JP2023175834A - Ｔｐｂｇ－陽性ドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病治療用薬学的組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】ドーパミン神経細胞の製造方法を提供する。【解決手段】次の段階を含むドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ）の製造方法：（ａ）細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体と接触させる段階；及び（ｂ）ＴＰＢＧ抗体に結合するＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階。【選択図】図１９
Description
本発明は、ドーパミン神経細胞の分離方法及びこれを用いて分離されたドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病治療用薬剤学的組成物に関するものである。
本開示は、２０１８年４月３０日から２０２１年１２月３１日まで、韓国保健産業振興院の管理下にある延世大学産業財団による「先進医療技術の開発」と題された研究プロジェクト内で、「多能性幹細胞の神経障害への応用のための移植細胞の最小数のインビボ分化モニタリング及び予測」という研究テーマの下で実施されたプロジェクト番号ＨＩ１８Ｃ０８２９の下で、韓国の保健福祉部の支援を受けて行われた。
本出願は、２０１８年５月２日に韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０－２０１８－００５０９１８号及び２０１９年４月２５日に韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０－２０１９－００４８７８４号について優先権を主張し、上記特許出願の開示事項は、参照により本明細書に組み込まれる。
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）は細胞－基盤治療法（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）に最も適切な、中脳性ドーパミン（ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ、ｍＤＡ）神経細胞の局所的死滅（ｆｏｃａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）による神経退行性障害の１つである。
１９８０年代初期から、胎児腹側中脳（ｆｅｔａｌ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ、ＶＭ）組織を患者の線条体（ｓｔｒｉａｔａｌ）に移植することによって、パーキンソン病関連運動機能を回復させようとする試みがなされてきた。
このような研究によって、移植片により運動機能の回復が誘導できることを確認したが、研究機関ごとに細胞移植の結果が一貫せず、一部の場合、副作用も表れて、以後、細胞－基盤治療法がさらに改善されなければならないという共感が形成された。
特に、既存の研究で問題として指摘されていた、移植材料である細胞を生体に存在する細胞と近接した水準に発達させ、胎児組織の制限された可用性及び非一貫性（ｂａｔｃｈ－ｔｏ－ｂａｔｃｈ ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）などの短所を補完するための代案研究が続けられてきた。
その結果、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で無限増殖能を示し、多様な神経細胞への幅広い分化能を有する、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣｓ）及び誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）を含むヒト多能性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｈＰＳＣｓ）が注目を受けるようになった。
これによって、最近まで多様なｍＤＡ神経細胞の分化技術が開発されて高い収率の細胞を生産することができる水準に進化したが、最近、開発された分化技術を通じてｈＰＳＣから分化誘導された結果物でもｍＤＡ神経細胞の以外の他の種類の細胞が多く混ざっている異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が観察されて、現在の分化技術を土台に臨床適用を考慮することには困難な状況である。
したがって、多様な細胞集団からのｈＰＳＣ－由来ｍＤＡ神経細胞の同定及び分離は、移植細胞の標準化だけでなく、成功的な移植治療研究に非常に重要である。
一方、初期のｈＰＳＣから分化誘導されたｍＤＡ神経細胞を純粋分離（濃縮）させるための戦略は、多表面抗原（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）を標的とする蛍光－活性化細胞選別法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）を基盤とした。このような接近法はチロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、ＴＨ）を発現する神経細胞集団（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を増加させたが、このような細胞集団がｍＤＡ神経細胞特性を保有したか否かは不明であった。
最近、マウスｆＶＭ組織及びマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）－由来ｍＤＡ神経前駆細胞の転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）を分析して、ｍＤＡ神経細胞を区別して濃縮させることができる特異的表面マーカーを同定する研究が遂行された。
このような研究は、いくつかの可能性ある細胞表面マーカーを提示しており、これを用いてドーパミン神経細胞の分離及び濃縮が可能であるということが分かったが、同時に、神経細胞発生過程のうち、正確にどの段階の神経細胞が発現する細胞表面マーカーを同定しなければならないかに対してはまだ明確に明らかにしていなかった。発生段階によって分離された神経細胞の移植後、生存率や分化程度が異なり、これは移植後、機能回復に影響を与えることができるということが本業界の共通な意見であるので、分化段階－特異的マーカーの同定はやはり重要な課題に間違いない。
ここに、中脳性ドーパミン神経細胞及びその分化段階の表面マーカーに対する研究が至急な実状である。
本発明者らは中脳性ドーパミン神経細胞の分化過程を区別し、各段階の細胞表面マーカーを開発しようと努力した。その結果、ＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰ及びＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターｈＥＳＣ細胞株を確立し、これを分化させてＬＭＸ１Ａ＋ ｍＤＡ神経前駆細胞及びＰＩＴＸ３＋ ｍＤＡ神経細胞を分離し、これから中脳性ドーパミン神経細胞と関連した細胞表面マーカー（ＴＰＢＧ）を同定することによって、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、ドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ）の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－陽性ドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）治療用薬学的組成物を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の細胞移植治療法のためのドーパミン神経細胞の効能を増進させ、移植安全性を向上させる方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、ＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－陽性ドーパミン神経細胞を含むドーパミン神経細胞移植用組成物を提供することにある。
本発明者らは中脳性ドーパミン（ｍＤＡ）神経細胞の分化過程を区別し、各段階の細胞表面マーカーを開発しようと努力した。その結果、ＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰ及びＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターｈＥＳＣ細胞株を確立し、これを分化させてＬＭＸ１Ａ＋ ｍＤＡ神経前駆細胞及びＰＩＴＸ３＋ ｍＤＡ神経細胞を分離し、これから中脳性ドーパミン神経細胞と関連した細胞表面マーカー（ＴＰＢＧ）を同定した。
より具体的に、本発明者らはｍＤＡ神経前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）段階－特異的遺伝子であるＬＭＸ１Ａが発現する時、同時に緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）が発現されるように操作されたＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーターｈＥＳＣ細胞株、及び成熟したｍＤＡ神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ）段階－特異的遺伝子であるＰＩＴＸ３が発現する時、同時に赤色蛍光蛋白質（ｍＣｈｅｒｒｙ）が発現されるように操作されたＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターｈＥＳＣ細胞株を各々樹立し、ＬＭＸ１Ａ＋ ｍＤＡ神経前駆細胞及びＰＩＴＸ＋ ｍＤＡ神経細胞の転写体比較分析を通じて、ｍＤＡ神経細胞の前駆体（神経前駆細胞）に特異的に発現される細胞表面マーカー候補を選別した。そのうち、ＴＰＢＧを新たな細胞表面マーカーとして発見しており、ＴＰＢＧを標的とする細胞分離の結果、ｍＤＡ神経前駆細胞が濃縮することを確認した。また、ｍＤＡ神経前駆細胞段階で磁性－活性細胞選別法（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ）により選別されたＴＰＢＧ－陽性細胞を６－ＯＨＤＡ－損傷パーキンソン病（ＰＤ）ラットモデルに移植した結果、ＰＤラットで腫瘍形成無しに運動機能異常症状が回復することを確認した。
したがって、ＴＰＢＧは移植可能なｍＤＡ神経前駆細胞を分離するための新たな表面マーカー蛋白質であって、ＴＰＢＧを用いて分離されたｍＤＡ細胞はパーキンソン病治療のための安全で、効果的な細胞代替治療法を提供できることと期待される。
