JP2023505256A - 腫瘍ターゲティング抗体と組み合わせた抗ｃｄ４７抗体を含む組成物および方法 - Google Patents

腫瘍ターゲティング抗体と組み合わせた抗ｃｄ４７抗体を含む組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、完全ヒト抗ＣＤ４７抗体を含む第１の抗体およびエフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む第２の抗体を含む組成物および方法を提供する。種々の実施形態では、方法および組成物で使用される抗ＣＤ４７抗体は、赤血球への結合レベルが低く、抗体濃度が高い場合でさえ赤血球凝集を誘導しない。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、腫瘍ターゲティング抗体（ＣＤ２０抗原、ＰＤ－Ｌ１抗原、ＣＤ３８抗原、またはＳＬＡＭＦ７抗原に結合する抗体が含まれる）を含む。完全ヒト抗ＣＤ４７抗体と第２の抗体との組み合わせると、被験体における癌負荷量を減少させることができる。

Description

緒言
ＣＤ４７は、多くの腫瘍細胞上に過剰発現される細胞表面抗原である。ＣＤ４７は、先天性免疫細胞（マクロファージなど）の表面上のその受容体であるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰα）と会合することによって、前述の免疫細胞による食作用を阻害することができる。（ＣＤ４７は食作用を阻害するので、時折、「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」分子と称される。）抗ＣＤ４７抗体を投与すると、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用の遮断によって先天免疫系の阻害を緩和することができるので、抗癌ストラテジーを提供することができる。
多数の腫瘍細胞上で過剰発現されることに加えて、ＣＤ４７は、いくつかの正常細胞（血小板およびエリスロサイトが含まれる）上でも発現される。したがって、抗ＣＤ４７抗体で患者を処置すると、患者に対して正常血球への結合に起因した有毒作用が生じ得る。例えば、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体Ｈｕ５Ｆ９（マグロリマブ）の第１相試験により、処置を受けた患者の５７％が一過性貧血を経験し、３６％が末梢血球の赤血球凝集を示した（Ｓｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．３７：９４６－９５３）。
Ｓｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．３７：９４６－９５３
要旨
本開示は、完全ヒト抗ＣＤ４７抗体を含む第１の抗体および細胞表面抗原に特異的に結合し、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合することができるＦｃ部分を含む第２の抗体を含む組成物および方法を提供する。種々の実施形態では、第２の抗体は、腫瘍ターゲティング抗体（ＣＤ２０抗原、ＰＤ－Ｌ１抗原、ＣＤ３８抗原、またはＳＬＡＭＦ７抗原に結合する抗体など）を含む。
完全ヒト抗ＣＤ４７抗体は、種々の実施形態では、配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域および配列番号２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を有する。いくつかの実施形態では、完全ヒト抗体は、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、完全ヒト抗体は、Ｆｃ領域中に１またはそれを超える変異を有するＩｇＧ１抗体であり、ここで、１またはそれを超える変異によってＦｃ領域のＦｃ受容体との相互作用が減少する。
癌を有する被験体を処置する方法であって、治療有効量の１）ＣＤ４７に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片および２）癌細胞上に存在する抗原に結合する第２の抗体を投与することを含み、ここで、前述の第１の抗体が、ＣＤ４７に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断し、前述の第２の抗体が、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ領域を含む、方法も本明細書中に提供する。種々の実施形態では、第１の抗体は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域および配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む本明細書中に開示の抗ＣＤ４７抗体である。種々の実施形態では、Ｆｃ領域を含む抗体の第２の抗体は、腫瘍抗原（ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＰＤ－Ｌ１、またはＳＬＡＭＦ７など）に結合する。例えば、第２の抗体は、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブなど）または抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）であり得る。
癌細胞集団中の少なくとも１つの癌細胞を死滅させる方法であって、前述の少なくとも１つの癌細胞はＣＤ４７抗原を過剰発現し、前述の方法が、前述の少なくとも１つの癌細胞を、治療有効量のＣＤ４７抗原に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片および腫瘍抗原に結合する第２の抗体と接触させることを含み、ここで、前述の第１の抗体は、ＣＤ４７抗原に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断し、前述の第２の抗体は、腫瘍細胞に結合し、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む、方法も含まれる。
ＣＤ４７抗原を過剰発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、治療有効量のＣＤ４７抗原に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片および腫瘍抗原に結合する第２の抗体を前述の被験体に投与することを含み、ここで、前述の第１の抗体は、ＣＤ４７抗原に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断し、前述の第２の抗体は、腫瘍細胞に結合し、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む、方法も含まれる。
方法は、本明細書中に開示のＣＤ４７抗体のいずれか（ＳＴＩ－６６４３抗体およびそのバリアントなど）を使用することができ、任意の腫瘍ターゲティング抗体（ＣＤ２０、ＣＤ３８、またはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。
図１は、赤血球凝集反応の概略図（上）および抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９の活性を比較した赤血球凝集アッセイの写真を示す。
図２Ａは、ＣＤ４７結合についての抗ＣＤ４７／ＳＩＲＰ－アルファ－Ｆｃとの競合アッセイの概略図である。図２Ｂは、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９の活性を比較した競合アッセイのグラフである。
図３は、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９の活性を比較した抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイのグラフである。
図４は、抗ＣＤ４７抗体クローンＳＴＩ－６６４３と準最適の量の抗ＣＤ２０抗体リツキシマブとの組み合わせを試験したアッセイにおける食作用死滅の増加を比較した棒グラフである。
図５Ａは、対照アイソタイプＩｇＧ４、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９の活性を比較した播種性ヒトＲａｊｉ－Ｆｌｕｃ異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍活性を示す。 図５Ｂは、図５Ａに記載のマウスモデルの抗腫瘍活性を示すグラフである。上のグラフは、対照アイソタイプＩｇＧ４または抗ＣＤ４７抗体クローンＳＴＩ－６６４３で処置したマウスで検出された全束を示す。下のグラフは、対照アイソタイプＩｇＧ４または抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９で処置したマウスで検出された全束を示す。実施例５を参照のこと。図５Ｃは、図５Ｂおよび５Ｃに示したデータの統計的有意性分析を示すグラフである。
図５Ｄは、図５Ａ～Ｃに示したデータの動物生存率分析を示すグラフである。図５Ｅは、図５Ａ～Ｃに記載の動物における循環抗体検出のグラフである。
図６Ａは、単剤治療としてか、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３とＨｕ５Ｆ９との組み合わせとしての、対照アイソタイプＩｇＧ４、抗ＣＤ４７抗体ＳＴＩ－６６４３またはＨｕ５Ｆ９の活性を比較した播種性ヒトＲａｊｉ－Ｆｌｕｃ異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍活性を示す。実施例６を参照のこと。 図６Ｂは、図６Ａに記載のマウスモデルの抗腫瘍活性を示すグラフである。左のグラフは、単剤治療として対照アイソタイプＩｇＧ４または抗ＣＤ４７抗体クローンＳＴＩ－６６４３で処置したマウスにおいて検出された全束（ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ）を示す。中央のグラフは、単剤治療として対照アイソタイプＩｇＧ１または抗ＣＤ２０抗体リツキシマブで処置したマウスにおいて検出された全束を示す。右のグラフは、対照アイソタイプＩｇＧ１とＩｇＧ４アイソタイプとの組み合わせ、または抗ＣＤ４７抗体クローンＳＴＩ－６６４３と抗ＣＤ２０抗体リツキシマブとの組み合わせで処置したマウスにおいて検出された全束を示す。 図６Ｃは、図６ＢおよびＣに示したデータの統計的有意性分析を示すグラフである。
図６Ｄは、図６Ａ～Ｃに示したデータに基づく動物生存率分析を示すグラフである。
図７Ａは、Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，２０１５ ＰＬｏＳ ＯＮＥ（１０）９：ｅ０１３７３４５（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３７３４５から再現したグラフである（図中に示した用量で抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９を単回静脈内注入で投与したカニクイザルの薬物動態解析（ヘモグロビン）を示すＬｉｕの図４Ａを参照のこと。影をつけたバーは、ヒトにおいて輸血を開始し得るヘモグロビンの範囲を示す）。 図７Ｂは、抗ＣＤ４７抗体ＳＴＩ－６６４３（各用量は１５０ｍｇ／ｋｇ）をＩＶボーラスによって１週間に１回、４週間にわたって投与したカニクイザルの本発明者らの薬物動態解析を示すグラフである。影をつけたバーは、ヒトにおいて輸血を開始し得るヘモグロビンの範囲を示す）。
図８Ａは、腫瘍細胞および赤血球（ＲＢＣ）への抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９の結合と比較して、抗ＣＤ４７抗体クローンＳＴＩ－６６４３がＲＢＣより腫瘍細胞に優先して結合することを示す４つのグラフを含む。グラフは、混合細胞試料に対する結合アッセイからのフローサイトメトリーデータの結果を示す。 図８Ｂは、抗ＣＤ４７抗体クローンＳＴＩ－６６４３によるＲＢＣおよび腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、ＣＤ１９発現腫瘍細胞、およびＣＤ３発現腫瘍細胞）への抗ＣＤ４７抗体クローンＳＴＩ－６６４３の結合を示す棒グラフである。抗体Ｈｕ５Ｆ９のＲａｊｉ細胞への結合を、比較のためにｙ軸上の１００％に設定する。
図９は、赤血球凝集反応の概略図（上）および抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９の活性を比較した別の赤血球凝集アッセイの写真を示す。
図１０は、ｔｈｒｅｅ－ｗａｙ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ由来の４つのグラフを示す。
図１１Ａは、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）アッセイの結果を示す棒グラフである。ｘ軸に沿った各濃度は、左から右に以下を含む：抗体対照なし；アイソタイプＩｇＧ４対照；Ｈｕ５Ｆ９；およびＳＴＩ－６６４３。 図１１Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数を２つの個別のグラフ中に示した、上の図１１Ａに記載のＳＥＢアッセイの結果を示す。 図１１Ｃは、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋ＣＤ８＋活性化Ｔ細胞数を２つの個別のグラフ中に示した、上の図１１Ａに記載のＳＥＢアッセイの結果を示す。
図１２Ａは、Ｒａｊｉマウス腫瘍モデルにおける用量研究由来の生存パーセントを示すグラフである。図１２Ｂは、上の図１２Ａに記載のマウスＲａｊｉ腫瘍モデルにおける各処置群のｐ値を列挙した表である。 図１２Ｃは、上の図１２Ａに記載のＲａｊｉマウス腫瘍モデル由来の抗体の累積循環濃度を示すグラフである。
図１３Ａは、マウスＮＣＩ－Ｈ８２肺固形腫瘍モデルにおける有効性研究由来の平均腫瘍容積を示すグラフである。図１３Ｂは、上の図１３Ａに記載のマウスＮＣＩ－Ｈ８２肺固形腫瘍モデルにおけるアイソタイプＩｇＧ４抗体またはＳＴＩ－６６４３抗体のいずれかで処置した個別の動物由来の腫瘍容積を示す。 図１３Ｃは、上の図１３Ａに記載のマウスＮＣＩ－Ｈ８２肺固形腫瘍モデル由来の相対腫瘍重量を示す棒グラフである。図１３Ｄは、上の図１３Ａに記載のマウスＮＣＩ－Ｈ８２肺固形腫瘍モデル由来の循環抗体濃度を示す棒グラフである。ｘ軸に沿った各時間は、左から右に以下を含む：アイソタイプＩｇＧ４対照；およびＳＴＩ－６６４３。
図１４は、マウスＮＣＩ－Ｈ８２肺固形腫瘍モデルにおける用量有効性研究由来の腫瘍容積および生存パーセントのいくつかのグラフを示す。
図１５Ａは、マウスＡ３７５黒色腫の固形腫瘍研究における有効性研究由来の腫瘍容積を示すグラフである。図１５Ｂは、上の図１５Ａに記載のマウスＡ３７５黒色腫の固形腫瘍研究におけるアイソタイプＩｇＧ４抗体またはＳＴＩ－６６４３抗体のいずれかで処置された個別の動物由来の腫瘍容積を示す。 図１５Ｃは、上の図１５Ａに記載のマウスＡ３７５黒色腫の固形腫瘍研究由来の生存パーセントのグラフを示す。
図１６Ａは、マウスをＳＴＩ－６６４３と抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ）との組み合わせで処置したマウスＲａｊｉ腫瘍モデルにおける有効性研究由来の生存パーセントのグラフを示す。 図１６Ｂは、上の図１６Ａに記載のマウス併用療法研究における各処置群のｐ値を列挙した表である。
図１７Ａは、陽性および陰性の赤血球凝集アッセイの例を提供する。図１７Ｂは、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、および１３Ｈ３を使用した赤血球凝集アッセイの結果の写真を提供する。図１７Ｃは、ヒト、カニクイザル、およびイヌのＲＢＣと共に抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９を使用した赤血球凝集アッセイの結果の写真を提供する。 図１７Ａは、陽性および陰性の赤血球凝集アッセイの例を提供する。図１７Ｂは、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、および１３Ｈ３を使用した赤血球凝集アッセイの結果の写真を提供する。図１７Ｃは、ヒト、カニクイザル、およびイヌのＲＢＣと共に抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９を使用した赤血球凝集アッセイの結果の写真を提供する。
図１８は、抗体濃度の関数としてのヒト、カニクイザル、およびイヌのＲＢＣへの抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９の結合のグラフを提供する。
図１９は、抗体濃度の関数としてのＲａｊｉ腫瘍細胞およびＲＢＣへの抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、および１３Ｈ３の結合のグラフを提供する。
図２０Ａは、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、および１３Ｈ３とのインキュベーション後にＰＢＭＣから回収されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ５６＋細胞数のグラフを提供する。 図２０Ｂは、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、および１３Ｈ３とのインキュベーション後にＰＢＭＣから回収されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ５６＋細胞の、アイソタイプ対照とのインキュベーション後に回収された同一の細胞型に対する百分率のグラフを提供する。
図２１は、異なる投薬量の抗ＣＤ４７抗体で処置した腫瘍担持マウスにおける経時的な腫瘍容積のグラフを提供する。
図２２Ａ～Ｃは、種々の抗ＣＤ４７抗体、ＣＤ４７抗原、抗ＣＤ２０抗体、およびＣＤ２０抗原のアミノ酸配列を示す。 図２２Ａ～Ｃは、種々の抗ＣＤ４７抗体、ＣＤ４７抗原、抗ＣＤ２０抗体、およびＣＤ２０抗原のアミノ酸配列を示す。 図２２Ａ～Ｃは、種々の抗ＣＤ４７抗体、ＣＤ４７抗原、抗ＣＤ２０抗体、およびＣＤ２０抗原のアミノ酸配列を示す。 図２３Ａ～Ｅは、種々の抗ＣＤ３８抗体およびＣＤ３８標的抗原のアミノ酸配列を示す。 図２３Ａ～Ｅは、種々の抗ＣＤ３８抗体およびＣＤ３８標的抗原のアミノ酸配列を示す。 図２３Ａ～Ｅは、種々の抗ＣＤ３８抗体およびＣＤ３８標的抗原のアミノ酸配列を示す。 図２３Ａ～Ｅは、種々の抗ＣＤ３８抗体およびＣＤ３８標的抗原のアミノ酸配列を示す。 図２３Ａ～Ｅは、種々の抗ＣＤ３８抗体およびＣＤ３８標的抗原のアミノ酸配列を示す。
説明
本明細書中に提供した見出しは、読み手の便宜のみを目的とし、本開示の種々の態様を制限せず、態様は、明細書全体を参照することによって理解され得る。
本明細書中に引用した全ての刊行物、特許、および特許出願の開示は、その全体が参考として本願に援用される。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、別段の定義がない限り、当業者に一般に理解されている意味を有する。一般に、本明細書中に記載の細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、トランスジェニック細胞産生、タンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリッド形成の技術に関連する専門用語は、当該分野で周知であり、一般的に使用されるものである。別段の指示がない限り、本明細書中に提供した方法および技術を、一般に、当該分野で周知の従来の方法に従い、かつ本明細書中で引用および考察された種々の一般的およびより具体的なリファレンスに記載のように実施する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）を参照のこと。いくつかの基本的なテキストには標準的な抗体産生プロセスが記載されている（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，１９９５；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９６；およびＰａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，Ｎ．Ｊ．，１９９５；Ｐａｕｌ（ｅｄ．），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ，１９９３；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，および引用文献；Ｃｏｄｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８６，ならびにＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５が含まれる）。本明細書中の全ての引用文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。また、酵素反応および富化／精製技術は、周知であり、当該分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品科学および製薬化学に関連して使用された用語ならびにその実験の手順および技術は、当該分野で周知であり、一般に使用されている。化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置のための標準的な技術を使用することができる。
本明細書中の文脈で別段の必要性がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、および任意の用語の単数形での使用には、１つの参照対象に明確かつ明解に制限されない限り、複数形が含まれる。
本明細書中で選択肢（例えば、「または」）を使用する場合、選択肢のうちの１つまたは両方または任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解される。
本明細書中で使用される用語「および／または」は、指定した各々の特徴または構成要素を他の特徴または構成要素を含むか含まずに具体的に開示することを意味するものとする。例えば、本明細書中の「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）が含まれることが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される用語「および／または」は、以下の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
本明細書中で使用される場合、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、および「～を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、ならびにこれらの文法的な異型は、本明細書中で使用される場合、非限定であることが意図され、したがって、リスト内の１つの項目または複数の項目は、他の項目を排除せず、列挙された項目に加えることができる。態様が用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて本明細書中に記載される場合はいつでも、「～からなる」および／または「～から本質的になる」という用語で記載された別の類似の態様も提供されると理解される。
