KR20220110810A - 종양 표적화 항체와 병용된 항-cd47 항체를 포함하는 조성물 및 방법 - Google Patents

종양 표적화 항체와 병용된 항-cd47 항체를 포함하는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원 개시내용은 완전 사람 항-CD47 항체를 포함하는 첫번째 항체 및 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함하는 두번째 항체를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법 및 조성물에서 사용된 항-CD47 항체는 적혈구에 대한 낮은 수준의 결합을 나타내고, 항체의 고 농도에서조차 적혈구응집을 유발하지 않는다. 일부 실시형태에서, 두번째 항체는 CD20, PD-L1, CD38 또는 SLAMF7 항원에 결합하는 항체를 포함하는 종양-표적화 항체를 포함한다. 완전 사람 항-CD47 항체 및 두번째 항체의 병용은 대상자에서 암 부담을 감소시킬 수 있다.

Description

종양 표적화 항체와 병용된 항-CD47 항체를 포함하는 조성물 및 방법
도입
CD47은 다수의 종양 세포 상 과발현된 세포 표면 항원이다. CD47은, 선천 면역 세포, 예를 들면, 마크로파지에 의해 면역 세포 표면 상 이의 수용체, 신호 조절 단백질 알파 (SIRPα)를 결합하여 포식작용을 억제할 수 있다 (포식작용을 억제하기 때문에, CD47은 때때로 "나를 섭취하지 마세요(don't eat me)" 분자로서 언급된다.) 항-CD47 항체의 투여는 CD47- SIRPα 상호작용을 차단시켜 고유 면역체계의 억제를 완화할 수 있고, 이에 따라 항암 전략을 제공한다.
다수의 종양 세포 상에서 과발현되는 것 이외에, CD47은 또한 혈소판 및 적혈구를 포함하는 일부 정상 세포 상에서 발현된다. 따라서, 항-CD47 항체를 사용한 환자의 치료는 환자에게 정상 혈액 세포 결합으로부터 야기되는 독성 효과를 야기할 수 있다. 예를 들면, 항-CD47 모노클로날 항체 Hu5F9 (마그롤리맙)의 I기 시도는 처리된 환자의 57%가 일시적인 빈혈을 경험하고, 36%가 말초 혈액 세포의 적혈구응집이 나타내었다 (참조: Sikic et al. (2019) J. Clinical Oncol. 37:946-953).
요지
본원 개시내용은 완전 사람 항-CD47 항체를 포함하는 첫번째 항체 및 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하고 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함하는 두번째 항체를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 두번째 항체는 종양-표적화 항체, 예를 들면, CD20, PD-L1, CD38 또는 SLAMF7 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 완전 사람 항-CD47 항체는 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, 완전 사람 항체는 IgG2 항체 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시형태에서, 완전 사람 항체는 Fc 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG1 항체이고, 여기서, 하나 이상의 돌연변이는 Fc 영역의 Fc 수용체와의 감소된 상호작용을 야기한다.
치료학적 유효량의 1) CD47에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 2) 암 세포에 존재하는 항원에 결합하는 두번째 항체를 투여함을 포함하는 암을 갖는 대상자를 치료하는 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서, 첫번째 항체는 CD47에 결합하고 CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하고, 두번째 항체는 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 첫번째 항체는 서열번호 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 개시된 항-CD47 항체이다. 다양한 실시형태에서, Fc 영역을 포함하는 항체의 두번째 항체는 종양 항원, 예를 들면, CD20, CD38, PD-L1, 또는 SLAMF7에 결합한다. 예를 들면, 두번째 항체는 항-CD20 항체, 예를 들면, 리툭시맙 또는 항-CD38 항체, 예를 들면, 다라투무맙일 수 있다.
암 세포의 집단에서 적어도 하나의 암 세포를 사멸하기 위한 방법을 또한 포함하고, 여기서, 적어도 하나의 암 세포는 CD47 항원을 과발현하고, 상기 방법은: 적어도 하나의 암 세포를 치료학적 유효량의 CD47 항원에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 항원에 결합하는 두번째 항체와 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 첫번째 항체는 CD47 항원에 결합하고, CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하고, 두번째 항체는 종양 세포에 결합하고, 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함한다.
CD47 항원을 과발현하는 암을 갖는 대상자를 치료하는 방법을 또한 포함하고, 상기 방법은: 대상자에게 치료학적 유효량의 CD47 항원에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 항원에 결합하는 두번째 항체를 투여함을 포함하고, 여기서, 첫번째 항체는 CD47 항원에 결합하고, CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하고, 두번째 항체는 종양 세포에 결합하고, 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함한다.
상기 방법은 본원에 개시된 CD47 항체 중 어느 것, 예를 들면, STI-6643 항체 및 이의 변종을 사용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, CD20, CD38, 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임의의 종양 표적화 항체를 사용할 수 있다.
도 1은 적혈구응집 반응의 도식 (상부) 및 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 활성을 비교하는 적혈구응집 검정의 사진을 나타낸다.
도 2A는 CD47 결합에 대해 항-CD47/SIRP-알파-Fc를 사용한 경쟁 검정의 도식이다.
도 2B는 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 활성을 비교하는 경쟁 검정의 그래프를 나타낸다.
도 3은 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 활성을 비교하는 항체 의존 세포 포식작용 (ADCP) 검정의 그래프를 나타낸다.
도 4는 항-CD47 항체 클론 STI-6643 및 준최적 양의 항-CD20 항체 리툭시맙의 병용물을 시험하는 검정에서 포식작용 사멸의 증가를 비교하는 막대 그래프이다.
도 5a는 대조군 이소형 IgG4, 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 활성을 비교하는 파종성(disseminated) 사람 Raji-Fluc 이종이식 마우스 모델에서 항-종양 활성을 나타낸다.
도 5b는 도 5a에 기재된 마우스 모델의 항-종양 활성을 나타내는 그래프이다. 상부 그래프는 대조군 이소형 IgG4 또는 항-CD47 항체 클론 STI-6643으로 처리된 마우스에서 검출된 총 플럭스를 나타낸다. 하부 그래프는 대조군 이소형 IgG4 또는 항-CD47 항체 Hu5F9로 처리된 마우스에서 검출된 총 플럭스를 나타낸다. 실시예 5 참조.
도 5c는 도 5b 및 5c에 나타낸 데이터의 통계적 유의성 분석을 나타내는 그래프이다.
도 5d는 도 5a-c에 나타낸 데이터를 기초로 하여 동물 생존 분석을 나타내는 그래프이다.
도 5e는 도 5a-c에 기재된 동물에서 순환하는 항체 검출의 그래프를 나타낸다.
도 6a는 단일-요법으로서 대조군 이소형 IgG4, 항-CD47 항체 STI-6643 또는 Hu5F9, 또는 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 병용물의 활성을 비교하는 파종성 사람 Raji-Fluc 이종이식 마우스 모델에서 항-종양 활성을 나타낸다. 실시예 6을 참조한다.
도 6b는 도 6a에 기재된 마우스 모델의 항-종양 활성을 나타내는 그래프이다. 왼쪽 그래프는 단일-요법으로서 대조군 이소형 IgG4 또는 항-CD47 항체 클론 STI-6643으로 처리된 마우스에서 검출된 총 플럭스를 나타낸다. 가운데 그래프는 단일-요법으로서 대조군 이소형 IgG1 또는 항-CD20 항체 리툭시맙으로 처리된 마우스에서 검출된 총 플럭스를 나타낸다. 오른쪽 그래프는 대조군 이소형 IgG1 및 IgG4 이소형의 병용물, 또는 항-CD47 항체 클론 STI-6643 및 항-CD20 항체 리툭시맙의 병용물로 처리된 마우스에서 검출된 총 플럭스를 나타낸다.
도 6c는 도 6b 및 c에 나타낸 데이터의 통계적 유의성 분석을 나타내는 그래프이다.
도 6d는 도 6a-c에 나타낸 데이터를 기초로 하여 동물 생존 분석을 나타내는 그래프이다.
도 7a는 문헌[참조: Liu, et al., 2015 PLoS ONE (10)9: e0137345 (doi:10.1371/journal.pone.0137345]로부터 재현된 그래프이다 (상기 Liu의 문헌 에서 도 4A를 참조하고, 여기에서 상기 도에 지시된 용량으로 항-CD47 항체 Hu5F9의 단일 정맥내 주입으로 투여된 시노몰구스 원숭이의 약동학적 분석 (헤모글로빈)을 나타낸다. 음영 막대는 사람에서 수혈를 촉발할 수 있는 헤모글로빈의 범위를 나타낸다).
도 7b는 항-CD47 항체 STI-6643 (각각 용량 150 mg/kg에서)을 일주일에 1회 IV 볼루스를 통해 4 주 동안 투여받은 시노몰구스 원숭이의 본 발명의 약동학적 분석을 나타내는 그래프이다. 음영 막대는 사람에서 수혈을 촉발할 수 있는 헤모글로빈의 범위를 나타낸다.
도 8a는 종양 세포 및 RBCs에 결합하는 항-CD47 항체 Hu5F9와 비교하여, 적혈구 (RBCs)에 관하여 항-CD47 항체 클론 STI-6643의 종양 세포로의 우선적 결합을 나타내는 4개의 그래프를 포함한다. 그래프는 혼합-세포 샘플에 대한 결합 검정으로부터 유세포분석 데이터의 결과를 나타낸다.
도 8b는 항-CD47 항체 클론 STI-6643에 의한 항-CD47 항체 클론 STI-6643의 RBCs 및 종양 세포 (Raji, CD19-발현 종양 세포, 및 CD3-발현 종양 세포)로의 결합을 나타내는 막대 그래프이다. 항체 Hu5F9의 Raji 세포로의 결합은 비교를 위해 y-축 상 100%로 설정된다.
도 9는 적혈구응집 반응 (상부)의 도식 및 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 활성을 비교하는 또다른 적혈구응집 검정의 사진을 나타낸다.
도 10은 3-원 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정으로부터의 4개 그래프를 나타낸다.
도 11a는 스타필로코칼 엔테로톡신(Staphylococcal Enterotoxin) B (SEB) 검정의 결과를 나타내는 막대 그래프이다. x-축에 따른 각각의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로: 항체 비함유 대조군; 이소형 IgG4 대조군; Hu5F9; 및 STI-6643을 포함한다.
도 11b는 2개의 개별 그래프에 나타낸 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수로 상기 도 11a에 기재된 SEB 검정의 결과를 나타낸다.
도 11c는 2개의 개별 그래프에 나타낸 CD25+ CD4+ 및 CD25+ CD8+ 활성화된 T 세포의 수로 상기 도 11a에 기재된 SEB 검정의 결과를 나타낸다.
도 12a는 Raji 마우스 종양 모델에서 용량 연구로부터 퍼센트 생존을 나타내는 그래프이다.
도 12b는 상기 도 12a에 기재된 마우스 Raji 종양 모델에서 각각의 처리 그룹의 p 값을 열거한 표이다.
도 12c는 상기 도 12a에 기재된 Raji 마우스 종양 모델에서 항체의 누적 순환 농도를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 마우스 NCI-H82 폐 고형 종양 모델에서 효능 연구로부터 평균 종양 용적을 나타내는 그래프이다.
도 13b는 상기 도 13a에 기재된 마우스 NCI-H82 폐 고형 종양 모델에서 이소형 IgG4 항체 또는 STI-6643 항체 중 어느 하나로 처리된 개별적인 동물로부터 종양 용적을 나타낸다.
도 13c는 상기 도 13a에 기재된 마우스 NCI-H82 폐 고형 종양 모델로부터 상대적 종양 중량을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13d는 상기 도 13a에 기재된 마우스 NCI-H82 폐 고형 종양 모델로부터 순환하는 항체 농도를 나타내는 막대 그래프이다. x-축을 따라 배치된 각각의 시간은 왼쪽에서 오른쪽으로: 이소형 IgG4 대조군; 및 STI-6643을 포함한다.
도 14는 마우스 NCI-H82 폐 고형 종양 모델에서 용량 효능 연구로부터 종양 용적 및 퍼센트 생존의 수개의 그래프를 나타낸다.
도 15a는 마우스 A375 흑색종 고형 종양 연구에서 효능 연구로부터 종양 용적을 나타내는 그래프이다.
도 15b는 상기 도 15a에 기재된 마우스 A375 흑색종 고형 종양 연구에서 이소형 IgG4 항체 또는 STI-6643 항체 중 어느 하나로 처리된 개별적인 동물로부터의 종양 용적을 나타낸다.
도 15c는 상기 도 15a에 기재된 마우스 A375 흑색종 고형 종양 연구로부터 퍼센트 생존 그래프를 나타낸다.
도 16a는 마우스 Raji 종양 모델에서 효능 연구로부터 퍼센트 생존 그래프를 나타내고, 여기서, 마우스는 STI-6643 및 항-CD38 항체 (다라투무맙)의 병용물로 처리된다.
도 16b는 상기 도 16a에 기재된 마우스 병용 요법 연구에서 각각의 처리 그룹의 p 값을 열거하는 표이다.
도 17a는 양성 및 음성 적혈구응집 검정의 예를 제공한다. 도 17b는 항-CD47 항체 STI-6643, Hu5F9, AO-176, 및 13H3을 사용하는 적혈구응집 검정의 결과의 그림을 제공한다. 도 17c는 사람, 시노몰구스, 및 개 RBCs로 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9를 사용하는 적혈구응집 검정의 결과의 그림을 나타낸다.
도 18은 항체 농도의 함수로서 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 사람, 시노몰구스, 및 개 RBCs로의 결합의 그래프를 제공한다.
도 19는 항체 농도의 함수로서 항-CD47 항체 STI-6643, Hu5F9, AO-176, 및 13H3의 Raji 종양 세포 및 RBCs로의 결합의 그래프를 제공한다.
도 20a는 항-CD47 항체 STI-6643, Hu5F9, AO-176, 및 13H3으로 인큐베이션 후 PBMCs로부터 회수된 CD4+, CD8+, CD19+, 및 CD56+ 세포의 수의 그래프를 제공한다.
도 20b는 항-CD47 항체 STI-6643, Hu5F9, AO-176, 및 13H3로 인큐베이션 후 PBMCs로부터 회수된 CD4+, CD8+, CD19+, 및 CD56+ 세포의 그래프를 이소형 대조군으로 인큐베이션 후 회수된 동일한 세포 유형의 백분율로서 제공한다.
도 21은 상이한 투여량의 항-CD47 항체로 처리된 종양-을 갖는 마우스에서 경시적인 종양 용적의 그래프를 제공한다.
도 22A-C는 다양한 항-CD47 항체, CD47 항원, 항-CD20 항체 및 CD20 항원의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 23A-E는 다양한 항-CD38 항체 및 CD38 표적 항원의 아미노산 서열을 나타낸다.
기술
본원에 제공된 제목은 독자의 편의를 위한 것이고, 개시내용의 다양한 양상을 한정하지 않고, 이러한 양상은 본 명세서 전체를 참조하여 이해할 수 있다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원의 개시내용은 이의 전문이 본 출원에 참조로서 포함된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 당해 기술 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하고 있는 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 유전자삽입 세포 생산, 단백질 화학 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 기술에 관련된 용어는 잘 공지되어 있고 당해 기술분야에 일반적으로 사용된다. 본원에 제공된 방법 및 기술은 일반적으로 달리 지시되지 않는 한 본원에 인용되고 논의되는 다양한 일반적 및 보다 상세한 참조에 기재된 당해 기술분야에 잘 공지된 기술에 따라서 수행된다. 예를 들면, 문헌을 참조한다 [참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)]. 다수의 기준 텍스트는 문헌에 포함된 표준 항체 생산 프로세스를 포함한다 [참조: Borrebaeck (ed) Antibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY, 1995; McCafferty et al. Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England, 1996; and Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, N.J., 1995; Paul (ed.), Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y, 1993; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 및 이에 인용된 참조; Coding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, N.Y., 1986, and Kohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975]. 인용된 모든 문헌은 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 효소 반응 및 풍부화/정제 기술은 또한 잘 공지되어 있고, 제조자의 명세세에 따라서 당해 기술분야에서 일반적으로 수행되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학적 및 약제학적 화학에서 실험 절차 및 기술에 연관되어 사용되는 용어는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있고, 일반적으로 사용된다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약제학적 제제, 제형 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본원의 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수를 포함하여야 한다. 단수 형태 하나("a", "an") 및 상기("the"), 및 모든 용어의 단수 사용은, 분명하고 명백하게 하나의 지시대상에 제한되지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다.
본원에서 대안적인 (예를 들면, "또는")의 사용은 대안 중 하나 또는 둘 다 또는 이의 모든 조합을 의미하는 것을 이해하여야 한다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 다른 것의 존재 또는 부재에 상관 없이 특정한 특징 또는 성분 각각의 특정한 개시를 의미하기 위한 것이다. 예를 들면, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 구절에서 사용되는 용어 "및/또는" "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함함을 의도한다. 또한 "A, B, 및/또는 C"와 같은 구절에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음을 포함함을 의도한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "갖는"(having)" 및 "포함하는(containing)", 및 이들의 문법적 변형은, 비-제한것이어서 열거된 하나의 항목 또는 다수의 항목이 다른 항목을 배제하지 않고 열거된 항목에 추가될 수 있음을 의도한다. 양상이 언어 "포함하는(comprising)"으로 본원에 기재된 곳이면 어디든지, 그렇지 않으면 "로 이루어진(consisting of)" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"의 용어로 개시된 유사한 양상을 또한 제공하는 것을 이해하여야 한다.
