JP2023057069A - 蛍光ｖｈｈ抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】ウイルス等の抗原の高感度な検出に有用な蛍光ＶＨＨ抗体及びその利用法を提供する。【解決手段】ＶＨＨ抗体と蛍光タンパク質が直接又はペプチドリンカーを介して結合したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体であって、蛍光タンパク質が下記１）～２）のタンパク質及びその変異体から選ばれる、前記融合体。１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質２）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質【選択図】なし

Description

ＶＨＨ抗体と蛍光タンパク質との融合体及びその利用に関する。
感染症、特にウイルス感染症は、感冒症状を始め、肺炎、肝炎、脳炎等の重篤な症状を引き起こす疾患であり、人類にとって永遠の脅威となっている。近年では、インフルエンザウイルスが世界的に猛威を振るい、時には、抗原性が変化した新型インフルエンザの発現によってパンデミックを起こす場合もある。また、２０１９年には、ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が出現し、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こして、生命や健康のみならず、経済活動、社会機能にまで影響を及ぼしている。
ウイルスの診断には、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）によるウイルス遺伝子の検出（ＰＣＲ検査）の他、ウイルス構造タンパク質断片を特異的抗体を用いて検出する抗原検査が行われる。抗原検査は、高価な機械や検査に要する労力を必要とせず、感染の有無も数分で診断が可能という利点を有する。
一般に、生体が感染によって抗原と接触した後にできる抗体（イムノグロブリン；Ｉｇ）は、軽鎖と重鎖とで構成されているが、ラクダ科の動物では軽鎖を持たない重鎖抗体を産生することが知られている。重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメイン（シングルドメイン）はそれ自身でも抗体として機能し、ＶＨＨ抗体と呼ばれる。
ＶＨＨ抗体は、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さいため、通常のＩｇＧでは立体構造上の問題からエピトープに結合することができない場合でも結合が可能で、また多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る幅が広い。さらに、ＶＨＨ抗体は耐酸性や耐熱性にも優れており、ＩｇＧとは異なって培養細胞で産生させる必要がなく、大腸菌、酵母等で生産することができる。このため、大量生産しやすく、精製も容易であるという利点がある。さらに、ＶＨＨ抗体は１本鎖のペプチドで構成されているため、蛋白質工学の技術又は化学修飾等の技術を用いて機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有することが知られている。
本発明者らは、これまでに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に親和性が高いＶＨＨ抗体を取得することに成功している（特許文献１～３）。また、非特許文献１には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するＶＨＨ抗体にｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ等の蛍光タンパク質を結合させた蛍光ＶＨＨ抗体を用いて、蛍光抗体法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染培養細胞を検出することが報告されている。
ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／０１７１０６ 特願２０２１－０８５６９８ 特願２０２１－０２９０５０
Laura Jo Sherwood and Andrew Hayhurst. (2021)，Toolkit for Quickly Generating and Characterizing Molecular Probes Specific for SARS-CoV-2 Nucleocapsid as a Primer for Future Coronavirus Pandemic Preparedness., ACS Synth Biol. 2021 Feb 19;10(2):379-390. doi: 10.1021/acssynbio.0c00566. Epub 2021 Feb 3.
本発明は、ウイルス等の抗原の高感度な検出に有用な蛍光ＶＨＨ抗体及びその利用法を提供することに関する。
本発明者らは、ＶＨＨ抗体と特定の蛍光タンパク質を結合した融合体が、抗原とＶＨＨ抗体との親和性を阻害することなく抗原に結合し、当該抗原の高感度な検出に有用であることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の（１）～（５）に係るものである。
（１）ＶＨＨ抗体と蛍光タンパク質が直接又はペプチドリンカーを介して結合したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体であって、蛍光タンパク質が下記１）～２）のタンパク質及びその変異体から選ばれる、前記融合体。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）上記（１）記載の融合体をコードする核酸を有する細胞を培養する工程を含む、前記融合体の製造方法。
（３）試料中の抗原を検出する方法であって、上記（１）記載の融合体と試料とを接触させる工程を含む、抗原の検出方法。
（４）ＶＨＨ抗体を（１）記載の融合体として発現させる、該ＶＨＨ抗体の多量体化方法。
（５）ＶＨＨ抗体を（１）記載の融合体として発現させる、該ＶＨＨ抗体の抗原に対する結合活性向上方法。
本発明によれば、試料中のウイルス等の抗原を簡易且つ高感度で検出することができる。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体のインテグリティー。 ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の蛍光発色団の形成度。 感染細胞に対するＶＨＨ抗体-蛍光タンパク質融合体による染色の特異性。 ３種類のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質の蛍光シグナル強度。 凍結乾燥したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の染色性。 Ｅ０＝ＫｉｋＧとＥ９＝ＫｉｋＧのシグナル強度の比較。 Ｅ９＝ＫｉｋＧの蛍光シグナルの経日的な安定性。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床検体（唾液サンプル）に含まれる細胞のコンフォーカル顕微鏡による観察。 Ｎ１０＝ＫｉｋＧを用いたヌクレオカプシドを認識するＶＨＨ抗体Ｎ１０によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床検体の染色。 蛍光ＶＨＨによる抗体染色と間接蛍光抗体法による染色との比較。 表面プラズモン共鳴法によるＥ９＝ＫｉｋＧ、Ｅ９＝ＡｚａｌｅａＢ５又はＥ９＝ｍＡｃｈｉｌｌｅｓのオミクロン株Ｓ－タンパク質３量体又はＲＢＤに対する結合活性測定。黒線は計測された生データに基づく結合解離曲線、灰色線はフィッティング後の結合解離曲線を示す。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記を用いて、以下のように表記される。
