CN109952525A - 用于沿着三维线扫描的方法和通过扫描多个三维线来扫描感兴趣的区域的方法 - Google Patents
用于沿着三维线扫描的方法和通过扫描多个三维线来扫描感兴趣的区域的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种使用3D激光扫描显微镜用给定速度沿着3D空间中的任意方向的基本直线(3D线)扫描的方法，所述3D激光扫描显微镜具有在x‑z平面偏转激光束的第一对声光偏转器(x轴偏转器)和在y‑z平面中偏转激光束的第二对声光偏转器(y轴偏转器)，用于在3D中聚焦激光束。本发明还涉及一种使用3D激光扫描显微镜扫描感兴趣的区域的方法，3D激光扫描显微镜具有声光偏转器，用于在由显微镜的光轴(Z)和垂直于光轴以及彼此垂直的X、Y轴限定的3D空间内聚焦激光束。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用3D激光扫描显微镜以给定速度沿在3D空间中的任意方向上的基本直线(3D线)扫描的方法。
本发明还涉及一种利用具有声光偏转器的3D激光扫描显微镜扫描感兴趣的区域的方法，所述声光偏转器用于将激光束聚焦在3D空间内。
背景技术
神经元多样性、信息处理的层特异性、神经机制的区域特化、内部生成的模式和动态网络属性都表明理解神经计算需要不仅从单个平面或点而且以位于大型3D体积的大型神经元群体水平快速读出信息流和处理。此外，神经元网络内的编码和计算不仅由体细胞整合域形成，而且由高度非线性的树突整合中心形成，在大多数情况下，这些中心仍然不受体细胞记录的影响。因此，期望同时读出群体和单细胞水平的神经活动。此外，最近已经表明，在清醒和行为动物中神经元信令可能完全不同。因此，需要新的方法，其能够在行为动物的大脑中以大的扫描体积同时记录具有高空间和时间分辨率的神经元、树突、棘和轴突组件的活动模式。
最近已经开发了几种新的光学方法用于快速读出3D中的神经元网络活动。在用于多光子显微镜的可用3D扫描解决方案中，3D AO扫描能够执行3D随机接入点扫描(KatonaG,Szalay G,Maak P,Kaszas A,Veress M,Hillier D,Chiovini B,Vizi ES,Roska B,Rozsa B(2012)；Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.Nature methods 9:201-208)以与经典光栅扫描相比较将测量速度和信号采集效率提高几个数量级。这是因为预先选择的感兴趣的区域(ROI)可以被精确且快速地定向，而不会浪费不必要的背景体积的测量时间。更定量地，3D AO扫描增加了测量速度和信噪比的平方与总图像体积与预选扫描点覆盖的体积之比率的乘积。与相同样本体积的传统光栅扫描相比，该比率可以非常大，约每ROI 106-108。
尽管3D随机访问AO显微镜具有明显的好处，但该方法面临两个主要的技术限制：i)在活体记录期间荧光数据丢失或被大幅度运动伪影污染；ii)采样率受AO偏转器的大光学孔径尺寸的限制，AO偏转器必须用声波填充以解决给定的扫描点。出现第一个技术限制是因为记录的ROI的实际位置在活体测量期间由于由心跳、附近血管中的血流，呼吸和物理运动引起的组织运动而连续变化。由于各种荧光标记的基线荧光信号的空间不均匀性，这导致荧光伪影。此外，记录的隔室内的相对荧光变化也存在空间不均匀性；因此，体细胞(somata)或树突隔室内的测量位置不相等。此外，运动诱导的瞬变的幅度甚至可以大于由遗传编码的钙指示剂(GECI)检测到的一个或几个动作电位诱导的幅度。此外，Ca2+瞬变和运动伪影的动力学也可能非常相似。因此，事后很难将与神经活动相关的真正荧光变化与由脑运动引起的伪影分开。3D逐点扫描的第二个技术问题是相对较长的切换时间，这限制了测量速度或ROI的数量。这是因为为了实现具有高空间分辨率的大扫描体积，需要大的AO偏转器孔径。然而，用声学信号填充这些大孔径需要相当长的时间。因此，所得到的长持续时间AO切换时间不允许在适当的时间段内从单个点生成体积或表面元素。
使用AO显微镜进行3D逐点扫描的强大性能已在切片制备或麻醉动物的早期工作中得到证实。在这些研究中，通过使用两组x和y偏转器实现3D扫描。在聚焦期间，第二x(和y)偏转器的驱动器功能补充了反向传播的声波，其线性增加(啁啾)频率被编程为完全补偿焦点的横向漂移-否则这种漂移将由在啁啾波中不断增加平均声频引起。以这种方式，点扫描方法产生高的指向稳定性，但是需要相对长的切换时间，因为每次在寻址3D中的新点时都需要填充大的AO偏转器孔径。
另一种连续轨迹扫描方法(Katona G,Szalay G,Maak P,Kaszas A,Veress M,Hillier D,Chiovini B,Vizi ES,Roska B,Rozsa B(2012)；Fast two-photon in vivoimaging with three-dimensional random-access scanning in large tissuevolumes.Nature methods 9:201-208)允许更短的像素停留时间，但在这种情况下，快速横向扫描被限制在两个维度；然而，当沿z轴移动时，3D轨迹扫描仍需要耗时的跳跃来中断。换句话说，沿z轴扫描仍然受到与逐点扫描期间相同的限制。
发明内容
本发明的目的是克服与现有技术相关的问题。特别地，本发明的目的是通过导出焦点坐标和速度之间的一对一关系以及四个AO偏转器的啁啾参数以允许具有不仅在水平面上而且从扫描体积中的任何一点开始沿着任何3D线的焦点的快速扫描漂移(3D漂移AO扫描)，来概括先前的方法。
这些目的通过用于使用3D激光扫描显微镜用给定速度沿着3D空间中的任意方向的基本直线(3D线)扫描的方法来实现，所述3D激光扫描显微镜具有在x-z平面偏转激光束的第一对声光偏转器(x轴偏转器)和在y-z平面中偏转激光束的第二对声光偏转器(y轴偏转器)，用于在3D中聚焦激光束，该方法包括：
确定作为起点的3D线的一端的坐标x0(0)、y0(0)、z0(0)，
确定扫描速度矢量分量vx0,vy0,vzx0(＝vzy0)，使得扫描速度矢量的大小对应于给定的扫描速度，扫描速度矢量的方向对应于3D线的方向，
根据如下函数在x轴偏转器中提供非线性啁啾信号：
其中，
i＝1或2分别表示第一和第二x轴偏转器，D是AO偏转器的直径；和va是偏转器内声波的传播速度并且
Δf0x＝f1x(0,0)-f2x(0,0))≠0
以及根据如下函数在y轴偏转器中提供非线性啁啾信号：
其中，
i＝1或2分别表示第一和第二x轴偏转器，和
Δf0y＝f1y(0,0)-f2y(0,0))≠0
其中Δf0x、bx1、bx2、cx1、cx2、Δf0y、by1、by2、cy1以及cy2表示为初始位置(x0(0),y0(0),z0(0))和焦点的矢量速度(vx0,vy0,vzx0＝vzy0)的函数。
在本发明的上下文中，3D线是具有沿着显微镜的光轴(z轴)的非零维度和沿垂直于光轴(x-y平面)的平面的非零维度的线。因此，与光轴平行的线不被认为是3D线，也不是纯粹位于x-y平面中的线。线的等式可以用一一组线性等式来描述，线路径的参数根据通用等式选择，在3D中：
x0＝x0(0)+s*vx0
y0＝y0(0)+s*vy0
z0＝z0(0)+s*vz0
由于偏转器在x-z和y-z平面中偏转，因此可以将这些等式转换为描述x-z和y-z平面上的线投影的等式：
有了这些，我们暗示初始速度值vzx0＝vzy0＝vz0，参数m、n、k、l由沿x、y、z轴的初始速度值vx0,vy0,vz0确定：
优选地，参数Δf0x、bx1、bx2、cx1、cx2、Δf0y、by1、by2、cy1以及cy2表示为
本发明提供了一种新颖的方法，3D漂移AO显微镜，其中，不是保持相同的扫描位置，而是允许激发点在3D空间中以任何期望的速度在任何方向上漂移，同时连续记录荧光数据而没有采样率的限制。为了实现这一点，在具有抛物线频率分布的AO偏转器中使用非线性啁啾。利用这些抛物线频率分布实现的部分漂移补偿允许焦点在任意方向上、利用由啁啾声信号的时间形状确定的任意速度的定向和连续移动。在焦点的这些快速3D漂移期间，荧光收集不间断，提高了先前使用的点扫描的像素停留时间限制。以这种方式，预先选择的各个扫描点可以扩展到小的3D线、表面或体积元素，以不仅覆盖预先选择的ROI而且覆盖相邻的背景区域或体积元素。
根据另一方面，本发明提供了一种使用3D激光扫描显微镜扫描感兴趣的区域的方法，3D激光扫描显微镜具有声光偏转器，用于在由显微镜的光轴(Z)和垂直于光轴以及彼此垂直的X、Y轴限定的3D空间内聚焦激光束，该方法包括：
选择感兴趣的区域的引导点，
将3D轨迹拟合到选定的引导点，
将3D轨迹的每个扫描点延伸到位于3D空间中的基本直线(3D线)，以便部分地沿光轴方向延伸，3D线在给定扫描点处横切于3D轨迹以及直线共同定义一个基本上连续的表面，
通过将激光束聚焦在3D线的一端并且为偏转器中的声频提供非线性啁啾信号以沿着3D线连续移动焦点来扫描每条3D线。
3D线可以是例如5至20μm长度。
优选地，3D线基本垂直于3D轨迹。
优选地，该方法包括将3D轨迹的每个扫描点延伸到定义在给定扫描点处基本上横切于3D轨迹的表面的5到20μm长度的多条平行的基本直线。
优选地，该方法包括将3D轨迹的每个扫描点延伸到5到20μm长度的多条平行的基本直线，所述直线一起限定基本上连续的体积，使得3D轨迹位于该体积内。
