KR20190126714A

KR20190126714A - 도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20190126714A
Application number: KR1020190048784A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 유정은; 이동진; 박상현; 김종완; 조명수
Original assignee: (주) 에스바이오메딕스
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2019-11-12
Also published as: AU2019240547A1; KR102201417B1; EP3591039A4; JP7421529B2; CN110914412A; JP2022003079A; JP2023175834A; KR20210151765A; JP2020521433A; JP7000452B2; KR102449283B1; AU2019240547B2; EP3591039A1; CN110914412B; US20210093673A1; KR20210002408A

Abstract

본 발명은 도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 도파민 신경세포의 분리방법은 TPBG(Trophoblast glycoprotein)-양성 도파민 신경세포를 분리하는 단계를 포함함으로써, 본 방법에 따라 분리된 도파민 신경세포는 이식 시 세포의 효능이 증진되고 이식 안전성이 향상된 것을 특징으로 하므로, 파킨슨병 치료를 위한 세포 이식 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물{A method for separation of dopaminergic neural cells and a pharmaceutical composition comprising dopaminergic neural cells for the treatment of Parkinson's disease}

본 발명은 도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 세포-기반 치료법(cell-based therapies)에 가장 적절한, 중뇌성 도파민(midbrain dopaminergic, mDA) 신경세포의 국소적 사멸(focal degeneration)으로 인한 신경퇴행성 장애 중 하나이다.

1980 년대 초반부터, 태아 배측 중뇌(fetal ventral mesencephalon, VM) 조직을 환자의 선조체(striatal)에 이식함으로써 파킨슨병 관련 운동기능을 회복시키려는 시도가 이루어졌다.

이러한 연구에 따라, 이식편에 의해 운동기능의 회복이 유도될 수 있음을 확인하였지만, 연구 기관마다 세포 이식의 결과가 일관되지 않고 일부의 경우 부작용도 나타나, 이후 세포-기반 치료법이 더 개선되어야 한다는 공감대가 형성되었다.

특히, 기존 연구에서 문제로 지적되었던, 이식 재료인 세포를 생체에 존재하는 세포와 근접한 수준으로 발달시키고, 태아 조직의 제한된 가용성 및 비일관성(batch-to-batch inconsistency) 등의 단점을 보완하기 위한 대안 연구가 지속되었다.

그 결과, 시험관 내(in vitro)에서 무한 증식능을 나타내고 다양한 신경세포로의 폭넓은 분화능을 지닌, 배아 줄기세포(Embryonic stem cells, ESCs) 및 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)를 포함하는 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSCs)가 주목을 받게 되었다.

이에 따라, 최근까지 다양한 mDA 신경세포의 분화 기술이 개발되어 높은 수율의 세포를 생산해낼 수 있는 수준으로 진화하였으나, 최근 개발된 분화 기술을 통해 hPSC로부터 분화 유도된 결과물에서도 mDA 신경세포 이외의 다른 종류 세포들이 상당히 섞여 있는 이질성(heterogeneity)이 관찰되어, 현재의 분화 기술을 바탕으로 임상 적용을 고려하기엔 어려운 상황이다.

따라서, 다양한 세포 집단으로부터의 hPSC-유래 mDA 신경세포의 동정 및 분리는 이식세포의 표준화뿐만 아니라 성공적인 이식치료 연구에 매우 중요하다.

한편, 초기의 hPSC로부터 유도 분화된 mDA 신경세포를 순수 분리(농축)시키기 위한 전략은 다 표면 항원(multiple surface antigens)을 표적으로 하는 형광-활성유세포분리법(fluorescence-activated cell sorting, FACS)을 기반으로 하였다. 이러한 접근법은 티로신 하이드록시아제(tyrosine hydroxylase, TH)를 발현하는 신경세포 집단(neuronal population)을 증가시켰으나, 이러한 세포 집단이 mDA 신경세포 특성을 보유하였는지는 불분명하였다.

최근, 마우스 fVM 조직 및 마우스 배아 줄기세포(mESC)-유래 mDA 신경전구세포의 전사체(transcriptome)를 분석하여, mDA 신경세포를 구별하여 농축시킬 수 있는 특이적 표면 마커를 발굴하는 연구가 수행되었다.

이러한 연구들은, 몇몇 가능성 있는 세포 표면 마커를 제시하였고, 이를 이용하여 도파민 신경세포의 분리 및 농축이 가능하다는 것을 보였지만, 동시에, 신경세포 발생 과정 중 정확히 어느 단계의 신경세포가 발현하는 세포 표면 마커를 발굴해야 하는 지에 대해서는 아직 명확히 밝히고 있지 않았다. 발생 단계에 따라 분리된 신경세포의 이식 후 생존율이나 분화 정도가 다르고, 이는 이식 후 기능 회복에 영향을 줄 수 있다는 것이 본 업계의 공통된 의견이기 때문에, 분화단계-특이적 마커의 발굴 역시 중요한 과제임에 틀림없다.

이에, 중뇌성 도파민 신경세포 및 그 분화 단계의 표면 마커에 대한 연구가 시급한 실정이다.

국내공개특허 제10-2015-0143976호

본 발명자들은 중뇌성 도파민 신경세포의 분화 과정을 구별하고, 각 단계의 세포 표면 마커를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, LMX1A-eGFP 및 PITX3-mCherry 리포터 hESC 세포주를 확립하고, 이를 분화시켜 LMX1A⁺ mDA 신경전구세포 및 PITX3⁺ mDA 신경세포를 분리하고, 이로부터 중뇌성 도파민 신경세포와 관련된 세포 표면 마커(TPBG)를 발굴함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 TPBG(Trophoblast glycoprotein)-양성 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병(Parkinson's disease) 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 파킨슨병(Parkinson's disease)의 세포 이식 치료법을 위한 도파민 신경세포의 효능을 증진시키고 이식 안전성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TPBG(Trophoblast glycoprotein)-양성 도파민 신경세포를 포함하는 도파민 신경세포 이식용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 중뇌성 도파민(mDA) 신경세포의 분화 과정을 구별하고, 각 단계의 세포 표면 마커를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, LMX1A-eGFP 및 PITX3-mCherry 리포터 hESC 세포주를 확립하고, 이를 분화시켜 LMX1A⁺ mDA 신경전구세포 및 PITX3⁺ mDA 신경세포를 분리하고, 이로부터 중뇌성 도파민 신경세포와 관련된 세포 표면 마커(TPBG)를 발굴하였다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 mDA 신경전구세포(progenitor) 단계-특이적 유전자인 LMX1A가 발현할 때 동시에 초록색 형광단백질(eGFP)이 발현되도록 조작된 LMX1A-eGFP 리포터 hESC 세포주, 및 성숙한 mDA 신경세포(neuronal) 단계-특이적 유전자인 PITX3가 발현할 때 동시에 빨간색 형광단백질(mCherry)이 발현되도록 조작된 PITX3-mCherry 리포터 hESC 세포주를 각각 수립하고, LMX1A⁺ mDA 신경전구세포 및 PITX⁺ mDA 신경세포의 전사체 비교 분석을 통하여, mDA 신경세포의 전구체(신경전구세포)에 특이적으로 발현되는 세포 표면 마커 후보를 선별하였다. 그 중, TPBG을 새로운 세포 표면 마커로서 발견하였으며, TPBG를 표적으로 하는 세포분리 결과, mDA 신경전구세포가 농축되는 것을 확인하였다. 또한, mDA 신경전구세포 단계에서 자성-활성세포분리법(magnetic-activated cell sorting, MACS)으로 분리된 TPBG-양성 세포를 6-OHDA-손상 파킨슨병(PD) 래트 모델에 이식한 결과, PD 래트에서 종양 형성 없이 운동기능 이상 증상이 회복됨을 확인하였다.

따라서, TPBG는 이식 가능한 mDA 신경전구세포를 분리하기 위한 새로운 표면 마커 단백질로서, TPBG를 이용하여 분리된 mDA 세포는 파킨슨병 치료를 위한 안전하고 효과적인 세포 대체 치료법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 도파민 신경세포의 분리방법, 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물, 파킨슨병의 세포 이식 치료법을 위한 도파민 신경세포의 효능을 증진시키고 이식 안전성을 향상시키는 방법, 및 이를 이용하여 제조된 도파민 신경세포 이식용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 세포 집단(population)을 TPBG(Trophoblast glycoprotein) 항체와 접촉시키는 단계; 및

(b) TPBG 항체에 결합하는 TPBG-양성 도파민 신경세포를 분리하는 단계.

본 발명에서 "신경세포(neural cells)"는 신경계를 구성하는 세포로 뉴런(neuron)과 동일한 의미로 사용될 수 있고, "도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)"는 신경전달물질인 도파민(dopamine)을 분비하는 신경세포를 의미한다.

상기 도파민 신경세포는 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural progenitors 또는 dopaminergic neural precursor cells) 또는 성숙 도파민 뉴런(dopaminergic neurons)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "신경전구세포"는 아직 분화 형질을 발현하지 않은 미분화 전구세포를 의미하며, "progenitors", "precursors" 및 "precursor cell" 모두 동일한 의미로 사용될 수 있다.

상기 도파민 신경세포는 중뇌성(midbrain) 도파민 신경세포일 수 있다.

본 발명에서 "중뇌성 도파민 신경세포"란 중뇌(midbrain) 영역에서 관찰되는 도파민 신경세포를 의미하고, 예를 들어, 중뇌 배측(ventral) 영역에서 관찰되는 도파민 신경세포를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 중뇌성 도파민 신경세포는 A9 지역-특이적(A9 region-specific)으로 발현할 수 있다.

상기 "A9 지역"은 중뇌 복외측(ventrolateral)지역으로, 중뇌 흑색질(substantia nigra)의 치밀부(pars compacta)에 해당하는 부분을 의미하는 바, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 세포는 중뇌성 세포임을 알 수 있다.

또한, 상기 A9 지역은 도파민 신경세포가 밀집된 부위로 운동기능의 조절과 관련이 있고, 특히, 파킨슨병 환자의 경우 이 부위의 도파민 신경세포가 특이적으로 사멸되어 있는 것을 특징으로 하는바, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 세포는 파킨슨병의 예방 및/또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 도파민 신경세포 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.

