JP2023100612A - 三次元ラインに沿った走査方法及び複数三次元ラインの走査による関心領域の走査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】３Ｄレーザー走査型顕微鏡を用いて、所定速度で３Ｄ空間内の任意の方向に通る実質的にまっすぐなライン（３Ｄライン）に沿って走査する方法の提供。【解決手段】レーザービーム１４をｘ－ｚ面内で偏向させる第１の対の音響光学偏向器（ｘ軸偏向器）１６と該レーザービームをｙ－ｚ面内で偏向させる第２の対の音響光学偏向器（ｙ軸偏向器）１６とを備え、各細胞体内部で１つの走査点を選択し、選択した各走査点を、その走査点が実質的に中心にくる直方体を規定する複数の平行な実質的にまっすぐなドリフトラインに伸長し、各ドリフトラインの走査を、そのドリフトラインの一端でレーザービームを集束させ、そのドリフトラインに沿って焦点を連続的に移動させるためにｘ軸偏向器内及びｙ軸偏向器内の音響周波数に対して線形又は非線形チャープ信号を付与し、前記測定を反復して、前記走査された直方体の時系列を用いて動きアーチファクトを補正する。【選択図】図１

Description

本発明は、３Ｄレーザー走査型顕微鏡を用いて所定速度で３Ｄ空間内に任意方向に位置する１本の実質的に直線のライン（３Ｄライン）に沿って走査する方法に関する。
本発明はまた、３Ｄ空間内部でレーザービームを集束（焦点合わせ）させるための音響光学（acousto-optic，ＡＯ）偏向器（デフレクタ）を有する３Ｄレーザー走査型顕微鏡による関心領域の走査方法にも関する。

神経系の多様性、情報処理の層特異性、神経メカニズムの区画的な専門化、内部発生パターン、及び動的ネットワーク特性のどれもが、神経演算処理（ニューロコンピューティング）を理解するには、１平面又は１点からのみならず、大きな３Ｄ体積内に位置する大きな神経細胞（ニューロン）集団のレベルで、すばやい情報フローの読出しと処理が必要であることを示している。さらに、神経回路網（neuronal networks）内でのコーディング及び演算処理は、細胞体統合ドメインによるのだけでなく、ほとんどの場合には細胞体記録から隠れたままである高度に非直線的な樹状突起の統合中心によっても組立てられている。そのため、神経活動の読出しを集団と単一細胞の両レベルで同時に行うことが望ましいであろう。さらに、目覚めた動物と行動している動物とでは神経シグナリングが完全に異なることが最近示された。従って、行動している動物の脳内の大きな走査体積内でニューロン、樹状突起、スパイン（棘）及びアキソン（軸索）アセンブリの活動パターンを、高い空間的及び時間的分解能で同時に記録することができる新規な方法が必要になっている。

３Ｄでの神経回路活動の迅速な読出しのための新規な光学的方法が最近いくつか開発された。多光子顕微鏡法のための利用可能な３Ｄ走査解決策として、３Ｄ ＡＯ走査法は、３Ｄランダムアクセス有感点走査（ポイントスキャニング）を実施することにより、古典的なラスタースキャン法に比べて数桁の大きさで測定速度及び信号収集効率を増大させることができる（Katona G, Szalay G, Maak P, Kaszas A, Veress M, Hillier D, Chiovini B, Vizi ES, Roska B, Rozsa B (2012); Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes（大きな組織体積内の三次元ランダムアクセス走査による高速二光子in vivoイメージング）Nature methods 9:201-208）。これは、予め選択した関心領域（ＲＯＩ，regions of interest）を、不必要なバックグラウンド体積のための無駄な測定時間を使わずに、正確かつ迅速に標的化することができるためである。より定量的には、３Ｄ ＡＯ走査法は、測定速度と信号／雑音比の二乗との積を、予め選択された走査点によりカバーされる体積に対する全画像体積の比で増大させる。この比は、同じ検体体積の従来のラスタースキャン法に比べて、ＲＯＩ当たりで約１０⁶～１０⁸と非常に大きくなりうる。

３ＤランダムアクセスＡＯ顕微鏡法の明白な利点にもかかわらず、この方法は次の２つの大きな技術的制約に直面している：ｉ）in vivo記録中に蛍光データが大きな振幅の動きアーチファクト（movement artifact又はmotion artifact）により消失若しくは汚染される；及びｉｉ）ＡＯ偏向器の大きな光学的開口サイズ（これは所定の走査点に向けるために音波で充満させなければならない）によりサンプリング速度が制限される。前記の最初の技術的制約は、記録されたＲＯＩの実際の位置が、心臓拍動、近くの血管内の血流、呼吸及び生理学的動きにより生じた組織の動きのためにin vivo測定中に常に変化しているために起こる。その結果、あらゆる種類の蛍光標識化のベースライン蛍光信号における空間的不均等性のために蛍光アーチファクト（不自然な結果）を生ずることとなる。さらに、記録された区画内の相対的な蛍光変化の空間的不均等性も加わる。そのため、１つの細胞体又は樹状突起区画内部の測定部位も同等ではない。また、動きにより誘起された過渡信号（transients）の振幅は、遺伝子工学的にコードされたカルシウムセンサー（genetically encoded calcium indicators, ＧＥＣＩ）により検出された１又はいくつかの活動電位により誘起されたものより一層大きいこともありうる。さらに、Ｃａ^2＋過渡信号と動きアーチファクトの動力学的挙動は非常に似ている場合がある。従って、脳の動きにより生じたアーチファクトから神経活動に伴う真の蛍光変化を事後に分離することは極めて困難である。３Ｄポイントごと走査手法（3D point-by-point scanning）に伴う前記第２の技術的問題点は、切替（スイッチング）時間が比較的長いことであり、これにより測定速度又はＲＯＩ数のいずれかが制限される。これは、高い空間分解能で大きな走査体積を達成するために大きなＡＯ偏向器開口が必要となるためである。しかし、これらの大きな開口を音響信号で満たすにはかなりの時間を要する。従って、生じた長時間のＡＯ切替時間のため、体積又は面エレメントを妥当な時間内に個々の単独ポイントから発生させることができなくなる。

ＡＯ顕微鏡により行われた３Ｄポイントごと走査の堅牢な性能は、切片プレパラート又は麻酔した動物における初期の研究において既に実証された。これらの検討において、３Ｄ走査は２群のｘ及びｙ偏向器を用いて実施された。集束（フォーカシング）中、第２のｘ（及びｙ）偏向器の駆動（ドライバ）関数は、焦点の横方向変位（横ずれ）を完全に補償するようにプログラミングされた、線形に増大する周波数（チャープ波、chirped frequency）を持つ逆方向伝播型の音波で補足された（そうしないと、この横ずれが、チャープ波の連続的に増大する平均音響周波数により生じてしまうだろう）。このように、有感点走査法（ポイントスキャニング）は高いポインティング安定性を生ずるが、３Ｄ内の新たな点にアドレスするたび毎に、大きなＡＯ偏向器開口を充満させることが必要であることから、比較的長い切替時間を必要とする。

別の連続軌道走査法（Katona G, Szalay G, Maak P, Kaszas A, Veress M, Hiller D,Chiovini V, Vizi ES, Roska B, Rozsa B (2012); ); Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes, Nature methods 9:201-208））は、より短いピクセル滞留時間（pixel dwell times）を可能にするが、この場合には、高速横方向走査が二次元に制限される。この場合もなお、ｚ方向に移動する時に時間のかかるジャンプにより３Ｄ軌道走査を中断する必要がある。換言すると、ｚ軸方向の走査はやはりポイントごと走査と同じ制約を受けることになる。

Katona G, Szalay G, Maak P, Kaszas A, Veress M, Hillier D, Chiovini B, Vizi ES, Roska B, Rozsa B (2012); Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes, Nature methods 9:201-208）

本発明の目的は、従来技術に伴う問題点を克服することである。具体的には、本発明の目的は、走査体積の任意の点から出発して、水平面内のみならず、任意の３Ｄラインに沿っても、焦点（フォーカルスポット）での高速走査ドリフト（変位、ずれ）を可能にするように、焦点座標及び速度と、４つのＡＯ偏向器のチャープパラメータとの間で１：１の関係を導き出すことにより既存の方法を一般化することである。

これらの目的は、レーザービームを３Ｄで集束させるために該レーザービームをｘ－ｚ面内で偏向させる第１の対の音響光学偏向器（ｘ軸偏向器）と該レーザービームをｙ－ｚ面内で偏向させる第２の対の音響光学偏向器（ｙ軸偏向器）とを有する３Ｄレーザー走査型顕微鏡を用いて、所定速度で３Ｄ空間内の任意の方向に通る実質的にまっすぐなライン（３Ｄライン）に沿って走査する方法であって、下記を含むことを特徴とする方法により達成される：
－起点（出発点）として作用する該３Ｄラインの一端の座標ｘ_０(0)、ｙ_０(0)、ｚ_０(0)を定め、
－走査速度ベクトル成分ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚｘ０（＝ｖ_ｚｙ０）を、この走査速度ベクトルの大きさが前記所定の走査速度に一致し、かつこの走査速度ベクトルの方向が前記３Ｄラインの方向に一致するように定め、
－下記２つの関数に従ってｘ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与し、

式中、ｉ＝１若しくは２とは、それぞれ第１及び第２のｘ軸偏向器を示し、Ｄは当該ＡＯ偏向器の直径であり、そしてｖ_ａは該偏向器内部の音波の伝播速度である；及び

そして、
－下記２つの関数に従ってｙ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与する。

式中、ｉ＝１若しくは２とは、それぞれ第１及び第２のｘ軸偏向器を示す；及び

式中、Δｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１、ｃ_ｘ２、Δｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１、及びｃ_ｙ２は焦点の初期位置（ｘ_０(0)、ｙ_０(0)、ｚ_０(0)）及びベクトル速度（ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚｘ０（＝ｖ_ｚｙ０）の関数として表される。

本発明の文脈において、３Ｄラインとは、顕微鏡の光学軸（ｚ軸）に沿ってゼロではない寸法をもち、この光学軸に垂直な平面（ｘ－ｙ面）に沿ってゼロではない寸法をもつ線である。従って、光学軸に平行な線は３Ｄラインと考えられず、また、純粋にｘ－ｙ面内に位置する線も同様である。該ラインの方程式は、そのライン行路のパラメータが３Ｄで次の一般式に従って選択される一組の線形方程式により記述することができる。

偏向器はｘ－ｚ面及びｙ－ｚ面内で偏向させているので、上記方程式は、次に示すように、ｘ－ｚ面及びｙ－ｚ面上への線投影を記述する方程式に変換することができる。

これらの式で、初期速度値ｖ_ｚｘ０＝ｖ_ｚｙ０＝ｖ_ｚ０並びにパラメータｍ、ｎ、ｋ、ｌは、次式に示すように、ｘ、ｙ、ｚの各軸方向の初期速度値ｖ_ｘ０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚ０により決定されることを含意する。

好ましくは、パラメータΔｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１、ｃ_ｘ２、Δｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１、及びｃ_ｙ２は次のように表される。

本発明は、同じ走査位置を保持するのではなく、サンプリング速度の制限なしに蛍光データを連続的に記録しながら、励起スポットを３Ｄ空間内で任意の所望速度で任意の方向にドリフト（変位）させる新規な方法である３ＤドリフトＡＯ顕微鏡法を提供する。これを実現するために、放物線型の周波数プロファイルでＡＯ偏向器内に非線形チャープを使用する。これらの放物線型周波数プロファイルで実現された部分ドリフト補償により、チャープさせた音波信号の時間的形状により決定される任意速度で任意方向への焦点の有向の連続移動が可能となる。焦点のこれらの高速３Ｄドリフト中、蛍光収集は中断されず、従来より用いられてきた有感点走査のピクセル滞留時間の制限を解除する。こうして、予め選択された個々の走査点は、予め選択されたＲＯＩのみならず、隣接したバックグラウンド面積又は体積エレメントをも覆うように、小さい３Ｄライン、面又は体積エレメントに広げることができる。

別の側面によると、本発明は、使用する顕微鏡の光学軸（Ｚ）とこの光学軸に対して垂直、かつ互いに対して垂直のＸ軸、Ｙ軸とにより規定される３Ｄ空間内部でレーザービームを集束させるための音響光学偏向器を備えた３Ｄレーザー走査型顕微鏡で関心領域を走査する方法を提供する。この方法は下記を含んでいる：
－前記関心領域に沿って複数のガイド点（guiding points）を選択し、
－選択したガイド点に対して或る１つの３Ｄ軌道をフィットさせ、
－前記３Ｄ軌道の各走査点を、前記光学軸の方向に部分的に拡張するように、前記３Ｄ空間内に位置する実質的にまっすぐなライン（３Ｄライン）に拡張（＝伸長）し、この３Ｄラインは所定の走査点で前記３Ｄ軌道に対して横断方向であり、前記まっすぐなラインは一緒になって実質的に連続した面を規定し、
－前記３Ｄラインの一端でレーザービームを集束させ、３Ｄラインに沿って焦点を連続的に移動させるために偏向器内の音響周波数に対して非線形チャープ信号を付与することにより各３Ｄラインを走査する。

前記３Ｄラインは例えば長さ５～２０μｍのものでよい。
好ましくは、前記３Ｄラインは前記３Ｄ軌道に対して実質的に垂直である。
好ましくは、本方法は、前記３Ｄ軌道の各走査点を、所定走査点で３Ｄ軌道に対して実質的に横断方向の複数の面を規定する、５～２０μｍ長さの複数の平行な実質的にまっすぐのラインに伸長することを含む。

好ましくは、本方法は、前記３Ｄ軌道の各走査点を５～２０μｍ長さの複数の平行な実質的にまっすぐのラインに伸長することを含み、これらのまっすぐな線は一緒になって、実質的に連続している１つの体積を、前記３Ｄ軌道がこの体積内部に位置するように規定している。

好ましくは、本方法は、前記３Ｄ軌道の各走査点を、所定走査点で３Ｄ軌道上に実質的に中心をもつ複数の直方体を規定する、５～２０μｍ長さの複数の平行な実質的にまっすぐのラインに伸長することを含む。

単独の個々の走査点を面積及び体積エレメントに伸長するための方法はいくつかあるが、３Ｄライン、面積及び体積の組合わせはほぼ無制限であり、本発明者らは特に有利な下記６種類の新たな走査方法を見出した：３Ｄリボン走査法、チェス盤（chessboard）走査法、多層多フレームイメージング法、スネーク走査法、マルチキューブ走査法、及びマルチ３Ｄライン走査法。これらはそれぞれ、異なる神経生物学的目的に最適である。

これらの方法に用いた体積又は面積走査は、精細な空間スケールで動きアーチファクトの補正を可能にし、従って、行動している動物内の微細構造物のin vivo測定を可能にする。そのため、個々のＲＯＩで神経活動を分析するのに必要な１０～１０００Ｈｚのサンプリング速度を保持しながら、行動している動物の脳内でさえも３Ｄ測定中の予め選択した複数のＲＯＩから蛍光情報を保存することができる。これらの方法は、１桁以上の大きさで動きアーチファクトの振幅を減少させることができ、従って、動いている行動している動物においてさえも６５０μｍ以上のｚ走査範囲内で３Ｄで樹状突起スパイン及び樹状突起といった、ニューロン細胞体及び精密な神経細胞プロセスの迅速な機能測定を可能にする。