优选地，该方法包括将3D轨迹的每个扫描点延伸到5到20μm长度的多条平行的基本直线，所述直线定义基本上以给定扫描点处的3D轨迹为中心的立方体。
虽然有几种方法可以将单个扫描点扩展到表面和体积元素，但3D线、表面和体积的组合几乎是无限的，发明人发现了六种特别有利的新扫描方法：3D条带扫描；棋盘扫描；多层、多帧成像；蛇形扫描；多立方体扫描；和多3D线扫描。它们中的每一个都是针对不同神经生物学目标的最佳选择。
在这些方法中使用的体积或面积扫描允许在精细空间尺度上的运动伪影校正，并因此在行为动物中进行精细结构的活体测量。因此，即使在行为动物的大脑中，也可以在3D测量期间从预先选择的ROI保留荧光信息，同时保持解决各个ROI处的神经活动所需的10-1000Hz采样率。可以证明，这些扫描方法可以将运动伪影的幅度降低一个数量级，因此能够快速测量神经元体细胞和精细神经元过程，如树突棘和树突，甚至可以在移动中，3D中超过650μm的z扫描范围中的行为动物。
在所附的从属权利要求中限定了本发明的其他有利实施例。
附图说明
根据附图和示例性实施例，本发明的进一步细节将变得显而易见。
图1A是用激光扫描声光显微镜进行纵向和横向扫描的示意图。
图1B是显示从在插图中用白色三角形指示的一个树突和一个棘ROI在运动(光)和静止(暗)期间使用3D随机访问点扫描记录的示例性树突和棘瞬变的图。
图1C是选定的GCaMP6f标记的神经元的树突片段和用虚线显示的树突片段周围的选定条带的3D图像。
图1D示出了彩色编码图，其示出了在使用纵向(左)和横向(右)扫描模式的自发活动期间沿着图1C的条带的平均Ca2+响应。
图2A是脑运动记录的图。
图2B示出了记录的脑运动的归一化幅度直方图。插图显示静止和运行期间的平均和平均峰到峰位移。
图2C显示了作为距离函数的相对荧光振幅的归一化变化。插图显示了树突片段的例子。
图2D是GCaMP6f标记的神经元的体细胞的图像(左)，以及信噪比的标准化增加(右)。
图2E对应于图2D，但是用于树突记录。
图2F示出了运动校正之前和之后的脑运动记录的图。
图2G示出了运动伪影校正的其他示例。
图2H示出了具有和不具有运动校正的体细胞瞬变。
图3A是多个树突片段的示意性透视图。
图3B示出了x-y和x-z平面中的编号帧，表示用于同时记录十二个多棘树突片段的十二个3D条带。
图3C显示了沿图3B中所示的12个树突区域同时进行的荧光记录的结果。
图3D示出了源自图3C中突出显示的132个编号区域的Ca2+瞬变。
图3E显示了图3C中所示的树突棘的活动模式的光栅图。
图3F显示了来自图3C中用数字表示的五个示例性树突棘的Ca2+瞬变。
图3G显示了来自图3F的五个树突棘的活动模式的光栅图。
图4A示出了棋盘扫描的示意性透视图。
图4B是所选扫描区域的示意性透视图。
图4C示出了视觉刺激期间136个体细胞的示意图。
图4D示出了在运动伪影补偿之后从图4C中的颜色编码区域得到的代表性体细胞Ca2+响应。
图4E示出了从图4C中所示的颜色编码神经元移动光栅刺激到八个不同方向所诱导的平均Ca2+响应的光栅图。
图4F是多帧扫描的示意性透视图。
图4G是选自稀疏标记的V1网络的选定的GCaMP6f标记的层V锥体神经元的树突图像。
图4H是图4G中所示的神经元的x-z投影，同时描绘了成像的树突和体细胞Ca2+响应。
图4I是每个ROI的衍生Ca2+瞬变。
图5A是用GCamP6f传感器标记的层II/III神经元的3D视图，其中矩形表示四个同时成像的层。
图5B显示了图5A中所示的四个同时测量的层中的平均基线荧光。
图5C示出了在运动伪影消除之后从图5B中所示的编号黄色子区域得到的体细胞Ca2+响应。
图5D显示来自图5B的平均基线荧光图像。
图6A示出了蛇形扫描的示意性透视图。
图6B是使用稀疏标记用GCaMP6f传感器标记的V1区域中的锥体神经元的z投影，并且以放大的比例显示选择的树突片段。
图6C示出了在图6B中所示的所选树突区域中以10Hz执行的快速蛇形扫描的结果。
图6D是与图6C中相同的树突片段，但3D体积显示为x-y和z-y平面投影。
图6E示出了3D多立方体扫描的示意性透视图。
图6F示出了10个代表性立方体的体积渲染图像，其选择用于同时3D体积成像的单个神经元体。
图6G示出了在3D运动校正之后从图6F中所示的10个立方体得到的Ca2+瞬变。
图7A示出了多3D线扫描的示意性透视图。
图7B示出了脑运动的幅度，平均运动方向由箭头示出。
图7C是用GCaMP6f标记的层2/3锥体细胞的z投影，白线表示穿过164个预先选择的棘的扫描线。
图7D显示了使用多3D线扫描沿14个棘记录的单个原始Ca2+响应。
图7E示出了通过在四个不同方向上移动光栅刺激诱导的示例性棘Ca2+瞬变。
图7F示出了使用点扫描(左)和多3D线扫描(右)测量的选定的Ca2+瞬变。
图8示出了根据本发明的快速不同3D扫描方法的示意性透视图。
图9示出了3D扫描仪和聚焦系统的光学几何结构的示意图。
具体实施方式
图1A中示出了示例性激光扫描声光(AO)显微镜10，其可用于执行根据本发明的方法。AO显微镜10包括提供激光束14的激光源12，声光偏转器16和用于将激光束14聚焦在样本上的物镜18，以及用于检测由样本发出的背散射光和/或荧光的一个或多个检测器20。如本领域中已知的，AO偏转器16的其他布置也是可能的。可以提供另外的光学元件(例如，镜子、分束器、法拉第隔离器、色散补偿模块、激光束稳定模块、扩束器、角色散补偿模块等)，用于将激光束14引导到AO偏转器16和物镜18，以及用于引导所述背散射和/或发射的荧光的光到检测器20，如本领域中已知的(参见例如Katona et al."Fast two-photon in vivoimaging with three-dimensional random-access scanning in large tissuevolumes",Nature methods 9:201-208；2012)。当然，也可以使用具有不同结构的激光扫描显微镜10。
用于双光子激发的激光源12可以是飞秒脉冲激光，例如，模式锁定的Ti：S激光器，其产生激光束14。在这种情况下，激光束14由离散的激光脉冲组成，该脉冲具有飞秒脉冲宽度和MHz范围内的重复频率。
优选地，法拉第隔离器位于激光束14的光路中，其防止激光束的反射，从而有助于更平滑的输出性能。在通过法拉第隔离器之后，激光束14优选地进入色散补偿模块，其中以已知的方式利用棱镜进行预色散补偿。此后，激光束14优选地在到达AO偏转器16之前穿过光束稳定模块和光束扩展器。
由AO偏转器16偏转的激光束14优选地通过角度色散补偿模块，用于补偿光束14的角度色散，如本领域中已知的。物镜18将激光束14聚焦到放置在物镜18之后的样本26上。优选地，分束器放置在角色散补偿模块和物镜18之间，物镜18传输从样本26反射的或由样本26发射并由物镜18收集的激光束14的一部分到光电倍增管(PMT)检测器20，如本领域所公知的。
根据本发明的方法，扫描点被扩展到3D线和/或表面和/或体积元件，以便基本上增加信噪比，这允许在体内进行测量，例如，在活动大脑中。
根据本发明的3D漂移AO扫描不仅允许扫描各个点，而且还允许沿着位于整个扫描体积中的任何位置的任何3D线的任何片段扫描。因此，任何折叠的表面(或体积)元件可以例如从横向或纵向线产生，如图1A所示。以这种方式，当在逐点扫描模式中的单点扫描所需的相同的短时间段(≈20μs)内扫描整个3D线时，可以连续地收集荧光信息。数据采集速率仅受PMT检测器20的最大采样率限制。
因此，可以利用3D中的3D漂移AO扫描技术生成折叠表面元件，并使它们适合任何任意扫描轨迹，例如，在最小化在大脑运动期间的荧光损失的方向中的长而弯曲的树突片段和分支点。该技术称为3D条带扫描(参见图2C)。
为了实现3D条带扫描，第一步是沿着感兴趣的区域(例如树突片段或任何其他细胞结构)选择引导点。
第二步是使用例如分段立方Hermite插值将3D轨迹拟合到这些引导点。沿着所选择的3D轨迹形成条带的两种优选策略是产生漂移(焦点在其间连续移动的短扫描)，或者平行于轨迹(纵向漂移)，或者与轨迹正交(横向漂移)，如图1A所示。在这两种情况下，优选最大化这些表面元件平行于脑运动平面或物镜的标称焦平面的程度。后者背后的基本思想是点扩散函数沿z轴伸长：因此荧光测量对沿z轴的运动不太敏感。因此，还可以遵循该第二策略并生成用于神经网络和神经纤维测量的多个x-y帧(参见下文)。
在下文中，将说明可以通过根据本发明的3D漂移AO扫描方法执行的不同扫描策略的实现和效率。
示例1：3D条带扫描以补偿体内运动伪影
为了演示3D条带扫描，我们用Ca2+传感器GCaMP6f标记视觉皮层的V1区域中的一小部分锥体神经元，使用AAV矢量用于递送。然后，根据预先获得的z-堆叠，我们选择引导点并拟合3D轨迹，其覆盖标记的锥体细胞的多棘树突片段(图1C)。图1C显示了所选GCaMP6f标记的神经元的树突片段的3D图像。表达Cre依赖性GCaMP6f的AAV矢量用于诱导稀疏标记。选择3D条带(用虚线表示)用于在长方体内进行快速3D漂移AO扫描。