本発明は、ドーパミン神経細胞の分離方法、これを用いて分離されたドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病治療用薬剤学的組成物、パーキンソン病の細胞移植治療法のためのドーパミン神経細胞の効能を増進させて移植安全性を向上させる方法、及びこれを用いて製造されたドーパミン神経細胞移植用組成物に関するものである。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一態様は、次の段階を含むドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ）の製造方法に関するものである。
（ａ）細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体と接触させる段階；及び
（ｂ）ＴＰＢＧ抗体に結合するＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階。
（ａ）細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体と接触させる段階；及び
（ｂ）ＴＰＢＧ抗体に結合するＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階。
本発明で、“神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ）”は神経系を構成する細胞で、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）と同一の意味として使われることができ、“ドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ）”は神経伝達物質であるドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）を分泌する神経細胞を意味する。
前記ドーパミン神経細胞は、ドーパミン神経前駆細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ又はｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）又は成熟ドーパミンニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）でありうるが、これに制限されるものではない。
本発明で、“神経前駆細胞”はまだ分化形質を発現していない未分化前駆細胞を意味し、“ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ”、“ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ”及び“ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ”全て同一の意味で使われることができる。
前記ドーパミン神経細胞は、中脳性（ｍｉｄｂｒａｉｎ）ドーパミン神経細胞でありうる。
本発明で、“中脳性ドーパミン神経細胞”とは、中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）領域で観察されるドーパミン神経細胞を意味し、例えば、中脳腹側（ｖｅｎｔｒａｌ）領域で観察されるドーパミン神経細胞を意味するものでありうるが、これに制限されるものではない。
また、前記中脳性ドーパミン神経細胞はＡ９領域－特異的（Ａ９ ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に発現することができる。
前記“Ａ９領域”は、中脳腹外側（ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ）領域で、中脳黒色質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ）の緻密部（ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ）に該当する部分を意味するところ、本発明の製造方法により製造された細胞は中脳性細胞であることが分かる。
また、前記Ａ９領域は、ドーパミン神経細胞が密集した部位で、運動機能の調節と関連があり、特に、パーキンソン病患者の場合、この部位のドーパミン神経細胞が特異的に死滅されていることを特徴とするところ、本発明の製造方法により製造された細胞はパーキンソン病の予防及び／又は治療目的で使われることができる。
以下、本発明のドーパミン神経細胞製造方法について詳細に説明する。
（ａ）段階
前記“細胞集団”は、ヒト幹細胞（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）；前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ又はｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）；及び／又はヒト幹細胞又は前駆細胞から分化されたドーパミン神経前駆細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、成熟ドーパミンニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）及びこれに由来する神経誘導体（ｎｅｕｒａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を含むものでありうるが、これに制限されるものではない。
前記“細胞集団”は、ヒト幹細胞（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）；前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ又はｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）；及び／又はヒト幹細胞又は前駆細胞から分化されたドーパミン神経前駆細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、成熟ドーパミンニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）及びこれに由来する神経誘導体（ｎｅｕｒａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を含むものでありうるが、これに制限されるものではない。
具体的に、前記ヒト幹細胞又は前記前駆細胞は、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ）、胚性癌腫細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）、誘導多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）、成体幹細胞（Ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は胎児細胞（Ｆｅｔａｌ ｃｅｌｌｓ）でありうるが、これに制限されるものではない。
前記胎児細胞は、胎児神経組織（Ｆｅｔａｌ ｎｅｕｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ）又はその誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）に由来するものでありえ、例えば、胎児腹側中脳細胞（ｆｅｔａｌ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｃｅｌｌｓ；ｆＶＭ ｃｅｌｌｓ）でありうるが、これに制限されるものではない。
（ｂ）段階
前記“ＴＰＢＧ”は、Ｗｎｔ－活性化阻害因子１（Ｗｎｔ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ １）又はＷＡＩＦ１と同一の意味で使われることができ、Ｗｎｔ／β－カテニン信号伝達経路の拮抗剤として知られているが、ＴＰＢＧの発現を通じてのドーパミン神経細胞分離に対してはまだ報告されたことがない。
前記“ＴＰＢＧ”は、Ｗｎｔ－活性化阻害因子１（Ｗｎｔ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ １）又はＷＡＩＦ１と同一の意味で使われることができ、Ｗｎｔ／β－カテニン信号伝達経路の拮抗剤として知られているが、ＴＰＢＧの発現を通じてのドーパミン神経細胞分離に対してはまだ報告されたことがない。
前記遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号５３に示した。また、前記遺伝子はヌクレオチド配列が遺伝子バンクに登録されているので、当業者であれば、容易に入手可能である。
本発明で、“ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞”とは、ＴＰＢＧ抗体に結合するドーパミン神経細胞を意味する。
前記“ＴＰＢＧ抗体”は、ＴＰＢＧに特異的に結合する抗体を意味する。
本段階で、ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する方法は、標的を特定して細胞を分離する方法であれば、如何なる方法でも使われることができ、例えば、蛍光－活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）及び／又は磁性－活性細胞選別法（ＭＡＣＳ）を用いるものでありうるが、これに制限されるものではない。
前記ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞は、パーキンソン病の症状を緩和させることができる。
前記ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞は、細胞移植治療法の安全性を向上させることができる。
本発明の他の態様は、ＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－陽性ドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）治療用薬学的組成物に関するものである。
本発明に従う薬学的組成物は、有効性分の以外に薬剤学的に許容される担体を含むことができる。この際、薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、滑石、ステアル酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。また、前記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか、又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、又は局所に適用）することができ、投与量は患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路、及び時間によって異なるが、当業者により適切に選択できる。