本発明のさらに有利な態様は特許請求の範囲の従属請求項に記載されている。
本発明のさらなる詳細は、以下添付図面及び例示の態様の説明から明らかとなろう。

図１Ａは、レーザー走査型音響光学顕微鏡による縦／横方向走査の概略説明図である。図１Ｂは、挿入図中に白三角で示した１つの樹状突起ＲＯＩと１つのスパインＲＯＩとからの運動中（淡色）及び休息中（濃色）の３Ｄランダムアクセス有感点走査を用いて記録した例示の樹状突起及びスパインの過渡信号を示す図である。図１Ｃは、選択したＧＣａＭＰ６ｆ標識したニューロンの樹状突起セグメントと、この樹状突起セグメントの周囲の選択したリボン（点線で示す）の３Ｄ画像である。図１Ｄは、、縦方向（左）及び横方向（右）走査モードを用いて自発活動中の図１Ｃのリボンに沿った平均Ｃａ^２＋応答を示す色コード付きの図を示す。 図２Ａは、脳動きの記録図。図２Ｂは、記録された脳動きの正規化された振幅ヒストグラムを示す。挿入図は、休息期間及びランニング期間における平均変位及び平均ピーク間（peak-to-peak）変位を示す。図２Ｃは、距離に対する相対蛍光振幅の正規化された変化を示す。挿入図は、樹状突起セグメント例を示す。図２Ｄは、ＧＣａＭＰ６ｆ標識ニューロンの細胞体の画像（左）及び信号／雑音比の正規化された増大（右）である。図２Ｅは図２Ｄと同様であるが、樹状突起の記録についてである。図２Ｆは、動き補正の前後での脳動きの記録図を示す。図２Ｇは、動きアーチファクト補正の別の例を示す。図２Ｈは、動き補正をした、及びしない細胞体の過渡信号を示す。 図３Ａは、複数の樹状突起セグメントの概略透視図である。図３Ｂは、１２個の棘状樹状突起セグメントを同時記録するために用いた１２個の３Ｄリボンを示すｘ－ｙ面内及びｘ－ｚ面内の番号つきフレームを示す。図３Ｃは、図３Ｂに示した１２個の樹状突起領域に沿って同時になされた蛍光記録の結果を示す。図３Ｄは、図３Ｃでハイライトされた１３２の番号付き領域から得られたＣａ^２＋過渡信号を示す。図３Ｅは、図３Ｃに示した樹状突起スパインの活動パターンのラスタープロットを示す。図３Ｆは、図３Ｃの番号により示した５つの例示の樹状突起スパインからのＣａ^２＋過渡信号を示す。図３Ｇは、図３Ｆからの５つの樹状突起スパインの活動パターンのラスタープロットを示す。 図４Ａは、チェス盤走査法の概略透視図を示す。図４Ｂは、選択された走査領域の概略透視図である。図４Ｃは、視覚刺激中の１３６の細胞体の概略画像を示す。図４Ｄは、動きアーチファクト補償後の図４Ｃの色コードつき領域から得られた代表的な細胞体Ｃａ^２＋応答を示す。図４Ｅは、図４Ｃに示した色コード付きニューロンから異なる８方向への移動グレーティング刺激（moving grating stimulation）により誘導された平均Ｃａ^２＋応答のラスタープロットを示す。図４Ｆは、多フレーム走査法の概略透視図である。図４Ｇは、まばらに標識した（sparsely labelled）Ｖ１回路網から選択された、１個の特定のＧＣａＭＰ６ｆ標識した第Ｖ層錐体ニューロンの樹状突起画像である。図４Ｈは、図４Ｇに示したニューロンのｘ－ｚ投影図であって、同時イメージングされた樹状突起及び細胞体Ｃａ^２＋応答を示す。図４Ｉは、各ＲＯＩについての誘導されたＣａ^２＋過渡信号である。 図５Ａは、ＧＣａＭＰ６ｆセンサーで標識した第ＩＩ／ＩＩＩ層ニューロンの３Ｄ図であり、ここで四角形は４つの同時イメージングされた層を示す。図５Ｂは、図５Ａに示した同時測定された４層における平均ベースライン蛍光を示す。図５Ｃは、動きアーチファクト消去後の図５Ｂに示した番号つき黄色サブ領域から得られた細胞体Ｃａ^２＋応答を示す。図５Ｄは、図５Ｂからの平均化したベースライン蛍光画像を示す。 図６Ａは、スネーク走査法の概略透視図を示す。図６Ｂは、まばら標識を用いてＧＣａＭＰ６ｆセンサーにより標識したＶ１領域内の錐体ニューロンのｚ投影図であり、拡大スケールで選択された樹状突起セグメントを示す。図６Ｃは、図６Ｂに示した選択された樹状突起領域における１０Ｈｚで行われた高速スネーク走査の結果を示す。図６Ｄは、図６Ｃに示したのと同じ樹状突起セグメントであるが、３Ｄ体積をｘ－ｙ面及びｚ－ｙ面投影図として示す。図６Ｅは、３Ｄマルチキューブ走査法の概略透視図を示す。図６Ｆは、同時３Ｄ体積イメージングのための個々のニューロン細胞体を選択している１０個の代表的キューブのボリュームレンダリングされた（volume-rendered）画像を示す。図６Ｇは、３Ｄ動き補正後の図６Ｆに示した１０個のキューブから得られたＣａ^２＋過渡信号を示す。 図７Ａは、マルチ３Ｄライン走査法の概略透視図を示す。図７Ｂは、脳動きの振幅を示し、平均動き方向を矢印で示す。図７Ｃは、ＧＣａＭＰ６ｆで標識された第２／第３層錐体細胞のｚ投影図であり、白い線は１６４の予め選択されたスパインを通過する走査線を示す。図７Ｄは、マルチ３Ｄライン走査法を用いて１４のスパインに沿って記録した１個の未加工のＣａ^２＋応答を示す。図７Ｅは、異なる４方向での移動グレーティング刺激により誘導された例示のスパインＣａ^２＋過渡信号を示す。図７Ｆは、有感点走査法（左）及びマルチ３Ｄライン走査法（右）を用いて測定された、選択されたＣａ^２＋過渡信号を示す。 本発明に係る各種の高速３Ｄ走査方法の概略透視図を示す。 ３Ｄスキャナー及び集束システムの光学的幾何学形状の略図を示す。

図１Ａには、本発明に係る方法を実施するのに使用することができる、例示となるレーザー走査型音響光学（ＡＯ）顕微鏡１０が示されている。このＡＯ顕微鏡１０は、レーザービーム１４を発生させるレーザー光源１２、レーザービーム１４を検体（サンプル）上に集束させるための音響光学偏向器１６及び対物レンズ１８、並びに後方散乱光及び／若しくは検体が発する蛍光を検出するための１若しくは２以上の検出器２０を備えている。本技術分野で知られているように、ＡＯ偏向器１６の他の構成も可能である。レーザービーム１４をＡＯ偏向器１６及び対物レンズ１８に導き、また後方散乱光及び／若しくは発生した蛍光を検出器２０に導くために、本技術分野で知られているように、さらなる光学要素（例、ミラー、ビーム・スプリッタ、ファラデイ・アイソレータ、分散補償モジュール、レーザービーム安定化モジュール、ビーム・エキスパンダ、角分散補償モジュール等）を設けてもよい（例えば、Katona et al.「大きな組織体積内の三次元ランダムアクセス走査による高速二光子in vivoイメージング」Nature methods 9:201-208, 2012を参照）。もちろん、異なる構造のレーザー走査型顕微鏡１０を用いることもできる。

二光子励起に使用するレーザー光源１２は、レーザービーム１４を生ずるフェムト秒パルスレーザー、例えば、モード周期（mode-locked）Ｔｉ：Ｓレーザーでよい。このような場合、レーザービーム１４は、不連続のレーザーパルスからなり、このパルスはフェムト秒のパルス振幅とＭＨｚ範囲内の繰り返し周波数を有する。

好ましくは、レーザービーム１４の光路内にファラデイ・アイソレータを配置する。これは、レーザービームの反射を防止することにより、よりスムースな出力性能を助ける。ファラデイ・アイソレータを通過した後、レーザービーム１４は、好ましくは分散補償モジュール内に入り、ここで既知方法によりプリズムを用いて予備分散補償が行われる。この後、レーザービーム１４は、好ましくはビーム安定化モジュールとビーム・エキスパンダとを通過してから、ＡＯ偏向器１６に到達する。

ＡＯ偏向器１６により偏向されたレーザービーム１４は、好ましくは本技術分野で知られているように、ビーム１４の角分散を補償するために角分散補償モジュールを通過する。対物レンズ１８が、この対物レンズ１８の後ろに置かれた検体２６上にレーザービーム１４を集束させる。好ましくは、角分散補償モジュールと対物レンズ１８との間にビーム・スプリッタが配置される。これは、本技術分野で知られているように、検体２６から反射され、及び／又は検体２６が発し、対物レンズ１８が捕集したレーザービーム１４の部分を、光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器２０に送る。

本発明の方法によれば、信号／雑音比を実質的に増大させ、それにより、例えば動いている脳内といったin vivoでの測定を可能にするために、走査点を３Ｄライン及び／又は面及び／又は体積エレメントに伸長する。

本発明による３ＤドリフトＡＯ走査法は、個々のポイント（点）の走査を可能にするだけでなく、走査体積全体の中の任意の位置にある任意の３Ｄラインの任意のセグメントに沿って走査することも可能にする。従って、例えば、図１Ａに示したように、任意の折られた面（又は体積）エレメントを、例えば横方向又は縦方向のラインから発生させることができる。このようにして、ポイントごと走査モードにおける単独有感点走査に必要となるのと同じような短時間（≒２０μｓ）で３Ｄライン全体を走査し、その間に蛍光情報を連続して収集することができる。データ収集速度はＰＭＴ検出器２０の最大サンプリング速度によってのみ制限される。

従って、３Ｄ内で３ＤドリフトＡＯ走査技法により折られた面エレメントを発生させて、それらのエレメントをいかなる任意走査軌道に、例えば、長い蛇行した樹状突起セグメント及び脳動き中の蛍光損失を低減させる向きの枝分かれポイント、にフィットさせることが可能である。この技法を３Ｄリボン走査法と称する（図１Ｃを参照）。

３Ｄリボン走査法を実施するための第１工程は、関心領域（例、１つの樹状突起セグメント又は任意の他の細胞構造）に沿って複数のガイド点を選択することである。
第２工程は、これらのガイド点に、例えば、区分的三次エルミート内挿（piecewise cubic Hermite interpolation）を用いて、ある３Ｄ軌道をフィットさせることである。この選択された３Ｄ軌道に沿ってリボンを形成するための２つの好ましい方策は、図１Ａに示すように、複数回のドリフト（焦点が連続的に動く間の短いスキャン）を、該軌道に平行（縦方向ドリフト）又は該軌道に直交（横方向ドリフト）のいずれかの方向で発生させることである。どちらの場合も、これらの面エレメントが脳動きの面又は対物レンズの公称焦点面に対していかに平行に位置するかを最大限にすることが好ましい。後者の後ろにある基本的アイディアは、点広がり関数をｚ軸に沿って拡張することである：そのため、蛍光測定値はｚ軸に沿った動きへの感受性が低くなる。従って、この第２の方策に従って、神経回路網及び神経線維網（ニューロピル）測定値のための複数ｘ－ｙフレームを発生させることも可能となる（後出を参照）。

以下に、本発明に係る３ＤドリフトＡＯ走査方法により達成することができるいくつかの異なる走査技法の実施と有効性について実証する。
実施例１：in vivo動きアーチファクトを補償するための３Ｄリボン走査
３Ｄリボン走査を実証するため、視覚野のＶ１領域内の錐体ニューロンの小部分を、導入用にＡＡＶベクターを用いて、Ｃａ^２＋センサーのＧＣａＭＰ６ｆで標識した。次いで、事前に取ったｚ－スタックに従ってガイド点を選択し、これらの点を、標識した椎体細胞の棘状（有棘）樹状突起セグメントをカバーする３Ｄ軌道にフィットさせた（図１Ｃ）。図１Ｃは、ある選択したＧＣａＭＰ６ｆ標識ニューロンの樹状突起セグメントの３Ｄ画像を示す。Ｃｒｅ依存性ＧＣａＭＰ６ｆを発現するＡＡＶベクターを用いて、まばら標識を誘起させた。生じた直方体内部の高速３ＤドリフトＡＯ走査のために、ある３Ｄリボン（図に点線で示す）を選択した。

この選択した３Ｄリボンに沿って走査するために、横方向ドリフトを使用して、選択した１４０μｍの樹状突起セグメント及び複数のスパインを７０.１Ｈｚで測定した（図１Ｄ）。未加工の生の蛍光データ（raw）は、選択した３Ｄリボンに沿って測定され、動きアーチファクトの消去後にリボンの縦軸及び横軸に沿って２Ｄに投影されたものである。自発的活動中のリボンに沿った平均Ｃａ^２＋応答（syn）は色コード付けされた。縦方向ドリフトを用いると、同じＲＯＩをカバーするのに必要な３Ｄラインの数がより少なく（但し、より長く）なるため、同じ樹状突起セグメントをずっと高速（１３９.３Ｈｚから４１７.９Ｈｚの範囲内）で測定することがが可能となった。次の工程では、３Ｄ記録したデータを、リボン面に沿った垂直及び横断方向距離の関数として２Ｄに投影した。こうすることで、樹状突起セグメントが１つのフレームに整直化されて（図１Ｄ）、その活動が２Ｄ動画に記録されたことに留意されたい。この投影はまた、２Ｄ走査における動きアーチファクト消去のために開発された従来技術の方法の適応版の使用を可能にした（Greenberg DS, Kerr JN (2009) Automated correction of fast motion artifacts for two-photon imaging of awake animals（覚醒動物の二光子イメージングのための高速動きアーチファクトの自動化補正）, Journal of neuroscience methods 176:1-15を参照）。

動きアーチファクト消去のために周囲蛍光情報を保存するには単独の個々の走査点を面又は体積エレメントに拡張する必要があることはまた、有感点走査方法の使用時には行動している動物の動きの間に蛍光情報が完全に失われることがあることによっても示唆される。図１Ｂは、挿入図中に白三角で示した１つの樹状突起及び１つのスパインの関心領域（ＲＯＩ）から運動中（淡色）及び休息中（濃色）の３Ｄランダムアクセス有感点走査を用いて記録した、例示の樹状突起及びスパインの過渡信号を示す図である。淡色のランニング（運動）期間中には蛍光情報がバックグラウンドレベルに到達することがある点に留意されたい。このことは、動いている行動している動物の活動を観測するのに個々の単独点では十分でないことを意味している。