我们使用横向漂移沿选定的3D条带扫描，以测量选定的140μm树突片段和70.1Hz的棘(图1D)。沿着所选择的3D条带测量原始荧光数据(原始)，并且在消除运动伪影之后沿着条带的纵向和横向轴投影到2D。在自发活动(同步)期间沿着条带的平均Ca2+响应被颜色编码。使用纵向漂移允许相同树突片段的更快测量(在139.3Hz至417.9Hz的范围内)，因为需要更少(但更长)的3D线来覆盖相同的ROI。在下一步骤中，3D记录数据被投影到2D，作为沿着条带表面的垂直和横向距离的函数。注意，通过这种方式，将树突片段拉直到一个框架(图1D)以记录其在2D电影中的活动。该投影还允许使用针对2D扫描中的运动伪影消除而开发的现有技术方法的改编版本(参见Greenberg DS，Kerr JN(2009)Automated correctionof fast motion artifacts for two-photon imaging of awake animals.Journal ofneuroscience method176:1-15。)。
将单个扫描点延伸到表面或体积元件以便保留用于运动伪影消除的周围荧光信息的需要也由如下事实指示：在使用点扫描方法时在行为动物的运动期间荧光信息可能完全丢失。图1B示出了示例性树突和棘瞬变，其从在插图中用白色三角形指示的一个树突和一个棘感兴趣的区域(ROI)在运动(光)和静止(黑暗)期间使用3D随机访问点扫描被记录。请注意，荧光信息可以在运行期间达到背景水平，表明单个点不足以监测运动的、表现动物的活动。
图2A-2H示出了3D漂移AO扫描的运动伪影消除能力的定量分析。
为了量化运动引起的误差和条带扫描期间运动伪影校正的效率，我们首先通过快速扫描被较暗背景区域包围的明亮、紧凑的荧光物体来测量脑部运动。为此，我们将一个小的扫描体积(立方体)集中在荧光物体上，并且当检查的老鼠在线性虚拟迷宫中运行时，从x-y、x-z和y-z投影计算位移。我们根据同时记录的运动信息分离静止和运行周期(图2A和2B)。在图2A的情况下，通过体积成像被较暗的区域包围的明亮、紧凑的荧光物体，以12.8Hz记录脑运动。图2A示出了当小鼠在线性迷宫中运行(光)或静止(黑暗)时从225s测量周期投射在x轴上的脑位移的示例性瞬态。通过使用虚拟现实系统的光学编码器检测头部受限小鼠的运动周期。
根据记录的运动信息(运行以浅色并且静止以深色)将位移数据分成两个间隔，并计算两个周期的脑运动的归一化幅度直方图(参见图2B)。插图显示静止和运行期间的平均和平均峰到峰位移。
图2C显示相对荧光振幅的归一化变化作为距离GCaMP6f标记的树突片段的中心的距离的函数(ΔF/F(x)，mean±SEM，n＝3)。虚线表示分别针对静止和运行时段计算的平均峰-峰位移值。注意运行期间平均位移值的ΔF/F幅度下降>80％。插图显示了树突片段的例子。沿虚线平均ΔF/F，然后移动线并重复平均以计算ΔF/F(x)。
脑运动可以诱发荧光伪影，因为基线荧光和相对荧光信号中存在空间不均匀性(图2C)。可以通过将平均峰-峰运动误差代入相对荧光变化的直方图来计算运动产生的荧光瞬变的幅度(图2C)。对于树突(n＝3,100μm长的树突片段，图2C)，平均ΔF/F(x)直方图相对较尖锐，因此运行期间的平均运动幅度对应于荧光幅度的相对较大(80.1±3.1％，平均150横截面)下降，这比单个AP诱导的Ca2+响应的平均幅度高约34.4±15.6倍。这些数据表明需要运动伪影补偿。
在图2D的左侧，可以看到GCaMP6f标记的神经元的体细胞图像。点和虚线箭头分别表示扫描点和扫描线。在右侧，图2D示出了当扫描点扩展到体细胞记录中的扫描线时，如左侧所示，对于清醒动物中的静止(暗)和运行(光)时段计算的信噪比的归一化增加。用逐点扫描的信噪比用虚线表示。
图2E示出了与图D类似的计算，但是用于树突记录。在静止(黑暗)和运行(光)时段期间，将树突棘的逐点扫描的信噪比与3D条带扫描进行比较。使用3D条带扫描时，请注意改进10倍以上。
接下来，我们分析了活体测量期间运动校正方法的效率。和以前一样，我们使用GCaMP6f传感器标记神经元及其过程，使用3D条带扫描，并将记录的荧光数据投影到电影帧。当通过以亚像素分辨率移动帧来校正沿3D条带记录的视频的每一帧以最大化连续帧之间的荧光互相关时，我们获得了最佳结果(图2F)。在图2F的左侧，可以从单个来自电影的树突棘看到单个Ca2+瞬态，该电影是在行为小鼠(原始迹线)中沿着49.2μm多棘树突片段用3D条带扫描记录的。当在像素和子像素分辨率下执行运动伪影校正后得到Ca2+瞬变时，消除了运动引起的伪像并且改善了信噪比。
与3D随机接入点扫描相比，条带扫描和在运行动物中以亚像素分辨率的连续帧移位将信噪比增加了7.56±3.14倍(p>0.000015，n＝10)(图2G)。图2G示出了运动伪影校正的其他示例。在顶部，可以从使用唤醒老鼠的3D条带扫描记录的电影中看到单个帧。在底部，可以看到示例性的Ca2+瞬变，其源自来自颜色编码区域的记录的电影帧。可以看出，在子像素分辨率的运动伪影校正之后导出瞬态的信噪比得到改善。在右侧，可以看到计算的棘Ca2+瞬变的信噪比(100个瞬变，n＝5/5刺/小鼠)。在子像素分辨率下没有和具有运动校正的瞬态被显示。
接下来，我们分别研究了条带扫描后的post-hoc帧移位对信噪比的影响。当瞬态来自原始视频时，低振幅棘Ca2+瞬变几乎不可见。为了进行精确的分析，我们在多棘的树突片段和体细胞的图像中添加了相同的1、2、5和10个动作电位诱导的平均瞬态。然后，我们通过预先记录的脑运动幅度移位每个帧来生成帧序列(类似于图2A)。最后，我们使用和不使用运动校正算法重新计算帧序列中的Ca2+瞬变，使用相同大小的ROI来比较在同一地区逐点扫描和运动校正3D条带扫描的信噪比。我们的数据表明，与逐点扫描相比允许运动校正的3D条带扫描可以大大提高在活体测量期间在最频繁记录的小的1-5个AP相关信号的情况下的信噪比(11.33±7.92倍，p>0.025，n＝4个体细胞；对于1个AP，n＝100次重复)，但该方法还显著改善了突发相关和树突响应的信噪比。最后，我们在“经典”行为实验方案中量化了我们方法的效率。我们在条件和无条件刺激期间同时记录了表达加压素的中间神经元(VIP)的多个体细胞。在GCamP6f标记的神经元中奖励引起的大的响应，其Ca2+信号在时间上与行为诱导运动重叠，因此Ca2+瞬变与大运动伪影相关，甚至可能产生具有负振幅的瞬变。然而，我们的方法在这些实验中有效地改善了信噪比(图2H)。在图2H的左侧，在经典行为实验中可以看到VIP神经元体细胞的同时3D成像，其中针对两种不同的声音给出条件刺激(水奖励)和无条件刺激(空气抽吸，未示出)。示例性体细胞瞬变用(光)显示，在子像素分辨率(黑暗)下没有运动校正。底部图显示了运动幅度。注意运动诱导和神经元Ca2+瞬变重叠。此外，瞬态可能具有负幅度而没有运动校正。在右侧，瞬态的信噪比用(光)和无(暗)运动校正(平均值±SEM，n＝3)显示。
实施例2：用多个3D条带扫描记录多棘树突片段
最近有报道称，对于许多皮层神经元，突触整合不仅发生在轴突起始区段，而且发生在顶端和基底树突树内。这里，树突片段形成非线性计算子单元，其也彼此相互作用，例如通过由非线性电压门控离子通道产生的局部再生活动。然而，在许多情况下，局部树突计算事件的直接结果仍然隐藏在体细胞记录中。因此，为了理解神经网络中的计算，我们还需要用于同时测量多个多棘树突片段的新方法。虽然先前的研究已经证明在体外条件下同时记录多个树突片段，但是在大z扫描范围内的体内记录仍然是一个未解决的问题，因为心跳、呼吸或物理运动产生的大脑运动已经抑制了这些精密结构的3D测量。因此，我们实施3D条带扫描以同时记录图3A中所示的多个树突片段的活动。
在单个树突片段的3D测量中，我们提前采取z-堆叠，沿多个树突片段选择3D导向点，并将3D轨迹以及最终3D条带拟合到每个选定的树突片段(图3B)。如上所述，条带的表面被设定为与大脑的平均运动矢量平行，以最小化运动伪影的影响。我们从GCaMP6f标记的V1锥体神经元中选择了12个树突片段用于快速3D条带扫描(图3B)。图3B显示GCaMP6f标记的层II/III锥体神经元的x-y和x-z平面中的最大强度投影。编号的帧表示用于使用3D条带扫描同时记录十二个多棘树突片段的十二条3D条带。白色框架表示相同的多棘树突片段，但在x-z投影上。
在下一步骤中，沿每个条带记录的3D数据被2D投影，作为垂直于轨迹的距离和沿着给定条带的轨迹的函数。然后，根据它们的长度对这些树突片段的2D投影进行排序，并将它们彼此相邻放置(图3C)。在顶部，沿着图3B中所示的12个树突区域同时记录荧光。将荧光数据投影到2D图像中作为沿每个条带的纵向和横向的距离的函数，然后所有图像彼此相邻排序。该变换允许同时记录，连续运动伪影消除以及12个所选树突区域的活动的可视化作为2D电影。顶部图像是以18.4Hz记录的电影中的单帧。插图是树突棘的放大视图，显示保留的双光子分辨率。在底部，数字表示132个ROI：从视频中选择的树突片段和刺。注意，以这种方式，所有树突片段被拉直并且平行可视化。通过这种方式，我们能够将3D功能数据实时转换和可视化为标准视频电影。这里使用的2D投影允许快速运动伪像消除并简化数据存储、数据可视化和手动ROI选择。
由于每个条带在3D空间中可以不同地定向，因此测量的局部坐标系随着沿给定条带的距离以及覆盖不同树突片段的条带之间的变化而变化。因此，脑运动在每个条带处产生具有不同相对方向的伪影，因此先前使用的2D运动校正方法不能用于由条带生成的平坦2D电影。为了解决这个问题，我们将每个树突区域的记录划分为短片段。然后，使用最亮的图像作为参考，通过互相关计算每个3D条带片段的位移。知道每个片段的原始3D方向，可以计算每个条带片段的位移矢量。然后我们计算这些位移矢量的中值来估计记录的树突树的净位移。接下来，我们将净位移矢量投影回每个条带片段，以计算每个条带片段的每个图像所需的后移，用于消除运动。最后，我们在每个片段中分别重复算法，以使算法校正位移中的局部不均匀性。例如，这允许消除位移中的深度、脉管系统和距离依赖性不均匀性。在这种3D到2D转换和运动伪像消除之后，我们能够将先前开发的2D方法应用于我们的3DCa2+数据，以计算来自例如超过130个棘和树突区域的常规Ca2+瞬变(图3C和D)。使用我们的方法，我们检测到自发和视觉刺激诱导的活动(图3D和3F)。在图3F中，通过移动光栅刺激诱发瞬变。注意单个棘的空间和时间定时的可变性。最后，我们从棘装配模式生成了两个栅格图，以证明树突棘组件的同步和异步活动都可以记录在行为、运动动物中(图3E和3G)。在图3G中，用灰色条表示在八个不同方向上移动光栅刺激的时间。