本発明の薬学的組成物は薬学的に有効な量で投与する。本発明において、“薬学的に有効な量”は医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療することに十分な量を意味し、有効量は患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使われる薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定できる。
本発明に従う薬学的組成物は、個別の治療剤として投与するか、又は他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次又は同時に投与することができ、単一又は多重投与できる。前記要素を全て考慮して副作用無しに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定できる。
具体的に、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内での活性成分の吸収度、不活性率及び排泄速度、疾病の種類、併用される薬物によって変えることができる。
本発明の更に他の態様は、前記ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を個体に投与する段階を含むパーキンソン病治療方法に関するものである。
前記“個体”とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非－ヒトの霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、犬、猫、馬、及び牛などの哺乳類を意味する。
本発明の更に他の態様は、前記ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞のパーキンソン病治療用途に関するものである。
前記ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病治療用薬学的組成物において、前記ドーパミン神経細胞の製造方法と重複する内容は本明細書の複雑性を考慮して省略する。
本発明の更に他の態様は、次の段階を含むパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の細胞移植治療法のためのドーパミン神経細胞の効能を増進させ、移植安全性を向上させる方法に関するものである。
（ａ）細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－抗体と接触させる段階；及び
（ｂ）ＴＰＢＧ抗体に結合するＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階。
（ａ）細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－抗体と接触させる段階；及び
（ｂ）ＴＰＢＧ抗体に結合するＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階。
前記ドーパミン神経細胞の効能を増進させ、移植安全性を向上させる方法において、前記ドーパミン神経細胞の製造方法と重複する内容は本明細書の複雑性を考慮して省略する。
本発明の更に他の態様は、ＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－陽性ドーパミン神経細胞を含むドーパミン神経細胞移植用組成物に関するものである。
前記ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞はドーパミン神経細胞の製造方法により培養することができ、前記方法により培養されたＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞は細胞効能が増進され、移植安全性が向上したものでありうる。
一方、前記ドーパミン神経細胞の移植は当業界に公知の適切な移植部位（例えば、脳の被殻［ｐｕｔａｍｅｎ］又は尾状核［ｃａｕｄａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ］、又はこれを全て包含する線条体［ｓｔｒｉａｔｕｍ］など）を選定し、移植部位に公知の方式（例えば、脳定位システム［ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ］など）により遂行できる。
本発明の組成物はパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療用途に使われることができる。
本発明の組成物は移植細胞としてドーパミン神経細胞のみを単独で含むか、又は有効性分（移植細胞）以外に生体由来及び／又は生分解性安定化剤を含むことができる。前記安定化剤は前記ドーパミン神経細胞を安定に分散させるためのものであって、生体由来物質であるので、体内移植時、副作用がないか、又はそうでなければ、生分解性を有しなければならない。本発明で、生分解性ということは、体内で徐々に分解されて吸収される特性を意味し、分解される速度には特別に意味を置かない。
前記安定化剤には、ヒアルロン酸、コラーゲン、トロンビン、エラスチン、硫酸コンドロイチン、アルブミン、及びその混合物を含むことができる。特に、前記ヒアルロン酸、コラーゲン、トロンビン、エラスチン、硫酸コンドロイチン、アルブミンなどは生体由来物質で、生体内で自然的に分解できる生分解性性質を有する。但し、生分解性と媒質で粘度を与える特性を満たす場合であれば、合成された化合物も生分解性物質であり、本発明の用途にも使用することができるので、必ず生体に由来する物質に制限するものではない。
前記安定化剤をドーパミン神経細胞と共に製剤化する場合、ドーパミン神経細胞が媒質中に浮遊するか、又は沈降せず、均等に分散されて存在することができる。
前記ＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を含むドーパミン神経細胞移植用組成物において、前記ドーパミン神経細胞の製造方法と重複する内容は本明細書の複雑性を考慮して省略する。
本発明はドーパミン神経細胞の分離方法及びこれを用いて分離されたドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病治療用薬剤学的組成物に関するものであって、前記ドーパミン神経細胞の分離方法はＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階を含むことによって、本方法により分離されたドーパミン神経細胞は移植時、細胞の効能が増進し、移植安全性が向上したことを特徴とするので、パーキンソン病治療のための細胞移植用途に有用に使われることができる。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｈＥＳＣ）培養
未分化のｈＥＳＣｓ（Ｈ９、ＷｉＣｅｌｌ Ｉｎｃ．，米国）をミトマイシン－Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ－Ｃ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）処理マウスＳＴＯ線維芽細胞（ＡＴＣＣ、米国）層で２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ－Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、米国）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。
未分化のｈＥＳＣｓ（Ｈ９、ＷｉＣｅｌｌ Ｉｎｃ．，米国）をミトマイシン－Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ－Ｃ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）処理マウスＳＴＯ線維芽細胞（ＡＴＣＣ、米国）層で２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ－Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、米国）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。
クローナル細胞の遺伝型分析（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
ゲノムＤＮＡはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキット（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を使用して製造会社の指示によって抽出した。ゲノムＤＮＡ ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７２０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標） ＧＴ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．， Ｊａｐａｎ）を使用して遂行した。
ゲノムＤＮＡはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキット（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を使用して製造会社の指示によって抽出した。ゲノムＤＮＡ ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７２０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標） ＧＴ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．， Ｊａｐａｎ）を使用して遂行した。
ＦＡＣＳ
ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩセルソーター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して細胞選別を遂行した。ｅＧＦＰ－陽性分画は４８８ｎｍレーザーを用いて蛍光強度によって決定しており、ｍＣｈｅｒｒｙ－陽性分画は５６１ｎｍレーザーを用いて蛍光強度によって決定した。
ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩセルソーター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して細胞選別を遂行した。ｅＧＦＰ－陽性分画は４８８ｎｍレーザーを用いて蛍光強度によって決定しており、ｍＣｈｅｒｒｙ－陽性分画は５６１ｎｍレーザーを用いて蛍光強度によって決定した。
ＭＡＣＳ
抗体の非特異的結合を抑制するために、細胞を１％ＦＢＳ－ＰＢＳ溶液で培養（４℃、３０分間）後、３０分間４℃で一次抗体（以下の表１参照）と結合させた。