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、当業者によって決定された特定の値または組成についての許容され得る誤差範囲内である値または組成を指し、この誤差範囲は、値または組成が測定または決定される方法（すなわち、測定系の限界）に一部依存するであろう。例えば、「約」または「およそ」は、当該分野の実務に従って１または１を超える標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」または「およそ」は、測定系の限界に依存して、１０％まで（すなわち、±１０％）またはそれを超える範囲を意味し得る。例えば、約５ｍｇには、４．５ｍｇと５．５ｍｇとの間の任意の数値が含まれ得る。さらに、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁までまたは５倍までを意味し得る。特定の値または組成が本開示に提供された場合、別段の指示がない限り、「約」または「およそ」の意味は、その特定の値または組成についての許容され得る誤差範囲内にあると見なされるものとする。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」、ならびに本明細書中で使用される他の関連する用語は、互換的に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを指す。ポリペプチドは、天然および非天然のアミノ酸を含んでよい。ポリペプチドには、組換えポリペプチドおよび化学合成されたポリペプチドが含まれる。ポリペプチドには、前駆体分子および成熟（例えば、プロセシングされた）分子が含まれる。前駆体分子には、切断（例えば、分泌性シグナルペプチドの切断またはある特定のアミノ酸残基（複数可）での酵素的もしくは非酵素的な切断）に依然として供されていないものが含まれる。ポリペプチドには、切断済みの成熟分子が含まれる。これらの用語は、未変性タンパク質、組換えタンパク質、および人工タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチドアナログ（ムテイン、バリアント、キメラタンパク質、および融合タンパク質など）、ならびに翻訳後に、そうでなければ共有結合性または非共有結合性に改変されたタンパク質を包含する。
用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」、ならびに本明細書中で使用される他の関連する用語は、互換的に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないヌクレオチドのポリマーを指す。核酸には、組換え形態および化学合成された形態が含まれる。核酸には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、発現構築物、ＤＮＡ断片など）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログ（例えば、ペプチド核酸および天然に存在しないヌクレオチドアナログ）を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、およびそのハイブリッド、ならびにペプチド核酸、ロックド核酸、および他の合成核酸アナログ、およびそのハイブリッドが含まれる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。１つの実施形態では、本開示の核酸分子は、抗体をコードする連続的な読み取り枠、またはその断片もしくはｓｃＦｖ、誘導体、ムテイン、もしくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つのポリヌクレオチド型または２つもしくはそれを超える異なるポリヌクレオチド型の混合物を含む。
用語「回収する」または「回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」または「回収（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ）」、および他の関連する用語は、タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）を、宿主細胞培養培地から、宿主細胞ライセートから、または宿主細胞膜から得ることを指す。１つの実施形態では、タンパク質は、発現されたタンパク質の分泌を媒介する分泌シグナルペプチド配列（例えば、リーダーペプチド配列）に融合した組換えタンパク質として宿主細胞によって発現される。分泌型タンパク質を、宿主細胞培地から回収することができる。１つの実施形態では、タンパク質は、分泌シグナルペプチド配列を欠く組換えタンパク質として宿主細胞によって発現され、宿主細胞ライセートから回収することができる。１つの実施形態では、タンパク質は、膜結合型タンパク質として宿主細胞によって発現され、発現されたタンパク質を宿主細胞膜から放出させるための界面活性剤を使用して回収することができる。１つの実施形態では、タンパク質を回収するために使用された方法と無関係に、タンパク質を、回収されたタンパク質から細胞デブリを除去する手順に供することができる。例えば、回収されたタンパク質を、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、および／または透析に供することができる。１つの実施形態では、クロマトグラフィは、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、および／またはシリカによるクロマトグラフィが含まれる任意の１つの手順または２つもしくはそれを超える手順の任意の組み合わせを含む。１つの実施形態では、アフィニティクロマトグラフィは、プロテインＡまたはプロテインＧ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の細胞壁成分）を含む。
用語「単離された」は、他の細胞物質を実質的に含まないタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）またはポリヌクレオチドを指す。また、単離されたという用語は、いくつかの実施形態では、同種の他の分子（例えば、それぞれ異なるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する他のタンパク質またはポリヌクレオチド）を実質的に含まないタンパク質またはポリヌクレオチドを指す。所望の分子の純度または均質性を、当該分野で周知の技術（分解能の低い方法（ゲル電気泳動など）および分解能の高い方法（ＨＰＬＣまたは質量分析など）が含まれる）を使用してアッセイすることができる。種々の実施形態では、本明細書中に開示の任意の抗ＣＤ４７抗体または腫瘍ターゲティング抗体が単離される。
抗体を、多様な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含む血清または血漿などの供給源から得ることができる。かかる抗体が親和性精製に供される場合、抗体を、特定の抗原特異性について富化することができる。かかる富化された抗体調製物は、通常、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する約１０％未満の抗体から作製される。これらの調製物を数ラウンドの親和性精製に供すると、前述の抗原に対する特異的結合活性を有する抗体の比率を増加させることができる。この様式で調製された抗体は、しばしば、「単一特異性」と称される。単一特異性抗体調製物は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％の、特定の抗原に対して特異的結合活性を有する抗体から構成され得る。抗体を、下記の組換え核酸テクノロジーを使用して産生することができる。
用語「リーダー配列」または「リーダーペプチド」または「［ペプチド］シグナル配列」または「シグナルペプチド」または「分泌シグナルペプチド」は、ポリペプチドのＮ末端に配置されたペプチド配列を指す。リーダー配列は、ポリペプチド鎖を細胞分泌経路に誘導し、ポリペプチドの細胞膜の脂質二重層への組み込みおよび係留を誘導することができる。典型的には、リーダー配列は、約１０～５０アミノ酸長であり、成熟ポリペプチドの分泌または成熟ポリペプチドの膜内への挿入の際にポリペプチドから切断される。したがって、本明細書中に提供したタンパク質（シグナルペプチド配列を含む前駆体配列によって同定される、シグナルペプチドを有する膜タンパク質および抗体など）は、シグナルペプチドを欠くポリペプチドの成熟形態を包含することも意図され、本明細書中に提供したタンパク質（シグナルペプチド配列を欠く成熟ポリペプチド配列によって同定される、シグナルペプチドを有する膜タンパク質および抗体など）は、前述のタンパク質に由来するか、別の分泌型または膜挿入型のタンパク質から誘導されるかどうかにかかわらず、シグナルペプチドを含むポリペプチドの形態を包含することも意図される。１つの実施形態では、リーダー配列には、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＣＤ１６リーダー配列を含むシグナル配列が含まれる。１つの実施形態では、シグナル配列は、哺乳動物配列（例えば、マウスまたはヒトのＩｇガンマ分泌シグナルペプチドが含まれる）を含む。１つの実施形態では、リーダー配列は、マウスＩｇガンマリーダーペプチド配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号４０）を含む。
本明細書中で使用される「抗原結合タンパク質」および関連する用語は、抗原に結合する部分および、必要に応じて、抗原結合部分が抗原への抗原結合タンパク質の結合を促進する高次構造を採用することを可能にする足場またはフレームワーク部分を含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質の例には、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体アナログが含まれる。本明細書中で使用される場合、「［参照］抗体由来の抗原結合タンパク質」は、参照抗体の可変軽鎖配列および可変重鎖配列を含む抗原結合タンパク質である。抗原結合タンパク質は、例えば、グラフティングされたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する代替タンパク質足場または人工足場を含み得る。かかる足場には、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された変異を含む抗体由来足場および、例えば、生体適合性ポリマーを含む完全に合成の足場が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ５３，Ｉｓｓｕｅ １：１２１－１２９；Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４を参照のこと。さらに、ペプチド抗体模倣物（「ＰＡＭ」）を使用することができ、足場としてフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）構成要素を利用する抗体模倣物に基づいた足場も使用することができる。
抗原結合タンパク質は、いくつかの例では、免疫グロブリン構造を有し得る。１つの実施形態では、「免疫グロブリン」は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成される四量体分子を指し、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、約１００～１１０個またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を定義し、これは主に抗原認識を担う。各鎖のカルボキシ末端部分が、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかに分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は約１２またはそれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約１０またはそれを超えるアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。重鎖および／または軽鎖は、分泌のためのリーダー配列を含んでも含まなくても良い。各軽／重鎖対の可変領域が抗体結合部位を形成し、その結果、インタクトな免疫グロブリンは２つの抗原結合部位を有する。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、四量体免疫グロブリン分子と異なる構造を有するが、依然として１つの標的抗原に結合するか、２またはそれを超える標的抗原に結合する合成分子であり得る。例えば、合成抗原結合タンパク質は、抗体断片、１～６またはそれを超えるポリペプチド鎖、ポリペプチドの非対称アセンブリ、または他の合成分子を含み得る。
免疫グロブリン鎖の可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって連結された相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域の同一の一般的構造を示す。Ｎ末端からＣ末端の方向に、軽鎖および重鎖の両方は、セグメントＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。
１またはそれを超えるＣＤＲは、共有結合性または非共有結合性のいずれかで分子に組み込まれて、抗原結合タンパク質となり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲ（複数可）をより大きなポリペプチド鎖の一部として組み込み得るか、ＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖に共有結合し得るか、ＣＤＲ（複数可）を非共有結合性に組み込み得る。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質を目的の特定の抗原に特異的に結合させることが可能である。
各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２，１９９１（例えば、「Ｋａｂａｔナンバリング」）に記載のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．の定義に従う。免疫グロブリン鎖におけるアミノ酸についての他のナンバリングシステムには、ＩＭＧＴ．ＲＴＭ．（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１８５－２０３；２００５）およびＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７－６７０；２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８；Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｍａｃｃａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５、およびＡｈｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ２００１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－６７０が含まれる。
本明細書中で使用される「抗体」および関連する用語は、抗原に特異的に結合するインタクトな免疫グロブリンまたはその抗原結合部分（またはその抗原結合断片）を指す。抗原結合部分（または抗原結合断片）は、組換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的な切断によって産生され得る。抗原結合部分（または抗原結合断片）には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ナノボディ、およびポリペプチドに抗原を特異的に結合させるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。
抗体には、組換えによって産生された抗体および抗原結合部分が含まれる。抗体には、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体が含まれる。抗体には、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、およびより高次の特異性を示す抗体）が含まれる。抗体には、四量体抗体、軽鎖単量体、重鎖単量体、軽鎖二量体、重鎖二量体が含まれる。抗体には、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、およびＦａｂ断片が含まれる。抗体には、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）、ミニボディが含まれる。抗体には、モノクローナル抗体集団およびポリクローナル抗体集団が含まれる。
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を指す（すなわち、前述の集団を含む個別の抗体は、天然に存在する変異の可能性が少しある場合があることを除いて同一である）。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向する。モノクローナル抗体には、同一の抗体分子集団を産生する細胞株を提供するハイブリドーマ法を使用して産生されたモノクローナル抗体が含まれ、また、抗体コード配列を含む１つの構築物または複数の構築物で細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞の子孫が単一の抗原部位に指向する抗体分子集団を産生するようなクローニング方法によって産生されたキメラ抗体、ハイブリッド抗体、および組換え抗体が含まれる。例えば、抗体の可変領域（可変重鎖領域および可変軽鎖領域または可変重鎖ＣＤＲおよび可変軽鎖ＣＤＲ）は、任意の種の定常領域（ヒト定常領域が含まれる）を含む抗体フレームワークにクローン化されてよく、細胞中の構築物が発現すると、本明細書中でモノクローナル抗体と称される単一の抗体分子または抗原結合タンパク質を産生することができる。
したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られた場合の抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とすると解釈されないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてよく、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号に記載のものなど）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載の技術を使用して生成されたファージライブラリーから単離されてもよい。
本明細書中で使用される「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗原結合部位」、および他の関連する用語は、抗原と相互作用して抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含む抗原結合タンパク質部分を指す。その抗原に特異的に結合する抗体について、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含むであろう。
用語「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「特異的に結合する」、または「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、および他の関連する用語は、抗体または抗原結合タンパク質または抗体断片の文脈において本明細書中で使用される場合、他の分子または部分と比較した、ある抗原への優先的な非共有結合または共有結合を指す（例えば、抗体は、他の入手可能な抗原と比較して、特定の抗原に特異的に結合する）。種々の実施形態では、抗体が標的抗原と１０－５Ｍもしくはそれ未満、または１０－６Ｍもしくはそれ未満、または１０－７Ｍもしくはそれ未満、または１０－８Ｍもしくはそれ未満、または１０－９Ｍもしくはそれ未満、または１０－１０Ｍもしくはそれ未満、または１０－１１もしくはそれ未満、または１０－１２もしくはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する場合、前述抗体は前述の抗原と特異的に結合する。
標的抗原に対する抗原結合タンパク質の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定することができる解離定数（Ｋｄ）として報告することができる。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用してバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによってリアルタイムの相互作用を分析することが可能な光学現象を指す。
本明細書中で使用される「エピトープ」および関連する用語は、抗原結合タンパク質によって（例えば、抗体またはその抗原結合部分によって）結合される抗原部分を指す。エピトープは、抗原結合タンパク質によって結合される２またはそれを超える抗原部分を含み得る。エピトープは、１つの抗原または２つもしくはそれを超える抗原の不連続部分（例えば、抗原の一次配列においては不連続であるが、抗原の三次構造および四次構造の文脈では、互いが抗原結合タンパク質によって結合されるのに十分に近接しているアミノ酸残基）を含むことができる。一般に、抗体の可変領域、特にＣＤＲは、エピトープと相互作用する。
抗体に関して、用語「アンタゴニスト」および「アンタゴニストの」は、同族標的抗原に結合し、結合した抗原の生物学的活性を阻害するか低下させる遮断抗体を指す。用語「アゴニスト」または「アゴニストの」は、抗体媒介性の下流シグナル伝達を引き起こす生理学的リガンドの結合を模倣する様式で、同族標的抗原に結合する抗体を指す。
本明細書中で使用される「抗体断片」、「抗体部分」、「抗体の抗原結合断片」、または「抗体の抗原結合部分」、および他の関連する用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｄ；およびＦｖ断片、ならびにｄＡｂ；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；ポリペプチドに抗原を特異的に結合させるのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。抗体の抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的な切断によって産生され得る。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、および抗体断片に抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。
用語「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ断片」、および他の関連する用語は、可変軽鎖領域（ＶＬ）、定常軽鎖領域（ＣＬ）、可変重鎖領域（ＶＨ）、および第１の定常領域（ＣＨ１）を含む一価の断片を指す。Ｆａｂは、抗原に結合することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である。Ｆ（Ａｂ’）２は、抗原結合能を有する。Ｆｄ断片は、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含む。Ｆｖ断片は、ＶＬ領域およびＶＨ領域を含む。Ｆｖは、抗原に結合することができる。ｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨドメインもしくはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号および同第６，６９６，２４５号；米国特許出願公開第２００２／０２５１２号、同第２００４／０２０２９９５号、同第２００４／００３８２９１号、同第２００４／０００９５０７号、および同第２００３／００３９９５８号；ならびにＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域およびＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）によって連結されて、連続したタンパク質鎖を形成している抗体である。１つの実施形態では、リンカーは、タンパク質鎖自体を折りたたんで一価の抗原結合部位を形成するのに十分な長さである（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３を参照のこと）。
ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体であり、ここで、各ポリペプチド鎖がＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、同一鎖上の２つのドメインの間を対合するための非常に短いリンカーによって連結されているため、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補性ドメインと対合する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３を参照のこと）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、その対合に起因するダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有するであろう。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トライボディおよびテトラボディは、同一または異なる場合がある３つまたは４つのポリペプチド鎖をそれぞれ含み、３つまたは４つの抗原結合部位をそれぞれ形成する抗体である。ダイアボディ、トライボディ、およびテトラボディの構築物を、本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体のいずれか由来の抗原結合部分を使用して調製することができる。
「ヒト化抗体」は、対応するヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列に適合するように配列が改変されている１またはそれを超える可変領域および定常領域を有する非ヒト種を期限とする抗体を指す。例えば、ヒト化抗体の定常領域はヒト定常領域配列であってよく、可変ドメインのアミノ酸配列はマウスなどの別の種の抗体配列（抗体が生成される可能性がある）に由来してよい。ヒト化抗体は、ヒト被験体に投与した場合に、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導する可能性が低く、そして／または比較的軽度の免疫応答を誘導する。１つの実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークドメインおよび定常ドメイン中のある特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を産生するように変異されている。いくつかの実施形態では、ヒト抗体由来の定常ドメイン（複数可）は、非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合している。いくつかの実施形態では、非ヒト抗体の１またはそれを超えるＣＤＲ配列中の１またはそれを超えるアミノ酸残基は、ヒト被験体に投与した場合に非ヒト抗体の免疫原性の可能性を低下させるように変更されており、ここで、変更されたアミノ酸残基は、抗体のその抗原への免疫特異的結合に重要ではないか、得られたアミノ酸配列の変化が保存的な変化であり、その結果、ヒト化抗体の抗原への結合が非ヒト抗体の抗原への結合より有意に不良にならない。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、および同第５，８７７，２９３号に見出され得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、全ての定常ドメインおよび可変ドメイン（必要に応じて、ＣＤＲから排除される）がヒト免疫グロブリン配列に由来する「完全ヒト」抗体であり得る。本明細書中に開示の完全ヒト抗体は、野生型ヒト抗体配列と比較して、定常領域（例えば、重鎖のＦｃ定常領域など）中に１またはそれを超える変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る）を有し得る。例えば、完全ヒト抗体は、抗体の軽鎖または重鎖のいずれかの定常領域中に１またはそれを超える変異を有することができ、ここで、完全ヒト抗体の軽鎖定常領域または重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）のいずれかまたは両方の配列は、非変異ヒト定常領域の配列に対して９５％超、９６％超、９７％超、好ましくは９８％超または少なくとも９９％同一である。ヒト化抗体および完全ヒト抗体は、種々の方法で調製されてよく、その例は以下に記載されており、組換え法またはヒトの重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子由来の抗体を発現するように遺伝子改変されたマウス（例えば、抗原でチャレンジした場合に、高親和性完全ヒト抗体を生成する「Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ ＩＩ」）の目的の抗原での免疫化による方法が含まれる（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６）。これを、内因性ＪＨ領域を欠失したマウスへのメガベースのヒトの重鎖および軽鎖の遺伝子座の生殖系列組み込みによって行った。これらのマウスによって産生された抗体は、あらゆる点で（遺伝子再編成、アセンブリ、およびレパートリーが含まれる）ヒトで認められる抗体に酷似している。
あるいは、ファージディスプレイテクノロジー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５３［１９９０］）を使用して、免疫化ドナーまたは非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの主要または非主要のコートタンパク質遺伝子（Ｍ１３またはｆｄなど）のいずれかにインフレームでクローン化され、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体断片としてディスプレイされる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択によっても、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの性質を模倣する。ファージディスプレイを、種々の形式で実施することができる；例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，５６４－５７１（１９９３）を参照のこと。ファージディスプレイのために使用することができるＶ遺伝子セグメントのいくつかの供給源（例えば、免疫化マウスの脾臓（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５２、６２４－６２８（１９９１））または非免疫化ヒトドナーの血球）のうちのいずれかを使用して多様な抗原（自己抗原が含まれる）に対する抗体を生成することができ、抗体を、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１－５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２，７２５－７３４（１９９３）に記載の技術に本質的に従って単離することができる。
本明細書中で使用される用語「キメラ抗体」および関連する用語は、第１の抗体由来の１またはそれを超える領域および１またはそれを超える他の抗体由来の１またはそれを超える領域を含む抗体を指す。１つの実施形態では、１またはそれを超えるＣＤＲは、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、全てのＣＤＲは、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、１つを超えるヒト抗体由来のＣＤＲを混合し、キメラ抗体中に適合させる。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第２のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含み得る。別の例では、ＣＤＲは、異なる種（ヒトおよびマウス、ヒトおよびウサギ、またはヒトおよびヤギなど）を起源とする。当業者は、他の組み合わせが可能であることを認識するであろう。
さらに、キメラ抗体のフレームワーク領域は、同一の抗体のうちの１つ、１またはそれを超える異なる抗体（ヒト抗体など）、またはヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の一例では、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、類似するか、由来し、一方、鎖（複数可）の残部は、別の種に由来するか、別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体（複数）と同一であるか、類似するか、由来する。所望の生物学的活性（すなわち、標的抗原に特異的に結合する能力）を示すかかる抗体の断片も含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「バリアント」ポリペプチドおよびポリペプチドの「バリアント」は、参照ポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に挿入され、アミノ酸配列から欠失され、そして／またはアミノ酸配列に置換された１またはそれを超えるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ポリペプチドバリアントには、融合タンパク質が含まれる。同一の様式で、バリアントポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列に挿入され、ヌクレオチド配列から欠失され、そして／またはヌクレオチド配列に置換された１またはそれを超えるヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドバリアントには、融合ポリヌクレオチドが含まれる。
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの「誘導体」という用語は、例えば、別の化学的部分（例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）など）への抱合、リン酸化、およびグリコシル化によって化学修飾されているポリペプチド（例えば、抗体）である。
別段の指示がない限り、用語「抗体」には、全長重鎖および全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片、およびムテインが含まれ、その例を以下に記載する。
用語「ヒンジ」は、一般的にはタンパク質の２つのドメインの間に見出され、構造全体を柔軟にし、互いに対してドメインの一方または両方を移動することが可能となり得るアミノ酸セグメントを指す。構造的には、ヒンジ領域は、約１０～約１００個のアミノ酸、例えば、約１５～約７５個のアミノ酸、約２０～約５０個のアミノ酸、または約３０～約６０個のアミノ酸を含む。１つの実施形態では、ヒンジ領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長である。ヒンジ領域は、天然に存在するタンパク質のヒンジ領域に由来し得る（ＣＤ８ヒンジ領域もしくはその断片、ＣＤ８αヒンジ領域もしくはその断片、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体）のヒンジ領域、または抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２を連結するヒンジ領域など）。ヒンジ領域は、抗体に由来し得、かつ１またはそれを超える抗体の定常領域を含んでも含まなくてもよく、あるいは、ヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域および抗体のＣＨ３定常領域を含み、あるいは、ヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域および抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含み、あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在しないペプチドであり、あるいは、ヒンジ領域は、ｓｃＦｖのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に配置されている。１つの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリン分子由来の上部、コア、または下部のヒンジ配列を含む２またはそれを超える領域のいずれか１つまたは任意の組み合わせを含む。１つの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１上部ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号４１）を含む。１つの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１コアヒンジ配列ＣＰＸＣ（式中、Ｘは、Ｐ、Ｒ、またはＳである）を含む。１つの実施形態では、ヒンジ領域は、下部ヒンジ／ＣＨ２配列ＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（（配列番号４２））を含む。１つの実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ（配列番号４３）を有するＦｃ領域（ＣＨ２）に連結されている。１つの実施形態では、ヒンジ領域には、上部ヒンジ、コアヒンジ、および下部ヒンジのアミノ酸配列が含まれ、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰ ＥＬＬＧＧＰ（配列番号４４）を含む。１つの実施形態では、ヒンジ領域は、少なくとも１つ、２つ、３つ、またはそれを超える鎖間ジスルフィド結合を形成することができる１つ、２つ、３つ、またはそれを超えるシステインを含む。
本明細書中で使用される用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、ヒンジ領域中またはヒンジ領域後から始まり、重鎖のＣ末端で終了する抗体重鎖定常領域の一部を指す。Ｆｃ領域は、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含み、ヒンジ領域の一部を含んでも含まなくてもよい。Ｆｃドメインは、Ｆｃ細胞表面受容体および免疫補体系のいくつかのタンパク質に結合することができる。Ｆｃ領域は、補体成分Ｃ１ｑに結合することができる。Ｆｃドメインは、エフェクター機能（補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用（ＡＤＰ）、オプソニン化、および／または細胞結合が含まれる２つまたはそれを超える活性のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせが含まれる）を示す。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ（例えば、ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（例えば、ＣＤ３２）、および／またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、ＣＤ１６ａ）が含まれる）に結合することができる。Ｆｃ領域は、これらの機能のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを増加または減少させる変異を含み得る。例えば、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を低下させるＬＡＬＡ変異（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａと等価）を含むことができる。一例では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低下させるＬＡＬＡ－ＰＧ変異（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇに等価）を含む。また、Ｆｃドメインは、抗体の血清半減期せを増加または減少させることができる１またはそれを超える変異を含むことができる。
ポリペプチドに関して本明細書中で使用される用語「標識された」または関連する用語は、非標識であるか検出のために検出可能な標識または部分に連結された連結物である抗体およびその抗原結合部分を指し、ここで、検出可能な標識または部分は、放射性、比色性、抗原性、酵素性、検出可能なビーズ（磁性または高電子密度の（例えば、金）ビーズなど）、ビオチン、ストレプトアビジン、またはプロテインＡである。種々の標識を使用することができる（放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）が含まれるが、これらに限定されない）。本明細書中に記載の抗ＰＤ－１抗体のいずれかは、非標識であり得るか、検出可能な標識または部分に連結することができる。
ポリペプチドに関して本明細書中で使用される用語「標識された」または関連する用語は、検出のための検出可能な標識または部分へのその連結物を指す。例示的な検出可能な標識または部分には、放射性、比色性、抗原性、酵素性の標識／部分、検出可能なビーズ（磁性または高電子密度の（例えば、金）ビーズなど）、ビオチン、ストレプトアビジン、またはプロテインＡが含まれる。種々の標識を使用することができる（放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）が含まれるが、これらに限定されない）。本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体または本明細書中に記載の腫瘍抗原結合抗体のいずれかは、非標識であり得るか、検出可能な標識または部分に連結することができる。
本明細書中で使用される「同一性パーセント」または「相同性パーセント」および関連する用語は、２つのポリペプチド配列の間または２つのポリヌクレオチド配列の間の類似性の定量的測定を指す。２つのポリペプチド配列の間の同一性パーセントは、ギャップ（２つのポリペプチド配列のアラインメントを最適にするために導入される必要があり得る）の数および各ギャップの長さを考慮した、２つのポリペプチド配列の間で共有されたアライメントした位置での同一のアミノ酸数の関数である。類似の様式で、２つのポリヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ギャップ（２つのポリヌクレオチド配列のアラインメントを最適にするために導入される必要があり得る）の数および各ギャップの長さを考慮した、２つのポリヌクレオチド配列の間で共有されたアライメントした位置での同一のヌクレオチド数の関数である。２つのポリペプチド配列の間、または２つのポリヌクレオチド配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して行われ得る。例えば、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の「同一性パーセント」または「相同性パーセント」は、デフォルトパラメーターを使用したＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）の一部）を使用して配列を比較することによって決定され得る。試験配列に関する「Ｙに対して少なくともＸ％同一の配列を含む」などの表現は、上記のように配列Ｙをアラインメントした場合、試験配列がＹの残基に少なくともＸ％同一の残基を含むことを意味する。
１つの実施形態では、試験抗体のアミノ酸配列は、本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体のいずれかを作出するポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかに類似し得るが、必ずしも同一でなくてよい。試験抗体とポリペプチドとの間の類似性は、本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合タンパク質のいずれかを作出するポリペプチドのいずれかに対して少なくとも９５％、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であり得る。１つの実施形態では、類似のポリペプチドは、重鎖および／または軽鎖内にアミノ酸置換を含むことができる。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、１またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基に置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２またはそれを超えるアミノ酸配列が保存的置換によって相互に異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度は、置換の保存性を補正するために上方に調整され得る。この調整手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸群の例には、以下が含まれる：（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、および（７）硫黄含有側鎖は、システインおよびメチオニンである。
本明細書中で使用される「ベクター」および関連する用語は、外来遺伝子材料（例えば、核酸導入遺伝子）に作動可能に連結することができる核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ベクターを、外来遺伝子材料を細胞（例えば、宿主細胞）内に導入するためのビヒクルとして使用することができる。ベクターは、導入遺伝子をベクターに挿入するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むことができる。ベクターは、ベクター－導入遺伝子構築物を保有する宿主細胞の選択を助けるための抗生物質耐性または選択可能な特徴を付与する少なくとも１つの遺伝子配列を含むことができる。発現ベクターは、１またはそれを超える複製起点配列を含むことができる。ベクターは、一本鎖または二本鎖の核酸分子であり得る。ベクターは、線状または環状の核酸分子であり得る。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、線状または環状の二本鎖染色体外ＤＮＡ分子を指し、導入遺伝子に連結することができ、宿主細胞中での複製、ならびに導入遺伝子の転写および／または翻訳が可能である。ウイルスベクターは、典型的には、導入遺伝子に連結することができるウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡのバックボーン配列を含む。ウイルスバックボーン配列を、感染を不可能にするが、ウイルスバックボーンおよび同時に連結された導入遺伝子が宿主細胞ゲノムに依然として挿入されるように改変することができる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびエプスタイン／バーウイルスのベクターが含まれる。ある特定のベクターは、前述のベクターが導入された宿主細胞中で自律複製することが可能である（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。