본원에 사용된 용어 "약"은, 값 또는 조성물을 측정하고 결정하는 방법, 즉, 측정 시스템의 제한에 부분적으로 의존할 수 있는, 당해 기술 분야의 숙련가가 결정하는 특정 값 또는 조성물에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 언급한다. 예를 들면, "약" 또는 "대략적으로"는 당해 기술분야에서 관행에 따라 하나 이상의 표준 편차 내에 있음을 의미한다. 대안적으로, "약" 또는 "대략적으로"는 측정 시스템의 제한에 좌우되어 10% (i.e., ±10%)까지 또는 그 이상의 범위를 의미할 수 있다. 예를 들면, 약 5 mg은 4.5 mg 내지 5.5 mg의 임의의 수를 포함할 수 있다. 추가로, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스에 대해, 용어는 값의 규모 순서로 또는 5-배의 크기까지 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성물이 본 개시내용에 제공되는 경우, 달리 지시되지 않는 한, "약" 또는 "대략적으로"의 의미는 특정 값 또는 조성물에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 존재한다는 것이 가정되어야 한다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질" 및 본원에 사용된 다른 관련 용어는 상호교환적으로 사용하고, 임의의 특정한 길이에 제한되지 않는 아미노산의 중합체를 언급한다. 폴리펩타이드는 천연 및 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 재조합 및 화학적으로-합성된 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드는 전구체 분자 및 성숙 (예를 들면, 처리된) 분자를 포함한다. 전구체 분자는 개열, 예를 들면 분비 신호 펩타이드의 개열에 또는 특정 아미노산 잔기(들)에서 효소적 또는 비-효소적 개열에 의해 아직 적용되지 않은 것들을 포함한다. 폴리펩타이드는 개열을 겪은 성숙 분자를 포함한다. 이들 용어는 고유 단백질, 재조합 단백질, 단백질 서열의 뿐만 아니라 번역-후, 또는 그렇지 않으면 공유결합 또는 비-공유결합으로, 변형된 단백질, 및 인공 단백질, 단백질 단편 및 폴리펩타이드 유사체 (예를 들면, 뮤테인, 변종, 키메라 단백질 및 융합 단백질)을 포함한다.
용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 및 본원에 사용된 다른 관련 용어는 상호교환적으로 사용하고, 특정 길이에 제한되지 않는 뉴클레오티드의 중합체를 언급한다. 핵산은 재조합 및 화학적으로-합성된 형태를 포함한다. 핵산은 DNA 분자 (예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA, 발현 작제물, DNA 단편 등), RNA 분자 (예를 들면, mRNA), 뉴클레오티드 유사체 (예를 들면, 펩타이드 핵산 및 비-천연 발생 뉴클레오티드 유사체)를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이의 하이브리드, 뿐만 아니라 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 및 다른 합성 핵산 유사체 및 이의 하이브리드를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 항체, 또는 단편 또는 scFv, 유도체, 뮤테인, 또는 이의 변종을 암호화하는 인접한 개방 판독 프레임을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드의 하나의 유형 또는 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 상이한 유형의 혼합물을 포함한다.
용어 "회수하다" 또는 "회수" 또는 "회수하는", 및 다른 관련 용어는, 숙주 세포 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 또는 숙주 세포 막으로부터 단백질 (예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 부분)을 수득함을 언급한다. 하나의 실시형태에서, 단백질은, 발현된 단백질의 분비를 중재하는 분비 신호 펩타이드 서열 (예를 들면, 리더 펩타이드 서열)에 융합된 재조합 단백질로서 숙주 세포에 의해 발현된다. 분비된 단백질은 숙주 세포 배지로부터 회수될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 단백질은, 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있는 분비 신호 펩타이드 서열이 없는 재조합 단백질로서 숙주 세포에 의해 발현된다. 하나의 실시형태에서, 단백질은, 숙주 세포 막으로부터 발현된 단백질을 방출하는 계면활성제(detergent)를 사용하여 회수될 수 있는 막-결합 단백질로서 숙주 세포에 의해 발현된다. 하나의 실시형태에서, 단백질을 회수하는데 사용되는 방법에 상관없이, 단백질은 회수된 단백질로부터 세포 데브리스를 제거하는 절차에 적용될 수 있다. 예를 들면, 회수된 단백질은 크로마토그래피, 겔전기영동 및/또는 투석에 적용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 크로마토그래피는 친화도 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및/또는 실리카 상 크로마토그래피를 포함하는 임의의 하나 또는 임의의 조합 또는 2개 이상의 절차를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피는 단백질 A 또는 단백질 G (스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 세포벽 성분)를 포함한다.
용어 "단리된"은 실질적으로 다른 세포 물질이 없은 단백질 (예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 부분) 또는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 용어 단리된은 또한 일부 실시형태에서, 동일한 종의 다른 분자, 예를 들면 각각 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는 다른 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 실질적으로 없는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 목적하는 분자의 순도 또는 균질성은 저 분해능 방법, 예를 들면, 겔전기영동 및 고 분해능 방법, 예를 들면, HPLC 또는 질량 분광법을 포함하는 당해 기술분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 검정될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본원에 개시된 항-CD47 항체 또는 종양 표적화 항체 중 어느 것은 단리된다.
항체는 가변 항원 특이성을 갖는 갖는 면역글로불린을 포함하는 혈청 또는 혈장과 같은 공급원으로부터 입수될 수 있다. 이러한 항체가 친화도 정제에 적용되는 경우, 특정 항원 특이성에 대해 풍부화될 수 있다. 항체의 이러한 풍부화 제제는 보통 특정 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는 약 10% 미만의 항체로 제조된다. 이들 제제를 수회 친화도 정제에 적용하는 것은 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는 항체의 비율을 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 항체는 종종 "단일특이적"으로 언급된다. 단일특이적 항체 제제는 특정 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는 항체 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.9%로 구성될 수 있다. 항체는 하기한 재조합 핵산을 사용하여 제조할 수 있다.
용어 "리더 서열" 또는 "리더 펩타이드" 또는 "[펩타이드] 신호 서열" 또는 "신호 펩타이드" 또는 "분비 신호 펩타이드"는 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하는 펩타이드 서열을 언급한다. 리더 서열은 폴리펩타이드 쇄를 세포 분비 경로로 지시하고, 폴리펩타이드의 세포 막의 지질 이중층으로의 통합 및 앵커링을 지시할 수 있다. 전형적으로, 리더 서열은 약 10-50개의 아미노산 길이이고, 성숙 폴리펩타이드의 분비 및 성숙 폴리펩타이드의 막으로의 삽입시 폴리펩타이드로부터 개열된다. 따라서, 신호 펩타이드 서열을 포함하는 이들의 전구체 서열에 의해 확인되는 신호 펩타이드를 갖는, 본원에 제공된 단백질, 예를 들면, 막 단백질 및 항체는 또한 신호 펩타이드가 결핍된 폴리펩타이드의 성숙 형태를 포함하는 것을 의도하고, 신호 펩타이드 서열이 결핍된 이들의 성숙 폴리펩타이드 서열에 의해 확인되는 신호 펩타이드를 갖는 본원에 제공된 단백질, 예를 들면, 막 단백질 및 항체는 또한, 고유한 단백질이든, 또다른 분비된 또는 막-삽입된 단백질로부터 유도되는지에 상관없이, 신호 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드의 형태를 포함하는 것을 의도한다. 하나의 실시형태에서, 리더 서열은 CD8α, CD28 또는 CD16 리더 서열을 포함하는 신호 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 신호 서열은, 예를 들면, 마우스 또는 사람 Ig 감마 분비 신호 펩타이드를 포함하는 포유류 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 리더 서열은 마우스 Ig 감마 리더 펩타이드 서열 MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (서열번호 40)를 포함한다.
"항원-결합 단백질" 및 본원에 사용된 관련 용어는, 항원에 결합되고, 임의로, 항원 결합 부분이 항원-결합 단백질의 항원으로의 결합을 촉진하는 형태를 채택하도록 하는 골격 또는 외곽구조 부분에 결합되는 일부를 포함하는 단백질을 언급한다. 항원-결합 단백질의 예는 항체, 항체 단편 (예를 들면, 항체의 항원 결합 부분), 항체 유도체, 및 항체 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 "[참조] 항체로부터 유도된 항원-결합 단백질"은 참조 항체의 가변 경쇄 서열 및 가변 중쇄 서열을 포함하는 항원-결합 단백질이다. 항원 결합 단백질은, 예를 들면, 대안적인 단백질 골격 또는 인공 골격을 그래프팅된 CDRs 또는 CDR 유도체와 함께 포함할 수 있다. 이러한 골격은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 항원 결합 단백질의 삼차원 구조를 안정화시키기 위해 도입된 돌연변이를 포함하는 항체-유래 골격 뿐만 아니라 예를 들면, 생체적합성 중합체를 포함하는 완전 합성 골격을 포함한다. 예를 들면, 문헌을 참조한다[참조: Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654]. 추가로, 펩타이드 항체 미메틱 ("PAMs")을 사용할 수 있고, 뿐만 아니라 골격으로서 피브로넥틴 성분을 이용하는 항체 미메틱에 기반하는 골격을 사용할 수 있다.
항원 결합 단백질은, 일부 예에서, 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. 하나의 실시형태에서, "면역글로불린"은 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성된 사량체 분자를 언급하고, 각각의 쌍은 하나의 "경" 쇄 (약 25 kDa) 및 하나의 "중" 쇄 (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의한다. 사람 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 부류되고, 항체의 이소형을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 각각 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역으로 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 초과의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로 문헌을 참조한다 [참조: Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] (모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로서 본원에 포함된). 중쇄 및/또는 경쇄는 분비를 위한 리더 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성하여 온전한 면역글로불린은 2개의 항원 결합 부위를 갖는다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 단백질은 사량체 면역글로불린 분자와 상이하지만, 여전히 표적 항원에 결합하거나 2개 이상의 표적 항원에 결합하는 구조를 갖는 합성 분자일 수 있다. 예를 들면, 합성 항원 결합 단백질은 항체 단편, 1-6개 이상의 폴리펩타이드 쇄, 폴리펩타이드의 비대칭 어셈블리, 또는 다른 합성 분자를 포함할 수 있다.
면역글로불린 쇄의 가변 영역은, 또한 상보성 결정 영역 또는 CDRs로 언급되고, 상대적으로 보존된 외곽구조 영역 (FR)에 연결된 3개의 초가변 영역의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 세그먼트 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.
하나 이상의 CDRs는 공유결합으로 또는 비공유결합으로 분자 내로 도입되어 이를 항원 결합 단백질로 만들 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDR(들)을 더 큰 폴리펩타이드 쇄의 부분으로서 도입할 수 있고, CDR(들)을 또다른 폴리펩타이드 쇄로 공유결합으로 링크할 수 있거나, CDR(들) 비공유결합으로 도입할 수 있다. CDRs은 항원 결합 단백질을 관심 대상 특정 항원에 특이적으로 결합하도록 한다.
각각의 도메인으로 아미노산의 배치는 Kabat 등의 문헌의 정의에 따른다 [참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991] (예를 들면, "Kabat 넘버링"). 면역글로불린 쇄 중 아미노산을 위한 다른 넘버링 시스템은 IMGT.RTM. (international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) 및 AHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001); Chothia (Al-Lazikani et al., 1997 J. Mol. Biol. 273:927-948; Contact (Maccallum et al., 1996 J. Mol. Biol. 262:732-745, 및 Aho (Honegger and Pluckthun 2001 J. Mol. Biol. 309:657-670)를 포함한다.
"항체" 및 "항체들" 및 본원에 사용된 관련 용어는 항원에 특이적으로 결합된 온전한 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 부분 (또는 이의 항원 결합 단편)을 언급한다. 항원 결합 부분 (또는 항원 결합 단편)은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 개열에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합 부분 (또는 항원 결합 단편)은, 그 중에서도, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체 (dAbs), 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단-쇄 항체 (scFv), 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 나노바디, 및 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
항체는 재조합으로 생성된 항체 및 항원 결합 부분을 포함한다. 항체는 비-사람, 키메라, 사람화 및 완전 사람 항체를 포함한다. 항체는 일특이적, 다중특이적 (예를 들면, 이특이적, 삼특이적 및 보다 고차의 특이성)을 포함한다. 항체는 사량체 항체, 경쇄 단량체, 중쇄 단량체, 경쇄 이량체, 중쇄 이량체를 포함한다. 항체는 F(ab')2 단편, Fab' 단편 및 Fab 단편을 포함한다. 항체는 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단쇄 항체, 단쇄 가변 단편 (scFv), 카멜화 항체, 아피바디(affibodies), 디설파이드-링크된 Fvs (sdFv), 항-이디오타입 항체 (항-Id), 미니바디를 포함한다. 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 집단을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 입수된 항체를 언급하고, 즉, 집단을 포함하는 개별적인 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대하여 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원에 대한 단일 결정인자에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는 동일한 항체 분자의 집단을 생성하는 세포주를 제공하는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조된 모노클로날 항체를 포함하고, 또한 항체-암호화 서열을 포함하는 작제물 또는 작제물들로 형질감염되는 클로닝 방법으로 생성된 키메라, 하이브리드, 및 재조합 항체를 포함하고, 형질감염된 세포의 자손은 단일 항원 부위에 대해 지시된 항체 분자의 집단을 생성한다. 예를 들면, 항체의 가변 영역 (가변 중쇄 및 경쇄 영역 또는 가변 중쇄 및 경쇄 CDRs)은 사람 불변 영역을 포함하는 임의의 종의 불변 영역을 포함하는 항체 외곽구조 내로 클로닝될 수 있고, 여기서, 세포에서 작제물의 발현은 모노클로날로서 언급될 수 있는 단일 항체 분자 또는 항원-결합 단백질을 생성할 수 있다.
따라서, 조절제 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 입수된 항체의 형질을 지시하고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 처음으로 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있거나, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 재조합 DNA 방법으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들면, 문헌[참조: McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
"항원 결합 도메인", "항원 결합 영역", 또는 "항원 결합 부위" 및 본원에 사용된 다른 관련 용어는 항원과 상호작용하고, 항원 결합 단백질의 특이성 및 항원에 대한 친화도에 기여하는 아미노산 잔기 (또는 다른 모이어티)를 포함하는 항원 결합 단백질의 일부를 언급한다. 이의 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 대해, 이는 이의 CDR 도메인 중 적어도 하나의 적어도 일부를 포함할 것이다.
용어 "특이적으로 결합하는", "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적으로 결합하는" 및 본원에 사용된 다른 관련 용어는, 항체 또는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편의 맥락에서, 다른 분자 또는 모이어티에 비해 항원에 비-공유결합 또는 공유결합 우선적 결합을 언급한다 (예를 들면, 다른 이용가능한 항원에 비해 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체). 다양한 실시형태에서, 항체는, 10-5 M 이하, 또는 10-6 M 이하, 또는 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하, 또는 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하, 또는 10-11 이하, 또는 10-12 이하의 해리 상수 (Kd)를 갖는 항원에 결합하는 경우, 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
표적 항원에 대한 항원-결합 단백질의 결합 친화도는 표면 플라즈몬공명 (SPR) 검정을 사용하여 측정할 수 있는 해리 상수 (Kd)로서 보고될 수 있다. 표면 플라즈몬공명은, 예를 들면 BIACORE 시스템 (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경을 검출하여 실시간 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학적 현상을 언급한다.
본원에 사용된 "에피토프" 및 관련 용어는 항원 결합 단백질에 의해 (예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 의해) 결합되는 항원의 일부를 언급한다. 에피토프는 항원 결합 단백질에 의해 결합되는 2개 이상의 항원의 부분을 포함할 수 있다. 에피토프는 하나의 항원의 또는 2개 이상의 항원의 비-인접 부분을 포함할 수 있다 (예를 들면, 항원의 일차 서열에 인접하지 않지만, 항원의 3차 및 4차 구조의 정황에서, 항원 결합 단백질에 의해 결합하기 위해 서로 충분히 가까운 아미노산 잔기). 일반적으로, 항체의 가변 영역, 특히 CDRs은, 에피토프와 상호작용한다.
항체에 관해서, 용어 "길항제" 및 "길항성"은 이의 동족 표적 항원을 결합하고, 결합된 항원의 생물할적 활성을 억제 또는 감소시키는 항체를 차단함을 언급한다. 용어 "작용제" 또는 "작용성"은 항체-중재된 다운스트림 신호화를 야기하는 생리학적 리간드의 결합을 모방하는 방식으로 이의 동족 표적 항원에 결합하는 항체를 언급한다.
"항체 단편", "항체 부분", "항체의 항원-결합 단편", 또는 "항체의 항원-결합 부분" 및 본원에 사용된 다른 관련 용어는 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합되는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 언급한다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; Fd; 및 Fv 단편, 뿐만 아니라 dAb; 디아바디; 선형 항체; 단-쇄 항체 분자 (예를 들면, scFv); 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 항체 중 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 항체의 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 개열에 의해 제조될 수 있다. 항원 결합 부분은, 그 중에서도 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 (dAbs), 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 항체 단편에 항원 결합 성질을 부여하는데 충분한 면역글로불린 중 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
용어 "Fab", "Fab 단편" 및 다른 관련 용어는 가변 경쇄 영역 (VL), 불변 경쇄 영역 (CL), 가변 중쇄 영역 (VH), 및 첫번째 불변 영역 (CH1)을 포함하는 1가 단편을 언급한다. Fab는 항원에 결합할 수 있다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 링크된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이다. F(Ab')2는 항원 결합 가능성을 갖는다. Fd 단편은 VH 및 CH1 영역을 포함한다. Fv 단편은 VL 및 VH 영역을 포함한다. Fv는 항원에 결합할 수 있다. dAb 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 또는 VL 도메인의 항원-결합 단편을 갖는다 (미국 특허 6,846,634 및 6,696,245; 미국 공개 출원 번호 2002/02512, 2004/0202995, 2004/0038291, 2004/0009507, 2003/0039958; 및 Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).
단-쇄 항체 (scFv)는 VL 및 VH 영역이 링커 (예를 들면, 아미노산 잔기의 합성 서열)를 통해 연결되어 연속 단백질 쇄를 형성하는 항체이다. 하나의 실시형태에서, 링커는 단백질 쇄가 자체로 다시 접힐 수 있고, 1가 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 충분히 길다 (예를 들면, 참조: Bird et al., 1988, Science 242:423-26 및 Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83).
디아바디는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 2가 항체이고, 각각의 폴리펩타이드 쇄는 너무 짧아서 동일한 쇄 상 2개의 도메인 간의 페어링할 수 없고, 이에 따라, 각각의 도메인이 또다른 폴리펩타이드 쇄 상 상보적 도메인과 페어링되는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함한다 (예를 들면, 참조: Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 및 Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). 디아바디의 2개의 폴리펩타이드 쇄가 동일한 경우, 이들의 페어링으로부터 야기되는 디아바디는 2개의 동일한 항원 결합 부위를 가질 것이다. 상이한 서열을 갖는 폴리펩타이드 쇄를 사용하여 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 디아바디를 제조할 수 있다. 유사하게, 트리바디 및 테트라바디는, 동일하거나 상이할 수 있는, 3 및 4개의 폴리펩타이드 쇄를 각각 포함하고, 3 및 4개의 항원 결합 부위를 각각 형성하는 항체이다. 디아바디, 트리바디 및 테트라바디 작제물을 본원에 기재된 항-CD47 항체 중 어느 것으로부터의 항원 결합 부분을 사용하여 제조할 수 있다.