図２Ａ～２Ｈは、３ＤドリフトＡＯ走査法がもつ動きアーチファクト消去の可能性についての定量的解析を実証する。
リボン走査中の動きに誘発された誤差と動きアーチファクト補正の有効性とを定量化するために、本発明者らはまず、より暗いバックグラウンド領域で包囲された１つの明るいコンパクトな蛍光物体を素早く走査することにより、脳の動きを測定した。これを行うため、その蛍光物体上に１つの小さな走査体積であるキューブ（立方体）を中心合わせして配置し、試験したマウスが直線仮想迷路中を走っている間にｘ－ｙ、ｘ－ｚ及びｙ－ｚ投影から変位を計算した。同時に記録した移動情報に従って休息期間と動いている期間とを分離した（図２Ａ及び２Ｂ）。図２Ａの場合、より暗い領域で包囲された１つの明るいコンパクトな蛍光物体を体積イメージングすることにより脳の動きを１２.８Ｈｚで記録した。図２Ａは、マウスが直線迷路内を走っている時（淡色）及び休息している時（濃色）に２２５秒の測定期間からｘ軸上に投影された脳変位の例示的な過渡信号を示す。頭部拘束されたマウスの動き期間を、この仮想現実システムの光学的エンコーダーを用いて検出した。

変位データを、記録された移動情報（淡色の走り＜ランニング＞と濃色の休息）に従って２つの間隔に分け、この２つの期間について脳動きの正規化された振幅ヒストグラムを算出した（図２Ｂ）。挿入図は、休息及び走り期間時の平均変位と平均ピーク間変位を示す。

図２Ｃは、ＧＣａＭＰ６ｆ標識樹状突起セグメントの中心からの距離の関数としての相対的蛍光振幅の正規化した変化（ΔＦ／Ｆ(ｘ)、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）を示す。点線は、それぞれ休息期間及び走り期間について算出された平均ピーク間変位値を示す。走り時の平均変位値についてΔＦ／Ｆ振幅に８０％を超える低下があることに留意されたい。挿入図は樹状突起セグメントの１例を示す。ΔＦ／Ｆを点線に沿って平均化した後、線をシフトさせ、平均化を繰り返してΔＦ／Ｆ(ｘ)を算出した。

脳動きは、ベースライン蛍光及び相対的蛍光信号も空間的な不均等性があるため、蛍光アーチファクトを誘起しうる（図２Ｃ）。動きで発生した蛍光の過渡信号の振幅は、相対的蛍光変化のヒストグラムに平均ピーク間動き誤差を代入することにより算出することができる（図２Ｃ）。平均ΔＦ／Ｆ(ｘ)のヒストグラムは樹状突起（ｎ＝３、１００μｍ長さの樹状突起セグメント、図２Ｃ）について比較的シャープであった。従って、走り時の平均動き振幅は蛍光振幅の比較的大きな（８０.１±３.１％、１５０断面の平均）低下に対応し、これは、単一のＡＰ誘起Ｃａ^２＋応答の平均振幅より約３４.４±１５.６倍高い値である。これらのデータは動きアーチファクト補償の必要性を示唆している。

図２Ｄの左側には、ＧＣａＭＰ６ｆ標識したニューロンの細胞体の画像が見られる。点と点線矢印はぞれぞれ走査点と走査線とを示している。右側で、図２Ｄは、左側に示したように細胞体記録において走査点を走査線に拡張した時に覚醒動物における休息（濃色）及び走り（淡色）期間について計算した信号／雑音比の正規化された増大を示す。ポイントごと走査による信号／雑音比を点線で示している。

図２Ｅは、図２Ｄと同様の計算を樹状突起記録について実証する。樹状突起スパインのポイントごと走査の信号／雑音比が、休息（濃色）及び走り（淡色）時間中の３Ｄリボン走査に対して比較された。３Ｄリボンを使用した時には１０倍以上の改善があることに留意されたい。

次に、本発明者らはin vivo測定中の動き補正に対する本発明の方法の有効性を分析した。前と同様に、ニューロン及びそれらのプロセスをＧＣａＭＰ６ｆセンサーで標識し、３Ｄリボン走査を使用し、記録された蛍光データを動画フレームに投影した。３Ｄリボンに沿って記録された動画の各フレームを、引き続くフレーム間の蛍光クロス相関を最大にするようにサブピクセル分解能でフレームをシフトすることにより補正した時に最も良い結果が得られた（図２Ｆ）。図２Ｆの左側には、行動しているマウスの４９.２μｍ棘状樹状突起セグメントに沿った３Ｄリボン走査で記録された動画から誘導された、単一の樹状突起スパインからの例示の個々のＣａ^２＋過渡信号が見られる（未加工トレース）。ピクセル分解能及びサブピクセル分解能で行った動きアーチファクト補正後にＣａ^２＋過渡信号を誘導すると、動き誘起アーチファクトは解消し、信号／雑音比が改善された。

走り運動中の動物においてリボン走査とサブピクセル分解能での引き続くフレームのシフトにより、３Ｄランダムアクセス有感点走査に比べて、７.５６±３.１４倍（ｐ＞０.００００１５、ｎ＝１０）も信号／雑音比が増大した（図２Ｇ）。図２Ｇは、動きアーチファクト補正についてのさらなる例を示す。最上段には、覚醒マウスからの３Ｄリボン走査で記録された動画からの単一フレームを見ることができる。下段には、色コードされた領域からの記録された動画フレームから得られた例示のＣａ^２＋過渡信号を見ることができる。これに見られるように、サブピクセル分解能で動きアーチファクト補正を行った後にデータを得た時に、過渡信号の信号／雑音比が改善した。右側には、計算されたスパインＣａ^２＋過渡信号（１００過渡信号、ｎ＝５／５ スパイン／マウス）の信号／雑音比が見られる。過渡信号はサブピクセル分解能での動き補正の有無別に示してある。

次に、本発明者らは、リボン走査後の信号／雑音比に対する事後（post hoc）フレームシフトの効果を別々に検討した。低振幅スパインＣａ^２＋過渡信号は、過渡信号が生（未加工）動画から得られた場合にはほとんど見えなかった。正確な解析的分析のために、棘状樹状突起セグメント及び細胞体の画像に同じ１、２、５及び１０個の活動電位誘導した平均過渡信号を加えた。その後、予め記録された脳の動きの振幅で各フレームをシフトさせることにより（図２Ａと同様）、フレームのシリーズを発生させた。最後に、同じ領域についてポイントごと走査と動き補正した３Ｄリボン走査の信号／雑音比を比較するために、同じサイズのＲＯＩを用いて、動き補正アルゴリズムの採用の有り、無しで、これらのフレームシリーズからＣａ^２＋過渡信号を再計算した。得られたデータは、ポイントごと走査とは異なり、３Ｄリボン走査は、動き補正を可能にし、in vivo測定中に最も高頻度で記録された、小さな１～５ＡＰの付随信号の場合に信号／雑音比を大きく改善させることができる（１１.３３±７.９２倍、ｐ＞０.０２５、ｎ＝４細胞体；１ＡＰについてｎ＝１００繰り返し）ことを示したが、本方法はバースト付随（burst-associated）及び樹状突起応答の信号／雑音比も著しく向上させた。最後に、本発明者らは本方法の有効性を「古典的な」行動実験プロトコルで定量化した。同時に、条件刺激及び無条件刺激中のバソプレシン発現性介在ニューロン（ＶＩＰ, vasopressin-expressing interneurons）の複数の細胞体を記録した。見返りは、そのＣａ^２＋信号が行動誘発動きと一時的にオーバーラップし、従ってＣａ^２＋過渡信号が大きな動きアーチファクトを伴ったＧＣａＭＰ６ｆ標識ニューロンに大きな応答を誘発したことであり、負の振幅をもつ過渡信号さえ発生したことがあった（図２Ｈ）。図２Ｈの左側は、条件刺激（水罰、water reward）と無条件刺激（空気吹きつけ、図示せず）を２つの異なる音について付与した古典的行動実験中におけるＶＩＰニューロン細胞体の同時３Ｄイメージングを見ることができる。例示の細胞体過渡信号が、サブピクセル分解能での動き補正の有り（淡色）及び無し（濃色）で示されている。下部の図は動き振幅を示している。動き誘発されたものとニューロン性のＣａ^２＋過渡信号とがオーバーラップしていることに留意されたい。さらに、動き補正がないと過渡信号は負の振幅をとりうることがあった。右側には、過渡信号の信号／雑音比を、動き補正の有り（淡色）及び無し（濃色）で示してある（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。

実施例２：複数３Ｄリボン走査による棘状樹状突起セグメントの記録
近年、多くの皮質ニューロンについて、シナプス統合が、軸策起始セグメントのみならず、尖端及び基底樹状突起ツリー内部でも起こることが報告されている。ここで、樹状突起セグメントは、非線形計算性の（non-linear computational）サブユニットを形成し、それらは、例えば、非線形の電位依存性イオンチャネルにより発生した局部的再生能を通して、互いに相互作用もする。しかし、多くの場合、局部的樹状突起計算性事象の直接的な結果は細胞体記録内に隠れたままである。従って、ニューロン（神経）回路網におけるコンピューテーション（計算モデル）を理解するには、複数の棘状樹状突起セグメントの同時測定のための新規な方法も必要となる。既存の研究ではin vitro条件下での複数の樹状突起セグメントの同時記録は実証されていたが、大きなｚ－走査範囲に及ぶin vivo記録は、心臓拍動、呼吸又は物理的な動きにより発生した脳の動きがこれら微細構造物の３Ｄ測定を阻害するため、未解決の問題として残ったままであった。そのため、本発明者らは、図３Ａに示すように、樹状突起の複数セグメントの活動を同時記録するために３Ｄリボン走査を実施した。

個々の単独樹状突起セグメントの３Ｄ測定の場合と同様に、事前にｚ－スタックをとり、複数樹状突起セグメントに沿って３Ｄでガイド点を選択し、３Ｄ軌道にフィットさせ、最後に、選択した複数の樹状突起セグメントのそれぞれに３Ｄリボンを作成した（図３Ｂ）。上述したように、リボン面は、動きアーチファクトの影響を最小限にするために脳の平均動きベクトルに平行となるように設定した。本発明者らは、高速３Ｄリボン走査のためにＧＣａＭＰ６ｆ標識Ｖ１錐体ニューロンから１２の樹状突起セグメントを選択した（図３Ｂ）。図３Ｂは、ＧＣａＭＰ６ｆ標識した第ＩＩ／ＩＩＩ層錐体ニューロンのｘ－ｙ面及びｘ－ｚ面における最大強度投影を示す。番号を付した各フレームは、３Ｄリボン走査を用いて１２の棘状樹状突起セグメントを同時記録するのに用いた１２の３Ｄリボンを示している。白いフレームは同じ棘状樹状突起セグメントを、但しｘ－ｚ投影で示す。

次の工程では、各リボンに沿って記録された３Ｄデータを、その所定リボンの軌道に垂直方向及び軌道と平行方向の距離の関数として２Ｄ投影した。次に、これらの樹状突起セグメントの２Ｄ投影図をそれらの長さの関数として（長さ順に）配列し、並列に並べて配置した（図３Ｃ）。上段には、図３Ｂに示した１２の樹状突起領域に沿って蛍光を同時に記録した。蛍光データは、各リボンの縦方向及び横方向に沿った距離の関数として２Ｄ画像に投影された後、全画像を並列に配列した。この変換により、１２の選択された樹状突起領域の活動の同時記録、引き続く動きアーチファクトの解消及び２Ｄ動画としての可視化が可能になった。上段の画像は、１８.４Ｈｚで記録された動画からの単独フレームである。挿入図は、保存された二光子分解能を示す樹状突起スパインの拡大図である。下段には、数字が１３２個のＲＯＩを表示している：これらはビデオから選択された樹状突起セグメント及びスパインである。こうすることで、全ての樹状突起セグメントがまっすぐにされて、並列して可視化されることに留意されたい。このようにして、３Ｄ機能データをリアルタイムで標準的なビデオ動画として変換及び可視化することができる。ここで用いた２Ｄ投影は、高速の動きアーチファクト消去を可能にし、データ保存、データ可視化及び手動のＲＯＩ選択を単純化する。

各リボンは３Ｄ空間内で異なるいろいろな方向に向きうるので、測定結果の局所座標系は、ある所定リボンに沿った距離の関数として、また異なる樹状突起セグメントをカバーするリボン間の距離の関数として変動する。そのため、脳の動きが各リボンで異なる相対的な方向でアーチファクトを発生させるので、これまで用いられてきた２Ｄの動き補正方法は、リボンから発生させた平坦化させた２Ｄ動画には使用することができない。この問題を解決するために、本発明者らは各樹状突起領域の記録を短いセグメントに分割した。次に、各３Ｄリボンセグメントの変位を、最も明るい画像を参照基準として用いた相互相関により算出した。各セグメントの最初の３Ｄ方位がわかれば、各リボンセグメントに対する変位ベクトルを計算することができた。次に、これらの変位ベクトルの中央値（メジアン）を算出して、記録された樹状突起ツリーの正味の変位を推定した。次に、この正味変位ベクトルを各リボンセグメントに投影し直して、動き消去のために各リボンセグメントの各画像に対して必要なバックシフトを算出した。最後に、それぞれ及び全てのセグメントにおいて前記アルゴリズムを別々に繰り返して、変位の局所不均質性に対してアルゴリズムを正した。これにより、例えば、変位における深さ、血管及び距離に依存する不均質さを解消することができた。この３Ｄから２Ｄへの変換及び動きアーチファクト消去に続いて、本発明者らは、既に開発されている２Ｄ方法を本発明の３ＤのＣａ^２＋データに適用して、例えば、１３０以上のスパイン及び樹状突起領域から、規則的なＣａ^２＋過渡信号を算出することができた（図３Ｃ及び３Ｄ）。本方法を用いて、本発明者らは自発的及び視覚的刺激誘発活動を検出した（図３Ｄ及び３Ｆ）。図３Ｆでは、移動グレーティング刺激により過渡信号が誘導された。個々のスパインの空間及び時間タイミングの可変性に留意されたい。最後に、樹状突起スパインアセンブリの同期及び非同期の両方の活動を、行動し、動いている動物内で記録することができることを実証するために、スパインアセンブリパターンから２つのラスタープロットを発生させた（図３Ｅ及び３Ｇ）。図３Ｇでは、８つの異なる方向における移動グレーティング刺激の時間が灰色の棒状領域で示されている。

実施例３：神経回路網の多層多フレームイメージング：チェス盤走査法
神経計算モデルを理解するには、スパインと樹状突起の組合わせ（アセンブリ）の記録のみならず、細胞体の集団を記録することも重要である。ランダムアクセス有感点走査法は、in vitro測定及び麻酔下のマウスモデルにおける集団イメージングには良好な信号／雑音比を与える迅速な方法であるが、有感点走査法は覚醒した行動している動物の記録中には、次の２つの理由で大きな動きアーチファクトを発生させる。第１に、動きアーチファクトの振幅がその細胞体の直径のレベルであることである。第２に、特に標識にＧＥＣＩを使用した場合、ベースライン及び相対蛍光が空間内で均質とはならない（図２Ｃ）。そのため、動いている間の細胞体の蛍光情報を保存するためには、蛍光情報を、各細胞体由来の単独点からのみならず、周囲の隣接したＲＯＩからも検出することが必要となる。これを達成するため、本発明者らは、各走査点を小さな四角形及び別セットの測定では（下記参照）小さなキューブに拡張した。四角形の向きを動き補正に最適となるように設定するには、上述した２種類の主な方策を採用することができる。即ち、該四角形を動きの方向と平行になるか、又は対物レンズの公称焦点面と平行になる（図４Ａ）、のいずれかに設定することができる。この第２の方策を本書に実証する。図４Ｂは、選択した走査領域の概略透視図である。Ｖ１領域におけるマウス由来のニューロンをＧＣａＭＰ６ｆセンサーで標識した。ニューロン細胞体及び周囲のバックグラウンド部分（小さい水平フレーム）を、測定開始時にとったｚ－スタックに従って選択した。図４Ｂのスケール棒は５０μｍである。

