JP2023180218A - 乳酸菌を含むｉｌ－１０の産生促進のための剤 - Google Patents
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【課題】新規に乳酸菌を含むＩＬ－１０の産生促進のための剤、などを提供すること。【解決手段】Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５７０）の死菌を有効成分として含む、ＩＬ－１０の産生促進のための剤を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、例えばヒト等に用いるための乳酸菌を含むＩＬ－１０の産生促進のための剤に関し、より詳細には、乳酸菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）の死菌を有効成分として含む、ＩＬ－１０の産生促進のための剤、などに関する。
近年、乳酸菌が免疫賦活作用など様々な機能を有することが明らかとなり、乳酸菌が注目を集めている。例えば、植物性乳酸菌であるラクトバチルス パラカゼイＫ７１株の有する抗アレルギー作用（特許文献１）、アブラナ科植物のラクトバチルス カゼイの特定の菌株が有する抗酸化機能（特許文献２）、微細藻類又はその処理物を含有する培地中で、特定の乳酸菌を培養して得られる発酵物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤（特許文献３）などが報告されている。また、乳酸菌などのプロバイオティクスが例えば抗炎症作用、抗アレルギー作用、抗感染症作用、免疫賦活作用などの免疫調節作用を有することが報告されている（特許文献４）。
本発明は、例えば、新規に乳酸菌を含むＩＬ－１０の産生促進のための剤、などを提供すること、を目的とする。
上記目的を達成するため、本発明者は、新規に乳酸菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５７０））を見出した。更に、本発明者は、ヒト等の細胞に対して、当該見出した乳酸菌を添加することにより、当該細胞においてＩＬ－１０を産生することも見出した。これらを見出したことにより、本発明者は本発明を完成させた。
本発明は以下の実施形態を含む。
（１）乳酸菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５７０））を有効成分として含む、ＩＬ－１０の産生促進のための剤。
（２）当該乳酸菌が死菌である、（１）に記載の剤。
（３）（１）又は（２）を含有する、経口組成物。
本発明は以下の実施形態を含む。
（１）乳酸菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５７０））を有効成分として含む、ＩＬ－１０の産生促進のための剤。
（２）当該乳酸菌が死菌である、（１）に記載の剤。
（３）（１）又は（２）を含有する、経口組成物。
本発明の剤などは、例えば、ＩＬ－１０の産生促進のため、ブルーライト等の光の暴露に起因する視機能の障害を防止するため、用いることができる。
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
（乳酸菌）
本発明に使用される乳酸菌は、味噌、醤油、漬物、糠、牧草、米、麦、麦芽など加工食品から分離され、糖質などを利用して乳酸を産生する乳酸菌である。例えば、米及び米加工品から分離され、抗変異原性を有する複数の乳酸菌が報告されている（日本食品科学工学会誌、第４８巻、第９号、６９３～６９６頁、２００１年）。本発明の有効成分として用いられる乳酸菌は、これらの中で、株（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）又はその変異株が最も好ましい。なおここで「変異株」とは、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。
本発明に使用される乳酸菌は、味噌、醤油、漬物、糠、牧草、米、麦、麦芽など加工食品から分離され、糖質などを利用して乳酸を産生する乳酸菌である。例えば、米及び米加工品から分離され、抗変異原性を有する複数の乳酸菌が報告されている（日本食品科学工学会誌、第４８巻、第９号、６９３～６９６頁、２００１年）。本発明の有効成分として用いられる乳酸菌は、これらの中で、株（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）又はその変異株が最も好ましい。なおここで「変異株」とは、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。
なお、株（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）は、２０２１年１２月７日（原寄託日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、１２２号室）に寄託されている。受託番号は、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５７０である（以下、本菌株を「Ｌ０３８株」と称する）。
本発明の有効成分として用いられる乳酸菌の菌体は、生菌体及び死菌体のいずれでもよいが、例えば生菌体の増殖による異臭発生防止などを考慮すると好ましくは死菌体が用いられる。より好ましくは、上記乳酸菌を公知の加熱処理手段で殺菌して得られる加熱殺菌菌体が用いられる。加熱殺菌菌体は、上記乳酸菌を、所定の培地を用いて常法に従って培養して得られた培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の方法により菌体を回収し、水洗後、水等に懸濁して１２０℃以下（好ましくは８０～１２０℃）、３０分以内（３秒～３０分間）加熱処理した後、必要に応じて濃縮、乾燥することにより調製できる。また菌体を焼成、蒸煮（例えば１７０℃以下、６０分以内）に付すことによって調製してもよい。
（ＩＬ－１０の産生促進のための剤）
ＩＬ－１０の産生促進のための剤は、上記Ｌ０３８株の菌体を有効成分として含み、スキンケア作用を有する製剤又は組成物を意味する。好ましい実施形態において用いられる死菌体は、ＩＬ－１０の産生促進の効果が期待できるだけでなく、生菌の場合、製品製造以降の配送時や陳列時に形態変化を起こす可能性があるのに対し、それ以上形態変化を起こさない死菌体は好適に使用できる。