すなわち、所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記され、アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記され、アミノ酸の「欠失」に関しては、[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記され、アミノ酸の「挿入」に関しては、
[元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸]で表記される。また、複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）によって表記される。
本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体は、ＶＨＨ抗体と蛍光タンパク質が直接又はペプチドリンカーを介して結合したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体であって、蛍光タンパク質が下記１）～２）のタンパク質及びその変異体から選ばれるものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
「ＶＨＨ抗体」とは、軽鎖を持たない重鎖抗体の抗原結合ドメインを切り出した分子を意味する。ＶＨＨ抗体は、通常抗体のＨ鎖等と同様に３本の抗原結合ループ（抗原相補性決定領域；ＣＤＲ）を有する、シングルドメイン構成の低分子抗体である。
本発明において、ＶＨＨ抗体はいかなる抗原に親和性を有する抗体であっても良いが、好ましくはウイルスに親和性を有するＶＨＨ抗体である。ここで、ウイルスは、核酸の種類（ＲＮＡ、ＤＮＡ）及びエンベロープの有無を問わず、すべての種類のウイルスであり得る。例えば、核酸としてＲＮＡを有するインフルエンザウイルス；コロナウイルス；ＳＡＲＳコロナウイルス；ＳＡＲＳコロナウイルス－２；ＲＳウイルス；ムンプスウイルス；ラッサウイルス；デングウイルス；風疹ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス、ノロウイルス；ポリオウイルス；エコーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；ライノウイルス；アストロウイルス；ロタウイルス；コクサッキーウイルス；エンテロウイルス；サポウイルス、核酸としてＤＮＡを有するヒトヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルス；Ｂ１９ウイルス；パポバウイルス；ヒトパピローマウイルス等が挙げられる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に親和性を有するＶＨＨ抗体としては、前記特許文献１～３に記載された、以下のＡ（前記特許文献１）、Ｂ（前記特許文献２）、Ｃ（前記特許文献３）の抗体又はペプチドが例示される。
Ａ：配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号１１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
具体的には、ＣｏＶＨＨ１（配列番号１２、後述の実施例においては、「Ｅ０」と称する）等が挙げられる。
Ｂ：配列番号１３～２１のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチド。
好ましくは、さらに配列番号２２～３０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２を含む、ペプチド。
より好ましくは、下記の配列番号１３～３９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む構造ドメインを１つ以上有する、１）～９）から選ばれる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチド。
Figure 2023057069000001
具体的には、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１（配列番号４０）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２（配列番号４１）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３（配列番号４２）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４（配列番号４３）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５（配列番号４４）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６（配列番号４５）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７（配列番号４６）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８（配列番号４７）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号４８、後述の実施例においては、「Ｅ９」と称する）等が挙げられる。
Ｃ：以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）配列番号４９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号５１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）配列番号５２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号５４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
具体的には、ＣｏＶＨＨ―Ｎ１（配列番号５５、後述の実施例においては、「Ｎ１」と称する）、ＣｏＶＨＨ―Ｎ２（配列番号５６）等が挙げられる。
一方、本発明に係る蛍光タンパク質は、以下の１）～２）から選ばれるタンパク質又はその変異体である。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
「蛍光タンパク質」とは、蛍光性であるタンパク質を意味し、適切な励起波長の光で照射されたときに一定の蛍光を示す（蛍光活性）。
１）の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、キクメイシ科のサンゴであるキクメイシ（Ｆａｖｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）由来のタンパク質で「ＫｉｋＧ」と称される（EMBO Rep (2005)6:233-238）。当該タンパク質は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。ＫｉｋＧの励起及び発光スペクトルは、それぞれ５０７及び５１７ｎｍで最大を示す。ＫｉｋＧは強固な４量体構造を形成することで、全体として分散性が高いタグとして活用される。
当該蛍光タンパク質の変異体としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、且つ前記タンパク質と同様の蛍光活性を有するタンパク質が挙げられる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列には、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が包含される。