(a) 단계

상기 "세포 집단"은 인간 줄기세포(human stem cells); 전구세포(progenitors 또는 precursors); 및/또는 인간 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural progenitors), 성숙 도파민 뉴런(dopaminergic neurons) 및 이로부터 유래한 신경유도체(neural derivatives)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 인간 줄기세포 또는 전구세포는 배아 줄기세포(Embryonic stem cells), 배아 생식세포(Embryonic germ cells), 배아 암종세포(Embryonic carcinoma cells), 유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체 줄기세포(Adult stem cells) 또는 태아 세포(Fetal cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 태아 세포는 태아 신경 조직(Fetal neural tissue) 또는 이의 유도체(derivatives)로부터 유래된 것일 수 있고, 예를 들어 태아 배측 중뇌 세포(fetal ventral mesencephalic cells; fVM cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

(b) 단계

상기 "TPBG"는 Wnt-Activated Inhibitory Factor 1 또는 WAIF1와 동일한 의미로 사용될 수 있고, Wnt/β-catenin 신호 전달 경로의 길항제로 알려져 있으나, TPBG의 발현을 통한 도파민 신경세포 분리에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.

상기 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 53에 나타내었다. 또한, 상기 유전자는 뉴클레오티드 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자라면 쉽게 입수가 가능할 것이다.

본 발명에서 "TPBG-양성 도파민 신경세포"란 TPBG 항체에 결합하는 도파민 신경세포를 의미한다.

상기 "TPBG 항체"는 TPBG에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.

본 단계에서, TPBG-양성 도파민 신경세포를 분리하는 방법은 타겟을 특정하여 세포를 분리하는 방법이라면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있고, 예를 들어 형광-활성유세포분리법(FACS) 및/또는 자성-활성세포분리법(MACS)을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 TPBG-양성 도파민 신경세포는 파킨슨병의 증상을 완화시킬 수 있다.

상기 TPBG-양성 도파민 신경세포는 세포 이식 치료법의 안전성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 TPBG(Trophoblast glycoprotein)-양성 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병(Parkinson's disease) 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 TPBG-양성 도파민 신경세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료방법에 관한 것이다.

상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 TPBG-양성 도파민 신경세포의 파킨슨병 치료 용도에 관한 것이다.

상기 TPBG-양성 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약학적 조성물에 있어, 상기 도파민 신경세포의 제조방법과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 포함하는 파킨슨병(Parkinson's disease)의 세포 이식 치료법을 위한 도파민 신경세포의 효능을 증진시키고 이식 안전성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

(a) 세포 집단(cell population)을 TPBG(Trophoblast glycoprotein)-항체와 접촉시키는 단계; 및

상기 도파민 신경세포의 효능을 증진시키고 이식 안전성을 향상시키는 방법에 있어, 상기 도파민 신경세포의 제조방법과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태는 TPBG(Trophoblast glycoprotein)-양성 도파민 신경세포를 포함하는 도파민 신경세포 이식용 조성물에 관한 것이다.

상기 TPBG-양성 도파민 신경세포는 도파민 신경세포의 제조방법에 의해 배양될 수 있으며, 상기 방법으로 배양된 TPBG-양성 도파민 신경세포는 세포 효능이 증진되고 이식 안전성이 향상된 것일 수 있다.

한편, 상기 도파민 신경세포의 이식은 당업계에 공지된 적절한 이식부위(예를 들면, 뇌의 조가비핵[putamen] 또는 미상핵[caudate nucleus], 또는 이를 모두 아우르는 선조체[striatum] 등)를 선정하고, 이식 부위에 공지된 방식(예를 들면 뇌정위시스템[stereotactic system] 등)을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 조성물은 파킨슨병(Parkinson's disease)의 치료 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 이식 세포로서 도파민 신경세포만을 단독으로 포함하거나, 유효성분(이식 세포) 이외에 생체유래 및/또는 생분해성 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 안정화제는 상기 도파민 신경세포를 안정하게 분산시키기 위한 것으로서, 생체유래 물질이어서 체내 이식 시 부작용이 없거나, 그렇지 않다면 생분해성을 가져야 한다. 본 발명에서 생분해성이라 함은 체내에서 서서히 분해되어 흡수되는 특성을 의미하며, 특별히 분해되는 속도에는 의미를 두지 않는다.

상기 안정화제로는, 히아루론산, 콜라겐, 트롬빈, 엘라스틴, 황산 콘드로이틴, 알부민 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 상기 히아루론산, 콜라겐, 트롬빈, 엘라스틴, 황산 콘드로이틴, 알부민 등은 생체유래 물질로, 생체 내에서 자연적으로 분해될 수 있는 생분해성 성질을 가진다. 다만, 생분해성과 매질에서 점도를 부여하는 특성을 충족시키는 경우라면 합성된 화합물도 생분해성 물질이며, 본 발명의 용도로도 사용할 수 있으므로, 반드시 생체에서 유래되는 물질로 제한하는 것은 아니다.

상기 안정화제를 도파민 신경세포와 함께 제제화할 경우, 도파민 신경세포가 매질 중에 부유하거나 침강되지 않고 골고루 분산되어 존재할 수 있다.

상기 TPBG-양성 도파민 신경세포를 포함하는 도파민 신경세포 이식용 조성물에 있어, 상기 도파민 신경세포의 제조방법과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

본 발명은 도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 도파민 신경세포의 분리방법은 TPBG-양성 도파민 신경세포를 분리하는 단계를 포함함으로써, 본 방법에 따라 분리된 도파민 신경세포는 이식 시 세포의 효능이 증진되고 이식 안전성이 향상된 것을 특징으로 하므로, 파킨슨병 치료를 위한 세포 이식 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 도파민 신경세포의 제조방법을 모식화한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 제조예에 따른 LMX1A-eGFP hES 리포터 세포주의 제조방법을 모식화한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 제조예에 따른 PITX3-mCherry hES 리포터 세포주의 제조방법을 모식화한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 제조예에 따라 제조된 LMX1A-eGFP hES 리포터 세포주의 mDA 신경전구세포 분화 과정을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 제조예에 따라 제조된 PITX3-mCherry hES 리포터 세포주의 mDA 신경세포(뉴런) 분화 과정을 확인한 도이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 LMX1A-발현 mDA 신경전구세포의 특성을 확인한 도이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 LMX1A-발현 mDA 신경전구세포의 특성을 확인한 도이다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 LMX1A-발현 세포의 최종 분화(terminal differentiation) 후의 특성을 확인한 도이다.
도 9a 내지 9c는 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 PITX3-발현 mDA 신경세포(뉴런)의 특성을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 PITX3-발현 mDA 신경세포(뉴런)의 특성을 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 LMX1A-발현 mDA 신경전구세포 및 PITX3-발현 mDA 신경세포(뉴런)에 대하여, 시험관 내(in vitro) 세포사멸 정도를 비교한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 LMX1A-발현 mDA 신경전구세포 및 PITX3-발현 mDA 신경세포(뉴런)에 대하여, 전사체 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 mDA 마커의 후보군을 동정하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 14 및 15는 mDA 마커의 후보군을 동정하기 위하여, 표적 유효성을 평가한 결과이다.
도 16 및 17은 mDA 마커의 후보군(CORIN, TPBG, CD47, ALCAM)을 타겟으로 하는 MACS 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 hESC로부터 분리된 TPBG-양성 세포가 이식된 PD-동물 모델에 대하여, TPBG-양성 세포 이식 후 행동 회복을 확인한 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 hESC로부터 분리된 TPBG-양성 세포가 이식된 PD-동물 모델에 대하여, TPBG-양성 세포 이식 후 이식편의 특성을 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 hESC로부터 분리된 TPBG-양성 세포가 이식된 PD-동물 모델에 대하여, TPBG-양성 세포 이식 후 TPBG-양성 세포 이식편(graft)과 비교하여 분류되지 않은(Unsorted) 세포 이식편에서 세포 증식 가능성을 확인한 도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 human fVM 세포로부터 분리된 TPBG-양성 세포의 특성을 확인한 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 human iPSC로부터 분리된 TPBG-양성 세포의 특성을 확인한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

인간 배아 줄기세포(human Embryonic stem cells, hESC) 배양

미분화된 hESCs(H9, WiCell Inc., 미국)를 미토마이신-C(mitomycin-C; Sigma-Aldrich, 미국) 처리 마우스 STO 섬유아세포(ATCC, 미국) 층에서 20% KSR(Knockout-Serum Replacement; Invitrogen, 미국), 1x 비필수 아미노산(Gibco-Thermo Fisher Scientific, 미국), 0.1 mM β-메르캅토 에탄올(Sigma-Aldrich) 및 4 ng/mL bFGF (basic fibroblast growth factor; R&D System, 미국)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F12 배지(Gibco-Thermo Fisher Scientific)로 배양하였다.

클로날 세포의 유전형 분석(Genotyping)

게놈 DNA는 DNeasy Blood&Tissue 키트(QIAGEN, 독일)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 추출하였다. 게놈 DNA PCR은 GeneAmp PCR System 2720(Applied Biosystems-Thermo Fisher Scientific)에서 EmeraldAmp® GT PCR Master Mix(TAKARA Bio Inc., Japan)를 사용하여 수행하였다.

FACS

BD FACSAria III 유세포분리기 및 FACSDiva 소프트웨어(BD Bioscience)를 사용하여 세포분리를 수행하였다. eGFP-양성 분획은 488 nm 레이저를 이용하여 형광 강도에 따라 결정하였으며, mCherry-양성 분획은 561 nm 레이저를 이용하여 형광 강도에 따라 결정하였다.

MACS

항체의 비특이적 결합을 억제하기 위하여, 세포를 1% FBS-PBS 용액에서 배양(4℃, 30분) 후, 30분 동안 4℃에서 일차 항체(하기 표 1 참조)와 결합시켰다.