抗体の非特異的結合を抑制するために、細胞を１％ＦＢＳ－ＰＢＳ溶液で培養（４℃、３０分間）後、３０分間４℃で一次抗体（以下の表１参照）と結合させた。
洗浄後、一次抗体－標識された細胞を１×１０７細胞当たり２０μＬのマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に培養した。洗浄後、細胞懸濁液を磁気（ｍａｇｎｅｔｉｃ）スタンドに付着された分離カラム（ＬＳカラム）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）にローディングした。カラム洗浄中に通過された陰性－標識細胞を別途のチューブに収集し、磁性スタンドからカラムを除去した後、カラム内に残存する陽性－標識細胞を培養培地と共に他のチューブに溶出させた。
免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析
まず、細胞を４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液に固定させた。
まず、細胞を４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液に固定させた。
次に、抗体の細胞質内への透過を円滑にするために、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００－ＰＢＳ溶液で１５分間処理後、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｖｏｇｅｎ、オーストラリア）－ＰＢＳ溶液で室温で１時間の間反応させた後、一次抗体（前記表１参照）と４℃で一晩中結合させた。前記一次抗体が結合された蛋白質を視覚化するために、適切な蛍光－標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を使用した。
最後に、細胞核を確認するために、４’，６－ダイアミノ－２－フェニルインドールが含まれたマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にマウントし、ＤＰ７１デジタルカメラが取り付けられたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐ．、日本）、オリンパスＦＳＸ１００システム又はＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を使用してイメージを獲得した。
フローサイトメトリー分析法（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
細胞をアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ）を使用して単一細胞に解離後、４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液を使用して固定させた。細胞内マーカーを検出するために、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞膜を透過化させ、１時間の間適切な抗体と共に２％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液で培養した。前記抗体に適切な蛍光－標識二次抗体を使用した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で流動細胞を計数してＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
細胞をアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ）を使用して単一細胞に解離後、４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液を使用して固定させた。細胞内マーカーを検出するために、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞膜を透過化させ、１時間の間適切な抗体と共に２％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液で培養した。前記抗体に適切な蛍光－標識二次抗体を使用した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で流動細胞を計数してＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
遺伝子発現（Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）分析
細胞内に存在する総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）はＥａｓｙ－Ｓｐｉｎ（登録商標） Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、韓国）を使用して分離した。ｃＤＮＡはＰｒｉｍｅ ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用して総ＲＮＡ １μｇから合成された。ｍＲＮＡ水準はＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）及びＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を使用してリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析で定量化された。各標的遺伝子に対するＣｔ値はＧＡＰＤＨの値によって標準化しており、標的遺伝子の標準化された発現水準は比較Ｃｔ方法によって分類（ｓｏｒｔｅｄ）／分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループを対照群サンプルと比較した。データは３個の独立的な実験から得た平均相対偏差±平均の標準偏差（ＳＥＭ）で表現された。遺伝子発現分析に使われたプライマーの配列は以下の表２に示した。
細胞内に存在する総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）はＥａｓｙ－Ｓｐｉｎ（登録商標） Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、韓国）を使用して分離した。ｃＤＮＡはＰｒｉｍｅ ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用して総ＲＮＡ １μｇから合成された。ｍＲＮＡ水準はＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）及びＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を使用してリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析で定量化された。各標的遺伝子に対するＣｔ値はＧＡＰＤＨの値によって標準化しており、標的遺伝子の標準化された発現水準は比較Ｃｔ方法によって分類（ｓｏｒｔｅｄ）／分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループを対照群サンプルと比較した。データは３個の独立的な実験から得た平均相対偏差±平均の標準偏差（ＳＥＭ）で表現された。遺伝子発現分析に使われたプライマーの配列は以下の表２に示した。
マイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析：転写体プロファイリング
各試料の総ＲＮＡ １０μｇをマクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，韓国）で処理／分析しており、試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイにハイブリッド化した。
各試料の総ＲＮＡ １０μｇをマクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，韓国）で処理／分析しており、試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイにハイブリッド化した。
実施例．中脳性ドーパミン（ｍＤＡ）神経細胞への分化プロトコル
具体的なプロトコルは、図１に示した。
具体的なプロトコルは、図１に示した。
前記コロニー形態に培養中であるｈＥＳＣに２ｍｇ／ｍＬのタイプＩＶコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，米国）を３０分間処理して胚性体形成を誘導し、ｂＦＧＦ－ｆｒｅｅ ｈＥＳ培養培地（ＥＢ培地）で培養した。この際、初めの２４時間は１．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を処理し、その後、４日間は５μｍのドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＤＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び５μｍのＳＢ４３１５４２（ＳＢ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理した。
５日目（ｄ５）から２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ及び２０μｇ／ｍＬヒトインシュリン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２ １×Ｎ２補充培地（ｂｍＮ２培地）内マトリゲル－コーティング培養皿にＥＢを付着し、６日間パターニング因子（１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び０．５μＭ ＳＡＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を処理した。
１１日目（ｄ１１）に細く抜いた（ｐｕｌｌｅｄ）ガラスピペットを使用してＥＢコロニー内で形成された神経ロゼットを機械的に単離し、単離された神経ロゼット塊はピペッティングにより細かく砕いてマトリゲル－コーティング培養皿に再付着した。再付着された細胞は２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２ １×Ｎ２及び１×Ｂ２７培地（ｂＮ２Ｂ２７培地）で２日間１μ ＭＣＨＥＭ９９０２１及び０．５μＭ ＳＡＧを追加で補充して増幅（ｅｘｐａｎｄｅｄ）培養させ、中脳性ドーパミン神経細胞特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）分化を誘導した。
１３日目（ｄ１３）にアキュターゼを用いて中脳性ドーパミン神経前駆細胞クラスターを単一細胞に分離し、ｂＦＧＦを含まないＮ２Ｂ２７培地（Ｎ２Ｂ２７培地）で３．１２×１０５細胞／ｃｍ２の密度でマトリゲル－コーティングプレートの上に再付着した。細胞がプレート総面積の９０％近く占める程度に７日間増幅培養させた。