３Ｄリボン走査法と同様に、多層多フレーム記録中に、画像獲得中であっても、良好な可視化と動画記録のために、全ての四角形、従って各細胞体を「チェス盤」パターンに単に配列させることにより、得られた３Ｄデータの２Ｄ投影を発生させることができる（このバージョンの多層多フレームイメージングを「チェス盤」走査法と呼ぶ）。３Ｄリボン走査法と同様に、この場合も、平均脳変位ベクトルを時間の関数として算出し、それを動きアーチファクト補正のために全フレームから差し引いた。最後に、本発明者らは、この２Ｄ投影からサブ領域を選択して、上述のように対応するＣａ^２＋過渡信号を計算し（図４Ｃ～４Ｄ）、移動グレーティング刺激により方位及び方向感受性ニューロンを検出（図４Ｅ）することができた。図４Ｃでは、選択されたフレームが、２Ｄ「チェス盤」に「変換」されており、ここで個々の「四角形」はそれぞれ単独の細胞体に対応する。従って、活動を２Ｄ動画として記録することができる。図４Ｃに示した画像は、視覚的刺激中の１３６の細胞体のビデオ記録からの単独フレームである。図４Ｄは、動きアーチファクト補償後の図４Ｃにおける色コード付けした領域から誘導された代表的な細胞体Ｃａ^２＋応答を示す。図４Ｅは、図４Ｃに示した色コード付けしたニューロンから異なる８方向への移動グレーティング刺激により誘導された平均Ｃａ^２＋応答のラスタープロットを示す。

多層多フレーム走査法は、レゾナントスキャニング法（resonant scanning）よりは大きな速度で走査体積内の任意位置に配置された複数の小フレームに沿った同時イメージングを可能にすることによって、低出力時間的オーバーサンプリング（ＬＯＴＯＳ, low-power temporal oversampling）の低い光子毒性という利点に、ＡＯ顕微鏡測定法の３Ｄ走査能力の特別な融通性を結びつける。

長い神経細胞プロセスの多層多フレームイメージング
多層多フレーム走査法は、神経細胞プロセス（ニューロンプロセス）の測定にも使用することができる（図４Ｆ）。図４Ｆは測定の概要を示す。走査体積中の異なるサイズ及び任意の位置での複数フレームを用いて、活動を捕捉することができる。ＧＥＣＩによる全ｚ－走査範囲が６５０μｍ以上に拡張されたために、例えば、第ＩＩ／ＩＩＩ層又は第Ｖ層ニューロンをの尖端及び基底の樹状突起アーバー（dendritic arbors）を同時にイメージングすることができ、又はこのｚ－走査範囲内で樹状突起ツリーの活動を追跡することができる。この大きな樹状突起イメージング範囲を実証するために、まばらに標識したＶ１回路網からＧＣａＭＰ６ｆ標識した第Ｖ層ニューロンを選択した（図４Ｇ）。図４Ｈは、図４Ｇに示したニューロンのｘ－ｚ投影を示す。覚醒動物において５００μｍ以上のｚ範囲内で異なる４１の深さレベルに位置する複数フレーム内で視覚的刺激により誘導した樹状突起及び細胞体のＣａ^２＋応答を同時にイメージングした（図４Ｈ）。図４Ｇに示した色コード付けしたフレームは、同時イメージングされた四角形の位置を示す。動きアーチファクトは、上述したように、サブピクセル分解能での動き補正を与える時間依存性の正味変位ベクトルを減ずることにより、フレームから消去した。最後に、各ＲＯＩについてＣａ^２＋過渡信号を誘導した（図４Ｉ）。過渡信号は、灰色で示した時間期間での移動グレーティング刺激により誘導された。

もちろん、多層多フレーム走査法は、単一のニューロンの単一の樹状突起に制限されるものではなく、それぞれ樹状突起（又は軸索）アーバーをもつ多数のニューロンの同時イメージングも当然可能である。図５Ａは、ＧＣａＭＰ６ｆセンサーで標識された第ＩＩ／ＩＩＩ層ニューロンの３Ｄ図を示す。矩形は４つの同時イメージングされた層（ＲＯＩ１～４）を示す。数字は、脳軟膜からの距離を示す。ニューロンは、まばら標識を用いてＶ１領域内で標識された。同じ走査体積中に位置する別の３つのＧＣａＭＰ６ｆ標識されたニューロンの細胞体及び神経細胞プロセスは、明確さのためにｚ－スタックから除去された。非特異性ＡＡＶベクターを用いて４層の神経線維網を選択し、４層内を同時に１０１Ｈｚで活動の記録を行った。図５Ｂは、図５Ａに示した同時測定された４層の平均ベースライン蛍光を示す。右上角の数字は脳軟膜からのイメージング深さを示す。図５Ｃには、図５Ｂに示した数字つき黄色サブ領域から動きアーチファクト消去後に得られた代表的なＣａ^２＋過渡信号を示す。応答は、灰色の影で表示した時間間隔で異なる３方向への移動グレーティング刺激により誘導された。図５Ｄには、図５Ｂからの平均化ベースライン蛍光画像が、グレイスケールで示されており、これらは色コード付けされた相対Ｃａ^２＋変化（ΔＦ／Ｆ）と重ねられている。代替となる別の定量的分析を示すために、いくつかの例証的な細胞体及び樹状突起ＲＯＩ（図５Ｂ）からのＣａ^２＋過渡信号も算出した（図５Ｃ）。

マルチキューブ及びスネーク走査法による体積走査（ボリュームスキャニング）
本発明者らのデータは、脳が空間的三次元の全てに沿って動いていても、３Ｄで少ない次元の面エレメントに沿って走査することにより、蛍光情報をなお保存して、動きアーチファクトを効果的に消去できることを実証した。しかし、状況によっては、例えば、より大きい動物、又は手術若しくは行動プロトコルに応じて、動きの振幅がより大きくなることがあり、見えない第３の走査次元を補償することができない場合がある。このような場合であっても蛍光情報を十分に保存するために、測定のための必要なノイズ消去効率を達成するまで自動アルゴリズムを用いて面エレメントを体積エレメントに拡張することにより見えない走査次元を取り戻すことができる。これを２つの例で実証するために、本発明者らは、３Ｄリボンを折り曲げられた直方体（キューボイド）に拡張し（「スネーク走査法」と呼ばれる）、多フレームを多キューボイドに拡張した。図６Ａは、この３Ｄ測定の概要を示す。３Ｄ走査のために選択した複数の３Ｄリボンを、樹状突起スパイン、親の樹状突起及び隣接するバックグラウンド体積を完全に含むように３Ｄ体積エレメント（３Ｄ「スネーク」）に拡張して、覚醒した行動している動物の脳の動き時の蛍光情報を完全に保存することができる。図６Ｂは、スネーク走査のために皮質のまばら標識したＶ１領域から選択されたＧＣａＭＰ６ｆ標識第ＩＩ／ＩＩＩ層ニューロンの棘状樹状突起セグメントのｚ投影である（図６Ｂ）。選択された樹状突起セグメントが拡大スケールで示されている。開始時にとったｚ－スタックに従って、本発明者らは多数のガイド点を選択し、３Ｄ軌道を内挿し、全セグメントをカバーする３Ｄリボンを発生させた（上述の通り）。その後、得られたリボンを体積に拡張し、選択された折り曲げられたキューボイドから３Ｄスネーク走査を実施した（図６Ａ～６Ｄ）。図６Ｃでは、移動グレーティング刺激により三次元Ｃａ^２＋応答が誘導され、樹状突起に沿った距離及び垂直方向の１つに沿った距離の関数として２Ｄに投影された。図６Ｂに示した選択された樹状突起領域において１０Ｈｚで高速スネーク走査を実施した。蛍光データを、縦方向及び横方向に沿った距離に関数として投影した後、データを第２の（そして直交）垂直軸に沿って最大値投影して、３つの移動方向についての平均応答を、別々に、そして一緒に、動き補正後に示した。別の方法として、折り曲げられたスネーク形態を規則的なキューブに変換することにより、単一面への最大値投影を避けることができた。図６Ｄは、図６Ｃと同じ樹状突起セグメントを示すが、本図では３Ｄ体積をｘ－ｙ面及びｚ－ｙ面投影図として示している。代表的な自発Ｃａ^２＋応答が、樹状突起スパイン及び２つの樹状突起領域に対応するコーディングされたサブ体積エレメントから誘導された。これらのサブ体積エレメントからサブピクセル分解能での３Ｄ動き補正後に過渡信号が誘導された。この表示では、異なるサブ体積からＣａ^２＋過渡信号が算出できた（図６Ｄ）。保存された良好な空間分解能のために、動いている動物において各スパインを、他のスパインから、そして根元の樹状突起から、明確に分離することができることに留意されたい。その結果、複数のスパインが隠れた位置やオーバーラップする位置にある場合であっても、それらのスパインからの過渡信号を同時に記録して分離することが可能となり、これは樹状突起コンピューテーションを正確に理解するのに必要である（図６Ｄ）。

図６Ｅは、３Ｄマルチキューブ走査法の概略透視図である。マルチキューブ・イメージングを実証するために、複数フレームを単に小さなキューブに拡張し、細胞体のｚ方向直径と最大ｚ方向移動（peak z movement）の合計より僅かに大きいｚ方向寸法を付加して、動き時の全ての細胞体蛍光点を保存した。図６Ｆは、同時３Ｄ体積イメージングのための個々のニューロン細胞体を選択している１０個の代表的キューブのボリュームレンダリングされた画像を示す。１０個のＧＣａＭＰ６ｆ標識された細胞体の同時測定は、そのサイズが細胞体の直径に整列されている比較的大きなキューブを用いて８.２Ｈｚから２５.２Ｈｚまでで実施された（各キューブは４６×１４×１５ボクセルから４６×３２×２０ボクセルまでの範囲内であり、１ボクセルは１.５μｍ×３μｍ×４μｍ及び１.５μｍ×１.５μｍ×４μｍであった）。この空間的及び時間的分解能のために、細胞下レベルのＣａ^２＋ダイナミクスを解像することが可能となった。キューブを発生させるのに用いた３Ｄドリフトの数と逆比例して、走査速度又は記録細胞の数をさらに増大させることができる。例えば、５０×１０×５ボクセルからなるキューブを用いた場合には、５０Ｈｚで５０個の細胞体を記録することができる。多フレーム記録と同様に、ＲＯＩを可視化のために互いに隣り合わせで配列することができる（図６Ｆ）。図６Ｇでは、図６Ｆに示した１０個のキューブからＣａ^２＋過渡信号が誘導された。上と同様に、ここでも動きを消去するために、Ｃａ^２＋過渡信号の計算中の各時点で、正味変位ベクトルを算出して、体積下（サブボリューム）位置を補正した。本発明者らは、ボリュームスキャニングの使用によって、行動している動物の大振幅の動きの間のＣａ^２＋過渡信号における動きアーチファクトの振幅が１９.２８±４.１９倍も低減することを見出した。これらのデータは、マルチキューブ及びスネーク走査法を、全走査体積にわたって分布した多数のサブボリューム内で神経回路網及び棘状樹状突起セグメントの３Ｄ測定に効果的に使用できることを実証した。さらに、これらの方法は、大きな振幅の動きアーチファクトを完全に消去することができる。

マルチ３Ｄライン走査法
前章では、本発明者らは一次元の走査点を二次元又は三次元の物体に拡張した。本章では、走査点を一次元だけに拡張して、より高速での測定を実施する。多くの実験では、検体の動きが小さく、脳の動きは単一の３Ｄ軌道に沿った動きで近似できることを本発明者らは見出した（図７Ｂ）。図７Ａは、マルチ３Ｄライン走査法の概略透視図を示す。各走査線は、１つのスパインと関連する。この場合、３Ｄランダムアクセス有感点走査法の各点を、多数の面積及び体積エレメントの代わりに、多数の短い３Ｄラインだけに拡張することができる（図７Ａ）。第１工程では、ｚ－スタックからいくつかの点を選択した。第２工程では、脳の動きを記録して、動きの平均軌道を算出した。図７Ｂでは、脳の動きの振幅を、図２Ａと同様に３つの垂直イメージング面と明るい蛍光物体とを用いて３Ｄで記録した。平均動き方向を動き軌道のｚ投影画像で示す。第３工程では、予め選択した各点に対して、３ＤドリフトＡＯ走査で短い３Ｄラインを、それらのラインの中心が当該予め選択した点と一致するようにして発生させ、これらのラインを動きの平均軌道に平行に設定した（図７Ｂ及び７Ｃ）。図７Ｃは、ＧＣａＭＰ６ｆで標識した２／３層錐体細胞のｚ投影を示す。これら３Ｄラインに沿って１６９のスパインの活動を同時検出した（図７Ｃ及び７Ｅ）。白い線は、１６４の予め選択されたスパインを通過して通る走査線を示す。全ての走査線が図７Ｂに示した平均動きに平行に設定された。対応する３Ｄ－Ｃａ^２＋応答がこの１６４のスパインに沿って同時記録された。図７Ｄには、単一の生（未加工）のＣａ^２＋応答がマルチ３Ｄライン走査法を用いて１４のスパインに沿って記録されている。生の蛍光における動きアーチファクトに留意されたい。図７Ｅは、下部に表示された異なる４方向での移動グレーティング刺激により誘導された、例証のスパインＣａ^２＋過渡信号を示し、これらはポイントごと走査法（左）及びマルチ３Ｄライン走査法（右）を用いて記録された。

図７Ｆは、ポイント走査法（左）及びマルチ３Ｄライン走査法（右）を用いて測定された選択されたＣａ^２＋過渡信号を示す。マルチ３Ｄライン走査モードから古典的な３Ｄポイントごと走査モードに切り換えて戻すと、心臓の拍動、呼吸及び物理的な動きにより誘導された振動が過渡信号に直ちに現れた（図７Ｆ）。これらのデータは、マルチ３Ｄライン走査法を使用した場合の信号／雑音比の改善を示していた。動きの振幅が小さく、ほとんど或る１つの３Ｄ軌道に制限されている場合には、行動している動物において１６０以上の樹状突起スパインを迅速に記録するのにマルチ３Ｄライン走査法を効果的に使用することができる。

各種走査モードの利点
上で本発明者らは新規な二光子顕微鏡技法である３ＤドリフトＡＯ走査法を提示した。この技法を用いて、本発明者らは図８に示した次の６つの新規な走査方法を発生させた：３Ｄリボン走査法、チェス盤走査法、多層多フレームイメージング法、スネーク走査法、マルチキューブ走査法、及びマルチ３Ｄライン走査法。図中の点、線、面積及び体積エレメントは、測定に選択したＲＯＩを示している。

これらの走査方法はそれぞれ異なる神経生物学的目的に最適であり、大きな走査体積内の移動する検体の３Ｄイメージングに、単独で又は任意の組合わせで使用することができる。本発明の方法は、物理的動きにより大振幅の動きアーチファクトが発生する条件下にあっても、覚醒した行動している動物において棘状樹状突起セグメントのような微細な神経細胞プロセスのレベルで神経回路網を高分解能で３Ｄ測定することを初めて可能にするものである。