Protein	Species	Company	Cat. no.	Dilution
OCT4	Rabbit	Santa Cruz	sc-9081	1:200
SOX2	Rabbit	Millipore	AB5603	1:200
NANOG (human)	Goat	R&D Systems	AF1997	1:50
SSEA4	Mouse	Millipore	MAB4304	1:200
TRA-1-81	Mouse	Millipore	MAB4381	1:100
TRA-1-60	Mouse	Millipore	MAB4360	1:100
NESTIN (human)	Rabbit	Millipore	ABD69	1:1,000
SOX1	Goat	R&D Systems	AF3369	1:100
SMAα	Mouse	SIGMA	A5228	1:100
BRACHYURY	Goat	R&D Systems	AF2085	1:100
EN1	Mouse	Dev. Stud. Hybridoma Bank	4G11	1:50
FOXA2 (HNF3β)	Rabbit	Abcam	AB108422	1:300
FOXA2 (HNF3β)	Goat	Santa Cruz	sc-6554	1:100
LMX1A	Goat	Santa Cruz	sc-54273	1:100
eGFP	Goat	Rockland	600-101-215	1:1,000
eGFP	Mouse	Rockland	600-301-215	1:1,000
PITX3	Rabbit	NOVUS	NBP1-92274	1:500
mCherry	Rabbit	Rockland	600-401-P16S	1:1,000
mCherry	Rat	Thermo	M11217	1:1,000
KI67	Rabbit	Vision Biosystem	NCL-K67P	1:1,000
TUBB3	Mouse	Covance (BioLegend)	MMS-435P (801201)	1:1,000
TH	Rabbit	Pel-freez	P40101-0	1:1,000
TH	Mouse	Sigma	T1299	1:10,000
NURR1	Rabbit	Santa Cruz	sc-990	1:1,000
MAP2	Rabbit	Millipore	AB5622	1:1,000
AADC	Rabbit	Chemicon	AB1569	1:500
VMAT2	Rabbit	Abcam	AB81855	1:1,500
DAT	Rabbit	Pel-freez	P40501-0	1:500
KCNJ6	Rabbit	Almone Labs	APC-006	1:500
CALB	Rabbit	Millipore	AB1778	1:1,000
NCAM (human)	Mouse	Santa Cruz	sc-106	1:100
PCNA	Rabbit	Abcam	ab18197	1:700
PH3	Rabbit	Millipore	06-570	1:500
NeuN	Mouse	Chemicon	MAB377	1:100
NeuroD	Mouse	Abcam	AB60704	1:500
ALCAM	Mouse	R&D Systems	MAB561	2.5μg/10⁶ cells
TPBG	Mouse	R&D Systems	MAB49751	2.5 μg /10⁶ cells
CORIN	Mouse	R&D Systems	MAB2209	2.5 μg /10⁶ cells
CD47	Mouse	Santa Cruz	sc-12730	1.0 μg /10⁶ cells

세척 후, 일차 항체-표지된 세포를 1Х10⁷ 세포 당 20 μL의 마이크로비즈(Miltenyi Biotec)와 함께 배양하였다. 세척 후, 세포 현탁액을 자기(magnetic) 스탠드에 부착된 분리 컬럼(LS 컬럼)(Miltenyi Biotec)에 로딩하였다. 컬럼 세척 중에 통과된 음성-표지 세포를 별도의 튜브에 수집하고, 자성 스탠드로부터 컬럼을 제거한 후 컬럼 내에 잔존하는 양성-표지 세포를 배양 배지와 함께 다른 튜브로 용출시켰다.

면역세포화학(Immunocytochemistry) 분석

먼저, 세포를 4% 파라포름알데하이드-PBS 용액에 고정시켰다.

다음으로, 항체의 세포질 내로의 투과를 원활히 하기 위하여, 0.1% Triton X-100-PBS 용액으로 15분 동안 처리 후, 2% 소혈청알부민(BSA)(Bovogen, 호주)-PBS 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 일차 항체(상기 표 1 참조)와 4℃로 밤새 결합시켰다. 상기 일차 항체가 결합된 단백질을 시각화하기 위하여, 적절한 형광-표지 이차 항체(Molecular Probes-Thermo Fisher Scientific 및 Vector Laboratories, 미국)를 사용하였다.

끝으로, 세포핵을 확인하기 위하여, 4',6-다이아미노-2-페닐인돌이 포함된 마운팅 배지(Vector Laboratories)에 마운트하고, DP71 디지털 카메라가 장착된 Olympus IX71 현미경(Olympus Corp., 일본), 올림푸스 FSX100 시스템 또는 LSM710 공초점 현미경(Carl Zeiss, 독일)을 사용하여 이미지를 획득하였다.

유세포분석법(Flow cytometry)

세포를 아큐타제(Accutase; Merck Millipore, 독일)를 사용하여 단일 세포로 해리 후, 4% 파라포름알데하이드-PBS 용액을 사용하여 고정시켰다. 세포 내 마커를 검출하기 위하여, 1X Perm/Wash 버퍼(BD Biosciences)로 세포막을 투과화시키고, 1시간 동안 적절한 항체와 함께 2% BSA-PBS 용액에서 배양하였다. 상기 항체에 적절한 형광-표지 이차 항체를 사용하였다. LSRII(BD Biosciences)로 유동세포를 계수하여 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

유전자 발현(Gene expression) 분석

세포 내에 존재하는 총 RNA(total RNA)는 Easy-Spin^® Total RNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology, 한국)를 사용하여 분리하였다. cDNA는 PrimeScript^TM RT Master Mix(TAKARA Bio Inc.)를 사용하여 총 RNA 1 μg으로부터 합성되었다. mRNA 수준은 SYBR^® Premix Ex Taq^TM (TAKARA Bio Inc.) 및 CFX96 Real-Time System(Bio-Rad, 미국)을 사용하여 실시간 RT-PCR 분석으로 정량화되었다. 각 표적 유전자에 대한 Ct 값은 GAPDH의 값에 따라 표준화하였고, 표적 유전자의 표준화된 발현 수준은 비교 Ct 방법에 따라 분류(sorted)/분류되지 않은(Unsorted) 그룹을 대조군 샘플과 비교하였다. 데이터는 3 개의 독립적인 실험으로부터 얻은 평균 상대 편차±평균의 표준 편차(SEM)로 표현되었다. 유전자 발현 분석에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다.

Symbol	Gene name	Sequence(5' to 3')	SEQ ID No.
GAPDH	Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase	F: CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC R: TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG	SEQ ID No.1 SEQ ID No.2
OCT4	POU class 5 homeobox 1	F: CCT CAC TTC ACT GCA CTG TA R :CAG GTT TTC TTT CCC TAG CT	SEQ ID No.3 SEQ ID No.4
SOX2	SRY-box2	F: TTC ACA TGT CCC AGC ACT ACC AGA R: TCA CAT GTG TGA GAG GGG CAG TGT GC	SEQ ID No.5 SEQ ID No.6
NANOG	Nanog homeobox	F: TGA ACC TCA GCT ACA AAC AG R: TGG TGG TAG GAA GAG TAA AG	SEQ ID No.7 SEQ ID No.8
TET1	TET methylcytosine dioxygenase 1	F: CTG CAG CTG TCT TGA TCG AGT TAT R: CCT TCT TTA CCG GTG TAC ACT ACT	SEQ ID No.9 SEQ ID No.10
REX1	ZFP42 zinc finger protein	F: TCA CAG TCC AGC AGG TGT TTG R: TCT TGT CTT TGC CCG TTT CT	SEQ ID No.11 SEQ ID No.12
EN1	Engrailed 1	F: CGT GGC TTA CTC CCC ATT TA R: TCT CGC TGT CTC TCC CTC TC	SEQ ID No.13 SEQ ID No.14
FOXA2	Forkhead box A2 (HNF-3β)	F: CCG TTC TCC ATC AAC AAC CT R: GGG GTA GTG CAT CAC CTG TT	SEQ ID No.15 SEQ ID No.16
LMX1A	LIM homeobox transcription factor 1a	F: CGC ATC GTT TCT TCT CCT CT R: CAG ACA GAC TTG GGG CTC AC	SEQ ID No.17 SEQ ID No.18
eGFP	Enhanced green fluorescent protein	F: CAT CAA GGT GAA CTT CAA GAT CCG CCA CAA C R: CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C	SEQ ID No.19 SEQ ID No.20
PITX3	Paired like homeodomain 3	F: GCC AAC CTT AGT CCG TG R: GCA AGC CAG TCA AAA TG	SEQ ID No.21 SEQ ID No.22
mCherry		F: ACT ACG ACG CTG AGG TCA AG R: GTG TAG TCC TCG TTG TGG GA	SEQ ID No.23 SEQ ID No.24
OTX2	Orthodenticle homeobox 2	F: GGA AGC ACT GTT TGC CAA GAC C R: CTG TTG TTG GCG GCA CTT AGC T	SEQ ID No.25 SEQ ID No.26
FOXA1	Forkhead box A1	F: GGG CAG GGT GGC TCC AGG AT R: TGC TGA CCG GGA CGG AGG AG	SEQ ID No.27 SEQ ID No.28
SIM1	Single-minded homolog 1	F: AAA GGG GGC CAA ATC CCG GC R: TCC GCC CCA CTG GCT GTC AT	SEQ ID No.29 SEQ ID No.30
LHX1	LIM homeobox 1	F: AGG TGA AAC ACT TTG CTC CG R: CTC CAG GGA AGG CAA ACT CT	SEQ ID No.31 SEQ ID No.32
LMX1B	LIM homeobox transcription factor 1b	F: CTT AAC CAG CCT CAG CGA CT R: TCA GGA GGC GAA GTA GGA AC	SEQ ID No.33 SEQ ID No.34
NKX2.2	NK2 homeobox 2	F: CCT TCT ACG ACA GCA GCG ACA A R: ACT TGG AGC TTG AGT CCT GAG G	SEQ ID No.35 SEQ ID No.36
NKX6.1	NK6 homeobox 1	F: CGA GTC CTG CTT CTT CTT GG R: GGG GAT GAC AGA GAG TCA GG	SEQ ID No.37 SEQ ID No.38
NURR1	Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2	F: AAA CTG CCC AGT GGA CAA GCG T R: GCT CTT CGG TTT CGA GGG CAA A	SEQ ID No.39 SEQ ID No.40
TH	Tyrosine hydroxylase	F: GCT GGA CAA GTG TCA TCA CCT G R: CCT GTA CTG GAA GGC GAT CTC A	SEQ ID No.41 SEQ ID No.42
DAT	Dopamine transporter	F: CCT CAA CGA CAC TTT TGG GAC C R: AGT AGA GCA GCA CGA TGA CCA G	SEQ ID No.43 SEQ ID No.44
VMAT2	Solute carrier family 18 member A2(vesicular monoamine transporter 2)	F: GCT ATG CCT TCC TGC TGA TTG C R: CCA AGG CGA TTC CCA TGA CGT T	SEQ ID No.45 SEQ ID No.46
HTR2B	5-hydroxytryptamine receptor 2B	F: GCT GGT TGG ATT GTT TGT GAT GC R: CCA CTG AAA TGG CAC AGA GAT GC	SEQ ID No.47 SEQ ID No.48
NeuN	RNA binding fox-1 homolog 3	F: TAC GCA GCC TAC AGA TAC GCT C R: TGG TTC CAA TGC TGT AGG TCG C	SEQ ID No.49 SEQ ID No.50
MAP2	Microtubule associated protein 2	F: AGG CTG TAG CAG TCC TGA AAG G R: CTT CCT CCA CTG TGA CAG TCT G	SEQ ID No.51 SEQ ID No.52

마이크로어레이(Microarray) 분석: 전사체 프로파일링

각 시료의 총 RNA 10 μg을 마크로젠(Macrogen Inc., 한국)에서 처리/분석하였고, 시료를 Affymetrix Human U133 Plus 2.0 어레이에 하이브리드화하였다.