"사람화 항체"는 상응하는 사람 면역글로불린 아미노산 서열에 일치되게 변형된 서열인 하나 이상의 가변 및 불변 영역을 갖는 비-사람 종으로부터 비롯되는 항체를 언급한다. 예를 들면, 사람화 항체의 불변 영역은 사람 불변 영역 서열일 수 있고, 여기서, 가변 도메인의 아미노산 서열은 또다른 종, 예를 들면, 마우스 (항체가 이미 생성되었을 수 있음)의 항체 서열 유래일 수 있다. 사람화 항체는, 사람 대상자에게 투여되는 경우 비-사람 종 항체과 비교하여, 면역 반응을 덜 유발하는 경향이 있고/있거나, 덜 심각한 면역 반응한다. 하나의 실시형태에서, 외곽구조의 특정 아미노산 및 비-사람 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인은 돌연변이되어 사람화 항체를 생성한다. 일부 실시형태에서, 사람 항체로부터의 불변 도메인(들)은 비-사람 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 일부 실시형태에서, 비-사람 항체의 하나 이상의 CDR 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 사람 대상자에게 투여되는 경우 비-사람 항체의 가능한 면역원성을 감소시키고, 여기서, 변경된 아미노산 잔기는 항체의 이의 항원으로의 면역특이적 결합에서 중요하지 않거나, 수행된 아미노산 서열의 변경은 보존적 변경이고, 이에 따라 사람화 항체의 항원으로의 결합이 비-사람 항체의 항원으로의 결합보다 유의하게 더 악화되지 않는다. 사람화 항체를 제조하는 방식의 예는 미국 특허 번호 6,054,297, 5,886,152 및 5,877,293에서 발견할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 "완전 사람" 항체일 수 있고, 여기서, 모든 불변 및 가변 도메인 (임의로 CDRs에서 제외)은 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 본원에 개시된 완전 사람 항체는 야생형 유형 사람 항체 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이 (예를 들면 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입일 수 있다)를 불변 영역, 예를 들면, 중쇄의 Fc 불변 영역에서 가질 수 있다. 예를 들면, 완전 사람 항체는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 중 어느 하나의 불변 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있고, 여기서, 완전 사람 항체의 경쇄 불변 영역 또는 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2, 및 CH3) 중 어느 하나 또는 둘 다의 서열은 비-돌연변이 사람 불변 영역의 서열에 대해 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 바람직하게는 98% 초과 또는 적어도 99% 동일성이다. 사람화 및 완전 사람 항체를 다양한 방식으로 제조할 수 있고, 이의 예는 하기에 기재되고, 재조합 방법론을 통한 방식 또는 유전적으로 변형되어 사람 중쇄 및/또는 경쇄-암호화 유전자로부터 유도되는 항체를 발현하는 마우스의 관심 항원을 사용한 면역화, 예를 들면, 항원을 접종하여, 고 친화도 완전 사람 항체를 생성하는 "Xenomouse II"를 통한 방식을 포함한다[참조: Mendez et al. ((1997) Nature Genetics 15: 146-156)]. 이는 메가베이스 사람 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 내인성 JH 영역이 결실된 마우스 내로 생식선 통합으로 성취되었다. 이들 마우스에서 생성된 항체는 유전자 재배치, 어셈블리, 및 레퍼토리를 포함하여 모든 측면에서 사람에서 나타나는 것과 매우 유사하다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (참조: McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990])을 사용하여 시험관내 사람 항체 및 항체 단편을, 면역화 또는 비면역화 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라서, 항체 V 도메인 유전자는 실모양 박테리오파지, 예를 들면, M13 또는 fd의 주요 또는 소량 코트 단백질 유전자 중 어느 하나로 인-프레임 클로닝되고, 기능적 항체 단편으로서 파지 입자의 표면 상에 나타난다. 실모양 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능성 성질을 기초로 한 선택은 또한 이들 성질을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 야기한다. 따라서, 파지는 B-세포 성질의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다; 예를 들면, 문헌을 참조한다 [참조: Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)]. V-유전자 세그먼트의 다수의 공급원 중 어느 것은 파지 디스플레이, 예를 들면, 면역화된 마우스의 비장에 대해 사용될 수 있거나 (참조: Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)), 비면역화 사람 공여자의 혈액 세포를 사용하여 다양한 어레이의 항원 (자가-항원을 포함함)에 대한 항체를 생산할 수 있고, 문헌[참조: Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991) 또는 Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라서 본질적으로 단리될 수 있다.
용어 "키메라 항체" 및 본원에 사용된 관련 용어는 첫번째 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 포함하는 항체를 언급한다. 하나의 실시형태에서, CDRs 중 하나 이상은 사람 항체로부터 유도된다. 또다른 실시형태에서, CDRs 모두는 사람 항체로부터 유도된다. 또다른 실시형태에서, 하나 초과의 사람 항체로부터의 CDRs을 혼합하고, 키메라 항체에서 매칭한다. 예를 들면, 키메라 항체는 첫번째 사람 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 두번째 사람 항체의 경쇄로부터의 CDR2 및 CDR3, 및 세번째 항체의 중쇄로부터의 CDRs를 포함할 수 있다. 또다른 예에서, CDRs는 상이한 종, 예를 들면, 사람 및 마우스, 또는 사람 및 토끼, 또는 사람 및 염소로부터 비롯된다. 당해 기술 분야의 숙련가는 다른 조합이 가능하다는 것을 인식할 수 있다.
추가로, 키메라 항체의 외곽구조 영역을 동일한 항체 중 하나로부터, 하나 이상의 상이한 항체, 예를 들면, 사람 항체로부터, 또는 사람화 항체로부터 유도할 수 있다. 키메라 항체의 하나의 예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터의 항체 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체와 동일하거나, 이와 동종이거나, 이로부터 유도되는 반면, 나머지 쇄(들)는 또다른 종으로부터의 항체 (들) 또는 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체와 동일하거나, 이와 동종이거나, 이로부터 유도된다. 또한 목적하는 생물학적 활성 (즉, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력)을 나타내는 이러한 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "변종" 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드의 "변종"은 참조 폴리펩타이드 서열에 대해 아미노산 서열 내로 삽입, 이로부터 결실, 및/또는 치환되는 하나 이상의 아미노산 잔기와 함께 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 폴리펩타이드 변종은 융합 단백질을 포함한다. 동일한 방식으로, 변종 폴리뉴클레오티드는 또다른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 뉴클레오티드 서열 내로 삽입, 이로부터 결실, 및/또는 치환되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변종은 융합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 폴리펩타이드의 "유도체"는, 예를 들면, 또다른 화학적 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민 (예를 들면, 사람 혈청 알부민)로의 접합, 인산화, 및 글리코실화를 통해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체)이다.
달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 전체-길이 중쇄 및 전체-길이 경쇄를 포함하는 항체 이외에, 이의 유도체, 변종, 단편, 및 뮤테인을 포함하고, 이의 예는 하기에 기재되어 있다.
용어 "힌지"는 일반적으로 단백질의 2개의 도메인 사이에서 발견되는 아미노산 세그먼트를 언급하고, 전체 작제물의 유연성 및 서로에 대해 도메인 중 어느 하나 또는 이들 둘 다의 이동을 가능하게 할 수 있다. 구조적으로, 힌지 영역은 약 10 내지 약 100개의 아미노산, 예를 들면, 약 15 내지 약 75개의 아미노산, 약 20 내지 약 50개의 아미노산, 또는 약 30 내지 약 60개의 아미노산을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 아미노산 길이이다. 힌지 영역은 천연-발생 단백질의 힌지 영역, 예를 들면, CD8 힌지 영역 또는 이의 단편, CD8α 힌지 영역, 또는 이의 단편, 항체 (예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체)의 힌지 영역, 또는 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 영역으로부터 유도될 수 있다. 힌지 영역은 항체로부터 유도될 수 있고, 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있거나, 힌지 영역은 항체의 힌지 영역 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함하거나, 힌지 영역은 항체의 힌지 영역 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함하거나, 힌지 영역은 비-천연 발생 펩타이드이거나, 힌지 영역은 scFv의 C-말단 및 막횡단 도메인의 N-말단 사이에 위치한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 면역글로불린 분자로부터 상부, 코어, 또는 하부 힌지 서열을 포함하는 2개 이상의 영역 중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 상부 힌지 서열 EPKSCDKTHT (서열번호 41)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 코어 힌지 서열 CP X C을 포함하고, 여기서, X 는 P, R 또는 S이다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 하부 힌지/CH2 서열 PAPELLGGP ((서열번호 42))을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지는 아미노산 서열 SVFLFPPKPKDT (서열번호 43)을 갖는 Fc 영역 (CH2)에 연결된다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역는 상부, 코어, 또는 하부 힌지의 아미노산 서열을 포함하고, EPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGP (서열번호 44)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 힌지 영역은 적어도 1, 2, 3개 이상의 쇄간 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 1, 2, 3개 이상의 시스테인을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"은 힌지 영역 내에서 또는 그 뒤에서 시작하고 중쇄의 C-말단에서 끝나는 항체 중쇄 불변 영역의 부분을 언급한다. Fc 영역은 CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하고, 힌지 영역의 일부를 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다. Fc 도메인은 Fc 세포 표면 수용체 및 면역 보체계의 일부 단백질에 결합할 수 있다. Fc 영역은 상보적 성분 C1q에 결합할 수 있다. Fc 도메인은, 상보적-의존 세포독성 (CDC), 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존 포식작용 (ADP), 옵소닌화 및/또는 세포 결합을 포함하는 것들 중 어느 하나 또는 2개 이상의 활성의 임의의 조합을 포함하는 이펙터 기능을 나타낸다. Fc 도메인은 FcγRI (예를 들면, CD64), FcγRII (예를 들면, CD32) 및/또는 FcγRIII (예를 들면, CD16a)을 포함하는 Fc 수용체에 결합할 수 있다. Fc 영역은 이들 기능 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 증가 또는 감소시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 영역은 이펙터 기능을 감소시키는 LALA 돌연변이 (예를 들면, Kabat 넘버링에 따른 L234A, L235A에 대한 등가물)를 포함할 수 있다. 하나의 예에서, Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키는 LALA-PG 돌연변이 (예를 들면, Kabat 넘버링에 따른 L234A, L235A, P329G에 대한 등가물)을 포함한다. Fc 도메인은 또한 항체의 혈청 반감기를 증가 또는 감소시킬 수 있는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드에 관련하여 본원에 사용된 용어 "표지화된" 또는 관련 용어는 비표지되거나 검출을 위해 검출가능한 표지 또는 모이어티에 연결되는 연결자 항체 및 이들의 항원 결합 부분을 언급하고, 여기서, 검출가능한 표지 또는 모이어티는 방사성, 비색, 항원성, 효소적, 검출가능한 비드 (예를 들면, 자성 또는 전자고밀도 (예를 들면, 금) 비드), 비오틴, 스트렙타비딘 또는 단백질 A이다. 다양한 표지가 이용될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 방사성핵종, 형광물질, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 및 리간드 (예를 들면, 비오틴, 합텐)를 포함한다. 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 어느 것은 비표지될 수 있거나, 검출가능한 표지 또는 모이어티에 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표지화된" 또는 폴리펩타이드에 관한 관련 용어는 검출을 위해 검출가능한 표지 또는 모이어티에 대한 이의 결합자를 언급한다. 예시적인 검출가능한 표지 또는 모이어티는 방사성, 비색, 항원성, 효소적 표지/모이어티, 검출가능한 비드 (예를 들면, 자성 또는 전자고밀도 (예를 들면, 금) 비드), 비오틴, 스트렙타비딘 또는 단백질 A를 포함한다. 다양한 표지가 이용되고, 여기에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 방사성핵종, 형광물질, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 및 리간드 (예를 들면, 비오틴, 합텐)이 포함된다. 본원에 기재된 항-CD47 항체 또는 종양 항원-결합 항체 중 어느 것은 비표지될 수 있거나, 검출가능한 표지 또는 검출가능한 모이어티에 연결될 수 있다.
"퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 상동성" 및 본원에 사용된 관련 용어는 2개의 폴리펩타이드 간의 또는 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 유사도의 정량적 측정치를 언급한다. 2개의 폴리펩타이드 서열 간의 퍼센트 동일성은 2개의 폴리펩타이드 서열 간에 공유되는 정렬된 위치에서 동일한 아미노산의 수의 함수이고, 2개의 폴리펩타이드 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 갭(gaps)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 유사한 방식으로, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간에 공유된 정렬된 위치에서 동일한 뉴클레오티드의 수의 함수이고, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있을 수 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 폴리펩타이드 서열 간의, 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 및 퍼센트 동일성의 측정의 비교는, 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 상동성"은 이의 디폴트 파라미터를 사용하는 GAP 컴퓨터 프로그램 (GCG Wisconsin Package의 일부, 버젼 10.3 (Accelrys, San Diego, Calif.))을 사용하여 서열을 비교하여 측정될 수 있다. 이와 같은 시험 서열에 대해 발현이 "Y와 적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함한다"는, 상기한 바와 같이 서열 Y과 정렬되는 경우, 시험 서열은 Y의 잔기의 적어도 X%까지 동일한 잔기를 포함함을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 시험 항체의 아미노산 서열은 본원에 기재된 항-CD47 항체 중 어느 것을 구성하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 어느 것과 반드시 동일한 필요는 없지만 유사할 수 있다. 시험 항체 및 폴리펩타이드 사이의 유사성은 본원에 기재된 항-CD47 항체, 또는 이의 항원 결합 단백질 중 어느 것을 구성하는 폴리펩타이드 중 어느 것과 적어도 95%, 또는 적어도 96% 동일성, 또는 적어도 97% 동일성, 또는 적어도 98% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 유사한 폴리펩타이드 중쇄 및/또는 경쇄 내에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 아미노산 치환은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 그룹)를 갖는 또다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질은 실질적으로 변화하지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성 또는 유사도는 치환의 보존적 성질을 수정하기 위해 상향으로 조정될 수 있다. 이러한 조정을 수행하는 수단은 당해 기술 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된 문헌을 참조한다 [참조: Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 시스테인 및 메티오닌인 황-함유 측쇄를 포함한다.
"벡터" 및 본원에 사용된 관련 용어는 외래 유전 물질 (예를 들면, 핵산 이식유전자)에 작동가능하게 링크될 수 있는 핵산 분자 (예를 들면, DNA 또는 RNA)를 언급한다. 벡터는 외래 유전 물질을 세포 (예를 들면, 숙주 세포) 내로 도입하는 비히클로서 사용할 수 있다. 벡터는 벡터 내로 이식유전자의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 항생물질 내성 또는 벡터-이식유전자 작제물을 보유하는 숙주 세포의 선택시 도움을 주는 선택가능한 특징을 부여하는 적어도 하나의 유전자 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 복제 서열의 하나 이상의 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 분자일 수 있다. 벡터는 선형 또는 환형 핵산 분자일 수 있다. 벡터의 하나의 유형이 "플라스미드"이고, 이는 이식유전자에 링크될 수 있는 선형 또는 환형 이중 가닥 염색체외 DNA 분자를 언급하고, 숙주 세포에서 복제, 및 이식유전자의 전사 및/또는 번역을 가능하게 할 수 있다. 바이러스 벡터는 전형적으로 이식유전자로 링크될 수 있는 바이러스 RNA 또는 DNA 주쇄 서열을 포함한다. 바이러스 주쇄 서열은 변형되어 감염을 불가하게 하지만, 숙주 세포 게놈 내로 바이러스 주쇄 및 공-링크된 이식유전자의 삽입을 유지할 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 바큘로바이러스, 파포바바이러스, 우두 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 엡스타인 바르 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제를 할 수 있다 (예를 들면, 복제의 세균 기원을 포함하는 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.
"발현 벡터"는 하나 이상의 조절 서열, 예를 들면, 유발성 및/또는 구성 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있는 벡터의 유형이다. 발현 벡터는 리보솜 결합 위치 및/또는 폴리아데닐화 위치를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 복제 서열의 하나 이상의 기원을 포함할 수 있다. 조절 서열은, 숙주 세포 내로 형질도입된 발현 벡터 내로 링크 또는 삽입된 이식유전자의 전사, 또는 전사 및 번역을 지시한다. 조절 서열(들)은 이식유전자의 발현의 수준, 시기 및/또는 위치를 제어할 수 있다. 조절 서열은, 예를 들면, 이식유전자에 직접적으로, 또는 하나 이상의 다른 분자 (예를 들면, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩타이드)의 작용을 통해 이의 효과를 발휘할 수 있다. 조절 서열은 벡터의 부분일 수 있다. 조절 서열의 추가 예는, 예를 들면, 문헌[참조: Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-3606]에 기재되어 있다.
이식유전자는 조절 서열이 이식유전자의 발현 (예를 들면, 발현의 수준, 시기, 또는 위치)에 영향을 주는 경우 조절 서열 (예를 들면, 프로모터)에 "작동가능하게 링크된다".