示例3：神经网络的多层、多帧成像：棋盘扫描。
为了理解神经元计算，不仅要记录刺和树突的集合，还要记录体细胞的种群。随机接入点扫描是一种快速方法，可为体外测量和麻醉小鼠模型中的群体成像提供良好的信噪比；然而，点扫描在清醒行为动物的记录期间产生大的运动伪影，有两个原因。首先，运动伪影的幅度处于体细胞直径的水平。其次，基线和相对荧光在空间上不均匀，特别是当GECI用于标记时(图2C)。因此，我们不仅需要从每个体细胞的单个点检测荧光信息，还需要从周围的相邻ROI检测荧光信息，以便在运动期间保留体细胞荧光信息。为实现这一目标，我们将每个扫描点扩展为小方块，并将其他测量集(见下文)扩展为小方块。我们可以使用上面描述的两个主要策略来设置方块的最佳方向以进行运动校正：即，我们可以将方块设置为平行于运动方向，或者平行于目标的标称焦平面(图4A)：这里将展示第二个策略。图4B是所选扫描区域的示意性透视图。来自V1区域的小鼠的神经元用GCaMP6f传感器标记。根据在测量开始时采取的z-堆叠选择神经元体细胞和周围背景区域(小水平帧)。图4B中的标尺是50μm。
与3D条带扫描类似，我们可以在多层、多帧记录期间，甚至在图像采集期间，通过简单地将所有正方形并且因此每个体细胞排列成“棋盘”图案，更好的可视化和电影录制(这个版本的多层、多帧成像被称为“棋盘”扫描，生成3D数据的2D投影。与3D条带扫描类似，这里我们计算平均脑位移矢量作为时间的函数，并从所有帧中减去它以校正运动伪影。最后，我们可以从2D投影中选择子区域并如上所述计算相应的Ca2+瞬变(图4C-D)，并用移动光栅刺激检测定向和方向敏感神经元(图4E)。在图4C选择的帧被“变换”成2D“棋盘”，其中“正方形”对应于单个体细胞。因此，活动可以被记录为2D电影。图4C所示的图像是在视觉刺激期间来自136个体细胞的视频记录的单帧。图4D示出了在运动伪影补偿之后从图4C中的颜色编码区域得到的代表性体细胞Ca2+响应。图4E示出了从图4C中所示的颜色编码神经元移动光栅刺激到八个不同方向所诱导的平均Ca2+响应的光栅图。
多层、多帧扫描结合了低功率时间过采样(LOTOS)的低光毒性的优点和AO显微镜3D扫描能力的特殊灵活性，通过允许以速度大于共振扫描的扫描体积沿放置在任意位置的多个小帧同时成像。
长神经元过程的多层、多帧成像
多层、多帧扫描也可用于测量神经元过程(图4F)。图4F显示了测量的示意图。可以使用不同大小和扫描体积中的任何位置的多个帧来捕获活动。因为GECI的总z扫描范围扩展到超过650μm，我们可以，例如，同时成像层II/III或V神经元的顶端和基底树突状乔木(arbor)，或者在这个z扫描范围中跟踪树突树的活动。为了证明大的树突成像范围，我们从稀疏标记的V1网络中选择了GCaMP6f标记的V层神经元(图4G)。图4H示出了图4G中所示的神经元的x-z投影。视觉刺激诱导的树突和体细胞Ca2+响应同时在30Hz下在位于41个不同深度水平的多个帧中在超过500μm z范围内在清醒动物中成像(图4H)。图4G中所示的彩色编码帧表示同时成像的正方形的位置。通过减去提供具有子像素分辨率的运动校正的依赖于时间的净位移矢量，如上所述从帧中消除运动伪影。最后，我们得出每个ROI的Ca2+瞬变(见图4I)。通过在灰色显示的时间段内移动光栅刺激来诱导瞬变。
当然，多层、帧扫描方法不限于单个神经元的单个树突，而是我们可以用它们的树突(或轴突)乔木同时成像许多神经元。图5A显示用GCaMP6f传感器标记的层II/III神经元的3D视图。矩形表示四个同时成像的层(ROI 1-4)。数字表示距离软脑膜(pia)物质的距离。使用稀疏标记在V1区域标记神经元。为清楚起见，将位于相同扫描体积中的三个其他GCamP6f标记的神经元的体细胞和神经元过程从z-堆叠中移除。我们使用非特异性AAV矢量选择了四层神经纤维，并且在四层中同时记录了101Hz的活动。图5B显示了图5A中所示的四个同时测量的层中的平均基线荧光。右上角的数字表示来自软脑膜物质的成像深度。在图5C中，代表性的Ca2+瞬变是在运动伪影消除之后从图5B中所示的编号黄色子区域导出的。通过在用灰色阴影指示的时间间隔将光栅刺激移动到三个不同方向来诱导响应。在图5D中，来自图5B的平均基线荧光图像以灰度显示，并且用颜色编码的相对Ca2+变化(ΔF/F)覆盖。为了显示替代的定量分析，我们还从一些示例的体细胞和树突ROI(图5B)计算了Ca2+瞬变(图5C)。
使用多立方体和蛇形扫描进行体积扫描
我们的数据表明，即使大脑沿着所有三个空间维度移动，我们仍然可以保留荧光信息并通过沿3D表面元素以缩小尺寸扫描来有效地消除运动伪影。然而，在某些情况下，例如在较大的动物中或取决于手术或行为方案，运动的幅度可以更大并且丢失的第三扫描尺寸不能被补偿。为了在这些情况下充分保留荧光信息，我们可以通过使用自动算法将表面元素扩展到体积元素来收回丢失的扫描尺寸，直到我们达到测量所需的噪声消除效率。为了在两个例子中证明这一点，我们将3D条带扩展到折叠长方体(称为“蛇形扫描”，图6A)和多帧到多长方体。图6A示出了3D测量的示意图。选择用于3D扫扫描的3D条带可以扩展到3D体积元素(3D“蛇”)以完全涉及树突棘、父树树突和相邻背景体积，以在清醒、行动动物的大脑运动期间完全保留荧光信息。图6B是从用于蛇形扫描的稀疏标记的皮层V1区域选择的GCaMP6f标记的层II/III神经元的多棘树突片段的z投影(图6B)。选择的树突片段以放大的比例显示。根据开始时采用的z-堆叠，我们选择引导点，内插3D轨迹，并生成覆盖整个片段的3D条带，如上所述。然后我们将条带扩展到一个体积，并从选定的折叠长方体进行3D蛇形扫描(图6A-D)。在图6C中，通过移动光栅刺激诱导三维Ca2+响应，并将其作为沿树突的距离和沿垂直方向之一的距离的函数投影到2D中。在图6B中所示的所选树突区域中以10Hz进行快速蛇形扫描。荧光数据被投影为沿纵向和横向的距离的函数，然后数据沿着第二(和正交)垂直轴被最大强度投影，以分别显示三个移动方向的平均响应，并且一起跟随运动校正。或者，我们可以通过将折叠的蛇形变换为规则立方体来避免最大强度投影到单个平面。图6D显示与图6C中相同的树突片段，但3D体积显示为x-y和z-y平面投影。代表性的自发Ca2+响应来自编码的子体积元件，其对应于树突棘和两个树突状区域。在子像素分辨率下的3D运动校正之后，从子体积元素导出瞬态。在该表示中，可以从不同的子体积计算Ca2+瞬变(图6D)。请注意，由于保留了良好的空间分辨率，我们可以清楚地将每个棘彼此分开，并与移动动物中的母树突分开。因此，我们可以同时记录和分离来自棘的瞬变，即使它们位于隐藏和重叠位置，这是精确理解树突计算所需的(图6D)。
图6E示出了3D多立方体扫描的示意性透视图。为了演示多立方体成像，我们简单地将帧扩展为小立方体，并添加了比体细胞的z直径和峰值z移动的总和略大的z维度，以保留运动期间的所有体细胞荧光点。图6F示出了10个代表性立方体的体积渲染图像，其选择用于同时3D体积成像的单个神经元体。使用相对较大的立方体，从8.2Hz到25.2Hz同时测量10个GCaMP6f标记的体细胞，立方体的尺寸与体细胞的直径对齐(每个立方体在46×14×15体素到46×32×20体素的范围内，其中一个体素为1.5μm×3μm×4μm和1.5μm×1.5μm×4μm)。这种空间和时间分辨率使得解决亚细胞Ca2+动态成为可能。我们可以进一步增加扫描速度或记录单元的数量与用于生成立方体的3D漂移的数量成反比。例如，当使用由50×10×5体素制成的立方体时，可以用50Hz记录50个体细胞。与多帧记录类似，ROI可以彼此相邻排序以进行可视化(图6F)。在图6G中，Ca2+瞬变来自图6F中所示的10个立方体。如上所述，这里我们计算了在计算Ca2+瞬态期间每个时间点的净位移矢量和校正的子体积位置，以便消除运动。我们发现，在行为动物的大幅度运动期间，使用体积扫描将Ca2+瞬态中的运动伪影的幅度减小了19.28±4.19倍。这些数据表明，多立方体和蛇形扫描可以有效地用于在整个扫描体积上分布的多个子体积中的神经网络和多棘树突片段的3D测量。而且，这些方法能够完全消除大幅度运动伪影。
多3D线扫描
在上一节中，我们将一维扫描点扩展为二维或三维对象。在本节中，我们仅沿一个维度扩展扫描点，以更高的速度执行测量。我们发现，在许多实验中，样本运动很小，并且可以通过沿着单个3D轨迹的运动来近似脑运动(图7B)。图7A示出了多3D线扫描的示意性透视图。每条扫描线与一根棘相关联。在这种情况下，我们可以将3D随机访问点扫描的每个点扩展到仅多个短3D线而不是多个表面和体积元素(图7A)。在第一步中，我们从z-堆叠中选择了点。在第二步中，我们记录了大脑运动以计算平均运动轨迹。在图7B中，使用三个垂直成像平面和如图2A中的明亮荧光物体以3D记录脑运动的幅度。平均运动方向显示在运动轨迹的z投影图像中。在第三步中，我们生成短3D线，其中3D漂移AO扫描到每个预选点，使得线的中心与预选点重合，并且线被设置为与运动平均轨迹平行(图7B和7C)。图7C显示用GCaMP6f标记的层2/3锥体细胞的z投影。我们同时沿3D线检测到169169个棘的活动(图7C和E)。白线表示扫描线穿过164个预先选定的棘。将所有扫描线设置为与图7B中所示的平均运动平行。沿着164个棘同时记录相应的3D Ca2+响应。在图7D中，使用多3D线扫描沿着14个棘线记录单个原始Ca2+响应。注意原始荧光中的运动伪影。图7E示出了使用逐点扫描(左)和多3D线扫描(右)记录在底部指示的四个不同方向上由移动光栅刺激诱发的示例性棘Ca2+瞬变。