ここで、「前記タンパク質と同様の蛍光活性を有する」とは、例えば、前記タンパク質の最大蛍光波長±５ｎｍの範囲に最大蛍光波長を有することが挙げられる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体としては、具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
・Ｄ６２Ｈ
・Ｍ４０Ｖ＋Ｄ６２Ｈ＋Ｉ１９８Ｍ
・Ｍ１０Ｉ＋Ｌ１２Ｖ＋Ｍ４０Ｖ＋Ｖ６０Ａ＋Ｄ６２Ｈ＋Ｙ１１９Ｎ＋Ｐ１４４Ｓ＋Ｒ１９７Ｌ＋Ｉ１９８Ｍ
２）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、トゲクボミコモンサンゴから単離した蛍光タンパク質の改変体であり、「ＡｚａｌｅａＢ５」と称される（bioRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.30.015156）。当該タンパク質は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる。
ＡｚａｌｅａＢ５の励起及び発光スペクトルは、それぞれ５７４ｎｍ及び５９６ｎｍで最大を示す。斯かるＡｚａｌｅａＢ５は２量体を形成する。
当該蛍光タンパク質の変異体としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、且つ前記タンパク質と同様の蛍光活性を有するタンパク質が挙げられる。
配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列には、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が包含される。
また、「前記タンパク質と同様の蛍光活性を有する」とは、例えば、前記タンパク質の最大蛍光波長±５ｎｍの範囲に最大蛍光波長を有することが挙げられる。
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体としては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換（Ｄ１０８Ｅ＋Ｃ１１９Ｓ＋Ｃ１５５Ｓ＋Ｃ１７７Ｖ）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体において、ＶＨＨ抗体は、直接又はペプチドリンカーを介して蛍光タンパク質と連結するが、その態様は蛍光タンパク質のＮ末端、Ｃ末端のいずれに結合するものであっても良い。好適には、ＶＨＨ抗体が、ペプチドリンカーを介して蛍光タンパク質のＮ末端に連結される態様が挙げられる。
ペプチドリンカーとは、直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるリンカーを意味し、そのアミノ酸長は、通常５～５０アミノ酸、好ましくは１３～３０アミノ酸、更に好ましくは１５～３０アミノ酸である。ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、特に限定は無く、ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体中のＶＨＨ抗体と蛍光タンパク質の機能が保持されるように好適に設計される。本発明においては、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（ＧＧＧＧＳ）３；配列番号５）を用いるのが好ましい。
また、本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体は、タグをさらに含んでもよい。タグとしては、例えばヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号６））、ＦＬＡＧ－ｔａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号７））、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号８））等のタンパク質単離／精製用ペプチドタグが挙げられる。タグは、例えば本発明に係るＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体のＮ末端又はＣ末端に、直接又はペプチドリンカー（例えばＧＧＧ）を介して連結させることができる。
本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体は、遺伝子組換え法により製造することができる。具体的には、本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体をコードする核酸（ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ））を有する大腸菌を培養することで、ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を製造することができる。
遺伝子組換え法による製造は、例えば、本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体をコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、得られた細胞（形質転換体）を培養し、該細胞内から又は細胞外液から目的のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を回収することを含む方法によりなされ得る。
本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体をコードするＤＮＡは、例えば適当なプライマーを用いるＰＣＲ法により合成した各構成要素（ＶＨＨ抗体、蛍光タンパク質、ペプチドリンカー、ペプチドタグ）をコードするＤＮＡを常法によりリガーゼで連結することによって得ることができる。あるいは、本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体をコードするＤＮＡは、常法により化学合成してもよい。
ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターである。プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ１７ｂ、ｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、及び酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）等が挙げられる。ファージベクターとしては、限定するものではないが、Ｔ７ファージディスプレイベクター（Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１０－３ｂ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１－１ｂ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１－２ａ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１－２ｂ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１－２ｃ等（Ｎｏｖａｇｅｎ））、及びλファージベクター（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ、λＺＡＰＩＩ等）が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Ｌｏｒｉｓｔ６、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９－２０、及びＣｈａｒｏｍｉｄ９－４２等が挙げられる。ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばｐＳＫＡＮ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＫ、及びｐＣｏｍｂ３Ｈ等が知られている。