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 또는 본원에 사용된 다른 관련 용어는 외인 핵산 (예를 들면, 이식유전자)이 숙주 세포, 예를 들면, 항체 생산 숙주 세포 내로 이동 또는 도입되는 과정을 언급한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 숙주 세포는 외인 핵산 (이식유전자)으로 도입되는 것이다. 숙주 세포는 일차 대상자 세포 및 이의 자손을 포함한다. 본원에 기재된 항-CD47 항체 중 어느 것 중 적어도 일부를 암호화하는 외인 핵산을 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 본원에 기재된 항-CD47 항체 중 어느 것의 적어도 일부를 포함하는 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 숙주 세포는 항-CD47 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
이러한 정황에서, 숙주 세포는 폴리펩타이드-암호화 핵산으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있고, 이어서, 숙주 세포에서 발현될 수 있는 배양된 세포일 수 있다. 구절 "유전자삽입 숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"를 사용하여 발현되거나 발현되지 않은 핵산과 함께 도입 (예를 들면, 형질도입, 형질전환 또는 형질감염)되는 숙주 세포를 표시할 수 있다. 숙주 세포는 또한 핵산을 포함하지만 조절 서열이 숙주 세포 내로 도입되어 핵산으로 작동가능하게 링크되지 않는 경우 목적하는 수준으로 발현하지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포가 특정 대상자 세포 뿐만 아니라 또한 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 언급함을 이해하여야 한다. 특정 변형이 예를 들면, 돌연변이 또는 환경 영향 때문에 연속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 사실상, 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
따라서 본원에 사용된 용어 "숙주 세포" 또는 "또는 숙주 세포의 집단" 또는 관련 용어는 항체 또는 이의 단편의 생산을 위해 사용되는 세포 (또는 이의 집단 또는 다수의 숙주 세포)를 언급할 수 있고, 외래 (외인 또는 이식유전자) 핵산이 도입되어 예를 들면, 숙주 세포의 생산에 의해 항-CD47 항체의 생산을 지시하는 세포 또는 세포들이다. 외래 핵산은 이식유전자에 작동가능하게 링크된 발현 벡터를 포함할 수 있고, 숙주 세포를 사용하여 외래 핵산 (이식유전자)에 의해 암호화된 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 숙주 세포 (또는 이의 집단)는 배양된 세포일 수 있거나, 대상자로부터 추출될 수 있거나, 사람 대상자를 포함하는 유기체의 세포일 수 있다. 숙주 세포 (또는 숙주 세포의 집단)은 일차 대상자 세포 및 세대나 통과 수에 상관없이 이의 자손을 포함한다. 숙주 세포 (또는 이의 집단)는 불멸화 세포주를 포함한다. 자손 세포는 모 세포와 비교하여 동일한 유전 물질을 보유할 수 있거나 하지 않을 수 있다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포의 생산은 본원에 개시된 항체를 발현하는 임의의 방식으로 변형, 형질감염, 형질도입, 형질전환, 및/또는 조작된 임의의 세포 (이의 자손을 포함함)를 기술한다. 하나의 예에서, 숙주 세포 (또는 이의 집단)를 본원에 기재된 목적하는 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 링크된 발현 벡터로 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있다. 생산 숙주 세포 및 이의 집단은 숙주의 게놈 내로 안정화게 통합되는 발현 벡터를 보유할 수 있거나, 염색체외 발현 벡터를 보유할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포 및 이의 집단은 수회 세포 분열 후 존재하거나 일시적으로 존재하고 수회 세포 분열 후 상실되는 염색체외 벡터를 보유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상자"는 척추동물, 포유동물, 및 비-포유동물를 포함하는 사람 및 비-사람 동물을 언급한다. 하나의 실시형태에서, 대상자는 사람, 비-사람 영장류, 원숭이, 유인원, 뮤린 (예를 들면, 마우스), 소, 돼지, 말, 개, 고양이, 염소, 이리, 또는 물고기일 수 있다.
용어 "투여하는", "투여된" 및 문법적 변형은 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 어느 것을 사용하여 대상자에게 제제의 물리적 도입을 언급한다. 본원에 개시된 제형을 위한 예시적인 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들면 주사 또는 주입에 의한 경로를 포함한다. 본원에 사용된 구절 "비경구 투여"는 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 보통 주사를 의미하고, 제한없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 림프관내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공법을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 제형은 비-비경구 경로, 예를 들면, 경구를 통해 투여된다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들면, 비강내, 질, 직장, 설하 또는 국소를 포함한다. 투여는 또한, 예를 들면, 1회, 복수회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간 동안 수행될 수 있다. 본원에 기재된 항-CD47 항체 중 어느 것 (또는 본원에 개시된 종양 항원 결합 항체)는 당해 기술에 공지된 방법 및 전달 경로를 사용하여 대상자에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량", "치료학적 유효량" 또는 "유효 용량" 또는 관련 용어는 상호교환적으로 사용할 수 있고, 대상자에게 투여되는 경우, 종양 또는 암 항원 발현과 연관된 질환 또는 장애의 측정가능한 개선 또는 예방을 야기하는데 충분한 항체 또는 항원 결합 단백질 (예를 들면, 본원에 기재된 항-CD47 항체 중 어느 것 또는 본원에 기재된 종양 항원-결합 항체)의 양을 언급한다. 본원에 제공된 항체의 치료학적 유효량은, 단독 또는 병용하여 사용되는 경우, 항체 및 병용물의 상대적 활성 (예를 들면, 세포 성장의 억제시)에 좌우되어 및 치료되는 대상자 및 질환 상태, 대상자의 체중 및 연령 및 성별, 대상자에서 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 좌우되어 가변적일 것이고, 당해 기술 분야의 통상의 숙련가가 용이하게 결정할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 치료학적 유효량은 치료될 대상자의 특정 양상 및 치료될 장애에 좌우될 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드를 대상자에게 1일당 약 0.01 g/kg - 50 mg/kg, 1일당 약 0.01 mg/kg - 30 mg/kg, 또는 1일당 약 0.1 mg/kg - 20 mg/kg으로 투여될 수 있다. 폴리펩타이드를 매일 (예를 들면, 1일 1회, 2회, 3회 또는 4회) 또는 덜 빈번하게 (예를 들면, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월, 또는 분기마다) 투여할 수 있다. 추가로, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 연령 뿐만 아니라 체중, 일반적 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시기, 약물 상호작용, 및 질환의 중증도에 따른 조정이 필수적일 수 있다.
항체 병용물
적어도 2개의 항체를 포함하는 조성물이 본원에 제공되고, 여기서, 하나의 항체는 CD47의 Fcγ 수용체 (예를 들면, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII)로의 결합을 차단하는 항-CD47 항체이고, 조성물의 두번째 항체는 종양 항원에 특이적으로 결합하고, Fc 영역을 포함한다.
항-CD47 항체는 본원에 기재된 것, 예를 들면, 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-CD47 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 C47A8-CL 항체 (US 10,035,855, 본원에 참조로서 포함됨) 또는 서열번호 1과 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2와 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 이의 변종이다. 항-CD47 항체는 IgG2 또는 IgG4 항체일 수 있고, 예를 들면 IgG4 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 Fc 영역에서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들면 Fcγ 수용체와의 상호작용을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이, 및/또는 항체 반감기를 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG1 항체이다. 항체의 Fc 영역의 이의 수용체 (예를 들면, FcγRs)와의 상호작용을 감소 또는 제거하는 돌연변이는, 제한없이 L234A; L235A 또는 L235E; N297A, N297Q, 또는 N297D; 및 P329A 또는 P329G를 포함한다. 예를 들면, 항-CD47 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A (LALA)를 포함할 수 있다.
일부 대안적인 실시형태에서, 항-CD47 항체는 단쇄 항체, 예를 들면, 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 ScFv일 수 있다. 추가 실시형태에서, 항-CD47 항체는 항체의 Fab 단편, 예를 들면, 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 IgG 항체의 Fab 단편일 수 있다.
종양 항원에 결합하고 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 영역을 포함하는 항체는, 예를 들면, IgG1 항체는 임의로, 항체-의존 세포 세포독성 (ADCC) 또는 다른 메카니즘을 통해 면역체계에 의해 파괴하기 위해 결합하는 세포를 마킹하는 옵소닌화 항체일 수 있다. 종양 항원-결합 항체는 고형 또는 액상 종양에서 발현되는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 항체는 CD19, CD20, CD33, CD38, PD-L1, 또는 SLAMF7에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 항-CD20 항체는, 비제한적인 예로서, 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 또는 우블리툭시맙, 또는 도 22에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 갖는 항-CD20 항체 중 어느 것일 수 있다. 항-CD38 항체는, 비제한적인 예로서, 다라투무맙 (Darzalex) 또는 도 23에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 갖는 항-CD38 항체 중 어느 것 또는 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된 US 10,059,774, US 9,951,144, 또는 WO 2019/245616에 개시된 어느 것일 수 있다. PD-L1 항체는, 비제한적인 예로서, 두르발루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 본원에 참조로서 포함된 US 9,175,082에 기재된 항-PD-L1 항체 중 어느 것일 수 있다.
본원 개시내용의 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체 및 항체 단편)를 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 예에서, 폴리펩타이드를, 숙주 세포 내로 도입되고 발현 촉진 조건하에 숙주 세포에 의해 발현되는 재조합 발현 벡터 내로 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 (예를 들면, DNA)을 삽입하여 재조합 핵산 방법에 의해 제조한다.
재조합 DNA는 또한 임의로 단백질을 정제하기 위해 유용할 수 있는 임의의 유형의 단백질 태그 서열을 암호화할 수 있다. 단백질 태그의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 히스티딘 (his) 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, 또는 GST 태그를 포함한다. 세균, 진균, 효모, 및 포유류 세포 숙주을 사용하는 적합한 클로닝 및 발현 벡터를 문헌[참조: Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985)]에서 발견할 수 있다.
발현 벡터 작제물을 숙주 세포, 예를 들면, 생산 숙주 세포 내로, 숙주 세포에 적합한 방법을 사용하여 도입할 수 있다. 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 다양한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 전기천공법; 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 이용하는 형질감염; 바이러스 형질감염; 비-바이러스 형질감염; 미세투사물 충격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들면, 여기서 벡터는 바이러스 벡터이다)을 포함한다.
적합한 세균은 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜리(E. coli) 또는 바실루스 종(Bacillus spp.)을 포함한다. 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces) 종으로부터의 효모, 예를 들면, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)를, 또한 폴리펩타이드의 제조를 위해 사용할 수 있다. 다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템을 또한 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 제조를 위한 바쿨로바이러스(Baculovirus) 시스템을 문헌[참조: Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)]에서 검토하였다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), 사람 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T, 및 BHK 세포주를 포함한다. 정제된 폴리펩타이드를 재조합 단백질을 발현하기 위한 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양하여 제조한다. 다수의 적용을 위해, 이. 콜리 숙주 세포는 소 폴리펩타이드를 발현하기 위해 적합하다. 이어서, 단백질은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제될 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단백질은 또한 세포-번역 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은, 시험관내 전사를 가능하게 하여 mRNA를 생산하고, mRNA의 무세포 번역을 이용되는 특정 무세포 시스템 (진핵, 예를 들면, 포유류 또는 효모 무세포 번역 시스템 또는 원핵, 예를 들면, 세균 무세포 번역 시스템)에서 가능하게 하도록 변형되어야 한다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩타이드 중 어느 것을 암호화하는 핵산을 화학적으로 또는 유전자 합성 방법을 사용하여 합성할 수 있다 (예를 들면 시판되는 기업을 통해 이용가능함, 예를 들면, Blue Heron, DNA 2.0, GeneWiz 등). 코돈 용법은 세포에서 발현을 개선시기 위해 선택될 수 있다. 이러한 코돈 용법은 생산 숙주 세포 유형에 좌우될 것이다. 특정 코돈 용법 패턴은 이. 콜리 및 다른 세균, 뿐만 아니라 포유류 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대해 개발되었다. 예를 들면: 문헌을 참조한다 [참조: Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 100(2):438-42; Sinclair et al. Protein Expr. Purif. 2002 (1):96-105; Connell N D. Curr. Opin. Biotechnol. 2001 12(5):446-9; Makrides et al. Microbiol. Rev. 1996 60(3):512-38; and Sharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78].
본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단백질은 또한 화학적 합성에 의해 (예를 들면, 문헌[참조: Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.)에 기재된 방법에 의해) 제조될 수 있다. 단백질에 대한 변형은 또한 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단백질은 단백질 화학 분야에 일반적으로 공지된 단백질의 단리/정제 방법으로 정제될 수 있다. 비-제한적인 예는 추출, 재결정화, 염석 (예를 들면, 암모늄 설페이트 또는 나트륨 설페이트를 사용함), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡수 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 침투 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 전기영동, 역류 분배법 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 정제 후, 폴리펩타이드는 상이한 완충액으로 교환되고/되거나, 이에 제한되는 것은 아니지만, 여과 및 투석를 포함하는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 어느 것으로 농축될 수 있다.
본원에 기재된 정제된 항체 및 항원 결합 단백질은 적어도 65% 순도, 적어도 75% 순도, 적어도 85% 순도, 적어도 95% 순도, 또는 적어도 98% 순도일 수 있다. 순도의 정확한 수치 값에 상관없이, 폴리펩타이드는 약제학적 제품으로서 용도를 위해 충분히 순수하다. 본원에 기재된 항-CD47 항체 또는 종양 항원-결합 항체 중 어느 것은 유전자삽입 숙주 세포에 의해 발현되고, 이어서, 당해 기술에 공지된 방법을 사용하여 약 65-98% 순도 또는 높은 수준의 순도로 정제될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단백질은 추가로 번역-후 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 번역-후 단백질 변형은 인산화, 아세틸화, 메틸화, ADP-리보실화, 유비퀴틴화, 글리코실화, 카보닐화, 수모일화, 비오티닐화 또는 폴리펩타이드 측쇄 또는 소수성 그룹의 참가를 포함한다. 결과적으로, 변형된 폴리펩타이드는 비-아미노산 요소, 예를 들면, 지질, 폴리- 또는 모노-삭카라이드, 및 포스페이트를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 글리코실화의 형태는 시알릴화일 수 있고, 이는 하나 이상의 시알산 모이어티를 폴리펩타이드에 접합한다. 시알산 모이어티는 용해도 및 혈청 반감기를 개선시키는 반면, 또한 단백질의 가능한 면역원성을 감소시킨다. 문헌을 참조한다 [참조: Rajuetal. Biochemistry 2001 31; 40:8868-76].
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단백질을 변형시켜 이들의 용해도 및/또는 혈청 반감기를 증가시킬 수 있고, 이는 항체 및 항원 결합 단백질을 비-단백질성 중합체에 링크시킴을 포함한다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌을, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 항원-결합 단백질에 접합할 수 있다.
용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"를, 크기 또는 PEG의 말단에서 변형에 상관없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하도록 광범위하게 사용하고, 화학식: X-O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH (1)로 나타낼 수 있고, 상기 화학식에서, n은 20 내지 2300이고, X는 H 또는 말단 변형, 예를 들면, C1-4　알킬이다. 하나의 실시형태에서, PEG는 각 말단에서 하이드록시 또는 메톡시로 말단화되고, 즉, X는 H 또는 CH3 ("메톡시 PEG")이다. PEG는, 결합 반응에 필수적이거나; 분자의 화학적 합성으로부터 야기되거나; 분자의 부분의 최적 거리를 위한 스페이서인 추가 화학적 그룹을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 PEG는 함께 링크된 하나 이상의 PEG 측-쇄로 이루어질 수 있다. 하나 초과의 PEG 쇄를 갖는 PEGs는 다중팔(multiarmed) 또는 분지형 PEGs로 칭명된다. 분지형 PEGs는, 예를 들면, 폴리에틸렌 옥사이드를 글리세롤, 펜타에리트리톨, 및 소르비톨을 포함하는 다양한 폴리올에 부가하여 제조할 수 있다. 분지형 PEG 분자는 예를 들면, EP-A 0 473 084 및 미국 특허 번호 5,932,462에 기재되어 있다. PEGs 중 하나의 형태는 리신의 일차 아미노 그룹을 통해 링크된 2개의 PEG 측-쇄 (PEG2)를 포함한다 (참조: Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69).
약제학적 조성물
본원 개시내용은 1) 본원에 기재된 항-CD47 항체 중 어느 것 및 2) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체를, 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 본원에 개시된 항-CD47 항체를 포함하고, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (항체 STI-6643의 중쇄 가변 영역) 및 서열번호 2와의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 (항체 STI-6643의 경쇄 가변 영역)을 포함한다. 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 본원에 기재된 것일 수 있고, 여기서, 항체는 Fcγ 수용체를 결합할 수 있는 Fc 영역을 포함한다.
약제학적 조성물은 제조 및 저장 조건하에 멸균성이고 안정하게 제조될 수 있다. 본원에 제공된 항원-결합 단백질은 예를 들면, 전달 전에 또는 전달 시점에 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 재구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 대안적으로, 항원-결합 단백질은 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제를 갖는 용액일 수 있거나, 약제학적으로 허용되는 부형제는 전달 전에 또는 전달 시점에 첨가 및/또는 혼합하여 예를 들면 주사가능한 형태의 단위 투여량을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용되는 부형제는 높은 약물 농도에 적합하고, 적합한 유동성을 유지할 수 있고, 일부 실시형태에서, 흡수를 지연시킬 수 있다.
부형제는 담체 및 안정화제를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 예는, 예를 들면 불활성 희석제 또는 필러 (예를 들면, 수크로스 및 소르비톨), 완충제, 안정화제, 보존제, 비-이온성 세제, 항산화제, 및 등장화제를 포함한다. 제형의 유형 및 전달 방법에 좌우되어, 부형제는 윤활제, 활주제, 및 항-부착제 (예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수소화 식물성유, 또는 탈크)를 포함할 수 있다.
치료학적 조성물 및 이를 제조하기 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌에서 발견된다 [참조: "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)]. 치료학적 조성물은 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있고, 예를 들면, 부형제, 멸균수, 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기원 오일, 또는 수소화 나프탈렌을 포함할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜라이드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 본원에 기재된 항체 (또는 이의 항원 결합 단백질)의 방출을 제어하기 위해 사용할 수 있다. 나노입자 제형 (예를 들면, 생분해성 나노입자, 고형 지질 나노입자, 리포솜)을 항체 (또는 이의 항원 결합 단백질)의 생물학적 분배를 제어하기 위해 사용할 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포솜을 포함한다. 항체 (또는 이의 항원 결합 단백질)의 제형 중 농도는 투여되는 약물 투여량, 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 좌우되어 다양한다.
본원에 개시된 항-CD47 항체 및 항-종양 항체 중 어느 것은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 약제 산업에서 통상 사용되는 비-독성 산 부가 염 또는 금속 착물로서 임의로 투여될 수 있다. 산 부가 염의 예는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 락트산, 팔모산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 석신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타르타르산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 또는 트리플루오로아세트산 등; 중합체산, 예를 들면, 탄산, 카복시메틸 셀룰로스 등; 및 무기산, 예를 들면, 염화수소산, 수소화브롬산, 황산 인산 등을 포함한다. 금속 착물은 아연, 철 등을 포함한다. 하나의 예에서, 항체 (또는 이의 항원 결합 부분)를 나트륨 아세테이트의 존재하에 제형화하여 열 안정성을 증가시킨다.