图7F示出了使用点扫描(左)和多3D线扫描(右)测量的选定的Ca2+瞬变。如果我们从多3D线扫描模式切换回经典的3D逐点扫描模式，则由心跳、呼吸和物理运动引起的振荡立即出现在瞬变中(图7F)。这些数据表明，当使用多3D线扫描时，信噪比有所改善。在运动幅度较小并且大多局限于3D轨迹的情况下，我们可以有效地使用多3D线扫描在行为动物中快速记录160多个树突棘。
不同扫描模式的优点
上面我们介绍了一种新型双光子显微镜技术，3D漂移AO扫描，我们已经生成了六种新颖的扫描方法：3D条带扫描；棋盘扫描；多层、多帧成像；蛇行扫描；多立方体扫描；图8中所示的多3D线扫描。点、线、表面和体积元素说明了为测量选择的ROI。
这些扫描方法中的每一种对于不同的神经生物学目标是最佳的，并且可以单独使用或以任何组合用于大扫描体积中的移动样本的3D成像。我们的方法首次允许在清醒、行动动物的微小神经元过程(如多棘树突片段)水平的神经网络的高分辨率3D测量，即使在物理运动生成大幅度运动伪影的情况下也是如此。
上述用于使用漂移AO扫描方法的3D成像的新型激光扫描方法基于它们如何适合于不同的脑结构和测量速度而具有不同的应用领域。最快的方法是多3D线扫描，其速度与随机访问逐点扫描一样快(多达1000个ROI，每个ROI 53kHz)，可用于测量棘或体细胞(图8)。在第二组中，多层、多帧成像，棋盘扫描和3D条带扫描可以沿长神经元过程和体细胞测量多达500个ROI，每个ROI具有5.3kHz。最后，两种体积扫描方法，多立方体扫描和蛇形扫描，可以测量多达50-100个体积元素，每体积元素高达约1.3kHz，非常适合分别测量体细胞和多棘树突片段。两种体积扫描方法提供最佳的噪声消除能力，因为可以最大程度地保留荧光信息。最后，我们量化了当行为动物的大脑中同时记录大量神经元时，新扫描策略的改善的信噪比如何改善单个Ca2+瞬变的单个AP分辨率。行为动物中的棋盘扫描、多立方体扫描或多层多帧成像分别改善了Ca2+响应的标准偏差，因子分别为14.89±1.73、14.38±1.67和5.55±0.65，(n＝20)与3D随机访问点扫描相比。因此，运动伪影校正的Ca2+响应的标准偏差变得小于单个AP的平均振幅，这使得在行为动物的神经网络测量中可以进行单动作电位检测。这对于3D随机访问AO显微镜是不可能的，因为当动物运行时，Ca2+响应的标准偏差比单个AP的振幅高4.85±0.11倍。
实验程序
外科手术
用于上述方法的所有实验方案均在小鼠上进行。手术过程类似于先前描述的(Katona et al.“Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes”，Nature methods 9：201-208；2012)；Fasttwo-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning inlarge tissue volumes.Nature methods 9:201-208)，具有一些微小的修改，简单地：用咪达唑仑、芬太尼和美托咪定(分别为5mg，0.05mg和0.5mg/kg体重)的混合物麻醉小鼠；视觉皮层的V1区域通过内在成像(平均0.5mm前部和1.5mm侧面λ结构)定位；使用牙钻在V1上进行圆形开颅术，并如前所述完全覆盖双层玻璃盖(参见Goldey GJ，Roumis DK，GlickfeldLL，Kerlin AM，Reid RC，Bonin V，Schafer DP，Andermann ML(2014)；Removable cranialwindows for long-term imaging in awake mice.Nature protocols 9:2515-2538)。对于双光子记录，小鼠从用nexodal、revetor和氟马西尼(分别为1.2mg、2.5mg和2.5mg/kg体重)的混合物的芬太尼麻醉被唤醒，并在实验前保持在平静和温度控制的条件下2-12分钟。在成像过程之前，将小鼠在3D显微镜下在黑暗中保持头部约束至少1小时以适应设置。在一些动物中，分别在24或48小时后进行第二次或第三次成像期。
AAV标签
V1区域局部有内在成像，简要说明：皮肤被打开，皮质右半球上的颅骨被清除。使用我们稍后在双光子成像期间使用的相同视觉刺激方案记录固有信号。如前所述进行注射程序(Chen TW，Wardill TJ，Sun Y，Pulver SR，Renninger SL，Baohan A，Schreiter ER，Kerr RA，Orger MB，Jayaraman V，Looger LL，Svoboda K，Kim DS(2013)；Ultrasensitivefluorescent proteins for imaging neuronal activity.Nature 499:295-300)有一些修改。在颅骨中打开0.5mm的孔，其中牙钻的尖端在V1皮质区域上方(中心1.5mm侧向和前囟后面1.5mm)。用于注射的玻璃微量移液管(尖端直径≈10μm)用0.5ml矢量溶液(≈6×1013颗粒/ml)回填，然后缓慢注射(前50nl为20nl/s，剩余量为2nl/s)进入皮质，在软脑膜下400μm的深度。对于群体成像，我们使用AAV9.Syn.GCaMP6s.WPRE.SV40或AAV9.Syn.Flex.GCaMP6f.WPRE.SV40(在Thy-1-Cre和VIP-Cre动物的情况下)；两种病毒均来自Penn Vector Core，Philadelphia，PA。对于稀疏标记，我们注射稀释10,000倍的AAV9.Syn.Flex.GCaMP6f.WPRE.SV40和AAV1.hSyn.Cre.WPRE.hGH的1:1混合物。如在外科手术部分中所述，在注射部位注射后2周将颅窗植入。
讨论
神经科学中新的3D漂移AO扫描方法有许多好处：i)它可以实现扫描体积，GECI比以前的实现大两个数量级，同时空间分辨率保持不变；ii)它提供了一种在任何方向上利用任意速度快速3D扫描的方法，，没有任何采样率限制；iii)它可以在保持记录的高速度的同时添加表面和体积元素；iv)它可以补偿3D中的快速运动伪影，以保持高空间分辨率，这是双光子显微镜的特征，在3D表面扫描和体积成像过程中甚至在行动动物时；v)它可以在快速3D AO测量中产生2D光栅扫描的低功率时间过采样(LOTOS)策略，以减少光毒性。
这些技术成果使得能够在行为、移动动物中实现以下快速3D测量和分析方法：i)同时功能记录超过150个棘；ii)快速并行成像超过12个多棘树突片段的活动；iii)从记录的体积中精确分离空间和时间上的快速信号与每个单独的棘(和树突节段)，其信号与当前可用的方法重叠；iv)在超过650μm的z扫描范围内同时成像大部分树突状乔木和神经网络；v)以高达500μm×500μm×650μm的扫描体积成像具有亚细胞分辨率的超过100个神经元的大型网络，其信噪比比3D随机接入点扫描大一个数量级；和vi)在神经元网络测量中解码具有单AP分辨率超过10倍的AP。
对神经过程的理解的限制现在在于3D中活组织中发生的快速树突和神经元活动模式，以及它们在更大网络体积上的整合。到目前为止，神经回路功能的这些方面尚未在清醒、行动动物中进行测量。我们新的3D扫描方法具有高度的空间和时间分辨率，为这些活动测量提供了缺失的工具。除了其他优点，我们将能够使用这些方法来研究尖峰时间依赖的可塑性和潜在的机制，树突再生活动的起源，树突棘的传播，感受野结构，多棘和无棘树突之间的树突计算片段，不同输入组件的时空聚类，联想学习，多感官整合，棘活动的空间和时间结构，树突和体细胞集合，稀疏分布的神经元群体的功能和相互作用，如小白蛋白、生长抑素、和血管活性肠多肽表达神经元。这些3D扫描方法还可以提供理解本地和更大规模的神经元电路介导的同步过程的关键：这些被认为在神经系统的综合功能或不同疾病中是重要的。重要的是，这些复杂的功能性问题可以通过我们的方法在细胞和亚细胞水平上解决，同时在多棘(或无棘)树突片段以及在行为动物的神经元网络水平上解决。
在运动期间成像大脑活动
已经在麻醉动物甚至运行动物中实现了棘Ca2+反应的二维体内记录，但是在这些纸中仅记录了具有相对低的信噪比的少量棘。然而，在清醒、运行和行为动物中对大棘组件和多棘树突片段的快速2D和3D成像仍然是一个挑战。然而，最近的研究表明，在运动过程中大多数神经元的神经元放电率超过两倍，这表明在移动、行为动物中神经元功能完全改变。此外，大多数神经元计算发生在远端顶端和基底树突节段中，其在脑中形成复杂的3D乔木。然而，以前的2D和3D成像方法都没有能够在运行期间或在不同的行为实验中提供对这些复杂和薄(多棘)树突片段的访问，尽管复杂的行为实验在神经学领域迅速传播。一个原因是，在典型的行为实验中，运动诱导的瞬变具有与行为相关的Ca2+瞬变相似的幅度和动力学。而且，这些瞬变通常在任务期间同时出现，使得它们的分离变得困难。因此，这里展示的3D扫描方法，单独或以不同的组合，将添加神经光子学工具包中长期遗漏的新工具，用于记录行为动物的树突活动。