ベクターには、目的のＤＮＡが発現可能なように調節配列や、目的ＤＮＡを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的ＤＮＡを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ＳＤ配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリＡサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が用いられ得る。
ベクターを導入するための宿主細胞としては、例えば大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、及び植物細胞等が挙げられるが、本発明においては、宿主細胞として大腸菌を使用することが好ましい。これらの宿主細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクル・ガン法、及びＰＥＧ法等を含む。
形質転換細胞の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物の培養液は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する。本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の回収を容易にするために、発現によって生成した当該ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を細胞外に分泌させることが好ましい。これは、その細胞からのＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の分泌を可能にするペプチド配列をコードするＤＮＡを、当該ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体をコードするＤＮＡの５’末端側に結合することにより行うことができる。細胞膜に移行した融合ペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断されて、目的のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体が培地に分泌放出される。あるいは、細胞内に蓄積されたＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を回収する。
製造されたＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体は、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により回収又は精製することができる。上述のように、本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体がヒスチジンタグ等の精製用タグを有する場合には、細胞又は培地から当該精製用タグを利用してＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を精製することができる。例えば、ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体がヒスチジンタグを有する場合には、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によりＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を精製することができる。
上述したように、ＫｉｋＧは４量体構造を形成し、ＡｚａｌｅａＢ５は２量体構造を形成することから、ＶＨＨ抗体を上記ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体として発現させることによりＶＨＨ抗体の多量体化が可能であると云える。そして、当該ＶＨＨ抗体の多量体化によれば抗原、特に多量体の抗原に対する結合活性を向上させることができる。
したがって、本発明は、ＶＨＨ抗体を前記ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体として発現させる、該ＶＨＨ抗体の多量体化方法、また、ＶＨＨ抗体を前記ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体として発現させる、該ＶＨＨ抗体の抗原に対する結合活性向上方法を提供するものでもある。
斯くして得られた本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体は、試料中の抗原の存在を検出するための蛍光標識抗体として使用できる。
したがって、本発明は、当該ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体と試料とを接触させる工程を含む、試料中の抗原の検出方法を提供する。
すなわち、本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体と試料とを接触させて抗原抗体反応を行い、反応物（抗原抗体結合物）の蛍光を測定することにより、試料中の抗原の存在を検出する。斯かる方法によれば、抗原を直接的に検出でき、追加のステップを必要とせず、より短時間で感度良く抗原の検出が可能となる。
ここで、試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、涙、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルス等の抗原が付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料の何れでもよい。特に、本発明のＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を用いて試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する場合、唾液やウイルス感染細胞等のいずれの試料を用いても、ＰＣＲ法に匹敵する高感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能である。
ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体と試料との接触は、抗原抗体反応を十分に行うことができればよく、ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の濃度及び接触量、接触時間は適宜設定され得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する場合は、予めブロッキング処理を行なった試料に、同ブロッキング液にて希釈したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を添加し、１～数時間、室温で反応させることが挙げられる。
蛍光測定は、特に限定されないが、反応物にある波長領域を持つ励起光を照射して蛍光物質を発光させ、回収される光の強度又は光子の数を蛍光顕微鏡のカメラや共焦点レーザー顕微鏡等の受光素子により計測し、試料中に含まれる抗原を識別することにより行われる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
製造例１ ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の作製
（１）大腸菌発現プラスミドの構築
ＶＨＨ抗体、Ｅ０（配列番号１２）のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ｐＢＳ Ｃ４ベクター（Shimozono et al., Methods Cell Biol. 85: 381-393 (2005)）のＢａｍＨＩ／