본원에 개시된 항-CD47 항체 및 항-종양 항체 중 어느 것을 경구 사용을 위해 제형화할 수 있고, 비-독성 약제학적으로 허용되는 부형제와의 혼합물 중 활성 성분(들)을 포함하는 정제를 포함한다. 경구 사용을 위한 제형은 또한 씹을 수 있는 정제로서, 또는 활성 성분이 불활성 고형 희석제와 혼합된 경성 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질과 혼합된 연성 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
본원에 개시된 항-CD47 항체 및 종양 항원에 특이적으로 결합하고 Fc 영역을 포함하는 항체를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 항체는 함께, 예를 들면 혼합물로 제공될 수 있거나, 개별적인 바이알, 앰풀, 패킷, 또는 다른 용기에 제공될 수 있다. 키트는 추가로 항체 중 하나 또는 둘 다를 재현탁 또는 희석하기 위한 하나 이상의 멸균성 약제학적으로 허용되는 용액을 포함할 수 있고, 비제한적인 예로서, 추가 항체 중 어느 것, 진통제, 또는 항생물질일 수 있는 하나 이상의 추가 약제학적 제형을 포함할 수 있다. 키트를 암을 갖는 대상자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 키트의 성분은 적합한 용기에 제공할 수 있고, 암의 치료를 위해 라벨을 붙일 수 있다. 상기-언급된 성분은 단위 또는 다중-용량 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀, 바이알, 병, 시린지, 및 시험관에, 수성, 바람직하게는 멸균성, 용액으로서 또는 재구성을 위한 동결건조된, 바람직하게는 멸균성, 제형으로서 저장될 수 있다. 용기는 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있고, 멸균성 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 피하 주사 니들에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 키트는 추가로, 약제학적으로 허용되는 완충액, 예를 들면, 포스페이트-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 추가 용기를 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 견해에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있고, 여기에는 다른 완충액, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 적합한 숙주의 하나 이상을 위한 배양 배지가 포함된다. 예를 들면, 적응증, 용법, 투여량, 제조, 투여, 금기 및/또는 이러한 치료학적, 예방적 또는 진단적 제품의 사용에 관련된 경고에 대한 정보를 포함하는 치료학적, 예방적 또는 진단적 제품의 시판 패키지에 통상 포함되는 지시서가 키트와 관련될 수 있다.
치료 방법
본원 개시내용은 하나 이상의 종양-연관된 항원의 발현 또는 과-발현과 연관된 질환/장애를 갖는 대상자를 치료하는 방법을 제공한다. 질환은 종양-연관된 항원, 예를 들면, CD38 또는 CD20 항원을 발현하는 암 또는 종양 세포를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 암 또는 종양은 전립샘, 유방, 난소, 두경부, 방광, 피부, 결장직장, 항문, 직장, 췌장, 폐 (비-소세포 폐 및 소세포 폐 암을 포함함), 평활근종, 뇌, 신경아교종, 아교모세포종, 식도, 간, 신장, 위, 결장, 자궁목, 자궁, 자궁내막, 외음, 후두, 질, 뼈, 비강, 부비동, 코인두, 구강, 입인두, 후두, 하후두, 침샘, 요관, 요도, 음경 및 고환의 암을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 암은, 백혈병, 림프종, 골수종, 및 B 세포 림프종을 포함하는 혈액 암을 포함한다. 혈액암은 다발 골수종 (MM), 버킷 림프종 (BL)을 포함하는 비-호지킨 림프종 (NHL), B 만성 림프구성 백혈병 (B-CLL), 전신 홍반 루푸스 (SLE), B 및 T 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 만성 골수성 백혈병 (CML), 털세포 백혈병 (HCL), 소포 림프종, 발덴스트롬마크로글로불린혈증, 맨틀 세포 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 혈장 세포 골수종, 전구체 B 세포 림프모구 백혈병/림프종, 형질세포종, 거대 세포 골수종, 혈장 세포 골수종, 중-쇄 골수종, 경쇄 또는 벤스-존스 골수종, 림프종모양육아종증, 이식-후 림프구증식 장애, 면역조절 장애, 류마티스관절염, 중증근육무력증, 특발 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병, 그레이브병, 베게너육아종증, 결절다발동맥염, 쇼그렌 증후군, 보통천포창, 공피증, 다발경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 관련 혈관염, 굿파스처병, 가와사키병, 자가면역 용혈 빈혈, 및 급속 진행 사구체신염, 중-쇄 질환, 원발성 또는 면역세포-연관된 아밀로이드증, 및 미결정 중요성의 모노클로날 감마글로불린병증을 포함한다.
상기 방법은 치료학적 유효량의 CD47 항원에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 항원에 결합하는 두번째 항체를 대상자에게 투여함을 포함하고, 여기서, 첫번째 항체는 CD47 항원에 결합하고, CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하고, 두번째 항체는 종양 세포에 결합하고, 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함한다. 암은 CD47을 과발현하는 암일 수 있다.
암 세포의 집단에서 적어도 하나의 암 세포를 사멸시키는 방법이 또한 포함되고, 여기서, 적어도 하나의 암 세포는 CD47 항원을 과발현하고, 상기 방법은: 적어도 하나의 암 세포를 치료학적 유효량의 CD47 항원에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 종양 항원에 결합하는 두번째 항체와 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 첫번째 항체는 CD47 항원에 결합하고, CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하고, 두번째 항체는 종양 세포에 결합하고, 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함한다.
상기 방법은 본원에 개시된 CD47 항체 중 어느 것, 예를 들면, STI-6643 항체 및 이의 변종을 사용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, CD19, CD20, CD38, SLAMF7, 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 본원에 개시된 것들을 포함하는 임의의 종양 표적화 항체를 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양 표적화 항체, 예를 들면, 항-CD38 또는 항-CD20 항체에 부가하여 본원에 제공된 CD47 항체의 병용물을 사용한 암을 갖는 대상자의 치료는, 종양 표적화 항체 단독 또는 CD47 항체 단독으로 암을 갖는 대상자를 치료하는 것에 비해 상승 효과를 가질 수 있다. 상승 효과는 비제한적인 예로서 종양 용적의 감소 또는 증가된 생존일 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양 표적화 항체 및 본원에 제공된 CD47 항체, 즉, STI-6643, 또는 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체의 병용물로 암을 갖는 대상자의 치료는, 제한없이, 동일한 종양 표적화 항체 및 상이한 항-CD47 항체를 사용하는 환자의 치료보다 더 적은 빈혈, 지속되는 헤모글로빈 농도, 적혈구의 감소된 적혈구응집 및/또는 건강한 면역 세포의 감소를 포함하는 더 적은 독성을 대상자에게 야기할 수 있다.
일부 실시형태에서, CD47에 특이적으로 결합하는 항체의 투여는 경구 전달에 의한 투여일 수 있다. 경구 투여량 형태는, 예를 들면, 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁제, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멀젼, 경성 캡슐, 연성 젤라틴 캡슐, 시럽 또는 엘릭서제, 알약, 드라제, 액제, 겔, 또는 슬러리로 제형화될 수 있다. 이들 제형은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 불활성 희석제, 예를 들면, 칼슘 카보네이트, 나트륨 카보네이트, 락토스, 칼슘 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트; 과립화제 및 붕해제, 예를 들면, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들면, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 윤활제, 예를 들면, 칼슘 스테아레이트, 글리세릴 베헤네이트, 수소화 식물성유, 마그네슘 스테아레이트, 광유, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 스테아릴, 푸마레이트, 스테아르산, 탈크, 아연 스테아레이트; 보존제, 예를 들면, n-프로필-p-하이드록시벤조에이트; 착색제, 향미제 또는 감미제, 예를 들면, 수크로스, 사카린, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 또는 소르비톨; 식물성유, 예를 들면, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일; 광유, 예를 들면, 액체 파라핀; 습윤제, 예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 도쿠세이트 나트륨, 레시틴, 폴록사머, 나트륨 라우릴 설페이트, 소르비탄 에스테르; 및 증점제, 예를 들면, 한천, 알긴산, 밀랍, 카복시메틸 셀룰로스 칼슘, 카라기난, 덱스트린 또는 젤라틴을 포함하는 약제학적 부형제를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 투여는 주사 또는 정맥내 또는 동맥내 전달에 의한 투여일 수 있고, 예를 들면, 표피, 진피내, 피하, 근육내, 복강내, 흉강내, 복강내, 또는 강내 전달에 의한 투여일 수 있다. 비경구 투여용 제형은 그 중에서도 수성 또는 비-수성 등장성 멸균성 비-독성 주사 또는 주입 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 바람직한 비경구 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막외, 및 근육내 주사 또는 주입을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 사용되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 비-독성인 제제, 예를 들면, 1,3-부탄디올, 링거 용액, 행크스 용액, 등장성 나트륨 클로라이드 용액, 오일, 예를 들면, 합성 모노- 또는 디글리세라이드 또는 지방 산, 예를 들면, 올레산, 국소 마취제, 보존제, 완충액, 점도 또는 용해도 향상 제제, 수용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 비설페이트, 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 설파이트 등, 오일-가용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등, 및 금속 킬레이트제, 예를 들면, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 적혈구에 대한 더 높은 정도의 결합을 나타내는 다른 항체로 처리된 환자보다 더 낮은 독성을 야기한다.
실시예
하기 실시예는 예시하는 것을 의미하고, 본원 개시내용의 실시형태를 추가로 이해하기 위해 사용될 수 있고, 어떠한 방식으로든 본 교시의 범위를 한정하는 것으로 간주하여서는 안된다.
실시예 1. STI-6643은 경쟁자 항체 Hu5F9와 비교하여 급격하게 감소된 적혈구응집을 나타낸다.
적혈구 (RBCs)의 제조: 말초 혈액을 건강한 사람 공여자로부터 입수하였다. 4 mL의 혈액을 15 mL 원뿔형 튜브로 피펫팅하고, 1X PBS로 실온 (RT)에서 마무리하였다. 세포를 800 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 튜브의 바닥에서 RBCs를 교란시키지 않고 흡인하고, 12ml의 1X PBS를 첨가하였다. 세포를 튜브를 뒤집어서 혼합하였다. 세포를 800 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 세척을 두번 반복하였다. 상청액을 혈액 세포를 교란하지 않고 최종 세척 후 흡인하고, 충분한 1X PBS를 첨가하여 RBCs의 10% 용액 (이 용액은 1 주일 동안 사용가능함)을 제조하였다. 최종 작동 용액을 제조하기 위해 RBCs의 1X PBS 중 10% 용액을 희석하여 0.5% 용액을 수득하였다.
적혈구응집 검정을 위해, 0.5% RBCs 작동 용액을 튜브를 뒤집어서 혼합하였다. 0.5% RBCs 작동 용액을 U형-바닥 96-웰 플레이트 RT의 각각의 웰 (50 μL)에 첨가하였다. 다음 항체를 이러한 검정에 사용하였다: STI-6643, 항-CD47 IgG4 Hu5F9, 및 이소형 IgG4 대조군. 항체의 연속 희석물을 1X PBS 중 초저 부착 96-웰 플레이트에서 제조하였다 (75 μg/mL에서 시작하는 2-배 희석물). 항체 희석물 (100 μL/웰)을 RBCs(최종 출발 항체 농도: 50 μg/mL)를 포함하는 플레이트 내로 이동시키고, 다채널 피펫으로 수회 서서히 혼합하였다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 (5% CO2, 37℃) 내로 약 20시간 인큐베이션 동안 위치시켰다. 음성 결과 (적혈구응집 없음)는 둥근-바닥 플레이트의 중심에 적색 점으로 나타난다. 양성 결과 (적혈구응집)는 웰에 걸쳐서 균일한 적색을 형성할 것이다.
도 1은 상응하는 웰의 가시적 외관에 대한 응집 및 응집 없음의 도식을 제공한다. 항체 Hu5F9는 50 μg/mL 내지 0.05 μg/mL의 항체 농도에 상응하는 웰에서 응집을 나타내고, 응집은 0.012 μg/mL 및 그 아래의 항체 농도에서는 나타나지 않는다. 대조적으로, STI-6643 (50 μg/mL)의 최고 항체 농도에서조차, 응집은 나타나지 않는다.
실시예 2. STI-6643은 용량-의존 방식으로 사람 CD47 / SIRPα 상호작용을 차단한다.
STI-6643의 T 림프모구 백혈병 세포주 CCRF-CEM의 세포로의 결합이 세포의 SIRPα (CD47에 대한 수용체)로의 결합을 차단할 수 있는지를 측정하기 위해, CCRF-CEM 세포 (50 μL /웰 중 20,000 세포)를 항-CD47 (클론 STI-6643 또는 Hu5F9) 또는 이소형 IgG4 대조군 항체 중 어느 하나로 400 내지 0.18 μg/mL 범위의 농도에서 FACS 완충액 (1X PBS+2% FCS) 중에서 인큐베이팅하고, 15 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세척 없이, 정제된 SIRPα-Fc 융합 단백질 (R&D system; Cat#4546-SA-050)을 각각의 웰에 0.4 μg/mL (50 μL/웰)의 농도에서 FACS 완충액 중에서 첨가하고 (37℃에서 유지됨), 인큐베이션을 또다른 20 분 동안 37℃에서 계속하였다. 이어서, CCRF-CEM 세포를 524 g에서 2 분 동안 실온 (RT)에서 원심분리하여 3회 세척하고, 매회 170 μL/웰의 RT FACS 완충액 중에서 재현탁하였다. SIRPα-Fc 융합 단백질의 CCRF-CEM 세포로의 결합을 드러내기 위해, PE-표지화된 항-SIRPα 항체 (R&D system; Cat#FAB4546P)를 5 μL/웰에서 70 μL의 RT FACS 완충액 중에서 사용하였다. 세포를 20 분 동안 RT에서 암실에서 인큐베이팅하였다. 이어서, CCRF-CEM 세포를 524 g에서 2 분 동안 실온 (RT)에서 원심분리하여 2회 세척하고, 매번 170 μL/웰의 RT FACS 완충액 중에서 재현탁하였다. 샘플을 유세포분석에 의해 즉시 획득하고, FlowJo를 사용하여 분석하였다.
도 2B는 IgG4 이소형 대조군 항체의 첨가가 SIRPα의 CCRF-CEM 세포로의 결합에 영향을 주지 않음을 나타낸다 (상부 곡선은 용량 의존성을 나타내지 않는다). 반대로, CCRF-CEM 세포에 첨가되는 경우 STI-6643의 강력한 용량 의존성이 존재하고, STI-6643 항체의 농도를 증가에 따라 SIRPα의 CCRF-CEM 세포로의 결합을 강력하게 감소시켰다 (곡선은 MFI > 4,000 내지 1,000 미만의 그래프에 걸쳐서 사선으로 감소한다). Hu5F9 항체는 SIRPα의 CCRF-CEM 세포로의 결합을 1 μg/mL 이상의 항체 농도에서 강력하게 억제한다..
실시예 3. STI-6643은 용량-의존 방식으로 종양 세포의 포식작용을 촉진한다.
10% FBS 및 항생물질이 보충된 50 μL의 RPMI 1640 중 10,000 RAJI-GFP 세포를 실온 (RT)에서 평평한 바닥 96 웰 플레이트 내로 이동시켰다. 항체 (STI-6643, Hu5F9, 및 이소형 IgG4)를 400 μg/mL의 농도로 출발하여 연속 희석하였다. 항체 희석물 (50 μL)을 종양 세포를 포함하는 웰에 첨가하였다.
ADCP 검정에 대해, 2명의 건강한 사람 공여자로부터 입수한 말초 혈액을 PBMCs (CD14+ 포식세포 함유)를 위한 공급원으로서 사용하였다. 100 μL 중 30,000 PBMCs를 각각의 웰에서 PBMCs 대 Raji 세포의 3:1 비를 위해 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 혼합하고, 1 분 동안 1,500 rpm에서 회전시키고, 유세포분석에 의한 분석을 위해 수거하기 전에 웰을 90 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다.
비부착성 세포를 96-웰 V형 바닥 플레이트에 이동시키고, 플레이트를 3 분 동안 1,500 rpm에서 회전시키고, 세포를 100 μl FACS 완충액(PBS 2% FBS, 2 mM EDTA) 중에 4℃에서 재현탁시켰다. 100 μL Tryple (Thermo Fisher, cat. 12604013)을 첫번째 플레이트에 첨가하여 남아있는 비부착성 세포를 탈착하고, 이들 세포를 비부착성 세포를 포함하는 V형 바닥 플레이트에 이동시켰다. 1,500 rpm에서 3 분 원심분리 후, FACS 완충액 중 희석된 100 μL의 항-CD14-PE 함유 염색 혼합물 (90 μL로 1.5 μL/웰)에 재현탁시킨 후, 세포를 15 분 동안 4℃에서 인큐베이팅하고, 이어서, 100 μL FACS 완충액으로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 100 μL의 고정 완충액 (Biolegend, cat. 420801) 중에 20 분 동안 4℃에서 재현탁시켰다. 100 μL FACS 완충액을 직접적으로 첨가하고 (최종 용적 200 μL), 유세포분석기에서 작동시킨다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 도 3은 이소형 IgG4의 존재하에 포식작용이 용량 의존 방식으로 증가하지 않고, 약 35% 내지 40% 사이에 유지됨을 나타낸다. 항체 STI-6643이 검정에서 사용되는 경우, % 포식작용의 큰 증가가 대략적으로 10-9의 항체 농도에서 시작하여 증가되는 항체의 농도로서 관찰되었다. Hu5F9 항체는 또한 용량-의존을 나타내고, 대략적으로 10-10의 항체 농도에서 시작하여 관찰되는 포식작용이 신속하게 상승되고 약 10-8의 농도에서 평준화되었다.
실시예 4. 준최적 용량에서 병용한 경우 STI-6643은 리툭시맙-유발된 포식작용을 개선시킨다.
CD14+ 세포를 사람 PBMCs으로부터 단리하고, 세포를 20% FBS, 항생물질 및 20 ng/mL M-CSF로 보충된 RPMI-1640에서 배양하여 마크로파지 내로 분화하였다. 세포를 평평한 바닥 96-웰 플레이트 (30,000 세포 웰당 100 μL)에 플레이팅하고, 7일 동안 또는 차이가 관찰될 때까지 인큐베이팅하였다. 배지를 2-3일마다 완전한 배지로 다시 채웠다.
10% FBS 및 항생물질로 보충된 50 μL의 RPMI 1640 중 60,000 RAJI-GFP 세포를 실온 (RT)에서 U형-바닥 96 웰 플레이트 내로 이동시켰다. 항체를 STI-6643에 대해 10 μg/mL 및 리툭시맙에 대해 2.5, 5, 또는 10 ng/mL의 최종 희석으로 연속 희석하였다. 50 μL의 항체를 종양 세포 함유 웰에 첨가하였다.
ADCP 검정을 100 μL의 RAJI-항체 혼합물을 평평한 바닥 96-웰 플레이트에서 사람 마크로파지의 상부에서 이동시켜 시작하였다. 세포 및 항체를 혼합하고, 1 분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하고, 유세포분석에 의한 분석을 위해 수거하기 전에, 플레이트를 30 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 20 분 후 1 μL의 항-CD11b-PE를 각각의 웰에 첨가하였다.