「発現ベクター」は、１またはそれを超える制御配列（誘導性および／または構成性のプロモーターならびにエンハンサーなど）を含むことができるベクターの１つのタイプである。発現ベクターは、リボゾーム結合部位および／またはポリアデニル化部位を含むことができる。発現ベクターは、１またはそれを超える複製起点配列を含むことができる。制御配列は、宿主細胞に形質導入される発現ベクターに連結または挿入された導入遺伝子の転写、または転写および翻訳を指示する。制御配列（複数可）は、導入遺伝子発現のレベル、タイミング、および／または位置を調節することができる。制御配列は、例えば、その効果を、導入遺伝子に対して直接か、または１またはそれを超える他の分子（例えば、制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して発揮することができる。制御配列は、ベクターの一部であり得る。制御配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５－３６０６に記載されている。
導入遺伝子は、制御配列（例えば、プロモーター）が導入遺伝子の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を及ぼす場合、制御配列に「作動可能に連結されている」。
本明細書中に記載の用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」または他の関連する用語は、外因性核酸（例えば、導入遺伝子）が宿主細胞（抗体産生宿主細胞など）に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」宿主細胞は、外因性核酸（導入遺伝子）が導入されている宿主細胞である。宿主細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体のいずれかの少なくとも一部をコードする外因性核酸を、宿主細胞に導入することができる。本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体のいずれかの少なくとも一部を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することができ、前述の宿主細胞は、抗ＣＤ４７抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを発現することができる。
この文脈では、宿主細胞は、その後に宿主細胞中で発現され得るポリペプチドコード核酸で形質転換またはトランスフェクトすることができる培養細胞であり得る。句「トランスジェニック宿主細胞」または「組換え宿主細胞」を使用して、発現されるべきか発現されるべきではない核酸が導入されている（例えば、形質導入されている、形質転換されている、またはトランスフェクトされている）宿主細胞を示すことができる。また、宿主細胞は、核酸を含むが、制御配列が宿主細胞に導入され、この制御配列が核酸と作動可能に連結されるようにならない限り、所望のレベルで前述の核酸を発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫も指すと理解される。例えば、変異または環境の影響のために後世において一定の改変が生じ得るので、かかる子孫は、実際は親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書中で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
したがって、本明細書中で使用される用語「宿主細胞」または「または宿主細胞集団」または関連する用語は、抗体またはその断片の産生のために使用すべき細胞（またはその集団もしくは複数の宿主細胞）を指す場合があり、例えば、宿主細胞の産生による抗ＣＤ４７抗体の産生を指示するために外来核酸（外因性遺伝子または導入遺伝子）が導入されている細胞である。外来核酸は、導入遺伝子に作動可能に連結された発現ベクターを含むことができ、宿主細胞を使用して、外来核酸（導入遺伝子）によってコードされる核酸および／またはポリペプチドを発現することができる。宿主細胞（またはその集団）は、培養細胞であり得るか、被験体から抽出することができるか、生物（ヒト被験体が含まれる）の細胞であり得る。宿主細胞（または宿主細胞集団）には、初代対象細胞およびいかなる世代数や継代数も考慮しないその子孫が含まれる。宿主細胞（またはその集団）には、不死化細胞株が含まれる。子孫細胞は、親細胞と比較して同一の遺伝子材料を保有してもしなくてもよい。１つの実施形態では、産生宿主細胞は、本明細書中に開示されるように、抗体を発現するための任意の方法で改変されており、トランスフェクトされており、形質導入されており、形質転換されており、そして／または操作されている任意の細胞（その子孫が含まれる）をいう。一例として、宿主細胞（またはその集団）を、本明細書中に記載の所望の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターでトランスフェクトするか形質導入することができる。産生宿主細胞およびその集団は、宿主のゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを保有することができるか、染色体外発現ベクターを保有することができる。１つの実施形態では、宿主細胞およびその集団は、数回の細胞分裂後に存在するか、数回の細胞分裂後に一過性に存在して喪失する染色体外ベクターを保有することができる。
本明細書中で使用される用語「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物（脊椎動物、哺乳動物、および非哺乳動物が含まれる）を指す。１つの実施形態では、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、マウス（例えば、マウス）、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、オオカミ、カエル、または魚類であり得る。
用語「投与」、「投与した」、および文法的な異型は、当業者に公知の種々の方法および送達系のいずれかを使用した、被験体への薬剤の物理的導入を指す。本明細書中に開示の製剤のための例示的な投与経路には、例えば、注射または注入による静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または他の非経口の投与経路が含まれる。本明細書中で使用される句「非経口投与」は、通常は注射による腸内投与および局所投与以外の投与様式を意味し、制限されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入、ならびにｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションが含まれる。１つの実施形態では、製剤を、非経口でない経路（例えば、経口）によって投与する。他の非経口でない経路には、局所、表皮、または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、膣、直腸、舌下、または局所が含まれる。例えば、１回、複数回、および／または１もしくはそれを超える長期間にわたって投与することもできる。本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体（または本明細書中に開示の腫瘍抗原結合抗体）のいずれかを、当該分野で公知の方法および送達経路を使用して被験体に投与することができる。
用語「有効量」、「治療有効量」、もしくは「有効用量」、または関連する用語は、互換的に使用してよく、被験体に投与した場合に、腫瘍または癌抗原の発現に関連する疾患または障害を測定可能に改善または予防するのに十分な抗体または抗原結合タンパク質（例えば、本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体または本明細書中に開示の腫瘍抗原結合抗体のいずれか）の量を指す。本明細書中に提供した抗体の治療有効量は、単独または組み合わせて使用した場合、抗体および組み合わせの相対活性（例えば、細胞成長の阻害）ならびに処置される被験体および病状、被験体の体重および年齢および性別、被験体の病状の重症度、投与様式など（当業者はこれらを容易に決定することができる）に依存して変動するであろう。
１つの実施形態では、治療有効量は、処置すべき被験体および処置すべき障害のある特定の態様に依存し、当業者が公知の技術を使用して確認し得る。一般に、ポリペプチドは、約０．０１ｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ／日で被験体に投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、１日に１回、２回、３回、または４回）またはより低い頻度で（例えば、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、または四半期毎）投与され得る。さらに、当該分野で公知のように、年齢だけでなく、体重、全身健康、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用、および疾患の重症度によっても調整する必要があり得る。
抗体の組み合わせ
少なくとも２つの抗体を含む組成物であって、１つの抗体がＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）へのＣＤ４７の結合を遮断する抗ＣＤ４７抗体であり、組成物の第２の抗体が腫瘍抗原に特異的に結合し、かつＦｃ領域を含む、組成物を本明細書中に提供する。
抗ＣＤ４７抗体は、本明細書中に記載の任意の抗体（配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域および配列番号２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体など）であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、配列番号１の重鎖可変領域配列および配列番号２の軽鎖可変領域配列を有するＣ４７Ａ８－ＣＬ抗体（本明細書中で参考として援用される米国特許第１０，０３５，８５５号）または配列番号１に対して少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域および配列番号２に対して少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を有するそのバリアントである。抗ＣＤ４７抗体は、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ４抗体であり得る（例えば、ＩｇＧ４抗体であってよい）。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域中に１またはそれを超える変異（例えば、Ｆｃγ受容体との相互作用を減少させる１またはそれを超える変異および／または抗体半減期を増加させる１またはそれを超える変異）を有するＩｇＧ１抗体である。抗体のＦｃ領域のその受容体（例えば、ＦｃγＲｓ）との相互作用を低下させるか消失させる変異には、制限されないが、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５ＡまたはＬ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、またはＮ２９７Ｄ；およびＰ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇが含まれる。例えば、抗ＣＤ４７抗体は、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を含むことができる。
いくつかの別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、単鎖抗体（例えば、配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域配列および配列番号２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域配列を有するＳｃＦｖ）であり得る。さらなる実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域および配列番号２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、ｏｒ 少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体の（例えば、ＩｇＧ抗体の）Ｆａｂ断片であり得る。
腫瘍抗原に結合し、かつＦｃγ受容体に結合するＦｃ領域を含む抗体は、例えば、ＩｇＧ１抗体であり得、必要に応じて、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または他の機序を用いた免疫系によって破壊するために結合する細胞に印を付けるオプソニン化抗体であり得る。腫瘍抗原結合抗体は、固形腫瘍または液性腫瘍上に発現する細胞表面抗原に特異的に結合することができる。例えば、抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＰＤ－Ｌ１、またはＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する抗体であり得る。抗ＣＤ２０抗体は、非限定的な例として、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、もしくはウブリツキシマブ、または図２２に開示の重鎖可変配列および軽鎖可変配列を有する抗ＣＤ２０抗体のいずれかであり得る。抗ＣＤ３８抗体は、非限定的な例として、ダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ）もしくは図２３に開示の重鎖可変配列および軽鎖可変配列を有する抗ＣＤ３８抗体のいずれか、または米国特許第１０，０５９，７７４号、同第９，９５１，１４４号、もしくはＷＯ２０１９／２４５６１６号（これらの全てのその全体が、本明細書中で参考として援用される）に開示の任意の抗体であり得る。ＰＤ－Ｌ１抗体は、非限定的な例として、デュルバルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、または米国特許第９，１７５，０８２号（本明細書中で参考として援用される）に開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかであり得る。
本開示のポリペプチド（例えば、抗体および抗体断片）を、当該分野で公知の任意の方法を使用して産生することができる。一例として、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を、宿主細胞に導入されて発現を促進する条件下で宿主細胞によって発現される組換え発現ベクターに挿入することによる組換え核酸法によって産生される。
また、組換えＤＮＡは、必要に応じて、タンパク質の精製に有用であり得る任意のタイプのタンパク質タグ配列をコードすることができる。タンパク質タグの例には、ヒスチジン（ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが含まれるが、これらに限定されない。細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞の宿主と共に使用するのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターを、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）に見出すことができる。
発現ベクター構築物を、宿主細胞に適切な方法を使用して、宿主細胞（例えば、産生宿主細胞）に導入することができる。種々の宿主細胞に核酸を導入する方法は、当該分野で公知であり、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を使用したトランスフェクション；ウイルストランスフェクション；非ウイルストランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがウイルスベクターである場合）が含まれるが、これらに限定されない。
好適な細菌には、グラム陰性またはグラム陽性の生物（例えば、大腸菌またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）が含まれる。また、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種に由来する酵母を、ポリペプチド産生のために使用してよい。また、種々の哺乳動物細胞または昆虫細胞の培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させることができる。昆虫細胞における異種タンパク質産生のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７，１９８８）によって概説されている。好適な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株が含まれる。精製ポリペプチドは、組換えタンパク質を発現させるための好適な宿主／ベクター系の培養によって調製される。多くの適用について、大腸菌宿主細胞は、小型のポリペプチドの発現に好適である。次いで、タンパク質を、培養培地または細胞抽出物から精製することができる。
また、本明細書中に開示の抗体および抗原結合タンパク質を、細胞翻訳系を使用して産生することができる。かかる目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるｍＲＮＡの産生が可能であり、利用される特定の無細胞系（哺乳動物細胞または酵母細胞を含まない翻訳系などの真核生物無細胞系または細菌細胞を含まない翻訳系などの原核生物無細胞系）でのｍＲＮＡの無細胞翻訳が可能であるように改変されなければならない。
本明細書中に開示の種々のポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、遺伝子合成法を使用して合成され得る（例えば、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ、ＤＮＡ ２．０、ＧｅｎｅＷｉｚなどの商業的実体から入手可能）。細胞中での発現を改善するためにコドン使用頻度を選択してもよい。かかるコドン使用頻度は、産生宿主細胞型に依存するであろう。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞のための専用のコドン使用頻度パターンが開発されている。例えば、以下を参照のこと：Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３ １００（２）：４３８－４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２（１）：９６－１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｎ Ｄ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ １２（５）：４４６－９；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９６ ６０（３）：５１２－３８；およびＳｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ．１９９１ ７（７）：６５７－７８。
また、本明細書中に記載の抗体および抗原結合タンパク質を、化学合成によって（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌに記載の方法によって）産生することができる。また、化学合成によってタンパク質を改変することができる。
本明細書中に記載の抗体および抗原結合タンパク質を、タンパク質化学分野で一般的に知られているタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。非限定的な例には、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、順相クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動、向流分配、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。精製後、ポリペプチドを、異なる緩衝液と交換し、そして／または当該分野で公知の種々の方法のいずれか（濾過および透析が含まれるが、これらに限定されない）によって濃縮してもよい。
本明細書中に記載の精製された抗体および抗原結合タンパク質は、少なくとも純度６５％、少なくとも純度７５％、少なくとも純度８５％、少なくとも純度９５％、または少なくとも純度９８％であり得る。厳密な純度の数値と無関係に、ポリペプチドは、医薬品として使用するのに十分な純度である。本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体または腫瘍抗原結合抗体のいずれかを、トランスジェニック宿主細胞によって発現させ、次いで、任意の当該分野で公知の方法を使用して純度約６５～９８％または高レベルの純度に精製することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書中の抗体および抗原結合タンパク質は、翻訳後修飾をさらに含むことができる。例示的な翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ－リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ｓｕｍｏ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾ポリペプチドは、脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびホスファートなどの非アミノ酸エレメントを含み得る。１つの実施形態では、グリコシル化の一形態は、１またはそれを超えるシアル酸部分がポリペプチドに抱合したシアル化であり得る。シアル酸部分は、溶解性および血清半減期を改善し、タンパク質が免疫原性となる可能性も軽減する。Ｒａｊｕｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１ ３１；４０：８８６８－７６を参照のこと。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の抗体および抗原結合タンパク質を、その溶解性および／または血清半減期を増加させるように修飾することができ、この修飾は、抗体および抗原結合タンパク質の非タンパク質ポリマーへの連結を含む。例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンを、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載の様式で、抗原結合タンパク質に抱合することができる。