ＥｃｏＲＩサイトにクローニングした（ｐＢＳＣ４／Ｅ０）。さらに、ＫｉｋＧのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ｐＢＳＣ４／Ｅ０のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩサイトにクローニングした（ｐＢＳＣ４／Ｅ０＝ＫｉｋＧ）。ｐＢＳＣ４のＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間には、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３（“＝”と表記。Ｇ：グリシン、Ｓ：
セリン）に対応する塩基配列が組み込まれているため、Ｅ０とＫｉｋＧの間にリンカーが挿入されたことになる。ｐＢＳＣ４／Ｅ０＝ＫｉｋＧからＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによってＥ０＝ＫｉｋＧを抽出し、独自に改変した大腸菌発現ベクター、ｐＲＳＥＴＢ （ＨｉｎｄＩＩＩサイトの直前にＳａｌＩサイトを挿入したうえでＨｉｎｄＩＩＩサイトを除去）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩサイトにクローニングした（ｐＲＳＥＴＢ／Ｅ０＝ＫｉｋＧ）。
ｐＲＳＥＴＢ／Ｅ０＝ＫｉｋＧをテンプレートに、その他のＶＨＨ－蛍光タンパク質融合体の作製を行った。ｐＲＳＥＴＢ／Ｅ０＝ＫｉｋＧに対してＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩの制限酵素処理によりＫｉｋＧを切り出し、ＰＣＲ増幅した蛍光タンパク質のｃＤＮＡ（ＡｚａｌｅａＢ５、Ａｃｈｉｌｌｅｓ、ＥＧＦＰ）と入れ替えた。さらに、ＰＣＲ増幅したＶＨＨ抗体（Ｅ９（配列番号４８），Ｎ１０（配列番号５５））のｃＤＮＡを、制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ）もしくはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、Ｅ０と入れ替えた。
以下に、各ＶＨＨ－蛍光タンパク質融合体の作製に用いたＶＨＨ－蛍光タンパク質融合体のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチドの配列を示す。
Figure 2023057069000002
（２）大腸菌の形質転換・培養
作製したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体発現プラスミドを、ヒートショックによりコンピテントセル（ＪＭ１０９（ＤＥ３））に導入し、形質転換した。アンピシリンを含む寒天培地（ＬＢブロス）に形質転換処理した大腸菌を塗布し、約１６時間、３７℃にて培養した。形成されたコロニーの一つを、アンピシリン入りＬＢブロス（２５ｍｌ）に接種し、室温（２３℃程度）にて４日間、振盪培養した。
（３）ＶＨＨ抗体―蛍光タンパク質融合体の精製
振盪培養した大腸菌を遠心機にて回収し、ＰＢＳに懸濁した。プロテアーゼインヒビター及びリゾチームを加えたのち、液体窒素による凍結と流水による融解を３回程度繰り返し大腸菌を破砕した。ソニケーターにより更に大腸菌を破砕するとともに大腸菌ゲノムを切断した。破砕液を遠心することによりデブリを除去し、上清にＮｉ－ＮＴＡアガロースレジン（Ni-NTA agarose (Qiagen, cat.#30230)）を大腸菌培養液２５ｍLあたり１ｍL加え、４℃にて１時間程度攪拌した。Ｎｉ－ＮＴＡアガロースレジンをカラムにつめ、ＰＢＳ、１０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳにて洗浄後、３００ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳにて溶出した。溶出したタンパク質溶液は、ゲル濾過カラムＰＤ－１０によりバッファーを１５０ｍＭ ＫＣｌ，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．４）に置換した。精製したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体は、Bovine Serum Albumin (Quick Start Bovine Serum Albumin Standard (BIO-RAD, cat. #500-0206))を標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法により濃度を決定した。１０％（ｗｅｉｇｈｔ／ｍｌ）アクリルアミド－０．３３％（ｗｅｉｇｈｔ／ｍｌ）ビスアクリルアミドを架橋重合させたゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質のインテグリティーを検討し、吸収分光光度計（U-3310(日立ハイテクサイエンス)）を用いて、１５０ｍＭ ＫＣｌ，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．４）をバックグラウンドに吸収スペクトルを測定することにより発色団の形成度合いを確認した。
（４）結果
タンパク質のインテグリティーについての結果を図１に示した。加えて蛍光タンパク質の発色団形成についての結果を図２に示した。図１においてＳＤＳ－ＰＡＧＥ上の主バンドの移動度から、図中に示したいずれのＶＨＨ抗体－蛍光タンパク融合体の場合も予測される（分子設計に叶った）目的タンパク質の分子量に相当していた。また同時に、組換え体タンパク質（ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質）の分解を抑えながら高効率で安定的に産生すること可能であり、さらに高い精製度を実現していることが認められた。このことは図２に示した発色団形成を示す吸収スペクトルがいずれのＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質の場合にもＫｉｋＧあるいはＡｚａｌｅａＢ５固有のスペクトルが示されたことからも明らかである。
以上より、分子設計に叶った分子が安定的に形成されていることが支持されたと考えられた。
試験例１ ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染培養細胞の蛍光観察
（１）方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（Toshiki Ebisudani et al., Cell Rep. 2021 Jun 8;35(10):109218）及び非感染細胞（３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ）もしくは９６穴ガラスボトムプレート（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ））を用いた。タンパク分解酵素ＴＭＰＲＳＳ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが宿主となる細胞膜上に存在するＡＣＥ２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスウイルスの受容体）と結合する際にウイルス膜上にあるスパイクタンパク質を切断し活性型にするために必要な酵素であり、ＡＣＥ２と同じく宿主細胞膜上に存在する。ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞は、本来のＶｅｒｏ Ｅ６細胞にはこのＴＭＰＲＳＳ２が存在しないため、実験的に感染を誘起することを目的としてこのＴＭＰＲＳＳ２遺伝子をあらかじめ導入した細胞である。この細胞に対してブロッキング液（３％ＢＳＡ，１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／１２０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．８））により１時間室温にてブロッキングした。ブロッキング液にて希釈した１０μｇ／ｍｌＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体（Ｅ０＝ＫｉｋＧ、Ｅ０＝ＥＧＦＰ、Ｅ０＝Ａｃｈｉｌｌｅｓ）を１時間、室温にて反応させ染色を行った後ＰＢＳ（ｐＨ７．８）で３回洗浄を行い、以下に示す蛍光顕微鏡システムを用いて、ウイルスを実験的に感染させた培養細胞（Ｖｅｒｏ Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞）の蛍光観察を行った。顕微鏡システム及び撮像条件を以下に示す。