２０日目（ｄ２０）から中脳／腹側の特性を有するようになった中脳性ドーパミン神経前駆細胞を１×Ｎ２、０．５×Ｂ２７及び０．５×Ｇ２１補充剤（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国）が含まれた培地（ＮＢＧ培地）で培養した。この際、初めの７日間は１μＭのＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、その後、１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ、イスラエル）、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ）、２００μＭのアスコルビン酸（ＡＡ）及び１μＭのジブチリルサイクリック－ＡＭＰ（ｄｂ－ｃＡＭＰ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して最終分化させた。
製造例１．ＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｉｎｅ）の製造
具体的なプロトコルは、図２に示した。
具体的なプロトコルは、図２に示した。
１－１．ヌクレアーゼ及び供与（ｄｏｎｏｒ）ＤＮＡプラスミドの設計
ＴＡＬＥＮ－コーディングプラスミドはツールジェン（ＴｏｏｌＧｅｎ Ｉｎｃ．， 韓国）から購入した。
ＴＡＬＥＮ－コーディングプラスミドはツールジェン（ＴｏｏｌＧｅｎ Ｉｎｃ．， 韓国）から購入した。
ＴＡＬＥＮサイトはＬＭＸ１Ａ遺伝子のエクソン９（ｅｘｏｎ ９）の終止コドンであるＴＧＡ近く（５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＡＣ ＴＴ－３’（左側）、５’－ＴＣＡ ＣＡＧ ＡＡＣ ＴＣＴ ＡＧＧ ＧＧＡ ＡＧ－３’（右側））で二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｓａｋｓ、ＤＳＢ）を起こすように設計されており、潜在的オフ－標的（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）サイトはＣａｓ－Ｏｆｆｉｎｄｅｒ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／）を使用して検索した。
供与ＤＮＡプラスミドはプラスミドバックボーンにｐＵＣ１９を使用してＤＨ５αで次の通り製作された：５’ 相同性アーム－内因性ＬＭＸ１Ａゲノムフラグメント（左アーム）－Ｔ２Ａ－ｅＧＦＰ－ｂＧＨポリ（Ａ）－ＰＧＫプロモーター駆動ピューロマイシン耐性カセット－ｂＧＨポリ（Ａ）－３’相同性アーム（右アーム）。
１－２．ＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株の製造
不活性化された（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＳＴＯ上のｈＥＳＣコロニーをＳｔｅｍＭＡＣＳＴＭ ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ完全培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）内ｈＥＳＣ－適合マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）でコーティングされたプレートの上に移した。次に、細胞がプレート総面積の８０～９０％近く占める程度に継代培養した（継代比率、１：５）。アキュターゼを使用して単一細胞（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）に解離させた後、初めて２４時間の間ＲＯＣＫ抑制剤（１０μＭ、Ｙ－２７６３２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が添加された培地内マトリゲル－コーティングプレートに移して、毎日培地を新しく交替した。酵素的継代培養が１０回未満になされたｈＥＳＣのみ実験に使われた。
不活性化された（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＳＴＯ上のｈＥＳＣコロニーをＳｔｅｍＭＡＣＳＴＭ ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ完全培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）内ｈＥＳＣ－適合マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）でコーティングされたプレートの上に移した。次に、細胞がプレート総面積の８０～９０％近く占める程度に継代培養した（継代比率、１：５）。アキュターゼを使用して単一細胞（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）に解離させた後、初めて２４時間の間ＲＯＣＫ抑制剤（１０μＭ、Ｙ－２７６３２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が添加された培地内マトリゲル－コーティングプレートに移して、毎日培地を新しく交替した。酵素的継代培養が１０回未満になされたｈＥＳＣのみ実験に使われた。
アキュターゼを使用してｈＥＳＣを収得し、単一細胞懸濁液を製造した。次に、Ｎｅｏｎトランスフェクションキット（１００μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＲバッファに１．０×１０７細胞／ｍＬの最終密度で穏やかに再懸濁させた。再懸濁された細胞１２０μＬを前記製造例１－１のＴＡＬＥＮ－コーディングプラスミド１対（各６μｇ）及びＬＭＸ１Ａ供与ＤＮＡプラスミド（６μｇ）と混合し、３０ｍｓの間８５０ｍＶの電圧でパルスを加えてエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を遂行した（Ｎｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）。
次に、細胞をｈＥＳＣ培地内ＳＴＯ ｆｅｅｄｅｒを予め接種した２～３個の３５ｍｍプレートに移して、初めの４８時間ＲＯＣＫ抑制剤を添加し、２日間後に培地を交替した後、毎日培地を新しく交替した。
エレクトロポレーション５日間後、前記ｈＥＳＣ培地に０．５μｇ／ｍＬピュロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理した。１０～１４日間後、ピュロマイシン抵抗性を示すコロニーをレポーター細胞株候補に分類し、これを継代培養して細胞数を拡張した。
最終的に、クローナル細胞の遺伝型分析を通じてＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株を確定した。
製造例２．ＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株の製造
具体的なプロトコルは、図３に示した。
具体的なプロトコルは、図３に示した。
２－１．ヌクレアーゼ及び供与ＤＮＡプラスミドの設計
Ｃａｓ９－及びｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）－コーディングプラスミドはツールジェンから購入した。
Ｃａｓ９－及びｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）－コーディングプラスミドはツールジェンから購入した。
ＰＩＴＸ３標的化を媒介するｓｇＲＮＡを製造するための配列は終止コドンであるＴＧＡ近くで二本鎖切断（ＤＳＢ）を起こすように、終止コドンＴＧＡ（５’－ＴＡＣ ＧＧＧ ＣＧＧ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＡＣ ＧＧ－３’（アンダーライン：ＰＡＭ））を横切って位置するように設計された。潜在的オフ－標的（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）サイトはＣａｓ－Ｏｆｆｉｎｄｅｒ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／）を使用して検索した。
供与ＤＮＡプラスミドはプラスミドバックボーンにｐＵＣ１９を使用してＤＨ５αで次の通り製作された：５’相同性アーム－内因性ＰＩＴＸ３ゲノムフラグメント（左アーム）－Ｔ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｂＧＨポリ（Ａ）－ＰＧＫプロモーター駆動ネオマイシン耐性カセット－ｂＧＨポリ（Ａ）－３’相同性アーム（右アーム）。
２－２．ＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株の製造
ＴＡＬＥＮ－コーディングプラスミドの代わりにＣａｓ９－及びｓｇＲＮＡ－コーディングプラスミドを、ＬＭＸ１Ａ供与ＤＮＡプラスミドの代わりにＰＩＴＸ３供与ＤＮＡプラスミドを使用し、０．５μｇ／ｍＬピュロマイシンの代わりに１００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を処理することを除いて、前記製造例１－２と同一の方法によりＰＩＴＸ３レポーター細胞株を製造した。
ＴＡＬＥＮ－コーディングプラスミドの代わりにＣａｓ９－及びｓｇＲＮＡ－コーディングプラスミドを、ＬＭＸ１Ａ供与ＤＮＡプラスミドの代わりにＰＩＴＸ３供与ＤＮＡプラスミドを使用し、０．５μｇ／ｍＬピュロマイシンの代わりに１００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を処理することを除いて、前記製造例１－２と同一の方法によりＰＩＴＸ３レポーター細胞株を製造した。
実験例１．前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）段階の同定：ＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株確認
前記製造例１で製造されたＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化過程を確認した（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＣｙｔｏｍｅｔｒｙ）。
前記製造例１で製造されたＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化過程を確認した（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＣｙｔｏｍｅｔｒｙ）。