用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」を、ＰＥＧのサイズおよび末端の修飾と無関係に任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広義で使用し、以下の式で示すことができる：Ｘ－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）（式中、ｎは２０～２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾である（例えば、Ｃ１～４アルキル））。１つの実施形態では、ＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終了している（すなわち、Ｘは、ＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である）。ＰＥＧは、結合反応に必要であるか；分子の化学合成に起因するか；分子の部品に最適な距離をあけるためのスペーサーである化学基をさらに含むことができる。さらに、かかるＰＥＧは、相互に連結した１またはそれを超えるＰＥＧ側鎖からなることができる。１つを超えるＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、分岐または分枝ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧを、例えば、ポリエチレンオキシドの種々のポリオール（グリセロール、ペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｏｌ）、およびソルビトールが含まれる）への付加によって調製することができる。分枝ＰＥＧ分子は、例えば、欧州特許出願公開第０４７３０８４号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの一形態には、リジンの一級アミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が含まれる（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６（１９９５）６２－６９）。
本開示は、薬学的に許容される賦形剤中に１）本明細書中に記載の抗ＣＤ４７抗体のいずれかおよび２）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、配列番号１（抗体ＳＴＩ－６６４３の重鎖可変領域）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２（抗体ＳＴＩ－６６４３の軽鎖可変領域）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む本明細書中に開示の抗ＣＤ４７抗体を含む。腫瘍抗原に特異的に結合する抗体は、本明細書中に記載の任意の抗体であり得、ここで、前述の抗体は、Ｆｃγ受容体に会合することができるＦｃ領域を含む。
医薬組成物を、製造および保存条件下で無菌かつ安定であるように産生することができる。本明細書中に提供した抗原結合タンパク質は、例えば、送達前または送達時に適切な薬学的に許容される賦形剤で再構成するための粉末形態であり得る。あるいは、抗原結合タンパク質は、適切な薬学的に許容される賦形剤と共に溶液中に存在することができるか、薬学的に許容される賦形剤を、例えば、注射用の単位剤形を提供するために、送達前または送達時に添加および／または混合することができる。好ましくは、本発明で使用される薬学的に許容される賦形剤は、高い薬物濃度に好適であり、適切な流動性を維持することができ、いくつかの実施形態では、吸収を遅延させることができる。
賦形剤は、担体および安定剤を包含する。薬学的に許容される賦形剤の例には、例えば、不活性な希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および等張化剤が含まれる。製剤の型および送達方法に応じて、賦形剤には、潤滑剤、流動促進剤、および付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）が含まれ得る。
治療組成物およびその調製方法は、当該分野で周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０ｔｈ ｅｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ Ｒ．，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）に見出される。治療組成物を、非経口投与のために製剤化することができ、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩液、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコールなど）、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含んでもよく、含むことができる。生体適合性生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、本明細書中に記載の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の放出を調節してよい。ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用して、抗体（またはその抗原結合タンパク質）の生体内分布を調節してよい。他の特に有用な非経口送達系には、エチレン－ビニルアセタートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み式注入システム、およびリポソームが含まれる。処方物中の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の濃度は、いくつかの要因（薬物の投薬量および投与経路が含まれる）に応じて変動する。
本明細書中に開示の抗ＣＤ４７抗体および抗腫瘍抗体のいずれかを、薬学的に許容される塩（医薬品産業で一般的に使用されている非毒性の酸付加塩または金属錯体など）として必要に応じて投与してよい。酸付加塩の例には、有機酸（酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸など）；ポリマー酸（タンニン酸またはカルボキシメチルセルロースなど）；および無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸など）が含まれる。金属錯体には、亜鉛および鉄などが含まれる。一例として、抗体（またはその抗原結合部分）は、熱安定性を増加させるための酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。
本明細書中に開示の抗ＣＤ４７抗体および抗腫瘍抗体のいずれかを、経口用に製剤化してよく、製剤には、有効成分（複数可）が非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された錠剤が含まれる。経口用の製剤を、有効成分が不活性固体希釈剤と混合された咀嚼錠または硬ゼラチンカプセルとしてか、有効成分が水媒体または油媒体と混合された軟ゼラチンカプセルとして提供してもよい。
本明細書中に開示の抗ＣＤ４７抗体および腫瘍抗原に特異的に結合し、かつＦｃ領域を含む抗体を含むキットも提供する。これらの抗体を、例えば混合物中に共に提供することができるか、個別のバイアル、アンプル、パケット、または他の容器中に提供してもよい。キットは、抗体の一方または両方の再構成または希釈のための１またはそれを超える無菌の薬学的に許容される溶液をさらに含むことができ、非限定的な例として、さらなる抗体、鎮痛薬、または抗生物質のいずれかであってよい１またはそれを超えるさらなる医薬製剤を含むことができる。キットを、癌を有する被験体の処置のために使用することができる。キットの構成要素を、好適な容器中に提供し、癌処置用とラベルすることができる。前述の構成要素を、単回投与または複数回投与のための容器、例えば、密封したアンプル、バイアル、ボトル、シリンジ、および試験管中に保存してよいか、好ましくは無菌の水溶液として、または再構成用の、好ましくは無菌の凍結乾燥製剤として保存してよい。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されていてよく、無菌のアクセスポートを有してよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液のバッグまたはバイアルであってよい）。キットは、薬学的に許容される緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液など）を含むさらなる容器をさらに含んでよい。キットは、商業的視点および使用からの視点から望ましい他の材料（１またはそれを超える好適な宿主のための他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、培養培地が含まれる）をさらに含んでよい。治療用、予防用、または診断用の製品のコマーシャルパッケージ中に慣例的に含まれ、かかる治療用、予防用、または診断用の製品の使用に関する情報（例えば、適応症、用法、投薬量、製造、投与、禁忌および／または警告）を含む説明書をキットに添付することができる。
処置方法
本開示は、１またはそれを超える腫瘍関連抗原の発現または過剰発現に関連する疾患／障害を有する被験体を処置する方法を提供する。疾患は、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ３８またはＣＤ２０抗原など）を発現する癌細胞または腫瘍細胞を含む。１つの実施形態では、癌または腫瘍には、前立腺、乳房、卵巣、頭頸部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺癌および小細胞肺癌が含まれる）、平滑筋腫、脳、神経膠腫、膠芽細胞腫、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頸部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、上咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、および精巣の癌が含まれる。
種々の実施形態では、癌は、血液学的な癌（白血病、リンパ腫、骨髄腫、およびＢ細胞リンパ腫が含まれる）を含む。血液学的癌には、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（バーキットリンパ腫（ＢＬ）が含まれる）、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞白血病（ＨＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、形質細胞性骨髄腫、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、プラズマ細胞腫、巨細胞骨髄腫、形質細胞性骨髄腫、重鎖骨髄腫、軽鎖またはベンス・ジョーンズ骨髄腫、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ球増殖性疾患、免疫調節障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少症 紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連脈管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急性進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性または免疫細胞関連アミロイド症、ならびに意義未確定の単クローン性免疫グロブリン血症が含まれる。
方法は、治療有効量のＣＤ４７抗原に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片および腫瘍抗原に結合する第２の抗体を被験体に投与することを含み、ここで、前述の第１の抗体は、ＣＤ４７抗原に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断し、前述の第２の抗体は、腫瘍細胞に結合し、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む。癌は、ＣＤ４７を過剰発現する癌であり得る。
癌細胞集団中の少なくとも１つの癌細胞を死滅させる方法であって、前述の少なくとも１つの癌細胞はＣＤ４７抗原を過剰発現し、前述の方法が、前述の少なくとも１つの癌細胞を、治療有効量のＣＤ４７抗原に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片および腫瘍抗原に結合する第２の抗体と接触させることを含み、ここで、前述の第１の抗体は、ＣＤ４７抗原に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断し、前述の第２の抗体は、腫瘍細胞に結合し、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む、方法も含まれる。
方法は、本明細書中に開示のＣＤ４７抗体（ＳＴＩ－６６４３抗体など）およびそのバリアントのいずれかを使用することができ、任意の腫瘍ターゲティング抗体（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、またはＰＤ－Ｌ１（本明細書中に開示のものなどであるが、これら限定されない）に特異的に結合する抗体が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。
いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティング抗体（抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ２０抗体）に加えて本明細書中に提供したＣＤ４７抗体の組み合わせでの癌を有する被験体の処置は、腫瘍ターゲティング抗体のみまたはＣＤ４７抗体のみでの癌を有する被験体の処置と比較して相乗効果を有し得る。相乗効果は、非限定的な例として、腫瘍容積の減少または生存率の増加であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した腫瘍ターゲティング抗体とＣＤ４７抗体（すなわち、ＳＴＩ－６６４３）、または配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域および配列番号２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体との組み合わせで癌を有する被験体を処置すると、同一の腫瘍ターゲティング抗体および異なる抗ＣＤ４７抗体での患者の処置よりも、被験体に対する毒性を低下させることができる（制限されないが、貧血の減少、ヘモグロビン濃度の維持、赤血球の赤血球凝集の減少、および／または健康な免疫細胞の減少が含まれる）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体を、経口送達によって投与することができる。経口投薬形態を、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性の懸濁剤、分散性の散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬カプセル剤、軟ゼラチンカプセル剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤、丸薬、糖衣錠、液剤、ゲル剤、またはスラリーとして製剤化することができる。これらの製剤には、薬学的な賦形剤（不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど）；造粒剤および崩壊剤（トウモロコシデンプンまたはアルギン酸など）；結合剤（デンプン、ゼラチン、またはアカシアなど）；潤滑剤（ステアリン酸カルシウム、グリセリルベヘナート、硬化植物油、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ポリエチレングリコール、ナトリウムステアリル、フマラート、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸亜鉛など）；防腐剤（ｎ－プロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾアートなど）；着色剤、香味剤、または甘味剤（スクロース、サッカリン、グリセロール、プロピレングリコール、またはソルビトールなど）；植物油（ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツ油など）；鉱油（流動パラフィンなど）；湿潤剤（塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、レシチン、ポロクサマー、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステルなど）；および増粘剤（寒天、アルギン酸、蜜蝋、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カラギーナン（ｃａｒａｇｅｅｎａｎ）、デキストリン、またはゼラチンなど）が含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。
種々の実施形態では、注射または静脈内もしくは動脈内送達によって投与することができ、例えば、表皮、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、胸膜内、腹腔内、または腔内送達によって投与してもよい。非経口投与のための製剤は、とりわけ、水性または非水性、等帳、無菌、非毒性の注射または注入用の溶液または懸濁液の形態であり得る。好ましい非経口投与経路には、静脈内、動脈内、腹腔内、硬膜外、および筋肉内注射または注入が含まれる。溶液または懸濁液は、使用した投薬量および濃度でレシピエントに非毒性の薬剤（１，３－ブタンジオール、リンゲル液、ハンクス液、等帳塩化ナトリウム溶液、油（合成のモノ－もしくはジグリセリまたは脂肪酸（オレイン酸など）など）、局所麻酔剤、防腐剤、緩衝液、増粘剤もしくは溶解性を増加させる剤、水溶性抗酸化剤（アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなど）、油溶性抗酸化剤（アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、およびアルファ－トコフェロールなど）、ならびに金属キレート剤（クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）など）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、赤血球への結合度がより高い他の抗体を用いた処置より患者への毒性が低い。
実施例
以下の実施例は、例示を意味し、本開示の実施形態をさらに理解するために使用することができ、いかなる場合も本発明の教示を制限すると解釈されないものとする。
実施例１．ＳＴＩ－６６４３は競合抗体Ｈｕ５Ｆ９と比較して赤血球凝集を劇的に減少させる。
赤血球（ＲＢＣ）の調製：末梢血を、健康なヒトドナーから得た。４ｍＬの血液を、１５ｍＬコニカルチューブにピペットで移し、室温（ＲＴ）の１×ＰＢＳで満たした。細胞を、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を、管の底部のＲＢＣを破壊しないように吸引し、１２ｍｌの１×ＰＢＳを添加した。細胞を、管を反転させることによって混合した。細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、洗浄を２回繰り返した。上清を、最後の洗浄後に血球を破壊しないように吸引し、十分な１×ＰＢＳを添加して、１０％ＲＢＣ溶液を作製した（この溶液は、１週間使用可能であった）。最終的な希釈標準溶液を作製するために、１×ＰＢＳ中の１０％ｐｆＲＢＣ溶液を希釈して０．５％溶液を得た。
赤血球凝集アッセイのために、管を反転させることによって０．５％ＲＢＣ希釈標準溶液を混合した。０．５％ＲＢＣ希釈標準溶液を、Ｕ底９６ウェルプレートＲＴ（５０μＬ）の各ウェルに添加した。以下の抗体を、このアッセイで使用した：ＳＴＩ－６６４３、抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４ Ｈｕ５Ｆ９、およびアイソタイプＩｇＧ４対照。抗体の系列希釈物を、１×ＰＢＳを含む超低接着性９６ウェルプレート中で調製した（７５μｇ／ｍＬから開始して２倍希釈）。抗体希釈物（１００μＬ／ウェル）を、ＲＢＣを含むプレートに移し（最終開始抗体濃度：５０μｇ／ｍＬ）、マルチチャンネルピペットを用いてゆっくり数回混合した。プレートを、組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）に入れ、約２０時間インキュベートした。陰性の結果（赤血球凝集なし）は、丸底プレートの中央に赤点として出現する。陽性の結果（赤血球凝集）は、ウェル全体が均一に赤みがかった色を形成するであろう。
図１は、凝集および凝集なしの線図を、対応するウェルの目視可能な外観の上に提供する。抗体Ｈｕ５Ｆ９は、５０μｇ／ｍＬから０．０５μｇ／ｍＬまでの抗体濃度に対応するウェルで凝集を示し、この凝集は、０．０１２μｇ／ｍＬおよびそれ未満の抗体濃度で消失する。対照的に、ＳＴＩ－６６４３は、抗体濃度が最高であっても（５０μｇ／ｍＬ）、凝集は認められない。
実施例２．ＳＴＩ－６６４３は、用量依存的にヒトＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を遮断する。
Ｔリンパ芽球性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭの細胞へのＳＴＩ－６６４３の結合がＳＩＲＰα（ＣＤ４７の受容体）への細胞の結合を阻害し得るかどうかを判定するために、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞（５０μＬ／ウェル中２０，０００細胞）を、４００～０．１８μｇ／ｍＬの濃度範囲の抗ＣＤ４７（クローンＳＴＩ－６６４３またはＨｕ５Ｆ９）またはアイソタイプＩｇＧ４対照抗体のいずれかとＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）中でインキュベートし、３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄を行わずに、精製されたＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ；カタログ番号４５４６－ＳＡ－０５０）を、濃度０．４μｇ／ｍＬ（５０μＬ／ウェル）にてＦＡＣＳ緩衝液（３７℃に維持）中の各ウェルに添加し、３７℃でさらに２０分間インキュベーションし続けた。次いで、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を、室温（ＲＴ）で５２４ｇにて２分間の遠心分離によって３回洗浄し、各回において１７０μＬ／ウェルのＲＴのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞への結合を明らかにするために、ＰＥ標識された抗ＳＩＲＰα抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ；カタログ番号ＦＡＢ４５４６Ｐ）を、７０μＬのＲＴのＦＡＣＳ緩衝液中にて５μＬ／ウェルで使用した。細胞を、暗所にてＲＴで２０分間インキュベートした。次いで、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を、室温（ＲＴ）で５２４ｇにて２分間の遠心分離によって２回洗浄し、各回において１７０μＬ／ウェルのＲＴのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料をフローサイトメトリーによって直ちに獲得し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