（ワイドフィールド蛍光顕微鏡システム）
・顕微鏡システム：
顕微鏡：倒立型ＩＸ８３（オリンパス）、光源：Ｘ－ｃｉｔｅ ＸＹＬＩＳ（ＥＸＣＥＬＩＴＡＳ）、カメラ：ＯＲＣＡ－Ｆｕｓｉｏｎ（浜松ホトニクス）、制御ソフト：ｃｅｌｌＳｅｎｓ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ（オリンパス）
・対物レンズ：ＵＰＬＸＡＰＯ２０ｘ／ＮＡ ０．８（オリンパス）
・蛍光ミラーユニット：
・ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体（Ｅ０＝ＫｉｋＧ，Ｅ０＝ＥＧＦＰ，Ｅ０＝Ａｃｈｉｌｌｅｓ）：Ｕ－ＦＢＮＡ（オリンパス）
・励起光強度：５％
・露光時間：１秒間
（２）結果
図３に示す結果より、ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体による染色は、非感染細胞では観察されず感染細胞特異的であることがわかった。
図４に示す結果より、ＶＨＨ抗体に融合する蛍光タンパク質として、Ｅ０＝ＫｉｋＧ，Ｅ０＝ＥＧＦＰ，およびＥ０＝Ａｃｈｉｌｌｅｓの三者を比較したところ、Ｅ０＝ＫｉｋＧが感染細胞を強く染色し、高感度に感染細胞を検出できることがわかった。
ＰＣＲでは感染が疑われる検体の平均的な感染状況を知るにとどまるのに対して、感染あるいは非感染の状態を細胞ごとに個別に分別可能であること、そして染色による蛍光強度から感染の度合いを細胞ごとに個別に検出することが可能であると考えられた。
試験例２ 凍結乾燥したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者由来の唾液における染色性
試験例１で確認した培養細胞におけるＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の染色性能の知見をもとに、凍結乾燥の有無がタンパク質分子の安定性に影響を及ぼすかを臨床検体で確認した。
（１）方法
２０ｍｌのＣｅｌｌｐｒｅｐシステム用試薬 婦人科・口腔用（ｃａｔ．ｎｏ：５１８－１１１４５８）に懸濁された検体、５００μＬをマイクロチューブに分取し１５，０００ｒｐｍ（２０，９５４ｘｇ）にて２０分遠心した。上清を除き、ペレット懸濁液約３μＬを、シランコートスライドガラス（水縁磨フロスト１１０６、武藤化学）にアプライした。
風乾により半湿潤状態にした細胞成分がスライドガラスに固定されたことを確認し、９９．５％エタノール（富士フィルム和光純薬）にて３０分間、室温にて固定した。
ＰＢＳ（ｐＨ７.８）にて２回洗浄し、ブロッキング液（３％ＢＳＡ，１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ－Ｘ／１２０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．８））にて１時間、室温にてブロッキングを行なった。
ブロッキング液にて希釈した１０μｇ／ｍＬ ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を、
１時間、室温にて反応させた。
ＰＢＳ（ｐＨ７.８）にて３回洗浄し、細胞核を、ＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍＬ ｉｎ
ＰＢＳ，富士フィルム和光純薬、ｃａｔ．ｎｏ：３４０－０７９７１）にて、染色（５分間、室温）した。
３回のＰＢＳ洗浄後、ＰＢＳを包埋剤にしてカバーガラスにて包埋し、試験例１と同条件でワイドフィールド蛍光顕微鏡による観察を行った。
（１）方法
１．５ｍＬマイクロチューブに分注した１００μＬの精製ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体Ｅ０＝ＫｉｋＧを液体窒素にて凍結し、凍結乾燥機FDU-830（EYELA）を用いて２４時間凍結乾燥を行った。凍結乾燥したサンプルは、チューブの開口部をパラフィルムにて密閉し、室温にて保管した。使用直前に１００μＬの純水を添加することにより再構成した。
（２）結果
結果を図５に示した。ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体Ｅ０＝ＫｉｋＧの溶液を精製後液体窒素により急速凍結し－８０℃にて保存したもの（新鮮プローブ）と、同タンパク質溶液を凍結乾燥し乾燥条件下に室温にて保管しておいたＥ０＝ＫｉｋＧ（凍結乾燥プローブ）は同等のシグナル強度を示した。
したがって、ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体は凍結乾燥しても機能をほぼ完全に保つと考えられた。
試験例３ Ｅ０＝ＫｉｋＧとＥ９＝ＫｉｋＧによる感染細胞の染色シグナル強度の比較
Ｅ０＝ＫｉｋＧとＥ９＝ＫｉｋＧという異なるＶＨＨ抗体をＫｉｋＧに融合させることでシグナルの強さが変化するか否かを検討した。
試験例１の方法を用いて感染細胞を染色した結果、Ｅ９＝ＫｉｋＧの方がシグナル強度が高く、且つ感染細胞に対する特異性も保たれていることが確認された（図６）。
図２の発色団形成の結果を参考にすると、シグナルの強さの違いは融合するＶＨＨ抗体との間に生じる分子の高次構造形成上のストレスではなく、むしろＶＨＨ抗体の抗原に対する親和性の違いに応じたＶＨＨ抗体－蛍光タンパク融合体の結合量の違いによって生じたと考えられた。
試験例４ ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体の蛍光シグナルの安定性
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者由来の唾液サンプルをＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体Ｅ９＝ＫｉｋＧを用いて染色し、経日的に３日間にわたり同一視野で蛍光強度を観察した（観察は室温で行い、保管を４℃で行った）。
その結果、Ｅ９＝ＫｉｋＧの蛍光シグナルの強度は、染色後少なくとも３日間は変化せず安定であることが確認された（図７）。
ＫｉｋＧ融合させたＥ９ ＶＨＨ抗体は数日間保存しても安定して強いシグナルを保持し、しかも抗原から離脱せず安定的に結合した状態にあると考えられた。
試験例５ ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床検体のコンフォーカル顕微鏡による高精細な観察
Ｓ－タンパク質の染色に強い蛍光シグナルを示すＥ９＝ＫｉｋＧ、蛍光タンパク質ＡｚａｌｅａＢ５を融合させたヌクレオカプシドを認識するＶＨＨ抗体（Ｎ１０＝ＡｚａｌｅａＢ５）、さらにＤＡＰＩによる核染色そして口腔内の上皮細胞の染色に汎サイトケラチン抗体を用いて四重染色を行った。
（１）方法
２０ｍｌのＣｅｌｌｐｒｅｐシステム用試薬 婦人科・口腔用（ｃａｔ．ｎｏ：５１８－１１１４５８）に懸濁された検体、５００μＬをマイクロチューブに分取し１５，００
０ ｒｐｍ（20,954 x g）にて２０分遠心した。上清を除き、ペレット懸濁液約３μＬを
、シランコートスライドガラス（水縁磨フロスト１１０６、武藤化学）にアプライした。 風乾により半湿潤状態にした細胞成分がスライドガラスに固定されたことを確認し、９９．５％エタノール（富士フィルム和光純薬）にて３０分間、室温にて固定した。