ドリフトＡＯ走査方法を用いた３Ｄイメージングのための上述した新規なレーザー走査法は、それらが異なる各種の脳構造物にいかに適しているか、及び測定速度に基づいて、適用分野はさまざまである。最も速い方法はマルチ３Ｄライン走査法であり、これはランダムアクセスポイントごと走査法と同様の高速であり（ＲＯＩ当たり５３ｋＨｚで１０００ＲＯＩまで）、スパイン又は細胞体の測定に使用することができる（図８）。第２の群では、多層多フレームイメージング、チェス盤走査法、及び３Ｄリボン走査法が、長い神経細胞プロセス及び細胞体に沿ってＲＯＩ当たり５.３ｋＨｚで５００ＲＯＩまでを測定することができる。最後に、２種類の体積走査方法であるマルチキューブ走査法及びスネーク走査法は、体積エレメント当たり約１.３ｋＨｚまでで５０～１００体積エレメントの測定が可能であり、それぞれ細胞体及び棘状樹状突起セグメントの測定に理想的である。この２種類の体積走査方法は、蛍光情報を最大限に保存することができるので、最良のノイズ消去能力を与える。最後に、これらの新たな走査技法の改善された信号／雑音比が、行動している動物の動いている脳内で多数のニューロンを同時記録した時の個々のＣａ^２＋過渡信号からの単独のＡＰ分解能をいかに改善するかについて定量化した。行動している動物において、チェス盤走査法、マルチキューブ走査法、又は多層多フレームイメージング法は、３Ｄランダムアクセス有感点走査法に比べて、Ｃａ^２＋応答の標準偏差をそれぞれ１４.８９±１.７３、１４.３８±１.６７及び５.５５±０.６５倍だけ改善した（ｎ＝２０）。従って、動きアーチファクト補正されたＣａ^２＋応答の標準偏差は単独のＡＰの平均振幅より小さくなった。これにより、単独の活動電位の検出が、行動している動物における神経回路網測定において利用可能となった。このことは、３ＤランダムアクセスＡＯ顕微鏡法では、動物が走っている時にはＣａ^２＋応答の標準偏差が単独ＡＰの振幅より４.８５±０.１１倍高くなっていたことから、可能ではなかった。

実験手順
外科的手順
上述した全ての方法についての実験プロトコルはマウスで実施した。外科的方法は、既述のもの（Katona et al.「大きな組織体積内の三次元ランダムアクセス走査による高速二光子in vivoイメージング」Nature methods 9:201-208, 2012）と同様であったが、いくつかの瑣末な変更を加えた。概略を述べると、マウスをミダゾラム、フェンタニル及びメデトミジンの混合物（それぞれ体重１ｋｇ当たり５ｍｇ、０.０５ｍｇ及び０.５ｍｇ）で麻酔し；視覚野のＶ１領域を固有イメージング（intrinsic imaging）により位置特定し（平均でラムダ構造物に対して、横方向に１.５ｍｍ、前方に０.５ｍｍ）；既述のように（Goldey GJ, Roumis DK, Glickfeld LL, Kerlin AM, Reid RC, Bonin V, Schafer DP, Andermann ML (2014); Removabl cranial windows for long-term imaging in awake mice (覚醒マウスにおける長期イメージング用の取り外し可能な頭蓋窓) Nature protocols 9:2515-2538参照）、歯科用ドリルを用いてＶ１周囲を円形に開頭して、ダブルカバーグラスで完全に覆った。二光子記録のために、ネキソダール（nexodal）、レベトール（revetol）及びフルマゼニルの混合物（それぞれ体重１ｋｇ当たり１.２ｍｇ、２.５ｍｇ及び２.５ｍｇ）でマウスをフェンタニル麻酔から覚醒させ、実験まで２～１２分間、温度制御された穏やかな条件下に保持した。イメージングのセッション前に、実験装置に適応させるためマウスを少なくとも１時間にわたり３Ｄ顕微鏡下で暗所にて頭部拘束状態に保持した。一部の動物においては、第２又は第３のイメージングのセッションをそれぞれ２４又は４８時間後に実施した。

ＡＡＶ標識
Ｖ１領域を固有イメージングにより位置特定した：概略を述べると、皮膚を切開し、皮質の右半球にわたる頭骨をきれいにした。後で二光子イメージングのセッション中に使用するのと同じ視覚刺激プロトコルを用いて固有信号を記録した。注入手順は既述（Chen TW, Wardill TJ, Sun Y, Pulver SR, Renninger SL, Baohan A, Schreiter ER, Kerr RA, Orger MB, Jayaraman V, Looger LL, Svoboda K, Kim DS (2013); Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neronal activity (ニューロン活動イメージング用超高感度蛍光タンパク質)、 Nature 499:295-300）のようにして若干の変更を加えて実施した。歯科用ドリルのチップを用いてＶ１皮質領域にわたり頭骨に０.５ｍｍの穴をあけた（ブレグマ（前頂）に対して１.５ｍｍ側方で１.５ｍｍ後方を中心にして）。注入に用いるガラスマイクロピペット（先端径≒１０μｍ）に０.５ｍｌのベクター溶液（≒６×１０^１３粒子／ｍｌ）を逆充填した後、軟膜下４００μｍの深さで、皮質にゆっくり（最初の５０ｎｌは２０ｎｌ／ｓ、残りの量については２ｎｌ／ｓ）注入した。集団イメージングのために、本発明者らは、ＡＡＶ９.Ｓｙｎ.ＧＣａＭＰ６ｓ.ＷＰＲＥ.ＳＶ４０又はＡＡＶ９.Ｓｙｎ.Ｆｌｅｘ.ＧＣａＭＰ６ｆ.ＷＰＲＥ.ＳＶ４０（Ｔｈｙ－１－Ｃｒｅ及びＶＩＰ－Ｃｒｅ動物の場合）を使用した。どちらもウイルスも米国ペンシルバニア州フィラデルフィアのPenn Vector Core社から入手した。まばら標識（sparse labeling）用には、１０,０００倍に希釈されたＡＡＶ９.Ｓｙｎ.Ｆｌｅｘ.ＧＣａＭＰ６ｆ.ＷＰＲＥ.ＳＶ４０とＡＡＶ１.Ｓｙｎ.Ｃｒｅ.ＷＰＲＥ.ｈＧＨとの１：１混合物を注入した。外科的手順の項目で述べた通りにして、注入から２週間後に頭蓋窓を注入部位を覆うように移植した。

考察
本発明の新規な３ＤドリフトＡＯ走査方法の神経科学における利点は数多くある。ｉ）空間的分解能を維持したまま、既存の実現可能なものより２桁以上も大きな、ＧＥＣＩによる走査体積を可能にする；ｉｉ）サンプリング・レートの制限なしに、任意の速度で任意方向の高速３Ｄ走査の方法を提供する；ｉｉｉ）高速の記録を保持しながら面積及び体積エレメントを追加することを可能にする；ｉｖ）行動している動物においても３Ｄ面走査及び体積走査中に二光子顕微鏡法に特有の高い空間分解能を維持するために３Ｄですばやい動きアーチファクトを補償する；そしてｖ）光毒性を低減させるため、高速３Ｄ ＡＯ測定において２Ｄラスター走査の低出力時間的オーバーサンプリング（ＬＯＴＯＳ）技法の普遍化を可能にする。

これらの技術的な達成により、行動し、動いている動物における下記の高速３Ｄ測定及び分析方法の実現が可能になった：ｉ）１５０以上のスパインの同時機能的記録；ｉｉ）１２以上の棘状樹状突起セグメントの活動の高速並列イメージング；ｉｉｉ）記録された体積からのそれぞれ個々のスパイン（及び樹状突起セグメント）由来の空間及び時間の高速信号の精確な分離（これらの信号は、現在利用可能な方法ではオーバーラップする）；ｉｖ）６５０μｍ以上のｚ走査範囲内での樹状突起アーバー及び神経回路網の大きな部分の同時イメージング；ｖ）３Ｄランダムアクセス有感点走査法より１桁以上大きな信号／雑音比で５００μｍ×５００μｍ×６５０μｍまでの走査体積内で細胞下レベルの分解能で１００以上のニューロンの大きな回路網をイメージングする；及びｖｉ）神経回路網の測定において１０倍以上良好な単独ＡＰ分解能でＡＰをデコーディングする。

神経細胞プロセスの理解の制限は、現在のところ、３Ｄで生きている組織内で起こる高速の樹状突起及びニューロン活動パターンとより大きな回路網体積にわたるそれらの統合に存する。これまで、神経回路機能のこれらの側面は、覚醒した行動している動物において測定されたことはなかった。高い空間的及び時間的分解能が維持される本発明の新規な３Ｄ走査方法は、これらの活動測定に対して、既存には欠けていたツールを提供する。別の利点として、本発明の方法は次のような研究に使用することができる：スパイクタイミングに依存性の神経可塑性及びその根元をなすメカニズム、樹状突起再生活動の起源、樹状突起スパイクの伝搬、受容野構造、多数の棘状及び無棘樹状突起セグメント間の樹状突起コンピューテーション、異なるインプットアセンブリの時空間クラスタリング、連合学習、多感覚統合、スパインの活動の空間的及び時間的構造、樹状突起と細胞体のアセンブリ、並びにパルブアルブミン、ソマトスタチン及び血管作動性腸管ポリペプチドを発現するニューロンのような、まばらに分布するニューロン集団の機能及び相互作用。本発明の３Ｄ走査方法はまた、局所的かつ大規模に神経回路により媒介される同期化プロセスを理解する手掛かりも提供しうる。これらのプロセスは、神経系の統合機能又は各種疾患において重要であると考えられている。重要なことは、これらの複雑な機能上の疑問が、細胞レベル及び細胞下レベルで、多数の棘状（又は無棘）樹状突起セグメントで同時に、かつ行動している動物中の神経回路網レベルで、本発明の方法により対処できることである。

動き中の脳活動のイメージング
スパインＣａ^２＋応答の二次元in vivo記録は、麻酔した動物や、さらには走っている動物においても既に実現されてきたが、これらの論文では、わずか数個のスパインだけを比較的低い信号／雑音比で記録したにすぎなかった。しかし、覚醒し、走り、そして行動している動物中の大きなスパインアセンブリや棘状樹状突起セグメントの高速２Ｄ及び３Ｄイメージングは挑戦すべき難題のままであった。それでも、その必要性は、ニューロン発火速度は運動中はほとんどのニューロンで２倍以上になることを示し、ニューロン機能は動いて行動している動物では完全に変化することを示唆している最近の研究によって、明らかにされている。さらに、ニューロンのコンピューテーションの大部分は、脳内で複雑な３Ｄアーバーを形成している、多数の離間した尖端及び基底樹状突起セグメント内で起こる。しかし、従来の２Ｄ及び３Ｄイメージング法はいずれも、複雑な行動実験が神経科学の分野で急速に広がっている事実にもかかわらず、走っている期間中又は異なる行動実験において、これらの複雑かつ細い（棘状）樹状突起セグメントに接近することが可能ではなかった。１つの理由は、典型的な行動実験では、動きで誘導された過渡信号が行動関連のＣａ^２＋過渡信号に類似する振幅及び速度変化を持っていることである。さらに、これらの過渡信号が、典型的にはタスク中に同時に現れるため、それらの分離が困難となる。従って、本書において実証した３Ｄ走査方法は、単独又は各種の組合わせで、行動している動物における樹状突起活動を記録するためのニューロフォトニクス（神経光通信学）のツールキットから長らく欠落していた新たなツールを加えるものとなろう。

脳の動きの補償
３自由度での閉ループ動きアーチファクト補償は低速（≒１０Ｈｚ）では既に開発されているが、その方法の有効性は、覚醒した動物においては、又は樹状突起スパイン測定においては、又は動きアーチファクトに特有のものより高速では、いずれも実証されていなかった。さらに、脳の複雑なクモ膜腔懸架（arachnoidal suspension）のために、また血管がそれらの局所的環境における空間的に不均質な拍動を発生させていることのために、脳もまた著しい変形（単なる移行性の動きではない）を示し、従って、変位の振幅はイメージングしたそれぞれの、そして全てのサブ領域（下位領域）において異なりうるものである。このことは、小振幅の細胞体応答（例えば、単一又は数個のＡＰ付随応答）を測定する場合、又は樹状突起スパインのような小さな構造物を測定したい場合には、非常に重要である。幸いにも、本発明の３Ｄイメージング及び対応する解析方法は、イメージングした各サブ領域において可変の振幅及び方向での補償も可能にする。このことは、不均質な変位分布を３Ｄで測定して効果的に補償できることを意味する。

本発明の３Ｄ走査及び動きアーチファクト補償方法の有効性はまた、特にマルチキューブ又はチェス盤走査法を使用した場合、個々の細胞体Ｃａ^２＋過渡信号の標準偏差が大きく低減し（１４倍まで）、単一ＡＰの振幅よりも小さくなったことによっても証明される。これにより、現在好まれているＧＥＣＩであるＧＣａＭＰ６ｆを用いて、行動している動物の動いている脳における単一ＡＰの解像が可能になる。神経回路網イメージングに対して単一ＡＰ解像を提供することの重要性は、多くの系でニューロン集団はバースト（群発）ではなく単独のＡＰで情報をコーディングしていることを実証している最近の研究によっても証明された。

尖端及び基底樹状突起アーバーの同時３Ｄイメージング
最近のデータは、皮質錐体ニューロンの尖端樹状突起房状分枝（tuft）がフィードバック入力の主要なターゲットであり、そこではそれらが局所ＮＭＤＡスパイクにより増幅されて、遠位樹状突起Ｃａ^２＋に、そして最終的には細胞体ナトリウム統合点に到達し、そこでそれらは、やはり局所ＮＭＤＡスパイクにより増幅された基底入力と出会う。そのため、トップダウンとボトムアップの入力統合が、数百μｍの距離で離間している局所統合計算サブユニット（local integrative computational subunits）で同時に起こり、このことは数百μｍのｚ－範囲での神経細胞プロセスの同時３Ｄイメージングを必要とする。ＡＯ顕微鏡法の最大１０００μｍ以上のｚ－走査範囲（これは、現在利用可能なレーザーの最大有効電流によってＧＥＣＩによるin vivo測定時には約６５０μｍに制限されている）により、５００μｍ以上の範囲内で第ＩＩ／ＩＩＩ層ニューロンの尖端及び基底樹状突起セグメント並びに第Ｖ層ニューロンの樹状突起セグメントの同時測定が既に可能となっている。

麻酔下の動物における２Ｄイメージングは長い神経細胞プロセスを捕捉することができるが、水平方向に向かう長いセグメントの位置は数層（例えば、第Ｉ層）だけにほぼ制限されてしまい、他の全ての領域は、典型的には断面又は斜め若しくは直交方向を向いた樹状突起の短いセグメントのみを見るだけである。さらに幸運にも単一の焦点面で複数の短いセグメントを捕捉した場合であっても、空間時間統合の複雑さを理解するためにイメージングされた領域を樹状突起や分岐点に沿って移動させることは不可能である。マルチ３Ｄリボン及びスネーク走査方法の主な利点は、任意のＲＯＩを全く制約なしに柔軟に選択し、シフトさせ、傾斜させ、そしてＲＯＩに整列させることができることである。従って、複雑な樹状突起統合プロセスを空間的にも時間的にも精確なやり方で記録することが可能となる。