실시예. 중뇌성 도파민(mDA) 신경세포로의 분화 프로토콜

구체적인 프로토콜은 도 1에 나타내었다.

상기의 콜로니 형태로 배양 중인 hESC에 2 mg/mL의 타입 IV 콜라게나아제(Worthington Biochemical Corp., 미국)를 30분 동안 처리하여 배아체 형성을 유도하고, bFGF-free hES 배양 배지(EB 배지)에서 배양하였다. 이때, 처음 24시간 동안 1.5% 다이메틸술폭사이드(DMSO; Calbiochem-Merck Millipore)를 처리하였고, 그 후 4일 동안은 5 μm의 도소모르핀(dorsomorphin, DM)(Calbiochem-Merck Millipore) 및 5 μm의 SB431542(SB)(Sigma-Aldrich)를 처리하였다.

5 일째(d5)부터 20 ng/mL bFGF 및 20 μg/mL 인간 인슐린 용액(Sigma-Aldrich)이 첨가된 DMEM/F12 1X N2 보충 배지(bmN2 배지) 내 마트리겔-코팅 배양 접시에 EB를 부착하고, 6일 동안 패터닝 인자(1 μM CHIR99021(Miltenyi Biotec) 및 0.5 μM SAG(Calbiochem-Merck Millipore))를 처리하였다.

11 일째(d11)에 가늘게 뽑은(pulled) 유리 피펫을 사용하여 EB 콜로니 내에서 형성된 신경 로제트를 기계적으로 단리하고, 단리된 신경 로제트 덩어리는 피펫팅을 통해 잘게 부수어 마트리겔-코팅 배양 접시에 재부착하였다. 재부착된 세포는 20 ng/mL bFGF가 첨가된 DMEM/F12 1X N2 및 1X B27 배지(bN2B27 배지)에서 2일 동안 1 μM CHEM99021 및 0.5 μM SAG를 추가로 보충하여 증폭(expanded) 배양시키고, 중뇌성 도파민 신경세포 특이적(specified) 분화를 유도하였다.

13 일째(d13)에 아큐타제를 이용하여 중뇌성 도파민 신경전구세포 클러스터를 단일 세포로 분리하고, bFGF가 없는 N2B27 배지(N2B27 배지)에서 3.12x10⁵ 세포/cm²의 밀도로 마트리겔-코팅 플레이트 위에 재부착하였다. 세포가 플레이트 총 면적의 90% 가까이 차지할 정도로 7일 동안 증폭 배양시켰다.

20 일째(d20)부터 중뇌/배측의 특성을 갖게 된 중뇌성 도파민 신경전구세포를 1X N2, 0.5X B27 및 0.5X G21 보충제(Gemini Bio-Products, 미국)가 포함된 배지(NBG 배지)에서 배양하였다. 이때, 처음 7일 동안은 1μM의 DAPT(Sigma-Aldrich)를 첨가하였으며, 그 후로는 10 ng/mL의 BDNF(brain-derived neurotrophic factor; ProSpec-Tany TechnoGene, 이스라엘), 10 ng/mL의 GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor; ProSpec-Tany TechnoGene), 200 μM의 아스코르브산(AA) 및 1 μM의 다이부틸릴 사이클릭-AMP(db-cAMP)(Sigma-Aldrich)를 첨가하여 최종 분화시켰다.

제조예 1. LMX1A-eGFP 리포터 세포주(reporter line)의 제조

구체적인 프로토콜은 도 2에 나타내었다.

1-1. 뉴클레아제 및 공여자(donor) DNA 플라스미드의 설계

TALEN-코딩 플라스미드는 툴젠(Toolen Inc., 한국)으로부터 구입하였다.

TALEN 사이트는 LMX1A 유전자의 엑손 9(exon 9)의 정지 코돈인 TGA 근처(5'-TCC ATG CAG AAT TCT TAC TT-3'(왼쪽), 5'-TCA CAG AAC TCT AGG GGA AG-3'(오른쪽))에서 이중-가닥 절단(double-strand brsaks, DSB)을 일으키도록 설계되었으며, 잠재적 오프-타겟(off-target) 사이트는 Cas-Offinder(www.rgenome.net/)를 사용하여 검색하였다.

공여자 DNA 플라스미드는 플라스미드 백본으로 pUC19를 사용하여 DH5α에서 다음과 같이 제작되었다: 5' homology arm-endogenous LMX1A genomic fragment(left arm)-T2A-eGFP-bGH poly(A)-PGK promoter driven puromycin resistance cassette-bGH poly(A)-3' homology arm(right arm).

1-2. LMX1A-eGFP 리포터 세포주의 제조

불활성화된(inactivated) STO 상의 hESC 콜로니를 StemMACS^TM iPS-Brew XF 완전 배지(Miltenyi Biotec, 독일) 내 hESC-적합 마트리겔(BD Biosciences, 미국)로 코팅된 플레이트 위로 옮겼다. 그 다음, 세포가 플레이트 총 면적의 80-90% 가까이 차지할 정도로 계대배양하였다(Split ratio, 1:5). 아큐타제를 사용하여 단일 세포(Single cell)로 해리시킨 후, 처음 24시간 동안 ROCK 억제제(10 μM, Y-27632)(Calbiochem-Merck Millipore)가 첨가된 배지 내 마트리겔-코팅 플레이트로 옮기고, 매일 배지를 새로 교체하였다. 효소적 계대배양이 10 회 미만으로 이루어진 hESC만 실험에 사용되었다.

아큐타제를 사용하여 hESC를 수득하고, 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, Neon 트랜스펙션 키트(100μL, Invitrogen)의 R 버퍼에 1.0Х10⁷ 세포/mL의 최종 밀도로 부드럽게 재현탁시켰다. 재현탁된 세포 120 μL를 상기 제조예 1-1의 TALEN-코딩 플라스미드 1쌍(각 6 μg) 및 LMX1A 공여자 DNA 플라스미드(6 μg)와 혼합하고, 30 ms 동안 850 mV의 전압으로 펄스를 가하여 일렉트로포레이션(electroporation)을 수행하였다(Neon transfection system).

그 다음, 세포를 hESC 배지 내 STO feeder를 미리 접종한 2~3 개의 35mm 플레이트로 옮기고 처음 48시간 동안 ROCK 억제제를 첨가하였으며, 2일 후에 배지를 교체한 후, 매일 배지를 새로 교체하였다.

일렉트로포레이션 5일 후, 상기 hESC 배지에 0.5 μg/mL 퓨로마이신(Sigma-Aldrich)을 처리하였다. 10-14일 후, 퓨로마이신 저항성을 보이는 콜로니를 리포터 세포주 후보로 분류하고, 이를 계대배양하여 세포수를 확장하였다.

최종적으로, 클로날 세포의 유전형 분석을 통하여 LMX1A-eGFP 리포터 세포주를 확정하였다.

제조예 2. PITX3-mCherry 리포터 세포주의 제조

구체적인 프로토콜은 도 3에 나타내었다.

2-1. 뉴클레아제 및 공여자 DNA 플라스미드의 설계

Cas9- 및 sgRNA(CRISPR/Cas9)-코딩 플라스미드는 툴젠으로부터 구입하였다.

PITX3 표적화를 매개하는 sgRNA를 제조하기 위한 서열은 정지 코돈인 TGA 근처에서 이중-가닥 절단(DSB)을 일으키도록, 정지 코돈 TGA(5'-TAC GGG CGG GGC CGC TCA TAC GG-3'(밑줄: PAM))을 가로 질러 위치하도록 설계되었다. 잠재적 오프-타겟(off-target) 사이트는 Cas-Offinder(www.rgenome.net/)를 사용하여 검색하였다.

공여자 DNA 플라스미드는 플라스미드 백본으로 pUC19를 사용하여 DH5α에서 다음과 같이 제작되었다: 5' homology arm-endogenous PITX3 genomic fragment(left arm)-T2A-mCherry-bGH poly(A)-PGK promoter driven neomycin resistance cassette-bGH poly(A)-3' homology arm(right arm).

2-2. PITX3-mCherry 리포터 세포주의 제조

TALEN-코딩 플라스미드 대신 Cas9- 및 sgRNA-코딩 플라스미드를, LMX1A 공여자 DNA 플라스미드 대신 PITX3 공여자 DNA 플라스미드를 사용하고, 0.5 μg/mL 퓨로마이신 대신 100 μg/mL G418(Calbiochem-Merck Millipore)을 처리하는 것을 제외하고, 상기 제조예 1-2와 동일한 방법으로 PITX3 리포터 세포주를 제조하였다.

실험예 1. 전구세포(progenitor) 단계의 동정: LMX1A-eGFP 리포터 세포주 확인

상기 제조예 1에서 제조된 LMX1A-eGFP 리포터 세포주를 상기 실시예의 분화 프로토콜을 이용하여 분화시킨 후, 분화 과정을 확인하였다(Immunocytochemistry 및 Cytometry).

도 4에서 확인할 수 있듯이, 분화 과정 전체에서 중뇌 위치(regional) 마커인 EN1, 중뇌 바닥판(floor plate) 위치 마커인 FOXA2, 도파민 계통(lineage) 마커인 LMX1A, 및 eGFP의 발현이 관찰되었다. 특히, 분화 20일째(d20)에는 세포 집단의 ~41.1%가 eGFP-양성(eGFP⁺) 세포로 나타났으며, eGFP⁺ 세포는 EN1 및 FOXA2를 동시에 발현하였다. 상기 3개의 마커(EN1 및 FOXA2, 및 LMX1A) 모두 양성 반응을 보인 전구세포(~46.6% EN1⁺eGFP⁺, ~49.2% FOXA2⁺eGFP⁺)도 검출되었다(도 6 참조).