ＰＢＳ（ｐＨ８）にて２回洗浄し、ブロッキング液（３％ＢＳＡ，１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／１２０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．８））にて１時間、室温にてブロッキングを行なった。
ブロッキング液にて希釈した１０μｇ／ｍＬ ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体（Ｅ
１０＝ＫｉｋＧ及びＮ１０＝ＡｚａｌｅａＢ５）を、１時間、室温にて反応させた。
ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体反応後にＰＢＳ（ｐＨ７．８）で２回洗浄を行い、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．８）で１０分間、室温にて再固定を行った。
この後、ＰＢＳ（ｐＨ７．８）にて３回洗浄し、平上皮細胞のマーカーであるマウス由来モノクローナル抗－汎サイトケラチン抗体（クローン：ＡＥ１／ＡＥ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、 ｃｏｄｅ：９１４２０４）を０．１％ （ｗｔ／ｖｏｌ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（ｐＨ７．８）で最終濃度１．２５μｇ／ｍｌに希釈して１時間、室
温で反応させた。
ＰＢＳ（ｐＨ７．８）にて３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３標識－ヤギ由来抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，ｃｏｄｅ：Ａ２１０５３）を０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（ｐＨ７．８）で最終濃度２μｇ／ｍｌに希
釈して１時間、室温で反応させた。
次いでＰＢＳ（ｐＨ７．８）にて３回洗浄した後、細胞核を、ＤＡＰＩ（１ｍｇ／ｍＬ ｉｎＰＢＳ、富士フィルム和光純薬、ｃａｔ．ｎｏ：３４０－０７９７１）をＰＢＳ（ｐＨ７．８）で２μｇ／ｍｌに希釈して染色を行った（５分間、室温）。
３回のＰＢＳ洗浄後、ＰＢＳを包埋剤にしてカバーガラスにて包埋し、唾液（自然排出）の臨床検体に含まれる剥離細胞に対して倒立型コンフォーカルレーザー走査型顕微鏡による蛍光観察を行った。
コンフォーカルレーザー走査型顕微鏡による蛍光観察の観察および撮像条件は次のとおりである。
（共焦点レーザー走査型顕微鏡システム）
顕微鏡：倒立型ＦＶ３０００ （Ｏｌｙｍｐｕｓ）
１．対物レンズ（４０倍）：ＵＰＬＦＬＮ－４０ＸＯ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｏｉｌ，ＮＡ：１．３０，ＷＢ：０．２ｍｍ）
２．レーザーライン：１０％ＮＤ フィルターを使用
・染色ＤＡＰＩの検出：４０５ｎｍ（励起），蛍光検出スペクトル域４３０－４７０ｎｍ・ＫｉｋＧの検出：４８８ｎｍ（励起），蛍光検出スペクトル域５００－５４０ｎｍ
・Ａｚａｌｅａの検出：５６１ｎｍ（励起），蛍光検出スペクトル域５７０－６１１ｎｍ・汎サイトケラチン（扁平上皮細胞，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３）の検出６４０ｎｍ（励起），蛍光検出スペクトル域６５０－７５０ｎｍ
３．スキャン
・ｘ－ｙスキャン：
モード：シーケンシャルライン
スキャンスピード４．０μｓｅｃ／ｐｉｘｅｌ
・ｚ－方向：
ｚ－ステップ幅：１．５μｍ、光学切片枚数：５～８枚
４．画像サイズ：５１２×５１２
５．ピンホール径：１５８μｍ
６．デジタルズーム：１．０倍～３倍
感染サンプル及び非感染サンプルの観察条件は同一である。それぞれの観察におけるｘｙ画像をｚ方向に重ね合わせたプロジェクション画像で示した。
（２）結果
図８に顕微鏡観察像を示した。Ｓタンパク質を認識するＥ９＝ＫｉｋＧによって感染検体中の細胞を強い蛍光シグナルで鮮明に可視化することができた。これに対して、非感染細胞では蛍光シグナルはほとんど検知することができなかった。また、同時に染色を行ったヌクレオカプシドを認識するＮ１０＝ＡｚａｌｅａＢ５も同様に感染検体中の細胞を比較的強いシグナルで可視化することができた。
また、汎サイトケラチン抗体陰性の細胞でもＳタンパク質の染色シグナルが認められたことから、口腔内の扁平上皮細胞以外の細胞も感染している可能性がある。これらは感染による炎症に応答した炎症性の細胞であると考えられた。
試験例６ Ｎ１０＝ＫｉｋＧによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床検体の染色
ＶＨＨ抗体の種類が変わってもＫｉｋＧが強い蛍光シグナルを呈するか否かを検討するために、ヌクレオカプシドの染色にヌクレオカプシドを認識するＶＨＨ抗体Ｎ１０にＫｉｋＧを融合させたＮ１０＝ＫｉｋＧを用い、またＳ－タンパク質を認識するＶＨＨ抗体Ｅ９にＡｚａｌｅａＢ５を融合させたＥ９＝ＡｚａｌｅａＢ５を用いた染色に加え、ＤＡＰＩによる核染色そして口腔内の上皮細胞の染色に汎サイトケラチン抗体を用いた四重染色を行い、観察した。
（１）方法
試験例５と同様に、臨床検体サンプルを調製し、同様の条件でコンフォーカル顕微鏡により観察した。
（２）結果
図９に顕微鏡観察像を示した。ＫｉｋＧを融合させたヌクレオカプシドを認識するＶＨＨ抗体Ｎ１０（Ｎ１０＝ＫｉｋＧ）によって感染検体中の細胞を図８に示したＮ１０＝ＡｚａｌｅａＢ５の場合よりも強い蛍光シグナルで鮮明に可視化することができた。これに対して、非感染細胞では蛍光シグナルはほとんど検知することができなかった。
Ｎ１０＝ＫｉｋＧがＮ１０＝ＡｚａｌｅａＢ５以上のシグナル強度を示してより鮮明な画像を得ることができたことから，ＶＨＨ抗体が異なってもＫｉｋＧとの融合が分子形成に負荷を与えることなく有効に働くことが考えられた。また、このことはＫｉｋＧ分子そのものの物性とＫｉｋＧが４量体を形成することに依存すると考えられた。
参考例 蛍光ＶＨＨ抗体による抗体染色と従来の間接蛍光抗体法による染色との比較
（１）方法
臨床検体（口腔内の組織をぬぐいとったスワブ検体）を、試験例５と同様の方法を用いてスライドガラスにマウントし、Ｅ９＝ＫｉｋＧによる抗体染色（直接蛍光抗体法に相当）による染色、あるいは１次抗体にＳタンパク質を認識するマウス由来ａｎｔｉ－Ｓｐｉｋｅ モノクローナル抗体［ＧｅｎｅＴｅｘ社製（クローン１Ａ９），ｃｏｄｅ：ＧＴＸ６３２６０４］を用い、２次抗体にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ｃｏｄｅ：Ａ１１００１）を用いた間接蛍光抗体法による染色を行った。間接蛍光抗体法では、１次抗体を最終濃度１７μｇ／ｍＬ、また２次抗体を最終濃度２μｇ／ｍＬを反応に用いた。それぞれの反応ステップでは、まず室温で３０分間反応させた後さらに３７℃で３０分間反応させるという二つの温度による反応条件を用いた。加えて、それぞれの検体についてＤＡＰＩ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）による染色を行ったのちにマウントしてワイドフィールド蛍光顕微鏡による観察を行い、Ｅ９＝ＫｉｋＧによる抗体染色と間接蛍光抗体法による染色との比較を行った。観察には、以下のシステムを用いた。
顕微鏡：ＩＸ８３ （オリンパス）
光源：Ｘ－ｃｉｔｅ ＸＹＬＩＳ （ＥＸＣＥＬＩＴＡＳ）
対物レンズ：ＵＰＬＸＡＰＯ２０×／ＮＡ＝０．８ （オリンパス）
カメラ：ＯＲＣＡ－Ｆｕｓｉｏｎ （浜松ホトニクス）
蛍光ミラーユニット：
ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８：Ｕ－ＦＢＮＡ （オリンパス）
核染色（ＤＡＰＩ）：Ｕ－ＦＵＮＡ（オリンパス）
制御ソフト：ＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ（オリンパス）
励起光：ＮＤフィルターで５％に減弱
露光時間（ＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８）：１秒間