図４で確認することができるように、分化過程全体で中脳位置（ｒｅｇｉｏｎａｌ）マーカーであるＥＮ１、中脳底板（ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ）位置マーカーであるＦＯＸＡ２、ドーパミン系統（ｌｉｎｅａｇｅ）マーカーであるＬＭＸ１Ａ、及びｅＧＦＰの発現が観察された。特に、分化２０日目（ｄ２０）には細胞集団の～４１．１％がｅＧＦＰ－陽性（ｅＧＦＰ＋）細胞で表れており、ｅＧＦＰ＋細胞はＥＮ１及びＦＯＸＡ２を同時に発現した。前記３個のマーカー（ＥＮ１及びＦＯＸＡ２、及びＬＭＸ１Ａ）全て陽性反応を示した前駆細胞（～４６．６％ＥＮ１＋ｅＧＦＰ＋、～４９．２％ ＦＯＸＡ２＋ｅＧＦＰ＋）も検出された（図６参照）。
このような結果は、ｅＧＦＰを発現する細胞がＬＭＸ１Ａを発現する細胞であることを示し（ＬＭＸ１Ａレポーター細胞株確立）、ｈＥＳＣが底板（ＦＯＸＡ２）及び中脳（ＥＮ１）特性を示すｍＤＡ神経前駆細胞に直接分化されたことを意味する。
実験例２．神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ）段階の同定：ＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株確認
前記製造例２で製造されたＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化過程を確認した（免疫組織化学及び細胞化学）。
前記製造例２で製造されたＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化過程を確認した（免疫組織化学及び細胞化学）。
図５で確認することができるように、分化３０日目（ｄ３０）程度まではｍＣｈｅｒｒｙの発現が観察されなかったが、分化４０日目（ｄ４０）程度にｍＣｈｅｒｒｙ－陽性（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）神経細胞（ニューロン）クラスターが観察された。一方、ＰＩＴＸ３遺伝子の発現パターンは分化（成熟）過程全体でレポーターｍＣｈｅｒｒｙと同一に表れており、特に、最終分化されたｍＤＡ神経細胞（ニューロン）集団の～１６％が発生位置及び系統マーカー（ＥＮ１及びＦＯＸＡ２、及びＬＭＸ１Ａ）を共に発現するｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞で表れた（図９参照）。
このような結果は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞がＰＩＴＸ３を発現する細胞であることを示し（ＰＩＴＸ３レポーター細胞株確立）、ｈＥＳＣが底板（ＦＯＸＡ２）及び中脳（ＥＮ１）、及び中脳性ドーパミン（ＬＭＸ１Ａ）特性を示すｍＤＡ神経細胞（ニューロン）に直接分化されたことを意味する。
実験例３．ＬＭＸ１Ａ＋細胞の特性確認
前記実験例１のｄ２０の細胞を１時間の間１０μｍのＹ２７６３２に露出させ、アキュターゼを使用して解離させた後、セルストレーナー（Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ、ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて４０μｍ以下の細胞を収集した。解離された前駆細胞を３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及びＨＢＳＳ（ＷＥＬＧＥＮＥ Ｉｎｃ．，韓国）の中の１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加されたＬＭＸ１Ａ－Ｓｏｒｔｉｎｇバッファ（ＬＭＸ１Ａ－ＳＢ）に２×１０６細胞／ｍＬの最終密度で再懸濁させ、細胞選別（ＦＡＣＳ）を遂行した。分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループ、ＬＭＸ１Ａ－グループ、及びＬＭＸ１Ａ＋グループのｍＲＮＡ発現水準を比較した。
前記実験例１のｄ２０の細胞を１時間の間１０μｍのＹ２７６３２に露出させ、アキュターゼを使用して解離させた後、セルストレーナー（Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ、ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて４０μｍ以下の細胞を収集した。解離された前駆細胞を３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及びＨＢＳＳ（ＷＥＬＧＥＮＥ Ｉｎｃ．，韓国）の中の１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加されたＬＭＸ１Ａ－Ｓｏｒｔｉｎｇバッファ（ＬＭＸ１Ａ－ＳＢ）に２×１０６細胞／ｍＬの最終密度で再懸濁させ、細胞選別（ＦＡＣＳ）を遂行した。分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループ、ＬＭＸ１Ａ－グループ、及びＬＭＸ１Ａ＋グループのｍＲＮＡ発現水準を比較した。
図６ａで確認することができるように、細胞分離後、生存可能な細胞の～４１．１％がＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰ＋（ＬＭＸ１Ａ＋）分画で表れた。また、ＬＭＸ１Ａ＋及びＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰ－（ＬＭＸ１Ａ－）前駆細胞は分類されていない細胞と類似の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を維持しているように見えた。特に、分離されたＬＭＸ１Ａ＋の～９９．４％はＥＮ１及びＦＯＸＡ２全て陽性と表れた。このような結果は、ＦＡＣＳ細胞選別によりｍＤＡ神経前駆細胞が分離されたことを意味する。
また、図６ｂで確認することができるように、ＬＭＸ１Ａ＋グループではｍＤＡ前駆細胞－特異的遺伝子（ＥＮ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ）の発現が有意に上向き調節されたが、セロトニン性前駆細胞－特異的遺伝子（ＮＫＸ２．２）及び赤核（Ｒｅｄ ｎｕｃｌｅｕｓ、中脳の解剖学的一部位）前駆細胞－特異的遺伝子（ＳＩＭ１、ＬＨＸ１、ＮＫＸ６．１）の発現は分類されていないグループ及びＬＭＸ１Ａ－グループで上向き調節された。このような結果は、ＦＡＣＳ細胞選別により選別されたＬＭＸ１Ａ＋細胞がｍＤＡ神経前駆細胞の特性を示すことを意味する。
追加的に、前記細胞選別（ＦＡＣＳ）後、分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループ、ＬＭＸ１Ａ－グループ及びＬＭＸ１Ａ＋グループを追加的に１日間体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養した。
前記培養された細胞に対して、神経系（ｎｅｕｒａｌ）－特異的及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）細胞－特異的マーカーを観察し、ＢｒｄＵ分析を遂行して細胞周期を確認した。
図７ａで確認することができるように、３グループ全てでＮＥＳＴＩＮ－、ＳＯＸ１－、ＳＯＸ２－及びＫＩ６７－陽性細胞が類似するように表れた。このような結果は、分類されたＬＭＸ１Ａ＋細胞が分類されていないグループ及びＬＭＸ１Ａ－グループと同様に、神経前駆細胞の特性及び細胞増殖能力を維持することを意味する。
また、図７ｂで確認することができるように、ＬＭＸ１Ａ＋グループはｍＤＡ神経前駆細胞段階で生存細胞の３８．５±３．９％及び４９．５±６．２％がＧ０／Ｇ１及びＳ段階におり、６±２．７％がＧ２／Ｍにいた。このような結果は、分類されたＬＭＸ１Ａ＋細胞が実際に細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）を回る増殖する細胞であることを意味する。
最後に、前記細胞選別（ＦＡＣＳ）後、分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループ、ＬＭＸ１Ａ－グループ及びＬＭＸ１Ａ＋グループを追加的に最終分化（４週、ｄ５２）させた後、ｍＤＡ神経細胞－関連マーカーの発現を比較した。
図８ａで確認することができるように、最終分化後、分類されていないグループ及びＬＭＸ１Ａ－グループに比べてＬＭＸ１Ａ＋グループでｍＤＡ神経細胞－関連マーカー（ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＰＩＴＸ３）を発現する細胞の比率が増加した。このような結果は、ＬＭＸ１Ａ＋細胞がｍＤＡ神経細胞に分化可能なｍＤＡ神経前駆細胞であることを意味する。
延いては、前記最終分化により完全に成熟した細胞（８週、ｄ７５）に対して、ドーパミン分泌（ｒｅｌｅａｓｅ）程度を確認した。
具体的に、細胞を低ＫＣｌ溶液（２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、低ＫＣｌ溶液で２分間培養した。次に、高ＫＣｌ溶液（２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、６０ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４及び８５ｍＭ ＮａＣｌ）に置換し、１５分間追加培養した。溶液を１５ｍＬチューブに収集し、２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して残骸（ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、上澄液を１．５ｍＬチューブに収集して－８０℃で保管した。ドーパミンの濃度はドーパミンＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ． Ｎｏ． ＫＡ３８３８；Ａｂｎｏｖａ、台湾）により製造者の指示によって検出された。
図８ｂで確認することができるように、最終分化後、分類されていないグループ及びＬＭＸ１Ａ－グループに比べてＬＭＸ１Ａ＋グループでドーパミンの分泌が増加した。このような結果は、ＬＭＸ１Ａ＋細胞が最終分化して形成されたｍＤＡ神経細胞はドーパミンを分泌する機能的ｍＤＡ神経細胞であることを意味する。
実験例４．ＰＩＴＸ３＋細胞の特性確認
前記実験例２のｄ４０の細胞を５％トレハロースが添加されたパパイン（Ｐａｐａｉｎ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して単一細胞に解離させた後、７０μｍ及び４０μｍセルストレーナーを順次に用いて４０μｍ以下の細胞を収集した。解離された細胞を５％ＦＢＳ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５％トレハロース及びＨＢＳＳのうちの１×Ｐ／Ｓが添加されたＰＩＴＸ３－Ｓｏｒｔｉｎｇバッファ（ＰＩＴＸ３－ＳＢ）に１×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ、細胞選別（ＦＡＣＳ）を遂行した。また、細胞選別後、追加的に３６時間の間体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養した後、生き残った細胞の形態を観察した。