深い走査（ディープスキャニング）
高速３Ｄ記録に対していくつかの優れたテクノロジーが開発されているが、深層のニューロンのイメージングは、機械的な創傷を生じさせるか、又は収集すべき深さから蛍光光子を散乱させてしまう単独点二光子又は三光子励起を用いるか、のいずれでしか可能ではない。補償光学系及び再生増幅器を用いると、深部での分解能及び信号／雑音比を改善することができる。さらに、対物レンズアームに直接設置されたＧａＡｓＰ光電子増倍管を使用すると、in vivo走査範囲を８００μｍ以上に広げることができる。本書で実証した各種３Ｄ走査方法の主な展望の１つは、１.６ｍｍ以上の最大走査範囲に到達するための主な制限が、４つのＡＯ偏向器の固有損失を補償することができない現在利用可能なレーザーの相対的に低いレーザー強度であることである。３ｍｍのｚ走査範囲にわたってこれを裏付けることが、強度と組織散乱が制限的ではない透明検体における３Ｄ ＡＯイメージングでは既に実証されてきた。従って、将来的には、新たな高出力レーザーを高速の補償光学系及び新たな赤方偏移センサーと組合わせることによって、ずっと大きな３Ｄ走査範囲が利用可能となり、皮質からどんな部分も除去せずに、例えば、深層ニューロンのアーバー全体の測定や３Ｄ海馬イメージングが可能となるかもしれない。

高速３Ｄ走査用の顕微鏡を実現することができる受動光学素子と４つのＡＯ偏向器の配置にはいくつか異なる種類があるが、これらの顕微鏡はどれも第２群の偏向器で反対方向に伝播するＡＯ波によるドリフト補償を採用しており、従って、本書で実証した走査方法は全ての３Ｄ ＡＯ顕微鏡で容易に実施することができる。さらに、走査体積の減少を犠牲にすれば、３Ｄ ＡＯ顕微鏡を単純化して、任意の二光子システムでアップグレードとして使用することができよう。そのため、本発明者らは、我々の新たな方法が、行動している動物における高分解能in vivoイメージングに新たな地平を開くものであると予想する。

３ＤドリフトＡＯ走査
以下に、走査体積内の任意の地点から出発して、焦点を任意の３Ｄラインに沿って移動させるための４つのＡＯ偏向器のチャープ・パラメータと焦点座標及び速度との間の１：１関係の操縦のやり方について簡単に説明する。

４つのＡＯ偏向器の駆動周波数と焦点のｘ、ｙ及びｚ座標との間の関係を決定するために、３Ｄ顕微鏡の単純化された伝達行列（transfer matrix）モデルが必要となる。本発明で用いた３Ｄ ＡＯシステムは、ｘ－ｚ面及びｙ－ｚ面に対称的に配置されている２つのｘ筒形レンズと２つのｙ円筒形レンズに基づいているため、ｘ座標及びｙ座標に沿って対称である。そのため、１つの面、例えばｘ－ｚ面についての伝達行列を計算することが必要となる。本発明で用いた３Ｄスキャナーの第１及び第２のｘ偏向器は、これらが２つのアクロマティック（色消し）レンズからなる無限焦点投影レンズに連結されていることから、共役焦点面内にある。従って、単純化のために、それらを光学計算中は並列で使用することができる。

図９に示すように、ここで使用した近軸モデルでは、焦点距離がそれぞれＦ_１とＦ_２の２つのレンズをＦ_１＋Ｆ_２の距離で用いて（無限焦点投影）、対物レンズに２つのＡＯ偏向器（ＡＯＤｘ_１及びＡＯＤｘ_２）をイメージングする。Ｆ_objectiveは対物レンズの焦点距離であり、ｚ_ｘはｚ軸に沿った対物レンズからの焦点の距離を規定し、そしてｔ_１及びｔ_２は、それぞれＡＯ偏向器と無限焦点投影の第１のレンズとの間の距離、及び第２のレンズと対物レンズとの間の距離である。

本光学系の幾何学的光学記述はＡＢＣＤ行列法により行うことができる。任意の光学系の出射（出力）レーザービームの角度（α_０）及び位置（ｘ_０）は、該系のＡＢＣＤ行列（式１）を用いて、入射レーザービームの角度（α）及び位置（ｘ）から計算することができる。

ｘ方向及びｙ方向に沿って偏向させる偏向器も、やはりこのＡＢＣＤ行列系を用いて近軸的にモデル化することができる光学系によりリンクされている。スキャナーと検体（サンプル）との間の光学系から区別するため、それを小文字（ａｂｃｄ）で表示することができる。こうして、第１の結晶（ｘ軸に沿って偏向させる）内の座標ｘ_１で通過する各光線について、第２の結晶内で取られる座標ｘ_２及び角度α_２を決定することができる。

第２の偏向器と検体面との間のリンクは次式により与えられる。

ここで、α_２’は偏向後に結晶を出る光線の角度である。α_２とα_２’との関係は、第２の偏向器の偏向規則により決まる。最も単純な近似は単に次式を与える。

従って、第２の行列変換形式を当てはめると、次式が得られる。

第１の行列伝達を当てはめると、２つの偏向器の間で次式が成立する。

偏向器１の偏向規則を当てはめると、次式が与えられる。

標的とする検体座標について次式を得る。

最後のステップで式からｘ_２を消去する。

２つの偏向器の周波数のｘ及びｔ依存性は次の２式により記述することができる。

これらにより、ｘ_０座標は次式となる。

周波数を代入すると次のようになる。

こうしてｘ_１及びｔのみに依存する式の形態を得る。
次にｘ_１を含んでいる項の係数の式を次のように収集することができる。

これは、係数ａ_ｘ１及びａ_ｘ２がｔに依存していないなら全く単純にゼロとなしうる。この場合、パラメータａ_ｘ１及びａ_ｘ２が次式で規定される条件を満たす時には、両方の偏向器における単純な線形周波数掃引と一定速度でのドリフトする焦点とを持つことになる。

ｘ_０座標は次式の時間変化を有するであろう。

ここで

及び

上の式を逆転させて、所望のｖ_ｘ及びｘ_０(０）値から始めることによりパラメータを決定することもできる。しかし、一定の線形速度だけではなく、加速も含んでいる曲線に沿ってスポット（焦点）を移動させたい場合には、それはより複雑になる。これを達成するには、この場合ａ_ｘ１及びａ_ｘ２パラメータはｔに依存している筈である。最も単純な依存性は、次式のように線形である。

第２の偏向器については次式。

この場合もｘ_２とｘ_１との関係を使用すると、次式になる。

これをｘ_０の式に代入すると、次式を得る。

ここで、ｘ_０はｘ_１及びｔだけに依存する。コンパクトな焦点を得るには、全てのｘ_１依存項をゼロにしなければならない。一次、二次、三次及び四次の依存性を持つ４項があり、全てが一般事例ではｔに依存している。この一般事例はあまりに複雑であるので、解析的に記述することができる解決策を見出すために特殊な場合を選択する必要がある。

上の一般式２２を、行列要素に対して特定の適用可能な変数を用いて異なる各種の光学的構成（セットアップ）に当てはめることができる。
例証となる具体例において、全ての偏向器は異なる焦点距離のレンズにより構成されるテレスコープにより光学的に連結されている。

それぞれ焦点距離がｆ_１及びｆ_２を持ち、互いに距離ｔだけ離間して配置された２枚のレンズ（レンズ１及びレンズ２）から構成される２つの偏向器１及び２（レンズ１は偏向器１から距離ｄ_１の位置に、レンズ２は偏向器２から距離ｄ_２の位置に配置）を連結するテレスコープに対する一般行列は次式になる。

テレスコープの理想的な場合に、２枚のレンズが、光学イメージングのために互いからｆ_１＋ｆ_２の距離で配置されているなら、行列は次のように縮小する。

言及した参照の系では、偏向器は全て中間テレスコープの共役イメージ面に置かれている。テレスコープでの最も効率的なイメージングは第１レンズの第１焦点面（ｆ_１＝ｄ_１を意味する）と第２レンズの第２焦点面（ｆ_２＝ｄ_２）との間で行われる。

この場合、行列は次式のように縮小する。

２つの焦点距離が等しい場合、下記の最も単純な関係が得られる。

解析されている系の各偏向器の間で、式２３～２６からの行列のいずれかを当てはめて、式２２を記述する適当な行列要素を得ることができる。ｘ軸及びｙ軸に沿って偏向させる偏向器が交互に配置されている（例、１つのｘの後に１つのｙを配置）なら、２つのｘ方向（ｘ_１及びｘ_２）とｙ方向（ｙ_１及びｙ_２）の偏向器を連結する複数のテレスコープは、それぞれｘ_１及びｘ_２偏向器並びにｙ_１及びｙ_２偏向器を記述する行列の乗算によって記述される。ここで、偏向器（ｄ_１、ｆ_１などの距離に比べて無視できる長さ）を通る伝播は無視した。また、ｙ方向の偏向器はｘ－ｚ面における伝播角度を変化させず、逆もまた同じで、ｘ方向の偏向器はｙ－ｚ面に影響しないと考える。その結果、例えば、式２４を用いて、ｘ_１偏向器とｙ_１偏向器とを連結する焦点距離ｆ_１及びｆ_２のレンズにより形成されるテレスコープと、ｙ_１偏向器とｘ_２偏向器とを連結する焦点距離ｆ_３及びｆ_４のレンズにより形成されるテレスコープについて次式を得る。

焦点距離ｆ_１＝ｆ_２かつｆ_３＝ｆ_４であるなら、下記の最も単純な行列を得る。

最後の偏向器と標的の検体面との間の光学伝達は、ｘ及びｙに沿って偏向させる偏向器について異なるであろう。最後のｘ偏向器を検体面に連結する光学系は、焦点距離ｆ_３’及びｆ_４’を持つレンズから作られたｘ_２及びｙ_２偏向器間のテレスコープをも含んでいる。偏向器ｘ_２とレンズｆ_３’との間の距離はｄ_３’であり、レンズｆ_３’とｆ_４’との間の距離はｆ_３’＋ｆ_４’であり、レンズｆ_４’と偏向器ｙ_２との間の距離はｄ_４’である。偏向器ｙ_２と標的検体面との間の光学系は焦点距離Ｆ_１、Ｆ_２及びＦ_ｏｂｊの３枚のレンズからなり、これらの要素間の距離は、偏向器ｙ_２から出発して、それぞれｔ_１、Ｆ_１＋Ｆ_２、ｔ_２、ｚ_ｘ＝ｚ_ｙである。その結果、ｘ_２と検体面との間の完全な伝達は次式により記述される。

また、ｙ_２と検体面とのそれは次式により記述される。

後者は閉形式では次のように記述することができる。

上の行列のａ、ｂ、ｃ、ｄ及びＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの値を式２２と似た方程式に用いて、焦点のｘ_０及びｙ_０座標の時間変動を求めることができる。
別の態様では、偏向器は中間のテレスコープ又はレンズを介在させずにｘ_１－ｘ_２－ｙ_１－ｙ_２の順に配置する。偏向器間の距離は、偏向器ｘ_１から出発して、それぞれｄ_１、ｄ_２及びｄ_３である。ここで、各偏向器の厚みはそれらの間の距離に対して無視することができないので、それらの光学的厚み（屈折率×物理的厚み）を、それぞれｔｘ_１、ｔｘ_２、ｔｙ_１、ｔｙ_２と表示する。偏向器ｘ_１とｘ_２とを連結する光学的伝達行列は次式である。

そして、偏向器ｙ_１とｙ_２とを連結する光学的伝達行列は次式である。

偏向器ｙ_２と検体面との間の光学系は前に解析した顕微鏡と同じで、前記と同じ間隔で配置された焦点距離Ｆ_１、Ｆ_２及びＦ_ｏｂｊの３枚のレンズにより形成されている。
従って、ｙ－ｚ面におけるＡＢＣＤ行列は式３１に示したものの乗算であって、そして偏向器ｙ_２の半分を通る伝播である。

しかし、通常はｔｙ_２がＦ_１、Ｆ_２等よりずっと小さいため、上の乗算される行列は通常は無視することができる。
ｘ－ｚ面のＡＢＣＤ行列は偏向器ｙ_１及びｙ_２を通る伝播及びそれらの間の距離を考慮に入れる必要がある。

これらの行列要素はｘ－ｚ面とｙ－ｚ面とにおいて非対称であり、従って焦点のｘ_０及びｙ_０座標を決定するパラメータは別々に計算する必要があろう。
本発明者らは、Reddy et alの顕微鏡より少ない要素を含んでいるシステム (Katona et al) を実現したが、式３４及び３５で表されたTomas et alの系に現れる非対称性を避けるために、偏向器ｘ_１、ｙ_１とｘ_２、ｙ_２との間にテレスコープを使用する。２つの偏向器対の間のテレスコープは、焦点距離の等しい２枚のレンズを互いから焦点距離の２倍で離間させて配置することにより形成される。このテレスコープはそれぞれ偏向器ｘ_１とｘ_２及び偏向器ｙ_１とｙ_２の間で完全なイメージングを行う。

各偏向器の厚みは、中間テレスコープのレンズの焦点距離に比べて、また焦点距離Ｆ_１、Ｆ_２及び距離ｔ_１、ｔ_２に比べて無視することができる。
これらの近似により、理想的なイメージングを仮定して、両方の偏向器対について下記の（ａｂｃｄ）行列を得る。

第２の偏向器の出力面から対物レンズの焦点面に光線を伝達する図９に示したシステム部分のＡＢＣＤ伝達行列は、光学系が同じであることから、式３１に従って計算することができる。

これらの行列の積はその一般形態では極めて複雑であって、式３１におけるのと同じであるが、ｚ_ｘ＝ｚ_ｙではｘ及びｙ座標について同じである。

しかし、理想的テレスコープイメージングでは、無限焦点（アフォーカル）光学系は対物レンズの開口上で偏向器出力面のイメージを生ずることを考慮すると、下記の単純化を使用することができる。この場合、ｔ_１＝Ｆ_１及びｔ_２＝Ｆ_２である。この単純化により次式を得る。

この式３６及び３９の行列を用いて、最後のＡＯ偏向器の面内でとった角度（α）及び位置（ｘ）から対物レンズからの或るｚ距離（ｚ_ｘ）でｘ－ｚ面内における任意の出力光線の角度（α_０）及び座標（ｘ_０）を計算することができる。同じ計算をｙ－ｚ面に対しても使用できる。ｘ_０座標は式２２により一般形式で与えられ、ここで、今度は式３６からの（ａｂｃｄ）行列要素を挿入し、ｘ_１を、第１偏向器のｘ座標を表すｘで置換する。

式３９から行列要素Ａ及びＢも置換する。

同じ変換及び単純化の後で次式を得る。

カッコ内の項を拡張して、別個のｘ依存性部分とｔ依存性部分とを得る。

理想的集束を得るために、第１の仮定において、ｘ_０座標のｘ依存性部分における時間依存性の項と非依存性の項は全てのｔ値に対して別々にゼロになるべきである。ビームを集束させるため、任意のｘ値についてｘ^２及びｘを含んだ項はゼロにならなければならない。これは、１つだけではなく下記の２つの式を含意する。