図２Ｂは、ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を添加してもＳＩＲＰαのＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞への結合に効果がないことを示す（上の曲線は、用量依存を示していない）。他方では、ＳＴＩ－６６４３をＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞に添加した場合にＳＴＩ－６６４３の強い用量依存性が認められ、漸増濃度のＳＴＩ－６６４３抗体を用いたＳＩＲＰαのＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞への結合が強力に増加する（グラフの４，０００超から１，０００未満のＭＦＩにわたって曲線が右肩下がりに減少する）。Ｈｕ５Ｆ９抗体は、１μｇ／ｍＬおよびそれを超える抗体濃度でＳＩＲＰαのＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の結合を強く阻害する。
実施例３．ＳＴＩ－６６４３は、用量依存的に腫瘍細胞の食作用を促進する。
１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補足した室温（ＲＴ）の５０μＬのＲＰＭＩ１６４０中の１０，０００個のＲＡＪＩ－ＧＦＰ細胞を、平底９６ウェルプレートに移した。抗体（ＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、およびアイソタイプＩｇＧ４）を、濃度４００μｇ／ｍＬから開始して連続希釈した。抗体希釈物（５０μＬ）を、腫瘍細胞を含むウェルに添加した。
ＡＤＣＰアッセイのために、２人の健康なヒトドナーから得た末梢血を、ＰＢＭＣ（ＣＤ１４＋食細胞を含む）の供給源として使用した。１００μＬ中の３０，０００個のＰＢＭＣを、各ウェル中ＰＢＭＣ：Ｒａｊｉ細胞比３：１で各ウェルに添加した。ウェルを混合し、１，５００ｒｐｍで１分間スピンし、ウェルを３７℃で９０分間インキュベーション後、フローサイトメトリー分析のために採取した。
非接着細胞を、９６ウェルＶ底プレートに移し、プレートを、１，５００ｒｐｍで３分間スピンし、細胞を、４℃の１００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁した。１００μＬ Ｔｒｙｐｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ１２６０４０１３）を第１のプレートに添加して残存する非接着細胞を剥離し、これらの細胞を、非接着細胞を含むＶ底プレートに移した。１，５００ｒｐｍで３分間の遠心分離およびＦＡＣＳ緩衝液で希釈した抗ＣＤ１４－ＰＥ（９０μＬ中１．５μＬ／ウェル）を含む染色混合物１００μＬへの再懸濁後、細胞を、４℃で１５分間インキュベートし、次いで、１００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで、細胞を、１００μＬの固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ４２０８０１）に４℃で２０分間再懸濁した。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を直接添加し（最終体積２００μＬ）、フローサイトメーターで測定した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。図３は、アイソタイプＩｇＧ４の存在下での食作用が用量依存的に増加せず、約３５％と４０％との間で残存したことを示す。このアッセイにおいて抗体ＳＴＩ－６６４３を使用した場合、抗体濃度の増加につれて％食作用が大きく増加し、この増加はおよそ１０－９の抗体濃度から始まった。Ｈｕ５Ｆ９抗体も用量依存性を示し、食作用は抗体濃度およそ１０－１０から急増し、濃度約１０－８で横ばいになった。
実施例４．ＳＴＩ－６６４３は、準最適の用量で組み合わせた場合にリツキシマブ誘導性食作用を改善する。
ＣＤ１４＋細胞を、ヒトＰＢＭＣから単離し、２０％ＦＢＳ、抗生物質、および２０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦを補足したＲＰＭＩ－１６４０中でこの細胞を培養することによってマクロファージに分化させた。細胞を、平底９６ウェルプレートにプレートし（１００μＬ／ウェル中に３０，０００細胞）、７日間または分化が認められるまでインキュベートした。培地を、２～３日毎に完全培地と交換した。
１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補足した室温（ＲＴ）の５０μＬのＲＰＭＩ１６４０中の６０，０００個のＲＡＪＩ－ＧＦＰ細胞を、Ｕ底９６ウェルプレートに移した。抗体を連続希釈し、最終基希釈物はＳＴＩ－６６４３については１０μｇ／ｍＬ、リツキシマブについては２．５、５、または１０ｎｇ／ｍＬであった。５０μＬの抗体を、腫瘍細胞を含むウェルに添加した。
ＡＤＣＰアッセイを、平底９６ウェルプレート中のヒトマクロファージの上部に１００μＬのＲＡＪＩ－抗体混合物を移すことによって開始した。細胞および抗体を混合し、１，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、その後にプレートを３７℃で３０分間インキュベーション後、フローサイトメトリーによる分析のために採取した。２０分後、１μＬの抗ＣＤ１１ｂ－ＰＥを、各ウェルに添加した。
フローサイトメトリーのために、非接着細胞を、９６ウェルＶ底プレートに移し、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、４℃の１００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁した。アキュターゼ（１５０μＬ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮＣ９８３９０１０）を平底プレートに添加して残存する非接着細胞を剥離し、これらの細胞をピペットで取り出し、非接着細胞を含むＶ底プレートに移した。細胞を、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１５０μＬ／ウェルの固定剤（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ３３８０３６）に再懸濁した。データを、フローサイトメーターで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
図４は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（単色のバー）および抗ＣＤ４７抗体（黒一色のバー）を個別に投与した場合に食作用を誘導することを示す。抗ＣＤ２０抗体および抗ＣＤ４７抗体を共に投与した場合（黒色の斜線を引いたバー）、抗ＣＤ２０抗体のみを使用した場合と比較して食作用が増強される。最低濃度の抗ＣＤ２０抗体では、ＳＴＩ－６６４３を含めた場合に食作用は最も強く増強され、抗ＣＤ２０を単独で使用した場合に認められる食作用がおよそ２倍になる。
実施例５．ＳＴＩ－６６４３は、前臨床マウスモデルにおいてＨｕ５Ｆ９より比較可能な抗腫瘍活性を示す。
ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞（ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ）を静脈内移植したＦｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウス（アイソタイプＩｇＧ４群についてはｎ＝８；Ｈｕ５Ｆ９群についてはｎ＝５、およびＳＴＩ－６６４３群についてはｎ＝１５）を、３０ｍｇ／ｋｇの表示の抗体で、ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ腫瘍接種後７日目から開始して１週間に３回、２週間連続して処置した。腫瘍細胞接種後７日目から４８日目までの代表的なマウスのルシフェラーゼ画像（図５Ａ）および個別のマウスの発光データ（図５Ｂ）または生存率が低下する前の２２日目までのみをプロットした全束値の平均＋／－ＳＤ（図５Ｃ）を示す。統計的有意性を、列の平均を比較する（列の主効果））二元配置ＡＮＯＶＡ（各行が異なる時点を表す（したがって、対応値が行にわたって存在する）によって評価し、テューキーの比較検定を使用した多重比較で補正した（個別の分散を各分散毎に計算した）。カプラン・マイヤー生存分析を行った（図５Ｄ）。各群を他の２群と比較したｐ値を示す（ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす）。マウスが処置を受けた時間を、灰色の領域で表す。処置開始後０日目から１３日目までの抗ＣＤ４７（ＳＴＩ－６６４３またはＨｕ５Ｆ９）で処置された各動物における循環抗体濃度を評価した（図５Ｅ）。データを平均＋／－Ｓ．Ｄ．として示す。矢印は、各群についての抗体処置時間を表す。全ての統計的検定は両側検定であり、結果は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意と見なした。
実施例６．ＳＴＩ－６６４３とリツキシマブとの組み合わせは、抗腫瘍活性を改善し、生存期間を延長する。
抗ＣＤ４７抗体およびリツキシマブを用いた併用療法は、播種性ヒトＲＡＪＩ異種移植マウスモデルのリンパ腫を消失させる。ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞（ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ）を静脈内移植したＦｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／群）を、示すように３ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）もしくはそのＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体または２０ｍｇ／ｋｇのＳＴＩ－６６４３もしくはそのＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を単独または組み合わせて用いて処置した。処置は、ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ接種後７日目から開始して１週間に３回、２週間連続して行った（７、９、１１、１４、１６、および１８日目）。腫瘍細胞接種後１４日目から３７日目までの代表的なマウスのルシフェラーゼ画像（図６Ａ）。個別のマウスの発光データ（図６Ｂ）または生存率が低下する前の２３日目までのみをプロットした全束値の平均＋／－ＳＥＭ（図６Ｃ）を示す。統計的有意性を、二元配置ＡＮＯＶＡ、その後のテューキーの多重比較検定によって評価した。カプラン・マイヤー生存分析を行った（図６Ｄ）。各群を他の群と比較したｐ値を示す。マウスが処置を受けた時間を、灰色の領域で表す。全ての統計的検定は両側検定であり、結果は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意と見なした。生存度は、ＳＴＩ－６６４３を抗ＣＤ２０と組み合わせて用いたマウスの処置で最も高く（上のライン）、ＳＴＩ－６６４３のみでの処置がそれに続き、抗ＣＤ２０のみがそれに続く。下のリツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）＋ＳＴＩ－６６４３（抗ＣＤ４７抗体）処置とリツキシマブ処置との間のマウスの生存率の増加は、統計的に有意であった。
実施例７．ＳＴＩ－６６４３は非ヒト霊長類において高い忍容性が認められ、１５０ｍｇ／ｋｇで安全である。
この非ＧＬＰ用量探索毒性試験の目的は、カニクイザルへのいかなる初回投与も行わない（１、８、１５、および２２日目の）週１回で合計４回の静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって投与した場合のＳＴＩ－６６４３の潜在的毒性を決定することであった（表１に示す）。動物を２８日間回復させた後、５７日目に剖検を行った。研究デザインは、以下の通りであった：
Figure 2023505256000002
群１および２に最初に投与し、群１および２のおよそ２週間後に群３への投与を開始し；群３のおよそ５週間後に群４への投与を開始した。
５７日目に全ての動物ａに対して剖検を行った。経時的な循環ヘモグロビン濃度を示すグラフを、図７Ｂに示す。
以下のパラメーターおよびエンドポイントを、この研究で評価した：臨床所見（ケージ内所見、投与後所見、および詳細所見）、体重、定性的飼料消費、臨床病理学パラメーター（血液学、凝固、および臨床化学）、骨髄評価、生物分析、抗薬物抗体、毒物動態パラメーター、肉眼による剖検所見、臓器重量、および組織病理学的試験。全ての動物は、剖検予定日まで生存した。
貧血が抗ＣＤ４７処置の際の主要有害事象の１つであることが公知であるので、本発明者らは、カニクイザルをＬｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１５）によって公開のＨｕ５Ｆ９の単回投与（図７Ａ）またはＳＴＩ－６６４３での４回の連続投与（図７Ｂ）で処置した場合のヘモグロビンレベルを経時的に比較することを決定した。
結論：臨床化学パラメーターのＳＴＩ－６６４３に関連する変化は、２９日目の１５０ｍｇ／ｋｇ／投与での有害でない尿素窒素のわずかな減少に限られた。また、１５０ｍｇ／ｋｇ／投与での２９日目の尿素窒素は、対照値と比較して統計的有意に減少した。
臨床所見、体重、定性的飼料消費、血液学、凝固パラメーター、骨髄評価、肉眼による剖検所見、臓器重量、または組織病理学のＳＴＩ－６６４３に関連する変化は認められなかった。結論として、（１、８、１５、および２２日目の）週１回で合計４回の静脈内ボーラス注射によるＳＴＩ－６６４３の投与は、１５０ｍｇ／ｋｇ／投与までのレベルでカニクイザルにおいて高い忍容性が認められた。これらの結果に基づいて、４回までの投与についての無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、１５０ｍｇ／ｋｇ／投与であると見なされた。
実施例８．抗ＣＤ４７クローンＳＴＩ－６６４３は、腫瘍細胞への優先的な結合を示す。混合細胞試料に対する結合アッセイ。
ヒト全血（２５μＬ／ウェル）およびＲＡＪＩ－ＧＦＰ（５，０００細胞／ウェル）を混合し、種々の濃度（３００μｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ）の抗ＣＤ４７（ＳＴＩ－６６４３または競合物質Ｈｕ５Ｆ９（インハウスで発現））またはアイソタイプＩｇＧ４対照抗体を用いて３７℃で４５分間染色した。細胞を２回洗浄し、次いで、以下の抗体混合物とインキュベートした：二次抗体（ＡＰＣ標識抗ヒトＦｃ）、抗ＣＤ４５－ＢＶ７１１、抗ＣＤ３－ＢＶ５１０、抗ＣＤ１９－ＡＰＣ－Ｃｙ７、および抗ＣＤ２３５ａ－ＰＢ（３７℃で２０分間）。２回洗浄後、細胞を固定し、フローサイトメトリーによって分析した。図８Ａは、Ｈｕ５Ｆ９抗体（各グラフ中の上の曲線）がＲａｊｉ腫瘍細胞およびＲＢＣの両方とそれぞれ５．１×１０－６および３．３×１０－６のＥＣ５０で結合し、一方、抗ＣＤ４７抗体ＳＴＩ－６６４３によるＲａｊｉ腫瘍細胞およびＲＢＣの結合は、それぞれおよそ６．４×１０－５および５．６×１０－５のＥＣを有することが見出されたことを示す。Ｒａｊｉ腫瘍細胞および赤血球の両方について、濃度約１０－５ｇ／ｍｌで特異的に結合し始める；しかしながら、ＳＴＩ－６６４３抗体によるＲａｊｉ腫瘍細胞の結合は、濃度およそ５×１０－３ｇ／ｍｌの抗体Ｈｕ５Ｆ９によって実証された結合レベルまで上昇するのに対して、ＳＴＩ－６６４３抗体によるＲＢＣの結合は、Ｈｕ５Ｆ９抗体によるＲＢＣの結合と比較して依然として非常に低いままである。
最高用量（３００μｇ／ｍＬ）で評価したＳＴＩ－６６４３のＲＡＪＩ 腫瘍細胞、赤血球（ＲＢＣ）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、またはＴ細胞（ＣＤ３＋）への結合の百分率を、同一の抗体濃度のＨｕ５Ｆ９クローンによって得られた１００％相対結合と比較して（幾何平均蛍光強度によって計算した場合）、図８Ｂ中の棒グラフで示す。
結論：ＳＴＩ－６６４３抗ＣＤ４７抗体は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞に、Ｈｕ５Ｆ９抗体のＲａｊｉ細胞への結合と少なくとも同程度に結合したのに対して、ＳＴＩ－６６４３のＲＢＣへの結合は、Ｈｕ５Ｆ９抗体によって示されたＲＢＣへの結合のわずかおよそ１０％であった。
実施例９．ＳＴＩ－６６４３は、競合抗体Ｈｕ５Ｆ９と比較して赤血球凝集を劇的に減少させる（さらなる赤血球凝集実験）。
赤血球（ＲＢＣ）を調製するために、健康なヒトドナーから末梢血を得た。４ｍＬの血液を、１５ｍＬコニカルチューブにピペットで移し、室温（ＲＴ）の１×ＰＢＳで満たした。管を１４０ｇで１０分間スピンした。上清を、管の底部のＲＢＣを破壊しないように吸引した。１２ｍＬの１×ＰＢＳを添加し、管を反転させることによって混合した。細胞を１４０ｇで５分間遠心分離し、洗浄を２回繰り返した。上清を、最後の洗浄後にＲＢＣを破壊しないように吸引し、十分な１×ＰＢＳを添加して、１０％ＲＢＣ溶液を作製した。最終的な希釈標準溶液を作製するために、１０％ＲＢＣ溶液を１×ＰＢＳで希釈して０．５％溶液を得た。
赤血球凝集アッセイのために、５０μＬの０．５％ＲＢＣ希釈標準溶液を、Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレートをＲＴで維持した。以下の抗体を、このアッセイで使用した：抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４（クローンＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９）およびアイソタイプＩｇＧ４対照。抗体の系列希釈物を、１×ＰＢＳを含む超低接着性９６ウェルプレート中で作製した（４５０μｇ／ｍＬから開始して２倍希釈）。抗体希釈物を、ＲＢＣを含むプレートに移し（１００μＬ／ウェル、開始抗体濃度：３００μｇ／ｍＬ）、マルチチャンネルピペットを用いてゆっくり数回混合した。プレートを、組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）に入れ、約２０時間インキュベートした。陰性の結果（赤血球凝集なし）は、丸底プレートの中央に点として出現した。陽性の結果（赤血球凝集）は、ウェル全体が均一に赤みがかっていた。図９（上）は、線図ならびに陽性および陰性の結果の例を提供する。図９（下）は、アッセイの結果を示す。
結論：ＳＴＩ－６６４３は、高濃度であっても赤血球凝集を誘導しない。
実施例１０：ＳＴＩ－６６４３は、適応免疫系および先天性免疫系を保存する：３－ｗａｙ ＭＬＲアッセイ
０日目に、３人の異なる健康なヒトドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製し、完全ＲＰＭＩ－１０ＡＢ培地（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ｒｅｆ ＨＰ１０２２、ロット６Ｆ１１３１の１０％ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁した。各ドナー由来の同数のＰＢＭＣを平底９６ウェルプレートにプレートして、１００μＬのＲＰＭＩ－１０ＡＢ中の播種密度１．６５Ｅ＋０５細胞／ドナー／ウェル（最終約５．０Ｅ＋０５細胞／ウェル）とした。アイソタイプ対照または抗ＣＤ４７（ＳＴＩ－６６４３またはＨｕ５Ｆ９）ヒトＩｇＧ４抗体を、完全ＲＰＭＩ－１０ＡＢ培地で２×濃度に希釈し（２００μｇ／ｍＬから開始した１０倍系列希釈）、その後、最終濃度を１００μｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬまでにするために、１００μＬ／ウェルを適切なウェルに添加した。プレートを、加湿組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で６日間インキュベートした。
共培養後６日目に、細胞を３００ｇで５分間スピンし、冷ＦＡＣＳ緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２％ウシ胎児血清を補足したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）を使用して洗浄した。次いで、細胞を、ＰＥ抱合ＣＤ４（クローンＯＫＴ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４１０、ロット番号Ｂ２６４３６３）、ＦＩＴＣ抱合ＣＤ８（クローンＨＩＴ８ａ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００９０６、ロット番号Ｂ２７５２７７）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抱合ＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６３０１０、ロット番号Ｂ２７６７９５）、パシフィックブルー抱合ＣＤ５６（クローンＨＣＤ５６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１８３２６、ロット番号Ｂ２８０４５１）から構成された抗体混合物と４℃で３０分間インキュベートした。１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液での細胞の２回の洗浄後、細胞を、１００μＬ／ウェルの固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ４２０８０１）を使用して室温で２０分間固定した。その後に、細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、およびＣＤ５６＋細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。データは、各ポイントについての３連の値の＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ５６＋の結果を、図１０に示す。
結論：ＳＴＩ－６６４３は、ＭＬＲ誘導炎症誘発性環境でＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の生存率を維持する。
実施例１１：ＳＴＩ－６６４３は、ＳＥＢアッセイにおいてＴ細胞の数および活性をより良好に保存する。
新鮮なＰＢＭＣを単離し、完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で２．０Ｅ＋０６細胞／ｍＬに希釈した。細胞を、Ｕ底プレート中に２．０Ｅ＋０５細胞／ウェルでプレートした（１００μＬ／ウェル）。次に、抗ＣＤ４７（ＳＴＩ－６６４３またはＨｕ５Ｆ９）またはアイソタイプ対照抗体クローンを、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのブドウ球菌エンテロトキシンＢ；カタログ番号１２２、ロット番号１２２４１７１）を含む完全ＲＰＭＩで（１００μｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬまでに）連続希釈した（５０μＬのＳＥＢと混合した５０μＬの抗体調製物（共に４×濃度））。プレートを、３７℃のインキュベーターに入れ、３日間インキュベートした。