유세포분석을 위해, 비부착성 세포를 96-웰 V형-바닥 플레이트 내로 이동시키고, 3 분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하고, 100 μl FACS 완충액 (PBS 2% FBS 2 mM EDTA)에서 4℃에서 재현탁하였다. 아쿠타제 (150 μL) (Fisher Scientific, cat. NC9839010)를 평평한 바닥 플레이트에 첨가하여 남아있는 비부착성 세포를 탈착하고, 세포를 피펫팅하고, 비부착성 세포를 포함하는 V형 바닥 플레이트에 이동시켰다. 세포를 5 분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하고, 150 μL/웰의 안정화 고정제 (Fisher Scientific, cat. 338036) 중에 재현탁시켰다. 데이터를 유세포분석기 상에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 4는 항-CD20 항체 리툭시맙 (유색을 칠한 막대) 및 항-CD47 항체 (흑색을 칠한 막대)가 개별적으로 투여되는 경우 각각 포식작용을 유발함을 나타낸다. 항-CD20 항체 및 항-CD47 항체가 함께 투여되는 경우 (흑색 사선이 그어진 막대), 항-CD20 항체 단독의 사용에 대해 포식작용의 향상이 있다. 항-CD20 항체의 최저 농도에서, STI-6643가 포함되는 경우 포식작용의 향상이 가장 크고, 항-CD20이 자체로 사용되는 경우 관찰되는 대략적으로 2배의 포식작용을 야기하였다.
실시예 5. STI-6643은 전임상 마우스 모델에서 Hu5F9와 비슷한 항-종양 활성을 나타낸다.
루시퍼라제 발현 Raji 세포 (RAJI-Fluc)로 정맥내 이식된 폭스 체이스(Fox Chase) SCID 마우스 (이소형 IgG4에 대해 n=8; Hu5F9에 대해 n=5 및 STI-6643 그룹에 대해 n=15)를 30 mg/kg의 지시된 항체로 1주일에 3회 연속 2 주 동안 RAJI-Fluc 종양 접종 후 7일째에 시작하여 처리하였다. 종양 세포 접종 후 7 내지 48일째에 대표적인 마우스의 루시퍼라제 영상 (도 5a) 및 개별적인 마우스에 대한 발광 데이터 (도 5b) 또는 생존 감소 전 d22까지만 플롯팅된 총 플럭스 값의 평균 +/- SD (도 5c)를 나타낸다. 통계적 유의성을 2-원 ANOVA로 평가하고, 여기서, 각각의 가로줄(row)은 상이한 시점 (따라서 매치 값은 가로줄에 따라서 펼쳐진다)을 나타내고, 컬럼 평균 (주요 컬럼 효과)을 비교하고 터키 비교 검정을 사용하여 다중 비교에 대해 보정하고, 개별적인 분산을 각 비교에 대해 산출하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 분석을 수행하였다 (도 5d). 각각의 그룹을 다른 2개의 그룹과 비교하는 p 값을 나타낸다 (p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려된다). 마우스가 처리를 받는 시간 간격은 회색 영역으로 나타낸다. 순환하는 항체 농도는 처리 개시 전 0 내지 13일째에 항-CD47 (STI-6643 또는 Hu5F9)로 처리된 각각의 동물에서 평가된다 (도 5e). 데이터를 평균 +/- S.D.로 제공한다. 화살표는 각각의 그룹에 대한 항체 처리 시간을 나타낸다. 모든 통계 검정은 2-측이고, 결과는 P < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.
실시예 6. STI-6643 및 리툭시맙의 병용물은 항-종양 활성 및 장기간 생존을 개선시킨다.
항-CD47 항체 및 리툭시맙을 사용한 병용 요법은 파종성 사람 RAJI 이종이식 마우스 모델에서 림프종을 제거한다. 루시퍼라제 발현 Raji 세포 (RAJI-Fluc)로 정맥내 이식된 폭스 체이스 SCID 마우스 (그룹당 n=8)를 3 mg/kg의 리툭시맙 (항-CD20 항체) 또는 이의 IgG1 이소형 대조군 또는 20 mg/kg의 STI-6643 또는 이의 IgG4 이소형 대조군 항체 단독 또는 병용으로 지시한 바와 같이 처리하였다. 처리를 1주일에 3회 연속 2 주 동안 RAJI-Fluc 접종 후 7일째에 시작하여 제공하였다 (7, 9, 11, 14, 16 및 18일째). 종양 세포 접종 후 14 내지 37일째 대표적인 마우스의 루시퍼라제 영상 (도 6a). 개별적인 마우스에 대한 발광 데이터 (도 6b) 또는 생존 감소 전 d23까지만 플롯팅한 총 플럭스 값의 평균 +/- SEM (도 6c)을 나타낸다. 통계적 유의성을 2-원 ANOVA, 이어서, 터키 다중 비교 검정으로 평가하였다. 카플란-마이어 생존 분석을 수행하였다 (도 6d). 각각의 그룹을 다른 것과 비교하는 p 값을 나타낸다. 마우스가 처리를 받는 시간 간격은 회색 영역으로 나타낸다. 모든 통계 검정은 2-측이었고, 결과는 P < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다. 항-CD20와 병용된 STI-6643으로 마우스의 처리는 가장 큰 정도의 생존 (상당 선)을 갖고, STI-6643 단독로의 처리, 이어서, 항-CD20 단독이 뒤따른다. 리툭시맙 (항-CD20 항체) 플러스 STI-6643 (항-CD47 항체) 및 하기 리툭시맙으로 처리된 마우스 간의 생존율 증가는 통계적으로 유의하였다.
실시예 7. STI-6643은 비-사람 영장류에서 150 mg/kg에서 양호하게 허용되고(Well Tolerated) 안정하다.
이러한 비-GLP 용량-결과 독성 연구의 목적은 정맥내 (IV) 볼루스 주사로 일주일에 1회 (1, 8, 15, 및 22일째에) 총 4 용량을 시노몰구스 원숭이에게 어떠한 프라이밍 용량도 없이 제공하는 경우 STI-6643의 잠재적 독성을 측정하는 것이었다 (표 1에 나타냄). 동물을 57일째에 부검하기 전에 28-일 회복 기간을 겪었다. 연구 설계를 다음과 같이 하였다:
Figure pct00001
그룹 1 및 2를 먼저 투약하고, 그룹 3을 그룹 1 및 2 이후 대략적으로 2 주에 투약을 시작하고; 그룹 4를 그룹 3 후 대략적으로 5 주 후에 투약을 시작하였다.
모든 동물a은 57일째 부검을 받았다. 순환하는 헤모글로빈 농도를 경시적으로 나타내는 그래프를 도 7b에 나타낸다.
다음 파라미터 및 종점을 이러한 연구에서 평가하였다: 임상적 관찰 (케이지 측, 투약-후, 및 상세한 항목), 체중, 정성적 식품 소비, 임상적 병리학 파라미터 (혈액학, 응고, 및 임상 화학), 골수 평가, 생체분석, 항-약물 항체, 독성 역학 파라미터, 총 부검 관찰, 기관 중량, 및 조직병리학 검사. 모든 동물은 예정된 부검까지 생존하였다.
빈혈은 항-CD47 처리시 주요한 유해사건 중 하나인 것으로 공지되어 있기 때문에, 본 발명자들은, 시노몰구스 원숭이를 문헌[참조: Liu J et al. (Plos One, 2015)]에 공개된 바와 같이 단일 용량의 Hu5F9 (도 7a)로 또는 4개 연속 용량의 STI-6643 (도 7b)으로 처리하였을 때 경시적인 헤모글로빈 수준을 비교하기로 결정하였다.
결론: 임상적 화학 파라미터의 STI-6643-관련 변화는 비-유해한, 약간 감소된 요소질소를 29일째에 150 mg/kg/용적에서 한정하였다. 29일째 150 mg/kg/용적에서 요소질소는 또한 대조 값과 비교하여 통계적으로 유의하게 감소하였다.
임상적 관찰, 체중, 정성적 식품 소비, 혈액학, 응고 파라미터, 골수 평가, 총 부검 관찰, 기관 중량, 또는 조직병리학에서 STI-6643-관련 변화는 없었다. 결론적으로, 총 4 용량에 대해 일주일에 1회 (1, 8, 15, 및 22일째에) 정맥내 볼루스 주사에 의한 STI-6643의 투여는 시노몰구스 원숭이에서 150 mg/kg/용적 이하의 수준에서 양호하게 허용되었다. 이들 결과를 기초로 하여, 관찰되지 않은 부작용 수준 (NOAEL)이 4개 이하의 용량에 대해 150 mg/kg/용적인 것으로 고려되었다.
실시예 8. 항-CD47 클론 STI-6643은 종양 세포에 대한 우선적 결합을 나타낸다. 혼합-세포 샘플에 대한 결합 검정.
사람 전혈 (25 μL/웰) 및 RAJI-GFP (웰당 5,000 세포)를 혼합하고, 다양한 농도 (300 μg/mL 내지 1 ng/mL)의 항-CD47 (STI-6643 또는 내부에서(in-house) 발현된 경쟁자 Hu5F9) 또는 이소형 IgG4 대조군 항체로 45 분 동안 37℃에서 염색하였다. 세포를 2회 세척하고, 이어서, 다음 항체 혼합물: 이차적인 항체 (APC-표지화된 항-사람-Fc), 항-CD45-BV711, 항-CD3-BV510, 항-CD19-APC-Cy7 및 항-CD235a-PB로 20 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 2번 세척 후, 세포를 고정하고, 유세포분석에 의해 분석하였다. 도 8a는 Hu5F9 항체 (각각의 그래프에서 상부 곡선)가 Raji 종양 세포 및 RBC 둘 다에 각각 5.1 x 10-6 및 3.3. x 10-6의 EC50로 결합하는 반면, 항-CD47 항체 STI-6643에 의한 Raji 종양 세포 및 RBCs로의 결합이 각각 대략적으로 6.4 x 10-5 및 5.6 x 10-5의 EC를 갖는 것으로 발견되었다는 것을 나타낸다. Raji 종양 세포 및 적혈구 둘 다에 대해, 특이적 결합은 약 10-5 g/ml의 농도에서 발생하기 시작하고; 그러나, STI-6643 항체에 의한 Raji 종양 세포의 결합이 항체 Hu5F9에 의해 나타난 결합 수준을 대략적으로 5 x 10-3 g/ml의 농도로 상승시키는 반면, STI-6643 항체에 의한 RBCs의 결합은 Hu5F9 항체에 의한 RBCs의 결합에 대해 매우 낮게 유지된다.
STI-6643의 RAJI 종양 세포, 적혈구 (RBC), B (CD19+) 또는 T (CD3+) 세포로의 결합 퍼센트를, 동일한 항체 농도 (기하 평균 형광 강도로 계산함)에서 Hu5F9 클론에 의해 제공된 상대적 100% 결합과 비교하여, 최고 용량 (300 μg/mL)에서 평가하고, 도 8b에 막대 그래프로 나타낸다.
결론: STI-6643 항-CD47 항체는 Raji 종양 세포에 적어도 결합하고, 뿐만 아니라 Hu5F9 항체는 Raji 세포에 결합한 반면, STI-6643의 RBCs로의 결합은 Hu5F9 항체에 의해 나타난 RBCs에 대한 결합의 단지 대략적으로 10%였다.
실시예 9. STI-6643은 경쟁자 항체 Hu5F9와 비교하여 적혈구응집을 급격하게 감소시킨다 (추가 적혈구응집 실험).
적혈구 (RBCs)를 제조하기 위해, 말초 혈액을 건강한 사람 공여자로부터 입수하였다. 4 mL의 혈액을 15 mL 원뿔형 튜브 내로 피펫팅하고, 실온 (RT)에서 1X PBS로 마무리하였다. 튜브를 140 g에서 10 분 동안 회전시켰다. 상청액을 튜브의 바닥에서 RBCs를 교란시키지 않고 흡인하였다. 12 mL의 1X PBS를 첨가하고, 튜브를 뒤집어서 혼합하였다. 세포를 140 g에서 5 분 동안 원심분리하고, 세척을 두번 반복하였다. 상청액을 최종 세척 후 RBCs를 교란시키지 않고 흡인하고, 충분한 1X PBS를 첨가하여 RBCs의 10% 용액을 제조하였다. 최종 작동 용액을 제조하기 위해 10% 용액 RBCs을 1X PBS로 희석하여 0.5% 용액을 수득하였다.
적혈구응집 검정을 위해, 50 μL의 0.5% RBCs 작동 용액을 U형-바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 유지하였다. 다음 항체를 이러한 검정에서 사용하였다: 항-CD47 IgG4 (클론 STI-6643 및 Hu5F9) 및 이소형 IgG4 대조군. 항체의 연속 희석물을 초저 부착 96-웰 플레이트에서 1X PBS (450 μg/mL에서 시작하는 2-배 희석물) 중에서 제조하였다. 항체 희석물을 RBCs (100 μL/웰, 출발 항체 농도: 300 μg/mL)를 포함하는 플레이트 내로 이동시키고, 수회 다채널 피펫으로 서서히 혼합하였다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 (5% CO2, 37℃)에서 약 20 시간 인큐베이션 동안 위치시켰다. 음성 결과 (적혈구응집 없음)는 둥근-바닥 플레이트의 중심에 점으로서 나타났다. 양성 결과 (적혈구응집)는 웰에 걸쳐서 균일한 적색을 형성하였다. 도 9 (상부)는 양성 및 음성 결과의 도식 및 예를 제공한다. 도 9 (하부)는 검정의 결과를 나타낸다.
결론: STI-6643은 심지어 고농도에서도 적혈구응집을 유발하지 않는다.
실시예 10: STI-6643은 적응 및 선천 면역체계를 보존한다: 3-원 MLR 검정
0일째에, 3개의 상이한 사람 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 제조하고, 완전 RPMI-10AB 배지 (10% 사람 AB 혈청 (제조원: Valley Biomedical, ref HP1022, lot 6F1131)으로 보충된 RPMI1640) 내로 재현탁하였다. 각각의 공여자로부터의 동일한 수의 PBMCs를 평평한-바닥 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하여 100 μL의 RPMI-10AB 중 1.65E+05 세포/공여자/웰 (약 5.0E+05 세포/웰 최종) 시딩 밀도를 수득하였다. 이소형 대조군 또는 항-CD47 (STI-6643 또는 Hu5F9) 사람 IgG4 항체를 완전 RPMI-10AB 배지에서 2X 농도로 희석하고 (200 μg/mL에서 시작하는 10-배 연속 희석), 이어서, 후속적으로 100 μL/웰을 적합한 웰에 100 μg/mL 내지 1 ng/mL 범위의 최종 농도로 첨가하였다. 플레이트를 6 일 동안 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다 (37℃, 5% CO2).
공-배양-후 6일째에, 세포를 300 g에서 5 분 동안 회전시키고, 냉각된 FACS 완충액 (2 mM EDTA 및 2% 소태아 혈청으로 보충된 둘베코 포스페이트 완충 염수)을 사용하여 세척하였다. 이어서, 세포를 30 분 동안 4℃에서 PE-접합된 CD4 (클론 OKT4; Biolegend, Cat. no. 317410, lot# B264363), FITC-접합된 CD8 (클론 HIT8a; Biolegend, Cat. no. 300906, lot# B275277), APC-Cy7-접합된 CD19 (클론 SJ25C1; Biolegend, Cat. no. 363010, lot# B276795), Pacific Blue-접합된 CD56 (클론 HCD56; Biolegend, Cat. no. 318326, lot# B280451)로 구성된 항체 혼합물로 인큐베이팅하였다. 세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 100 μL/웰의 고정 완충액 (Biolegend; Cat. 420801)을 사용하여 20 분 동안 실온에서 고정하였다. 후속적으로, 세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 1회 세척하고, CD4+, CD8+, CD19+ 및 CD56+ 세포의 수를 유세포분석에 의해 측정하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 각 포인트에 대해 삼중 값의 평균 +/- S.E.M을 나타낸다. CD4+, CD8+, CD19+ 및 CD56+의 결과를 도 10에 나타낸다.
결론: STI-6643은 MLR-유발된 염증유발 환경에서 T, B 및 NK 세포 생존능력을 지속시킨다.
실시예 11: STI-6643은 SEB 검정에서 T 세포 수 및 활성화를 우수하게 보존한다.
신선한 PBMCs를 단리하고, 2.0E+06 세포/mL에서 완전 RPMI (RPMI 1640+10% FCS + Pen/Strep) 중에서 희석하였다. 세포를 2.0E+05 세포/웰로 U형-바닥 플레이트 (100 μL/웰)에 플레이팅하였다. 다음에, 항-CD47 (STI-6643 또는 Hu5F9) 또는 이소형 대조군 항체 클론을 SEB (스타필로코칼 엔테로톡신 B, 제조원: List Biological laboratories; Cat. no. 122, lot# 1224171) 함유 완전 RPMI 중 100 ng/mL 최종 농도 (50 μL의 항체 제제를 4X 농도에서 둘 다 50 μL의 SEB와 혼합함)로 연속 희석시켰다 (100 μg/mL 내지 1 ng/mL). 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 3일 동안 위치시켰다.
3일째에, 세포를 5 분 동안 420 g에서 회전시켰다. 상청액을 새로운 96-웰 플레이트로 이동시키고, IFNν 사이토킨 함량을 제조자의 추천에 따라 염증유발 패널 1 (사람) 키트 (제조원: Meso Scale Discovery) (MSD; Cat. No. K15049D)로 측정하였다 (도 11a). 도 11a에서, x-축에 따른 각각의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로: 항체 비함유 대조군; 이소형 IgG4 대조군; Hu5F9; 및 STI-6643을 포함한다. CD4+, CD8+, CD19+ 및 CD56+ 세포의 총 수 (도 11b) 뿐만 아니라 활성화된 CD4+CD25+ 및 CD8+CD25+ T 세포의 백분율 (도 11c)을 다음과 같이 평가하였다: 세포를 냉각된 FACS 완충액 (2 mM EDTA 및 2% 소태아 혈청으로 보충된 둘베코 포스페이트 완충 염수)를 사용하여 세척하였다. 이어서, 세포를 20 분 동안 4℃에서 PE-접합된 CD8 (클론 SK1; Biolegend, Cat. no. 344706, lot# B267519), BV421-접합된 CD4 (클론 OKT4; Biolegend, Cat. no. 317434, lot# B280597), AF647-접합된 CD25 (클론 M-A251; Biolegend, Cat. no. 356128, lot# B269090)로 구성된 항체 혼합물로 인큐베이팅하였다. 세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 200 μL/웰의 FACS 완충액에 재현탁시키고, 유세포분석에 의해 즉시 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 각 포인트에 대해 삼중 값의 평균 +/- S.E.M을 나타낸다.