ＩＬ－１０の産生促進のための剤は、上記Ｌ０３８株の菌体を有効成分として含み、スキンケア作用を有する製剤又は組成物を意味する。好ましい実施形態において用いられる死菌体は、ＩＬ－１０の産生促進の効果が期待できるだけでなく、生菌の場合、製品製造以降の配送時や陳列時に形態変化を起こす可能性があるのに対し、それ以上形態変化を起こさない死菌体は好適に使用できる。
ＩＬ－１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０）は、炎症及び自己免疫応答を抑制するサイトカインで、誘導性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制能の一端を担うサイトカインである。Ｔｙｐｅ１ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ （Ｔｒ１）細胞は、ＩＬ－１０産生を特徴とするＩＬ－１０産生制御性Ｔ細胞の中でも代表的なものである（日本臨床免疫学会会誌、３６ 巻 （２０１３） １ 号、４０～４６ページ）。
（眼疲労）
眼疲労は、眼が重い、物がぼやけるなどの一般的な眼の疲れであり、一定の休息を取
ることによって比較的短時間に回復する疲労である。眼疲労の蓄積により眼精疲労に発展
する。眼精疲労は、疲労状態が著しく病的な状態であり、休息を取っても回復しない。視
作業を続けることにより、眼部、鼻根部、前額部の不快感、圧迫、頭痛、視力減衰、めま
い、吐き気などを訴える（特許文献５）。眼疲労は、例えば、焦点調節機能に影響を及ぼす毛様体筋などの眼調節系の筋肉疲労と、認知機能に影響を及ぼす視覚情報処理の中枢性疲労、が挙げられる。眼調節系の筋疲労の原因の一つに、近くにあるものを長時間注視し続けることが挙げられる。ＰＣディスプレイや本などの近距離にある物体を長時間注視すると眼の特定の筋肉の緊張状態が続き、筋肉疲労物質が蓄積して眼疲労として現れる。眼疲労の中でも、パーソナルコンピューター（ＰＣ）の普及に伴い急激に増加してきたＶＤＴ（Ｖｉｓｕａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｒｍｉｎａｌ）作業による眼疲労が非常に多くなっている。当該眼疲労の解決が望まれている。
眼疲労は、眼が重い、物がぼやけるなどの一般的な眼の疲れであり、一定の休息を取
ることによって比較的短時間に回復する疲労である。眼疲労の蓄積により眼精疲労に発展
する。眼精疲労は、疲労状態が著しく病的な状態であり、休息を取っても回復しない。視
作業を続けることにより、眼部、鼻根部、前額部の不快感、圧迫、頭痛、視力減衰、めま
い、吐き気などを訴える（特許文献５）。眼疲労は、例えば、焦点調節機能に影響を及ぼす毛様体筋などの眼調節系の筋肉疲労と、認知機能に影響を及ぼす視覚情報処理の中枢性疲労、が挙げられる。眼調節系の筋疲労の原因の一つに、近くにあるものを長時間注視し続けることが挙げられる。ＰＣディスプレイや本などの近距離にある物体を長時間注視すると眼の特定の筋肉の緊張状態が続き、筋肉疲労物質が蓄積して眼疲労として現れる。眼疲労の中でも、パーソナルコンピューター（ＰＣ）の普及に伴い急激に増加してきたＶＤＴ（Ｖｉｓｕａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｒｍｉｎａｌ）作業による眼疲労が非常に多くなっている。当該眼疲労の解決が望まれている。
（ＩＬ－１０の産生促進のための剤を含有する組成物）
一実施形態としての組成物は、有効成分である菌体又はその培養物をそのまま用いることもできるが、製剤上許容される担体等を適宜配合して、例えば経口組成物等の形態に調製される。
一実施形態としての組成物は、有効成分である菌体又はその培養物をそのまま用いることもできるが、製剤上許容される担体等を適宜配合して、例えば経口組成物等の形態に調製される。
なお、好ましい実施形態の組成物は、乳酸菌を死菌体で含有させることができ、該組成物の製品を提供するに当たっては、加圧などの加熱以外の条件を適宜用いてもよい。
本実施形態の組成物中へのＬ０３８株菌体の配合量は、一般には、組成物１００ｇ中に、菌数が１０８～１０１１個前後（生菌数である必要はない。但し、死菌体を含む場合は、殺菌前の生菌数として計数するものとする。以下、同じ）となる量から適宜選択することができる。生菌数の測定は、菌培養用の寒天培地に希釈した試料を塗布して３７℃で培養を行い、生育したコロニー数を計測することにより算出する。この生菌数と濁度とは相関するため、予め生菌数と濁度との相関を求めておくと、生菌数の測定に代えて濁度を測定することによって上記生菌数を計数できる。以下に、各組成物の形態について具体的に説明する
（経口組成物）
本発明に係る経口組成物は、例えば飲食品（機能性表示食品、特定保健用食品、サプリメントなども含む）、医薬品などである。
本発明に係る経口組成物は、例えば飲食品（機能性表示食品、特定保健用食品、サプリメントなども含む）、医薬品などである。
例えば、当該経口組成物が飲食品の場合、当該飲食品の形態は、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料などの各種飲食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。種々の形態の食品は、本発明の有効成分を単独で、または他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
例えば、当該経口組成物が医薬品の場合は、当該医薬品は一般的に苦痛の程度に従って調整することができる好都合の１日投薬レジメンを組み立てやすいが、当該医薬品の形態は、例えば固体の形態、液体の形態である。当該固体の形態は、例えば、粉末剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤、坐剤および分散性顆粒剤などが挙げられる。例えば、粉末剤では、担体は一般に、微粉化した活性成分との混合物である微粉化した固体である。例えば、錠剤では、活性成分は一般に、必要な結合能力を有する担体と適切な割合で混合され、所望の形状および大きさに成形される。適切な担体は、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等を非限定的に含むこともある。当該医薬品は、所望の効果を損なわない範囲内で、必要に応じて賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、ｐＨ調整剤、防腐剤等の成分を含有することもできる。