补偿大脑的运动
尽管已经在低速(≈10Hz)下开发了具有三个自由度的闭环运动伪影补偿，但该方法的效率尚未在清醒动物或树突棘测量中或在比那些运动人工制品的特征更高速度下得到证实。此外，由于大脑的复杂蛛网膜悬吊，并且由于血管在其局部环境中产生空间不均匀的脉动，大脑也表现出显著的变形，而不仅仅是平移运动，因此，位移的幅度可能是在每个子区域中成像不同。当我们测量小幅度体细胞响应(例如单个或几个AP相关响应)或我们想要测量小结构(如树突棘)时，这是至关重要的。幸运的是，我们的3D成像和相应的分析方法还允许在成像的每个子区域中具有可变幅度和方向的补偿，这意味着因此可以在3D中测量和有效地补偿不均匀的位移分布。
我们的3D扫描和运动伪影补偿方法的效率也通过以下事实得到验证：单个体细胞Ca2+瞬变的标准偏差大大降低(高达14倍)，并且变得小于单个AP的振幅，特别是当使用多立方体或棋盘扫描。这允许使用当前受欢迎的GECI、GCaMP6f在行为动物的移动大脑中进行单AP解析。最近的工作也验证了为神经元网络成像提供单一AP分辨率的重要性，这些研究表明，在许多系统中，神经元群体用单个AP而不是突发来编码信息。
顶端和基底树突状乔木的同时三维成像
最近的数据已经证明，皮质锥体神经元的顶端树突簇是反馈输入的主要目标，其中它们被局部NMDA峰值放大以到达远端树突状Ca2+，并且最后，它们也满足基础输入的体细胞钠集成点被当地NMDA峰值放大。因此，大多数自上而下和自下而上的输入集成同时发生在由几百微米的距离分开的局部整合计算子单元，这需要在几百微米的z范围内同时进行神经元过程的3D成像。AO显微镜的最大超过1000μm的z扫描范围，在目前可用激光器的最大可用功率的GECI活体测量期间限制到约650μm，已经允许同时测量层II/II I神经元的顶端和基底树突片段和超过500μm范围内的层V神经元的树突片段。
尽管麻醉动物的2D成像可以捕获长的神经元过程，但是水平定向的长片段的位置几乎仅限于几层(例如，层I)，而在所有其他区域，我们通常只看到倾斜或正交取向的树突的横截面或短的片段。此外，即使在我们幸运地利用单个焦平面捕获多个短片段的情况下，也不可能沿着树突和分支点移动成像区域以理解时空整合的复杂性。多3D带状和蛇形扫描方法的主要优点是任何ROI都可以灵活地选择、移位、倾斜和与ROI对齐，而不受任何限制；因此，可以以空间和时间精确的方式记录复杂的树突整合过程。
深度扫描
尽管已经开发了几种用于快速3D记录的伟大技术，但是仅通过引起机械损伤或使用单点双光子或三光子激发(其允许从深度散射的荧光光子被收集)来成像深层神经元。使用自适应光学和再生放大器可以提高深度处的分辨率和信噪比。此外，使用直接安装在物镜臂中的GaAsP光电倍增管本身可以将体内扫描范围扩展到超过800μm。这里展示的3D扫描方法的主要观点之一是达到超过1.6mm的最大扫描范围的主要限制是当前可用激光器的相对低的激光强度，其不能补偿四个AO偏转器中的固有损耗。在透明样本中使用3D AO成像已经证明了在3mm z扫描范围内支持这一点，其中强度和组织散射不受限制。因此，未来新型高功率激光器与快速自适应光学器件和新的红移位传感器相结合，可以利用更大的3D扫描范围，例如，可以测量整个深层神经元的乔木或3D海马成像，无需从皮质中移除任何部分。
尽管有几种不同的无源光学元件和4种AO偏转器可以实现显微镜快速3D扫描，所有这些显微镜都使用漂移补偿和第二组偏转器的反向传播AO波，因此这里演示的扫描方法可以在所有3D AO显微镜中轻松实现。此外，以降低的扫描体积为代价，3D AO显微镜可以简化并用作任何双光子系统的升级。因此，我们预计我们的新方法将在行为动物的高分辨率体内成像中开辟新的视野。
3D漂移AO扫描
在下文中，我们简要描述了如何在焦点坐标和速度以及四个AO偏转器的啁啾参数之间建立一对一的关系，以在扫描体积在任何点开始沿着任何3D线移动焦点。
为了确定四个AO偏转器的驱动频率与焦点的x、y和z坐标之间的关系，我们需要3D显微镜的简化传递矩阵模型。我们的3D AO系统沿x和y坐标对称，因为它基于两个x和两个y柱面透镜，它们对称地排列在x-z和y-z平面上。因此，我们需要计算一个平面的传递矩阵，例如x-z平面。我们的3D扫描仪的第一和第二x偏转器处于共轭焦平面，因为它们与由两个消色差透镜组成的无焦投影透镜耦合。因此，为简单起见，我们可以在光学计算过程中并置使用它们。
如图9所示，在我们的近轴模型中，我们使用具有F1和F2焦距的两个透镜，距离为F1+F2(无焦投影)，以将两个AO偏转器(AOD x1和AOD x2)成像到物镜。Fobjective是物镜的焦距，zx定义了焦点与物镜沿z轴的距离，t1和t2分别是AO偏转器与无焦投影的第一透镜之间的距离，以及第二透镜和物镜之间的距离。
可以通过ABCD矩阵技术执行光学系统的几何光学描述。可以使用系统的ABCD矩阵从入射激光束的角度(α)和位置(x)计算任何光学系统的输出激光束的角度(α0)和位置(x0)(等式S1)：
沿x和y方向偏转的偏转器也通过光学系统连接，该光学系统也可以使用ABCD矩阵系统进行近轴建模。为了区别于扫描仪和样本之间的光学系统，我们可以用小写字母表示它(a b c d)。通过这种方式，我们可以确定在第一个晶体中的坐标x1处通过的每条光线(沿x轴偏转)在第二晶体中取得的坐标x2和角度α2：
第二偏转器和样本平面之间的连接由下式给出：
这里α2′是偏转后离开晶体的光线的角度。α2和α2′之间的关系由第二偏转器的偏转规则确定。最简单的近似简单地给出：
α′2＝α2+K*f2 [等式4]
因此应用第二矩阵变换得到：
x0(t)＝A*x2+B*α′2(x2,t)＝A*x2+B*(α2(x2,t)+K*f2(x2,t)) [等式5]
应用第一矩阵传递，即两个偏转器之间的传递：
x0(t)＝A*(a*x1+b*α1(x1,t))+B*(c*x1+d*α1(x1,t)+K*f2(x2,t)) [等式6]
应用偏转器1的偏转规则：
α1(x1,t)＝K*f1(x1,t) [等式7]
我们得到目标样本坐标：
x0(t)＝A*(a*x1+b*K*f1(x1,t))+B*(c*x1+d*K*f1(x1,t)+K*f2(x2,t)) [等式8]
在最后一步中，我们从等式中消除x2：
x0(t)＝A*(a*x1+b*K*f1(x1,t))+B*(c*x1+d*K*f1(x1,t)+K*f2(a*x1+b*K*f1(x1,t),t)) [等式9]
两个偏转器中频率的x和t依赖性可用以下等式描述：
使用这些x0坐标：
x0(t)＝(A*a+B*c)*x1+(A*b*K+B*d*K)*f1(x1,t))+B*(K*f2(a*x1+b*K*f1(x1,t),t)) [等式12]
当替换频率时：
我们得到的等式只取决于x1和t。
现在我们可以收集包含项的x1的系数的表达式：
线性x1项系数：
如果系数ax1和ax2不依赖于t，则可以非常简单地使其为零。在这种情况下，当参数ax1和ax2满足等式给出的条件时，我们在两个偏转器中都有一个简单的线性频率扫描，以及一个具有恒定速度的漂移焦点：
x0坐标将具有时间变化：
x0(t)＝x0(0)+vx*t [等式16]
具有：
以及
可以通过从期望的vx和x0(0)值开始反转上述等式来确定参数。然而，当人们想要沿曲线移动点时，它更复杂，这不仅意味着线速度恒定，而且还意味着加速度。为实现此目的，在这种情况下，ax1和ax2参数必须依赖于t。最简单的依赖是线性的：
并对于第二偏转器：
再次使用x2和x1之间的关系：
将其代入x0的等式，我们得到：
这里x0仅取决于x1和t。为了获得紧凑的焦点，所有依赖x1的项必须消失。在一般情况下，有四个项具有线性、二次、三次和四次幂依赖性，并且都依赖于t。我们必须选择特殊情况来找到可以分析描述的解决方案，因为一般情况太复杂了。
通用等式22可以使用矩阵元素的特定适用变量应用于不同的光学设置。
在示例性实施例中，所有偏转器通过由不同焦距透镜组成的望远镜光学连接。
用于连接两个偏转器1和2的望远镜的一般矩阵，由两个透镜组成-透镜1和2-焦距f1和f2彼此相距t，透镜1放置在距偏转器1的距离d1处和透镜2放置在距偏转器2的距离d2处：
如果在望远镜的理想情况下，镜头彼此相距f1+f2进行光学成像，则矩阵会缩小为：
在所提到的参考的系统中，偏转器全部放在中间望远镜的共轭图像平面上。利用望远镜进行的最有效成像是在第一透镜的第一焦平面(即f1＝d1)和第二透镜的第二焦平面(f2＝d2)之间进行的。
在这种情况下，矩阵减少到：
如果两个焦距相等，我们得到最简单的关系：
在分析系统的每个偏转器之间，可以应用来自等式23-26的矩阵中的任一个来获得适当的矩阵元素以描述等式22。如果沿x和y轴偏转的偏转器交替地定位，例如，一个x后跟一个y，连接两个x方向(x1和x2)和y方向(y1和y2)偏转器的望远镜通过分别描述x1和x2以及y1和y2偏转器的矩阵的相乘来描述。在这里，我们忽略了通过偏转器的传播(与距离d1、f1等相比可以忽略不计)，并认为y偏转器不会改变x-z平面中的传播角度，反之亦然x导向偏转器对y-z平面没有影响。因此使用例如等式24我们得到由连接x1和y1偏转器的焦距为f1和f2的透镜以及连接y1和x2偏转器的焦距为f3和f4的透镜形成的望远镜：
如果焦距f1＝f2且f3＝f4，
我们得到最简单的矩阵：