결론: STI-6643는 염증-유발 환경에서 활성화된 T 세포 생존능력 및 IFNν 반응을 지속시킨다.
실시예 12: RAJI 종양 모델에서 STI-6643의 용량-효능 연구
폭스 체이스 SCID 마우스에게 루시퍼라제 발현 Raji 세포 (RAJI-Fluc)를 정맥내 접종하고, 상이한 처리 그룹으로 무작위 배정하였다 (30 mpk STI-6643, n=16 마우스; 10 mpk STI-6643, n= 24 마우스; 1 mpk STI-6643, n=24 마우스; 0.1 mpk STI-6643, n=16 마우스; 10 mpk 이소형 대조군, n=24 마우스 및 30 mpk 이소형 대조군, n=8 마우스).
처리 (0.1 - 1 - 10 또는 30 mpk의 STI-6643, 및 이소형 대조군의 사람 IgG4에 대해 10 또는 30 mpk)를 RAJI-Fluc 접종 후 7일째에 출발하여 1주 3회 연속하여 2 내지 3 주 동안 제공하였다 (총 6 내지 8 용량). 카플란-마이어 생존 분석을, 각각 STI-6643 및 이소형 처리된 그룹 둘 다를 포함하는 3개 독립적인 실험으로부터 데이터를 조합하여 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 생존 시간을 각각의 동물에 대해 뒷다리 마비 징후가 관찰된 첫번째 날로서 측정하였다. 퍼센트 생존 결과를 도 12a에 나타낸다. 각각의 처리 그룹을 다른 것과 비교하는 p 값을 표에 나타낸다 (p<0.05, 통계적으로 유의한 것으로 고려된다) (도 12b의 표 참조).
순환하는 항체 농도를 처리된 동물에서 평가하였다. 혈액 샘플을 다음과 같이 수집하였다: 각각의 샘플에 대해 10 μL의 전혈을 PBS 중 90 μL의 Blocker™ Casein (Thermo Fisher; Cat. 37528)과 혼합하고, ELISA를 수행할 때까지 -80℃에서 신속하게 저장하였다. 다중-어레이 96-웰 플레이트 (Meso Scale Discovery, Cat. L15XA-3)를 비표지된 마우스 항-사람 IgG (CH2 도메인) 항체 (Thermo Fisher; Cat. MA5-16929, lot. UE2781631A)로 1X PBS 중 2 μg/mL (50 μL/웰)에서 코팅하였다. 1X KPL 세척 용액 (Sera care; Cat. 5150-0008, lot. 10214473)으로 세척한 후, 플레이트를 PBS 중 Blocker™ Casein으로 1 시간 동안 37℃에서 차단시켰다. 표준 곡선을 50 내지 0 ng/mL의 범위의 농도를 포함하는 연속 희석을 수행하여 PBS 중 Blocker™ Casein에서 STI-6643 mAb를 사용하여 제작하였다. 후속적으로, 96-웰 플레이트를 세척하고, 혈액 샘플 (1:10,000로 희석됨) 및 표준 곡선 샘플 둘 다를 웰 (50 μL/웰) 내로 이동시키고, 2 시간 동안 실온 (RT)에서 느린 전탕하에 인큐베이팅하였다. 플레이트를 1X KPL 세척 용액으로 3회 세척하고, 1 시간 동안 RT에서 PBS (25 μL/웰) 중 Blocker™ Casein에서 1:500 희석한 염소 항-사람/NHP SULFO-TAG 항체 (제조원: Meso Scale Discovery) (Cat. D20JL-6, lot. W0018045S)를 사용하여 인큐베이팅하였다. 1X KPL 세척 용액으로 3회 세척한 후, 항체의 존재가 150 μL/웰의 2X Read 완충액 (Meso Scale Discovery; Cat. R92TC-3, lot. Y0140368)을 첨가하여 나타났다. 플레이트를 MSD 장치 (Meso Sector S600 Model 1201; 일련 번호 1201160919484) 상에서 즉시 판독하였다. 데이터를 평균 +/- S.D.로서 제공한다. 결과를 도 12c에 나타낸다.
결론: STI-6643은 RAJI 종양 모델에서 용량-의존 항-종양 활성을 나타내었다.
실시예 13: NCI-H82 폐 고형 종양 모델에서 효능 연구
Balb/SCID 마우스에게 오른쪽 옆구리 내로 1X HBSS (150 μL/마우스) 중 제조된 5.0E+06 NCI-H82 폐 종양 세포로 피하 접종하고, 상이한 처리 그룹으로 12일째에 무작위 배정하였다 (종양 덩어리가 동물의 80% 초과에서 존재하는 경우). 마우스가 처리 시작에서 종양 덩어리를 나타내지 않는 경우, 연구로부터 제거하였다. STI-6643 (n=9 마우스) 또는 이소형 대조군 (n=8 마우스) 사람 IgG4 항체를 90 mg/kg에서 피하 주사 (150 μL/마우스)로 격일로 총 6 용량에 대해 전신 투여하였다.
평균적인 (도 13a) 및 개별적인 (도 13b) 종양 용적을 경시적으로 측정하고, 종양 성장 억제 (TGI)를 종양 세포 이식 후 연구 31일째 말기에 계산하였다. 종양을 절제하고, 분해(take down) 시점에 중량을 쟀다 (도 13c). 데이터를 상대적 종양 중량의 평균으로서 나타낸다 (종양 중량/종양 절제 일). 평균 데이터는 평균 +/- S.E.M을 나타낸다 (p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려된다). 순환하는 항체 농도를 처리된 동물에서 평가하였다 (도 13d). 도 13d에서, x-축을 따라 배치된 각각의 시간은 왼쪽에서 오른쪽으로: 이소형 IgG4 대조군; 및 STI-6643을 포함한다. 혈액 샘플을 다음과 같이 수집하였다: 각각의 샘플에 대해 10 μL의 전혈을 PBS 중 90 μL의 Blocker™ Casein (Thermo Fisher; Cat. 37528)와 혼합하고, ELISA를 수행할 때까지 -80℃에서 신속하게 저장하였다. 다중-어레이 96-웰 플레이트 (Meso Scale Discovery, Cat. L15XA-3)를 비표지된 마우스 항-사람 IgG (CH2 도메인) 항체 (Thermo Fisher; Cat. MA5-16929, lot. UE2781631A)로 1X PBS 중 2 μg/mL (50 μL/웰)에서 코팅하였다. 1X KPL 세척 용액 (Sera care; Cat. 5150-0008, lot. 10214473)으로 세척한 후, 플레이트를 Blocker™ Casein으로 PBS 중에 1 시간 동안 37℃에서 차단하였다. 표준 곡선을 50 내지 0 ng/mL 범위의 농도를 포함하는 연속 희석을 수행하여 PBS 중 Blocker™ Casein에서 STI-6643 mAb를 사용하여 제조하였다. 후속적으로, 96-웰 플레이트를 세척하고, 혈액 샘플 (1:10,000로 희석) 및 표준 곡선 샘플 둘 다를 웰 (50 μL/웰) 내로 이동시키고, 2 시간 동안 실온 (RT)에서 느린 전탕하에 인큐베이팅하였다. 플레이트를 1X KPL 세척 용액으로 3회 세척하고, 1 시간 동안 RT에서 PBS (25 μL/웰) 중 Blocker™ Casein로 1:500 희석한 염소 항-사람/NHP SULFO-TAG 항체 (제조원: Meso Scale Discovery) (Cat. D20JL-6, lot. W0018045S)로 인큐베이팅하였다. 1X KPL 세척 용액으로 3회 세척한 후, 항체의 존재가 150 μL/웰의 2X Read 완충액 (Meso Scale Discovery; Cat. R92TC-3, lot. Y0140368)을 첨가하여 나타났다. 플레이트를 MSD 장치 (Meso Sector S600 Model 1201; 일련 번호 1201160919484)에서 즉시 판독하였다. 데이터를 평균 +/- S.D로서 제공한다.
결론: STI-6643은 NCI-H82 종양 모델에서 항-종양 활성을 나타내었다.
실시예 14: NCI-H82 폐 고형 종양 모델에서 용량 효능 연구
SCID 마우스에게 오른쪽 옆구리 내로 HBSS 1X (150 μL/마우스)로 제조된 5.0E+06 NCI-H82 폐 종양 세포로 피하 접종하고, 종양 덩어리가 동물의 80% 초과에서 존재하는 경우 상이한 처리 그룹으로 무작위 배정하였다 (11 또는 12일째에). 마우스가 처리 시작에서 종양 덩어리를 나타내지 않는 경우, 연구로부터 제거하였다.
STI-6643 또는 이소형 대조군 사람 IgG4 항체를 20, 60 또는 90 mpk (mg/kg)로 피하 주사 (150 μL/마우스)에 의해 상이한 처리 스케줄을 사용하여 전신으로 투여하였다. 20 및 60 mpk 그룹에 대한 처리는 2 및 3 주 동안 1주당 5 연속 주사, 이어서, 1주당 3 회 주사였다. 90 mpk 그룹의 경우, 처리 스케줄은 총 6 용량에 대해 격일 (Q2D)이었다. 개별적인 종양 용적 및 카플란-마이어 생존 곡선을 시험된 각각의 농도에 대해 수득하였다 (도 14). 각각의 카플란-마이어 플롯에서 상부 곡선은 STI-6643 처리된 마우스를 기초로 하고, 하부 곡선은 이소형 처리된 마우스를 기초로 한다. 생존율을 20 및 60 mpk 그룹에 대해 1,500 ㎣의 종양 용적, 및 90 mpk 그룹에 대해 1,000 ㎣의 종양 용적을 기초로 하여 계산하였다 (이러한 연구는 31일째에 조기 종료하였기 때문이다). p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려된다. 종양 용적 및 퍼센트 생존 결과를 도 14에 나타낸다.
결론: STI-6643은 mg/마우스의 주사된 항체의 총량을 비교하는 경우 NCI-H82 종양 모델에서 용량-의존 항-종양 활성을 나타내었다.
실시예 15: A375 흑색종 고형 종양 모델에서 효능 연구
NBSGW 마우스에게 오른쪽 옆구리 내로 HBSS 1X (150 μL/마우스) 중 제조된 5.0E+06 A375 폐 종양 세포로 피하 접종하고, 7일째에 상이한 처리 그룹으로 무작위배정하였다 (종양 덩어리가 동물의 80% 초과에서 존재하는 경우). 마우스가 처리 시작에서 종양 덩어리를 나타내지 않는 경우, 연구로부터 제거하였다.
STI-6643 (n=10 마우스) 또는 이소형 대조군 (n=10 마우스) 사람 IgG4 항체를 20 mg/kg로 피하 주사 (150 μL/마우스)에 의해 격일로 총 6 용량에 대해 전신으로 투여하였다.
평균적 (도 15a) 및 개별적인 (도 15b) 종양 용적을 경시적으로 측정하고, 종양 성장 억제 (TGI)를 연구 말기에 종양 세포 이식 후 31일째에 계산하였다. 카플란-마이어 생존 곡선을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다 (도 15c). 생존율을 800 ㎣의 종양 용적을 기초로 하여 계산하였다. p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려된다.
결론: STI-6643은 A375 종양 모델에서 20 mpk에서 항-종양 활성을 나타내었다.
실시예 16: 다라투무맙 (항-CD38)과 병용된 항-CD47 (STI-6643)의 효능 연구
루시퍼라제 발현 Raji 세포 (RAJI-Fluc)로 정맥내 이식한 폭스 체이스 SCID 마우스 (그룹당 n=8)를 5 mpk (mg/kg)의 항-CD38 다라투무맙 단독, 10 mpk의 STI-6643 단독, (5 mpk 다라투무맙 + 10 mpk의 STI-6643)의 병용물 또는 (5 mpk 사람 IgG1 + 10 mpk의 사람 IgG4 이소형 대조군)의 병용물 중 어느 하나로 처리하였다. 처리는 RAJI-Fluc 접종 후 7, 9, 11, 14, 16 및 18일째에 제공되었다.
카플란-마이어 생존 분석을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 생존 시간은 각각의 동물에 대해 뒷다리 마비 징후가 관찰된 첫번째 날로서 결정하였다. 퍼센트 생존 그래프를 도 16a에 나타낸다. 각각의 처리 그룹을 다른 것과 비교하는 p 값을 표에 나타낸다 (p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려된다 ) (도 16b의 표 참조).
결론: 항-CD47 항체 및 다라투무맙을 사용한 병용 요법 파종성 사람 RAJI 이종이식 마우스 모델에서 장기간 생존.
실시예 17. 항-CD47 항체 STI-6643은 항-CD47 항체 Hu5F9, AO176, 및 13H3과 비교하여 적혈구응집을 급격하게 감소시킨다.
적혈구 (RBCs) 제조: RBCs를 실시예 9의 방법을 사용하여 건강한 사람 공여자, 시노몰구스 원숭이, 및 비글 개로부터의 4 mL의 말초 혈액으로부터 제조하였다. 적혈구응집 검정을 위해, 사람, 원숭이, 및 개 근원의 0.5% RBCs 50 μL를 U형-바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 유지하였다. 이러한 검정에서 사용된 항체는 다음과 같다: 항-CD47 IgG4 STI-6643; 항-CD47 IgG4 Hu5F9 (참조: Liu et al. (2015) PLoSONE, 본원에 참조로서 포함됨); 항-CD47 IgG4 AO-176 (Puro et al. (2020) Mol. Cancer Ther. 19:835-846, 본원에 참조로서 포함됨), 및 항-CD47 IgG4 13H3 (참조: US2020/0140565A1, 본원에 참조로서 포함됨), 및 이소형 사람 IgG4 대조군. 항체의 연속 희석물을 초저 부착 96-웰 플레이트에서 1X PBS (2-배 희석물) 중에서 제조하였다. 항체 희석물을 RBCs (100 μL/웰, 출발 항체 농도: 300 μg/mL)를 포함하는 플레이트 내로 이동시키고, 수회 다채널 피펫으로 서서히 혼합하였다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 (5% CO2, 37℃)에 약 20 시간 인큐베이션 동안 위치시켰다. 음성 결과 (적혈구응집 없음)는 둥근-바닥 플레이트의 중심에 점으로서 나타났다. 양성 결과 (적혈구응집)는 웰에 걸쳐서 균일한 적색을 형성하였다. 도 17a (상부)는 양성 및 음성 결과의 예를 제공한다. 도 17b (하부)는 항-CD47 항체 STI-6643, Hu5F9, AO-176, 및 13H3을 사용한 적혈구응집 검정의 결과를 나타내고, 시험된 다른 항-CD47 항체와 다르게, STI-6643가 고농도에서조차 적혈구응집을 유발하지 않음을 나타낸다.
도 17c는, 일부 적혈구응집이 3 μg/mL 초과의 항체의 농도에서 개 RBCs에서 발생하지만, STI-6643 항체가 사람 및 시노몰구스 (원숭이) RBCs의 적혈구응집을 유발하지 않음을 나타낸다.
실시예 18. 항-CD47 항체 STI-6643 및 Hu5F9의 사람, 시노몰구스, 및 개 RBCs로의 결합.
RBCs를 상기 실시예 17에 기재된 바와 같이 제조하였다. RBCs로의 결합을 다중웰 포맷으로 시험하였다. FACS 완충액 (1X PBS + 2% FCS + 2 mM EDTA)을 검정 동안 사용하였다. 웰당 1.25E+06 RBCs를 V형-바닥 96-웰 플레이트에서 50 μL 1X PBS로 플레이팅하였다. 다양한 농도의 항-CD47 IgG4 항체 (STI-6643 또는 Hu5F9) 또는 이소형 IgG4 대조군을 포함하는 50 μL의 FACS 완충액을 RT에서 첨가하여 플레이팅하였다. 세포를 항체의 존재하에 45 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하고, 다채널 피펫으로 15 분마다 가볍게 혼합하였다. 이어서, 세포를 100 μL/웰의 FACS 완충액으로 RT에서 2회 세척하고, 원심분리 (524 x g 3 분 동안)로 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. RBC 펠릿을 1:200로 희석된 APC-표지화된 항-사람 IgG Fc 항체 (BioLegend; clone HP6017, Cat. No. 409306; Lot. B86581)를 포함하는 50 μL/웰의 FACS 완충액 중에 RT에서 재현탁시키고, 30 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 RT에서 2회 세척하고, 원심분리 (524g; 3 min)로 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 폐기하였다. 이어서, 세포를 펠릿을 100 μL의 고정 완충액 (BioLegend; Cat. No. 420801) 중에 20 분 인큐베이션 동안 4℃에서 재현탁하여 고정하였다. 100 μL/웰의 4℃-냉각된 FACS 완충액의 첨가 후, 세포를 원심분리 (524g; 3 min)로 회전시키고, 상청액을 느린 흡인으로 제거하고, 펠릿을 200 μL의 4℃-냉각된 FACS 완충액 중에 재혁탁시켰다. 샘플을 24 시간 내에 유세포분석에 의해 분석하였다.
도 18은 사람, 원숭이, 및 개의 RBCs를 사용하는 항-CD47 결합 검정의 결과를 제공한다. 사람 및 시노몰구스 RBCs에 대한 결합을 나타내는 그래프에서, 그래프에서 상부 곡선은 항-CD47 항체 Hu5F9에 의한 결합을 나타내고, 이는 항체 농도가 10-7 g/ml 초과로 상승하면 결합이 증가함을 나타낸다. STI-6643은 이러한 검정에서 사람 RBCs의 특이적 결합이 없음을 나타내고 (곡선은 이소형 대조군과 일치한다), 시노몰구스 RBCs의 결합은 약 10-5 g/ml 초과 농도에서 훨씬 더 낮은 정도로 발생한다. 개 RBCs에 대한 결합을 나타내는 가장 오른쪽 그래프의 상부 곡선은 STI-6643 항체에 의한 결합하고, 하부 곡선은 개 RBCs에 대한 Hu5F9 결합의 곡선이다. 이들 항체 둘 다는 약 10-7 g/ml 초과 농도에서 개 RBCs에 결합한다.