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、本発明の剤などに含有される成分等の含有量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。
以下、本発明の実施例について、説明する。
［試験例１］表皮角化細胞を用いたＬ０３８株菌体の機能性評価試験（ＲＴ－ＰＣＲ）
ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、ランダムに選択した他の菌体と比べて、Ｌ０３８株菌体の機能性評価を行った。
ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、ランダムに選択した他の菌体と比べて、Ｌ０３８株菌体の機能性評価を行った。
（試験方法の概要）
１．試験で用いる細胞の準備
表皮角化細胞（ＫＫ－４００９、凍結ＮＨＥＫ（ＮＢ）新生児由来、ＫＵＲＡＢＯ）を準備した。表皮角化細胞を、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ））及びサプリメントＳ７を添加したＥｐｉＬｉｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、所定の条件（５％ＣＯ２、３７℃）で培養して、この試験で使用の表皮角化細胞を準備した。
１．試験で用いる細胞の準備
表皮角化細胞（ＫＫ－４００９、凍結ＮＨＥＫ（ＮＢ）新生児由来、ＫＵＲＡＢＯ）を準備した。表皮角化細胞を、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ））及びサプリメントＳ７を添加したＥｐｉＬｉｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、所定の条件（５％ＣＯ２、３７℃）で培養して、この試験で使用の表皮角化細胞を準備した。
Ｊ７７４．１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手した単球・マクロファージ様細胞株）を準備した。Ｊ７７４．１細胞を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（富士フィルム和光純薬、１８９－０２０２５）を用いて、所定の条件（５％ＣＯ２、３７℃）で培養して、この試験で使用のＪ７７４．１細胞を準備した。
２．Ｌ０３８株などの菌株の準備
Ｌ０３８株などこの試験で用いる菌株は、所定の培地を用いて３７℃で２４時間培養した後、４℃冷却下で生理食塩水を用いて遠心洗浄（３０００ｒｐｍ、１０分）を４回繰り返した菌体の懸濁液を純水にて調製し、オートクレーブで滅菌したものを使用した。この試験で用いた菌株を以下に示す。
・Ｌ００６：Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍの菌体（漬物由来、秋田今野様提供）
・Ｌ０３８：上述の通り（穀物発酵種由来、秋田今野様提供）
・Ｌ０５８：Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（漬物由来、秋田今野様提供）
・Ｌ０６０：Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（酒由来、秋田今野様提供）
Ｌ０３８株などこの試験で用いる菌株は、所定の培地を用いて３７℃で２４時間培養した後、４℃冷却下で生理食塩水を用いて遠心洗浄（３０００ｒｐｍ、１０分）を４回繰り返した菌体の懸濁液を純水にて調製し、オートクレーブで滅菌したものを使用した。この試験で用いた菌株を以下に示す。
・Ｌ００６：Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍの菌体（漬物由来、秋田今野様提供）
・Ｌ０３８：上述の通り（穀物発酵種由来、秋田今野様提供）
・Ｌ０５８：Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（漬物由来、秋田今野様提供）
・Ｌ０６０：Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（酒由来、秋田今野様提供）
当該懸濁液をｑＮＡＮＯで粒度観察した。当該粒度結果を以下表１及び図１～図４に示す。図１～４は、ｑＮＡＮＯナノ粒子マルチアナライザー（ＩＺＯＮ社製）で測定した当該懸濁液の粒径分布である。表１で記載の定義は以下意味する。
・懸濁液濃度（％）：懸濁液中に含有する菌体の濃度（質量％）。
・平均粒子径（ｎｍ）：当該懸濁液に含有された菌体の平均粒子径。
・測定粒子濃度（個／ｍＬ）：当該懸濁液（１ｍＬあたり）における菌体の個数（個）。
・懸濁液濃度（％）：懸濁液中に含有する菌体の濃度（質量％）。
・平均粒子径（ｎｍ）：当該懸濁液に含有された菌体の平均粒子径。
・測定粒子濃度（個／ｍＬ）：当該懸濁液（１ｍＬあたり）における菌体の個数（個）。
３．ＲＴ－ＰＣＲ
２４穴プレートにて細胞密度がコンフルエントになるまで表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞）を、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。この培養後に、当該２４穴プレートに最終濃度が１ｍＭになるようにカルシウムを添加した。このカルシウムの添加後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間の培養を行った。
２４穴プレートにて細胞密度がコンフルエントになるまで表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞）を、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。この培養後に、当該２４穴プレートに最終濃度が１ｍＭになるようにカルシウムを添加した。このカルシウムの添加後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間の培養を行った。
当該２４時間培養後の細胞に対し、上述の懸濁液を、質量比でそれぞれ０．１％となるように添加し、以下の群を作製した。
（実験群）
・コントロール群：菌体を添加しなかった群