（２）結果：
結果を図１０に示した。間接蛍光抗体法による染色においては、Ｅ９＝ＫｉｋＧと比較して、サンプルの存在しないガラス面に非特異的な強い蛍光が顕著に観察された。
Ｅ９＝ＫｉｋＧを用いた染色では従来の間接法の抗体染色と比較して、スライドガラスにマウントしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞を特異的、かつＳ／Ｎよく高感度に観察できることが分かった。
試験例７ 表面プラズモン共鳴法によるＥ９＝ＫｉｋＧ及びＥ９＝ＡｚａｌｅａＢ５の抗原結合活性の測定
ＫｉｋＧ融合ＶＨＨ抗体の検出感度が高かったのは、ＫｉｋＧが強固な４量体構造を形成することでＶＨＨ抗体も４量体化するため、その結合の総和により高い結合活性を示すことに起因すると考えられた。それを確認するために、表面プラズモン共鳴法を用いて抗原結合活性を測定した。
（１）方法
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ）に固相化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株Ｓ－タンパク質３量体又はＳ－タンパク質ＲＢＤ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ。Ｓ－タンパク質の一部で、宿主細胞上の受容体に結合する領域。３量体形成に必要な領域を含まない。）に対する蛍光ＶＨＨ抗体の結合活性を測定した。Ｗｉｚａｒｄ、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ａｆｆｉｎｉｔｙのモードで測定した。温度は２５℃に設定した。ランニング緩衝液には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ ７．４）を用いた。１）抗原の固相化：流速を１０μＬ／ｍＬに設定した。７５ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ塩酸塩水溶液と１１．５ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ水溶液を等量混合し、これを４２０秒間添加してセンサーチップ表面上のカルボキシル基を活性化した。１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｔｒｉｍｅｒ， Ｈｉｓ Ｔａｇ （Ｂ．１．１．５２９／Ｏｍｉｃｒｏｎ） （ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）（Ｈｉｓタグ付きＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株Ｓ－タンパク質３量体、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．５２９ （Ｏｍｉｃｒｏｎ） Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株Ｓ－タンパク質ＲＢＤ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、それぞれ１８００ＲＵ、３６０ＲＵ固定化した。１Ｍ エタノールアミン－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を４２０秒間添加してブロッキングした。２）結合活性の測定：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、ランニング緩衝液で希釈したＥ９＝ＫｉｋＧ、Ｅ９＝ＡｚａｌｅａＢ５又はＥ９＝ｍＡｃｈｉｌｌｅｓをＣｏｎｔａｃｔ Ｔｉｍｅ１８０秒間、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ４２０秒間に設定して相互作用させた。３）センサーチップ表面の再生：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液を３０秒間添加した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ソフトウェアバージョン２．０）（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによる解析を行い、結合活性を算出した。
（２）結果
取得されたセンサーグラムを図１１、解析結果により算出されたカイネティクスパラメーターを表３に示す。算出されるＫＤ値は多量体化したＶＨＨ抗体の結合活性の総和になるため、「見かけ上のＫＤ値」として示す。単量体蛍光タンパク質のｍＡｃｈｉｌｌｅｓと融合したＥ９＝ｍＡｃｈｉｌｌｅｓ（配列番号７４）と比較して、Ｅ９＝ＫｉｋＧとＥ９＝ＡｚａｌｅａＢ５は解離速度が低下し、それはＥ９＝ＫｉｋＧで顕著に示された。ＫｉｋＧは４量体、ＡｚａｌｅａＢ５は２量体を形成するため、ＶＨＨ抗体が多量体化することで、抗原に対する結合の価数が増加したためだと考えられた。このような差が、ＫｉｋＧ融合ＶＨＨ抗体を用いたウイルス可視化における感度の高さに影響していると考えられた。また、Ｓ－タンパク質３量体とＳ－タンパク質ＲＢＤを比較すると、前者の方がさらに解離速度が低下した。３量体を構成する各々のＳ－タンパク質に対してＶＨＨ抗体が結合するためだと考えられた。以上より、多量体構造を有するウイルス抗原を検出する際に多量体化したＶＨＨ抗体を用いることは、有効な手段であると考えられた。
Figure 2023057069000003

Claims (13)

  1. ＶＨＨ抗体と蛍光タンパク質が直接又はペプチドリンカーを介して結合したＶＨＨ抗体－蛍光タンパク質融合体であって、蛍光タンパク質が下記１）～２）のタンパク質及びその変異体から選ばれる、前記融合体。
    １）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    ２）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
  2. ＶＨＨ抗体が、前記蛍光タンパク質のＮ末端又はＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介して連結されている、請求項１記載の融合体。
  3. ＶＨＨ抗体が、ペプチドリンカーを介して前記蛍光タンパク質のＮ末端に連結されている、請求項１記載の融合体。
  4. ペプチドリンカーが（ＧＧＧＧＳ）３(配列番号５)である、請求項３記載の融合体。
  5. ＶＨＨ抗体がウイルスに対して親和性を有するＶＨＨ抗体である、請求項１～４のいずれか１項記載の融合体。
  6. ＶＨＨ抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して親和性を有するＶＨＨ抗体である、請求項１～４のいずれか１項記載の融合体。
  7. ＶＨＨ抗体が配列番号１２、配列番号４８又は配列番号５５で示されるアミノ酸配列からなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＶＨＨ抗体である、請求項１～４のいずれか１項記載の融合体。
  8. 請求項１～７のいずれか１項記載の融合体をコードする核酸を有する細胞を培養する工程を含む、前記融合体の製造方法。
  9. 試料中の抗原を検出する方法であって、請求項１～７のいずれか１項記載の融合体と試料とを接触させる工程を含む、抗原の検出方法。
  10. 抗原がウイルスである、請求項９記載の方法。
  11. 抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項９記載の方法。
  12. ＶＨＨ抗体を請求項１記載の融合体として発現させる、該ＶＨＨ抗体の多量体化方法。
  13. ＶＨＨ抗体を請求項１記載の融合体として発現させる、該ＶＨＨ抗体の抗原に対する結合活性向上方法。
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