이러한 결과는, eGFP를 발현하는 세포가 LMX1A를 발현하는 세포임을 나타내며(LMX1A 리포터 세포주 확립), hESC가 바닥판(FOXA2) 및 중뇌(EN1) 특성을 나타내는 mDA 신경전구세포로 직접 분화되었음을 의미한다.

실험예 2. 신경세포(neuronal) 단계의 동정: PITX3-mCherry 리포터 세포주 확인

상기 제조예 2에서 제조된 PITX3-mCherry 리포터 세포주를 상기 실시예의 분화 프로토콜을 이용하여 분화시킨 후, 분화 과정을 확인하였다(Immunocytochemistry 및 Cytometry).

도 5에서 확인할 수 있듯이, 분화 30일(d30) 정도 까지는 mCherry의 발현이 관찰되지 않다가, 분화 40일(d40) 정도에 mCherry-양성(mCherry⁺) 신경세포(뉴런) 클러스터가 관찰되었다. 한편, PITX3 유전자의 발현 패턴은 분화(성숙) 과정 전체에서 리포터 mCherry와 동일하게 나타났으며, 특히, 최종 분화된 mDA 신경세포(뉴런) 집단의 ~16%가 발생 위치 및 계통 마커(EN1 및 FOXA2, 및 LMX1A)를 함께 발현하는 mCherry⁺ 세포로 나타났다(도 9 참조).

이러한 결과는, mCherry를 발현하는 세포가 PITX3를 발현하는 세포임을 나타내며(PITX3 리포터 세포주 확립), hESC가 바닥판(FOXA2) 및 중뇌(EN1), 및 중뇌성 도파민(LMX1A) 특성을 나타내는 mDA 신경세포(뉴런)로 직접 분화되었음을 의미한다.

실험예 3. LMX1A ⁺ 세포의 특성 확인

상기 실험예 1의 d20의 세포를 1시간 동안 10 μm의 Y27632에 노출시킨 다음 아큐타제를 사용하여 해리시킨 후, 세포 체(Cell strainer, BD Science)를 이용하여 40μm 이하의 세포를 수집하였다. 해리된 전구세포를 3% 소태아혈청(FBS)(Gemini Bio-Products) 및 HBSS(WELGENE Inc., 한국) 중의 1x 페니실린-스트렙토마이신(P/S)(Gibco-Thermo Fisher Scientific)이 첨가된 LMX1A-Sorting 버퍼(LMX1A-SB)에 2Х10⁶ 세포/mL의 최종 밀도로 재현탁시키고, 세포분리(FACS)를 수행하였다. 분류되지 않은(Unsorted) 그룹, LMX1A^- 그룹 및 LMX1A⁺ 그룹의 mRNA 발현 수준을 비교하였다.

도 6a에서 확인할 수 있듯이, 세포분리 후 생존 가능한 세포의 ~41.1%가 LMX1A-eGFP⁺(LMX1A⁺) 분획으로 나타났다. 또한, LMX1A⁺ 및 LMX1A-eGFP^-(LMX1A^-) 전구세포는 분류되지 않은 세포와 유사한 형태(morphology)를 유지하는 것으로 나타났다. 특히, 분리된 LMX1A⁺의 ~99.4%는 EN1 및 FOXA2 모두 양성으로 나타났다. 이러한 결과는, FACS 세포분리에 의해 mDA 신경전구세포가 분리되었음을 의미한다.

또한, 도 6b에서 확인할 수 있듯이, LMX1A⁺ 그룹에서는 mDA 전구세포-특이적 유전자(EN1, FOXA1, FOXA2, LMX1A, LMX1B)의 발현이 유의미하게 상향 조절되었으나, 세로토닌성 전구세포-특이적 유전자(NKX2.2) 및 적핵(Red nucleus, 중뇌의 해부학적 한 부위) 전구세포-특이적 유전자(SIM1, LHX1, NKX6.1)의 발현은 분류되지 않은 그룹 및 LMX1A^- 그룹에서 상향 조절되었다. 이러한 결과는, FACS 세포분리에 의해 분리된 LMX1A⁺ 세포가 mDA 신경전구세포의 특성을 나타냄을 의미한다.

추가적으로, 상기 세포분리(FACS) 후, 분류되지 않은(Unsorted) 그룹, LMX1A^- 그룹 및 LMX1A⁺ 그룹을 추가적으로 1일 동안 체외(in vitro) 배양하였다.

상기 배양된 세포에 대하여, 신경계(neural)-특이적 및 증식(proliferative)세포-특이적 마커를 관찰하고, BrdU 분석을 수행하여 세포 주기를 확인하였다.

도 7a에서 확인할 수 있듯이, 세 그룹 모두에서 NESTIN-, SOX1-, SOX2- 및 KI67-양성 세포가 유사하게 나타났다. 이러한 결과는, 분류된 LMX1A⁺ 세포가 분류되지 않은 그룹 및 LMX1A^- 그룹과 마찬가지로, 신경전구세포의 특성 및 세포 증식 능력을 유지함을 의미한다.

또한, 도 7b에서 확인할 수 있듯이, LMX1A⁺그룹은 mDA 신경전구세포 단계에서 생존 세포의 38.5±3.9% 및 49.5±6.2%가 G0/G1 및 S 단계에 있었고, 6±2.7%가 G2/M에 있었다. 이러한 결과는, 분류된 LMX1A⁺ 세포가 실제로 세포주기(cell cycle)를 도는 증식하는 세포임을 의미한다.

마지막으로, 상기 세포분리(FACS) 후, 분류되지 않은(Unsorted) 그룹, LMX1A^- 그룹 및 LMX1A⁺ 그룹을 추가적으로 최종 분화(4주, d52)시킨 다음, mDA 신경세포-관련 마커의 발현을 비교하였다.

도 8a에서 확인할 수 있듯이, 최종 분화 후, 분류되지 않은 그룹 및 LMX1A^- 그룹에 비하여 LMX1A⁺ 그룹에서 mDA 신경세포-관련 마커(TH, NURR1, PITX3)를 발현하는 세포의 비율이 증가하였다. 이러한 결과는, LMX1A⁺ 세포가 mDA 신경세포로 분화 가능한 mDA 신경전구세포임을 의미한다.

나아가, 상기 최종 분화에 의해 완전히 성숙된 세포(8주, d75)에 대하여, 도파민 분비(release) 정도를 확인하였다.

구체적으로, 세포를 저 KCl 용액(2.5 mM CaCl₂, 11 mM 글루코스, 20 mM HEPES-NaOH, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄ 및 140 mM NaCl)로 세척하고 저 KCl 용액에서 2 분간 배양하였다. 그 다음, 고 KCl 용액(2.5 mM CaCl₂, 11 mM 글루코스, 20 mM HEPES-NaOH, 60 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄ 및 85 mM NaCl)으로 대체하고 15 분 동안 추가 배양하였다. 용액을 15 mL 튜브에 수집하고 2,000 rpm으로 1 분간 원심분리하여 잔해(debris)를 제거하고, 상등액을 1.5 mL 튜브에 수집하여 -80 ℃에서 보관하였다. 도파민의 농도는 도파민 ELISA 키트(Cat. No. KA3838; Abnova, 대만)에 의해 제조자의 지시에 따라 검출되었다.

도 8b에서 확인할 수 있듯이, 최종 분화 후, 분류되지 않은 그룹 및 LMX1A^- 그룹에 비하여 LMX1A⁺ 그룹에서 도파민의 분비가 증가하였다. 이러한 결과는, LMX1A⁺ 세포가 최종 분화하여 형성된 mDA 신경세포는 도파민을 분비하는 기능적 mDA 신경세포임을 의미한다.

실험예 4. PITX3 ⁺ 세포의 특성 확인

상기 실험예 2의 d40의 세포를 5% 트레할로오스가 첨가된 파파인(Papain; Worthington Biochemical Corp.)을 사용하여 단일 세포로 해리시킨 후, 70 μm 및 40 μm 세포 체를 순차적으로 이용하여 40μm 이하의 세포를 수집하였다. 해리된 세포를 5% FBS, 1x Glutamax(Gibco-Thermo Fisher Scientific), 5% 트레할로오스 및 HBSS 중의 1x P/S이 첨가된 PITX3-Sorting 버퍼(PITX3-SB)에 1Х10⁷ 세포/mL의 농도로 재현탁시키고, 세포분리(FACS)를 수행하였다. 또한, 세포분리 후 추가적으로 36 시간 동안 체외(in vitro) 배양한 후 살아남은 세포의 형태를 관찰하였다.

도 9a에서 확인할 수 있듯이, 세포분리 후 생존 가능한 세포의 ~16%가 PITX3-mCherry⁺(PITX3⁺) 분획으로 나타났다. 또한, 세포 선별 과정에서 세포의 소실이 있었음에도 불구하고, 추가 체외 배양 후 살아남은 PITX3⁺ 및 PITX3-mCherry^-(PITX3^-) 세포는 분류되지 않은 세포와 유사한 신경세포(neuronal) 형태를 유지하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는, FACS 세포분리에 의해 PITX3⁺ 세포가 분리되었으며, 세 그룹(분류되지 않은 그룹, PITX3⁺ 그룹 및 PITX3^- 그룹) 모두 신경세포-특이적 형태를 나타냄을 의미한다.

다음으로, 상기 d40 세포의 분류되지 않은(Unsorted) 그룹, PITX3^-그룹 및 PITX3⁺ 그룹에서 mDA 신경세포-관련 마커의 발현을 비교하였다.

도 9b에서 확인할 수 있듯이, PITX3⁺ 그룹에서 신경세포(뉴런)-특이적 유전자(NeuN 및 MAP2) 및 mDA 신경세포(뉴런)-특이적 유전자(PITX3, NURR1, TH, DAT 및 VMAT2)의 발현이 유의미하게 상향 조절되었으나, 세로토닌성 신경세포(뉴런)-특이적 유전자(HTR2B)의 발현은 하향 조절되었다. 또한, 도 9c에서 확인할 수 있듯이, PITX3⁺ 그룹에서 mDA 신경세포 마커인 TH를 발현하는 세포, 및 신경세포-특이적 마커인 TUBB3(TUJ1) 및 MAP2를 동시에 발현하는 세포의 비율이 증가하였다. 이러한 결과는, PITX3⁺ 세포가 mDA 신경세포임을 의미한다.