실시예 19. 항-CD47 항체 STI-6643, Hu5F9, 13H3, 및 AO-176의 Raji 종양 세포 및 사람 RBCs로의 결합.
RBCs를 상기 실시예 17에 따라 제조하고, FACS 완충액 (1X PBS + 2% FCS + 2 mM EDTA)을 검정 동안 사용하였다.
웰당 30,000 RAJI 세포를 V형-바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 3 분 동안 524g에서 원심분리로 회전시키고, 상청액을 플레이트를 빠르게 가볍게 쳐서 제거하였다. 세포를 다양한 농도의 항-CD47 IgG4 항체 (STI-6643, Hu5F9, AO-176 및 13H3) 또는 이소형 IgG4 대조군 (100 μg/mL에서 시작하는 1:10 연속 희석)을 포함하는 50 μL/웰의 FACS 완충액 중에 RT에서 재현탁시키고, 25 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 RT에서 세척하고, 원심분리 (524g; 3 min)로 회전시키고, 상청액을 플레이트를 빠르게 가볍게 쳐서 제거하였다. 세포를 1:200으로 희석된 APC-표지화된 항-사람 IgG Fc 항체 (BioLegend; clone HP6017, Cat. No. 409306; Lot. B86581)를 포함하는 50 μL/웰의 FACS 완충액 중에 RT에서 재현탁하고, 20 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 RT에서 세척하고, 원심분리 (524g; 3 min)로 회전시키고, 상청액을 플레이트를 빠르게 가볍게 쳐서 제거하였다. 세포를 펠릿을 100 μL의 고정 완충액 (BioLegend; Cat. No. 420801) 중에서 20-min 인큐베이션 동안 4℃에서 재현탁하여 고정하였다. 4℃-냉각된 FACS 완충액 (100 μL/웰)의 첨가 후, 샘플을 24 시간 내에 유세포분석에 의해 분석하였다.
RBCs (웰당 1.25E+06)를 V형-바닥 96-웰 플레이트에 50 μL 1X PBS 중에 플레이팅하였다. 다양한 농도의 항-CD47 IgG4 항체 (STI-6643, Hu5F9, 13H3 및 AO-176) 또는 이소형 IgG4 대조군을 포함하는 50 μL의 FACS 완충액을 RT에서 첨가하였다. 세포를 항체의 존재하에 45 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하고, 다채널 피펫으로 15 분마다 가볍게 혼합하였다. 이어서, 세포를 100 μL/웰의 FACS 완충액으로 RT에서 2회 세척하고, 원심분리 (524g; 3 min)로 회전시키고, 상청액을 흡인하였다. RBC 펠릿을 1:200으로 희석된 APC-표지화된 항-사람 IgG Fc 항체 (BioLegend; clone HP6017, Cat. No. 409306; Lot. B86581)를 포함하는 50 μL/웰의 FACS 완충액 중에 RT에서 재현탁시키고, 30 분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 RT에서 2회 세척하고, 원심분리 (524g; 3 min)로 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 폐기하였다. 이어서, 세포를 펠릿을 100 μL의 고정 완충액 (BioLegend; Cat. No. 420801) 중에 20 분 인큐베이션 동안 4℃에서 재현탁하여 고정하였다. 100 μL/웰의 4℃-냉각된 FACS 완충액의 첨가 후, 세포를 원심분리 (524g; 3 min)로 회전시키고, 상청액을 느린 흡인으로 제거하고, 펠릿을 200 μL의 4℃-냉각된 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. 샘플을 24 시간 내에 유세포분석에 의해 분석하였다.
도 19는 도의 왼쪽 그래프에서 항-CD47 항체에 의한 Raji 세포로의 결합을 나타낸다. 상부 곡선은 항체 Hu5F9, 이어서, 매우 유사한 결합 곡선을 나타내는 항체 13H3 및 AO-176, 이어서, 항체 ST-6643이다. 이소형 대조군은 낮은 MFI에서 평평한 선이다 (농도 의존성 없음). 도의 오른쪽 그래프는 항체 Hu5F9가 모든 농도에서 최고 수준의 RBC 결합을 갖고, 이어서, 13H3 항체 (Hu5F9 결합에 대해 최대 결합 농도에서 대략적으로 68%까지 감소함), 이어서, AO-176 결합 곡선 (최대 결합 농도에서 Hu5F9 결합에 대해 대략적으로 80%까지 감소함)임을 나타낸다. STI-6643은 최저 곡선이고, 이는 약 10-7 g/ml 미만의 농도에서 RBCs로의 결합의 최저 양을 나타내고, 최대 결합 농도에서 항-CD47 항체 Hu5F9에 의한 RBCs의 결합에 대해 대략적으로 93%까지 감소하였다.
실시예 20. 항-CD47 항체 STI-6643, Hu5F9, 13H3, 및 AO-176을 사용한 PBMC 인큐베이션 후 면역 세포의 평가.
정상 면역 세포에 미치는 항-CD47 항체 STI-6643의 효과를 시험하기 위해, 검정을 수행하고, 여기서, PBMCs를 항-CD47 항체로 인큐베이팅하고, 이어서, 면역 세포 유형의 마커로 염색하였다.
3명의 상이한 공여자로부터 신선하게 정제된 PBMCs를 동등한 비율로 혼합하고, 0.5E+06 세포/웰에서 200 μL의 RPMI1640 10% 사람 AB 혈청 (Valley Biomedical, Cat. No. HP1022, Lot. 6F1131) + P/S 중에 37℃에서 평평한-바닥 96-웰 플레이트에서 이소형 IgG4 Ab, 항-CD47 mAbs STI-6643, Hu5F9, AO-176 또는 13H3의 존재하에 1 ng/mL 내지 100 μg/mL 범위의 최종 농도에서 플레이팅하였다. 37℃에서 6-일 인큐베이션 후, 세포를 3 분 동안 524g에서 원심분리로 회전시키고, 상청액을 플레이트를 가볍게 쳐서 폐기하고, 세포를 200 μL FACS 완충액으로 4℃에서 세척하고, 30 분 동안 4℃에서 100 μL의 FACS 완충액으로 4℃에서 희석된 하기 형광색소-접합된 mAbs으로 염색하였다: 항-사람 CD4-PE (클론 OKT4, BioLegend, Cat. No. 317410, Lot. B264363, 2 μL/웰), 항-사람 CD8-FITC (클론 HIT8a, BioLegend, Cat. No. 300906, Lot. B275277, 2 μL/웰), 항-사람 CD19-APC-Cy7 (클론 SJ25C1, BioLegend, Cat. No. 363010, Lot. B276795, 2 μL/웰), 및 CD56-PB (클론 HCD56, BioLegend, Cat. No. 318326, Lot. B280451, 2 μL/웰). 세포를 100 μL의 FACS 완충액을 4℃에서 첨가하여 세척하고, 3 분 동안 524g에서 원심분리하고, 상청액을 플레이트를 가볍게 쳐서 제거하고, 이어서, 100 μL의 고정 완충액 (BioLegend; Cat. No. 420801) 중에 20 분 동안 4℃에서 재현탁하였다. 100 μL의 FACS 완충액을 4℃에서 세척 없이 첨가하고, 6-일 인큐베이션 기간의 말기에 회수된 CD4+, CD8+, CD19+ 및 CD56+ 세포의 수를 유세포분석에 의해 분석하고, 데이터를 평균 +/- S.E.M로 제시한다.
하나의 대표적인 실험을 도 20a에 나타내고, 여기서, 데이터를 항-CD47 항체로 인큐베이션 후 회수된 세포의 수의 평균 +/- S.E.M로 제시한다. 도 20b에서, 데이터를 이소형 IgG4의 존재하에 동일한 농도로 회수된 세포의 수의 백분율로서 제시한다. 2개의 실험 (13H3 및 AO-176) 또는 4개의 실험 (이소형 IgG4, STI-6643 및 Hu5F9)으로부터의 데이터를 사용하여 정규화된 그래프를 생성하였다. 데이터를 2-4개의 독립적인 실험의 평균 +/- S.E.M로 제시한다.
A)의 그래프에서, CD4+, CD8+, CD19+, 및 CD56+ 세포에 대한 세포 수의 가장 큰 감소는 항체 Hu5F9 및 13H3에 대해 나타나고, AO-176 항체는 또한 CD19+ 세포의 농도-의존 감소를 야기하였다. B)의 그래프에서, 이소형 항체 인큐베이션 후 회수된 세포의 백분율을 기초로 하여, STI-6643로 인큐베이션 후 회수된 세포의 백분율은 그래프의 상부에서 이소형 대조군을 추적하고, 이는, CD19+ 세포의 경우 항체의 최고 농도에서 단지 적은 정도까지 세포의 농도-의존 상실을 나타낸다.
실시예 21: MDA-MB-231 가성(Pseudo)-사람화 마우스 모델에서 항-CD47 (STI-6643)의 효능 연구
0일째에, NSG-Tg(Hu-IL15) 마우스 (스톡 넘버 30890; The Jackson Laboratory)를 1.0E+07 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 복강내 주사를 사용하여 사람화하였다. 8일째, 마우스에게 오른쪽 옆구리 내로 HBSS 1X (100 μL/마우스) 중 제조된 5.0E+06 MDA-MB-231 유방 종양 세포로 피하 접종하고, 15일째에 상이한 처리 그룹으로 무작위 배정하였다 (종양 크기가 동물의 90% 초과에서 50-100 ㎣에 도달한 경우). 마우스가 처리 시작에서 종양 덩어리를 나타내지 않는 경우, 연구로부터 제거하였다. STI-6643 항체를 0.1, 1 및 10 mg/kg에서 전신으로 피하 주사 (100 μL/마우스; n=5 마우스/그룹)로 격일로 총 3 용량에 대해 투여하였다. 개별적인 및 평균적 종양 용적을 경시적으로 측정하였다. 데이터를 플롯팅하고, 통계를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 입수하였다. 통계적 분석을 2-원 ANOVA, 시다크(Sidak) 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려된다.
도 21은 STI-6643로의 처리가 사람화 MDA-MB-231 종양 모델에서 감소된 종양 성장을 야기하였음을 나타내는 결과를 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> SORRENTO THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING AN ANTI-CD47 ANTIBODY IN COMBINATION WITH A TUMOR TARGETING ANTIBODY <130> 087735.0178 <140> PCT/US2020/063243 <141> 2020-12-04 <150> 63/065,927 <151> 2020-08-14 <150> 63/030,464 <151> 2020-05-27 <150> 62/943,926 <151> 2019-12-05 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Leu Trp Phe Ser Glu Phe Asp Tyr Trp 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Phe Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 35 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Phe His 20 25 30 Phe Val Tyr Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asp 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Ser Asn Gly Arg Pro Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Trp Gly Gly Glu Phe Thr Asp Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 37 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Phe His 20 25 30 Phe Val Tyr Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 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43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 43 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 1 5 10 <210> 44 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 44 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 <210> 45 <211> 303 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 45 Met Ala Asn Tyr Glu Phe Ser Gln Val Ser Glu Asp Arg Pro Gly Cys 1 5 10 15 Arg Leu Thr Arg Lys Ala Gln Ile Gly Leu Gly Val Gly Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Val Ala Leu Val Val Val Val Val Ile Val Leu Trp Pro Arg Ser 35 40 45 Pro Leu Val Trp Lys Gly Lys Pro Thr Thr Lys His Phe Ala Asp Ile 50 55 60 Ile Leu Gly Arg Cys Leu Ile Tyr Thr Gln Ile Leu Arg Pro Glu Met 65 70 75 80 Arg Asp Gln Asp Cys Lys Lys Ile Leu Ser Thr Phe Lys Arg Gly Phe 85 90 95 Ile Ser Lys Asn Pro Cys Asn Ile Thr Asn 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Claims (29)

  1. (i) CD47 항원의 에피토프에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (ii) CD20 항원 또는 CD38 항원의 에피토프에 결합하는 두번째 항체를 포함하는 조성물로서, 첫번째 항체가 CD47 항원에 결합하고, CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하는, 조성물.
  2. 암 세포의 집단에서 적어도 하나의 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 암 세포가 CD47 항원을 과발현하고, 상기 방법이 상기 적어도 하나의 암 세포를 치료학적 유효량의 CD47 항원에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 CD20 항원에 결합하거나 CD38 항원에 결합하는 두번째 항체와 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 첫번째 항체가 CD47 항원에 결합하고, CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하고, 두번째 항체가 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함하는, 방법.
  3. CD47 항원을 과발현하는 암을 갖는 대상자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 CD47 항원에 결합하는 첫번째 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 CD20 항원 또는 CD38 항원에 결합하는 두번째 항체의 치료학적 유효량을 상기 대상자에게 투여함을 포함하고, 여기서, 첫번째 항체가 CD47 항원에 결합하고, CD47 항원과 SIRPα 항원 사이의 결합을 차단하고, 두번째 항체가 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함하는, 방법.
  4. 첫번째 항체의 항원 결합 단편이 Fab 단편, F(Ab')2 단편 또는 scFv 단편을 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  5. 두번째 항체가 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하는 Fc 부분을 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  6. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
  7. 첫번째 항체가 IgG4 유형 항-CD47 항체를 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  8. 첫번째 항체가 완전 사람 항-CD47 항체를 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  9. 첫번째 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 (STI-6643), 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  10. 상기 CD47 항원이 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 사람 CD47 항원 또는 이의 부분을 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  11. 첫번째 항체가 사람 적혈구와 접촉하는 경우, 항-CD47 항체 (Hu5F9)와 비교하여, 감소된 적혈구응집를 나타내고, 여기서, Hu5F9 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 1-117을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 4의 아미노산 서열의 아미노산 1-112를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  12. 첫번째 항체가 사람 마크로파지 세포 (예를 들면, CD14+ 마크로파지 세포)와 접촉하는 경우, CD47 항원을 발현하는 세포를 사멸시키는 포식작용(phagocytosis)을 중재하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  13. 두번째 항체가 IgG1 유형 항-CD20 항체 또는 IgG1 유형 항-CD38 항체를 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  14. 두번째 항체가 이펙터 세포의 존재하에 항체 의존 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유발하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  15. 두번째 항체가
    a) 키메라 항-CD20 항체 (예를 들면, 리툭시맙); 사람화 항-CD20 항체 (예를 들면, 오비누투주맙); 또는 완전 사람 항-CD20 항체 (예를 들면, 오파투무맙); 또는
    b) 항-CD38 항체 (예를 들면, 다라투무맙, 도 18B); 또는 도 18C-D에 열거되어 있는 표 A, B 또는 C에 열거된 어느 하나의 항-CD38 항체를 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  16. 두번째 항체가
    a) 서열번호 6의 아미노산 서열의 아미노산 1-121을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 1-106을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함(리툭시맙)하거나;
    b) 서열번호 8의 아미노산 서열의 아미노산 1-119를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 9의 아미노산 서열의 아미노산 1-115를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함(오비누투주맙)하거나;
    c) 서열번호 10의 아미노산 서열의 아미노산 1-122를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 11의 아미노산 서열의 아미노산 1-107을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함(오파투무맙)하거나;
    d) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함(다라투무맙)하거나;
    e) 표 A, B, 및 C (각각 도 18C-E)에 열거된 쌍을 이룬(paired) 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인 중 어느 하나를 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  17. CD20 항원이 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 이의 부분을 포함하는 사람 CD20 항원을 포함하거나, CD38 항원이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 사람 CD38 항원을 포함하는, 제1항의 조성물, 또는 제2항 또는 제3항의 방법.
  18. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 암 세포를 치료학적 유효량의 첫번째 및 두번째 항체와 본질적으로 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 접촉시키는, 방법.
  19. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 암 세포의 사멸이 포식작용을 포함하는, 방법.
  20. 제2항에 있어서, CD47 항원을 과발현하는 상기 적어도 하나의 암 세포가 난소 암 세포, 결장 암 세포, 결장직장 암 세포, 유방 암 세포 및 폐 암 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제2항에 있어서, CD47 항원을 과발현하는 상기 적어도 하나의 암 세포가 골수종, 신경아세포-유래 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유래 백혈병, T-세포 유래 백혈병, B-세포 유래 림프종, T-세포 유래 림프종, 비-호지킨 림프종, 및 비만 세포 유래 종양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제3항에 있어서, 상기 투여가, 상기 대상자에게
    a) 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항-CD20 항체를 본질적으로 동시에 투여하거나, 또는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항-CD20 항체를 임의의 순서로 순차적으로 투여하거나;
    b) 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항-CD38 항체를 본질적으로 동시에 투여하거나, 또는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항-CD38 항체를 임의의 순서로 순차적으로 투여함을 포함하는, 방법.
  23. 제3항에 있어서, 상기 투여가 정맥내, 근육내, 피하, 복강내 및 척수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방식을 통해 상기 대상자에게 투여됨을 포함하는, 방법.
  24. 제3항에 있어서, CD47 항원을 과발현하는 상기 암이 난소 암 세포, 결장 암 세포, 결장직장 암 세포, 유방 암 세포 및 폐 암 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제3항에 있어서, CD47 항원을 과발현하는 상기 암이 골수종, 신경아세포-유래 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유래 백혈병, T-세포 유래 백혈병, B-세포 유래 림프종, T-세포 유래 림프종, 비-호지킨 림프종, 및 비만 세포 유래 종양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제3항에 있어서, 상기 투여가 상기 대상자에게 항-CD47 항체를 약 20-150 mg/kg 또는 약 30-150 mg/kg 또는 약 40-150 mg/kg 또는 약 50-150 mg/kg 또는 약 60-150 mg/kg 또는 약 70 mg/kg 또는 약 80-150 mg/kg 또는 약 90-150 mg/kg 또는 약 100-150 mg/kg 또는 약 110-150 mg/kg 또는 약 120-150 mg/kg 또는 약 130-150 mg/kg의 용량으로 투여함을 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 투여가 상기 대상자에게 항-CD47 항체의 용량을 2-6 주 또는 보다 장기간 (예를 들면, 최대 10 주) 동안 1주일에 1회 투여함을 포함하는, 방법.
  28. 제3항에 있어서, 상기 투여가 상기 대상자에게 항-CD20 항체 또는 항-CD38 항체를 약 0.1-100 mg/kg의 준최적 용량으로 투여함을 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 투여가 상기 대상자에게 항-CD20 항체 또는 항-CD38 항체의 용량을 2-6 주 또는 보다 장기간 (예를 들면, 최대 10 주) 동안 1주일에 1회 투여함을 포함하는, 방법.
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