第２の仮定はｂ_ｘ１＝ｂ_ｘ２＝ｂ_ｘを含意する。これはまた、式４３の右側の第１項、ｔ^２に依存する項を含んでいるシングル項がゼロになることも含意する。そのため、一定速度で動いているｘ_０座標を持つことになる。これが時間依存性ではない一定のｚで起こり、そしてｂ_ｘ１＝ｂ_ｘ２＝０であれば、音響周波数の単純な線形時間スロープに戻る。

式４４からｚ座標の時間依存性を次のように表すことができる。

本発明者らは、ｚ_ｘ座標が一定であって、従って焦点が水平ｘ－ｙ面内でドリフトする場合（下記実施例Ｉを参照）と、焦点が、任意の３Ｄラインに沿って、恐らくは測定される構造物（例、軸索、樹状突起等）の軸を追って移動する場合（実施例ＩＩ）とを別々に取り扱う。

実施例Ｉ：ｚ_ｘ座標が時間に依存しない
この場合、式４及び４６（上記）から見られるようにｂ_ｘ１＝ｂ_ｘ２＝０である。
式４６から、焦点面が一定であることもわかる。

所望のｚ_ｘ面を設定すれば、必要となるｃ_ｘ１及びｃ_ｘ２パラメータ間の下記の関係について次式を得る。

この場合のｘ_０座標の時間変動は次式により与えられる。

ｚ_ｘを式４７からのその表式で置換すると、ｘ_０座標について次式が得られる。

単純化後に次式になる。

ｘ_０座標に沿った焦点の初期速度及び加速は次のように表される。

さらに単純化する。

そして

最後の式は、ｘ－ｚ面内では焦点は加速され得ず、一定速度ｖ_ｘ０でドリフトし、この速度は周波数チャープの持続中は同じであることを示している。下記パラメータ：開始時のｘ座標ｘ_０、対物レンズからの距離ｚ_ｘ、ｘ軸に沿った速度ｖ_ｘ０、により特徴づけられる移動する焦点を得るために必要な周波数傾斜の値を算出したい場合、ｃ_ｘ１＋ｃ_ｘ２（式４８）及びｃ_ｘ１－ｃ_ｘ２（式５３）についての表式を使用する必要がある。

ｃ_ｘ１及びｃ_ｘ２については次式を得る。

上記２つの式の加算及び減算により、下記の結果が得られる。

要約すると、焦点を水平面（対物レンズ軸に対して垂直）内に位置する線に沿って一定速度でドリフトさせることは可能であり、焦点距離ｚ_ｘはＡＯ偏向器内で音響周波数チャープにより設定することができると言うことができる。利用可能なｚ_ｘ及びｖ_ｘ０の範囲はこの解析からは導き出すことはできない。それらは、所定傾斜のチャープシーケンスの時間長さを制限するＡＯ偏向器の周波数バンド幅により制限される。

実施例ＩＩ：ｚ_ｘ座標が時間に依存する
１つのＡＯ切替時間の期間内にｚ軸に沿って検体空間内で焦点をドリフトさせたい場合、ｚ_ｘ座標の時間変化を可能にしなければならない。次の式が、ＡＯセルから発する全ての光線を対物レンズ後の単一焦点上に集束させるための制約から生ずる（時間非依存性のｚ_ｘについては式４７を参照）。

式５９からは次式が得られる。

その結果、次式になる。

しかし、この式は時間依存性が非線形である。従って、その後の計算を単純化するためにそのテイラー級数が必要となる。

速度をほぼ一定とするために、上記テイラー級数における二次及びより高次の項を小さくするか、又はほぼゼロにすべきである。これは、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１及びｃ_ｘ２の値に制約を課す。最も単純な推定は、一次形式（線形）部分が二次形式部分を凌いで時間依存性を支配しているとすることであり、これはそれらの係数の比が小さくなるべきであることを意味する。

しかし、上記総和式の第２の構成要素では、ｚ－ｘ面のｚ軸に沿った速度（ｖ_ｚｘ）も同様に表される。

式３５から、ｂ_ｘ１＝ｂ_ｘ２＝ｂ_ｘとなり、この値はこの場合はゼロではない。ｂ_ｘを表すための他の制約と、さらなる定数が必要となる。
ｘ_０座標に対する式（式４３から）は次の通りとなる。

ｘ軸に沿ったドリフト速度を見出すため、上記関数をｔに対して微分すべきである。

ｔ＝０にとると、ｘ軸に沿ったドリフト速度成分の初期値ｖ_ｘ０を求めることができる。

ｖ_ｚｘの表式（式６４）からｂ_ｘをとり、それを式６７に導入すると、ｃ_ｘ１及びｃ_ｘ２の選択に対する制約を与える式（式６８）が得られよう。この制約はｃ_ｘ１及びｃ_ｘ２をｖ_ｘ０及びｖ_ｚｘに関連づける。

ここで、下記の記号法を導入した。

式６８からｐを表すことができ、その結果、ｐとｑとの関係が得られる。

ここで、下記の記号法を導入した。

これらは全ての可能な軌道にあてはまる一般方程式である。実際的には、異なる軌道に沿った（焦点）スポットの動きは別々に解析することができる。
３Ｄラインに沿った空間内の動き
実用的に重要な可能性は、例えば測定された樹状突起の軸又は軸索に追随して、ドリフトするスポットに対して線形軌道を設定することであろう。これは軸に対して任意角度を持った一般３Ｄラインである。この３Ｄラインのｘ－ｚ面及びｙ－ｚ面への投影図も、別々に処理することができるラインである。ここではｘ－ｚ面上の投影図を取り扱うこととする。ｙ－ｚ面上の投影図も同様に取り扱うことができる。しかし、後で示されるように、それらは完全に独立してはいない。スポットが軌道上で加速される場合、加速及び初期速度もｘ－ｚ面及びｙ－ｚ面上に投影される。ｘ－ｚ面内における初期速度の２つの直交する成分をｖ_ｘ０及びｖ_ｚｘ０と名付ける。これらは、それぞれｘ軸及びｚ軸に対して平行である。従って、ｘ－ｚ面内ではライン軌道の投影に対して次式を持つ。

チャープパラメータを計算するため、それぞれ式６２及び式６５で表されるｚ(ｔ)及びｘ_０(ｔ)関数の時間依存性を挿入しなければならない。
下記の記号法を導入する。

これらの記号法及び式６２及び６５からの時間依存性を式７５に導入すると、次のように３Ｄラインの投影が得られる。

いくらかの単純化後に、次式が得られる。

この式は各時間ポイントｔ’について満たされなければならない。各ｔ’に対して有効であるために、次式を課さなければならない。

第１の式（式８２）は、次式を与える。

式７６から▲ｕ▼（ｕの上に波線）を導入すると次式が得られる。

この式から、ｐ（式７２により規定）を次のように表すことができる。

ｂ_ｘ１＝ｂ_ｘ２＝ｂ及びｑ＝ｃ_ｘ１－ｃ_ｘ２を表すために、初期速度ｖ_ｚｘ０の所望値から設定することができる別の制約を必要とする。
式７６及び７７の記号法を用いて、初期速度値を見出すためにｔ＝０でのｚ(ｔ)の導関数（式６２）をとる。

式Ｓ５８からＢを表す。

式７７からこのＢの表式を導入すると、パラメータｂを生ずることができる。

ｑ（式７１により規定）を表すために、式８３及び８８を使用する。

最後に、ｑ及びｐ（式８６及び９０）の加算及び減算によりｃ_ｘ１及びｃ_ｘ２を表すことができる。

ｔ’＝０での最初に設定したｘ_０(０)から、極めて重要なパラメータΔｆ_０ｘを算出することができる。その後、次式を得る。

１好適態様において、ＡＯデバイスの固有パラメータは次の通りである：Ｋ＝０.００２ｒａｄ／ＭＨｚ、ｖ＝６５０×１０^６μｍ／ｓ、倍率Ｍ＝１、初期周波数差Δｆ＝１０ＭＨｚ、並びに動きパラメータ：ｍ＝２、ｖ_ｚ０＝１μｍ／μｓ、ｎ＝ｆ_objective－４μｍ。これらの値に対して、ｃ_ｘ１値は３ｋＨｚ／μｓとなるのに対して、ｃｘ２＝１７ＫＨｚ／ｓである。

ｚ方向における加速ａ_ｚｘはこれらのパラメータでは約０.１ｍ／ｓ^２である。
最後に、本発明者らは我々の結果をまとめる。本書において本発明者らは、ｘ－ｚ面においてあるラインパスに沿って所定の初期速度で所定地点から焦点を動かすために、非線形チャープされたドライバー関数についてのパラメータをどのように計算することができるかを実証している。このラインパスのパラメータは３Ｄで下記一般式に従って選択される。

偏向器はｘ－ｚ面及びｙ－ｚ面内で偏向させているので、式Ｓ６５をこれらの面上でのライン投影を記述する式に変換する。

これらでは、ｖ_ｚｘ０＝ｖ_ｚｙ０＝ｖ_ｚ０、かつ下記を含意する。

偏向器を操縦するため、ｘ－ｚ面内でのΔｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１及びｃ_ｘ２パラメータを、軌道及びドリフトの選択されたｘ_０(０)、ｚ_０(０)、ｖ_ｘ０及びｖ_ｚｘ０パラメータの関数として求める必要がある。同じことがｙ－ｚ面についても当てはまる。この場合は、軌道の所望のｙ_０(０)、ｚ_０(０)、ｖ_ｙ０及びｖ_ｚｙ０パラメータに対して、Δｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１、及びｃ_ｙ２を求める。

スポット（焦点）はその後もドリフト中はその形状を保持しよう。なぜなら、対応する制約が両方の面内で満たされるからである。ｘ及びｙ座標に沿った初期速度ｖ_ｘ０及びｖ_ｙ０は、ｚに対して設定された初期側樋ｖ_ｚｘ＝ｖ_ｚｙと一緒に、ｍ及びｋパラメータを決定し（式９６及び９７）、加速値もこれらのパラメータにより求められる。得られた加速値は通常は実際のパラメータセットの範囲内で低く、従って、スポットの速度はあまり長くない軌道については急激には変化しないであろう。

光学計算のために、その向き（方位）がＡＯ偏向器の偏向方向によって設定される２つの垂直面内で適用されたＡＯ顕微鏡全体の近軸近似を使用する（図９）。必要となるのは下記の３群の式である：ｉ）ｘ－ｚ面（及びｙ－ｚ面）内のＡＯ顕微鏡の単純化された行列式（式２～３）；ｉｉ）ＡＯ偏向器の基本的方程式（式７）；並びにｉｉｉ）ｘ－ｚ面（及びｙ－ｚ面）内で偏向させる偏向器内の音響周波数についての時間的に非線形の（temporally non-linear）チャープ（ｆ）。

上の式において、ｉ＝１又はｉ＝２とは第１及び第２のｘ軸偏向器を表示し、Ｄは該ＡＯ偏向器の直径であり、そしてｖ_ａは該偏向器内部の音波の伝播速度である。
この式は式１０、１１、１９及び２０から導出された。本節においては全てをｘ－ｚ面内で計算する。ｘ軸は一方の偏向器対の偏向方向であり（ｙはもう一方のそれである）、ｚは円筒形対物レンズの対称軸と一致する光学軸である。同じ計算がｙ－ｚ面内でも適用されるべきである（上の詳細な計算を参照）。これら３群の式（ｉ～ｉｉｉ）から、焦点のｘ_０座標を計算することができる（式２２、６５）。すべての光線を対物レンズの焦点内で集束させるために、ｘ_０座標のｘ及びｘ^２依存性の部分はゼロにしなければならない（偏向器開口内の任意のｘ材料から出発する全ての光線が焦点面内で同じｘ_０座標を通過しなければならない）。このことは、それからｚ座標のｔ依存性を表すことができる（式６１）、２つの方程式（式４４、４５）を含意する。

しかし、式６１は非線形の時間依存性を持つ。従って、その後の計算を単純化するためにそのテイラー級数が必要となる。本発明者らの最も単純な推定は、一次（線形）部分について時間依存性が二次部分を越えて支配的であることであり、従ってｚ－ｘ面におけるｚ軸に沿った速度はほぼ一定（ｖ_ｚｘ）であり、そして式６４を用いて、ｘ軸に沿った速度（ｖ_ｘ）を求めることができる（式６６を参照）。

最終段階において、異なる３Ｄ軌道に沿った焦点の動きを解析したい。単純化のために、軸に対して任意の角度及び任意の速度での一般３Ｄラインに沿ったドリフトを計算する。上と同様にｘ－ｚ面とｙ－ｚ面とを別々に取り扱うことができる。ｘ－ｚ面では３Ｄラインの投影を下記のように表すことができる。

ｚ_ｘ(ｔ)の表式をｘ_０(ｔ)と組合わせ、同様に計算されたｚ_ｙ(ｔ)とｙ_０(ｔ)とを用い、必要な焦点の初期位置（ｘ_０、ｙ_０、ｚ_０）及び速度パラメータ値（ｖ_ｘ０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚｘ０＝ｖ_ｚｙ０）を加入すると、４つのＡＯ偏向器における式１００に従った非線形チャープを計算するのに必要な全てのパラメータ（Δｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１、ｃ_ｘ２並びにΔｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１、ｃ_ｙ２）を明示することができる。

Δｆ_０ｘとΔｆ_０ｙは完全には決定されないことに留意されたい。ここでは、ＡＯ偏向器の第１群（ｆ_１）と第２群（ｆ_２）の周波数範囲から選択して、それらを３Ｄ走査中にバンド幅の中位に保持するするのに余分な自由度がある。要約すれば、本発明者らは、ＡＯ偏向器の焦点座標及び速度とチャープパラメータとの間に１：１関係を引き出すことができた。それにより、走査体積内の任意の地点で出発して任意の３Ｄラインに沿った速い動きを発生させることができる。

３Ｄ二光子顕微鏡
下記の例証的な具体例において、より以前に用いたエレクトロニクスシステムで実施された新規ＡＯ信号合成カードを用いることにより３Ｄ ＡＯイメージング法を改良した。この新規なカードは、ＦＰＧＡ（Xilinx Spartan-6）で供給された高速ＤＡチップ（ＡＤ９７３９Ａ）を使用する。このカードはその通電状態で一次及び二次時間依存性を付与する周波数チャープを持つ変動振幅の１０～１４０ＭＨｚ信号の発生を可能にする。このカードの同期及び命令により、焦点を任意の位置に位置させ、それを全（１０～３０μｓ）ＡＯサイクルについて任意の３Ｄラインに沿ってドリフトさせることが可能であった。ＡＯ偏向器のそれぞれで無線周波数（ＲＦ）ドライバー信号の後方反射を直接測定し、ＲＦエネルギーを偏向器間でより均質に分布させるために、このＲＦ反射及び損失を補償した。これにより、結晶上でより高い絶対音響エネルギーが可能となって、より高いＡＯ効率を与え、従って、対物レンズ下でのより高いレーザー出力と走査体積のより均質な照度を付与した。