마지막으로, 상기 세포분리(FACS) 후, 분류되지 않은(Unsorted) 그룹을 추가적으로 배양한 후, 분화 44일째(d44)에 이중-표지 면역 염색을 수행하였다.

도 10에서 확인할 수 있듯이, PITX3⁺ 세포는 성숙한 mDA 신경세포 마커인 NURR1, AADC, VMAT2 및 DAT를 발현함을 확인하였다. 또한, A9 지역 마커인 KCNJ6(GIRK2)는 발현하였으나, A10 지역 마커인 CALB를 발현하는 세포는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 본 발명의 분화 프로토콜을 통해 분화된 PITX3⁺ 세포는 성숙한 mDA 신경세포임을 의미한다.

실험예 5. 이식 적합성(suitability) 확인

상기 제조예 1의 LMX1A-eGFP 리포터 세포주 및 제조예 2의 PITX3-mCherry 리포터 세포주를 상기 실시예의 분화 프로토콜을 이용하여 분화시킨 후, 분화 20일(d20)의 mDA 신경전구세포 및 분화 50일(d50)의 성숙한 mDA 신경세포를 각각 상기 실험예 3 및 4와 동일한 방법을 이용하여 단일 세포로 분리하였다. 분리된 단일 세포의 시험관 내(in vitro) 세포사멸 정도를 비교하였다. 이때, 세포사멸은 LIVE/DEAD? Fixable Violet Dead Cell Stain 키트(Thermo Fisher)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 확인하였다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, 단일 세포 분리 후 세포사멸을 보이는 세포는 LMX1A⁺ 세포 중에서는 약 8%, PITX3⁺ 세포 중에서는 약 30%로 나타났다. 즉, 단일 세포로 분리 시, LMX1A⁺ mDA 신경전구세포가 PITX⁺ mDA 신경세포에 비하여 높은 생존력을 유지하였으며, 이를 통하여 LMX1A⁺ 세포 및 PITX3⁺ 세포는 이식을 위한 단일세포 분리 과정에 대한 감수성 차이가 나타나는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는, mDA 신경전구세포인 LMX1A⁺ 세포를 이식하는 것이 성숙한 신경세포인 PITX3⁺ 세포를 이식하는 것보다 세포사멸 측면에서 유리함을 의미한다.

실험예 6. 중뇌성 도파민(mDA) 마커의 동정

6-1. 전사체 분석

상기 제조예 1의 LMX1A-eGFP 리포터 세포주 및 제조예 2의 PITX3-mCherry 리포터 세포주를 상기 실시예의 분화 프로토콜을 이용하여 분화시킨 후, 분화 20일(d20, mDA 신경전구세포 단계)의 LMX1A⁺ 및 LMX1A^- 세포, 및 분화 40일(d40, mDA 신경세포 단계)의 PITX3⁺ 및 PITX3^- 세포를 분리하고, 이에 대한 전사체 분석(Microarray)을 수행하였다(도 12 참조).

한편, 상기 mDA 신경전구세포 단계에서는 eGFP 및 세포주기 마커(Ki67, PCNA 및 PH3)를 발현하는 세포가 관찰되었으며, 상기 mDA 신경세포 단계에서는 mCherry 및 mDA 신경세포 마커(TH)를 발현하는 세포, 성숙한 신경세포 마커(NeuN)를 발현하는 세포가 관찰되었으나, 미성숙 신경세포 마커(NeuroD) 및 증식 세포 마커(KI67)를 발현하는 세포는 관찰되지 않았다.

6-2. mDA 마커의 후보군(candidates) 확인

상기 결과에 기초하여, mDA 마커의 후보군을 확보하였다. 구체적인 과정은 도 13에 나타내었다.

상기 분리된 4종류의 세포에 대한 비교 마이크로어레이 분석 결과, LMX1A^- 세포에 비하여 LMX1A⁺ 세포에서 상향 조절(> 2-FC)되어 있는 유전자 및 PITX3^- 세포에 비하여 PITX3⁺ 세포에서 상향 조절(> 2-FC)되어 있는 유전자를 확인하고, 유전자 마이닝(gene mining)을 통하여 이들 중 표면 마커를 코딩하고 있는 53개의 유전자를 동정하였다. 동정된 53개의 유전자에는 마우스 mDA 신경전구세포-특이적으로 알려진 다수의 유전자(Corin, Clstn2, Kitlg, Plxdc2, Pcdh7, Ferd3l, Frem1, Alcam 및 Notch2)가 포함되어 있었다.

다음으로, 상기 유전자에 대하여, 실제로 분화 중인 mDA 세포에서 발현 여부를 확인하여 표적 유효성(target validation)을 평가하였다. 그 결과, LMX1A^- 세포와 비교하여 LMX1A⁺ 세포에서 상향 조절되는 유전자 중 표면 마커 유전자(도 14), 및 LMX1A⁺ 세포 및 PITX3⁺ 세포 모두에서 상향 또는 하향 조절되는 표면 마커 유전자(도 15)를 동정하였다. 상기 도 14의 21개의 유전자 중에서 상업적으로 이용 가능한 항체가 있는 18개의 유전자에 대하여 스크리닝을 수행하였다.

그 결과, 상기 18개 유전자 중 4개의 유전자(CORIN, TPBG, CD47, ALCAM)가 최종 표면 마커 후보군으로 선정되었다.

6-3. mDA 신경전구세포-특이적 마커 동정

상기 결과에 기초하여, 상기 4개의 유전자(CORIN, TPBG, CD47, ALCAM)를 타겟으로 하는 MACS를 수행하였다.

도 16 및 도 17에서 확인할 수 있듯이, CORIN- 및 TPBG(trophoblast glycoprotein)-표적 MACS는 통계적으로 유의하게 LMX1A⁺FOXA2⁺ mDA 신경전구세포의 농축(enrichment)을 나타내었다. 특히, TPBG는 mDA 신경전구세포에서 광범위하게 발현되었다.

한편, 상기 CORIN 유전자는 mDA 신경전구세포 농축을 위한 용도로 이미 알려져 있으나, TPBG는 mDA 발달 과정에서 전혀 보고된 적이 없는 바, TPBG를 최종 mDA 신경전구세포-특이적 마커로 선정하였다.

실험예 7. 인간 배아 줄기세포(hESC)로부터 분리된 TPBG-양성 세포의 생체 내( in vivo ) 이식 효과 확인

7-1. 6-OHDA 손상 파킨슨병(PD)-모델 제조

200-250g의 암컷 Sprague-Dawley계 래트(Orient Bio Inc., 한국)를 이식 대상으로 사용하였다. 30 mg/kg Zoletil^®(Virbac, 프랑스) 및 10 mg/kg Rompun^®(Bayer, 독일)을 혼합하여 마취제로 사용하였다.

좌표(TB -0.45, AP -0.40, ML -0.13, DV -0.70)에 따라 3 μL의 30 mM 6-OHDA를 래트의 내측 전뇌(medial forebrain) 번들에 주입하여 반-파킨슨병 모델(hemi-parkinsonian model)을 유도하였다.

7-2. TPBG-양성 세포 이식 후 PD-모델의 행동 회복 확인

상기의 콜로니 형태로 배양 중인 hESC를 상기 실시예의 분화 프로토콜을 이용하여 분화시킨 후, 분화 20일(d20)에 TPBG를 타겟으로 하는 MACS를 수행하였다.

분리한 TPBG-양성 세포를 최종 농도가 8.75Х10⁴ 세포/μL가 되도록 1X HBSS에 현탁시켜 세포 현탁액을 제조하였다. 이때, 대조군(Control)으로는 HBSS만을 이식한 그룹을 사용하였다.

상기 실험예 7-1의 6-OHDA 손상 4주 후, 제조된 세포 현탁액(총 350,000 세포)을 좌표(TB -0.24, AP +0.08, ML -0.30, DV -0.40 및 -0.50)에 따라 래트 당 4 μL씩 정위 방법으로 이식하였다.

이식 2일 전부터 쥐가 희생될 때까지, 실험 기간 동안 매일 10 mg/kg의 사이클로스포린 A(cyclosporine A; 종근당, 한국)를 복강 내 주사하여 면역 억제(Immunosuppressive) 처리하였다.

이식 전, 이식 후 4, 8, 12 또는 16 주에 암페타민(2.5 mg/kg, Sigmal-Aldrich)을 복강 내 주사하고, 30 분 동안 래트의 회전 여부를 기록하였다.

도 18에서 확인할 수 있듯이, TPBG-양성 세포는 이식 후 16주 동안 대조군에 비하여 유의한 운동기능 향상을 보였다. 이러한 결과는, hESC 유래의 TPBG-양성 mDA 신경전구세포가 생체 내에서 생존 가능하고, 운동기능을 개선시킨다는 것을 나타낸다.

7-3. TPBG-양성 세포 이식 후 이식편의 특성 확인

대조군으로 분류되지 않은(Unsorted) 세포를 이식한 그룹을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 7-2와 동일한 방법으로 TPBG-양성 세포 및 분류되지 않은 세포를 이식하였다.

이식 16주 후, 래트를 25% 우레탄 용액으로 마취시키고, 0.9% 식염수 및 4% 파라포름알데하이드를 경심관류로 관류시켰다. 제거된 뇌를 밤새 고정시키고 30% 수크로오스-PBS 용액으로 동결보호시켰다. 동결보호된(cryoprotected) 뇌는 FSC 22^® 화합물(Leica, Nußloch, Germamy)에 고정되었고, 크라이오스탯(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 18 μm 두께로 관상절편(coronal sections)을 제작하였다. 그 다음, hNCAM(human-specific neural cell adhesion molecule)을 표적으로 하는 면역조직화학 염색을 실시하였다.

도 19에서 확인할 수 있듯이, TPBG-양성 세포 그룹은 분류되지 않은 그룹에 비하여 보다 많은 수의 TH⁺hNCAM⁺ 및 PITX3⁺hNCAM⁺ mDA 신경세포로 구성되었다. 이러한 결과는, 생체 내 mDA 신경세포로의 분화에 있어, 분류되지 않은 그룹에 비하여 TPBG-양성 세포가 보다 적합함을 의미한다.