对于沿x和y偏转的偏转器，最后偏转器和目标样本平面之间的光学传递将是不同的。将最后的x偏转器连接到样本平面的光学系统还包括由焦距为f3′和f4′的透镜制成的x2和y2偏转器之间的望远镜，偏转器x2和透镜f3′之间的距离为d3′，透镜f3′和f4′之间的距离为f3′+f4′为，以及f4′和偏转器y2之间为d4′。偏转器y2和目标样本平面之间的光学系统由三个具有焦距F1，F2和Fobj的透镜组成，元件之间的距离分别为：t1、F1+F2、t2、zx＝zy，从偏转器y2开始。因此，x2和样本平面之间的完全转移描述如下：
y2和样本平面之间是：
后者可以封闭形式书写：
矩阵的值a、b、c、d和A、B、C、D可以用在诸如等式22的等式中，以确定焦点的x0和y0坐标的时间变化。
在另一个实施例中，偏转器以x1-x2-y1-y2的顺序放置，没有中间望远镜或透镜。偏转器之间的距离分别为d1、d2和d3，从偏转器x1开始。这里，偏转器的厚度相对于它们之间的距离不能忽略，它们的光学厚度(折射率乘以物理厚度)分别由tx1、tx2、ty1、ty2表示。连接偏转器x1和x2的光学传递矩阵是：
以及y1和y2之间：
偏转器y2和样本平面之间的光学系统与先前分析的显微镜中的光学系统相同，由三个焦距为F1、F2和Fobj的透镜形成，放置在与之前相同的距离处。
因此，y-z平面中的ABCD矩阵是等式31中给出的乘法，并且传播到偏转器y2的一半：
但乘法矩阵通常可以忽略不计，因为ty2通常比F1、F2等小得多。
x-z平面中的ABCD矩阵必须考虑通过偏转器y1和y2的传播以及它们之间的距离。
这些矩阵元素在x-z和y-z平面中是不对称的，因此必须分别计算确定焦点的x0和y0坐标的参数。
我们实现了一个系统-Katona等-包含比Reddy等人的显微镜更少的元素，但在偏转器x1、y1和x2、y2之间使用望远镜，以避免在Tomas等人的系统中出现不对称，由等式34和35表示。两个偏转器对之间的望远镜由两个焦距相等的透镜形成，彼此焦距的两倍。望远镜分别在偏转器x1和x2以及偏转器y1和y2之间进行完美的成像。
与中间望远镜镜头的焦距相比，并且与焦距F1、F2和距离t1、t2相比较，偏转器的厚度可以忽略。
通过这些近似，假设理想成像，我们得到两个偏转器对的(a b c d)矩阵：
图9中所示的可以将光线从第二偏转器的输出平面传递到物镜的焦平面的系统部分的ABCD传递矩阵根据等式31计算，因为光学系统是相同的：
矩阵的乘积一般形式相当复杂，与等式31相同，但x和y坐标都相同，zx＝zy
然而，我们可以使用下面的简化，考虑到无焦光学系统在物镜的孔径上产生偏转器输出平面的图像，具有理想的望远镜成像。在这种情况下，t1＝F1并且t2＝F2。通过这种简化，我们得到：
使用等式36和39中的矩阵，我们可以在从最后一个AO偏转器的平面中取得的角度(α)和位置(x)计算在距离物镜给定z距离(zx)的x-z平面中任何输出光线的角度(α0)和坐标(x0))取在最后一个AO偏转器的平面上。相同的计算可用于y-z平面。x0坐标通常由等式22给出，其中我们现在插入等式36中的(abcd)矩阵元素，并将x1替换为x，表示第一偏转器中的x坐标：
我们也从等式39中替换矩阵元素A和B：
经过相同的转换和简化后，我们得到：
扩展括号中的项，我们得到单独的x和t依赖部分：
为了提供理想的聚焦，在第一假设中，x0坐标的x依赖部分中的时间相关和独立项应该对所有t值分别消失。为了使光束聚焦，包含x2和x的项必须对任何x值消失。这意味着两个等式而不是一个等式：
以及：
第二个意味着bx1＝bx2＝bx。这也意味着等式43右侧的第一项，即包含依赖于t2的项的单一项消失。因此，我们有一个以恒定速度移动的x0坐标。如果这发生在常数z，这不依赖于时间，并且bx1＝bx2＝0，我们回到声频的简单线性时间斜率。
从等式44我们可以表示z坐标的时间依赖性：
当zx坐标恒定时，我们将分别处理这些情况，因此焦点在水平x-y平面内漂移(见下面的例子I)；并且当点沿着任意3D线移动时，可能跟随被测结构的轴-例如轴突、树突等(例二)。
示例I：zx坐标不依赖于时间
在这种情况下，bx1＝bx2＝0，我们可以从等式45和46看到(以上)。
从等式46，我们也看到焦平面是恒定的：
如果我们设置一个所需的zx平面，我们得到所需的cx1和cx2参数之间的以下关系：
在这种情况下，x0坐标的时间变化由下式给出：
如果我们用等式47中的表达式替换zx，我们得到x0坐标：
简化后：
我们沿着x0坐标表示焦点的初始速度和加速度：
进一步被简化:
以及:
最后一个等式表明，在x-z平面上焦点不能加速；它以恒定速度vx0漂移，这在频率啁啾的持续时间内是相同的。当我们想要计算所需频率斜率的值以获得由以下参数表征的移动焦点时：开始x坐标x0，距物镜zx的距离，沿x轴的速度vx0，我们需要使用cx1+cx2(等式48)和cx1-cx2(等式53)的表达式。
对于cx1和cx2，我们得到：
相加和相减上面两个等式，我们得到结果：
总之，我们可以说，可以沿着位于水平面(垂直于物镜轴)的线以恒定速度漂移焦点；焦距zx可以通过AO偏转器中的声频啁啾来设定。可以从该分析推导出可用的zx和vx0的范围，它们受到限制给定斜率的啁啾序列的时间长度的AO设备的频率带宽的限制。
示例II：zx坐标取决于时间
如果我们想在一个AO切换时间段内沿z轴漂移样本空间中的点，我们必须允许zx坐标的时间变化。等式：
来自约束，以将从AO细胞出射的所有光线聚焦到物镜之后的单个焦点上(参见等式47，用于与时间无关的zx)。
从等式59我们得到：
因此：
然而，该等式具有非线性时间依赖性。因此，我们需要其泰勒级数来简化进一步的计算：
为了具有几乎恒定的速度，泰勒级数中的二阶和更高阶项应该小或者几乎消失：这对bx1、bx2、cx1和cx2值施加约束。我们最简单的假设是线性部分将支配二次部分的时间依赖性，这意味着它们的系数比应该很小：
然而，总和中的第二个成员，z-x平面中沿z轴的速度(vzx)，也类似地表达：
根据等式35，我们得到bx1＝bx2＝bx，在这种情况下，这不是零。我们需要其他约束来表达bx和更多常量。
x0坐标的公式(来自等式43)是：
为了找到沿x轴的漂移速度，我们应该将上述函数与t区分开来：
在t＝0时，我们可以确定沿x轴的漂移速度分量的初始值vx0：
如果我们从vzx的表达式(等式64)中取bx，并将其引入等式67，我们将得到一个等式(等式68)，它给出了cx1和cx2选择的约束。此约束将cx1和cx2与vx0和vzx相关联：
这里我们介绍了以下符号：
Δf0:＝f1x(0,0)-f2x(0,0) [等式70]
q:＝cx1-cx2 [等式71]
p:＝cx1+cx2 [等式72]
我们可以用等式68表示p，得到p和q之间的关系：
其中我们介绍了符号：
H:＝vx-r*Δf0x*vzx [等式74]
这些是适用于所有可能轨迹的一般等式。实际上，我们可以分别沿着不同的轨迹分析点(spot)的运动。
沿着3D线在空间中运动
实际上重要的可能性是设置漂移点的线性轨迹，例如，测量的树突或轴突的轴。这是一般3D线，相对于轴具有任意角度。该3D线在x-z和y-z平面上的投影也是可以单独处理的线。我们现在处理x-z平面上的投影。可以类似地处理y-z平面上的投影；然而，它们并不是完全独立的，这将在后面说明。如果点在轨迹上加速，则加速度和初始速度也投影在x-z和y-z平面上。我们将x-z平面中初始速度的两个正交分量命名为vx0和vzx0，它们分别平行于x和z轴。因此，在x-z平面中，我们具有用于线轨迹的投影：
为了计算啁啾参数，我们必须插入z(t)和x0(t)函数的时间依赖性，分别用等式62和65表示。
我们介绍以下符号：
将这些符号和等式62和65的时间依赖性引入等式75，我们得到3D线的投影：
经过一些简化后，我们得到：
每个时间点t′必须满足该等式。为了对每个t′有效，我们必须强加以下：
以及：
第一等式(等式82)给出：
从等式76介绍u：
根据这个等式，我们可以表达p(由等式72定义)如下：
为了表达bx1＝bx2＝b和q＝cx1-cx2，我们需要另一个约束，可以从初始速度vzx0的期望值设置。
我们在t＝0时得到z(t)的导数(等式62)，使用等式76和77中的符号找到初始速度值：
从等式S58表达B：
从等式77引入B的表达式，我们可以得到参数b：
为了表达q(由等式71定义)，我们使用等式83和88：
最后，我们可以通过加和减q和p来表示cx1和cx2(等式86和90)：
以及：
关键参数Δf0x可以在t’＝0处从初始设置x0(0)计算出来。然后我们得到：到：
在优选实施例中，AO设备的特征参数是：K＝0.002rad/MHz，v＝650×106μm/s，放大率M＝1，初始频率差Δf＝10MHz，以及运动参数：m＝2，vz0＝1μm/μs，n＝fobjective-4μm。对于这些值，cx1值导致3kHz/μs，而cx2＝17kHz/s。
使用这些参数，z方向上的加速度azx约为0.1m/s2。
最后，我们总结了我们的结果。这里我们演示了如何计算非线性啁啾驱动器函数的参数，以便沿着x-z平面中的线路径以给定的初始速度从给定点移动焦点。根据通用公式，在3D中选择线路径的参数：
x0＝x0(0)+s*vx0
y0＝y0(0)+s*vy0 [等式94]
z0＝z0(0)+s*vz0
由于偏转器在x-z和y-z平面中偏转，因此将等式S65转换为等式描述了这些平面上的线投影的等式：
有了这些，我们暗示vzx0＝vzy0＝vz0，并且：
为了控制偏转器，我们需要确定x-z平面中的Δf0x、bx1、bx2、cx1和cx2参数，作为轨迹和漂移的所选x0(0)、z0(0)、vx0和vzx0参数的函数。这对于y-z平面也是有效的：这里我们确定轨迹的期望y0(0)、z0(0)、vy0和vzy0的Δf0y、by1、by2、cy1和cy2。