前記実験例２のｄ４０の細胞を５％トレハロースが添加されたパパイン（Ｐａｐａｉｎ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して単一細胞に解離させた後、７０μｍ及び４０μｍセルストレーナーを順次に用いて４０μｍ以下の細胞を収集した。解離された細胞を５％ＦＢＳ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５％トレハロース及びＨＢＳＳのうちの１×Ｐ／Ｓが添加されたＰＩＴＸ３－Ｓｏｒｔｉｎｇバッファ（ＰＩＴＸ３－ＳＢ）に１×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ、細胞選別（ＦＡＣＳ）を遂行した。また、細胞選別後、追加的に３６時間の間体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養した後、生き残った細胞の形態を観察した。
図９ａで確認することができるように、細胞選別後、生存可能な細胞の～１６％がＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙ＋（ＰＩＴＸ３＋）分画で表れた。また、細胞選別過程で細胞の消失があったことにもかかわらず、追加体外培養後に生き残ったＰＩＴＸ３＋及びＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙ－（ＰＩＴＸ３－）細胞は分類されていない細胞と類似の神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ）形態を維持することと表れた。このような結果は、ＦＡＣＳ細胞選別によりＰＩＴＸ３＋細胞が選別されており、３グループ（分類されていないグループ、ＰＩＴＸ３＋グループ及びＰＩＴＸ３－グループ）全て神経細胞－特異的形態を示すことを意味する。
次に、前記ｄ４０細胞の分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループ、ＰＩＴＸ３－グループ及びＰＩＴＸ３＋グループでｍＤＡ神経細胞－関連マーカーの発現を比較した。
図９ｂで確認することができるように、ＰＩＴＸ３＋グループで神経細胞（ニューロン）－特異的遺伝子（ＮｅｕＮ及びＭＡＰ２）及びｍＤＡ神経細胞（ニューロン）－特異的遺伝子（ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ１、ＴＨ、ＤＡＴ、及びＶＭＡＴ２）の発現が有意に上向き調節されたが、セロトニン性神経細胞（ニューロン）－特異的遺伝子（ＨＴＲ２Ｂ）の発現は下向き調節された。また、図９ｃで確認することができるように、ＰＩＴＸ３＋グループでｍＤＡ神経細胞マーカーであるＴＨを発現する細胞、及び神経細胞－特異的マーカーであるＴＵＢＢ３（ＴＵＪ１）及びＭＡＰ２を同時に発現する細胞の比率が増加した。このような結果は、ＰＩＴＸ３＋細胞がｍＤＡ神経細胞であることを意味する。
最後に、前記細胞選別（ＦＡＣＳ）後、分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）グループを追加的に培養した後、分化４４日目（ｄ４４）に二重－標識免疫染色を遂行した。
図１０で確認することができるように、ＰＩＴＸ３＋細胞は成熟したｍＤＡ神経細胞マーカーであるＮＵＲＲ１、ＡＡＤＣ、ＶＭＡＴ２、及びＤＡＴを発現することを確認した。また、Ａ９地域マーカーであるＫＣＮＪ６（ＧＩＲＫ２）は発現したが、Ａ１０地域マーカーであるＣＡＬＢを発現する細胞は観察されなかった。このような結果は、本発明の分化プロトコルを通じて分化されたＰＩＴＸ３＋細胞は成熟したｍＤＡ神経細胞であることを意味する。
実験例５．移植適合性（ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ）確認
前記製造例１のＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株及び製造例２のＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０）のｍＤＡ神経前駆細胞及び分化５０日目（ｄ５０）の成熟したｍＤＡ神経細胞を各々前記実験例３及び４と同一の方法を用いて単一細胞に分離した。分離された単一細胞の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞死滅程度を比較した。この際、細胞死滅はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて製造者の指示によって確認した。
前記製造例１のＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株及び製造例２のＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０）のｍＤＡ神経前駆細胞及び分化５０日目（ｄ５０）の成熟したｍＤＡ神経細胞を各々前記実験例３及び４と同一の方法を用いて単一細胞に分離した。分離された単一細胞の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞死滅程度を比較した。この際、細胞死滅はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて製造者の指示によって確認した。
図１１で確認することができるように、単一細胞分離後、細胞死滅を示す細胞はＬＭＸ１Ａ＋細胞の中では約８％、ＰＩＴＸ３＋細胞の中では約３０％に表れた。即ち、単一細胞に分離時、ＬＭＸ１Ａ＋ｍＤＡ神経前駆細胞がＰＩＴＸ＋ｍＤＡ神経細胞に比べて高い生存力を維持しており、これを通じてＬＭＸ１Ａ＋細胞及びＰＩＴＸ３＋細胞は移植のための単一細胞分離過程に対する感受性の差異が表れることが分かった。このような結果は、ｍＤＡ神経前駆細胞であるＬＭＸ１Ａ＋細胞を移植することが成熟した神経細胞であるＰＩＴＸ３＋細胞を移植することより細胞死滅の面で有利であることを意味する。
実験例６．中脳性ドーパミン（ｍＤＡ）マーカーの同定
６－１．転写体（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）分析
前記製造例１のＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株及び製造例２のＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０、ｍＤＡ神経前駆細胞段階）のＬＭＸ１Ａ＋及びＬＭＸ１Ａ－細胞、及び分化４０日目（ｄ４０、ｍＤＡ神経細胞段階）のＰＩＴＸ３＋及びＰＩＴＸ３－細胞を分離し、これに対する転写体分析（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を遂行した（図１２参照）。
６－１．転写体（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）分析
前記製造例１のＬＭＸ１Ａ－ｅＧＦＰレポーター細胞株及び製造例２のＰＩＴＸ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０、ｍＤＡ神経前駆細胞段階）のＬＭＸ１Ａ＋及びＬＭＸ１Ａ－細胞、及び分化４０日目（ｄ４０、ｍＤＡ神経細胞段階）のＰＩＴＸ３＋及びＰＩＴＸ３－細胞を分離し、これに対する転写体分析（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を遂行した（図１２参照）。
一方、前記ｍＤＡ神経前駆細胞段階ではｅＧＦＰ及び細胞周期マーカー（Ｋｉ６７、ＰＣＮＡ及びＰＨ３）を発現する細胞が観察されており、前記ｍＤＡ神経細胞段階ではｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＤＡ神経細胞マーカー（ＴＨ）を発現する細胞、成熟した神経細胞マーカー（ＮｅｕＮ）を発現する細胞が観察されたが、未成熟神経細胞マーカー（ＮｅｕｒｏＤ）及び増殖細胞マーカー（ＫＩ６７）を発現する細胞は観察されなかった。
６－２．ｍＤＡマーカーの候補群（ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ）確認
前記結果に基づいて、ｍＤＡマーカーの候補群を確保した。具体的な過程は、図１３に示した。
前記結果に基づいて、ｍＤＡマーカーの候補群を確保した。具体的な過程は、図１３に示した。
前記分離された４種類の細胞に対する比較マイクロアレイ分析結果、ＬＭＸ１Ａ－細胞に比べてＬＭＸ１Ａ＋細胞で上向き調節（＞２－ＦＣ）されている遺伝子及びＰＩＴＸ３－細胞に比べてＰＩＴＸ３＋細胞で上向き調節（＞２－ＦＣ）されている遺伝子を確認し、遺伝子マイニング（ｇｅｎｅｍｉｎｉｎｇ）を通じてこれらのうち、表面マーカーをコーディングしている５３個の遺伝子を同定した。同定された５３個の遺伝子にはマウスｍＤＡ神経前駆細胞－特異的に知られた多数の遺伝子（Ｃｏｒｉｎ、Ｃｌｓｔｎ２、Ｋｉｔｌｇ、Ｐｌｘｄｃ２、Ｐｃｄｈ７、Ｆｅｒｄ３ｌ、Ｆｒｅｍ１、Ａｌｃａｍ及びＮｏｔｃｈ２）が含まれていた。
次に、前記遺伝子に対して、実際に分化中であるｍＤＡ細胞で発現有無を確認して標的有効性（ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を評価した。その結果、ＬＭＸ１Ａ－細胞と比較してＬＭＸ１Ａ＋細胞で上向き調節される遺伝子のうち、表面マーカー遺伝子（図１４）、及びＬＭＸ１Ａ＋細胞及びＰＩＴＸ３＋細胞全てで上向き又は下向き調節される表面マーカー遺伝子（図１５）を同定した。前記図１４の２１個の遺伝子のうち、商業的に利用可能な抗体がある１８個の遺伝子に対してスクリーニングを遂行した。
その結果、前記１８個の遺伝子のうち、４個の遺伝子（ＣＯＲＩＮ、ＴＰＢＧ、ＣＤ４７、ＡＬＣＡＭ）が最終表面マーカー候補群に選ばれた。
６－３．ｍＤＡ神経前駆細胞－特異的マーカー同定
前記結果に基づいて、前記４個の遺伝子（ＣＯＲＩＮ、ＴＰＢＧ、ＣＤ４７、ＡＬＣＡＭ）を標的とするＭＡＣＳを遂行した。
前記結果に基づいて、前記４個の遺伝子（ＣＯＲＩＮ、ＴＰＢＧ、ＣＤ４７、ＡＬＣＡＭ）を標的とするＭＡＣＳを遂行した。
図１６及び図１７で確認することができるように、ＣＯＲＩＮ－及びＴＰＢＧ（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－標的ＭＡＣＳは統計的に有意にＬＭＸ１Ａ＋ＦＯＸＡ２＋ｍＤＡ神経前駆細胞の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を示した。特に、ＴＰＢＧはｍＤＡ神経前駆細胞で広範囲に発現された。
一方、前記ＣＯＲＩＮ遺伝子はｍＤＡ神経前駆細胞濃縮のための用途に既に知られているが、ＴＰＢＧはｍＤＡ発達過程で全く報告されたことがないところ、ＴＰＢＧを最終ｍＤＡ神経前駆細胞－特異的マーカーに選定した。
実験例７．ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分離されたＴＰＢＧ－陽性細胞の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）移植効果確認