또한, 도 20에서 확인할 수 있듯이, 분류되지 않은 그룹 중 하나의 특정 래트에서 약 20% 이상의 KI67⁺hNCAM⁺ 세포를 가진 이식편(graft)이 관찰되었으나, TPBG-양성 그룹에서는 KI67⁺hNCAM⁺ 세포가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 분류되지 않은 경우 이식 16 주 후에도 증식능을 유지할 가능성이 있으나, TPBG로 세포 분류 시 증식 세포를 배제할 수 있음을 의미한다. 이는 세포 치료의 안전성 측면에서 매우 중요한 결과라 할 것이다.

실험예 8. 인간 태아 배측 중뇌 세포(human fetal ventral mesencephalic cells; fVM cells)로부터 분리된 TPBG-양성 세포의 특성 확인

신경줄기세포 유지 배양액(ReNcell NSC maintenance Medium, Merck)에서 라미닌-코팅 플레이트 위에 배양 중인 fVM 세포에 대하여, 세포가 플레이트 총 면적의 80-90% 가까이 차지할 정도로 배양되었을 때, TPBG를 타겟으로 하는 MACS를 수행하였다. 그 다음, hESC(H9)를 대조군(H9의 발현=1)으로 하여 분리된 TPBG-양성 세포 및 TPBG-음성 세포에서 상대적인 EN1의 발현을 qRT-PCR 방법으로 확인하였다.

도 21에서 확인할 수 있듯이, TPBG-음성 세포에 비하여 TPBG-양성 세포에서 mDA 신경세포의 발생 위치 마커인 EN1의 발현이 증가되었다. 이러한 결과는, TPBG를 이용하여 fVM 세포 중 중뇌 특성을 나타내는 세포를 농축할 수 있음을 의미한다.

실험예 9. 인간 유도 만능 줄기세포(human induced pluripotent stem cells; iPSC)로부터 분리된 TPBG-양성 세포의 특성 확인

상기 인간 배아 줄기세포와 동일한 방법으로 배양 중인 human iPSC(HDF-epi3)를 상기 실시예의 분화 프로토콜을 이용하여 분화시킨 후, 분화 20일(d20)에 TPBG를 타겟으로 하는 MACS를 수행하였다. 분리된 TPBG-양성 세포에서의 EN1, FOXA2, LMX1A의 발현을 확인하였다(Immunocytochemistry).

도 22에서 확인할 수 있듯이, 중뇌 발생 위치 마커인 EN1 및 FOXA2의 발현은 MACS 전과 후에서 차이가 나타나지 않았으나, mDA 발생 계통 마커인 LMX1A를 발현하는 세포는 TPBG-양성 세포에서 농축되는 것을 알 수 있었다. 더불어, 상기 3개의 마커(EN1 및 FOXA2, 및 LMX1A) 모두 양성 반응을 보인 세포의 비율도 TPBG-양성 세포에서 유의하게 농축되었다.

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<210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX2-R <400> 26 ctgttgttgg cggcacttag ct 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA1-F <400> 27 gggcagggtg gctccaggat 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA1-R <400> 28 tgctgaccgg gacggaggag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM1-F <400> 29 aaagggggcc aaatcccggc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM1-R <400> 30 tccgccccac tggctgtcat 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHX1-F <400> 31 aggtgaaaca ctttgctccg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHX1-R <400> 32 ctccagggaa ggcaaactct 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1B-F <400> 33 aggtgaaaca ctttgctccg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1B-R <400> 34 tcaggaggcg aagtaggaac 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2.2-F <400> 35 ccttctacga cagcagcgac aa 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2.2-R <400> 36 acttggagct tgagtcctga gg 22 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX6.1-F <400> 37 cgagtcctgc ttcttcttgg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX6.1-R <400> 38 ggggatgaca gagagtcagg 20 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NURR1-F <400> 39 aaactgccca gtggacaagc gt 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NURR1-R <400> 40 gctcttcggt ttcgagggca aa 22 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH-F <400> 41 gctggacaag tgtcatcacc tg 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH-R <400> 42 cctgtactgg aaggcgatct ca 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT-F <400> 43 cctcaacgac acttttggga cc 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT-R <400> 44 agtagagcag cacgatgacc ag 22 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VMAT2-F <400> 45 gctatgcctt cctgctgatt gc 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VMAT2-R <400> 46 ccaaggcgat tcccatgacg tt 22 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HTR2B-F <400> 47 gctggttgga ttgtttgtga tgc 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HTR2B-R <400> 48 ccactgaaat ggcacagaga tgc 23 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NeuN-F <400> 49 tacgcagcct acagatacgc tc 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NeuN-R <400> 50 tggttccaat gctgtaggtc gc 22 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2-F <400> 51 aggctgtagc agtcctgaaa gg 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2-R <400> 52 cttcctccac tgtgacagtc tg 22 <210> 53 <211> 8823 <212> DNA <213> Trophoblast glycoprotein <400> 53 actaaaggca catgtcccag gcacaagcct caggatcctt atttgatctt ttttaatacg 60 accaggtctt aaatttccga accatgtttt ccctaattgc cattttctct ctaaaatgaa 120 gaagcctgga agaaccttct tatcccttcg gggaaattat ttaattggga caaaggggat 180 gtggagttac agagagcaac gatagggctt tcagaaccca aaacctgtct ggtataataa 240 cagatccttc cggtaaccaa ccattcaatt tgtccctctc cccaacccca tcctctccat 300 caccatctgc cagatgcccc ctgggacaat cgactttgaa accaaacttc tctcccaggt 360 cagctcctgc aatccccact cctcatcctt ggagctttct ccacagaagt gacttgacac 420 accgcgctac atctggggag gggggcgggt ccgctttccg ggagactcaa gtctttgcta 480 tttgcctttt gtttctggga tgcctttggc tgcctttctc ttccatctgc ttttaatttt 540 ggtaagagaa aagctaatga atcaggaatg aatctcctct ccactaatct tttttttttc 600 tttctctctc tctctctctt aaagttggcg cgctctcttc acaagttcca tcactaccca 660 agaagtgagg gggcgggggg gacaggcggg aaggcattaa ttacacctaa atctgaagtt 720 tgcggcctca agtaccactt tgatggggag agcttctgaa gcttccatac aacctgccgt 780 gcctttgctg ctgccgcagt agattttcag ctcatttctt tctgctgctg cttcgcgctg 840 ctctgtcatg cctaaatcta tctcgtcact gccaaaggtg cctgaatcag ggtgaattcc 900 acgagattca ccagcggttt tgctccagtc caaggtaaat acagtatgca aaatgaggaa 960 ccacccaagg atgtcgggga ggggggagag aaagggattc cctcaccttt tccggcacat 1020 tcctcgttaa tttccaccag gaggaggcgc gcagcccagc tcccctagtc tctcttctta 1080 aatcccccta cctacggctg ccgaggttgg ccgcgcgtcg ggaatctccc cgacagtcct 1140 ggccctcccc cgccccccgg gttggttttt cccagctgcg gaggttggga ggttgggcca 1200 ggggctgggg tgcgaagaga gtcggcgccc gcaacgcgga gccgggaagt cgtcgctact 1260 ctggtggaac tcagagttgg ttctggaggc ggcggacgcg gaggtgagca gtgggagccc 1320 gcggcctggg agagacccgg gaggcgtcgt tggggcccct ccccatcctc gggtggagag 1380 tagggttggt tcgggttgcc actgtacccc gagtcccact gctgctttgt tcccagactc 1440 tcccctcctc tttggagatg acttgaaccc ctttgagatc cgaggggctg gcggggcgcg 1500 ggctgggggg cgacagttgt agctccactt cctgctaatg cgagaaggta caaaaagaga 1560 tcaaaaagtc ctgtaacctg aaacttccct cgcatcctaa ccgggacctg gtggagaggt 1620 ctgggcgggg gcggagacac ccggaggccg accttccgcc gaggcggtgc aggaaggaac 1680 gggagaggga gaagtttggt agggaaggaa ttggggatta agcggtaagt tagacgcggg 1740 agacgagtct cctcgggaaa ggcggagggc gggaggccgg tcgggtttat ttagtgtggg 1800 ccagggaaga aggaagactt tgcggtctgg gtgtcggatg cgcgtccccc tccggagtaa 1860 aagtgaccgg aggggttggg gaggcgaggc cggggcgggc ttttggaagg aggtctctgg 1920 gacagactgg agacgactag actcgaaaag gccggttttt gcactccgga agccgcggca 1980 gccaccgctg ttcacgcctc tctcctgctt gtcccaggtc cctcagagga tccagcgagg 2040 ggcgccaaca agaggcgaag aggtggcacc agggcggcgg caggaagagg agcgggagca 2100 ggagcgcgga gcggagcgtc ccgacccgcc gtgcgtactt tctggaggga aggggcgggg 2160 gaatcggccc ctgagggaag cgcccggtgg cgagggggtt agccaagttc cggctgcggc 2220 gccactccct cggttccacg agaggaaagt tttttttttc cagacgcttc cgccggctcg 2280 cgccctccgg gcccagcctc ccgagccttc ggagcgggcg ccgtcccagc ccagctccgg 2340 ggaaacgcga gccgcgatgc ctggggggtg ctcccggggc cccgccgccg gggacgggcg 2400 tctgcggctg gcgcgactag cgctggtact cctgggctgg gtctcctcgt cttctcccac 2460 ctcctcggca tcctccttct cctcctcggc gccgttcctg gcttccgccg tgtccgccca 2520 gcccccgctg ccggaccagt gccccgcgct gtgcgagtgc tccgaggcag cgcgcacagt 2580 caagtgcgtt aaccgcaatc tgaccgaggt gcccacggac ctgcccgcct acgtgcgcaa 2640 cctcttcctt accggcaacc agctggccgt gctccctgcc ggcgccttcg cccgccggcc 2700 gccgctggcg gagctggccg cgctcaacct cagcggcagc cgcctggacg aggtgcgcgc 2760 gggcgccttc gagcatctgc ccagcctgcg ccagctcgac ctcagccaca acccactggc 2820 cgacctcagt cccttcgctt tctcgggcag caatgccagc gtctcggccc ccagtcccct 2880 tgtggaactg atcctgaacc acatcgtgcc ccctgaagat gagcggcaga accggagctt 2940 cgagggcatg gtggtggcgg ccctgctggc gggccgtgca ctgcaggggc tccgccgctt 3000 ggagctggcc agcaaccact tcctttacct gccgcgggat gtgctggccc aactgcccag 3060 cctcaggcac ctggacttaa gtaataattc gctggtgagc ctgacctacg tgtccttccg 3120 caacctgaca catctagaaa gcctccacct ggaggacaat gccctcaagg tccttcacaa 3180 tggcaccctg gctgagttgc aaggtctacc ccacattagg gttttcctgg acaacaatcc 3240 ctgggtctgc gactgccaca tggcagacat ggtgacctgg ctcaaggaaa cagaggtagt 3300 gcagggcaaa gaccggctca cctgtgcata tccggaaaaa atgaggaatc gggtcctctt 3360 ggaactcaac agtgctgacc tggactgtga cccgattctt cccccatccc tgcaaacctc 3420 ttatgtcttc ctgggtattg ttttagccct gataggcgct attttcctcc tggttttgta 3480 tttgaaccgc aaggggataa aaaagtggat gcataacatc agagatgcct gcagggatca 3540 catggaaggg tatcattaca gatatgaaat caatgcggac cccagattaa cgaacctcag 3600 ttctaactcg gatgtctgag aaatattaga ggacagacca aggacaactc tgcatgagat 3660 gtagacttaa gctttatccc tactaggctt gctccacttt catcctccac tatagataca 3720 acggactttg actaaaagca gtgaagggga tttgcttcct tgttatgtaa agtttctcgg 3780 tgtgttctgt taatgtaaga cgatgaacag ttgtgtatag tgttttaccc tcttcttttt 3840 cttggaactc ctcaacacgt atggagggat ttttcaggtt tcagcatgaa catgggcttc 3900 ttgctgtctg tctctctctc agtacagttc aaggtgtagc aagtgtaccc acacagatag 3960 cattcaacaa aagctgcctc aactttttcg agaaaaatac tttattcata aatatcagtt 4020 ttattctcat gtacctaagt tgtggagaaa ataattgcat cctataaact gcctgcagac 4080 gttagcaggc tcttcaaaat aactccatgg tgcacaggag cacctgcatc caagagcatg 4140 cttacatttt actgttctgc atattacaaa aaataacttg caacttcata acttctttga 4200 caaagtaaat tacttttttg attgcagttt atatgaaaat gtactgattt ttttttaata 4260 aactgcatcg agatccaacc gactgaattg ttaaaaaaaa aaaaaataaa gattcttaaa 4320 agaattacag tgtgtgcaag tttgctttga aaaaaggatg aagggcagga gtattcaatg 4380 gtcttggttc cgatgataat tattacttaa catagctgag aatcaaactg tagcaatgtc 4440 taatataaat agacttggga gatcgttttg aaatggtgga tccttttagt atttaaatgg 4500 agagtttgag tattcatgtg actgtatggt cccaaagtta atgctattta tgaaacagtt 4560 ttgtaagaac ataatgaagt tggtaaaagc taagcgttct gcacaataaa cagttcccag 4620 tttggggctt tttcaaggct aatgaagtta ttgttggtct agaaaaatag tatttactta 4680 ataaaactct gtttgaaatt gttctgtgga tttttagagc agaatttgaa acaaatgtaa 4740 tgcaaataaa tataaagata aagtgtctta aagacaatat tctgaaataa aagatataaa 4800 atataattta aaaaatattt ctcaatgtct taatgtaaat tgaaacttag attttcttga 4860 ggatattttc aaaaaaacat ttaaagtgga acataaatgt tctttagttt atcagagacc 4920 cagctaatat gtttaaaaag ttgacttgac atggttgaat atgaacttga ggaaataacc 4980 acagataaat gtctacatct gtaaacacgt gtctcaagta tttataggtt cttatcttca 5040 gttcagtgtt taagaatttg aggatatttt gattttagct aagctgttca taatgtaagt 5100 atatacacct ttgtgaagaa taaatcacat ttaggtgtaa atacaggcaa tcattaattg 5160 atacatccat aatatacaag gcttttatta ttttttcagt ttattatctg tcatttaatc 5220 tgaaaagtaa attccattaa tcagtcttca ggctctttta tcaagtgatt taaatgtagc 5280 cattattgct taactgaaag tattaggtaa acttgcatca gtaagtctta gggcttgctt 5340 ttcctttgaa ctggttatgt ccttcagtgc tttatgtttg aaataaaatc tacattttca 5400 tatttttata aataaaatag gatcagatag tattttaggt tctagaaatc tttgctgatt 5460 ccttctttga attaaattca gaaattttca aagtagggct aaaaataagt aaatcttcct 5520 ttttataggt tagaatatat agtcagaata caaagctgta attccttaaa ttccatcagg 5580 cttgttttgt gaaatatagt atttattatt taagggttat atttcagatc ctataattac 5640 ctcagaaaaa gctaaatatt tggcacttaa aattccatca aacagtttaa gtgttcatca 5700 gaaattccta aactgtctgg ttgccattat ttggtaagaa caatgagata ctaatctgtc 5760 aaaaatagtg accactatct tagtaaactg ttgatggact tagtaagtct tctgatattg 5820 taggaaacaa attataatat tgatagagcc tctattgaga agaattgttt cttcatcaca 5880 tgataatcta acagtttaaa gtggagcttt atctaagaac cagggaagca gtagattcat 5940 tagtctagct tttctcatca actctttgaa gcaatgatga atctgataaa gtgaagccaa 6000 gttttccctg ttaggtagat ggcttctttg aagttataat ttattgcttc tttttcatcc 6060 ccctacttat tctcttgttt ggactttcca attgctactg ctttgttttc catcacatca 6120 ctccttcctg ttctccaaaa tatggaaata aaaaagtcaa ttaaaagaac accttattct 6180 taagataaaa aattgttatt atttgacaac taattaatgt tttgcagccc taatattctt 6240 aagtctataa gcttataaaa cattctaagt tccttggaag atagaggcta tataaattca 6300 ataagtataa gggaatatgg gaaaaataaa agtatcactt tatttaaaaa taagacaagt 6360 ctgtttgttt taaatactgt tcttactatt aatgcattgt tgactctaga aacctgcaag 6420 tatccatttt taaaatttta ttttagttgg taatactctt tattactgaa cgtaaaattt 6480 tcaacataaa acacccttca tttatccttt acaagtttca tttgaagaaa gttagaaaaa 6540 atacttagaa attcaaggac ttgatatatc ccttaattta gaaagctatt caactatccc 6600 ataaatttct atttaaagta gcaaaaattt taggataata cagctatttg gccctgaatt 6660 ataactgccc cctttgattg taaccattca gtttgcagca ttcgtttttg 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Claims