・Ｌ００６添加群：菌体（Ｌ００６）を含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０３８添加群：菌体（Ｌ０３８）を含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０５８添加群：菌体（Ｌ０５８）を含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０６０添加群：菌体（Ｌ０６０）を含有する懸濁液を添加した群
（実験群）
・コントロール群：菌体を添加しなかった群
・Ｌ００６添加群：菌体（Ｌ００６）を含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０３８添加群：菌体（Ｌ０３８）を含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０５８添加群：菌体（Ｌ０５８）を含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０６０添加群：菌体（Ｌ０６０）を含有する懸濁液を添加した群
当該群を作製後、さらにＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。この２４時間培養後の細胞より、ｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡの精製にはＱＩＡＧＥＮ社より販売されているＱＩＡｓｈｒｅｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。
精製したｍＲＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａより販売されているＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。以下の表２に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。ＲＴ－ＰＣＲにはＴａＫａＲａより販売されているＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはＲＰＳ１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１８）の増幅結果を用いた。
（試験の結果：ＲＴ－ＰＣＲの結果）
以下結果を示す。結果は、コントロール群の値（当該相対定量にて発現量変化）を１とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第４位を四捨五入した値である。
・コントロール群：１
・Ｌ００６添加群：０．５４３
・Ｌ０３８添加群：４．４４１（＊）
・Ｌ０５８添加群：０．９４６
・Ｌ０６０添加群：１．７５９
以下結果を示す。結果は、コントロール群の値（当該相対定量にて発現量変化）を１とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第４位を四捨五入した値である。
・コントロール群：１
・Ｌ００６添加群：０．５４３
・Ｌ０３８添加群：４．４４１（＊）
・Ｌ０５８添加群：０．９４６
・Ｌ０６０添加群：１．７５９
＊印は、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定において、コントロール群の値（１）との比較による有意差（ｐ＜０．０１）、を示す。当該試験結果より、他の菌体と比べて、菌体（Ｌ０３８）の添加により、ＩＬ－１０の産生量が高いことを確認した。
４．ＲＴ－ＰＣＲ
２４穴プレートにて細胞密度が８０％コンフルエントになるまでＪ７７４．１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手した単球・マクロファージ様細胞株）を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。この培養後に、培地交換を行い、０．１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。
２４穴プレートにて細胞密度が８０％コンフルエントになるまでＪ７７４．１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手した単球・マクロファージ様細胞株）を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。この培養後に、培地交換を行い、０．１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。
当該２４時間培養後の細胞に対し、以下の群を作製した。
（実験群）
・コントロール群：菌体を添加しなかった群
・Ｌ０３８添加群１：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度８μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０３８添加群２：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度４０μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
（実験群）
・コントロール群：菌体を添加しなかった群
・Ｌ０３８添加群１：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度８μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０３８添加群２：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度４０μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
当該群を作製後、さらにＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。この２４時間培養後の細胞より、ｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡの精製にはＱＩＡＧＥＮ社より販売されているＱＩＡｓｈｒｅｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。