７－１．６－ＯＨＤＡ損傷パーキンソン病（ＰＤ）－モデル製造
２００～２５０ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系ラット（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，韓国）を移植対象に使用した。３０ｍｇ／ｋｇ Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標）（Ｖｉｒｂａｃ、フランス）及び１０ｍｇ／ｋｇ Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ、ドイツ）を混合して麻酔剤に使用した。
７－１．６－ＯＨＤＡ損傷パーキンソン病（ＰＤ）－モデル製造
２００～２５０ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系ラット（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，韓国）を移植対象に使用した。３０ｍｇ／ｋｇ Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標）（Ｖｉｒｂａｃ、フランス）及び１０ｍｇ／ｋｇ Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ、ドイツ）を混合して麻酔剤に使用した。
座標（ＴＢ－０．４５、ＡＰ－０．４０、ＭＬ－０．１３、ＤＶ－０．７０）によって３μＬの３０ｍＭ ６－ＯＨＤＡをラットの内側前脳（ｍｅｄｉａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）バンドルに注入して半－パーキンソン病モデル（ｈｅｍｉ－ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｍｏｄｅｌ）を誘導した。
７－２．ＴＰＢＧ－陽性細胞移植後、ＰＤ－モデルの行動回復確認
前記のコロニー形態に培養中であるｈＥＳＣを前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０）にＴＰＢＧを標的とするＭＡＣＳを遂行した。
前記のコロニー形態に培養中であるｈＥＳＣを前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０）にＴＰＢＧを標的とするＭＡＣＳを遂行した。
分離したＴＰＢＧ－陽性細胞を最終濃度が８．７５×１０４細胞／μＬになるように１×ＨＢＳＳに懸濁させて細胞懸濁液を製造した。この際、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）にはＨＢＳＳのみを移植したグループを使用した。
前記実験例７－１の６－ＯＨＤＡ損傷４週後、製造された細胞懸濁液（総３５０，０００細胞）を座標（ＴＢ －０．２４、ＡＰ ＋０．０８、ＭＬ －０．３０、ＤＶ －０．４０及び－０．５０）によってラット当たり４μＬずつ定位方法により移植した。
移植２日前からラットが犧牲されるまで、実験期間の間毎日１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ；鐘根堂、韓国）を腹腔内注射して免疫抑制（Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）処理した。
移植前、移植後、４、８、１２、又は１６週にアンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａｌ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射し、３０分間ラットの回転有無を記録した。
図１８で確認することができるように、ＴＰＢＧ－陽性細胞は移植後１６週の間対照群に比べて有意な運動機能向上を示した。このような結果は、ｈＥＳＣ由来のＴＰＢＧ－陽性ｍＤＡ神経前駆細胞が生体内で生存可能であり、運動機能を改善させることを示す。
７－３．ＴＰＢＧ－陽性細胞移植後、移植片の特性確認
対照群に分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）細胞を移植したグループを使用したことを除いて、前記実施例７－２と同一の方法によりＴＰＢＧ－陽性細胞及び分類されていない細胞を移植した。
対照群に分類されていない（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）細胞を移植したグループを使用したことを除いて、前記実施例７－２と同一の方法によりＴＰＢＧ－陽性細胞及び分類されていない細胞を移植した。
移植１６週後、ラットを２５％ウレタン溶液で麻酔させ、０．９％食塩水及び４％パラホルムアルデヒドを経心灌流で灌流させた。除去された脳を一晩中固定させ、３０％スクロース－ＰＢＳ溶液で凍結保護させた。凍結保護された（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）脳はＦＳＣ ２２（登録商標）化合物（Ｌｅｉｃａ、Ｎｕβ ｌｏｃｈ、Ｇｅｒｍａｍｙ）に固定されており、クライオスタット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１８μｍ厚さで冠状切片（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を製作した。次に、ｈＮＣＡＭ（ｈｕｍａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を標的とする免疫組織化学染色を実施した。
図１９で確認することができるように、ＴＰＢＧ－陽性細胞グループは分類されていないグループに比べてより多い数のＴＨ＋ｈＮＣＡＭ＋及びＰＩＴＸ３＋ｈＮＣＡＭ＋ ｍＤＡ神経細胞で構成された。このような結果は、生体内ｍＤＡ神経細胞への分化において、分類されていないグループに比べてＴＰＢＧ－陽性細胞がより適することを意味する。
また、図２０で確認することができるように、分類されていないグループのうち、１つの特定ラットで約２０％以上のＫＩ６７＋ｈＮＣＡＭ＋細胞を有する移植片（ｇｒａｆｔ）が観察されたが、ＴＰＢＧ－陽性グループではＫＩ６７＋ｈＮＣＡＭ＋細胞が観察されなかった。このような結果は、分類されていない場合、移植１６週後にも増殖能を維持する可能性があるが、ＴＰＢＧに細胞分類時、増殖細胞を排除することができることを意味する。これは、細胞治療の安全性の面で非常に重要な結果といえる。
実験例８．ヒト胎児腹側中脳細胞（ｈｕｍａｎｆｅｔａｌ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｃｅｌｌｓ；ｆＶＭ ｃｅｌｌｓ）から分離されたＴＰＢＧ－陽性細胞の特性確認
神経幹細胞維持培養液（ＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｒｃｋ）でラミニン－コーティングプレートの上に培養中のｆＶＭ細胞に対して、細胞がプレート総面積の８０～９０％近く占める程度に培養された時、ＴＰＢＧを標的とするＭＡＣＳを遂行した。次に、ｈＥＳＣ（Ｈ９）を対照群（Ｈ９の発現＝１）にして分離されたＴＰＢＧ－陽性細胞及びＴＰＢＧ－陰性細胞で相対的なＥＮ１の発現をｑＲＴ－ＰＣＲ方法により確認した。
神経幹細胞維持培養液（ＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｒｃｋ）でラミニン－コーティングプレートの上に培養中のｆＶＭ細胞に対して、細胞がプレート総面積の８０～９０％近く占める程度に培養された時、ＴＰＢＧを標的とするＭＡＣＳを遂行した。次に、ｈＥＳＣ（Ｈ９）を対照群（Ｈ９の発現＝１）にして分離されたＴＰＢＧ－陽性細胞及びＴＰＢＧ－陰性細胞で相対的なＥＮ１の発現をｑＲＴ－ＰＣＲ方法により確認した。
図２１で確認することができるように、ＴＰＢＧ－陰性細胞に比べてＴＰＢＧ－陽性細胞でｍＤＡ神経細胞の発生位置マーカーであるＥＮ１の発現が増加した。このような結果は、ＴＰＢＧを用いてｆＶＭ細胞のうち、中脳特性を示す細胞を濃縮することができることを意味する。
実験例９．ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣ）から分離されたＴＰＢＧ－陽性細胞の特性確認
前記ヒト胚性幹細胞と同一の方法により培養中であるｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ（ＨＤＦ－ｅｐｉ３）を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０）にＴＰＢＧを標的とするＭＡＣＳを遂行した。分離されたＴＰＢＧ－陽性細胞でのＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａの発現を確認した（免疫組織化学）。
前記ヒト胚性幹細胞と同一の方法により培養中であるｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ（ＨＤＦ－ｅｐｉ３）を前記実施例の分化プロトコルを用いて分化させた後、分化２０日目（ｄ２０）にＴＰＢＧを標的とするＭＡＣＳを遂行した。分離されたＴＰＢＧ－陽性細胞でのＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａの発現を確認した（免疫組織化学）。
図２２で確認することができるように、中脳発生位置マーカーであるＥＮ１及びＦＯＸＡ２の発現はＭＡＣＳ前と後で差異が表れなかったが、ｍＤＡ発生系統マーカーであるＬＭＸ１Ａを発現する細胞はＴＰＢＧ－陽性細胞で濃縮されることが分かった。併せて、前記３個のマーカー（ＥＮ１及びＦＯＸＡ２、及びＬＭＸ１Ａ）全て陽性反応を示した細胞の比率もＴＰＢＧ－陽性細胞で有意に濃縮された。
本発明はドーパミン神経細胞の分離方法及びこれを用いて分離されたドーパミン神経細胞を含むパーキンソン病治療用薬剤学的組成物に関するものであって、前記ドーパミン神経細胞の分離方法はＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階を含むことによって、本方法によって分離されたドーパミン神経細胞は移植時、細胞の効能が増進し、移植安全性が向上したことを特徴とするので、パーキンソン病治療のための細胞移植用途に有用に使われることができる。
Claims (1)
- 次の段階を含むドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ）の製造方法：
（ａ）細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をＴＰＢＧ（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体と接触させる段階；及び
（ｂ）ＴＰＢＧ抗体に結合するＴＰＢＧ－陽性ドーパミン神経細胞を分離する段階。
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