また、空間分解能を向上させ、視野を広げ、全透過光強度を増大させるために、本発明者らは下記の光学機械的な変更を加えた。Mai Tai eHPフェムト秒レーザー（８７５～８８０ｎｍ、SpectraPhysics）のＤｅｅｐＳｅｅユニットを取り外し、光路の二次及び三次の物質分散（７２,０００ｆｓ^２及び４０,０００ｆｓ^３）の大部分を補償するために電動の外部４プリズムコンプレッサだけを使用した。コヒーレント後方反射をファラデイアイソレータ（Electro-Optics Technology）を用いて排除した。熱ドリフトにより誘起される光学誤差を排除するために、電動４プリズムシーケンスの前方及び後方の閉ループ回路内に電動ミラー（AG-M100N, Newport）及び象限検出器（PDQ80A, Thorlabs）を配置した。Ｚフォーカシング及び横方向走査を２つの別個のＡＯ偏向器対により達成した。これらの偏向器対は２つのアクロマティック（色消し）レンズ（NT32-886, Edmund Optics）に結合されていた。最後に、Edmund Optics（47319、ｆ＝２００ｍｍ）及び Linos （QIOPTIQ, G32 2246 525, ｆ＝１８０ｍｍ）レンズからなるテレセントリックリレーを用いて、正立型二光子顕微鏡（Femto2D, Femtonics Ltd.）に光を結合した。励起レーザー光を検体に投じ、蛍光信号を収集した。これには、集団イメージング用には２０×オリンパス製対物レンズ（XLUMPlanFI20×/1.0レンズ、２０×、ＮＡ１.０）、又はスパインイメージング用には２５×ニコン製対物レンズ（CFI75アクロマート25×W MP、ＮＡ１.１）のいずれかを用いた。蛍光は、フィルターとダイクロイックミラーにより２つのスペクトルバンドにスペクトルにより分離された後、対物レンズアームに直接固定されたＧａＡｓＰ光電子増倍管（Hamamatsu） に送りこまれた。これは２Ｄガルバノスキャニングで８００μｍ以上のの範囲の深いイメージングを可能にする。ＡＯ偏向器の無線周波数ドライブの効率の向上と光学的改善のために、空間分解能及び走査体積はそれぞれ約１５％及び３６倍だけ増大した。新たなソフトウェアモジュールが高速３Ｄ樹状突起測定と検体ドリフトの補償のために開発された。

３Ｄにおける動き補正
３Ｄリボン走査法、多層多フレーム走査法及びチェス盤走査法から得られたデータを２Ｄフレームの時系列として３Ｄアレイ内に保存する。これらの２Ｄフレームは、本発明の動き補正方法の基本ユニットを形成するために、ＡＯドリフトにマッチしたバーに区分される。本発明者らは、参照フレームとして、その時系列において最高の平均強度を持つフレームを選択した。次に、各フレーム及びバー及び参照フレームの対応するバーの間の相互相関を計算して、そのデータ空間内の一組の変位ベクトルを得た。各フレーム及び各バーの変位ベクトルを、その検体のデカルト座標系（カルテシアン又は直交座標系）に変換して、各バーについての走査方位を知る。１つのフレームの変位ベクトルを、その複数バーの動きベクトルの中央値（メジアン）として算出することによりノイズバイアスを避ける。この単一フレームの共通変位ベクトルをデータ空間に逆変換する。次に、全フレームの各バーについて得られた変位ベクトルを用いて、サブピクセル精度に対する線形補間を使用し、バーのデータをシフトさせる。ギャップは可能なら常に、隣りのバーからのデータで埋める。

上に開示した態様に対する各種の変更が、この後の特許請求の範囲により決まる保護範囲から逸脱せずに、当業者には明らかであろう。

１０：顕微鏡
１２：レーザー光源
１４：レーザービーム
１６：音響光学偏向器
１８：対物レンズ
２０：検出器
２６：検体（サンプル）

Claims (18)

1. ３Ｄレーザー走査型顕微鏡により複数の細胞体を走査することによるin vivo蛍光測定の動きアーチファクトを補正する方法であって、当該顕微鏡は、顕微鏡の対物レンズ(１８)により発生したレーザービームの焦点を、この顕微鏡の対物レンズの光学軸(ｚ)と、この光学軸に対して垂直、かつ互いに対して垂直のｘ軸及びｙ軸とにより規定される３Ｄ空間内部で偏向させるための複数の音響光学偏向器を備え、これら複数の音響光学偏向器は、レーザービームの焦点をｘ－ｚ面内で偏向させるためのｘ軸偏向器を形成する第１の対の音響光学偏向器と、該レーザービームの焦点をｙ－ｚ面内で偏向させるためのｙ軸偏向器を形成する第２の対の音響光学偏向器とを備え、下記を含む方法：
   －各細胞体内部で１つの走査点を選択し、
   －選択した各走査点を、その走査点が実質的に中心にくる直方体、好ましくはその細胞体に直径に適合したサイズの直方体、を規定する複数の平行な実質的にまっすぐなドリフトラインに伸長し、
   －各ドリフトラインの走査を、そのドリフトラインの一端で前記レーザービームを集束させ、そのドリフトラインに沿って焦点を連続的に移動させるために前記ｘ軸偏向器内及び前記ｙ軸偏向器内の音響周波数に対して線形又は非線形チャープ信号を付与することにより行い、
   －前記測定を反復して、前記走査された直方体の時系列を得、そして
   －この時系列を用いて動きアーチファクトを補正する。
2. 走査された複数の直方体を互いに隣り合わせで配列し、そして各時点で走査された直方体の正味変位ベクトルを算出して体積下位置を補正することにより動きアーチファクトを補正することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ドリフトラインの方向をｘ－ｙ面と平行になるように選択し、そして、各ドリフトラインの走査を、そのドリフトラインの一端で前記レーザービームを集束させ、そのドリフトラインに沿って焦点を連続的に移動させるために前記ｘ軸偏向器内及び前記ｙ軸偏向器内の音響周波数に対して線形チャープ信号を付与することにより行うことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 平均動きベクトルを持つ生きている組織を走査し、そしてドリフトラインの方向をこの平均動きベクトルと平行になるように選択することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
5. ３Ｄレーザー走査型顕微鏡により関心領域を走査することによるin vivo蛍光測定の動きアーチファクトを補正する方法であって、当該顕微鏡は、顕微鏡の対物レンズ(１８)により発生したレーザービームの焦点を、この顕微鏡の対物レンズの光学軸(ｚ)と、この光学軸に対して垂直、かつ互いに対して垂直のｘ軸及びｙ軸とにより規定される３Ｄ空間内部で偏向させるための複数の音響光学偏向器を備え、これら複数の音響光学偏向器は、レーザービームの焦点をｘ－ｚ面内で偏向させるためのｘ軸偏向器を形成する第１の対の音響光学偏向器と、該レーザービームの焦点をｙ－ｚ面内で偏向させるためのｙ軸偏向器を形成する第２の対の音響光学偏向器とを備え、下記を含む方法：
   －前記関心領域に沿って複数のガイド点を選択し、
   －選択したガイド点に対して或る１つの３Ｄ軌道をフィットさせ、
   －この３Ｄ軌道の各走査点を、複数の平行で実質的にまっすぐなドリフトラインに伸長し、これらの伸長されたドリフトラインは、一緒になって、実質的に連続している１つの体積を、前記３Ｄ軌道がこの体積内部に位置するように規定しており、
   －各ドリフトラインの走査を、そのドリフトラインの一端で前記レーザービームを集束させ、そのドリフトラインに沿って焦点を連続的に移動させるために前記ｘ軸偏向器内及び前記ｙ軸偏向器内の音響周波数に対して線形又は非線形チャープ信号を付与することにより行うことで、前記実質的に連続している体積を走査し、
   －前記実質的に連続している体積を１つの規則的な直方体に変換し、
   －前記測定を反復して、引き続く複数の前記規則的な直方体から時系列を得、そして
   －この時系列を用いて動きアーチファクトを補正する。
6. 対応する走査点において前記３Ｄ軌道に対して横断方向でｚ軸に対して垂直方向のドリフトラインを付与し、かつこれらのドリフトラインを走査するためにｘ軸偏向器内及びｙ軸偏向器内の音響周波数に対して線形チャープ信号を付与することを含む、請求項５に記載の方法。
7. 対応する走査点において前記３Ｄ軌道に平行で光学軸(ｚ)に沿って０ではない寸法を持つドリフトラインを付与し、かつこれらのドリフトラインを走査するためにｘ軸偏向器内及びｙ軸偏向器内の音響周波数に対して非線形チャープ信号を付与することを含む、請求項５に記載の方法。
8. 光学軸(ｚ)に沿って０ではない寸法を持つ複数のドリフトラインを付与し、かつこれらのドリフトラインの走査を下記により行うことを含む、請求項１又は５に記載の方法：
   －そのドリフトラインの起点として作用する一端の座標ｘ_０(0)、ｙ_０(0)、ｚ_０(0)を定め、
   －走査速度ベクトル成分ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚｘ０（＝ｖ_ｚｙ０）を、この走査速度ベクトルの大きさがある所定の走査速度に一致し、かつこの走査速度ベクトルの方向が前記ドリフトラインの方向に一致するように定め、
   －焦点を前記速度ベクトル成分ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚｘ０により規定される速度で前記起点から移動させるように、該ｘ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与し、かつ該ｙ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与しながら、レーザービームをｘ軸偏向器及びｙ軸偏向器内を通過させる。
9. 前記ｘ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与し、かつ前記ｙ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与することが、下記工程を含んでいる、請求８に記載の方法：
   下記関数に従って該ｘ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与し
   

   

   式中、ｉ＝１は第１のｘ軸偏向器を、ｉ＝２は第２のｘ軸偏向器をそれぞれ示し、Ｄはその音響光学偏向器の直径であり、そしてｖ_ａは偏向器内部の音波の伝播速度であり、そして下記関係が成立し：
   

   

   そして、下記関数に従って前記ｙ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与する：
   

   

   式中、ｉ＝１は第１のｙ軸偏向器を、ｉ＝２は第２のｙ軸偏向器をそれぞれ示し、そして下記関係が成立する：
   

   

   上記式中、Δｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１、ｃ_ｘ２、Δｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１及びｃ_ｙ２は、焦点の初期位置（ｘ_０(0)、ｙ_０(0)、ｚ_０(0)）及びベクトル速度（ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚｘ０＝ｖ_ｚｙ０）の関数として表されるパラメータである。
10. 音響光学偏向器における音響周波数に対する偏向角の依存率をＫとし、３Ｄレーザー走査型顕微鏡が、音響光学偏向器の下流に位置するそれぞれ焦点距離Ｆ_１及びＦ_２の第１及び第２のレンズと、この第１及び第２のレンズの下流に位置する焦点距離Ｆ_ｏｂｊの顕微鏡対物レンズとを備え、パラメータΔｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１、ｃ_ｘ２、Δｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１及びｃ_ｙ２が次式により表される、請求項９に記載の方法：
    

    

    

    式中、Ｍ＝Ｆ_１／Ｆ_２である。
11. レーザービームを３Ｄで集束させるために該レーザービームをｘ－ｚ面内で偏向させる第１の対の音響光学偏向器（ｘ軸偏向器）と該レーザービームをｙ－ｚ面内で偏向させる第２の対の音響光学偏向器（ｙ軸偏向器）とを備えた３Ｄレーザー走査型顕微鏡を用いて、或る所定速度で３Ｄ空間内の任意の方向に通っているライン（３Ｄライン）に沿って走査する方法であって、下記を含むことを特徴とする方法：
    －起点として作用する該３Ｄラインの一端の座標ｘ_０(0)、ｙ_０(0)、ｚ_０(0)を定め、
    －走査速度ベクトル成分ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚ０（＝ｖ_ｚｙ０）を、この走査速度ベクトルの大きさが前記所定の走査速度に一致し、かつこの走査速度ベクトルの方向が前記３Ｄラインの方向に一致するように定め、
    －焦点を前記速度ベクトル成分ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚ０により規定される速度で前記起点から動かすように、該ｘ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与し、かつ該ｙ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与する。
12. 前記ｘ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与し、かつ前記ｙ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与することが、下記工程を含んでいる、請求項１１に記載の方法：
    下記関数に従って該ｘ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与し
    

    

    式中、ｉ＝１は第１のｘ軸偏向器を、ｉ＝２は第２のｘ軸偏向器をそれぞれ示し、Ｄはその音響光学偏向器の直径であり、そしてｖ_ａは偏向器内部の音波の伝播速度であり、そして下記関係が成立し：
    

    

    そして、下記関数に従って前記ｙ軸偏向器に非線形チャープ信号を付与する：
    

    

    式中、ｉ＝１は第１のｙ軸偏向器を、ｉ＝２は第２のｙ軸偏向器をそれぞれ示し、そして下記関係が成立する：
    

    

    上記式中、Δｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１、ｃ_ｘ２、Δｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１及びｃ_ｙ２は、焦点の初期位置（ｘ_０(0)、ｙ_０(0)、ｚ_０(0)）及びベクトル速度（ｖ_x０、ｖ_ｙ０、ｖ_ｚｘ０＝ｖ_ｚｙ０）の関数として表されるパラメータである。
13. Δｆ_０ｘ、ｂ_ｘ１、ｂ_ｘ２、ｃ_ｘ１、ｃ_ｘ２、Δｆ_０ｙ、ｂ_ｙ１、ｂ_ｙ２、ｃ_ｙ１、及びｃ_ｙ２が次式により表される、請求項１２に記載の方法。
    

    

    
14. 使用する顕微鏡の光学軸（Ｚ）とこの光学軸に対して垂直、かつ互いに対して垂直のＸ軸、Ｙ軸とにより規定される３Ｄ空間内部でレーザービームを集束させるための音響光学偏向器を備えた３Ｄレーザー走査型顕微鏡で関心領域を走査する方法であって、下記を含んでいる方法：
    －前記関心領域に沿って複数のガイド点を選択し、
    －選択した複数のガイド点に対して１つの３Ｄ軌道をフィットさせ、
    －前記３Ｄ軌道の各走査点を、前記光学軸の方向に部分的に伸びるように、前記３Ｄ空間内に位置するライン（３Ｄライン）に伸長し、この３Ｄラインはその走査点で前記３Ｄ軌道に対して横断方向であり、これらの３Ｄラインは一緒になって実質的に連続した１つの面を規定し、
    －前記３Ｄラインの一端でレーザービームを集束させ、かつこの３Ｄラインに沿って焦点を連続的に移動させるために該偏向器内の音響周波数に対して非線形チャープ信号を付与することにより、各３Ｄラインを走査する。
15. 前記３Ｄ軌道の各走査点を、その走査点で該３Ｄ軌道に対して実質的に横断方向の面を規定する、複数の平行なラインに伸長することを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記３Ｄ軌道の各走査点を複数の平行なラインに伸長し、これらのラインは一緒になって実質的に連続した１つの体積を規定し、前記３Ｄ軌道がこの体積の内部に位置するようになっている、請求項１５に記載の方法。
17. 前記３Ｄ軌道の各走査点を、その走査点で該３Ｄ軌道上に実質的に中心をもつ直方体を規定している複数の平行なラインに伸長することを含む請求項１４に記載の方法。
18. 前記３Ｄラインが湾曲したライン又は実質的にまっすぐなラインである、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。