然后点将在漂移期间保持其形状，因为在两个平面中都满足相应的约束。沿x和y坐标的初始速度vx0和vy0确定m和k参数，以及为z设置的初始速度vzx＝vzy(等式96和97)，并且加速度值也由这些参数确定。在实际参数组内，所得到的加速度值通常较低，因此对于不太长的轨迹，点的速度不会急剧变化。
对于光学计算，我们使用在两个垂直平面上应用的整个AO显微镜的近轴近似，其取向由AO偏转器的偏转方向设定(图9)。我们需要以下三组等式：i)在x-z(和y-z)平面中的AO显微镜的简化矩阵等式(等式2-3)；ii)AO偏转器的基本等式(等式7)；iii)在x-z(和y-z)平面(f)中偏转的偏转器中声频的时间非线性啁啾：
(其中i＝1或i＝2，表示第一和第二x轴偏转器；D表示AO偏转器的直径；以及va是偏转器内声波的传播速度)
该等式来自等式10、11、19和20。在本段中，我们计算x-z平面中的所有内容，x轴是一个AO偏转器对的偏转方向(y是另一个的偏转方向)，z是与圆柱形物镜的对称轴相符的光学轴。同样的计算也应该在y-z平面上应用(参见上面的详细计算)。根据这三组等式(i-iii)，我们可以计算焦点的x0坐标(等式22、65)。要使所有光线聚焦在物镜的焦点上，x0坐标的x和x2相关部分必须消失(从偏转器孔径中的任何x坐标开始的所有光线必须通过焦平面中的相同x0坐标)，这意味着两个等式(等式44、45)，我们可以从中表达z坐标的t依赖性(等式61)。
然而，等式61具有非线性时间依赖性。因此，我们需要其泰勒级数来简化进一步的计算。我们最简单的假设是，对于线性部分，时间依赖性将主导于二次部分；因此，z-x平面中沿z轴的速度几乎恒定(vzx)，并且使用等式64，可以确定沿x轴的速度(vx)(参见等式66)。
在最后一步中，我们想要分析焦点沿不同3D轨迹的运动。为简单起见，我们计算利用任意速度和相对于轴的任意角度沿着一般3D线的漂移。可以如上单独处理x-z和y-z平面。在x-z平面中，我们可以将3D线的投影表示为：
当我们组合表达式zx(t)与x0(t)，类似计算的zy(t)和y0(t)，并相加所有需要的焦点的初始位置(x0,y0,z0)和速度参数值(vx0,vy0,vzx0＝vzy0)，我们可以根据四个AO偏转器中的等式100显示计算非线性啁啾所需的所有参数(Δf0x,bx1,bx2,cx1,cx2和Δf0y,by1,by2,cy1,cy2)：
Δf0x＝f1x(0,0)-f2x(0,0))≠0
Δf0y＝f1y(0,0)-f2y(0,0))≠0
注意，Δf0x和Δf0y未完全确定；在这里，我们有额外的自由选择第一(f1)和第二(f2)组AO偏转器的频率范围，以在3D扫描期间将它们保持在带宽的中间。总之，我们能够得出AO偏转器的啁啾参数与速度和焦点坐标之间的一对一关系。因此，我们可以沿着任何3D线从扫描体积中的任何一点开始生成快速移动。
3D双光子显微镜
在以下示例性实施例中，我们通过使用在先前使用的电子系统中实现的新型AO信号合成卡来改进3D AO成像方法。新卡采用FPGA(Xilinx Spartan-6)供电的高速DA芯片(AD9739A)。处于其当前状态的卡允许产生具有变化幅度的10-140MHz信号，其中频率啁啾实现线性和二次时间依赖性。同步和命令卡允许我们任意放置焦点，并让它在每个(10-35μs)AO周期沿着任何3D线漂移。我们直接在每个AO偏转器处测量射频(RF)驱动器信号的背反射，并补偿RF反射和损耗，以在偏转器之间更均匀地分布RF能量。这允许晶体上更高的绝对声能，提供更高的AO效率，并因此在物镜下更高的激光输出和更均匀的扫描体积照射。
我们还实施了以下光学机械修改，以提高空间分辨率、扩展视野、并增加总透射光强度。我们拆除了迈泰eHP飞秒激光器(875-880nm，SpectraPhysics)的DeepSee单元，并仅使用电动外部四棱镜压缩机来补偿光路的大部分二阶和三阶材料分散(72,000fs2和40,000fs3)。使用法拉第隔离器(电光学技术)消除了相干背反射。为了消除由热漂移引起的光学误差，我们在电动四棱镜序列的前面和后面的闭环电路中实现了电动镜(AG-M100N，Newport)和象限检测器(PDQ80A，Thorlabs)。通过两对独立的AO偏转器实现Z聚焦和横向扫描，这两对AO偏转器耦合到两个消色差透镜(NT32-886，Edmund Optics)。最后，使用由Edmund Optics(47319，f＝200mm)和Linos(QIOPTIQ，G32 2246 525，f＝180)镜头组成的远心继电器将光耦合到直立双光子显微镜(Femto2D，Femtonics Ltd.)。mm)。将激发激光传递到样本，并使用20×Olympus物镜(XLUMPlanFI20×/1.0镜头，20倍，NA 1.0)进行群体成像或25倍尼康物镜(CFI75 Apochromat 25xW MP，NA 1.1)用于棘成像来收集荧光信号。通过滤光片和二向色镜将荧光光谱分离成两个光谱带，然后将其传送到直接固定在物镜臂上的GaAsP光电倍增管(Hamamatsu)，这样可以在800微米范围内进行2D电扫描的深深度成像。由于光学改进和AO偏转器的射频驱动效率的提高，空间分辨率和扫描体积分别增加了约15％和36倍。开发了新的软件模块，用于快速3D树突测量，并补偿样本漂移。
3D运动校正
由3D条带扫描，多层、多帧扫描和棋盘扫描方法产生的数据作为2D帧的时间序列存储在3D阵列中。2D帧被分割成与AO漂移匹配的条形，以形成我们的运动校正方法的基本单元。我们选择时间序列中具有最高平均强度的帧作为参考帧。然后我们计算每个帧和条之间的互相关以及参考帧的相应条，以在数据空间中产生一组位移矢量。知道每个条的扫描定向，将每个帧和每个条的位移矢量转换为样本的笛卡尔坐标系。通过计算帧的位移矢量作为其条的运动矢量的中值来避免噪声偏差。单帧的这个公共位移矢量被转换回数据空间。然后，使用每个帧中的每个条的所得位移矢量来使用线性插值来移动条的数据以用于子像素精度。只要有可能，间隙就会填充相邻条形图中的数据。
在不脱离由所附权利要求确定的保护范围的情况下，对上述公开的实施例的各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
Claims (8)
1.一种使用3D激光扫描显微镜用给定速度沿着3D空间中的任意方向的线(3D线)扫描的方法，所述3D激光扫描显微镜具有在x-z平面偏转激光束的第一对声光偏转器(x轴偏转器)和在y-z平面中偏转激光束的第二对声光偏转器(y轴偏转器)，用于在3D中聚焦激光束，该方法包括：
确定作为起点的3D线的一端的坐标x0(0)、y0(0)、z0(0)，
确定扫描速度矢量分量vx0,vy0,vzx0(＝vzy0)，使得扫描速度矢量的大小对应于给定的扫描速度，扫描速度矢量的方向对应于3D线的方向，
在x轴偏转器中提供非线性啁啾信号，并在y轴偏转器中提供非线性啁啾信号，以便以由速度矢量分量vx0,vy0,vzx0定义的速度从起始点移动焦点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在x轴偏转器中提供非线性啁啾信号并在y轴偏转器中提供非线性啁啾信号包括以下步骤：
根据如下函数在x轴偏转器中提供非线性啁啾信号：
其中，
i＝1或2分别表示第一和第二x轴偏转器，D是AO偏转器的直径；和va是偏转器内声波的传播速度并且
Δf0x＝f1x(0,0)-f2x(0,0))≠0
以及根据如下函数在y轴偏转器中提供非线性啁啾信号：
其中，
i＝1或2分别表示第一和第二x轴偏转器，和
Δf0y＝f1y(0,0)-f2y(0,0))≠0
其中Δf0x、bx1、bx2、cx1、cx2、Δf0y、by1、by2、cy1以及cy2表示为焦点的初始位置(x0(0),y0(0),z0(0))和矢量速度(vx0,vy0,vzx0＝vzy0)的函数。
3.根据权利要求2所述的方法，其中参数Δf0x、bx1、bx2、cx1、cx2、Δf0y、by1、by2、cy1以及cy2表示为
4.一种使用3D激光扫描显微镜扫描感兴趣的区域的方法，3D激光扫描显微镜具有声光偏转器，用于在由显微镜的光轴(Z)和垂直于光轴以及彼此垂直的X、Y轴限定的3D空间内聚焦激光束，该方法包括：
选择感兴趣的区域的引导点，
将3D轨迹拟合到选定的引导点，
将3D轨迹的每个扫描点延伸到位于3D空间中的线(3D线)，以便部分地沿光轴方向延伸，3D线在给定扫描点处横切于3D轨迹以及3D线共同定义一个基本上连续的表面，
通过将激光束聚焦在3D线的一端并且为偏转器中的声频提供非线性啁啾信号以沿着3D线连续移动焦点来扫描每条3D线。
5.根据权利要求4所述的方法，包括：将3D轨迹的每个扫描点延伸到多个平行线，所述多个平行线限定在给定扫描点处基本上横切于3D轨迹的表面。
6.根据权利要求5所述的方法，包括将所述3D轨迹的每个扫描点延伸到多条平行线，所述多条平行线一起限定基本上连续的体积，使得所述3D轨迹位于所述体积内。
7.根据权利要求4所述的方法，其中将所述3D轨迹的每个扫描点延伸到多个平行线，所述多个平行线限定在给定扫描点处基本上以3D轨迹为中心的立方体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述3D线是曲线或基本直线。
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