらの単一細胞データは、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞、培養ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン、およびｈｔａｕマウスからのバルク脳組織で発現されたＭＡＰＴ標的ＺＦＰ－ＴＦについて得られた抑制結果を裏付ける。
これらの知見は、この研究で試験されたタウＺＦＰ－ＴＦ候補が、マウスにおいてインビボで望ましいタウ低下プロファイルを有し、神経炎症マーカー上昇の証拠が最小限であり、ｈｔａｕマウス脳における発現後のニューロン損失がないことを示す。
Claims (27)
- ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写抑制ドメインを含む融合タンパク質であって、ＺＦＰドメインがヒト微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の標的領域に結合する、融合タンパク質。
- 標的領域が、ＭＡＰＴ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の１．５ｋｂ以内にある、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 標的領域が、ＭＡＰＴ遺伝子のＴＳＳの上流１０００ｂｐｓ以内、および／またはＴＳＳの下流５００ｂｐｓ以内にある、請求項２に記載の融合タンパク質。
- ないかまたは最小限の検出可能なオフターゲット結合または活性とともに、融合タンパク質が、ＭＡＰＴ遺伝子の発現を少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％抑制する、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 転写抑制ドメインが、ＫＲＡＢドメインを含み、所望により該ＫＲＡＢドメインがヒトＫＯＸ１タンパク質由来である、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ＤＮＡ結合ドメインが、ペプチドリンカーを通して転写リプレッサーに連結されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ＺＦＰドメインが、図１４または１６に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ＺＦＰドメインが、図１４または１６の単一行に示されるようなＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質のＺＦＰドメインが、
４つ、５つ、または６つのジンクフィンガーを含み；
図１４または１６に示される標的配列に結合し；
図１５または１７に示されるＺＦＰ転写因子のＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含み；
図１４、１５、１６、または１７に示されるように連結されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含み；および／または
配列番号８９～１９６、１９７～２４８および２６７～３０７から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質のコード配列を含む核酸構築物であって、該コード配列が転写調節エレメントに作動可能に連結されている、核酸構築物。
- 転写調節エレメントが、脳細胞において構成的に活性または誘導可能である哺乳動物プロモーターである、請求項１０に記載の核酸構築物であって、ここで所望により構築物が組換えウイルス構築物である、核酸構築物。
- 請求項１０または１１に記載の核酸構築物を含む、組換えウイルス。
- 組換えウイルスが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載の組換えウイルス。
- 請求項１０または１１に記載の核酸構築物、または請求項１２または１３に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 請求項１０または１１に記載の核酸構築物、または請求項１２または１３に記載の組換えウイルスを含む、宿主細胞。
- 宿主細胞がヒト細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が、脳細胞または多能性幹細胞であり、所望により幹細胞が胚性幹細胞または誘導可能多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１５または１６に記載の宿主細胞。
- ヒト脳細胞におけるタウの発現を阻害する方法であって、所望により請求項１０または１１に記載の核酸構築物、請求項１２または１３に記載の組換えウイルスの導入を通して、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞中に導入すること、またはそれにより細胞におけるタウの発現を阻害することを含む、方法。
- ヒト脳細胞が、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、神経上皮細胞、内皮細胞、または希突起膠細胞である、請求項１８に記載の方法。
- 細胞が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、発作性疾患、皮質基底核変性症(ＣＢＤ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、または別のタウオパチーを患っているかまたは発症するリスクがある患者の脳中にある、請求項１８または１９に記載の方法。
- 融合タンパク質を発現する組換えウイルスを細胞中に導入することを含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えウイルスが、所望により血清型９またはＡＡＶ９由来のシュードタイプの、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２１に記載の方法。
- 請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする組換えＡＡＶまたは核酸構築物を患者に投与することを含む、処置を必要とする患者においてタウオパチーを処置する方法。
- ＡＡＶまたは核酸構築物が、静脈内、鞘内、大脳内、脳室内、大槽内、海馬内、視床内、または実質内経路を介して患者に導入される、請求項２３に記載の方法。
- タウオパチーが、アルツハイマー病、または前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、発作性疾患、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）である、請求項２３または２４に記載の方法。
- 請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための、請求項１から９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸構築物、請求項１２または１３に記載の組換えウイルス、または請求項１４に記載の医薬組成物。
- 請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための医薬の製造のための、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項１０または１１に記載の核酸構築物、または請求項１２または１３に記載の組換えウイルスの使用。
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