精製したｍＲＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａより販売されているＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ、ＲＲ０３６Ａ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。以下の表３に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。ＲＴ－ＰＣＲにはＴａＫａＲａより販売されているＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはＲＰＳ１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１８、配列番号１及び配列番号２）の増幅結果を用いた。
（試験の結果：ＲＴ－ＰＣＲの結果）
以下結果を示す。結果は、コントロール群の値（当該相対定量にて発現量変化）を１とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第３位を四捨五入した値である。
・コントロール群：１
・Ｌ０３８添加群１：４４．４１
・Ｌ０３８添加群２：８３．９４
以下結果を示す。結果は、コントロール群の値（当該相対定量にて発現量変化）を１とした場合の値で示す。これらの値は、小数点第３位を四捨五入した値である。
・コントロール群：１
・Ｌ０３８添加群１：４４．４１
・Ｌ０３８添加群２：８３．９４
５．ＥＬＩＳＡ
２４穴プレートにて細胞密度が８０％コンフルエントになるまでＪ７７４．１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手した単球・マクロファージ様細胞株）を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。この培養後に、培地交換を行い、０．１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。
２４穴プレートにて細胞密度が８０％コンフルエントになるまでＪ７７４．１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手した単球・マクロファージ様細胞株）を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。この培養後に、培地交換を行い、０．１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にてＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。
当該２４時間培養後の細胞に対し、以下の群を作製した。
（実験群）
・コントロール群：菌体を添加しなかった群
・Ｌ０３８添加群１：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度８μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０３８添加群２：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度４０μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
（実験群）
・コントロール群：菌体を添加しなかった群
・Ｌ０３８添加群１：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度８μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
・Ｌ０３８添加群２：菌体（Ｌ０３８）を最終濃度４０μｇ／ｍＬ含有する懸濁液を添加した群
当該群を作製後、さらにＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。この培養後、当該培養の培養液の上清を回収した。当該上清の中のＩＬ－１０の量を、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－１０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｍ１０００Ｂ－１）を用いて評価した。ＩＬ－１０産生量は、培養後にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で均質化処理した細胞懸濁液を用い、ＢＣＡ法により求めたタンパク質量で補正した。
（試験の結果：ＥＬＩＳＡの結果）
以下結果を示す。これらの値は、小数点第３位を四捨五入した値である。
・コントロール群：６．０
・Ｌ０３８添加群１：２７１．０
・Ｌ０３８添加群２：４７５．３
以下結果を示す。これらの値は、小数点第３位を四捨五入した値である。
・コントロール群：６．０
・Ｌ０３８添加群１：２７１．０
・Ｌ０３８添加群２：４７５．３
以上、本発明の実施の形態（実施例も含め）について、図面を参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。
Claims (1)
- Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５７０）の死菌を有効成分として含む、ＩＬ－１０の産生促進のための剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| JP2022092866 | 2022-06-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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ID=89235557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023076069A Pending JP2023180218A (ja) | 2022-06-08 | 2023-05-02 | 乳酸菌を含むｉｌ－１０の産生促進のための剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023180218A (ja) |
-
2023
- 2023-05-02 JP JP2023076069A patent/JP2023180218A/ja active Pending
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