３日目に、細胞を、４２０ｇで５分間遠沈した。上清を、新しい９６ウェルプレートに移し、ＩＦＮγサイトカイン含有量を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ；カタログ番号Ｋ１５０４９Ｄ）の炎症誘発性パネル１（ヒト）キットを製造者の説明書に従って使用して測定した（図１１Ａ）。図１１Ａでは、ｘ軸に沿った各濃度は、左から右に以下を含む：抗体対照なし；アイソタイプＩｇＧ４対照；Ｈｕ５Ｆ９；およびＳＴＩ－６６４３。ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、およびＣＤ５６＋細胞の総数（図１１Ｂ）ならびに活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の百分率（図１１Ｃ）を、以下の通り評価した：細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２％ウシ胎児血清を補足したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）を使用して洗浄した。次いで、細胞を、ＰＥ抱合ＣＤ８（クローンＳＫ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７０６、ロット番号Ｂ２６７５１９）、ＢＶ４２１抱合ＣＤ４（クローンＯＫＴ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４、ロット番号Ｂ２８０５９７）、ＡＦ６４７抱合ＣＤ２５（クローンＭ－Ａ２５１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１２８、ロット番号Ｂ２６９０９０）から構成される抗体混合物と４℃で２０分間インキュベートした。１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液での細胞の２回の洗浄後、細胞を、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって直ちにデータ取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。データは、各ポイントについての３連の値の＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
結論：ＳＴＩ－６６４３は、炎症促進性環境で活性化されたＴ細胞の生存率およびＩＦＮγ応答を維持する。
実施例１２：ＲＡＪＩ腫瘍モデルにおけるＳＴＩ－６６４３の用量－有効性研究
Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスに、ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞（ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ）を静脈内接種し、異なる処置群（３０ｍｐｋ ＳＴＩ－６６４３、ｎ＝１６マウス；１０ｍｐｋ ＳＴＩ－６６４３、ｎ＝２４マウス；１ｍｐｋ ＳＴＩ－６６４３、ｎ＝２４マウス；０．１ｍｐｋ ＳＴＩ－６６４３、ｎ＝１６マウス；１０ｍｐｋアイソタイプ対照、ｎ＝２４マウス、および３０ｍｐｋアイソタイプ対照、ｎ＝８マウス）にランダム化した。
処置（０．１－１－１０または３０ｍｐｋのＳＴＩ－６６４３、およびアイソタイプ対照のヒトＩｇＧ４については１０または３０ｍｐｋ）を、ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ接種後７日目から開始して１週間に３回、２～３週間連続して行った（合計６～８回）。カプラン・マイヤー生存分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、３つの独立した実験由来のデータ（各実験は、ＳＴＩ－６６４３およびアイソタイプで処置した群の両方を含む）を組み合わせることによって行った。各動物についての生存期間を、後肢麻痺の兆候が認められた日を１日目として決定した。生存パーセントの結果を、図１２Ａに示す。各処置群を他の群と比較したｐ値を表に示す（ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす）（図１２Ｂ中の表を参照のこと）。
処置動物中の循環抗体濃度を評価した。血液試料を、以下の通り採取した：各試料について、１０μＬの全血を、９０μＬのＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインとＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ３７５２８）中で混合し、ＥＬＩＳＡを行うまで直ちに－８０℃で保存した。マルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログＬ１５ＸＡ－３）を、１×ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）中２μｇ／ｍＬの非標識マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ２ドメイン）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログＭＡ５－１６９２９、ロットＵＥ２７８１６３１Ａ）でコーティングした。１×ＫＰＬ洗浄液（Ｓｅｒａ ｃａｒｅ；カタログ５１５０－０００８、ロット１０２１４４７３）での洗浄後、プレートを、ＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインにて３７℃で１時間ブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインを含むＰＢＳ中のＳＴＩ－６６４３ｍＡｂを使用して５０から０ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲を対象とする系列希釈を行うことによって、検量線を作成した。その後に、９６ウェルプレートを洗浄し、血液試料（１：１０，０００に希釈）および検量線試料の両方を、ウェルに移し（５０μＬ／ウェル）、ゆっくり浸透しながら室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを１×ＫＰＬ洗浄液で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインを含むＰＢＳで１：５００に希釈したＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（カタログＤ２０ＪＬ－６、ロットＷ００１８０４５Ｓ）のヤギ抗ヒト／ＮＨＰ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ抗体とＲＴで１時間インキュベートした（２５μＬ／ウェル）。１×ＫＰＬ洗浄液で３回洗浄後、１５０μＬ／ウェルの２×Ｒｅａｄ緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；カタログＲ９２ＴＣ－３、ロットＹ０１４０３６８）を添加することによって抗体の存在を明らかにした。プレートを、ＭＳＤ装置（Ｍｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００ Ｍｏｄｅｌ １２０１；シリアル番号１２０１１６０９１９４８４）で直ちに読み取った。データを平均＋／－Ｓ．Ｄ．として示す。結果を図１２Ｃに示す。
結論：ＳＴＩ－６６４３は、ＲＡＪＩ腫瘍モデルにおいて用量依存性に抗腫瘍活性を示した。
実施例１３：ＮＣＩ－Ｈ８２肺固形腫瘍モデルにおける有効性研究
Ｂａｌｂ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、１×ＨＢＳＳ中に調製した５．０Ｅ＋０６個のＮＣＩ－Ｈ８２肺腫瘍細胞（１５０μＬ／マウス）を皮下接種し、１２日目に（８０％を超える動物に腫瘍隆起が存在した時点）異なる処置群にランダム化した。マウスが処置開始時に腫瘍隆起を示さなかった場合、マウスを研究から除去した。ＳＴＩ－６６４３（ｎ＝９マウス）またはアイソタイプ対照（ｎ＝８マウス）ヒトＩｇＧ４抗体を、９０ｍｇ／ｋｇで皮下注射（１５０μＬ／マウス）によって１日おきに合計６回全身投与した。
平均（図１３Ａ）および個別の（図１３Ｂ）腫瘍容積を、経時的に測定し、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を、腫瘍細胞移植後３１日目の研究終了時に計算した。腫瘍を切除し、切除時に秤量した（図１３Ｃ）。データは、相対腫瘍重量の平均（腫瘍重量／腫瘍切除日）として示した。平均データは、平均＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍを表す（ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす）。処置動物中の循環抗体濃度を評価した（図１３Ｄ）。図１３Ｄにおいて、ｘ軸に沿った各時点は、左から右に以下を含む：アイソタイプＩｇＧ４対照；およびＳＴＩ－６６４３。血液試料を、以下の通り採取した：各試料について、１０μＬの全血を、９０μＬのＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインとＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ３７５２８）中で混合し、ＥＬＩＳＡを行うまで直ちに－８０℃で保存した。マルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログＬ１５ＸＡ－３）を、１×ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）中２μｇ／ｍＬの非標識マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ２ドメイン）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログＭＡ５－１６９２９、ロットＵＥ２７８１６３１Ａ）でコーティングした。１×ＫＰＬ洗浄液（Ｓｅｒａ ｃａｒｅ；カタログ５１５０－０００８、ロット１０２１４４７３）での洗浄後、プレートを、ＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインにて３７℃で１時間ブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインを含むＰＢＳ中のＳＴＩ－６６４３ｍＡｂを使用して５０から０ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲を対象とする系列希釈を行うことによって、検量線を作成した。その後に、９６ウェルプレートを洗浄し、血液試料（１：１０，０００に希釈）および検量線試料の両方を、ウェルに移し（５０μＬ／ウェル）、ゆっくり浸透しながら室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを１×ＫＰＬ洗浄液で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインを含むＰＢＳで１：５００に希釈したＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（カタログＤ２０ＪＬ－６、ロットＷ００１８０４５Ｓ）のヤギ抗ヒト／ＮＨＰ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ抗体とＲＴで１時間インキュベートした（２５μＬ／ウェル）。１×ＫＰＬ洗浄液での３回の洗浄後、１５０μＬ／ウェルの２×Ｒｅａｄ緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；カタログＲ９２ＴＣ－３、ロットＹ０１４０３６８）を添加することによって抗体の存在を明らかにした。プレートを、ＭＳＤ装置（Ｍｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００ Ｍｏｄｅｌ １２０１；シリアル番号１２０１１６０９１９４８４）で直ちに読み取った。データを平均＋／－Ｓ．Ｄ．として示す。
結論：ＳＴＩ－６６４３は、ＮＣＩ－Ｈ８２腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示した。
実施例１４：ＮＣＩ－Ｈ８２肺固形腫瘍モデルにおける用量有効性研究
ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、ＨＢＳＳ １×中に調製した５．０Ｅ＋０６個のＮＣＩ－Ｈ８２肺腫瘍細胞（１５０μＬ／マウス）を皮下接種し、８０％を超える動物に腫瘍隆起が存在した時点で（１１または１２日目に）、異なる処置群にランダム化した。マウスが処置開始時に腫瘍隆起を示さなかった場合、マウスを研究から除去した。
ＳＴＩ－６６４３またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ４抗体を、異なる処置スケジュールを使用して、２０、６０、または９０ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）で皮下注射（１５０μＬ／マウス）によって全身投与した。２０ｍｐｋ群および６０ｍｐｋ群の処置を、１週目に５回の連続注射、次いで、２週目および３週目については週に３回の注射で行った。９０ｍｐｋ群については、処置スケジュールは、１日おき（Ｑ２Ｄ）に合計６回であった。個別の腫瘍容積およびカプラン・マイヤー生存曲線を、各試験濃度について得た（図１４）。各カプラン・マイヤープロット中の上の曲線は、ＳＴＩ－６６４３処置マウスに基づき、下の曲線は、アイソタイプ処置マウスに基づく。生存率を、２０ｍｐｋ群および６０ｍｐｋ群についての腫瘍容積１，５００ｍｍ３および９０ｍｐｋ群についての１，０００ｍｍ３（この研究をより早期の３１日目に終了した場合）に基づいて計算した。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす。腫瘍容積および生存パーセントの結果を、図１４に示す。
結論：ＳＴＩ－６６４３は、総抗体注射量をｍｇ／マウスで比較した場合に、ＮＣＩ－Ｈ８２腫瘍モデルにおいて用量依存性に抗腫瘍活性を示した。
実施例１５：Ａ３７５黒色腫固形腫瘍モデルにおける有効性研究
ＮＢＳＧＷマウスの右脇腹に、ＨＢＳＳ １×中に調製した５．０Ｅ＋０６個のＡ３７５肺腫瘍細胞（１５０μＬ／マウス）を皮下接種し、７日目に（８０％を超える動物に腫瘍隆起が存在した時点）異なる処置群にランダム化した。マウスが処置開始時に腫瘍隆起を示さなかった場合、マウスを研究から除去した。
ＳＴＩ－６６４３（ｎ＝１０マウス）またはアイソタイプ対照（ｎ＝１０マウス）ヒトＩｇＧ４抗体を、２０ｍｇ／ｋｇで皮下注射（１５０μＬ／マウス）によって１日おきに合計６回全身投与した。
平均（図１５Ａ）および個別の（図１５Ｂ）腫瘍容積を、経時的に測定し、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を、腫瘍細胞移植後３１日目の研究終了時に計算した。カプラン・マイヤー生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットした（図１５Ｃ）。生存率を、腫瘍容積８００ｍｍ３に基づいて計算した。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす。
結論：ＳＴＩ－６６４３は、Ａ３７５腫瘍モデルにおいて２０ｍｐｋで抗腫瘍活性を示した。
実施例１６：ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）と組み合わせた抗ＣＤ４７（ＳＴＩ－６６４３）の有効性研究
ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞（ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ）を静脈内移植したＦｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／群）を、５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の抗ＣＤ３８ダラツムマブのみ、１０ｍｐｋのＳＴＩ－６６４３のみ、その組み合わせ（５ｍｐｋのダラツムマブ＋１０ｍｐｋのＳＴＩ－６６４３）、またはその組み合わせ（５ｍｐｋのヒトＩｇＧ１＋１０ｍｐｋのヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照）のいずれかで処置した。ＲＡＪＩ－Ｆｌｕｃ接種後７、９、１１、１４、１６、および１８日目に処置した。
カプラン・マイヤー生存分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。各動物についての生存期間を、後肢麻痺の兆候が認められた日を１日目として決定した。生存パーセントのグラフを図１６Ａに示す。各処置群を他の群と比較したｐ値を、表に示す（ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす）（図１６Ｂ中の表を参照のこと）。
結論：抗ＣＤ４７抗体およびダラツムマブを用いた併用療法は、播種性ヒトＲＡＪＩ異種移植マウスモデルにおいて生存期間を延長した。
実施例１７．抗ＣＤ４７抗体ＳＴＩ－６６４３は、抗ＣＤ４７抗体であるＨｕ５Ｆ９、ＡＯ１７６、および１３Ｈ３と比較して、赤血球凝集を劇的に減少させる。
赤血球（ＲＢＣ）の調製：ＲＢＣを、実施例９の方法を使用して、健康なヒトドナー、カニクイザル、およびビーグル犬由来の４ｍＬの末梢血から調製した。赤血球凝集アッセイのために、ヒト、サル、およびイヌ起源の５０μＬの０．５％ＲＢＣを、Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレートをＲＴで維持した。このアッセイで使用した抗体は、以下であった：抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４ ＳＴＩ－６６４３；抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４ Ｈｕ５Ｆ９（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＯＮＥ（本明細書中で参考として援用される））；抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４ ＡＯ－１７６（Ｐｕｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１９：８３５－８４６（本明細書中で参考として援用される））、および抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４ １３Ｈ３（米国特許出願公開第２０２０／０１４０５６５Ａ１号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、およびアイソタイプヒトＩｇＧ４対照。抗体の系列希釈物を、１×ＰＢＳを含む超低接着性９６ウェルプレート中で作製した（２倍希釈物）。抗体希釈物を、ＲＢＣを含むプレートに移し（１００μＬ／ウェル、開始抗体濃度：３００μｇ／ｍＬ）、マルチチャンネルピペットを用いてゆっくり数回混合した。プレートを、組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）に入れ、約２０時間インキュベートした。陰性の結果（赤血球凝集なし）は、丸底プレートの中央に点として出現した。陽性の結果（赤血球凝集）は、ウェル全体が均一に赤みがかっていた。図１７Ａ（上）は、陽性の結果および陰性の結果の例を提供する。図１７Ｂ（下）は、抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、および１３Ｈ３を使用した赤血球凝集アッセイの結果を示し、この結果は、他の試験した抗ＣＤ４７抗体と異なり、ＳＴＩ－６６４３が高濃度でさえも赤血球凝集を誘導しないことを実証している。
図１７Ｃは、ＳＴＩ－６６４３抗体は、イヌＲＢＣにおいて３μｇ／ｍＬを超える抗体濃度でいくらかの赤血球凝集が認められるが、ヒトおよびカニクイザル（サル）ＲＢＣの赤血球凝集を誘導しないことを実証している。
実施例１８．抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３およびＨｕ５Ｆ９の、ヒト、カニクイザル、およびイヌのＲＢＣへの結合。
ＲＢＣを、上の実施例１７に記載のように調製した。ＲＢＣへの結合を、マルチウェル形式で試験した。このアッセイを通してＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した。１．２５Ｅ＋０６個のＲＢＣ／ウェルを、５０μＬ １×ＰＢＳを含むＶ底９６ウェルプレート中にプレートした。種々の濃度の抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４抗体（ＳＴＩ－６６４３またはＨｕ５Ｆ９）またはアイソタイプＩｇＧ４対照を含む室温の５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を、抗体の存在下にて３７℃で４５分間インキュベートし、１５分毎にマルチチャンネルピペットを用いてゆっくり混合した。次いで、細胞を、ＲＴの１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離（５２４×ｇで３分間）によって遠心沈殿させ、上清を吸引した。ＲＢＣペレットを、１：２００に希釈したＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；クローンＨＰ６０１７、カタログ番号４０９３０６；ロットＢ８６５８１）を含むＲＴの５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＲＴの１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離（５２４ｇ；３分間）によって遠心沈殿させ、上清を吸引して破棄した。次いで、細胞を、１００μＬの固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；カタログ番号４２０８０１）にペレットを再懸濁して４℃で２０分間インキュベートすることによって固定した。１００μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液の添加後、細胞を遠心分離（５２４ｇ；３分間）によって遠心沈殿させ、ゆっくり吸引することによって上清を除去し、ペレットを２００μＬの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、２４時間以内にフローサイトメトリーによって分析した。
図１８は、ヒト、サル、およびイヌのＲＢＣを使用した抗ＣＤ４７結合アッセイの結果を提供する。ヒトおよびカニクイザルのＲＢＣへの結合を示すグラフでは、グラフ中の上の曲線は、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９による結合を示し、これは、抗体濃度が１０－７ｇ／ｍｌを超えて上昇するにつれて結合が増加することを示す。ＳＴＩ－６６４３は、このアッセイにおいてヒトＲＢＣの特異的結合を示さず（曲線がアイソタイプ対照と一致する）、カニクイザルＲＢＣへの結合は、約１０－５ｇ／ｍｌを超える濃度で遥かに小さい程度に起こる。イヌＲＢＣへの結合を示す右端のグラフの上の曲線はＳＴＩ－６６４３抗体による結合であり、下はイヌＲＢＣへのＨｕ５Ｆ９結合の曲線である。これらの抗体の両方は、約１０－７ｇ／ｍｌを超える濃度でイヌＲＢＣに結合する。
実施例１９．抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、１３Ｈ３、およびＡＯ－１７６のＲａｊｉ腫瘍細胞およびヒトＲＢＣへの結合。
ＲＢＣを上記の実施例１７に従って調製し、アッセイを通してＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した。