다음의 단계를 포함하는 도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)의 제조방법:
(a) 세포 집단(cell population)을 TPBG(Trophoblast glycoprotein) 항체와 접촉시키는 단계; 및
(b) TPBG 항체에 결합하는 TPBG-양성 도파민 신경세포를 분리하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 집단은
인간 줄기세포(human stem cells);
전구세포(progenitors 또는 precursors); 및
상기 인간 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural progenitors), 성숙 도파민 뉴런(dopaminergic neurons) 및 이로부터 유래한 신경유도체(neural derivatives);
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 인간 줄기세포 또는 전구세포는 배아 줄기세포(Embryonic stem cells), 배아 생식세포(Embryonic germ cells), 배아 암종세포(Embryonic carcinoma cells), 유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체 줄기세포(Adult stem cells) 또는 태아 세포(Fetal cells)인, 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 태아 세포는 태아 신경 조직(Fetal neural tissue) 또는 이의 유도체(derivatives)로부터 유래된 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 TPBG-양성 도파민 신경세포는 파킨슨병의 증상을 완화시키는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 TPBG-양성 도파민 신경세포는 세포 이식 치료법의 안전성을 향상시키는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural progenitors 또는 dopaminergic neural precursor cells) 또는 성숙 도파민 뉴런(dopaminergic neurons)인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 중뇌성(midbrain) 도파민 신경세포인, 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 중뇌성 도파민 신경세포는 A9 지역-특이적(A9 region-specific) 중뇌성 도파민 신경세포인, 방법.
TPBG(Trophoblast glycoprotein)-양성 도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)를 포함하는 파킨슨병(Parkinson's disease) 치료용 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 중뇌성(midbrain) 도파민 신경세포인, 약학적 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 중뇌성 도파민 신경세포는 A9 지역-특이적(A9 region-specific) 중뇌성 도파민 신경세포인, 약학적 조성물.
다음의 단계를 포함하는 파킨슨병(Parkinson's disease)의 세포 이식 치료법을 위한 도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)의 효능을 증진시키고 이식 안전성을 향상시키는 방법:
(a) 세포 집단(cell population)을 TPBG(Trophoblast glycoprotein)-항체와 접촉시키는 단계; 및
(b) TPBG 항체에 결합하는 TPBG-양성 도파민 신경세포를 분리하는 단계.
제 13 항에 있어서, 상기 세포 집단은
인간 줄기세포(human stem cells);
전구세포(progenitors 또는 precursors); 및
상기 인간 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural progenitors), 성숙 도파민 뉴런(dopaminergic neurons) 및 이로부터 유래한 신경유도체(neural derivatives);
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 인간 줄기세포 또는 전구세포는 배아 줄기세포(Embryonic stem cells), 배아 생식세포(Embryonic germ cells), 배아 암종세포(Embryonic carcinoma cells), 유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체 줄기세포(Adult stem cells) 또는 태아 세포(Fetal cells)인, 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 태아 세포는 태아 신경 조직(Fetal neural tissue) 또는 이의 유도체(derivatives)로부터 유래된 것인, 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 도파민 신경전구체 세포(dopaminergic neural progenitors 또는 dopaminergic neural precursor cells) 또는 성숙 도파민 뉴런(dopaminergic neurons)인, 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 중뇌성(midbrain) 도파민 신경세포인, 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 중뇌성 도파민 신경세포는 A9 지역-특이적(A9 region-specific) 중뇌성 도파민 신경세포인, 방법.
TPBG(Trophoblast glycoprotein)-양성 도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)를 포함하는 도파민 신경세포 이식용 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 중뇌성(midbrain) 도파민 신경세포인, 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 중뇌성 도파민 신경세포는 A9 지역-특이적(A9 region-specific) 중뇌성 도파민 신경세포인, 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 조성물은 파킨슨병(Parkinson's disease)의 치료 용인 것인, 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 조성물은 도파민 신경세포의 효능을 증진시키고 이식 안전성을 향상시키는 것인, 조성물.