３０，０００個のＲＡＪＩ細胞／ウェルを、Ｖ底９６ウェルプレートにプレートした。プレートを、５２４ｇで３分間の遠心分離によって遠心沈殿させ、プレートを素早く叩くことによって上清を除去した。細胞を、種々の濃度の抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４抗体（ＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、および１３Ｈ３）またはアイソタイプＩｇＧ４対照（１００μｇ／ｍＬから開始する１：１０系列希釈）を含むＲＴの５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３７℃で２５分間インキュベートした。次いで、細胞をＲＴの１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離（５２４ｇ；３分間）によって遠心沈殿させ、プレートを素早く叩くことによって上清を除去した。細胞を、１：２００に希釈したＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；クローンＨＰ６０１７、カタログ番号４０９３０６；ロットＢ８６５８１）を含むＲＴの５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞をＲＴの１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離（５２４ｇ；３分間）によって遠心沈殿させ、プレートを素早く叩くことによって上清を除去した。細胞を、ペレットを１００μＬの固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；カタログ番号４２０８０１）に再懸濁し、４℃で２０分間インキュベートすることによって固定した。４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液（１００μＬ／ウェル）の添加後、試料を、２４時間以内にフローサイトメトリーによって分析した。
ＲＢＣ（１．２５Ｅ＋０６／ウェル）を、５０μＬ １×ＰＢＳを含むＶ底９６ウェルプレートにプレートした。種々の濃度の抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４抗体（ＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、１３Ｈ３、およびＡＯ－１７６）またはアイソタイプＩｇＧ４対照を含むＲＴの５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞を、抗体の存在下にて３７℃で４５分間インキュベートし、１５分毎にマルチチャンネルピペットを用いてゆっくり混合した。次いで、細胞を、ＲＴの１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離（５２４ｇ；３分間）によって遠心沈殿させ、上清を吸引した。ＲＢＣペレットを、１：２００に希釈したＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；クローンＨＰ６０１７、カタログ番号４０９３０６；ロットＢ８６５８１）を含むＲＴの５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＲＴの１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離（５２４ｇ；３分間）によって遠心沈殿させ、上清を吸引して破棄した。次いで、細胞を、ペレットを１００μＬの固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；カタログ番号４２０８０１）に再懸濁し、４℃で２０分間インキュベートすることによって固定した。１００μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液の添加後、細胞を遠心分離（５２４ｇ；３分間）によって遠心沈殿させ、ゆっくり吸引することによって上清を除去し、ペレットを２００μＬの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、２４時間以内にフローサイトメトリーによって分析した。
図１９は、図の左側のグラフ中に抗ＣＤ４７抗体によるＲａｊｉ細胞への結合を示す。上の曲線は、抗体Ｈｕ５Ｆ９であり、抗体１３Ｈ３およびＡＯ－１７６が続き、これらは非常に類似した曲線を示し、次いで、抗体ＳＴ－６６４３が続く。アイソタイプ対照は、低ＭＦＩの水平の線である（濃度依存性なし）。図の右側のグラフは、抗体Ｈｕ５Ｆ９が全ての濃度で最高レベルのＲＢＣ結合を示し、１３Ｈ３抗体（Ｈｕ５Ｆ９結合に対して最大結合濃度でおよそ６８％低下）が続き、次いで、ＡＯ－１７６結合曲線（Ｈｕ５Ｆ９結合に対して最大結合濃度でおよそ８０％の低下）が続くことを示す。ＳＴＩ－６６４３は、最も低い曲線であり、約１０－７ｇ／ｍｌ未満の濃度でＲＢＣへの結合量は最小であり、最大結合濃度で抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９によるＲＢＣ結合に対しておよそ９３％低下することを示す。
実施例２０．抗ＣＤ４７抗体であるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、１３Ｈ３、およびＡＯ－１７６とのＰＢＭＣのインキュベーション後の免疫細胞の評価。
正常な免疫細胞に対する抗ＣＤ４７抗体ＳＴＩ－６６４３の影響を試験するために、ＰＢＭＣを抗ＣＤ４７抗体とインキュベートし、次いで、免疫細胞型のマーカーについて染色するアッセイを行った。
３つの異なるドナー由来の新たに精製したＰＢＭＣを、等しい比率で混合し、０．５Ｅ＋０６細胞／ウェルで、１ｎｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまでの範囲の最終濃度のアイソタイプＩｇＧ４ Ａｂ、抗ＣＤ４７ ｍＡｂであるＳＴＩ－６６４３、Ｈｕ５Ｆ９、ＡＯ－１７６、または１３Ｈ３の存在下で、平底９６ウェルプレート中の３７℃の２００μＬのＲＰＭＩ１６４０ １０％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、カタログ番号ＨＰ１０２２、ロット６Ｆ１１３１）＋Ｐ／Ｓ中にプレートした。３７℃で６日間のインキュベーション後、細胞を５２４ｇで３分間の遠心分離によって遠心沈殿させ、プレートを叩くことによって上清を破棄し、細胞を、４℃の２００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃の１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で希釈した以下の蛍光色素抱合ｍＡｂを用いて４℃で３０分間染色した：抗ヒトＣＤ４－ＰＥ（クローンＯＫＴ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４１０、ロットＢ２６４３６３、２μＬ／ウェル）、抗ヒトＣＤ８－ＦＩＴＣ（クローンＨＩＴ８ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００９０６、ロットＢ２７５２７７、２μＬ／ウェル）、抗ヒトＣＤ１９－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＳＪ２５Ｃ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６３０１０、ロットＢ２７６７９５、２μＬ／ウェル）、およびＣＤ５６－ＰＢ（クローンＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１８３２６、ロットＢ２８０４５１、２μＬ／ウェル）。細胞を、４℃の１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液の添加、５２４ｇで３分間の遠心分離、およびプレートを叩くことによる上清の除去によって洗浄し、次いで、１００μＬの固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；カタログ番号４２０８０１）に４℃で２０分間再懸濁した。洗浄することなく４℃の１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、６日のインキュベーション期間の終了時に回収されたＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、およびＣＤ５６＋細胞の数を、フローサイトメトリーによって分析し、データを平均＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。
１つの代表的な実験を図２０Ａに示し、ここでは、データを、抗ＣＤ４７抗体とのインキュベーション後の回収細胞数の平均＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。図２０Ｂでは、データを、同一濃度のアイソタイプＩｇＧ４の存在下での回収細胞数の百分率として表す。２つの実験（１３Ｈ３およびＡＯ－１７６）または４つの実験（アイソタイプＩｇＧ４、ＳＴＩ－６６４３、およびＨｕ５Ｆ９）由来のデータを使用して、正規化グラフを作成した。データを、２～４つの独立した実験の平均＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。
Ａ）のグラフでは、抗体Ｈｕ５Ｆ９および１３Ｈ３でＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、およびＣＤ５６＋細胞の細胞数が最も減少し、また、ＡＯ－１７６抗体でＣＤ１９＋細胞が濃度依存性に減少する。Ｂ）のグラフでは、アイソタイプ抗体接種後に回収された細胞の百分率に基づいて、ＳＴＩ－６６４３とのインキュベーション後の回収細胞の百分率は、グラフの上部でアイソタイプ対照の軌跡をたどり、ＣＤ１９＋細胞の場合に最高濃度の抗体でわずかな程度にしか細胞が濃度依存性に喪失されないことを示す。
実施例２１：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１偽ヒト化マウスモデルにおける抗ＣＤ４７（ＳＴＩ－６６４３）の有効性研究
０日目に、ＮＳＧ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＩＬ１５）マウス（ストック番号３０８９０；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、１．０Ｅ＋０７個のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の腹腔内注射を使用してヒト化した。８日目に、マウスの右脇腹に、ＨＢＳＳ １×中に調製した５．０Ｅ＋０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳房腫瘍細胞（１００μＬ／マウス）を皮下接種し、１５日目に（９０％を超える動物の腫瘍サイズが５０～１００ｍｍ３に到達した時点で）異なる処置群にランダム化した。マウスが処置開始時に腫瘍隆起を示さなかった場合、マウスを研究から除去した。ＳＴＩ－６６４３抗体を、０．１、１、および１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射（１００μＬ／マウス；ｎ＝５マウス／群）によって１日おきに合計３回全身投与した。個別の腫瘍容積および平均腫瘍容積を、経時的に測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計的にプロットした。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｓｉｄａｋ多重比較検定を用いて行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす。
図２１は、ＳＴＩ－６６４３で処置するとヒト化ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍モデルにおいて腫瘍成長が低下したことを示す結果を提供する。

Claims (29)

  1. （ｉ）ＣＤ４７抗原のエピトープに結合する第１の抗体またはその抗原結合断片、および（ｉｉ）ＣＤ２０抗原またはＣＤ３８抗原のエピトープに結合する第２の抗体を含む組成物であって、前記第１の抗体がＣＤ４７抗原に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断する、組成物。
  2. 癌細胞集団中の少なくとも１つの癌細胞を死滅させる方法であって、前記少なくとも１つの癌細胞はＣＤ４７抗原を過剰発現し、前記方法が、前記少なくとも１つの癌細胞を、治療有効量のＣＤ４７抗原に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片およびＣＤ２０抗原に結合するかまたはＣＤ３８抗原に結合する第２の抗体と接触させることを含み、ここで、前記第１の抗体は、ＣＤ４７抗原に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断し、前記第２の抗体は、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む、方法。
  3. ＣＤ４７抗原を過剰発現する癌を有する被験体を処置する方法であって、前記方法が、治療有効量のＣＤ４７抗原に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片およびＣＤ２０抗原またはＣＤ３８抗原に結合する第２の抗体を前記被験体に投与することを含み、ここで、前記第１の抗体は、ＣＤ４７抗原に結合し、ＣＤ４７抗原とＳＩＲＰα抗原との間の結合を遮断し、ここで、前記第２の抗体は、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む、方法。
  4. 前記第１の抗体の前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（Ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  5. 前記第２の抗体が、エフェクター細胞上のＦｃγ受容体に結合するＦｃ部分を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  6. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ４型抗ＣＤ４７抗体を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  8. 前記第１の抗体が、完全ヒト抗ＣＤ４７抗体を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  9. 前記第１の抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む（ＳＴＩ－６６４３）、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  10. 前記ＣＤ４７抗原が、配列番号５のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ４７抗原またはその一部を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  11. 前記第１の抗体が、ヒト赤血球と接触した場合に抗ＣＤ４７抗体（Ｈｕ５Ｆ９）と比較して赤血球凝集を低下させ、ここで、前記Ｈｕ５Ｆ９抗体が、配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸１～１１７を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸１～１１２を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  12. 前記第１の抗体が、ヒトマクロファージ細胞（例えば、ＣＤ１４＋マクロファージ細胞）と接触した場合に、ＣＤ４７抗原を発現する細胞の食作用による死滅を媒介する、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  13. 前記第２の抗体が、ＩｇＧ１型抗ＣＤ２０抗体またはＩｇＧ１型抗ＣＤ３８抗体を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  14. 前記第２の抗体が、エフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  15. 前記第２の抗体が、
    ａ）キメラ抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）；ヒト化抗ＣＤ２０抗体（例えば、オビヌツズマブ）；もしくは完全ヒト抗ＣＤ２０抗体（例えば、オファツムマブ）；または
    ｂ）抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ、図１８Ｂ）；または図１８Ｃ～Ｄ中に列挙された表Ａ、Ｂ、もしくはＣ中に列挙された任意の１つの抗ＣＤ３８抗体
    を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  16. 前記第２の抗体が、
    ａ）配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸１～１２１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸１～１０６を含む可変軽鎖ドメイン（リツキシマブ）；
    ｂ）配列番号８のアミノ酸配列のアミノ酸１～１１９を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列のアミノ酸１～１１５を含む可変軽鎖ドメイン（オビヌツズマブ）；
    ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸１～１２２を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１１のアミノ酸配列のアミノ酸１～１０７を含む可変軽鎖ドメイン（オファツムマブ）；または
    ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン（ダラツムマブ）；または
    ｅ）表Ａ、Ｂ、およびＣ（それぞれ、図１８Ｃ～Ｅ）に列挙された可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインの対のいずれか１つ
    を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  17. 前記ＣＤ２０抗原が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ２０抗原もしくはその一部を含むか、または前記ＣＤ３８抗原が、配列番号１３のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８抗原を含む、請求項１に記載の組成物または請求項２もしくは３に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの癌細胞を、治療有効量の前記第１および第２の抗体と、本質的に同時または逐次的に任意の順序で接触させる、請求項２に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つの癌細胞の前記死滅が、食作用を含む、請求項２に記載の方法。
  20. ＣＤ４７抗原を過剰発現する前記少なくとも１つの癌細胞が、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、および肺癌細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  21. ＣＤ４７抗原を過剰発現する前記少なくとも１つの癌細胞が、骨髄腫、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および肥満細胞由来腫瘍からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  22. 前記投与することが、
    ａ）前記抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合断片および前記抗ＣＤ２０抗体を本質的に同時に、または前記抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合断片および前記抗ＣＤ２０抗体を逐次的に任意の順序で；または
    ｂ）前記抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合断片および前記抗ＣＤ３８抗体を本質的に同時に、または前記抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合断片および前記抗ＣＤ３８抗体を逐次的に任意の順序で
    前記被験体に投与することを含む、請求項３に記載の方法。
  23. 前記投与することが、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、および脊髄からなる群から選択される様式によって前記被験体に投与することを含む、請求項３に記載の方法。
  24. 前記ＣＤ４７抗原を過剰発現する癌が、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、および肺癌細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  25. 前記ＣＤ４７抗原を過剰発現する癌が、骨髄腫、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および肥満細胞由来腫瘍からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  26. 前記投与することが、前記被験体に、前記抗ＣＤ４７抗体を、約２０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約３０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約４０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約５０～１５０ｍｇ／ｋｂまたは約６０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約７０ｍｇ／ｋｇまたは約８０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約９０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約１００～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約１１０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約１２０～１５０ｍｇ／ｋｇまたは約１３０～１５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することを含む、請求項３に記載の方法。
  27. 前記投与することが、前記被験体に前記用量の前記抗ＣＤ４７抗体を、１週間に１回、２～６週間またはそれより長期間（例えば、１０週間まで）投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記投与することが、前記被験体に、前記抗ＣＤ２０抗体または前記抗ＣＤ３８抗体を、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇの準最適の用量で投与することを含む、請求項３に記載の方法。
  29. 前記投与することが、前記被験体に前記用量の前記抗ＣＤ２０抗体または前記抗ＣＤ３８抗体を、１週間に１回、２～６週間またはそれより長期間（例えば、１０週間まで）投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
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